BRPI0810149B1

BRPI0810149B1 - “METHOD FOR THE PRODUCTION OF A MILK PROTEIN HYDROLISATE, AND USE OF A MILK WEATHER PROTEIN

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Publication number: BRPI0810149B1
Authority: BR
Publication date: 2018-10-02

Description

(54) Título: MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM HIDROLISADO DE PROTEÍNA DE SORO DE LEITE, E, USO DE UM HIDROLISADO DE PROTEÍNA DE SORO DE LEITE (73) Titular: NOVOZYMES A/S, Companhia Dinamarquesa. Endereço: KrogshOjvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, DINAMARCA(DK) (72) Inventor: GITTE BUDOLFSEN LYNGLEV; PER MUNK NIELSEN(54) Title: METHOD FOR THE PRODUCTION OF A MILK SERUM PROTEIN HYDROLYSATE, AND USE OF A MILK SERUM PROTEIN HYDROLYZATE (73) Holder: NOVOZYMES A / S, Danish Company. Address: KrogshOjvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, DENMARK (DK) (72) Inventor: GITTE BUDOLFSEN LYNGLEV; PER MUNK NIELSEN

Código de Controle: D04D8EEC937C2F83 F5FDBE8DBA5EF163Control Code: D04D8EEC937C2F83 F5FDBE8DBA5EF163

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/10/2018, observadas as condições legaisValidity Term: 10 (ten) years from 10/02/2018, subject to legal conditions

Expedida em: 02/10/2018Issued on: 10/02/2018

Assinado digitalmente por:Digitally signed by:

Liane Elizabeth Caldeira LageLiane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados “MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM HIDROLISADO DE PROTEÍNA DE SORO DE LEITE, E, USO DE UM HIDROLISADO DE PROTEÍNA DE SORO DE LEITE”Director of Patents, Computer Programs and Topographies of Integrated Circuits “METHOD FOR THE PRODUCTION OF A MILK SERUM PROTEIN HYDROLYZATE, AND THE USE OF A MILK SERUM PROTEIN HYDROLYZATE”

CAMPO TÉCNICOTECHNICAL FIELD

A presente invenção diz respeito a um método de produzir um hidrolisado de proteína de soro de leite usando-se uma endopeptidase microbiana.The present invention relates to a method of producing a whey protein hydrolyzate using a microbial endopeptidase.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

Os suplementos de proteína, tais como proteína do soro de leite em pó, são comumente usados por fisiculturistas e outros atletas para acelerar o desenvolvimento muscular e auxiliar na recuperação. Da mesma maneira, tais suplementos de proteína são úteis para a nutrição química. No geral, as proteínas do soro de leites pré-digeridas, parcialmente hidrolisadas são absorvidas mais facilmente do que a proteína não hidrolisada, os hidrolisados de proteína do soro de leite são considerados tendo benefícios nutricionais. Mas visto que a proteína do soro de leite não hidrolisada é suave a levemente leitoso no sabor, a proteína do soro de leite hidrolisada tende ao gosto muito diferente, usualmente de uma maneira que toma-se indesejável. Portanto, quando tais hidrolisados são usados, por exemplo, em bebidas, o sabor deve ser mascarado, por exemplo, pela adição de sabor artificial.Protein supplements, such as whey protein powder, are commonly used by bodybuilders and other athletes to accelerate muscle development and aid recovery. In the same way, such protein supplements are useful for chemical nutrition. In general, whey proteins from pre-digested, partially hydrolyzed milk are absorbed more easily than non-hydrolyzed protein, whey protein hydrolysates are considered to have nutritional benefits. But since non-hydrolyzed whey protein is mild to slightly milky in taste, hydrolyzed whey protein tends to taste very different, usually in a way that becomes undesirable. Therefore, when such hydrolysates are used, for example, in drinks, the flavor must be masked, for example, by the addition of artificial flavor.

A hidrólise da proteína usando-se endopeptidases específicas é conhecida na técnica, ver, por exemplo, WO97/43910. A hidrólise de betalactoglobulina, que é uma das proteínas presentes na proteína do soro de leite, foi estudada em Madsen et al. (1997), Int. Dairy Journal, 7, pp. 399 a 409. A hidrólise de epítopos de beta-lactoglobulina com proteases diferentes também é descrita em Food Proteins and Their Applications; Ed. S. Damodaran & A. Paraf; Marcei Dekker, New York, 1997; pp. 443-472.Protein hydrolysis using specific endopeptidases is known in the art, see, for example, WO97 / 43910. The hydrolysis of betalactoglobulin, which is one of the proteins present in whey protein, was studied in Madsen et al. (1997), Int. Dairy Journal, 7, pp. 399 to 409. Hydrolysis of beta-lactoglobulin epitopes with different proteases is also described in Food Proteins and Their Applications; Ed. S. Damodaran & A. Paraf; Marcei Dekker, New York, 1997; pp. 443-472.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

Surpreendentemente, os presente inventores encontraram um método para a produção de um hidrolisado de proteína de soro de leite, em que a proteína do soro de leite é submetida ao tratamento com uma endopeptidase microbiana tendo especificidade quanto à arginina e lisina, seguidp pela inativação da endopeptidase, que dá origem a um hidrolisado tendo um sabor agradável. O hidrolisado ainda pode ter um sabor melhor do que a proteína do soro de leite não hidrolisada. Além disso, o hidrolisado de proteína do soro de leite obtido pelo método da invenção é estável e tem uma tendência reduzida ao gel no tratamento por calor em comparação com os hidrolisados obtidos por outras endopeptidases.Surprisingly, the present inventors have found a method for the production of a whey protein hydrolyzate, in which the whey protein is subjected to treatment with a microbial endopeptidase having specificity for arginine and lysine, followed by inactivation of endopeptidase , which gives rise to a hydrolyzate having a pleasant taste. The hydrolyzate may still taste better than the non-hydrolyzed whey protein. In addition, the whey protein hydrolyzate obtained by the method of the invention is stable and has a reduced tendency to gel in heat treatment compared to hydrolysates obtained by other endopeptidases.

A presente invenção portanto, diz respeito a um método para a produção de um hidrolisado de proteína de soro de leite que compreende:The present invention therefore relates to a method for the production of a whey protein hydrolyzate comprising:

a) fornecer uma composição aquosa de proteína de soro de leite que compreende beta-lactoglobulina e alfa-lactalbumina;a) providing an aqueous whey protein composition comprising beta-lactoglobulin and alpha-lactalbumin;

b) submeter a dita composição à ação de uma endopeptidase microbiana que cliva especificamente no lado do terminal carboxi de arginina ou lisina eb) subjecting said composition to the action of a microbial endopeptidase that specifically cleaves on the carboxy terminal side of arginine or lysine and

c) inativar a endopeptidase.c) inactivate endopeptidase.

A presente invenção também diz respeito ao uso de um hidrolisado de proteína de soro de leite obtido pelo método acima na nutrição clínica ou em uma bebida energética ou uma bebida esportiva.The present invention also relates to the use of a whey protein hydrolyzate obtained by the above method in clinical nutrition or in an energy drink or sports drink.

DIVULGAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DISCLOSURE OF THE INVENTION

Como mencionado acima, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de um hidrolisado de proteína de soro de leite que compreende:As mentioned above, the present invention relates to a method for the production of a whey protein hydrolyzate comprising:

c) inativar a endopeptidase.c) inactivate endopeptidase.

