BRPI0821508B1 - cultura celular compreendendo uma cianobactéria recombinante da espécie synechococcus elongatus e método para converter carbono inorgânico em ácidos graxos. - Google Patents

Abstract

cultura celular de um micro-organismo fotossintético recombinante e método para converter carbono inorgânico em ácidos graxos. a presente invenção refere-se a micro-organismos fotossintéticos recombinantes que convertem carbono inorgânico em ácidos graxos secretados que são descritos. métodos para recuperar os ácidos graxos secretados a partir do meio de cultura sem a necessidade de coleta celular também são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CULTURA CELULAR COMPREENDENDO UMA CIANOBACTÉRIA RECOMBINANTE DA ESPÉCIE SYNECHOCOCCUS ELONGATUS E MÉTODO PARA CONVERTER CARBONO INORGÂNICO EM ÁCIDOS GRAXOS.

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente provisório 61/007.333 depositado em 11 de dezembro de 2007. Os conteúdos deste pedido de patente são incorporados neste pedido por referência. Campo Técnico

A presente invenção refere-se a micro-organismos fotossintéticos que convertem o carbono inorgânico em ácidos graxos e os secretam no meio de cultura, métodos de produção de ácidos graxos usando tais organismos, e usos do mesmo. Os ácidos graxos podem ser usados diretamente ou podem ser ainda modificados para formas alternadas, tais como ésteres, formas reduzidas, tais como alcoóis, ou hidrocarbonetos, para aplicações em diferentes indústrias, incluindo de combustíveis e produtos químicos.

Antecedentes da Técnica

Micro-organismos fotossintéticos, incluindo algas eucarióticas e cianobactérias, contêm vários lipídios, incluindo lipídios polares e lipídios neutros. Lipídios polares (por exemplo, fosfolipídeos, glicolipídeos, sulfolipídeos) estão presentes tipicamente em membranas estruturais ao passo que os lipídios neutros (por exemplo, triaciIgliceróis, ésteres de cera) se acumulam em corpos oleosos ou glóbulos oleosos citoplasmáticos. Um esforço de pesquisa substancial foi dedicado ao desenvolvimento de métodos para produzir combustíveis e produtos químicos baseados em lipídio a partir de micro-organismos fotossintéticos. Tipicamente, microalgas eucarióticas são cultivadas sob condições repletas de nutrientes até que certa densidade celular seja alcançada, após a qual as células são submetidas ao crescimento sob condições deficientes de nutrientes, que muitas vezes leva ao acúmulo de lipídios neutros. As células então são coletadas por vários meios (por exemplo, colonização, que pode ser facilitada pela adição de floculantes, seguida por centrifugação), secas, e então os lipídios são extraídos das células para uso por vários solventes não polares. A coleta das células e extração

Petição 870180144370, de 25/10/2018, pág. 6/14 dos lipídios são etapas de alto custo. Seria desejável obter lipídios a partir de micro-organismos fotossintéticos sem a necessidade de coleta e extração celular.

As Publicações PCT números W02007/136762 e

W02008/119082 descrevem a produção de componentes de biocombustível usando micro-organismos. Estes documentos revelam a produção por estes organismos de derivados de ácido graxo que são, aparentemente, alcoóis de cadeia curta e longa, hidrocarbonetos, alcoóis graxos e ésteres incluindo ceras, ésteres de ácido graxo ou ésteres graxos. Até o ponto que a produção 10 de ácido graxo é descrita, é proposta como um intermediário a estes derivados, e os ácidos graxos, por isso, não são secretados. Além disso, não há revelação de conversão do carbono inorgânico diretamente em ácidos graxos secretados usando um organismo fotossintético cultivado em um meio de cultura contendo carbono inorgânico como fonte de carbono primária. A 15 presente invenção tira proveito da eficiência de organismos fotossintéticos na secreção de ácidos graxos no meio a fim de recuperar estes compostos valiosos.

A invenção inclui a expressão de genes de acil-ACP tioesterase heterólogos (TE) em micróbios fotossintéticos. Muitos destes genes, junto 20 com seu uso para alterar o metabolismo de lipídio em sementes oleaginosas, foram descritos anteriormente. Genes que codificam as proteínas que catalisam várias etapas na síntese e metabolismo adicional de ácidos graxos também foram extensivamente descritos.

Duas classes funcionais de acil-ACP tioesterases vegetais (FatA que reconhece ácido graxo não saturado contra FatB que reconhece ácido graxo saturado) podem ser agrupadas com base em alinhamentos de sequência de aminoácido bem como função. FatAs mostra preferência marcada por 18:1-ACP com atividade menor em direção a ACPs 18:0 e 16:0, e FatBs hidrolisam acil-ACPs principalmente saturados com comprimentos de 30 cadeia que variam entre 8 e 16 carbonos. Vários estudos têm focado na engenharia de tioesterases vegetais com especificidades por substrato aperfeiçoadas ou alteradas como uma estratégia para modificar óleos de semente.

Como mostrado na figura 1, sintetase de ácido graxo catalisa um ciclo de repetição em que a proteína-veículo malonil-acila (ACP) é condensada com um substrato, inicialmente acetil-CoA, para formar acetoacetilACP, liberando CO₂. A acetoacetil-ACP é então reduzida, desidratada, e re5 duzida adicionalmente a butiril-ACP que então pode ser condensado com malonil-ACP, e o ciclo repetido, adicionando uma unidade de 2 carbonos a cada volta. A produção de ácidos graxos livres, por isso, seria aumentada por tioesterase que liberaria o próprio ácido graxo de ACP, quebrando o ciclo. Isto é, a acil-ACP é impedida re-entrar no ciclo. A produção do ácido 10 graxo também seria estimulada pelo aumento dos níveis de ácido graxo sintetase e inibição de quaisquer enzimas que resultem em degradação ou metabolismo adicional do ácido graxo.

A figura 2 apresenta uma descrição mais detalhada da formação mas de tioesterase listadas na figura 2 liberam o ácido graxo de tioéster ACP.

Tirando proveito deste princípio, Dehesh, K., et al, The Plant

Journal (1996) 9:167-172, descrevem Production of high leveis of octanoic (8:0) and decanoic (10:0) fatty acids in transgenic canola by overexpression of ChFatB2, a thioesterase cDNA from Cuphea hookeriana. e reportaram Two novel thioesterases are key determinants of the bimodal distribution of acil chain length of Cuphea palustris seed oil.

Voelker, T., et al, Science (1992) 257:12-72-74, descrevem Fatty acid biosynthesis redirected to médium chains in transgenic oilseed 25 plants. Voelker, T., and Davies, M., Journal of Bacteriology (1994)

176:7320-7327, descrevem Alteration of the specificity and regulation of fatty acid synthesis of Escherichia coli by expression of a plant medium-chain acyl-acyl carrier protein thioesterase.

Descrição da Invenção

A presente invenção é dirigida à produção de micro-organismos fotossintéticos recombinantes que são capazes de secretar ácidos graxos derivados do carbono inorgânico no meio de cultura. Métodos para remover os ácidos graxos secretados do meio de cultura sem a necessidade de coleta celular também são fornecidos. É esperado que estas melhoras levarão a menores custos para produção de combustíveis e produtos químicos baseados em lipídio a partir de micro-organismos fotossintéticos. Além disso, esta 5 invenção permite a produção de ácidos graxos de comprimento de cadeia definido, dessa forma permitindo seu uso na formulação de uma variedade de produtos diferentes, incluindo combustíveis e produtos químicos.

Dióxido de carbono (que, junto com ácido carbônico, bicarbonato e/ou carbonato definem o termo carbono inorgânico) é convertido no pro10 cesso fotossintético em compostos orgânicos. A fonte de carbono inorgânica inclui qualquer modo de entrega de carbono inorgânico, opcionalmente em mistura com qualquer outra combinação de compostos que não servem de matéria-prima de carbono primária, mas somente como uma mistura ou veíctrio (por exemplo, emissões de plantas de biocombustível (por exemplo, 15 etanol), plantas de energia, refinarias baseadas em petróleo, bem como fontes atmosféricas e subterrâneas).

Uma modalidade da invenção relaciona-se a uma cultura de micro-organismos fotossintéticos recombinantes, os ditos organismos compreendendo pelo menos um vetor de expressão recombinante que codifica pelo 20 menos uma tioesterase acil-ACP exógena, em que pelo menos uma tioesterase acil-ACP exógena preferencialmente libera cadeias de ácido graxo contendo 6 a 20 carbonos a partir destes tioésteres ACP. Os ácidos graxos são formados a partir do carbono inorgânico como sua fonte de carbono e a cultura contém substancialmente somente carbono inorgânico como uma fonte 25 de carbono. A presença de tioesterase exógena aumentará os níveis de secreção de ácidos graxos desejados em pelo menos 2 a 4 vezes.

Especificamente, em uma modalidade, a invenção é direcionada a uma cultura celular de um micro-organismo fotossintético recombinante onde o micro-organismo foi modificado para conter uma molécula de ácido 30 nucleico compreendendo pelo menos um sistema de expressão recombinante que produz pelo menos uma tioesterase acil-ACP exógena, em que a dita tioesterase acil-ACP preferencialmente libera uma cadeia de ácido graxo que contém 6 a 20 carbonos, e em que o meio de cultura fornece o carbono inorgânico substancialmente como a única fonte de carbono e em que o dito micro-organismo secreta o ácido graxo liberado pela tioesterase acil-ACP no meio. Em modalidades alternativas, a tioesterase preferencialmente libera uma cadeia de ácido graxo que contém 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 carbonos.

Em outros aspectos, a invenção é direcionada a um método para produzir ácidos graxos de comprimentos de cadeia desejados pela incubação destas culturas e recuperação destes ácidos graxos secretados das culturas. Em uma modalidade, a recuperação emprega adsorventes particulados sólidos para coletar os ácidos graxos secretados. Os ácidos graxos dessa forma recuperados podem ser ainda modificados sinteticamente ou usados diretamente como componentes de biocombustíveis ou produtos químicos.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um diagrama da via de síntese de ácido graxo como é conhecido na técnica.

A figura 2 é um diagrama mais detalhado da síntese de ácidos graxos de múltiplos comprimentos de cadeia como é conhecido na técnica.

A figura 3 é uma visão geral enzimática de biossíntese de ácido graxo identificando classes enzimáticas para a produção de ácidos graxos de vários comprimentos de cadeia.

A figura 4 é um diagrama esquemático de um sistema de recuperação de ácidos graxos do meio.

A figura 5 mostra um sistema experimental baseado de acordo com os princípios na figura 4.

A figura 6 mostra tioesterase acil-ACP representativa de uma variedade de organismos.

Modos de Realização da Invenção

A presente invenção fornece micro-organismos fotossintéticos que secretam ácidos graxos no meio de cultura, junto com métodos para adsorver os ácidos graxos no meio de cultura e os coletá-los para processar em combustíveis e produtos químicos. A invenção por meio disso elimina ou reduz muito a necessidade de coletar e extrair as células, resultando em custos de produção substancialmente reduzidos.

A figura 2 é uma visão geral de um aspecto da invenção. Como mostrado na figura 2, o dióxido de carbono é convertido em acetil-CoA usando as múltiplas etapas no processo fotossintético. A acetil-CoA então é convertida em malonil-CoA pela ação de acetil-CoA carboxilase. A malonilCoA então é convertida em malonil-ACP pela ação de malonil-CoA:ACP transacilase que, sobre a ação progressiva de ácido graxo sintetase, resulta 10 em adições sucessivas de duas unidades de carbono. Em uma modalidade da invenção, o processo é essencialmente parado em comprimentos de cadeia de carbono de 6 ou 8 ou 10 ou 12 ou 14 ou 16 ou 18 carbonos pelo fornecimento de tioesterase apropriada (mostrada na figura 2 como FatB). Até o ponto que conversões adicionais para ácidos graxos de cadeia mais longa 15 ocorrem nesta modalidade, a biomassa celular pode ser coletada também.

Os ácidos graxos secretados podem ser convertidos em várias outras formas incluindo, por exemplo, ésteres de metila, alcanos, alquenos, alfaolefinas e alcoóis graxos.

Tioesterases (Acil-ACP TEs)

A fim de resultar na secreção dos ácidos graxos livres, o organismo é fornecido em pelo menos um sistema de expressão de pelo menos uma tioesterase que funciona preferencialmente para liberar ácidos graxos de comprimento desejado. Muitos genes que codificam tais tioesterases estão disponíveis na técnica. Alguns destes são objetos de Patentes America25 nas como se segue:

exemplos incluem Patente Americana 5298421, intitulada Plant medium-chain-preferring acil-ACP thioesterases and related methods, que descreve o isolamento de tioesterase acil-ACP e o gene que a codifica das sementes imaturas de Umbellularía califomica. Outras fontes de tais tioeste30 rases e seus genes de codificação incluem Patente Americana 5.304.481, intitulada Plant thioesterase having preferential hydrolase activity toward

C12 acil-ACP substrate, Patente Americana 5.344.771, intitulada Plant thioesterases, Patente Americana 5.455.167, intitulada Medium-chain thioesterases in plants, Patente Americana 5.512.482, intitulada Plant thioesterases, Patente Americana 5.530.186, intitulada Nucleotide sequences of soybean acil-ACP thioesterase genes, Patente Americana 5.639.790, intitulada Plant medium-chain thioesterases, Patente Americana 5.667.997, intitulada C8 and C10 medium-chain thioesterases in plants, Patente Americana 5.723.761, intitulado Plant acil-ACP thioesterase sequences, Patente Americana 5.807.893, intitulada Plant thioesterases and use for modification of fatty acid composition in plant seed oils, Patente Americana 5.850.022, intitulada Production of myristate in plant cells, Patente Americana 5.910.631, intitulada Middle chain-specific thioesterase genes from Cuphea lanceolata Patente Americana 5.945.585, intitulada Specific for palmitoyl, stearoyl and oleoyl-alp thioesters nucleic acid fragments encoding acil-ACP thioesterase enzymes and the use of these^Tagments in altering plant oil composition, Patente Americana 5.955.329, intitulada Engineering plant thioesterases for altered substrate specificity, Patente Americana 5.955.650, intitulada Nucleotide sequences of canola and soybean palmitoyl-ACP thioesterase genes and their use in the regulation of fatty acid content of the oils of soybean and canola plants, e Patente Americana 6.331.664, intitulada Acil-ACP thioesterase nucleic acids from maize and methods of altering palmitic acid leveis in transgenic plants therewith.

Outros são descritos na literatura livre como se segue:

Dormann, P. et al, Planta (1993) 189:425-432, descrevem Characterization of two acyl-acyl carrier protein thioesterases from developing Cuphea seeds specific for medium-chain and oleoyl-acyl carrier protein. Dormann, P., et al, Biochimica Biophysica Acta (1994) 1212:134-136, descrevem Cloning and expression in Escherichia coli of a cDNA coding for the oleoyl-acyl carrier protein thioesterase from coriander (Coriandrum sativum L.). Filichkin, S., et al, European Joumal ofLipid Science and Technology (2006) 108:979-990, descrevem New FATB thioesterases from a highlaurate Cuphea. species: Functional and complementation analyses. Jones, A., et al, Plant Cell (1995) 7:359-371, describe Palmitoyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterase and the evolutionary origin of plant acyl-ACP thioesterases. Knutzon, D. S., et al, Plant Physiology (1992) 100:1751-1758, descrevem Isolation and characterization of two safflower oleoyl-acyl carrier protein thioesterase cDNA clones. Slabaugh, M., et al, The Plant Journal (1998) 5 13:611-620, descrevem Condensing enzymes from Cuphea wrightii associated with médium chain fatty acid biosynthesis.

Genes adicionais, não anteriormente isolados, que codificam estas acil-ACP TEs podem ser isolados de plantas que naturalmente contêm grandes quantidades de ácidos graxos de cadeia média em sua semente 10 oleaginosa, incluindo certas plantas das famílias Lauraceae, Lythraceae, Rutaceae, Ulmaceae e Vochysiaceae. Tipicamente, os ácidos graxos produzidos pelas sementes destas plantas são esterificados com glicerol e conservados no interior das células. As sementes contendo os produtos então fontes destas enzimas, tais como bactérias também podem ser usadas.

As acil-ACP TEs conhecidas de plantas podem ser divididas em duas classes principais, baseadas em suas sequências de aminoácidos e sua especificidade para acil-ACPs de diferentes comprimentos de cadeia e graus de insaturação. O tipo FatA de acil-ACP TE vegetal tem atividade 20 preferencial sobre oleoil-ACP, por meio disso liberando ácido oleico, um ácido graxo de 18 carbonos com uma ligação dupla única nove carbonos distais ao grupo carboxila. O tipo FatB de acil-ACP TE vegetal tem atividade preferencial sobre acil-ACPs saturados, e pode ter especificidade de comprimento de cadeia larga ou estreita. Por exemplo, enzimas FatB de espécies 25 diferentes de Cuphea mostraram liberar ácidos graxos nos limites de oito carbonos de comprimento a dezesseis carbonos no comprimento de acilACPs correspondentes. Listadas abaixo na Tabela 1 são várias acil-ACP TEs vegetais junto com suas preferências de substrato. (Ácidos graxos são indicados pela notação de forma abreviada padrão, em que o número prece30 dente dos dois pontos representa o comprimento de cadeia acila e o número após os dois pontos, representa o número de ligações duplas na cadeia acila.)

Tabela 1

Acil-ACP Tioesterase Vegetal

FatA de Garcinia mangostana	18:1 e 18:0
FatA de Carthamus tinctorius	18:1
FatA de Coríandrum sativum	18:1
FatB1 de Cuphea hookeriana	16:0
FatB2 de Cuphea hookeriana	8:0 e 10:0
FatB1 de Cuphea wrightii	12:0 a 16:0
FatB1 de Cuphea palustris	8:0 e 10:0
FatB2 de Cuphea palustris	14:0 e 16:0
FatB1 de Cuphea calophylla	12:0 a 16:0
FatB1 de Umbellularia califomica	12:0
FatB1 de Ulmus americana	8:0 e 10:0

As enzimas listadas na Tabela 1 são exemplares e muitos genes adicionais que codificam acil-ACP TEs podem ser isolados e usados nesta invenção, incluindo mas não limitados a genes, tais como aqueles que codificam as seguintes acil-ACP TEs (referido por Números de acesso no GenPept):

CAA52069.1, CAA52070.1, CAA54060.1, CAA85387.1, CAA85388.1,

CAB60830.1, CAC19933.1, CAC19934.1, CAC39106.1, CAC80370.1,

CAC80371.1, CAD32683.1, CAL50570.1, CAN60643.1, CAN81819.1,

CA017726.1, CA042218.1, CA065585.1, CA068322.1, AAA33019.1, AAA33020.1, AAB51523.1, AAB51524.1, AAB51525.1, AAB71729.1, AAB71730.1, AAB71731.1, AAB88824.1, AAC49001.1, AAC49002.1, AAC49179.1, AAC49180.1, AAC49269.1, AAC49783.1, AAC49784.1, AAC72881.1, AAC72882.1, AAC72883.1, AAD01982.1, AAD28187.1, AAD33870.1, AAD42220.2, AAG35064.1, AAG43857.1, AAG43858.1, AAG43859.1, AAG43860.1, AAG43861.1, AAL15645.1, AAL77443.1, AAL77445.1, AAL79361.1, AAM09524.1, AAN 17328.1, AAQ08202.1, AAQ08223.1, AAX51636.1, AAX51637.1, ABB71579.1, ABB71581.1,

ABC47311.1, ABD83939.1, ABE01139.1, ABH11710.1, ABI18986.1, ABI20759.1, ABI20760.1, ABL85052.1, ABU96744.1, EAY74210.1, E10

ΑΥ86874.1, ΕΑΥ86877.1, ΕΑΥ86884.1, ΕΑΥ99617.1, ΕΑΖ01545.1, ΕΑΖ09668.1, ΕΑΖ12044.1, ΕΑΖ23982.1, ΕΑΖ37535.1, ΕΑΖ45287.1,

ΝΡ 001047567.1, NP_001056776.1, ΝΡ_001057985.1, ΝΡ_001063601.1, ΝΡ_001068400.1, ΝΡ_172327.1, ΝΡ_189147.1, ΝΡ_193041.1,

ΧΡ_001415703.1, Q39473, Q39513, Q41635, Q42712, Q9SQI3,

ΝΡ_189147.1, AAC49002, CAA52070.1, CAA52069.1, 193041.1,

CAC39106, CA017726, AAC72883, ΑΑΑ33020, AAL79361, AAQ08223.1, ΑΑΒ51523, AAL77443, ΑΑΑ33019, AAG35064, e AAL77445.

Fontes adicionais de acil-ACP TEs que são úteis na presente invenção incluem: Arabidopsis thaliana (At); Bradyrhizobium japonicum (Bj); Brassica napus (Bn); Cinnamonum camphorum (cc); Capsicum chinense (Cch); Cuphea hookeriana (Ch); Cuphea lanceoiata (Cl); Cuphea palustris (Cp); Coriandrum sativum (Cs); Carthamus tinctorius (Ct); Cuphea wrightii

Garcinia mangostana (Gm); Helianthus annuus (Ha); Iris germanica (Ig); Iris tectorum (It); Myristica fragrans (Mf); Triticum aestivum (Ta); Ulmus Americana (Ua); e Umbellularia califomica (Uc). TEs exemplares são mostradas na figura 6 com números de acesso no NCBI correspondentes.

