BRPI0810658B1 - Construto de dna, método de produção de uma planta de milho transgênica com teor alto de asparagina, alimento ou ração e método de produção do mesmo - Google Patents

Abstract

PLANTAS E SEMENTE DE MILHO COM TEOR AUMENTADO DE ASPARAGINA E PROTEÍNA. A presente invenção refere-se a uma e a uma semente de milho com níveis aumentados de proteína e aminoácidos. A invenção refere-se também a construtos de DNA que proveem expressão em células de milho transgênicas de uma enzima asparagina sintetase. Os construtos de DNA são usados em um método para produzir plantas e sementes de milho transgênicas e selecionar plantas e semente com níveis aumentados de proteína e aminoácidos.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se em geral ao campo de biotecnologia de planta e mais especificamente a aumento de asparagina e proteína em plantas e sementes.

2. Descrição da Técnica Relacionada

[0002] Fazendeiros e consumidores desejam plantas de cultura com características agronômicas aperfeiçoadas tais como rendimento aumentado, produção de proteína de semente aumentada e composição nutricional aperfeiçoada. Componentes nutricionais desejados de plantas de cultura incluem, entre outros, fibra, antioxidantes tais como Vitamina E, selênio, ferro, magnésio, zinco, vitaminas B, lignanos, ácidos fenólicos, aminoácidos essenciais e fitoestrogênios. Embora esforços consideráveis em cultivo de planta tenham provido alguns ganhos nessas características desejáveis, a habilidade em introduzir DNA não-hospedeiro específico em um genoma de planta provê mais oportunidades para geração de plantas com essas características. Em particular, embora o rendimento de milho convencional tenha aumentado uniformemente com os anos, não houve um aumento similar na capacidade de plantas de milho em assimilar nitrogênio mais eficientemente ou aumentar o teor de proteína da semente.

[0003] Disponibilidade de nitrogênio tem um impacto positivo significante sobre produtividade de planta, biomassa e rendimento de cultura incluindo a produção de proteína de semente. Em plantas, nitrogênio inorgânico é assimilado do solo, reduzido para amônia e incorporado a nitrogênio orgânico na forma de aminoácidos de transporte de nitrogênio asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Asparagina (Asn) é a molécula de transporte de amida preferida por causa de sua razão de nitrogênio para carbono alta (2N:4C versus 2N:5C) e porque ela é relativamente inerte. Asn e outros aminoácidos também são usados como elementos básicos para síntese de proteína.

[0004] Em plantas, Asn é sintetizada a partir de glutamina, aspartato e ATP, em uma reação catalisada pela enzima asparagina sintetase (AsnS). Glutamato, AMP e pirofosfato são formados como subprodutos. Duas formas de AsnS foram descritas: uma forma dependente de glutamina e uma forma dependente de amônia. A AsnS dependente de glutamina pode catalisar ambas as reações dependentes de glutamina e dependentes de amônia embora glutamina seja a fonte de nitrogênio preferida.

[0005] Concentração alta de proteína é considerada uma característica de qualidade importante para a maioria das principais culturas, incluindo soja, milho e trigo. Variedades de milho, trigo e sojas com muita proteína, por exemplo, foram identificadas através de geração tradicional. No entanto, a maioria das linhagens com muita proteína desenvolvida desta maneira têm obstáculo de rendimento ou outras desvantagens agronômicas. Seria desejável se o teor de proteína de culturas, especialmente milho, pudesse ser aumentado acima dos níveis atualmente disponíveis, ambos para o consumo humano e para o uso do produto em rações animais. Isto ofereceria o benefício de valor de nutriente bastante aumentado quando a cultura é usada como alimento e ração para seres humanos e animais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A invenção provê métodos e composições para desenvolvimento de culturas e produtos de planta para aumentar o teor de proteína e aminoácido. Os métodos e as composições aumentam o nível de aminoácidos e proteína livres em tecidos de planta, particularmente em sementes. Mais especificamente, plantas e sementes transgênicas são providas, as quais contêm composições de DNA heterólogo que expressam um produto de gene envolvido em biossíntese de asparagina aumentada e proteína aumentada. A expressão do produto aumenta o valor nutricional de fontes de milho para alimento e milho para ração e produtos processados derivados de semente de milho transgênico ou partes do mesmo.

[0007] Em um aspecto, a invenção provê métodos para aumento do teor de proteína em uma planta de milho. Construtos de DNA compreendendo uma sequência de polinucleotídeo codificando polipeptídeos com atividade de asparagina sintetase são também providos.

[0008] Em outra modalidade, a presente invenção compreende uma célula de planta de milho transformada com a composição de DNA heterólogo codificando uma asparagina sintetase identificada aqui. Em modalidades específicas, a expressão heteróloga de uma molécula de polinucleotídeo de AsnS4 (isozima 4 de asparagina sintetase) de milho é provida, por exemplo, para resultar em asparagina e/ou proteína elevada em uma planta transgênica, incluindo as sementes, com relação à planta da mesma variedade não expressando a molécula de polinucleotídeo de AsnS2 de milho heteróloga.

[0009] Em modalidades particulares, uma sequência de ácido nucleico é provida, bem como métodos de uso da mesma, onde a sequência é selecionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência de acido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 50; (b) uma sequência de ácido nucleico com pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 50, onde a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo compreendendo atividade de asparagina sintetase; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 51; (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de polipeptídeo com pelo menos cerca de 90% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 51, onde o polipeptídeo compreende atividade de asparagina sintetase; e (e) uma sequência de ácido nucleico que hibridiza para uma sequência de (a)-(d) sob condições de estringência de cerca de 0,2 x SSC e 65°C, onde a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo compreendendo atividade de asparagina sintetase. Em modalidades particulares, são providos ácidos nucleicos tendo pelo menos 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 50. Em modalidades adicionais, são providos ácidos nucleicos codificando uma sequência de polipeptídeo tendo pelo menos 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 51. A invenção também provê sequências de polipeptídeo isoladas compreendendo SEQ ID NO: 51, bem como sequências tendo pelo menos 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com ela.

[00010] A presente invenção refere-se também a alimento ou à ração de animal preparada a partir de uma semente provida pela invenção com teor de proteína e/ou aminoácido aumentado, ou um produto processado de tal semente, por exemplo, uma farinha. Deste modo, a presente invenção também compreende uma semente de milho contendo uma enzima asparagina sintetase produzida através da expressão de um construto de DNA heterólogo compreendendo uma molécula de DNA codificando uma enzima asparagina sintetase de milho. Uma modalidade de tal semente é grão colhido, a presente invenção também compreende uma farinha, glúten e outros produtos de milho feitos de tal grão.

[00011] A presente invenção inclui sequências de iniciador de ácido nucleico isoladas compreendendo uma ou mais SEQ ID NOs: 52-59 ou um complemento das mesmas. A presente invenção inclui um método para detectar ou identificar, no genoma de uma planta transformada ou progênie da mesma, uma molécula de polinucleotídeo heteróloga codificando um polipeptídeo de AsnS de planta, ou um polipeptídeo de planta tendo atividade de AsnS da presente invenção, compreendendo uma molécula de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 52-59, onde a dita molécula de polinucleotídeo é usada como um iniciador de DNA em um método de amplificação de DNA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS Figuras

[00012] A Figura 1 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON79706.

[00013] A Figura 2 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66229.

[00014] A Figura 3 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66230.

[00015] A Figura 4 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66231.

[00016] A Figura 5 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66239.

[00017] Figura 6 Expressão de transgene em eventos de pMON79706. Barras de erro representam intervalo de 95% de segurança, com n=5 para eventos transgênicos e n=10 para controle de consanguíneo.

[00018] Figura 7 Expressão de transgene em eventos de pMON92870. Barras de erro representam intervalo de 95% de segurança, com n>3 plantas para eventos transgênicos e n=8 plantas para controle consanguíneo.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO E POLIPEPTÍDEO

[00019] A SEQ ID NO: 1 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma Asn1 de Zea mays.

[00020] A SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo de AsnS1 de Zea mays.

[00021] A SEQ ID NO: 3 é uma sequência de polinucleotídeo codificando AsnS2 de Zea mays.

[00022] A SEQ ID NO: 4 é um polipeptídeo de AsnS2 de Zea mays.

[00023] A SEQ ID NO: 5 é uma sequência de polinucleotídeos codificando AsnS3 de Zea mays.

[00024] A SEQ ID NO: 6 é um polipeptídeo de AsnS3 de Zea mays.

[00025] A SEQ ID NO: 7 é uma sequência de polinucleotídeo codificando AsnS de Glycine max.

[00026] A SEQ ID NO: 8 é um polipeptídeo de AsnS de Glycine max.

[00027] A SEQ ID NO: 9 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS de Xylella fastidiosa.

[00028] A SEQ ID NO: 10 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS de Xanthomonas campestris.

[00029] A SEQ ID NO: 11 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS de Bacillus halodurans.

[00030] A SEQ ID NO: 12 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS de Oryza sativa.

[00031] A SEQ ID NO: 13 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS de Galdieria sulphuraria.

[00032] A SEQ ID NO: 14 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS de Galdieria sulphuraria.

[00033] A SEQ ID NO: 15 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS de Galdieria sulphuraria.

[00034] A SEQ ID NO: 16 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS de Galdieria sulphuraria.

[00035] A SEQ ID NO: 17 é uma sequência de polinucleotídeo codificando uma AsnS CGPG3913 de Saccharomyces cerevisiae.

[00036] A SEQ ID NO: 18 é uma sequência de iniciador de PCR de AsnS avançado (f).

[00037] A SEQ ID NO: 19 é uma sequência de iniciador de PCR de AsnS avançado (f).

[00038] As SEQ ID NOs:20-43 são sequências de iniciador de PCR de AsnS avançado (f) e reverso (r) primárias e secundárias usadas em um procedimento de clonagem Gateway.

[00039] A SEQ ID NO: 44, uma sequência de iniciador de PCR de AsnS avançado (f).

[00040] SEQ ID NO: 45, uma sequência de iniciador de PCR de AsnS avançado (f).

[00041] SEQ ID NO: 46 iniciador sensoZmAS.

[00042] SEQ ID NO: 47 iniciador antissensoZmAS.

[00043] SEQ ID NO: 48 iniciador avançado de AsnS3 de milho

[00044] SEQ ID NO: 49 iniciador reverso de AsnS3 de milho

[00045] SEQ ID NO: 50 é uma sequência de polinucleotídeo codificando AsnS4 de Zea mays.

[00046] A SEQ ID NO: 51 é um polipeptídeo AsnS4 de Zea mays.

[00047] A SEQ ID NO: 52 é um iniciador de PCR avançado, Zm- AsnS1_for1.

[00048] A SEQ ID NO: 53 é um iniciador de PCR reverso, Zm- AsnS1_rev1.

[00049] A SEQ ID NO: 54 é um iniciador de PCR avançado, Zm- AsnS3_for2.

[00050] A SEQ ID NO: 55 é um iniciador de PCR reverso, Zm- AsnS3_rev2.

[00051] A SEQ ID NO: 56 é um iniciador de PCR avançado, Zm- AsnS4_for3.

[00052] A SEQ ID NO: 57 é um iniciador de PCR reverso, Zm- AsnS4_rev3.

[00053] A SEQ ID NO: 58 é um iniciador de PCR avançado, Zm- AsnS2_for4.

[00054] A SEQ ID NO: 59 é um iniciador de PCR reverso, Zm- AsnS2_rev4. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00055] O que segue é uma descrição detalhada da invenção provida para auxiliar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que de outro modo aqui definido, os termos devem ser compreendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica relevante. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser também encontradas em Rieger e outros, 1991; e Lewin, 1994. A nomenclatura para bases de DNA conforme mostrado em 37 CFR § 1.822 é usada. A nomenclatura-padrão de uma letra e três letras para resíduos de aminoácidos é usada. Modificações e variações nas modalidades descritas aqui podem ser feitas por aqueles versados na técnica sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.

[00056] A presente invenção provê um método para aumentar o teor de proteína em uma planta de milho através de introdução no genoma de uma célula de planta de milho de um polinucleotídeo heterólogo que expressa um polipeptídeo de AsnS na célula de planta transgênica. A presente invenção provê construtos de DNA que compreendem (compreende significa "incluindo, mas não limitado a") moléculas de polinucleotídeo, ou segmentos de uma molécula de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de AsnS, opcionalmente operavelmente ligadas a um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

[00057] Moléculas de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo AsnS ou análogo ou alelo do mesmo ou moléculas de polinucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito ou gene marcador/repórter são "isoladas" pelo fato de que elas foram pelo menos parcialmente preparadas in vitro, por exemplo, isoladas de seu estado nativo, de uma célula, purificadas e amplificadas, por exemplo, elas estão em combinação com elementos genéticos heterólogos para aqueles encontrados normalmente associados a elas em seu estado nativo. Conforme aqui usado, um construto de DNA heterólogo compreendendo uma molécula de polinucleotídeo codificando AsnS que foi introduzido em uma célula hospedeiro é preferivelmente não-idêntico a nenhuma molécula de polinucleotídeo presente na célula em seu estado nativo, não-transformado, e é isolado com relação a outras moléculas de DNA que acontecem no genoma da célula hospedeiro.

