BRPI0811404A2 - composição para produção de corpo de planta com teor de açucar melhorado conjunto para produzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado e corpo de planta - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO PARA PRODUÇÃO DE CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚCAR MELHORADO, CONJUNTO PARA PRODUZIR UM CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚCAR MELHORADO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚCAR MELHORADO E CORPO DE PLANTA A composição para produzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado, de acordo com a presente invenção, inclui glutationa, um polinucleotídeo que codifica y-glutamilcisteína sintetase, ou um polinucleotídeo que codifica frutose-1,6-bisfosfato aldolase tipo plasmídeo de ligação de glutationa; dita composição inclui, de preferência, glutationa oxidada, tal que isso permite o fornecimento de uma composição para produzir facilmente um corpo de planta com teor de açúcar melhorado.

Description

mt -} 1 / 32

C "COMPOSIÇÃO PARA PRODUÇÃO DE CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚCAR MELHORADO, CONJUNTO PARA PRODUZIR UM CORPO DE PLAN- TA COM TEOR DE AÇÚCAR MELHORADO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM

CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚCAR MELHORADO E CORPO DE 5 PLANTA" Campo Técnico A presente invenção se refere a uma composição, incluindo uma subs- tância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula, a qual é usada para produzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado. A presente invenção tam- lO bém se refere ao uso da composição. Histórico da Técnica Anterior Uma planta, tal como fruta, legume e cereal, geralmente inclui açúcar. A quantidade de açúcar na planta é representada por um teor de açúcar. O teor de açú- car influencia o valor comercial da planta dependendo do tipo de planta. Portanto, 15 recentemente, vêm sendo realizados desenvolvimentos técnicos para aumentar o teor de açúcar das plantas.

Por exemplo, tomates com alto teor de açúcar são produzidos princi- palmente por cultura no solo. Além disso, foi sugerida uma técnica para produzir to- mates com alto teor de açúcar por cultura de solução com nutrientes (Literatura de âo Patente 1 ).

t É sabido que uma substância para regular o estado de oxidação-redução "? m de uma célula, por exemplo, a glutationa, pode funcionar como agente de controle de diferenciação para uma célula ou um órgão (Literatura de Patente 2). Além disso, é conhecido que a glutationa pode fúncionar como agente auxiliar de controle de cres- cimento da planta (Literatura de Patente 3).

Lista de Documentos Citados Literatura de Patente I Publicação do Pedido de Patente Japonês, Tokukaihei, N°" 10-271924 (Data da Publicação: 13.10.98) Literatura de Patente 2 Publicação Internacional WO 01/08063 8 (Data de Publicação: 01.11.01) Literatura de Patente 3 Publicação do Pedido de Patente Japonês, Tokukai, N°' 2004-352679 A m h 2 / 32 (Data da Publicação: 16 de dezembro de 2004) Sumário da Invenção Contudo, falta simplicidade à técnica convencional para melhorar o teor de açúcar de uma planta. Aqueles que podem produzir tomates com alto teor de açúcar 5 por cultura no solo ficam limitados a alguns especialistas. Além disso, a produção de tomates com alto teor de açúcar por cultura de solução com nutrientes exige uma téc- nica especializada e aparelho de produção especializado para o controle do cultivo. A presente invenção foi realizada tendo em vista essas circunstâncias, e é um objetivo da presente invenção prover uma composição para produzir facilmente 10 uma planta com teor de açúcar melhorado e prover uma técnica que utiliza a composi- ção. A fím de atingir o objetivo, os inventores da presente invenção realiza- ram estudos minuciosos. Como consequência, verificaram que o teor de açúcar de um corpo de planta foi melhorado em um caso em que o corpo da planta foi cultivado em 15 meio de cultura (o qual inclui solo e um agente de fertilização do solo) ao qual foi acrescentada uma substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula, ou em um caso em que o corpo da planta foi pulverizado ou coberto diretamente com a substância. A presente invenção foi realizada com base nessa descoberta totalmente nova e inclui as seguintes invenções. "P ?20 A composição de acordo com a presente invenção é uma composição r -, . para produzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado, a composição inclu- indo uma substância (excluindo peróxido de hidrogênio) para. regular o estado de oxi- . , dação-redução de uma célula. A composição de acordo com a presente invenção é prepa- 25 rada de preferência de modo que a substãncia seja a glutationa, um polinucleotideo que codifica Y-glutamilcisteína sintetase, ou um poli- nucleotídeo que codifica frutose-l,6-bisfosfato aldolase tipo plastídeo de ligação de glutationa.

A composição de acordo com a presente invenção é preparada de prefe- 30 rência de modo que a substância seja a glutationa oxidada. O conjunto, kit, de acordo com a presente invenção é um kit para pro- duzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado, o kit incluindo uma substân- cia (excluindo peróxido de hidrogênio) para regular o estado de oxidação-redução de

H b 3 / 32 uma célula. O método de produção de acordo com a presente invenção é um método para produzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado, o método incluindo a etapa de cultivar o corpo da planta usando uma substância (excluindo peróxido de 5 hidrogênio) para regular o estado de oxidação-redução de uma célula. A presente invenção também inclui um corpo de planta obtido pelo mé- todo de produção de acordo com a presente invenção. objetivos, características e pontos fortes adicionais da presente inven- ção serão esclarecidos pela descrição abaixo. Além disso, as vantagens da presente 10 invenção ficarão evidentes a partir da seguinte explicação com referência aos dese- nhos. Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 ilustra um resultado de determinação do teor de açúcar do huto Lycopersicum esculentum obtido no Exemplo 2.

15 A Figura 2 ilustra um resultado de análise ANOVA sobre o resultado da deterIninação do teor de açúcar ilustrado na Figura 1. A Figura 3 é uma vista que ilustra o resultado da determinação de relação entre o teor de açúcar e o número de dias a contar do dia do tratamento com GSSG ou GSH. -F.

àO A Figura 4 ilustra um resultado da determinação de amido e glicose de 35S- ,' r" GSHl.

P A Figura 5 ilustra um resultado da determinação do teor de açúcar do fruto Prunus avium obtido no Exemplo 8. A Figura 6 ilustra um resultado da deterininação do teor de açúcar do fruto 25 Citrus unshiu obtido no Exemplo 9. A Figura 7 ilustra um resultado da determinação do teor de açúcar do fruto Fragaria ananassa obtido no Exemplo 10. A Figura 8 ilustra um resultado da determinação do teor de açúcar do fruto Zea mays L. var. saccharata Sturt obtido no Exemplo 11. 30 A Figura 9 é uma vista que ilustra uma árvore da família genética dos genes deSEQIDNO: 15 até36. Descrição de Modos de Realização <1. Composição, de acordo com a presente invenção, para produzir corpo de

~ ) 4 / 32 planta com teor de açúcar melhorado> Uma composição, de acordo com a presente invenção, para produzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado (doravante denominada "composição de acordo com a presente invenção") tem apenas que incluir uma substância para re- 5 gular o estado de oxidação-redução de uma célula. Usando a composição de acordo com a presente invenção, torna-se pos- sível produzir facilmente um corpo de planta com teor de açúcar melhorado. Por e- xemplo, o corpo de planta pode ser produzido em um meio de cultura que inclui a composição de acordo com a presente invenção. Além disso, em um caso em que a lO substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula é um polinucleo- tídeo, confome descrito posteriormente, o cjue é necessário fazer é apenas introduzir o polinucleotídeo em uma planta, por meio de uma técnica de transformação conven- cional e então cultivar a planta. Isso torna possível obter a planta com um teor de açú- car melhorado de uma maneira extremamente simples em comparação à técnica con- 15 veneional, como por exemplo, a cultura de solo descrita acima. Isso porque não são necessárias habilidades, técnicas especializadas, aparelhos de produção especializa- dos, ou similares para esse caso.

Na presente invenção, a substância para regular o estado de oxidação- redução de uma célula é usada com a finalidade de produzir uma planta com teor de "& 'àO açúcar melhorado. Essa utilização da substância é nova e totalmente diferente da utili- . fC " ,, zação convencional da substância. Esse efeito de poder obter a planta com um teor de açúcar melhorado não poderia ser esperado da utilização convencional. Portanto, a - , presente invenção é realizada com base em uma descoberta totalmente nova feita pe- los inventores da presente invenção- 25 No presente relatório, o "corpo de planta com teor de açúcar melhora- do" é um corpo de planta que possui um teor de açúcar melhor que uma cepa natural do corpo da planta. Em outras palavras, o "corpo da planta com um teor de açúcar melhorado" possui um teor de açúcar maios elevado que a cepa natural. Em outras palavras, a composição de acordo com a presente invenção é uma composição usada 30 na produção de um corpo de planta com teor de açúcar maior que uma cepa natural. Por exemplo, cultivando um corpo de pjanta usando a composição de acordo com a presente invenção, é possível melhorar o teor de açúcar do corpo de planta, em com- paração a um caso de cultivo de corpo de planta sem a composição de acordo com a

+.

Íl 5 / 32 presente invenção. É possível determinar o teor de açúcar por um método convencio- nal. Também é possível determinar o teor de açúcar usando um reflatômetro brix con- vencional, conforme descrito nos Exemplos. No presente relatório, a "substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula" é uma substância que regula a 5 oxidação/redução de uma substância que é responsável pela oxidação-redução da célu- la. A substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula inclui subs- tâncias que modificam os valores, por exemplo, da frequência de ocorrência de oxigê- nio ativo, um valor absoluto de glutationa, uma relação entre a glutationa reduzida e a glutationa oxidada, um valor absojuto de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato 10 (NDA(P)H) reduzido, uma relação de NADPH/NADP+, uma relação de citocromo oxidado c para citocromo reduzido c e uma relação entre oxidação e redução de um componente da cadeia de transferência de elétrons, por exemplo, plastoquinona e ubi- quinona. A substância responsável pela oxidação-redução de uma célula é conhecida na técnica, mas não está limitada àquelas conhecidas no estado da técnica. As subs- 15 tâncias que modificam os valores podem, por exemplo, ser uma substância que afeta a síntese de glutationa ou uma quantidade de glutationa, uma substância que promove ou inibe a síntese de oxigênio ativo e uma substância que promove ou inibe a altera- ção de um certo composto em forma oxidada ou em forma reduzida. A substância incluída na composição de acordo com a presente inven- .,Zo ção para regular o estado de oxidação-redução de uma célula não está limitada, desde ., : que esteja incluída no significado acima mencionado. Contudo, é preferível que a substância influencie a síntese de glutationa ou uma quantidade de glutationa. Essa

W , substância torna possível a obtenção de uma planta com um teor de açúcar mais ele- vado.