Em uma modalidade, a presente invenção contempla a produção específica de um comprimento individual do ácido graxo de cadeia média, por exemplo, predominantemente produzindo ácidos graxos C8 em uma cultura de micro-organismos fotossintéticos recombinantes. Em outra modalidade, a presente invenção contempla a produção de uma combinação de dois ou mais ácidos graxos de comprimento diferentes, por exemplo, tanto ácidos graxos C8 como C10 em uma cultura de micro-organismos fotossintéticos recombinantes.

Ilustradas abaixo estão manipulações destes genes conhecidos na técnica para construir sistemas de expressão adequados que resultam na produção de quantidades eficazes das tioesterases em organismos fotossintéticos recombinantes selecionados. Em tais construções, pode ser desejável remover a porção do gene que codifica a região de peptídeo de trânsito plastidial, já que esta região é inapropriada em procariontes. Alternativamen11 te, se a expressão é realizada em células eucarióticas, a região de codificação de peptídeo de trânsito plastidial apropriada para o organismo hospedeiro pode ser substituída. Códons preferenciais também podem ser empregados, dependendo do hospedeiro.

Outras Modificações

Além do fornecimento de um sistema de expressão para um ou mais genes acil-ACP TE apropriados, alterações adicionais no hospedeiro fotossintético podem ser feitas. Por exemplo, o hospedeiro pode ser modificado para incluir um sistema de expressão de um gene heterólogo que codifica uma β-cetoacil sintase (KAS) que preferencialmente produz acil-ACPs tendo comprimentos de cadeia médios. Tais enzimas KAS foram descritas a partir de várias plantas, incluindo várias espécies de Cuphea. Ver Dehesh,

K., et al., The Plant Journal (1998) 15:383-390, que descrevem KAS IV: a 3ketoacyl-ACP synthase from Cuphea sp. is a médium chatrrspecific condensing enzyme.; Slabaugh, M., et al., The Plant Joumal (1998) 13:611-620), e serviría para aumentar a disponibilidade de moléculas acil-ACP de comprimento próprio de reconhecimento e divagem pela acil-ACP TE para cadeia média heteróloga. Outro exemplo é que a célula hospedeira fotossintética contendo um gene acil-ACP heterólogo TE pode ser ainda modificada para incluir um sistema de expressão de um gene heterólogo que codifica uma acetil-CoA carboxilase multifuncional ou um grupo de genes heterólogos que codificam as várias subunidades de um tipo de multissubunidade de acetilCoA carboxilase. Outros genes heterólogos que codificam enzimas adicionais ou componentes da via de biossíntese de ácido graxo também podem ser introduzidos e expressos em células hospedeiras contendo acil-ACP TE.

O micro-organismo fotossintético também pode ser modificado tal que um ou mais genes que codificam enzimas da via de beta oxidação tenham sido inativados ou regulados para baixo, ou as próprias enzimas podem ser inibidas. Isto preveniría a degradação de ácidos graxos liberados de acil-ACPs, dessa forma aumentando o rendimento de ácidos graxos secretados. Em casos onde os produtos desejados são ácidos graxos de cadeia média, a inativação ou regulação para baixo de genes que codificam as en12 zimas acil-CoA sintetase e/ou acil-CoA oxidase que preferencialmente usam estes comprimentos de cadeia como substratos seriam benéficos. Mutações nos genes que codificam as enzimas acil-CoA sintetase específica para cadeia média e/ou acil-CoA oxidase específica para cadeia média tal que a atividade das enzimas seja diminuída também seriam eficazes no aumento do rendimento de ácidos graxos secretados. Uma modificação adicional inativa ou regula para baixo o gene de acil-ACP sintetase ou inativa o gene ou proteína. Mutações nos genes podem ser introduzidas por métodos recombinantes ou não recombinantes. Estas enzimas e seus genes são bem conhecidos, e podem ser visados especificamente por interrupção, deleção, geração de sequências antissenso, geração de ribozimas ou outras abordagens recombinantes conhecidas pelo profissional. A inativação dos genes também pode ser realizada por técnicas de mutação randômica, tais como UV, e as células resultantes rastreadas para mutantes conrsucesso. As^prõprias proteínas podem ser inibidas por geração intracelular de anticorpos apropriados ou geração intracelular de inibidores peptídicos.

O micro-organismo fotossintético também pode ser modificado tal que um ou mais genes que codificam o carboidrato de armazenamento ou enzimas da via de biossíntese de poli-hidroxialcanoato (PHA) tenham sido inativados ou regulados para baixo, ou as próprias enzimas podem ser inibidas. Exemplos incluem enzimas envolvidas em síntese de glicogênio, amido ou crisolaminarina, incluindo glicano sintases e enzimas ramificadoras. Outros exemplos incluem enzimas envolvidas na biossíntese de PHA, tais como sintase de acetoacetil-CoA e PHA sintase.

Sistemas de Expressão

Expressão de genes heterólogos em cianobactérias e algas eucarióticas é permitida pela introdução de vetores de expressão apropriados.

Para a transformação de cianobactérias, uma variedade de promotores que funcionam em cianobactérias pode ser utilizada, incluindo, mas não limitada aos promotores lac, tac e trc e derivados que são induzíveis pela adição de isopropil β-D-l-tiogalactopiranosídeo (IPTG), promotores que naturalmente estão associados com os genes de resistência a antibióticos originados de transposon ou cromossomo bacteriano (neomicina fosfotransferase, cloranfenicol acetiltransferase, espectinomicina adeniltransferase, etc.), os promotores associados com vários genes bacterianos heterólogos e cianobacterianos nativos, promotores de vírus e fagos, e promotores sintéticos. Promoto5 res isolados de cianobactérias que foram usados com sucesso incluem o seguinte:

secA (secreção; controlado pelo estado redox da célula) rbc (Operon de rubisco) psaAB (proteínas de centro de reação PS I; regulada por luz) psbA (proteína D1 de PSII; induzível por luz)

Do mesmo modo, uma larga variedade de terminadores transcricionais pode ser usada para a construção de vetor de expressão. Exemplos de terminadores possíveis incluem, mas não são limitados a, psbA, psaAB, rbc, secA e proteína de revestimento T7.

Vetores de expressão são introduzidos nas cepas cianobacterianas por métodos-padrão, incluindo, mas não limitados a, entrada de DNA natural, conjugação, eletroporação, bombardeio de partícula, e abrasão com contas de vidro, fibras de SiC ou outras partículas. Os vetores podem ser: 1) visados para a integração no cromossomo cianobacteriano pela inclusão de 20 sequências flanqueadoras que permitem a recombinação homóloga no cromossomo, 2) visados para a integração em plasmídeos cianobacterianos endógenos pela inclusão de sequências flanqueadoras que permitem a recombinação homóloga nos plasmídeos endógenos, ou 3) desenhados tal que os vetores de expressão repliquem dentro do hospedeiro escolhido.

Para transformação de algas verdes, uma variedade de promotores e terminadores gênicos que funcionam em algas verdes pode ser utilizada, incluindo, mas não limitada a promotores e terminadores de Chlamydomonas e outras algas, promotores e terminadores de vírus, e promotores e terminadores sintéticos.

Vetores de expressão são introduzidos nas linhagens de algas verdes por métodos-padrão, incluindo, mas não limitados a, eletroporação, bombardeio de partícula, e abrasão com contas de vidro, fibras de SiC ou outras partículas. Os vetores podem ser 1) visados para a integração sítioespecífica no cromossomo de cloroplasto de algas verdes pela inclusão de sequências flanquedoras que permitem a recombinação homóloga no cromossomo, ou 2) visado para a integração no cromossomo celular (localizado no núcleo).

Para a transformação de diatomáceas, uma variedade de promotores gênicos que funcionam em diatomáceas pode ser utilizada nestes vetores de expressão, incluindo, mas não limitada a: 1) promotores de Thalassiosira e outras algas heterokont, promotores de vírus e promotores sintéticos. Promotores de Thalassiosira pseudonana que seriam adequados para uso em vetores de expressão incluem um promotor de alfa-tubulina (SEQ ID N°:1), um promotor de beta-tubulina (SEQ ID N°:2), e um promotor de actina (SEQ ID N°:3). Promotores de Phaeodactylum tricomutum que seriam adequados para uso em vetores de expressão incluem um promotor de alfatubulina (SEQ ID N°:4), um promotor de beta-tubulina (SEQ ID N°:5) e um promotor de actina (SEQ ID N°:6). Estas sequências são deduzidas das sequências genômicas dos organismos relevantes disponíveis em bancos de dados públicos e são simplesmente exemplares da larga variedade de promotores que podem ser usados. Os terminadores associados com estes e outros genes, ou genes heterólogos particulares podem ser usados para parar a transcrição e fornecer o sinal apropriado de poliadenilação e podem ser derivados de uma maneira similar ou são conhecidos na técnica.

Vetores de expressão são introduzidos nas linhagens de diatomáceas por métodos-padrão, incluindo, mas não limitados a, eletroporação, bombardeio de partícula, e abrasão com contas de vidro, fibras de SiC ou outras partículas. Os vetores podem ser 1) visados para a integração sítioespecífica no cromossomo de cloroplasto de diatomácea pela inclusão de sequências flanqueadoras que permitem a recombinação homóloga no cromossomo, ou 2) visados para a integração no cromossomo celular (localizado no núcleo).

Organismos Hospedeiros

As células hospedeiras usadas para preparar as culturas da in15 venção incluem qualquer organismo fotossintético que é capaz de converter o carbono inorgânico em um substrato que é por sua vez convertido em derivados de ácido graxo. Estes organismos incluem procariontes bem como organismos eucarióticos, tais como algas e diatomáceas.

Organismos hospedeiros incluem algas eucarióticas e cianobactérias (algas azuis-verdes). Algas representativas incluem algas verdes (clorófitas), algas vermelhas, diatomáceas, prasinófitas, glaucófitas, cloraracniófitas, euglenófitas, cromófitas e dinoflageladas. Diversas espécies cianobacterianas são conhecidas e foram manipuladas usando técnicas de biologia 10 molecular, incluindo a cianobactéria unicelular Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus elongates PCC7942, cujos genomas foram completamente sequenciados.

Os seguintes gêneros de cianobactérias podem ser usados: um grupo inclui

Chamaesiphon Chroococcus Cyanobacteríum Cyanobium

Cyanothece

Dactylococcopsis Gloeobacter Gloeocapsa Gloeothece Microcystis

Prochlorococcus

Prochloron

Synechococcus

Synechocystis

Outro grupo inclui

Cyanocystis

Dermocarpella

Stanieria

Xenococcus

Chroococcidiopsis

Myxosarcina

Pleurocapsa

Outro grupo ainda inclui

Arthrospira

Borzia

Crínalium

Geitlerinema

Halospirulina

Leptolyngbya

Limnothríx

Lyngbya

Microcoleus Oscillatoría Planktothríx Prochlorothrix

Pseudanabaena

Spirulina

Starria

Symploca

Trichodesmium

Tychonema

Outro grupo ainda inclui

Anabaena	Cyanospira	Nostoc
Anabaenopsis	Cylindrospermopsis	Rivularía
Aphanizomenon	Cylindrospermum	Scytonema
Calothrix	Nodularia	Tolypothrix

E outro grupo inclui

Chlorogloeopsis	Geitleria	Nostochopsis
Fischerella	lyengaríella	Stigonema

Além disso, várias algas, incluindo diatomáceas e algas verdes podem ser empregadas.

Qualidades desejáveis da cepa hospedeira incluem alto potencial de taxa de crescimento e produtividade de lipídio de 25 a 50°C, tolerância à alta intensidade luminosa, crescimento em água salobra ou salina, isto é, em uma larga faixa de tipos de água, resistência à inibição de crescimento por altas concentrações de O₂, morfologia filamentosa para ajudar a coleta por redes; resistência à predação, capacidade de ser floculada (por produtos químicos ou ‘autofloculação de imediato’), características de entrada de carbono inorgânico excelentes, resistência a vírus ou cianofago, tolerância a ácidos graxos livres ou outros compostos associados com o método da invenção, e capacidade de sofrer engenharia metabólica.

Engenharia metabólica é facilitada pela capacidade de introduzir DNA por eletroporação ou conjugação, falta de um sistema de restrição e recombinação homóloga eficiente na substituição gênica de evento ou silenciamentos gênicos são necessários.

Adsorção, Remoção e Recuperação de Ácido Graxo

Os ácidos graxos secretados em meio de cultura pelos microorganismos fotossintéticos recombinantes descritos acima podem ser recuperados de uma variedade de maneiras. Um método de isolamento direto por partição usando solventes imiscíveis pode ser empregado. Em uma modalidade, adsorventes particulados podem ser empregados. Estes podem ser lipofílicos particulados ou resinas de troca iônica, dependendo do desenho do método de recuperação. Podem estar circulando em meio separado e então coletados, ou o meio pode ser passado sobre uma coluna de leito fixo, por exemplo, uma coluna cromatográfica contendo estes particulados. Os ácidos graxos são então eluídos dos adsorventes particulados pelo uso de um solvente apropriado. Evaporação do solvente, seguido pelo processamento adicional dos ácidos graxos e lipídios isolados então pode ser reali5 zada para produzir produtos químicos e combustíveis que podem ser usados para uma variedade de fins comerciais.

Os adsorventes particulados podem ter diâmetros médios variando de 0,5 mm a 30 mm que podem ser produzidos a partir de vários materiais incluindo, mas não limitados a, polietileno e derivados, poliestireno e 10 derivados, poliamida e derivados, poliéster e derivados, poliuretano e derivados, poliacrilatos e derivados, silício e derivados, e polissacarídeo e derivados. Certos materiais vítreos e cerâmicos também podem ser usados como o componente de suporte sólido dos objetos de adsorção de gordura. As superfícies dos adsorventes particulados podem ser modificadas para que 15 sejam mais capazes de ligar-se a ácidos graxos e lipídios. Um exemplo de tal modificação é a introdução de grupos alquila ligados ao éter que têm vários comprimentos de cadeia, preferencialmente 8 a 30 carbonos. Em outro exemplo, cadeias acila de vários comprimentos podem ser ligadas na superfície dos objetos de adsorção de gordura através de ligações éster, tioéster 20 ou amida.

Em uma modalidade, os adsorventes particulados são recobertos com compostos inorgânicos conhecidos pela ligação a ácidos graxos e lipídios. Exemplos de tais compostos incluem mas não são limitados a hidróxido de alumínio, grafite, antracito e sílica.

As partículas usadas também podem ser magnetizadas ou de outra maneira derivatizadas para facilitar a recuperação. Por exemplo, as partículas podem ser ligadas a um membro de um par de ligação e o adsorvido a um substrato contendo o parceiro de ligação relevante.

Os ácidos graxos podem ser eluídos dos adsorventes particula30 dos pelo uso de um solvente apropriado, tal como hexano ou etanol. Os adsorventes particulados podem ser reutilizados devolvendo-os ao meio de cultura ou usados em uma coluna regenerada. O solvente contendo os áci18 dos graxos dissolvidos então é evaporado, deixando os ácidos graxos em um estado purificado para conversão adicional a produtos químicos e combustíveis. Os adsorventes particulados podem ser desenhados para ser neutramente flutuantes ou positivamente flutuantes para aumentar a circulação no meio de cultura. Um ciclo contínuo de remoção e recuperação de ácido graxo pode ser implementado pela utilização das etapas delineadas acima. Os ácidos graxos recuperados podem ser convertidos em compostos orgânicos alternativos, usados diretamente, ou misturados com outros componentes. Métodos químicos para tais conversões são bem entendidos na técnica, e os desenvolvimentos de métodos biológicos para tais conversões também são contemplados.

A presente invenção contempla ainda uma variedade de composições compreendendo os ácidos graxos produzidos pelos micro-organismos fotossintéticos recombinantes descritos neste pedido, e usos dos mesmos. A composição pode compreender os próprios ácidos graxos, ou derivados adicionais dos ácidos graxos, tais como alcoóis, alcanos e alcenos que podem ser gerados a partir dos ácidos graxos produzidos pelos micro-organismos por quaisquer métodos que são conhecidos na técnica, bem como pelo desenvolvimento de métodos biológicos de conversão. Para exemplos, os ácidos graxos podem ser convertidos em alcenos por hidrogenação catalítica e desidratação catalítica.

A composição pode servir, por exemplo, como um bio-óleo. O bio-óleo pode ser processado por refinarias que converterão os compostos da composição em vários substitutos de petróleo e petroquímicos, incluindo alcanos, olefinas e aromáticos através de processos incluindo hidrotratamento, descarboxilação, isomerização, e quebra e reforma catalítica. O bio-óleo também pode ser convertido em combustíveis baseados em éster, tais como éster de metila de ácido graxo (comercialmente conhecido como biodiesel), através de processos químicos estabelecidos incluindo transesterificação e esterificação.

Além disso, um versado na técnica pode contemplar uma variedade de outros usos para os ácidos graxos da presente invenção, e deriva19 dos dos mesmos, que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, a produção de produtos químicos, sabões, tensoativos, detergentes, lubrificantes, nutracêuticos, farmacêuticos, cosméticos, etc. Por exemplo, os derivados dos ácidos graxos da presente invenção incluem produtos químicos C8, tais como octanol, usados na produção de ésteres para cosméticos e aromatizantes bem como para várias aplicações médicas, e octana, usada principalmente como um comonômero na produção de polietileno. Os derivados dos ácidos graxos da presente invenção também podem incluir produtos químicos C10, tais como decanol, usado na produção de plastificantes, tensoativos e solventes, e deceno, usado na produção de lubrificantes.

Bio-óleos são compostos biologicamente produzidos ou uma mistura de compostos diferentes biologicamente produzidos que são usados como uma matéria-prima para refinarias na substituição de, ou no complemento a, óleo bruto ou outras formas de petróleo. Em gerat, masTião necessariamente, estas matérias-primas foram pré-processadas através de processos biológicos, químicos, mecânicos ou térmicos a fim de estar em um estado líquido que é adequado para a introdução em uma refinaria de petróleo.

Os ácidos graxos da presente invenção podem ser um bio-óleo, e processados ainda a uma composição de biocombustível. O biocombustível então pode ter desempenho como um combustível final ou um aditivo de combustível.

Combustível final é definido como um composto químico ou uma mistura de compostos químicos (produzido através de vias químicas, termoquímicas ou biológicas) que está em um estado químico e físico adequado a ser usado diretamente como um combustível tratado ou aditivo de combustível em um motor. Em muitos casos, mas não sempre, a conveniência de um combustível final para uso em uma aplicação de motor é determinada por uma especificação que descreve as propriedades físicas e químicas necessárias que têm que ser encontradas. Alguns exemplos de motores são: motor de combustão interna, turbina a gás, turbina a vapor, motor de combustão externa e caldeira para aquecer líquidos a vapor. Alguns exem20 pios de combustíveis finais incluem: combustível diesel a ser usado em um motor de combustão interna com ignição por compressão (diesel), combustível de jato a ser usado em uma turbina de aviação, óleo de combustível a ser usado em uma caldeira para aquecer líquidos para gerar vapor ou em um motor de combustão externa, etanol a ser usado em um motor de combustível flexível. Exemplos de especificações de combustível são padrões ASTM, principalmente usado nos EUA, e padrões EN, principalmente usados na Europa.

Aditivo de combustível refere-se a um composto ou composição que é usada em combinação com outro combustível por uma variedade de razões, que incluem mas não são limitadas a obedecer as instruções para uso de biocombustíveis, reduzir o consumo de produtos derivados de combustíveis fósseis ou aumentar o desempenho de um combustível ou motor. Por exemplo, aditivos de combustível podem ser ttsados para alterar ponto de congelamento/gelificação, ponto-nuvem, lubricidade, viscosidade, estabilidade oxidativa, qualidade de ignição, nível de octano e ponto de ignição. Aditivos podem funcionar ainda como antioxidantes, demulsificantes, oxigenantes, melhoradores de estabilidade térmica, melhoradores de cetano, estabilizadores, melhoradores de fluxo frio, melhoradores de combustão, antiespuma, aditivos antineblina, inibidores de congelamento, aditivos de limpeza de injetor, supressores de fumaça, aditivos de redução de arraste, desativadores metálicos, dispersantes, detergentes, demulsificantes, corantes, marcadores, dissipadores de estática, biocidas e/ou inibidores de corrosão.

Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar mas não para limitar a invenção.

Exemplo 1 Secreção de Ácidos graxos por Cepas Derivadas de Cianobactéria Unicelular Fotoautotrófica Synechococcus elongatus PCC 7942

O gene FatB2 de Cuphea hookeriana que codifica uma enzima tioesterase acil-ACP (ChFatB2) foi modificado para expressão otimizada em Synechococcus elongatus PCC 7942. Em primeiro lugar, a porção do gene que codifica a região de peptídeo de trânsito plastidial da proteína natural ChFatB2 foi removida. O resto da região de codificação então foi códonotimizada usando o programa Gene Designer (versão 1.1.4.1) fornecida por DNA2.0, Inc. A sequência nucleotídica deste derivado do gene ChFatB2 (após ChFatB2-7942) é fornecida como SEQ ID N°:7. A sequência proteica codificada por este gene é fornecida na SEQ ID N°:8.

