BRPI0821816B1 - Processos para produzir equol, tetraidrodaidzeína e dihidrodaidzeína - Google Patents

Abstract

ENZIMA ASSOCIADA COM SÍNTESE DE EQUOL. Um objetivo da presente invenção é fornecer enzimas associadas com síntese de equol, gene codificando tais enzimas, e um processo para produzir equol e seus intermediários usando as enzimas e genes. A presente invenção fornece uma enzima de sintetização da diidrodaidzeína, enzima de sintetização da tetraidrodaidzeína, enzima de sintetização de equol, e genes codificando estas enzimas. A presente invenção também fornece um processo para sintetizar diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína, e/ou equol usando estas enzimas.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato, um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar tetraidro- daidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato, e um polipeptí- deo tendo uma atividade de sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato, bem como um polinucleotídeo que codifica estes polipeptídeos. A invenção também se refere a processos para produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína, e equol usando os polipeptídeos acima, e um aparato de produção usado nos processos. A invenção também fornece técnicas com relação aos mesmos.

Técnica Antecedente

[0002] Derivados de isoflavona são acreditados possuirem várias atividades fisiológicas e farmacológicas. Por esta razão, derivados de isoflavona são usados como material para alimentação e produtos farmacêuticos. Como estudos revelaram as funções de derivados de isoflavona, neste contexto houve relatos de que a atividade semelhante ao estrogênio de derivados de isoflavona não é, como convenientemente acreditado, devido à ação dos próprios derivados de isoflavo- na, porém devido à forte atividade semelhante ao estrogênio encontrado em todo o corpo exibida por equol, que é absorvido nos intestinos após ser liberado de vários tipos de bactérias intestinais metaboli- zando (biosintetizando) os derivados de isoflavona para produzir equol. Em humanos, nem todos os indivíduos têm a capacidade de produzir equol nos intestinos, e tal capacidade de produzir equol varia entre os diferentes indivíduos. Por exemplo, alguns indivíduos podem não ter nenhuma bactéria produtora de equol nos intestinos, enquanto outros podem ter tais bactérias, porém com apenas uma capacidade limitada para produzir equol.

[0003] Consequentemente, seria benéfico em países com popula ções envelhecendo, tal como o Japão, fazer uso efetivo de equol no corpo, particularmente em consideração de distúrbios crônicos tais como osteoporose afetando o idoso. Devido ao fato de que as bactérias produtoras de equol não são encontradas em todos os indivíduos, existe uma necessidade de encontrar uma síntese de material de equol que possibilite produção de equol artificial eficiente.

[0004] Sob estas circunstâncias, é muito importante, em termos de fornecimento de uma síntese de material de equol, identificar e usar enzimas envolvidas na série de reação biosintética de equol. Entretanto, nenhuma informação está disponível com relação a enzimas que produzem ou catalisam alguns dos intermediários envolvidos na série de reação biossintética. Consequentemente, a identificação de enzimas associadas com a síntese de tais intermediários é desejada.

Documento de Patente 1: JP-A-2006-296434 Descrição da Invenção Problema Técnico

[0005] É um objetivo da presente invenção fornecer uma enzima associada com a síntese de diidrodaidzeína que pode ser usada como um material de síntese de equol. Especificamente, a invenção objetiva fornecer um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar diidro- daidzeína usando daidzeína como um substrato. A invenção também objetiva fornecer um polinucleotídeo que codifica um tal polipeptídeo, e técnicas com respeito à síntese de diidrodaidzeína usando um tal poli- peptídeo.

[0006] É outro objetivo da presente invenção fornecer uma enzima associada com a síntese de tetraidrodaidzeína que pode ser usada como um material de síntese de equol. Especificamente, a invenção objetiva fornecer um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato. A invenção também objetiva fornecer um polinucleotídeo que codifica um tal polipeptídeo, e técnicas com respeito à síntese de tetraidrodaidzeí- na usando um tal polipeptídeo.

[0007] É outro objetivo da presente invenção fornecer uma enzima associada com síntese de equol. Especificamente, a invenção objetiva fornecer um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato. A invenção também objetiva fornecer um polinucleotídeo que codifica um tal polipeptídeo, e técnicas com respeito à síntese de equol usando um tal polipeptídeo.

[0008] É outro objetivo da presente invenção fornecer um proces so para produzir intermediários tais como diidrodaidzeína e tetraidro- daidzeína geradas na produção de equol de daidzeína, e um processo para produzir equol usando os intermediários obtidos. A invenção também objetiva fornecer um aparato de produção para uso na produção. Solução Técnica

[0009] Os inventores da presente invenção conduziram estudos intensivos para solucionar os problemas anteriores, e bem sucedida- mente isolaram de bactérias intestinais produtoras de equol, uma enzima capaz de sintetizar diidrodaidzeína, uma enzima capaz de sintetizar tetraidrodaidzeína, e uma enzima capaz de sintetizar equol, usadas como materiais de partida de síntese de equol, e revelaram as estruturas destas enzimas. Além disso, os inventores conduziram outros estudos, e foram bem-sucedidos na produção artificial de diidrodaidzeína, tetrai- drodaidzeína, e equol, usando as enzimas acima. A presente invenção foi executada em outros estudos com base nestas descobertas.

[00010] Especificamente, em um aspecto, a presente invenção fornece:

[00011] Item A1. Um polipeptídeo selecionado de: (Aa) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1; (Ab) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato; e (Ac) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais identidade com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 1, e tendo uma atividade de sintetizar diidro- daidzeína usando daidzeína como um substrato.

[00012] Item A2. Um polinucleotídeo selecionado de : (Ad) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 4; (Ae) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; e (Af) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Ad) ou (Ae), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar dii- drodaidzeína usando daidzeína como um substrato.

[00013] Item A3. Um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo de item A2.

[00014] Item A4. Uma célula recombinante transformada com o vetor de expressão de item A3.

[00015] Item A5. Uma célula recombinante de acordo com o item A4, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

[00016] Item A6. Uma célula recombinante de acordo com o item A5, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao gênero Lactococcus.

[00017] Item A7. Um processo para produzir um polipeptídeo, compreendendo cultivar uma célula de qualquer um dos itens A4 a A6 para obter um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar diidrodaidzeí- na usando daidzeína como um substrato.

[00018] Item A8. Um polipeptídeo obtido pelo processo de item A7.

[00019] Item A9. Um processo para produzir diidrodaidzeína, compreendendo ter o polipeptídeo de Item A1 or A8, e NADPH e/ou NADH age sobre a daidzeína.

[00020] Item A10. Um processo para produzir diidrodaidzeína, compreendendo ter a célula de qualquer um dos itens A4 a A6 age sobre a daidzeína.

[00021] Item A11. Um anticorpo tendo a atividade do polipeptídeo de item A1, ou o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item A2.

[00022] Item A12. Um método imunológico para detectar ou medir o polipeptídeo de item A1 ou o polipeptídeo codificado pelo polinucleotí- deo de item A2, o método compreendendo ter o anticorpo de ítem A11 contato com a amostra de teste.

[00023] Item A13. Um método de acordo com o ítem A12, em que o polipeptídeo a ser detectado ou medido existe em uma célula procarió- tica bacteriana.

[00024] Item A14. Uma sonda tendo uma sequência de nucleotídeo capaz de hibridizar sob condições rigorosas com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de item A1, ou com o polinucleotídeo de item A2.

[00025] Item A15. A iniciador tendo uma sequência de nucleotídeo capaz de hibridizar sob condições rigorosas com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de item A1, ou com o polinucleotídeo de item A2.

[00026] Item A16. Um método para detectar ou medir um polinucle- otídeo que codifica o polipeptídeo de item A1, ou o polinucleotídeo de item A2, usando a sonda de item A14.

[00027] Item A17. Um método de acordo com o ítem A16, em que o polipeptídeo a ser detectado ou medido existe em uma célula procarió- tica bacteriana.

[00028] Item A18. Um método de acordo com o ítem A16, compreendendo amplificação por PCR de todo ou parte de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de item A1, ou o polinucleotídeo de item A2.

[00029] Item A19. Uma composição de enzima de sintetização de diidrodaidzeína, compreendendo o polipeptídeo de item A1, ou um po- lipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item A2.

[00030] Item A20. Uma composição de acordo com o item A19, também compreendendo NADPH e/ou NADH.

[00031] Item A21. Uma composição de síntese de diidrodaidzeína, compreendendo: (Ai) o polipeptídeo de item A1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item A2; (Aii) NADPH e/ou NADH; e (Aiii) daidzeína.

[00032] Item A22. Uma composição de síntese de diidrodaidzeína, compreendendo: (Aiv) a célula de qualquer um dos itens A4 a A6; e (Aiii) daidzeína.

[00033] Item A23. Um kit de síntese de diidrodaidzeína, compreendendo: (Ai) o polipeptídeo de item A1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item A2; (Aii) NADPH e/ou NADH; e (Aiii) daidzeína.

[00034] Item A24. Um kit de síntese de diidrodaidzeína, compreendendo: (Aiv) a célula de qualquer um dos itens A4 a A6; e (Aiii) daidzeína.

[00035] Item A25. Um kit de medição imunológica para medir o poli- peptídeo de item A1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotí- deo de item A2,

[00036] O kit compreendendo pelo menos o anticorpo de item A11.

[00037] Item A26. Um kit de PCR para detectar um polinucleotídeo codificando o polinucleotídeo de item A1, ou o polinucleotídeo de item A2,o kit PCR compreendendo pelo menos o iniciador de item A15.

[00038] Item A27. Um kit de acordo com o item A26, em que o kit é para identificar a célula contendo a polinucleotídeo codificando o poli- peptídeo de item A1, ou o polinucleotídeo de item A2.

[00039] Item A28. Um kit de PCR de acordo com o item A27, em que o kit é para PCR.

[00040] Item A29. Uma enzima de sintetização de diidrodaidzeína, que consiste no polipeptídeo de item A1.

[00041] Item B1. Um polipeptídeo selecionado de: (Ba) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7; (Bb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato; e (Bc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais identidade com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 7, e tendo uma atividade de sintetizar tetrai- drodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[00042] Item B2. Um polinucleotídeo selecionado de : (Bd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 10; (Be) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo con- sistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; e (Bf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Bd) ou (Be), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar te- traidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[00043] Item B3. Um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo de item B2.

[00044] Item B4. Uma célula recombinante transformada com o vetor de expressão de item B3.

[00045] Item B5. Uma célula recombinante de acordo com o item B4, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

[00046] Item B6. Uma célula recombinante de acordo com o item B5, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao gênero Lactococcus.

[00047] Item B7. Um processo para produzir um polipeptídeo, compreendendo cultivar uma célula de qualquer um dos itens B4 a B6 para obter um polipeptídeo tendo uma atividade de formação de tetraidro- daidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[00048] Item B8. um polipeptídeo obtido pelo processo de item B7.

[00049] Item B9. Um processo para produzir tetraidrodaidzeína, compreendendo ter o polipeptídeo de Item B1 or B8, e NADPH e/ou NADH age sobre a diidrodaidzeína.

[00050] Item B10. Um processo para produzir tetraidrodaidzeína, compreendendo ter a célula de qualquer um dos itens B4 a B6 age sobre a diidrodaidzeína.

[00051] Item B11. Um anticorpo tendo a atividade de o polipeptídeo de item B1, ou o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item B2.

[00052] Item B12. Um método imunológico para detectar ou medir o polipeptídeo de item B1 ou o polipeptídeo codificado pelo polinucleotí- deo de item B2,o método compreendendo ter o anticorpo de ítem B11 contato com a amostra de teste.

[00053] Item B13. Um método de acordo com o ítem B12, em que o polipeptídeo a ser detectado ou medido existe em uma célula procarió- tica bacteriana.

[00054] Item B14. Uma sonda tendo uma sequência de nucleotídeo capaz de hibridizar sob condições rigorosas com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de item B1, ou com o polinucleotídeo de item B2.

[00055] Item B15. Um iniciador tendo uma sequência de nucleotí- deo capaz de hibridizar sob condições rigorosas com um polinucleotí- deo que codifica o polipeptídeo de item B1, ou com o polinucleotídeo de item B2.

[00056] Item B16. Um método para detectar ou medir um polinucle- otídeo que codifica o polipeptídeo de item B1, ou o polinucleotídeo de item B2, usando a sonda de item B14.

[00057] Item B17. Um método de acordo com o ítem B16, em que o polipeptídeo a ser detectado ou medido existe em uma célula procarió- tica bacteriana.

[00058] Item B18. Um método de acordo com o ítem B16, compreendendo amplificação por PCR de todo ou parte de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de item B1, ou o polinucleotídeo de item B2.

[00059] Item B19. A enzima de sintetização da tetraidrodaidzeína composition, compreendendo o polipeptídeo de item B1, ou um poli- peptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item B2.

[00060] Item B20. Uma composição de acordo com o item B19, também compreendendo NADPH e/ou NADH.

[00061] Item B21. Uma composição de síntese de tetraidrodaidzeí- na, compreendendo: (Bi) o polipeptídeo de item B1, ou um polipeptídeo codifica- do pelo polinucleotídeo de item B2; (Bii) NADPH e/ou NADH; e (Biii) diidrodaidzeína.

[00062] Item B22. Uma composição de síntese de tetraidrodaidzeí- na, compreendendo: (Biv) a célula de qualquer um dos itens B4 a B6; e (Biii) diidrodaidzeína.

[00063] Item B23. Um kit de síntese de tetraidrodaidzeína, compreendendo: (81) o polipeptídeo de item B1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item B2; (811) NADPH e/ou NADH; e (Biii) diidrodaidzeína.

[00064] Item B24. Um kit de síntese de tetraidrodaidzeína, compreendendo: (Biv) a célula de qualquer um dos itens B4 a B6; e (Biii) diidrodaidzeína.

[00065] Item B25. Um kit de medição imunológica para medir o po- lipeptídeo de item B1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotí- deo de item B2, o kit compreendendo pelo menos o anticorpo de item B11. Item B26. Um kit de PCR para detectar um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de item B1, ou o polinucleotídeo de item B2, o kit de PCR compreendendo pelo menos o iniciador de item B15.

[00066] Item B27. Um kit de acordo com o item B26, em que o kit é para identificar a célula contendo o polinucleotídeo codificando o poli- peptídeo de item B1, ou o polinucleotídeo de item B2.

[00067] Item B28. Um kit de PCR de acordo com o item B27, em que o kit é para PCR.

[00068] Item B29. A enzima de sintetização da tetraidrodaidzeí- na,que consiste no polipeptídeo de item B1.

[00069] Item C1. Um polipeptídeo selecionado de: (Ca) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 13; (Cb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 13 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato; e (Cc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais identidade com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 13, e tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato. Item C2. Um polinucleotídeo selecionado de : (Cd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO: 16; (Ce) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; e (Cf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Cd) ou (Ce), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato.

[00070] Item C3. Um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo de item C2.

[00071] Item C4. Uma célula recombinante transformada com o vetor de expressão de item C3.

[00072] Item C5. Uma célula recombinante de acordo com o item C4, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

[00073] Item C6. Uma célula recombinante de acordo com o item C5, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao gênero Lacto-coccus.

[00074] Item C7. Um processo para produzir um polipeptídeo, compreendendo cultivar uma célula de qualquer um dos itens C4 a C6 para obter um polipeptídeo tendo uma atividade de formação de equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato.

[00075] Item C8. Um polipeptídeo obtido pelo processo de item C7.

[00076] Item C9. Um processo para produzir equol, compreendendo ter o polipeptídeo de Item C1 ou C8 age sobre a tetraidrodaidzeína.

[00077] Item C10. Um processo para produzir equol, compreendendo ter a célula de qualquer um dos itens C4 a C6 age sobre a tetrai- drodaidzeína.

[00078] Item C11. Um anticorpo tendo a atividade do polipeptídeo de item C1, ou o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item C2.

[00079] Item C12. Um método imunológico para detectar ou medir o polipeptídeo de item C1 ou o polipeptídeo codificado pelo polinucleotí- deo de item C2,o método compreendendo ter o anticorpo de ítem C11 contato com a amostra de teste.

[00080] Item C13. Um método de acordo com o ítem C12, em que o polipeptídeo a ser detectado ou medido existe em uma célula procarió- tica bacteriana.

[00081] Item C14. Uma sonda tendo uma sequência de nucleotídeo capaz de hibridizar sob condições rigorosas com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de item C1, ou com o polinucleotídeo de item C2.

[00082] Item C15. A iniciador tendo uma sequência de nucleotídeo capaz de hibridizar sob condições rigorosas com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de item C1, ou com o polinucleotídeo de item C2.

[00083] Item C16. Um método para detectar ou medir um polinucle- otídeo que codifica o polipeptídeo de item C1, ou o polinucleotídeo de item C2, usando a sonda de item C14.

[00084] Item C17. Um método de acordo com o ítem C16, em que o polipeptídeo a ser detectado ou medido existe em uma célula procarió- tica bacteriana.

[00085] Item C18. Um método de acordo com o ítem C16, compreendendo amplificação por PCR de todo ou parte de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de item C1, ou o polinucleotídeo de item C2.

[00086] Item C19. Uma composição de enzima de sintetização de equol, compreendendo o polipeptídeo de item C1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item C2.

[00087] Item C20. Uma síntese de equol composição compreendendo: (Ci) o polipeptídeo de item C1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item C2; e (Cii) tetraidrodaidzeína. Item C21. Uma síntese de equol composição compreendendo: (Ciii) a célula de qualquer um dos itens C4 a C6; e (Cii) tetraidrodaidzeína.

[00088] Item C22. Um kit de síntese de equol compreendendo: (Ci) o polipeptídeo de item C1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de item C2; e (Cii) tetraidrodaidzeína.

[00089] Item C23. Um kit de síntese de equol compreendendo: (Ciii) a célula de qualquer um dos itens C4 a C6; e (Cii) tetraidrodaidzeína.

[00090] Item C24. Um kit de medição imunológica para medir o po- lipeptídeo de item C1, ou um polipeptídeo codificado pelo polinucleotí- deo de item C2,o kit compreendendo pelo menos o anticorpo de item C11.

[00091] Item C25. Um kit de PCR para detectar um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de item C1, ou o polinucleotídeo de item C2,o kit de PCR compreendendo pelo menos o iniciador de item C15.

[00092] Item C26. Um kit de acordo com o item C25, em que o kit é para identificar a célula contendo a polinucleotídeo codificando o poli- peptídeo de item C1, ou o polinucleotídeo de item C2.

[00093] Item C27. Um kit de acordo com o item C26, em que o kit é para PCR.

[00094] Item C28. Uma enzima de sintetização de equol, que consiste no polipeptídeo de item C1.

[00095] Item D1. Um processo para produzir tetraidrodaidzeína compreendendo a seguinte Primeira Etapa e Segunda Etapa, a Primeira Etapa compreendendo uma etapa de ter uma enzima consistindo em um dos seguintes polipeptídeos (Aa) a (Ac), e NADPH e/ou NADH agem sobre a daidzeína, desse modo produzindo diidrodaidzeína, (Aa) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1; (Ab) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato; e (Ac) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais identidade com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 1, e tendo uma atividade de sintetizar diidro- daidzeína usando daidzeína como um substrato, Segunda Etapa compreendendo uma etapa de ter uma enzima consistindo em um dos seguintes polipeptídeos (Ba) a (Bc) e NADPH e/ou NADH age sobre a diidrodaidzeína, desse modo produzindo tetraidrodaidzeína, (Ba) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; (Bb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato; e (Bc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais identidade com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 7, e tendo uma atividade de sintetizar tetrai- drodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[00096] Item D2. Um produto contendo tetraidrodaidzeína, produzido pelo processo de acordo com o item D1.

[00097] Item D3. Um processo para produzir equol compreendendo a seguinte Segunda Etapa e Terceira Etapa, a Segunda Etapa compreendendo uma etapa de ter uma enzima consistindo em um dos seguintes polipeptídeos (Ba) a (Bc) e NADPH e/ou NADH age sobre a diidrodaidzeína, desse modo produzindo tetraidrodaidzeína, (Ba) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7; (Bb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato; e (Bc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais identidade com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 7, e tendo uma atividade de sintetizar tetrai- drodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato,

[00098] Terceira Etapa compreendendo uma etapa de ter uma enzima consistindo em um dos seguintes polipeptídeos (Ca) a (Cc) para agir sobre a tetraidrodaidzeína, desse modo produzindo equol, (Ca) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 13; (Cb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 13 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato; e (Cc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais identidade com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 13, e tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato.

[00099] Item D4. Um produto contendo equol, produzido pelo processo de acordo com o item D3.

[000100] Item D5. Um processo para produzir equol compreendendo Primeira Etapa à Terceira Etapa.

[000101] Item D6. Um produto contendo equol, produzido pelo processo de acordo com o item D5.

[000102] Item D7. Um vetor de expressão tendo pelo menos um poli- nucleotídeo selecionado do grupo consistindo nos seguintes (Ad) a (Af), (Bd) a (Bf), e (Cd) a (Cf), (Ad) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 4; (Ae) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; (Af) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Ad) ou (Ae), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar dii- drodaidzeína usando daidzeína como um substrato; (Bd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 10; (Be) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo con- sistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; (Bf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Bd) ou (Be), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar te- traidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato; (Cd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO: 16; (Ce) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; e (Cf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Cd) ou (Ce), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato.

[000103] Item D8. Uma célula recombinante transformada com o vetor de expressão de item 7.

[000104] Item D9. Uma célula recombinante de acordo com o item 8, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

[000105] Item D10. Uma célula recombinante de acordo com o item 9, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao gênero Lactococcus.

[000106] Item D11. Um processo para produzir diidrodaidzeína, te- traidrodaidzeína, e/ou equol, compreendendo pelo menos duas das seguintes Quarta Etapa à Sexta Etapa,

[000107] Quarta Etapa compreendendo uma etapa de ter uma célula recombinante compreendendo um dos seguintes polinucleotídeos (Ad) a (Af) agem sobre a daidzeína, desse modo produzindo diidrodaidzeína, (Ad) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 4; (Ae) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; e (Af) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Ad) ou (Ae), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar dii- drodaidzeína usando daidzeína como um substrato,

[000108] Quinta Etapa compreendendo uma etapa de ter uma célula recombinante compreendendo um dos seguintes polinucleotídeos (Bd) a (Bf) age sobre a diidrodaidzeína, desse modo produzindo tetraidro- daidzeína, (Bd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 10; (Be) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; e (Bf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Bd) ou (Be), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar te- traidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato,

[000109] Sexta Etapa compreendendo uma etapa de ter uma célula recombinante compreendendo um dos seguintes polinucleotídeos (Cd) a (Cf) age sobre a tetraidrodaidzeína, desse modo produzindo equol, (Cd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 16; (Ce) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; and (Cf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Cd) ou (Ce), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato, em que pelo menos dois polinucleotídeos selecionados do grupo consistindo em (Ad) a (Af), (Bd) a (Bf), e (Cd) a (Cf) podem existir em uma célula recombinante simples.

[000110] Item D12. Uma célula recombinante de acordo com o item 11, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

[000111] Item D13. Uma célula recombinante de acordo com o item 12, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao gênero Lactococcus.

[000112] Item D14. Um produto contendo diidrodaidzeína, tetraidro- daidzeína, e/ou equol, produzido por qualquer dos processos de acordo com os itens D11 a D13.

[000113] Item D15. Um dispositivo para produzir diidrodaidzeína, te- traidrodaidzeína, e/ou equol, compreendendo pelo menos um dos seguintes Primeiro a Terceiro vasos de reação,

[000114] O primeiro vaso de reação tendo um recurso de reação em que uma enzima consistindo em um dos polipeptídeos (Aa) a (Ac) é imobilizada, um vaso de reação sendo usado para a produção de dii- drodaidzeína de daidzeína usando a enzima, o recurso de reação sendo disposto em uma posição permitindo contato com daidzeína;

[000115] O segundo vaso de reação tendo um recurso de reação em que uma enzima consistindo em um dos polipeptídeos (Ba) a (Bc) é imobilizada, um vaso de reação sendo usado para a produção de te- traidrodaidzeína de diidrodaidzeína usando a enzima, o recurso de reação sendo disposto em uma posição permitindo contato com diidro- daidzeína; e

[000116] O terceiro vaso de reação tendo um recurso de reação em que uma enzima consistindo em um dos polipeptídeos (Ca) a (Cc) é imobilizada, um vaso de reação sendo usado para a produção de equol de tetraidrodaidzeína usando a enzima, o recurso de reação sendo disposto em uma posição permitindo contato com tetraidro- daidzeína.

[000117] Item D16. Um dispositivo para produzir diidrodaidzeína, te- traidrodaidzeína, e/ou equol, compreendendo pelo menos um dos se-guintes Quarto a Sexto Vasos de Reação,

[000118] O Quarto Vaso de Reação tendo um recurso de reação em que uma célula recombinante compreendendo um dos polinucleotí- deos (Ad) a (Af) é imobilizada, um vaso de reação sendo usado para a produção de diidrodaidzeína de daidzeína usando um recurso de reação, o recurso de reação sendo disposto em uma posição permitindo contato com daidzeína;

[000119] Quinto Vaso de Reação tendo um recurso de reação em que uma célula recombinante compreendendo um dos polinucleotí- deos (Bd) a (Bf) é imobilizada, um vaso de reação sendo usado para a produção de tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína usando um recurso de reação, o recurso de reação sendo disposto em uma posição permitindo contato com diidrodaidzeína; e

[000120] Sexto Vaso de Reação tendo um recurso de reação em que uma célula recombinante compreendendo um dos polinucleotídeos (Cd) a (Cf) é imobilizada, um vaso de reação sendo usado para a produção de equol de tetraidrodaidzeína usando um recurso de reação, o recurso de reação sendo disposto em uma posição permitindo contato com tetraidrodaidzeína.

Efeitos da Invenção

[000121] A presente invenção fornece polipeptídeos capazes de: (1) sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato, (2) sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato, e (3) sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato. Desse modo, a presente invenção é útil para síntese industrial de dii- drodaidzeína e/ou tetraidrodaidzeína, que são intermediários gerados na produção de equol de daidzeína, bem como síntese industrial de equol. A presente invenção abrirá a porta para a produção industrial de equol, sem usar as cepas bacterianas anaeróbicas difíceis de manipular tradicionalmente usadas para produção de equol.

Melhor modo para realizar a invenção

[000122] Nos seguintes, todas as abreviações usadas para representar os nomes de substâncias, incluindo aminoácidos, polipeptídeos, sequências de base, e ácidos nucleicos, seguem a nomenclatura especificada pela IUPAC-IUB (IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)), a Guideline for Drafting Specifications containing Base Sequence or Amino Acid Sequence (Escritório de Patente Japonesa), e outros símbolos convencionais comumente usados no campo.

[000123] O seguinte descreve a presente invenção em detalhes.

A: enzima de sintetização de diidrodaidzeína

[000124] Esta seção descreve a enzima de sintetização de diidro- daidzeína (a seguir também referida como enzima E1) em detalhes. Exceto que de outro modo descrito, explicação geral da enzima de sintetização de diidrodaidzeína é aplicada a uma enzima de sintetização da tetraidrodaidzeína e enzima de sintetização de equol, descrita posteriormente.

Polipeptídeo A-1

[000125] A presente invenção fornece um polipeptídeo (a seguir também referida como "polipeptídeo E1") para a síntese de diidro- daidzeína usando daidzeína como um substrato. Especificamente, a invenção fornece: (Aa) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1; por exemplo, a faixa é de 1 a 250, preferivelmente 1 a 200, mais preferivelmente 1 a 150, mais preferivelmente 1 a 100, mais preferivelmente 1 a 50, mais preferivelmente 1 a 30, mais preferivelmente 1 a 15, mais preferivelmente 1 a 5, também preferivelmente 1 a 4, ainda mais preferivelmente 1 a 3, e particularmente preferivelmente 1 ou 2. (Ab) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato; e (Ac) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais identidade com a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 1, e tendo uma atividade de sintetizar diidro- daidzeína usando daidzeína como um substrato.

[000126] Em polipeptídeo (Ab), a faixa de "um ou mais aminoácidos" não é particularmente limitada contanto que o polipeptídeo tenha a atividade de sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato. Exemplos de polipeptídeo (Ab) inclui um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 e um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3. Em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 contém três aminoácidos substituídos. Em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 contém dez aminoácidos substituídos. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 corresponde à enzima polipeptídeo E1 da cepa Bacteroides ovatus E-23-15 (FERM BP-6435). A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 cor-responde à enzima polipeptídeo E1 de Streptococcus constellatus A6G-225 (FERM BP-6437).

[000127] Além disso, o tipo de substituição de aminoácido em poli- peptídeo (Ab) não é particularmente limitado. Entretanto, do ponto de vista de prevenir a alteração fenotípica no polipeptídeo, é preferível que a substituição seja feita entre aminoácidos análogos. Aminoácidos análogos podem ser classificados como segue.Aminoácido aromático: Phe, Trp, Tyr Aminoácido alifático: Ala, Leu, Ile, Val Aminoácido polar : Gln, Asn Aminoácido básico: Lys, Arg, His Aminoácido acídico: Glu, Asp Aminoácidos com um grupo hidroxila: Ser, Thr Aminoácidos com uma cadeia lateral curta: Gly, Ala, Ser, Thr, Met

[000128] No polipeptídeo (Ab), é preferível que a substituição, dele- ção, inserção, ou adição de aminoácido ocorra em regiões onde a alteração de aminoácido não tenha grandes efeitos sobre as estruturas de maior ordem do polipeptídeo, ou onde a alteração não afete adversamente o centro ativo da enzima de sintetização de diidrodaidzeína. Exemplos de tais regiões incluem regiões de baixa conservação entre as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, e vizinhanças das mesmas, e a região de terminal N ou região de terminal C. Exemplos específicos incluem leucina na posição 45, asparagina na posição 80, valina na posição 167, ácido aspártico na posição 231, isoleucina na posição 233, arginina na posição 435, ácido aspártico na posição 459, valina na posição 462, arginina na posição 528, serina na posição 540, isoleucina na posição 639, na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e regiões adjacentes destes aminoácidos. Uma "região adjacente" significa regiões onde a enzima de sintetização de atividade de diidrodaidzeína não é afetada. Exemplos incluem aqueles dentro de cinco aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, preferivelmente aqueles dentro de quatro aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, mais preferivelmente aqueles dentro de três aminoáci- dos de um dos aminoácidos exemplificados, ainda mais preferivelmente aqueles dentro de dois aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, particularmente preferivelmente aqueles dentro de um ami- noácido de um dos aminoácidos exemplificados.

[000129] Em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, a sequência dos aminoácidos nas posições 112 a 116 é considerada cor- responder ao domínio de ligação NADPH. Contanto que as funções do domínio de NADPH não sejam inibidas, Pode existir substituição, dele- ção, inserção ou adição de aminoácido na sequência dos five aminoá- cidos. Na referida sequência, o número de aminoácidos mutados é preferivelmente não maior do que três, mais preferivelmente não maior do que dois, e ainda mais preferivelmente um. O mais preferido é nenhuma mutação na sequência de aminoácido. Particularmente, não existe preferivelmente nenhuma substituição, deleção, inserção ou adição dos aminoácidos nas posições 112, 115, e 116.

[000130] Histidina na posição 260 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é também considerada estar associada com o sítio de revezamento de próton. Consequentemente, contanto que as funções de sítio de revezamento de próton não sejam inibidas, a referida histi- dina pode ser substituída por outro aminoácido, porém é preferivelmente não substituída.

[000131] Em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, a sequência dos aminoácidos nas posições 343 a 363 é considerada corresponder ao motivo de feixe de Fe-S. Contanto que as funções do motivo não sejam inibidas, pode existir substituição, deleção, inserção ou adição de um aminoácido arbitrário na sequência. É entretanto preferido que cisteínas nas posições 343, 346, 350, e 363 não sejam mu- tadas. quando a sequência tenha uma ou mais substituições de ami- noácido nas posições exceto os referidos três aminoácidos, é preferido que o número de aminoácidos substituídos seja preferivelmente não maior do que quatro, mais preferivelmente não maior do que três, ainda mais preferivelmente não maior do que dois, e particularmente preferivelmente um. O mais preferido é nenhuma substituição, deleção inserção ou adição de aminoácido na sequência.

[000132] Em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, a sequência dos aminoácidos nas posições 390 a 413 é considerada cor- responder ao domínio de ligação FAD. Consequentemente, contanto que as funções do domínio não sejam inibidas, pode existir substituição, deleção, inserção ou adição de um aminoácido arbitrário na sequência. É entretanto preferido que glicinas nas posições 390, 392, e 395 não sejam mutadas. quando a sequência tem uma ou mais substituições, deleções, inserções ou adições de aminoácido, o número de aminoácidos mutados é preferivelmente não maior do que quatro, mais preferivelmente não maior do que três, ainda mais preferivelmente não maior do que dois, e particularmente preferivelmente um. O mais preferido é nenhuma mutação na sequência de aminoácido.

[000133] Em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, a sequência dos aminoácidos nas posições 512 a 540 é também considerada corresponder ao domínio de ligação FAD. Consequentemente, contanto que as funções do domínio não sejam inibidas, pode existir substituição, deleção, inserção ou adição de um aminoácido arbitrário na sequência. É entretanto preferido que glicinas nas posições 512, 514, e 517 não sejam mutadas. quando a sequência tem uma ou mais substituições, deleções, inserções ou adições de aminoácido, o número de aminoácidos mutados é preferivelmente não maior do que quatro, mais preferivelmente não maior do que três, ainda mais preferivelmente não maior do que dois, e particularmente preferivelmente um. O mais preferido é nenhuma mutação na sequência de aminoácido.

[000134] Um alinhamento, que indica as regiões de sequências de aminoácido com possíveis funções como acima descrito, é mostrado na Figura 27.

[000135] A substituição, deleção, inserção ou adição de um ou diversos aminoácidos em uma sequência de aminoácido específica é possível por técnicas conhecidas.

[000136] Em polipeptídeo (Ac), a sequência de aminoácido tem, por exemplo, 60% ou mais identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. É preferível, entretanto, que a sequência de aminoáci- do tenha geralmente 80% ou mais, preferivelmente 85% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, further preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 98% ou mais, e particularmente preferivelmente 99% ou mais identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[000137] Especificamente, polipeptídeo (Ac) pode ser um polipeptí- deo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3. A identidade de aminoácido entre a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 é de 99,5% (Blast2). A identidade de aminoácido entre a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 é de 98,6% (Blast2). Consequentemente, em uma modalidade preferida da invenção, polipeptídeo (Ac) compreende uma sequência de aminoácido tendo 98,6% ou mais, e mais preferivelmente 99,5% de identidade para a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[000138] A identidade da sequência de aminoácido pode ser calculada usando ferramentas de análise tais como, por exemplo, FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH, ou outros tipos de software disponíveis comercialmente ou através de linhas de telecomunicação (a Internet). Especificamente, uma indagação BLAST é geralmente realizada sob as seguintes condições iniciais para calcular a identidade (%) da sequência de aminoácido. BLAST 2.1 avançado: Programa: blastp Valor esperado: 10 Filtros: todos DESLIGADOS Matriz: BLOSUM62 custo de existência do Gap: 11 (default) Por custo de gap de resíduo: 1 (default) Relação lambda: 0,85 (default) Outros parâmetros (default)

[000139] Considerando polipeptídeos (Ab) e (Ac), a atividade para sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato pode ser confirmada como segue. Primeiro, um polipeptídeo de interesse é adicionado a uma solução de substrato da composição abaixo em uma concentração de 0,001 mg/mL, a solução é então incubada a 37°C durante 2 horas para checar quanto à presença ou ausência de diidro- daidzeína na solução. A presença de diidrodaidzeína na solução após incubação é usada como um indicador da atividade do polipeptídeo para sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato. Composição de Solução de Substrato tampão de fosfato de potássio a 0,1 M PMSF a 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila) ditiotreitol a 2 mM hidrosulfito de sódio a 5 mM NADPH ou NADH a 2 mM daidzeína a 40 μM PH 7,0

Propriedade de Enzima

[000140] Visto que o polipeptídeo E1 tem uma atividade de enzima para sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato, o polipeptídeo E1 é também referido como enzima E1. A enzima E1 é ativada pela presença de um agente de redução tal como Na2S2O4 e íons de metal tal como Fe2+ e Mn2+. Além disso, a enzima E1 requer NADPH or NADH como uma coenzima. A temperatura ideal da enzima E1 é em torno de 30°C, e o pH ideal é 7,0. A enzima E1 não pode apenas sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato, porém também sintetizar a daidzeína de diidrodaidzeína, como uma reação reversa.

[000141] O polipeptídeo E1 pode ser produzido pelas técnicas de engenharia genética a serem descritas posteriormente ou por isolamento e purificação de microorganismos capazes de produzí-lo. Além disso, métodos comuns de síntese química podem ser usados para produzir o polipeptídeo E1, com base na informação da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, 2, ou 3. Tais métodos de síntese química incluem métodos de síntese de peptídeo de fase líquida ou fase sólida comuns.

[000142] O seguinte descreve um método para o isolamento e purificação de polipeptídeo E1 de um microorganismo capaz de produzir o polipeptídeo E1. Primeiro, as células de um microorganismo capazes de produzir o polipeptídeo E1 são rompidas para obter um extrato cru do microorganismo. Aqui, as células podem ser rompidas por métodos usados em processos de ruptura celular comuns, tal como ruptura usando uma prensa French, um moinho celular, e outros disruptores, e sonicação em uma solução hipotônica. O extrato cru pode ser suplementado com um tampão apropriado. Quando o polipeptídeo E1 é anaerobicamente condicionado, é desejável adicionar um agente de redução adequado ao extrato cru para manter o polipeptídeo E1 ativo. Para melhorar a pureza, o extrato cru pode ser também purificado através de processos tais como precipitação de sulfato de amônio, precipitação de solvente orgânico usando etanol ou outros mais, e precipitação isoelétrica. Uma fração contendo polipeptídeo E1 pode em seguida ser obtida por submissão do extrato cru aos processos tais como cromatografia de permuta de íon, cromatografia por filtragem em gel, cromatografia hidrofóbica, vários tipos de cromatografia por afinidade, cromatografia de fase reversa, e cromatografia de coluna de hi- droxiapatita. Estes processos de cromatografia podem usar uma coluna aberta, ou HPLC pode ser usada, tal como requerido. A pureza da fração incluindo o polipeptídeo E1 pode ser facilmente estimada por visualização através de eletroforese, e particularmente, através de SDS-PAGE. A confirmação do polipeptídeo E1 é também possível através de análise da seqüência de aminoácido, espectrometria de massa usando um espectrômetro de massa tal como MALDI-TOF MS, ESI Q-TOF MS, e MALDI Q-TOF MS, e retirada de impressão digital da massa do peptídeo, por exemplo.