25 No presente relatório, a "substância que afeta a síntese de glutationa ou uma quantidade de glutationa" é uma substância que modifica uma quantidade de glu- tationa em uma célula e é, de preferência, uma substância que aumenta a glutationa, como por exemplo, a própria glutationa, uma enzima para síntese de glutationa e um polinucleotídeo que codifica a enzima.

30 A substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula pode ser classificada em (i) uma substância que pode ser absorvida por uma planta em contato com a planta e (ii) uma substância que é introduzida no genoma da planta. Será compreendido que essas substâncias podem ser usadas isoladamente ou em com-

»j l) 6 / 32 binação.

A substância que influencia a sintese de glutationa ou uma quantidade de glutationa e pode ser absorvida por uma planta pelo contato com a. planta pode ser, por exemplo, glutationa, glutationa conjugada, oxigênio ativo (peróxido de hidrogê- S nio, por exemplo), nitrogênio ativo, poliamina, titânio oxidado, ácido jasmônico, áci- do salicílico, cisteína, cistina, metal pesado de cádmio, ou íon de ferro.

A poliamina pode gerar peróxido de hidrogênio.

O titânio oxidado gera oxigênio ativo em resposta à luz.

Cisteína e cistina são precursoras da glutationa.

Com relação ao metal pesado de cádmio e íon de ferro, prefere-se a aplicação excessiva.

Dentre as substâncias exem- lo plificadas acima, a glutationa é a mais preferida a usar.

Glutationa inclui glutationa reduzida (doravante denominada "GSH") e glutationa oxidada (doravante denominada "GSSG"). A GSSG é preferível como glutationa para ser incluída na composição de acordo com a presente invenção.

Conforme descrito posteriormente nos Exemplos, o uso de GSSG torna possível a obtenção de uma planta com teor de açúcar mais eleva- 15 do.

Além disso, o uso de GSSG possibilita aumentar o número e o tamanho dos hutos.

A substância que influencia a sintese de glutationa ou a quantidade de glutationa e é introduzida no genoma de uma planta po- de ser, de preferência, por exemplo, Y-glutamilcisteína sintetase, um polinucleotídeo que codifica a Y-glutamilcisteína sintetase (doravante -è 120 denominado "gene GSH 1"), frutose-1,6-bisfosfato aldolase tipo plasti-

-., " deo de ligação de glutationa, ou um polinucleotídeo que codifica a fru- ., tose- 1,6-bisfosfato aldolase tipo plastídeo de ligação de glutationa (do- . , ravante denominado "gene FBA"). Exemplos concretos do gene GSHl não se limitam panicularmente, mas 25 incluem genes, por exemplo, de Zinnia elegans (Genbank accession: AB158510), Oryza sativa (Genbank accession: AJ508915) e Nicotiana tabacum (Genbank acees- sion: DQ444219). Os genes dessas plantas também podem ser usados adequadamente na presente invenção.

Cada produto de tradução desses genes possui um peptídeo si- nal de trânsito de cloroplasto na sua região terminal N, como Arabidopsis thaliana. 30 A esse respeito, contudo, os seguintes exemplos de (a) até (d) são usa- dos de preferência como gene GSHl na presente invenção: (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 3;

+,

[) 7 / 32

(b) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui uma atividade de Y-glutamilcisteina sintetase e possui uma sequência de aminoácidos com deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 3; 5 (C) um polinucleotídeo que possui a sequência de base de SEQ ID NO: 2 ou 4; e (d) um polinucleotídeo que hibridiza sob condição severa com um polinucleo- tídeo que possui uma sequência de base complementar a qualquer um dos polinucleo- tídeos dos exemplos de (a) a (C). lO Observe que a sequência de SEQ ID NO: 2 é um exemplo de uma se- quência de base que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Observe também que a sequência de SEQ ID NO: 4 é um exemplo de uma sequência de base que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. 15 O gene FBA não está particularmente limitado, mas, de preferência, po- dem ser os seguintes exeniplos (e) a (h): (a) um polinueleotídeo que codifica uma proteína que possui a sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NO: 5, 6 e 15 a 36; (D "um polinucleotídeo que codifica uma proteína que possui uma atividade de "S-

"ào frutose-1,6-bisfosfato aldolase tipo plastídeo de ligação de glutationa e possui uma

.. " sequência de aminoácidos com deleção, substituição ou adição de um ou vários ami- - D noácidos na sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NO: 5, 6 e 15 a 36;

, (C) um polinucleotídeo que possui as sequências de base de SEQ ID NO: 7 e 37 a 56; e 25 (d) um polinucleotídeo que hibridiza em condição severa com um polinucleotí- deo que possui uma sequência de base complementar a qualquer um dos polinucleotí- deos dos exemplos de (e) a (g)· A sequência de SEQ ID NO: 8 mostra uma sequência cDNA de uma proteína que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Na sequência de 30 base de SEQ ID NO: 8, a sequência da posição 145 para a posição 147 é um códon de início e a sequência da posição 13 18 para a posição 1320 é um códon de parada.

Em outras palavras, um gene FBA 1 de Arabidopsis thaliana possui a sequência a partir da posição 145 para a posição 1320 da sequência de base de SEQ ID NO: 8 como uma

W

\) 8 / 32 estrutura de leitura aberta (ORF). A sequência de SEQ ID NO: 9 mostra um exemplo de uma sequência de base que codifica uma proteína que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Na sequência de SEQ ID NO: 9, a sequência a partir da posição 104 para a 5 posição 1300 é uma região que codifica a proteína que possui a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 6. Observe que um peptídeo constituído por aminoácidos entre metionina na posição 1 e alanina na posição 48 da sequência de SEQ ID NO: 6 é um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

A sequência de base de SEQ ID NO: 7 é uma sequência de base que lO serve como uma ORF no gene FBAI de Arabidopsis thaliana.

A sequência de base do gene Arabidopsis thaliana FBAI é homóloga, por exemplo, ao gene (dbj|BAB55475.1) encontrado no genoma de Oryza sativa.

As sequências de SEQ ID NO: 37 a 56 são exemplos de sequências de DNA que codificam as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 a 34, respecti- lS vamente.

Para referência, a Figura 9 mostra um dendrograma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 até 36. Técnicos no assunto podem entender facihnente que, no caso em que as sequências de aminoácidos acima mencionadas ou sequências de DNA incluem uma e—

"20 região correspondente ao cloroplasto sinal de trânsito, a região pode ser substituída r

-: . por um cloroplasto sinal de trânsito de outra proteina.

As palavras "deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoáci- dos" aqui possuem o significado de deleção, substituição ou adição de tal número de aminoácido(s) (de preferência 10 ou menos, mais preferivelmente 7 ou menos, ainda

25 mais preferivehnente 5 ou menos) que pode ser deletado, substituído ou adicionado por meio de um método conhecido para produzir um peptídeo mutante, tal como um método de indução de mutação específíca do local.

Essa proteína mutante não está limitada a uma proteína que é artificialmente modificada por um método conhecido para produzir um polipeptídeo mutante, mas pode ser uma proteína naturalmente exis- 30 tente isolada e purificada.

É bem conhecido no estado da técnica que alguns aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína podem ser facilmente alterados sem afetar de forma significativa a estrutura ou a função da proteína.

Também é conhecido no

P

(Y 9 / 32 estado da técnica que uma proteína possui um mutante qye existe naturalmente e que não modifica de modo significativo a estrutura ou a função da proteína, além da prote- ína artificialmente modificada.

De preferência, o mutante deve incluir substituição, deleção, ou adição 5 conservadora ou não conservadora de aminoácidos.

A esse respeito, a maior preferên- cia é pela substituição, adição e deleção silenciosas e a substituição conservadora é especialmente preferida.

Essas mutações não alteram a atividade do polipeptídeo de acordo com a presente invenção.

Consideram-se exemplos representativos da substituição conservadora: lO a substituição de um aminoácido por outro dentre os aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; a troca de resíduos de hidroxila Ser e Thr; a troca de resíduos de ácido Asp e Glu; a substituição entre resíduos de amida Asn e Gln; a troca de resíduos básicos Lys e Arg; e a substituição entre resíduos aromáticos Phe e Tyr.

A "condição severa" no presente relatório significa aquela condição na 15 qual as sequências hibridizam-se entre si apenas quando as sequências tiverem pelo menos 90°4 de identidade, de preferêneia pelo menos 95°4 de identidade e, mais pre- ferivelmente, 97°/o de identidade.

Especificamente, a "condição severa" inclui, por exemplo, incubação noturna a 42°C em uma solução de hibridização (50°4 de forma- mida, 5 x SSC (15mM de citrato trissódico e 150mM de NaCl), 50mM de fosfato de "'20 sódio (pH7,6), 5 x solução de Denhardt, iO°/o de sulfato de dextran e 20ig/ml de DNA

" ,¢ " de esperma de salmão desnaturado fragmentado DNA) e lavagem de um filtro em 0,1 xSSC a aproximadamente 65°C.

A hibridização pode ser realizada por um método conhecido, tal como o método descrito em Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3" Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Geralmente, 25 quanto maior a temperatura e menor a concentração de sal, maior a severidade (a hi- bridização se torna mais dificil de ocorrer). A maior severidade possibilita obter um polinucleotídeo com maior homologia.

Em um caso em que a composição de acordo com a presente invenção inclui um polinucleotídeo dentre os polinucleotídeos acima mencionados, a composi- 30 ção de acordo com a presente invenção pode incluir um vetor de expressão incjuindo o polinucleotídeo.

O vetor de expressão pode ser construído por um método conheeido, sendo que o método de construção não está particularmente limitado.

É possível usar vários vetores conhecidos como base do vetor de ex-

b ,§ 10 / 32 pressão. Por exemplo, um plasmídeo, um fago, um cosmídeo, ou similar, pode ser u- sado e selecionado como apropriado de acordo com um método de introdução ou célu- la da planta na qual é introduzido o vetor de expressão. Especificamente, pode ser usado um vetor pBR322, um vetor pBR325, um vetor pUCl9, um vetor pUCl19, um 5 vetor pBluescript, um vetor pBluescriptSK, um vetor pBI ou similar, por exemplo. Em particujar, é preferivej usar um vetor binário pBI no caso de a composição de acordo com a presente invenção ser usada na introdução de um vetor que inclui um polinu- cleotídeo em um corpo de planta por rneio do método Agrobacterium. Especificamen- te, o vetor binário pBI pode ser pBIG, pBIN19, pBIIOI, pBI12 1, pBI221, ou similar, 10 por exemplo. No vetor de expressão, um promotor não está particularmente limitado desde que seja capaz de expressar um gene no corpo da planta, podendo ser adequa- damente usado um promotor conhecido. O promotor pode, por exemplo, ser um pro- motor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV35S), um promotor de actina, um 15 promotor de sintetase de nopalina, um promotor do gene PRla do tabaeo, um pequeno promotor de subunidade de ribulose-l,5-bisfosfato carboxilase/oxidase do tomate, ou similar. Dentre esses promotores, o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor ou o promotor de actina pode ser usado de preferência. O vetor de expressão com cada um dos promotores pode expressar firmemente um gene dado quando introduzido na "20 célula de uma planta.