Duas versões diferentes do promotor trc, trc (Egon, A., et al., Gene (1983) 25:167-178) e trc potencializado (após trcE, de pTrcHis A, Invitrogen) foram usados para dirigir a expressão de ChFatB2-7942 em S. elongatus PCC 7942. O promotor trc é reprimido pela proteína repressora Lac codificada pelo gene laclq e pode ser induzido pela adição de isopropil β-D-l-tiogalactopiranosídeo (IPTG). O promotor trcE é um derivado de trc desenhado para facilitar a expressão de proteínas eucarióticas em E. coli e é também induzível por IPTG.

Os fragmentos de fusão de ChFatB2-7942 operacionalmente ligados a trc ou trcE, em conjunto com o gene laclq, foram clonados no vetor de transporte pAM2314 (Mackey, S. R., et al., Methods Mol. Biol. (2007) 362:115-129), que permite a transformação de S. elongatus PCC 7942 através da integração mediada por recombinação homóloga dupla no sítio NS1 do cromossomo. O plasmídeo construído contendo o cassete de expressão trcE::ChFatB2-7942 e gene laclq é designado pSGI-YCO1. SEQ ID N°:9 representa a sequência entre e incluindo os sítios de recombinação NS1 de pSGI-YCO1. O plasmídeo construído contendo o cassete de expressão trc::ChFatB2-7942 e gene laclq é indicado pSGI-YC09. SEQ ID N°: 10 representa a sequência entre e incluindo os sítios de recombinação NS1 de pSGIYC09.

Cada um dos plasmídeos pSGI-YCO1 e pSGI-YC09, junto com o vetor controle pAM2314, foi introduzido em células de S. elongatus PCC 7942 de tipo selvagem como descrito por Golden and Sherman (J. Bacteríol. (1984) 158:36-42). Tanto cepas recombinantes como de controle foram précultivadas em 100 mL de meio BG-11 fornecido com espectinomicina (5 mg/L) à fase log tardia (DO₇30nm = 1,0) em um agitador rotatório (150 rpm) a

30°C com iluminação constante (60 μΕ m’²s’¹). As culturas então foram subcultivadas em DO₇30nm inicial = 0,4 a 0,5 em BG-11 e cultivadas durante a noite a DO₇30nm = 0,7 a 0,9. Para o estudo de curso de tempo, alíquotas de 60 mL da cultura foram transferidas em frascos de 250 mL e induzidas pela adição de IPTG (conc. final = 1 mM) se aplicável. As culturas foram amostradas 0, 48, 96, e 168 horas após indução com IPTG e então filtradas através de filtros Whatman® GF/F usando filtro coletor a vácuo Millipore. Os filtrados foram coletados em tubos de cultura com tampa de rosca para análise por cromatografia gasosa (GC).

Ácidos graxos livres (FFAs) foram separados de culturas celulares filtradas usando extração líquido-líquido. Cinco mL do filtrado foram misturados com 125 pL de H3PO3 1 M e 0,25 mL de NaCI 5 M, seguido pela adição de 2 mL de hexano e mistura completa. Para análise por GC-FID, uma amostra de O,2 μΙ de hexano foi injetada usando uma proporção de divisão 40:1 em uma coluna DB-FFAP (J&W Scientific, 15 m x 250 pm x 0,25 pm), com um perfil de temperatura começando em 150°C por 0,5 min, então aquecendo a 15°C/min a 230°C e mantidas por 7,1 minutos (1,1 mL/min He).

Resultados de análise por GC indicando os níveis de FFAs de cadeia média (8:0 e 10:0) em culturas contendo várias cepas de Synechococcus elongatus 168 horas após indução por IPTG são mostrados na Tabela 1-1.

Tabela 1-1

Secreção de ácido graxo de cadeia média em várias cepas de S. elongatus

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado Transgenes	Ácidos Graxos (mg/L)
8:0	10:0
SGC-YC2-5	PCC 7942	PAM2314	nenhum	ND	ND
SGC-YC1-2	PCC 7942	pSGI-YCOl	trcE::ChFatB2-	1,5	3,5
SGC-YC14-4	PCC 7942	PSGI-YC09	trc::ChFatB2-7942	5,1	10,1

Observação: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Exemplo 2

Secreção de Ácidos graxos por Cepas Derivadas de Cianobactéria Unicelular Foto-heterotrófica Svnechocystis sp. PCC 6803

Os fragmentos de fusão trcE::ChFatB2-7942 e trc::ChFatB223

7942, em conjunto com o gene laclq, foram clonados no vetor de transporte pSGI-YC03 (SEQ ID N°: 11), que permite a transformação de Synechocystis sp. PCC 6803 através da integração mediada por recombinação homóloga dupla no sítio RSI do cromossomo (Williams, Methods Enzymol. (1988) 167:766-778). O plasmídeo construído contendo o cassete de expressão trcE::ChFatB2-7942 e gene laclq é designado pSGTYC08. SEQ ID N°: 12 representa a sequência entre e incluindo os sítios de recombinação RSI de pSGI-YC08. O plasmídeo construído contendo o cassete de expressão trc::ChFatB2-7942 e gene laclq é designado pSGI-YC14. SEQ ID N°: 13 representa a sequência entre e incluindo os sítios de recombinação RSI de pSGI-YC14.

Cada um dos plasmídeos pSGI-YC08, pSGI-YC14, e vetor controle pSGI-YC03, foi introduzido em células Synechocystis PCC 6803 de tipo selvagem, como descrito por Zang, X. etal.y J Microbiol. (2007) 45.244-245. Tanto cepas recombinantes como controle foram pré-cultivadas em 100 mL de meio BG-11 suprido com canamicina (10 mg/L) à fase log tardia (D0₇3o_nm = 1,0) em um agitador rotatório (150 rpm) a 30°C com iluminação constante (60 pE rri² s¹). As culturas então foram subcultivadas em DOzsonm inicial = 0,4 a 0,5 em BG-11 e cultivadas durante a noite a D07₃o_nm = 0,7 a 0,9 . Para estudos de curso de tempo, alíquotas de 60 mL da cultura foram transferidas para frascos de 250 mL e induzidas pela adição de IPTG (conc. final = 1 mM) quando aplicável. As culturas foram amostradas 0, 72, e 144 horas após indução com IPTG e então filtradas através de filtros Whatman® GF/B usando filtro coletor a vácuo Millipore. Os filtrados foram coletados em tubos de cultura com tampa de rosca para análise por cromatografia gasosa (GC). Os ácidos graxos livres (FFA) foram separados das soluções de sobrenadante de cultura filtrados por extração líquido-líquido. Para cada amostra, 2 mL de cultura filtrada foram extraídos com uma mistura de 50 pl de ácido fosfórico (1 M), 100 μΙ de NaCI (5 M) e 2 mL de hexano. Uma amostra de 0,2 μΙ foi injetada usando uma proporção de divisão 40:1 em uma coluna DBFFAP (J&W Scientific, 15 m x 250 pm x 0,25 pm), com um perfil de temperatura começando em 150°C por 0,5 minutos, então aquecendo a 15°C/min a

230°C e mantidas por 7,1 minutos (1,1 mL/min He).

Os resultados de análise por GC indicando os níveis de FFAs de cadeia média (8:0 e 10:0) em culturas 144 horas após indução por IPTG são mostrados na Tabela 2-1.

Tabela 2-1

Secreção de ácido graxo de cadeia média em várias cepas de Synechocystis.

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Transgenes	Ácidos Graxos (mg/L)
				8:0	10:0
SGC-YC9-8	PCC 6803	PSGI-YC03	nenhum	ND	ND
SGC-YC10-5	PCC 6803	pSGI-YC08	trcE::ChFatB2-7942	61,3	52,7
SGC-YC16-2	PCC 6803	pSGI-YC14	trc::ChFatB2-7942	2,7	5,8

Observação: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Exemplo 3

Secreção de Ácidos graxos por Cepas Derivadas de Cianobactéria Filamentosa Anabaena variabilis ATCC 29413

Os fragmentos de fusão trc::ChFatB2-7942 e trcE::ChFatB27942, em conjunto com o gene laclq, foram amplificados por PCR usando iniciadores RS3-3F (SEQ ID N°: 14) e 4YC-rrnBter-3 (SEQ ID N°:15) de pSGI-YC14 e pSGI-YC08, respectivamente, e então clonados no vetor de transporte pEL17, que permite a transformação de A. variabilis ATCC 29413 através da integração mediada por recombinação homóloga dupla no locus nifU1 do cromossomo (Lyons and Thiel, J. Bacteriol. (1995) 177:1570-1575). Os plasmídeos construídos são designados pSGI-YC69 e pSGI-YC70 para trc::ChFatB2-7942 etrcE::ChFatB2-7942, respectivamente.

Cada um dos plasmídeos pSGI-YC69, pSGI-YC70, junto com o vetor controle pEL17, são introduzidos em células de A. variabilis ATCC

29413 de tipo selvagem através de conjugação triparental, como descrito por

Elhai and Wolk (Methods Enzymol. (1988) 167:747-754). Tanto cepas recombinantes como controle são pré-cultivadas em 100 mL de meio BG-11 suprido com NH₄CI 5 mM e espectinomicina (3 mg/L) à fase log tardia (DO₇30nm = 1,0) em um agitador rotatório (150 rpm) a 30°C com iluminação constante (60 μΕ rri² s'¹). As culturas então são subcultivadas em DO₇30nni inicial = 0,4 a 0,5 em BG-11 e cultivadas durante a noite a D07₃ a 0,9 . Para estudos de curso de tempo, alíquotas de 60 mL da cultura são transferidas para frascos de 250 mL e induzidas pela adição de IPTG (conc. final = 1 mM) se aplicável. As culturas são amostradas a cada 12. horas e então filtradas através de filtros Whatman® GF/F usando filtro coletor a vácuo Millipore. Filtrados são coletados em tubos de cultura com tampa de rosca para análise por cromatografia gasosa (GC) como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 4 Secreção de Ácidos graxos em Cepas Derivadas de Synechococcus elonaatus PCC 7942 Contendo um Gene de Acil-ACP Sintetase Inativado

Um gene de acil-ACP sintetase putativo em S. elongatus PCC 7942, synpcc7942_0918 (designação do gene em Cyanobase), foi interrompido através da substituição de uma porção de 422 bp interna da sua região de codificação com uma sequência de DNA de 1.741 bp que transporta o gene marcador de resistência a cloranfenicol, cat (que codifica çloranfenicol acetiltransferase). Pares de iniciadores 918-15 (SEQ ID N°:16) / 918-13 (SEQ ID N°:17) e 918-25 (SEQ ID N°:18) / 918-23 (SEQ ID N°:19) foram usados para amplificar dois fragmentos de DNA correspondentes a uma porção 5’ (1 a 480 bp) e uma porção 3’ (903 a 1521 bp) da região de codificação de synpcc7942_0918, respectivamente. O fragmento cat foi amplificado a partir do plasmídeo pAM1573 (Mackey et al., Methods Mol. Biol. 362:115-29) usando PCR com iniciadores NS21-3Cm (SEQ ID N°:20) e ter-3Cm (SEQ ID N°:21), que sobrepõem iniciadores 918-13 e 918-25, respectivamente. A técnica de PCR quimérica recombinante então foi usada para amplificar o cassete de interrupção completa com os três fragmentos de PCR supracitados, bem como iniciadores 918-15 e 918-23. O fragmento de PCR de extremidade cega de 2.840 bp resultante (SEQ ID N°:22) foi então ligado em pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-119), que foi digerido tanto com Hind\\\ como com EcoRI para remover os múltiplos sítios de clonagem e posteriormente cego com DNA T4 polimerase, para produzir o plasmídeo pSGI26

YC04.

O plasmídeo pSGI-YC04 foi introduzido em cepas de S. elongatus SGC-YC1-2, que carrega uma cópia de trcE::ChFatB2-7942 integrada em NS1 (ver Exemplo 1). A cepa resultante foi designada SGC-YC4-7. Ensaios de produção de ácido graxo e análises por GC foram realizados como descrito no Exemplo 1. Os resultados de análise por GC indicando os níveis de FFAs em culturas de várias cepas de S. elongatus 168 horas após a indução de IPTG são mostrados na Tabela 4-1. É possível que a inativação do gene de acil-ACP sintetase tenha um maior impacto na secreção de ácidos graxos de cadeia longa do que na secreção de ácidos graxos de cadeia média.

Tabela 4-1

Secreção de ácido graxo de cadeia média em várias cepas de S. elongatus.

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Transgenes	Deleções	Ácidos Graxos (mg/L)
8:0	10:0	16:0	16:1
SGCYC2-5	PCC794 2	pAM231 4	nenhum	nenhum	ND	ND	ND	1,4
ISGC- YC1-2	PCC794 2	pSGIYC01	trcE::ChFatB27942	nenhum	1,4	4,2	ND	1,6
ISGCYC4-7	SGCYC1-2	pSGYYC04	trcE::ChFatB27942	synpcc7942_0918	1	3,1	1,1	3,9

Observação: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Exemplo 5 Secreção de Ácidos Graxos em Cepas Derivadas de Synechocystis sp. PCC6803 Contendo um Gene de Acil-ACP Sintetase Inativado

Um fragmento de DNA de ~1,7 kbp que estendendo-se a uma área a montante e na região de codificação do gene acil-ACP que codifica a sintetase, slrl609 (designação do gene na Cyanobase), de Synechocystis sp. PCC 6803 foi amplificado a partir de DNA genômico usando PCR com iniciadores NB001 (SEQ ID N°:23) e NB002 (SEQ ID N°:24). Este fragmento foi clonado no vetor pCR2.1 (Invitrogen) para produzir o plasmídeo pSGI-NB3 e posteriormente cortado com a enzima de restrição Mfe1. Um cassete marcador de resistência a cloranfenicol contendo o gene cat e sequências controle regulatórias associadas foi amplificado a partir do plasmídeo pAM1573 (Andersson, et al., Methods Enzymol. (2000) 305:527-542) para conter sítios de restrição flanqueando Mfe1 usando PCR com iniciadores NB010 (SEQ ID N°:25) e NB011 (SEQ ID N°:26). O cassete de expressão de gene cat então foi inserido no sítio Mfe1 de pSGI-NB3 para produzir pSGI-NB5 (SEQ ID N°:27).

O vetor pSGI-NB5 foi transformado na cepa de Synechocystis SGC-YC10-5 contendo trcE::ChFatB2-7942 (ver Exemplo 1) de acordo com Zang et al., J. Microbiology (2007) 45:241-245. A inserção do marcador de resistência a cloranfenicol no gene Slrl609 através da recombinação homóloga foi verificada por rastreamento por PCR do inserto e sítio de inserção. A cepa resultante foi designada SGC-NB10-4, que foi testada no meio BG-11 líquido para secreção de ácido graxo. Todas as condições de crescimento de_meios líquidos usaram um agitador rotatório (150 rpm) a 30°C com iluminação constante (60 μΕ m’² s'¹). As culturas foram inoculadas em 25 mL de meio BG-11 contendo cloranfenicol e/ou canamicina (5 pg/mL) apropriadamente e cultivadas para uma densidade suficiente (D0₇₃onm mínimo = 1,6 a 2). As culturas então foram usadas para inocular 100 mL de meio BG-11 em frascos de policarbonato de 250 mL a DO_730nm = 0,4 a 0,5 e incubadas durante a noite. 45 mL da cultura noturna em D0₇₃o_nm = 0,7 a 0,9 foram adicionados a novos frascos de 250 mL, induzindo com IPTG 1 mM ou usando como controles não induzidos. Amostras de 5 mL foram tomadas em 0, 72 e 144 horas pós-indução e processadas como descrito no Exemplo 2.

Ácidos graxos livres (FFA) foram separados das soluções de sobrenadante de cultura filtradas pela extração líquido-líquido para análise por GC/FID (detector de ionização de chama). Para cada amostra, 2 mL de cultura filtrada foram extraídos com uma mistura de 50 μΙ de ácido fosfórico (1 M), 100 μΙ de NaCI (5 M) e 2 mL de hexano. Uma amostra de 0,2 μΙ foi injetada usando uma proporção de divisão 40:1 em uma coluna DB-FFAP (J&W Scientific, 15 m x 250 um x 0,25 pm), com um perfil de temperatura começando em 150°C por 0,5 min, então aquecendo a 15°C/min a 230°C e mantida por 7,1 min (1,1 mL/min He).

Os resultados de GC indicando os níveis secretados de ácidos graxos livres após 144 horas são mostrados na Tabela 5-1.

Tabela 5.1

Secreção de ácido graxo de cadeia média em várias cepas de Synechocys5 tis.

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Transqenes	Deleções	Ácidos Graxos (mq/L)
8:0	10:0
SGC-YC10-5	PCC 6803	pSGI-YC08	trcE::ChFatB2-7942	nenhuma	58,3	67,7
SGC-NB10-4	SGC-YC10-5	pSGI-NB5	trcE::ChFatB2-7942	slr1609	57,7	73,7

Observação: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Exemplo 6

Expressão de genes de Cuphea lanceolata Kas-IV e Helianthus annuus KasIII em Synechocystis sp.

Um fragmento de DNA compreendendo um operon funcional foi sintetizado tal que contivesse os seguintes elementos na dada ordem: o promotor trc, o gene de proteína-veículo sintase IV 3-cetoacil-acila de Cuphea lanceolata (CIKas-IV, Acesso no GenBank No. CAC59946) códonotimizado para expressão em Synechococcus elongatus PCC 7942, e o ter15 minador rpsl4 (SEQ ID N°:28) de Synechococcus sp. WH8102. A sequência nucleotídica deste operon funcional inteiro, junto com vários flanqueadores de sítios de reconhecimento de enzima de restrição, é fornecida na SEQ ID N°:29.

Outro fragmento de DNA compreendendo um operon funcional foi sintetizado tal que contivesse os seguintes elementos na dada ordem: o promotor trc, o gene de proteína-veículo III sintase 3-cetoacil-acila de Helianthus annuus (HaKas-lll, Acesso no GenBank No. ABP93352) códonotimizado para expressão tanto em Synechococcus elongatus PCC 7942 como em Synechocystis sp. PCC 6803, e o terminador rpsl4 de Synecho25 coccus sp. WH8102. A sequência nucleotídica deste operon funcional, junto com vários flanquedores de sítios de reconhecimento de enzima de restrição, é fornecida na SEQ ID N°:30.

A otimização de códon foi realizada pelo uso do programa Gene

Designer (versão 1.1.4.1) fornecido por DNA 2.0, Inc. O operon funcional (cassete de expressão) contendo o gene C1Kas-IV códon-modificado como representado na SEQ ID N°:29 foi digerido pelas enzimas de restrição Spel e Xbal e inserido no plasmídeo pSGI-YC39 entre os sítios de restrição Spel e 5 Xbal para formar o plasmídeo pSGI-BL26, que permite a integração do operon funcional no cromossomo de Synechocystis sp. PCC 6803 no sítio de recombinação RS2 (Aoki, et al., J. Bacteríol (1995) 177:5606-5611). O plasmídeo pSGI-BL27 contendo o fragmento de DNA representado na SEQ ID N°:30 foi construído de mesmo modo.

O plasmídeo pSGI-BL43 contém o promotor trcE, o gene C1 KasIV otimizado por códon, e o terminador rpsl4 como representado na SEQ ID N°:31 e foi feito pela inserção de um fragmento trcE Spel/Ncol de pTrcHis (Invitrogen) em pSGT digerido por BL26Spel/Ncol. Um plasmídeo adicional, pSGTBL44, contém α promotor trcE, o gene C1 Kas-IV otimizado, a legião intergênica de S. elongatus PCC 7942 kaiBC, o gene HaKas-lll otimizado, e o terminador rpsl4 como representado na SEQ ID N°:32 e foi feito pela inserção de um fragmento BamHI/SacI (contendo a região intergênica de S. elongatus kaiBC, o gene HaKas-lll e o terminador rpsl4) gerado através da amplificação por PCR em pSGI-BL43 digerido por Bglll/Sacl. Os iniciadores de 20 PCR usados para gerar o fragmento de DNA contendo a região kaiBC, HaKas-lll e terminador rpsl4 são fornecidos como SEQ ID N°:33 e SEQ ID N°:34.

Células de Synechocystis PCC 6803 de tipo selvagem e cepas de Synechocystis SGC-YC10-5 transgênicas, que contêm o gene ChFatB225 7942, foram transformados com plasmídeos pSGI-BL26, pSGI-BL27, pSGIBL43 e pSGI-BL44 como descrito por Zang, X. et al., J. Microbiol. (2007)

45:241-245. Tanto as linhagens de controle recombinantes como de tipo selvagem foram pré-cultivadas em 20 mL do meio BG-11 na fase log média (DO₇30nm = 0,7 a 0,9 ) em um agitador rotatório (150 rpm) a 30°C com ilumi30 nação constante (60 μΕ m'²s'¹). Canamicina (5 pg/mL) e/ou espectinomicina (10 pg/mL) foram incluídas em culturas recombinantes como apropriado. As culturas então foram subcultivadas em DO73_0nm inicial = 0,4 a 0,5 em BG-11 e cultivadas durante a noite a DO₇3_0nm = 0,7 a 0,9 . Para um estudo de curso de tempo, alíquotas de 45 mL da cultura foram transferidas para frascos de 250 mL e induzidas pela adição de IPTG (conc. final = 1 mM) quando aplicável. As culturas foram amostradas 0, 72, e 144 horas após indução por IPTG e então filtradas através de filtros Whatman® GF/B usando filtro coletor a vácuo Millipore. Filtrados foram coletados em tubos de cultura com tampa de rosca para análise por cromatografia gasosa (GC) como descrito no Exemplo 2.