[000143] Aqui, o microorganismo capaz de produção do polipeptídeo E1 é preferivelmente cultivado em um meio contendo uma quantidade desejada de daidzeína (por exemplo, mas não limitado a, um meio contendo pelo menos 0,01 μg/mL de daidzeína) em termos de produção eficiente do polipeptídeo E1.

[000144] O polipeptídeo E1 pode ser monomérico, ou dimérico ou polimérico, uma vez que ele pode sintetizar diidrodaidzeína. Além disso, para melhorar a estabilidade e outras características, o polipeptí- deo E1 pode ser modificado tal como requerido, por adição de polieti- leno glicol ou uma cadeia de açúcar.

[000145] O polipeptídeo E1 pode servir como um catalisador que converte daidzeína (um substrato) em diidrodaidzeína. A diidrodaidzeí- na é também convertida ao equol por enzima de sintetização de tetrai- drodaidzeína e enzima de sintetização de equol tal como descrito abaixo . Equol acredita-se exibir várias atividades fisiológicas no corpo. A este respeito, o polipeptídeo E1, capaz de fornecimento do material para síntese de equol, é considerado importante.

A-2. Polinucleotídeo

[000146] A presente invenção também fornece um polinucleotídeo (a seguir também referido como "polinucleotídeo E1") que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato. Especificamente, a invenção fornece: (Ad) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 4; (Ae) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; e (Af) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Ad) ou (Ae), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar dii- drodaidzeína usando daidzeína como um substrato.

[000147] A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 corresponde à seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 corresponde à seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 5. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 corresponde à seqüência de aminoácido codificada pela se- qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 6.

[000148] Considerando o polinucleotídeo (Af), a frase "hibridiza-se sob condições rigorosas" descreve a hibridização entre dois fragmentos de polinucleotídeo sob condições de hibridização ordinárias tais como descrito em Sambrook e outros in Molecular Clonagem: A laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, USA. Mais especificamente, "condições rigorosas" quer dizer hi- bridização em 6,0 x SSC em cerca de 45°C, e lavagem com 2,0 x SSC em 50°C. Exemplos de (Af) polinucleotídeo incluem a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 5 e a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 6.

[000149] O "polinucleotídeo que se hibridiza sob condições rigorosas" geralmente possui acima de um certo nível de identidade com a seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo usado como uma sonda. A identidade é, por exemplo, 60% ou mais, preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, também preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, e particular- mente preferivelmente 98% ou mais. A identidade da seqüência de nu- cleotídeo pode ser calculada usando instrumentos de análise tais como, por exemplo, FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH, ou outros tipos de software disponíveis ou comercialmente ou através de linhas de telecomunicação (a Internet). Especificamente, um BLAST query é geralmente desempenhado sob as seguintes condições iniciais para calcular a identidade (%) da seqüência de nucleotídeo. BLAST 2.1 avançado: Programa: blastn Parâmetros: básico

[000150] A homologia de seqüência de base entre a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4 e a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 5 é 99,6% (Blast2). A homologia de seqüência de base entre a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4 e a seqüência de nucleotí- deo de SEQ ID NO: 6 é 97,6% (Blast2). Consequentemente, em uma modalidade preferida da invenção, um polinucleotídeo (Af) compreende uma seqüência de base possuindo 97,6% de homologia, e mais preferivelmente 99,6% de homologia à seqüência de base de SEQ ID NO: 4.

[000151] Considerando o polinucleotídeo (Af), a "atividade de sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato" pode ser confirmada pelo método usado para os polipeptídeos (Ab) e (Ac).

[000152] O polinucleotídeo E1 pode ser produzido ou obtido através de métodos de síntese de DNA química, com base na informação de seqüência de SEQ ID NOs: 4, 5, e 6. Geralmente, o polinucleotídeo E1 pode ser facilmente produzido ou obtido através de técnicas de engenharia genética comuns (veja, por exemplo, Molecular Clonagem 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); e Zoku Seikagaku Jikken Kouza, Gene Kennkyu-hou I, II, III, the Japanese Biochemical Society (1986)).

[000153] Um exemplo de tais métodos de síntese de DNA química é um método de síntese de fase sólida usando o método de fosforamidi- ta, que pode empregar um autosintetizador.

[000154] Em um exemplo específico de técnicas de engenharia genética comuns, uma biblioteca de cDNA é preparada através de um método usual de uma fonte adequada expressando o polinucleotídeo E1, e a biblioteca é analisada quanto aos clones desejados usando uma sonda adequada ou anticorpo específico ao polinucleotídeo E1 (veja, por exemplo, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)).

[000155] A fonte de cDNA não é particularmente limitada uma vez que ela é um organismo expressando o polinucleotídeo E1. Exemplos específicos incluem microorganismos capazes de produção de equol, preferivelmente bactérias de ácido lático, bactérias pertencentes aos gêneros Bacteróides e Estreptococos capazes de produção de equol, mais preferivelmente Lactococcus garvieae, Bacteroides ovatus e Streptococcus constellatus capazes de produção de equol, também preferivelmente Lactococcus garvieae fecal capazes de produção de equol, e cepa Lactococcus 20-92 particularmente preferivelmente, cepa E-23-15 de Bacteroides ovatus, A6G-225 de Streptococcus constel- latus (FERM BP-10036, FERM BP-6435, e FERM BP-6437, respectivamente; depositados com o International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan), cepas de Lactococcus garvieae fecal capazes de produção de equol.

[000156] Métodos usuals podem ser usados para procedimentos incluindo a separação de RNA total, a separação e purificação de mRNA, e a preparação e clonagem de cDNA. O método de análise da biblioteca de cDNA para um polinucleotídeo da presente invenção não é particularmente limitado, e um método usual pode ser usado. Por exemplo, os polipeptídeos produzidos de cDNA podem ser analisados por seleção dos correspondentes clones de cDNA por uma análise imunológica usando um anticorpo específico por polipeptídeo. Além disso, a análise pode ser feita através de técnicas de hibridização tais como hibridização de placa e hibridização de colônia, que usam sondas que especificamente ligam-se às seqüências de nucleotídeo alvo. Além disso, uma combinação destas diferentes técnicas pode ser usada.

[000157] Geralmente, a sonda pode ser, por exemplo, DNA quimicamente sintetizado obtido com base na informação com relação à se- qüência de nucleotídeo do polinucleotídeo E1 (por exemplo, a seqüên- cia de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4, 5, ou 6). Além disso, uma sonda usada para análise pode ser um iniciador de sentido e/ou um iniciador de antissentido designado com base na informação da seqüência de base de um polinucleotídeo da presente invenção.

[000158] O polinucleotídeo E1 pode ser adequadamente obtido pelo método de PCR (Science, 130, 1350 (1985)), ou por variantes do método de PCR, tal como um método de amplificação de DNA ou RNA. Qualquer dificuldade na análise da biblioteca para cDNA de tamanho natural pode ser evitada por uso de técnicas adequadas tais como o método de RACE (Rapid amplification of cDNA ends, Experimental Medicine, 12(6), 35 (1994)); e particularmente o método de 5'-RACE (M.A. Frohman, e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)). O método de Race e o método de 5'-RACE são úteis para obtenção do polipeptídeo E1 de eucarioto.

[000159] Os iniciadores usados para o método de PCR podem ser apropriadamente designados com base na informação de seqüência do polinucleotídeo E1. Tais iniciadores podem ser sintetizados através de um método usual. Tal como notado acima, o isolamento e purificação de fragmentos de DNA ou RNA amplificados podem ser desempenhados através de um método usual tal como eletroforese em gel e hibridização.

[000160] O polinucleotídeo E1 facilmente permite produção estável em massa do Produto polinucleotídeo (o polipeptídeo), usando técnicas de engenharia genética comuns. O isolamento bem sucedido do polinucleotídeo E1 pela presente invenção abrirá a porta para a produção industrial de equol, sem uso das cepas bacterianas anaeróbicas difíceis de manusear tradicionalmente usadas para produção de equol.

A-3. Vetor de Expressão

[000161] Um vetor de expressão da presente invenção não é particularmente limitado uma vez que ele inclui o polinucleotídeo E1 e é capaz de expressão do polinucleotídeo E1. Geralmente, ele é apropriadamente selecionado de acordo com o tipo de célula hospedeira.

[000162] Quando a célula hospedeira é a célula procariótica, o vetor de expressão pode ser, por exemplo, um vetor de plasmídeo de expressão, replicável na célula hospedeira, preparado por adição de promotores e uma seqüência de base SD (Shine-Dalgarno) a montante do polinucleotídeo para causar expressão do polinucleotídeo. Um exemplo específico é um plasmídeo de expressão usando um promotor PL, um promotor T7, e um promotor lac. Outros exemplos de vetores de expressão bacterianas preferíveis incluem plasmídeo pKK233-2 e plasmídeo pKK233-3 usando um promotor tac ou promotor trc. Estes são exemplos não limitantes, e outras cepas e vetores bacterianos conhecidos podem ser usados, também.

[000163] Quando a célula hospedeira é uma célula eucariótica, o vetor de expressão pode geralmente incluir promotores a montante do polinucleotídeo a ser expressado, e outras seqüências específicas incluindo um sítio de união de RNA, um sítio de poliadenilação, e uma seqüência de terminação de transcrição. O vetor de expressão pode também incluir uma origem de replicação. Há vários vetores eucarióti- cos bem conhecidos úteis para a inserção do polinucleotídeo. Exem- plos de tais vetores eucarióticos adequados incluem pCD e pCMV. Outros exemplos incluem pMSG e pSVL, que fazem uso de promotor tardio de MMTV ou SV40 tal como requerido. Estes não são exemplos limitantes, e vários eucariotos e vetores conhecidos podem ser usados, também.

A-4. Célula recombinante

[000164] A presente invenção fornece uma célula recombinante (transformante) transformada com um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo E1.

[000165] A célula hospedeira usada para a célula recombinante pode ser uma célula procariótica ou uma célula eucariótica.

[000166] Exemplos adequados de uma célula hospedeira procarióti- ca incluem: células procarióticas bacterianas do gênero Lactococcus, tais como bactérias de ácido lático; e células procarióticas bacterianas tais como, por exemplo, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subti- lis, Streptococcus, e Staphylococcus, que podem desenvolver-se sob condições aeróbicas.

[000167] Exemplos de uma célula eucariótica hospedeira incluem: microorganismos eucarióticos tais como levedura e Aspergillus; células de inseto tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; e células de animal e planta tais como células L, células CHA, células COS, células HeLa, células C127, células BALB/c3T3 (incluindo cepas mutantes desprovidas de diidrofolato redutase ou timidina cinase), células BHK21, células HEK293, células de melanoma de Bowes, e ovócitos.

[000168] O método usado para introduzir o vetor de expressão na célula hospedeira não é particularmente limitado, e uma variedade de métodos comuns pode ser usada. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira de acordo com os métodos de muitos manuais de laboratório padrões, incluindo, por exemplo, Davis e outros, Basic Methods in Molecular Biology, 1986, e Sambrook e outros, Molecular Clonagem: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.Exemplos específicos incluem transfecção de fosfato de cálcio, trans- fecção mediada por DEAE-dextrana, transvecção, microinjeção, trans- fecção mediada por lipídeo catiônico, eletroporação, transdução, carga de raspadura, introdução balística, e infecção.

[000169] Porque a célula recombinante é capaz de produzir o poli- peptídeo E1 (uma enzima conversora de diidrodaidzeína), ela pode ser usada para produzir uma enzima conversora de diidrodaidzeína. A célula recombinante pode também ser usada para produzir diidrodaidze- ína em uma forma celular.

A-5. Produção de Polipeptídeo usando Célula Recombinante

[000170] O polipeptídeo E1 pode ser produzido pela cultura de uma célula recombinante na qual o polinucleotídeo E1 é introduzido e coleta do polipeptídeo E1 da célula e cultura.

[000171] A cultura pode ser subcultura ou cultura em batelada usando um meio adequado para o hospedeiro. As células podem ser cultivadas até que uma quantidade adequada do polipeptídeo E1 seja obtida, usando o nível do polipeptídeo E1 dentro e fora das células re- combinantes como um índice.

[000172] O meio de cultura pode ser apropriadamente selecionado de meios comuns de acordo com o tipo de célula hospedeira usada. A cultura pode ser incubada sob condições de desenvolvimento adequadas para a célula hospedeira.

[000173] O polipeptídeo E1 resultante pode ser opcionalmente separado e purificado através de vários tipos de técnicas de separação utilizando as propriedades físicas e químicas do polipeptídeo E1 (veja, por exemplo, Biochemistry Data Book II, pp. 1175-1259, primeira edição, primeira publiação, 23 de junho de 1980, Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.; Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); e Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)). Especificamente, o polipeptídeo E1 pode ser separado e purificado, por exemplo, como no "método para isolamento e purificação do polipeptídeo E1 de microorganismos capazes de produção do poli- peptídeo E1" descrito ns Seção A-1 sob o título "Polipeptídeo".

A-6. Produção de Diidrodaidzeína usando polipeptídeo E1

[000174] A presente invenção fornece um processo para produzir diidrodaidzeína usando polipeptídeo E1. No processo de produção, a daidzeína pode ser convertida em diidrodaidzeína tendo o polipeptídeo E1 agindo sobre a daidzeína na presença de NADPH e/ou NADH. De preferência, a daidzeína pode ser convertida em diidrodaidzeína tendo o polipeptídeo E1 agindo sobre a daidzeína na presença de NADPH.

[000175] Uma vez que a enzima de sintetização da atividade de dii- drodaidzeína do polipeptídeo E1 é ativada pela presença de Mn2+ e Fe2+, o peptídeo E1 deve preferivelmente ter o polipeptídeo E1 agindo sobre a daidzeína na presença de Mn2+ e/ou Fe2+. A concentração de Mn2+ e/ou Fe2+ em uma solução de reação não é particularmente limitada uma vez que a atividade de enzima do polipeptídeo E1 pode ser ativada. Uma concentração de Fe2+ é preferivelmente 2 mM e mais, mais preferivelmente 2mM a 100 mM, mais preferivelmente 10 mM a 40 mM. A concentração de Mn2+ é preferivelmente 0,2 μM e mais, mais preferivelmente, mais preferivelmente 0,2 μM a 100 mM e ainda mais preferivelmente 1,0 μM a 40 mM.

[000176] A reação usada no processo de produção pode ser desempenhada em um tampão adequado. Exemplos de tais tampões adequados incluem tampão de fosfato, tampão de carbonato, tampão de acetato, tampão de Tris, e tampão de borato. A condição de pH de uma reação pode ser adequadamente selecionada a fim de não inati- var a atividade de enzima desejada do polipeptídeo E1. Por exemplo, a reação pode ser desempenhada em uma faixa de pH de preferivelmente 5,0 a 10,0, e mais preferivelmente 6,0 a 8,0.

[000177] Na reação, uma quantidade apropriada de inibidor de protease tal como PMSF ou EDTA pode ser adicionada tal como requerido. Além disso, considerando que o polipeptídeo deriva de bactérias anae- róbicas, uma quantidade apropriada de agente de redução, tal como DTT, 2ME, DET, e Na2S2O4 pode ser adicionada também.

[000178] A reação usada no processo de produção é desempenhada sob tais condições em que, por exemplo, cada componente é adicionado em um meio nas faixas de concentração mostradas abaixo no início da reação a fim de preparar uma mistura. A mistura é incubada durante 0,5 a 10 horas, preferivelmente 1 a 6 horas, e mais preferivelmente 2 a 4 horas em temperaturas de 20 a 45°C, preferivelmente 25 a 40°C, e mais preferivelmente 30 a 38°C. A concentração inicial de cada componente são como segue:

[000179] O conteúdo de polipeptídeo é 0,0001 a 1,0 % em peso, pre-ferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,01 % em peso;

[000180] O conteúdo de daidzeína é 0,0001 a 10,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 1,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso;

[000181] O teor de NADPH e/ou NADH é 0,01 a 5 % em peso, preferivelmente 0,05 a 1% em peso, e mais preferivelmente 0,1 a 0,5 % em peso.

[000182] A presente invenção também fornece uma mistura de material para a síntese de diidrodaidzeína, especificamente, uma composição para sintetização de diidrodaidzeína incluindo (Ai) polipeptídeo E1, (Aii) NADPH e/ou NADH, e (Aiii) daidzeína. Adicionalmente, a presente invenção fornece uma mistura de material para a síntese de diidro- daidzeína, especificamente uma composição de material de síntese de diidrodaidzeína incluindo (Ai) polipeptídeo E1, (Aii) NADPH e/ou NADH, (Aiii) daidzeína, e (Aiv) Mn2+ e/ou Fe2+. Por incubação da composição sob as condições acima mencionadas, a daidzeína contida na composição pode ser convertida à diidrodaidzeína. A composição de material de síntese corresponde à mistura de material acima mencionada usada para iniciar uma reação para produzir diidrodaidzeína. Além disso, as concentrações do polipeptídeo E1, NADPH e/ou NADH, e daidzeína na composição, e outros componentes que podem ser adicionados à composição de material de partida de síntese são essencialmente como em um sistema de reação (uma mistura de materiais de partida no início da reação) usado no processo de produção acima mencionado.

[000183] A presente invenção também fornece um kit para sintetização de diidrodaidzeína, especificamente, um kit de síntese de diidro- daidzeína incluindo (Ai) polipeptídeo E1, (Aii) NADPH e/ou NADH, e (Aiii) daidzeína. Adicionalmente, a presente invenção fornece um kit para sintetização de diidrodaidzeína, especificamente um kit de síntese de diidrodaidzeína incluindo (Ai) polipeptídeo E1, (Aii) NADPH e/ou NADH, (Aiii) daidzeína, e (Aiv) Mn2+ e/ou Fe2+. Os componentes podem opcionalmente ser armazenados separadamente no kit de síntese a fim de convenientemente permitir a síntese de diidrodaidzeína da daidzeína sob as condições anteriores. O kit de síntese pode também incluir um tampão tal como requerido. Um kit de síntese pode também incluir quaisquer instrumentos necessários ou manuais de operação que ajudam a desempenhar a síntese de diidrodaidzeína.

A-7. Composição de enzima de sintetização de diidrodaidzeína

[000184] A presente invenção também fornece uma enzima de sintetização da composição de diidrodaidzeína incluindo o polipeptídeo E1. Uma composição de enzima pode ser adequadamente usada como uma enzima de sintetização de diidrodaidzeína no processo de produção de diidrodaidzeína usando polipeptídeo E1.

[000185] A composição de enzima pode ser um polipeptídeo E1 purificado cru, ou uma composição de enzima pode ser um polipeptídeo E1 purificado cru ou purificado formulado com um suporte adequado.

[000186] A proporção do polipeptídeo E1 em uma composição de enzima não é particularmente limitada uma vez que a composição pode ser usada como uma enzima de sintetização de diidrodaidzeína no processo de produção de diidrodaidzeína. Especificamente, o teor de polipeptídeo E1 é, por exemplo, 0,001 a 20,0 % em peso, preferivelmente 0,005 a 5,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,01 a 1,0 % em peso, com respeito ao total de uma composição de enzima.

[000187] A composição de enzima pode incluir NADPH e/ou NADH, que agem como uma coenzima do polipeptídeo E1. Quando contida em uma composição de enzima, a proporção de NADPH e/ou NADH, embora não particularmente limitada, é 0,0005 a 25,0 % em peso, preferivelmente 0,005 a 5,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,01 a 2,5 % em peso, com respeito ao total de uma composição de enzima.

[000188] Além do mais, em uma modalidade preferível, uma composição de enzima pode incluir Mn2+ e/ou Fe2+. Quando contida em uma composição de enzima, a proporção de Mn2+ e/ou Fe2+ não é particu-larmente limitada uma vez que a enzima de sintetização de atividade de diidrodaidzeína do polipeptídeo E1 pode ser ativada. A proporção de Fe2+ é preferivelmente 2mM ou mais, mais preferivelmente 2 mM a 100 mM, e ainda mais preferivelmente 10 mM a 40 mM com respeito ao total da composição. A proporção de Mn2+ é preferivelmente 0,2 μM ou mais, mais preferivelmente 0,2 μM a 100 mM, e ainda mais preferivelmente 1,0 μM a 40 mM com respeito ao total da composição.

[000189] Para melhorar a estabilidade do polipeptídeo, uma composição de enzima pode também incluir antioxidantes tais como sulfito, ácido ascórbico, a-tocoferol, e cisteína, além do polipeptídeo E1. Além disso, para assegurar a preservabilidade de uma composição de enzima, uma composição de enzima pode incluir preservativos tais como p-hidroxibenzoatos, clorobutanol, álcool de benzila, álcool de 2- feniletila, ácido desidroacético, e ácido sórbico, tal como requerido.

A-8. Processo de Produção de diidrodaidzeína usando Célula Recombinante

[000190] A presente invenção fornece um processo de produção de diidrodaidzeína usando células recombinantes incluindo o polinucleotí- deo E1. Especificamente, no processo de produção, a daidzeína é convertida em diidrodaidzeína tendo a célula recombinante agindo sobre a daidzeína.

[000191] A reação usada no processo de produção é desempenhada em condições que permitem a célula recombinante sobreviver, e a daidzeína ser convertida em diidrodaidzeína.

[000192] Especificamente, quantidades apropriadas de células re- combinantes e daidzeína são adicionadas e cultivadas em um meio que permite desenvolvimento das células recombinantes.

[000193] O meio usado no processo de produção é adequadamente selecionado de vários tipos de meios convencionais de acordo com o tipo da célula usado como a célula recombinante hospedeira.

[000194] O meio pode ser suplementado com quantidades apropriadas de inibidores de protease tais como PMSF e EDTA, tal como requerido. Além disso, considerando que o polipeptídeo deriva de bactérias anaeróbicas, quantidades apropriadas de agentes de redução tais como DTT, 2ME, DET, e Na2S2O4 podem também ser adicionadas. Quando usando uma célula recombinante, o meio pode ser suplementado com NADPH e/ou NADH tal como requerido, embora ele não seja essencial. Além do mais, o meio pode ser suplementado com Mn2+ e/ou Fe2+.

[000195] Especificamente, o processo de produção é desempenhado como segue. Primeiro, as células recombinantes são inoculadas em meio contendo 0,001 a 1% em peso, preferivelmente 0,01 a 1% em peso, e mais preferivelmente 0,01 a 0,5 % em peso de daidzeína, e a cultura é incubada sob condições de temperatura permissivas durante 6 a 30 horas, preferivelmente 7 a 24 horas, e mais preferivelmente 7 a 18 horas.

[000196] A presente invenção também fornece uma mistura de material para a sintetização de diidrodaidzeína, especificamente, uma composição de material de síntese de diidrodaidzeína contendo (Aiv) a célula recombinante e (Aiii) daidzeína. Por cultivo da composição de material de síntese sob as condições acima mencionadas, a diidrodaidze- ína na composição pode ser convertida à diidrodaidzeína. A composição corresponde à mistura de material de partida acima mencionada usada para iniciar uma reação para produzir diidrodaidzeína. Além disso, as concentrações da célula recombinante e daidzeína na composição, e outros componentes que podem ser adicionados a uma composição de material de partida de síntese, são essencialmente como nas condições usadas no processo de produção antecedente.

[000197] A presente invenção também fornece um kit para sintetização de diidrodaidzeína, especificamente, um kit de síntese de diidro- daidzeína incluindo (Aiv) a célula recombinante e (Aiii) daidzeína. Adicionalmente, a presente invenção fornece um kit para sintetização de diidrodaidzeína, especificamente um kit de síntese de diidrodaidzeína incluindo (Aiv) a célula recombinante, (Aiii) daidzeína, e (Aiv) Mn2+ e/ou Fe2+. O kit de síntese pode incluir a célula recombinante e daidzeína separadamente tal como requerido, a fim de convenientemente permitir síntese de diidrodaidzeína de daidzeína sob as condições acima mencionadas. O kit de síntese pode também incluir um tampão ou um meio, tal como requerido. O kit de síntese pode também incluir quaisquer instrumentos necessários ou manuais de operação que ajudam desempenhar síntese de diidrodaidzeína.

[000198] As células recombinantes incluídas no kit de síntese podem ser preservadas neste através de métodos conhecidos. Há várias téc- nicas de preservação de célula recombinante conhecidas. Por exemplo, há um método no qual as células recombinantes são preservadas em 4 a 25°C depois de serem tratadas com um liofilizador para evacuar uma ampola armazenando as células recombinantes em um solvente tal como dimetilformamida. Outro exemplo é um método de nitrogênio líquido, no qual as células são suspensas em um meio de preservação suplementado com glicerol a 10%, que é em seguida armazenado em uma ampola específica e mantido em um tanque de nitrogênio líquido (em -150 a -196°C).

A-9. Anticorpo Possuindo Afinidade ao polipeptídeo

[000199] A presente invenção também fornece um anticorpo (um anticorpo de IgG) possuindo afinidade ao polipeptídeo E1.

[000200] O anticorpo monoclonal pode ser preparado através de um método usual. Especificamente, o método descrito em Harlow, H. e Lane, D. em Antibody: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Nova Iorque, pp. 139-240 (1988) pode ser usado.

[000201] O anticorpo policlonal pode também ser preparado através de um método usual. Especificamente, o método descrito em, por exemplo, Cell Engineering Experiment Protocol, Department of Oncology, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, 1992, pp. 155-173, pode ser usado.

[000202] O anticorpo de IgG policlonal e o anticorpo de IgG monoclonal podem ser purificados através de métodos comuns, tais como um método de precipitação de amônio de ácido sulfúrico, e cromato- grafia de proteína A.

A-10. Método Imunológico para a Detecção ou Medição do polipeptídeo

[000203] A presente invenção também fornece um método imunoló- gico para detectar ou medir o polipeptídeo E1 usando o anticorpo. Especificamente, o método imunológico é desempenhado tendo o anti- corpo estando em contato com a amostra de teste. Mais especificamente, o polipeptídeo na amostra de teste pode ser detectado ou medido como segue. Primeiro, o anticorpo é estabelecido estar em contato com a amostra de teste para checar quanto à presença do polipep- tídeo E1 na amostra de teste. Se presente, o anticorpo especificamente liga-se ao polipeptídeo E1. Em seguida, o anticorpo ligado ao poli- peptídeo E1 é detectado e opcionalmente quantificado.

[000204] Aqui, a amostra de teste é uma amostra usada para a detecção ou medição do polipeptídeo E1. Porque o polipeptídeo E1 espera-se existir em células procarióticas bacterianas, o método imuno- lógico é adequado para a detecção e medição do polipeptídeo E1 residente em células procarióticas bacterianas. Na detecção e medição do polipeptídeo E1 na célula, a amostra de teste pode ser preparada de células rompidas, ou células submetidas à purificação de proteína depois da ruptura.

[000205] Técnicas para detectar ou medir um polipeptídeo alvo pelo método imunológico usando o anticorpo são conhecidas, e seria óbvio para o técnico versado apropriadamente estabelecer várias condições adequadas para o método imunológico. Por exemplo, os métodos tais como radioimunoensaio e ELISA podem ser usados sob condições apropriadamente estabelecidas.

[000206] A presente invenção também fornece um kit de detecção imunológica incluindo o anticorpo, usado para a detecção ou medição do polipeptídeo E1. O kit de detecção pode também incluir um polipep- tídeo E1 padrão, tal como requerido. Um kit de detecção pode também incluir, tal como requerido, os reagentes adicionais que facilitam a fácil detecção do polipeptídeo E1 sob as condições anteriores. O kit de detecção pode também incluir quaisquer instrumentos necessários ou manuais de operação que facilitem fácil detecção do polipeptídeo E1.

A-11. Método para Detecção ou Medição de Polinucleotídeo que Codi-fica o polipeptídeo

[000207] A presente invenção também fornece um método para detectar ou medir o polinucleotídeo E1. Especificamente, o método é desempenhado fazendo com que uma sonda de ligação do polinucleotí- deo E1 esteja em contato com a amostra de teste. Para ser mais específico, o polinucleotídeo E1 na amostra de teste pode ser detectado ou medido como segue. Primeiro, a sonda é estabelecida estar em contato com a amostra de teste para hibridizar-se com a amostra de teste, que ocorre quando o polinucleotídeo E1 está presente na amostra de teste. Em seguida, a presença ou ausência do filamento duplo é detectada, e o filamento duplo, se presente, é opcionalmente quantificado.

[000208] Aqui, a amostra de teste é uma amostra usada para a detecção ou medição do polinucleotídeo E1. Porque o polinucleotídeo E1 espera-se existir em células procarióticas bacterianas, o método é adequado para a detecção e medição do polinucleotídeo E1 residente em células procarióticas bacterianas. Na detecção e medição do poli- nucleotídeo E1 na célula, a amostra de teste pode ser preparada das células rompidas, ou células submetidas à purificação de ácido nucléi- co depois da ruptura.

[000209] A sonda usada no método possui uma seqüência de nucle- otídeo que pode hibridizar-se com o polinucleotídeo sob condições rigorosas. Tal como usado aqui, "condições rigorosas" descrevem, por exemplo, condições comuns às sondas e iniciadores, e especificamente, condições descritas na Seção A-2 acima.

[000210] A sonda pode ser quimicamente sintetizada com base na informação com relação à seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo E1 (por exemplo, a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4, 5, ou 6), ou pode ser um polinucleotídeo E1 previamente produzido ou um fragmento do polinucleotídeo E1. A sonda pode ser rotulada ou não rotulada, embora sondas rotuladas sejam geralmente usadas. Além disso, quando a sonda é usada como um iniciador de PCR (um iniciador de sentido ou um iniciador de antissentido), um tamanho de sonda é, por exemplo, cerca de 10 a 40 nucleotídeos, e preferivelmente cerca de 20 a 30 nucleotídeos.

[000211] Exemplos de métodos para especificamente detectar o po- linucleotídeo incluem: hibridização de placa, hibridização de colônia, manchamento do Sul, manchamento do Norte, e o método de PCR. Do ponto de vista da sensibilidade, um método de PCR que usa as sondas como iniciadores para amplificar parte do ou a totalidade do polinucleotídeo E1 é preferivelmente usado.

[000212] O método de PCR pode ser, por exemplo, método de RT- PCR, ou vários tipos de métodos variantes usados na técnica. O método de PCR pode ser usado testar a presença e a quantidade do poli- nucleotídeo E1. Exemplos de tais métodos de PCR incluem um ensaio competitivo tal como MSSA (Kinoshita, M., e outros, CCA, 228, 83-90 (1994)), e o método de PCR-SSCP, que é um método conhecido de detecção de mutações com base nas mudanças na mobilidade de DNA de filamento único devido às diferentes estruturas de ordem elevada (Orita, M., e outros, Genomics, 5, 874-879 (1989)).

[000213] A presente invenção também fornece um kit para detecção ou medição do polinucleotídeo E1, especificamente um kit de detecção do polinucleotídeo E1 incluindo a sonda. Para facilidade da detecção do polinucleotídeo E1 sob as condições acima mencionadas, o kit de detecção pode incluir reagentes adicionais ou outros mais tal como requerido, além da sonda. Além disso, o kit de detecção pode ser usado para identificar células contendo o polinucleotídeo E1. Do ponto de vista da permissão de detecção acurada, o kit de detecção pode preferivelmente ser fornecido como um kit para desempenho de detecção usando PCR.

B. Enzima de Sintetização de Tetraidrodaidzeína B-1. Polipeptídeo

[000214] A presente invenção fornece um polipeptídeo (a seguir também referido como "polipeptídeo E2") para a síntese de tetraidro- daidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato. Especificamente, a invenção fornece: (Ba) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7; (Bb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato; e (Bc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, e tendo uma atividade de sintetizar te- traidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[000215] No polipeptídeo (Bb), a faixa de "um ou mais aminoácidos" não é particularmente limitada uma vez que o polipeptídeo possui a atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato. Por exemplo, a faixa é de 1 a 50, preferivelmente 1 a 30, mais preferivelmente 1 a 15, mais preferivelmente 1 a 5, também preferivelmente 1 a 4, ainda mais preferivelmente 1 a 3, e particularmente preferivelmente 1 ou 2.

[000216] Exemplos de (Bb) polipeptídeo inclui um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 e um polipeptí- deo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. Em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 contém dois aminoácidos substituídos e uma seqüência de aminoácido possuindo 24 aminoáci- dos no terminal N. Em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 con tém 20 aminoácidos substituídos e perde 1 aminoácido. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 corresponde ao polipeptídeo de enzima E2 da cepa E-23-15 de Bacteroides ovatus (FERM BP-6435). A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 corresponde ao polipeptí- deo de enzima E2 de A6G-225 de Streptococcus constellatus (FERM BP-6437).

[000217] No (Bb) polipeptídeo, a substituição, deleção, inserção, ou adição de aminoácido pode ser feita como na substituição, deleção, inserção, ou adição de aminoácido no polipeptídeo E1 descrito na Seção A-1. É preferível que a substituição, deleção, inserção, ou adição de aminoácido no polipeptídeo (Bb) seja em regiões onde a mudança de aminoácido não tenha grande efeitos nas estruturas de ordem elevada do polipeptídeo, ou onde a mudança não adversamente afete o centro ativo de uma enzima de sintetização de tetraidrodaidzeína. Exemplos de tais regiões incluem regiões fracamente conservadas entre as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 7, 8, e 9, e vizinhanças destas, e a região de terminal de N ou região de terminal C. Exemplos específicos incluem valina na posição 7, prolina na posição 8, valina na posição 26, leucina na posição 36, arginina na posição 46, ácido aspártico na posição 94, ácido glutâmico na posição 101, glicina na posição 126, isoleucina na posição 137, glutamina na posição 156, lisina na posição 157, ácido aspártico na posição 159, alanina nas posições 160 e 171, cisteína na posição 185, serina na posição 221, ala- nina na posição 233, valina na posição 241, serina na posição 258, isoleucina na posição 266, e valina na posição 286, na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; e regiões adjacentes destes aminoáci- dos. A "região adjacente" quer dizer regiões onde a enzima de sintetização da atividade de tetraidrodaidzeína não é afetada. Exemplos das referidas regiões incluem aminoácidos dentro de cinco aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, preferivelmente aqueles dentro de quatro aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, mais preferivelmente aqueles dentro de três aminoácidos de um dos amino- ácidos exemplificados, ainda mais preferivelmente aqueles dentro de dois aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, e particularmente preferivelmente um aminoácido de um dos aminoácidos exemplificados.

[000218] Na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, a seqüên- cia dos aminoácidos nas posições 38 a 45 é considerada corresponder ao domínio de ligação de NADPH. Consequentemente, uma vez que as funções do domínio não são inibidas, pode haver substituição, de- leção, inserção, ou adição de um aminoácido arbitrário na seqüência. É entretanto preferido que treonina na posição 38, glicina na posição 39, glicina na posição 43, e glicina na posição 45 não sejam mutados. Quando a seqüência contém uma ou mais substituições, deleções, inserções, ou adições de aminoácido, o número de aminoácidos muta- dos é preferivelmente não mais do que quatro, mais preferivelmente não mais do que três, ainda mais preferivelmente não mais do que dois, e mais preferivelmente um.

[000219] Na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, a seqüên- cia dos aminoácidos nas posições 115 a 118 é considerada corresponder ao motivo altamente conservado entre a família de SDR. Quando a seqüência contém uma ou mais substituições, deleções, inserções, ou adições de aminoácido na seqüência, o número de aminoácidos muta- dos é preferivelmente não mais do que três, mais preferivelmente não mais do que dois, e ainda mais preferivelmente um. Mais preferido é nenhuma mutação na seqüência.

[000220] Na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, serina na posição 168, histidina na posição 182, e lisina na posição 186 considera-se serem associadas com o centro de atividade da enzima E2. Consequentemente, uma vez que a atividade de enzima não é inibida, os três aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos arbitrários. É entretanto preferido que estes aminoácidos não sejam mutados.

[000221] Na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, a seqüên- cia dos aminoácidos nas posições 212 a 217 é considerada ser associada com ligação aos cofatores. Consequentemente, uma vez que a função não é inibida, pode haver substituição, deleção, inserção, ou adição de um aminoácido arbitrário na seqüência. É entretanto preferido que a prolina na posição 212, glicina na posição 213, e treonina na posição 217 não sejam mutados. Quando a seqüência contém uma ou mais substituições, deleções, inserções, ou adições de aminoácido, o número de aminoácidos mutados é preferivelmente não mais do que três, mais preferivelmente não mais do que dois, e ainda mais preferi-velmente um. Particularmente preferido é nenhuma mutação na se- qüência. Um alinhamento, que indica as regiões de sequências de aminoácido com funções possíveis tal como acima descrito, é mostrado na Fig. 28.

[000222] No polipeptídeo (Bc), a seqüência de aminoácido possui, por exemplo, 60% ou mais de identidade com a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7. É preferível, entretanto, que a seqüência de aminoácido possua geralmente 80% ou mais, preferivelmente 85% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, também preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 98% ou mais, e particularmente preferivelmente 99% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7.

[000223] Especificamente, o (Bc) polipeptídeo pode ser um polipep- tídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. A identidade entre a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 é 99,3% (Blast2). A identi- dade entre a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é 93,0% (Blast 2). Consequentemente, em uma modalidade preferida da invenção, o (Bc) polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido possuindo 93,0% ou mais, e mais preferivelmente 99,3% de identidade à sequência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 7.

