BRPI0810065A2 - caracterização de n-glicanos usando exoglicosidases - Google Patents

Abstract

caracterização de n-glicanos usando exoglicosidases a presente revelação proporciona métodos para analisar a estrutura e/ou composição de n-glicanos. estes métodos muitas vezes envolvem a digestão de n-glicanos com exoglicosidases múltiplas. em algumas modalidades, os n-glicanos são digeridos com exoglicosidades múltiplas simultaneamente. em algumas modalidades, os n-glicanos são digeridos com exoglicosidades múltiplas seqüencialmente. em algumas modalidades, os métodos de acordo com a presente revelação envolvem a comparação de produtos da clivagem de n-glicanos que foram digeridos com exoglicosidades múltiplas simultaneamente a n-glicanos que foram digeridos com exoglicosidades múltiplas seqüencialmente.

Description

CARACTERIZAÇÃO DE N~aLXCANOS USANDO EXQQXjICOSXDASES

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Esta invenção reivindica prioridade ao pedido provisório dos Estados Unidos, número de série 60/923,688, depositado em 16 de Abril de 2007, cujo teor aqui ê dado como integralmente incorporado por citação,

ANTECEDENTES

O padrão de glicosilação de uma glicoproteína muitas vezes desempenha um papel significativo na função daquela glicoproteína. Para dar apenas alguns exemplos, o padrão de glicoáilação da glicoproteína pode afetar a sua capacidade para dobrar corretamente, a sua estabilidade (por exemplo, resistência à degradação proteolítica e/ou outras), a atividade catalítica, as propriedades farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas e/ou a capacidade daquela glicoproteína de interagir apropriadamente com outras moléculas. Alternativamente ou adicíonaltnente, um padrão de glicosilação de uma glicoproteína pode afetar o transporte e o direcionamento da glicoproteína. Per exemplo, o padrão de glicosilação da glicoproteína pode afetar se a glicoproteína permanece intracelular (incluindo, por exemplo, o direcionamento correto da glicoproteína para o compartimento ou compartimentos subcelulares apropriados), se a glicoproteína será ligada â membrana e/ou se a glicoproteína será segregada da célula.

Muitas vezes, os métodos atuais não são capazes de detectar espécies de glicanos que estão presentes em baixos níveis em uma população de glicanos. As espécies principais de glicanos podem, evitar a detecção e identificação de espécies de glícanas que estão presentes em baixos níveis.

Além disso, os métodos atuais, de um modo geral, não podem quantificar da forma precisa os níveis relativos de espécies individuais de glicanos em uma população de glicanos.. Os métodos atuais podem não ser capazes de detectar ligações não padrão em uma população de glicanos. Em consequência, são necessários métodos para detectar espécies de glicanos que estão presentes em níveis baixas em uma população de glicanos. São necessários métodos para quantificar níveis relativos de espécies individuais de glicanos em uma população de glicanos.

swÃaio

A presente revelação proporciona métodos para analisar a composição e/ou a estrutura de glicanos 17ligados, Os métodos aqui descritos podem ser usados para analisar uma preparação de 17-glicanos (por exemplo, uma mistura de N-glicanos) e para medir os níveis relativos na. preparação de grupos estruturais específicos e/ou modificações pouco comuns (por exemplo, fucose de núcleo ou antenária, extensões de lactosamina, glicanos híbridos e com alto teor de manose, sulfatação e fosforilação) . Os métodos aqui descritos podem, de um modo geral, envolver etapas para obter uma preparação de A^T-glicano; digerir glicanos ligados com. as enzimas exoglicosídase para especificamente clivar monossacarídeos das extremidades não redatoras; e analisar os produtos da divagem. A comparação dos resultados de tratamentos múltiplos com as enzimas exoglicosidase (por exemplo, tratamentos simultâneos e várias tratamentos sequenciais) pode proporcionar informações surpreendentes sobre a estrutura do glicano, por exemplo, pode identificar espécies de glicanos que estão presentes em níveis muito baixos em uma preparação de N-glicanos.

Uma. preparação de glicanos pode ser obtida por meio de qualquer método disponível na técnica. Em geral, a obtenção de uma preparação de 17-gl ícaro compreende as etapas de (1) obter uma glicoproteína ou outra preparação de glicoconjugados; e (2) obter uma preparação de Anglicano a partir da preparação de glicoconjugados. Uma preparação de glicoconjugados (por exemplo, glicoproteína) pode ser obtida de qualquer fonte incluindo, mas não limitada a formulações terapêuticas, produtos biológicos comerciais e amostras biológicas.

Em algumas modalidades, uma preparação de K-glicano é obtida proporcionando uma população de glicoproteínas e removendo os h’-glicanos das glicoproteínas da população de glicoproteínas. Em algumas modalidades, os IV-glicanos podem ser associados a um marcador detectável (por exemplo, uma unidade fluorescente e/ou radioativa).

Em algumas modalidades, as populações de íi-glicanos são digeridas com uma ou mais exoglicosidases, e a estrutura e/ou composição dos produtos da digestão é analisada. Em algumas modalidades. as exoglicosidases usadas de acordo com a presente revelação reconhecem e clivam apenas um tipo particular de ligação glicosídica. Em algumas modalidades, as exoglicosidases usadas de acordo com a presente revelação reconhecem e clivam mais de um tipo particular de ligação glicosídica. As exoglicosidases exemplifícativas que podem ser usadas de acordo com a presente revelação incluem, mas não se limitam a sialida.se, galactosidase, hexosaminidase, fucosidase e manosidase.

De acordo com a presente invenção, uma população de N~glicanos pode ser digerida com qualquer¹ exoglicosida.se. Em certas modalidades, os #~glicanos são digeridos submetendo uma população de Anglicanos a uma pluralidade de exogllcosidases. Por exemplo, uma população de N-glicanos pode ser submetida a 2, 3, 4, S, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais exoglicosidases. Em algumas modalidades, exoglicosidases múltiplas são administradas simultaneamente. Em algumas modalidades, exoglicosidases múltiplas são administradas seqüencialmente. Em algumas modalidades, variar a identidade das exoglicosidases que são administradas revela informações sobre a estrutura e/ou a composição dos Anglicanos. Em algumas modalidades, variar a sequência na :$uar exoglicosidases múltiplas radas revel informações estrutura xVqlicanos.

Em aloumas modalidades, sequencial múltiplas revela informações estrutura.

a composição dos ΑΓ-g li canos que informações reveladas pela simultânea om mesmo junto de exoglicosidases

Em algumas modalidades sequencial exoglicosidases múltiplas revela informações sobre a estrutura e/ou a composição dos AZ-glicanos que são as mesmas informações reveladas pela digestão simultânea com o mesmo conjunto de exoglicosidases

Em algumas modalidades, assim que um tratamento com exogliuosidase tenha sido realizado até o término, a estrutura e/ou identidade dos glicanos clivados é analisada. Em algumas modalidades, pele menos uma amostra pode ser removida da preparação de glicanos durante o transcurso do tratamento com exoglicosidase (por exemplo, em qualquer momento antes- do término do tratamento com exoglicosidase). Em algumas modalidades, as estruturas e/ou identidades dos glicanos clivados são analisadas em pelo menos uma das amostras removidas. Em algumas modalidades, a etapa de analisar compreende comparar a estrutura e/ou função dos glicanos clivados em uma ou mais das amostras removidas som a estrutura e/ou função de glicanos clivados em pelo menos uma outra amostra removida. Em algumas modalidades, a etapa de analisar compreende comparar a estrutura e/ou função dos glicanos clivados em uma ou mais das amostras removidas com a estrutura e/ou função de glicanos clivados em uma amostra de referência.

A estrutura e composição dos ^-glicanos digeridos pode ser analisada por qualquer método disponível (por exemplo, métodos cromatográficos, espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear, eletroforese capilar, etc.).

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos possibilitam a detecção de espécies de Iw-glicanos que estão presentes em níveis baixos em uma população de Ν'-glicanos, Por exemplo, de acordo com a presente revelação, os métodos aqui descritos pos glicanos que estão inferiores a 5%, inferiores a 2%, inferiores a 0,75%, ou inferiores a 0,l^: iibilitam a detecção presentes em níveis inferiores a 4%, inferiores a 1,5%, inferiores a 0,5%, ; em uma população de

de espécies de
inferiores	3 XO'% f
inferiores
inferiores	a 1%,
inferiores	a 0,25%
glicanos<

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Em algumas modalidades., os métodos aqui descritos possibilitam a detecção de ligações particulares que estão presentes em níveis baixos, em uma população de Anglicanos. Por exemplo, de acordo com a presente revelação, os métodos aqui descritos possibilitam a detecção de ligações particulares que estão presentes em níveis inferiores a 10%, inferiores a 5%, inferiores a 4%, inferiores a 3%. inferiores a 2%, inferiores a 1,5 %, inferiores a 1%, inferiores a 0,75%, inferiores a 0,5%, inferiores a 0,25%, inferiores a 0,1%, inferiores a 0,075%, inferiores a 0,05%, inferiores a 0,025% ou inferiores a 0.,01% em uma população de N- gli canos.

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos possibilitam a detecção de níveis relativos de espécies individuais de A-glicanos em uma população de Anglicanos. Por exemplo, a área sob cada pico de uma cromatografia líquida pode ser medida e expressa como uma percentagem do total. Esta analise proporciona uma quantidade percentual relativa de cada espécie de Anglicano em uma população de Anglicanos.

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem ser usados para analisar o padrão de glicosilação das glicoproteínas que são usadas como agentes terapêuticos (por exemplo, interferons, fatores estimulantes de colônia, fatores de coagulaçao do sangue, etc,). Cerno serã entendido pelos especialistas na técnica, os padrões de glicosilação destes agentes terapêuticos de glicoproteína podem potencialmente afetar as suas propriedades terapêuticas. Assim sendo, é importante caracterizar de forma precisa cs padrão de glicosilação de uma glicoproteína expressa de interesse. Em certas modalidades, os métodos de acordo com a revelação são úteis na caracterização precisa do padrão de glicosilação destas glicoproteínas terapêuticas.

Em certas modalidades, uma glicoproteína terapêutica de interesse ê produzida em uma célula e é segregada da célula depois da produção. Os métodos de acordo com a revelação podem ser usados para prever o padrão de glicosilação destas glicoproteínas terapêuticas segregadas.

Em algumas modalidades, os métodos de acorde com a revelação podem ser usados para monitorizar o padrão de glicosílação de glicoproteínas durante o transcurso da sua produção por células. Por exemplo, a produção de uma glicoproteína (por exemplo, a produção comercial) pode envolver etapas de (1) cultivar as células que produzem a glicoproteína, (2) obter amostras a intervalos regulares ou irregulares durante todo o processo de cultura das células e (3) analisar o padrão de glicosilação das glicoproteínas produzidas em cada amostra obtida. Em algumas modalidades, estes métodos podem ainda compreender uma etapa de comparar os padrões de glicosilação das glicoproteínas produzidas em cada amostra obtida uns aos outros. Em algumas modalidades, estes métodos podem ainda compreender uma etapa de comparar os padrões de glicosilação das glicoproteínas produzidas em cada, amostra obtida ao padrão de glicosilação de uma amostra de referência.

Em certas modalidades, uma. glicoproteína terapêutica de interesse é uma glicoproteína. disponível comerei alimente (por exemplo, anti corpos, polipeptídeos, inter1eucinas, análogos de receptores, antagonistas de receptores, etc., e/ou suas porções características que são usadas para tratar uma doença, estado patológico ou transtorno). Os métodos de acordo com a revelação podem ser usados para determinar os padrões de glicosilação destas glicoproteínas disponíveis comercialmente.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: Estruturas exemplificativas de A-glicano.

Figura 2: Uma mistura de Anglicanos marcados com 2AB foi submetida a tratamento com as encimas sialidase, galactosidase, hexosaminidase e fucosidase, As amostras foram aplicadas a uma coluna de amida. e aluídas por cromatografia de fase normal. (A) Mistura de fV-glicanos separada na coluna de amida. (B) IV-glicanos depois de tratamento gradativo com enzimas. Conforme apresentado no cromatograma, os glicanos estendidos por lactosamina não são totalmente clivados em M3N2 por este tratamento. A identidade dos picos foi confirmada por espectrometria de massas por dessorção e ionixação a laser assistida por matriz (MALDI-MS).