Resultados indicando os níveis de ácido octanoico e ácido deca10 noico secretados nos sobrenadantes de cultura 144 horas após inoculação de cultura são mostrados na Tabela 6-1. Os genes C1Kas-IV e HaKas-lll presentes nas cepas indicadas estavam sob o controle do promotor trc. Tabela 6-1

Secreção de ácido graxo de cadeia média em (em mg/L) várias cepas de 15 Synechocystis sp.

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Transqenes	Ácidos Graxos (m.q/L)
8:0	10:0
PCC 6803	n/a	n/a	Nenhum	ND	ND
SGC-YC10-5	PCC 6803	pSGI-YC08	trcE-ChFatB2-7942	69,8	68,4
SGC-BL26-3	PCC 6803	pSGI-BL26	trc-CIKas-IV	ND	ND
SGC-BL26-5	SGC-YC10-5	pSGI-BL26	trcE-ChfatB2-7942 trc-CIKasIV	69,5	71,9
SGC-BL27-1	PCC 6803	pSGl-BL27	trc-HaKas-lll	ND	ND
SGC-BL27-2	SGC-YC10-5	pSGI-BL27	trcE-ChFatB2-7942 trc- HaKas-lll	65,7	66,6

Observação: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Para uma medida mais otimizada da secreção de ácido graxo nestas cepas, os dados de secreção de ácido graxo mostrados na Tabela 61 foram normalizados pela densidade de cultura celular, medida como den20 sidade ótica em 730 nm (D073o_nm); estes dados são apresentados na Tabela

6-2. Outros experimentos descritos neste pedido de patente podem ser normalizados de uma maneira similar.

Tabela 6-2

Secreção de ácido graxo de cadeia média normalizada (mg/L/DO7₃0nm) em várias cepas de Synechocystis sp.

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Transqenes	Ácidos Graxos
8:0	10:0
PCC 6803	n/a	n/a	Nenhum	ND	ND
SGC-YC10-5	PCC 6803	PSGI-YC08	trcE-ChFatB2-7942	11,7	11,4
SGC-BL26-3	PCC 6803	pSGI-BL26	trc-CIKas-IV	ND	ND
SGC-BL26-5	SGC-YC10-5	pSGI-BL26	trcE-ChfatB2-7942 trc-CIKas-IV	11,7	12,1
SGC-BL27-1	PCC 6803	pSGI-BL27	trc-HaKas-lll	ND	ND
SGC-BL27-2	SGC-YC10-5	pSGI-BL27	trcE-ChFatB2-7942 trc-HaKaslll	12,2	12,3

Observação: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Resultados indicando os níveis de ácido octanoico e ácido decanoico secretados nos sobrenadantes de cultura de cepas adicionais 120 horas após inoculação de cultura são mostrados na Tabela 6-3. Os genes C1Kas-IV e HaKas-lll presentes nas cepas indicadas estavam sob o controle do promotor trcE.

Tabela 6-3

Secreção de ácido graxo de cadeia média (em mg/L) em várias cepas de Synechocystis sp.

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Transgenes	Ácidos Graxos (mg/L)
8:0	10:0
SGC-YC10-5	PCC 6803	PSGI-YC08	trcE-ChFatB2-7942	34,8	43,5
SGC-BL44	PCC 6803	PSGI-BL44	trcE-CIKAS-IV+HaKAS-lll	ND	ND
SGC-YC10-5BL43	SGC-YC10-5	PSGI-BL43	trcE-ChFatB2-7942 trcECIKas-IV	40,0	48,1
SGC- YC10-5BL44	SGC-YC10-5	PSGI-BL44	trcE-ChfatB2-7942 trcECIKAS-IV+HaKAS-lll	38,5	47,1

Observe: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Para uma medida mais otimizada da secreção de ácido graxo nestas cepas, os dados de secreção de ácido graxo mostrados na Tabela 61 foram normalizados pela densidade da cultura celular, medida como den32 sidade ótica em 730 nm (DO730nm); estes dados são apresentados na Tabela

6-4.

Tabela 6-4 Secreção de ácido graxo de cadeia média normalizada (mg/L/DOysonm) em várias cepas de Synechocystis sp.

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Transgenes	Ácidos Graxos
8:0	10:0
SGC-YC10-5	PCC 6803	PSGI-YC08	trcE-ChFatB2-7942	6,8	8,5
SGC-BL44	PCC 6803	pSGI-BL44	trcE-CIKAS-IV+HaKAS-lll	ND	ND
SGC-YC10-5BL43	SGC-YC10-5	pSGI-BL43	trcE-ChFatB2-7942 trcECIKas-IV	7,4	8,9
SGC-YC105-BL44	SGC-YC10-5	pSGI-BL44	trcE-ChfatB2-7942 trcECIKAS-IV+HaKAS-lll	8,3	10,2

Exemplo 7

Introdução de um Gene de Acil-ACP Tioesterase Heterólogo em uma Diatomácea

Um gene sintético que codifica um derivado da enzima ChFatB2 com especificidade para acil-ACPs de cadeia média (8:0-10:0) é expresso 10 em várias diatomáceas (Bacillaríophyceae) pela construção e utilização de vetores de expressão compreendendo o gene ChFatB2 operacionalmente ligado a regiões reguladoras do gene (promotores e terminadores) que funcionam em diatomáceas. Em uma modalidade preferencial, o gene é otimizado para a expressão em espécies diatomáceas específicas e a porção do 15 gene que codifica a região de peptídeo de trânsito plastidial da proteína natural ChFatB2 é substituído com um peptídeo de trânsito plastidial que funciona otimamente em diatomáceas. A sequência nucleotídica fornecida como SEQ ID N°:35 representa um derivado sintético do gene de ChFatB2 que foi otimizado para a expressão em Thalassiosira pseudonana e em que a 20 região que codifica peptídeo de trânsito plastidial nativo do gene foi substituída com o peptídeo de trânsito plastidial (incluindo a sequência sinal ligada) associado com a subunidade gama da porção do fator de acoplamento (CF1) do cloroplasto ATP sintase da T. pseudonana (Identificador JGI = jgi/Thaps3/40156/est Ext_gwp_gwl.C_chr_40019). A proteína codificada por 25 este gene, referida a seguir como ChFatB2-Thal,) é fornecido na SEQ ID

Ν^Ο:36.

Para produzir um vetor de expressão para T. pseudonana, o gene ChFatB2-Thal foi colocado entre as sequências regulatórias promotoras e terminadoras de alfa-tubulina de T. pseudonana. O promotor de alfa-tubulina 5 foi amplificado a partir de DNA genômico isolado de T. pseudonana CCMP 1335 pelo uso de iniciadores PR1 (SEQ ID N°:37) e PR3 (SEQ ID N°:38), ao passo que terminador de alfa-tubulina foi amplificada pelo uso de iniciadores PR4 (SEQ ID N°:39) e PR8 (SEQ ID N°:40). O fragmento Kpnl/BamHI do amplicon do promotor de alfa-tubulina, o fragmento BamHI/Xbal de termina10 dor de alfa-tubulina e o grande fragmento de pUC118 cortado por Kpnl/Xbal (Vieira and Messing, Meth. Enzymol. (1987) 153:3-11) então foram combinados para formar pSGI-PR5. O fragmento Ncol/BamHI do gene ChFatB2-Thal então foi inserido no pSGTPR5 digerido por Ncol/BamHI para formar pSGT PR16. Além disso, um gene códon-otimizado que codifica a enzima nourseo15 tricina acetiltransferase (NAT) de Streptomyces noursei (SEQ ID N°:41) (Krugel, et al., Gene (1993) 127:127-131) foi sintetizado e o fragmento Ncol/BamHI desta molécula de DNA que codifica NAT foi inserido no grande fragmento Ncol/BamHI de pSGTPRõ para formar pSGTPR7, que na introdução em T. pseudonana e outras diatomáceas pode fornecer resistência ao 20 antibiótico nourseotricina.

pSGI-PR16 e pSGI-PR7 foram cotransformados em T. pseudonana CCMP 1335 por meio de bombardeio de partícula essencialmente como descrito por Poulsen, et al., (J. Phycol. (2006) 42:1059-1065). Células transformadas foram selecionadas em placas de ágar na presença de nour25 seotricina 100 mg/L (ClonNAT, obtido de Werner BioAgents, Alemanha). A presença do gene ChFatB2-Thal nas células foi confirmada pelo uso de PCR. Os transformantes foram cultivados em meio líquido ASW (Darley and Volcani, Exp. Cell Res. (1964) 58:334) em um agitador rotatório (150 rpm) a 18°C com iluminação constante (60 μΕ rri² s'¹). As amostras foram removi30 das sete dias após inoculação e meio de cultura foi testado para a presença de FFAs como descrito no Exemplo 1.

Embora nenhuma secreção de ácido graxo fosse detectada sob estas condições experimentais particulares, a otimização do gene ChFatB2Thal e cepa diatomácea hospedeira pode ser realizada para alcançar a secreção de ácido graxo em diatomáceas, que são conhecidas por ter paredes celulares relativamente impenetráveis.

Exemplo 8

Secreção de Ácidos graxos por Algas Verdes

Um gene sintético que codifica um derivado da enzima ChFatB2 com especificidade para acil-ACPs de cadeia média (8:0-10:0) é expresso em algas verdes (Chlorophyceae) pela construção e utilização de vetores de 10 expressão compreendendo o gene ChFatB2 operacionalmente ligado a regiões regulatórias do gene (promotores e terminadores) que funciona em algas verdes. O gene é otimizado para expressão em espécies de algas verdes específicas e a porção do gene que codifica a região de peptídeo de trânsito jjlastidial da proteína ChFatB2 natural é substituída com um peptí15 deo de trânsito plastidial que funciona otimamente em algas verdes. A sequência nucleotídica fornecida como SEQ ID N°:42 representa um derivativo do gene ChFatB2 otimizado para a expressão em Chlamydomonas reinhardtii e em que a região que codifica peptídeo de trânsito plastidial nativo do gene foi substituída com o peptídeo de trânsito plastidial associado com a 20 subunidade gama da porção de fator de acoplamento (CF1) de cloroplasto ATP sintase de C. reinhardtii (Acesso no GenPept No. XP 001696335). A proteína codificada por este gene é fornecida na SEQ ID N°:43.

Exemplo 9

Secreção de Ácidos graxos em Cepas de Synechocystis sp. Contendo um 25 Gene de Enzima Ramificadora 1,4-alfa-Glicano Interrompido

Um fragmento de DNA de 1,4 kbp estendendo-se a uma área a montante e na região de codificação do gene da enzima ramificadora 1,4alfa-glicano (glgB, designação do gene na Cyanobase = s110158) de Synechocystis sp. PCC6803 foi amplificado a partir de DNA genômico usando

PCR com iniciadores glgB-5 (SEQ ID N°:44) e glgB-3 (SEQ ID N°:45). Este fragmento foi clonado no vetor pCR4-Topo (Invitrogen) para produzir o plasmídeo pSGI-BL32 e posteriormente cortado com a enzima de restrição Aval.

Um cassete marcador de resistência à espectinomicina contendo o gene aadA e sequências controle regulatórias associadas foi digerida por HindIII a partir do plasmídeo pSGI-BL27. Ambos os fragmentos lineares foram tratados com o Conjunto Quick Blunting® (New England Biolabs). O cassete de 5 expressão gênica aadA então foi inserido no sítio de Aval de pSGI-BL32 para produzir pSGI-BL33. A porção de pSGI-BL33 que se insere e inativa o gene glgB é fornecida como SEQ ID N°:46).

O vetor pSGI-BL33 foi transformado em Synechocystis de tipo selvagem PCC 6803 e na cepa de Synechocystis SGC-YC10-5 contendo 10 trcE::ChFatB2-7942 (ver Exemplo 1) de acordo com Zang, et al., J. Microbiology (2007) 45:241-245. Inserção do marcador de resistência à espectinomicina no gene S110158 (glgB) através da recombinação homóloga foi verificada pelo rastreamento por PCR no inserto e sítio de inserção. Cepas de silenciamento verificadas foram testadas em meio BG-14 líquido para secre15 ção de ácidos graxos. Todas as condições de crescimento de meio líquido usaram um agitador rotatório (150 rpm) a 30°C com iluminação constante (60 μΕ m'² s'¹). As culturas foram inoculadas em 25 mL de meio BG-11 contendo espectinomicina (10 pg/mL) e/ou canamicina (5 pg/mL) apropriadamente e cultivadas a uma densidade suficiente (D0₇3o_nm mínimo = 1,6 a 2).

As culturas então foram usadas para inocular 100 mL de Meio BG-11 em frascos de policarbonato de 250 mL a D0₇3o_nm = 0,4 a 0,5 e incubadas durante a noite. Quarenta e cinco mL da cultura noturna em DO₇₃0nm = 0,5 foram adicionados a novos frascos de 250 mL; algumas culturas foram induzidas com IPTG 1 mM ou usadas como controles não induzidos. As amostras 25 (0,5 mL) foram tomadas em 0, 72, 144, e 216 horas pós-indução e processadas como descrito no Exemplo 2.

Ácidos graxos livres (FFA) foram separados das soluções de sobrenadante de cultura filtradas por extração líquido-líquido para análise por GC/FID. Para cada amostra, 2 mL de cultura filtrada foram extraídos com uma mistura de 50 pL de ácido fosfórico (1 M), 100 pL de NaCl (5 M) e 2 mL de hexano. Uma amostra de 0,2 pl foi injetada usando uma proporção de divisão 40:1 em uma coluna DB-FFAP (J&W Scientific, 15 m x 250 pm x 0,25 pm), com um perfil de temperatura começando em 150°C por 0,5 min, então aquecendo a 15°C/min a 230°C e mantida por 7,1 min (1,1 mL/min He).

Os resultados de GC que indicam os níveis secretados dos ácidos graxos livres após 216 horas são mostrados na Tabela 9-1.

Tabela 9-1

Secreção de Ácido Graxo de cadeia média (em mg/L) em Várias Cepas de Synechocystis sp.

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Deleçâo	Transgenes	Ácidos Graxos
8:0	10:0
PCC 6803	n/a	n/a	Nenhum	Nenhum	ND	ND
SGC-BL33-1	PCC 6803	pSGI-BL33	S110158 (glgB)	Nenhum	ND	ND
SGC-YC10-5	PCC 6803	pSGI-YC08	Nenhum	trcE-ChFatB2- 7942	70,0	68,7
SGC-BL33-2	SGC-YC10-5	pSGI-BL33	S110158 (glgB)	trcE-ChFatB2-	66,2	68,1
- - - - - -	- - - - - --	. - - - - -		7942

Observe: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Para uma medida mais otimizada da secreção de ácido graxo nestas cepas, os dados de secreção de ácido graxo mostrados na Tabela 91 foram normalizados à densidade de cultura celular, medida como densidade ótica em 730 nm (DO₇30nm); estes dados são apresentados na Tabela 9-2. Outros experimentos descritos neste pedido de patente podem ser normalizados de uma maneira similar.

Tabela 9-2

Secreção de Ácido graxo de cadeia média normalizada (rng/L/DO₇30nm) em Várias Cepas de Synechocystis

Cepa	Cepa Parental	Plasmídeo Adicionado	Deleção	Transgenes	Ácidos Graxos
8:0	10:0
PCC 6803	n/a	n/a	Nenhum	Nenhum	ND	ND
SGC-BL33-1	PCC 6803	pSGI-BL33	S110158 (glgB)	Nenhum	ND	ND
SGC-YC10-5	PCC 6803	pSGI-YC08	Nenhum	trcE-ChFatB27942	9,8	9,7
SGC-BL33-2	SGC-YC10-5	pSGI-BL33	S110158 (glgB)	trcE-ChFatB27942	10,4	10,7

Observe: ND representa não detectado (<1 mg/L).

Exemplo 10

Captura de Ácidos graxos Livres de Soluções Modelo com Resinas de Adsorção Hidrofóbicas

Uma solução de pico foi formulada pela dissolução de ácido octanoico 75 mg/L e ácido decanoico 75 mg/L em meio BG-11 suplementado com NaCI 300 mM e ajustando o pH a 5,8. 50 mg de cada uma das resinas listadas na Tabela 1 foram pesados em um tubo de centrífuga de 50 mL e combinados com 1,0 mL de metanol e agitados suavemente. O excesso de 10 metanol foi decantado e as resinas foram secas sob um vácuo de 25 inHg, temperatura ambiente, durante a noite. 50 mL da solução de pico então foram adicionados a cada uma das resinas e incubados com agitação suave a 31 °C por 24 horas. Após a incubação, as resinas foram removidas por filtração em um filtro de fibra de vidro Whatman® GF/F e os filtrados foram anali15 sados para conteúdo de ácido octanoico e ácido decanoico por cromatografia gasosa como descrito no Exemplo 2. A capacidade de cada resina para ácido octanoico e decanoico então pode ser determinada pela diferença na concentração de cada ácido graxo antes e após incubação com cada resina. Os resultados são mostrados na Tabela 10-1 abaixo.

Tabela 10-1

Capacidades de adsorção de vários adsorventes comercialmente disponíveis

Descrição	Tipo de Resina	Capacidade de Adsorção (mg/g)
Ácido Octanoico	Ácido Decanoico	Ácidos Graxos Livres Totais
Dowex Optipore® V503 (Dow Chemical)	Poliestireno de divinil benzeno macroporoso pós reticulação	26,3	69,8	96,0
Lewatit 1064 MD (LanXess)	Poliestireno de divinil benzeno macroporoso	1,1	46,7	47,8
ZeolystCBV 28014 (Zeolyst)	Zeólita de baixíssimo teor de alumina	17,4	74,7	92,0
Zeolyst CBV 901 (Zeolyst)	Zeólita de baixo teor de alumina	5,4	64,8	70,1

Descrição	Tipo de Resina	Capacidade de Adsorção (mg/g)
Ácido Octanoico	Ácido Decanoico	Ácidos Graxos Livres Totais
Hisiv 3000 Silicalito (UOP Honeywell)	Silicalito hidrofóbico	15,3	23,7	39,1
Lipidex 5000 (Packard Instrument Co.)	Gel sefadex alquilado	0,00	18,6	18,6
Norit ROW 0,8 (Fluka)	Carvão ativado extrusado	40,2	71,8	112,1

Eluição dos ácidos graxos livres a partir dos adsorventes hidrofóbicos também foi investigada. Dowex® Optipore® V503, Zeolyst CBV 28014, Zeolyst CBV 901, e Norit® ROW foram incubados com 1,0 mL da solução de pico por mg do adsorvente como descrito acima. Após período de 5 incubação, os adsorventes foram enxaguados e combinados com 0,1, 0,5, ou 1,0 mL de metanol por mg de adsorvente e agitados suavemente à temperatura ambiente por 4 horas. Os eluatos de metanol e os picos pôsadsorção foram analisados para a concentração de ácido graxo livre por cromatografia gasosa. Os resultados são listados na Tabela 10-2 abaixo.

Tabela 10-2

Dessorção de ácidos graxos livres em metanol

	% em Dessorção
mL MeOH/mg Resina	0,1 mL/mg	0,5 mL/mg	1,0 mL/mg
Dowex Optipore® V503	92%	84%	100%
CBV 28014	53%	76%	84%
CBV 901	78%	76%	57%
Norit® ROW	44%	85%	77%

O efeito de pH na capacidade adsorvente foi estudado utilizando Dowex Optipore® V503. 40 mg de resina foram combinados com 40 mL de meio BG-11 de pico com 150 mg/L de ácido octanoico e decanoico e ajusta15 dos a um pH de 10,0, 7,5, 4,8, ou 2,8. O pico de pH 10 foi tamponado com CAPS 5 mM. Os picos de pH 7,5 e 2,8 foram tamponados com fosfato 5 mM, e o pH 4,8 foi tamponado naturalmente pelos ácidos graxos dissolvidos, com NaCl 5 mM adicionado para manter a condutividade consistente. Os picos foram incubados com resina como descrito acima. As concentrações de áci39 do graxo livres foram medidas com um ensaio enzimático adquirido de Zenbio. Os resultados são expostos na Tabela 10-3 abaixo. A partir destes resultados, é claro que adsorção hidrofóbica de ácidos graxos livres é possível ao longo de uma larga faixa do pH.

Tabela 10-3

Capacidade de Adsorção de Dowex® Optipore® V503 em vários valores de

PH

PH	Capacidade de Adsorção (mg FFA/g resina)
10	42 ± 13
7,5	64 ±4
4,8	172 ±4
2,8	259 ± 1

Os valores reportados são a média de duas replicatas experimentais, +/- desvio-padrão

Exemplo 11 Captura In Vivo de Ácidos Graxos Livres a partir de Culturas de Cepa de Synechocystis SGC-YC10-5

Cepas de Synechocystis sp. SGC-YC10-5, que contém o gene ChFatB2-7942 como descrito no Exemplo 1, foram cultivadas em BG-11 com e sem resina Dowex® Optipore® V503. 400 mL da cultura fresca foram induzidos com IPTG 5 mM e incubados à temperatura ambiente por 1 hora para permitir a entrada do indutor. A cultura então foi dividida em quatro frascos vazados Erlenmeyer de 1.000 mL com tampas de abertura de PTFE. A dois dos frascos, aproximadamente 400 mg de Dowex® Optipore® V503 foram adicionados. A resina de adsorção nos frascos teste foi recuperada e trocada por resina fresca diariamente por 10 dias. A resina recuperada foi lavada generosamente com a água deionizada e eluída com 2 mL de metanol. Amostras de meio de cultura dos frascos teste e frascos controle também foram tomadas diariamente. As amostras foram medidas para DO₇30nm e filtradas em um filtro de fibra de vidro Whatman® GF/B e analisadas para conteúdo de ácido octanoico e ácido decanoico por cromatografia gasosa como anteriormente descrito no Exemplo 2. Os resultados são apresentados na

Tabela 11-1.