[00058] Conforme aqui usado, níveis "alterados ou aumentados" de asparagina em uma planta, tecido de planta ou célula de planta transformado são níveis que são maiores do que os níveis encontrados na planta, tecido de planta ou células de planta correspondentes não contendo os construtos de DNA da presente invenção.

[00059] Os agentes da presente invenção podem ser também recombinantes. Conforme aqui usado, o termo recombinante significa qualquer agente (por exemplo, DNA, peptídeo, etc.) que é, ou resulta, mesmo indiretamente, de manipulação humana de uma molécula de polinucleotídeo.

[00060] Conforme aqui usado em um aspecto preferido, um aumento na qualidade nutricional de uma semente, por exemplo, teor de proteína de semente aumentado, é determinado pela habilidade de uma planta em produzir uma semente tendo um rendimento maior de proteína ou um componente nutricional do que uma semente sem tal aumento em proteína ou qualidade nutricional. Em um aspecto particularmente preferido da presente invenção, o aumento em qualidade nutricional é medido com relação a uma planta com uma base genética similar à planta nutricionalmente mais elevada exceto que a planta da presente invenção expressa ou superexpressa uma proteína ou fragmento da mesma descrita nos presentes construtos de DNA heterólogo.

Moléculas de Polinucleotídeo

[00061] A presente invenção inclui e provê plantas e semente de milho transgênicas que compreendem em seu genoma um transgene compreendendo uma molécula de DNA heterólogo codificando uma enzima asparagina sintetase de milho (Zm.AsnS4), a molécula de DNA, por exemplo, compreendendo SEQ ID NO: 50 e sequências tendo pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade com tais sequências com atividade de asparagina sintetase.

[00062] Um aspecto adicional da invenção é um método para aumento da proteína em uma planta de milho através da introdução em uma célula de milho de um construto de DNA que provê moléculas de polinucleotídeo heterólogas, por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 50 que codificam uma enzima asparagina sintetase. O polinucleotídeo pode diferir de qualquer um desses exemplos sem alterar o polipeptídeo que ele codifica. Por exemplo, é compreendido que códons capazes de codificar tais substituições de aminoácido conservativas são conhecidos na técnica. Adicionalmente, a invenção compreende que polipeptídeos onde um ou mais aminoácidos foram deletados, substituídos ou adicionados sem alterar a função da asparagina sintetase podem ser usados na invenção.

[00063] Em um aspecto da presente invenção, os polinucleotídeos da presente invenção são ditos ser moléculas de polinucleotídeo introduzidas. Uma molécula de polinucleotídeo é dita ser "introduzida" se ela for inserida em uma célula ou organismo como um resultado de manipulação humana, sem importar o quanto indireto. Exemplos de moléculas de polinucleotídeo introduzidas incluem, sem-limitação, polinucleotídeos que foram introduzidos em células através de transformação, transfecção, injeção e projeção e aqueles que foram introduzidos em um organismo através de conjugação, endocitose, fagocitose, etc. Preferivelmente, o polinucleotídeo é inserido no genoma da célula.

[00064] Um subconjunto das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção são moléculas de polinucleotídeo em fragmento. Moléculas de polinucleotídeo em fragmento podem consistir em porção(ões) significante(s) de, ou na verdade a maioria das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção, tais como aquelas especificamente descritas. Alternativamente, os fragmentos podem compreender oligonucleotídeos menores (tendo de a partir de cerca de 15 a cerca de 400 resíduos de nucleotídeo e mais preferivelmente cerca de 15 a cerca de 30 resíduos de nucleotídeo ou cerca de 50 a cerca de 100 resíduos de nucleotídeo ou cerca de 100 a cerca de 200 resíduos de nucleotídeo ou cerca de 200 a cerca de 400 resíduos de nucleotídeo ou cerca de 275 a cerca de 350 resíduos de nucleotídeo). Um fragmento de uma ou mais moléculas de polinucleotídeo da presente invenção pode ser uma sonda e especificamente uma molécula de iniciador de PCR. Um iniciador de PCR é uma molécula de polinucleotídeo capaz de iniciar uma atividade de polimerase enquanto em uma estrutura de fita dupla com outro polinucleotídeo. Vários métodos para determinação da estrutura de sondas de PCR e técnicas de PCR existem na técnica.

[00065] Conforme aqui usado, duas moléculas de polinucleotídeo são ditas ser capazes de especificamente hibridizar uma para a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de polinucleotídeo antiparalela, de fita dupla.

[00066] Uma molécula de polinucleotídeo é dita ser o "complemento" de outra molécula de polinucleotídeo se elas exibirem complementaridade completa. Conforme aqui usado, moléculas são ditas exibir "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas ser "minimamente complementares" se elas puderem hibridizar uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra pelo menos sob condições de "baixa estringência" convencionais. Similarmente, as moléculas são ditas ser "complementares" se elas puderem hibridizar uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas umas para as outras sob condições de "alta estringência" convencionais. Condições de estringência convencionais são descritas por Sambrook e outros (2001) e por Haymes e outros (1985). Afastamentos de complementaridade completa são então permissíveis, contanto que tais afastamentos não impeçam completamente a capacidade das moléculas em formar uma estrutura de fita dupla. Então, a fim de que uma molécula de polinucleotídeo sirva como um iniciador ou sonda ela precisa ser apenas suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla sob concentrações de solvente e sal particulares empregadas.

[00067] Condições de estringência apropriadas que promovem hibridização de DNA são, por exemplo, 6 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 X SSC a 20-25°C, são conhecidas daqueles versados na técnica ou podem ser encontradas em Ausubel e outros, Eds. (1989), seção 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa estringência de cerca de 2,0 X SSC a 50°C a uma alta estringência de cerca de 0,2 X SSC a 65°C. Ainda, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência em temperatura ambiente, cerca de 22°C, a condições de alta estringência em cerca de 65°C. Ambos a temperatura e o sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante de modo que ácido nucleico hibridize especificamente para uma ou mais moléculas de polinucleotídeo providas aqui, por exemplo, conforme mostrado nas: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18-45 e 50, e complementos das mesmas, sob condições moderadamente estringentes, por exemplo, em cerca de 2,0 X SSC e cerca de 65°C.

[00068] Em uma modalidade de um método da presente invenção, qualquer uma das sequências de polinucleotídeo ou sequências de polipeptídeo, ou fragmentos de qualquer uma, da presente invenção pode ser usada para pesquisar sequências relacionadas. Conforme aqui usado, "pesquisa por sequências relacionadas" significa qualquer método de determinação da relação entre duas sequências incluindo, mas não limitado a, pesquisas que comparam homologia de sequência: por exemplo, uma pesquisa PBLAST de um banco de dados quanto à relação com uma sequência de polipeptídeo única. Outras pesquisas podem ser conduzidas usando métodos à base de perfil, tal como o HMM (Hidden Markov model) META-MEME, que é mantido pela South Dakota State University, SD e PSI-BLAST, que é mantido pelo National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health (NCBI).

[00069] Uma molécula de polinucleotídeo pode codificar uma molécula de polipeptídeo substancialmente idêntica ou substancialmente homóloga. Os graus de identidade ou homologia podem ser determinados através do uso de software de computador tal como o Programa Gap WISCONSIN PACKAGE. O programa Gap no WISCONSIN PACKAGE versão 10.0-UNIX da Genetics Computer Group, Inc. é baseado no método de Needleman e Wunsch, 1970. Usando o programa TBLASTN no software suite BLAST 2.2.1 (Altschul e outros, 1977) ou usando matriz BLOSUM62 (Henikoff e Henikoff, 1992). Uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção pode também codificar um polipeptídeo homólogo. Conforme aqui usado, uma molécula de polipeptídeo homólogo ou fragmento da mesma é uma molécula de proteína contraparte ou fragmento da mesma em uma segunda espécie (por exemplo, subunidade pequena rubisco de milho é um homólogo da subunidade pequena rubisco de Arabidopsis). Um homólogo pode ser também gerado através de técnicas de evolução molecular ou embaralhamento de DNA, de modo que a molécula retém pelo menos uma característica funcional ou de estrutura do polipeptídeo original (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.811.238).

[00070] Em uma modalidade preferida, qualquer uma das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção pode ser operavelmente ligada a uma região promotora que funciona em uma célula de planta para causar a produção de uma molécula de mRNA, onde a molécula de polinucleotídeo que é ligada ao promotor é heteróloga com relação àquele promotor. Conforme aqui usado, DNA "heterólogo" é qualquer sequência de DNA que não seja naturalmente encontrada próximo ao DNA adjacente. "Nativo" refere-se a uma sequência de ácido nucleico de ocorrência natural. Sequência "heteróloga" frequentemente se origina de uma fonte ou espécie estranha ou, se da mesma fonte, é modificada de sua forma e/ou localização original no genoma.

[00071] Conforme aqui usado, o termo "proteína", "molécula de peptídeo" ou "polipeptídeo" inclui qualquer molécula que compreenda cinco ou mais aminoácidos. Sabe-se bem na técnica que moléculas de proteína, peptídeo ou polipeptídeo podem sofrer modificação, incluindo modificações pós-traducionais, tais como, mas não limitado a, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Então, conforme aqui usado, o termo "proteína", "molécula de peptídeo" ou "polipeptídeo" inclui qualquer proteína que seja modificada por qualquer processo biológico ou não-biológico. Os termos "aminoácido" e "aminoácidos" referem-se a todos os L-aminoácidos de ocorrência natural. A definição pretende incluir norleucina, norvalina, ornitina, homocisteína e homosserina.

[00072] Um "fragmento de proteína" é uma molécula de peptídeo ou polipeptídeo cuja sequência de aminoácido compreende um subconjunto da sequência de aminoácido daquela proteína. Uma proteína ou um fragmento da mesma que compreende uma ou mais regiões de peptídeo adicionais não-derivadas daquela proteína é uma proteína "de fusão". Tais moléculas podem ser derivatizadas para conter carboidrato ou outras porções (tal como hemocianina do molusco keyhole limpet). Proteína de fusão ou moléculas de peptídeo da presente invenção são preferivelmente produzidas através de meios recombinantes.

Construtos de Planta e Transformantes de Planta

[00073] Um ou mais construtos de DNA da presente invenção que codificam uma asparagina sintetase podem ser usados em transformação ou transfecção de planta. Material genético exógeno pode ser transferido para uma célula de planta e a célula de planta regenerada em uma planta inteira, fértil ou estéril. Material genético exógeno é qualquer material genético, seja de ocorrência natural ou outro, de qualquer fonte que seja capaz de ser inserida em qualquer organismo.

[00074] Em um aspecto adicional da presente invenção, sequências de polinucleotídeo da presente invenção também codificam peptídeos envolvidos em localização intracelular, exportação ou modificação pós- traducional, por exemplo, peptídeos de trânsito de cloroplasto.

[00075] Conforme aqui usado, o termo "gene" inclui uma molécula de ácido nucleico que provê regulação de transcrição que inclui um promotor que funciona em plantas, moléculas não-traduzidas 5', por exemplo, íntrons e sequências-líder, uma molécula de ácido nucleico transcrita e uma molécula de terminação transcripcional 3'.

[00076] As moléculas de ácido nucleico codificando um polipeptídeo da presente invenção podem ser combinadas com outras sequências não-nativas ou heterólogas de várias maneiras. Por sequências "heterólogas" se quer dizer qualquer sequência que não seja encontrada naturalmente unida a uma sequência de nucleotídeo codificando polipeptídeo da presente invenção incluindo, por exemplo, combinações de sequências de nucleotídeo da mesma planta que não são naturalmente encontradas juntas, ou as duas sequências se originam de duas espécies diferentes. O termo "operativamente ligado" conforme usado em referência à disposição física e função de moléculas de polinucleotídeo reguladoras e estruturais que causam expressão regulada de uma molécula de polinucleotídeo estrutural operativamente ligada.

[00077] A expressão de um construto de DNA ou transgene significa a transcrição e o acúmulo estável de RNA senso ou antissenso ou proteína derivada da molécula de polinucleotídeo da presente invenção ou tradução da mesma. RNA "senso" significa transcrito de RNA que inclui o mRNA e então pode ser traduzido em polipeptídeo ou proteína pela célula."RNA antissenso" significa um transcrito de RNA que é complementar a todo ou parte de um transcrito primário alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um gene-alvo (Patente U.S. 5.107.065, incorporado aqui a título de referência). A complementaridade de um RNA antissenso pode ser com qualquer parte do transcrito de gene específico, isto é, na sequência de não-codificação 5', sequência não- traduzida 3', íntrons ou a sequência de codificação. "Transcrito de RNA" significa o produto resultante de transcrição catalisada por polimerase de RNA de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da sequência de DNA, ele é referido como o transcrito primário ou ele pode ser uma sequência de RNA derivada de processamento pós-transcripcional do transcrito primário e é referido como o RNA maduro.