O promotor somente tem que ser introduzido no vetor de modo a ser co- -. r-

B nectado para que um gene que codifica um fator de transcrição possa ser expresso. O

P , promotor não está particularmente limitado a uma estrutura específica como o vetor de expressão.

25 O vetor de expressão pode ainda incluir um segmento de DNA além do promotor e do polinucleotídeo. O segmento de DNA não está particularmente limitado e pode ser um terminador, um marcador de seleção, um enhancer ou acentuador, uma sequência de base para aumentar a eficiência da tradução e similar. Além disso, o ve- tor de expressão pode incluir uma região T-DNA. A região T-DNA pode aumentar a 30 eficiência da introdução do gene panicularmente no caso em que o vetor de expressão é introduzido no corpo de uma planta por meio de Agrobacterium. O terminador não está particularmente limitado, desde que tenha a fun- ção de local de terminação de transcrição e pode ser um terminador conhecido. Espe-

V., W

F 11 / 32 cificamente, é possível usar de preferência um local de terminação de transcrição de um gene de nopalina sintetase (terminador Nos), um local de terminação de transcri- ção de um vírus do mosaico da couve-flor 35S (terminador CahíV35S), ou similar, por exemplo. Dentre estes, o terminador Nos pode ser usado com maior preferência. 5 Dispondo o terminador em um sítio apropriado no vetor de expressão, é possível evi- tar, após a introdução do vetor de expressão no corpo de uma planta, fenômenos tais como a sintetização de uma transcrição desnecessariamente longa e a diminuição do número de cópias de plasmídeo por um promotor forte. O marcador de seleç.ão pode ser um gene de resistência à droga, por e- 10 xemplo. O gene de resistêneia à droga, por exemplo, é aquele que é resistente à hi- gromicina, bleomicina, canamicina, gentamicina, cloroanfenicol ou similar. Com o gene de resistência à droga, é possível selecionar facilmente uma planta transformada cultivando corpos de planta eni un] meio de cultura que inclui o antibiótico acima mencionado e depois seleeionando um corpo de planta capaz de crescer no meio de 15 cultura. O polinucleotídeo para aumentar a eficiência de tradução pode ser, por exemplo, uma seq uência ômega derivada de um vírus do mosaico do tabaco. Dispondo a sequência ômega em uma região não traduzida (5'UTR) de um promotor, é possível aumentar a eficiência da tradução do gene que codifica um fator de transcrição. Con- +: n 20 forme descrito acima, vários segmentos de DNA podem ser incluídos no vetor de ex- .

r .

pressão de acordo com as finalidades. + Especificamente, o vetor de expressão é construído, por exemplo, por .

um método no qual o promotor, o polinucleotídeo e o segmento de DNA, se necessá- rio, são introduzidos em um vetor da base que é selecionado de forma correspondente, 25 de modo a ficar dispostos em uma ordem predeterminada. O polinucleotídeo e o pro- motor (e o terminador e similar, se necessário) podem ser conectados de modo que um cassete de expressão genética seja construído, podendo o cassete de expressão genéti- ca ser introduzido no vetor de base. Ao constmir o cassete de expressão genética, é possível preparar para que, por exernplo, cada segmento de DNA inclua um sítio de 30 clivagem como uma extremidade protuberante complementar a uma extremidade pro- tuberante de outro segmento de DNA e essas extremidades protuberantes sofram uma reação via enzima de ligação. Isso possibilita regular a ordem dos segmentos de DNA. No caso em que o terminador seja incluído no cassete de expressão genética, o promo-

? 12"/ 32 tor, um polinucleotídeo que codifica N-acetilglucosamina transferase e o terminador são dispostos nessa ordem a partir da linha de cima. Os reagentes usados na constru- ção do vetor de expressão, i.e. enzimas de restrição, enzimas de ligação e similar, não têm um tipo particularmente limitado e, consequentemente, podem ser selecionados e 5 usados reagentes comercialmente disponíveis. O vetor de expressão pode ser multiplicado por um método conhecido e um método de multiplicação (método de produção) do vetor de expressão não está particularmente limitado. Em geral, o vetor de expressão é multiplicado em Escheri- chia coli servindo de hospedeiro. Nesse caso, pode ser selecionado um tipo apropriado 10 de E. coli de acordo com o tipo do vetor de expressão. É possível usar as substâncias exemplificadas acima isoladamente e usar dois ou mais tipos das substâncias em combinação. No caso em que a composição de acordo com a presente invenção inclui como substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula, uma subs- 15 tância que pode ser absorvida pela planta por meio de contato com a planta, uma quantidade da substâncias não é limitada particularmente, mas é de preferência O,O1mM a 20mM, mais preferivelmente 0,lmM a 2mM. Quando a quantidade da subs- tância está dentro da faixa, é possível melhorar mais o teor de açúcar da planta a ser produzida. Deve-se observar que a concentração da substância pode ser alterada con- m forme apropriado, de acordo com o teor de açúcar desejado, tipo de planta à qual a . r substância é aplicada e similar. ^ A composição de acordo com a presente invenção pode incluir outro .

componente desde que o efeito da composição de acordo com a presente invenção não seja prejudicado. Por exemplo, no caso em que a composição de acordo com a presen- 25 te invenção inclui como substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula, uma substância que pode ser absorvida pela planta por meio de contato com a planta, a composição pode ser dissolvida em água, um transportador líquido conheci- do, ou similar, de modo a ser fornecida na forma de agente líquido, emulsão, agente em gel ou similar. Esse transportador líquido pode ser, por exemplo, hidrocarboneto 30 aromático, tal como xileno; álcool, tal como etanol e etileno glicol; cetona, tal como acetona; éter, tal como dioxano e tetraidrofuran; dimetilformamida, dimetilsulfóxido, acetonitrila e similar, mas não se limita a estes. Alternativamente, a substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula pode ser apoiada por um compo-

b

F 13 / 32 nente transportador sólido para que a composição seja fornecida como agente sólido, agente em pó ou similar.

Esse componente de transportador sólido pode, por exemplo, ser um material inorgânico, tal como, talco, argila, vermiculita, diatomita, caulim, carbonato de cálcio, hidróxido de cálcio, argila branca e gel de sílica; e um material 5 orgânico, tal como farinha e amido, mas não se limita a estes.

Além disso, a composi- ção de acordo com a presente invenção pode ser combinada com outro agente auxiliar de modo correspondente.

Esse agente aux'iliar pode ser, por exemplo, um agente sur- factante de ânion, tal como sulfato de alquila, sulfonato de alquila, alquil aril sulfona- to, dialquil sulfossucinato; um agente surfactante catiônico, tal como sal de amina lO alifática mais alto; um agente surfactante não-iônico, tal como polioxietileno glicol alquila éter, polioxietileno glicol acil éster, polioxietileno glicol poliálcool acil éster e derivado de celulose; um agente espessante, tal como gelatina, caseína e goma arábi- ca; um agente de ponderação; um agente aglutinador e similar.

A utilização da composição de acordo com a presente invenção não está 15 particularmente limitada.

Por exemplo, no caso em que a composição de acordo com a presente invenção inclui como substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula, uma substância que pode ser absorvida pela planta por meio de contato eom a planta e em que a composição é um agente líquido ou similar, a composição pode ser incluída em um meio de cultura ou similar, o qual é usado na cultura da plan- ,k àO ta, ou pode ser pulverizada, gotejada ou aplicada no corpo da planta inteiro ou em

" uma parte do corpo da planta, tal como um ponto vegetativo, um broto, uma folha e .- D caule.

Observe que um "meio de cultura" usado no cultivo de uma planta no presente

. relatório inclui solo e agente de fertilização do solo.

No caso em que a composição é um agente sólido ou similar, a compo- 25 sição pode ser incluída em um meio de cultura, o qual é usado no cultivo de planta.

Altemativamente, no caso de cultivo hidropônico, a composição pode ser adicionada à água e dissolvida gradativamente na mesma.

A composição pode ser aplicada como agente sólido ou similar para ser dissolvida em água e dissolvida em água no momen- to do uso.

Além disso, a composição de acordo com a presente invenção pode ser a-

30 plicada a uma planta como mistura com um fertilizante conhecido e um agente, tal como hormônio de planta.

A composição de acordo com a presente invenção não está particular- mente limitada no momento da aplicação a uma planta.

Por exemplo, a composição

W é 14 / 32 pode ser aplicada à planta a partir do momento da semeadura.

Especificamente, no caso em que a composição é aplicada a uma planta, tal como Lycopersicum esculen- tum, a qual produz fruto aproximadamente 2 meses até meio ano após a semeadura, a composição pode ser aplicada no dia da semeadura e, de preferência, aplicada a inter-

5 valos regulares durante 30 dias após a semeadura, mais preferivelmente durante 60 dias após a semeadura, ainda mais preferivelmente a partir do dia da semeadura até o dia da colheita.

Nesse caso, um intervalo de aplicação da composição não está particu- larmente limitado, mas de preferência, de uma a quatro vezes por semana, mais prefe- rivelmente duas ou três vezes por semana.

A quantidade aplicada da composição não

10 está particularmente limitada.

A quantidade aplicada pode ser preparada como apro- priado, conforme o tipo de planta.

No caso de Lycopersicum esculentum, ou similar, por exemplo, preferivelmente 0,OO1mmoj ou mais e 0,1 mmol ou menos, mais preferi- velmente 0,Olmmol ou mais e 0,05mmol ou menos da substância para regular o estado de oxidação-redução da célula é aplicado por vez por planta.

No caso em que a com-

15 posição seja incluída em um meio de cultura conforme descrito acima, a composição é aplicada a uma planta a partir do momento em que a pIanta é semeada no meio de cul- tura, ou no momento em que uma muda da planta, ou similar, é transplantada para o meio de cultura.

A composição de acordo com a presente invenção pode ser aplicada a

20 uma planta após semear e depois de a planta ter crescido até certo ponto, por exemplo, bm após a produção de uma muda da planta.

Por exemplo, no caso em que a composição é 0 aplicada a uma planta gramínea, tal como Zea mays L. var. saccharata Sturt, a com- r posição pode ser aplicada à planta após o crescimento de uma muda da planta.

Nesse caso, a composição de acordo com a presenle invenção pode ser incluída antecipada-

25 mente em um meio de cultura para o qual é transplantada a muda, ou pode ser aplica- da periodicamente ao meio de cultura após a muda ser transplantada para o meio de cultura.