Tabela 11-1

Captura in vivo de ácidos graxos livres de culturas de Synechocystis SGCYC10-5

	Taxa de Crescimento Específico Médio (d1)	Produtividade de Ácido Graxo Livre Média (mg L’1 d'1)
Sem Dowex	0,090+0,005	16 + 0,8
Com Dowex	0,090+0,010	31+3

Os valores relatados são a média de duas replicatas biológicas +/- desvio-padrão.

Exemplo 12

Integração de Entrega de CO? e Recuperação de Produto como um Meio para Aumentar a Eficiência e Economia de Ambos ,10 A tabela 10-3 acima revela uma relação clara entre capacidade de adsorção de ácido graxo livre e pH. Esta relação resulta da ineficiência de extração da forma ionizada dos ácidos graxos livres. Muitos hospedeiros de produção potenciais requerem um pH significativamente superior ao pKa de ácidos graxos livres a fim de sobreviver e reproduzir. Um exemplo extremo 15 disto seriam as cianobactérias alcalofílicas, tais como aquelas pertencentes aos gêneros Synechococcus, Synechocystis, Spirulina, e muitos outros, que preferem um pH entre 9 e 11 para o crescimento ótimo. A figura 5 delineia uma modalidade da invenção em que este problema é resolvido pela reciclagem de uma porção da primeira cultura através de um vaso onde é conta20 tada com o gás CO₂ concentrado para abaixar o pH, então através de uma coluna adsorvente em estado estacionário em que os ácidos graxos livres protonados são capturados.

A suspensão depletada pelo ácido graxo enriquecida com CO₂, livre então é devolvida ao volume de cultura. A pressão dentro do contatator 25 gáslíquido pode ser controlada independentemente para fornecer um pH constante na corrente que sai da coluna de adsorção. Além disso, a pressão do vaso de flash pós-coluna pode ser controlada para fornecer um suprimento de CO₂que é titulado à taxa de consumo de CO₂do volume de cultura pelo controle PID do pH, CO₂ dissolvido, sem gás CO₂, ou qualquer combinação dos três. O excesso de CO₂ então pode ser reciclado.

A fim de demonstrar a prova conceituai da invenção descrita acima, um sistema experimental foi construído como exibido na figura 5.

O Vaso E-1 foi enchido com 4L de uma solução de pico contendo ácido octanoico 700 mg/L dissolvido em NaCI 100 mM, pH 11,1. A Coluna C1 foi enchida com 45,2 g de resina polimérica Dowex® Optipore® V503. A resina foi ativada com dois volumes de coluna de metanol, seguida por lavagem de três volumes de coluna de NaCI 100 mM, pH 11,1. O vaso de contato de líquido gás E2 então foi enchido com 200 mL da solução de pico e 239,24 kPa de CO₂. Quando o pH da solução de pico no interior de E-2 foi reduzido entre 5 e 6 (como determinado por uma fita de papel de pH contida em E-2) bombas peristálticas P-1 e P-2 foram estabelecidas na mesma taxa de fluxo e o carregamento de coluna foi Jniciado. A Válvula V-2 foi ajustada como necessário para aumentar a pressão da coluna e evitar a formação de bolhas de gás.

As frações do eluído foram tomadas em intervalos periódicos de 70 a 100 mL e analisadas para ácido octanoico por um ensaio de ácido graxo livre comercialmente disponível adquirido de Zen-Bio. Duas taxas de fluxo lineares superficiais foram avaliadas: 16,3 cm/min e 6,1 cm/min. Para ambas as taxas de fluxo, uma corrida controle foi realizada pela qual o vaso E-2 foi desviado e a coluna foi carregada diretamente em um pH de 11,1. A tabela 12-1 abaixo exibe os resultados deste experimento. Para ambas as taxas de fluxo, a capacidade de ligação dinâmica da coluna foi aproximadamente 4 vezes maior quando CO₂ foi usado para reduzir o pH da carga.

Tabela 12-1

Capacidade de ligação dinâmica com e sem acidificação mediada por CO₂

Capacidade de Ligação Dinâmica (mg/g)

Velocidade de fluxo (cm/min)	+239,24 kPa CO2	Controle (pH 11,1) 0 kPa CO2
6,1	43,5	10,5
16,3	7,2	1,9

Exemplo 13

Secreção de Ácido Oleico por Micro-orqanismos Fotossintéticos

Um gene sintético que codifica um derivado de uma enzima acilACP TE vegetal tipo FatA com especificidade para oleoil-ACP é expresso em vários micro-organismos fotossintéticos pela construção e utilização de vetores de expressão compreendendo um gene FatA operacionalmente ligado a regiões regulatórias gênicas (promotores e terminadores) que funciona no micro-organismo hospedeiro fotossintético. O gene é otimizado para a expressão no micro-organismo hospedeiro fotossintético e a porção do gene que codifica a região de peptídeo de trânsito plastidial da proteína natural FatA é removido para expressão em cianobactérias ou substituído com um peptídeo de trânsito plastidial que funciona efetivamente nos microorganismos hospedeiros fotossintéticos eucarióticos.

Genes que podem ser usados com esta finalidade incluem, mas não são limitados a, aqueles que codificam as seguintes acil-ACP TEs (referidas por Números de acesso GenPept): NP_189147.1, AAC49002, CAA52070.1, CAA52069.1, 193041.1, CAC39106, CA017726, AAC72883, AAA33020, AAL79361, AAQ08223.1, AAB51523, AAL77443, AAA33019, AAG35064, e AAL77445.

A seguir está uma listagem de sequência de todas as sequências mencionadas acima.

SEQ ID N°:l

ATATCGTGGAGTATATCAATGGTGGGGAGGTGTGGTGTAGTAGTTGCGAGCAAAGATGACACTTGGTAAACTGA

TGCGACGTGGATACTGCGACGAAGATTGGCCGTACACACGTCGGATTTGAATGAACATATGTGTTTTATTCAAA CCAATTTGACTAGTTTGAGGAACCTTCACGTGTTTCGCTCTCAAACTTTGAGACAACAGCCTCCGAATCCAAAT GAATGACTTTTAAACACAAGCTAGGAGCTGGTGATATATAATATGCTGGTTGTATGAAAGAGACTAATCGTGTG AAATAAATGATGGCTCGCCCTAGTGAATGCTCCTCAGAGACGCTCATTCGTCCAAGTGTTCGTCACTTCTGTCA TTGTTTCCTCCGAGGCCAAGGTGGTCGAGTAGGTAGATACCAGCTATTCTCTTGCTTCTTTTACTTTATCTCCC TCTACCAAAAACAGCACGTTATTATCTCCTTTCCATTCCACGCAATAACAAGAGGCAATCGGTAAAGAGGCACA AACAAGAGAACAAAGACCCCGGCTGCTTCTCTCGTCCGTCCGCCGCCCCTAAACTTCAAGTTTTACTTCAAGTT CAATCTGTTTTTTGGCGCAAAAAGCGCCGTTGCTCCGCCGTCCTCCGCACTTTTCAGTTCTCTGTCGTCGAGGA

CTGTTATCAACTTCCAAGATCTCCATCTCTTCTCCTATCCTCCCCTAACAAAGTACG

SEQ ID N°:2

GTTCAATGCCTTTGGTGTTGTCGTCAATAGGCACTTCGACTTTGCTCTTGGTTCCGTTATCCCAAACTTGAACG AGCGCCACGGTCCTCTCGGTTTCGGTGGTATCCCAGGACCTCTCGTAGTTGATGCAGGGTTCAGAATCGAGATA ACTCATGTTGTCGTTTGTTGTTTTGTTGATTTTACCTTGCTTCCAGCTTTCGGTCTGTAATTACAGTGACACGC TGTACTAGAAATGATGTACGTTTGATGGAATCTCTAAAATTATGAGCTATTTATGAACACAGGAGTTCTCATCA ACTTTCCATCGAAATCCGTAGGAGAATTCTAATGTCCTCTTCGGACGAGAGACAGACGTATCAGGAGTCACTTG AAGGTTCCAAGATTCTATCTTCATGAGGTCTGGATATGACAGTCCTGCCTTCGAGGCAAGCCCTGTCACTGTGA CCTTTTCGCGTCGTCAATAATTTTAGGAACGCAAGGATAGGGATTCTCCATAGTAAGGACTATTGTTTGACCCC TGAAACTTCAACCTTTACCCCAAGAATGGGGCATTCATAAGTGAAAAACGTTTGTTATGTATGCCCCAATTCCT ACACAGGAATAGGTATTGAATCACGTAGAAAATGATCGTTGCGCCGCAAGCAAACACACCGGCTCTCTTCCGCC GCACTCTCTTCCAATCCAACAAACAAACGCAACC

SEQ ID N°:3

ACGCAGATAGTGTATATTTGCGTCACAGTCTCTTGTCGTCATAGGAGAGGAGAACTAGAGAACAAAAAGCGTCA TGTAATAAATGTTGGATGTTGGCATGTCGTCCCAGCCAGTATCCAAAACACC.GAATTGTCGAGGTTGGTGAGCT TGCAGCACTCATGGCAACGGCTAATTTCATATCTATGTTATCAATGTTATCTGTAACACTAATGCTAAGTAATG CGTCAACAACTTATCTCCTCCGGCTCTTCACTCCACTTCGCTGACGTCGTTTGATATTTTATCTGCTCTATTAT TCAAGTTGAATCTGCAGTTGAGGCATTCTCTAACTTAGCCGAGAAATCAAGACGGTGACTTTGAATTTACAAGT ACAGTTACGCTTACACAAGATACCTTTCTCACAAAAAAGATTCCGTTGGCTCCCACTGCGCATTGCTACTTGGT ACTATTCCCATGTGGAACTGGATTTGGGGGAAAGAGGGAGTCTGAGTTTGTAAATGTACATTTGTTATTCCCTT CATTATCGACAACATCACTAACTCATCGTGCATACAGAGAAAAACAATCTCCACTTTCTCAACAAAAGTGGCCA CAATGTGCCTCCGACACAGCCTCAAGAGCCGACCGATCGTTGCATTTTTCACTCTCGAACACACACACACACAC ACACCCACACACCACCACCTCTCTTTATCCAACC

SEQ ID H°:4

AGTCGGATTGAAAACAGCGAATGTACGCCATTCCAAAGGCGCTCAGCAAAAGGAGACATATGCACACATCCAGC GGAAGTAAGTACGACACTTGAACAAGAGCATGACCTGTCAAAGCATGCTGCCATCGTCGCTTCGCTTCTATTCC CAATGACACTTTGGTCACCACGACTTGAAAAACGGCAATCAGCAAAATAAGCGATAGACCCTGACCAACGGCAG CTTTCATCTTTTATGAACGGCAGATATTCGCATCCTCTTTTATCGATACAGCAAACACGCAGAATTTCTGTTCT CTTTCAAGACGACAAGCACGAATTTCGGTACGCTGTCATAATTTATTGACTATGTTAGATAACACAACTCTCAT GCGCTTTGAAAATCTGCTTACTTCACAGTAAAGAGACAAGCTCTTTGCACTGACTGCGACAGAGATGGAAAAAA GGAATTCTACCGGCAATTGACAGACTGATGTGAAAACAGAGAGTAACCGTAAACAAGTACCGGTAAGTATGCGC GCAACCTTTACTTGTTCCGTTGGCGTCTGTCATTTGATGTCACGCAGACTTGAAAAGTCGTTCGCTCCATTGTG

AAAAATATCATGCGACAACGTTCAGAAAGGCCGGCGTGCAATCGGTTTGCCTTGTTTCTGATCCGCTGCTTTTT

GAGCAACGACCTGCGGAGGACCACAATGATCTTTCTCTTGTCGTGAGAGCTAGTTCTATTACCTGTTCAATTAC

CTGCTTTCTTGTATTACTCGAAGCTCTCGTTCTTCTATC

SEQ ID N°:5

TTTTGTAATTCGCCACTACCTTTACGCAAGTAAGAACGTTTCATGCTGGAGTCGTGGACCAATCGTAAGGTATA CGTTAGTCATACCGCGCCTGTACTATTTACGACACGAGAGAAAGCCACTGCAGTTCTGGGATGGGATCAGATGC TTGCTCCTTTCACTGCGCTGGCAAACTGTATGCTAGACACGACTCGGATCGGATATCGAAATCAAACGGCGGAG AATGGGTTCGGATGACTGTCCGGAGCTACCTAGGAAAAGCTTCTTTTTCGTTTCGGACCACCAAGAGGGAAGCG CTGCCTGTACTCGTGCGATAGGAAGCATCAGACGTATTTGTTCGGATGAGATCACACCAGAACTAGCCAGGCAG CCAGCTAGCTATTGTCATCTACAGATTTCGAACCAAACGTGGATACTAGAAAGCATGGGATTGACTGTGACTGT GATTTGTGTTGCACACTTTATACCTACCCTCGACCTCGTACTTTGTGTAGTAGCAAAATGTGGATTGTGCGTTG AAATGTAGAAGGGTTTGGGGTTGACACGGGTTCATTCATATCCGGGTACTCGAAAATGACCGCAACGATACTCA TCGATCGAGATACGGTGTACACGTAGACTACGTAGAAAACCTACGAGGAAGCAGATATGATTTTCCGGTCCGCA GCATCCACCCAGCCAACGTCGGCAAACAACCAAACAACCTCGTCGCCCCTTGTTGTTCAAGATCTGCATTCCAT TGACAGCCTTTTCAACGAAACCGTTCGCTCGTTTGATTGCATACGT-CTTTGAATAGCAACAGAAAAT

SEQ ID N°:6

AAAGTATCAATAGCTTATTCCAGATTTTTGTGATGTTAGCCTACTTGTAAAGCAGCGGAGGTCTGTCATGACGG TGTAGTGGCTGGTTTCGCTCCGGAAATTAAGTTCTGGTTTTATATCTCAACATAACTAGAGATAAAGTTACAGG CACGTTACTGTAAGTCCGCAGATTGCTAATGCTTTGCTTCGGTGTCCGTAAAGCTTATGTTACTGTTCTAGATT AGAGTGGTATCCACGATTTTCAAACGAAAGTGACATATTGCGAATTGTGCAGTATCAGAAAATCTCCAAAGCAG GAGCATACATTAGTTTGGCCGTATTGCAACGAGTAGCTCTCCTGAAGATGCAAGTAATAGAGGCTGTGAGCGTG AATAATGAATTTGCCTGTTTAGAAGCTGGGGATCACATCTCGTGCTCCCCAAAAGTCTCTCAGTAAATCAAGAA TGTTCCTATTTTCGAAAACATTGCTATTTATTTAGTTAACCGGCTTCGTCCTCCCATTTAAATAAAGATTTTCA AAAATGACACCACCAACGTCCGCAAGATCACGATTCGAGAGGATTCTTCTTTGTCCCAACCATGGATGACCTCT CCTATTAACACGTATATGAAGTACCGCTGCTGGTACCCGGAAAAGAGAGGACATTCCTTGTGGGAGAGTCATCG ATGCGCTGCCAATCGAAAAAAATGCCAAGGCGAGAAAAGCGCAGTTCGTTCTTATAATCCAATTTTGAGTTTCA AGACATACTCGTTGCTACCTTCCCACCTTCCCAACCAAACCACTCGCAACC

SEQ ID N°:7 CCATGGCGAATGGTTCTGCAGTCTCTTTGAAATCTGGAAGCTTGAATACGCAGGAGGATACTAGTTCCAGTCCC CCTCCTCGGACGTTTTTGCATCAGCTGCCCGACTGGAGTCGCTTGCTGACCGCCATCACAACAGTGTTTGTCAA ATCTAAACGACCGGACATGCATGATCGGAAAAGCAAGCGCCCAGATATGCTCGTCGATAGTTTCGGACTCGAGT CTACTGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGTCAATCCTTCAGCATCCGAAGCTACGAGATTGGTACGGACCGTACC

GCTAGCATTGAAACGTTGATGAACCATCTCCAAGAAACCAGTTTGAACCACTGCAAGAGCACGGGCATCCTGCT

GGATGGTTTTGGCCGCACATTGGAAATGTGCAAGCGAGACTTGATCTGGGTGGTCATTAAAATGCAGATCAAAG TTAATCGATACCCGGCCTGGGGAGATACCGTTGAGATCAATACACGCTTTTCCCGTTTGGGCAAAATTGGCATG GGTCGCGATTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGTGAGATCTTGGTCCGTGCAACGTCTGCGTACGCGATGAT GAATCAAAAGACGCGTCGGTTGAGTAAGCTGCCGTATGAAGTTCACCAAGAAATTGTTCCATTGTTCGTTGATA GTCCCGTTATCGAGGATTCTGACCTCAAAGTCCACAAGTTTAAAGTCAAGACTGGCGATTCCATCCAGAAGGGC CTGACGCCAGGTTGGAACGATCTGGATGTGAACCAACACGTTAGCAACGTTAAGTATATCGGCTGGATCTTGGA AAGTATGCCTACGGAAGTCCTGGAGACGCAGGAACTCTGCAGTCTCGCTCTGGAGTACCGCCGTGAGTGTGGCC GTGATTCCGTGCTCGAGTCCGTCACTGCGATGGACCCTAGCAAAGTGGGTGTTCGCAGTCAATACCAACACCTC TTGCGGCTCGAAGATGGGACCGCCATTGTGAACGGCGCGACCGAATGGCGCCCCAAAAATGCCGGCGCTAACGG GGCAATTAGTACCGGGAAAACCTCCAATGGAAACAGCGTCAGCTAATGATAGGATCC

SEQ ID N°:8

MANGSAVSLKSGSLNTQEDTSSSPPPRTFLHQLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKRPDMLVDSFGLES TVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTLEMCKRDLIWWIKMQIKV NRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDÇNTGEIJjyRATSAYAtffiajQKTRRLSKtPYEVHQEIVPLFVDS PVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGR DSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIVNGATEWRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID N° : 9

CGCCGGGGCTGGCAGCTTAGTCCTGCGCAATCTCTACTACATCTGCCAACCCAGTGAAATTTTGATCTTTGCTG GCAGTAGTCGCCGCAGTAGTGATGGCCGCCGAGTTGGCTATCGCTTGGTCAAGGGCGGCAGCAGCCTGCGGGTA CCTCTGCTGGAAAAAGCGCTCCGCATGGATCTGACCAACATGATCATTGAGTTGCGCGTTTCCAATGCCTTCTC CAAGGGCGGCATTCCCCTGACTGTTGAAGGCGTTGCCAATATCAAGATTGCTGGGGAAGAACCGACCATCCACA ACGCGATCGAGCGGCTGCTTGGCAAAAACCGTAAGGAAATCGAGCAAATTGCCAAGGAGACCCTCGAAGGCAAC TTGCGTGGTGTTTTAGCCAGCCTCACGCCGGAGCAGATCAACGAGGACAAAATTGCCTTTGCCAAAAGTCTGCT GGAAGAGGCGGAGGATGACCTTGAGCAGCTGGGTCTAGTCCTCGATACGCTGCAAGTCCAGAACATTTCCGATG AGGTCGGTTATCTCTCGGCTAGTGGACGCAAGCAGCGGGCTGATCTGCAGCGAGATGCCCGAATTGCTGAAGCC GATGCCCAGGCTGCCTCTGCGATCCAAACGGCCGAAAATGACAAGATCACGGCCCTGCGTCGGATCGATCGCGA TGTAGCGATCGCCCAAGCCGAGGCCGAGCGCCGGATTCAGGATGCGTTGACGCGGCGCGAAGCGGTGGTGGCCG AAGCTGAAGCGGACATTGCTACCGAAGTCGCTCGTAGCCAAGCAGAACTCCCTGTGCAGCAGGAGCGGATCAAA CAGGTGCAGCAGCAACTTCAAGCCGATGTGATCGCCCCAGCTGAGGCAGCTTGTAAACGGGCGATCGCGGAAGC GCGGGGGGCCGCCGCCCGTATCGTCGAAGATGGAAAAGCTCAAGCGGAAGGGACCCAACGGCTGGCGGAGGCTT GGCAGACCGCTGGTGCTAATGCCCGCGACATCTTCCTGCTCCAGAAGCTCGAAATTCGAGCTCGGTACCATTTA

CGTTGACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG

TGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGC GTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTA CATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGG CCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTG TCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGG GCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGT TATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGC GTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCG TCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACT GGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTT GCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTC GGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTC GCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTG TTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGGCCATkTACGCAAAGCGCGT-GTGeGGGCGGGTTGGC CGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTA AGTTAGCGCGAATTGATCTGGTTTGACAGCTTATCATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCA GCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCC GTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTA ATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCGCCGCTGAGAAA AAGCGAAGCGGCACTGCTCTTTAACAATTTATCAGACAATCTGTGTGGGCACTCGACCGGAATTATCGATTAAC TTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCATGGCGAATGGT TCTGCAGTCTCTTTGAAATCTGGAAGCTTGAATACGCAGGAGGATACTAGTTCCAGTCCCCCTCCTCGGACGTT TTTGCATCAGCTGCCCGACTGGAGTCGCTTGCTGACCGCCATCACAACAGTGTTTGTCAAATCTAAACGACCGG ACATGCATGATCGGAAAAGCAAGCGCCCAGATATGCTCGTCGATAGTTTCGGACTCGAGTCTACTGTGCAGGAC GGCCTGGTGTTCCGTCAATCCTTCAGCATCCGAAGCTACGAGATTGGTACGGACCGTACCGCTAGCATTGAAAC GTTGATGAACCATCTCCAAGAAACCAGTTTGAACCACTGCAAGAGCACGGGCATCCTGCTGGATGGTTTTGGCC GCACATTGGAAATGTGCAAGCGAGACTTGATCTGGGTGGTCATTAAAATGCAGATCAAAGTTAATCGATACCCG GCCTGGGGAGATACCGTTGAGATCAATACACGCTTTTCCCGTTTGGGCAAAATTGGCATGGGTCGCGATTGGCT GATCTCCGACTGCAACACCGGTGAGATCTTGGTCCGTGCAACGTCTGCGTACGCGATGATGAATCAAAAGACGC GTCGGTTGAGTAAGCTGCCGTATGAAGTTCACCAAGAAATTGTTCCATTGTTCGTTGATAGTCCCGTTATCGAG GATTCTGACCTCAAAGTCCACAAGTTTAAAGTCAAGACTGGCGATTCCATCCAGAAGGGCCTGACGCCAGGTTG

GAACGATCTGGATGTGAACCAACACGTTAGCAACGTTAAGTATATCGGCTGGATCTTGGAAAGTATGCCTACGG

AAGTCCTGGAGACGCAGGAACTCTGCAGTCTCGCTCTGGAGTACCGCCGTGAGTGTGGCCGTGATTCCGTGCTC GAGTCCGTCACTGCGATGGACCCTAGCAAAGTGGGTGTTCGCAGTCAATACCAACACCTCTTGCGGCTCGAAGA TGGGACCGCCATTGTGAACGGCGCGACCGAATGGCGCCCCAAAAATGCCGGCGCTAACGGGGCAATTAGTACCG GGAAAACCTCCAATGGAAACAGCGTCAGCTAATGATAGGATCCGAGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGG GAATTCGAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAA GCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAA GTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAA AACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGG ACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATA AACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGT TTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGGGGATCCGACTAGTAGGCCTCGAGGAATTCACGCG TACGTAGATCTCCGCGGCCGCCGATCCTCTAGTATGCTTGTAAACCGTTTTGTGAAAAAATTTTTAAAATAAAA AAGGGGACCTCTAGGGTCCCCAATTAATTAGTAATATAATCTATTAAAGGTCATTCAAAAGGTCATCCACCGGA TCAGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAGATTTTAATGCGGATGTTGCGAT-TACTTGGGCAAGTATTGCGATAACAAGA AAAAGCCAGCCTTTCATGATATATCTCCCAATTTGTGTAGGGCTTATTATGCACGCTTAAAAATAATAAAAGCA GACTTGACCTGATAGTTTGGCTGTGAGCAATTATGTGCTTAGTGCATCTAACGCTTGAGTTAAGCCGCGCCGCG AAGCGGCGTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTG GACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTT CAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATT TTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGG CGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTT CCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCG ATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGC TGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTC CAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACC GTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAG CAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCG CTTCCCTCATGATGTTTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATC AAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACCCCAAAAAAACAGTC ATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTG AGCGCATACGCTACTTGCATTACAGCTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCCACTGGGTTCGTGCCTTCATCCGT

TTCCACGGTGTGCGTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAACGA

GCGCAAGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCTGTGCA CGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGAAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCGGTGGTGCTGACCCCGGAT GAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGTTCGCCCAGCTTCTGTATGGAACGGGCAT GCGGATCAGTGAGGGTTTGCAACTGCGGGTCAAGGATCTGGATTTCGATCACGGCACGATCATCGTGCGGGAGG GCAAGGGCTCCAAGGATCGGGCCTTGATGTTACCCGAGAGCTTGGCACCCAGCCTGCGCGAGCAGGGGAATTGA TCCGGTGGATGACCTTTTGAATGACCTTTAATAGATTATATTACTAATTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTT TTTTATTTTAAAAATTTTTTCACAAAACGGTTTACAAGCATAAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGC TTCGAGTCCCTGCTCGTCACGCTTTCAGGCACCGTGCCAGATATCGACGTGGAGTCGATCACTGTGATTGGCGA AGGGGAAGGCAGCGCTACCCAAATCGCTAGCTTGCTGGAGAAGCTGAAACAAACCACGGGCATTGATCTGGCGA AATCCCTACCGGGTCAATCCGACTCGCCCGCTGCGAAGTCCTAAGAGATAGCGATGTGACCGCGATCGCTTGTC AAGAATCCCAGTGATCCCGAACCATAGGAAGGCAAGCTCAATGCTTGCCTCGTCTTGAGGACTATCTAGATGTC TGTGGAACGCACATTTATTGCCATCAAGCCCGATGGCGTTCAGCGGGGTTTGGTCGGTACGATCATCGGCCGCT TTGAGCAAAAAGGCTTCAAACTGGTGGGCCTAAAGCAGCTGAAGCCCAGTCGCGAGCTGGCCGAACAGCACTAT GCTGTCCACCGCGAGCGCCCCTTCTTCAATGGÇÇTÇGTCGAGTT-CATCACCTCTGGGCCGATGGTGGCGATCGT CTTGGAAGGCGAAGGCGTTGTGGCGGCTGCTCGCAAGTTGATCGGCGCTACCAATCCGCTGACGGCAGAACCGG GCACCATCCGTGGTGATTTTGGTGTCAATATTGGCCGCAACATCATCCATGGCTCGGATGCAATCGAAACAGCA CAACAGGAAATTGCTCTCTGGTTTAGCCCAGCAGAGCTAAGTGATTGGACCCCCACGATTCAACCCTGGCTGTA CGAATAAGGTCTGCATTCCTTCAGAGAGACATTGCCATGCCCGTGCTGCGATCGCCCTTCCAAGCTGCCTTGCC CCGCTGTTTCGGGCTGGCAGCCCTGGCGTTGGGGCTGGCGACCGCTTGCCAAGAAAGCAGCGCTCCGCCGGCTG CCGGATC

SEQ ID N°:10

CGCCGGGGCTGGCAGCTTAGTCCTGCGCAATCTCTACTACATCTGCCAACCCAGTGAAATTTTGATCTTTGCTG GCAGTAGTCGCCGCAGTAGTGATGGCCGCCGAGTTGGCTATCGCTTGGTCAAGGGCGGCAGCAGCCTGCGGGTA CCTCTGCTGGAAAAAGCGCTCCGCATGGATCTGACCAACATGATCATTGAGTTGCGCGTTTCCAATGCCTTCTC CAAGGGCGGCATTCCCCTGACTGTTGAAGGCGTTGCCAATATCAAGATTGCTGGGGAAGAACCGACCATCCACA ACGCGATCGAGCGGCTGCTTGGCAAAAACCGTAAGGAAATCGAGCAAATTGCCAAGGAGACCCTCGAAGGCAAC TTGCGTGGTGTTTTAGCCAGCCTCACGCCGGAGCAGATCAACGAGGACAAAATTGCCTTTGCCAAAAGTCTGCT GGAAGAGGCGGAGGATGACCTTGAGCAGCTGGGTCTAGTCCTCGATACGCTGCAAGTCCAGAACATTTCCGATG AGGTCGGTTATCTCTCGGCTAGTGGACGCAAGCAGCGGGCTGATCTGCAGCGAGATGCCCGAATTGCTGAAGCC GATGCCCAGGCTGCCTCTGCGATCCAAACGGCCGAAAATGACAAGATCACGGCCCTGCGTCGGATCGATCGCGA TGTAGCGATCGCCCAAGCCGAGGCCGAGCGCCGGATTCAGGATGCGTTGACGCGGCGCGAAGCGGTGGTGGCCG

AAGCTGAAGCGGACATTGCTACCGAAGTCGCTCGTAGCCAAGCAGAACTCCCTGTGCAGCAGGAGCGGATCAAA

CAGGTGCAGCAGCAACTTCAAGCCGATGTGATCGCCCCAGCTGAGGCAGCTTGTAAACGGGCGATCGCGGAAGC GCGGGGGGCCGCCGCCCGTATCGTCGAAGATGGAAAAGCTCAAGCGGAAGGGACCCAACGGCTGGCGGAGGCTT GGCAGACCGCTGGTGCTAATGCCCGCGACATCTTCCTGCTCCAGAAGCTCGAAATTCGAGCTCGGTACCATTTA CGTTGACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG TGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGC GTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTA CATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGG CCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTG TCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGG GCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGT TATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGC GTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCG TCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACT

GGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAAC7\AACCATGCAAATGCTGAATGAGGGGATCGTT€G€A6TGCGATGeTGGTT

GCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTC GGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTC GCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTG TTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGC CGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTA AGTTAGCGCGAATTGATCTGGTTTGACAGCTTATCATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCA GCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCC GTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTA ATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCGAATG GTTCTGCAGTCTCTTTGAAATCTGGAAGCTTGAATACGCAGGAGGATACTAGTTCCAGTCCCCCTCCTCGGACG TTTTTGCATCAGCTGCCCGACTGGAGTCGCTTGCTGACCGCCATCACAACAGTGTTTGTCAAATCTAAACGACC GGACATGCATGATCGGAAAAGCAAGCGCCCAGATATGCTCGTCGATAGTTTCGGACTCGAGTCTACTGTGCAGG ACGGCCTGGTGTTCCGTCAATCCTTCAGCATCCGAAGCTACGAGATTGGTACGGACCGTACCGCTAGCATTGAA ACGTTGATGAACCATCTCCAAGAAACCAGTTTGAACCACTGCAAGAGCACGGGCATCCTGCTGGATGGTTTTGG CCGCACATTGGAAATGTGCAAGCGAGACTTGATCTGGGTGGTCATTAAAATGCAGATCAAAGTTAATCGATACC CGGCCTGGGGAGATACCGTTGAGATCAATACACGCTTTTCCCGTTTGGGCAAAATTGGCATGGGTCGCGATTGG CTGATCTCCGACTGCAACACCGGTGAGATCTTGGTCCGTGCAACGTCTGCGTACGCGATGATGAATCAAAAGAC

GCGTCGGTTGAGTAAGCTGCCGTATGAAGTTCACCAAGAAATTGTTCCATTGTTCGTTGATAGTCCCGTTATCG

AGGATTCTGACCTCAAAGTCCACAAGTTTAAAGTCAAGACTGGCGATTCCATCCAGAAGGGCCTGACGCCAGGT TGGAACGATCTGGATGTGAACCAACACGTTAGCAACGTTAAGTATATCGGCTGGATCTTGGAAAGTATGCCTAC GGAAGTCCTGGAGACGCAGGAACTCTGCAGTCTCGCTCTGGAGTACCGCCGTGAGTGTGGCCGTGATTCCGTGC TCGAGTCCGTCACTGCGATGGACCCTAGCAAAGTGGGTGTTCGCAGTCAATACCAACACCTCTTGCGGCTCGAA GATGGGACCGCCATTGTGAACGGCGCGACCGAATGGCGCCCCAAAAATGCCGGCGCTAACGGGGCAATTAGTAC CGGGAAAACCTCCAATGGAAACAGCGTCAGCTAATGATAGGATCCGAGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATAT GGGAATTCGAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAG AAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAG AAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAAT AAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTA GGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCA TAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTT GTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGGGGATCCGACTAGTAGGCCTCGAGGAATTCACG CGTACGTAGATCTCCGCGGCCGCCGATCÇTÇTAGTATGGTTGTAAACCGTTTT-GT-GAAAAAATTTTTAAAATAA AAAAGGGGACCTCTAGGGTCCCCAATTAATTAGTAATATAATCTATTAAAGGTCATTCAAAAGGTCATCCACCG GATCAGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAGATTTTAATGCGGATGTTGCGATTACTTCGCCAACTATTGCGATAACAA GAAAAAGCCAGCCTTTCATGATATATCTCCCAATTTGTGTAGGGCTTATTATGCACGCTTAAAAATAATAAAAG CAGACTTGACCTGATAGTTTGGCTGTGAGCAATTATGTGCTTAGTGCATCTAACGCTTGAGTTAAGCCGCGCCG CGAAGCGGCGTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAG TGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGC TTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGA TTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCG GGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAG TTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGT CGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTA GCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTC TCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCA CCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCC AGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCAC CGCTTCCCTCATGATGTTTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACA TCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACCCCAAAAAAACAG

TCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCG

TGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGCTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCCACTGGGTTCGTGCCTTCATCC GTTTCCACGGTGTGCGTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAAC GAGCGCAAGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCTGTG CACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGAAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCGGTGGTGCTGACCCCGG ATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGTTCGCCCAGCTTCTGTATGGAACGGGC ATGCGGATCAGTGAGGGTTTGCAACTGCGGGTCAAGGATCTGGATTTCGATCACGGCACGATCATCGTGCGGGA GGGCAAGGGCTCCAAGGATCGGGCCTTGATGTTACCCGAGAGCTTGGCACCCAGCCTGCGCGAGCAGGGGAATT GATCCGGTGGATGACCTTTTGAATGACCTTTAATAGATTATATTACTAATTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCC TTTTTTATTTTAAAAATTTTTTCACAAAACGGTTTACAAGCATAAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAA GCTTCGAGTCCCTGCTCGTCACGCTTTCAGGCACCGTGCCAGATATCGACGTGGAGTCGATCACTGTGATTGGC GAAGGGGAAGGCAGCGCTACCCAAATCGCTAGCTTGCTGGAGAAGCTGAAACAAACCACGGGCATTGATCTGGC GAAATCCCTACCGGGTCAATCCGACTCGCCCGCTGCGAAGTCCTAAGAGATAGCGATGTGACCGCGATCGCTTG TCAAGAATCCCAGTGATCCCGAACCATAGGAAGGCAAGCTCAATGCTTGCCTCGTCTTGAGGACTATCTAGATG TCTGTGGAACGCACATTTATTGCCATCAAGCCCGATGGCGTTCAGCGGGGTTTGGTGGGTAeGATCATeGGCCG ’ CTTTGAGCAAAAAGGCTTCAAACTGGTGGGCCTAAAGCAGCTGAAGCCCAGTCGCGAGCTGGCCGAACAGCACT ATGCTGTCCACCGCGAGCGCCCCTTCTTCAATGGCCTCGTCGAGTTCATCACCTCTGGGCCGATCGTGGCGATC GTCTTGGAAGGCGAAGGCGTTGTGGCGGCTGCTCGCAAGTTGATCGGCGCTACCAATCCGCTGACGGCAGAACC GGGCACCATCCGTGGTGATTTTGGTGTCAATATTGGCCGCAACATCATCCATGGCTCGGATGCAATCGAAACAG CACAACAGGAAATTGCTCTCTGGTTTAGCCCAGCAGAGCTAAGTGATTGGACCCCCACGATTCAACCCTGGCTG TACGAATAAGGTCTGCATTCCTTCAGAGAGACATTGCCATGCCCGTGCTGCGATCGCCCTTCCAAGCTGCCTTG CCCCGCTGTTTCGGGCTGGCAGCCCTGGCGTTGGGGCTGGCGACCGCTTGCCAAGAAAGCAGCGCTCCGCCGGC TGCCGGATC

SEQ ID NO:11 CTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAG GCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGC CAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATC GACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTC GTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCT TTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAAC CCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTA TCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAA

GTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCG

GAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAG CAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAA CGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAA AATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAG GCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGAT ACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT CAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCT ATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTAC AGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTA CATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCC GCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTC TGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGT CAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGA AAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAAC.CCAC-TCGXGCACGGAAGTGATCTTCAGC ATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGG CGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTC ATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGT GCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC GTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTG TAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAA CTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCG CGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAA GAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAA CGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAGTTTTTTGG GGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCG GCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC GCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGGTTGCTTTGACGTAT GCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCA ACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGG CGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTATTGCT GAAGCGGAATCCCTGGTTAATGCCGCCGCCGATGCCAATTGCATTCTCCAAGTGGGGCACATTGAACGCTTCAA

CCCGGCATTTTTAGAGCTAACCAAAATTCTCAAAACGGAAGAGTTATTGGCGATCGAAGCCCATCGCATGAGTC

CCTATTCCCAGCGGGCCAATGATGTCTCCGTGGTATTGGATTTGATGATCCATGACATTGACCTGTTGCTGGAA

TTGGTGGGTTCGGAAGTGGTTAAACTGTCCGCCAGTGGCAGTCGGGCTTCTGGGTCAGGATATTTGGATTATGT CACCGCTACGTTAGGCTTCTCCTCCGGCATTGTGGCCACCCTCACCGCCAGTAAGGTCACCCATCGTAAAATTC GTTCCATCGCCGCCCACTGCAAAAATTCCCTCACCGAAGCGGATTTTCTCAATAACGAAATTTTGATCCATCGC CAAACCACCGCTGATTGGAGCGCGGACTATGGCCAGGTATTGTATCGCCAGGATGGTCTAATCGAAAAGGTTTA CACCAGTAATATTGAACCTCTCCACGCTGAATTAGAACATTTTATTCATTGTGTTAGGGGAGGTGATCAACCCT CAGTGGGGGGAGAACAGGCCCTCAAGGCCCTGAAGTTAGCCAGTTTAATTGAAGAAATGGCCCTGGACAGTCAG GAATGGCATGGGGGGGAAGTTGTGACAGAATATCAAGATGCCACCCTGGCCCTCAGTGCGAGTGTTTAAATCAA CTTAATTAATGCAATTATTGCGAGTTCAAACTCGATAACTTTGTGAAATATTACTGTTGAATTAATCTATGACT ATTCAATACACCCCCCTAGCCGATCGCCTGTTGGCCTACCTCGCCGCCGATCGCCTAAATCTCAGCGCCAAGAG TAGTTCCCTCAACACCAGTATTCTGCTCAGCAGTGACCTATTCAATCAGGAAGGGGGAATTGTAACAGCCAACT ATGGCTTTGATGGTTATATGGTACCATATGCATGCGAGCTCAGATCTACCAGGTTGTCCTTGGCGCAGCGCTTC CCACGCTGAGAGGGTGTAGCCCGTCACGGGTAACCGATATCGTCGACAGGCCTCTAGACCCGGGCTCGAGCTAG CAAGCTTGGCCGGATCCGGCÇGGATCCGGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCGATGeGTGAGGATGGeCTTCTG CTTAATTTGATGCCTGGCAGTTTATGGCGGGCGTCCTGCCCGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTCCGCAACGTTCA AATCCGCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAG TCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGGGAGACCCCACACTAC CATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCAGGTGGGACCACCGCGCTACTGCCGCCAGGC AAATTCTGTTTTATTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCCGATGGCAAGAGGCCC GAAGGTCCCCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCA GGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCACTCGTCAGCAAAGAAGCAAGCTTAGATCGACCTGCAGGGG GGGGGGGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAA CAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGC TCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCA ATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTA GCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATC AAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGT ATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGA TTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAAC GGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCA TAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACG

AGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTA

TGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGA

TATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACT

GGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATC

AGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACC

TACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGA

GTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGATCTGGTAACCCCAGCG

CGGTTGCTACCAAGTAGTGACCCGCTTCGTGATGCAAAATCCGCTGACGATATTCGGGCGATCGCTGCTGAATG

CCATCGAGCAGTAACGTGGCGAATTCGGTACCGGTATGGATGGCACCGATGCGGAATCCCAACAGATTGCCTTT

GACAACAATGTGGCCTGGAATAACCTGGGGGATTTGTCCACCACCACCCAACGGGCCTACACTTCGGCTATTAG

CACAGACACAGTGCAGAGTGTTTATGGCGTTAATCTGGAAAAAAACGATAACATTCCCATTGTTTTTGCGTGGC

CCATTTTTCCCACCACCCTTAATCCCACAGATTTTCAGGTAATGCTTAACACGGGGGAAATTGTCACCCCGGTG

ATCGCCTCTTTGATTCCCAACAGTGAATACAACGAACGGCAAACGGTAGTAATTACGGGCAATTTTGGTAATCG

TTTAACCCCAGGCACGGAGGGAGCGATTTATCCCGTTTCCGTAGGCACAGTGTTGGACAGTACTCCTTTGGAAA

TGGTGGGACCCAACGGCCCGGTCAGTGÇGGTGGGTATTACCAT.T-GA-TAGTCT€AAG€GCTACGTGG€CGGCAAT^_

GGTCCCAAAATTGTCGCCGCTAAGTTAGACCGCTTCAGTGACCTGGGGGAAGGGGCTCCCCTCTGGTTAGCCAC

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GTTTTTCCCCCGATGGCATTGCCAGTTTACTACCCACAGAATTTGAACGGTATTTTCAACTCCAAGCGGAAGAT