Figura 3 c Cromatograma de uma mistura de N~glicanos a seguir a uma digestão exaustiva da mistura com um tratamento simultâneo com as enzimas sialidase, galactosidase, hexosaminidase e fucosidase. As amostras foram aplicadas a uma coluna de amida e eluídas por cromatografia de fase normal. inserção: close-up do cromatograma de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 minutos, em escala aumentada para visualizar menos picos.

.Figura 4: População de ÍZ-glicanos exemplificativa que e seqüencialmente digerida com sialidase, galactosidase, hexosaminidase e fucosidase de ampla especificidade (tratamento RxO5~C). ê ilustrada a população de vários produtos de digestão.

.Figura 5; Comparação dos produtos de digestão obtidos depois da digestão sequencial (esquerda) e simultânea (direita) de uma população de glicanos (representada pelos dois glicanos ilustrados na parte superior) o-2/3,6,8,9 sialidase, β~1/3,4,6-galactosídase e β-l,4-hexosaminidase.

A digestão simultânea produz o mesmo produto de reação (o núcleo de manose) para ambos os glicanos da população de glicanos. A digestão seqüencíâl produz dois produtos de digestão diferentes. Este exemplo, demonstra como a. digestão sequencial pode revelar informações que não seriam obtidas de uma digestão simultânea.

Figura 6; Fucosilação (representada por um triângulo) de glcNAo (quadrados) evita que a hexosaminidase seja capaz de clivar um terminal glcNAc. Estão aqui apresentadas duas espécies de glicanos, uma com uma glcNAc fucosilada antenãria (direita) e uma sem (esquerda) < Depois da digestão com sial.ida.se, galactosídase e hexosaminidase, a espécie da esquerda e clivada até o seu núcleo de manose.

Em contraste, a glcNAc fucosilada é incapaz de ser clivada por um tratamento idêntico com exoglicosidase.

Figura 7: Tratamento simultâneo e sequencial com exoglicosidase para revelar estruturas híbridas e de polilactosamina. As misturas de glicano foram tratadas com exoglicosidases e marcadas. Comparação de estruturas de glicanos que permanecem na divagem simultânea va. sequencial é ilustrada por HPLC (.A) . As preparações de glicano eram. simultaneamente ou sequencialmente com sialidase, galactosídase (painel superior), sialidase,

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ga.1 actosidase e hexosaminidase	(painel	do	meio)	ou
sialidase, galactosidase, hexos	saminidase	e	fucosií	âase
(painel inferior) . Compaiação das	estruturas	de	glicano	que

permanecem na divagem simultânea vs. seqüencial para reação de sialidase, galactosidase, hexosaminidase e fucosidase é ilustrada por espectrometria de massa (MS) (B) . As estruturas de polilactosamina que permanecera a seguir a divagem seqüencial são marcadas tanto na HPLC como na MS correspondente.

Figura 8: Identificação rápida de glicanos que compreendem polilactosamina via comparação direta de cromatogramas resultantes de tratamentos enzimáticos sequenciais e simultâneos da mesma amostra de glicano. Sialidase, galactosidase, hexosaminidase e fucosidase foram usadas para as reações enzimáticas. Os tratamentos seqüenciais e simultâneos estão indicados com setas.

Figura 5: Identificação rápida de glicanos que compreendem polilactosamina via comparação direta dos espectros MALDI-MS resultantes de tratamentos enz-imãtícos (painel superior) e simultâneos (painel inferior) da mesma amostra de glicano. Sialidase,· galactosidase, .hexosaminidase e fucosidase foram usadas para reações enzimatinas.

Definições

Aproximadamente, Cerca áe, Ca. : Tal como aqui usados, os termos aproximadamente, cerca de ou ca., aplicados a um ou mais valores de interesse, se referem a um valor que é similar a um valor de referência declarado. Em certas modalidades, os termos aproximadamente, cerca de ou ca., se referem a uma faixa de valores que se enquadra em

25%,. 20%., 19%, 18%·, 17%, 16%, 15%,. 14%, η ο ' V> %· 3 Π $<ι. Ο << _ζ .1- «ώ ο < X X V _f X W q / %, 8 % ι 7 %, 6 %,. 5 %,. 4 %,

3%, 2%,. 1%, ou menos do valor de eferência declarado.

Amostra biológica: 0 termo amostra biológica, tal como aqui usado se refere a qualquer amostra sólida ou fluida obtida, excretada ou secretada por qualquer célula ou organismo vivo, incluindo,, mas não limitada a cultura de tecido, amostra de biorreator, tecido humano ou animal, plantas, frutas, legumes, microorganismos unicelulares (tais como bactérias e leveduras) e organismos multicelulares. Por exemplo, uma amostra biológica pode ser um fluido biológico obtido, por exemplo, do sangue, plasma, soro,, urina, biles, fluido seminal, fluido cerebroespinhal, humor aquoso ou vítreo ou qualquer secreção corporal, um transudato, um exsudato (por exemplo, fluido obtido de um abscesso ou qualquer outro local de infecção ou inflamação) , ou fluido obtido de uma articulação (por exemplo, uma articulação normal ou uma articulação afetada por doença tal como uma artrite reumatóide, osteoartrite, gota ou artrite séptica). Uma amostra biológica também pode ser,, por exemplo, uma amostra obtida de qualquer órgão ou tecido (incluindo um espécime de biópsia ou autópsia), pode compreender células (sejam células primárias ou células cultivadas), meio condicionado por qualquer célula, tecido ou órgão, cultura de tecido.

G1 i cop.ro teí.na de superfície celular: Tal como aqui usado, o termo glicoproteína de superfície celular se refere a uma glicoproteína, da qual pelo menos uma porção está presente na superfície exterior de uma célula. Em algumas modalidades, uma glicoproteína de superfície

1.2/83 celular é uma proteína que está posicionada sobre a superfície de uma célula de tal modo que pelo menos uma das estruturas de glieano está presente sobre a superfície exterior da célula.

Glieano de superfície celular: Um glieano de superfície celular é um glieano que esta presente sobre a superfície exterior de uma. célula. Em muitas modalidades da presente revelação, um glieano de superfície celular está covalentemente ligado a um pclipeptídeo como parte de uma glicoproteína de superfície celular. Um glieano de superfície celular também pode estar ligado a um lipídeo de membrana celular.

Glieano: Como ê conhecido na técnica e aqui usado os glicanos são açúcares. Os glicanos podem ser monômeros ou polímeros de resíduos de açúcar, mas tipicamente contêm pelo menos três açúcares, e podem ser lineares ou ramificados. Um glieano pode incluir resíduos de açúcar natural (por exemplo, glicose, N-acetilglucosamina, ácido N~acetil neuramínico, galactose, manose, fucose, hexose, arabinose, ribose, xilose, etc.) e/ou açúcares modificados (por exemplo, 2 ‘ -£lucrorribose, 2'-desoxirribose, fosfomanose, 6'sulfo N-acetilglucosamina, etc.). O termo glieano inclui homo e heteropolímeros de resíduos de açúcar. O termo glieano também abrange um componente de glieano de um glicoconjugado (por exemplo, uma glicoproteína, glicolipido, proteoglicano, etc) . O termo também abrange glicanos livres, incluindo glicanos que foram clivados ou então libertados de um glicoconjugado.

Preparação de glieano; 0 termo preparação de glieano tal com aqui usades se refere a um conjunto de glicanos obtidos de acordo com um método de produção particular. Em algumas modalidades, a preparação de gl.ica.no se refere a um conjunto de gli canos obtidas de urna preparação de glicoproteínas (ver definição de preparação 5 de glicoproteína adiante).

Glicoconjugado; 0 termo glicoconjugado, tal com aqui usado, abrange todas as moléculas em que pelo menos uma unidade de açúcar estã covalentemente ligada a pelo menos uma outra unidade. 0 termo especificamente abrange 10 todas as biomoléculas com unidades de açúcar covalentemente ligadas, incluindo, por exemplo, as glicoproteínas Ν'ligadas, glicoproteínas 0-ligadas, glícolípídeos, proteoglioanos₍ etc.

Glicoxorma: O termo glicoforma é aqui usado para se 15 referir a uma forma particular de um glicoconjugado. Isto ê, quando a mesma unidade de estrutura de base (por exemplo, polipeptídeo, lipídeo, etc.) que ê parte de um glicoconjugado tem o potencial de ser ligada a glicanos ou conjuntos de glicanos diferentes, então cada versão 20 diferente do glicoconjugado (isto é_; onde a estrutura de base está ligada a um conjunto particular de glicanos) é referida como glicoforma.

dliuollpideot O termo glicol ipídeo tal com aqui usado se refere a um lipídeo que contém uma ou mais 25 unidades de açúcar covalentemente ligadas (isto é, glicanos). A(s) unidade(s) de açúcar podem ser na forma de monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos e/ou polissacarídeos. A(s) unidade(s) de açúcar podem compreender uma única cadeia não ramificada de resíduos de 30 açúcar ou pode ser compreendida de uma ou mais cadeias

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Χ3S)1f .1 CadaS · Em CeXtaS moda J. IdadCS _t aS UniSadOS Cte aÇUCar podem incluir grupos sulfato e/ou fosfato. Em certas modalidades., as glicoproteínas contêm unidades de açúcar Oligadas; em certas modalidades, as glicoproteínas contêm unidades de açúcar JV-ligadas.

Glicoproteina; Tal com aqui usado, o termo glicoproteína'’ se refere a uma proteína que contém «ma estrutura de base de peptídeo covalentemente ligada a uma ou mais unidades de açúcar (isto é, glicanos). Como é entendido pelos especialistas na técnica a estrutura de base do peptídeo tipicamente compreende uma cadeia linear de resíduos de aminoácidos. Em certas modalidades, a estrutura de base de peptídeo se estende pela membrana celular, de tal modo que compreende ama porção transmembrana e uma porção extracelular. Em certas modalidades, uma estrutura de base do peptídeo de uma glicoproteína que se estende pela membrana celular compreende uma porção intracelular,. uma porção transmembrana e uma porção extracelular. Em certas modalidades, os métodos da presente revelação compreendam clivar uma glicoproteína de superfície celular com uma protease para libertar a porção extracelular da glicoproteína, ou uma porção da mesma, onde esta exposição não rompe substancialmente a membrana celular. A(s) unidade(s) de açúcar podem ser na forma de monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos, e/ou polissacarídeos. A(s) unidade(s) de açúcar podem compreender uma única cadeia não ramificada de resíduos de açúcar ou podem compreender uma ou mais cadeias ramificadas. Em certas modalidades, as unidades de açúcar podem incluir grupos sulfato e/ou fosfata. Alternativamente eu adicionalmente, as unidades de açúcar podem incluir acetila, glicolila, propila ou outras modificação alquila. Em certas modalidades, as glioop.ro te í.nas contêm unidades de açúcar O-ligadas; em certas modalidades, as glicoprotelnas contêm unidades de açúcar ligadas. Em certas modalidades, os métodos aqui revelados compreendem uma etapa de analisar algumas ou todas as glicoprotelnas de superfície celular, fragmentos libertados (por exemplo, glicopeptídeos)' de glicoprotelnas de superfície celular, glicanos de superfície celular ligados a glicoprotelnas de superfície celular, estruturas de base de peptídeos de glicoprotelnas de superfície celular, fragmentos destas glicoprotelnas, glicanos e/ou estruturas de base de peptídeos, e combinações destes.

Glicosidaset 0 termo glicosidase tal coso aqui visado se refere a um agente que cliva uma ligação covalente entre açúcares sequenciais em um glicano ou entre o açúcar e a unidade de estrutura de base (por exemplo, entre o açúcar e a estrutura de base peptídica da glicoproteína). Em algumas modalidades, a giicosida.se é uma enzima. Em certas modalidades, uma glicosida.se é uma proteína (por exemplo, uma enzima proteína) compreendendo uma ou mais cadeias de polipeptídeos. Em certas modalidades, uma glicosidase é um agente de divagem químico.