[000224] Considerando os polipeptídeos (Bb) e (Bc), a atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato pode ser confirmada como segue. Primeiro, um polipeptídeo de interesse é adicionado a uma solução de substrato da composição abaixo em uma concentração de 0,001 mg/mL. A solução é em seguida incubada em 37°C durante 2 horas para checar quanto à presença ou ausência de tetraidrodaidzeína em uma solução. A presença de tetraidro- daidzeína em uma solução depois de incubação é usada como um indicador da atividade de polipeptídeo para sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato. Composição de Solução de Substrato tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0) PMSF a 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila) ditiotreitol a 2 mM hidrossulfito de sódio a 5 mM NADPH a 2 mM NADH a 2 mM diidrodaidzeína a 40 μM

Propriedade da Enzima

[000225] Uma vez que o polipeptídeo E2 possui uma atividade de enzima para sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato, o polipeptídeo E2 é também referido como enzima E2. A enzima E2 requer NADPH ou NADH como uma coenzima. A temperatura ideal da enzima E2 é na vizinhança de 37°C, e o pH ideal é 4,5. A enzima E2 pode não apenas sintetizar tetraidrodaidzeína usando dii- drodaidzeína como um substrato, porém também sintetizar diidro- daidzeína de tetraidrodaidzeína, como uma reação reversa.

[000226] Similarmente ao polipeptídeo E1, o polipeptídeo E2 pode ser produzido pelas técnicas de engenharia genética com base na informação da seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 10, 11, ou 12. Além disso, métodos de síntese química comuns podem ser usados para produzir o polipeptídeo E2, com base na informação da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, 8, ou 9. O polipeptídeo E2 pode também ser produzido pelo isolamento e purificação de microorganismos capazes de produzí-lo. Estes métodos podem ser desempenhados de acordo com a descrição na seção anterior A-1.

[000227] O microorganismo capaz de produção de polipeptídeo E2 pode ser cultivado em um meio contendo uma quantidade desejada de diidrodaidzeína, e adicionalmente, daidzeína. O polipeptídeo E2 pode também ser produzido deste modo em microorganismos capazes de produzir o polipeptídeo E2.

[000228] O polipeptídeo E2 pode ser monomérico, ou dimérico ou polimérico, uma vez que ele pode sintetizar tetraidrodaidzeína. Além disso, para melhorar a estabilidade e outras características, o polipep- tídeo E2 pode ser modificado tal como requerido, pela adição de polie- tileno glicol ou uma cadeia de açúcar.

[000229] O polipeptídeo E2 pode servir como um catalisador que converte a diidrodaidzeína (um substrato) em tetraidrodaidzeína. A te- traidrodaidzeína é também convertida em equol por enzima de sintetização de equol tal como descrito abaixo. Equol acredita-se exibir várias atividades fisiológicas no corpo. A este respeito, o polipeptídeo E2, capaz de fornecimento de um material de partida de síntese de equol, é considerado importante. A presente invenção por esse motivo fornece uma enzima de sintetização da tetraidrodaidzeína incluindo quais-quer dos polipeptídeos (Ba) a (Bc).

B-2. Polinucleotídeo

[000230] A presente invenção também fornece um polinucleotídeo (a seguir também referido como "polinucleotídeo E2") que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato. Especificamente, a invenção fornece: (Bd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 10; (Be) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; e (Bf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Bd) ou (Be), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar te- traidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[000231] A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 corresponde à seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 10. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 corresponde à seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 corresponde à seqüência de aminoácido codificada pela se- qüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 12.

[000232] Considerando o polinucleotídeo (Bf), a frase "hibridiza-se sob condições rigorosas" é sinônimo da frase "hibridiza-se sob condições rigorosas" na Seção A-2. Exemplos de polinucleotídeo (Bf) incluem a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11 e a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 12. A homologia de seqüência de base entre a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 10 e a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11 é 99,7% (Blast2). A homologia de se- qüência de base entre a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 10 e a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 12 é 91,0% (Blast2). Consequentemente, em uma modalidade preferida da invenção, um polinucleotídeo (Bf) compreende a seqüência de base possuindo 91,0% de homologia, e mais preferivelmente 99,7% de homologia à seqüência de base de SEQ ID NO: 10.

[000233] Considerando o polinucleotídeo (Bf), a "atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato" pode ser confirmada pelo mesmo método usado para polipeptídeos (Bb) e (Bc).

[000234] O polinucleotídeo E2 pode ser produzido ou obtido pelos métodos de síntese química ou técnicas de engenharia genética, com base na informação de seqüência de SEQ ID NO: 10, 11, ou 12. Especificamente, os métodos descritos para o polinucleotídeo E1 na Seção A-2 podem ser empregados. O método pode ser modificado ou mudado, tal como requerido.

[000235] A fonte de cDNA de polinucleotídeo E2 não é particularmente limitada uma vez que ela é um microorganismo expressando o poli- nucleotídeo E2. Exemplos específicos incluem microorganismos capazes de produção de equol, preferivelmente bactérias de ácido lático, bactérias pertencentes aos gêneros Bacteróides e Estreptococos capazes de produção de equol, mais preferivelmente Lactococcus gar- vieae, Bacteroides ovatus e Streptococcus constellatus capazes de produção de equol, também preferivelmente Lactococcus garvieae fecal capaz de produção de equol, e particularmente preferivelmente cepa 20-92 de Lactococcus, cepa E-23-15 de Bacteroides ovatus, A6G- 225 de Streptococcus constellatus (FERM BP-10036, FERM BP-6435, e FERM BP-6437, respectivamente; depositados com a International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan), cepas de Lactococcus garvieae fecal capazes de produção de equol.

[000236] Expressão de polinucleotídeo E2 usando técnicas de engenharia genética comuns facilmente permite produção estável em massa do Produto de polinucleotídeo (o polipeptídeo). O isolamento bem sucedido de polinucleotídeo E2 pela presente invenção abrirá a porta para a produção industrial de equol, sem uso das cepas bacterianas anaeróbicas difíceis de manusear tradicionalmente usadas para produção de equol.

B-3. Vetor de Expressão

[000237] Um vetor de expressão da presente invenção não é particularmente limitado uma vez que ele inclui o polinucleotídeo E2 e é capaz de expressar o polinucleotídeo E2. Geralmente, ele é apropriadamente selecionado de acordo com o tipo de célula hospedeira, similar ao vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo E1. Especificamente, a célula hospedeira descrita na Seção A-3 pode ser usada.

B-4. Célula Recombinante

[000238] A presente invenção fornece uma célula recombinante (transformante) transformada com um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo E2. A célula hospedeira usada para a célula recombi- nante pode ser aquelas descritas na Seção A-4, sem limitação. Além disso, o vetor de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira pelo método descrito na Seção A-4.

[000239] Porque a célula recombinante é capaz de produção de poli- peptídeo E2 (uma enzima conversora de tetraidrodaidzeína), ela pode ser usada para produzir uma enzima conversora de tetraidrodaidzeína. A célula recombinante pode também ser usada para produzir tetraidro- daidzeína em uma forma celular.

B-5. Produção de Polipeptídeo usando Célula Recombinante

[000240] O polipeptídeo E2 pode ser produzido pela cultura de uma célula recombinante na qual o polinucleotídeo E2 é introduzido e coleta do polipeptídeo E2 da célula e cultura. As células recombinants podem ser cultivadas de acordo com a descrição da Seção A-5.

B-6. Produção de Tetraidrodaidzeína usando o polipeptídeo E2

[000241] A presente invenção fornece um processo para produzir tetraidrodaidzeína usando o polipeptídeo E2. No processo de produção, a diidrodaidzeína pode ser convertida em tetraidrodaidzeína tendo o polipeptídeo E2 agindo sobre diidrodaidzeína na presença de NADPH e/ou NADH.

[000242] A reação usada no processo de produção pode ser desempenhada em um tampão adequado tal como aquele descrito na Seção A-6.

[000243] A reação usada no processo de produção é desempenhada sob tais condições em que, por exemplo, cada componente é adicionado em um meio nas faixas de concentração mostradas abaixo no início da reação a fim de preparar uma mistura. A mistura é incubada durante 0,5 a 10 horas, preferivelmente 1 a 6 horas, e mais preferivelmente 2 a 4 horas em temperaturas que não alterem ou inativem os materiais de partida, incluindo o polipeptídeo E2 e a diidrodaidzeína, e o produto, incluindo tetraidrodaidzeína. A temperatura reacional não é particularmente limitada. Por exemplo, quando a temperatura reacional é 0°C ou menor, a reação usa, por exemplo, um tampão que não congela em tais temperaturas de reação. A temperatura reacional é, por exemplo, preferivelmente 0 a 45°C, e mais preferivelmente 0 a 37°C. Considerando a tetraidrodaidzeína, o composto existe em uma forma cis ou uma forma trans. Entretanto, a formação de configurações cis e trans pode ser controlada por condições de reação variáveis tais como temperatura reacional e tempo de reação. Por exemplo, uma mistura de cis- e trans-tetraidrodaidzeínas pode ser produzida por fixação da temperatura reacional a 0°C, ou a reação pode ser controlada para facilitar a forma trans fixando a temperatura reacional a 37°C.

[000244] A concentração de cada componente no processo de pro-dução acima são como segue.

[000245] O teor do polipeptídeo E2 é 0,0001 a 1,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,01 % em peso;o teor de diidrodaidzeína é 0,0001 a 10,0 % em peso, prefe-rivelmente 0,001 a 1,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso; e o teor de NADPH e/ou NADH é 0,01 a 5 % em peso, prefe-rivelmente 0,05 a 1% em peso, e mais preferivelmente 0,1 a 0,5 % em peso.

[000246] A presente invenção também fornece uma mistura de material para a síntese de tetraidrodaidzeína. Especificamente, a composição de material de síntese de tetraidrodaidzeína incluindo (Bi) polipep- tídeo E2, (Bii) NADPH e/ou NADH, e (Biii) diidrodaidzeína. Por incubação da composição sob as condições acima mencionadas, a diidro- daidzeína contida na composição de material de partida de síntese pode ser convertida para tetraidrodaidzeína. A composição corresponde à mistura de material de partida acima mencionada usada para iniciar a reação para produzir tetraidrodaidzeína. Além disso, as concentrações de polipeptídeo E2, NADPH e/ou NADH, e diidrodaidzeína na composição, e outros componentes que podem ser adicionados a composição de material de partida de síntese são essencialmente como em um sistema de reação (uma mistura de material de partida no início da reação) usado no processo de produção acima mencionado.

[000247] A presente invenção também fornece um kit para sintetizar tetraidrodaidzeína. Especificamente, um kit de síntese de tetraidro- daidzeína incluindo (Bi) polipeptídeo E2, (Bii) NADPH e/ou NADH, e (Biii) diidrodaidzeína. O kit de síntese pode incluir os componentes em compartimentos quando requerido, para convenientemente permitir a síntese de tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína sob as condições an- teriores. O kit de síntese pode também incluir um tampão quando requerido. O kit de síntese pode também incluir qualquer ferramenta ou manual de operação necessário que ajude a realizar a síntese de te- traidrodaidzeína.

B-7. Enzima de Sintetização da Composição de Tetraidrodaidzeína

[000248] A presente invenção também fornece a enzima de sintetização da composição de tetraidrodaidzeína incluindo polipeptídeo E2. A composição de enzima pode ser adequadamente usada como uma enzima de sintetização da tetraidrodaidzeína no processo de produção de tetraidrodaidzeína usando polipeptídeo E2.

[000249] A composição de enzima pode ser a polipeptídeo E2 purificado bruto, ou uma composição de enzima pode ser um polipeptídeo E2 purificado bruto ou purificado formulado com um suporte adequado. O suporte não tem qualquer efeito adverso em uma atividade de poli- peptídeo E2, e é usado em uma quantidade adequada.

[000250] A proporção de polipeptídeo E2 em uma composição de enzima não é particularmente limitada contanto que a composição possa ser usada como uma enzima de sintetização da tetraidrodaidze- ína no processo de produção de tetraidrodaidzeína. Especificamente, o conteúdo de polipeptídeo E2 é, por exemplo, 0,001 a 20,0% em peso, preferivelmente 0,005 a 5,0% em peso, e mais preferivelmente 0,01 a 1,0% em peso, com respeito ao total de uma composição de enzima.

[000251] A composição de enzima pode incluir NADPH e/ou NADH, que age como uma coenzima de polipeptídeo E2. Quando contida em uma composição de enzima, a proporção de NADPH e/ou NADH, embora não particularmente limitada, é 0,005 a 50,0% em peso, preferivelmente 0,05 a 10,0% em peso, e mais preferivelmente 0,1 a 5,0% em peso, com respeito ao total de uma composição de enzima.

[000252] Para melhorar a estabilidade do polipeptídeo e/ou para garantir a capacidade de preservação de uma composição de enzima, a composição de enzima pode também incluir vários antioxidantes e preservativos descritos na Seção A-7, além do polipeptídeo E2.

B-8. Processo de Produção de Tetraidrodaidzeína Usando Célula Re- combinante

[000253] A presente invenção fornece um processo de produção de tetraidrodaidzeína usando células recombinantes incluindo polinucleo- tídeo E2. Especificamente, no processo de produção, a diidrodaidzeí- na que é convertida em tetraidrodaidzeína tendo a célula recombinante age sobre uma diidrodaidzeína.

[000254] A reação usada no processo de produção é realizada em condições que permitem a célula recombinante sobreviver, e a diidro- daidzeína ser convertida em tetraidrodaidzeína.

[000255] Especificamente, quantidades apropriadas de células re- combinantes e diidrodaidzeína são adicionadas e cultivadas em um meio que permite o crescimento das células recombinantes.

[000256] O meio usado no processo de produção é adequadamente selecionado de vários tipos de meios convencionais de acordo com o tipo da célula usada como a célula recombinante hospedeira.

[000257] O meio pode ser suplementado com quantidades apropriadas de inibidores de protease tal como PMSF e EDTA, quando requerido. Além disso, considerando que o polipeptídeo deriva de bactérias anaeróbicas, as quantidades apropriadas de agentes de redução tais como DTT, 2ME, DET, e Na2S2O4 podem também ser adicionadas. Quando usando a célula recombinante, o meio pode ser suplementado com NADPH e/ou NADH quando requerido, embora não seja essencial.

[000258] Especificamente, o processo de produção é realizado como segue. Primeiro, as células recombinantes são inoculadas em meio contendo 0,001 a 1% em peso, preferivelmente 0,01 a 0,5% em peso, e mais preferivelmente 0,01 a 0,1 peso% de diidrodaidzeína, e a cultura é incubada sob condições de temperatura permissivas durante 7 a 30 horas, preferivelmente 15 a 24 horas, e mais preferivelmente 17 a 20 horas. Aqui, as condições de temperatura permissiva não são particularmente limitadas, e são essencialmente como na seção anterior B- 6 no título "Produção de Tetraidrodaidzeína Usando Polipeptídeo E2".

[000259] A presente invenção também fornece a mistura de material para sintetizar tetraidrodaidzeína, especificamente, uma composição de material de síntese de tetraidrodaidzeína contendo (Biv) a célula recombinante e (Biii) diidrodaidzeína. Cultivando-se a composição sob as condições acima mencionadas, a diidrodaidzeína na composição pode ser convertida para tetraidrodaidzeína. A composição corresponde à mistura de material de partida anterior usada para iniciar uma reação para produzir tetraidrodaidzeína. Além disso, as concentrações da célula recombinante e diidrodaidzeína em uma composição de material de partida de síntese, e outros componentes que podem ser adicionados a uma composição de material de partida de síntese, são essencialmente como nas condições usadas no processo de produção anterior.

[000260] A presente invenção também fornece um kit para sintetizar tetraidrodaidzeína. Especificamente, um kit de síntese de tetraidro- daidzeína incluindo (Biv) a célula recombinante e (Biii) diidrodaidzeína. O kit de síntese pode incluir a célula recombinante e diidrodaidzeína separadamente quando requerido, para convenientemente permitir a síntese de tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína sob as condições acima mencionadas. O kit de síntese pode também incluir um tampão ou um meio, quando requerido. O kit de síntese pode também incluir qualquer ferramenta ou manual de operação necessário que ajude a realizar a síntese de tetraidrodaidzeína.

[000261] As células recombinantes incluídas no kit de síntese podem ser preservadas aqui por métodos conhecidos neste por métodos conhecidos. Há várias técnicas de preservação de célula recombinante. Por exemplo, há um método no qual as células recombinantes são preservadas em 4 a 25°C após serem tratadas com um liofilizador para evacuar a ampola que armazena as células recombinantes em um solvente tal como dimetilformamida. Outro exemplo é um método de nitrogênio líquido, no qual as células são suspensas em um meio de preservação suplementado com 10% de glicerol, que é em seguida armazenado em uma ampola específica e mantido em um tanque de nitrogênio líquido (a -150 a -196°C).

B-9. Anticorpo Tendo Afinidade com o Polipeptídeo

[000262] A presente invenção também fornece um anticorpo (um anticorpo IgG) tendo afinidade com o polipeptídeo E2.

[000263] O anticorpo monoclonal e anticorpo policlonal podem ser preparados por um método usual. Especificamente, estes anticorpos podem ser preparados pelo método descrito na Seção A-9.

B-10. Método Imunológico para a Detecção ou Medição do Polipeptídeo

[000264] A presente invenção também fornece um método imunoló- gico para detectar ou medir polipeptídeo E2 usando o anticorpo. Especificamente, o método imunológico pode ser realizado de acordo com o método descrito na Seção A-10.

[000265] A presente invenção também fornece um kit de detecção imunológica incluindo o anticorpo, usado para a detecção ou medição de polipeptídeo E2. O kit de detecção pode também incluir um polipep- tídeo E2 padrão, quando requerido. O kit de detecção pode também incluir, quando requerido, reagentes adicionais que facilitam a detecção fácil de polipeptídeo E2 sob as condições anteriores. Um kit de detecção pode também incluir qualquer ferramenta ou manuais de operação necessários que facilitam a detecção de polipeptídeo E2 fácil.

B-11. Método para Detecção ou Medição de Polinucleotídeo que Codifica o Polipeptídeo

[000266] A presente invenção também fornece um método para detectar ou medir polinucleotídeo E2. Especificamente, o método é realizado tendo uma sonda de ligação de Polinucleotídeo E2 para contato com a amostra de teste, de acordo com o método descrito na Seção A-11.

[000267] A presente invenção também fornece um kit para detectar ou medir polinucleotídeo E2, especificamente um kit de detecção de polinucleotídeo E2 incluindo a sonda. Para facilidade de detecção de polinucleotídeo E2 sob as condições anteriores, o kit de detecção pode incluir reagentes adicionais ou similar quando requerido, além da sonda. Além disso, o kit de detecção pode ser usado para identificar as células contendo polinucleotídeo E2. Do ponto de vista de permitir a detecção precisa, o kit de detecção pode preferivelmente ser fornecido como um kit para realizar a detecção usando PCR.

C. Enzima de Sintetização de Equol C-1. Polipeptídeo

[000268] A presente invenção fornece um polipeptídeo (a seguir também referido como "polipeptídeo E3") para a síntese de equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato. Especificamente, A invenção fornece: (Ca) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 13; (Cb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 13 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato; e (Cc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato.

[000269] No polipeptídeo (Cb), a faixa de "um ou mais aminoácidos" não é particularmente limitada contanto que o polipeptídeo tenha a atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato. Por exemplo, a faixa é de 1 a 200, preferivelmente 1 a 150, mais preferivelmente 1 a 100, mais preferivelmente 1 a 50, mais preferivelmente 1 a 45, mais preferivelmente 1 a 40, mais preferivelmente 1 a 30, mais preferivelmente 1 a 15, mais preferivelmente 1 a 5, também preferivelmente 1 a 4, ainda mais preferivelmente 1 a 3, e particularmente preferivelmente 1 ou 2.

[000270] Os exemplos de (Cb) o polipeptídeo inclui um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 ou um po- lipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15. Comparada com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 contém dois aminoácidos substituídos. Em comparação com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 contém 42 aminoácidos substituídos e um aminoácido adicional (ácido glutâmico) no terminal de C. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 corresponde ao polipeptídeo de enzima E3 de filamento Bacteroides ovatus E-23-15 (FERM BP-6435). A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 corresponde ao polipeptídeo de enzima E3 de Streptococcus constellatus A6G-225 (FERM BP-6437).

[000271] No (Cb) polipeptídeo, "a substituição, deleção, inserção, ou adição de aminoácido" pode ser feita como na substituição, deleção, inserção, ou adição de aminoácido em polipeptídeo E1 descrito na Seção A-1. É preferível que a substituição, deleção, inserção, ou adição de aminoácido no polipeptídeo (Cb) seja nas regiões onde a mudança de aminoácido não tem grandes efeitos nas estruturas de ordem superior do polipeptídeo, ou onde a mudança não afeta o centro ativo da enzima de sintetização de equol. Os exemplos de tais regiões incluem regiões pouco conservadas entre as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 13, 14, e 15, e vizinhanças destas, e a região de terminal de N ou região de terminal de C. Os exemplos específicos incluem ácido glutâmico na posição 3, arginina na posição 28, ácido glutâmico na posição 29, arginina na posição 32, asparagina na posição 61, iso- leucina na posição 80, asparagina na posição 92, ácido aspártico na posição 112, alanina na posição 119, asparagina na posição 129, ácido aspártico na posição 172, alanina na posição 174, serina na posição 204, ácido glutâmico na posição 206, treonina na posição 223, valina na posição 230, prolina na posição 244, tirosina na posição 246, treo- nina na posição 280, arginina na posição 282, alanina na posição 285, valina na posição 307, alanina na posição 322, ácido glutâmico na posição 347, glicina na posição 359, serina na posição 360, alanina na posição 366, leucina na posição 367, isoleucina na posição 368, valina na posição 372, ácido aspártico na posição 373, treonina na posição 374, alanina na posição 377, alanina na posição 380, ácido aspártico na posição 381, glutamina na posição 399, prolina na posição 403, metionina na posição 404, valina na posição 405, ácido glutâmico na posição 406, glicina na posição 407, arginina na posição 426, valina na posição 434, alanina na posição 436, tirosina na posição 438, e alani- na na posição 440, na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; e regiões adjacentes destes aminoácidos. A "região adjacente" significa regiões onde a atividade de enzima de sintetização de equol não é afetada. Os exemplos das referidas regiões incluem aminoácidos em cinco aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, preferivelmente aqueles em quatro aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, mais preferivelmente aqueles em três aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, ainda mais preferivelmente aqueles em dois aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, e particularmente preferivelmente um aminoácido de um dos aminoácidos exemplificados. Os exemplos preferíveis das regiões com baixa capa- cidade de preservação e suas vizinhas incluem a região que corresponde às posições 25 a 35, a região que corresponde às posições 170 a 177, a região que corresponde às posições 201 a 208, a região que corresponde às posições 242 a 248, a região que corresponde às posições 276 a 289, a região que corresponde às posições 355 a 385, a região que corresponde às posições 396 to 409, e a região que corresponde às posições 431 to 443, na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13.

[000272] Na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, a sequência variando do aminoácido na posição 14 para o aminoácido na posição 19 é considerada corresponder ao domínio de ligação de FAD. Consequentemente, contanto que as funções do domínio não sejam inibidas, pode haver substituição, deleção, inserção, ou adição de um aminoácido arbitrário na sequencia. É, entretanto preferido que a glicina na posição 14, glicina na posição 16, e glicina na posição 19 não sejam mutadas. Na substituição, deleção, inserção, ou adição de aminoácido na sequencia, vários aminoácidos mutados são preferivelmente não mais do que 3, mais preferivelmente não mais do que 2, ainda mais preferivelmente 1. Mais preferido é nenhuma mutação na sequencia.

[000273] Fig. 29 mostra um alinhamento das sequências de aminoá- cido de SEQ ID Nos. 13, 14 e 15.

[000274] Em polipeptídeo (Cc), a sequência de aminoácido tem, por exemplo, 60% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13. É preferível que a sequência de aminoácido tenha geralmente 80% ou mais, preferivelmente 85% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, também preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 98% ou mais, e particularmente preferivelmente 99% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13.

[000275] Especificamente, (Cc) polipeptídeo pode ser um polipeptí- deo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 ou um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15. A identidade de aminoácido entre a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é 99,6% (Blast2). A identidade de aminoácido entre a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 13 e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 é 90,9% (Blast 2). Consequentemente, em uma modalidade preferida da invenção, (Bc) polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo 90,9% ou mais, e mais preferivelmente 99,6% de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13.

[000276] Considerando os polipeptídeos (Cb) e (Cc), a atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato pode ser confirmada como segue. Primeiro, um polipeptídeo de interesse é adicionado a uma solução de substrato da composição abaixo em uma concentração de 0,001 mg/mL. A solução é em seguida incubada a 37°C durante 2 horas para verificar quanto à presença ou ausência de equol em uma solução. A presença de equol em uma solução após incubation é usada como um indicador da atividade de polipeptídeo para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato. Composição de Solução de Substrato tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0) PMSF a 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila) Dithiothreitol a 2 mM Hidrossulfito de sódio de sódio a 5 mM 40 uM de diidrodaidzeína

Propriedade da Enzima

[000277] Uma vez que o polipeptídeo E3 tem uma atividade de enzima para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato, polipeptídeo E3 é também referido como enzima E3. A temperatura ideal de enzima E3 está por volta de cerca de 23 a 37°C, e o pH ideal é 4,5. A enzima E3 pode também sintetizar tetraidrodaidzeína de equol.

[000278] Similarmente ao polipeptídeo E1 e polipeptídeo E2, polipep- tídeo E3 pode ser produzido pelas técnicas de engenharia genética com base na formação de uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 16, 17, ou 18. Além disso, métodos de síntese química comuns podem ser usados para produzir polipeptídeo E3, com base na informação da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, 14, ou 15. O polipeptídeo E3 pode também ser produzido pelo isolamento e purificação de microorganismos capazes de produzi-lo. Estes métodos podem ser realizados de acordo com a descrição na seção anterior A-1.

[000279] O microorganismo capaz de produzir polipeptídeo E3 pode ser cultivado em um meio contendo uma quantidade desejada de te- traidrodaidzeína. O polipeptídeo E3 pode também ser produzido deste modo em microorganismos capazes de produzir polipeptídeo E3.

[000280] O polipeptídeo E2 pode ser monomérico, ou dimérico ou polimérico, contanto que possa sintetizar a tetraidrodaidzeína. Além disso, para melhorar a estabilidade e outras características, o polipep- tídeo E3 pode ser modificado quando requerido, adicionando-se polie- tilene glicol ou uma cadeia de açúcar.

[000281] O polipeptídeo E3 pode servir como um catalisador que converte tetraidrodaidzeína (um substrato) em equol. Acredit-ase que equol exiba várias atividades fisiológicas no corpo. Neste respeito, o polipeptídeo E3, capaz de fornecer equol, é considerado importante. A presente invenção, portanto, fornece a enzima de sintetização de equol incluindo quaisquer dos polipeptídeos (Ca) até (Cc).

C-2. Polinucleotídeo

[000282] A presente invenção também fornece um polinucleotídeo (a seguir também referido como "polinucleotídeo E3") que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de sintetizar equol usando tetraidro- daidzeína como um substrato. Especificamente, A invenção fornece: (Cd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO: 16; (Ce) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; e (Cf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Cd) ou (Ce), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato.

[000283] A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 corresponde à sequência de aminoácido codificada por uma sequência de nucleotí- deo de SEQ ID NO: 16. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 corresponde à sequência de aminoácido codificada por uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 corresponde à sequência de aminoácido codificada por uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 18.

[000284] Considerando polinucleotídeo (Cf), a frase "hibridiza sob condições rigorosas" é sinônima com a frase "hibridiza sob condições rigorosas" na Seção A-2. Os exemplos de polinucleotídeo (Cf) incluem a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17 e a sequência de nu-cleotídeo de SEQ ID NO: 18. A homologia de sequência de base entre a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 16 e a sequência de nu-cleotídeo de SEQ ID NO: 17 é 99,8% (Blast2). A homologia entre a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 16 e a sequência de nucleotí- deo de SEQ ID NO: 18 é 85,2% (Blast2). Consequentemente, em uma modalidade preferida da invenção, um polinucleotídeo (Cf) compreende uma sequência de base tendo 85,2% de homologia, e mais preferivelmente 99,8% de homologia com a sequência de base de SEQ ID NO: 16.

[000285] Considerando polinucleotídeo (Cf), a "atividade de sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato" pode ser confir-mada pelo mesmo método usado para polipeptídeos (Cb) e (Cc).

[000286] Polinucleotídeo E3 pode ser produzido ou obtido por métodos de síntese de DNA químicos ou técnicas de engenharia genética, com base na informação de sequência de SEQ ID NO: 16, 17 ou 18. Especificamente, o método descrito para polinucleotídeo E1 na Seção A-2 pode ser empregado.

[000287] A fonte de cDNA de polinucleotídeo E3 não é particularmente limitada contanto que seja um microorganismo expressando o poli- nucleotídeo E3. Os exemplos específicos incluem microorganismos capazes de produzir equol, preferivelmente bactérias de ácido láctico, bactérias que pertencem aos gêneros Bacteroides e Streptococcus capazes de produzir, mais preferivelmente Lactococcus garvieae, Bac- teroides ovatus, e Streptococcus constellatus capazes de produzir equol, também preferivelmente Lactococcus garvieae fecal e particularmente preferivelmente filamento Lactococcus 20-92, filamento Bac- teroides ovatus E-23-15, Streptococcus constellatus A6G-225 (FERM BP-10036, FERM BP-6435, e FERM BP-6437, respectivamente; depo-sitado com o International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science e Technology, 1-1-1 Higashi, Tsu- kuba, Ibaraki, Japan), os filamentos de Lactococcus garvieae fecal capazes de produzir equol.

[000288] Expressão de polinucleotídeo E3 usando técnicas de engenharia genética comuns facilmente permite a produção de massa, estável do produto de polinucleotídeo (o polipeptídeo). O isolamento bem sucedido de polinucleotídeo E3 pela presente invenção abrirá a porta para a produção industrial de equol, sem usar os filamentos bacteria- nos anaeróbicos difíceis de se manipular tradicionalmente usados para a produção de equol.

C-3. Vetor de Expressão

[000289] Um vetor de expressão da presente invenção não é particu- larmente limitado uma vez que ele inclui o polinucleotídeo E3 e é capaz de expressar o polinucleotídeo E3. Geralmente, ele é apropriadamente selecionado de acordo com o tipo de célula hospedeira, similar ao vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo E1. Especificamente, a célula hospedeira descrita na Seção A-3 pode ser usada.

C-4. Célula Recombinante

[000290] A presente invenção fornece uma célula recombinante (transformante) transformada com um vetor de expressão incluindo o polinucleotídeo E3. A célula hospedeira usada para a célula recombi- nante pode ser qualquer daqueles descritos na Seção A-4. Além disso, o vetor de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira pelo método descrito na Seção A-4.

[000291] Porque a célula recombinante é capaz de produção de poli- peptídeo E3 (uma enzima conversora de equol), ela pode ser usada para produzir uma enzima conversora de equol. A célula recombinante pode também ser usada para produzir equol em uma forma celular.

C-5. Produção de Polipeptídeo usando Célula Recombinante

[000292] O polipeptídeo E3 pode ser produzido pela cultura de uma célula recombinante na qual o polinucleotídeo E3 é introduzido, e coleta do polipeptídeo E3 da célula e cultura. As células recombinantes podem ser cultivadas de acordo com a descrição da Seção A-5.

C-6. Produção de Equol usando polipeptídeo E3

[000293] A presente invenção fornece um processo para produzir equol usando polipeptídeo E3. No processo de produção, a tetraidro- daidzeína pode ser convertida em equol tendo o polipeptídeo E3 agindo sobre a tetraidrodaidzeína.

[000294] A reação usada no processo de produção pode ser desempenhada em um tampão adequado. Especificamente, os tampões descritos na Seção A-6 podem ser usados.

[000295] A reação usada no processo de produção é desempenhada sob tais condições em que, por exemplo, cada componente é adicionado em um meio nas faixas de concentração descritas abaixo no início da reação a fim de preparar uma mistura. A mistura é incubada durante 0,5 a 10 horas, preferivelmente 1 a 6 horas, e mais preferivelmente 2 a 4 horas em temperaturas que não alteram ou inativam os materiais de partida, incluindo o polipeptídeo E3 e tetraidrodaidzeína, e o produto, incluindo equol. A temperatura reacional não é particularmente limitada. Por exemplo, quando a temperatura reacional é 0°C ou menor, a reação usa, por exemplo, um tampão que não congela em tais temperaturas de reação. A temperatura reacional é, por exemplo, preferivelmente 0 a 45°C, e mais preferivelmente 0 a 37°C.

[000296] O conteúdo de polipeptídeo E3 é 0,0001 a 1,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,01 % em peso; e o teor de tetraidrodaidzeína é 0,0001 a 10,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 1,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso.

[000297] A presente invenção também fornece uma mistura de material para a síntese de equol, especificamente, uma síntese de material de composição de equol incluindo (Ci) polipeptídeo E3, (Cii) tetraidro- daidzeína. Por incubação da composição sob as condições anteriores, a tetraidrodaidzeína contida na composição pode ser convertida em equol. A composição corresponde à mistura de material de partida antecedente usada para iniciar a reação para produzir equol. Além disso, as concentrações de polipeptídeo E3, e tetraidrodaidzeína na composição, e outros componentes que podem ser adicionados à composição são essencialmente como em um sistema de reação (uma mistura de material de partida no início da reação) usado no processo de produção antecedente.

[000298] A presente invenção também fornece um kit para sintetiza- ção de equol, especificamente, um kit de síntese de equol incluindo (Ci) polipeptídeo E3 e (Cii) tetraidrodaidzeína. O kit de síntese pode incluir os componentes em compartimentos tal como requerido, a fim de convenientemente permitir síntese de equol de tetraidrodaidzeína sob as condições anteriores. O kit de síntese pode também incluir um tampão tal como requerido. O kit de síntese pode também incluir quaisquer instrumentos necessários ou manuais de operação que ajudam desempenhar síntese de equol.

C-7. Composição de enzima de sintetização de equol

[000299] A presente invenção também fornece uma composição de enzima de sintetização de equol incluindo o polipeptídeo E3. Uma composição de enzima pode ser adequadamente usada como uma enzima de sintetização de equol no processo de produção de equol usando polipeptídeo E3.

[000300] A composição de enzima pode ser um polipeptídeo E3 purificado cru, ou uma composição de enzima pode ser um polipeptídeo E3 purificado cru ou purificado formulado com um suporte adequado. O suporte não possui qualquer efeito adverso em uma atividade de polipeptídeo E3, e é usado em uma quantidade adequada.

[000301] A proporção de polipeptídeo E3 em uma composição de enzima não é particularmente limitada uma vez que a composição pode ser usada como uma enzima de sintetização de equol no processo de produção de equol. Especificamente, o conteúdo de polipeptídeo E3 é, por exemplo, 0,001 a 20,0 % em peso, preferivelmente 0,005 a 5,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,01 a 1,0 % em peso, com respeito ao total de uma composição de enzima.

[000302] Para melhorar a estabilidade do polipeptídeo e/ou para assegurar a preservabilidade de uma composição de enzima, uma composição de enzima pode também incluir vários antioxidantes e preservativos descritos na Seção A-7, além do polipeptídeo E3.

C-8. Processo de Produção de Equol usando Célula Recombinante

[000303] A presente invenção fornece um processo de produção de equol usando células recombinantes incluindo polinucleotídeo E3. Especificamente, no processo de produção, a tetraidrodaidzeína é convertida em equol tendo a célula recombinante agindo sobre a tetrai- drodaidzeína para converter-se.

[000304] A reação usada no processo de produção é desempenhada em um ambiente que permite a célula recombinante sobreviver, e a tetraidrodaidzeína ser convertida em equol.

[000305] Especificamente, as quantidades apropriadas de células recombinantes e tetraidrodaidzeína são adicionadas e cultivadas em um meio que permite desenvolvimento das células recombinantes.

[000306] O meio usado no processo de produção é adequadamente selecionado de vários tipos de meios convencionais de acordo com o tipo da célula usado como a célula recombinante hospedeira.

[000307] O meio pode ser suplementado com quantidades apropriadas de inibidores de protease tais como PMSF e EDTA, tal como requerido. Além disso, considerando que o polipeptídeo deriva de bactérias anaeróbicas, quantidades apropriadas de agentes de redução tais como DTT, 2ME, DET, e Na2S2O4 podem também ser adicionados. Quando usando uma célula recombinante, o meio pode ser suplementado com NADPH e/ou NADH tal como requerido, embora ele não seja essencial.

[000308] Especificamente, o processo de produção é desempenhado como segue. Primeiro, as células recombinantes são inoculadas em meio contendo 0,001 a 1% em peso, preferivelmente 0,01 a 0,5 % em peso, e mais preferivelmente 0,01 a 0,1 % em peso de tetraidrodaidze- ína, e a cultura é incubada sob condições de temperatura permissivas durante 7 a 30 horas, preferivelmente 15 a 24 horas, e mais preferivelmente 17 a 20 horas. Aqui, as condições de temperatura permissi- vas não são particularmente limitadas, e são essencialmente como na seção anterior C-6.

[000309] A presente invenção também fornece uma mistura de material para sintetização de equol, especificamente, uma síntese de material de composição de equol contendo (Ciii) a célula recombinante e (Cii) tetraidrodaidzeína. Por cultivo da composição sob as condições anteriores, a tetraidrodaidzeína na composição pode ser convertida em equol. A composição corresponde à mistura de material de partida antecedente usada para iniciar a reação para produzir equol. Além disso, as concentrações da célula recombinante e tetraidrodaidzeína na composição, e outros componentes que podem ser adicionados à composição, são essencialmente como nas condições usadas no processo de produção antecedente.

[000310] A presente invenção também fornece um kit para sintetização de equol, especificamente, um kit de síntese de equol incluindo (Ciii) a célula recombinante e (Cii) tetraidrodaidzeína. O kit de síntese pode incluir a célula recombinante e tetraidrodaidzeína em compartimentos tal como requerido, a fim de convenientemente permitir síntese de equol de diidrodaidzeína sob as condições anteriores. O kit de síntese pode também incluir um tampão ou um meio, tal como requerido. O kit de síntese pode também incluir quaisquer instrumentos necessários ou manuais de operação que ajudam desempenhar síntese de equol.

[000311] As células recombinantes incluídas no kit de síntese podem ser preservadas neste através de métodos conhecidos. Há várias técnicas de preservação de célula recombinante conhecidas. Por exemplo, há um método no qual as células recombinantes são preservadas em 4 a 25 °C depois sendo tratadas com um liofilizador para evacuar uma ampola armazenando as células recombinantes em um solvente tal como dimetilformamida. Outro exemplo é um método de nitrogênio líquido, no qual as células são suspensas em um meio de preservação suplementado com glicerol a 10%, que é em seguida armazenado em uma ampola específica e mantido em um tanque de nitrogênio líquido (em -150 a -196°C).