[00078] Conforme aqui usado, o termo cassete de expressão de planta refere-se a um construto compreendendo as moléculas reguladoras de DNA necessárias operavelmente ligadas à molécula- alvo para prover expressão em uma célula de planta.

[00079] O construto de DNA da presente invenção pode, em uma modalidade, conter um promotor que causa a superexpressão do polipeptídeo da presente invenção, onde "superexpressão" significa a expressão de um polipeptídeo ou não normalmente presente na célula hospedeiro ou presente na dita célula hospedeiro em um nível maior do que normalmente expresso a partir do gene endógeno codificando o dito polipeptídeo. Promotores, que podem causar a superexpressão do polipeptídeo da presente invenção, são geralmente conhecidos na técnica, exemplos de tais que proveem padrão de expressão constitutivo incluem promotor do vírus do mosaico da couve-flor 19S e promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S (Patente U.S. 5.352.605), promotor do vírus do mosaico da escrofularia 35S (Patente U.S. 6.051.753), promotor do vírus baciliforme da cana-de-açúcar (Patente U.S. 5.994.123), promotor do vírus mosqueado amarelo da comelina (Medberry e outros, 1992), subunidade pequena do promotor da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase, promotor da triosefosfato isomerase citosólica do arroz, promotor da adenina fosforribosiltransferase, promotor 1 da actina do arroz (Patente U.S. 5.641.876), promotor da ubiquitina do milho, promotor da manopina sintase e promotor da octopina sintase.

[00080] Tais construtos genéticos podem ser transferidos ou para plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas incluindo, mas não limitado a, alfafa, maçã, Arabidopsis, banana, Brassica campestris, canola, mamona, café, milho, algodão, semente de algodão, crisântemo, crambe, pepino, Dendrobium spp., Dioscorea spp., eucalipto, festuca, linho, gladiolus, liliácea, semente de linho, painço, melão cantalupo, mostarda, aveia, palmas de óleo, colza de semente oleosa, amendoim, azevém perene, Phaseolus, semente de colza, arroz, sorgo, soja, centeio, tritórdeo, gramado, trigo, açafrão, sésamo, beterraba açucareira, cana-de-açúcar, amora, papaia, açafrão e girassol (Christou, 1996). Em uma modalidade preferida, o material genético é transferido para uma célula de milho.

[00081] Transferência de uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma proteína pode resultar em expressão ou superexpressão daquele polipeptídeo em uma célula transformada ou planta transgênica. Uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas codificadas por moléculas de polinucleotídeo da presente invenção podem ser superexpressas em uma célula transformada ou planta transformada.

[00082] Em uma modalidade, construtos de DNA da presente invenção compreendem uma molécula de polinucleotídeo codificando uma sequência de polipeptídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 50. A invenção provê células de milho transformadas onde, com relação a uma planta de milho não-transformada sem tal construto de DNA, a célula tem um nível de asparagina aumentado.

[00083] Em outra modalidade, os construtos de DNA da presente invenção compreendem uma molécula de DNA heteróloga operavelmente ligada a uma sequência de codificação de asparagina sintetase de milho, por exemplo, SEQ ID NO.: 1, 3, 5 ou 50, e o construto de DNA é célula de milho transformada. Em uma modalidade, construtos de DNA da presente invenção compreendendo SEQ ID NO: 50 ou sequências relacionadas descritas aqui são providos em uma célula de milho transformada, e expressão do construto de DNA provê um tecido de planta de milho com asparagina aumentada ou uma semente de planta de milho com proteína aumentada com relação à planta de milho não-transformada com o construto de DNA.

[00084] Em algumas modalidades, os níveis de um ou mais produtos da AsnS podem ser aumentados em uma planta toda ou localizados em um ou mais órgãos ou tecidos específicos da planta. Sem limitar o escopo da presente invenção, várias sequências de promotor são úteis para expressão do gene da enzima acima. Por exemplo, promotor PPDK do tipo C4 de milho (Glackin e outros, 1990), promotor PEPC do tipo C4 de milho (Hudspeth e Grula, 1989), promotor da subunidade pequena da Rubisco de arroz (Kyozuka e outros, 1993) e promotor da proteína de ligação a/b de clorofila de captação de luz (Sakamoto e outros, 1991), promotor da P-FDA (US20040216189A1, cuja sequência de polinucleotídeo é aqui incorporada a título de referência) e promotor da P-RTBV (Patente U.S. 5.824.857), cuja sequência de polinucleotídeo é aqui incorporada a título de referência). Por exemplo, os níveis de asparagina ou proteína podem ser aumentados em um ou mais tecidos e órgãos de uma planta incluindo sem limitação: raízes, tubérculos, caules, folhas, talos, frutas, bagas, nozes, casca, vagens, sementes e flores. Um órgão preferido é uma semente.

[00085] Para o propósito de expressão em tecidos de fonte da planta, tal como a folha, semente, raiz ou caule, é preferido que promotores utilizados tenham expressão relativamente alta nesses tecidos específicos. Expressão específica de tecido de uma proteína da presente invenção é uma modalidade particularmente preferida.

[00086] Construtos ou vetores de DNA podem também incluir, com a região de codificação de interesse, uma sequência de polinucleotídeo que age, no todo ou em parte, para terminar a transcrição daquela região. Várias tais sequências foram isoladas, incluindo a região 3' T- NOS (Ingelbrecht e outros, 1989; Bevan e outros, 1983). Regiões de terminação de transcrição reguladoras podem ser providas em construtos de expressão de planta da presente invenção também. Regiões de terminação de transcrito podem ser providas pela sequência de DNA codificando o gene de interesse ou uma região de terminação de transcrição conveniente derivada de uma fonte de gene diferente, por exemplo, a região de terminação de transcrito que é naturalmente associada à região de iniciação de transcrito. O versado na técnica vai reconhecer que qualquer região de terminação de transcrito conveniente que é capaz de terminar transcrição em uma célula de planta pode ser empregada nos construtos da presente invenção.

[00087] Um vetor ou o construto pode também incluir elementos reguladores, tal como íntrons. Exemplos de tais incluem o íntron Adh 1 (Callis e outros, 1987), o íntron da sucrose sintase (Vasil e outros, 1989), íntron hsp70 (Patente U.S. 5.859.347) e o elemento ômega TMV (Gallie e outros, 1989). Esses e outros elementos reguladores podem ser incluídos quando apropriado.

[00088] Um vetor ou construto pode incluir também um marcador selecionável. Marcadores selecionáveis podem ser também usados para selecionar plantas ou células de planta que contêm o material genético exógeno. Exemplos de tais incluem, mas não estão limitados a: um gene neo (Potrykus e outros, 1985), que codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado usando canamicina, nptII, G418, hpt, etc; um gene bar, que codifica resistência a bialafos; um gene da EPSP sintase mutante (Hinchee e outros, 1988; Reynaerts e outros, 1988; Jones e outros, 1987), que codifica resistência a glifosato; um gene da nitrilase que confere resistência à bromoxinila; um gene da acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia (Patente U.S. 4.761.373); D'Halluin e outros, 1992); e um gene da DHFR resistente a metotrexato (Thillet e outros, 1988).

Transformação de Planta

[00089] Os métodos mais comumente usados para transformação de células de planta são processo de transferência de DNA mediados por Agrobacterium e o processo mediado por biolística ou bombardeamento de microprojétil (isto é, a pistola de gene). Tipicamente, transformação nuclear é desejada, mas se for desejado transformar especificamente plasmídeos, tais como cloroplastos ou amiloplastos, plastídeos de planta podem ser transformados utilizando uma aplicação mediada por microprojétil do polinucleotídeo desejado.

[00090] Os métodos para introdução de transgenes em plantas através de transformação mediada por Agrobacterium utilizam um T- DNA (DNA de transferência) que incorpora os elementos genéticos do transgene e transfere esses elementos genéticos para o genoma de uma planta. Em geral, o(s) transgene(s) tendo em volta uma molécula de DNA de borda da direita (RB) e uma molécula de DNA de borda da esquerda (LB) é (são) transferido(s) para o genoma de planta em um local único. A molécula de "T-DNA" refere-se a uma molécula de DNA que integra em um genoma de planta através de um método de transformação mediado por Agrobacterium. As extremidades da molécula de T-DNA são definidas na presente invenção como sendo flanqueadas pelas regiões de borda do T-DNA de plasmídeos Ti de Agrobacterium. Essas regiões de borda são geralmente referidas como as regiões de borda da direita (RB) e borda da esquerda (LB) e existem como variações em sequência e comprimento de nucleotídeo dependendo de se elas são derivadas de linhagens produtoras de nopalina ou octopina de Agrobacterium. As regiões de borda geralmente usadas em construtos de DNA elaborados para transferência de transgenes em plantas são frequentemente de várias centenas de polinucleotídeos de comprimento e compreendem um sítio de corte onde uma endonuclease digere o DNA para prover um sítio para inserção no genoma de uma planta. Moléculas de T-DNA geralmente contêm um ou mais cassetes de expressão de planta.

[00091] Com relação a bombardeamento de microprojétil (Patentes U.S. 5.550.318; 5.538.880; e 5.610.042; cada uma das quais é especificamente aqui incorporada a título de referência em sua totalidade), partículas são revestidas com polinucleotídeos e aplicadas a células através de uma força propelente. Partículas exemplares incluem aquelas compreendidas de tungstênio, platina e, preferivelmente, ouro. Um método útil para aplicação de DNA a células de planta através de aceleração de partícula é o Biolistics Particle Delivery System (BioRad, Hercules, Califórnia), que pode ser usado para propelir partículas revestidas com DNA ou células através de uma tela, tal como uma tela de aço inoxidável ou tela Nytex, em uma superfície de filtro coberta com células de planta monocotiledôneas culturadas em suspensão. Técnicas de bombardeamento de microprojétil são amplamente aplicáveis, e podem ser usadas para transformar virtualmente qualquer espécie de planta. Exemplos de espécies que foram transformadas através de bombardeamento de microprojétil incluem espécies monocotiledôneas tais como milho (Publicação PCT WO 95/06128), cevada, trigo (Patente U.S. 5.563.055, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade), arroz, aveia, centeio, cana-de-açúcar e sorgo; bem como várias dicotiledôneas incluindo tabaco, soja (patente U.S. 5.322.783, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade), girassol, amendoim, algodão, tomate e legumes em geral (Patente U.S. 5.563.055, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade).

[00092] Para selecionar ou registrar as células de planta transformadas sem importar a metodologia de transformação, o DNA introduzido na célula contém um gene que funciona em um tecido de planta regenerável para produzir um composto que confere ao tecido da planta resistência a um composto de outro modo tóxico. Genes de interesse para uso como um marcador selecionável, classificável ou registrável incluiriam, mas não seriam limitados a genes de tolerância a GUS, proteína fluorescente verde (GFP), luciferase (LUX) e antibiótico ou herbicida. Exemplos de genes de resistência a antibiótico incluem aqueles que conferem resistência à canamicina (e neomicina, G418) e bleomicina.

[00093] A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas de vários explantes transformados são bem documentados na técnica. Este processo de regeneração e crescimento tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas e cultura dessas células individualizadas através de estágios comuns de desenvolvimento embriônico através do estágio de muda enraizada. Embriões e sementes transgênicos são similarmente regenerados. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são em seguida plantados em um meio de crescimento de planta apropriado tal como solo. As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram registradas positivas em um ensaio de avaliação, podem ser culturadas em meio que apóia a regeneração de plantas. Mudas em desenvolvimento são transferidas para mistura de crescimento de planta sem solo, e aclimatizadas, antes da transferência para uma estufa ou câmara de crescimento para maturação.

[00094] A presente invenção pode ser usada com qualquer célula ou tecido transformável. Por transformável conforme aqui usado se quer dizer uma célula ou um tecido que é capaz de propagação adicional para dar origem a uma planta. Aqueles versados na técnica reconhecem que várias células ou tecidos de planta são transformáveis onde após inserção de DNA exógeno e condições de cultura apropriadas as células ou tecidos de planta podem se formar em uma planta diferenciada. Tecido adequado para esses propósitos podem incluir, mas não estão limitados a, embriões imaturos, tecido escutelar, culturas de célula de suspensão, inflorescência imatura, meristema de broto, explantes nodais, tecido de calo, tecido hipocótilo, cotilédones, raízes e folhas.

[00095] Qualquer meio de cultura de planta adequado pode ser usado. Exemplos de meios adequados incluiriam, mas não estão limitados a, meios à base de MS (Murashige e Skoog, 1962) ou meios à base de N6 (Chu e outros, 18:659, 1975) suplementados com reguladores de crescimento de planta adicionais incluindo, mas não limitado a, auxinas, citocinas, ABA e giberelinas. Aqueles versados na técnica são familiares com a variedade de meios de cultura de tecido, que, quando suplementados apropriadamente, apóiam crescimento e desenvolvimento de tecido de planta e são adequados para transformação e regeneração de planta. Esses meios de cultura de tecido podem ser ou comprados como uma preparação comercial ou preparados como de costume e modificados. Aqueles versados na técnica têm ciência de meios e suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores de crescimento para uso em transformação e regeneração e outras condições de cultura tais como intensidade de luz durante incubação, pH e temperaturas de incubação que podem ser otimizadas para a variedade particular de interesse.