Padrão de glicosiiação: Tal como aqui usado, o termo padrão de glicosilação se refere ao conjunto de estruturas de glicano presente em uma amostra particular. Por exemplo, um glicoconjugado particular (por exemplo, glicoproteína) ou conjunto de glicoconjugados (por exemplo, conjunto de glicoprotelnas} terão um padrão de

15/83 glicosilação. Em algumas modalidades, é feita referência ao padrão de gliccsílação de glicanos de supex*fície celular. Um padrão de glicosilação pode ser caracterizado, por exemplo, pelas- identidades dos glicanos, quantidades 5 (absoluta ou relativa) dos glicanos individuais ou glicanos de tipos particulares, grau de ocupação dos sítios de glicosilação, etc., ou combinações destes parâmetros.

Preparação de glicoproterna: Uma preparação de glicoproteína, tal como este termo é aqui usado, se refere 0 a um conjunto de moléculas de glicoproteínas individuais, cada uma das quais compreende um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos particular (cuja sequência de aminoácidos inclui pelo menos um sítio de glicosilação) e pelo menos um glicano covalentemente ligado ac pelo menos 5 um sítio de glicosilação. As moléculas individuais de uma glicoproteína particular em uma preparação de glicoproteína, tipicamente, têm sequências de aminoácidos idênticas mas podem diferir na ocupação do pelo menos um sítio de glicosilação e/ou na identidade dos glicanos 0 ligados ao pelo menos um. sítio de glicosilação. Isto é, uma preparação de glicoproteínas pode conter apenas urna única glicoforma de uma glicoproteína particular, mas mais tipicamente- contém uma pluralidade de glicoformas. Preparações diferentes da mesma glicoproteína podem diferir 5 -na identidade das glicoformas presentes (por exemplo, uma glicoforma que está presente em uma preparação pode estar ausente da outra) e/ou nas quantidades relativas de glicoformas diferentes.

N-giicano: 0 termo fí-glicano, tal como aqui usado, 0 se refere a. um polímero de açúcares que foi libertado de um

17/83 glicaconjugado mas estava anteriormente ligado ao gXicoconjugado por meio de uma ligação da nitrogênio (ver definição de glicano XZ-Xigado adiante) .

Glicanos li gados: Qs glicanos Ν'-ligados são glicanos que estão ligados a um glicoconjugado por meio de uma ligação de nitrogênio. Existe um variado so.rt.ime.nto de glicanos N-ligados, mas é tipicamente com base no pentassacarídeo de núcleo comum (Man) ₃ (GlcNAc) (GloNAc) .

O-glloano: 0 termo O-glícano, tal como aqui usado, se refere a um polímero de açúcares que foi libertado de um gXicoconjugado que estava anteriormente ligado ao gXicoconjugado por meio de uma ligação de oxigênio (ver definição de glicano O-ligado adiante) .

Glicanos 0~ligadosc Os glicanos 0~ligados são glicanos que estão ligados a um gXicoconjugado por meio de uma ligação de oxigênio. Os glicanos O~ligados são tipicamente ligados a glicoproteínas por meio de N-acetilo-galactosamína (GalNAc) ou por meio de N~acetil~nglucosamine (GlcNAc) ao grupo hidroxila de t-serina (Ser) ou r-treonina (Thr). Alguns glicanos O-ligados também têm modificações tais como acetilação e sulfataçao. Em alguns casos, os glicanos 0-ligados são ligados a glicoproteínas por meio de frutose ou manose ao grupo hidroxila de tserina (Ser) ou r-treonina (Thr).

Fosforilação: Tal como aqui usado, o termo fosforilação se refere ao processo de adicionar covalentemente um ou mais grupos fosfato a uma molécula (por exemplo, a um glicano).

Proteaser O termo protease tal como aqui usado, se refere a um agente que oliva uma ligação de peptídeo entre

18/83 aminoãcidos seqüenoiais en uma -cadeia de polipeptídeos. Em algumas modalidades, uma protease é uma enzima (isto é, uma enzima proteolitica). Em certas modalidades, uma protease é uma proteína (por exemplo, uma enzima proteína) que 5 compreende uma. ou mais cadeias de polipeptídeos. Em certas modalidades, uma protease é um agente de divagem químico.

Proteína: De um medo geral, uma proteína” é um polipeptídeo (isto é, uma série de pelo menos dois aminoácídos ligados um ao outro por ligações peptídicas).

Proteínas podem incluir unidades que não sejam aminoácidos (por exemplo, podem ser glicoproteínas) e/ou, então, podem ser processadas ou modificadas. Os especialistas na técnica entenderão que uma proteína pode ser uma cadeia completa de polipeptídeos conforme produzida por uma célula (com. ou 15 sem uma sequência sinal), ou pode ser uma porção funcional da mesma. Os especialistas na técnica entenderão também que uma proteína, algumas vezes, pode incluir mais de uma cadeia de polipeptídeos, por exemplo, ligada por uma ou mais ligações dissulfureto ou associada por- outros meios.

Ácido siálico: O termo ácido siálico, tal como aqui usado, é um termo genérico para os derivados ou 0substituídcs do ácido neuramínico, um monossacarídeo de nove carbonos. O grupo amino do ácido neuramínico, tipicamente, tem um grupo acetila ou glícolila em um ácido siâXico. Os substituintes hidroxila presentes no ácido siálico podem ser modificados por acetilação, metilação, sulfatação e fosforilação. O ácido siálico predominante é o ácido N-acetilneuramínico (NeuSAc). Os ácidos siálicos conferem uma carga negativa aos glicanos, porque o grupo 30 carboxila tende a dissociar um próton ao p'H fisiológico.

19/83 desprotonados exemplificativos são como a

Ácido AT-acetilneuramínico úVeuSAc) Ácido newramínico uVeuJ

Subsfancíalmentc: Tal como aqui usado, o termo 10 substancialmente se refere à condição qualitativa de exibir uma. extensão ou grau total ou quase total de uma característica· ou propriedade de interesse. Um especialista na técnica biológica entenderá que os fenômenos biológicos e químicos raramente ou nunca chegam ao término e/ou 15 prosseguem até a conclusão ou atingem ou evitam um resultado absoluto, o termo substancialment-e” é, portanto, aqui usado para captar a potencial falta de conclusão inerente em muitos fenômenos biológicos e químicos. Para dar apenas um exemplo particular, quando se diz que um 20 tratamento substancialmente não rompe as membranas celulares, pretende-se indicar que toda ou a maior parte das membranas celulares permanecem intactas durante e depois do tratamento, por exemplo, de modo que eis glicoproteínas ou os glicopeptídeos intracelulares deste 25 modo, não são libertadas das células. Em certas modalidades, o termo substancialmente· conforme aplicado a membranas celulares não rompidas, se refere a condições onde 15%, .10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos das células submetidas a um tratamento particular exibem 30 membranas celulares rompidas mensuráveis. Em certas

20/83 modalidades, o termo -substancialmente conforme aplicado a membranas celulares não rompidas, refere-se ã condição em que nenhuma das células sujeitas a um tratamento particular exibe membranas de oálulas rompidas mensuráveis.

Descrição Detalhada de Certas Modalidades

A presente revelação proporciona métodos para analisar as composições de glicanos A-ligados. De acordo com a presente revelação, cs métodos aqui descritos podem ser usados para analisar uma mistura de A-glicanos, e para medir os níveis relativos nesta mistura de grupos estruturais específicos e modificações pouco comuns (por exemplo, fucose de núcleo ou antenária, extensões de laetosamina, glicanos com alto teor de manose ou híbridos, sulfatação, fosforilação, etc.)» Por exemplo, a Figura 6 demonstra como a fucosilação antenária evita a digestão de glcNAc por hexosaminidase» Em muitas modalidades, a presente revelação proporciona métodos que envolvem etapas para obter uma preparação de M-glicanos; digerir glicanos A-ligados com enzimas exoglicosidase para especificamente clivar monossacarídeos das extremidades não redatoras; e analisar cs produtos da divagem.

Glicanos A-Digados

De um modo geral, um glicano se refere a. uma unidade de hidrato de carbono que, em algumas modalidades, está covalentemente ligada a uma glicoproteína. As unidades de hidrato de carbono (por exemplo, cadeias de oligossacarídeos) são ligadas a glicoproteína^ no retículo endopl asmatico e no aparelho de Golgi por meio de coligações ou A-ligações. Tipicamente, as cadeias de oligossacarídeos lí-ligadas são adicionadas a. glicoproteínas do lúmen do retículo endoplasmático (ver Alberts et al.. , Molecular Sialcgy of the Cell, 1594, aqui dado com incorporado per citação). As unidades de hidrato de carbono são adicionadas ao grupo amino na cadeia lateral de um resíduo de asparagina contido na sequência de consenso alvo de Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina, A cadeia de oligossacarídeo inicial é, em geral, aparada por enzimas glicosidase específicas no retículo endoplasmátioo, resultando em um oligossacarídeo curto, de núcleo ramificado composto de dois resíduos de 17acetilglucosamina e três de manose,

Os Anglicanos pedem ser subdivididos em três grupos distintos chamados tipo com alto teor de manose, ^tttipo híbrido e tipo complexo com um núcleo de pentassacarídeos comum (ManpCal,6)-(Manp(al, 3))~Manp(pl,4)GlcpNAo (j31,4)GlcpNAe (βΐ, N)-Asn) que ocorre em todos os três grupos. Modificações no núcleo incluem, por exemplo, glicosilação adicional, proporcionando uma bissecção do GlcNAc, ligação de um resíduo fucosil no GlcNAc mais interno e capeamento com resíduos de ãcido siálico (Neu). N-g li canos exemplif icativos estão representados na Figura 2. Como se pode observar, a variação estrutural dos Anglicanos ocorre na maioria das vezes em relação a (até) 4 antenas do lado esquerdo dos A’-glicanos representados na Figura 1. Os gli.ca.nos .<¥-ligados são geralmente encontrados como componentes de peptídeos (isto é, um glicopeptídeo) e proteínas (isto é, uma glicoproteína).

Depois do processamento inicial no retículo endoplasmático, as glicoproteínas são, então, transportadas para o Golgi onde pode ter lugar um processamento

22/ 83 adicional. As cadeias de oligossacarídeos N~ligadas aparadas podem ser modificadas pela adição de vários resíduos de inanose, resultando em um ol.igossacarídeo com alto teor de manose . Alternativamente ou adiaionalmente, uma ou mais unidades de monossacarídeos de N~ acetilglucosamina podem ser adicionadas às subunidades de manose do núcleo para formar oligossacarídeos complexos. Pode-se adicionar galactose à subunidades de 27acetilglucosamina e subunidades de ácido siálico podem ser adicionadas as subunidades de galactose, resultando em cadeias que terminam com qualquer um de ácido siálíco, uma galactose ou um resíduo de N-acetilglucosamina. Um resíduo de fucose pode ser adicionado ε< um resíduo de 27acetilglucosamina do oligossacarídeo do núcleo. Cada uma destas adições é catalisada por glicosil transferases específicas.

OS	glicanos 27-ligados	estão envolvidos em	uma
variedade	de processos celulares. Por exemplo, os	27-
glicanos	contribuem para o	dobramento apropriado	de
proteína <	sm células eucariotas.	As proteínas chaperenas	:· no
retículo	endoplasmático (por	exemplo, calnexina	e

calreticulina) se ligam aos três resíduos de glicose presentes no núcleo 27-glicano. Tipicamente, as proteínas chaperonas auxiliam no dobramento da proteína à qual o glicano está ligado. Depois da dobragem apropriada, os três resíduos de glicose são removidos e o glicano pode prosseguir para reações de processamento adicionais. Se a proteína não dobra de forma apropriada, os três resíduos de glicose são religados, permitindo que a proteína se reassocie as chaperonas. Este ciclo pode se repetir várias

23/83 vezes até que uma proteína atinja a sua conformação apropriada. Se uma proteína repetidamente não consegue, dobrar de forma apropriada, a mesma, é geralmente excretada do retículo endoplasmático e degradada por protea.se s 5 ci top1asmá t i cas.