A proteína do soro de leite a ser usada no método da invenção deve ser entendida como proteínas que podem ser obteníveis a partir do soro de leite, tais como proteínas isoladas da proteína de leite. O soro de leite pode ser definido como a porção líquida que separa-se quando o leite coagula com ácido e/ou coalho. O soro de leite pode ser, desta maneira, um sub-produto da produção de queijo ou da proteína de caseína. O leite no contexto da presente invenção pode ser derivado de qualquer mamífero, tais como vacas, cabras, ovelhas, jumentas, camelas, camelídeos, iaques ou búfalas. Em um aspecto preferido, o leite é leite de vaca.The whey protein to be used in the method of the invention is to be understood as proteins that can be obtained from whey, such as proteins isolated from the whey protein. Whey can be defined as the liquid portion that separates when milk coagulates with acid and / or rennet. In this way, whey can be a by-product of cheese production or casein protein. Milk in the context of the present invention can be derived from any mammal, such as cows, goats, sheep, donkeys, camels, camelids, yaks or buffaloes. In a preferred aspect, the milk is cow's milk.

A proteína do soro de leite a ser usada no método da invenção compreende beta-lactoglobulina e alfa-lactalbumina. Esta também pode compreender outras proteínas obteníveis de soro de leite, tal como albumina de soro. A composição aquosa da etapa a) também pode compreender outras proteínas que não são obteníveis do soro de leite.The whey protein to be used in the method of the invention comprises beta-lactoglobulin and alpha-lactalbumin. It can also comprise other proteins obtainable from whey, such as serum albumin. The aqueous composition of step a) can also comprise other proteins that are not obtainable from whey.

Em um aspecto preferido, a composição aquosa da etapa a) compreende pelo menos 15 %, tal como pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 % ou pelo menos 60 % beta-lactoglobulina de matéria seca total. Em um outro aspecto preferido, a composição aquosa da etapa a) compreende pelo menos 5 %, tal como pelo menos 10%, pelo menos 15 % ou pelo menos 20 % alfa-lactalbumina de matéria seca total. Em um outro aspecto, a composição aquosa da etapa a) compreende pelo menos 1 %, tal como pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 % de albumina de soro de matéria seca total.In a preferred aspect, the aqueous composition of step a) comprises at least 15%, such as at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55% or at least 60% beta-lactoglobulin of total dry matter. In another preferred aspect, the aqueous composition of step a) comprises at least 5%, such as at least 10%, at least 15% or at least 20% total dry matter alpha-lactalbumin. In another aspect, the aqueous composition of step a) comprises at least 1%, such as at least 2%, at least 3%, at least 4% or at least 5% of total dry matter serum albumin.

Em um outro aspecto preferido, a composição aquosa da etapaIn another preferred aspect, the aqueous composition of the step

a) compreende pelo menos 15 % (p/p), tal como pelo menos 20 % (p/p), pelo menos 25 % (p/p), pelo menos 30 % (p/p), pelo menos 35 % (p/p), pelo menos 40 % (p/p), pelo menos 45 % (p/p), pelo menos 50 % (p/p), pelo menos 55 % (p/p) ou pelo menos 60 % (p/p) beta-lactoglobulina de proteína total. Em um outro aspecto preferido, a composição aquosa da etapa a) compreende pelo menos 5 % (p/p), tal como pelo menos 10 % (p/p), pelo menos 15 % (p/p) ou pelo menos 20 % (p/p) alfa-lactalbumina de proteína total. Em um outro aspecto, a composição aquosa da etapa a) compreende pelo menos 1 % (p/p), tal como pelo menos 2 % (p/p), pelo menos 3 % (p/p), pelo menos 4 % (p/p) ou pelo menos 5 % (p/p) de albumina de soro de proteína total.a) comprises at least 15% (w / w), as well as at least 20% (w / w), at least 25% (w / w), at least 30% (w / w), at least 35% ( w / w), at least 40% (w / w), at least 45% (w / w), at least 50% (w / w), at least 55% (w / w) or at least 60% ( w / w) total protein beta-lactoglobulin. In another preferred aspect, the aqueous composition of step a) comprises at least 5% (w / w), such as at least 10% (w / w), at least 15% (w / w) or at least 20% (w / w) total protein alpha-lactalbumin. In another aspect, the aqueous composition of step a) comprises at least 1% (w / w), such as at least 2% (w / w), at least 3% (w / w), at least 4% ( w / w) or at least 5% (w / w) total protein serum albumin.

Preferivelmente, a proteína do soro de leite foi isolada do soro de leite e a razão entre beta-lactoglobulina e alfa-lactalbumina é, em essência a mesma como no soro de leite do qual esta foi isolada.Preferably, whey protein has been isolated from whey and the ratio of beta-lactoglobulin to alpha-lactalbumin is essentially the same as in the whey from which it was isolated.

Em uma forma de realização preferida, a proteína do soro de leite usada no método pode ser uma proteína do soro de leite concentrada, que tem um teor de proteína de cerca de 29 % a menos do que cerca de 90 % em uma base isenta de umidade. As proteínas do soro de leite concentradas contém um nível baixo de gordura e de colesterol mas, no geral, tem níveis mais altos de carboidratos na forma de lactose.In a preferred embodiment, the whey protein used in the method can be a concentrated whey protein, which has a protein content of about 29% less than about 90% on a non-whey basis. moisture. Concentrated whey proteins contain a low level of fat and cholesterol but, in general, have higher levels of carbohydrates in the form of lactose.

Em uma outra forma de realização, a proteína do soro de leite pode ser uma proteína do soro de leite isolada. No geral, as proteínas do soro de leite isoladas têm um teor de proteína de pelo menos cerca de 90 % proteína do soro de leite em uma base isenta de umidade. Tais isolados foram, no geral, processados para remover a gordura e a lactose.In another embodiment, the whey protein may be an isolated whey protein. In general, isolated whey proteins have a protein content of at least about 90% whey protein on a moisture-free basis. Such isolates were, in general, processed to remove fat and lactose.

A proteína do soro de leite a ser usada no método da invenção pode ser uma combinação de proteína de soro de leite concentrada e proteína do soro de leite isolada.The whey protein to be used in the method of the invention can be a combination of concentrated whey protein and isolated whey protein.

A proteína do soro de leite pode compreender proteínas do soro de leite intactas ou pode compreender proteínas do soro de leite parcialmente hidrolisadas.The whey protein may comprise intact whey proteins or may comprise partially hydrolyzed whey proteins.

No método da invenção, o material de proteína do soro de leite é tipicamente misturado ou dispersado em água para formar uma pasta que compreende cerca de 1 % a cerca de 20 % de proteína em peso. Em uma forma de realização, a pasta pode compreender cerca de 1 % a cerca de 5 % de proteína em peso. Em uma outra forma de realização, a pasta pode compreender cerca de 6 % a cerca de 10 % de proteína em peso. Em uma outra forma de realização, a pasta pode compreender cerca de 11 % a cerca de 15 % de proteína em peso. Ainda, em uma outra forma de realização, a pasta pode compreender cerca de 16 % a cerca de 20 % de proteína em peso.In the method of the invention, the whey protein material is typically mixed or dispersed in water to form a slurry comprising about 1% to about 20% protein by weight. In one embodiment, the paste can comprise about 1% to about 5% protein by weight. In another embodiment, the pulp may comprise about 6% to about 10% protein by weight. In another embodiment, the paste can comprise about 11% to about 15% protein by weight. In yet another embodiment, the pulp may comprise about 16% to about 20% protein by weight.