No caso em que a composição é aplicada após transplantar a muda, o momen- to da aplicação não é particularmente limitado.

Contudo, é preferivel que, por exem- plo, a composição seja aplicada uma a quatro vezes por semana, mais preferivelmente

30 duas ou três vezes por semana, a partir do transplante da muda até a colheita.

A quan- tidade aplicada da composição de acordo com a presente invenção não está particu- larmente limitada.

A quantidade aplicada pode ser preparada como apropriado, con- forme o tipo de planta.

No caso de Zea mays L. var. saccharata Stun, ou similar, por m

'r 15 / 32 exemplo, preferivelmente 0,OOlmmol ou mais e O,1mmol ou menos, mais preferivel- mente 0,0 lmmol ou mais e 0,05mmol ou menos da substância para regular o estado de oxidação-redução da célula é aplicado por vez por planta.

Tambéni é possível preparar o momento da aplicação da composição 5 tendo em vista a ocasião da produção das flores.

Por exemplo, a composição pode ser aplicada enquanto o broto da flor ainda está inteiro, depois de as pétalas caírem, a par- tir de um período em que o broto da flor está inteiro até o nascimento do fruto, a partir do momento do florescimento até o nascimento do fruto, ou a partir de quando as pé- talas caírem até o nascimento do fruto.

No caso em que a composição é aplicada à 10 Vitis labrusca conforme descrito posteriormente no Exemplo, a composição pode ser aplicada à antotaxia.

Nesse Exemplo, a composição é misturada ao hormônio de uma planta (giberelina), o qual serve para produzir fruto sem sementes de Vitis labrusca, e aplicada quando o hormônio da planta deveria ser aplicado.

Também é possíve! organizar o momento da aplicação da composição 15 com base no cálculo retroativo de dias a partir do momento da colheita.

Por exemplo, a composição pode ser aplicada 10 dias ou 20 dias antes da colheita.

No caso em que a composição de acordo com a presente invenção é a- plicada a uma planta durante o cultivo da planta, conforme descrito acima, a composi- ção pode ser misturada com um fertilizante e/ou agente, tal como um hormônio de -r

"20 planta, conforine descrito acima.

Nesse caso, o momento da aplicação de uma mistura

., " da composição e do fertilizante ou similar, não está particularmente limitado e a mis- -, tura pode ser aplicada num momento exemplificado acima ou em um momento prefe- . . rido para aplicar o fertilizante ou similar.

No caso em que a composição de acordo com a presente invenção inclui 25 como substância para aumentar a glutationa na célula, uma substância a ser introduzi- da no genoma de uma planta, tal como o polinucleotídeo descrito acima, a composição pode ser usada de tal modo que o polinucleotídeo seja introduzido no genoma do cor- po da planta por meio de um conhecido método de transformação.

Por exemplo, a composição pode incluir um polinucleotídeo e pode ser introduzida no corpo da planta

30 por um vetor de expressão da planta conhecido, ou pode incluir um vetor que inclui o polinucleotídeo.

O conteúdo de polinucleotídeo da composição de acordo com a presente invenção não está particularmente limitado.

O polinucleotídeo pode ser dissolvido em

W

Ç, r . 16 / 32 uma solução tampão ou similar, a qual geralmente é usada ria preservação do polinu- cleotídeo.

A introdução de um vetor em uma célula da planta é realizada por um método de transformação conhecido no estado da técnica (por exemplo, o método A- 5 grobacterium, pistola de partículas, o método de polietileno glicol e o método de ele- troporação). No c.aso em que o método Agrobacterium é usado, por exemplo, um vetor de expressão de planta construído é introduzido no Agrobacterium apropriado (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens) e um disco de folha de cultura asséptica é in- fectado por essa cepa pelo método de disco de folha (Hirofumi UCHIMIYA, Manuals lO for plant genetic manipulation, 1990, 27-3 lpp, Kodansha Scientific Ltd., Tóquio), ou método similar para que possa ser obtida uma planta transformada.

No caso da pistola de partículas, é possível usar (i) um corpo de planta, órgão de planta ou tecido de planta sem qualquer tratamento, (ii) um pedaço cortado do corpo de planta, órgão de planta ou tecido de planta, ou (iii) um protoplasto do corpo de planta, órgão de planta 15 ou tecido de planta.

Essa amostra preparada pode ser processada usando um aparelho para introdução de gene (por exemplo, PDS-lOOO, Bio-Rad Laboratories, Inc.). Nesse processo, as condições diferem de acordo com a planta ou amostra, contudo, geral- mente são preparadas de modo que a pressão seja de aproximadamente 450psi a 200Opsi e uma distância de aproximadamente 4cm a l2cm. 20 A célula ou teeido da planta no qual é introd,uzido um gene alvo, é sele- Vr ~ cionado com um marcador de resistência à droga, tal como marcador de resistência à µ&

canamicina e um marcador de resistência à higromicina e então reproduzido para ser ¶' um corpo de planta por um método padrão.

A reprodução do corpo de uma planta a partir de uma célula transfor- 25 mada pode ser realizada por um método conhecido na técnica, de acordo com um tipo da célula de planta.

A fim de determinar se um gene alvo é introduzido ou não em uma planta, é possível usar PCR, hibridização do sul, hibridização do norte, ou similar.

Por exemplo, o DNA é preparado a partir de uma planta transformada e então submetido à

30 PCR com o uso de um primer especí'fico para o DNA que foi introduzido na planta transformada.

Então, o produto de amplificação assim obtido é submetido a eletrofo- rese por gel de agarose, eletroforese por gel de poliacrilamida, ou eletroforese por capilaridade e, depois disso, pigmentado com brometo de etídio.

Consequentemente,

~

17 / 32 o produto-alvo de amplificação pode ser detectado.

Desse modo, é possível determinar se a planta é transformada ou não.

Uma vez o corpo de planta transformado no qual é introduzido um gene alvo no genoma é obtido, é possível obter uma progênie a partir do corpo de planta 5 transformado por reprodução sexuada ou reprodução assexuada.

Além disso, é possí- vel realizar produção em massa de corpos de planta alvo a partir de um material re- produtivo (por exemplo, semente ou protoplasto) obtido do corpo de planta ou da sua progênie ou clone.

Na presente invenção, uma planta ajvo para transformação é um corpo 10 de planta inteiro, um órgão de uma planta (por exemplo, folha, pétala, caule, raiz e semente), tecido da planta (por exemplo, epiderme, floema, parênquima, xilema, maço de vaso, parênquima de cerca, parênquima esponjosa), uma célula de planta em cultu- ra, uma célula de planta em várias formas (por exemplo, célula em cultura por suspen- SãO), protoplasto, um pedaço conado de uma folha, calo ou similar.

A planta alvo para 15 transformação não está particularmente Limitada e uma planta capaz de expressar um gene alvo pode ser selecionada de modo correspondente.

O polinucleotídeo acima mencionado é derivado de Arabidopsis thalia- na.

Foi relatado, por exemplo, que plantas transformadas de Nicotiana tabacum L., Populus, Citrus limon e similar podem ser produzidas com o uso de um gene de Ara- " 7

20 bidopsis thaliana.

Esses relatos também podem ser usados como referências para co-

fg n mo usar a composição de acordo com a presente invenção (Franke R, McMichael CM, 0

Meyer K, Shirley AM, Cusumano JC, Chapple C. (2000) Modifíed lignin in tobacco and poplar plants over-expressing the Arabidopsis gene encoding ferulate S- hydroxylase.

Plant J. 22: ?23-234; Pena L, Martin-Trillo M, Juarez J, Pina JA, Navar- 25 ro L, Martinez-Zapater JM. (2001) Constitutive expression ofArabidopsis LEAFYor APETALAI genes in citrus reduces their generation time.

Nat Biotechnol. 19: 263- 267). As plantas alvo para a composição de acordo com a presente invenção não estão particularmente limitadas.

A composição pode ser aplicada a quase todas as 30 plantas, tais como várias plantas monocotiledôneas, plantas dicotiledôneas e árvores.

Exemplos de plantas monocotiledôneas incluem: Lemnaceae, tais como Spirodela (Spirodela polyrhiza Schleid) e Lemna (Lemna paucicostata e Lemna trisulca); Or- chidaceae, tais como Cattleya, Cymbidium, Dendrobium, Phalaenopsis, Vanda, Pap-

18 / 32 hlopedllum e Oncidium; Typhaceae; Sparganiaceae; Potamogetonaceae; Najadaceae; Scheuchzeriaceae; Alismataceae; Hydrocharitaceae; Triuridaceae; Gramineae (por exemplo, Zea mays, tais como Zea mays L. var. saccharata Sturt), Cyperaceae; Pal- mae; Araceae; Eriocaulaceae; Commelinaceae; Pontederiaceae; Juncaceae; Stemona- S ceae; Liliaceae; Amaryllidaceae; Dioscoreacea; lridaceae; Musaceae; Zingiberaceae; Cannaceae; e Burmannia. Exemplos de plantas dicotiledôneas incluem: Convolvulaceae, tais co- mo Pharbitis (Pharbitis nil Choisy), Calystegia (Calystegia japonica Choisy, Calyste- gia hederacea e Calysteegia so/danella Rohm. et Schult.), Ipomoea (lpomoea pes- 10 caprae e Ipomoea batatas Lam. var. edulis Maikno) e Cuscuta (Cuscuta japonica Chois. e Cuscuta australis); Caryophyllaceae, tais como Dianthus (Dianthus caryo- phillus L.), Stellaria, Minuartia, Cerastium, Sagina, Arenaria, Moehringia, Pseudostel- laria, Hankenya, Spergula, Spergularia, Silene, Lychnis, Melandryum e Cucubalus; Casuarinaceae; Saururacea; Piperaceae; Choranthaceae; Sailicaceae; Myricaceae; Ju- 15 glandaceae; Betulaceae; Fagaceae; Ulmaceae; Moraceae; Urticaceae; Podostemaceae; Proteaceae; Olacaceae; Santalaceae; Loranthaceae; Aristolochiaceae; Rafflesiaceae; Balanophoraceae; Polygonaceae; Chenopodiaceae; Amaranthaceae; Nyctaginaceae; Cynocrmbaceae; Phytolaccaceae; Aizoaceae; Portulacaceae; Magnoliaceae; Trocho- dendraceae; Cercidphyllaceae; Nymphaeaceae; Ceratophyllaceae; Ranunculaceae; a 20 Lardizabalaeae; Berberidaceae; Menispermaceae; Calycanthaceae; Lauraceae; Papave- ·a raceae; Capparidaceae; Cruciferae; Droseraceae; Nepenthaceae; Crassulaceae; Saxi-