[00096] Qualquer uma das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção pode ser introduzida em uma célula de planta de uma maneira permanente ou transiente em combinação com outros elementos genéticos tais como vetores, promotores, intensificadores, etc. Ainda, qualquer uma das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção pode ser introduzida em uma célula de planta de modo que permita expressão ou superexpressão da proteína ou fragmento da mesma codificada pela molécula de polinucleotídeo.

[00097] A presente invenção também provê partes das plantas, particularmente partes reprodutoras ou de armazenamento, da presente invenção. Partes de planta, sem limitação, incluem semente, endosperma, óvulo, pólen ou tubérculos. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a parte da planta é uma semente de milho. Em uma modalidade, a semente de milho (ou grão) é um constituinte de ração animal.

[00098] Em uma modalidade preferida, a ração de milho ou farinha de milho ou proteína da semente de milho é elaborada para animais de criação ou para seres humanos ou para ambos. Métodos para produzir ração, farinha e proteína são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U.S. 4.957.748; 5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; e 6.156.227. Em uma modalidade preferida, a preparação de proteína é uma preparação com muita proteína. Tal preparação com muita proteína tem preferivelmente um teor de proteína maior do que cerca de 5% (p/v), mais preferivelmente 10% (p/v) e mais preferivelmente ainda 15% (p/v).

[00099] Descrições de métodos de cruzamento que são geralmente usados para características e culturas diferentes podem ser encontradas em um de vários livros de referência (por exemplo, Hayward, 1993; Richards, 1997; Allard, 1999).

Outros Organismos

[000100] Um polinucleotídeo da presente invenção pode ser introduzido em qualquer célula ou organismo tal como uma célula de mamífero, mamífero, célula de peixe, peixe, célula de ave, ave, célula de alga, alga, célula de fungo, fungos ou célula bacteriana. Uma proteína da presente invenção pode ser produzida em uma célula ou organismo apropriado. Hospedeiro e transformantes preferidos incluem: células de fungos tais como Aspergillus, leveduras, mamíferos, particularmente bovino e porcino, insetos, bactérias e algas. Bactérias particularmente preferidas são Agrobacterium tumefaciens e E. coli.

[000101] Em um aspecto da presente invenção, uma ou mais moléculas de ácido nucleico da presente invenção são usadas para determinar o nível de expressão (isto é, a concentração de mRNA em uma amostra, etc.) em uma planta (preferivelmente canola, milho, Brassica campestris, colza de semente oleosa, semente de colza, soja, crambe, mostarda, mamona, amendoim, sésamo, semente de algodão, semente de linhaça, açafrão, palma de óleo, cânhamo ou girassol) ou padrão (isto é, a cinética de expressão, taxa de decomposição, perfil de estabilidade, etc.) da expressão de uma proteína codificada em parte ou integral por uma ou mais da molécula de polinucleotídeo da presente invenção. Vários métodos podem ser usados para comparar a expressão entre duas ou mais amostras de células ou tecido. Esses métodos incluem ensaios de hibridização tais como northerns, ensaios de proteção de RNAse e hibridização in situ. Alternativamente, os métodos incluem ensaios do tipo PCR. Em um método preferido, expressão é avaliada através de hibridização de polinucleotídeos a partir de duas ou mais amostras para uma disposição de polinucleotídeos. A disposição contém uma pluralidade de sequências suspeitas conhecidas ou suspeitas estar presentes nas células ou tecidos das amostras.

[000102] Os exemplos que seguem são incluídos para demonstrar aspectos da invenção, aqueles versados na técnica devem, à luz do presente relatório, compreender que muitas mudanças podem ser feitas nos aspectos específicos que são descritos e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

EXEMPLOS

[000103] Aqueles versados na técnica vão compreender as muitas vantagens dos métodos e das composições providos pela presente invenção. Os exemplos que seguem são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser compreendido por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam técnicas constatadas pelos inventores funcionar bem na prática da invenção, e então podem ser consideradas constituir modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz do presente relatório, compreender que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui a título de referência até o ponto que elas suplementem, expliquem, provejam uma base para ou ensinem metodologia, técnicas ou composições empregadas aqui.

Exemplo 1 Construção de cDNA de planta de milho e soja e bibliotecas genômicas

[000104] Este exemplo descreve a produção de bibliotecas de cDNA feitas de tecidos de planta de milho e soja das quais as sequências de polinucleotídeo de AsnS de milho e de soja da presente invenção foram isoladas. Bibliotecas de cDNA foram geradas de tecido de Zea mays e Glycine Max usando técnicas conhecidas no campo, por exemplo, Alba, 2004. Bibliotecas de cDNA de milho foram feitas de dois tecidos diferentes. Uma biblioteca foi feita de sementes incipientes coletadas na fase lenta da linhagem consanguínea 90DDD5. Uma segunda biblioteca de cDNA de milho foi feita de tecido de cabelo de milho no estágio de crescimento de cabelo de milho da linhagem consanguínea de milho H99 e pólen em germinação da linhagem consanguínea de milho MO17. Para construção de uma biblioteca de cDNA de soja (Glycine Max), tecido meristemático e parte do hipocótilo foram excisados de sementes de soja secas reidratadas da variedade A3237 (Asgrow). Explantes foram preparados primeiro germinando sementes esterilizadas na superfície em meio de cultura de tecido sólido por 6 dias a 28°C em 18 horas de luz/dia, e então transferência das sementes germinadas para 4°C por pelo menos 24 horas. Para o tecido usado na preparação de biblioteca os cotilédones foram removidos para enriquecer o tecido específico de interesse. 0,5 a 2 gramas de tecido foram usados para preparação de RNA total e RNA poli A+. Para todas as bibliotecas de cDNA, tecidos de planta foram coletados e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. O tecido coletado foi armazenado a -80°C até preparação de RNA total. O RNA total foi purificado usando reagente Trizol da Invitrogen Corporation (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, U.S.A.), essencialmente conforme recomendado pelo fabricante. RNA poli A+ (mRNA) foi purificado usando contas dT oligo magnéticas essencialmente conforme recomendado pelo fabricante (Dynabeads®, Dynal Biotech, Oslo, Norway).

[000105] Construção de bibliotecas de cDNA de planta é bem conhecida na técnica e várias estratégias de clonagem existem. Vários kits de construção de biblioteca de cDNA estão comercialmente disponíveis. Bibliotecas de cDNA foram preparadas usando o Superscript® Plasmid System para síntese de DNA e Plasmid Cloning (Invitrogen Corporation), conforme descrito no protocolo de síntese de biblioteca de cDNA Superscript II. As bibliotecas de cDNA foram checadas para confirmar uma razão de inserto:vetor apropriada.

[000106] Uma biblioteca de DNA genômico foi construída usando DNA genômico isolado de Zea mays usando um protocolo de isolamento de DNA genômico modificado descrito abaixo (Dellaporta e outros, 1983). Mudas de milho foram cultivadas em solo ou em placas de Petri, foram colhidas e mantidas congeladas em nitrogênio líquido até extração. O tecido foi moído em um pó fino usando um pilão enquanto mantendo o tecido congelado com nitrogênio líquido. O tecido em pó foi transferido para um misturador Waring contendo 200 mL de tampão de extração de DNA frio (0°C) (sorbitol a 350 mM; Tris a 100 mM; EDTA a 5 mM; pH para 7,5 com HCl; bissulfito de sódio, 3,8 mg/mL) que foi adicionado um pouco antes do uso e homogeneizado em velocidade alta por 30-60 segundos. O homogenato foi filtrado em uma camada de gaze de algodão e coletado em uma garrafa de centrífuga. As amostras foram então centrifugadas a 2500 xg por 20 minutos e o sobrenadante e qualquer material verde solto foram descartados. O pélete foi então ressuspenso em 1,25 mL de tampão de extração de DNA e transferido para um tubo de polipropileno de 50 mL. Tampão de lise de núcleo (1,75 mL contendo Tris a 200 mM; EDTA a 50 mM; NaCL a 2 M; 2,0% (p/v) CTAB; pH ajustado para 7,5 com HCl) foi então adicionado, seguido pela adição de 0,6 mL de sarcosila 5% a (p/v). Os tubos foram suavemente misturados e as amostras foram incubadas a 65°C por 20 minutos. Um volume igual de clorofórmio:álcool de isoamila (24:1) foi adicionado e os tubos foram novamente suavemente misturados. Os tubos foram então centrifugados a 2500xg por 15 minutos e o sobrenadante resultante foi transferido para um tubo limpo. Um volume igual de isopropanol gelado foi vertido na amostra, e a amostra foi invertida várias vezes até que um precipitado se formou. O precipitado foi removido da solução usando uma pipeta de vidro e álcool residual removido ao permitir que o precipitado secasse ao ar por 2-5 minutos. O precipitado foi ressuspenso em 400 μL de tampão TE (Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH ajustado para 8,0).

Exemplo 2 Isolamento de sequências de polinucleotídeo de AsnS através de métodos de clonagem independentes de ligação e Gateway® e transformação de milho

[000107] Este exemplo ilustra o isolamento de moléculas de polinucleotídeo codificando AsnS usando métodos de clonagem independentes de ligação e Gateway® e a construção de construtos de DNA da presente invenção que compreendem as moléculas de polinucleotídeo que codificam polipeptídeos de AsnS isolados de várias fontes de plantas e micro-organismos conforme descrito na Tabela 1. As moléculas de promotor usadas para direcionar a expressão das moléculas de polinucleotídeo codificando AsnS ligadas são o promotor 1 da actina de arroz, P-Os.Act1 (Patente U.S. 5.641.876, aqui incorporada a título de referência); a PPDK de Zea mays (Matsuoka e outros, 1993), P-RTBV-1 (Patente U.S. No. 5.824.857, aqui incorporada a título de referência) e a P-Zm.NAS (molécula promotora da região genômica codificando um polipeptídeo da nicotianamina sintase 2 do milho).Tabela 1. Fonte da sequência de codificação de AsnS, promotor e construtos de DNA

[000108] C onagem independente de ligação foi d esenvolvida para clonar produtos de PCR e é baseada no anelamento de extremidades de fita simples não-palindrômicas. LIC é um método de clonagem eficiente, que não é limitado por sítios de restrição ou a necessidade de restrição de digestão de enzima ou reações de ligação e deixa junções sem suturas (Aslanidis e de Jong, 1990).

[000109] Segmentos de DNA de fita simples, terminais, são produzidos no vetor através do uso de uma "endonuclease de corte" e endonuclease de restrição. Uma endonuclease de corte é uma endonuclease que corta uma fita do dúplex de polinucleotídeo para criar fitas simples no vetor de clonagem. O vetor é primeiro linearizado com uma endonuclease de restrição padrão. Isto é então seguido por digestão com uma endonuclease de corte. Após tratamento com calor, segmentos de DNA de fita simples são produzidos no vetor. Um teor de GC de mais ou menos 55% é recomendado para amplificação por PCR a jusante e anelamento eficiente. O promotor, marcador ou outro elemento de sequência pode ser adicionado às extremidades 5' e 3' do produto amplificado através de PCR para criar um construto linear que pode ser usado em aplicações a jusante.

[000110] O construto de DNA pMON92870 foi montado a partir do vetor-base, pMON82060, e uma molécula de polinucleotídeo de AsnS3 de milho codificando um polipeptídeo de AsnS provido como SEQ ID NO: 5. A estrutura principal do plasmídeo pMON82060 foi linearizada usando a endonuclease de restrição, HpaI. A estrutura principal do plasmídeo foi então tratada com a endonuclease de corte, N.BbvC IA (New England Biolabs, Beverly, MA). Após digestão, a reação foi aquecida para 65°C. Isto faz com que as fitas cortadas de DNA dissociem de suas fitas de DNA complementares. A estrutura principal de plasmídeo linearizada resultante foi deixada com dois segmentos de DNA de fita simples, terminais, disponíveis para montagem.