Após o material de proteína ser dispersado em água, o pH e a 10 temperatura da pasta de proteína podem ser ajustados a fim de otimizar a reação de hidrólise e, em particular, para garantir que a endopeptidase usada na reação de hidrólise funcione próximo de seu nível de atividade ótimo.After the protein material is dispersed in water, the pH and temperature of the protein slurry can be adjusted to optimize the hydrolysis reaction and, in particular, to ensure that the endopeptidase used in the hydrolysis reaction works close to its optimal activity level.

O pH da pasta de proteína pode ser ajustado e monitorado de acordo com os métodos, no geral, conhecidos na técnica. O pH da pasta de proteína pode ser ajustado e mantido de cerca de 5,0 a cerca de 10,0, Em uma forma de realização, o pH da pasta de proteína pode ser ajustado e mantido de cerca de 6,5 a cerca de 8,0. Em uma forma de realização preferida, o pH da pasta de proteína pode ser ajustado e mantido em cerca de 7,5. A temperatura da pasta de proteína é preferivelmente ajustada e mantida de cerca de 40° C a cerca de 70° C durante a reação de hidrólise de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Em uma forma de realização preferida, a temperatura da pasta de proteína pode ser ajustada e mantida em de cerca de 40° C a cerca de 60° C durante a reação de hidrólise. No geral, as temperaturas acima desta faixa podem inativar a endopeptidase, enquanto temperaturas abaixo ou acima desta faixa tendem a diminuir a atividade da endopeptidase.The pH of the protein paste can be adjusted and monitored according to methods generally known in the art. The pH of the protein paste can be adjusted and maintained from about 5.0 to about 10.0. In one embodiment, the pH of the protein paste can be adjusted and maintained from about 6.5 to about 8.0. In a preferred embodiment, the pH of the protein slurry can be adjusted and maintained at about 7.5. The temperature of the protein slurry is preferably adjusted and maintained from about 40 ° C to about 70 ° C during the hydrolysis reaction according to methods known in the art. In a preferred embodiment, the temperature of the protein slurry can be adjusted and maintained at from about 40 ° C to about 60 ° C during the hydrolysis reaction. In general, temperatures above this range can inactivate endopeptidase, while temperatures below or above this range tend to decrease endopeptidase activity.

A reação de hidrólise é, no geral, iniciada pela adição de uma endopeptidase à pasta de material de proteína.The hydrolysis reaction is, in general, initiated by the addition of an endopeptidase to the protein material slurry.

As endopeptidases a serem usadas no método da invenção clivam especificamente no terminal carbóxi secundário de um resíduo de arginina ou um resíduo de lisina. Por “clivando-se especificamente” é entendido que a endopeptidase tem uma especificidade mais alta para a clivagem no terminal carboxi secundário de arginina ou lisina do que para a clivagem no terminal carboxi secundário de qualquer outro aminoácido. Em uma forma de realização, a endopeptidase especificamente cliva no terminal carboxi secundário de arginina, significando que a endopeptidase tem uma especificidade mais alta para a clivagem no terminal carboxi secundário de arginina do que para a clivagem no terminal carboxi secundário de qualquer outro aminoácido.The endopeptidases to be used in the method of the invention cleave specifically at the secondary carboxy terminus of an arginine residue or a lysine residue. By "specifically cleaving" is meant that endopeptidase has a higher specificity for cleavage at the secondary carboxy terminus of arginine or lysine than for cleavage at the secondary carboxy terminus of any other amino acid. In one embodiment, the endopeptidase specifically cleaves at the secondary carboxy terminal of arginine, meaning that endopeptidase has a higher specificity for cleavage at the secondary carboxy terminal of arginine than for cleavage at the secondary carboxy terminal of any other amino acid.

Tipicamente, a endopeptidase tem atividade proteolítica ótima em um pH de cerca de 6,0 a cerca de 11,0, preferivelmente em um pH de cerca de 8 a cerca de 10 e em uma temperatura de cerca de 40° C a cerca de 70° C, preferivelmente em uma temperatura de cerca de 45° C a cerca de 60° C ou de cerca de 45° C a cerca de 55° C.Typically, endopeptidase has optimal proteolytic activity at a pH of about 6.0 to about 11.0, preferably at a pH of about 8 to about 10 and at a temperature of about 40 ° C to about 70 ° C, preferably at a temperature of about 45 ° C to about 60 ° C or from about 45 ° C to about 55 ° C.

Uma endopeptidase a ser usada no método da invenção é de origem microbiana. O uso de enzimas microbianas, em vez de enzimas animais ou vegetais, é vantajoso em que as enzimas microbianas apresentam um amplo espectro de características (pH ótimo, temperatura etc.) e pode ser consistentemente obtenível em quantidades relativamente grandes.An endopeptidase to be used in the method of the invention is of microbial origin. The use of microbial enzymes, instead of animal or plant enzymes, is advantageous in that microbial enzymes have a wide range of characteristics (optimum pH, temperature etc.) and can be consistently obtainable in relatively large quantities.

A endopeptidase é, preferivelmente, uma endopeptidase semelhante à tripsina de origem microbiana. No contexto da presente invenção, uma endopeptidase semelhante à tripsina é uma endopeptidase tendo uma especificidade similar àquela de tripsina, por exemplo, uma endopeptidase tendo uma razão de tripsina maior do que 100, em que a razão de tripsina é determinada como a atividade da enzima quando cliva-se após Arg ou Lys (seja qual for o maior) dividido pela atividade da enzima quando cliva-se após qualquer outro aminoácido. Tais medições de atividade para determinar a razão de tripsina devem ser realizadas em um valor de pH onde a atividade da endopeptidase é pelo menos metade da atividade da endopeptidase em seu pH ótimo. A taxa de tripsina pode ser determinada como descrito no Exemplo 3 do presente pedido.Endopeptidase is preferably an endopeptidase similar to trypsin of microbial origin. In the context of the present invention, a trypsin-like endopeptidase is an endopeptidase having a specificity similar to that of trypsin, for example, an endopeptidase having a trypsin ratio greater than 100, where the trypsin ratio is determined as the activity of the enzyme when it cleaves after Arg or Lys (whichever is greater) divided by the activity of the enzyme when it cleaves after any other amino acid. Such activity measurements to determine the trypsin ratio should be performed at a pH value where the endopeptidase activity is at least half of the endopeptidase activity at its optimum pH. The rate of trypsin can be determined as described in Example 3 of the present application.

Em uma forma de realização, a endopeptidase é uma endopeptidase bacteriana.In one embodiment, the endopeptidase is a bacterial endopeptidase.

Em uma outra forma de realização, a endopeptidase é uma endopeptidase fungica. Em uma forma de realização preferida, a endopeptidase é de uma cepa de Fusarium, preferivelmente Fusarium oxysporum, por exemplo, tendo a sequência de aminoácido mostrada como SEQ ID N°: 2 do presente pedido (SWISSPROT N° P35049). Uma endopeptidase semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum tendo a sequência de aminoácido mostrada como aminoácidos 25 a 248 da SEQ ID N°: 2 foi previamente descrita (US 5.288.627; US 5.693.520).In another embodiment, endopeptidase is a fungal endopeptidase. In a preferred embodiment, the endopeptidase is from a Fusarium strain, preferably Fusarium oxysporum, for example, having the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2 of the present application (SWISSPROT No. P35049). A trype-like endopeptidase from Fusarium oxysporum having the amino acid sequence shown as amino acids 25 to 248 of SEQ ID NO: 2 has been previously described (US 5,288,627; US 5,693,520).