Alternativamente ou adicionalmente, os K~glicanos contribuem para o dobramento- da proteína por efeitos estéricos. Por exemplo, resíduos de. cisteína em um peptideo podem ser temporariamente bloqueados para não formar 10 ligações dissulfvreto com outros resíduos de cisteína, devido ao tamanho de um glicano próximo. A presença de um glicano Ν'-ligado, portanto, pode permitir que uma célula controle quais os resíduos de cisteína formarão ligações dissu.lfu.reto.

M-glicanos podem estar envolvidos em interações de célula-célula. Por exemplo, células tumorais frequentemente produzem estruturas de Ν'-glicano anormais, que podem ser r-eConhecidas pelo receptor CD337 em células extermínadoras naturais (natural kíllers) como um sinal de que a célula em 20 questão é cancerosa.

Os Ν'-glicanos podem estar envolvidos no direcionamento de enzimas lisossomais degradativas para o lisossoma. Em particular', a modificação de um Ν'-glicano com um resíduo de mancse-6-fosfato pode servir como um sinal de 25 que a proteína â qual este glicano está ligado deve ser dirigida para o lisossoma.

Deste modo, a presente revelação abrange o reconhecimento de que é importante determinar o padrão de glicosilação de N-glicanos (por exemplo, N-glicanos que são 30 conjugados a glícoproteínas). Os métodos aqui descritos

24/83 podem ser usados para analisar as características (por exemplo, composição e/ou estrutura) de qualquer N~glicano.

Preparações de Glicanos

Ά presente revelação proporciona métodos para analisar a estrutura e/ou composição de glicanos individuais em uma preparação de glicano. Uma preparação de glicano pode ser obtida por meio de qualquer método disponível na técnica. De um modo geral, a obtenção de uma preparação de N--glicano compreende as etapas de (1) obter uma preparação de glicoproteína; e (2) obter uma. preparação de N-glicanos a partir da preparação de glicoproteína. Em algumas modalidades, a- obtenção de uma preparação de .Ν'glicano opcionalmente compreende uma etapa de marcar a preparação de N-glicano com um marcador detectável.

Preparações de Glicoproteínas

Uma preparação de glicoproteína pode ser obtida a partir de qualquer .fonte incluindo, mas não limitada a formulações terapêuticas {por exemplo, eritropoietina, insulina, hormônio do crescimento humano, etc.), produtos 20 biológicos comerciais (por exemplo, aqueles apresentados na

Tabela 3) e amostras biológicas. Tal como aqui usado, o termo amostra biológica se refere a qualquer amostra sólida ou fluida obtida, excretada ou secretada por qualquer célula ou organismo vivo, incluindo, mas não 25 limitada a cultura de tecido, tecido humano ou animal, p1antas, f rutas, legumes, microorganismos unicelulaxes (tais como bactérias e leveduras) e organismos multicelulares. Por exemplo, uma amostra biológica pode ser um fluido biológico obtido, por exemplo, do sangue, plasma, 30 soro, urina, biles, fluido seminal, fluido cerebroespinhal,

25/83 humor aquoso- ou vítreo ou qualquer secreção corporal, um transudato, um exsudato (por exemplo, fluído obtido da um abscesso o-u qualquer outro local de infecção ou inflamação), ou fluido obtido de uma articulação {por exemplo, uma articulação normal ou uma articulação afetada por doença tal como uma artrite reumatóide, osteoartrite, gota ou artrite séptica). Uma amostra biológica também pode ser, por exemplo, uma amostra obtida de qualquer órgão ou tecido (incluindo um espécime de biôpsia ou autópsia), pode compreender células (sejam células primárias ou células cultivadas), meio condicionado por qualquer célula, tecido ou órgão, cultura de tecido.

Uma preparação de glicoproteína pode ser recebida por qualquer máquina, pessoa ou entidade. Em algumas modalidades, uma preparação de glicoproteína pode ser recebida por uma máquina, que pode, então, realizar um ou mais testes, processos ou refinamentos da preparação de glicoproteína. Em algumas modalidades, uma preparação de glicoproteína pode ser recebida por uma pessoa. Em algumas modalidades, uma preparação de glicoproteína pode ser recebida por uma entidade externa. Em algumas modalidades, uma preparação de glicoproteína pode ser recebida por uma pessoa ou empresa que realiza serviços de caracterização para uma segunda pessoa ou empresa. Por exemplo, uma organização pode funcionar onde a mesma recebe de outras empresas ou laboratórios as preparações de glicoproteína a serem caracterizadas. Uma preparação de glicoproteína pode ser pré-processada de várias formas. Por exemplo, uma preparação de glicoproteína pode ser pré-processada para isolar uma ou mais glicoformas.

Em algumas modalidades-, uma preparação de ^-glicano é obtida proporcionando uma população de giicoproteínas e removendo os F-glicanos das giicoproteínas da população de giicoproteínas.

Em algumas modalidades, os /Aglicanos são removidos das giicoproteínas por digestão. De um modo geral., as glicanases a serem usadas de acordo com a presente revelação clívam entre os resíduos GleNAc-Asn, GlcNAc-GlcNAc ou Man-GlcNAc do núcleo. Enzimas exemplifícativas que podem ser usadas para remover N-glicanos de giicoproteínas incluem, mas não se limitam a ^-glícanoase F e/ou íí-glicanoase-A, O-glicanoase e/ou Endo H,

Em algumas modalidades, os íZ-glicanos são removidos das giicoproteínas por divagem química. Para dar apenas alguns exemplo, pode-se usar hidrasína, boro-hidreto de sódio, e/ou ácido trif luorometanossulfônico (T.FMS) para remover os glicanos de uma glicoproteína.

Marcação de xV~Glicanos

Em algumas modalidades, os K···glicanos (por exemplo, iA glicanos que foram removidos de uma. população de giicoproteínas) podem ser associados a. um ou mais marcadores detectãveis. Os marcadores detectãveis estão tipicamente associados oom as extremidades redutoras dos Nglicanos. Em algumas modalidades, os marcadores detectáveis são unidades fluorescentes. Os fluoróforos exemplificar!vos que podem ser usados de acordo com a presente revelação incluem, mas não se limitam ao ãcido 2-aminobenzóico (2AA) , 2-aminobenzamida (2AB) , e/ou 2-aminopurina (2AP) . De um modo geral, os fluoróforos para uso de acordo com a presente revelação são caracterizados por terem reatividade com a extremidade redutora de uma oligossaoarídeo e/ou monossacarídeo em condições que não danificam e/ou destroem o glieano. Em algumas modalidades, as unidades 5 fluorescentes são ligadas diretamente às extremidades redutoras. Por exemplo, a ligação direta pode ser conseguida pela conjugação direta por aminação redutiva. Em algumas modalidades, as unidades fluorescentes são ligadas indiretamente às extremidades redutoras. Por exemplo, a 10 ligação indireta pode ser conseguida por um braço de ligaçao reativa.

Em algumas modalidades, os marcadores detectáreis compreendem unidades radioativas ou moléculas marcadas isotopicamente. Unidades radioativas exemplificativas que 15 podem ser usadas de acordo com a presente revelação incluem, mas não se limitam a trítio , deutério e/ou ^ssS. Tipicamente, estas unidades são ligadas diretamente ou, então associadas ao fluorôforo. Para dar apenas um exemplo de um fluorôforo radioativo, a 2AP pode 20 ser modificada de tal modo que todos cs hidrogênios são deuterados.

Digestão de Glicanos A^T~Ligados

A presente revelação proporciona métodos melhoradas para determinar os padrões de glicasilação das glicoproteinas. Estes métodos, em geral, envolvem submeter uma população de N-glicanos a uma ou mais exoglicosidases e analisar a estrutura e/ou composição dos produtos da digestão. Em algumas modalidades, as exoglicosidases usadas de acordo com a presente revelação reconhecem e clivam mais 30 de um tipo particular de ligação glicosídica. Em algumas

28/83 modalidades, as exoglicosidases usadas de acordo com a presente revelação reconhecem e clivam apenas ura tipo particular de ligação glicosídica.

Exoglí cosi dases

As exoglicosidases são enzimas que clívam ligações glicosfdicas terminais de extremidades não redatoras de glicanos. Tipicamente, as mesmas são altamente específicas a ligações de monossacarídeos e anomericidade particulares (α/β)< Em algumas modalidades, padrões de ramificação 10 próximos podem afetar a especificidade da exoglicosidase. o tratamento com exoglicosidase, de um modo geral, resulta em glicanos de ligações antenãrías padrão sendo clivados até o núcleo do pentassacarídeo (M3N2) contendo 3 resíduos de manose e 2 de glcNAc. No entanto, espécies modificadas de 15 forma pouco comum (por exemplo, espécies fucosiladas no núcleo ou antenárias, glicanos com alto teor de manose e híbridos, glicanos estendidos por lactosamina, glicanos sulfatados, glicanos fosforilados, etc.) são resistentes ao tratamento com exoglicosidase e podem sei* 20 cromatograficamente resolvidos e quantificados em relação ao pentassacarídeo M3N2.

As exoglicosidas.es exemplif icativas que podem ser usadas de acordo com a presente revelação incluem, mas não galactosidase., hexosaminidase.,

As exoglicosidases podem ser incluindo fontes comerciais (por exemplo, da QA~Bio, ProZyme, Roche, Sigma, NEB, EMD, Glyko, etc.). Alternativamente ou adicionalmente, as exoglicosidases podem ser isoladas e/ou purificadas a se limitam a sialidase, fucosidase e manosidase obtidas de aualcfuer fonte

9/83 partir de uma fonte celular (por exemplo, bactérias, levedura, planta, etc.}.

Em algumas modalidades, as exoglicosidases (por exemplo, sialidases, galactosidases, hexosaminidases, fucosidases e manosidases) podem ser divididas em categoria múltiplas ou subconjuntos. Em algumas modalidades, os diferentes subconjuntos apresentam diferentes capacidades para clivar diferentes tipos de ligações. A Tabela 1 apresenta algumas exoglicosidases exemplif1cativas, suas 10 especificidades de ligação e c· organismo do qual cada uma é derivada. Um especialista na técnica entenderá que esta é uma lista exemplificativa e não abrangente de exoglicosidases, e que qualquer exoglicosidase que tem qualquer especificidade de ligação pode ser usada de acordo 15 com a presente revelação.

Tabela 1« Exoglií3CíS.ídases ( Classe de Γ j j | EC* Atividade Organismo [ enzima______í j «“Sialidase | 3.2.1.18 |õ<2/3,6,8 I Artòrobacter ] | (geralmente não ureafaciens

I I específico de | Vibrio choierae

		ligação) | Clostrídiim?
L
	a-2,3 (NeuAc de oligossacarídeos)	Salmonella typhimu.r.i nm S t rep t o coo c us pneuirjonia
		tt-2/3,6 (NeuAc de complexo)	Clostridíwn perfríngens
β-	3.2.1.23		Testículo

Galactosida.se		1/3,4,6 Gal Ligações β -1/4,6 Gal Ligação β ~1,4 Gal	bovino Espécie Xa π t h amena s Espécies <5 trep t o cocc us E, colf Feijão de porco 6’ t r ep t o cocc us pneumonia
I
Ligaçao β ~1,3 ~Gal linkage Li ga ç?ões β ~ 1 / 3,6- Ga. .1	.F. col i Espécie Xazi t h Gffiona s Espécie Xan tho.mo.na s .EL col i
β - Hexosaminidase	3,2.1.52 3,2.1.30	β -1/2,3,4,6 nexosaminas	5't.rep tococcus plúcatus .51 r ep t ococcus pneumonia Bacteroides Feijão de porco
a~Fucosidase	3.2.1.51	a-l-3,4-Fuo (em	.Xan tho.mo.na s

|3,2.1.111 geral estrutura Farinha de i de desglicosilato amêndoa j de Lewis) i a-1/2,3,4,6~Fuc Rim bovina i (geralmente em C.