C-9. Anticorpo Possuindo Afinidade ao polipeptídeo

[000312] A presente invenção também fornece um anticorpo (um anticorpo de IgG) possuindo afinidade ao polipeptídeo E3.

[000313] O anticorpo monoclonal e anticorpo policlonal pode ser preparado através de um método usual. Especificamente, estes anticorpos podem ser produzidos pelos métodos descritos na Seção A-9.

C-10. Método Imunológico para a Detecção ou Medição do polipeptídeo

[000314] A presente invenção também fornece um método imunoló- gico para detectar ou medir o polipeptídeo E3 usando o anticorpo. Especificamente, o método imunológico pode ser desempenhado de acordo com o método descrito na Seção A-10.

[000315] A presente invenção também fornece um kit de detecção imunológica incluindo o anticorpo, usado para a detecção ou medição do polipeptídeo E3. O kit de detecção pode também incluir um polipep- tídeo E3 padrão, tal como requerido. O kit de detecção pode também incluir, tal como requerido, reagentes adicionais que facilitam a fácil detecção de polipeptídeo E3 sob as condições anteriores. O kit de detecção pode também incluir quaisquer instrumentos necessários ou manuais de operação que facilitam fácil detecção de polipeptídeo E3.

C-11. Método para Detecção ou Medição de Polinucleotídeo que Codifica o polipeptídeo

[000316] A presente invenção também fornece um método para detectar ou medir polinucleotídeo E3. Especificamente, o método é desempenhado fazendo com que uma sonda de ligação de polinucleotí- deo E3 esteja em contato com a amostra de teste, de acordo com o método descrito na Seção A-11.

[000317] A presente invenção também fornece um kit para detecção ou medição de polinucleotídeo E3, especificamente um kit de detecção de polinucleotídeo E3 incluindo a sonda. Para facilidade de detecção do polinucleotídeo E3 sob as condições anteriores, o kit de detecção pode incluir reagentes adicionais ou outros mais tal como requerido, além da sonda. Além disso, o kit de detecção pode ser usado para identificar células contendo o polinucleotídeo E3. Do ponto de vista de permissão de detecção acurada, o kit de detecção pode preferivelmente ser fornecido como um kit para desempenho de detecção usando PCR.

D. Processo para produção de equol usando enzimas E1 - E3, ou in-termediário daqueles D-I-1. Processo para produção de tetraidrodaidzeína compreendendo Primeira Etapa e Segunda Etapa

[000318] A presente invenção fornece um processo para produzir tetraidrodaidzeína compreendendo a seguinte Primeira Etapa e Segunda Etapa (a seguir, este processo é ocasionalmente referido como "Primeiro Método de Produção"). Primeira Etapa produz diidrodaidzeí- na de daidzeína. Segunda Etapa produz tetraidrodaidzeína de diidro- daidzeína.

[000319] A Primeira Etapa compreende uma etapa de indução de uma enzima consistindo em um dos seguintes polipeptídeos (Aa) a (Ac), e NADPH e/ou NADH a agir sobre a daidzeína, desse modo produzindo diidrodaidzeína. (Aa) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1. (Ab) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 1 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato. (Ac) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e tendo uma atividade de sintetizar dii- drodaidzeína usando daidzeína como um substrato.

[000320] A Segunda Etapa compreende uma etapa de ter uma enzima consistindo em um dos seguintes polipeptídeos (Ba) a (Bc), e NADPH e/ou NADH agindo sobre a diidrodaidzeína, desse modo produzindo tetraidrodaidzeína. (Ba) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7. (Bb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato. (Bc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, e tendo uma atividade de sintetizar te- traidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[000321] O Primeiro Método de Produção da presente invenção permite produção de tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína.

Primeira Etapa

[000322] Na Primeira Etapa, a daidzeína é convertida em diidro- daidzeína tendo uma enzima consistindo no polipeptídeo E1 agindo sobre daidzeína na presença de NADPH e/ou NADH. A reação Na Primeira Etapa é realizada por meio de incubação em uma solução contendo uma enzima consistindo no polipeptídeo E1, daidzeína, e NADPH e/ou NADH em temperaturas que não alterem ou inativem os materiais de partida, incluindo o polipeptídeo e daidzeína, e o produto, incluindo diidrodaidzeína; a saber como condições detalhadas na seção anterior A-6.

[000323] Quando a Primeira Etapa e a Segunda Etapa depois descrita são realizadas sob as mesmas condições, a reação é desempenhada sob tais condições que os componentes satisfaçam as faixas de concentração tal como mostrado abaixo em um sistema de reação no início da reação (em uma mistura de materiais de partida no início da reação), e que a mistura é incubada durante 0,5 a 10 horas, preferivelmente 1 a 6 horas, e mais preferivelmente 2 a 4 horas, em 15 a 45 °C, preferivelmente 25 a 40 °C, e mais preferivelmente 30 a 38 °C. Com esta disposição, tanto a Primeira quanto a Segunda Etapas são eficientemente realizadas. O teor da enzima consistindo no polipeptí- deo E1 é 0,0001 a 1,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,01 % em peso. O conteúdo de daidzeína é 0,0001 a 10,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 1,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso. O teor de NADPH e/ou NADH é 0,01 a 5 % em peso, preferivelmente 0,05 a 1% em peso, e mais preferivelmente 0,1 a 0,5 % em peso.

[000324] A fonte de daidzeína usada como um substrato Na Primeira Etapa não é limitada. Por exemplo, as daidzeínas comercialmente disponíveis ou daidzeínas produzidas ou sintetizadas por métodos apropriados podem ser usadas.

[000325] Além disso, por exemplo, uma composição de material de síntese de diidrodaidzeína contendo (Ai) uma enzima consistindo no polipeptídeo E1; (Aii) NADPH e/ou NADH; e (Aiii) daidzeína pode ser usada como uma mistura de materiais de partida na produção de dii- drodaidzeína na Primeira Etapa. Por incubação da composição sob as condições anteriores, a daidzeína na composição é convertida em dii- drodaidzeína. Uma composição é especificamente descrita nas seções anteriores A-6 e A-7.

Segunda Etapa

[000326] Na Segunda Etapa, a diidrodaidzeína que é convertida em tetraidrodaidzeína tendo uma enzima consistindo no polipeptídeo E2 agindo sobre diidrodaidzeína na presença de NADPH e/ou NADH.

[000327] A reação na Segunda Etapa é realizada por meio de incubação em uma solução contendo uma enzima consistindo no polipep- tídeo E2, diidrodaidzeína, e NADPH e/ou NADH em temperaturas que não alterem ou inativem os materiais de partida, incluindo a enzima consistindo no polipeptídeo E2 e diidrodaidzeína, e o produto, incluindo tetraidrodaidzeína; a saber como condições detalhadas na seção anterior B-6.

[000328] Considerando a tetraidrodaidzeína, o composto existe em uma forma cis ou uma forma trans. A formação de configurações cis e trans pode ser controlada por condições de reação variáveis tais como temperatura reacional e tempo de reação. Por exemplo, uma mistura de cis- e trans-tetraidrodaidzeínas pode ser produzida por fixação da temperatura reacional a 0°C, ou a reação pode ser controlada para facilitar a forma trans fixando a temperatura reacional a 37°C.

[000329] Quando como a Primeira Etapa e Segunda Etapa são realizadas sob as mesmas condições, a reação é realizada por meio de incubação sob as condições anteriormene mencionadas para realizar a Primeira Etapa e Segunda Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Primeira Etapa. Com esta disposição, tanto a Primeira quanto a Segunda Etapas são eficientemente realizadas. Neste caso, os teores da enzima consistindo no po- lipeptídeo E2, diidrodaidzeína, e NADPH e/ou NADH são ajustados como segue:o teor da enzima consistindo no polipeptídeo E2 é 0,0001 a 1,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,01 % em peso; o teor de diidrodaidzeína é 0,0001 a 10,0 % em peso, prefe-rivelmente 0,001 a 1,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso; e o teor de NADPH e/ou NADH é 0,01 a 5 % em peso, prefe-rivelmente 0,05 a 1% em peso, e mais preferivelmente 0,1 a 0,5 % em peso.

[000330] Entretanto, quando sendo realizadas na presença da enzima consistindo no polipeptídeo E1 ou da enzima consistindo no poli- peptídeo E2, a Primeira Etapa e Segunda Etapa requerem o uso de NADPH para aumentar a eficiência na reação de produção de diidro- daidzeína. A concentração de NADPH é determinada com base nas condições anteriormente mencionadas para realizar a Primeira Etapa e Segunda Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Primeira Etapa. A concentração de NADH, que é usada com NADPH, é 0,01 a 5 % em peso, preferivelmente 0,05 a 1% em peso, mais preferivelmente 0,1 a 0,5 % em peso.

[000331] A fonte de diidrodaidzeína usada como um substrato Na Segunda Etapa não é limitada.

[000332] Por exemplo, a diidrodaidzeína produzida na Primeira Etapa de daidzeína pode ser usada como um substrato para a Segunda Etapa. A diidrodaidzeína é usada ou na forma da solução contendo diidrodaidzeína como produzido na Primeira Etapa, ou em um estado toscamente refinado ou estado apropriadamente refinado.

[000333] As diidrodaidzeínas comercialmente disponíveis ou diidro- daidzeínas sintetizadas por meio de métodos apropriados podem também ser usadas.

[000334] Além disso, a síntese de composição de material de tetrai- drodaidzeína contendo (Bi) uma enzima consistindo no polipeptídeo E2; (Bii) NADPH e/ou NADH; e (Biii) diidrodaidzeína pode ser usada como uma mistura de materiais de partida na produção de tetraidro- daidzeína Na Segunda Etapa . Por incubação da composição sob as condições anteriores, a diidrodaidzeína na composição é convertida em tetraidrodaidzeína. Uma composição de síntese é especificamente descrita nas seções anteriores A-6 e A-7.

[000335] Na Segunda Etapa, é preferível usar diidrodaidzeína, produzida na Primeira Etapa usando daidzeína como um substrato; entretanto, diidrodaidzeína comercialmente disponível, uma composição de material de partida de síntese, uma composição de enzima etc. podem ser misturadas com a diidrodaidzeína produzida na Primeira Etapa.

Polipeptídeo E1 e Polipeptídeo E2

[000336] Primeiro Método de Produção da presente invenção usa a enzima consistindo no polipeptídeo E1 tal como detalhado na seção anterior A-1, e a enzima consistindo no polipeptídeo E2 tal como detalhado na seção anterior B-1.

D-I-2. Produto contendo tetraidrodaidzeína, produzido pelo Primeiro Método de Produção

[000337] A presente invenção fornece um produto contendo tetrai- drodaidzeína, produzido pelo processo anterior compreendendo Primeira Etapa e Segunda Etapa (Primeiro Método de Produção).

[000338] Tal como acima descrito, o Primeiro Método de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína de daidzeí- na, e tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína.

[000339] Consequentemente, o produto produzido pelo Primeiro Método de Produção da presente invenção contém não apenas tetraidro- daidzeína, porém também diidrodaidzeína e/ou daidzeína.

[000340] O produto da presente invenção pode ser usado na forma da solução como produzido no Primeiro Método de Produção, ou pode ser um produto de tetraidrodaidzeína obtido toscamente ou apropriadamente refinando a solução.

[000341] O produto da presente invenção pode ser incorporado em alimentos, drinques, ou materiais de produto de maquilagem, produtos medicinais etc., ou pode ser usado como um substrato.

D-I-3. Processo de produção de equol compreendendo Segunda Etapa e Terceira Etapa

[000342] A presente invenção fornece um processo para produzir equol compreendendo a seguinte Segunda Etapa e Terceira Etapa (a seguir, este processo é ocasionalmente referido como "Segundo Método de Produção"). A Segunda Etapa produz tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína. A Terceira Etapa produz equol de tetraidrodaidzeína.

[000343] Segunda Etapa compreende uma etapa de ter uma enzima consistindo em um dos seguintes polipeptídeos (Ba) a (Bc), e NADPH e/ou NADH agindo sobre a diidrodaidzeína, desse modo produzindo tetraidrodaidzeína. (Ba) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7. (Bb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 7 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade de sintetizar tetraidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato. (Bc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, e tendo uma atividade de sintetizar te- traidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[000344] Terceira Etapa compreende uma etapa de ter uma enzima consistindo em um dos seguintes (Ca) a (Cc) polipeptídeos agindo sobre a tetraidrodaidzeína, desse modo produzindo equol. (Ca) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 13. (Cb) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 13 com a substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato. (Cc) um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido tendo 60% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato.

[000345] Segundo Método de Produção da presente invenção permite produção de equol de tetraidrodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína. Segunda Etapa

[000346] Segunda Etapa de Segundo Método de Produção da presente invenção é o mesmo como a Segunda Etapa de Primeiro Método de Produção.

[000347] Quando a Segunda Etapa e a Terceira Etapa depois descrita são realizadas sob as mesmas condições, a reação é desempenhada sob tais condições que os componentes satisfaçam as faixas de concentração abaixo em um sistema de reação no início da reação (em uma mistura de materiais de partida no início da reação), e que a mistura é incubada durante 0,5 a 10 horas, preferivelmente 1 a 6 horas, e mais preferivelmente 2 a 4 horas, em 15 a 45°C, preferivelmente 25 a 40 °C, e mais preferivelmente 30 a 38°C. Com esta disposição, tanto a Primeira quanto a Segunda Etapas são eficientemente realizadas.

[000348] O teor da enzima consistindo no polipeptídeo E2 é 0,0001 a 1,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,01 % em peso. O teor de diidrodaidzeína é 0,0001 a 10,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 1,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso. O teor de NADPH e/ou NADH é 0,01 a 5 % em peso, preferivelmente 0,05 a 1% em peso, e mais preferivelmente 0,1 a 0,5 % em peso.

Terceira Etapa

[000349] A Terceira Etapa induz uma enzima consistindo no polipep- tídeo E3 a agir sobre a tetraidrodaidzeína, desse modo convertindo a tetraidrodaidzeína em equol.

[000350] A reação na Terceira Etapa é realizada por meio de incubação em uma solução contendo uma enzima consistindo no polipeptí- deo E3, e tetraidrodaidzeína em temperaturas que não alterem ou ina- tivem os materiais de partida, incluindo a enzima consistindo no poli- peptídeo E3 e tetraidrodaidzeína, e o produto, incluindo equol; a saber como condições detalhadas na seção anterior A-6.

[000351] Quando a Segunda Etapa e Terceira Etapa são realizadas sob as mesmas condições, a reação é realizada por meio de incubação sob as condições anteriormene mencionadas para realizar a Segunda Etapa e Terceira Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Segunda Etapa. Com esta disposição, ambas as Segunda e Terceira Etapa são eficientemente realizadas. Neste caso, os teores da enzima consistindo no polipeptídeo E3, tetraidrodaidzeína, e NADPH e/ou NADH são ajustados como segue: o teor da enzima consistindo no polipeptídeo E3 é 0,0001 a 1,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,01 % em peso;o teor de tetraidrodaidzeína é 0,0001 a 10,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 1,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso; e

[000352] O teor de NADPH e/ou NADH é 0,01 a 5 % em peso, preferivelmente 0,05 a 1% em peso, e mais preferivelmente 0,1 a 0,5 % em peso.

[000353] A fonte de tetraidrodaidzeína usado como um substrato na Terceira Etapa também não é limitada.

[000354] Por exemplo, a tetraidrodaidzeína produzida na Segunda Etapa de diidrodaidzeína pode ser usada como um substrato para a Terceira Etapa. A tetraidrodaidzeína é usada ou na forma de uma solu- ção contendo tetraidrodaidzeína como produzido na Segunda Etapa, ou em um estado toscamente refinado ou estado apropriadamente refinado.

[000355] As tetraidrodaidzeínas comercialmente disponíveis ou te- traidrodaidzeínas sintetizadas por meio de métodos apropriados podem também ser usadas.

[000356] Além disso, uma síntese de composição de material de te- traidrodaidzeína contendo (Ci) uma enzima consistindo no polipeptídeo E3; e (Cii) tetraidrodaidzeína pode ser usada como uma mistura de materiais de partida na produção de tetraidrodaidzeína na Terceira Etapa. Por incubação da composição sob as condições anteriores, a tetraidrodaidzeína na composição é convertida em equol. Uma composição é especificamente descrita nas seções anteriores C-6 e C-7.

[000357] Na Terceira Etapa, é preferível usar tetraidrodaidzeína, produzida na Segunda Etapa usando diidrodaidzeína como um substrato; entretanto, tetraidrodaidzeína comercialmente disponível, uma composição de material de partida de síntese, uma composição de enzima etc. podem ser misturadas com a tetraidrodaidzeína produzida na Segunda Etapa .

Polipeptídeo E2 e Polipeptídeo E3

[000358] O Segundo Método de Produção da presente invenção usa uma enzima consistindo no polipeptídeo E2 descrita na seção anterior B-1, e uma enzima consistindo no polipeptídeo E3 descrita na seção anterior C-1.

D-I-4. Produto contendo equol, produzido pelo Segundo Método de Produção

[000359] A presente invenção fornece um produto contendo equol, produzido pelo processo anterior compreendendo Segunda Etapa e Terceira Etapa (Segundo Método de Produção).

[000360] Tal como acima descrito, o Segundo Método de Produção da presente invenção permite produção de tetraidrodaidzeína de dii- drodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína.

[000361] Consequentemente, o produto produzido pelo Segundo Método de Produção da presente invenção contém não apenas equol, porém também tetraidrodaidzeína e/ou diidrodaidzeína.

[000362] O produto da presente invenção pode ser usado na forma da solução como produzida no Segundo Método de Produção, ou pode ser um Produto de equol obtido toscamente ou apropriadamente refinando a solução.

[000363] O produto da presente invenção pode ser incorporado em alimentos, drinques, materiais de produto de maquilagem, produtos medicinais etc., ou pode ser usado como um substrato.

D-I-5. Método de produção de equol compreendendo Primeira Etapa a Terceira Etapa

[000364] A presente invenção fornece um método de produção de equol compreendendo Primeira Etapa, Segunda Etapa e Terceira Etapa (a seguir, este processo é ocasionalmente referido como "Terceiro Método de Produção").

[000365] O Terceiro Método de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína de daidzeína, tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína.

Primeira Etapa

[000366] Na Primeira Etapa de Terceiro Método de Produção da presente invenção, daidzeína é convertida em diidrodaidzeína tendo uma enzima consistindo no polipeptídeo E1 agindo sobre daidzeína na presença de NADPH e/ou NADH. A Primeira Etapa de Terceiro Método de Produção da presente invenção é igual à Primeira Etapa anteriormente mencionada.

[000367] Quando a Primeira Etapa e Segunda Etapa são realizadas sob as mesmas condições, quando a Primeira Etapa e Terceira Etapa são realizadas sob as mesmas condições, ou quando a Primeira Etapa à Terceira Etapa são realizadas sob as mesmas condições, a reação é realizada por meio de incubação sob as condições/concentrações acima mencionadas para realizar a Primeira Etapa e Segunda Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Primeira Etapa. Com esta disposição, tanto a Primeira quanto a Segunda Etapas são eficientemente realizadas.

Segunda Etapa

[000368] Na Segunda Etapa do Terceiro Método de Produção da presente invenção, a diidrodaidzeína é convertida em tetraidrodaidzeí- na tendo uma enzima consistindo no polipeptídeo E2 agindo sobre dii- drodaidzeína na presença de NADPH e/ou NADH. A Segunda Etapa do Terceiro Método de Produção da presente invenção é igual à Segunda Etapa anteriormente mencionada.

[000369] Quando a Primeira Etapa e Segunda Etapa são realizadas sob as mesmas condições, ou quando a Primeira Etapa à Terceira Etapa são realizadas sob as mesmas condições, a reação é realizada por meio de incubação sob as condições/concentrações acima mencionadas para realizar a Primeira Etapa e Segunda Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Segunda Etapa. Com esta disposição, tanto a Primeira quanto a Segunda Etapas são eficientemente realizadas.

[000370] Além disso, quando a Primeira Etapa e Segunda Etapa são desempenhadas na presença da enzima consistindo no polipeptídeo E1 e a enzima consistindo no polipeptídeo E2, ou quando a Primeira Etapa à Terceira Etapa são desempenhadas na presença da enzima consistindo no polipeptídeo E1, a enzima consistindo no polipeptídeo E2, e a enzima consistindo no polipeptídeo E3, a reação é desempenhada através da incubação na presença da enzima consistindo no polipeptídeo E1 e a enzima consistindo no polipeptídeo E2, sob as condições/concentrações acima mencionadas, que é detalhado na explicação da Segunda Etapa, por exemplo.

[000371] Quando a Segunda Etapa e Terceira Etapa são realizadas sob as mesmas condições, a reação é realizada por meio de incubação sob as condições/concentrações acima mencionadas para realizar a Segunda Etapa e Terceira Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Segunda Etapa. Com esta disposição, ambas a Segunda e Terceira Etapa são eficientemente realizadas.

Terceira Etapa

[000372] Na Terceira Etapa do Terceiro Método de Produção da presente invenção, a tetraidrodaidzeína é convertida em equol tendo uma enzima consistindo no polipeptídeo E3 agindo sobre a tetraidrodaidze- ína na presença de NADPH e/ou NADH, desse modo convertendo a tetraidrodaidzeína em equol. A Terceira Etapa do Terceiro Método de Produção da presente invenção é igual à mencionada Terceira Etapa anteriormente.

[000373] Quando a Primeira Etapa e Terceira Etapa são realizadas sob as mesmas condições, ou quando a Primeira Etapa à Terceira Etapa são realizadas sob as mesmas condições, a reação é realizada por meio de incubação sob as condições anteriormene mencionadas para realizar a Primeira Etapa e Segunda Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Primeira Etapa. Com esta disposição, tanto a Primeira quanto a Segunda Etapas são eficientemente realizadas. Neste caso, os teores da enzima consistindo no polipeptídeo E3, tetraidrodaidzeína, e NADPH e/ou NADH são ajustados como segue:o teor da enzima consistindo no polipeptídeo E3 é 0,0001 a 1,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,01 % em peso; o teor de tetraidrodaidzeína é 0,0001 a 10,0 % em peso, preferivelmente 0,001 a 1,0 % em peso, e mais preferivelmente 0,001 a 0,1 % em peso; e o teor de NADPH e/ou NADH é 0,01 a 5 % em peso, prefe-rivelmente 0,05 a 1% em peso, e mais preferivelmente 0,1 a 0,5 % em peso.

[000374] Entretanto, quando sendo realizadas na presença da enzima consistindo no polipeptídeo E1 e a enzima consistindo no polipep- tídeo E3, a Primeira Etapa e Terceira Etapa requerem o uso de NADPH para aumentar a eficiência na reação de produção de diidro- daidzeína usando a enzima consistindo no polipeptídeo E1. Similarmente, quando sendo realizadas na presença da enzima consistindo no polipeptídeo E1, a enzima consistindo no polipeptídeo E2, e a enzima consistindo no polipeptídeo E3, a Primeira Etapa à Terceira Etapa requerem o uso de NADPH para aumentar a eficiência na reação de produção de diidrodaidzeína usando a enzima consistindo no polipep- tídeo E1. Neste caso, a concentração de NADPH é determinada com base nas condições anteriormente mencionadas para realizar a Primeira Etapa e Segunda Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Primeira Etapa. A concentração de NADH, que é usada com NADPH, é determinada com base nas condições anteriormente mencionadas para realizar reação na presença da enzima consistindo no polipeptídeo E1, a enzima consistindo no poli- peptídeo E2, que são detalhadas na explicação anterior da Segunda Etapa, e como condições anteriormente mencionadas para realizar a Segunda Etapa e Terceira Etapa sob as mesmas condições, que são detalhadas na explicação anterior da Segunda Etapa.

E1 a E3 polipeptídeos

[000375] O Terceiro Método de Produção da presente invenção usa a enzima consistindo no polipeptídeo E1, a enzima consistindo no po- lipeptídeo E2, e a enzima consistindo no polipeptídeo E3. Os peptí-deos E1 a E 3 são mesmo como aqueles descritos acima.

D-I-6. Produto contendo equol, produzido pelo Terceiro Método de Produção

[000376] A presente invenção fornece um produto contendo equol, produzido pelo processo anterior compreendendo Primeira Etapa à Terceira Etapa (Terceiro Método de Produção ).

[000377] Tal como acima descrito, o Terceiro Método de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína de daidzeína, tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína.

[000378] Consequentemente, o produto produzido pelo Terceiro Método de Produção da presente invenção contém não apenas equol, porém também tetraidrodaidzeína, diidrodaidzeína e/ou daidzeína.

[000379] O produto da presente invenção pode ser usado na forma da solução como produzida no Terceiro Método de Produção , ou pode ser um produto de tetraidrodaidzeína obtido toscamente ou apropriadamente refinando a solução.

[000380] O produto da presente invenção pode ser incorporado em alimentos, drinques, ou materiais de produto de maquilagem, produtos medicinais etc., ou pode ser usado como um substrato.

D-I-7. Processo para produção de diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol, compreendendo pelo menos duas da Quarta Etapa à Sexta Etapa

[000381] A presente invenção fornece um processo para produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína, e/ou equol, compreendendo pelo menos duas das seguintes Quarta Etapa à Sexta Etapa (a seguir, este processo é ocasionalmente referido como "Quarto Método de Produção"). A Quarta Etapa produz diidrodaidzeína de daidzeína. A Quinta Etapa produz tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e a Sexta Etapa produz equol de tetraidrodaidzeína.

[000382] A Quarta Etapa compreende uma etapa de ter uma célula recombinante consistindo em um dos seguintes (Ad) a (Af) polinucleo- tídeos agindo sobre a daidzeína, desse modo produzindo a diidro- daidzeína. (Ad) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 4; (Ae) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; e (Af) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Ad) ou (Ae), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar a dii- drodaidzeína usando daidzeína como um substrato.

[000383] A Quinta Etapa compreende uma etapa de ter uma célula recombinante consistindo em um dos seguintes (Bd) a (Bf) polinucleo- tídeos agindo sobre a diidrodaidzeína, desse modo produzindo tetrai- drodaidzeína. (Bd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nucle- otídeo de SEQ ID NO: 10; (Be) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; e (Bf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Bd) ou (Be), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar te- traidrodaidzeína usando diidrodaidzeína como um substrato.

[000384] A Sexta Etapa compreende uma etapa de ter uma célula recombinante consistindo em um dos seguintes (Cd) a (Cf) polinucleo- tídeos agindo sobre a tetraidrodaidzeína, desse modo produzindo equol. (Cd) um polinucleotídeo consistindo na sequência de nu- cleotídeo de SEQ ID NO: 16; (Ce) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo con- sistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; e (Cf) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o filamento complementar do polinucleotídeo (Cd) ou (Ce), e que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade para sintetizar equol usando tetraidrodaidzeína como um substrato.

[000385] O Quarto Método de Produção da presente invenção produz diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol por combinação apropriadamente da Quarta a Sexta Etapas.

[000386] O Quarto Método de Produção da presente invenção compreende pelo menos duas de Quarta Etapa, Quinta Etapa e Sexta Etapa.

[000387] Por exemplo, o Quarto Método de Produção da presente invenção que compreende Quarta Etapa e Quinta Etapa e não compreende a Sexta Etapa produz diidrodaidzeína de daidzeína, e tetrai- drodaidzeína de diidrodaidzeína.

[000388] Por exemplo, o Quarto Método de Produção da presente invenção que compreende Quinta Etapa e Sexta Etapa e não compreende a Quarta Etapa produz tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína.

[000389] E, por exemplo, o Quarto Método de Produção da presente invenção que compreende a totalidade da Quarta Etapa, Quinta Etapa e Sexta Etapa produz diidrodaidzeína de daidzeína, tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína.

[000390] Cada célula recombinante usada para o Quarto Método de Produção da presente invenção pode conter um ou mais polinucleotí- deos selecionados do grupo consistindo em (Ad) a (Af), (Bd) a (Bf) e (Cd) a (Cf).

[000391] Por exemplo, quando a célula contém dois polinucleotídeos: um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Ad) a (Af), e um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Bd) a (Bf), a Quarta Etapa e Quinta Etapa pode ser realizada com esta célula, isto é, a Quarta Etapa e Quinta Etapa podem ser realizadas com um tipo de célula recombinante.

[000392] Similarmente, quando a célula contém três polinucleotí- deos: um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Ad) a (Af), um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Bd) a (Bf), e um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Cd) a (Cf), a Quarta Etapa à Sexta Etapa pode ser realizada com esta célula, isto é, a Quarta Etapa à Sexta Etapa pode ser realizada com um tipo de célula recombinante.

[000393] No Quarto Método de Produção da presente invenção, a Quarta Etapa à Sexta Etapa podem também ser realizadas usando uma célula recombinante contendo dois polinucleotídeos: um polinu- cleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Ad) a (Af), um polinu- cleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Bd) a (Bf); e outra célula recombinante contendo um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Cd) a (Cf).

[000394] Similarmente, no Quarto Método de Produção da presente invenção, a Quarta Etapa à Sexta Etapa podem também ser realizadas usando uma célula recombinante contendo dois polinucleotídeos: Um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Ad) a (Af), um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Cd) a (Cf); e outra célula recombinante contendo um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (Bd) a (Bf).

Quarta Etapa

[000395] A Quarta Etapa induz uma célula recombinante possuindo o polinucleotídeo E1 tal como detalhado na seção A-2 a agir sobre a daidzeína, desse modo convertendo a daidzeína em diidrodaidzeína.

[000396] A reação na Quarta Etapa pode ser realizada sob as mesmas condições como aquelas da Primeira Etapa. Mais especificamente, a célula recombinante é inoculada no meio de cultura contendo 0,001 a 1% em peso, preferivelmente 0,01 a 1% em peso, mais prefe-rivelmente 0,01 a 0,5 % em peso de daidzeína, e incubada durante 6 a 30 horas, preferivelmente 7 a 24 horas, mais preferivelmente 7 a 18 horas em uma temperatura permitindo o desenvolvimento celular. A temperatura não é limitada, e pode ser a temperatura adotada na Primeira Etapa.

Célula recombinante usada na Quarta Etapa

[000397] Qualquer célula recombinante pode ser usada na Quarta Etapa uma vez que a célula contém o polinucleotídeo E1 e é capaz de expressar o polinucleotídeo E1. As células recombinantes detalhadas na seção A-4 podem ser usadas na etapa.

Produção de enzima consistindo no polipeptídeo E1 usando Célula Recombinante possuindo polinucleotídeo E1

[000398] A enzima consistindo no polipeptídeo E1 pode ser produzida pelo cultivo da célula recombinante depois da introdução do polinu- cleotídeo E2 e por coleta do polipeptídeo E1 da cultura celular. Mais especificamente, o polipeptídeo E1 pode ser produzido pela cultura da célula recombinante sob as condições detalhadas na seção A-5.

Quinta Etapa

[000399] A Quinta Etapa induz uma célula recombinante possuindo o polinucleotídeo E2 tal como detalhado na seção B-2 a agir sobre a dii- drodaidzeína, desse modo convertendo a diidrodaidzeína em tetrai- drodaidzeína.

[000400] A reação na Quinta Etapa pode ser realizada sob as mesmas condições como aquelas da Segunda Etapa. Mais especificamente, a célula recombinante é inoculada no meio de cultura contendo 0,001 a 1% em peso, preferivelmente 0,01 a 0,5 % em peso, mais preferivelmente 0,01 a 0,1 % em peso de daidzeína, e incubada durante 7 a 30 horas, preferivelmente 15 a 24 horas, mais preferivelmente 17 a 20 horas em uma temperatura permitindo o desenvolvimento celular. A temperatura não é limitada, e pode ser a temperatura adotada na Segunda Etapa .

Célula recombinante usada em Quinta Etapa

[000401] Qualquer célula recombinante pode ser usada na Quinta Etapa uma vez que a célula contém o polinucleotídeo E2 descrito na seção B-2 e é capaz de expressar o polinucleotídeo E2. Um exemplo é uma célula recombinante detalhada na seção B-4.

Produção de enzima consistindo no polipeptídeo E2 usando Célula Recombinante possuindo o polinucleotídeo E2

[000402] A enzima consistindo no polipeptídeo E2 pode ser produzida pelo cultivo da célula recombinante depois da introdução do polinu- cleotídeo E2 e por coleta do polipeptídeo E2 das células e/ou cultura.

[000403] As mesmas maneiras e condições como aquelas na seção "Produção de enzima consistindo no polipeptídeo E1 usando célula recombinante possuindo polinucleotídeo E1" podem ser usadas para incubação de célula recombinante provida com o polinucleotídeo E2, meio de cultura, e isolamento/purificação de polipeptídeo E2.

Sexta Etapa

[000404] A Sexta Etapa induz uma célula recombinante possuindo o polinucleotídeo E3 tal como detalhado na seção C-2 a agir sobre a te- traidrodaidzeína, desse modo convertendo a tetraidrodaidzeína em equol.

[000405] A reação na Sexta Etapa pode ser realizada sob as mesmas condições como aquelas da Terceira Etapa. Mais especificamente, a célula recombinante é inoculada no meio de cultura contendo 0,001 a 1% em peso, preferivelmente 0,01 a 0,5 % em peso, mais preferivelmente 0,01 a 0,1 % em peso de tetraidrodaidzeína, e incubada durante 7 a 30 horas, preferivelmente 15 a 24 horas, mais preferivelmente 17 a 20 horas em uma temperatura permitindo o desenvolvimento celular. A temperatura não é limitada, e pode ser a temperatura adota da na Terceira Etapa.

[000406] A fonte de tetraidrodaidzeína usada como um substrato na Sexta Etapa também não é limitada.

[000407] Por exemplo, a tetraidrodaidzeína produzida na Quinta Etapa de diidrodaidzeína pode ser usada como um substrato para Sexta Etapa. A tetraidrodaidzeína é usada ou na forma de uma solução contendo tetraidrodaidzeína como produzida na Quinta Etapa, ou em um estado toscamente refinado ou estado apropriadamente refinado.

[000408] As tetraidrodaidzeínas comercialmente disponíveis ou te- traidrodaidzeínas sintetizadas por meio de métodos apropriados podem também ser usadas.

[000409] Além disso, a síntese de composição de material de tetrai- drodaidzeína contendo células recombinantes contendo polinucleotí- deo E3; e tetraidrodaidzeína pode ser usada como uma mistura de materiais de partida na produção de tetraidrodaidzeína na Sexta Etapa. Por incubação da composição sob as condições anteriores, a tetrai- drodaidzeína na composição é convertida em equol. As mesmas condições e restrições tal como acima são aplicadas para determinar as concentrações das células recombinantes e tetraidrodaidzeína na composição, outros ingredientes adicionados à composição, condição de reação, etc.

[000410] Na Sexta Etapa, é preferível usar tetraidrodaidzeína, produzida na Quinta Etapa usando diidrodaidzeína como um substrato; entretanto, a tetraidrodaidzeína comercialmente disponível, uma composição de material de partida de síntese, uma composição de enzima etc. podem ser misturadas com a tetraidrodaidzeína produzida na Quinta Etapa.

Célula recombinante usada na Sexta Etapa

[000411] Qualquer célula recombinante pode ser usada na Sexta Etapa uma vez que a célula contém o polinucleotídeo E3 descrito na seção C-2 e é capaz de expressar o polinucleotídeo E3. Um exemplo é uma célula recombinante detalhada na seção C-4.

Produção de enzima consistindo no polipeptídeo E3 usando Célula Recombinante possuindo polinucleotídeo E3

[000412] A enzima consistindo no polipeptídeo E3 pode ser produzida pelo cultivo da célula recombinante depois da introdução do polinu- cleotídeo E3 e por coleta do polipeptídeo E3 das células e/ou cultura.

[000413] As mesmas maneiras e condições como aquelas da seção "Produção de enzima consistindo no polipeptídeo E1 usando célula recombinante possuindo polinucleotídeo E1" podem ser usadas para incubação de célula recombinante provida com o polinucleotídeo E3, meio de cultura, e isolamento/purificação de polipeptídeo E3.

E1 a E3 polinucleotídeos

[000414] O Quarto Método de Produção da presente invenção usa pelo menos um de E1 a E3 polinucleotídeos, que são detalhados nas seções anteriores A-2, B-2 e C-2, respectivamente.

D-I-8. Produto contendo diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol, produzido pelo Quarto Método de Produção

[000415] A presente invenção fornece um produto contendo diidro- daidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol, produzido pelo Quarto Método de Produção antecedente.

[000416] Tal como acima descrito, o Quarto Método de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína, tetraidro- daidzeína, e/ou equol por combinação apropriadamente da Quarta a Sexta Etapas.

[000417] Consequentemente, o produto produzido pelo Quarto Método de Produção da presente invenção contém diidrodaidzeína, te- traidrodaidzeína, e/ou equol.

[000418] O produto da presente invenção pode ser usado na forma da solução como produzida no Quarto Método de Produção, ou pode ser um produto de diidrodaidzeína, um Produto de tetraidrodaidzeína ou um Produto de equol obtido por purificação grosseiramente ou adequadamente da solução.

[000419] O produto da presente invenção pode ser incorporado em alimentos, drinques, ou materiais de produto de maquilagem, produtos medicinais etc., ou pode ser usado como um substrato.

D-II-1. Um dispositivo para produção de diidrodaidzeína, tetraidro- daidzeína e/ou equol, fornecido com pelo menos um do Primeiro Vaso de Reação ao Terceiro Vaso de Reação

[000420] A presente invenção fornece um dispositivo para produção de diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol, fornecido com pelo menos um dos seguintes Primeiro Vaso de Reação a Terceiro Vaso de Reação (a seguir, este dispositivo é ocasionalmente referido como "Primeiro Dispositivo de Produção ").

Primeiro Vaso de Reação

[000421] O Primeiro Vaso de Reação é um vaso de reação possuindo um meio de reação (a seguir, este meio é ocasionalmente referido como "meio de reação 1") no qual uma enzima consistindo em um de (Aa) a (Ac) polipeptídeos (polipeptídeos E1) é imobilizada. Este vaso de reação é usado para produção de diidrodaidzeína de daidzeína usando o polipeptídeo. Neste vaso de reação, um meio de reação é disposto em uma posição permitindo contato com a daidzeína.