Em uma forma de realização, a endopeptidase é uma endopeptidase semelhante à tripsina de Achromobacter lyticus, por exemplo, tendo a sequência de aminoácido mostrada como SEQ ID N°: 4 do presente pedido (UNIPROT:P 15636). Em uma outra forma de realização, a endopeptidase é uma endopeptidase semelhante à tripsina de Fusarium solani, por exemplo, AP977S tendo a sequência de aminoácido mostrada como a SEQ ID N°: 6 do presente pedido (GENESEQP: ADZ80577). Em uma outra forma de realização, a endopeptidase é uma endopeptidase semelhante à tripsina de Fusarium cf. solani, por exemplo, AP971 tendo a sequência de aminoácido mostrada como a SEQ ID N°: 8 do presente pedido.In one embodiment, the endopeptidase is an endopeptidase similar to Achromobacter lyticus trypsin, for example, having the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 4 of the present application (UNIPROT: P 15636). In another embodiment, endopeptidase is an endopeptidase similar to Fusarium solani trypsin, for example, AP977S having the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 6 of the present application (GENESEQP: ADZ80577). In another embodiment, endopeptidase is an endopeptidase similar to Fusarium cf. trypsin. solani, for example, AP971 having the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 8 of the present application.

Em uma forma de realização da invenção, a endopeptidase é selecionada do grupo que consiste de:In an embodiment of the invention, endopeptidase is selected from the group consisting of:

i) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % idêntica a (A) qualquer um de SEQ ID N°: 2, 4, 6 ou 8 ou (B) um fragmento de qualquer uma destas sequências tendo a atividade de protease;i) a polypeptide that has an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identical to (A) any of SEQ ID NO: 2, 4 , 6 or 8 or (B) a fragment of any of these sequences having protease activity;

ii) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que é pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % idêntica a qualquer um de SEQ ID N°: 1, 3, 5 ou 7;ii) a polypeptide that is encoded by a polynucleotide that is at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identical to any one of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7;

iii) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo cujo complemento hibridiza-se pelo menos sob condições de estringência baixas, preferivelmente, pelo menos estringência média, pelo menos estringência alta ou pelo menos condições de estringência muito altas, com qualquer um de SEQ ID N°: 1, 3, 5 ou 7 e iv) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido modificada por substituição, deleção e/ou inserção de um ou diversos aminoácidos em (A) qualquer um de SEQ ID N°: 2, 4, 6 ou 8 ou (B) um fragmento de qualquer uma destas sequências tendo a atividade de protease.iii) a polypeptide that is encoded by a polynucleotide whose complement hybridizes at least under low stringency conditions, preferably at least medium stringency, at least high stringency or at least very high stringency conditions, with any of SEQ ID N °: 1, 3, 5 or 7 and iv) a polypeptide that has a modified amino acid sequence by substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids in (A) any one of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 or (B) a fragment of any of these sequences having protease activity.

Um fragmento de uma sequência de aminoácido tendo a atividade de protease pode ser a sequência de aminoácido da enzima ativa, por exemplo, após o processamento, tal como após qualquer peptídeo e/ou propeptídeo sinalizador ser clivado. Os fragmentos preferidos são os aminoácidos 25-248 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 21-653 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 26-251 de SEQ ID N°: 6 ou aminoácidos 18-250 da SEQ ID N°:A fragment of an amino acid sequence having protease activity can be the amino acid sequence of the active enzyme, for example, after processing, such as after any signal peptide and / or propeptide is cleaved. Preferred fragments are amino acids 25-248 of SEQ ID NO: 2, amino acids 21-653 of SEQ ID NO: 4, amino acids 26-251 of SEQ ID NO: 6 or amino acids 18-250 of SEQ ID NO: :

8.8.

Em uma forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % idêntica aos aminoácidos 25-248 da SEQ ID N°: 2.In a preferred embodiment of the invention, endopeptidase has an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identical to amino acids 25-248 of SEQ ID N °: 2.

Condições de estringência muito baixas a muito altas são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42° C em 5X SSPE, 0,3 % de SDS, 200 microg/ml de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado e 25 % de formamida para condições de estringência muito baixa e de estringências baixas, 35 % de formamida para estringências médias e médiaaltas ou 50 % de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão para 12 a 24 horas otimamente. O material carregador é fmalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando-se 2X SSC, 0,2 % de SDS preferivelmente pelo menos a 45° C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50° C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55° C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60° C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65° C (estringência alta) e mais preferivelmente pelo menos a 70° C (estringência muito alta). Em uma forma de realização particular, a lavagem é conduzida usando-se 0,2X SSC, 0,2 % de SDS preferivelmente pelo menos a 45° C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50° C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55° C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60° C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65° C (estringência alta) e mais preferivelmente pelo menos a 70° C (estringência muito alta). Em uma outra forma de realização particular, a lavagem é conduzida usando-se 0,lX SSC, 0,2 % de SDS preferivelmente pelo menos a 45° C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50° C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55° C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60° C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65° C (estringência alta) e mais preferivelmente pelo menos a 70° C (estringência muito alta).Very low to very high stringency conditions are defined as prehybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microg / ml of cut and denatured salmon sperm DNA and 25% formamide for very low stringency and low stringency conditions, 35% formamide for medium and medium high stringencies or 50% formamide for high and very high stringencies, following standard Southern blotting procedures for 12 to 24 hours optimally. The carrier material is finally washed three times each for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS preferably at least at 45 ° C (very low stringency), more preferably at least 50 ° C (low stringency), more preferably at least at 55 ° C (medium stringency), more preferably at least 60 ° C (medium-high stringency), even more preferably at least 65 ° C (high stringency) and most preferably at least 70 ° C (very high stringency). In a particular embodiment, washing is conducted using 0.2X SSC, 0.2% SDS preferably at least at 45 ° C (very low stringency), more preferably at least 50 ° C (low stringency) , more preferably at least at 55 ° C (medium stringency), more preferably at least 60 ° C (medium-high stringency), even more preferably at least 65 ° C (high stringency) and most preferably at least 70 ° C (very high stringency). In another particular embodiment, washing is conducted using 0.1X SSC, 0.2% SDS preferably at least at 45 ° C (very low stringency), more preferably at least 50 ° C (low stringency) ), more preferably at least at 55 ° C (medium stringency), more preferably at least 60 ° C (medium-high stringency), even more preferably at least 65 ° C (high stringency) and most preferably at least 70 ° C (very high stringency).

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento de duas sequências de aminoácidos podem ser determinado pelo uso do programa Needle a partir da embalagem EMBOSS (Rice, P., Longden, I. and Bleasby, A. (2000) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16, (6) pp 276—277; http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle executa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, penalidade de abertura de fenda é de 10, e a penalidade de extensão de fenda é de 0,5.For the purposes of the present invention, the alignment of two amino acid sequences can be determined by using the Needle program from the EMBOSS package (Rice, P., Longden, I. and Bleasby, A. (2000) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite.Trends in Genetics 16, (6) pp 276—277; http://emboss.org) version 2.8.0. The Needle program runs the global alignment algorithm described in Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. The replacement matrix used is BLOSUM62, the gap opening penalty is 10, and the gap extension penalty is 0.5.

O grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é calculada como o número de pontos exatos em um alinhamento de duas sequências, dividido pelo comprimento de duas sequências mais curtas. O resultado é expressado na identidade de percentual. Um ponto exato ocorre quando as duas sequências tem resíduos de aminoácidos idênticos na mesma posição da sobreposição. O comprimento da sequência é o número de resíduos de aminoácidos na sequência (por exemplo o comprimento da SEQ ID N°: 2 é de 248 aminoácidos).The degree of identity between two amino acid sequences is calculated as the number of exact points in an alignment of two sequences, divided by the length of two shorter sequences. The result is expressed in the percentage identity. An exact point occurs when the two sequences have identical amino acid residues in the same position as the overlap. The length of the sequence is the number of amino acid residues in the sequence (for example the length of SEQ ID NO: 2 is 248 amino acids).

O grau de identidade entre duas sequências de nucleotídeos é determinado pelo método Wilbur-Lipman (Wilbur and Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) usando o software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros de alinhamento múltiplos: Penalidade de fenda de 10 e penalidade de comprimento de fenda de 10. Os parâmetros de alinhamento em forma de pares são Ktuple=3, penalidade de fetida=3 e Windows—20.The degree of identity between two nucleotide sequences is determined by the Wilbur-Lipman method (Wilbur and Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) using the LASERGENE ™ MEGALIGN ™ software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) with an identity table and the following multiple alignment parameters: Slit penalty 10 and slit length penalty 10. Paired alignment parameters are Ktuple = 3, fetida penalty = 3 and Windows — 20.

O grau de identidade entre as sequências de nucleotídeos é calculada como o número de pontos exatos em um alinhamento de duas sequências, dividido pelo comprimento de duas sequências mais curtas. O resultado é expressado na identidade de percentual. Um ponto exato ocorre quando as duas sequências tem nucleotídeos idênticos na mesma posição da sobreposição. O comprimento da sequência é o número de nucleotídeos na sequência (por exemplo o comprimento da SEQ ID N°: 1 é de 744 nucleotídeos).The degree of identity between the nucleotide sequences is calculated as the number of exact points in an alignment of two sequences, divided by the length of two shorter sequences. The result is expressed in the percentage identity. An exact point occurs when the two sequences have identical nucleotides in the same position as the overlap. The length of the sequence is the number of nucleotides in the sequence (for example the length of SEQ ID NO: 1 is 744 nucleotides).

Preferivelmente, a quantidade de endopeptidase microbiana usada no método da invenção é de cerca de 0,01 a cerca de 500 AU (como definido abaixo) por Kg da proteína do soro de leite, preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 100 AU por Kg da proteína do soro de leite, mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 50 AU por Kg da proteína do soro de leite.Preferably, the amount of microbial endopeptidase used in the method of the invention is from about 0.01 to about 500 AU (as defined below) per Kg of whey protein, preferably from about 0.1 to about 100 AU per kg of whey protein, more preferably from about 0.5 to about 50 AU per kg of whey protein.

Uma unidade Anson (AU) é definida como uma quantidade de enzima que está sob condições padrão (isto é 25° C, pH 7.5 e 10 minutos, período de reação) digerindo a hemoglobina em uma taxa inicial tal que aqui é liberada por minuto em uma quantidade do produto solúvel em TCA que dá a mesma cor com o reagente fenol como um miliequivalente de tirosina.An Anson (AU) unit is defined as an amount of enzyme that is under standard conditions (ie 25 ° C, pH 7.5 and 10 minutes, reaction period) digesting hemoglobin at an initial rate such that it is released here per minute in an amount of the TCA-soluble product that gives the same color with the phenol reagent as a tyrosine milliequivalent.

A quantidade de endopeptidase adicionado ao material de proteína pode e variará dependendo da fonte do material de proteína, o grau desejado de hidrólise e a duração da reação de hidrólise. A quantidade de endopeptidase pode variar de cerca de 1 mg da proteína da enzima a cerca de 5000 mg da proteína da enzima por quilograma do material de proteína. Em uma outra forma de realização, a quantidade pode variar de 10 mg da proteína da enzima a cerca de 2000 mg da proteína da enzima por quilograma do material de proteína. Já em uma outra forma de realização, a quantidade pode variar de cerca de 50 mg da proteína da enzima a cerca de 1000 mg da proteína da enzima por quilograma do material de proteína.The amount of endopeptidase added to the protein material can and will vary depending on the source of the protein material, the desired degree of hydrolysis and the duration of the hydrolysis reaction. The amount of endopeptidase can vary from about 1 mg of the enzyme protein to about 5000 mg of the enzyme protein per kilogram of the protein material. In another embodiment, the amount can vary from 10 mg of the enzyme protein to about 2000 mg of the enzyme protein per kilogram of the protein material. In yet another embodiment, the amount can vary from about 50 mg of the enzyme protein to about 1000 mg of the enzyme protein per kilogram of the protein material.

Como será apreciado por um técnico habilitado, a duração da reação de hidrólise pode e variará. No geral, a duração da reação de hidrólise pode variar de poucos minutos a muitas horas, tal como, de cerca de 30 minutos a cerca de 48 horas.As will be appreciated by a qualified technician, the duration of the hydrolysis reaction can and will vary. In general, the duration of the hydrolysis reaction can vary from a few minutes to many hours, such as from about 30 minutes to about 48 hours.

Preferivelmente, o tratamento com endopeptidase microbiana resulta em um hidrolisado de proteína do soro de leite tendo um grau de hidrólise (DH) de cerca de 0,1 % a cerca de 20 %, mais preferivelmente de cerca de 0,5 % a cerca de 10 % ou de cerca de 0,5 % a cerca de 8 %, ainda mais preferivelmente de cerca de 1 % a cerca de 5 %.Preferably, treatment with microbial endopeptidase results in a whey protein hydrolyzate having a degree of hydrolysis (DH) from about 0.1% to about 20%, more preferably from about 0.5% to about 10% or from about 0.5% to about 8%, even more preferably from about 1% to about 5%.

O grau de hidrólise (DH) expressa a extensão da hidrólise da proteína obtida pelo método. No contexto da invenção, o grau de hidrólise (DH) é definido como segue:The degree of hydrolysis (DH) expresses the extent of protein hydrolysis obtained by the method. In the context of the invention, the degree of hydrolysis (DH) is defined as follows:

DH = (Número de ligações de peptídeo clivadas / Número total de ligações de peptídeos) x 100 %DH = (Number of cleaved peptide bonds / Total number of peptide bonds) x 100%

A pessoa habilitada conhecerá para medir o DH.The qualified person will know to measure HD.

Na etapa c) do método da invenção, a endopeptidase é inativada. Tal inativação pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo pelo aquecimento a pelo menos 70° C, tal como a pelo menos 75° C ou pelo menos 80° C.In step c) of the method of the invention, the endopeptidase is inactivated. Such inactivation can be accomplished by any method known in the art, for example by heating to at least 70 ° C, such as at least 75 ° C or at least 80 ° C.

Um hidrolisado da proteína do soro de leite obtido pelo método da invenção pode ser usada em um produto alimentício, por exemplo em uma bebida. Exemplos não limitantes de tais produtos alimentícios incluem bebidas esportivas ou bebidas energéticas. Um hidrolisado da proteína do soro de leite obtido pelo método da invenção também pode ser usado na nutrição clínica, por exemplo em hospitais.A whey protein hydrolyzate obtained by the method of the invention can be used in a food product, for example in a beverage. Non-limiting examples of such food products include sports drinks or energy drinks. A whey protein hydrolyzate obtained by the method of the invention can also be used in clinical nutrition, for example in hospitals.