ATTACGGGACGGACAGTTATCCTAACCCAAACTGGTGTTGATTATGAAATTCCCGGCTTTGGTCTGGTGCAGGT

GTTGGGGCTGGCGGATTTGGCCGGGGTTCAGGACAGCTATGACCTGACTTACATCGAAGATCATGACAACTATT

ACGACATTATCCTCAAAGGGGACGAAGCCGCAGTTCGCCAAATTAAGAGGGTTGCTTTGCCCTCCGAAGGGGAT

TATTCGGCGGTTTATAATCCCGGTGGCCCCGGCAATGATCCAGAGAATGGTCCCCCAAATTCGTAATCATGTCA

TAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAA

AGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAA

ACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCT

SEQ ID N°:12

ATTGCTGAAGCGGAATCCCTGGTTAATGCCGCCGCCGATGCCAATTGCATTCTCCAAGTGGGGCACATTGAACG

CTTCAACCCGGCATTTTTAGAGCTAACCAAAATTCTCAAAACGGAAGAGTTATTGGCGATCGAAGCCCATCGCA

TGAGTCCCTATTCCCAGCGGGCCAATGATGTCTCCGTGGTATTGGATTTGATGATCCATGACATTGACCTGTTG

CTGGAATTGGTGGGTTCGGAAGTGGTTAAACTGTCCGCCAGTGGCAGTCGGGCTTCTGGGTCAGGATATTTGGA

TTATGTCACCGCTACGTTAGGCTTCTCCTCCGGCATTGTGGCCACCCTCACCGCCAGTAAGGTCACCCATCGTA

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AGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTG

ATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATAC CAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATA TGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGG TTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTT TTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAA ATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGC GATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCCCCCCCCCCCCTGCAGGTC GATCTGGTAACCCCAGCGCGGTTGCTACCAAGTAGTGACCCGCTTCGTGATGCAAAATCCGCTGACGATATTCG GGCGATCGCTGCTGAATGCCATCGAGCAGTAACGTGGCGAATTCGGTACCGGTATGGATGGCACCGATGCGGAA TCCCAACAGATTGCCTTTGACAACAATGTGGCCTGGAATAACCTGGGGGATTTGTCCACCACCACCCAACGGGC CTACACTTCGGCTATTAGCACAGACACAGTGCAGAGTGTTTATGGCGTTAATCTGGAAAAAAACGATAACATTC CCATTGTTTTTGCGTGGCCCATTTTTCCCACCACCCTTAATCCCACAGATTTTCAGGTAATGCTTAACACGGGG GAAATTGTCACCCCGGTGATCGCCTCTTTGATTCCCAACAGTGAATACAACGAACGGCAAACGGTAGTAATTAC GGGCAATTTTGGTAATCGTTTAACCCCAGGÇACGGAGGGAGCGATTTATCCCGÍT-TGGGTAGGCACAGTGTTGG ACAGTACTCCTTTGGAAATGGTGGGACCCAACGGCCCGGTCAGTGCGGTGGGTATTACCATTGATAGTCTCAAC CCCTACGTGGCCGGCAATGGTCCCAAAATTGTCGCCGCTAAGTTAGACCGCTTCAGTGACCTGGGGGAAGGGGC TCCCCTCTGGTTAGCCACCAATCAAAATAACAGTGGCGGGGATTTATATGGAGACCAAGCCCAATTTCGTTTGC GAATTTACACCAGCGCCGGTTTTTCCCCCGATGGCATTGCCAGTTTACTACCCACAGAATTTGAACGGTATTTT CAACTCCAAGCGGAAGATATTACGGGACGGACAGTTATCCTAACCCAAACTGGTGTTGATTATGAAATTCCCGG CTTTGGTCTGGTGCAGGTGTTGGGGCTGGCGGATTTGGCCGGGGTTCAGGACAGCTATGACCTGACTTACATCG AAGATCATGACAACTATTACGACATTATCCTCAAAGGGGACGAAGCCGCAGTTCGCCAAATTAAGAGGGTTGCT TTGCCCTCCGAAGGGGATTATTCGGCGGTTTATAATCCCGGTGGCCCCGGCAATGATCCAGAGAATGGTCCCCC A SEQ ID N°:14 ACCCTGGCCCTCAGTGCGAG

SEQ ID N°:15 TGCTTCTTTGCTGACGAGTGG

SEQ ID N° :16

GTGACTGGAACCGCCCTCG

SEQ ID N°:17 CCATCGAGCAGTAACGTGGCCGATAGTGACGCTAAACCAGGCTG

SEQ ID N°:18 CGAGTGGCGGACGGGTGAGTCTACGAGGGCGTGCAGAAGC

SEQ ID N°:19 CACCAAGTTGCCTTCACCGAC

SEQ ID N°:20 CAGCCTGGTTTAGCGTCACTATCGGCCACGTTACTGCTCGATGG

SEQ ID N°:21 GCTTCTGCACGCCCTCGTAGACTCACCCGTCCGCCACTCG

SEQ ID N°:22

GTGACTGGAACCGCCCTCGCGCAACCCCGCGCCATTACGCCCCACGAACAGCAGCTTTTGGCCAAACTGAAAAG CTATCGCGATATCCAAAGCTTGTCGCAAATTTGGGGACGTGCTGCCAGTCAATTTGGATCGATGCCGGCTTTGG TTGCACCCCATGCCAAACCAGCGATCACCCTCAGTTATCAAGAATTGGCGATTCAGATCCAAGCGTTTGCAGCC GGACTGCTCGCGCTGGGAGTGCCTACCTCCACAGCCGATGACTTTCCGCCTCGCTTGGCGCAGTTTGCGGATAA CAGCCCCCGCTGGTTGATTGCTGACCAAGGCACGTTGCTGGCAGGGGCTGCCAATGCGGTGCGCGGCGCCCAAG CTGAAGTATCGGAGCTGCTCTACGTCTTAGAGGACAGCGGTTCGATCGGCTTGATTGTCGAAGACGCGGCGCTG CTGAAGAAACTACAGCCTGGTTTAGCGTCACTATCGGCCACGTTACTGCTCGATGGCATTCAGCAGCGATCGCC CGAATATCGTCAGCGGATTTTGCATCACGAAGCGGGTCACTACTTGGTAGCAACCGCGCTGGGGTTACCAGATC CGTCGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGCAAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCAC ACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTG CCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGC GTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTA CTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCG GCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGGGAAGAAGTTGTeCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCC TTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAAT CGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACA CTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGGAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAG AATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCT GAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGAT ATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTC AAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTC ATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGA TCTTCCGTCACAGGTATTTATTCGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGA TAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTC TAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAA GAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTC ACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGAT CTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCT GCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTGACGGATCTAAGCTTGCTTCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAG TCTACGAGGGCGTGCAGAAGCAGTTTCGCGAGCAACCGGCGAAGAAACGTCGCTTGATCGATACCTTCTTTGGC

TTGAGTCAACGCTATGTTTTGGCACGGCGCCGCTGGCAAGGACTGGATTTGCTGGCACTGAACCAATCCCCAGC

CCAGCGCCTCGCTGAGGGTGTCCGGATGTTGGCGCTAGCACCGTTGCATAAGCTGGGCGATCGCCTCGTCTACG GCAAAGTACGAGAAGCCACGGGTGGCCGAATTCGGCAGGTGATCAGTGGCGGTGGCTCACTGGCACTGCACCTC GATACCTTCTTCGAAATTGTTGGTGTTGATTTGCTGGTGGGTTATGGCTTGACAGAAACCTCACCAGTGCTGAC GGGGCGACGGCCTTGGCACAACCTACGGGGTTCGGCCGGTCAGCCGATTCCAGGTACGGCGATTCGGATCGTCG ATCCTGAAACGAAGGAAAACCGACCCAGTGGCGATCGCGGCTTGGTGCTGGCGAAAGGGCCGCAAATCATGCAG GGCTACTTCAATAAACCCGAGGCGACCGCGAAAGCGATCGATGCCGAAGGTTGGTTTGACACCGGCGACTTAGG CTACATCGTCGGTGAAGGCAACTTGGTG

SEQ ID N°:23 CTCGAGCCCCCGTGCTATGACTAGC

SEQ ID N°:24 CTCGAGCCCGGAACGTTTTTTGTACCCC

SEQ ID N°:25 CAATTGGTCACACGGGATAATACCGCGCC

SEQ ID N°:26 CAATTGGTCGATCATATCGTCAATTATTACCTCCAC

SEQ ID N°:27

CCCCCGTGCTATGACTAGCGGCGATCGCCATACCGGCCACGACCATTTGCATTGGATCCCCAACGGCGGCCACA ACTTCCATGGCATTGAGATGCGGGGAATGATGTTCTAGACT.CTGACGCACCAAAGGGAAT-TTTTGTTGATGGTT GCAATGGGGATGACTACTGTTCACTTTGCCCCCAGCGTCAATGCCTAGACCTAGCAGTACCCCCAGGGCTGTGG TAGTGCCCCCCACCACGCATTCGCTTAGCACTAAGTAACTTTCGGCATGTTCCTGGGCTAACTGTGCGCCCCAC TGCAAACCCTGCTGAAAAAGATGCTCCACCAGGGCCAACGGTAACGCTTGCCCTGTGGAAAGACAGCGGGCGGG TTGTCCGTCTAGATTGATGACTGGCACCGCTGGGGGAATGGGTAAACCAGAGTTAAATAAATAAACCGGAGTAT GGAGGGCATCCACCAACGCTTTGGTGATGAACACTGGGGAAACCCCAGAAATGAGGGGAGGTAAGGGATAGGTT GCCCCTGCCGTAGTTCCCTTGATTAAAAATTCCGCATCGGCGATCGCCGTCAATTTTCGATCAGCGGGGGTTTT ACCCGCCGCAGAAATGCCCGGAATTAAACCAGTTTCCGTAAAGCCCAACACACAGACAAACACCGGTGGACAGT GGCCATGGCGCTCAATCCAGGATAAAGCTTGGTCAGACTGGGTATAAACTGTCAACATATTTCTGCAAGAGTGG GCCCAATTGGGAAAATCAACCTCAAATCCATTGGAATAGCCTTTTTTCAACCGTAAAAATCCAACTTTCTCTCT TCCCTTCTTCCTTCCATCTGATTATGGTTACGCCAATTAACTACCATTCCATCCATTGCCTGGCGGATATCTGG GCTATCACCGGAGAAAATTTTGCCGATATTGTGGCCCTCAACGATCGCCATAGTCATCCCCCCGTAACTTTAAC CTATGCCCAATTGGTCACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCC AACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAA AAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATC AGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACA TTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTAT

CACGAGGCCCTTTCGTCTTCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTC

CCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAA CTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAG CTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAG GCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGT AAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAAT TCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAG CAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCA AGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAG CCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTC ACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTG TGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAT TTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATG GCAGAAATTCGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCCGCTTATGTCTATT GCTGGTTTACCGGTTTATTGACTACCGGAAGCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCGTGAGGCeAGTTTGeT CAGGCTCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGACGATATGATCGACCAATTGCGGGAAGAAATTACAGCTTTTGCCGC TGGCCTACAGAGTTTAGGAGTTACCCCCCATCAACACCTGGCCATTTTCGCCGACAACAGCCCCCGGTGGTTTA TCGCCGATCAAGGCAGTATGTTGGCTGGAGCCGTCAACGCCGTCCGTTCTGCCCAAGCAGAGCGCCAGGAATTA CTCTACATCCTAGAAGACAGCAACAGCCGTACTTTAATCGCAGAAAATCGGCAAACCCTAAGCAAATTGGCCCT AGATGGCGAAACCATTGACCTGAAACTAATCATCCTCCTCACCGATGAAGAAGTGGCAGAGGACAGCGCCATTC CCCAATATAACTTTGCCCAGGTCATGGCCCTAGGGGCCGGCAAAATCCCCACTCCCGTTCCCCGCCAGGAAGAA GATTTAGCCACCCTGATCTACACCTCCGGCACCACAGGACAACCCAAAGGGGTGATGCTCAGCCACGGTAATTT ATTGCACCAAGTACGGGAATTGGATTCGGTGATTATTCCCCGCCCCGGCGATCAGGTGTTGAGCATTTTGCCCT GTTGGCACTCCCTAGAAAGAAGCGCCGAATATTTTCTTCTTTCCCGGGGCTGCACGATGAACTACACCAGCATT CGCCATTTCAAGGGGGATGTGAAGGACATTAAACCCCATCACATTGTCGGTGTGCCCCGGCTGTGGGAATCCCT CTACGAAGGGGTACAAAAAACGTTCCGGGCTAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCG AGCATGCATCTAGAGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGT CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAA TAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAG CGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCG CTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTC CCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAG

TGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGT

TCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC

TATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATTCAGGGCGCAAGGGCTGC TAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGC TATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAG ACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCC TGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGAC AGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGC TATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGG CGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATC GTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGC TATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCCCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCT GATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGA GCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGC CAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCÇCGACGGCGAGGATCT.CGTCGÍGAGCGATGGCGATG-GC TGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGA CCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCC TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA attgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgcctt CCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTA CATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCA CTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATA CACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAG AGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGAC CGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTG AATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATT AACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGAC CACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGC GGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGC AACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACC AAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTT TTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGAT

CAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAG

CGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATA CCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCT CGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGAC GATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGA CAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATC TTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGC CTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCC GAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCG CGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAAT TAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAA TTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGA TCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTTCTCGAG

SEQ ID N°:28

GATCCGCTGTTGACCCAACAGCATGAGTCGTTATCCAAGGGGAGCTTCGGCTCCCTTTTTTCATGCGCGGATGC GGTGA

SEQ ID N°:29

GGATCCACTAGTCCTGAGGTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA ATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCCGTCGCACTGCAACCAGCTCAAGAAGTCGCAACTAAGAAAAAGCCTGC AATCAAACAGCGGCGCGTGGTGGTTACCGGCATGGGTGTGGTGACTCCCCTCGGGCATGAACCGGATGTGTTTT ACAACAATCTCCTGGATGGCGTGAGCGGCATTAGTGAGATCGAGAATTTTGACTCGACGCAGTTTCCCACTCGC ATTGCCGGCGAAATCAAGAGTTTCAGCACCGACGGCTGGGTCGCGCCCAAATTGAGCAAACGGATGGATAAATT GATGCTGTATCTGCTCACCGCAGGCAAGAAAGCGCTGGCCGATGCGGGCATCACGGATGATGTGATGAAAGAGC TGGATAAACGCAAATGTGGAGTTCTGATTGGCAGTGGCATGGGCGGCATGAAGCTGTTCTACGATGCGCTCGAA GCCCTGAAGATTTCGTATCGAAAGATGAACCCATTCTGTGTGCCTTTTGCGACCACGAATATGGGTAGCGCCAT GCTGGCTATGGATTTGGGGTGGATGGGGCCGAATTATAGTATTTCCACCGCGTGCGCAACCTCGAACTTCTGCA TCTTGAACGCGGCTAACCACATTATCCGTGGTGAAGCAGACATGATGCTCTGCGGCGGCTCCGATGCGGTCATT ATCCCTATCGGTTTGGGCGGCTTTGTTGCTTGCCGCGCCTTGAGCCAACGCAATAACGACCCAACCAAGGCATC GCGCCCGTGGGACAGCAATCGCGATGGCTTCGTCATGGGCGAGGGAGCCGGGGTGCTGCTGTTGGAGGAGCTGG AACACGCGAAAAAGCGAGGCGCGACAATCTATGCTGAGTTCTTGGGAGGGTCCTTTACATGCGATGCCTACCAC

ATGACGGAGCCTCACCCAGAGGGCGCAGGCGTGATCTTGTGTATCGAGAAGGCAATGGCTCAGGCAGGAGTCTC

TCGCGAGGATGTTAACTACATTAATGCTCACGCAACGTCCACGCCGGCTGGTGACATCAAGGAATACCAAGCTC

TCGCCCATTGTTTCGGCCAGAACTCGGAGCTGCGGGTCAATAGTACAAAGTCCATGATCGGTCATCTGCTGGGT GCTGCCGGTGGCGTCGAAGCTGTGACAGTCATTCAAGCCATCCGCACCGGCTGGATTCACCCTAATCTGAACCT GGAAGACCCGGACAAGGCCGTTGACGCAAAATTCCTCGTCGGACCGGAGAAAGAACGTCTCAACGTTAAAGTCG GATTGAGCAATAGTTTCGGTTTTGGTGGCCATAACTCTAGTATCCTGTTTGCACCCTATAATTGATAATAGATC TGATCCGCTGTTGACCCAACAGCATGAGTCGTTATCCAAGGGGAGCTTCGGCTCCCTTTTTTCATGCGCGGATG CGGTGAGAGCTCACGTGTCTAGA

SEQ ID N°:30

GGATCCACTAGTCCTGAGGTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA ATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCAAGCCGTGTTGTTGGTAAAGGTTGTAAACTCGTTGGATGTGGTAGTGC CGTCCCGAAGTTGGAGGTGAGTAACGACGACCTCAGTAAGATCGTGGATACTTCCGATGAATGGATTTCTGTTC GGACGGGAATCCGCAACCGGCGGGTGATTACTGGTAAGGATAAGATGACGGGGCTGGCGGTCGAGGCAGCCCAG AAAGCCCTGGAAATGGCTGAAGTCGATGCTGACGATGTGGACTTGCTCCTGTTGTGCACCTCCACCCCAGATGA TCTCTTTGGAAGTGCGCCGCTkAATCCAGGCGGCACTCGGCTGCAAAGGAAACCCICTGGGATTTGATATTAeAG CCGCTTGTAGCGGCTTCGTTCTGGGTCTGGTGAGTGCTTCCTGCTATATCCGCGGCGGCGGGTTCAAGAACGTC

CTGGTTATCGGCGCGGACGCACTGAGCCGCTACGTCGATTGGACTGACCGCGGCACATGCATTCTCTTTGGTGA CGCCGCTGGCGCTGTGTTGGTCCAGGCGTGTGAGAGCGAGGACGACGGCGTCTTCGGGTTTGATCTGCATAGCG ATGGAGAGGGTTATCGCCACCTGCATACTGGGATCAAGGCGAACGAGGAGTTCGGGACGAACGGTTCCGTTGTG GATTTTCCGCCCAAGCGCAGCAGCTACTCTTCCATCCAAATGAATGGGAAAGAAGTGTTCCGTTTCGCCTGCCG CGTCGTGCCCCAGTCTATTGAGATCGCACTCGAGAACGCGGGCCTCACACGTTCTAGCATTGATTGGCTGCTGC TCCACCAAGCAAACCAACGAATCTTGGATGCCGTCGCAACGCGTCTGGAAATTCCCGCAGACCGCGTGATTAGT AACTTGGCTAATTACGGCAATACTTCTGCCGCCAGCATTCCGTTGGCACTGGATGAAGCCGTGCGCAGCGGTAA GGTCAAACCCGGTCAGACTATCGCAACTTCGGGGTTTGGAGCAGGCTTGACATGGGGCAGCGCGATCATTCGCT GGAATTAATGATAGATCTGATCCGCTGTTGACCCAACAGCATGAGTCGTTATCCAAGGGGAGCTTCGGCTCCCT TTTTTCATGCGCGGATGCGGTGAGAGCTCACGTGTCTAGA

SEQ ID NO:31

TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC GCCGCTGAGAAAAAGCGAAGCGGCACTGCTCTTTAACAATTTATCAGACAATCTGTGTGGGCACTCGACCGGAA TTATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC ATGGCCGTCGCACTGCAACCAGCTCAAGAAGTCGCAACTAAGAAAAAGCCTGCAATCAAACAGCGGCGCGTGGT GGTTACCGGCATGGGTGTGGTGACTCCCCTCGGGCATGAACCGGATGTGTTTTACAACAATCTCCTGGATGGCG

TGAGCGGCATTAGTGAGATCGAGAATTTTGACTCGACGCAGTTTCCCACTCGCATTGCCGGCGAAATCAAGAGT

TTCAGCACCGACGGCTGGGTCGCGCCCAAATTGAGCAAACGGATGGATAAATTGATGCTGTATCTGCTCACCGC AGGCAAGAAAGCGCTGGCCGATGCGGGCATCACGGATGATGTGATGAAAGAGCTGGATAAACGCAAATGTGGAG TTCTGATTGGCAGTGGCATGGGCGGCATGAAGCTGTTCTACGATGCGCTCGAAGCCCTGAAGATTTCGTATCGA AAGATGAACCCATTCTGTGTGCCTTTTGCGACCACGAATATGGGTAGCGCCATGCTGGCTATGGATTTGGGGTG GATGGGGCCGAATTATAGTATTTCCACCGCGTGCGCAACCTCGAACTTCTGCATCTTGAACGCGGCTAACCACA TTATCCGTGGTGAAGCAGACATGATGCTCTGCGGCGGCTCCGATGCGGTCATTATCCCTATCGGTTTGGGCGGC TTTGTTGCTTGCCGCGCCTTGAGCCAACGCAATAACGACCCAACCAAGGCATCGCGCCCGTGGGACAGCAATCG CGATGGCTTCGTCATGGGCGAGGGAGCCGGGGTGCTGCTGTTGGAGGAGCTGGAACACGCGAAAAAGCGAGGCG CGACAATCTATGCTGAGTTCTTGGGAGGGTCCTTTACATGCGATGCCTACCACATGACGGAGCCTCACCCAGAG GGCGCAGGCGTGATCTTGTGTATCGAGAAGGCAATGGCTCAGGCAGGAGTCTCTCGCGAGGATGTTAACTACAT TAATGCTCACGCAACGTCCACGCCGGCTGGTGACATCAAGGAATACCAAGCTCTCGCCCATTGTTTCGGCCAGA ACTCGGAGCTGCGGGTCAATAGTACAAAGTCCATGATCGGTCATCTGCTGGGTGCTGCCGGTGGCGTCGAAGCT GTGACAGTCATTCAAGCCATCCGCACCGGCTGGATTCACCCTAATCTGAACCTGGAAGACCCGGACAAGGCCGT TGACGCAAAATTCCTCGTCGGACCGGAGAAAGAAÇGTCTCAACGTTAAAG-TCGGATTGAGGAATAGTTTCGGTTTTGGTGGCCATAACTCTAGTATCCTGTTTGCACCCTATAATTGATAATAGATCTGATCCGCTGTTGACCCAACA GCATGAGTCGTTATCCAAGGGGAGCTTCGGCTCCCTTTTTTCATGCGCGGATGCGGTGA