Segundo Vaso de Reação

[000422] O Segundo Vaso de Reação é um vaso de reação possuindo um meio de reação (a seguir, este meio é ocasionalmente referido como "meio de reação 2") no qual uma enzima consistindo em um de (Ba) a (Bc) polipeptídeos (polipeptídeos E2) é imobilizada. Este vaso de reação é usado para produção de tetraidrodaidzeína de diidro- daidzeína usando o polipeptídeo. Em um vaso de reação, um meio de reação é disposto em uma posição permitindo contato com a diidro-daidzeína.

Terceiro Vaso de Reação

[000423] O Terceiro Vaso de Reação é um vaso de reação possuindo um meio de reação (a seguir, este meio é ocasionalmente referido como "meio de reação 3") no qual uma enzima consistindo em um de (Ca) a (Cc) polipeptídeos (polipeptídeos E3) é imobilizada. Este vaso de reação é usado para produção de equol de tetraidrodaidzeína usando o polipeptídeo. Em um vaso de reação, um meio de reação é disposto em uma posição permitindo contato com a tetraidrodaidzeína.

[000424] O Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol por combinação apropriadamente do Primeiro ao Terceiro Vasos de Reação.

[000425] O Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui pelo menos um do Primeiro Vaso de Reação, Segundo Vaso de Reação e Terceiro Vaso de Reação.

[000426] Por exemplo, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Primeiro Vaso de Reação, e não tem o Segundo Vaso de Reação e Terceiro Vaso de Reação, o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de dii- drodaidzeína de daidzeína.

[000427] Por exemplo, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Segundo Vaso de Reação, e não tem o Primeiro Vaso de Reação e Terceiro Vaso de Reação, o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de te- traidrodaidzeína de diidrodaidzeína.

[000428] Por exemplo, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Terceiro Vaso de Reação, e não tem o Primeiro Vaso de Reação e Segundo Vaso de Reação, o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de equol de tetraidrodaidzeína.

[000429] Por exemplo, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Primeiro Vaso de Reação e Segundo Vaso de Reação, e não tem o Terceiro Vaso de Reação, o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína de daidzeína, e tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína.

[000430] Por exemplo, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Segundo Vaso de Reação e Terceiro Vaso de Reação, e não tem o Primeiro Vaso de Reação, o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína.

[000431] Por exemplo, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Primeiro Vaso de Reação, Segundo Vaso de Reação, e Terceiro Vaso de Reação, o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína de daidzeína, tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetrai- drodaidzeína.

[000432] No Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção, um único vaso de reação pode possuir dois de um meio de reação 1 a 3.

[000433] Por exemplo, quando o meio de reação 1 e 2 são fornecidos em um único vaso de reação, as respectivas reações desempenhadas no Primeiro Vaso de Reação e Segundo Vaso de Reação podem ser desempenhadas em um vaso de reação. Além disso, por exemplo, quando um meio de reação 1 ao 3 são fornecidos em um único vaso de reação, as respectivas reações desempenhadas no Primeiro a Terceiro Vasos de Reação podem ser desempenhadas em um vaso de reação.

[000434] Na medida em que o efeito desejado é assegurado, o modo de montagem deste meio de reação a um vaso de reação não é limitado.

[000435] Além disso, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui pelo menos dois de um meio de reação 1 a 3 e múltiplos diferentes vasos de reação, os vasos de reação são conectados através de um meio de fornecimento.

[000436] Por exemplo, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Primeiro Vaso de Reação e Segundo Vaso de Reação, e não tem o Terceiro Vaso de Reação, no qual o Primeiro Vaso de Reação e Segundo Vaso de Reação são unidades independentes e o Primeiro Vaso de Reação e Segundo Vaso de Reação contêm um recurso de reação 1 e 2, respectivamente; o Primeiro Vaso de Reação e Segundo Vaso de Reação são conectados por meio de um recurso de suprimento para suprir um produto de diidrodaidzeína, produzido no Primeiro Vaso de Reação, ao Segundo Vaso de Reação.

[000437] Além disso, por exemplo, quando o Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção compreende um meio de reação 1 e 2 em um vaso de reação, e um meio de reação 3 em outro vaso de reação; um vaso de reação contendo um meio de reação 1 e 2 e um vaso de reação contendo um meio de reação 3 são conectados por meio de um recurso de suprimento para fornecimento de um produto, produzido em um vaso de reação contendo um meio de reação 1 e 2, a um vaso de reação contendo um meio de reação 3.

[000438] O produto pode ser uma forma de solução como produzido, ou pode ser um Produto de diidrodaidzeína etc. obtido por purificação grosseiramente ou adequadamente da solução.

Vaso de Reação

[000439] As formas, tamanhos, materiais etc. do Primeiro Vaso de Reação ao Terceiro Vaso de Reação fornecido no Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção não são limitados, dado que cada vaso é capaz de conter um meio de reação, e apropriadamente produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol.

Meio de Reação

[000440] O meio de reação 1 a 3 a ser usado no Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção não são limitados uma vez que cada um deles contêm uma respectiva enzima imobilizada, e é capaz de apropriadamente produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol.

[000441] A respectiva enzima imobilizada em cada meio de reação pode ser grosseiramente ou adequadamente (puramente) purificada. A imobilização de uma enzima consistindo em um dos polipeptídeos em um meio de reação é realizada usando um método conhecido.

[000442] Por exemplo, quando a enzima é imobilizada em um portador, o portador não é limitado uma vez que a atividade desejada de uma enzima pode ser exibida. Exemplos do portador incluem um portador possuindo um grupo funcional conectável com uma enzima através de ligação covalente, tal como grupos amino, grupos carboxila, ou grupos hidroxila; e um portador conectável com uma enzima consistindo no polipeptídeo através de um ligador. A forma do portador não é limitada. O portador, grupo de funcionamento, e ligador etc. são apropriadamente selecionados de acordo com a técnica conhecida adotada para imobilização de uma enzima no portador. A imobilização de uma enzima consistindo no polipeptídeo no portador é também realizada usando um método conhecido.

Meio de Fornecimento

[000443] O meio de fornecimento fornecido no Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção não é limitado uma vez que ele é capaz de conexão de múltiplos diferentes vasos de reação usados no Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção, e capaz de produzção de diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol no Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção. O meio de fornecimento é realizado por um meio apropriado de acordo com uma tecnologia conhecida adequada.

E1 a E3 polipeptídeo

[000444] E1 a E3 polipeptídeos usados no Primeiro Dispositivo de Produção da presente invenção são os mesmos como aqueles acima.

Produção de diidrodaidzeína no Primeiro Vaso de Reação

[000445] O Primeiro Vaso de Reação induz uma enzima consistindo no polipeptídeo E1 imobilizada em um meio de reação 1 a agir sobre a daidzeína na presença de NADPH e/ou NADH, desse modo convertendo daidzeína em diidrodaidzeína. A enzima consistindo no polipep- tídeo E1 pode ser imobilizada em um meio de reação junto com NADPH e/ou NADH que serve como uma coenzima de uma enzima consistindo no polipeptídeo E1. A reação no Primeiro Vaso de Reação é realizada de acordo com o método detalhado na explicação anterior de "Primeira Etapa".

Produção de tetraidrodaidzeína no Segundo Vaso de Reação

[000446] O Segundo Vaso de Reação induz uma enzima consistindo no polipeptídeo E2 imobilizada em um meio de reação 2 a agir sobre diidrodaidzeína na presença de NADPH e/ou NADH, desse modo convertendo diidrodaidzeína em tetraidrodaidzeína. A enzima consistindo no polipeptídeo E2 pode ser imobilizada em um meio de reação junto com NADPH e/ou NADH que serve como uma coenzima da enzima consistindo no polipeptídeo E2. A reação no Segundo Vaso de Reação é realizada de acordo com o método detalhado na explicação anterior de "Segunda Etapa".

Produção de equol no Terceiro Vaso de Reação

[000447] O Terceiro Vaso de Reação induz uma enzima consistindo no polipeptídeo E3 imobilizada em um meio de reação 3 a agir sobre a tetraidrodaidzeína, desse modo convertendo tetraidrodaidzeína em equol. A reação no Terceiro Vaso de Reação é realizada de acordo com o método detalhado na explicação anterior de "Terceira Etapa".

D-II-2. Um dispositivo para produção de diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol, compreendendo pelo menos um do Quarto ao Sexto Vasos de Reação

[000448] A presente invenção fornece um dispositivo para produção de diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol, compreendendo pelo menos um dos seguintes Quarto a Sexto Vasos de Reação (a seguir, este dispositivo é ocasionalmente referido como "Segundo Dispositivo de Produção").

Quarto Vaso de Reação

[000449] O Quarto Vaso de Reação é um vaso de reação possuindo um meio de reação (a seguir, este meio é ocasionalmente referido como "meio de reação 4") no qual uma célula recombinante consistindo em um de (Ad) a (Af) polinucleotídeos (polinucleotídeos E1) é imobilizada. Este vaso de reação é usado para produção de diidrodaidzeína de daidzeína usando o polinucleotídeo. Neste vaso de reação, um meio de reação é disposto em uma posição permitindo contato com daidzeína.

Quinto Vaso de Reação

[000450] O Quinto Vaso de Reação é um vaso de reação possuindo um meio de reação (a seguir, este meio é ocasionalmente referido como "meio de reação 5") no qual uma célula recombinante consistindo em um de (Bd) a (Bf) polinucleotídeos (polinucleotídeos E2) é imobilizada. Este vaso de reação é usado para produção de tetraidrodaidzeí- na de diidrodaidzeína usando o polinucleotídeo. Em um vaso de reação, um meio de reação é disposto em uma posição permitindo contato com diidrodaidzeína.

Sexto Vaso de Reação

[000451] O Sexto Vaso de Reação é um vaso de reação possuindo um meio de reação (a seguir, este meio é ocasionalmente referido como "meio de reação 6") no qual uma célula recombinante consistindo em um de (Cd) a (Cf) polinucleotídeos (polinucleotídeos E3) é imobilizada. Este vaso de reação é usado para produção de equol de tetrai- drodaidzeína usando o polinucleotídeo. Em um vaso de reação, um meio de reação é disposto em uma posição permitindo contato com tetraidrodaidzeína.

[000452] O Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol por combinação apropriadamente do Quarto ao Sexto Vasos de Reação.

[000453] O Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui pelo menos um de Quarto Vaso de Reação, Quinto Vaso de Reação e Sexto Vaso de Reação.

[000454] Por exemplo, quando o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui Quarto Vaso de Reação, e não tem o Quinto Vaso de Reação e Sexto Vaso de Reação, o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de diidro- daidzeína de daidzeína.

[000455] Por exemplo, quando o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Quinto Vaso de Reação, e não tem o Quarto Vaso de Reação e Sexto Vaso de Reação, o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de tetraidro- daidzeína de diidrodaidzeína.

[000456] Por exemplo, quando o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Sexto Vaso de Reação, e não tem o Quarto Vaso de Reação e Quinto Vaso de Reação, o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de equol de tetraidrodaidzeína.

[000457] Por exemplo, quando o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Quarto Vaso de Reação e Quinto Vaso de Reação, e não tem o Sexto Vaso de Reação, o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeí- na de daidzeína, e tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína.

[000458] Por exemplo, quando o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Quinto Vaso de Reação e Sexto Vaso de Reação, e não tem o Quarto Vaso de Reação, o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de tetraidro- daidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetraidrodaidzeína.

[000459] Por exemplo, quando o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Quarto Vaso de Reação, Quinto Vaso de Reação, e Sexto Vaso de Reação, o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção permite produção de diidrodaidzeína de daidzeína, tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína, e equol de tetraidro- daidzeína.

[000460] No Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção, um único vaso de reação pode possuir dois de um meio de reação 4 a 6.

[000461] Por exemplo, quando o meio de reação 4 e 5 são fornecidos em um único vaso de reação, as respectivas reações desempenhadas no Quarto Vaso de Reação e Quinto Vaso de Reação podem ser desempenhadas em um vaso de reação. Além disso, por exemplo, quando um meio de reação 4 ao 6 são fornecidos em um único vaso de reação, as respectivas reações desempenhada no Quarto ao Sexto Vasos de Reação podem ser desempenhadas em um vaso de reação.

[000462] Na medida em que o efeito desejado é assegurado, o modo de montagem deste meio de reação a um vaso de reação não é limitado.

[000463] Além disso, quando o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui pelo menos dois de um dos meios de reação 4 a 6 e múltiplos diferentes vasos de reação, os vasos de reação são conectados através de um meio de fornecimento.

[000464] Por exemplo, quando o Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção possui o Quarto Vaso de Reação e Quinto Vaso de Reação, e não tem o Sexto Vaso de Reação, em que o Quarto Vaso de Reação e o Quinto Vaso de Reação são unidades independentes e o Quarto Vaso de Reação e Quinto Vaso de Reação contêm um recurso de reação 4 e 5, respectivamente; o Quarto Vaso de Reação e Quinto Vaso de Reação são conectados por meio de um recurso de suprimento para suprir um produto de diidrodaidzeína, produzido no Quarto Vaso de Reação, ao Quinto Vaso de Reação.

[000465] Além disso, por exemplo, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção compreende os métodos de reação 4 e 5 em um vaso de reação, e os métodos de reação 6 em outro vaso de reação; o vaso de reação contendo os métodos de reação 4 e 5 e o vaso de reação contendo os métodos de reação 6 são conectados por um meio de fornecimento para fornecer um produto, produzido no vaso de reação contendo os métodos de reação 4 e 5, ao vaso de reação contendo os métodos de reação 6.

[000466] O produto pode ser uma forma de solução quando produzido, ou pode ser um produto de diidrodaidzeína etc. obtido grosseiramente ou apropriadamente purificando-se a solução.

Vaso de reação

[000467] As formas, tamanhos, materiais, etc. do Quarto Vaso de Reação ao Sexto Vaso de Reação de reação fornecido no Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção não estão limitados, determinado que cada vaso é capaz de conter um meio de reação, e apropriadamente produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol.

Meios de Reação

[000468] Os meios de reação 4 a 6 a serem usados no Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção não estão limitados contanto que cada contenha uma respectiva célula recombinante imobilizada, e seja capaz de apropriadamente produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol.

[000469] A imobilização da célula recombinante nos métodos de reação não está limitada contanto que a atividade desejada da célula re- combinante possa ser exibida, e realizada usando um método conhe- cido. A célula recombinante pode ser incubada ou incubável nos meios de reação. As condições para a incubação das células recombinantes são determinadas de acordo com as explicações anteriores da "Quarta Etapa", "Primeira Etapa", e "Sexta Etapa".

Meios de Fornecimento

[000470] Os meios de fornecimento fornecidos no Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção não estão limitados contanto que sejam capazes de conectar vasos de reação plurais diferentes usados no Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção, e capazes de produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol no Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção. Os meios de fornecimento são realizados por um meio apropriado de acordo com uma tecnologia conhecida adequada.

Células Recombinantes

[000471] As células recombinantes usadas no Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção são iguais àquelas detalhadas nas seções anteriores "Células Recombinantes usadas na Quarta Etapa", "Célula Recombinante usada na Primeira etapa", e "Célula recombi- nante usada na Sexta Etapa".

Polipeptídeo E1 a E3

[000472] Os polinucleotídeos E1 a E3 usados no Segundo Dispositivo de Produção da presente invenção são iguais àqueles acima.

Produção de diidrodaidzeína no Quarto vaso de reação

[000473] O quarto vaso de reação converte daidzeína em diidro- daidzeína usando uma célula recombinante consistindo em polinucleo- tídeo E1 imobilizado nos métodos de reação 4. A reação no quarto vaso de reação é realizada de acordo com o método detalhado na explicação anterior da "Quarta Etapa".

Produção de tetraidrodaidzeína no Quinto vaso de reação

[000474] O Quinto vaso de reação converte diidrodaidzeína em te- traidrodaidzeína usando uma célula recombinante que consiste em polinucleotídeo E2 imobilizado nos métodos de reação 5. A reação no Quinto vaso de reação é realizada de acordo com o método detalhado na explicação anterior da "Primeira etapa".

Produção de equol no Sexto vaso de reação

[000475] O Sexto vaso de reação converte tetraidrodaidzeína em equol usando uma célula recombinante que consiste em polinucleotí- deo E3 imobilizado nos métodos de reação 6. A reação no Sexto vaso de reação é realizada de acordo com o método detalhado na explicação anterior da "Sexta Etapa".

D-II-3. Dispositivo para produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol, compreendendo pelo menos um dentre o Primeiro ao Terceiro vasos de reação, e pelo menos um dentre o Quarto ao Sexto vasos de reação

[000476] A presente invenção fornece um dispositivo para produzir diidrodaidzeína, tetraidrodaidzeína e/ou equol, compreendendo pelo menos um dentre o Primeiro ao Terceiro vasos de reação, e pelo menos um dentre o Quarto ao Sexto vasos de reação (a seguir, este dispositivo é ocasionalmente referido como o "Terceiro Dispositivo de Produção").

[000477] As combinações dos vasos de reação, meios de reação no Terceiro Dispositivo de Produção são feitas de acordo com aquelas dos Primeiro e Segundo Dispositivo de Produção anteriores. Os vasos de reação, meios de reação, polinucleotídeos, células recombinantes, e s processos de reação nos vasos de reação no Terceiro Dispositivo de Produção são iguais aqueles para o Primeiro e Segundo Dispositivos de Produção anteriores.

Exemplos Exemplo A Exemplo de referência A1

[000478] Uma cepa Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) foi inoculada em um meio líquido de amplificação contendo daidzeína (um meio de caldo GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.) no qual a daidzeína foi adicionada em uma quantidade de 10 μg/mL), e a cultura foi incubada a 37°C durante horas apropriadas de 7 a 18 horas sob condições anaeróbicas (BBL Gas Pack systems). Após a incubação, as células foram coletadas por centrifugação e criogenicamente preservadas para serem usadas nos Exemplos abaixo.

Exemplo A1: Confirmação de Atividade de Biossíntese de diidrodaidze- ína no Sobrenadante Centrifugado de Material celular rompido, e Confirmação de Dependência de NADPH

[000479] As células congeladas (garrafa de 67mL x 2) foram descongeladas, e centrifugadas em 4°C em 8.000rpm durante 10 minutos. O pélete foi usado no teste abaixo. Primeiro, o pélete foi suspenso em 2 ml de uma solução de fosfato-potássio a 0,1 M contendo PMSF a 1mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), DTT a 2mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e hidrossulfeto de sódio a 5mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Uma suspensão foi fornecida para dois tubos de 2ml com tampas de roscas (Assist) e pré-suplementada com contas de zircônia/sílica a 0,1mM (BioSpec Products, Inc.). As células foram rompidas usando FastPrep® FP100A (Thermo ELECTRON CORPORATION) (6500rpm, 10 segundos, resfriamento com gelo x8). O líquido resultante foi centrifugado para obter o sobrenadante. A sus-pensão de célula rompida foi centrifugada em cerca de 10.000 rpm em 4°C durante 10 minutos para obter um sobrenadante, que foi em seguida diluído para 4,5 mL com solução de fosfato de potássio a 0,1 M contendo PMSF a 1 mM, DTT a 2 mM e hidrossulfeto de sódio a 5 mM. Isto foi usado como uma fonte de enzima.

[000480] Uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e a mistura foi incubada a 37°C durante 2 horas. Após a incubação, 3 mL de acetato de etila foram adicionados à mistura de reação de enzima para extração. Após a secagem, o extrato foi dissolvido pela fase móvel (eluent). O produto dissolvido foi analisado por HPLC. Como a solução padrão para Análise de HPLC, uma solução misturada de daidzeína (2 μg/mL; Funakoshi Corporation), equol (2 μg/mL; Funakoshi Corporation), diidrodaidzeína (2 μg/mL; Toronto Research Chemicals Inc.) foi usada. Composição de Mistura de reação de enzima Sobrenadante de células rompidas (fonte de enzima): 250 μl Água esterilizada, NADH (100mM) ou NADPH (100mM): 5 μl Diidrodaidzeína (1 mg/ml): 10 μl Tampão de fosfato de potássio a 0,1 M pH 7/ DTT a 1mM / sódioidrossulfeto a 5mM: 735 μl Total: 1.000 μl

[000481] Os resultados são mostrados na FIG. 1. Os resultados confirmaram a presença de atividade de biossíntese de diidrodaidzeína no sobrenadante centrifugado do material celular rompido. Foi também confirmado que a conversão de daidzeína em diidrodaidzeína é dependente da coenzima NADH.

Exemplo A2: Purificação de Enzima de Sintetização de diidrodaidzeína

[000482] As células de cepa Lactococcus 20-92 foram incubadas durante 18 horas em um meio de caldo GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.), 67 ml por garrafa de incubação. As células cultivadas de nove das tais garrafas foram centrifugadas, e suspensas em um tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7) contendo DTT a 2 mM (1, 4-Ditiotreitol, Merck), hidrossulfeto de sódio a 5 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e inibidor de proteinase (coquetel inibidor de proteinase completa livre de EDTA, Roche Diagnostics). A suspensão foi fornecida para três tubos de 2 ml com tampas de rosca (Assist) os quais previamente contêm contas de zircônia/sílica a 0,1mM (BioS- pec Products, Inc.). As células foram rompidas usando FastPrep® FP100A (Thermo ELECTRON CORPORATION) (6500rpm, 20 segundos x 4). O líquido resultante foi centrifugado para obter o sobrenadan- te. As células da cepa Lactococcus 20-92 foram incubadas durante 18 horas no mesmo meio líquido, 200 ml por garrafa de incubação. As células cultivadas de oito tais garrafas foram centrifugadas para obter o sobrenadante equivalente a oito garrafas.

[000483] A purificação foi realizada usando um tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0) ("Tampão A", a seguir) contendo PMSF a 1mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila, Sigma Aldrich), hidrossulfeto de sódio a 2 mM DTT e 5mM. O sobrenadante rompido das células foi misturado com Tampão A contendo a mesma quantidade de sulfato de amônio a 2 M, e colocado em colunas in colunas micro bio giratórias (x11, Bio-Red Laboratories, Inc.) cheias com Fluxo rápido de butil sefa- rose 4 (o gel foi cerca de 0,3 ml por garrafa, GE Healthcare) e equilibrado com Tampão A contendo sulfato de amônio a 1 M. Após ser lavado com Tampão A contendo sulfato de amônio a 1 M e enxaguado duas vezes subsequentemente com 0,75 ml de Tampão A contendo sulfato de amônio a 0,5 M, 0,75 ml e em seguida 0,5 ml de Tampão A foi adicionado para eluir uma fração tendo uma atividade de síntese de diidrodaidzeína. A seguir, o eluato obtido adicionando-se 0,75 ml de Tampão A é referido como um eluato I, e o eluato obtido adicionando- se 0,5 ml de Tampão A é referido como um eluato II.

[000484] 0,3 ml e 0,2 ml de Tampão A contendo sulfato de amônio a 3,4M foram adicionados ao eluato I (com 0,75 ml de Tampão A) e o eluato II (com 0,5 ml de Tampão A), respectivamente. Em seguida, os dois eluatos foram misturados para serem submetidos a HPLC usando coluna TSKgel Ether-5PW (TOSOH) equilibrada com um eluente contendo sulfato de amônio a 1 M. 0,5 ml da solução misturada foi derramado para a coluna 2 a 9 vezes, seguido por lavagem em uma taxa de fluxo de 0,1 ml/min usando um eluente contendo sulfato de amônio a 1 M (Eluente B). A seguir, a relação de mistura de Eluente B para Eluen- te A foi mudada usando um programa para que a concentração de sulfato de amônio linearmente descesse para 0M (Eluente A) em 15 minutos. A atividade enzimática foi observada na posição de eluição de sulfato de amônio a cerca de 0,6 M a 0,35 M, e o eluato total foi cerca de 3,5 ml. O seguinte mostra as condições na HPLC. A absorção de proteína a 280 nm foi observada. Coluna: TSKgel Ether-5PW Taxa de Fluxo: 0,05 a 0,1 ml/min em fornecimento de amostra, 0,1 ml/min em eluição Eluente A: tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0)/ DTT a 2mM /hidrossulfeto de sódio a 2,5mM /1% 2-propanol Eluente B: Eluente A contendo sulfato de amônio a 1M

[000485] O eluato da posição de eluição onde a atividade enzimática foi observada foi diluído com Tampão A, e o líquido diluído foi submetido à coluna microbiogiratória carregada com 2'5' ADP Sefarose 4B (GE Healthcare; o gel foi cerca de 0,3 ml por garrafa), equilibrado com Tampão A. Após a lavagem da coluna com Tampão A, a fração tendo a atividade de síntese de diidrodaidzeína foi eluída com 0,7 ml, e em seguida 0,6 ml de líquido da composição do Tampão A de pH 7,5 contendo NADPH a 20 mM.

[000486] O eluato obtido foi submetido a HPLC usando uma coluna a Mono Q (GE Healthcare) equilibrada com Eluente C (pH 7,5). O eluen- te C foi fornecido para a coluna em uma taxa de fluxo = 0,1 ml/min. Após a lavagem, a relação de mistura de Eluente C para Eluente D foi mudada para realizar um programa para linearmente converter em NaCl a 0,65 M durante 32,5 minutos. O seguinte mostra as condições na HPLC. Absorção de proteína de 280 nm foi observada.coluna: Mono Q PC 1.6/5 Eluente C: tampão de fosfato de potássio a 0,1 M pH 7,5/DTT a 3mM / hidrossulfeto de sódio a 2,5 mM / 1% de 2-propanol Eluente D: Eluente C contendo NaCl a 1 M

[000487] A atividade enzimática foi observada em fração de NaCl a 0,4 a 0,46 M (fração n° 28 a 30).

[000488] Fig. 2 mostra o resultado de Mono Q HPLC e da atividade enzimática. Fig. 3 mostra o resultado de SDS-PAGE para as frações n° 27 a 31. De acordo com esses resultados, uma faixa de 70 kDa foi observada na fração tendo uma atividade de síntese de diidrodaidzeína sob condição de redução.

Exemplo A3: Determinação da sequência de aminoácido de terminal de N

[000489] 30 μl de 0,1 % de ácido trifluoroacático (TFA) foram adicio nados a 70μl de fração, n° 29 tendo uma atividade de síntese de dii- drodaidzeína obtida pelo Mono Q HPLC (100μl no total).

[000490] Uma membrana de PVDF de cartucho ProSorb (Applied Biosystems Japão) foi umedecida com 10 μl de metanol, e o líquido misturado precedente foi adicionado. Após a absorção de água usando um filtro ProSorb (Applied Biosystems Japão), a membrana foi secada, e em seguida cortada usando um furador de membrana (Applied Biosystems Japão). A membrana foi lavada cinco vezes com 20% de metanol, e secada. A membrana foi submetida a análise de sequência de aminoácido de terminal de N usando um seqüenciador de protein (Applied Biosystems, Procise 494cLC), desse modo encontrando uma sequência de aminoácido contínua tendo os seguintes 22 resíduos.Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Ile Gly Asn Leu Glu Val Glu Asn (SEQ ID NO: 19)

Exemplo A4: Determinação de sequência de aminoácido

[000491] A proteína de enzima exibindo uma atividade de síntese de diidrodaidzeína foi fragmentada usando uma enzima digestiva em um peptídeo. A sequência de aminoácido interna foi encontrada analisando-se a sequência de aminoácido no Terminal de N do peptídeo.

(1) Preparação da amostra

[000492] As células da cepa Lactococcus 20-92 foram incubadas durante 18 horas em um meio de caldo GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.), 200 ml por garrafa de cultura. Três cepas das células cultivadas foram centrifugadas e suspensas em um tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0) contendo DTT a 2 mM (1, 4- Ditiotreitol, Merck), 5 mM de hidrossulfeto de sódio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e inibidor de proteinase (livre de EDTA de coquetel inibidor de proteinase completo, Roche Diagnostics). A suspensão foi então transferida para um tubo de 2 ml (Assist) que tem uma tampa de rosca e contém contas de zircônia/sílica a 0,1mM (BioSpec Pro-ducts, Inc.). As células foram rompidas usando FastPrep® FP100A (Thermo ELECTRON CORPORATION) (6500 rpm, 20 segundos x4). O líquido resultante foi centrifugado para obter o sobrenadante.

[000493] Um tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7) ("Tampão A", a seguir) contendo PMSF a 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila, Sigma Aldrich), DTT a 2 mM e hidrossulfeto de sódio a 5 mM foi usado no seguinte processo. O sobrenadante rompido das células foi misturado com Tampão A contendo a quantidade equivalente de sulfato de amônio a 2 M, e colocado em coluna micro bio giratórias (x3, Bio-Red Laboratories, Inc.) carregada com Fluxo rápido de butil sefarose 4 (o gel foi cerca de 0,3 ml por garrafa, GE Healthcare), equilibrado com Tampão A contendo sulfato de amônio a 1 M. Após ser lavado com Tampão A contendo sulfato de amônio a 1 M e subsequentemente enxaguado duas vezes com 0,75 ml de Tampão A contendo sulfato de amônio a 0,5 M, 0,75 ml de Tampão A foi adicionado duas vezes para eluir uma fração tendo uma atividade de síntese de diidrodaidzeína.

[000494] A coluna micro bio giratória carregada com 2'5'ADP Sefarose 4B foi equilibrada com Tampão A, e em seguida 1,5 ml da solução anteriormente eluída foi adicionado. Após cinco horas de lavagem com 0,75 ml de Tampão A, a eluição foi realizada usando 0,75 ml, e em seguida 0,45 ml de Tampão A contendo NADPH a 20 mM. Os eluatos foram misturados e dessalinados e concentrados para 5 μl em um tubo de concentração de micro centrifugação (NANOSEP 10K OMEGA, Pall Life Sciences).

[000495] A solução concentrada foi misturada com um tampão de amostra de SDS-PAGE duplamente concentrada contendo 2- mercaptoetanol; e a mistura foi aquecida durante 7 minutos a 90°C antes de ser submetida a SDS-PAGE de acordo com o método de La- emmuli. O SuperSep HG 10 a 20% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi usado como uma placa de gel de eletroforese. Após mancha- mento com Colloidal Blue (Invitrogen) e descoloração subseqüente com água Milli-Q, uma faixa de eletroforese a 70 kDa foi excisada. Com um controle, um gel de tamanho equivalente e equimolar foi cortado da mesma porção em uma faixa na área de eletroforese de não proteína, e processado da mesma maneira. Um outro grupo de células foi processado da mesma maneira, e as células foram transferidas para uma membrana de PVDF após SDS-PAGE. Em seguida, uma faixa na mesma posição foi submetida a análise de sequência de aminoáci- do de terminal de N para confirmar a consistência com a sequência da fração n° 29 no Mono Q HPLC.

(2) Geração de digestão de enzima e carboxamidametila reduzida

[000496] Os géis excisados foram cortados em pedaços, descoloridos usando uma solução aquosa de acetonitrila a 50%, desidratados por ace- tonitrila, e secados com um espessante centrífugo (SpeedVac A160, Savant). Após a solução aquosa de hidrogencarbonato de amônio a 100 mM contendo 55 mM de DTT ter sido adicionada, a redução foi realizada durante uma hora a 56°C. Após a remoção de uma solução de DTT, uma solução aquosa de hidrogencarbonato de amônio a 100 mM contendo 100mM de iodoacetamida foi adicionada, e a mistura bloqueada por luz foi suavemente agitada durante 30 minutos para gerar carboxamidameti- la. Após remover o reagente de reação, o gel foi lavado sequencialmente com uma solução aquosa de acetonitrila a 50%, acetonitrila, uma solução aquosa de hidrogencarbonato de amônio a 100 mM, e acetonitrila, antes de ser secada em um espessante centrífugo. Tampão de Tris-HCL a 20 mM (pH 9) contendo 2 μg de Achromobacter protease I (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e 0,02 % de Tween 20 foi adicionado, e a digestão foi realizada a 37°C durante sete horas. O sobrenadante centrifugado foi transferido para outro tubo, e o gel foi misturado com acetonitrila a 60% - solução aquosa de TFA a 0,1 % e aquecido a 30°C durante 20 minutos. A mistura aquecida foi centrifugada durante 10 minutos x três vezes para obter fragmentos de peptídeo. O sobrenadante foi coletado para ser filtrado usando Ultrafree-MC (0,22 μm, Amicon), seguido por concentração centrífuga.

(3) Mapeamento de Peptídeo

[000497] Através de HPLC de fase reversa, o peptídeo resultante da digestão de enzima foi isolado. Coluna: μRPC C2/C18 SC2.1/10 (GE Healthcare Bio Science) Taxa de Fluxo: 0,1 ml/min Eluente E: 0,05 % de TFA Eluente F: 90% de acetonitrila/0,04 % de TFA Programa de Eluição: 0 minuto: 5 % de F 3 minutos: 5% de F 43 minutos: 65% de F 48 minutos: 100% de F 68 minutos: 100% de F Fração: 30 μl Detecção: 215 nm

[000498] Por exemplo, "0 minuto 5% de B" significa uso de um Elu- ente contendo Eluente E e Eluente F em uma quantidade de 95% e 5%, respectivamente, no tempo 0 na eluição.

(4) Análise de sequência de aminoácido interna

[000499] Em comparação com o cromatograma de controle, um pico de peptídeo derivado de enzima-proteína exibindo atividade de síntese de diidrodaidzeína foi selecionado, e a análise de sequência de ami- noácido de terminal de N foi realizada usando um seqüenciador de proteína (Applied Biosystems, Procise 492HT). Após a separação usando HPLC de fase reversa ter sido iniciada, a eluição foi iniciada em 20,6 minutos. O seguinte mostra a sequência de aminoácido (Pep- tídeo 1, a seguir) do pico da eluição. Phe Asp Glu Pro Val Tyr Pro Gln Ala Glu (SEQ ID NO: 20)

[000500] O seguinte mostra a sequência de aminoácido (Peptídeo 2, a seguir) do pico da eluição que foi iniciada em 22,1 minutos.Ala Ser Arg Met Val Met Asp Ala Val His Glu Gly Tyr Ile Ala Gly (SEQ ID NO: 21)

[000501] O pico da eluição que foi iniciado em 26,6 minutos foi um peptídeo que foi não especificamente afastado; entretanto, como mostrado abaixo, seu terminal de N teve glicina que é o 13o resíduo do Terminal de N da referida proteína de enzima (a seguinte sequência de aminoácido é chamada Peptídeo 3, a seguir).Gly Tyr Ile Gly Asn Leu Glu Val Glu Asn Arg Ala Ile Arg Met Pro Met (SEQ ID NO: 22)

[000502] Figura 4 mostra o resultado do mapeamento de peptídeo no exemplo A4, e sequências de aminoácido correspondendo aos picos respectivos. Pico 1 (20,6 minutos) Pico 2 (22,1 minutos) Pico 3 (26,6 minutos)

Exemplo A5: Amplificação de gene de enzima de síntese de diidro- daidzeína de Terminal de N e sequências de aminoácido parciais de polipeptídeo purificado

[000503] Com base no Terminal de N e sequências de aminoácido parciais obtidos nos Exemplos A3 e A4, um iniciador degenerativo foi designado e criado. Usando o DNA de genoma da cepa Lactococcus 20-92 como um modelo, a amplificação do gene que codifica a enzima de síntese de diidrodaidzeína foi tentada através de PCR degenerativo.

(1) Purificação de DNA de genoma da cepa Lactococcus 20-92

[000504] A cepa Lactococcus 20-92 incubada em um meio de cultura de caldo GAM modificado de 40 mL (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.) sob uma condição anaeróbica foi centrifugado durante dez minutos, em 5000 rpm, 4°C. O meio de cultura foi removido por decantação, e as células de bactéria foram coletadas. As células foram imediatamente suspensas em 11mL de uma solução B1 (contendo 200 μg/mL de RNase) no Conjunto de Tampão de DNA Genômico QIAGEN (Qiagen), e incubadas durante 16 horas a 37°C após serem misturadas com 300 μL de solução de Lisozima (100 mg/mL), e 500 μL de solução de Proteinase K QIAGEN (Qiagen). Em seguida, após terem sido misturadas com 4mL de solução B2 e várias vezes de mistura completa, incubação de três horas foi realizada a 50°C.

[000505] A cultura foi centrifugada durante dez minutos a 5000 rpm, 4°C. O sobrenadante foi derramado em uma coluna QIAGEN Genomic-tip 500/G (Qiagen) equilibrada com uma solução QBT para que o DNA de genoma aderisse à coluna. Após lavar a coluna duas vezes com 30 mL de uma solução QC, o DNA de genoma foi eluato da coluna usando 15 mL de QF; em seguida 10,5 mL de isopropanol foi adicionado ao sal fora do DNA. O DNA de genoma do tipo de fio precipitado foi colocado em um microtubo de 1,5 mL, lavado com 75% de eta- nol, e secado em ar, antes de ser dissolvido em 250 μL de uma solu- ção de TE (0,4 μg/μL). A concentração da solução de DNA de genoma desse modo obtida foi medida, e a solução foi em seguida ajustada para 40 ng/μL adicionando-se uma solução de TE. Esta solução de DNA foi usada como um modelo de PCR.

(2) Desenho e Produção de Iniciador Degenerativo

[000506] No desenho de iniciador degenerativo, para reduzir o número de degeneração, o códon mais freqüente em cada aminoácido foi usado para a sequência na extremidade 5' de acordo com a informação de uso de códon (Base de Dados de Uso de Códon http://www.kazusa.or.jp/codon/) de Lactococcus garvieae. Além disso, uma base misturada foi usada para a sequência de extremidade de 3' para evitar o desequilíbrio com o gene de enzima de síntese de diidro- daidzeína.

[000507] O seguinte iniciador degenerativo foi designado e criado com base da sequência de terminal de N: MKNKFYPKTFERGYIGN- LEVEN determinada no exemplo A3, para ser usado para PCR degenerativo. E1-terminal de N-31: TGAAGAATAANTTNTAYCC- NAARACNTTYGA (SEQ ID NO: 23) (Na SEQ ID NO: 23, "N" nas 11a e 14a posições representa inosina, e "N" nas 20a e 26a posições representa adenina, guanina, citosina ou timina.) E1-terminal de N-37: TGAAGAATAANTTNTAYCC- NAARACNTTYGARRGNGG (SEQ ID NO: 24) (Em SEQ ID NO: 24, "N" nas 11a, 14a, 20a e 26a posições representam inosina, e "N" na 35a posição representa adenina, guani- na, citosina ou timina.) E1-terminal de N-F32: ATGAAGAATAAGTTTTAYCC- NAARACNTTYGA (SEQ ID NO: 25) (Em SEQ ID NO: 25, "N" nas 21a e 27a posições represen- tam adenina, guanina, citosina ou timina.)