EXEMPLO 1EXAMPLE 1

Cinco enzimas proteolíticas diferentes foram usadas para hidrolisar o concentrado da proteína do soro de leite (Lacprodan 80) de Arla Foods, Denmark (que compreende cerca de 80 % da proteína do total da origem seca). As enzimas e dosagens foram:Five different proteolytic enzymes were used to hydrolyze the whey protein concentrate (Lacprodan 80) from Arla Foods, Denmark (which comprises about 80% of the total dry protein). The enzymes and dosages were:

Protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum, dosagem de 500 mg da proteína da enzima/kg material bruto.Fusarium oxysporum trypsin-like protease, dosage of 500 mg of the enzyme protein / kg crude material.

PTN 6.0 (Novozymes A/S), dosagem de 0,5 % do material bruto.PTN 6.0 (Novozymes A / S), dosage of 0.5% of the raw material.

Alcalase 2.4L (Novozymes A/S), dosagem de 0,2 % do material bruto.Alcalase 2.4L (Novozymes A / S), dosage of 0.2% of the raw material.

Neutrase 0.8L (Novozymes A/S), dosagem de 1 % do material bruto.Neutrase 0.8L (Novozymes A / S), dosage of 1% of the raw material.

Protamex 1.5MG (Novozymes A/S), dosagem de 0,5 % do material bruto.Protamex 1.5MG (Novozymes A / S), dosage of 0.5% of the raw material.

O concentrado da proteína do soro de leite foi misturado com água (1:9) antes da adição da enzima.The whey protein concentrate was mixed with water (1: 9) before adding the enzyme.

A hidrólise foi colocada a 50° C em um béquer montado com o sistema de dosagem de adição da base (0,1 N de NaOH) para manter o pH constante a pH 7.5 até o grau da hidrólise (DH) = 4 %.The hydrolysis was placed at 50 ° C in a beaker assembled with the base addition dosing system (0.1 N NaOH) to keep the pH constant at pH 7.5 until the degree of hydrolysis (DH) = 4%.

As amostras foram aquecidas a 85° C para inativar as enzimas e testar no painel sensorial.The samples were heated to 85 ° C to inactivate the enzymes and test on the sensory panel.

Os testes triangulares foram usados para comparar o hidrolisado obtido com a protease microbiana semelhante à tripsina com cada um do hidrolisado obtido com um outro de quatro enzimas. Seis participantes, cada um recebeu três amostras codificadas. Estes relataram que duas das amostras foram as mesmas que uma foi diferente. Os participantes foram indagados para identificar a amostra ímpar. O número de “respostas corretas” na tabela abaixo indica o número de participantes que são capazes de identificar a amostra ímpar. Os participantes também foram indagados por selecionar o mínimo da amargura das amostras em cada teste triangular.Triangular tests were used to compare the hydrolyzate obtained with trypsin-like microbial protease with each of the hydrolyzate obtained with another of four enzymes. Six participants, each received three coded samples. These reported that two of the samples were the same as one was different. Participants were asked to identify the odd sample. The number of “correct answers” in the table below indicates the number of participants who are able to identify the odd sample. Participants were also asked to select the minimum bitterness of the samples in each triangular test.

As amostras feitas com Alcalase, Neutrase e Protamex todas tem uma clara tendência ao gel durante a pasteurização. As amostras feitas com PTN e protease microbiana semelhante à tripsina ficaram homogêneas.The samples made with Alcalase, Neutrase and Protamex all have a clear tendency to gel during pasteurization. The samples made with PTN and trypsin-like microbial protease were homogeneous.

As amostras foram diluídas a 3 % do conteúdo da proteína antes da avaliação do paladar.The samples were diluted to 3% of the protein content before the taste evaluation.

Os resultados a partir das avaliações do paladar triangular são mostradas abaixo. MTP é a protease microbiana experimental semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum. Seis participantes foram incluídos na avaliação. Se pelo menos 5 respostas corretas foram dadas (coluna 2), a diferença entre as amostras foi considerada significante. A terceira e quarta colunas são os números de participantes (com respostas corretas na segunda coluna) que observaram que as amostras tem a mínimo de amargura no paladar:The results from the triangular taste assessments are shown below. MTP is the experimental microbial protease similar to Fusarium oxysporum trypsin. Six participants were included in the assessment. If at least 5 correct answers were given (column 2), the difference between the samples was considered significant. The third and fourth columns are the numbers of participants (with correct answers in the second column) who observed that the samples have the least bitterness on the palate:

Respostas corretas Correct answers Mínimo de amargura Minimum bitterness Processo 1, PTN Process 1, PTN 5, 5, PTN PTN MTP MTP 2 2 3 3 Processo 2, Alcalase Process 2, Alcalase 4 4 Alcalase Alcalase MTP MTP 2 2 Processo 3, Neutrase Process 3, Neutrase 2 2 Neutrase Neutrase MTP MTP 1 1 Processo 4, Protamex Process 4, Protamex 3 < 3 < Protamex Protamex MTP MTP 2 2 1 1

Os resultados mostram que existe uma diferença significante entre as amostras produzidas por PTN e por MTP onde as amostras produzidas por MTP foram selecionadas como sendo o mínimo de amargura do que as amostras produzidas por PTN. Nenhuma diferença significante foi mostrada entre as amostras produzidas por MTP e qualquer uma das amostras produzidas com as enzimas não tendo a especificidade Lys e Arg (Alcalase, Neutrase, Protamex).The results show that there is a significant difference between the samples produced by PTN and by MTP where the samples produced by MTP were selected as being the least bitterness than the samples produced by PTN. No significant difference was shown between the samples produced by MTP and any of the samples produced with the enzymes not having the specificity Lys and Arg (Alcalase, Neutrase, Protamex).

EXEMPLO 2EXAMPLE 2

Cinco enzimas proteolíticas diferentes foram usadas para hidrolisar o concentrado da proteína do soro de leite de Leprino Foods, US (que compreende cerca de 80 % da proteína do total da origem seca). As enzimas e dosagens foram:Five different proteolytic enzymes were used to hydrolyze the whey protein concentrate from Leprino Foods, US (which comprises about 80% of the total dry protein). The enzymes and dosages were:

Protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum, dosagem de 500 mg da proteína da enzima/kg do material bruto.Fusarium oxysporum trypsin-like protease, dosage of 500 mg of the enzyme protein / kg of crude material.

A hidrólise foi colocada a 50° C em um béquer montado com o sistema de dosagem de adição da base (0,1 N de NaOH) para manter o pH constante a pH7.5 até o grau da hidrólise (DH) = 4 %.The hydrolysis was placed at 50 ° C in a beaker assembled with the base addition dosing system (0.1 N NaOH) to keep the pH constant at pH7.5 until the degree of hydrolysis (DH) = 4%.

Os testes triangulares foram usados para comparar o hidrolisado obtido com a protease microbiana semelhante à tripsina com cada um do hidrolisado obtido com um outro de quatro enzimas. Sete participantes cada um recebeu três amostras codificadas. Estes relataram que duas das amostras foram a mesma e que uma foi diferente. Os participantes foram indagados para identificar a amostra ímpar. O número de “respostas corretas” na tabela abaixo indica o número de participantes que são capazes de identificar a amostra ímpar. Os participantes também foram indagados por selecionar o mínimo da amargura das amostras em cada teste triangular.Triangular tests were used to compare the hydrolyzate obtained with trypsin-like microbial protease with each of the hydrolyzate obtained with another of four enzymes. Seven participants each received three coded samples. They reported that two of the samples were the same and that one was different. Participants were asked to identify the odd sample. The number of “correct answers” in the table below indicates the number of participants who are able to identify the odd sample. Participants were also asked to select the minimum bitterness of the samples in each triangular test.