í i ampla meníngosepticum í |especificidade)

* Ν^β EC se refere ao número de registro na Enzyme Commission

De acordo com a presente revelação, uma população de ar-glicanos pode ser digerida com qualquer. exoglicosidase. ou qualquer conjunto de exoglicosidases. Em geral, as reações de exoglicosidase têm lugar em condições. que são compatíveis com a atividade enzimãtica. Por exemplo, o pH, a temperatura, s componentes da solução de reação e a concentração (por exemplo, sal, detergente, etc.), e os períodos de tempo de reação podem ser otimizados a fim de atingir um nível desejado de atividade de exoglicosidase.

Em geral, as reações de exoglicosidase. têm lugar em condições neutras ou ácidas. Em algumas modalidades, as 15 reações de exoglicosidase têm lugar em condições que são substancialmente neutras. Em algumas modalidades, condições neutras se referem a um pH que varia entre aproximadamente 6 e aproximadamente 8. Em algumas modalidades, condições

32/83 neutras se referem, a um p.H de aproximadamente 7. Em algumas modalidades, condições neutras se referem a um pH de aproximadamente 6,5. Em algumas modalidades, condições neutras se referem a um pH de aproximadamente 7,5. Em 5 algumas modalidades, condições neutras se referem a um pH de aproximadamente 5. Em algumas modalidades, condições neutras se referem a um pH de aproximadamente 8.

Em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase têm lugar em. condições que são ácidas. Em algumas 1.0 modalidades, condições ãcidas se referem a um pH inferior a aproximadamente 7. .Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 1 e aproximadamente 7. Em algumas modalidade®, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 2 e 1.5 aproximadamente 7. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 3 e aproximadamente 7. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 4 e aproximadamente 7. Em algumas modalidades, condições ãcidas 20 se referem a um pH que varia entre aproximadamente 5 e aproximadamente 7. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente S e aproximadamente 7.

Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a ura pH que varia entre aproximadamente 2 e aproximadamente

6. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 3 e aproximadamente 6. Era algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 4 e aproximadamente 6. Em

33/83 algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 5 e aproximadamente 6.

Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 1 e aproximadamente 5 2. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 2 e aproximadamente 3. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH que varia entre aproximadamente 4 e aproximadamente 5.

Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente e,5. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 5. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 5,5. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 5. Em algumas 15 modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 4,5. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 4. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 3,5. Em algumas modalidades, condições 20 ácidas se referem a um pH da aproximadamente 3. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 2,5. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 2. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de 25 aproximadamente 1,5. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 1. Em algumas modalidades, condições ácidas se referem a um pH de aproximadamente 0,5.

Em certas modalidades, as reações de exoglicosida.se têm lugar a um pH que varia de aproximadamente 5 a

34/83 aproximadamente δ, Em certas modalidades, as reações de exoglicosidase têm lugar a um pH de aproximadamente 5,5. Em certas modalidades, as reações de exoglicosidase têm lugar a um pH que varia de aproximadamente 6 a aproximadamente 8.

Em geral, as reações de exoglicosidase têm lugar a temperaturas que variam entre aproximadamente 20 ^;;C a aproximadamente 45 'C, por exemplo, de aproximadamente 30 *C a aproximadamente 40 ^:!C. Em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase têm lugar a temperaturas que. variam entre aproximadamente 25 “C a aproximadamente 4 0 ’C. Em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase têm lugar a aproximadamente 20 “C, aproximadamente 25 '^:'C, aproximadamente 30*'C, aproximadamente 3S*C, aproximadamente 36 °C, aproximadamente 37 ’-C, aproximadamente 38 ^eC, aproximadamente 39 'C, aproximadamente 4 0*C, aproximadamente 42 ’C₍ ou aproximadamente 45 °C. Em certas modalidades, as reações de exoglicosidase têm lugar a temperaturas que variam entre aproximadamente 35 °C a aproximadamente 40 ^CC. Em certas modalidades, as reações de exoglicosidase têm lugar a temperaturas que variam entre aproximadamente 36 °C e aproximadamente 38 °C, Em certas modalidades, as reações de exoglicosidase têm lugar a temperaturas de aproximadamente 37 °C.

Em geral, as reações de exoglicosidase sao realizadas por períodos de tempo que variam entre aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 20 horas. Em algumas modalidades,

as reações de	exoglicosidase são realizadas	durante
apr ox imada mente	10 minutos,	aproximadamente 30	minutos,
aprox imadamen t e	1 hora,	aproximadamente 2	horas,
ap roximadamente	5 horas,	aproximadamente 10	horas,

5/83 aproximadamente 12 horas, aproximadamente- 15 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente '36 horas ou aproximadamente 48 horas. Em algumas modalidades, as 5 reações de exoglicosidase são realizadas de um dia para o outro.

Em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase são realizadas na presença de detergente, por exemplo, até

25% de detergente. Detergentes exemplif!cativos que podem ser usados nas reações de exoglicosidase de acordo com a revelação incluem, dodecil sulfato de sódio (SDS), lauril sulfato de sódio (SL»S) , ésteres de ácidos graxos de sorbitana (por exemplo, Tween, Span, Myr j, etc.),· ésteres de ácidos graxos de polietileno glicol (por exemplo, cremofor), Brij, Triton, nonil fenoxilpolietoxoletanol (NP~

40). Em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase são realizadas na presença de aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,5%, aproximadamente 1%, aproximadamente

5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25% ou mais de 25% de detergente. Em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase são realizadas na ausência de qualquer detergente.

Em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase são realizadas na presença de sal. Detergentes exemplificativos que podem ser usados nas reações de exoglicosidase de acordo com a revelação incluem, mas não se limitam a cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, acetato de sódio, bicarbonato de sódio, cloreto de magnésio, cloreto de manganês e/ou combinações destes.

36/83

Em algumas modalidades, as reações de exog.licosida.se são realizadas na presença de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM de sal. Por exemplo, em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase são realizadas na presença de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM,

aproximadamente	5	mM,	aproximadamente	10	mM,
aproximadamente	25	mM,	aproximadamente	50	mM,
aproximadamente	100	mM,	ap rox i ma damente	150	mM,
aproximadamente	200	mM,	aproximadamente	250	mM,
10 aproximadamente	3 00	mM,	aproximadamente	4 0 0	mM,
aprox.i ma dament e	OU mM,	aproximadamente 500 mM	de sal	. Em

algumas modalidades, as reações de exoglicosidase são realizadas na presença de aproximadamente 100 mM de sal. Em algumas modalidades, as reações de exoglicosidase são

1.5 realizadas na ausência de qualquer sal.

Em certas modalidades, os M-glicanos são digeridos submetendo uma população de N-glicanos a uma pluralidade de exoglicosidases, Por exemplo, uma população de N-glicanos pode ser submetida a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou mais 20 exoglicosidases. Em algumas modalidades, uma população de N-glicanos é digerida com duas ou mais exoglicosidases que estão todas presentes em quantidades substancialmente iguais. Em algumas modalidades, uma população de N-glicanos é digerida com duas ou mais exoglicosidases que não estão 25 todas presentes em quantidades substancialmente iguais.

Para dar apenas um exemplo, uma população de N-glicanos pode ser digerida com as exoglicosidases A, B, e C a uma proporção de 1:2:1. Em algumas modalidades,, exoglicosidases múltiplas' são administradas simultaneamente. Em algumas

37/83 modalidades, exoglicosidases múltiplas são administradas sequencialmente.

Digestão simultânea com Exoglicosidases Múltiplas

---CCÍ..^^^...^...........................»·.........................ΛΧ..............

Em algumas modalidades, a digestão simultânea com exoglicosidases múltiplas pode ser usada para analisar a estrutura e/ou função do glicano, Em alguns casos, a digestão simultânea pode ser realizada a fim de determinar a presença de tipos particulares de ligações e/ou modificações de glicano. Para dar apenas um exemplo, para a estrutura de glicano hipotética apresentada abaixo:

Prevê. - se que

ratamento simultâneo com galactosidase e hexosaminidase deixa apenas a antena que inicialmente continha os resíduos do ácido siálico terminal. Estes resíduos de ácido siálico podem, então, opcionalmente ser removidos e a mistura de glicanos resultante pode ser analisada por- HPLC, para revelar o perfil de espécies antenárias mono, di, trí e tetrasíalisadas que estavam presentes na mistura original. Exemplos de abordagens de digestão simultânea e análises destas abordagens estão descritos no Exemplo 2,

38/83

Urgesuao Seqnanc.i a... com Exog.i.i.cosn.cases Mult2.p.i.a.s

Como outro exemplo não limitativo., cs N-glicanos podem ser· digeridos submetendo uma população de Anglicanos a uma primeira exoglicosidase durante um primeiro período de tempo, depois do qual a população de ^-glicanos é submetida a uma segunda exoglicosidase durante um segundo período de tempo. Zmtes do tratamento com a segunda exoglicosidase, a primeira exoglicosidase pode opcionalmente ser removida e/ou inativada. A título de exemplo, a primeira exoglicosidase pode ser inativada incubando a exoglicosidase a. uma temperatura, durante um tempo suficiente para inativar a mesma. Adicionalmente ou alternativamente, a primeira exoglicosidase pode ser inativada por- incubação com um inibidor que é especifico à exoglicosidase (por exemplo, um anticorpo ou outra molécula que especificamente se liga, â primeira exoglicosidase e inibe a sua atividade catalítica). Outros métodos de inativar a primeira exoglicosidase serão conhecidos dos

especiali	stas na	técnica.	No caso onde	a primeira
20 exoglicos	idase e i	.nativada	por incubação da	mesma com	um
inibidor	específico, serã	entendido que a	presença	do
inibidor	não deve	substano	ialmente inibir a	atividade	da

segunda exoglicosidase. Em algumas modalidades, os métodos para inativar ou remover uma primeira exoglicosidase antes 25 da adição de uma segunda exoglicosidase incluem aquecer a mistura de reação, resfriar a mistura de reação, adicionar solventes orgânicos, adicionar proteases e/ou combinações destas. Em algumas modalidades, a primeira exoglicosidase é removida da reação antes da adição de uma segunda. 30 exoglicosidase, por exemplo, por cromatografia, cartuchos para extração em fase sólida, filtros de peso molecular, centrifugação, precipitação e/ou combinação destes. Um especialista na técnica entenderá que estes mesmos princípios se aplicam para a terceira, quarta, quinta, 5 sexta, etc., exoglicosidases.

Em algumas modalidades, a digestão sequencial com exoglicosidases múltiplas revela informações sobre a estrutura e/ou composição dos Ν'-glicanos que são diferentes das informações' reveladas pela digestão simultânea com o 10 mesmo conjunto de exoglicosidases>

Em algumas modalidades, a digestão sequencial com exoglicosidases múltiplas revela informações sobre a estrutura e/ou composição dos glicanos que são as mesmas informações reveladas pela digestão simultânea com o mesmo 15 conjunto de exoglicosidases.

Em algumas modalidades, variar a sequência em que as exoglicosidases múltiplas são administradas revela informações sobre a estrutura e/ou composição dos N~ glicanos. Para dar apenas um exemplo, submeter um Ν'-glicano 20 particular a (1) uma sialidase, (2) uma galactosídase, (3) uma hexosaminidase, (4) uma fucosidase e (5) uma manosidase, nesta ordem específica, pode produzir um conjunto de produtos de digestão que é diferente dos produtos de digestão obtidos submetendo o mesmo Ν'-glicano a 25 (1) uma hexosaminidase, (2) manosidase, (3) sialidase, (4) fucosidase e (5) uma sialidase, xxesta ordem. Realizar ambas as séries de digestões sequenciais, analisar os diferentes conjuntos de produtos de digestão obtidos por ambas as digestões sequências e comparar os diferentes conjuntos dos 30 produtos de digestão (por exemplo, em relação um ao outro e/ou em relação a uma amostra de referência} pode proporcionar informações a cerca da estrutura e/ou composição do N-glicanc que não seriam obtidas realizando apenas uma da série de digestões sequenciais e analisando 5 os produtos da digestão obtidos de apenas uma da série de digestões sequenciais. Exemplos de abordagens de digestão sequencial e análises destas abordagens estão descritos no Exemplo 3.