P Hagaceae; Pittosporaceae; Ilamamehdaceae; Platanaceae; Rosaceae; Leguminosae; r Oxalidaceae; Geraniaceae; Linaceae; Zygophyllaceae; Rutaceae; Cimaroubaceae; Me- liaceae; Polygalaceae; Euphorbiaceae; Callitrichaceae; Buxaceae; Empetraceae; Cori- 25 ariaceae; Anacardiaceae; Aquifoliaceae; Celastraceae; Staphyleaceae; Icacinaceae; Aceraceae; Hippocastanaceae; Sapindaceae; Sabiaceae; Balsaminaceae; Rhamnaceae; Vitaceae; Elaeocarpaceae; Tiliaceae; Malvaceae; Stearculiaceae; Actinidiaceae; Thea- ceae; Guttiferae; Elatinaceae; Tamaricaceae; Violaceae; Flacourtiaceae; Stachyurace- ae; Passifloraceae; Begoniaceae; Cactaceae; Thymelaeaceae; Elaegnaceae; Lythracea- 30 e; Punicaceae; Rhizophoraceae; Alangiaceae; Melastomataceae; Hydrocaryaceae; Oe- notheraceae; Haloragaceae; Hippuridaceae; Araliaceae; Umbelliferae; Cornaceae; Di- apensiaceae; Clethraceae; Pyrolaceae; Uricaceae; Myrsinaceae; Primulaceae; Plumba- ginaceae; Ebenaceae; Symplocaceae; Styracaceae; Oleaceae; Loganiaceae; Gentiana-

19 / 32 ceae; Apocynaceae; Asclepiadaceae; Polemoniaceae; Boraginaceae; Verbenaceae; Labiatae; Solanaceae (por exemplo, Lycopersicum esculentum); Scrophulariaceae; Bignoniaceae; Pedaliaceae; Orobanchaceae; Gesneriaceae; Lentibulariaceae; Acantha- ceae; Myoporaceae; Phrymaceae; Plantaginaceae; Rubiaceae; Caprifoliaceae; Adoxa- 5 ceae; Valerianaceae; Dipsacaceae; Cucurbitaceae; Campanulaceae; e Compositae. A presente invenção inclui um kit para produzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado (doravante denominado "kit de acordo com a presente in- venção"). O kit de acordo com a presente invenção somente tem que incluir uma subs- tância para regular o estado de oxidação-redução de c.élula (por exemplo, glutationa, 10 um polinucleotídeo que codifica y-glutamilcisteína sintetase, ou um polinucleotídeo que codifica frutose-1,6-bisfosfato aldolase tipo plastídeo de ligação de gjutationa). Além disso, o kit de acordo com a presente invenção pode incluir outro componente além da substância acima. A substância para regular o estado de oxidação-redução de uma célula e o componente podem ser fornecidos juntos em um só recipiente para 15 conter a substância e o componente em quantidade adequada e/ou em forma adequada, ou podem ser fornecidos separadamente em recipientes diferentes. Além disso, o kit de acordo com a presente invenção pode incluir um instrumento para cultivo de pIan- ta, um meio de cultura e similar. No caso em que o polinucleotídeo é incluído no kit de acordo com a presente invenção, o kit pode ser tal que um vetor de base de um ve- . b- "20 tor de expressão para expressar o polinucleotídeo pode ser fornecido em um recipiente "a diferente do polinucleotideo. Alternativamente, o kit pode incluir o vetor de base no qual o polinucleotídeo é introduzido antecipadamente. Além disso, o kit de acordo r com a presente invenção pode incluir um reagente e similar que é usado em um méto- do conhecido de transformação de planta.

25 <2. Método, de acordo com a presente invenção, para produzir corpo de planta com teor de açúcar melhorado> Um método de acordo com a presente invenção, para produzir um corpo de pIanta com teor de açúcar melhorado (doravante denominado "método de acordo com a presente invenção") somente tem que incluir uma etapa para cultivar um corpo 30 de planta com o uso de uma substância para regular o estado de oxidação-redução de célula (por exemplo, glutationa, um polinucleotídeo que codifíca y-glutamilcisteína sintetase, o'u um polinucleotídeo que codifica frutose-l,6-bisfosfato aldolase tipo plasmídeo de ligação de glutationa).

20 / 32 No caso em que a substância que pode ser absorvida pela planta por contato com a mesma é usada na regulagem do estado de oxidação-redução de célula, a etapa pode incluir, por exemplo, fazer com que a planta absorva a substância. Como fazer com que a planta absorva a substância para regular o estado de oxidação-redução 5 de uma célula não está particularmente limitado. Por exemplo, é possível fazer com que a planta absorva a substância cultivando a planta em meio de cultura (incluindo solo e agente de fertilização do solo) que inclui a substância, ou pulverizando ou co- brindo a planta com a substância durante o cultivo da planta. Alternativamente, tam- bém é possível cultivar a planta em meio de cultura que inclui absorvente, tal como 10 uma resina de troca de íons na qual a substância é absorvida, onde o absorvente é en- terrado no solo do meio de cultura, por exemplo, No caso em que uma substância tal como um polinucleotídeo deve ser introduzido no genoma de uma planta é usada na regulagem do estado de oxidação- redução da célula, o método não inclui fazer com que a planta absorva a substância, 15 mas pode incluir introduzir a substância na planta antecipadamente, de modo a produ- zir uma planta transformada e então cultivar a planta transformada. Como introduzir um polinucleotídeo na planta está descrito acima na eíxplicação da composição de a- cordo com a presente invenção. A presente invenção inclui um corpo de planta obtido pelo método de -¥ "20 acordo com a presente invenção. É possível identificar facilmente o corpo de planta ·.R . medindo pelo menos 'um conteúdo ou relação no corpo da planta, da substância para

B regular o estado de oxidação-redução da célula. Portanto, é possível distinguir clara- .

mente o corpo da planta daquele obtido por outro método. O corpo da planta também pode ser identificado, por exemplo, comparando os padrões de expressão genética por 25 meio de microconjunto de DNA ou similar, além de medir o conteúdo e a concentra- ção da substância. No caso em que seja usada GSSG como substância, é possível rea- lizar os seguintes procedimentos, por exemplo: (i) um padrão de expressão genética de uma planta cultivada depois de receber a aplicação de GSSG é analisado antecipada- mente; (ii) um padrão de expressão único para o corpo de planta que recebeu a aplica- 30 ção de GSSG (padrão de expressão de GSSG) é determinado pela comparação do pa- drão de expressão genética entre o corpo da planta que recebeu a aplicação de GSSG e o corpo de planta cultivado por outro método; (ii) um padrão de expressão de um cor- po de planta-alvo é analisado; e então (iv) o padrão de expressão do corpo de planta-

21 / 32 alvo é comparado ao padrão de expressão de GSSG. Isso permite uma fácil identifica- ção do corpo da planta que recebeu aplicação de GSSG. Além disso, conforme outro exemplo da identificação, a comparação de um perfil eletroforético bidimensional de uma proteína de ligação de glutationa a uma alteração de padrão analisada antecipa- 5 damente, possibilita determinar se foi aplicada GSSG ou não. No caso em que é usado um polinucleotídeo, é possível distinguir o corpo da planta de acordo com a presente invenção de outro corpo de planta, identifícando o polinucleotídeo no corpo da planta por meio de PCR, hibridização do sul, hibridização do norte, ou similar. Detalhes dos modos de realização da presente invenção são descritos 10 abaixo nos Exemplos. É óbvio que a presente invenção não se limita às descrições dos exemplos abaixo e detalhes da presente invenção podem ser variados de muitas ma- neiras. A presente invenção não se limita à descrição dos modos de realização acima, mas pode ser alterada por um técnico no assunto dentro do escopo das reivindieações. O escopo técnico da presente invenção abrange um modo de realização baseado em 15 uma combinação adequada de meios técnicos descritos em diferentes modos de reali- zação. Todos os documentos citados são aqui incorporados por referência. Exemplos: <Exemplo 1. Produção de Lycopersicum esculentum> No presente exemplo, a planta Lycopersicum esculentum foi cultivada —r "20 com o uso de GSSG ou GSH. Detalhes do cultivo estão descritos abaixo.

-Q Primeiro, mudas de Lycopersicum esculentum (TAKII & CO. Ltd., no- 6 me do produto: Osama tomato reika) foram transplantadas para um vaso de cultura hidropônica (1/2000 a). No vaso de cultura hidropônica, 6L de vermiculita (ASAHI INDUSTRIES Co., LTD.), 3L de solo para horticultura KUREHA (KUREHA COR- 25 PORATION), e 3L de vermiculita foram colocados seguindo uma camada inferior, uma intermediária e uma superior, respectivamente. Durante o cultivo de Lycopersicum esculentum, 50mL de 0,5mM GSSG ou 0,5mM GSH (ajustado com O,1N de NaOH para ter um pH 7) foram aplicados duas vezes por semana na raiz por planta. As plantas Lycopersicum esculentum foram cu1- 30 tivadas durante 60 dias sem serem submetidas à remoção do broto. Os últimos lO dias foram usados como período de colheita para colher o fruto das plantas. Para compara- ção, uma planta Lycopersicum esculentum foi cultivada sob a mesma condição, exceto pelo fato de que não foram aplicadas GSSG e GSH. Foram aplicados às plantas de

22 / 32 qualquer condição, 3 g de nitrato de amônio e potássio fosforado Kumiai S-604 (Chis- so Asahi Fertilizer Co., Ltd.) como fertilizante adicional uma vez em 2 semanas. Em seguida, o fruto colhido foi submetido a testes sensoriais de teor de açúcar e similar. Como consequência, foi determinado que o fruto da planta que rece- 5 beu aplicação de GSSG apresentou aumento do teor de açúcar em comparação ao da planta que não recebeu GSSG ou GSH. Além disso, foi determinado que a planta que recebeu aplicação de GSSG apresentou aumento do número de frutos. Foi determina- do que o fruto da planta que recebeu aplicação de GSH apresentou aumento do teor de açúcar e acidez. 10 Esses resultados indicaram que poderia ser produzida a planta Lycoper- sicum esculentum com um teor maior de açúcar pelo cultivo que emprega um meio de cultura contendo GSSG ou GSH. <Exemplo 2. Determinação do teor de açúcar> As plantas Lycopersicum esculentum foram cultivadas às quais foi apli- 15 cada GSSG ou GSH pelo método descrito no Exemplo 1. Então, o fruto obtido das plantas foi submetido à determinação de teor de açúcar usando o Refratômetro "Poc- ket" APAL-I (ATAGO CO., LTD.). Para comparação, as plantas Lycopersicum esculentum foram cultivadas em dois tipos de condições (denorninadas "Cont" e "Cont2 Sunny"). Na condição ré ' 20 Cont, as plantas Lycopersicum esculentum foram cultivadas pelo mesmo método do ·t Exemplo l, exceto pelo fato de que não receberam aplicação de GSSG e GSH. Na ^ l condição Cont2 Sunny, uma planta Lycopersicum esculentum recebeu a aplicação de

L GSSG ou GSH e foi cultivada independentemente em um local suficientemente expos- to à luz solar para que a intensidade de iluminação sobre a planta Lycopersicum escu- m lentum chegasse a 100°4. Na condição Cont e em uma condição na qual foi aplicada GSSG ou GSH, as plantas foram plantadas a intervalos de 40 cm a 50 cm. Nesse caso, uma planta pode interceptar a luz que ilumina outra planta. Portanto, a intensidade de iluminação sobre essas plantas se toma menor que 100°'6. Na condição em que foi aplicada GSSG, na condição em que GSH é a- 30 plicada e na condição Cont, foram cultivadas três plantas Lycopersicum esculentum, respectivamente. Na condição Cont2 Sunny, foi cultivada uma planta Lycopersicum esculentum. As Figuras 1 e 2 ilustram resultados da determinação do teor de açúcar.