Todas as amostras ficaram homogêneas durante/após a pasteurização.All samples were homogeneous during / after pasteurization.

Os resultados a partir das avaliações do paladar triangular são mostrados abaixo. MTP é a protease microbiana experimental semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum. Sete participantes foram incluídos na avaliação. Se pelo menos 5 respostas corretas foram dadas (coluna 2), a diferença entre as amostras foi considerada significante. A terceira e quarta colunas são os números de participantes (com respostas corretas na segunda coluna) que observaram que as amostras tem um mínimo de amargura no paladar:The results from the triangular taste assessments are shown below. MTP is the experimental microbial protease similar to Fusarium oxysporum trypsin. Seven participants were included in the assessment. If at least 5 correct answers were given (column 2), the difference between the samples was considered significant. The third and fourth columns are the numbers of participants (with correct answers in the second column) who observed that the samples have a minimum of bitterness on the palate:

Respostas corretas Correct answers Mínimo de amargura Minimum bitterness Processo 1, PTN Process 1, PTN 5 5 PTN PTN MTP MTP 4 4 Processo 2, Alcalase Process 2, Alcalase 6 6 Alcalase Alcalase MTP MTP 4 4 Processo 3, Neutrase Process 3, Neutrase 2 2 Neutrase Neutrase MTP MTP 2 2 Processo 4, Protamex Process 4, Protamex 3 3 Protamex Protamex MTP MTP 3 3

Os resultados mostram que existe uma diferença significante entre as amostras produzidas com MTP e as amostras produzidas com Alcalase ou PTN onde as amostras produzidas por MTP foram selecionadas como sendo o mínimo de amargura do que as amostras produzidas tanto por Alcalase quando por PTN.The results show that there is a significant difference between the samples produced with MTP and the samples produced with Alcalase or PTN where the samples produced by MTP were selected as being the least bitterness than the samples produced by both Alcalase and PTN.

EXEMPLO 3EXAMPLE 3

Definição, medição e cálculo da razão de TripsinaDefinition, measurement and calculation of the Trypsin ratio

PrincípioPrinciple

Para fazer um ensaio medido para a determinação da atividade de endopeptidase semelhante à tripsina, temos usados 10 substratos cromogênicos diferentes com a fórmula geral Suc-AAPX-pNA - onde X é uma abreviação da letra por um dos vinte resíduos de aminoácidos naturais. A endopeptidase clivará no lado do terminal carboxi de X e libera uma cor amarela (para-nitroanilina), que pode ser medida. Temos usados estes 10 substratos Suc-AAPX-pNA diferentes disponíveis de Bachem (X = A, R, D, Ε, I, L, K, M, F e V) para fazer a medição e cálculo de que intitulamos a razão de tripsina.To perform a measured assay for the determination of trypsin-like endopeptidase activity, we have used 10 different chromogenic substrates with the general formula Suc-AAPX-pNA - where X is an abbreviation of the letter by one of the twenty natural amino acid residues. The endopeptidase will cleave on the carboxy terminal side of X and release a yellow color (para-nitroaniline), which can be measured. We have used these 10 different Suc-AAPX-pNA substrates available from Bachem (X = A, R, D, Ε, I, L, K, M, F and V) to do the measurement and calculation that we call the trypsin ratio .

Uma endopeptidase semelhante à tripsina no contexto da presente invenção pode ser definido como uma endopeptidase tendo uma razão de tripsina de mais do que 100.A trypsin-like endopeptidase in the context of the present invention can be defined as an endopeptidase having a trypsin ratio of more than 100.

A razão de tripsina é calculada como a atividade máxima em Suc-AAPR-pNA ou Suc-AAPK-pNA dividida pela atividade máxima em quaisquer um dos oito outros substratos Suc-AAPX-pNA:The trypsin ratio is calculated as the maximum activity in Suc-AAPR-pNA or Suc-AAPK-pNA divided by the maximum activity in any of the eight other Suc-AAPX-pNA substrates:

Razão de tripsina = atividade máxima em Suc-AAP(R/K)-pNA / atividade máxima em Suc-AAP(nonR/K)-pNA.Trypsin ratio = maximum activity in Suc-AAP (R / K) -pNA / maximum activity in Suc-AAP (nonR / K) -pNA.

A medição da atividade deve ser realizada em um valor pH onde a atividade é pelo menos metade da atividade em ótimo pH.Activity measurement should be performed at a pH value where the activity is at least half the activity at optimal pH.

Materiais e MétodosMaterials and methods

Ensaio Suc-AAPX-pNA:Suc-AAPX-pNA Assay:

Substratos: Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775)Substrates: Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775)

Suc-AAPR-pNA (Bachem L-1720)Suc-AAPR-pNA (Bachem L-1720)

Suc-AAPD-pNA (Bachem L-1835)Suc-AAPD-pNA (Bachem L-1835)

Suc-AAPE-pNA (Bachem L-1710)Suc-AAPE-pNA (Bachem L-1710)

Suc-AAPI-pNA (Bachem L-1790)Suc-AAPI-pNA (Bachem L-1790)

Suc-AAPL-pNA (Bachem L-1390)Suc-AAPL-pNA (Bachem L-1390)

Suc-AAPK-pNA (Bachem L-1725)Suc-AAPK-pNA (Bachem L-1725)

Suc-AAPM-pNA (Bachem L-1395)Suc-AAPM-pNA (Bachem L-1395)

Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400)Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400)

Suc-AAPV-pNA (Bachem L-1770)Suc-AAPV-pNA (Bachem L-1770)

Temperatura: Temperatura ambiente (25° C)Temperature: Ambient temperature (25 ° C)

Tampão de ensaio: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl₂, 150 mM de KC1, 0,01 % de Triton X-100, pH 9.0.Assay buffer: 100 mM succinic acid, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl ₂ , 150 mM KC1, 0.01% Triton X-100, pH 9.0.

Ensaio: 20 ul (microlitro) da diluição de peptidase (diluído em 0,01 % deAssay: 20 ul (microliter) of the peptidase dilution (diluted in 0.01% of

Triton X-100) foi colocado em um reservatório em uma placa microtituladora. O ensaio foi começado pela adição 200 ul de substrato de pNA (50 mg dissolvido em 1,0 ml de DMSO e ainda diluído com 90x no tampão de ensaio). O aumento inicial em OD₄₀₅ foi monitorado como uma medida da atividade de peptidase. Se uma plotagem linear (ou quase linear) não for atingida nos 4 minutos do período de medição, a peptidase ainda será diluída e o ensaio será repetido.Triton X-100) was placed in a reservoir on a microtiter plate. The assay was started by adding 200 µl of pNA substrate (50 mg dissolved in 1.0 ml of DMSO and further diluted with 90x in the assay buffer). The initial increase in OD ₄₀₅ was monitored as a measure of peptidase activity. If a linear (or near-linear) plot is not reached within 4 minutes of the measurement period, the peptidase will still be diluted and the assay will be repeated.

Peptidases: Alcalase (Novozymes A/S, Denmark)Peptidases: Alcalase (Novozymes A / S, Denmark)

Endopeptidase de lisila de Achromobacter lyticus (SEQ IDAchromobacter lyticus lysyl endopeptidase (SEQ ID

N°: 4)N °: 4)

Protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum 5 Tripsina porcina (Novozymes A/S, Denmark)Trypsin-like protease from Fusarium oxysporum 5 Porcine trypsin (Novozymes A / S, Denmark)

Todas as enzimas foram purificadas pela cromatografia a uma alta pureza. Apenas um grupo foi visto para cada peptidase em coomassie tingidos pelos géis SDS-PAGE.All enzymes were purified by chromatography at high purity. Only one group was seen for each coomassie peptidase stained by the SDS-PAGE gels.