Em algumas modalidades, são escolhidas as enzimas 10 individuais que constituem um conjunto de enzimas a ser usada em digestões sequenciais e/ou simultâneas a fim de maximizar as informações que podem ser obtidas realizando digestões♦ Os tratamentos apresentados na Tabela 2 exemplificam a seleção de tratamentos ensimáticos para 15 identificar modificações de glicanos específicos em glicanos sializados.

Tabela 2. Tratamentos Ensímábicos Exemplificativos para identificar Modificações em Glicanos Giaiirados

| Exemplos de modificação	Exemplos de tratamentos
| no glicano a ser	enzimáticos aplicáveis para
identificado	identificação da modificação
	1 selecionada do glicano*
ίPo1ilactosam!na i x... .....................................................	Comparação entre reações sequenciais e simultâneas com sialidase, galactosidase, galactosidase, hexosaminidase sem sialidase e M-acetil- 1hexosaminidase.
! j Fucosilação antenária	{ Comparação entre tratamentos sequenciais e simultâneos com

	sialidase, ualactosidase. i - l I jhexosaminidase e fucosidase. 1 Comparação entre tratamentos (por | exemplo, seqüenoial e/ou [simultâneo) com a-1,3 fucosidase i e ft-1,δ(3 fucosidase. iComparação entre tratamentos (por iexemplo, sequencial e/ou [ simultâneo)com fucosidase seguido [ por galactosidase ou [ galactosidase, seguido por ί fucosidase | Comparação entre tratamentos {por j exemplo, sequencial e/ou jsimultâneo) com e sem fucosidase.
---------------------------- . . .». ... . ............ . . . . . . . . .....	.................................................................................
Glicano híbrido	Comparação entre reações seqüenciais e simultâneas com sialidase, galactosidase e N·· acetil-hexosamínídase, hexosaminidase e manosidase.
	.............................. .......
Glicanos sulfatados	Comparação entre reações sequenciais e simultâneas com j sialidase, galactosidase, |galactosidase, hexosaminidase sem [sialidase e N-acetil-
	j hexosamini das e.
Glicanos fosforilados	]Comparação entre tratamentos (por j iexemplo, sequencial e/ou j

imultânso) com e sem manosidase.

2/83

Ácido siá	lico ligado ao |Comparação entre reações
GlcNAc	sequenciais e simultâneas com |sialidase, galactosidase, ígalactosidase, hexosaminidase sem |sialidase e N-aeetil~
	i hexosaminidase.

Em algumas modalidades, os tratamentos enzimáticos para identificar as modificações em glicanos não sializados podem ser realizado» conforme descrito na Tabela 2, exceto 5 por a sealidase ser omitida, das reações exemplificadas na Tabela 2.

Análise da Estrutura do dl icano

Era geral, os métodos de acordo com a revelação compreendem submeter uma preparação de glicanos a um 10 tratamento cora exoglicosidase. Em algumas modalidades, assim que o tratamento com exoglicosidase foi realizado até o término, a estrutura e/ou identidade dos glicanos clivados é analisada. Em algumas modalidades, uma amostra pode ser removida da preparação de glicanos durante o 15 transcurso do tratamento com exoglicosidase. Em algumas modalidades, uma pluralidade de amostras, que são separadas no tempo (por exemplo, a intervalos regulares ou irregulares), pode ser removida da preparação de glicanos durante o transcurso do tratamento com exoglicosidase (por 20 exemplo, em qualquer momento antes do término do tratamento com exoglicosidase) . Em algumas modalidades, o tratamento com exoglicosidase compreende a administração de pelo menos uma exoglicosidase e a etapa de remoção compreende remover pelo menos uma amostra durante o transcurso da

3 / 8 3 administração de pelo menos uma exoglicosidase (por exemplo, depois da. exoglicosidase ter sido adicionada à preparação de glicanos, mas antes da exoglicosidase ter sido inativada. e/ou removida da preparação de glicanos). Em 5 algumas modalidades, o tratamento com exoglicosidase compreende a administração sequencial de pelo menos a primeira e a segunda exoglicosidases (por exemplo, primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima e/ou mais, exoglicosidases) e a etapa de remoção compreende

10 (i) remover	pelo	menos uma primeira amostra	depois da
adm i n i s t r a ç ão	da	primeira, exoglicosidase, mas	antes da
adm in i s t ração	da	segunda, exoglicosidase; e (i:	L) remover

pelo menos uma segunda amostra depois da administração da segunda exoglicosidase. Em algumas modalidades, a estrutura 15 -e/ou identidade dosglicanos clivados é analisada em pelo menos uma das amostras removidas. Em algumas modalidades, a etapa de analisar compreende comparar a estrutura e/ou função dos glicanos clivados em pelo menos uma ou mais das amostras removidas para a estrutura e/ou função de glicanos 20 clivados em pelo menos outra amostra removida. Em algumas modalidades, a etapa de analisar compreende comparar e estrutura e/ou função dos glicanos clivados em uma ou mais das amostras removidas à estrutura e/ou função dos glicanos clivados em uma amostra de referência.

A estrutura e composição dos N-glicanos podem ser analisadas por meio de qualquer método disponível. Em algumas modalidades, a estrutura e composição dc-s glicanos podem ser analisadas por métodos cromatogrãficos, métodos de espectrometria de massa (MS), métodos cromatogrãficos seguidos por MS, métodos electroforéticos,

44/S3 métodos electroforéticos seguidos por MS, métodos de ressonância magnética nuclear (NMR) e combinações destes.

Em algumas modalidades, a estrutura, e composição dos N-glicanos pode ser analisada por métodos cromatograficos, incluindo mas não limitado a cromatografia líquida (LC) , cromatografia líquida de alto desempenho ÍRPLC), cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC), cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia em coluna de amida e combinações destas.

Em algumas modalidades, a estrutura e composição dos N~glicanos podem ser analisadas por espectrometria de massa (MS) e métodos relacionados, incluindo mas não limitados a MS tandem, LC-MS, LC--MS/MS, espectrometria de massas por dessorção e ionisação a laser assistida por matriz (MALDI-MS) , espectrometria de massa com transformada de Fourier (FTMS), separação de mobilidade iônica com espectrometria. de massa (IMS-MS) ,. dissociação por transferência de elétrons (ETD-MS) e combinações destes.

Em algumas modalidades, a estrutura e composição dos N- glicanos podem ser analisadas por métodos eletroforéticos, incluindo mas não limitado a eletroforese capilar (CE), CE-MS, eletroforese em gel, eletroforese em gel de agarose, eletroforese em gel de acrilamida, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido por Western blotting usando anticorpos que reconhecem estruturas de glicano específicas e combinações destes<

Em algumas modalidades,, a estrutura e composição dos ?v~ glicanos podem ser analisadas por ressonância magnética nuclear (NMR) e métodos relacionados, incluindo mas não

45/83 limitado a NMR uni “dimensional (1D-NMR), NMR bi-dimensional (2D-NMR), correlação de espectroscopia magnêtica-NMR com rotação no ângulo (COSY-X4MR) ., correlação de espectroscopia magnética-NMR (TOCSY-NMR), nmr coerência heteronuclear 5 quântica simples (HSQC-NMR) , coerência heteronuclear quântica múltipla (HMQC-NMR) , espectroscopia de NMR rotacional de efeito de Overhauser ÍRQESY-NMR), espectroscopia nuclear de efeito de Overhauser (NOESY-HMR) e combinações destes.

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos permitem a detecção de espécies de Ν'-glicanos que estão presentes em baixos, níveis em uma população de N-glicanos. Por exemplo, os presentes métodos pei*mitem a detecção de espécies de N·· glicanos que estão presentes em níveis inferiores a 10%., inferiores a 5%, inferiores a 4%, inferiores a 3%, inferiores a 2%, inferiores a 1,5%, inferiores a 1%, inferiores a 0,75%, inferiores a 0,5%, inferiores a 0,25%, inferiores a 0,1%, inferiores a 0,075%, inferiores a 0,05%, inferiores a 0,025% ou inferiores a 20 0,01% em uma população de N-glicanos.

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos permitem a detecção de ligações particulares que estão presentes em níveis baixos em uma população de N-glicanos.

Por exemplo, os presentes métodos permitem a. detecção de ligações particulares que estão presentes em níveis inferiores a 10%, inferiores a 5%, inferiores a 4%, inferiores a 3%, inferiores a 2%, inferiores a 1,5%, inferiores a 1%, inferiores a 0,75%, inferiores a 0,5%, inferiores a 0,25%, inferiores a 0,1%, inferiores a 0,075%, δ / 8 3 inferiores a 0,05%, inferiores a 0,025% ou inferiores a 0,01% em uma população de N-glícanos.

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos permitem a detecção de níveis relativos de espécies 5 individuais de 27-glicano em uma população de 27-glicanos.

Por exemplo, a área sob cada pico de uma cromatografia líquida pode ser medida e expressa como uma percentagem do total. Esta análise proporciona uma quantidade percentual relativa de cada espécie de 27-glicano em uma população de 10 N- g 1 i c ano s .

Aplicações

A presente .revelação proporciona métodos para analisar a estrutura e/ou composição de qualquer glicano. Para dar apenas um exemplo, a presente revelação proporciona métodos para analisar o padrão de glicosilação de uma glicoproteína. A presente revelação abrange o reconhecimento de que determinar o padrão de glicosilação de uma glicoproteína tem muitas potenciais aplicações comerciais, industriais e/ou terapêuticas.

Os métodos de acordo com a revelação pedem ser aplicados a glicanos obtidos da uma ampla variedade de fontes incluindo, mas não limitadas a formulações farmacêuticas (por exemplo, eritropaietina, insulina, hormônio do crescimento humano, etc»), produtos biológicos comerciais (por* exemplo, aqueles apresentados na Tabela 3) e amostras biológicas. Uma amostra biológica pode ser submetida a uma ou mais análises e/ou etapas de purificação antes ou depois de serem analisadas de acordo com a presente revelação. Para dar apenas alguns exemplos, em algumas modalidades, uma amostra biológica e tratada com uma ou. mais proteases e/ou exoglicosidases (por exemplo, de modo que os glicanos possam ser libertados); em algumas modalidades, os glicanos em uma amostra biológica são marcados com um ou mais marcadores detectaveis ou outros agentes que podem facilitar a análise, por exemplo, espectrometria de massa ou NMR. Qualquer uma de uma variedade de etapas se separação e/ou isolamento pode ser aplicada a uma amostra biológica de acordo com a presente revelação.

Os métodos da presente revelação podem ser usados para analisar glicanos em qualquer uma de uma variedade de estados, incluindo, por exemplo, glicanos livres, glicoconjugados (por exemplo, glicopeptídeos, glicolipídeos, proteoglicanos, etc.), glicanos associados a células (por exemplo, glicanos associados a núcleo, citoplasma, membrana celular, glicanos, ato.}; glicanos associados a componentes celulares, extracelulares, intracelulares e/ou subcelulares (por exemplo, proteínas); glicanos em espaço extracelular (por exemplo, meio de cultura de células), etc.

Os métodos da presente revelação podem ser usados em uma ou mais etapas do desenvolvimento do processo para a produção de uma glicoproteína terapêutica ou outra glicoproteína comercial relevante de interesse. Exemplos não limitativos destas etapas de desenvolvimento do processo que podem empregar métodos da presente revelação incluem seleção de células, seleção clonal, otimização de meios, condições de cultura, condições do processo e/ou procedimento de purificação. Os especialistas na técnica

48/83 estarão conscientes de outras etapas da desenvolvimento do processo.

A presente revelação também pode ser usada para monitorizar a extensão e/ou o tipo de glicosilaçao que ocorre em uma cultura celular particular, permitindo, deste modo, o ajuste ou possivelmente a terminação da cultura a fim de, por exemplo, alcançar um padrão de glicosilaçao desejado particular ou para evitar o desenvolvimento de um padrão de glicosilaçao indesejado particular.

A presente revelação também pode ser utilizada para avaliar as características de glicosilaçao de células ou linhagens celulares que estão sendo consideradas para, produção de uma gliccproteina desejada particular (por exemplo, mesmo antes das células ou linhagens celulares terem sido geneticamente modificadas para produzir a glicoproteína ou para produzir a glicoproteína a um nível comercialmente relevante).