[000508] Além disso, o seguinte iniciador degenerativo foi designado e criado com base no Peptídeo 2 de sequência interna: ASRMVMDA- VHEGYIAG determinado no exemplo A4, para ser usado para PCR degenerativo.E1-interno-RP1: CCTGCAATATAACCTTCATGTACNG-CRTCCATNACCAT (SEQ ID NO: 26) (Em SEQ ID NO: 26, "N" nas 24a e 33a posições representa adenina, guanina, citosina ou timina.)

[000509] Todos os oligo DNAs usados como os iniciadores do presente Exemplo foram produzidos por Sigma-Aldrich Japão K.K.

(3) Amplificação de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína através de PCR degenerativo.

[000510] Uso do iniciador degenerativo produzido, amplificação de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína por modo de PCR degenerativo foi tentado.

[000511] Os seguintes são as combinações dos iniciadores degenerativos usados no PCR degenerativo. (i) E1-Terminal de N-31 e E1-interno-RP1 (ii) E1-Terminal de N-37 e E1-interno-RP1 (iii) E1-Terminal de N-F32 e E1-interno-RP1

[000512] Na amplificação de gene de enzima de síntese de diidro- daidzeína através de PCR degenerativo, Ex-Taq DNA polimerase (Ta- kara Bio Inc.) foi usado. O programa de amplificação foi: 95°C, 2min (95 °C, 45 seg; 38°C a 54°C, 30seg; 72°C, 2 min) x 50 ciclos, e 72°C, 3 min. Em atenção ao desequilíbrio com o DNA de genoma do iniciador degenerativo, o anelamento foi realizado em 5 estágios, começando em 38°C, com um aumento de temperatura de 4°C antes de cada estágio adicional, até 54°C. Após a reação de PCR, 1/10 de 10xDye foi adicionado ao produto de PCR. 6 μL do produto foram submetidos a eletroforese usando 0,8% de gel de agarose. Na eletroforese de agarose no presente Exemplo, a coloração foi realizada usando brometo de etídio; e À/StyI (Nippongene Co. Ltd.) e escada de 100 bp (Toyobo Co. Ltd.) foram usados como marcadores de peso molecular.

[000513] Figura 5 mostra o resultado de eletroforese de produto de PCR degenerativo. Para a combinação (E1-Terminal de N-F32 e E1- interno-RP1) do iniciador degenerativo (iii) em (3) do presente Exemplo, cerca de 1,9 kb de amplificação foi observado no fragmento de DNA em quaisquer das temperaturas de anelamento. O aumento mais significante foi observado quando a temperatura de anelamento foi 54°C.

(4) Determinação da sequência de base de fragmento de DNA amplificado

[000514] O fragmento de DNA amplificado de cerca de 1,9kb (temperatura de anelamento = 54°C) foi excisado do gel de gel de agarose, e purificado usando um kit de extração de Gel (Qiagen). O fragmento de DNA purificado foi inserido em um Vetor de Clonagem pT7-Azul (Novagen) para determinar a sequência de base.

[000515] A sequência de base de DNA obtida foi analisada usando software de montagem de sequência de DNA SEQUENCHER (Gene Codes Inc, USA), com o resultado que o fragmento de DNA conteve as Sequências de base correspondendo às sequências de aminoácido de Peptídeos 1 e 3 encontrados no exemplo A4.

Exemplo A6: Determinação de sequência de base total de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína

[000516] Para determinar as Sequências de extremidade 5' e extremidade 3' do gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína de 1,9kb obtido no exemplo A5 para determinar as Sequências de base inteiras, amplificação rápida de sequência de terminal de cDNA (5'-, 3'-RACE) foi realizada usando a biblioteca de DNA de genoma da cepa Lactococcus 20-92 como um modelo.

(1) Produção de biblioteca de DNA de genoma

[000517] O DNA de genoma da cepa Lactococcus 20-92 purificada no exemplo A5 foi fragmentado através de 16 horas de digestão a 37°C, usando endonuclease de restrição (BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SacI, SalI, Sau3AI, XhoI: produtos de Takara Bio Inc.). Após processamento com fenol/clorofórmio, o fragmento foi purificado por sedimentação de etanol. Os fragmentos de DNA de genoma purificados foram ligados com vetores de clonagem pUC19, que foram previamente excisados por endonuclease de restrição correspondente e desfos- forilados por Shrimp Alkaline Phosphatase (Takara Bio Inc.), usando a TaKaRa Ligation kit var.2.1 (Takara Bio Inc.), desse modo produzindo uma biblioteca de DNA de genoma.

(2) Amplificação rápida de sequência de terminal de cDNA (5'-RACE, 3'-RACE)

[000518] A biblioteca de DNA de genoma (líquido de reação de ligação) foi diluída 20 vezes com água esterilizada. A amplificação das Sequências de extremidade 5' e extremidade 3' do gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína através de amplificação rápida de Sequências de terminal de cDNA (5'-RACE, 3'-RACE) foi tentada usando um modelo de 1 μL.

(2-1) Iniciador

[000519] Os seguintes são as combinações dos iniciadores usados para 5'-RACE, 3'-RACE, respectivamente. (2-1-1) 5'-RACE Primeiro-PCR: E1-RACE-N-P1 e pUC19-FP-1, E1-RACE-N- P1 e pUC19-RP-1 PCR Embutido: E1-RACE-N-P2 e pUC19-FP-2, E1-RACE- N-P2 e pUC19-RP-2 (2-1-2) 3'-RACE Primeiro-PCR: E1-RACE-RP2-1 e pUC19-FP-1, E1-RACE- RP2-1 e pUC19-RP-1 PCR Embutido: E1-RACE-RP2-2 e pUC19-FP-2, E1-RACE- RP2-2 e pUC19-RP-2

(2-1-3) sequência do iniciador usado

[000520] Os seguintes são as sequências de iniciadores usados para 5'-RACE, 3'-RACE, respectivamente. Iniciadores para Vetor: pUC19-FP-1: ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG (SEQ ID NO: 27) pUC19-RP-1: AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTG- CAAGGC (SEQ ID NO: 28) pUC19-FP-2: ATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTG- CAGG (SEQ ID NO: 29) pUC19-RP-2: CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGG- CCAG (SEQ ID NO: 30)

[000521] Iniciadores para gene de enzima de síntese de diidro- daidzeína E1-RACE-N-P1: ATGCGGATCGCTCGGTTCTCGAC- CTCTAGGTTAC (SEQ ID NO: 31) E1-RACE-RP2-1: ATCGAGGAGAAGTGCGAGGAC- GTCAGGGTCATC (SEQ ID NO: 32) E1-RACE-N-P2: TTCTCGACCTCTAGGTTAC- CGATGTAGCCGC (SEQ ID NO: 33) E1-RACE-RP2-2: ACGTCAGGGTCATCGG- CATCGGCGACTGCAAG (SEQ ID NO: 34)

[000522] Todos os oligo DNAs usados como os iniciadores no presente Exemplo foram produzidos por Sigma-Aldrich Japão K.K.

(2-2) Amplificação das Sequências de extremidade 5' e extremidade 3' do gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína usando 5'-RACE e 3'-RACE

[000523] Ex-Taq DNA polimerase (Takara Bio Inc.) foi usado para 5'- RACE, 3'-RACE. Primeiro-PCR e PCR Embutido foram realizados usando o mesmo programa de amplificação: 95°C 2min, (95°C 45 segundos, 60°C 30 segundos, 72°C 1 minuto) x 30 ciclos, 72°C 3 minutos. No Primeiro-PCR, 1 μL (40 ng) do líquido de diluição de DNA de genoma preparado da maneira supracitada foi usado como um modelo. No PCR Embutido, 0,5 μL do produto de Primeiro-PCR foi usado.

[000524] Após a reação de PCR Embutido, 1/10 de 10xdia foi adicionado ao produto de PCR, e 5μL da mistura foram submetidos a eletroforese com 0,8% de gel de agarose. A amplificação observada do Fragmento de DNA foi cerca de 1,2kb (SacI) e cerca de 1,0 kb (Sau3AI) em 5'-RACE, e cerca de 0,6kb (SacI) e 0,3kb (KpnI) em 3'-RACE.

[000525] Na eletroforese de agarose no presente Exemplo, a coloração foi realizada usando brometo de etídio (Nippongene Co. Ltd.); e À/StyI (Nippongene Co. Ltd.) e escada de 100 bp (Toyobo Co. Ltd.) foram usados como marcadores de peso molecular.

[000526] Os fragmentos de DNA amplificados foram excisados do gel de agarose, e purificados usando um Kit de Extração de Gel (Qiagen). As Sequências de base dos fragmentos de DNA purificados foram determinadas pela sequência direta usando os iniciadores usados para a amplificação, com o resultado que a sequência de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína foi observada naqueles Fragmentos de DNA de cerca de 1,2kb(SacI) e cerca de 1,0 kb(Sau3AI) em 5'-RACE, e naqueles de cerca de 0,6kb(SacI) em 3'-RACE.

(3) Determinação da sequência de base total de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína

[000527] A sequência de base de DNA obtida pelo PCR degenerativo no exemplo A5 e a amplificação rápida da sequência de terminal de cDNA em (2) do presente Exemplo foi submetida ao ensaio de montagem usando software de montagem de sequência de DNA SEQUEN- CHER (Gene Codes Inc, USA). Como um resultado, a estrutura de ge- noma de 3548 bp na vizinhança do gene de enzima de síntese de dii- drodaidzeína foi obtida. Isto revelou que o gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína foi um polipeptídeo que consiste em 1935 nucleotí- deos e 644 aminoácidos.

[000528] As sequências de aminoácido inteiras obtidas pelas Sequências de base, e as sequências de aminoácido parciais obtidas pela sequência de aminoácido foram coletadas, com o resultado que todas as sequências de aminoácido parciais obtidas pela sequência de aminoácido atribuíram-se às sequências de aminoácido inteiras obtidas pelas Sequências de base.

(4) Confirmação de sequência de base na região de revestimento

[000529] Na sequência obtida em (3) do presente Exemplo, muitas porções foram observadas com os clones tendo bases inconsistentes causadas por erro de incorporação das bases de DNA polimerase em Amplificação por PCR. Portanto, usando o primeiro filamento de cDNA como um modelo, a região (2368bp) contendo a região de codificação do gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína foi amplificada através de PCR usando Enzima de Clonagem por PCR Easy-A®High- Fidelity (Stratagene), que é DNA-Polimerase de Alta-Fidelidade. Os seguintes são os iniciadores de amplificação usados acima. E1-conf- NP:TGCCGGTGCAATGGCTGACATCATGTTCAACCTG (SEQ ID NO: 35) E1-conf- CP:TCCTCCATCGTTCCTCCAATCAGTAAGACACGCG (SEQ ID NO: 36)

[000530] O fragmento de DNA obtido foi purificado usando um kit de Extração de Gel (Qiagen), e a confirmação e determinação final da sequência foi feita usando sequência direta.

Exemplo A7: Indução de expressão de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína adicionando-se daidzeína a solução de cultura de am-plificação

[000531] Como mostrado no exemplo A1, quando daidzeína, que é um substrato, é adicionada à solução de cultura de amplificação da cepa Lactococcus 20-92, as células cultivadas exibem uma atividade de síntese de diidrodaidzeína. Isto leva a uma suposição que a adição de daidzeína à solução de cultura de amplificação induz a transcrição de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína, e também induz a translação em proteína. O seguinte teste foi realizado com base nesta suposição. Duas amostras de cDNA derivado da cepa Lactococcus 2092 foram incubadas em um meio de cultura contendo daidzeína e em um meio de cultura sem daidzeína; elas foram submetidas a RT-PCR para descobrir se a expressão de gene de enzima de síntese de dii- drodaidzeína foi induzida pela adição de daidzeína na solução de cultura de amplificação.

(1) Extração de DNA total da cepa Lactococcus 20-92 e purificação da Extração de DNA

[000532] A extração do DNA total da cepa Lactococcus 20-92, e purificação foram realizadas da seguinte maneira.

[000533] A cepa Lactococcus 20-92 selada mantida em 4°C foi incubada durante oito horas em um meio de cultura de caldo GAM modificado, que contém 10mg/L de daidzeína (Funakoshi Co., Ltd.) ou nenhuma daidzeína, em 37°C sob uma condição anaeróbica. 25mL da solução de cultura foram transferidos para um tubo de 50mL, e centrifugados durante dez minutos em 3500rpm, 4°C. O meio de cultura foi removido por decantação e as células foram coletadas. As células coletadas foram imediatamente congeladas por nitrogênio líquido. Em seguida, o RNA total foi extraído e purificado usando 1mL de solução de TRIzol (Invitrogen) de acordo com a instrução. O RNA inteiro purificado foi processado por DNase I (Invitrogen) para remover o DNA de genoma, e usado para síntese de cDNA de primeiro filamento.

(2) Síntese de cDNA de primeiro filamento do RNA inteiro

[000534] De 2 μg do RNA inteiro desse modo processado por DNa- seI, o cDNA de primeiro filamento (transcrição reversa) foi sintetizado usando Sistema de Síntese de Primeiro Filamento SuperScript® para RT-PCR (Invitrogen). A síntese do cDNA de primeiro filamento foi realizada usando mistura de Hexâmero Aleatório como um iniciador de extensão de acordo com a instrução. Além disso, para confirmar que o RNA inteiro processado por DNase I usado pela síntese de cDNA de primeiro filamento não conteve DNA de genoma, outra reação foi realizada ao mesmo tempo sem transcrição reversa. O líquido de reação final foi usado como um modelo para RT-PCR.

[000535] Os seguintes dão os quarto tipos de líquidos de reação final desse modo preparados. 1. Produto de transcrição reversa do RNA inteiro derivado de células de bactéria incubadas em um meio contendo daidzeína (DZN(+)RT(+)) 2. Produto de transcrição reversa do RNA inteiro derivado de células de bactéria incubadas em um meio com nenhuma daidzeína (DZN(-)RT(+)) 3. Produto de transcrição não reversa do RNA inteiro derivado de células de bactéria incubadas em um meio contendo daidzeí- na (DZN(+)RT(-)) 4. Produto de transcrição não reversa do RNA inteiro derivado de células de bactéria incubadas em um meio com nenhuma daidzeína (DZN(-)RT(-))

(3) Confirmação de expressão de gene de enzima de síntese de dii- drodaidzeína usando RT-PCR

[000536] O gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína foi amplificado através de RT-PCR usando os quatro produtos de reação final como detalhado em (2) do presente Exemplo como modelos. As quan- tidades de expressão foram comparadas com cada outra. Como um controle, outro RT-PCR foi realizado ao mesmo tempo em que usando a sequência de RNA de 16S-ribossoma como um gene de controle.

[000537] Os seguintes são condições de amplificação em RT-PCR e uma sequência do iniciador para cada amplificação de gene.

[000538] Ex-Taq DNA polimerase (Takara Bio Inc.) foi usado para RT- PCR. O programa de amplificação foi: 95°C 2 minutos, (95°C 30 segundos, 56°C 20 segundos, 72°C 30 segundos) x 30 ciclos, 72°C 2min. Como um modelo, 1 μL de cada líquido de reação final como em (2) do presente exemplo foi usado.

[000539] O seguinte mostra uma sequência do iniciador usada pelo RT-PCR do presente Exemplo e o tamanho do Fragmento de DNA a ser amplificado.

[000540] Enzima de síntese de diidrodaidzeína:239bp E1- FP:CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG (SEQ ID NO: 37) E1-RP:CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC (SEQ ID NO: 38)

[000541] Sequência de RNA 16S-ribossoma:326bp Gar-16S-Ribo-FP:TGCGTAGATATATGGAGGAAC (SEQ ID NO: 39) Gar-16S-Ribo-RP:CTTATCTCTAAGGATAGCACG (SEQ ID NO: 40)

[000542] O iniciador usado para a amplificação de sequência de RNA de 16S-ribossoma foi criada com base na sequência de gene de RNA ribossômico de FLG12 16S da cepa Lactococcus garvieae, sequência parcial (No. de Acessão AF352163-66) na base de dados de DNA (GenBank) fornecida pelo Centro Nacional de Informação de Biotecnologia: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

[000543] 1/10 de 10xdia foi adicionado ao Produto de PCR, e 5μL da mistura foram submetidos à eletroforese com 1,5% de gel de agarose. A amplificação de cada fragmento de DNA foi observada.

[000544] Na eletroforese de agarose no presente Exemplo, a coloração foi realizada usando brometo de etídio (Nippongene Co. Ltd.); e À/StyI (Nippongene Co. Ltd.) e escada de 100 bp (Toyobo Co. Ltd.) foram usados como marcadores de peso molecular.

[000545] Figura 6 mostra os resultados.

[000546] Como evidente a partir do resultado da amplificação de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína através de RT-PCR, a expressão eficiente de gene foi observada somente no produto de transcrição reversa do RNA inteiro derivado de células de bactéria incubadas em um meio com daidzeína. O mesmo nível de expressão foi observado na amplificação de sequência de RNA de 16S-ribossoma usada como um controle, independente da incorporação de daidzeína. Além disso, uma vez que tanto o gene de enzima de síntese de diidro- daidzeína quanto a sequência de RNA de 16S-ribossoma não foram amplificados no produto de transcrição não reversa, foi confirmado que o RNA inteiro processado por DNase I usado para a síntese de cDNA de primeiro filamento não contém DNA de genoma. Esses resultados mostraram que a adição de daidzeína ao meio induziu a expressão de mRNA de gene de enzima de síntese de diidrodaidzeína.

Exemplo A8: Expressão de Polipeptídeo E1 Recombinante usando Escherichia coli, e Confirmação da atividade de síntese de diidrodaidzeína

[000547] O sistema de pET, um sistema de expressão de proteína recombinante usando Escherichia coli, foi usado para expressar poli- peptídeo E1, e sua atividade de síntese de diidrodaidzeína foi confirmada.

(1) Preparação de Vetor de Expressão de Polipeptídeo E1

[000548] Para preparar um vetor de expressão de Polipeptídeo E1 (pET21-E1-His), o DNA na estrutura de leitura aberta de nucleotídeo E1 foi amplificada por PCR.

[000549] Os seguintes iniciadores de amplificação foram preparados com base na sequência de nucleotídeo E1 determinada no exemplo A6.exp.E1 pet F Nde: AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTA- TCCGAA (SEQ ID NO: 41) exp.E1 pet His: AATCGAATTCCTACAGGTT- GCAGCCAGCGATGT (SEQ ID NO: 42)

[000550] Para inserção em pET21a (Novagen), os iniciadores de amplificação exp.E1 pet F Nde e exp.E1 pet His foram designados para incluir Sequências de restrição de NdeI e EcoRI, respectivamente.

[000551] Uma reação de PCR foi realizada usando 25 μL de uma mistura de reação contendo os iniciadores, 5 pmol cada; dNTP, 5 nmol cada; DNA genômico da cepa Lactococcus 20-92 purificada no exemplo A5, 40 ng; 10 x tampão para KOD-plus DNA polimerase (Toyobo Co., Ltd.), 2,5 μL; KOD-Plus DNA polimerase, 0,3 U (Toyobo Co., Ltd.). Programa de amplificação: 95°C durante 3 min, (94°C durante 30 sec, 60°C durante 30 sec, 68°C durante 2 min) x 30 ciclos, 68°C durante 7 min. Dispositivo PCR: GeneAmpPCR System 9700 (Applied Biosystems). A análise de uma parte da mistura de reação de PCR por eletroforese gel de agarose detectou uma faixa de um tamanho esperado. O Produto de PCR inteiro foi coletado por um kit de Purificação QIAGEN PCR (Qiagen).

[000552] Os fragmentos de DNA desse modo coletados foram cortados com enzimas de restrição NdeI e EcoRI, e submetidos a eletroforese de gel de agarose. Em seguida, uma porção contendo a faixa alvo foi excisada, e purificada e coletada com um kit de Extração de Gel Qiagen (Qiagen). Após a coleta, os fragmentos de DNA foram ligados em 16°C durante a noite com pET21a digerido com NdeI e EcoRI, usando um kit de Ligação de DNA ver.2.1 (Takara Bio Inc.). A mistura de reação ligada foi então usada para transformar a cepa Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.).

[000553] O transformante foi cultivado em 37°C durante a noite em uma placa àgar de meio de LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 μg/mL). As colônias únicas resultantes foram cultivadas durante a noite em um meio LB de 3 mL (GIBCO) contendo ampicilina (50 μg/mL). Em seguida, o DNA de plasmídeo foi extraído usando um autoextrator de plasmídeo PI-100 (KURABO).

[000554] A sequência de base do DNA inserido no plasmídeo foi se- quenciado pelo método terminador de pigmento. Isto confirmou a inserção bem sucedia de polinucleotídeo E1, quando inserido. Desse modo, pET21-E1-His foi obtido. Neste exemplo, a sequência de DNA foi determinada usando sequenciador de DNA ABI3700 (Applied Biosystems).

(2) Preparação de Recombinante, e Expressão e Confirmação de Polipeptídeo E1 Recombinante em Escherichia coli'

[000555] O plasmídeo pET21a (controle negativo) e plasmídeo pET21-E1-His expressando Polipeptídeo E1 recombinante foram usados para transformar a cepa Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen). Para obter colônias únicas, os transformantes foram cultivados durante a noite a 37°C em uma placa de ágar de meio de LB contendo ampici- lina (50 μg/mL).

[000556] Cada transformante de E. coli BL21 (DE3) foi cultivado durante a noite a 37°C em um meio LB líquido de 3 mL contendo ampici- lina (50 μg/mL). Em seguida, 0,5 mL da cultura foi pré-cultivado durante 3 horas (até OD em 630 nm ficar em cerca de 0,4) adicionando-se 50 mL de meio LB líquido contendo a mesma concentração de ampici- lina. Após ajustar a concentração final para 1 mM adicionando-se IPTG (isopropil-p-tiogalactopiranosídeo; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a cultura foi ainda incubada a 37°C durante 4 horas.

[000557] Após a incubação, as células foram colatadas por centrifugação (6.000 rpm, 4°C, 15 minutos) usando um Avanti HP25 (Beckman Coulter). Os procedimentos subsequentes foram realizados no gelo. Após remover o sobrenadante (o meio), as células foram suspensas em 1 mL de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0; KPB-PDH) contendo PMSF a 1 mM, DTT a 2 mM, e hidrossulfeto de sódio a 5 mM. A suspensão de célula foi então colocada em um tubo auxiliar de 2 mL carregado com 0,7 mL de contas de zircônia-sílica (BioSpec Products, Inc.) e 400 μL de KPB-PDH. As células foram em seguida rompidaspor dois ciclos repetidos de um tratamento de 20 segundos, 6.500 rpm e resfriamento com gelo de 3 minutos, usando um FastPrep® (Thermo Electron Corporation). Como um resultado, uma suspensão de células rompidas foi obtida.

[000558] A expressão de Polipeptídeo E1 recombinante em E. coli foi confirmada por eletroforese de SDS-poliacrilamida-gel (SDS-PAGE).

[000559] 2,5 μL de tampão de amostra 5 x (Tris-HCl a 125 mM (pH 2.5) /25% de glicerol/5% de SDS/5% de 2-mercaptoetanol/BPB a 0,5%) foram adicionados a 10 μL da suspensão de célula rompida. Após a desnaturação térmica a 98°C durante 5 minutos, a suspensão foi resfriada com gelo, e 5 μL foram eletroforesado por SDS-PAGE. SDS- PAGE foi realizado com uma placa de gel comercialmente disponível (SuperSep® 5-20%; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), e Quick CBB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para manchamento. A faixa de Prestained XL-Ladder Broad (Apro Science) foi usada como um marcador de peso molecular.

[000560] Os resultados de SDS-PAGE são mostrados em FIG. 7. Um Polipeptídeo E1 recombinante com um peso molecular de cerca de 70 kDa foi confirmado na suspensão de célula rompida derivada de trans- formante pET21-E1-His.

(3) Confirmação da atividade de síntese de diidrodaidzeína de Polipeptídeo E1 obtido de Recombinante

[000561] A suspensão de célula rompida obtida em (2) deste Exemplo foi usada como uma fonte de enzima para medir a atividade de conversão de daidzeína para diidrodaidzeína. Como um resultado, a atividade foi confirmada no Polipeptídeo E1 recombinante expresso.

[000562] Neste exemplo, a medição da atividade de conversão de daidzeína para diidrodaidzeína foi realizada como segue.

[000563] Uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e a mistura foi incubada a 37°C durante 2 horas.

[000564] Após a incubação, 3 mL de acetato de etila foram adicionados à mistura de reação de enzima para extração. Após a secagem, o extrato foi dissolvido pela fase móvel (eluente). O produto dissolvido foi analisado por HPLC para medir os conteúdos de daidzeína e diidro- daidzeína na mistura de reação de enzima.

[000565] Os resultados da análise de HPLC são mostrados na FIG. 8. Na suspensão de célula rompida derivada de transformante de pET21- E1-His de plasmídeo expressando o polipeptídeo E1 recombinante, a daidzeína (substrato) adicionada à mistura de reação de enzima foi convertida para diidrodaidzeína ao passo que diidrodaidzeína não foi detectada na mistura de reação de enzima no transformante de pET21a (controle negativo).

[000566] Esses resultados mostram que o polipeptídeo E1 recombi- nante tem a atividade para sintetizar a diidrodaidzeína de daidzeína.

Exemplo B Exemplo de Referência B1 Síntese de cis-tetraidrodaidzeína e trans-tetraidrodaidzeína

[000567] Cis-tetraidrodaidzeína e trans-tetraidrodaidzeína foram pro-duzidas de acordo com o fluxo de reação abaixo. Os compostos são designados como. Composto 1 (daidzeína): isoflavona 4',7-diidróxi Composto 2: isoflavona de 4',7-diacetóxi Composto 3: isoflavan-4-ona de 4',7-diacetóxi Composto 4: isoflavan-4-ol de cis-4',7-diacetóxi Composto 5: isoflavan-4-ol de trans-4',7-diacetóxi Composto 6: cis-tetraidrodaidzeína Composto 7: trans-tetraidrodaidzeína Fórmula 1

Síntese do composto 2

[000568] 0,76 mL (8,0 mmol) de anidreto acético foi adicionado a uma solução de piridina (5 mL) contendo 500 mg (1,97 mmol) de daidzeína (Composto 1), e a mistura foi agitada a 60°C durante 2 horas. Após adicionar uma quantidade minuta de metanol, a mistura de reação foi transferida em ácido clorídrico a 3 N. Após diluição com água, o precipitado sólido resultante foi filtrado e enxaguado com água. O sólido foi então secado ao ar em temperatura ambiente para obter 609 mg de um Composto 2 branco, em pó (1,80 mmol, 91% de produto).

[000569] Composto 2: 1H NMR (250 MHz, CDCh) δ (ppm): 2,33 (3H, s), 2,37 (3H, s), 7,13-7,22 (3H, m), 7,32 (1H, d, J = 2,3 Hz), 7,54-7,63 (2H, m), 8,01 (1H, s), 8,33 (1H, d, J = 8,8 Hz).

Síntese do composto 3

[000570] Uma suspensão de metanol (6 mL)-acetato de etila (6 mL) contendo 400 mg (1,18 mmol) de Composto 2 e 150 mg de paládio- carbono a 10% (hidratado, cerca de 50% em peso) foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura de reação foi filtrada com Celite, e os resíduos foram lavados com acetato de etila. Os resíduos obtidos por concentração do filtrado foram purificados por cromatografia de coluna de sílica gel (sílica gel: diclorometano/acetato de etila = 100/0 - 19/1) para obter 312 mg de um Composto 3 branco, em pó (0,917 mmol, 78% de produto). Composto 3: 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ (ppm): 2,29 (3H, s), 2,32 (3H, s), 3,93-4,04 (1H, m), 4,60-4,75 (2H, m), 6,76-6,84 (2H, m), 7,04-7,13 (2H, m), 7,27-7,35 (2H, m), 7,93-8,01 (1H, m).

Síntese do Composto 4 e Composto 5

[000571] 11 mg (0,29 mmol) de boroidreto de sódio foram adiciona dos a uma solução de metanol (1 mL)-diclorometano (1 mL) contendo 100 mg (0,294 mmol) do Composto 3 a 0°C. Após agitar a mistura de reação a 0°C durante 30 minutos, 2 mL de ácido clorídrico a 1 N e 50 mL de água foram sucessivamente adicionados, seguido por extração com acetato de etila. A camada orgânica foi sucessivamente lavada com bicarbonato de sódio saturado, água e salmoura saturada, seguido por secagem com sulfato de sódio anidroso. O solvente foi destilado, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna de sílica gel (sílica gel: diclorometano/acetato de etila = 19/1 - 3/1). A mistura de diastereômero resultante foi purificada por cromato- grafia de coluna de pressão média (Yamazen, Ultra Pack SI-40B: n- hexano/acetato de etila = 3/2) para obter 44 mg de um Composto 4 incolor, acicular (0,13 mmol, 44% de produção), e 26 mg de um Composto 5 incolor, acicular (75 mmol), 26% de produção).

[000572] Composto 4: 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ (ppm): 1,80 (1H, d, J = 4,0 Hz), 2,30 (3H, s), 2,31 (3H, s), 3,32 (1H, td, J = 3,5, 11,5 Hz), 4,32 (1H, ddd, J = 1,3, 3,5, 10,5 Hz), 4,59 (1H, dd, J = 10,5, 11,5 Hz), 4,764,83 (1H, m), 6,64-6,73 (2H, m), 7,06-7,14 (2H, m), 7,27-7,35 (3H, m).

[000573] Composto 5: 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ (ppm): 2,02 (1H, d, J = 5,5 Hz), 2,29 (3H, s), 2,30 (3H, s), 3,11-3,24 (1H, m), 4,26 (1H, dd, J = 9,0, 11,3 Hz), 4,37 (1H, dd, J = 3,8, 11,3 Hz), 4,92 (1H, dd, J = 5,5, 7,8 Hz), 6,62 (1H, d, J = 2,3 Hz), 6,72 (1H, dd, J = 2,3, 8,5 Hz), 7,04-7,12 (2H, m), 7,21-7,30 (2H, m), 7,47 (1H, d, J = 8,5 Hz).

Síntese do composto 6

[000574] 55 mg (1,0 mmol) de metóxido de sódio foram adicionados a uma solução de metanol (4 mL) contendo 116 mg (0,339 mmol) de Composto 4, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura de reação foi neutralizada adicionando-se uma resina de permuta de íon (DOWEX 50 x 8W, forma de amônio). Após filtrar a resina, o sólido obtido concentrando-se o filtrado foi lavado com metanol para obter 62 mg de um composto 6 branco, em pó (0,24 mmol, 71% de produção).

[000575] Composto 6: 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 3,03 (1H, td, J = 3,3, 12,0 Hz), 4,00-4,15 (1H, m), 4,31-4,51 (2H, m, incluindo 4,39, dd, J = 10,3, 12,0 Hz), 4,96 (1H, d, J = 5,8 Hz), 6,18 (1H, d, J = 2,3 Hz), 6,32 (1H, dd, J = 2,3, 8,3 Hz), 6,69 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,00 (1H, d, J = 8,3 Hz), 7,09 (2H, d, J= 8,5 Hz), 9,19 (1H, br s), 9,31 (1H, br s).

Síntese do Composto 7

[000576] 0,73 mL (0,73 mmol) de hidróxido de sódio 1 N foi adiciona do a uma suspensão de metanol (2 mL) contendo 84 mg (0,25 mmol) do Composto 5, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2,5 horas. Em seguida, água de cloreto de amônio saturado foi adicionada à mistura de reação, seguido por extração com acetato de etila. A camada orgânica foi sucessivamente lavada com água de bicarbonato de sódio saturado e salina saturada, seguido por secagem com sulfato de sódio anidroso. Destilando-se o solvente, 64 mg de um Composto 7 branco, em pó (0,25 mmol, produção quantitativa) foram obtidos.

[000577] Composto 7: 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 2,822,96 (1H, m), 4,04-4,22 (2H, m), 4,60 (1H, t, J = 7,0 Hz), 5,18 (1H, d, J = 7,0 Hz), 6,14 (1H, d, J = 2,3 Hz), 6,34 (1H, dd, J= 2,3, 8,5 Hz), 6,67 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,04 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,16 (1H, d, J = 8,5 Hz), 9,21 (1H, s), 9,28 (1H, s).

Exemplo de Referência B2

[000578] Uma cepa Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) foi inoculada em um meio líquido de amplificação contendo daidzeína, e a cultura foi incubada a 37°C durante 7 a 24 horas sob condições anaeróbi- cas. Após a incubação, as células foram coletadas e criogenicamente preservadas para serem usadas nos Exemplos abaixo.

Exemplo B1: Confirmação de Produção de Tetraidrodaidzeína

[000579] Os seguintes experimentos foram conduzidos para confirmar que tetraidrodaidzeína é o intermediário de biossíntese de equol.

(1) Preparação de Material Celular Rompido

[000580] As células da cepa Lactococcus 20-92 preservadas em -80°C foram rapidamente descongeladas. As células foram suspensas por tam- ponamento, e centrifugadas a 4°C (8.000 rpm x 5 min) usando um VC960 centrífugo (Taitec). Após remover o sobrenadante, tampão de fosfato de potássio a 0,1 M / PMSF a 1 mM (fluoreto de fenilmetanossulfonila)/ DTT a 2 mM (Ditiotreitol)/ hidrossulfeto de sódio a 5 mM (pH 7,0) foram adicionados para obter uma suspensão de célula. A suspensão de célula foi colocada em um tubo de 2 ml preparado para incluir contas de zircô- nia-sílica (cerca de 0,8 mL, 0,1 mm, 1 lb; Wakenyaku Co., Ltd.), e o tubo foi carregado com solução de fosfato de potássio a 0,1 M/ PMSF a 1 mM/ DTT a 2 mM/ hidrossulfeto de sódio a 5 mM (pH 7,0) para carregar o tubo quase completamente. Para o rompimento, o tubo foi fechado e mantido no gelo, onde um ciclo de 6.500 rpm x 20 seg de centrifugação e resfriamento no gelo foi repetido quatro vezes usando FastPrep®-FP100A (Thermo Electron Corporation). O material celular rompido resultante foi usado como uma fonte de enzima em uma reação de enzima.

(2) Reação de enzima

[000581] Uma mistura de reação de enzima de 1 mL da composição abaixo, contendo 0,1 ml do material celular rompido obtido em (1) foi preparada, e a mistura foi incubada a 37°C durante 2 horas. Após a incubação, 3 mL de acetato de etila foram adicionados ao produto de reação de enzima resultante para extração. O produto foi secado para preparar uma amostra para análise de HPLC. Composição de mistura de reação de enzima O tampão de fosfato de potássio a 0,1 M / PMSF a 1 mM / DTT a 2 mM / hidrossulfeto de sódio a 5 mM (pH 7,0) NADPH a 2 mM NADH a 2 mM 0 μg/mL de diidrodaidzeína ou tetraidrodaidzeína

(3) Produção de tetraidrodaidzeína de diidrodaidzeína por reação de enzima

[000582] FIG. 9 mostra os resultados de análise de HPLC do produto de reação de enzima obtido usando-se diidrodaidzeína como um substrato e o material celular rompido como uma fonte de enzima. FIG. 9 também mostra os resultados de análise de HPLC da tetraidrodaidzeí- na sintetizada no Exemplo de referência B1. Os resultados mostram que o produto de reação de enzima obtido usando-se diidrodaidzeína como um substrato e o material celular rompido como uma fonte de enzima inclui um intermediário tendo um tempo de retenção corres- pondendo ao tempo de retenção de trans-tetraidrodaidzeína, confirmando a produção de trans-tetraidrodaidzeína.

(4) Produção de Equol de tetraidrodaidzeína por reação de enzima

[000583] FIG. 10 mostra os resultados de análise de HPLC do produto de reação de enzima obtido usando-se cis-tetraidrodaidzeína ou trans-tetraidrodaidzeína como um substrato e o material celular rompido como uma fonte de enzima. Como está claro a partir da FIG. 10, equol foi produzido de ambos compostos, mostrando que a tetraidro- daidzeína é usada como um substrato em biossíntese de equol, tanto na forma cis quanto na forma trans.

Exemplo B2: Confirmação de Atividade de Biossíntese de Tetraidrodaidzeína em Sobrenadante Centrifugado de Material celular rompido, e Confirmação de NADH ou Dependência de NADPH

[000584] As células congeladas foram descongeladas e centrifugadas em 4°C durante 15 minutos (5.000 x G). O pélete foi usado no teste abaixo. Primeiro, o pélete (peso úmido 2,7 g) foi suspenso em 10 ml de uma solução de fosfato-potássio a 0,1 M contendo PMSF a 1 mM e hidrossul- feto de sódio a 5 mM. Após pré-aquecer a 37°C durante 5 minutos, a li- sozima foi adicionada em uma quantidade de 100 mg por grama do péle- te (peso úmido) para causar uma reação a 37°C durante 1,5 horas. Em seguida, uma quantidade equivalente de dissolução de fosfato de potássio a 0,1 M foi adicionada à mistura de reação, e a mistura foi vigorosamente agitada com um misturador de vórtice após adicionar contas de zircônia-sílica (3 ml). As células foram em seguida rompidas com um so- nicador (Branson Sonifier Cell Disruptor 200) (3 ciclos de uma sonicação de 5 minutos e um resíduo de 2 minutos). A suspensão de célula rompida foi centrifugada em cerca de 10.000 x G durante 15 minutos para obter um sobrenadante, que foi em seguida usado como uma fonte de enzima.

[000585] Uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e foi incubada a 37°C durante 2 horas. Após a incuba- ção, 5 mL de acetato de etila foram adicionados ao produto de reação de enzima para extração. Em seguida, o produto foi secado para preparar uma amostra para análise de HPLC.

[000586] Os resultados são mostrados na FIG. 11. Os resultados confirmaram a presence de atividade de biossíntese de tetraidro- daidzeína no sobrenadante centrifugado do material celular rompido. Foi também confirmado que a conversão de diidrodaidzeína em tetrai- drodaidzeína é dependente da coenzima NADH, e muito mais fortemente em NADPH.