[000111] A reação em cadeia da polimerase foi empregada para produzir os segmentos de DNA de fita simples terminais na molécula de DNA codificando AsnS. A sequência de polinucleotídeo de AsnS3 de milho (SEQ ID NO: 5) codificando o polipeptídeo de AsnS foi usada para a elaboração de iniciador de PCR avançado (SEQ ID NO: 48) e iniciador de PCR reverso (SEQ ID NO: 49). SEQ ID NO: 48: GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGC ATC SEQ ID NO: 49: GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCAG AC CGCG

[000112] Amplificação de reação em cadeia da polimerase foi realizada usando a polimerase térmica de alta fidelidade, KOD hot start DNA polimerase (Novagen, Madison, WI). A reação em cadeia da polimerase foi realizada em um volume de 25 μL contendo: 1X de tampão de KOD hot start DNA polimerase, betaína a 1M (Sigma, St. Louis, MO), MgSO4 a 1 mM, dNTPS a 250 μM, 5 pmols de cada iniciador e 1 unidade de KOD hot start DNA polimerase. A reação em cadeia da polimerase foi realizada em um ciclizador térmico PTC-225 DNA Engine Tetrad® (MJ Research Inc., Waltham, MA) usando os parâmetros de ciclizador que seguem: 1. 94°C por 2 minutos 2. 94°C por 15 segundos 3. 70°C por 30 segundos (-1°C por ciclo) 4. 72°C por 5 minutos 5. Ir para a etapa 2, 9 vezes 6. 94°C por 15 segundos 7. 60°C por 30 segundos 8. 72°C por 5 minutos 9. Ir para a etapa 6, 24 vezes 10. 72°C por 10 minutos 11. manter 10°C 12. fim

[000113] Uma segunda rodada de reação em cadeia da polimerase foi realizada para introduzir resíduos uridina na região onde os segmentos de DNA de fita simples, terminais, foram produzidos. Muitas polimerases de DNA são incapazes de ler resíduos uridina na fita molde de DNA ou são incapazes de polimerizar fitas usando resíduos uridina. Reação em cadeia da polimerase foi então realizada usando uma enzima capaz de incorporação e leitura de uridinas (Expand High Fidelity® mais PCR System; Roche, Indianapolis, IN). Modificação deste método e uso de outros métodos que proveem o resultado esperado são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[000114] O construto de DNA montado foi transformado em células competentes de E. coli ElectroMAX® DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma alíquota de 0,5 μL (microlitro) da reação de montagem foi misturada com 20 μL de células competentes ElectroMAX® DH10B em gelo e carregadas em um cadinho de eletroporação de 0,2 mm MicroPulser (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) para eletroporação. As células foram submetidas à eletroporação a 1,8 kV usando um 165-2100 MicroPulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories, Inc.). As células eletroporadas foram incubadas em 180 μL de meio SOC (Invitrogen, Inc.) a 37°C por 1 hora. As células foram então plaqueadas em placas de ágar LB contendo espectinomicina (75 mg/mL) e cultivadas da noite para o dia a 37°C. Colônias foram selecionadas e cultivadas em meio LB da noite para o dia a 37°C. O construto de DNA de plasmídeo foi isolado usando o QIAprep® Spin Miniprep Kit (QIAgen Sciences, Valencia, CA). Sequenciamento de DNA foi realizado em um ABI 3730x1 DNA Analyzer, usando terminador BigDye® (Applied Biosystems, Foster City, CA).

[000115] A clonagem de sequências de polinucleotídeo codificando AsnS AsnS2 de milho, AsnS de soja e AsnS1 de levedura foi realizada usando o método de clonagem Gateway® conforme descrito pelo fabricante (Invitrogen Corp.). O objetivo do método de clonagem Gateway® é fazer um clone de expressão. Este processo de duas etapas envolve primeiro, a clonagem do gene de interesse em um vetor de entrada, seguido por subclonagem do gene de interesse a partir do vetor de entrada para um vetor de destino para produzir um vetor de expressão. A tecnologia de clonagem é baseada no sistema de recombinação específica de sítio usado por fago lambda para integrar seu DNA no cromossomo de E. coli.

[000116] Construtos de DNA para uso em clonagem de recombinação subsequente, duas sequências de recombinação attB ou attR foram clonadas em um vetor recombinante flanqueando um gene de resistência à Espectinomicina/Estreptomicina (SPC/STR) e uma sequência de polinucleotídeo codificando AsnS. As sequências de polinucleotídeo codificando AsnS foram isoladas de bibliotecas de cDNA ou genômicas feitas de suas respectivas espécies usando as sequências de iniciador primárias e secundárias (SEQ ID NOs: 20-43). Os attB1/R1, gene de SPC/STR, gene de AsnS e sequências att-B2/R2 contíguos foram movidos como uma molécula de polinucleotídeo única para um construto recombinante para expressão em células de planta, os plasmídeos de DNA de fita dupla chamados pMON79706 (AsnS2 de Zea mays), pMON79700 (AsnS de Glycine Max) ou pMON79653 (AsnS de Saccharomyces cerevisiae). Esses construtos de DNA compreendem as regiões da borda direita (O-OTH.-RB) e as regiões da borda esquerda (LB) de Agrobacterium, e outros descritos por Herrera- Estrella e outros 1983; Bevan, 1984; Klee e outros, 1985, o promotor e35S (P-CAMV.35S, intensificador duplicado em tandem Patente U.S. 5.322.938), o elemento genético attB1/R1 (O-Lam.attB1/R1), o gene de SPC/STR, a respectiva região de codificação de AsnS (CR), o elemento genético attB2/R2 (O-Lam.attB2/R2), terminador II do inibidor da protease da batata (St.Pis), o promotor NOS de Agrobacterium (P- AGRtu..nos, Fraley e outros, 1983), a borda da esquerda de Agrobacterium (O-OTH.-LB), o gene de resistência à canamicina (CR- OTH.Kan, Patente U.S. 6.255.560) e a origem de replicação de E. coli (Ec.ori.ColE).

[000117] Os construtos de DNA foram amplificados em células Library Efficiency® DB3.1® (Invitrogen Corporation) sob seleção de cloranfenicol (25 μg/ml) e seleção de canamicina (50 μg/mL) para pMON79706, pMON79700 ou pMON79653. O DNA de vetor foi purificado a partir de culturas bacterianas usando um QIAGEN Plasmid Kit (QIAGEN Inc.).

[000118] DNA para pMON79700, pMON79706 e pMON79653 foi introduzido nos embriões de milho conforme descrito na Patente U.S. No. 5.015.580 usando o dispositivo de aplicação de gene de aceleração de partícula de descarga elétrica. Para bombardeamento de microprojétil de embriões imaturos pré-culturados de LH59, 35% a 45% de tensão máxima foram preferivelmente usados. Seguindo bombardeamento por microprojétil, o tecido de milho foi culturado no escuro a 27°C. Métodos de transformação e materiais para fabricação de plantas transgênicas da presente invenção, por exemplo, vários meios e células-alvo recipientes, transformação de embriões imaturos e subsequente regeneração de plantas transgênicas férteis são descritos nas Patentes U.S. 6.194.636 e 6.232.526 e Publicação de Pedido de Patente U.S. 20040216189, que são aqui incorporadas a título de referência.

[000119] Plantas de milho transgênicas férteis foram produzidas a partir de células de milho transformadas através do cultivo de calos transformados no meio de regeneração apropriado para iniciar desenvolvimento de broto e formação de muda. As mudas foram transferidas para o solo quando elas tinham cerca de 7,62 cm (3 polegadas) de altura e possuíam raízes (cerca de quatro a 6 semanas após transferência para o meio). As plantas foram mantidas por duas semanas em uma câmara de crescimento a 26°C, seguido por duas semanas em uma bancada com névoa em uma estufa. As plantas foram subsequentemente transplantadas em potes de 18,93 L (5 galões) e cultivadas até a maturidade na estufa. Polinações recíprocas foram feitas com a linhagem consanguínea LH59 de milho. A semente foi coletada de plantas de milho e usadas para análise de proteína e atividades de cruzamento adicionais.

Exemplo 3 Construção de vetor e transformação de milho com sequências de polinucleotídeo de AsnS

[000120] A AsnS2 de milho (SEQ ID NO: 3, pMON79706, Figura 1) foi amplificada através do uso de PCR (reação em cadeia da polimerase). As condições de reação para reação de PCR seguiram o protocolo do fabricante (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Aproximadamente 100 ng de DNA de milho, preparados conforme acima descrito, foram amplificados usando 30 nmols de cada um de iniciador avançado (f) (SEQ ID NO: 32) e iniciador reverso (r) (SEQ ID NO: 33) e 10 micromols de cada dATP, dCTP, dGTP e TTP, 2,5 unidades de TaKaRaLa Taq em 1X LA PCR Buffer II (Takara Bio INC., Shiga, Japão). Após incubação inicial a 94°C por 1 minuto, 35 ciclos de PCR foram realizados a 94°C por 45 segundos, seguido por anelamento a 60°C por 45 segundos, 72°C por 1 minuto e 15 segundos, seguido por 1 ciclo de 72°C por 7 minutos.

[000121] Cinco construtos de DNA de AsnS2 foram feitos. O primeiro construto de AsnS2 de milho foi feito isolando um fragmento de AsnS de 1821 pares de base de pMON79706 através de PCR, conforme acima descrito, seguido por digestão por restrição com enzimas de restrição XbaI e EcoRI. O gene de AsnS2 resultante foi ligado a pMON61560, que tinha sido também digerido com XbaI e EcoRI. O vetor de embaralhamento resultante (pMON66246) foi digerido com NotI e o inserto contendo o gene de AsnS2, em ligação operável com o promotor PPDK e terminador RGLUT1, foi ligado em pMON30167, que tinha também sido digerido com NotI. O plasmídeo pMON30167, que contém o gene de EPSPS, provê seleção com glifosato. O plasmídeo final resultante foi chamado pMON66230 (Figura 3).

[000122] Um segundo construto AsnS2 foi feito usando o gene de AsnS2 (pMON79706). O construto foi feito através da inserção do gene de AsnS2 digerido por XbaI/EcoRI em pMON61562, que tinha sido também digerido com XbaI e EcoRI, resultando no gene de AsnS2 estando em ligação operável com o promotor NAS e terminador RGLUT1. O plasmídeo resultante foi digerido com NotI e ligado ao pMON30167 digerido com NotI. O plasmídeo resultante foi chamado pMON66229 (Figura 2).

[000123] Um terceiro construto de AsnS2 foi feito usando o gene de AsnS2 acima mencionado (pMON79706). O promotor P-FDA usado neste construto foi isolado de pMON78810 através de digestão com enzimas de restrição NotI e XbaI. O promotor P-FDA foi então ligado a pMON66246, que foi previamente digerido com NotI e XbaL para remover seu promotor PPDK. O plasmídeo resultante foi digerido com NotI e ligado ao pMON30167 digerido com NotI. O plasmídeo resultante foi chamado pMON66231 (Figura 4).

[000124] Um quarto construto de AsnS2 foi feito usando o gene de AsnS2 acima mencionado (pMON79706). O promotor P-RTBV a ser usado nesse construto foi gerado através de PCR a partir de pMON74576. O fragmento de 721 pb foi digerido com NotI e XbaI e ligado a pMON66246, que foi previamente digerido com NotI e XbaI. O plasmídeo resultante, contendo o gene de AsnS2 em ligação operável com o promotor P-RTBV e terminador RGLUTI foi digerido com NotI e ligado ao pMON30167 digerido com NotI. O plasmídeo resultante foi chamado pMON66239 (Figura 5).

[000125] Um quinto construto de AsnS2 foi feito usando o gene de AsnS2 acima mencionado (pMON79706). Um par de iniciador de ZmASsentido, 5'TCCTAGACATGTCCGGCATACTTGCTG3' (SEQ ID NO: 46), e ZmASantissenso, 5'TGCAGAATTCTATCCCTCGATGG; (SEQ ID NO: 47), foi usado para amplificar AsnS2 de milho de pMON66240. Ajuste de PCR foi como segue: em um volume total de 50 μl de reação de PCR, 1 μl de 10 mM de cada iniciador de ZmASsentido e ZmASantissenso, 0,2 a 0,5 μg (1 μl) de DNA de plasmídeo de pMON66240, 5 μl de 10X AccuPrime® Pfx Reaction Mix, 1 μl de ACCuPrime® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) e 41 μl de água destilada. A reação de PCR foi realizada com os parâmetros de ciclo que seguem: 94°C por 1 minuto, seguido por 30 ciclos de 94°C por 15 segundos para desnaturação; 58°C por 15 segundos de anelamento e 68°C por 4 minutos; seguido por 10 minutos de extensão a 68°C. O produto de PCR foi purificado usando um estojo de purificação de PCR da QIAGEN (QIAGEN Inc.). Uma alíquota do produto de AsnS2 de milho da PCR foi digerida com enzima de restrição NcoI e EcoRI e outra alíquota do produto de PCR foi digerida com AflIII e NcoI. O fragmento de NcoI e EcoRI foi então clonado em sítios de NcoI e EcoRI de pMON94901. O fragmento da extremidade 5' de AflIII e NcoI de AsnS2 de milho foi clonado no NcoI e EcoRI do fragmento de AsnS2 de milho no sítio NcoI. O plasmídeo resultante (pMON74940), contendo AsnS2 de milho em ligação operável com o promotor e35S e o terminador Hsp17, foi digerido com NotI e ligado a pMON53616 digerido com NotI para construir pMON74946.