Por	exemplo, onde a	glicoproteína	alvo	é uma
glicop.ro teí	na terapêutica,	por exemplo,	tendo	sido
submetida a	revisão reguladora.	em um ou mais	países,	muitas

vezes serã desejável monitorizar culturas para avaliar a possibilidade de que as mesmas irão gerar um produto com um padrão de glicosilaçao o mais próximo possível do padrão de glicosilaçao estabelecido do produto farmacêutico, sendo ou não produzido por exatamente a mesma via. Tal como aqui usado, o termo próximo se refere a um padrão de glicosilaçao que tem uma correlação de pelo menos cercc-t de 75%, 80%, 85%, 90%, 85%,. 98%, ou .9.9% com o padrão de glicosilaçao estabelecido do produto farmacêutico. Jíestas modalidades, as amostras da cultura de produção são

49/83 tipicamente tomadas em pontas de tempo múltiplos, e são comparadas com um padrão estabelecido ou com uma cultura de controle a fim de avaliar a glicosilação relativa.

Por exemplo, em algumas modalidades, os -métodos para monitorizar a produção de uma glicoproteína compreendem as etapas de (i) durante a produção de uma glicoproteína, remover pelo menos a primeira e segunda amostras contendo glieano do sistema de produção; (ii) submeter cada uma da primeira e segunda amostras contendo glieano a um procedimento de exoglicosidase, a fim de especificamente clivar os monossacarideos das extremidades não redatoras de glicanos *V~ ligados nas amostras contendo glieano; e (iii) comparar os produtos da divagem obtidos da primeira amostra contendo glieano com aqueles obtidos da segunda

amostra contendo glieano d«	i modo que	são	determinadas
diferenças e portanto, o	progresso	da	produção da
glicoproteína é monitorizado.
Em algumas modalidades,	os métodos	para	monitorizar a

produção de uma glicoproteína envolvem remover pelo menos uma amostra contendo glieano em algum momento durante a reação de exoglicosidase (por exemplo, procedimento de exoglicosidase) . Em algumas modalidades, os métodos para monitorizar a produção de uma glicoproteína envolvem remover pelo menos uma amostra contendo glieano antes da 25 reação de exoglicosidase ter chegado ao término. Em algumas modalidades, os métodos para monitorizar a produção de uma glicoproteína envolvem remover pelo menos uma amostra contendo glieano assim que a reação de exoglicosidase tenha chegado ao término. Em algumas modalidades, pelo menos uma 30 amostra contendo glieano é removida quando o procedimento de exoglicosidase está cerca de 10%, cexOa de. 20%, cerca de

25%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50% completo, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 7 5%, cerca de 80%, cerca de 50%, cerca de 95%, cerca de 99%, quase 100%, substancialmente 100%, ou 100% completo. Em algumas modalidades, pelo menos uma amestra contendo glicano é removida quando o procedimento de exoglicosidase está quase 100% completo. Em algumas modalidades, pelo menos uma amostra contendo glicano ê removida quando o procedimento de exoglicosidase está 100% completo. Em algumas modalidades, pelo menos uma amostra contendo glicano é removida antes do procedimento de exoglicosidase estar 100% completo.

Em algumas modalidades, as amostras contendo glicano compreendem glicoconjugados (por exemplo, gliooproteínas). Em algumas modalidades, pelo menos uma amostra contendo glicano é removida antes de 100% dos glicoconjugados terem sido clivados. Em algumas modalidades, pelo menos uma amostra contendo glicano é removida quando 100% dos glicoconjugados foram clivados. Em algumas modalidades, pelo menos uma amostra contendo glicano é removida quando cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50% complete, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99%, quase 100%, substancialmente 100%, ou 100% dos conjugados foram clivados. Em algumas modalidades, pelo menos uma amostra contendo glicano é removida guando 100% dos glicoconjugados foram clivados. Em algumas modalidades, pelo menos uma amostra contendo glicano é removida antes de 100% dos conjugados terem sido clivados.

51/83

Em algumas modalidades, as amostras contendo glicano são removidas a intervalos regulares. Em algumas modalidades-, as amostras contendo glicano são removidas a intervalos de cerca de 3 0 segundos, cerca da 1 minuto,, cerca de 2 minutos, cerca de S minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 12 horas, ou cerca de 18 horas-, ou mesmo a intervalos maiores. Em algumas modalidades, as amostras contendo glicano são removidas a intervalos irregulares. Em algumas modalidades, as amostras contendo glicano são removidas a intervalos de 5 horas.

Em algumas modalidades da presente revelação, um. padrão de glicosilação desejado será mais extenso. Por exemplo, em algumas modalidades, um padrão de glicosilação desejada apresenta alta ocupação de sítios de glicosilação (por exemplo, superior a cerca de 50%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais); em algumas modalidades, um padrão de glicosilação desejado apresenta um alto grau de ramificação (por exemplo, superior a cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%,. cerca de 90%, cerca de

95%, cerca de .98%, cerca de 99% ou mais têm estruturas tri ou tetra-antenãrias).

Em algumas modalidades da presente revelação, um padrão de glicosilação desejado será menos extenso. Por exemplo, em algumas modalidades,, um padrão de glicosilação desejado apresenta baixa ocupação de sítios de glicosilação (por exemplo, inferior a cerca de 50%, cerca >de 45%, cerca

52/83 de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 15%, cerca de 5%, cerca de 1%·, ou menos}; e/ou um baixo grau de ramificação (por exemplo, menos de cerca de. 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de

5%, cerca de 1% ou menos têm estruturas tri ou tetraantenârias}.

Em algumas modalidades, um padrão ôe glicosilação desejado será mais extenso em alguns aspectos e menos extenso em outros. Por exemplo, pode ser desejável empregar 10 uma linhagem celular que tende a produzir glicoproteínas com cadeias de oligossacarídeos não ramificadas.

Alternativamente, pode ser desejável empregar uma linha celular que tende a produzir glicoproteínas com cadeias de oligossacarídeos curtas, altamente ramificadas,

Em algumas modalidades, um padrão de glicosilação desejado será enriquecido para um tipo particular de estrutura de glicano. Por exemplo, em algumas modalidades, um padrão de glicosilação desejado terá níveis baixos (por exemplo, inferior a cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de

10%, cerca de 5%, cerca de 1%, ou menos} de estruturas com alto teor de manose ou estruturas híbridas, níveis altos (por exemplo, superior a cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 7 5%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 50%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais) de estruturas com alto teor de manose, níveis altos de manose altamente fosforílada (por exemplo, superior a cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 8 5%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de .98%, cerca de 99%, ou mais; por exemplo pelo menos um por glicoproteína) , ou níveis baixos (por exemplo, inferior a cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cercêi. de 1%, ou menos) de inanose altamente fosforilada.

Em algumas modalidades, um padrão de gliaosilação desejado incluirá polo menos cerca da um ácido siálico. Em algumas modalidades, um padrão de glicosilação desejado incluirá um alto nível (por exemplo, superior a cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais) de terminais que são sializados. Em algumas modalidades, um padrão de glicosilação desejado que inclui sializaçao apresentará pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, cu mais ácido E^f~acetílneuramínieo e/ou menos de cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, ou menos ácido 17glicoliIneuramínico.

Em algumas modalidades, um padrão de glicosilação desejado demonstra especificidade de alongamento de ramo (por exemplo, superior a cerca âe 60%, cerca de 65%, cerca de 70%·, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 8'5%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais de extensão estã em ramos «1,6 de manose; ou superior acerca de 60%, cerna de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de $0%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou de extensão está em ramos «1,3 de manose).

Em algumas modalidades, um padrão de glicosilação desejado incluirá um nível baixo (por exemplo, inferior a cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, ou menos) ou nível alto (por exemplo, superior

54/83 a cerca de €0%, cerca de 65%,· cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 00%, cerca de 95%, cerca de 08%, cerca de 99%, ou mais) de fucosilação do núcleo.

Em algumas modalidades, um padrão de glicosílação desejado incluirá um nível baixo (por exemplo, inferior a cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, ou menos) ou nível alto (por exemplo, superior a cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%,. cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou more) de um glicano s ulfatado.

Em algumas modalidades, um padrão de glicosílação desejado incluirá um nível baixo (por exemplo, inferior a cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, ou menos) ou nível alto (por exemplo, superior a cerca de 50%, cerca de 65%, cerca de 7 0%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou more) de um glicano fosforliado.

Em algumas modalidades, um padrão de glicosílação desejado incluirá um nível baixo (por exemplo, inferior a cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, ou menos) ou nível alto (por exemplo, superior a cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou more) de um ácido siálico ligada a uma N-acetilglucosamina.

Em algumas modalidades, um padrão de glicosílação desejado incluirá um nível baixo (por exemplo, inferior a cerca da 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, ou menos) ou nível alto (por exemplo, superior a cerca de 80%, cerca de 05%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 50%, cerca de 95%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais) de um glicano ac et.il ade·.

Monitorizando ou não a produção de uma proteína alvo particular para fins de controle de qualidade, a presente invenção pode ser usada, por exemplo, para monitorisar a 10 glicosilação em. etapas de desenvolvimento particulares ou em condições de crescimentos particulares.

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos

podem ser	usados para caracterizai' e/ou controlar	ou
comparar a	qualidade de produtos	terapêuticos. Para	dar
5 apenas um	exemplo, as presentes	metodologias podem	ser
usadas para	avaliar·' >a glicosílaçao	em células que produzem

um produto protéico terapêutico. Partícularmente, dado que a glicosílaçao pode, muitas vezes, afetar a atividade, biodisponibilidade ou outras características de um produto 20 protéico terapêutico, métodos para avaliar a glicosilação durante a produção deste produto protéico terapêutico são particularmente desejáveis. Entre outras coisas, a presente revelação pode facilitar a análise em tempo real da glicosilação em sistemas de produção para proteínas 25 terapêuticas.

Produtos glicoprotéioos terapêuticos representativos cuja produção e/ou qualidade pode ser monitor!zada de acorde com a presente revelação incluem, por exemplo, qualquer ura de uma variedade de agentes heraatolôgícos (incluindo, por exemplo, eritropoietina, fatores de

56/83 coagulação ao sangue fatores estimulantes de anti corpos , enz ima.

hormônios.

produtos repres aore sent ados comero i aImente i n c 1uem na Tabela 3:

or exemplo, aqueles

Tabela 3: Produtos Clicopi-otéicos Disponíveis

Comereialmente alteplase; atirador do

Produto protéico interferon gama-lb

Droga de Referência plasmíonogênio tissular r e c omb in ant e albumina humana laronidase

ÍAlefacept,- recombín proteína filtrado por vírus

Fator IX de coagula fator ant i-hemofí1 leucõçitos humanos interferon alfa-N3,

..............................	Aldurasyme''5
derivado de	Alferon I<T
co humano	Alphanate'
ção humano	AlphaNine'5' SD
ante,	Amevive*
imêrica LFA3-

b i va 1i r ud i na gromax darbepoetina alfa

Aranesp oevacizumab

Avastin nterferon beta-la; recombinante I Avonex'

Fator IX de coagulação

BeneFix

Interferon beta-1b • Betaseror 'ositumomab

fator ant i-hemof í1i co	Bioclate*
Hormônio do crescimento humano	BioTropin”
Toxina botulínica tipo A	Sotox'5'
a.lemtu.zumab	Campath'
acrítumomab; marcado com tecnécío-99	CEA-Scanv
alglucera.se; forma modificada de be t a-gluoccerebros i dase	Ceredase’
imigluoerase,- forma reeombinante de beta-glucocerebrosidase	Cerezyme’·
crotalidae polyvalent immune Fabovino	CroFab”
digoxin immune Fab, ovino	DigiFab’
rasburicase	Elitek''
etanercept	Snbrel
epoietina alfa	Epogerf
cetuximab	Erbitux”
algasidase beta	Fabrazyme’'
urofolitropina	Fertinex*
folitropina beta	Follistim
teriparatide	Forteo*
s om a t r op i na. huma n a	GenoTropin
glucagon	GlucaGei?
foi itropina al f.a	Gonal-F*
Fator anti-hemofílico	Helixate*
Fator anti-hemofílico; Fator XXXI	Hemofil
insulina	Humalog*
Fator ant i - hemo f í .1 i c o / comp 1 ex.o	Humate-P*

humano fator de von Willebrand
somatotropina	Humatrope’'
adalimumab	HÜMIRA*
insulina humana	Humul in
h i a 1 u roni da s e huinana recombinante	Hylenex*
i nterferon a1f acon-1	Infergen*
Eptifibatide	Xntegrilin“
interferon alfa	Intron A
palifexmina	Kepivance
anakinra	Kineret”'
fator anti-hemofílico	Kogenate^FS
insulina glargine	Lantus*
Fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos	Leukme /Leukine Líquida
lutropina alfa, para injeção	Luveris
1ipoproteína QspA	LYMErix’
ranibizumab	Lucentis'
gemtuzumab ozogamicina	Mylotarg*
galsulfase	Naglazymew
nesiritide	Natrecor*
peg f i1grast im	Neulasta
oprelvekin	Neumega*
filgrastim	Neupogení'
fanolesomab	NeutroSpec” (antes LeuTech*')
somatropina [rDNA]	Nordi t ropir? /Nordi t ropin Nordiflex
insulina? suspensão de zinco;·	Novolin I?