23 / 32 A Figura 1 mostra um resultado da determinação do teor de açúcar de plantas Lyco- persicum esculentum obtidas no presente exemplo. Na Figura l, a escala vertical in- dica teor de açúcar (Brix, unidade:%) e a escala horizontal indica as condições de cul- tivo. Na Figura 1, o sinal de referência * indica que o fruto não pôde ser obtido duran- 5 te o período de colheita. A Figura 2 ilustra um resultado de análise ANOVA do resul- tado da determinação do teor de açúcar mostrado na Figura 1. Na Figura 2, a escala vertical indica o teor de açúcar e a eseala horizontal indica as condições de cultivo. Na Figura 2, caracteres alfabéticos acima de cada barra indicam que barras com o mesmo caractere pertencem ao mesmo grupo quando agrupadas com base na análise lO ANOVA. A análise ANOVA foi realizada por meio de StatView 5.0 (SAS Institute Inc.) com um nível de diferença signifícativo de 5°4. Conforme ilustrado nas F'iguras 1 e 2, a aplicação de GSSG ou GSH tomou possível obter o fruto de Lycopersicum esculentum com um teor de açúcar sig- nincativamente maior em comparação ao fruto de Lycopersicum esculentum cultivado 15 na condição Cont e também ao fruto de Lycopersicutn esculentum suficientemente exposto à luz solar. Especialmente, a aplicação de GSSG tornou possível obter Lyco- persicum esculentum com um teor de açúcar extremamente alto. <Exemplo 3. Produção de Zea mays L. var. saccharata Sturt> No exemplo, foi cultivada a planta Zea mays L. var. saccharata Sturt. 0" 20 Primeiro, uma semente de Zea mays L. var. saccharata Sturt (TAKII & CO. Ltd., no- -Q me do produto: Canberra 90) foi semeada em vermiculita (ASAHI INDUSTRIES Co.,

N LTD.). Duas semanas depois de semear, a planta Zea mays L. var. saccharata Sturt foi transplantada para um vaso de cultura hidropÔnica descrito no Exemplo 1. Foram a- plicados à pIanta 3g de nitrato de amônio e potássio fosforado S-604 (Chisso Asahi 25 Fertilizer Co., Ltd.) como fertilizante adicional 4 semanas e 6 semanas após a semea- dura. Dentro de 2 semanas a contar da 5". semana após a semeadura, foram aplicados 50mL de 0,2mM GSSG 4 vezes na raiz da planta. Dentro de 2 semanas a contar da 7'. semana após a semeadura, foram pulverizados 50mL de 0,2mM GSSG 4 30 vezes nas folhas da planta. Para comparação, uma planta Zea mays L. var. saccharata Sturt foi cultivada pelo mesmo método do presente exemplo, exceto pelo fato de que não foi aplicada GSSG e o fruto da mesma foi colhido. O fruto foi colhido 90 dias após a semeadura e submetido a um teste

24 / 32 sensorial do teor de açúcar.

Como consequência, foi determinado que o fruto da planta com aplicação de GSSG apresentou aumento do teor de açúcar em comparação ao da planta sem aplicação de GSSG.

Além disso, foi determinado que a planta com aplica- ção de GSSG teve aumento do tamanho e do número de frutos. 5 <Exemplo 4. Produção de Zea mays L. var. saccharata Sturt (2)> No presente exemplo, foi cultivada Zea mays L. var. saccharata Sturt em condição diferente do Exemplo 3 com relação à forma de aplicação de GSSG.

Primeiro, uma semente de Zea mays L. var. saccharata Sturt (TAKII & CO.

Ltd., no- me do produto: Canberra 90) foi semeada em vermiculita (ASAHI INDUSTRIES Co., lO LTDJ Uma semana depois de semear, uma planta Zea mays L. var. saccharata Stun foi transplantada para um vaso de cultura hidropônica descrito no Exemplo 1. Foram apli'cados à planta 3g de nitrato de amônio e potássio fosforado S-604 (Chisso Asahi Fertilizer Co., Ltd.) como fertilizante adicional 4 semanas e 6 semanas após a semea- dura. 15 Durante 12 semanas após a germinação, foram aplicados 20OmL de 0,5mM GSSG na raiz da planta duas vezes por semana.

Para comparação, uma planta Zea mays L. var. saccharata Sturt foi cultivada pelo mesmo método do presente e- xemplo, exceto pelo fato de que não foi aplicada GSSG e o fruto da mesma foi colhi- do. rp r

20 O fruto foi colhido 12 semanas após a semeadura e submetido a um tes- te sensorial de teor de açúcar.

Como consequência, foi determinado que o fruto da r . "¶

r planta com aplicação de GSSG apresentou aumento do teor de açúcar em comparação ao da planta sem aplicação de GSSG.

Além disso, foi determinado que a planta com aplicação de GSSG teve aumento do tamanho e do número de frutos. 25 <Exemplo 5. Produção de Vitis labrusca> Na presente invenção, Vitis labrusca foi cultivada.

Especificamente, imediatamente após a florescência de uma planta Vitis labrusca (Delaware), foi apli- cada à antotaxia da planta uma solução misturada de lmM de giberelina (GA3) e lmM de um agente.

O agente era GSSG ou GSH.

Então, a planta foi coberta com o 30 agente e depois o fruto produzido foi colhido.

Para comparação, uma planta Vitis la- brusca foi cultivada da mesma maneira, exceto pelo fato de que foi aplicada GA3 e não GSSG ou GSH e o Huto da mesma foi colhido e submetido a um teste sensorial descrito abaixo.

25 / 32

O fruto colhido foi submetido a um teste sensorial do teor de açúcar.

Como consequência, foi determinado que o fmto da planta com aplicação de GA3 e GSSG ou GSH teve aumento do teor de açúcar em comparação ao da planta que rece- l beu aplicação de GA3 somente.

Além disso, foi determinado que a planta com aplica- S ção de GSSG e GA3 apresentou aumento do tamanho do fruto.

Além disso, foi determinado que a planta Vitis labrusca que recebeu a- plicação de GSSG ou GSH, mas não de GA3, apresentou maior teor de açúcar.

Nesse caso, o efeito da produção de uva sem semente foi suprimido sem GA3. <Exemplo 6. Mudança no decorrer do tempo após a aplicação de substância pa- lO ra regular o estado de oxidação-redução da célula> No presente exemplo, foi determinado o teor de açúcar de uma planta após a aplicação à mesma de uma substância para regular o estado de oxidação- redução de célula.

A'substância para regular o estado de oxidação-redução da célula era GSH ou GSSG.

Como no caso do Exemplo 1, a espécie Lycopersicum esculentum 15 foi usada como planta.

Especificamente, foram realizadas as seguintes operações.

Noventa dias após a semeadura de sementes de Lycopersicum esculen- tum, as plantas Lycopersicum esculentum foram submetidas a um tratamento com GSH ou GSSG.

As plantas Lycopersicum esculentum foram cultivadas pelo mesmo método do Exemplo 1, exceto pelo tratamento com GSH ou GSSG.

O tratamento com < '20 GSH ou GSSG foi tal que 50mL de 0,5mM de GSSH ou 0,5mM de GSH (ajustado

., " mp com O,1N de NaOH para ter um pH 7) foram aplicados uma vez na raiz por planta.

Então, o fruto das plantas foi colhido todos os dias a partir do dia 0 até o 4°. dia após a

. aplicação de GSH ou GSSG e submetido a uma determinação do teor de açúcar.

A Figura 3 mostra um resultado da determinação do teor de açúcar.

A Figura 3 é um grá- 25 fico que ilustra o resultado da determinação da relação entre o teor de açúcar e o nú- mero de dias a contar de um dia de aplicação de GSH ou GSSG.

Na Figura 3, a escala vertical indica teor de açúcar (Brix, unidade:%) e a escala horizontal indica os dias a partir do dia da aplicação.

Na Figura 3, linhas identificadas com círculos, triângulos e quadrados mostram resultados das plantas que receberam aplicação de GSH, GSSG e 30 sem aplicação de GSH e GSSG, respectivamente.

Observe que foi aplicada GSSG ou GSH na manhã do dia 0 e o resultado do dia 0 na Figura 3 foi obtido eolhendo o fruto e determinando o teor de açúcar do fruto na noite do dia 0. Conforme ilustrado na Figura 3, foi mostrado que a aplicação de GSSG

26 / 32 ou GSH possibilitou melhorar rapidamente o teor de açúcar do huto. <Exemplo 6. Produção de planta na qual é introduzido o gene GSH1> No presente exemplo, um clone do gene y-glutamilcisteína sintetase foi usado como substância para regular o estado de oxidação-redução de célula.

O clone é 5 um polinucleotídeo com uma sequência de SEQ ID NO:3, é um dos genes GSHl e denominado simplesmente de "gene GSH 1" no presente exemplo. (1) Planta a ser utilizada A fim de produzir uma planta transformada, um tipo natural de Arabi- dopsis thaliana Columbia (Col-O) foi usado como planta-mãe.