Características da peptidase:Peptidase characteristics:

Alcalase: pH_opt = pH 9 em Suc-AAPF-pNA.Alkalase: pH _opt = pH 9 in Suc-AAPF-pNA.

Protease de Achromobacter lyticus'. pHo_pt = pH 10 em SucAAPK-pNA.Achromobacter lyticus' protease. pHo _pt = pH 10 in SucAAPK-pNA.

Protease semelhante à tripsina de Fusarium'. pHo_pt = pH 10 em Boc-VLGR-pNA.Fusarium 'trypsin-like protease. pHo _pt = pH 10 in Boc-VLGR-pNA.

Tripsina porcina: pHo_pt = pEl 10 em Boc-VLGR-pNA.Porcine trypsin: pHo _pt = pEl 10 in Boc-VLGR-pNA.

ResultadosResults

A especificidade das peptidases em substratos Suc-AAPXpNA no pH 9 e cálculo de uma razão de tripsina:The specificity of peptidases in Suc-AAPXpNA substrates at pH 9 and calculation of a trypsin ratio:

O experimento da especificidade foi realizado ao pH 9. Como 20 é visto no parágrafo de Materiais e métodos, três das peptidases testadas tem pHopt > pH 9. Entretanto, para estas três peptidases a atividade no pH 9 é mais do que metade da atividade no pHo_pt. Os resultados são mostrados na Tabela abaixo:The specificity experiment was carried out at pH 9. As 20 is seen in the Materials and Methods paragraph, three of the tested peptidases have pHopt> pH 9. However, for these three peptidases, the activity at pH 9 is more than half of the activity at pHo _pt . The results are shown in the Table below:

Suc-AAPX- pNA Suc-AAPX- pNA Alcalase Alcalase Protease de Achromobacter lyticus Protease from Achromobacter lyticus Tripsina de Fusarium Fusarium Trypsin Tripsina porcina Trypsin pig Suc-AAPA- pNA Suc-AAPA- pNA 0,02497 0.02497 0,00001 0.00001 0,00000 0.00000 0,00001 0.00001 Suc-AAPR- pNA Suc-AAPR- pNA 0,01182 0.01182 0,00001 0.00001 1,00000 1.00000 1,00000 1.00000 Suc-AAPD- pNA Suc-AAPD- pNA 0,00053 0.00053 0,00000 0.00000 0,00000 0.00000 0,00000 0.00000 Suc-AAPI-pNA Suc-AAPI-pNA 0,00026 0.00026 0,00000 0.00000 0,00000 0.00000 0,00000 0.00000

Suc-AAPM- pNA Suc-AAPM- pNA 0,37582 0.37582 0,00023 0.00023 0,00002 0.00002 0,00031 0.00031 Suc-AAPV- pNA Suc-AAPV- pNA 0,00033 0.00033 0,00000 0.00000 0,00000 0.00000 0,00000 0.00000 Suc-AAPL- pNA Suc-AAPL- pNA 0,86502 0.86502 0,00001 0.00001 0,00000 0.00000 0,00002 0.00002 Suc-A APEpNA Suc-A APEpNA 0,00289 0.00289 0,00000 0.00000 0,00000 0.00000 0,00000 0.00000 Suc-AAPK- pNA Suc-AAPK- pNA 0,01900 0.01900 1,00000 1.00000 0,53071 0.53071 0,51396 0.51396 Suc-AAPF- pNA Suc-AAPF- pNA 1,00000 1.00000 0,00001 0.00001 0,00003 0.00003 0,00057 0.00057 Max de Suc- AAP(R/K)- pNA Max de Suc- AAP (R / K) - pNA 0,01900 0.01900 1,00000 1.00000 1,00000 1.00000 1,00000 1.00000 Max de Suc- AAP(nonRTK)- pNA Max de Suc- AAP (nonRTK) - pNA 1,00000 1.00000 0,00023 0.00023 0,00003 0.00003 0,00057 0.00057 Razão de tripsina Reason for trypsin 0,019 0.019 4300 4300 33000 33000 1750 1750

Os dados da atividade relatada para cada endopeptidase na Tabela é relacionada à atividade para o melhor substrato Suc-AAPX-pNA.The activity data reported for each endopeptidase in the Table is related to the activity for the best Suc-AAPX-pNA substrate.

E visto que de acordo com esta definição, a protease de Achromobacter lyticus, a protease de Fusarium semelhante à tripsina e tripsina porcina são endopeptidases semelhantes à tripsina. Considerando a Alcalase não é uma endopeptidase semelhante à tripsina.And since according to this definition, the protease of Achromobacter lyticus, the protease of Fusarium similar to trypsin and porcine trypsin are endopeptidases similar to trypsin. Considering Alcalase is not an endopeptidase similar to trypsin.

Claims

1. Method for the production of a whey protein hydrolyzate, characterized by the fact that it comprises:

a) providing an aqueous whey protein composition comprising beta-lactoglobulin and alpha-lactalbumin;

b) subject said composition to the action of a microbial endopeptidase that cleaves specifically on the side of the arginine or Plant carboxy terminal and

c) inactivate endopeptidase.

10

2. Method according to claim 1, characterized by the fact that the microbial endopeptidase is a fungal endopeptidase.

Method according to claim 2, characterized by the fact that the fungal endopeptidase is derived from a Fusarium strain.

Method according to claim 3, characterized by the fact that the fungal endopeptidase is derived from a strain of Fusarium oxysporum.

10. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the whey protein hydrolyzate has a degree of hydrolysis of 0.1% to 20%.

5. Method according to any of the preceding claims, characterized by the fact that the endopeptidase has optimal proteolytic activity at a pH of 8 to 10.

20

6. Method according to any of the preceding claims, characterized by the fact that the endopeptidase has optimal proteolytic activity at a temperature of 45 ° C to 60 ° C.

7. Method according to any of the preceding claims, characterized by the fact that endopeptidase has a

25 amino acid sequence that is identical to amino acids 25 to 248 of SEQ ID NO: 2.

Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the whey protein is the whey protein concentrate or whey protein isolated.

Petition 870180060280, of 12/07/2018, p. 6/7

Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the aqueous solution of whey protein comprises at least 5% of total dry matter alpha-lactalbumin.

10 hydrolysis from 0.5% to 8%.

11. Method according to claim 10, characterized in that the whey protein hydrolyzate has a degree of

12. Method according to any of the preceding claims, characterized by the fact that step c) comprises heating to at least 70 ° C.

Method according to any one of the preceding claims 15, characterized in that the endopeptidase is added in a concentration of 0.01 to 10 g of enzyme protein per kg whey protein.

14. Use of a whey protein hydrolyzate obtained by the method as defined in any of the preceding claims,

20 characterized by the fact that it is in clinical nutrition.

15. Use of a whey protein hydrolyzate obtained by the method as defined in any of claims 1 to 13, characterized by the fact that it is in a sports drink.

Petition 870180060280, of 12/07/2018, p. 7/7

This annex presents the control code for the listing of biological sequences.

Control Code

Other information:

- File Name: 8861791491.txt

- Code Generation Date: 3/21/2018

- Code Generation Time: 12:19:13

- Control Code:

- Field 1: D04D8EEC937C2F83

- Field 2: F5FDBE8DBA5EF163

Petition 870180022679, of March 21, 2018, p. 13/13