SEQ ID N°:32

CCTGAGGTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGG AAACAGCGCCGCTGAGAAAAAGCGAAGCGGCACTGCTCTTTAACAATTTATCAGACAATCTGTGTGGGCACTCG ACCGGAATTATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGA ATAAACCATGGCCGTCGCACTGCAACCAGCTCAAGAAGTCGCAACTAAGAAAAAGCCTGCAATCAAACAGCGGC GCGTGGTGGTTACCGGCATGGGTGTGGTGACTCCCCTCGGGCATGAACCGGATGTGTTTTACAACAATCTCCTG GATGGCGTGAGCGGCATTAGTGAGATCGAGAATTTTGACTCGACGCAGTTTCCCACTCGCATTGCCGGCGAAAT CAAGAGTTTCAGCACCGACGGCTGGGTCGCGCCCAAATTGAGCAAACGGATGGATAAATTGATGCTGTATCTGC TCACCGCAGGCAAGAAAGCGCTGGCCGATGCGGGCATCACGGATGATGTGATGAAAGAGCTGGATAAACGCAAA TGTGGAGTTCTGATTGGCAGTGGCATGGGCGGCATGAAGCTGTTCTACGATGCGCTCGAAGCCCTGAAGATTTC GTATCGAAAGATGAACCCATTCTGTGTGCCTTTTGCGACCACGAATATGGGTAGCGCCATGCTGGCTATGGATT TGGGGTGGATGGGGCCGAATTATAGTATTTCCACCGCGTGCGCAACCTCGAACTTCTGCATCTTGAACGCGGCT AACCACATTATCCGTGGTGAAGCAGACATGATGCTCTGCGGCGGCTCCGATGCGGTCATTATCCCTATCGGTTT GGGCGGCTTTGTTGCTTGCCGCGCCTTGAGCCAACGCAATAACGACCCAACCAAGGCATCGCGCCCGTGGGACA GCAATCGCGATGGCTTCGTCATGGGCGAGGGAGCCGGGGTGCTGCTGTTGGAGGAGCTGGAACACGCGAAAAAG

CGAGGCGCGACAATCTATGCTGAGTTCTTGGGAGGGTCCTTTACATGCGATGCCTACCACATGACGGAGCCTCA

CCCAGAGGGCGCAGGCGTGATCTTGTGTATCGAGAAGGCAATGGCTCAGGCAGGAGTCTCTCGCGAGGATGTTA ACTACATTAATGCTCACGCAACGTCCACGCCGGCTGGTGACATCAAGGAATACCAAGCTCTCGCCCATTGTTTC GGCCAGAACTCGGAGCTGCGGGTCAATAGTACAAAGTCCATGATCGGTCATCTGCTGGGTGCTGCCGGTGGCGT CGAAGCTGTGACAGTCATTCAAGCCATCCGCACCGGCTGGATTCACCCTAATCTGAACCTGGAAGACCCGGACA AGGCCGTTGACGCAAAATTCCTCGTCGGACCGGAGAAAGAACGTCTCAACGTTAAAGTCGGATTGAGCAATAGT TTCGGTTTTGGTGGCCATAACTCTAGTATCCTGTTTGCACCCTATAATTGATAATAGATCCTGTCGTTAACTGC TTTGTTGGTACTACCTGACTTCACCCTCTTTTAAGATGGCAAGCCGTGTTGTTGGTAAAGGTTGTAAACTCGTT GGATGTGGTAGTGCCGTCCCGAAGTTGGAGGTGAGTAACGACGACCTCAGTAAGATCGTGGATACTTCCGATGA ATGGATTTCTGTTCGGACGGGAATCCGCAACCGGCGGGTGATTACTGGTAAGGATAAGATGACGGGGCTGGCGG TCGAGGCAGCCCAGAAAGCCCTGGAAATGGCTGAAGTCGATGCTGACGATGTGGACTTGCTCCTGTTGTGCACC TCCACCCCAGATGATCTCTTTGGAAGTGCGCCGCAAATCCAGGCGGCACTCGGCTGCAAAGGAAACCCTCTGGC ATTTGATATTACAGCCGCTTGTAGCGGCTTCGTTCTGGGTCTGGTGAGTGCTTCCTGCTATATCCGCGGCGGCG GGTTCAAGAACGTCCTGGTTATCGGCGCGGACGCACTGAGCCGCTACGTCGATTGGACTGACCGCGGCACATGC ATTCTCTTTGGTGACGCCGCTGGCGCTGTGTTGGTCCAGGCGTGTGAGAGCGAGGACGAGGGCGTGTTGGGGTT^_ TGATCTGCATAGCGATGGAGAGGGTTATCGCCACCTGCATACTGGGATCAAGGCGAACGAGGAGTTCGGGACGA ACGGTTCCGTTGTGGATTTTCCGCCCAAGCGCAGCAGCTACTCTTCCATCCAAATGAATGGGAAAGAAGTGTTC CGTTTCGCCTGCCGCGTCGTGCCCCAGTCTATTGAGATCGCACTCGAGAACGCGGGCCTCACACGTTCTAGCAT TGATTGGCTGCTGCTCCACCAAGCAAACCAACGAATCTTGGATGCCGTCGCAACGCGTCTGGAAATTCCCGCAG ACCGCGTGATTAGTAACTTGGCTAATTACGGCAATACTTCTGCCGCCAGCATTCCGTTGGCACTGGATGAAGCC GTGCGCAGCGGTAAGGTCAAACCCGGTCAGACTATCGCAACTTCGGGGTTTGGAGCAGGCTTGACATGGGGCAG CGCGATCATTCGCTGGAATTAATGATAGATCTGATCCGCTGTTGACCCAACAGCATGAGTCGTTATCCAAGGGG AGCTTCGGCTCCCTTTTTTCATGCGCGGATGCGG

SEQ ID N°:33 GTACGGGATCCCTGTCGTTAACTGCTTTGTTGGTACTACCTGACTTCACCCTCTTTTAAGATGGCAAGCCGTGT TGTTGGTAAAGGTTG

SEQ ID N°:34 CACGTGAGCTCTCACCGCATCCGCGCATG

SEQ ID N°:35 TCATGAAGTTCCTTGTCGTCGCCGTCTCAGCACTTGCAACTGCATCTGCTTTCACAACCAGTCCTGCCTCTTTC ACCACTGTCAGCAGTCCTTCGGTGAACAATGTGTTCGGACAGGAGGGAAATGCTCACAGGAACAGGAGAGCTAC CATTGTCATGGATGGAGCTAACGGAAGTGCAGTCAGTTTGAAAAGTGGGTCATTGAATACGCAGGAGGACACAA GTTCGTCGCCACCGCCCCGTACATTCCTTCACCAACTCCCTGATTGGAGCAGATTGCTCACTGCCATCACAACC

GTTTTTGTTAAAAGTAAGCGTCCGGATATGCATGATCGTAAGTCGAAAAGGCCGGACATGCTCGTGGATAGTTT

CGGGTTGGAGAGTACCGTTCAGGATGGACTCGTGTTCCGTCAAAGCTTTTCGATCCGTTCATATGAGATTGGAA

CTGATCGTACGGCTTCCATTGAGACTTTGATGAACCATCTTCAGGAGACTTCCCTCAACCATTGTAAGAGTACA

GGAATTTTGTTGGATGGATTCGGACGCACACTCGAAATGTGTAAGCGCGATTTGATTTGGGTCGTCATTAAAAT

GCAGATCAAGGTTAATAGATACCCGGCCTGGGGCGATACAGTAGAAATCAATACTAGGTTCAGCAGACTTGGTA

AGATCGGCATGGGTCGAGATTGGCTCATTAGCGACTGCAATACCGGTGAGATCCTCGTCAGGGCAACCAGCGCC TACGCCATGATGAATCAGAAGACCCGAAGACTCTCGAAGCTTCCGTACGAGGTCCACCAAGAGATTGTCCCCCT TTTTGTCGACTCCCCCGTAATTGAAGATTCGGATCTCAAGGTCCACAAATTCAAAGTTAAAACGGGTGACAGCA TCCAGAAGGGACTTACTCCTGGTTGGAACGACCTCGATGTGAACCAACATGTTTCGAACGTGAAATATATCGGC TGGATTCTTGAGAGTATGCCAACCGAGGTACTTGAGACGCAGGAATTGTGCTCGTTGGCATTGGAGTATCGTCG TGAGTGTGGGCGAGACTCAGTCCTCGAAAGTGTAACAGCAATGGACCCAAGCAAAGTTGGTGTTCGTTCACAGT ATCAACACCTCCTCCGTCTCGAGGATGGAACAGCCATTGTGAACGGGGCCACAGAGTGGAGGCCAAAGAACGCT GGCGCTAACGGAGCTATCTCCACAGGAAAGACCAGCAATGGTAACTCTGTGAGTTAATGATAGGATCC

SEQ ID N°:36

MKFLWAVSALATASAFTTSPASFTTVSSPSyNNVFGQEGNAHRNRRATIVMDGANGSAV-SL·KSGStNTQEDTS

SSPPPRTFLHQLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGT DRTASIETLMNHLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTLEMCKRDLIWWIKMQIKVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGK IGMGRDWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSI QKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQY QHLLRLEDGTAIVNGATEWRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID N°:37 CAGGATCCGGGGAGGTGTGGTGTAGT

SEQ ID N°:38 TAGGATCCAGTGGTGCCCATGGTACTTTGTTAGGGGAGGATAG

SEQ ID N°:39 CAGGATCCTCACTCTGTCGCGCTGTTG

SEQ ID N°:40 CATCTAGAGAGGATTGATTTCCGAGTC

SEQ ID NO:41

ATGGGCACCACTCTCGACGACACGGCTTACCGCTACCGCACCAGTGTGCCGGGGGACGCCGAGGCCATCGAGGC ACTGGATGGGTCCTTCACCACCGACACCGTCTTCCGCGTCACCGCCACCGGGGACGGCTTCACCCTGCGGGAGG TGCCGGTGGACCCGCCCCTGACCAAGGTGTTCCCCGACGACGAGTCGGACGACGAGTCGGACGACGGGGAGGAC GGCGACCCGGACTCCCGGACGTTCGTCGCGTACGGGGACGACGGCGACCTGGCGGGCTTCGTGGTCGTCTCGTA CTCCGGCTGGAACCGCCGGCTGACCGTCGAGGACATCGAGGTCGCCCCGGAGCACCGGGGGCACGGGGTCGGGC GCGCGCTGATGGGGCTCGCGACGGAGTTCGCCCGCGAGCGGGGTGCCGGGCACCTCTGGCTGGAGGTCACCAAC GTCAACGCACCGGCGATCCACGCGTACCGGCGGATGGGGTTCACCCTCTGCGGCCTGGACACCGCCCTGTACGA

CGGCACCGCCTCGGACGGCGAGCAGGCGCTCTACATGTCCATGCCCTGCCCCTAA

SEQ ID N°:42

CCATGGCCGCTATGCTCGCCTCTAAGCAGGGCGCCTTCATGGGCCGCAGCTCCTTTGCCCCCGCCCCCAAGGGC GTCGCCAGCCGCGGCTCCCTGCAGGTGGTGGCCGGCGCCAACGGCAGCGCGGTGAGCCTGAAGTCGGGTTCCCT CAACACTCAGGAGGACACCTCGTCCTCGCCCCCGCCGCGCACGTTCCTGCACCAGCTGCCGGACTGGTCCCGCC TGCTGACGGCTATTACGACCGTGTTCGTGAAGTCGAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGAGCAAGCGGCCT GATATGCTGGTGGACAGCTTTGGCCTGGAGTCCACGGTGCAGGACGGCCTCGTGTTCCGGCAAAGCTTCAGCAT CCGCAGCTACGAGATCGGCACGGACCGCACCGCGTCGATCGAGACGCTCATGAACCACCTCCAGGAGACGTCGC TCAACCACTGCAAGTCCACCGGTATCCTGCTGGACGGCTTTGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGGGATCTG ATCTGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTATCCCGCCTGGGGTGACACCGTCGAGATTAACAC CCGCTTCTCGCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGGCGCGACTGGCTGATCTCGGACTGCAACACTGGCGAGATCC TGGTCCGGGCCACGTCGGCCTACGCCATGATGAACCAGAAGACTCGGCGGCTGAGCAAGCTGCCTTACGAGGTG CATCAGGAGATCGTGCCGCTCTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACAGCGATCTGAAGGTGCACAAGTTCAA GGTCAAGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACTCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTCT CGAACGTGAAGTACATCGGCTGGATTCTGGAGTCGATGCCCACC-GAGGTGCTGGAGAGGGAGGAGCTGTGCTCC CTGGCGCTGGAGTATCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGTCCGTCACCGCGATGGACCCGTCGAA GGTGGGTGTCCGCAGCCAGTACCAACACCTGCTGCGCCTCGAGGACGGCACCGCCATTGTGAACGGCGCGACGG AGTGGCGGCCGAAGAACGCGGGCGCTAACGGCGCCATCTCCACGGGCAAGACCTCCAACGGCAACTCGGTGAGC TAATGATAGGATCC

SEQ ID N°:43

MAAMLASKQGAFMGRSSFAPAPKGVASRGSLQWAGANGSAVSLKSGSLNTQEDTSSSPPPRTFLHQLPDWSRL LTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSL NHCKSTGILLDGFGRTLEMCKRDLIWWIKMQIKVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDCNTGEIL VRATSAYAMMNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVS NVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIVNGATE WRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS

SEQ ID N°:44 GGTGGAAAATGCCTATGTGTTAACG

SEQ ID N°:45

CGTAGGCAGTGTGCAACCAGGAGCC

SEQ ID N°:46

GGTGGAAAATGCCTATGTGTTAACGGATCTACAAACCAGCACCAAACTCTATTACGAACCCCACGGTTTCCACT CTCCCCAACTGCAAGACTTGGGGCCCATTGATGTGGTTTTAACCCCCGTCATTGGCATCAATATCCTCGGATTC

CTGCCGGTGCTCAATGGCCAGAAAACCACCCTGGAGCTTTGTCGCACTGTCCATCCCCAGGCGATCGTCCCCAC

CTCTGGAGCCGCAGAATTGAACTATAGCGGTTTACTAACTAAAGTTTTACGTTTAGACGGCGATCTCAGTCAAT TTCGCCAGTCCCTAATTGACGAAGGGATACAAGCTTCCCTATGGGAACCCCAGGTGGGAGTGCCCCTCAATGTG CCCCAATCCACCGTTGGCTAGGTTGGAATGTTCAAATCACTGTGCGGTGTGATGCTTGATAAATACAGTGAGCC AGGGAAAACTGCAAAAAAGTGTATAAAGTAGGTTTAACTTGAATCAAAATCCTTTCTCCGCAGTCATAGCCAGG AGTAGGAAGATTACCAGCGAAGCAAGTTGTCTTCCCCTAGCTTTGGGCGGGCAAACCCCTTGCAGTATTGCCAA CGTCAAAAAATCACCATAGCCGAATGACCTACACCATCAACGCTGACCAAGTCCATCAGATTGTCCATAATCTT CACCACGATCCCTTTGAAGTGTTGGGCTGCCATCCCCTCGGAGCTTTATGCTTGTAAACCGTTTTGTGAAAAAA TTTTTAAAATAAAAAAGGGGACCTCTAGGGTCCCCAATTAATTAGTAATATAATCTATTAAAGGTCATTCAAAA GGTCATCCACCGGATCAGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAGATTTTAATGCGGATGTTGCGATTACTTCGCCAACTA TTGCGATAACAAGAAAAAGCCAGCCTTTCATGATATATCTCCCAATTTGTGTAGGGCTTATTATGCACGCTTAA AAATAATAAAAGCAGACTTGACCTGATAGTTTGGCTGTGAGCAATTATGTGCTTAGTGCATCTAACGCTTGAGT TAAGCCGCGCCGCGAAGCGGCGTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCG CCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATA AGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCC_GG_CAGG-CGCT-CCATTGGCGAGTeGGCAG€GACAT CCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCG CCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAAC CGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAG CCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGC AGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAG AATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAA GCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTAC AAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATAC TTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATGATGTTTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGC TGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGACCGAGGCATAGACTG TACCCCAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGG TTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGCTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCCACTGG GTTCGTGCCTTCATCCGTTTCCACGGTGTGCGTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCT GTCCTGGCTGGCGAACGAGCGCAAGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCT ACGGCAAGGTGCTGTGCACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGAAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCG GTGGTGCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGTTCGCCCAGCT TCTGTATGGAACGGGCATGCGGATCAGTGAGGGTTTGCAACTGCGGGTCAAGGATCTGGATTTCGATCACGGCA

CGATCATCGTGCGGGAGGGCAAGGGCTCCAAGGATCGGGCCTGGCACCCAGCCTGCGCGAGCAGGGGAATTGAT

CCGGTGGATGACCTTTTGAATGACCTTTAATAGATTATATTACTAATTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTT

TTTATTTTAAAAATTTTTTCACAAAACGGTTTACAAGCATAAAGCTTCGGGGACCACGGCAAGGTCAATCAATG

GGTCATTCGTGCCTATTTACCCACGGCTGAAGCGGTAACGGTGTTGCTTCCCACCGATCGCCGGGAAGTGATTA

TGACCACGGTCCACCATCCCAACTTTTTTGAATGCGTGTTGGAGTTGGAAGAACCGAAGAATTATCAATTAAGA

ATTACCGAAAATGGCCACGAAAGGGTAATTTATGACCCCTATGGTTTTAAAACTCCCAAACTGACGGATTTTGA

CCTCCATGTGTTTGGGGAAGGCAACCACCACCGTATTTACGAAAAACTCGGTGCTCACCTGATGACGGTGGATG

GAGTTAAAGGGGTTTATTTTGCTGTGTGGGCCCCCAATGCCCGCAACGTTTCCATTTTGGGGGATTTCAACAAC

TGGGACGGCAGATTGCACCAAATGCGGAAACGCAACAACATGGTGTGGGAATTATTTATCCCTGAGTTGGGGGT

GGGCACTTCTTATAAGTATGAGATTAAAAACTGGGAAGGGCACATCTACGAAAAGACTGACCCCTACGGTTTTT

ACCAAGAAGTACGCCCCAAAACCGCTTCCATTGTGGCAGACTTGGACGGTTACCAATGGCACGACGAAGATTGG

TTGGAAGCTAGGCGCACCAGCGATCCCCTGAGCAAACCCGTTTCCGTTTACGAACTCCATTTAGGCTCCTGGTT

GCACACTGCCTACG

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Cultura celular compreendendo uma cianobactéria recombinante da espécie Synechococcus elongatus, caracterizada pelo fato de que a dita cianobactéria compreende uma molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 que codifica uma acil-ACP FatB tioesterase exógena de planta de SEQ ID NO: 8, em que a dita acil-ACP FatB tioesterase de planta libera um ou mais ácidos graxos que contém uma cadeia acila que contém de 8 a 16 carbonos de acil-ACP, e em que o meio de cultura fornece carbono inorgânico como substancialmente a única fonte de carbono e em que a dita cianobactéria secreta o ácido graxo liberado de acilACP pela atividade da acil-ACP tioesterase no meio de cultura.
2. 2. Cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a acil-ACP FatB tioesterase exógena de planta tem uma preferência de substrato para cadeias de acila contendo 8 e/ou 10 carbonos.
3. 3. Cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a acil-ACP FatB tioesterase exógena de planta é derivada do gênero Cuphea.
4. 4. Cultura de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a acil-ACP FatB tioesterase exógena de planta é ChFatB2.
5. 5. Método para converter carbono inorgânico em ácidos graxos, caracterizado pelo fato de que compreende:

   incubação da cultura como definida na reivindicação 1; e recuperação dos ácidos graxos secretados no meio de cultura.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos são recuperados da cultura pelo contato do meio com adsorventes particulados compreendendo partículas lipofílicas ou resinas de troca iônica.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os adsorventes particulados circulam no meio.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo

   Petição 870180144370, de 25/10/2018, pág. 7/14 fato de que os absorventes particulados são contidos em uma coluna em leito fixo.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o meio é recirculado para a cultura.