A Columbia (Col-O) foi lO semeada no solo em um vaso plástico quadrado (6,5x6,5x5cm), cujo solo se constituía de três camadas de vermiculita (ASAHI INDUSTRIES Co., LTD., Okayama), solo para cultivo KUREHA (solo para horticultura KUREHA, KUREHA CORPORATION, Tóquio), sendo a vermiculita colocada em camadas nessa ordem a partir do fúndo a uma relação de 2:1:1. Então, a Columbia (Col-O) foi cultivada a uma temperatura de 15 crescimento de 22°C em condição de dia longo (16 horas de período de luz/8 horas de período escuro). (2) Clonagem do gene GSHl, alteração do gene GSHl e produção da planta transformada GSHl O RNA inteiro de um tipo natural de Arabidopsis thaliana Columbia L,~

" 20 (Col-O) foi isolado e o cDNA foi sintetizado baseado no RNA usando o kit para RT- ·9 PCR de primeiro segmento Prostar (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) . Com o uso dos seguintes primers específicos desenvolvidos com base em uma sequência de cDNA de um gene GSHl, um cDNA de co'mprimento integral foi ampliado como dois fragmentos pelo PCR: 25 GSHl _ 5'-3: 5'-GCTTTCTTCTAGATTTCGACGG-3' (SEQ ID NO: 10) GSHl _ 3'-3: 5'-CCTGATCATATCAGCTTCTGAGC-3' (SEQ ID NO: ll) GSHl _ 5'-2: 5'-ATGCCAAAGGGGAGATACGA-3' (SEQ ID NO: 12) GSHl _ 3'-2: 5'-GGAGACTCGAGCTCTTCAGATAG-3' (SEQ ID NO: 13). Então, foi realizada subclonagem de modo que cada um dos fragmentos fosse 30 inserido em um vetor pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, EUA). Os primers G- SHl _ 5'-3 e GSHl _ 3'-2 respectivamente incluem sítios de clivagem Xbal e Sacl ne- cessários para introdução dos fragmentos em um vetor binário pBI12 1 usado na trans- formação da planta.

27 / 32 Os dois fragmentos foram fundidos entre si em um sítio de clivagem de Kpn 1 para que um vetor (Chl.GSH1-pGEM) incluindo o cDNA de comprimento total fosse construído. O Chl.GSH1-pGEM foi tratado com enzimas de restrição Xba I e Sac I e o fragmento obtido foi substituído por uma região de um vetor binário pBI121, cuja re- 5 gião codifica â-glucuronidase (GUS), a região estando localizada a jusante de um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor. Desse modo, foi produzida uma construção (35S-Chl.GSH1-pBI121) para produzir a planta transformada. Existe apenas uma cópia do gene GSHl no genoma de Arabidopsis tha- liana e o gene GSHl inclui um cloroplasto sinal de trânsito. Com a finalidade de a- 10 cumular produtos do gene GSHl (y-glutamilcisteína sintetase) no citoplasma, foi pro- duzida uma construção (3 5S-cyt.GSH1-pBI121) para expressar a proteína na qual o 73° aminoácido a partir de um terminal N, cujo aminoácido é suspeito de ser um clo- roplasto sinal de trânsito, foi deletado e um resíduo de alanina na 74". posição a partir do terminal N foi substituído por um resíduo de metionina. Primeiro, a PCR foi reali- 15 zada com o primer GSHI_ 3'-3 e o primer seguinte GSHl(cyt.) _ 5' (um sítio de base substituto é sublinhado) no qual o resíduo de alanina na 74". posição a partir do termi- nal N foi substituído pelo residuo de metionina e um sitio de clivagem Xbal foi inse- rido a montante da 74'. posição: GSH1(cyt.)_ 5': 5'-AGGGCATCTAGAGACCATGGCAAGTCC-3' (SEQ ID «- "20 NO: 14).

.n " Então, um fragmento assim obtido foi tratado com enzimas de restrição Xbal e

P Kpnl. Depois, foi realizada subclonagem de modo que o fragmento fosse inserido em um vetor pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) (cyt.GSH-IpBS)- O cyt.GSlll- pBS foi tratado com enzimas de restrição Xbal e Kpnl e um fragmento assim obtido 25 foi substituído pelo fragmento XbaI-Kpnl do 35S-Chl.GSHI-pBI121. Como conse- quência, foi produzido o 35S-cyt.GSH1-pBI121. Os dois tipos de vetores de expressão produzidos conforme acima, i.e. 35S-Chl.GSH1-pBI121 e 35S-cyt.GSH1-pBI121 foram introduzidos na Col-O pelo método Agrobacterium (Clough, S.J. e SHI-pB Bent, A.F. (1998) Floral dip: A sim- 30 plified method for Abrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 73 5 -743). Consequentemente, foi produzida uma planta transformada. Especificamente, a seleção da planta transformada foi repetida em meio

28 / 32 de ágar (meio de cultura Murashige-Skoog em meia concentração) contendo canami- cina servindo como marcador seletivo, até que ocorresse a geração para que todas as sementes demonstrassem resistência à canamicina (uma geração não exibe divergên- cia). No processo de seleção, foi determinado que caracteres da resistência à canami- S cina divergiram em uma relação de 3: 1 e que os vetores de expressão foram introduzi- dos em pelo menos um cromossomo simples.

A planta obtida conforme acima é doravante denominada "35S-GSHl". (3) Determinação do teor de açúcar Foram cultivados 35S-GSH 1 e o tipo natural de Arabidopsis lO thaliana (Col-O) para fins comparativos, a uma intensidade de luz de crescimento de 5OµEm-2s-I ou 5O0µEm-2s-'. Depois do cultivo de uma semana, cada corpo de planta foi colhido.

Então, cada corpo de planta foi congelado com nitrogênio líquido, moído e transformado em pó e depois disso subme- tido a extração usando lOOíl de 50mM de solução tampão de acetato de sódio por 15 50mg de corpo de planta.

Em seguida, foram determinados o teor de glicose e o teor de amido de cada extrato assim obtido.

O teor de glicose foi determinado 'usando o Teste de Glico- se CII Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). O teor de amido foi determinado misturando o extrato com 3 5 Unidades/ml de amiloglucanase e uma solução tampão '" 20 de acetato de sódio (50mM, pH 4,5), deixando a mistura resultante em repouso duran-

.: " te 1 hora e então determinando a quantidade de glicose.

Os resultados da determina- . ção são mostrados na Figura 4. A Figura 4 mostra os resultados da determinação do

- teor de amido e de glicose de 35S-GSHl.

Na Figura 4, (a) mostra o teor de amido e (b) mostra o teor de glicose.

Em (a) e (b) da Figura 4, as escalas verticais indicam os 25 teores relativos de amido e de glicose, respectivamente e as escalas horizontais indi- cam os tipos de plantas.

A e B mostrados na Figura 4 são resultados de 35S-GSHl.

No presente exemplo, foram usadas duas plantas 35 S-GSHl em um experimento como A e B ilustrados na Figura 4. O termo "teor relativo" acima significa uma quantidade relativa na qual uma quantidade na Col-O cultivada com intensidade de luz de cresci-

30 mento de 501Em"',"' é de 100. Conforme ilustrado na Figura 4, 35 S-GSHl apresentou um teor de ami- do mais elevado e um teor de açúcar mais elevado que Col-O. <Exemplo 8. Produção de Prunus avium>

29 / 32 Na presente invenção, Prunus avium foi cultivada. Especificamente, 4 semanas e 3 semanas antes da data prevista para colheita do fruto Prunus avium (Na- poleão), uma superfície de folha em um ramo com fruto a ser colhido foi coberta com 0,5níM de GSSG. O fruto foi colhido na data prevista. 5 Em seguida, o fruto colhido foi submetido a um teste sensorial do teor de açúcar. Como consequência, foi determinado que o fruto que recebeu aplicação de GSSG apresentou aumento do teor de açúcar e menor acidez. Além disso, foi determi- nado que o fruto que recebeu a aplicação de GSSG apresentou peso maior. Além dis- so, o huto obtido foi submetido a determinação do teor de açúcar usando o Rehatô- 10 metro "Pocket" APAL-I (ATAGO CO., LTD.). Para fins comparativos, o fruto que não recebeu aplicação GSSG também foi submetido à determinação do teor de açúcar. A Figura 5 ilustra um resultado da determinação do teor de açúcar do fruto Prunus avium obtido no presente exemplo. Na Figura 5, a escala vertical indica teor de açú- car (Brix, unidade:°4). Além disso, uma análise ANOVA foi realizada usando StatVi- 15 ew 5.0 (SAS Institute Inc.) com um nível de diferença significativo de S°/o. Conse- quentemente, foi mostrada uma diferença significativa. Conforme descrito acima, a aplicação de GSSG tornou possível obter o fruto de Prunus avium com urn teor de açúcar significativamente melhorado. <Exemplo 9. Produção de Citrus unshiu> 7T 20 No presente exemplo, Citrus unshiu foi cultivada. Especificamente, P rP m uma semana antes da data prevista para colheita do fruto Citrus unshiu, uma superfí-

W cie de folha em um ramo com fruto a ser colhido foi coberta com 0,5mh1 de GSSG. O

W fruto foi colhido na data prevista. Em seguida, o fruto colhido foi submetido a um teste sensorial do teor 25 de açúcar. Como conse.quência, foi determinado que o fruto que recebeu aplicação de GSSG apresentou aumento do teor de açúcar e menor acidez. Além disso, foi determi- nado que o fruto que recebeu a aplicação de GSSG apresentou peso maior. Além dis- so, o fruto obtido foi submetido a determinação do teor de açúcar usando o RefratÔ- metro "Pocket" APAL-I (ATAGO CO., LTD.). Para fins comparativos, o fruto que 30 não recebeu aplicação GSSG também foi submetido à determinação do teor de açúcar. A Figura 6 ilustra um resultado da determinação do teor de açúcar do huto Citrus un- shiu obtido no presente exemplo. Na Figura 6, a escala vertical indica teor de açúcar (Brix, unidade:%). Além disso, uma análise ANOVA foi realizada usando StatView