[000126] Cada construto descrito acima continha um cassete de expressão para expressão de um EPSPS do Tipo II insensível a glifosato como um meio para seleção de eventos transgênicos (Patente U.S. 5.633.435). A sequência de ácido nucleico de cada construto foi determinada usando metodologia padrão conforme descrito por PE Applied Biosystems BigDye terminator v.3.0 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) e a integridade das junções de clonagem confirmada. Os vetores pMON66229, pMON66230, pMON66231, pMON66239 e pMON74946 foram usados na transformação subsequente de células de milho e regeneração dessas células em plantas de milho intactas. Construtos de interesse foram introduzidos em embriões imaturos da linhagem de milho LH244 através de um método de transformação mediada por Agrobacterium, por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente Publicado U.S. 20050048624.

Exemplo 4 Análise de proteína e aminoácido de amostras de semente de milho

[000127] Este exemplo mostra um método de análise de proteína e aminoácido para selecionar semente da presente invenção com asparagina e proteína aumentadas usando HPLC e medições quase infravermelhas. Para análise de proteína de semente, amostras brutas pequenas consistindo em de 50 a 100 sementes para cada tratamento foram medidas usando espectroscopia de transmitância quase infravermelha (modelo Infratec 1221, Tecator, Hoganas Suécia). Este procedimento era baseado na observação que uma relação linear existe entre a absorção de radiação quase infravermelha e a quantidade de constituintes químicos compreendida em uma amostra de semente típica. Antes da análise de amostras desconhecidas, dados espectrais foram coletados com amostras de calibragem que foram subsequentemente analisadas usando uma técnica de análise primária. A técnica primária usada foi combustão de nitrogênio (Murray e Williams, 1987). Um modelo multivariado foi desenvolvido usando os dados espectrais do espectrômetro e os dados primários. No presente caso, um modelo multivariado PLS-1 (Partial Least Squares Regression Type I) foi construído usando 152 amostras de calibragem. Cada amostra desconhecida foi varrida no espectrômetro pelo menos cinco vezes e seu teor de proteína previsto com cada varredura. Cada vez que a amostra foi varrida, ela foi adicionada de volta ao cadinho de amostra para prover uma representação precisa da amostra testada. Os valores de proteína previstos tiveram média feita para as múltiplas varreduras e então relatados para cada amostra.

[000128] Análise de aminoácido livre foi realizada em tecidos de milho através de HPLC. Para cada amostra, 20-50 mg de tecido liofilizado foram extraídos com 1,5 mL de ácido tricloroacético a 10% em tubos microfuge de 2 mL. As amostras foram extraídas em temperatura ambiente de um dia para o outro com agitação suave. As amostras extraídas foram limpas através de centrifugação e o sobrenadante foi removido para análise adicional. Análise de aminoácido livre foi realizada através de HPLC em uma Agilent Series 1100 HPLC com um detector de fluorescência e autoamostrador de placa de 96 cavidades equipado com uma coluna Zorbax Eclipse AAA C18 (4,6 x 75 mm, 3,5 mícrons, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) e coluna de guarda analítica Zorbax Eclipse AAA (4,6 x 12,5 mm, 5 mícrons). As amostras foram pré-derivatizadas com o-ftalaldeído imediatamente antes da separação. Aminoácidos livres foram separados com um tampão de fosfato a 40 mM, pH 7,6/gradiente de Metanol/Acetonitrila seguido por detecção de fluorescência a 340 nm/450 nm (excitação/emissão). Aminoácidos livres foram quantificados com base em padrões de aminoácido externos e picos foram integrados com software ChemStation (Agilent). Desviosopadrão relativos eram tipicamente menos do que 8%.

Exemplo 5 Avaliação de campo de níveis de asparagina e teor de proteína de grão em plantas de milho transgênicas

[000129] Este exemplo mostra o resultado de uma avaliação de campo dos efeitos dos construtos de AsnS de milho (pMON79706 e pMON92870) sobre níveis de asparagina e proteína em plantas e semente de milho transformadas; os efeitos dos construtos de AsnS de milho (pMON79700 e pMON79653) sobre teor de proteína do grão. A concentração relativa de asparagina livre em tecidos de milho foi obtida a partir de linhagens consanguíneas de plantas de milho R0 transformadas com pMON79706 ou pMON92870. Para pMON79706, transformantes R0 foram retrocruzados com o consanguíneo de origem, LH59, para criar semente BC1. A semente BC1, que segrega com o transgene, foi plantada em um viveiro de campo e plantas individuais foram classificadas quanto à presença do gene marcador NPTII. Tecido de folha foi coletado para análise de aminoácido para plantas positivas para transgene e negativas para transgene para cada evento transgênico para análise de aminoácido livre. Aminoácidos livres de folha de plantas transgênicas pMON79706 foram comparados a plantas isolina negativas dentro de cada evento e analisadas estatisticamente através do teste T de student com software JMP 5.1 (SAS Institute, Cary, NC). Para pMON92870, transformantes R0 foram retrocruzados com o consanguíneo de origem, LH244, para criar semente BC1. A semente BC1 foi plantada em um viveiro de campo e autopolinizada para criar a semente BC1S1, que foi subsequentemente plantada em um segundo viveiro de consanguíneo. Plantas positivas para transgene foram identificadas para cada evento transgênico seguindo classificação quanto à presença do gene marcador NPTII. Tecido de folha foi coletado de plantas BC1S1 positivas para transgene e lotes de consanguíneo de origem plantados em intervalos regulares no viveiro. Aminos ácidos livres de folha para pMON92870 foram analisados estatisticamente através da realização de análise de variância e comparando lançamentos transgênicos com controle de origem através da condução do teste T de Student usando software SAS 9.1. Para análises de aminoácido livre para ambos os construtos, tecido de folha foi coletado através da remoção de uma folha completamente aberta superior em antese seguido por congelamento em gelo seco. Amostras de folha foram congeladas moídas, liofilizadas e medidas quanto ao teor de aminoácido através de HPLC.

[000130] Eventos transgênicos múltiplos de pMON79706 e pMON92870 foram observados mostrar aumentos substanciais em teor de asparagina em folha (Tabela 2). Quatro de sete eventos de pMON79706 testados mostraram aumentos significantes na concentração de asparagina na folha, conforme indicado por um valor p de 0,05 ou menos. Em eventos transgênicos de pMON92870, expressão de um segundo gene de asparagina sintetase de milho, quatro de cinco eventos mostraram aumentos significantes em níveis de asparagina na folha (Tabela 2). Esses dados mostram que expressão transgênica de AsnS2 de milho e AsnS3 de milho sob promotor da actina do arroz em pMON79706 e pMON92870, respectivamente, pode resultar em um aumento específico em asparagina livre, que está de acordo com a superexpressão de asparagina sintetase ativa.

[000131] A concentração relativa de proteína em semente de milho foi obtida de linhagens consanguíneas derivadas de plantas de milho R0 transformadas com pMON79706 ou pMON92870. Plantas transgênicas BC1 de pMON79706 (descritas acima) foram autopolinizadas e o grão BC1S1 resultante foi cultivado até a maturidade e medido quanto ao teor de proteína através de orelhas simples. A proteína foi medida como uma porcentagem de peso seco a 0% de umidade. Proteína do grão para plantas transgênicas pMON79706 foi comparada com plantas isolina negativas dentro de cada evento e analisadas estatisticamente através do teste T de Student com software SAS 9.1. Para pMON98270, plantas BC1S1 foram autopolinizadas para crescerem até a maturidade e medidas quanto ao teor de proteína através de orelhas simples. Proteína do grão para pMON92870 foi analisada estatisticamente com um método espacial desenvolvido como de costume através da condução de análise "by-location". A análise "by-location" é um processo de duas etapas. A primeira etapa na análise envolveu estimativa da autocorrelação espacial no campo ao adaptar um modelo de semivariograma esférico anisotrópico usando todos os lotes de checagem espacial que foram postos sistematicamente no campo (cada 6° lote). O segundo estágio de análise envolvia ajuste dos valores dos lançamentos transgênicos para a variabilidade espacial usando a estrutura de autocorrelação esp’acial estimada no primeiro estágio da análise. Seguindo o ajuste para autocorrelação espacial, comparação de média foi realizada onde o valor médio de um lançamento transgênico foi comparado com o controle de origem para testar a significância estatística da diferença entre a média do transgene e do controle.

[000132] Eventos múltiplos de ambos o pMON79706 e pMON92870 mostraram aumentos significantes em teor de proteína no grão de consanguíneo (Tabela 3). Três de cinco eventos de pMON79706 que foram analisados estatisticamente mostraram aumentos significantes em teor de proteína no grão (p <0,05) e dois outros eventos mostraram tendência a aumentos significantes (p <0,15). Dois eventos não retornaram números suficientes de orelhas para uma análise estatística. Três de quatro eventos transgênicos de pMON92870 mostraram aumentos significantes em teor de proteína de grão (p <0,1), com um evento não testado devido a números insuficientes de orelhas para análise. Esses dados confirmam que pMON79706 e pMON92870 produzem eventos transgênicos que aumentam o teor de proteína no grão em milho em adição a aumentar o teor de asparagina na folha.

[000133] O pMON79706 com fenótipo de muita asparagina e proteína no grão foi confirmado em tecidos múltiplo em um segundo teste. Após a geração BC1, cinco eventos de pMON79706 foram autopolinizados em dois viveiros seguintes para gerar semente BC1S3 que era homozigota para o transgene. A concentração relativa de asparagina resultante da expressão do construto de pMON79706 foi determinada em um estudo no estágio de crescimento V8 do milho através de comparação de plantas BC1S3 homozigotas e um controle de variedade de milho LH59 (Tabela 4). Transgênicos e controles foram plantados em um design em bloco completo aleatorizado com 5 blocos em réplica em um lote de campo. As folhas completamente abertas superiores e seções de caule de duas plantas foram amostradas e agrupadas, postas em gelo seco, moídas, liofilizadas e medidas quanto ao teor de aminoácido através de HPLC. Valores seguidos por "*" indicam uma diferença significante do controle LH59 (teste unilateral de Dunnet; (SAS 9.1, Cary, NC). Medições de asparagina obtidas em ambos o estágio de crescimento V8 e na geração R1 mostraram que plantas de cinco eventos de pMON79706 tinham aumentos significantes em asparagina livre. Níveis de asparagina livres relativos em tecido de folha V8 foram aumentados para até 13,9% comparado com 3,4% no controle da variedade LH59, e a asparagina no caule foi aumentada até 39% comparado com 9,6 no controle (Tabela 4). Para análise de proteína no grão, 10 orelhas foram amostradas por lote, escamadas e analisadas quanto à concentração de proteína do grão. Proteína do grão também aumentou significantemente em cinco eventos de pMON79706 (Tabela 4). Os resultados mostram que, como uma tendência geral, eventos produzindo um aumento significante em asparagina também produziram um aumento significante em proteína da semente (Tabelas 2-4).Tabela 4. Concentrações de asparagina relativas no estágio de crescimento V8 e concentração de proteína no grão na maturidade em plantas de milho BC1S3 transformadas com o gene de AsnS2 de milho (pMON79706).

[000134] Aumentos significantes em proteína de grão híbrido foram observados para três construtos diferentes expressando genes da asparagina sintetase sob o promotor da actina do arroz. Linhagens de milho consanguíneas homozigotas foram produzidas de eventos transgênicos R0 de pMON79706 (AsnS2 de milho), pMON79700 (AsnS de soja) e pMON79653 (AsnS1 de levedura) através do primeiro evento R0 de retrocruzamento para a origem recorrente, LH59, seguido por autopolinações de seleções positivas para transgene em dois viveiros de cruzamento consanguíneo subsequentes usando o marcador selecionável NPTII para classificar zigosidade. Os eventos homozigotos para cada construto foram então usados como um doador de pólen masculino em um cruzamento com uma linhagem consanguínea fêmea para criar o híbrido F1. A semente híbrida F1 foi plantada em um teste de localização múltipla e eventos transgênicos para cada construto foram analisados quanto à proteína no grão final e comparados com o controle híbrido de origem recorrente seguindo uma análise de correção espacial com base em proteína no grão em híbridos controle que foram plantados em intervalos regulares em todo o campo. Grão foi coletado de cada lote, descamado e analisado quanto ao teor de proteína. Os dados foram analisados usando um método espacial desenvolvido como de costume através da condução de uma análise "by-location" e uma "across location". A análise "by-location" é um processo de duas etapas. A primeira etapa na análise envolvia estimativa da autocorrelação espacial no campo ao adaptar um modelo de semivariograma esférico anisotrópico usando todos os lotes de checagem espacial que foram postos sistematicamente no campo (cada 3° lote). O segundo estágio de análise envolvia ajuste dos valores dos lançamentos transgênicos para a variabilidade espacial usando a estrutura de autocorrelação espacial estimada no primeiro estágio da análise. Seguindo o ajuste para autocorrelação espacial em cada localização separadamente, uma análise "across-location" foi conduzida onde o valor médio de um lançamento transgênico foi comparado com o controle de origem para testar a significância estatística (P=0,20) entre a média do transgene e o controle. Todos os cinco eventos de pMON79706 mostraram aumentos significantes em proteína no grão no teste híbrido, de acordo com a observação de que proteína no grão foi aumentada nas linhagens consanguíneas de eventos transgênicos deste construto (Tabela 5). Dois outros construtos de asparagina sintetase, pMON79700 (AsnS de soja) e pMON79653 (AsnS de soja), também mostraram aumentos significantes em níveis de proteína no grão em dois de cinco eventos e dois de dois eventos, respectivamente.