Exemplo B3: Purificação de Enzima de Sintetização de Tetraidrodaidzeína

[000587] As células da cepa Lactococcus 20-92 foram incubadas durante 20 horas em 67 ml de um meio líquido de amplificação contendo daidzeína contido em uma garrafa de incubação. As células cultivadas de dez tais garrafas foram centrifugadas e suspensas em um tampão de fosfato de potássio a 0,02 M (pH 7; a seguir "Tampão A") contendo PMSF a 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila) e DTT a 4 mM (Ditiotrei- tol). As células foram rompidas com uma prensa French (SLM Instruments Inc.) seis vezes em 10 kPa, e a suspensão de célula rompida foi centrifugada para obter um sobrenadante. Separadamente, as células da cepa Lactococcus 20-92 foram incubadas durante 18 horas em 200 ml de um meio líquido contido em uma garrafa de incubação. As célu- las cultivadas de cinco tais garrafas foram similarmente rompidas com uma prensa French, e um sobrenadante foi obtido após a centrifugação. Esses sobrenadantes, 38 ml e 47ml, foram misturados, e 82 ml da mistura foram alimentados para red-Sefarose (cerca de 7 ml) equilibrado com tampão A. Após lavagem com o red-Sefarose com 150 ml de Tampão A, a mistura foi eluída com Tampão A contendo NADPH a 10 mM (20 ml/fração). Cada fração foi usada como uma fonte de enzima, e a atividade de biossíntese de tetraidrodaidzeína foi medida sob as mesmas condições como as condições de reação de enzima do Exemplo B2 (usando NADPH como uma coenzima). Como um resultado, as frações ativas n°: 1 a 5 foram obtidas.

[000588] As frações n°: 1 a 5 tendo atividade de biossíntese de tetrai- drodaidzeína foram concentratadas por ultrafiltração usando Amicon Ultra Centrifugal UFC801024 (MW Cut: 10.000) para obter um concentrado (cerca de 2,1 ml). O concentrado foi separado em três porções e alimentado para HPLC usando TSKgel Phenyl-5PW (Tosoh) após misturar cada porção com uma quantidade equivalente de Tampão A contendo sulfato de amônio a 3 M. As condições de HPLC são como segue. A proteína foi ensaiada medindo-se a absorção em 280 nm. Coluna: TSKgel Phenyl-5PW Taxa de Fluxo: 1 ml/min Fração: 2 ml/2 min/fração Eluente A: tampão de fosfato de potássio a 0,02 M pH 7/ DTT a 1 mM / sodioidrossulfeto a 2,5 mM /0,5% de isoPrOH Eluente B: Eluente A contendo sulfato de amônio a 1 M

[000589] Os resultados de HPLC revelaram que a atividade de síntese de tetraidrodaidzeína está presente em uma ampla faixa de frações (fração n°: 15 e frações subsequentes, um tempo de retenção de 30 minutos e por mais tempo). Determinado este resultado, as frações de HPLC Nos: 19 a 22 foram misturadas e concentradas por ultrafiltração (Amicon Ultra Centrifugal UFC801024; MW Cut: 10.000). De cerca de 130 μl do concentrado, 100 μl foram alimentados por HPLC de filtração de gel usando TSKgel G2000SWXL (Tosoh), sob as seguintes condições.

[000590] FIG. 12 mostra os resultados de HPLC de filtração de gel. FIG. 13 mostra os resultados de SDS-PAGE de cada fração realizada sob condições reduzidas. Os resultados mostraram faixas de 28 kDa e 32 kDa sob condições reduzidas na fração No: 7, uma fração principal de atividade de síntese de tetraidrodaidzeína.

Exemplo B4: Análise de Enzima de Sintetização de Sequência de Ami- noácido de Tetraidrodaidzeína

[000591] A fração (fração n° 7) tendo atividade de síntese de tetrai- drodaidzeína obtida no exemplo B3 foi usada como uma amostra para análise de MS. Mais especificamente, a amostra foi separada por SDS-PAGE, e as faixas foram excisadas. As faixas excisadas foram reduzidas por alquilação no gel, e digeridas com tripsina no gel. Os peptídeos diferidos com tripsina foram coletados e purificados para análise por LC-MS. Os dados adquiridos por análise de LC-MS foram analisados por seqüenciamento de novo usando o software de suporte de análise MS PICOS® (Infocom) para calcular e estimar as sequências de aminoácido dos peptídeos. Especificamente, isto foi realizado de acordo com os procedimentos abaixo.

(1) Materiais do Experimento

[000592] O experimento usou os seguintes materiais:

[000593] SuperSep HG 10/20% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); kit de manchamento Flamingo Gel (Bio-Rad); TCEP (Tris[2- carboxietil]fosfina) (Pierce); marcador de peso molecular (Apro Science); DTT (Calbiochem); iodoacetamida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); acetonitrila (Kanto Kagaku); tripsina (Promega); TFA (Pierce); bicarbonato de amônio (Sigma); água de amônio(Merck); ácido fórmico (Kanto Kagaku); Empore Cation-SR Disk (Sumitomo 3M); coluna de concentração MonoCap (GL Science); MonoCap para Fluxo Nano 0,1 x 150 mm (GL Science); FortisTip (AMR); Concentrador SpeedVac (SAVANT); HTS-PAL autoamostrador (CTC-Analytics); Chorus 220 (CTC-Analytics); QSTAR Pulsar i (Applied Biosystems); e software PICOS® (Infocom).

(2) Eletroforese de Gel de SDS-Poliacrilamida

[000594] 1 μl de TCEP a 100 mM foi adicionado a 20 μl da fração (fração n° 7) tendo atividade de síntese de tetraidrodaidzeína obtida no exemplo B3. Após redução em 70°C durante 10 minutos, a amostra inteira foi aplicada a SuperSep HG, e SDS-PAGE foi realizada por método usual. Em seguida à eletroforese, o gel foi manchado com kit de manchamento Flamingo Gel (Bio-Rad) (veja FIG. 14). Em seguida, as faixas LG1 e LG2 que apareceram após o manchamento foram cada cortada para um tamanho de cerca de 1 mm2. Os géis excisados foram lavados com solução de bicarbonato de amônio a 100 mM, desidratados com acetonitrila, e secados e solidificados com um Concentrador SpeedVac.

(3) Digestão de Tripsina em Gel

[000595] Uma solução de DTT (1,54 mg/ml em bicarbonato de amô- nio a 100 mM) foi adicionada aos géis secos, e a mistura foi incubada a 55°C durante 45 minutos para causar a redução. Após descartar a solução de DTT, uma solução de iodoacetamida (10,1 mg/ml em bicarbonato de amônio a 100 mM) foi adicionada, e a mistura foi incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos no escuro. Após descartar a solução, os géis foram sucessivamente lavados com uma solução de acetonitrila a 50%, uma solução de acetonitrila a 100%, uma solução de bicarbonato de amônio a 100 mM, e uma solução de acetonitri- la a 100%, seguido por secagem e solidificação com um Concentrador SpeedVac. Em seguida, uma pequena quantidade de solução de trip- sina (12,5 μg/ml em bicarbonato de amônio a 50 mM) foi adicionada aos géis secos para impregnar os géis durante 45 minutos no gelo. Após a impregnação, a solução de tripsina em excesso foi removida, e uma solução de bicarbonato de amônio a 50 mM foi adicionada até que os géis ficassem imersos. Em seguida, uma reação foi realizada a 37°C durante 16 horas.

(4) Análise de sequência de Aminoácido por Espectrometria de Massa

[000596] Os peptídeos digeridos com tripsina foram coletados, e pré- tratados purificando-se os peptídeos com uma coluna simples carregada com Empore Cation-SR Disk na ponta de pipeta. Os digeridos com peptídeos de tripsina foram coletados lavando-se com uma solução de TFA a 0,1%/acetonitrila a 90%. Na coluna simples, a amostra foi primeiro tratada por uma solução equilibrada, de TFA a 0,1%/acetonitrila a 2%. Após a absorção da amostra, a coluna foi lavada com uma solução de TFA a 0,1%/acetonitrila a 90%, e a amostra foi eluída com uma solução de amônia a 5%/acetonitrila a 30%. Após a eluição, os peptídeos digeridos foram secados e concentrados com um Concentrador SpeedVac. O pH da solução de peptídeo digerida foi ajustada para cerca de 3 adicionando-se TFA, e a amostra foi ajustada no autoamostrador HTS-PAL. O conjunto de amostra em HTS-PAL foi em seguida lavado na coluna carregando-o para dentro de uma coluna de concentração de amostra localizada na válvula injetora LC-MS. A amostra na coluna de concentração foi separada com uma coluna analítica usando nanoHPLC-Chorus 220, e analisada com QSTAR Pulsar após a ionização com o conjunto FortisTip na coluna analítica. As condições de análise de LC-MS são como segue.

MS

[000597] Modo Positivo NanoESI, modo de aquisição dependente da informação (m/z = 400 a 1,400, em 25 contagens, estado da carga = 2 a 4); 4 experimentos/1 ciclo: Experimento 1 (TOF-MS, m/z = 400 a 1,400, tempo de acúmulo = 1 seg); Experimentos 2 a 4 (Íon de Produto Positivo, m/z = 100 a 1.400, tempo de acúmulo = 2 seg).

[000598] Os dados adquiridos por LC-MS para cada faixa LG1 e LG2 (veja FIG. 14) foram analisados por sequenciamento de novo usando software PICOS® para estimar as sequências de aminoácido dos pep- tídeos digestos.

Exemplo B5: Análise de sequência de DNA Genômico Periférica de Gene de Enzima de Sintetização (E1) de Diidrodaidzeína (1) Preparação de Biblioteca de DNA Genômico para PCR Inverso

[000599] O DNA genômico da cepa Lactococcus 20-92 (FERM BP- 10036) purificado de acordo com Exemplo A5 foi digerido com enzimas de restrição (BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SacI, SalI, Sau3AI, XhoI; todas disponibilizadas por Takara Bio) a 37°C durante 16 horas para obter Fragmentos de DNA. Após o tratamento com fenol- clorofórmio, os fragmentos foram purificados por precipitação de etanol. Os fragmentos de DNA genômicos purificados foram auto-ligados usando kit de Ligação TaKaRa ver. 2.1 (Takara Bio). Cada solução de ligação foi diluída dez vezes com água esterilizada para preparar uma biblioteca de DNA genômico para PCR inverso.

(2) PCR Inverso

[000600] 1 μL (equivalente de 40 ng) da biblioteca de DNA genômico para PCR inverso obtido em (1) foi usado como um modelo para amplificar regiões a jusante e a montante do DNA genômico próximo do polinucleotídeo E1, usando PCR inverso. Os fragmentos tratados com PstI e XhoI foram usados como DNA modelo para PCR inverso amplificar a região a montante region. Para PCR inverso amplificar a região a jusante, os fragmentos tratados com HindIII, PstI, SacI, e XhoI foram usados como DNA modelo. TaKaRa LA Taq (Takara Bio) foi usado para PCR inverso. O primeiro PCR foi realizado usando 20 μL de uma mistura de reação contendo: 1 x tampão de PCR (Mg2+ livre); iniciadores, 0,5 nM cada; dNTP, 0,5 mM cada; MgCl2, 2,5 mM; e TaKaRa LA Taq, 0,2 U. 1 μL (40 ng) de uma solução diluída da biblioteca de DNA ge- nômico foi usado como um modelo. Programa de amplificação: 98°C durante 1 min, (95°C durante 10 seg, 62°C durante 10 seg, 68°C durante 10 min) x 35 ciclos, 68°C durante 15 min. O PCR embutido subsequente, foi realizado usando 0,5 μL do primeiro Produto de PCR como um modelo, e 30 μL de uma mistura de reação contendo: 1 x tampão de PCR (Mg2+ livre); iniciadores, 0,5 nM cada; dNTP, 0,5 mM cada; MgCl2, 2,5 mM; e TaKaRa LA Taq, 0,3 U. Programa de amplificação: 98°C durante 1 min, (95°C durante 10 seg, 62°C durante 10 seg, 68°C durante 10 min) x 30 ciclos, 68°C durante 15 minutos.

(2-1) Iniciadores

[000601] Os grupos de iniciador usados para PCR inverso são como segue. (2-1-1) Lado a montante Primeiro-PCR: RACE-N-P3-1 e E1-Bub-N-P1 PCR Embutido: RACE-N-P3-2 e E1-Bub-N-P2 (2-1-2) Lado a jusante Primeiro-PCR: RACE-C-P3-1 e E1-Bub-C-P1 PCR Embutido: RACE-C-P3-2 e E1-Bub-C-P2 (2-2) Sequências do Iniciador

[000602] As sequências dos iniciadores usados para amplificação dos lados a montante e a jusante por PCR inverso são como seguem.

[000603] Sequências do iniciador para amplificação do lado a montante RACE-N-P3-1: ATGGAGATAGTGCCGCTGGCAAGG- CAACGGCAC (SEQ ID NO: 43) RACE-N-P3-2: TCAACGAAGACTCGATTTGAG- CGAGAGGCGAGG (SEQ ID NO: 44) E1-Bub-N-P1: ACGGTGGAACCGGCATCGTGTTCATG- GACAAC (SEQ ID NO: 45) E1-Bub-N-P2: GCGTGACCCAGTTCCACCATGTCGGAC- TGTC (SEQ ID NO: 46) Sequências do iniciador para amplificação do lado a jusante RACE-C-P3-1: GACATCCCGTTCGAGCGCAG- GATCACCCATGAG (SEQ ID NO: 47) RACE-C-P3-2: AGGATCACCCATGAGCGCATCGC- TATCATGGAC (SEQ ID NO: 48) E1-Bub-C-P1: CATCGCTCTTGCAGTCGTTGTCCAG- GAAGTCC (SEQ ID NO: 49) E1-Bub-C-P2: TTGTCCAGGAAGTCCATCGCGTACAC- GACGGAG (SEQ ID NO: 50)

[000604] Observar que todos os oligo DNAs usados como iniciadores de amplificação neste Exemplo foram sintetizados por Sigma-Aldrich Japão.

(3) Purificação e Determinação de sequência de Base do PCR inverso Amplificado, Fragmentos de DNA Genômico Periférico de Gene de Enzima de Sintetização de Diidrodaidzeína

[000605] 10 x dia foi adicionada ao produto de PCR Embutido obtido em (2), em uma quantidade de 1/10 do produto de PCR Embutido. Em seguida, 5 μL foram eletroforesados em 0,8% de gel de agarose. Isto confirmou a amplificação de 0,5 kb (PstI) e 3,5 kb (XhoI) de Fragmentos de DNA na região a montante, e 1 kb (HindIII), 1 kb (SacI), e 2,5 kb (XhoI) de Fragmentos de DNA na região a jusante. Neste exemplo, a eletroforese de agarose usou brometo de etídio (Nippon Gene) para manchamento, e À/StyI (Nippon Gene) e escada de 100 bp (Toyobo) como marcadores de peso molecular. Os fragmentos de DNA amplificados foram excisados do gel de agarose, e purificados usando um Kit de Extração de Gel QIAGEN (Qiagen). As Sequências de base dos fragmentos de DNA purificados foram em seguida determinadas pelo método de sequência direta e pelo método de caminhada, usando os iniciadores usados para amplificação.

(4) Análise de sequência de Genoma e Estimação de ORF (Estrutura de Leitura Aberta)

[000606] As Sequências de DNA obtidas em (3) foram submetidas à análise de montagem usando o software de montagem de sequência SEQUENCHER (Gene Codes Inc, USA). Além disso, a estimação de ORF foi feita. A análise determinou a sequência de 6.685 bp na região de genoma periférico incluindo gene de enzima E1. FIG. 15 esquematicamente ilustra a estrutura de genoma periférico analisada incluindo o gene de enzima de sintetização de diidrodaidzeína. A estimação de ORF encontrou três ORFs a montante do gene de enzima E1 (o Terminal de N não identificado em uma das ORFs), e uma ORF no lado a jusante. As ORFs a montante foram designadas US (a montante) 1, US2, e US3, nesta ordem, lonhe da enzima de sintetização de diidro- daidzeína. A ORF a jusante foi designada DS (a jusante) 1.

Exemplo B6: Comparação de Sequências de Peptídeo Digeridas com sequência de Genoma por Análise de LC-MS

[000607] As sequências de aminoácido estimadas obtidas no exemplo B4 foram comparadas com os dados da sequência de gene de enzima de sintetização de diidrodaidzeína (E1) de DNA genômico periférico determinada no exemplo B5. Como um resultado, algumas das sequências principalmente obtidas de LG2 combinaram a sequência de poli- peptídeo inferida da sequência de nucleotídeo de ORF-US2. Isto sugere a possibilidade de que o polipeptídeo ORF-US2 pode ser a enzima de sintetização de tetraidrodaidzeína. As sequências de peptídeo digeridas que combinaram o polipeptídeo de ORF-US2 são mostradas abaixo. FIGS. 16-1, 16-2, e 16-3 mostram os dados obtidos por LC-MS.Tabela 1

[000608] Na tabela acima, m/z representa a relação de massa para carga, z o número de cargas, Massa a massa do peptídeo, e Peptídeo a sequência de aminoácidos estimada. Escore representa a porcentagem exata do cálculo de sequência realizado pelo software PICOS (100% sendo exato ao máximo). Observar que mesmo que isoleucina (I) e leucina (L) tenham o mesmo peso molecular e sejam indistinguí- veis, elas são ambas denotadas por X nas sequências de peptídeo digeridas combinando o polipeptídeo de ORF-US2.

Exemplo B7: Síntese de Polipeptídeo de ORF-US2 usando Sistema de Síntese de Proteína Acelular e Confirmação de Atividade de Síntese de Tetraidrodaidzeína

[000609] O polipeptídeo de ORF-US2 foi sintetizado usando o sistema de síntese de proteína acelular (PURESYSTEM Classic II mini; Post Genome Institute Co., Ltd.), e sua atividade de síntese de tetrai- drodaidzeína foi confirmada.

(1) Preparação de modelo de DNA

[000610] Por um PCR de duas etapas, o modelo de DNA de polinu- cleotídeo de ORF-US2 foi preparado para síntese de proteína acelular. (1-1) Iniciadores

[000611] Os iniciadores usados para PCR para preparar modelo de DNA de ORF-US2 são como segue. E2-invitroTS-FP1: ACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGG- CACAGGAAGTCAAAGTCC (SEQ ID NO: 57) E2-invitroTS-RP: CTAGACCTCGATCTCGCCCTG- CATGCCG (SEQ ID NO: 58) Iniciador Universal: GAAATTAATACGACTCAC- TATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTT- GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA (SEQ ID NO: 59)

[000612] E2-invitroTS-FP1 e E2-invitroTS-RP foram sintetizados por Sigma-Aldrich Japão com base na sequência de nucleotídeo de ORF- US2 determinada no exemplo B5. O iniciador universal foi obtido da ligação de PURESYSTEM Classic II mini (Post Genome Institute Co., Ltd.).

(1-2) Preparação de DNA modelo por PCR de Duas Etapas

[000613] O DNA modelo usado para a síntese de polipeptídeo de ORF-US2 foi preparado por um PCR de duas etapas de acordo com o manual. Neste exemplo, o PCR usou Enzima de Clonagem por PCR Easy-A® High-Fidelity (DNA polimerase, Stratagene), e GeneAmp PCR System 9700 (PCR dispositivo, Applied Biosystems).

[000614] No primeiro PCR, o DNA genômico da cepa Lactococcus 2092 foi usado como um modelo para amplificar o nucleotídeo de ORF- US2, usando os iniciadores E2-invitroTS-FP1 e E2-invitroTS-RP determinados em (1-1). O produto de PCR resultante (nucleotídeo de ORF- US2) foi usado como um modelo para realizar o segundo PCR, usando o universal iniciador e E2-invitroTS-RP. 300 μL (50 μL x 6) do produto de PCR foram purificados usando kit de Purificação de PCR (Qiagen), e usados como DNA modelo (DNA modelo para síntese de polipeptídeo de ORF-US2) para sintetizar o polipeptídeo de ORF-US2. O Primeiro e Segundo PCR foram realizados sob as seguintes condições.

[000615] Primeiro PCR: Uma mistura de reação de 50 μL contendo iniciadores de amplificação, 10 pmol cada; dNTP, 2,5 pmol cada; DNA genômico derivado da cepa Lactococcus 20-92, 40 ng; tampão Easy-A (Stratagene); e Enzima de Clonagem por PCR de Easy-A® High- Fidelity, 2U (Stratagene). Programa de amplificação: 95°C durante 2 min (95°C durante 45 sec, 58°C durante 20 sec, 72°C durante 1 min) x 30 ciclos, 72°C durante 3 min.

[000616] Segundo PCR: Uma mistura de reação de 50 μL contendo iniciadores de amplificação, 10 pmol cada; dNTP, 2,5 pmol cada; primeira mistura de reação de PCR, 0,5 μL; tampão Easy-A; e Enzima de Clonagem por PCR de Easy-A® High-Fidelity, 2U. Programa de amplificação: 95°C durante 2 minutos, (95°C durante 45 segundos, 45°C durante 20 segundos, 72°C durante 1 minuto) x 5 ciclos, (95°C durante 45 segundos, 60°C durante 20 segundos, 72°C durante 1 minuto) x 25 ciclos, 72°C durante 3 minutos.

(2) Síntese de proteína acelular de Polipeptídeo de ORF-US2 e Confirmação da Atividade de Síntese de Tetraidrodaidzeína

[000617] 25 μL de solução A e 10 μL de solução B de PURESYSTEM Classic II mini, preservados em -80°C, foram descongelados em gelo e misturados entre si. Em seguida, 0,6 μg (60 ng/μL, 10 μL) de DNA modelo de sintetização de polipeptídeo de ORF-US2 (incluindo uma sequência promotora T7 e uma sequência de ligação de ribossoma 5' a montante do códon iniciador) preparado pelo segundo PCR foi adicionado. O volume total foi ajustado para 50 μL adicionando-se água esterilizada, e a mistura foi incubada a 37°C durante 90 minutos para sintetizar um polipeptídeo alvo. Como um controle positivo de síntese de proteína usando este sistema, 0,5 μg (0,2 μg/μL, 2 μL) de DNA modelo de sintetização de diidrofolato redutase (DHFR), fornecido como uma ligação de PURESYSTEM Classic II mini, foi usado. Nenhum DNA modelo foi adicionado em um controle negativo, e somente água esterilizada foi usada. Para medição da atividade, 40 μL da mistura de reação foram adicionados a um tampão de reação de enzima da composição abaixo, e a mistura foi incubada a 37°C durante 6 horas. Após a reação, a mistura de reação de enzima foi extraída com 3 mL de acetato de etila. O extrato foi secado e dissolvido em tampão de forese, e tetraidrodaidzeína na mistura de reação de enzima foi ensaiado por análise de HPLC. Composição de Tampão de Reação de Enzima Tampão de fosfato de potássio a 0,1 M/ PMSF a 1 mM/ DTT a 2 mM/ hidrossulfeto de sódio a 5 mM (pH 7,0) NADPH a 2 mM NADH a 2 mM 10 μg/mL de diidrodaidzeína

[000618] As amostras com o DNA modelo de sintetização de diidrofo- lato redutase (DHFR) de modo bem sucedido expressaram a proteína do DNA, considerando que nenhuma expressão de proteína foi observada nas amostras com nenhum DNA modelo. Esses resultados sugerem que o experimento foi, sem dúvida, apropriado.

[000619] Os resultados são mostrados na FIG. 17. A mistura de reação expressando polipeptídeo de ORF-US2 teve um pico para tetrai- drodaidzeína em cerca de uma posição de 6,7 minutos 6 horas pós- reação, considerando que nenhum pico de tetraidrodaidzeína foi observado na mistura de reação com a síntese de proteína (NC) e a mistura de reação expressando diidrofolato redutase (DHFR). Além disso, ao mesmo tempo em que a mistura de reação expressando polipeptí- deo de ORF-US2 teve um nível reduzido de diidrodaidzeína (substrato) devido à biossíntese de tetraidrodaidzeína, uma redução de diidro- daidzeína não foi observada na mistura de reação como na síntese de proteína (NC) e na mistura de reação expressando diidrofolato redu- tase (DHFR). Esses resultados mostram que o polipeptídeo de ORF- US2 teve a atividade de sintetizar a tetraidrodaidzeína de diidrodaidze- ína. Pode ser, portanto dito que o polipeptídeo de ORF-US2 corresponde ao polipeptídeo E2.

Exemplo B8: Expressão de Polipeptídeo de ORF-US2 Recombinante Usando Escherichia coli, e Confirmação da Atividade de síntese de tetraidrodaidzeína

[000620] O sistema pET, um sistema de expressão de proteína re- combinante usando Escherichia coli, foi usado para expressar polipep- tídeo de ORF-US2, e sua atividade de síntese de tetraidrodaidzeína foi confirmada.

(1) Preparação de Vetor de Expressão de Polipeptídeo de ORF-US2

[000621] Para preparar um vetor de expressão de polipeptídeo de ORF-US2 (pET21-US2), o DNA na região de estrutura de leitura aberta de Polipeptídeo de ORF-US2 foi amplificado por PCR.

[000622] Os seguintes iniciadores de amplificação foram preparados com base na sequência de polipeptídeo de ORF-US2 determinada no exemplo B5. exp.US2 pet F Nde: TATACATATGGCACAGGAAGT- CAAAGTC (SEQ ID NO: 60) exp.US2 pet: AATCGAATTCCTAGACCTCGATCTCG- CCCTGC (SEQ ID NO: 61)

[000623] Para inserção em pET21a (Novagen), os iniciadores de amplificação exp.US2 pet F Nde e exp.US2 pet foram designados incluir sequências de restrição NdeI e EcoRI, respectivamente.

[000624] Uma reação de PCR foi realizada usando 25 μL de uma mistura de reação contendo os iniciadores, 5 pmol cada; dNTP, 5 nmol cada; DNA genômico da cepa Lactococcus 20-92, 40 ng; 10 x tampão para KOD-plus DNA polimerase (Toyobo), 2,5 μL; KOD-Plus DNA po- limerase, 0,3 U (Toyobo). Programa de amplificação: 95°C for 3 min, (94°C durante 30 sec, 60°C durante 30 sec, 68°C durante 1 min) x 30 ciclos, 68°C durante 7 min. Dispositivo de PCR: GeneAmpPCR System 9700 (Applied Biosystems). A análise de uma parte da mistura de reação PCR por eletroforese de gel de agarose detectou uma faixa de um tamanho esperado. O produto de PCR inteiro foi coletado por um kit de purificação por PCR QIAGEN (Qiagen).

[000625] Os fragmentos de DNA desse modo coletados foram cortados com enzimas de restrição NdeI e EcoRI, e submetidos a eletroforese de gel de agarose. Em seguida, uma porção contendo a faixa alvo foi excisada, e purificada e coletada com um kit de Extração de Gel Qiagen (Qiagen). Após a coleta, os fragmentos de DNA foram ligados a 16°C durante a noite com pET21a digerido com NdeI e EcoRI, usando um Kit de Ligação de DNA ver.2.1 (Takara Bio). A mistura de reação ligada foi em seguida usada para transformar a cepa Escherichia coli JM109 (Takara Bio).

[000626] O transformante foi cultivado a 37°C durante a noite em uma placa de ágar de meio LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 μg/mL). As colônias únicas resultantes foram cultivadas durante a noite em um meio de LB de 3 mL (GIBCO) contendo ampicilina (50 μg/mL). Em seguida, DNA de plasmídeo foi extraído usando um autoextrator de plasmídeo PI-100 (KURABO).

[000627] A sequência de base do DNA inserido no plasmídeo foi se- quenciada pelo método terminador. Isto confirmou a inserção bem sucedida de polinucleotídeo de ORF-US2, como pretendido. Neste exemplo, a sequência DNA foi determinada usando seqüenciador de DNA ABI3700 (Applied Biosystems).

(2) Expressão e Confirmação de Polipeptídeo de ORF-US2 Recombinante em Escherichia coli

[000628] O plasmídeo pET21-US2 de expressão de polipeptídeo de ORF-US2 recombinante e plasmídeo pET21a (controle negativo) foram usados para transformar a cepa Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen). Para obter colônias únicas, os transformantes foram cultivados durante a noite em 37°C em uma placa de ágar de meio LB contendo ampicilina (50 μg/mL).

[000629] Cada transformante de E. coli BL21 (DE3) foi cultivado durante a noite a 37°C em um meio LB líquido de 3 mL contendo ampici- lina (50 μg/mL). Em seguida, 0,5 mL da cultura foi pré-cultivado durante 3 horas (até OD em 630 nm ficasse em cerca de 0,4) adicionando- se 50 mL de meio LB líquido contendo a mesma concentração de am- picilina. Após ajustar a concentração final para 1 mM adicionando-se IPTG (isopropil-p-tiogalactopiranosídeo; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a cultura foi também incubada a 37°C durante 4 horas.

[000630] Após a incubação, as células foram coletadas por centrifugação (6.000 rpm, 4°C, 15 min) usando um Avanti HP25 (Beckman Coulter). Os procedimentos subsequentes foram realizados no gelo. Após remover o sobrenadante (o meio), as células foram suspensas em 1 mL de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0; KPB-PDH) contendo PMSF a 1 mM, DTT a 2 mM, e hidrossulfeto de sódio a 5 mM. A suspensão de célula foi em seguida colocada em um tubo auxiliar de 2 mL carregado com 0,7 mL de contas de zircônia-sílica (BioSpec Products, Inc.) e 400 μL de KPB-PDH. As células foram em seguida rompidas por dois ciclos repetidos de um tratamento de 20 segundos, 6.500 rpm e resfriamento com gelo de 3 minutos, usando um Fas- tPrep® (Thermo Electron Corporation). Como um resultado, uma suspensão de células rompidas foi obtida.

[000631] A expressão de polipeptídeo de ORF-US2 recombinante em E. coli foi confirmada por eletroforese de SDS-poliacrilamida-gel (SDS- PAGE).

[000632] 5 μL de tampão de amostra 5 x (Tris-HCl a 125 mM (pH 6,5)/25% de glicerol/5% de SDS/5% de 2-mercaptoetanol/BPB a 0,5%) foram adicionados a 20 μL da suspensão de célula rompida. Após desnaturação térmica a 98°C durante 5 minutos, a suspensão foi resfriada com gelo, e 10 μL foram eletroforesados por SDS-PAGE. SDS- PAGE foi realizada com uma placa de gel comercialmente disponível (SuperSep® 5-20%; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), e Quick CBB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para manchamento. A faixa Prestained XL-Ladder Broad (Apro Science) foi usada como um marcador de peso molecular.

[000633] Os resultados de SDS-PAGE são mostrados na FIG. 18. Um polipeptídeo recombinante com um peso molecular de cerca de 29 kDa foi confirmado na suspensão de célula rompida derivada de trans- formante pET21-US2.

(3) Confirmação de Atividade de Síntese de Diidrodaidzeína de Polipeptídeo de ORF-US2 Recombinante

[000634] A suspensão de célula rompida obtida em (2) deste Exemplo foi usada como uma fonte de enzima para medir a atividade de conversão de diidrodaidzeína para tetraidrodaidzeína. Como um resultado, a atividade foi confirmada no polipeptídeo de ORF-US2 recombi- nante expresso.

[000635] Neste exemplo, a medição da atividade de conversão de diidrodaidzeína para tetraidrodaidzeína foi realizada como segue.

[000636] Uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e a mistura foi incubada a 0°C durante 2 horas.

[000637] Após a incubação, 3 mL de acetato de etila foram adicionados à mistura de reação de enzima para extração. Após a secagem, o extrato foi dissolvido pela fase móvel (eluente). O produto dissolvido foi analisado por HPLC para medir os conteúdos de diidrodaidzeína e cise trans-tetraidrodaidzeínas na mistura de reação de enzima.

[000638] Os resultados de análise de HPLC são mostrados na FIG. 19. Na suspensão de célula rompida derivada de transformante de pET21-US2 de plasmídeo expressando o polipeptídeo de ORF-US2 recombinante, a diidrodaidzeína (substrato) adicionada à mistura de reação de enzima foi convertida para cis-tetraidrodaidzeína (c-THD) e trans-tetraidrodaidzeína (t-THD), considerando que tetraidrodaidzeína não foi detectada na mistura de reação de enzima no transformante de pET21a (controle negativo).

[000639] Esses resultados mostram que polipeptídeo de ORF-US2 recombinante tem a atividade de sintetizar a tetraidrodaidzeína de dii- drodaidzeína. Pode, portanto, ser dito que polipeptídeo de ORF-US2 recombinante corresponde ao polipeptídeo E2.

Exemplo C Exemplo C1: Confirmação de Atividade Biossíntética de Equol de Cé-lula Bacteriana de Tetraidrodaidzeína

[000640] Uma cepa Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) foi inoculada em um meio líquido de amplificação de contendo tetraidrodaidze- ína (um meio de caldo GAM modificado (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) ao qual cis- ou trans-tetraidrodaidzeína (organicamente sintetizado por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.: veja Exemplo de referência B1) foi adicionada em uma quantidade de 10 μg/mL), e a cultura foi incubada a 37°C durante 18 horas sob condições anaeróbicas (usando BBL Gas Pack systems). Após a incubação, 1 mL da cultura foi imediatamente colocado em um tubo centrífugo de vidro com tampa, e 3 mL de acetato de etila foram adicionados a isto para extração. O produto foi secado para preparar uma amostra para análise de HPLC. Como a solução padrão para análise de HPLC, uma solução misturada de daidzeína (2 μg/mL; Funakoshi Corporation), equol (2 μg/mL; Funa- koshi Corporation), diidrodaidzeína (2 μg/mL; Trend Research Chemicals Inc.), cis-tetraidrodaidzeína e trans-tetraidrodaidzeína (2 μg/mL; ambas quimicamente sintetizadas por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) foi usada.

[000641] Os resultados são mostrados em Fig. 20. Fig. 20 mostra que a cepa Lactococcus 20-92 tem uma atividade para biossintetizar equol de ambas cis- e trans-tetraidrodaidzeínas (Fig. 20, gráficos médios e menores). Observe que nas figuras, daidzeína é abreviada como DZN, diidrodaidzeína como DD, cis-tetraidrodaidzeína como c-THD, trans-tetraidrodaidzeína como t-THD, e equol como EQL.

Exemplo C2: Pesquisa e Identificação de Enzima de Sintetização de Equol por Sistema de Expressão de Proteína Recombinante usando Escherichia coli

[000642] O sistema pET (Novagen), um sistema de expressão de proteína recombinante usando Escherichia coli, foi usado para expressar polipeptídeos cada correspondendo a três polinucleotídeos de ORF (ORF-US3, US1, e DS1) identificados no gene de enzima de sintetização de diidrodaidzeína de sequência DNA genômico periférico (E1) determinado no exemplo B5, em Escherichia coli. A atividade para catalisar a conversão de equol de tetraidrodaidzeína foi examinada para pesquisar a enzima de sintetização de equol (E3).

(4) Preparação de Vetor de Expressão de Polipeptídeo de ORF

[000643] Para preparara um vetor de expressão de polipeptídeo cada de ORF (ORF-US3, US1, e DS1), o polinucleotídeo na região de estrutura de leitura aberta de cada polipeptídeo foi amplificado por PCR e inserido no vetor pET21a (Novagen).

(1-1) Iniciador de Amplificação

[000644] Os seguintes iniciadores de amplificação foram preparados com base na sequência de DNA genômico periférico de enzima de sintetização de diidrodaidzeína (E1) determinado no exemplo B5. Polipeptídeo de ORF-US3 exp.US3 F: TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG (SEQ ID NO: 62) exp.US3 R: CCGCAAGCTTCTACATAGTGGAGATCGCG- TGG ORF-US (SEQ ID NO: 63) Polipeptídeo de ORF-US1 exp.US1 F: TATACATATGTTCAAGGGTCCACAGGGC (SEQ ID NO: 64) exp.US1 R: GCTCGAATTCTTAGTGCTGCTGTGCCTTTT- CAG (SEQ ID NO: 65) Polipeptídeo de ORF-DS1 exp.DS1 F: ATATACATATGCAGGATATGGACTTCATGG (SEQ ID NO: 66) exp.DS1 R: GCTCGAATTCTCATAGTGACATCAGCG- CTCCC (SEQ ID NO: 67)

[000645] Para inserção em pET21a (Novagen), os iniciadores de amplificação exp.US3 F, exp.US1 F, e exp.DS1 F foram designados para incluir sequência de restrição NdeI, exp.US3 R para incluir a sequência de restrição HindIII, e exp.US1R e exp.DS1 R para incluir a sequência de restrição EcoRI.

(1-2) Amplificação de Cada Polinucleotídeo de ORF

[000646] Uma reação de PCR foi realizada usando 25 μL de uma mistura de reação contendo os iniciadores, 5 pmol cada; dNTP, 5 nmol cada; DNA genômico de cepa Lactococcus 20-92 purificada no exemplo A5, 40 ng; 10 x tampão para KOD-plus DNA polimerase (Toyobo Co., Ltd.), 2.5 μL; KOD-Plus DNA polimerase, 0,3 U (Toyobo Co., Ltd.). Programa de amplificação: 95°C durante 3 min, (94°C durante 30 seg, 60°C durante 30 seg, 68°C durante 2 min) x 30 ciclos, 68°C durante 7 min. PCR dispositivo: GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). A análise de uma parte da mistura de reação de PCR por eletroforese de gel de agarose detectou uma faixa de um tamanho esperado para cada iniciador. O produto de PCR inteiro foi coletado por um kit de Purificação por PCR QIAGEN (Qiagen).

(1-3) Preparação de Vetor de Expressão de Polipeptídeo de ORF

[000647] Os fragmentos de polinucleotídeo de ORF-US3 coletados no processo (1-2) foram cortados com enzimas de restrição NdeI e HindIII, e os fragmentos de polinucleotídeo de ORF-US1 e ORF-DS1 foram cortados com enzimas de restrição NdeI e EcoRI. Os fragmentos foram submetidos à eletroforese de gel de agarose. Em seguida, uma porção contendo a faixa alvo foi excisada, e purificada e coletada com um kit de Extração de Gel Qiagen (Qiagen). Após a coleta, os fragmentos de polinucleotídeo foram ligados a 16°C durante a noite com pET21a digerido com NdeI e HindIII ou EcoRI, usando um kit de Ligação de DNA ver. 2.1 (Takara Bio). A mistura de reação ligada foi em seguida usada para transformar a cepa Escherichia coli JM109 (Takara Bio) por um método usual. O transformante obtido foi cultivado a 37°C durante a noite em uma placa de ágar de meio de LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 μg/mL). As colônias únicas resultantes foram cultivadas durante a noite em um meio de LB de 3 mL (GIBCO) contendo ampicilina (50 μg/mL). Em seguida, o DNA de plasmídeo foi extraído usando um autoextrator de plasmídeo PI-100 (KURABO).