30 / 32

5.0 (SAS Institute Inc.) com um nível de diferença significativo de 5°/0. Consequente- mente, foi mostrada uma diferença significativa. Conforme descrito acima, a aplicação de GSSG tornou possível obter o fruto de Citrus unshiu com um teor de açúcar significativamente melhorado. 5 <Exernplo 10. Produção de Fragaria ananassa> No presente exemplo, Fragaria ananassa foi cultivada com o uso de GSSG ou GSH. Detalhes do cultivo estão descritos abaixo. Primeiro, as mudas de Fragaria ananassa foram transplantadas para um vaso para plantio. No vaso para plantio, 6L de vermiculita (ASAHI INDUSTRIES 10 Co., LTD.), 3L de solo para horticultura KUREHA (KUREHA CORPORATION) e 3L de vermieulita foram colocados seguindo uma camada inferior, uma intermediária e uma superior, respectivamente. Durante o cultivo de plantas Fragaria ananassa, 50mL de 0,2mM ou 0,5mM de GSSG ou 50mL de 0,4mM ou 0,5mM de GSH (ajustado com O,IN de Na- 15 OH para ter um pH 7) foram aplicados uma vez por semana na raiz por planta. As plantas foram cultivadas durante 63 dias sem serem submetidas à remoção do broto. Para comparação, uma planta Fragaria ananassa foi cultivada sob a mesma condição, exceto pelo fato de que não foram aplicadas GSSG e GSH. Foram aplicados às plan- tas de qualquer condição, 3g de nitrato de amônio e potássio fosforado Kumiai S-604 'r "r 20 (Chisso Asahi Fertilizer Co., Ltd.) como fertilizante adicional uma vez em 2 semanas. '* T ¶ Em seguida, o fruto colhido foi submetido a testes sensoriais de teor de * açúcar e similar. Como consequência, foi determinado q ue o fruto da planta que rece- beu aplicação de GSSG apresentou aumento do teor de açúcar e diminuição da acidez em comparação ao da planta que não recebeu aplicação de GSSG ou GSH. Além dis- 25 so, foi determinado que a planta que recebeu aplicação de GSSG apresentou aumento do número de frutos. Também foi deteminado que o fruto da planta que recebeu apli- cação de GSH apresentou aumento do teor de açúcar e acidez. Além disso, o fruto obtido foi submetido a determinação do teor de açú- car usando o Refratômetro "Pocket" APAL-I (ATAGO CO., LTD.). Para comparação, m o fruto que não recebeu aplicação GSSG ou GSH também foi submetido à determina- ção do teor de açúcar. A Figura 7 ilustra um resultado da determinação do teor de a- çúcar do fruto Fragaria ananassa obtido no presente exemplo. Na Figura 7, a escala vertical indica teor de açúcar (Brix, unidade:%). Além disso, uma análise ANOVA foi

31 / 32 realizada usando StatView 5.0 (SAS Institute Inc.) com um nível de diferença signifi- cativo de S°/o.

Consequentemente, foi mostrada uma diferença significativa.

Esses resultados indicaram que o fruto de Fragaria ananassa com um teor maior de açúcar poderia ser produzido por cultivo usando um meio de cultura 5 contendo GSSG ou GSH. <Exemplo 11. Produção de Zea mays L. var. saccharata Sturt> No exemplo, foi cultivada a planta Zea mays L. var. saccharata Sturt.

Primeiro, uma semente de Zea mays L. var. saccharata Sturt (TAKII & CO.

Ltd., no- me do produto: Canberra 86) foi semeada em vermiculita (ASAHI INDUSTRIES Co., 10 LTD.). Duas semanas depois de semear, a planta Zea mays L. var. saccharata Sturt foi transplantada para um vaso de cultura hidropônica descrito no Exemplo 1. Foram a- plicados à planta 3g de nitrato de amônio e potássio fosforado S-604 (Chisso Asahi Fertilizer Co., Ltd.) como fertilizante adicional 4 semanas e 6 semanas após a semea- dura. 15 Na 5'", 6"', 7" e 8'" semanas após a semeadura, foi pulverizado 0,5mM de GSSG (dissolvido em 0,1°4 de Tween80 servindo como agente de difusão) sobre a superfície de uma folha.

Para comparação, uma planta Zea mays L. var. saccharata Sturt foi cultivada pelo mesmo método do presente exemplo, exceto pelo fato de que foi aplicado Tween80 e não GSSG, e o fruto da mesma foi colhido. r

'"20 O fruto foi colhido 86 dias após a semeadura e submetido a um teste

Z- . - .. sensorial do teor de açúcar.

Como consequência, foi determinado que o fruto da planta com aplicação de GSSG apresentou aumento do teor de açúcar em comparação ao da ."' planta sem aplicação de GSSG.

Além disso, o fruto obtido foi submetido a determina-

ção do teor de açúcar usando o Refratômetro "Pocket" APAL-I (ATAGO CO., LTD.). 25 Para comparação, o fruto da planta que não recebeu aplicação de GSSG também foi submetido à determinação do teor de açúcar.

A Figura 8 ilustra um resultado da de- terminação do teor de açúcar do fruto de Zea mays L. var. saccharata Sturt obtido no presente exemplo.

Na Figura 8, a escala vertical indica teor de açúcar (Brix, unida- de:°'6). Além disso, uma análise ANOVA foi realizada usando StatView 5.0 (SAS Ins- 30 titute lnc.) com um nível de diferença significativo de 5°/,, Consequentemente, foi mostrada uma diferença significativa.

Também foi determinado que a planta com aplicação de GSSG apresen- tou aumento do tamanho e do número de frutos.

Além disso, foi determinado que o

32 / 32 huto da planta que recebeu aplicação de GSSG já era capaz de ser colhido 70 dias após a semeadura.

Os resultados acima indicaram que o fruto de Zea mays L. var. saccha- rata Sturt com um teor maior de açúcar poderia ser produzido por cultivo usando um 5 meio de cultura que inclui GSSG.

A composição, de acordo com a presente invenção, para produzir um corpo de planta com teor de açúcar melhorado inclui uma substância para regular o estado de oxidação-redução de célula.

Portanto, com a composição de acordo com a presente invenção, é possível produzir facilmente o corpo de planta com um teor de lO açúcar melhorado.

Os modos de realização e exemplos concretos de implementação discu- tidos na explicação detalhada acima servem unicamente para ilustrar os detalhes téc- nicos da presente invenção, os quais não devem ser interpretados de forma restrita dentro dos limites desses modos de realização e exemplos eoncretos, mas, ao contrá- 15 rio, podem ser aplieados em muitas variações dentro do espírito da presente invenção, desde que essas variações não excedam o escopo das reivindicações de patente descri- tas abaixo.

Aplicabilidade Industrial A composição de acordo com a presente invenção com a qual pode ser r" ~

20 facilmente produzida uma planta com teor de açúcar melhorado é aplicável industri- '~ *

almente na agricultura, indústria alimentícia e similar.

Além disso, considerando que &

o etanol pode ser produzido com grande eficiência a partir de uma planta com um alto teor de açúcar, a composição de acordo com a presente invenção é aplicável a uma ampla variedade de indústrias, por exemplo, a indústria energética.

Claims (1)

1. I/1 Reivindicações 1)-"COMPOSIÇÃO PARA PRODUÇÃO DE CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚCAR MELHORADO", caracterizada por uma substância (excluindo peróxido de hidrogênio) para regular o estado de oxidação-redução de célula. 5 2)-"COMPOSIÇÃO PARA PRODUÇÃO DE CORPO DE PLANTA COM TEORDE AÇÚCAR MELHORADO" de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela subs- tância ser a glutationa, um polinucleotídeo q ue codifica y-glutamilcisteína sintetase, ou um polinucleotídeo que codifica frutose-1,6-bisfosfato aldolase tipo plastídeo de ligação de glutationa. lO 3)-"COMPOSIÇÃO PARA PRODUÇÃO DE CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚCARMELHORADO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapela subs- tância ser glutationa oxidada. 4)-"CONJUNTO PARA PRODUZIR UM CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚCAR MELHORADO", caracterizado por compreender uma substância (excluin- 15 do peróxido de hidrogênio) para regular o estado de oxidação-redução de célula. 5)-"MÉTODO PARA PRODUZIR UM CORPO DE PLANTA COM TEOR DE AÇÚ- CAR MELHORADO", caracterizado por etapa de cultivar o corpo de planta usando uma substância (excluindo peróxido de hidrogênio) para regular um estado de oxida- > ção-redução de célula. 20 6)- "CORPO DE PLANTA" caracterizado por ser obtido pelo método de produção e 'R— b, referido na reivindicação 5.

   a r P.a 0

   R 1 /7 ")'))1l G,H GSSG Cont Con 2 Sunny FlG, 1 g ') ,"' /zji )) )/("/ÀJl-) gsh GSSG Cont Cont2 Sunny FlG. 2

   P Y.0 % 0 2/ 7 j-o-gsH ! _ 10 1 t j-ú-gssgj Cí° 4 &, j©"Cont| Z9} qZ -j} m ? 6 :j 0 1 2 . 3 4

   DIAS A PARTIR DA APLICAÇÃO FlG. 3 r b. 9, % 9' 3/ 7 (A)

   AMIDO N ::: ,nn %1 ,n,,n,,,a,, O 1400 mm, ljj PA fZl I DE CRESCIMENTO " 'LUMÍNAÇAO !')! ) \ "!""'Êíi"" u, c, r_i VA r_i tu E_l rm j— TIPO.NATURAL A B f (COI) ' " 35S-GSH1 (B) GLICOSE { Í!) , , " ., :\'2!!:'¢" Ê 100 ' Zl 500 O 50 . 2 0 " TlPO NATURAL A B r (Col) ' T 35S-GSH1 FlG. 4 r ¥ u .4 n 4/ 7 ')'))J,,g5 tratado 12 * S " qZ < "à '° < "Y@S \ ')W j

   TRATADO FlG. 6 r 'b @ .'í

   V 5/ 7 12j )')i))í

   0.2mM 0.5 mM 0.4 mM 1.0 mM

   CULTIVO OXIDADA REDUZIDA

   NORMAL GLUTATIONA FlG. 7

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   R 6/ 7

   J 20 *

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   IJJ

   È ljj }— - - JJÍ 18 P

   NÃO GSSG

   TRATADO FlG. 8

   ? "às -'!. D" 7/ 7 — AtCytFBA AT4G26520 SEQ ID NO 36 mGFBA2 BTO12696 SEQ ID NO 22 mLeFBA3 BTO12701 SEQ ID NO 23 mPtFBA2 EF147567 SEà ID NO 32 - mPtFBA3 EF147603 SEQ ID NO 33 - mOsFBA2 OS11@7020 SEQ ID NO 28

   P r- mHvFBA3 AK252603 SEQ ID NO 20 L—mHvFBA2 AK252711 partial SEQ ID NO 1 9 r FBA2/3 group — mAtFBA2 AT2G21330 SEQ ID NQ 16 - mAtFBA3 AT4G38970 SEQ ID NO 17 mPsFBA2 EFO84931 SEQ ID NO 30 mLjFBA2 chr3.CM0216.760 SEQ fO NO 25 - mljFBA3 chr4.CMD087.390 SEQ ID NO 26 J | mPsFBA1 EFO85589 SEQ ID NO 29 mOsFBA1 OsO1g02880 SEQ ID NO 27 - mZmFBA1 8TO17456Partia1 SEQ ID NO 34 mHvFBA1 RFL Contig2639 SEQ ID NO 18 - mAtFBA1 AT2GO1140 SEQ ID NO 1 5 :> FBAI graup . mLjFBA1 chr5.CM0328.30 partial SEQ1DNO24 I - mPtFBA1 EF14685Q SEQ ID NO 17 - mLeFBA1 BTO13615 SEQ ID NO 21 . mGmFBA1 ShotgunCDntig SEQ ID NO 35 0,1 FlG,9