Exemplo 6 Avaliação de campo da expressão de transgene e atividade da enzima asparagina sintetase devido a pMON79706 e pMON92870

[000135] Expressão de transgene foi confirmada em eventos transgênicos de pMON79706 e pMON92870. Para pMON79706, tecido usado para a determinação do teor de asparagina na folha no teste de campo com linhagens consanguíneas homozigotas BC1S3 foi também usado para determinação da expressão de transgene com base na medição da expressão a partir da sequência terminadora 3' (St.Pis4) de pMON79706 na antese. Duas amostras de folha foram coletadas e agrupadas de cada um de 5 lotes em réplica (10 para controle consanguíneo) e congeladas em gelo seco. Amostras de folha foram então congeladas moídas para análise de expressão. Para extração de RNA, 50 mg de tecido congelado foram separados em alíquota em placas de 96 cavidades. Cada amostra foi extraída com 500 μl de tampão de lise contendo uma solução 1:1 de solução de lise de ácido nucleico ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) para 1X PBS pH 7,4 (sem MgCl ou CaCl). RNA foi extraído de amostras de tecido recém-congeladas usando placas de filtro para capturar ácidos nucleicos de lisatos brutos, e 50 μl de tampão de eluição ABI foram usados para eluir RNA ligado. PCR quantitativa foi realizada usando um molde de RNA com 5 μl de reagente RT-PCR de uma etapa ABI. As reações foram realizadas por 40 ciclos de PCR em um instrumento de PCR ABI Taqman 7900, com parâmetros de ciclização de 48°C por 30 minutos, 95°C por 10 minutos, 95°C por 10 segundos, 60°C por 1 minuto. Medições fluorescentes foram obtidas de cada cavidade em cada um dos 40 ciclos para ambos a sequência terminadora derivada do inibidor II da protease de batata (St.Pis4) e o controle endógeno (ubiquitina). Um subconjunto de amostras foi administrado sem transcriptase reversa para monitorar contaminação de DNA. As amostras foram classificadas quanto à expressão relativa através da subtração dos valores limiares de ciclo para St.Pis4 do valor limiar do ciclo do controle endógeno. O limiar do ciclo (Ct) foi determinado, e o Ct delta foi calculado a partir do St.Pis4 menos valor do controle endógeno. Um tipo selvagem in situ foi criado através do cálculo dos sinais de controle endógeno médios e ajuste do valor de sinal de St.Pis4 em 40. O Ct delta das amostras desconhecidas foi subtraído do Ct delta do tipo selvagem in situ. Dados finais foram relatados como expressão de pinII (St.Pis4) com relação ao tipo selvagem. Análise RT-PCR quantitativa confirmou a superexpressão do transgene a partir de seis de seis eventos de pMON79706 (Figura 6).

[000136] Expressão de transgene foi também confirmada em eventos consanguíneos compreendendo pMON92870. Expressão de RNA foi determinada a partir de tecido de folha na antese de plantas consanguíneas em um viveiro de campo primeiro coletando uma folha aberta superior de cada planta (4-8 plantas por evento) e congelamento em gelo seco. Plantas positivas para transgene foram previamente identificadas com base na presença do gene marcador NPTII. Tecido de folha foi moído enquanto congelado e analisado quanto à expressão da sequência terminadora 3' (St.Pis4) de pMON92870. Análise de RP-PCR quantitativa mostrou que cinco de seis eventos compreendendo pMON92870 mostraram expressão de transgene aumentada comparado com um controle consanguíneo (Figura 7). A expressão de RNA baixa em evento de pMON92870 ZM_M103316 está de acordo com o teor de asparagina na folha e teor de proteína no grão baixo neste evento.

[000137] O efeito de expressão de genes da asparagina sintetase sobre atividade da asparagina sintetase foi medido em eventos transgênicos de pMON79706 e pMON92870. Tecido de folha moído, congelado, foi separado em alíquotas (200-400 mg) em cavidades de uma placa de 96 cavidades profundas pré-esfriadas. Proteína foi extraída em Tampão A (Hepes-OH a 100 mM, pH 8,0, EDTA a 0,1 mM, MgCl2 a 10 mM, aspartato a 2 mM, DTT a 0,5 mM, mercaptoetanol a 67 mM, glicerol a 20% (v/v), ATP a 0,1 mM, P9599 a 1% (v/v) (Sigma Company), KCl a 25 mM). Uma pequena quantidade de areia foi adicionada a cada cavidade. Tampão A foi então adicionado ao tecido de folha nas cavidades em uma razão de 4:1 (tampão:tecido). As placas foram então agitadas em um agitador de tinta por 2 minutos para misturar a amostra e então centrifugadas a 5000 x g por 10 minutos. O sobrenadante (100-200 μL) foi dessalinizado em uma macroplaca giratória de 96 cavidades (SNS S025L, The Nest Group Inc., Southboro, MA) equilibrada em tampão A. O sobrenadante foi então ou ensaiado imediatamente ou congelado em nitrogênio líquido e mantido a -80°C até ser usado. Para ensaiar atividade de asparagina sintetase, extratos de proteína dessalinizada (10-50 μL) foram adicionados a cavidades contendo 100 μL de solução de ensaio (Hepes a 100 mM, pH 8,0, MgCl2 a 10 mM, aspartato a 2 mM, DTT a 5 mM, ATP a 10 mM, ácido amino(oxi)acético a 1 mM (inibidor da aspartato amino transferase), semialdeído aspártico a 1 mM (inibidor da asparaginase). Para iniciar a reação, glutamina (concentração final de 2 mM para ensaio padrão) foi adicionada à solução, que foi então misturada. A mistura de ensaio foi então incubada por 1 a 2 horas. A reação foi então parada através da adição de um volume igual de ácido tricloroacético a 20% (p/v). A mistura foi então filtrada para remover precipitado e asparagina foi medida através de HPLC. O tamanho da amostra foi aumentado de 0,5 μl para 2,5 μL para HPLC, comprimento de onda de excitação foi reduzido de 340 nm para 235 nm e ganho de fluorímetro foi aumentado de 10 para 13. Isto resulta em uma sensibilidade de detecção de 0,5 a 100 mM de asparagina e permite a medição de níveis de atividade nos 100s de microunidades.

[000138] Para pMON79706, tecido usado para determinação da atividade da enzima asparagina sintetase na folha foi de um teste de campo com linhagens consanguíneas homozigotas BC1S3 coletadas no estágio de crescimento V7. Eventos de pMON79706 foram mostrados exibir atividade de asparagina sintetase na folha aumentada (Tabela 6). Atividade de asparagina sintetase foi aumentada até 5 vezes sobre o controle de variedade consanguínea. A atividade da enzima asparagina sintetase foi também determinada para eventos transgênicos de pMON92870 em um viveiro de campo consanguíneo no momento da antese. Quatro de cinco eventos de pMON92870 também mostraram atividade de enzima aumentada (Tabela 6). A atividade da enzima asparagina sintetase aumentada em plantas de milho expressando o AsnS2 de milho (pMON79706) ou AsnS3 de milho (pMON92870) sob o promotor da actina do arroz está de acordo com o aumento em expressão de gene e aumentos dem asparagina na folha observados com esses construtos. Tabela 6. Atividade da asparagina sintetase em linhagens consanguíneas de eventos transgênicos de pMON79706 e pMON92870a. a Atividades de enzima para pMON79706 e pMON92870 foram determinadas a partir de dois experimentos de campo diferentes.

Exemplo 7 Avaliação de campo dos efeitos de pMON66231, pMON66239 e pMON74946 sobre o teor de asparagina e proteína no grão

[000139] O teor relativo de asparagina livre em tecidos de milho foi obtido de linhagens híbridas derivadas de plantas de milho R0 (base LH244) transformadas com pMON66231 (Figura 4), onde AsnS2 de milho está sob o controle do promotor FDA de milho. Híbridos foram feitos através do cruzamento de plantas R0 com a linhagem consanguínea masculina LH59, que cria uma população F1 de segregação (1:1). A semente F1 resultante foi plantada em três locais no meio-oeste com réplicas em cada local. Os lotes foram pulverizados com glifosato no estágio de crescimento V3 para eliminar segregantes nulos. Um controle híbrido foi plantado no perímetro e comparações foram feitas com o controle híbrido. Folhas da parte superior foram coletadas e agrupadas das três plantas dentro de cada lote no momento da antese, duas horas após o pôr do sol, em todos os três locais. As folhas foram postas imediatamente em gelo seco e então armazenadas a -80°C até processamento. As folhas foram moídas congeladas, e uma porção foi liofilizada para análise de aminoácido livre através de HPLC. Os dados foram primeiros avaliados para outliers com o método de duas etapas para resíduos estudantizados deletados usando valores p ajustados por Bonferroni. Externos foram identificados e removidos do ajuste de dados antes da análise de cálculos de variância ser iniciada. Os dados foram analisados de acordo com uma elaboração de bloco completa aleatorizada "across-locations". Combinações de construto- evento foram modeladas com efeitos fixos, e locais e réplicas dentro de locais foram modelados com efeitos aleatórios. Comparações de tratamento foram feitas através da realização de contrastes das médias de quadrados mínimos das combinações construto-evento. Asparagina de folha relativa foi aumentada significantemente em 11 de 12 eventos de pMON66231, com níveis de asparagina tão altos quanto 16% comparado com 3% no controle (Tabela 7). Proteína de grão maduro foi também medida seguindo a coleta de 10 orelhas por lote seguido por descamação e agrupamento de semente para cada lote, o que foi então medido quanto ao teor de proteína no grão. Nove de 12 eventos foram verificados aumentar significantemente o teor de proteína no grão maduro sobre o controle híbrido LH244/LH59. Tabela 7. Teor de asparagina na folha e de proteína no grão maduro relativo em eventos transgênicos pMON66231. a Asparagina livre relativa medida como uma porcentagem de aminoácidos livres totais em tecido de folha b Comparado com controle híbrido.

[000140] O teor relativo de asparagina livre em tecidos de milho foi obtido de linhagens híbridas derivadas de plantas de milho R0 (base LH244) transformadas com pMON66239 e pMON74946, em que AsnS2 de milho está sob controle do promotor RTBV ou e35S, respectivamente. Os híbridos foram feitos cruzando as plantas R0 com a linhagem consanguínea masculina, LH59, que cria uma população F1 de segregação (1:1). A semente F1 resultante foi plantada em um local no Havaí com três réplicas para cada evento transgênico. Os lotes foram pulverizados com glifosato no estágio de crescimento V3 para eliminar segregantes nulos. Um controle híbrido sem o gene de AsnS2 de milho foi incluído para comparação. As folhas da parte superior foram coletadas e agrupadas de três plantas dentro de cada lote no momento da antese, duas horas após o pôr do sol. As folhas foram postas imediatamente em gelo seco e então armazenadas a -80°C até processamento. As folhas foram moídas congeladas e uma porção foi liofilizada para análise de aminoácido livre através de HPLC. Os dados foram primeiro avaliados quanto aos outliers com o método de duas etapas para resíduos estudantizados deletados usando valores p ajustados para Bonferroni. Externos foram identificados e removidos do ajuste de dados antes da análise de cálculos de variância ser iniciada. Os dados foram analisados de acordo com uma elaboração de bloco completa aleatorizada. Combinações de construto-evento foram modeladas com efeitos fixos, e réplicas foram modeladas com efeitos aleatórios. Comparações de tratamento foram feitas realizando contraste das médias de quadrado mínimo das combinações construto-evento. Asparagina de folha relativa foi aumentada significantemente em 10 de 13 eventos de pMON74946, com níveis de asparagina tão altos quanto 16% comparado com 2% no controle (Tabela 8). Proteína de grão maduro foi também medida seguindo a coleta de todas as orelhas por lote seguido por descamação e agrupamento de semente para cada lote, que foi então medida quanto ao teor de proteína no grão e analisada estatisticamente como a característica de asparagina na folha. Dez de treze eventos foram verificados possuir teor de proteína significantemente maior no grão maduro comparado com o controle híbrido, e os mesmos 10 eventos com mais asparagina na folha também mostraram mais proteína no teste de híbrido. Para eventos transgênicos de pMON66239, 11 de 15 eventos mostraram aumentos no teor de asparagina na folha e 3 de 15 eventos mostraram aumentos significantes em proteína no grão no nível alfa 0,05, embora mais cinco eventos transgênicos mostrassem mais proteína em p<0,15, indicando que expressão de AsnS2 de milho sob o promotor RTBV (pMON66239) pode aumentar o teor de asparagina da folha e teor de proteína da semente, mas a um grau menor do que sob o promotor e35s (pMON74946) (Tabela 8). Tabela 8. Teor de asparagina na folha e proteína no grão maduro relativo em eventos transgênicos pMON74946 e pMON66239 a Asparagina livre relativa medida como uma porcentagem de aminoácidos livres totais em tecido de folha b Comparado com controle híbrido.