[000648] A sequência de base do DNA inserido no plasmídeo foi se- qüenciada pelo método terminador de pigmento. Isto confirmou a inserção bem sucedida de cada polinucleotídeo, como pretendido. Desse modo, pET-US3, pET-US1, e pET-DS1 foram obtidos. Neste exemplo, a sequência de DNA foi determinada usando seqüenciador de DNA ABI3700 (Applied Biosystems).

(5) Expressão de Cada Polipeptídeo Recombinante em Escherichia coli' (2-1) Preparação de Transformante de Escherichia coli BL21

[000649] Os plasmídeos de pET-US3, pET-US1, pET-DS1, e pET21a de expressão de polipeptídeo de ORF recombinante (controle negativo) foram usados para transformar a cepa Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) por um método usual. Para obter colônias únicas, os trans- formantes foram cultivados durante a noite a 37°C em uma placa de ágar de meio LB contendo ampicilina (50 μg/mL).

(2-2) Indução de Expressão de Polipeptídeo Recombinante

[000650] Cada transformante de E. coli BL21 (DE3) foi cultivado durante a noite a 37°C em um meio de LB líquido de 3 mL contendo am- picilina (50 μg/mL). Em seguida, 0,5 mL da cultura foi pré-cultivado durante 3 horas (até que OD em 630 nm ficassem cerca de 0,4 a 0,7) adicionando-se 50 mL de meio LB líquido contendo a mesma concentração de ampicilina. Após ajustar a concentração final para 1 mM adicionando-se IPTG (isopropil-p-tiogalactopiranosídeo; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a cultura foi ainda incubada a 37°C durante 4 horas. Desse modo, a expressão de polipeptídeo recombinante em Escherichia coli foi induzida.

(2-3) Preparação de Suspensão de Célula Rompida

[000651] Após a indução de expressão no processo (2-2), as células foram coletadas por centrifugação (6.000 rpm, 4°C, 15 minutos) usando um Avanti HP25 (Beckman Coulter). Os procedimentos subsequentes foram realizados no gelo. Após remover o sobrenadante (o meio), as células foram suspensas em 1 mL de tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0; a seguir abreviado como KPB-PDH) contendo PMSF a 1 mM, DTT a 2 mM, e hidrossulfeto de sódio a 5 mM. A suspensão de célula foi em seguida colocada em um tubo auxiliar de 2 mL carregado com 0,7 mL de contas de zircônia-sílica (BioSpec Products, Inc.) e 400 μL de KPB-PDH. As células foram em seguida rompidas por dois ciclos repetido de um tratamento de 20 segundos, 6.500 rpm e resfri-amento com gelo de 3 minutos, usando um FastPreTM (Thermo Electron Corporation). Como um resultado, uma suspensão de células rompidas foi obtida.

(2-4) Confirmação de Expressão de Polipeptídeo Recombinante por Eletroforese de SDS-Poliacrilamida-Gel (SDS-PAGE)

[000652] A expressão de cada polipeptídeo de ORF recombinante em E. coli foi confirmada por SDS-PAGE. 5 μL de tampão de amostra 5 x (Tris-HCl a 125 mM (pH 6,5)/25% de glicerol/5% de SDS/5% de 2- mercaptoetanol/BPB a 0,5%) foram adicionados a 20 μL da suspensão de célula rompida obtida no processo (2-3). Após desnaturação térmica a 98°C durante 5 minutos, a suspensão foi resfriada com gelo, e 4 μL foram eletroforesados por SDS-PAGE. SDS-PAGE foi realizado com uma placa de gel comercialmente disponível (SuperSep® 5-20%; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), e Quick CBB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para manchamento. A faixa Prestained XL- Ladder Broad (Apro Science) foi usada como um marcador de peso molecular. Os resultados de SDS-PAGE são mostrados na FIG. 21. A expressão de polipeptídeos de ORF-US3 e ORF-DS1 recombinantes com pesos moleculares de cerca de 52 kDa e 50 kDa foi confirmada nas suspensões celulares rompidas derivadas de transformantes de pET-US3 e pET-DS1, respectivamente. Nenhuma expressão de poli- peptídeo de ORF-US1 recombinante foi observada na suspensão de célula rompida derivada de transformante de pET-US1.

Exemplo C3: Medição de Atividade de Síntese de Equol de Polipeptídeo de ORF Recombinante.

[000653] Uma suspensão de célula rompida obtida no exemplo C2 foi usada como uma fonte de enzima para medir a atividade de conversão de tetraidrodaidzeína para equol. Neste exemplo, a medição da atividade de conversão de tetraidrodaidzeína para equol foi realizada como segue.

[000654] Uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e a mistura foi incubada a 37°C durante 1 hora.

[000655] Após a incubação, 3 mL de acetato de etila foram adicionados à mistura de reação de enzima para extração. Após a secagem, o extrato foi dissolvido pela fase móvel (eluente). O produto dissolvido foi analisado por HPLC para medir os conteúdos de diidrodaidzeína, cis- tetraidrodaidzeína, trans-tetraidrodaidzeína, e equol na mistura de reação de enzima. Como a solução padrão para análise de HPLC, uma solução misturada de daidzeína (2 μg/mL; Funakoshi Corporation), equol (2 μg/mL; Funakoshi Corporation), diidrodaidzeína (2 μg/mL; Trend Research Chemicals Inc.), cis-tetraidrodaidzeína e trans- tetraidrodaidzeína (2 μg/mL; ambos quimicamente sintetizados por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) foi usada.

[000656] Como um resultado da análise de HPLC, na suspensão de célula rompida derivada de transformante de pET-US3 de plasmídeo expressando o polipeptídeo de ORF-US3 recombinante, a tetraidro- daidzeína adicionada à mistura de reação de enzima foi convertida para equol (Fig. 22). Adicionalmente, a atividade de conversão para dii- drodaidzeína, que é um precursor de tetraidrodaidzeína, foi confirmada durante a série de reação biossintética de equol (Fig. 22). Como para os transformantes pET-US1 e pET-DS1, e transformante pET21a (controle negativo), somente a tetraidrodaidzeína foi detectada na mistura de reação de enzima. Observe que nas figuras, aidzeína é abreviada como DZN, diidrodaidzeína como DD, cis-tetraidrodaidzeína como c- THD, trans-tetraidrodaidzeína como t-THD, e equol como EQL.

[000657] Esses resultados mostram que polipeptídeo de ORF-US3 tem a atividade de biossintetizar equol de tetraidrodaidzeína. Por, portanto, ser dito que o polipeptídeo de ORF-US3 recombinante corresponde ao polipeptídeo E3.

Exemplo D Exemplo D1: Expressão e Purificação de Enzima Relacionada com a Produção de Equol Rotulada por His Recombinante Usando Escherichia coli

[000658] Ao usar um sistema pET (Novagen), que é um sistema de expressão de proteína recombinante usando Escherichia coli, três enzimas relacionadas com a produção de equol com rótulo His: enzima de síntese de diidrodaidzeína (E1), enzima de síntese de etetraidro- daidzeína (E2), enzima de síntese de equol (E3), foram expressas, seguido por purificação por afinidade usando a coluna de purificação de proteína rotulada por His (Ni).

(6) Produção de Vetor de Expressão de Enzima Rotulada por His

[000659] Para produzir os vetores de expressão para as enzimas (E1, E2, E3), um polinucleotídeo em cada região de estrutura de leitura aberta foi amplificado por PCR e inserido em um vetor pET21a (Novagen).

(1-1) Iniciador de Amplificação

[000660] Com base na sequência de genoma na vizinhança da enzima de síntese de diidrodaidzeína (E1) encontrada no exemplo B5, os seguintes iniciadores de amplificação foram produzidos. Enzima E1 rotulada por His exp.E1 pet F Nde:AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA (Sequencia Número:41) exp.E1 pet His:AATCGAATTCGTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT (Sequencia Núme- ro:42) Enzima E2 rotulada por His exp.US2 pet F Nde:TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC (Sequencia Número:60) exp.E2 pet His:AATCGAATTCGAGACCTCGATCTCGCCCTGC (Sequencia Número:68) Enzima E3 rotulada por His exp.US3 F:TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG (Sequencia Número:62) exp.E3 R His:CCGCAAGCTTGTACATAGTGGAGATCGCGTGG (Sequencia Número:69)

[000661] Para inserção em pET21a (Novagen), os iniciadores de amplificação: exp.E1 pet F Nde, exp.US2 pet F, e exp.US3 F foram designados para cada incluir uma sequência de sítio de clivagem NdeI de enzima de restrição; exp.E1 pet His e exp.E2 pet His foram designados para incluir uma sequência de sítio de clivagem EcoRI; e exp.E3 R His foi designado para incluir uma sequência de sítio de clivagem HindIII.

(1-2) Amplificação de Polinucleotídeos de Enzima Rotulada por His

[000662] Uma reação de PCR foi realizada usando 25 μL de uma mistura de reação contendo os iniciadores, 5 pmol cada; dNTP, 5 nmol cada; DNA genômico da cepa Lactococcus 20-92 (FERM BP-10036) purificado no exemplo A5, 40 ng; 10* tampão para KOD-plus DNA po- limerase (Toyobo), 2,5 μL; KOD-Plus DNA polimerase (Toyobo) 0,3 U, usando um programa de amplificação: 95°C durante 3 minutos, (94°C durante 30 sec, 60°C durante 30 segundos, 68°C durante 2 minutos) * 30 ciclos, 68°C durante 7 minutos (dispositivo de PCR: GeneAmpPCR System 9700 (Applied Biosystems)). A análise de uma parte da mistura de reação de PCR por eletroforese de gel de agarose detectou uma faixa de um tamanho esperado. O produto de PCR total foi cletado por kit de Purificação por PCR QIAGEN (Qiagen).

(1-3) Produção de Vetor de Expressão de Polipeptídeo de Enzima Rotulada por His

[000663] Os fragmentos de polinucleotídeo de enzima rotulada por His coletadas em (1-2)foram cortados com enzimas de restrição NdeI e EcoRI, e submetidos à eletroforese de gel de agarose. Em seguida, uma porção contendo a faixa alvo foi excisada, e purificada, e coletada com kit de Extração de Gel Qiagen (Qiagen). Após a coleta, os fragmentos de polinucleotídeo foram ligados a 16°C durante a noite com pET21a digerido com NdeI e EcoRI, usando Kit de Ligação de DNA ver.2.1 (Takara Bio). Com a mistura de reação ligada, a transformação da cepa Escherichia coli JM109 (Takara Bio) foi realizada em um método geral. O transformante desse modo obtido foi cultivado a 37°C durante a noite em uma placa de ágar de meio LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 μg/mL). As colônias únicas resultantes foram cultivadas durante a noite em um meio LB de 3 mL (GIBCO) contendo ampicilina (50 μg/mL). Em seguida, DNA de plasmídeo foi extraído usando auto- extrator de plasmídeo PI-100 (KURABO).

[000664] A sequência de base do DNA inserido no plasmídeo foi se- quenciada pelo método terminador de pigmento. Isto confirmou a inserção bem sucedida de polinucleotídeo de ORF-US2 como pretendido. pET-E1-His, pET-E2-His, e pET-E3-His foram obtidos. Neste exemplo, a sequência de DNA foi determinada usando seqüenciador de DNA ABI3700 (Applied Biosystems).

(7) Expressão e Purificação por Afinidade de Cada Polipeptídeo de Enzima Recombinante Rotulada por His em Escherichia coli' (2-1) Produção de transformante de Escherichia coliBL21

[000665] Ao usar o plasmídeo pET-E1-His, pET-E2-His, pET-E3-His para expressar o polipeptídeo de enzima rotulada por His, cepas de Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen) foram transformadas usando um método geral. Os transformantes foram cultivados a 37°C durante a noite em placas de ágar de meio LB (GIBCO) contendo ampicilina (50μg/mL), desse modo obtendo as colônias únicas.

(2-2) Purificação de Polipeptídeo de Enzima Recombinante E1 e E2 Rotulada por His (2-2-1) Cultivo de Escherichia coli e Indução de Expressão de polipep- tídeos de Enzima Recombinante E1 e E2 Rotulada por His

[000666] Cada dos transformantes de E. coli BL21 (DE3), respectivamente transformados por pET-E1-His e pET-E2-His, foi cultivado durante a noite a 37°C em um meio LB líquido de 10 mL contendo ampi- cilina (50 μg/mL). Em seguida, 7,5 mL da cultura foram pré-cultivados durante 2 horas (até que OD em 600 nm ficasse em cerca de 0,5) adicionando-se 150 mL de meio LB líquido contendo a mesma concentração de ampicilina. Após ajustar a concentração final para 0,5 mM adicionando-se IPTG (isopropil-β-tiogalactopiranosideo; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a cultura foi também incubada a 30°C durante 4 horas ao mesmo tempo em que sendo suavemente agitada, desse modo induzindo a expressão de polipeptídeos de enzima recombinan- te E1 e E2 rotulada por His em Escherichia coli.

(2-2-2) Preparação de Lisado

[000667] Após a indução de expressão em (2-2), a cultura foi centrifugada (6000 rpm, 4°C, 10 minutos) usando Avanti HP25 (beckman coulter) para coletar as células, desse modo obtendo polipeptídeos de enzima recombinante E1 e E2 rotulada por His expressos em Escherichia coli, respectivamente em quantidades de 0,66 g e 0,73 g. Uma solução de Extração de proteína Bugbuster (Novagen) foi adicionada às células obtidas em uma quantidade de 15 mL por grama (peso úmido) da célula. A mistura foi suspensa suavemente com uma pipeta, e Lisozima (SIGMA) e Benzonase (Novagen) foram adicionados à suspensão nas quantidades de 2000 unidades/mL, e 25 unidades (1 μL)/mL, respectivamente. Em seguida, a mistura foi lentamente agitada com um rotor (RT-50:Taitec) em temperatura ambiente durante 30 minutos, desse modo obtendo um lisado (Lisado A). O lisado A foi centrifugado (8000 rpm, 4°C, 15 minutos) com Avanti HP25 (beckman coulter) para separar um sobrenadante (Lisado B).

(2-2-3) Purificação por Afinidade de Polipeptídeos de Enzima Rotulada por His E1 e E2

[000668] Ao usar His GraviTrap (GE Healthcare Bioscience) como uma coluna de purificação de proteína rotulada por His, a purificação por afinidade dos polipeptídeos de enzima rotulada por His E1 e E2 foi realizada de acordo com o manual de instrução exceto por algumas modificações. Mais especificamente, His GraviTrap foi equilibrado com tampão de ligação de 10 mL resfriado com gelo, e o Lisado B total preparado em (2-2-2) foi derramado na mistura para que as enzimas E1 ou E2 rotuladas por His alvo fossem aderidas a His GraviTrap por queda livre. Por conseguinte, His GraviTrap foi limpo duas vezes com tampão de limpeza de 10 mL resfriada com gelo, seguido por eluição das enzimas rotulada por His E1 e E2 alvo de His GraviTrap usando tampão de eluição de 3 mL. DTT (Ditiotreitol: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi adicionado ao eluato para que a concentração final ficasse 3mM. A mistura foi dividida em microtubos de 300 μL. Uma parte dos microtubos foi examinada quanto as suas atividades enzimáti- cas de E1 e E2 nos eluatos respectivos. O eluato foi preservado a 4°C até que ele fosse usado para o teste de enzima.

[000669] As composições do tampão de ligação, o tampão de ligação, e o tampão de eluição usado para a purificação foram mostrados abaixo.

[000670] Tampão de ligação: Tris-HCl a 20 mM, Imidazol a 20 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), NaCl a 0,5M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), DTT a 1 mM (Ditiotreitol: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), PMSF a 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

[000671] Tampão de Limpeza: Tris-HCl a 20 mM, Imidazol a 60 mM, NaCl a 0,5M, DTT a 1mM (Ditiotreitol), PMSF a 1 mM (fluoreto de fe- nilmetilsulfonila)

[000672] Tampão de Eluição: Tris-HCl a 20 mM, Imidazol a 500 mM, NaCl a 0,5M, DTT a 1 mM (Ditiotreitol), PMSF a 1 mM (fluoreto de fe- nilmetilsulfonila).

(2-3) Purificação de Polipeptídeo de Enzima Recombinante E3 Rotulada por His (2-3-1) Cultivo e Indução de Escherichia coli de expressão de Polipeptídeo de Enzima Recombinante E3 Rotulada por His

[000673] O transformante de E. coli BL21 (DE3), transformado por pET-E3-His, foi cultivado durante a noite a 37°C em um meio LB líquido 50 mL contendo ampicilina (50 μg/mL). Em seguida, 20 mL da cultura foram pré-cultivados durante 3 horas (até que OD em 600 nm ficasse em cerca de 0,4) adicionando-se 1L de meio LB líquido contendo a mesma concentração de ampicilina. Após ajustar a concentração final para 0,5 mM adicionando-se IPTG (isopropil-β-tiogalactopiranosideo; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a cultura foi também incubada a 37°C durante 4 horas ao mesmo tempo em que sendo agitada, desse modo induzindo a expressão de polipeptídeo de enzima recombinante E3 rotulada por His em Escherichia coli. Após a indução de expressão, a cultura foi centrifugada (6000 rpm, 4°C, 10 minutos) usando Avanti HP25 (beckman coulter) para coletar as células. Tampão de fosfato de potássio a 0,1 M contendo PMSF a 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila), DTT a 2 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e sodioidrossulfeto a 5 mM (Tampão A, a seguir: pH 7,0) foi adicionado para suspensão. Após a centrifugação (6000 rpm, 4°C, 10 minutos), a cultura foi mantida a -80°C.

(2-3-2) Preparação de Lisado

[000674] As células preservadas a -80°C foram rapidamente descongeladas e centrifugadas (10.000xg 15 min). As células foram suspensas adicionando-se 25 mL do novo Tampão A. Para o rompimento, as células foram em seguida rompidas por três ciclos repetidos de um tratamento de 20 segundos, 6.500 rpm e resfriamento com gelo de 3 minutos, usando FastPrep® (Thermo Electron Corporation). O material celular rompido resultante foi centrifugado (10000 Xg, 15 minutos). O sobrenadante foi separado para obter um lisado.

(2-3-3) Purificação por Afinidade de polipeptídeo de Enzima Recombinante E3 Rotulada por His

[000675] 4 mL do lisado obtido em (2-3-3) foram fornecidos para His-Trap HP (GE Healthcare Bioscience), que é uma coluna de purificação de proteína de fusão de rótulo His, para purificar o polipeptídeo de enzima recombinante E3 rotulada por His sob as condições de purificação abaixo. A proteína foi medida com base na absorção em 280 nm. A fração usando um coletor de fração foi iniciada após a Absorção em 280 nm na passagem pela fração diminuída para o valor de referência. Taxa de Fluxo: 1 ml/min Fração: 2 ml/2 min/Fração Eluente A: tampão de fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7)/ NaCl a 0,5 M /1% de isoPrOH Eluente B: Eluente A contendo Imidazol a 0,5M Programa de Eluição:

[000676] A atividade de síntese E3 foi observada nas Frações No.7 a 9. As frações ativas obtidas por uma pluralidade de purificações foram agrupadas, misturadas com glicerina em uma relação de 8%, mantidas em -28°C, e dissolvidas quando requerido para serem usadas para o experimento.

Exemplo D2: Síntese de Tetraidrodaidzeína de Daidzeína Usando Enzimas Recombinantes E1 e E2 Rotuladas por His

[000677] Ao usar as enzimas recombinantes E1 e E2 rotuladas por His obtidas no processo (2-2-3) do Exemplo D1 como uma fonte de enzima, uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e foi reagida a 37°C durante 2 horas para sintetizar a te- traidrodaidzeína de daidzeína. Adicionalmente, as reações usando a enzima recombinante E1 ou E2 rotulada por His unicamente como uma fonte de enzima foram conduzidas ao mesmo tempo.

[000678] Após a incubação, 3 mL de acetato de etila (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram adicionados à mistura de reação de enzima obtida para extração. Após a secagem, o extrato foi dissolvido pela fase móvel (eluente). O produto dissolvido foi analisado por HPLC para medir os conteúdos de cis- e trans-tetraidrodaidzeínas na mistura de reação de enzima.

[000679] Como a solução padrão para análise de HPLC, uma solução misturada de daidzeína (2 μg/mL; Funakoshi Corporation), equol (2 μg/mL; Funakoshi Corporation), diidrodaidzeína (2 μg/mL; Trend Research Chemicals Inc.), cis-tetraidrodaidzeína (2 μg/mL; Exemplo de referência B1) e trans-tetraidrodaidzeína (2 μg/mL; Exemplo de referência B1) foi usada.

[000680] FIG. 23 mostra os resultados de análise de HPLC. Quando usando a mistura das enzimas recombinantes E1 e E2 rotuladas por His como uma fonte de enzima, cis- e trans-tetraidrodaidzeínas foram confirmadas no produto. Quando usando a enzima recombinante E1 ou E2 rotulada por His unicamente como uma fonte de enzima, entretanto, cis- ou trans-tetraidrodaidzeínas não foi confirmada no produto.

Exemplo D3: Síntese de Equol de Diidrodaidzeína Usando Enzimas Recombinantes E2 e E3 Rotulada por His

[000681] Ao usar as enzimas recombinantes E2 e E3 rotuladas por His obtidas nos processos (2-2-3) e (2-3-3) de Exemplo D1 como uma fonte de enzima, uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e foi reagida a 37°C durante 2 horas para sintetizar equol de diidrodaidzeína. Adicionalmente, as reações usando a enzima recombinante E1 ou E2 rotulada por His unicamente como uma fonte de enzima foram conduzidas ao mesmo tempo.

[000682] Após a incubação, 3 mL de acetato de etila (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram adicionados à mistura de reação de enzima obtida para extração. Após a secagem, o extrato foi dissolvido pela fase móvel (eluente). O produto dissolvido foi analisado por HPLC para medir o conteúdo de equol na mistura de reação de enzima.

[000683] FIG. 24 mostra os resultados de análise de HPLC. Quando usando a mistura das enzimas recombinantes E2 e E3 rotuladas por His como uma fonte de enzima, equol foi confirmado no produto. Quando usando a enzima recombinante E2 ou E3 rotulada por His unicamente como uma fonte de enzima, entretanto, equol não foi confirmado no produto.

Exemplo D4: Síntese de Equol de daidzeína usando Enzimas Recom- binantes E1, E2, e E3 Rotuladas por His

[000684] Ao usar as enzimas recombinantes E1, E2, e E3 rotuladas por His obtidas nos processos (2-2-3) e (2-3-3) do Exemplo D1 como uma fonte de enzima, uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e foi reagida a 37°C durante 2 horas para sintetizar equol de daidzeína. Adicionalmente, as reações usando a enzima recombinante E1, E2, ou E3 rotulada por His unicamente como uma fonte de enzima foram conduzidas ao mesmo tempo.

[000685] Após a incubação, 3 mL de acetato de etila (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram adicionados à mistura de reação de enzima obtida para extração. Após a secagem, o extrato foi dissolvido pela fase móvel (eluente). O produto dissolvido foi analisado por HPLC para medir o conteúdo de equol na mistura de reação de enzima.

[000686] FIG. 25 mostra os resultados de Análise de HPLC. Quando usando a enzima recombinante E1, E2, ou E3 rotulada por His unicamente como uma fonte de enzima, equol não foi confirmado no produto. Quando usando a mistura das enzimas recombinantes E1, E2, e E3 rotuladas por His como uma fonte de enzima, entretanto, equol foi confirmado no produto.

Exemplo E: Influência de íons de metal em atividade de síntese de dii-drodaidzeína de Enzima Recombinante E1 Rotulada por His

[000687] Ao usar a enzima recombinante E1 rotulada por His (E1- His) expressa em Escherichia coli, purificada por Ni-Sefarose, como uma fonte de enzima, a influência de íons de metal na atividade de conversão de daidzeína para diidrodaidzeína foi examinada. Vários metais (MnCh2H2O, FeSO4-7H2O, CaCh2H2O, Zn(CH3COO)2-2H2O, CoSO4-7H2O, MgSO4-7H2O, NiSO4-6H2O) foram dissolvidos em água destilada para obter uma concentração de 100 mM. Ao usar a solução de íon de metal, uma mistura de reação de enzima da composição abaixo foi preparada, e foi reagida em 37°C durante 2 horas para medir a atividade.

[000688] Após a incubação, 3 mL de acetato de etila foram adicionados à mistura de reação de enzima obtida para extração. Após a secagem, o extrato foi dissolvido pela fase móvel (eluente). O produto dissolvido foi analisado por HPLC para medir os conteúdos de daidzeína e diidrodaidzeína na mistura de reação de enzima. Como um resultado, foi confirmado que Mn2+ e Fe2+ estimularam a atividade (Fig. 26).

Breve Descrição dos Desenhos

[000689] FIG. 1 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo A1. Três cromatográficos superiores: Produtos de reação de enzima não usando nenhuma coenzima (controle), e NADH e NADPH como coenzimas. Diagrama de barra: Áreas de pico correspondendo à diidrodaidzeína em controle (nenhuma coenzima) e em amostras usando NADH e NADPH como coenzimas.

[000690] FIG. 2 mostra os resultados de Mono Q HPLC no exemplo A2 (parte superior), e a atividade de enzima de sintetização de diidro- daidzeína de cada fração (parte inferior). A atividade de enzima é mostrada como uma área de pico correspondendo à diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato.

[000691] FIG. 3 mostra os resultados de SDS-PAGE no exemplo A2 (parte esquerda), e a atividade de enzima de sintetização de diidro- daidzeína de cada fração (parte direita). A atividade de enzima é mostrada como uma área de pico correspondendo à diidrodaidzeína usando daidzeína como um substrato. A SuperSep HG 10-20 % (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi usada como uma placa de gel de eletroforese.

[000692] FIG. 4 mostra os resultados de mapeamento de peptídeo no exemplo A4, e sequências de aminoácido de peptídeos correspondendo aos picos. Os números próximos às setas diagrama de análise de HPLC superior corresponde a 1: FDEPVYPQAE, 2:ASRMVMDAVHEGYIAG, e 3:GYIGNLEVENRAIRMPM respectivamente.

[000693] FIG. 5 mostra os resultados de eletroforese de agarose de produto de PCR degenerativo no exemplo A5. (1) E1-N-terminal-31 e E1-internal-RP1, (2) E1-N-terminal-37 e E1-internal-RP1, (3) E1-N- terminal-F32 e E1-internal-RP1; marcador M1: À/Styl, M2: escada de 100 bp.

[000694] FIG. 6 mostra os resultados de eletroforese de agarose de produto de RT-PCR no exemplo A7. Parte superior: diidrodaidzeína sintase; parte inferior: Ribosomal-RNA.

[000695] FIG. 7 mostra os resultados de SDS-PAGE no exemplo A8.

[000696] FIG. 8 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo A8. Parte superior: Controle; parte central: pET-E1-His; parte inferior: pET21a.

[000697] FIG. 9 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo B1. Diagrama superior: Cis-tetraidrodaidzeína (REF-000312); diagrama central: Produto de reação de enzima usando diidrodaidzeína como um substrato e material celular rompido como uma fonte de enzima; diagrama inferior: Trans-tetraidrodaidzeína (REF-000313).

[000698] FIG. 10 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo B1. Dois diagramas superiores: Produto de reação de enzima usando cis-tetraidrodaidzeína (REF-000312) como um substrato e material celular rompido como uma fonte de enzima; dois diagramas inferiores: Produto de reação de enzima usando trans-tetraidrodaidzeína (REF-000313) como um substrato e material celular rompido como uma fonte de enzima.

[000699] FIG. 11 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo B2. Três diagramas superiores: Produtos de reação de enzima não usando nenhuma coenzima (controle), e NADH e NADPH como coen- zimas. Diagrama de barra: Áreas de pico correspondendo à tetraidro- daidzeína em controle (nenhuma coenzima) e em amostras usando NADH e NADPH como coenzimas.

[000700] FIG. 12 mostra os resultados de análise de filtração de gel de HPLC no exemplo B3. Gráfico superior: Os resultados para proteína padrão; gráfico central: Atividade de enzima de cada fração mostrada como uma área de pico correspondendo ao produto tetraidro- daidzeína; gráfico inferior: Intensidade de absorção (280 nm) correspondendo à proteína de cada fração.

[000701] FIG. 13 mostra os resultados de SDS-PAGE no exemplo B3.

[000702] FIG. 14 mostra os resultados de SDS-PAGE no exemplo B4.

[000703] FIG. 15 mostra uma ilustração esquemática de uma estrutura de genoma periférico de gene de enzima de sintetização de diidro- daidzeína (E1) determinado no exemplo B5.

[000704] FIG. 16-1 mostra dados de análise de LC-MS, e um exemplo de uma sequência de aminoácido de peptídeo digerida inferida dos dados de LC-MS no exemplo B6; L, um resíduo de aminoácido denotado por X na descrição. A figura superior é para o peptídeo TPGVAASVADEXK, e a figura inferior é para o peptídeo MPGAPVFGK.

[000705] FIG. 16-2 mostra dados de análise de LC-MS, e um exemplo de uma sequência de aminoácido de peptídeo digerida inferida dos dados de LC-MS no exemplo B6; L, um resíduo de aminoácido denotado por X na descrição. A figura superior é para o peptídeo KXXXTG- TTK e a figura inferior é para o peptídeo VTQEXXCAHGAFVCGSGR.

[000706] FIG. 16-3 mostra dados de análise de LC-MS, e um exemplo de uma sequência de aminoácido de peptídeo digerida (WXSPEE- SVGQR) inferida dos dados de LC-MS no exemplo B6; L, um resíduo de aminoácido denotado por X na descrição.

[000707] FIG. 17 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo B7. Diagramas esquerdos superiores: Produto de reação de enzima usando diidrodaidzeína como um substrato e uma mistura de reação expressando polipeptídeo ORF-US2 como uma fonte de enzima (ORF-US2); diagramas direitos superiores: Produto de reação de enzima usando uma mistura de reação livre de proteína como uma fonte de enzima (NC). Diagrama de barra: Áreas de pico correspondendo à diidrodaidzeína (DD) e tetraidrodaidzeína (THD) produzidas por reações de enzima em NC (na síntese de proteína), e em amostras usando DHFR (mistura de reação expressando diidrofolato redu- tase) e ORF-US2 (Mistura de reação expressando o polipeptídeo ORF-US2) como uma fonte de enzima. FIG. 18 mostra os resultados de SDS-PAGE no exemplo B8.

[000708] FIG. 19 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo B8. Diagrama superior: Produto de reação de enzima usando diidrodaidzeína como um substrato, e uma suspensão celular rompida derivada de transformante pET21-US2 de plasmídeo expressando o polipeptídeo ORF-US2 recombinante como uma fonte de enzima (pET21-US2); diagrama inferior: Produto de reação de enzima usando diidrodaidzeína como um substrato, e uma suspensão celular rompida derivada de transformante de pET21a (controle negativo) como uma fonte de enzima (pET21a). Diagrama de barra: Áreas de pico correspondendo à diidrodaidzeína (DD) e cis- (c-THD) e trans- tetraidrodaidzeínas (t-THD) produzidas por reações de enzima em amostras usando suspensões celulares rompidas derivadas de mistura de reação expressando polipeptídeo ORF-US2 e transformante de pET21a como uma fonte de enzima.

[000709] FIG. 20 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo C1.

[000710] FIG. 21 mostra os resultados de SDS-PAGE no exemplo C2.

[000711] FIG. 22 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo C3. Parte superior: Padrão; parte central: pET-US3; parte in ferior: pET21a.

[000712] FIG. 23 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo D2. Primeira parte a partir do topo: Padrão; segunda: E1 e E2; terceira: E1; quarta: E2.

[000713] FIG. 24 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo D3. Primeira parte a partir do topo: Padrão; segunda: E2 e E3; terceira: E2; quarta: E3.

[000714] FIG. 25 mostra os resultados de análise de HPLC no exemplo D4. Primeira parte a partir do topo: Padrão; segunda: E1, E2 e E3; terceira: E1; quarta: E2; quinta: E3.

[000715] FIG. 26 mostra os efeitos de íons de metal sobre a atividade de enzima E1.

[000716] FIG. 27 mostra o alinhamento de sequências de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3.

[000717] FIG. 28 mostra o alinhamento de sequências de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 7, 8 e 9.

[000718] FIG. 29 mostra o alinhamento de sequências de aminoáci- do de SEQ ID NOs: 13, 14 e 15. Texto Livre de Listagem de Sequência SEQ ID NO: 23 é a sequência de base de iniciador E1-N-terminal-31. SEQ ID NO: 24 é a sequência de base de iniciador E1-N-terminal-37. SEQ ID NO: 25 é a sequência de base de iniciador E1-N-terminal-F32. SEQ ID NO: 26 é a sequência de base de iniciador E1-internal-RP1. SEQ ID NO: 27 é a sequência de base de iniciador pUC19-FP-1. SEQ ID NO: 28 é a sequência de base de iniciador pUC19-RP-1. SEQ ID NO: 29 é a sequência de base de iniciador pUC19-FP-2. SEQ ID NO: 30 é a sequência de base de iniciador pUC19-RP-2. SEQ ID NO: 31 é a sequência de base de iniciador E1-RACE-N-P1. SEQ ID NO: 32 é a sequência de base de iniciador E1-RACE-RP2-1. SEQ ID NO: 33 é a sequência de base de iniciador E1-RACE-N-P2. SEQ ID NO: 34 é a sequência de base de iniciador E1-RACE-RP2-2. SEQ ID NO: 35 é a sequência de base de iniciador E1-conf-NP. SEQ ID NO: 36 é a sequência de base de iniciador E1-conf-CP. SEQ ID NO: 37 é a sequência de base de iniciador E1-FP. SEQ ID NO: 38 é a sequência de base de iniciador E1-RP. SEQ ID NO: 39 é a sequência de base de iniciador Gar-16S-Ribo-FP. SEQ ID NO: 40 é a sequência de base de iniciador Gar-16S-Ribo-RP. SEQ ID NO: 41 é a sequência de base de iniciador exp.E1 pet F Nde. SEQ ID NO: 42 é a sequência de base de iniciador exp. E1 pet His. SEQ ID NO: 43 é a sequência de base de iniciador RACE-N-P3-1. SEQ ID NO: 44 é a sequência de base de iniciador RACE-N-P3-2. SEQ ID NO: 45 é a sequência de base de iniciador E1-Bub-N-P1. SEQ ID NO: 46 é a sequência de base de iniciador E1-Bub-N-P2. SEQ ID NO: 47 é a sequência de base de iniciador RACE-C-P3-1. SEQ ID NO: 48 é a sequência de base de iniciador RACE-C-P3-2. SEQ ID NO: 49 é a sequência de base de iniciador E1-Bub-C-P1. SEQ ID NO: 50 é a sequência de base de iniciador E1-Bub-C-P2. SEQ ID NO: 57 é a sequência de base de iniciador E2-invitroTS-FP. SEQ ID NO: 58 é a sequência de base de iniciador E2-invitroTS-RP. SEQ ID NO: 59 é a sequência de base de iniciador Universal-Primer. SEQ ID NO: 60 é a sequência de base de iniciador exp.US2 pet F Nde. SEQ ID NO: 61 é a sequência de base de iniciador exp. US2 pet. SEQ ID NO: 62 é a sequência de base de iniciador exp.US3 F. SEQ ID NO: 63 é a sequência de base de iniciador exp.US3 R. SEQ ID NO: 64 é a sequência de base de iniciador exp.US1 F. SEQ ID NO: 65 é a sequência de base de iniciador exp.US1 R. SEQ ID NO: 66 é a sequência de base de iniciador exp.DS1 F. SEQ ID NO: 67 é a sequência de base de iniciador exp.DS1 R.

Claims (12)

1. Processo para produzir equol, caracterizado pelo fato de que compreende a estapa de ter uma composição enzimática de síntese de equol que age sobre tetrahidrodaidzeína, em que a composição de sintetização de equol compreende um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, hidrossulfito e NADPH e/ou NADH.

2. Processo para produzir equol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição enzimática de síntese de equol compreende ainda ditiotreitol.

3. Processo para produzir tetrahidrodaidzeína, a qual é usada como intermediário na síntese de equol pelo processo conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição enzimática de síntese de tetrahidrodaidzeí- na que age sobre dihidrodaidzeína, em que a composição enzimática de síntese de tetrahidrodaidzeína compreende um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, hidrossulfito e NADPH e/ou NADH.

4. Processo para produzir tetrahidrodaidzeína, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a composição enzimáti- ca de síntese de tetrahidrodaidzeína compreende ainda ditiotreitol.

5. Processo para produzir dihidrodaidzeína, a qual é usada como intermediário na síntese de equol pelo processo conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição enzimática de síntese de dihidrodaidzeína que age sobre daidzeína, em que a composição de enzima de síntese de diidro- daidzeína compreende um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, hidrossulfito e NADPH e/ou NADH.

6. Processo para a produção de diidrodaidzeína, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a composição enzimática de síntese de diidrodaidzeína compreende ainda ditiotreitol.

7. Processo para produzir tetraidrodaidzeína, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que opcionalmente compreende a seguinte Primeira Etapa e Segunda Etapa, em que a Primeira Etapa compreende uma etapa de ter uma enzima consistindo em um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, hidrossulfito e NADPH e/ou NADH que atua em daidzeína, produzindo assim diidrodaidzeína; em que a Segunda Etapa compreende uma etapa de ter uma enzima consistindo em um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, hidrossulfito e NADPH e/ou NADH que atua em diidrodaidzeína, produzindo assim tetraidrodaidzeína.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que tanto a Primeira Etapa como a Segunda Etapa compreendem ainda ditiotreitol.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de ter uma enzima consistindo em um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7, hidrossulfito e NADPH e/ou NADH que atua em dihidrodaidzeína, produzindo assim tetrahidrodaidzeína.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda ditiotreitol.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de ter uma enzima consistindo em um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, hidrossulfito e NADPH e/ou NADH que atua em daidzeína, produzindo assim diidrodaidzeína.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda ditiotreitol.