Exemplo 8 Vetores de expressão bacteriana, purificação e cinética de isoformas de AsnSI, AsnS2, AsnS3 e AsnS4

[000141] Este exemplo descreve a clonagem da sequência de nucleotídeo para AsnS1 (SEQ ID NO: 1), AsnS2 (SEQ ID NO: 3), AsnS3 (SEQ ID NO: 5) e AsnS4 (SEQ ID NO: 50) em vetores de expressão de E. coli, bem como a expressão, purificação e cinética das formas recombinantes das quatro isoformas de AsnS.

[000142] Pesquisas de bioinformática usando uma sequência de gene de AsnS de milho publicada (Chevalier e outros, 1996; gi984262) resultou na identificação de quatro sequências de cDNA de comprimento completo em coleções de cDNA internas da proprietária que foram identificadas como compartilhando similaridade de sequência significante com o gene de AsnS de milho publicado. Dois dos cDNAs de comprimento integral que compartilham identidade de sequência com a sequência de AsnS pública foram chamados Zm-AsnS1 e Zm- AsnS3. Os dois outros genes foram chamados Zm-AsnS2 e Zm-AsnS4 (SEQ ID NO: 50), respectivamente. Clonagem de sequências de Zm- AsnS1, Zm-AsnS2 e Zm-AsnS3 em vetores de expressão de planta é descrita nos Exemplos 2 e 3 acima. Esses três genes bem como Zm- AsnS4 foram clonados em vetores de expressão bacteriana como segue:

[000143] As sequências de codificação de comprimento completo Zm- AsnS1, Zm-AsnS3 e AsnS4 foram amplificadas através de reação em cadeia da polimerase (PCR) de clones de cDNA 700151670_FLI, LIB5399-001-A2 e LibLIB3732-039-F9_FLI, respectivamente, nas coleções de cDNA internas da proprietária. Sequências dos iniciadores avançado e reverso para fragmentos amplificados por PCR codificando o Zm-AsnS1 foram: Zm_AsnS1_for1 5'-ggaattccatATGTGTGGCATCTTAGC-3' (SEQ ID NO: 52) e Zm_AsnS1_rev1 5'-ataagaatgcggccgcGACCGCGATCGCGATT GCGA CA-3' (SEQ ID NO: 53) Sequências dos iniciadores avançado e reverso usadas para a amplificação por PCR de Zm-AsnS3 foram: Zm_AsnS3-for2 5'-ctagctagctagATGTGCGGCATCCTC-3' (SEQ ID NO: 54) e Zm_AsnS3-rev2 5'-ccgctcgagGACAGCTGTGGCTGAAGCAACG-3' (SEQ ID NO: 55). Um fragmento amplificado por PCR codificando o comprimento completo de AsnS4 (SEQ ID NO: 50) foi obtido com o par de iniciador que segue: Zm-AsnS4_for3 5'-gggaattccatATGTGTGGCATCTTAGC-3' (SEQ ID NO: 56) e Zm-AsnS4_rev3 5'-ataagaatgcggccgcCACCGCGATCGCGACAG CGA- 3' (SEQ ID NO: 57). A sequência de codificação de comprimento completo de Zm-AsnS2 foi amplificada através da reação em cadeia da polimerase (PCR) de pMON79706 (Figura 1; SEQ ID NO: 3). Sequências de iniciadores para amplificação por PCR de Zm-AsnS2 foram: Zm-AsnS2_for4 5'-tatgtgcggcatacttgctggctcgggt-3' (SEQ ID NO: 58) e Zm-AsnS2_rev4 5'-gctatccctcgatggcaacgccagat-3' (SEQ ID NO: 59).

[000144] PCR foi realizada em um volume total de 50 μL usando o kit Expand® High Fidelity PCR (Boehringer Mannheim, Alemanha). A reação foi realizada em um ciclizador térmico PTC-200 Peltier (MJ Research Inc., Watertown, Massachusetts) sob as condições que seguem: Incubação inicial: 5 minutos a 95°C 27 ciclos de: 1 minuto a 95°C anelamento de 1 minuto a 56°C seguido por: extensão de 2 minutos a 72°C. incubação por 10 minutos a 72°C.

[000145] Os fragmentos de PCR resultantes foram subclonados em um dos plasmídeos de expressão pET30a(+) ou pET21(+) (Novagen, San Diego, CA), dando plasmídeos pET30a-Zm-AsnS1, pET30a- ZmAsnS2, pET30a-Zm-AsnS3 e pET21d-Zm-AsnS4. As sequências de plasmídeo foram confirmadas através de análise de sequência de DNA. Esses vetores são esperados produzir proteínas recombinantes com marcadores de histidina C-terminais.

[000146] Os vetores de expressão de E. coli descritos no parágrafo anterior foram usados para transformar células de E. coli Rosetta DE5® (Novagen). Células transformadas foram transferidas de placas de meios LB sólidos e cultivadas em meios LB líquidos contendo concentrações-padrão de canomicina (50 μM) e cloranfenicol (25 μM) a 37°C. Uma cultura da noite para o dia foi usada para inocular 25 mL de cultura, que foi cultivada a 37°C até a fase semi-log (OD600 = 0,4 - 0,6). As células foram então transferidas para 20°C por 30 minutos, após o que IPTG foi adicionado para uma concentração final de 0,5 mM. As células foram então cultivadas a 20°C por 12 horas e os péletes de célula foram coletados através de centrifugação.

[000147] A proteína foi recuperada da fração insolúvel enquanto ligada a uma coluna de níquel. Tampões usados para a purificação de AsnS recombinante foram:

[000148] Tampão A: Hepes a 100 mM-OH, pH = 7,6, EDTA a 0,1 mM, MgCl2 a 10 mM, aspartato a 2 mM, DTT a 0,5 mM, glicerol a 20% (v/v), ATP a 0,1 mM, coquetel inibidor de protease a 1% (v/v) (Produto Sigma N° P9599), KCl a 25 mM. Tampão B: (Tampão A + Guanidina-HCl 6 M) Tampão C: (Tampão A + Ureia a 6 M) Tampão D: (Tampão D + Ureia a 4 M) Tampão E: (Tampão A + Ureia a 2 M) Tampão F: (Tampão A + Ureia a 1 M) Tampão G: (Tampão A + imidazol a 500 mM)

[000149] Todos os procedimentos de purificação foram realizados a 4°C a menos que de outro modo declarado. Péletes de E. coli foram solubilizados em Tampão A e passados por uma French Press três vezes a 110,32 MPa (16.000 PSI). A amostra foi então centrifugada a 75.000 x g por pelo menos uma hora. O pélete (corpo de inclusão) foi congelado em N2 líquido e então armazenado a -80°C até ser usado.

[000150] Todas as medições de cinética de rotina para enzimas AsnS de planta foram realizadas em formas de AsnS de planta marcadas com his que tinham sido redobradas na coluna de níquel durante purificação. Um pélete de E. coli resultante de bactérias expressando uma das formas de AsnS em 200 mL de meios LB conforme aqui descrito foi usado como o material de partida. Corpos de inclusão foram isolados usando o método descrito no Pierce Pro-Matrix® Protein Refolding Guide (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, N° do produto 89867; Apêndice A) e então solublizados usando o protocolo Pierce Pro-Matrix Protein Refolding Guide (N° do produto 89867; Apêndice B) exceto que tampão B foi usado no lugar de GdnHCl 6-8 M, Tris 50 mM. A amostra solubilizada foi então aplicada em uma taxa de fluxo de 1 mL/min a uma coluna de agarose Nickel NTA de 3-5 mL (Qiagen) previamente equilibrada em Tampão B. A coluna foi então sucessivamente lavada em 1 mL/min com pelo menos dois volumes de leito de coluna de Tampões B, C, D e E e F. A coluna foi então lavada com Tampão A até que o OD280 do eluente da coluna fosse menos do que 0,05. O processo de lavagem todo foi completado dentro de 1-2 horas. A proteína foi então eluída com Tampão G em 1 mL/min. Frações de 2 mL foram obtidas e as três frações com as quantidades de proteína mais altas foram agrupadas, congeladas em N2 líquido e armazenadas a -80°C até serem ensaiadas conforme descrito no Exemplo 6. Os níveis de cada substrato (ATP, glutamina, NH4+ e aspartato) foram titulados para determinar os valores Km e Vmax individuais. Parâmetros cinéticos medidos foram Km (Asp), Km (Gln), Km (NH4+) e Vmax, para cada substrato, e para algumas enzimas. Os resultados são relatados na Tabela 9.

[000151] Todos os quatro genes codificam sequências que dão origem a polipeptídeos com atividade de AsnS. AsnS1, AsnS2 e AsnS3 parecem ser cineticamente distintas uma vez que Km (Gln) para AsnS2 é várias vezes menor do que as outras enzimas; e o Vmax de AsnS1 é varias vezes menor do que as outras enzimas.Tabela 9. Comparação cinética de asparagina sintetase de milho

[000152] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aqui incorporados a título de referência até o mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado estar incorporado a título de referência.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

[000153] As referências que seguem, até o ponto que elas provejam detalhes de procedimento ou outros suplementares àqueles mostrados aqui, são especificamente aqui incorporadas a título de referência: Patente U.S. 4.761.373 Patente U.S. 4.957.748 Patente U.S. 5.100.679 Patente U.S. 5.219.596 Patente U.S. 5.322.783 Patente U.S. 5.322.938 Patente U.S. 5.538.880 Patente U.S. 5.550.318 Patente U.S. 5.563.055 Patente U.S. 5.610.042 Patente U.S. 5.633.435 Patente U.S. 5.936.069 Patente U.S. 6.005.076 Patente U.S. 6.146.669 Patente U.S. 6.156.227 Patente U.S. 6.194.636 Patente U.S. 6.232.526 Publicação do Pedido de Patente U.S. 20040216189Al Publicação do Pedido de Patente U.S. 20050048624A1 Alba, Plant J., 39(5): 681-808, 2004. Allard, Em: Principles of Plant Breeding, 2a Ed., John Wiley & Sons, ISBN: 0471023094, 1999. Altschul e outros, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997. Aslanidis e de Jong, Nucleic Acids Res., 18(20):6069-6074, 1990. Ausubel e outros, eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989. Bevan, Nucleic Acids Res., 12:8711-8721,1984. Chu e outros, Scientia Sinicα, 18:659, 1975. Dellaporta e outros, Plant Molecular Biology Reporter, 1 :19- 21, 1983. D'Halluin e outros, Bio/Technology, 10:309-314, 1992. Fraley e outros., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 80:4803-4807, 1983. Haymes e outros, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985. Hayward, Em: Plant Breeding: Principles and Prospects, Vol. 1, Chapman & Hall, ISBN: 0412433907, 1993. Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 10915 10919, 1992. Herrera-Estrella e outros, Nature, 303:209, 1983. Hinchee e outros, Bio/Technology, 6:915-922, 1988. Jones and Shenk, Cell, 13: 181-188, 1978. Jones e outros, MoI Gen. Genet, 210(l): 1-4, 1987. Klee e outros, Bio-Technology, 3(7):637-642, 1985. Lewin, Em: Genes V, Oxford University Press, NY, 1994. Matsuoka e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:95869590, 1993. Murashige e Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962. Murray e Williams, Em: Chemical Principles of Near-Infrared Technology, Near- Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries, Williams e K. Norris (Eds.,), 1987. Pedido de Patente PCT WO 95/06128. Reynaerts e outros, Em: Selectable and Screenable Markers, Gelvin e Schilperoort (Eds.), Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht, 1988. Richards,Em: Plant Breeding Systems, Stanley Thornes Pub Ltd; 2a Ed., ISBN: 0412574500, 1997. Rieger e outros, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edição, Springer-Verlag: New York, 1991. Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. Stalker e outros, J. Biol. Chem., 263:6310-6314, 1988. Thillet e outros, J. Biol. Chem., 263:12500-12508, 1988.

Claims (7)

1. Construto de DNA, caracterizado pelo fato de que compre-ende a sequência de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 50; em que a sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligada a um elemento regulador heterólogo ou um promotor heterólogo funcional em plantas.

2. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo de asparagina sintetase.

3. Construto de DNA de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que o referido promotor heterólogo é um promotor de actina 1 de arroz.

4. Método de produção de uma planta de milho transgênica com teor alto de asparagina, caracterizado pelo fato de que compreende: a) introdução em uma planta de milho de um construto de DNA como definido na reivindicação 1; b) cultivo da planta até a maturidade; e c) coleta da semente da planta.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida sequênica de ácido nuclico codifica uma asparagina sintetase heteróloga.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de: f) seleção de uma semente com teor de proteína aumentado.

7. Método de produção de alimento ou ração, caracterizado pelo fato de que compreende obtenção da planta transgênica compreendendo o construto de DNA como definido na reivindicação 1, e produção de alimento ou ração a partir da planta ou uma parte da mesma.