59/83 insulina; suspensão de isofano iNovolin N | insulina, regular; iΝονοίin R j insulina___| Νονοίin* | Fator Vila de coagulação iNovoSeven __________j somatropina i Nutropin I

........................................~..............................|..................................................................................1 imunoglobulina intravenosa iOctaganT j

PEG~ l· - asparaginase oteína de fusão

Lüvel totalmente humana j muromomab

Orthoclone OKT3 iônica humana

Ovidrel peginterferon alfa-2a

Versão peguilada de interferon alfa-2b

PEG-Xntron (suspensão i nj e táve

Plenaxis libertação de gonadotrofin enoietina alfa dornase alfa j Efalizumab; bloqueador i reversível de células T, seletivo

Combinação de ribavirina e i interferon alfa

I interferon beta

fator anti-hemofíli j rAHF/fator anti eraofílico

Procrit*

Proleukin

Protropir?'

Pulmozyme

Rebetron

Recombinate

ReFacto

60/83

Xepirudina	Re findar?
inf liximab	Remicade'
abeiximab	ReoPro
reteplase	Retavase *
rituximab	Rituxan’
ínterferon alfa-2a	Roferon-Z?
somatropina	Saizer?
Secreção de porcina sintética	SecreFlow
basiliximab	S-imulect*
eculizumab	Solíris*
pegvisomant	Somavert
Palívizumab.; mAb humanizado, produzido de forma, recombinante	Synagis”
tirotropina alfa	Thyrogen*
tenect epias e	TNKase”
natalizumab	Tysabrd?
Soluções 5%· e 10% de imunoglobulina humana intravenosa	·¥: Venoglobulin~ S’
interfer on a1fa~nl, 1 in f ob lastoi.de	Wellferon''·
drotrecogina alfa	Xigris”
Oma.lizumab; imunoglobulina- E dirigida a anticorpo monoclonal humanizado derivado de DNA reccmbinante	Xclair
daclizumab	Zenapax*
ibritumomab tiuxetano	Zeval i.n
S om a t o t r op i na	Eorbt ive ” {Ser os t in?)

Em axgumas modalidades, a revelaçaç proporciona métodos nos quais os glicanos de diferentes fontes ou amostras são comparados uns aos outros. Em alguns destes exemplo, amostras múltiplas da mesma fonte são obtidas ao longo do tempo, de modo que mudanças em padrões de glicosílação (e particularmente em padrões de glicosílação de superfície celular) são monitorizadas. Em algumas modalidades, uma das amostras é uma amostra histórica ou um registro de uma amostra histórica. Em algumas modalidades, uma das amostras é uma amostra de referência.

Sm alguma» modalidades, glicanos de amostras de cultura de células diferentes preparadas em condições que diferem em um ou mais parâmetros selecionados (por exemplo, tipo de células, tipo de cultura [por exemplo, alimentação contínua vs alimentação descontínua, etc.], condições de cultura [por exemplo, tipo de meio, presença ou concentração de um componente particular de meio(s) particular(es) , osmolarídade, pH, temperatura, momento ou grau de desvio em um ou mais componentes, tais como osmolarídade, pH, temperatura, etc.], tempo de cultura, etapas de isolamento, etc.) mas, de resto, são idênticos, são comparados, de modo que são determinados os efeitos do parâmetro selecionado em padrões de N-glicosilação. Em certas modalidades, glicanos de amostras de cultura de células diferentes em condições que diferem em um. único parâmetro selecionada são comparados de modo que são determinadas os efeitos do parâmetro único selecionado sobre os padrões de glicosílação. Deste modo, entre outras aplicações, o uso das técnicas conforme aqui descrito pode facilitar a determinação dos efeitos de parâmetros particulares sobre padrões de glicosilação em células.

Em algumas modalidades, são comparados glicanos de lotes diferentes de uma glicoproteína de interesse (por exemplo, uma glicoproteína terapêutica), sejam preparados pelo mesmo método ou por métodos diferentes, e sejam preparados simultaneamente ou separadamente. Nestas modalidades, a presente revelação facilita o controle de qualidade da preparação de glicoproteína. Alternativamente ou adicionalmente, algumas modalidades facilitam a monitorisação do progresso de uma cultura particular que produz uma glicoproteína de interesse (por exemplo, quando amostras são removidas da cultura em pontos de tempo diferentes e são analisadas e comparadas umas com as outras). Em alguns exemplos, são obtidas amostras múltiplas da mesma fonte ao longo do tempo, de modo que são monitorizadas as mudanças nos padrões de glicosilação. Em algumas modalidades, as amostras contendo glicanos são

removidas a inter	valos de cerca de 30	segundos,	cerca	de	X
minuto, cerca de í	2 minutos, cerca de 5	minutos,	cerca	de	10
minutos, cerca de	30 minutos, cerca d	e 1 hora.,	cerca	de	2
horas, cerca de	3 horas, cerca de '	1 horas,	cerca	de	5
horas, cerca de 10 horas, cerca de 12	horas ou	cerca	de	18

horas, ou a intervalos mais longos. Em algumas modalidades as amostras contendo glicanos são removidas a intervalos irregulares, Em algumas modalidades, as amostras contendo glicanos são removidas a intervalos de 5 horas.

Em algumas modalidades, os métodos de acordo com a revelação podem ser usados para monitor!zar o padrão de glicosilação durante o transcurso da sua produção pelas celuxas. Por exemplo, a produção de uma glicoproteína (por exemplo, a produção comercial) pode envolver as etapas de (1) cultivar as células que produzem a glicoproteína, (2) obter amostras a intervalos regulares ou irregulares durante todo a cultura, e (3) analisar o padrão de glicosilação da(s) glicoproteína(s) produzida(s) na(s) amostra(s) obtida(s). Em algumas modalidades, estes métodos podem ainda compreender uma etapa de comparar os padrões de glicosilação da(s) glicoproteína(s) produzida(s) nas amostras obtidas uns aos outros. Em algumas modalidades, estes métodos podem ainda compreender uma. etapa de comparar os padrões de glicosilação da(s) glicoproteína(s) produzidas na(s) amostra(s) obtida(s) ao padrão de glicosilação de uma amostra de referência.

Em qualquer destas modalidades, as características da análise do glicano podem ser registradas, por exemplo, em um registra de controle de qualidade. Conforme indicado acima, em algumas modalidades, uma comparação ê feita com um registra histórico de um lute anterior ou padx'ão e/ou com uma amostra de referência de glicoproteína.

Em algumas modalidades, glicanos de lates diferentes de uma glicoproteína de interesse (por exemplo, uma glicoproteína terapêutica), sejam preparados pelo mesmo método ou por métodos diferentes, e sejam preparados simultaneamente ou separadamente, saa comparados uns aos outros e/ou a uma amostra, de referência. Em algumas modalidades, a comparação de lote-para-lote pode compreender' as etapas de (1) proporcionar uma primeira preparação de glicanos a partir de um primeiro late de glicoproteínas; (ii) proporcionar uma segunda preparação de

54/8 3 glicanos a partir de um segundo lote de glicoproteinas; segunda preparações exoglicosidase (por simultâneo com 1, 2,

3 , 4, 5, 6, 7 ou mais exoglicosidases) , para especificamente clivar os monossacarídeos das extremidades submeter cada ca primeira e de glicanos a um um tratamento e/ou não redutoras de glicanos 17-ligados nas preparações de glicanos; e (iv) comparar os produtos da divagem obtidos da primeira preparação de glicanos com os produtos da 10 divagem da segunda preparação de glicanos de modo a ser avaliada a consistência dos dois lotes. Em algumas modalidades, podem ser proporcionadas preparações de glicanos removendo pelo menos um N-glicano de pelo menos uma glicoproteína de um lote e, opcionalmente, isolando os glicanos removidos. Em algumas modalidades, preparações de glicanos podem ser marcadas conforme aqui descrito (por exemplo, de forma fluorescente e/ou radioativa; por exemplo, antes e/ou depois do isolamento),

Em algumas modalidades, a presente revelação facilita o controle de qualidade da preparação de glicoproteinas. As características da analise do glieano podem ser registradas, por exemplo, em um registro de controlo de qualidade. Conforme indicado acima, em algumas modalidades, uma comparação é feita com um registro histórico de um lote anterior ou padrão de glicoproteína. Em algumas modalidades, uma comparação é feita com uma amostra de glicoproteína de referência.

Em certas modalidades, a presente revelação pode ser usada em estudos para modificar as características de 30 glicosilação de uma célula, por exemplo, para estabelecer

65/83 uma linhagem celular e/ou condições de cultura com uma ou mais características de glicosilação desejáveis. Esta linhagem celular e/ou condições de cultura pode, então, ser usada, se desejado, para a produção de um glicoconjugado alvo particular (por exemplo, glicoproteína) para o qual se espera que esta-(s) característica (s) de glicosilação sej a/sej am benéfi cas.

Em certas modalidades, as técnicas de acorda com a revelação são aplicadas a glicanos que estão presentes sabre a superfície de células, Em algumas modalidades, as glicanos analisados são substancialmente livres de glicanos que não estão na superfície das células, Em algumas destas modalidades, cs glicanos analisadas, quando presentes na superfície da célula, estão presentes no contexto de um ou mais conjugados na superfície celular (por exemplo, glicoproteínas au glicoüpídeos). Em certas modalidades, o padrão de glicosilação de uma glicoproteína ligada à membrana au na superfície celular transmembrana pode ser determinada (1) libertando a glicoproteína por tratamento com uma ou mais proteases; (2) isolando uma população de glicanos digerindo a glicoproteína libertada com glicanase;

(3) digerindo a população de glicanos por digestão com exoglicosidase de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos; e (4) analisando os produtos da. digestão usando qualquer método disponível a um especialista na técnica.

Em algumas modalidades particulares, os glicanos de superfície celular são analisados a fim de avaliar a glicosilação de uma ou mais glicoproteínas alvo de interesse, particularmente quando estas glicoproteínas alvo não são glicoproteínas de superfície celular. Em algumas β 5 / 8 3 modalidades, pode-se monitor!zar a glicosilação de uma glicoproteína alvo sem isolar a própria glicoproteína. Em certas modalidades, a presente revelação proporciona métodos para usar glicanos de superfície celular como uma leitura ou representação para estruturas de glicanos em uma glicoproteína de interesse expressa. Em certas modalidades, estes métodos incluem, mas não se limitam a, pós~processo, lote, rastreio ou medições in line da qualidade do produto. Estes métodos podem proporcionar uma. medição independente do padrão de glicosilação de uma glicoproteína de interesse produzida usando um produto secundário da reação do produção (por exemplo, as células) sem necessitar do uso de destruição de qualquer glicoproteína produzida, Além disso, os métodos de acordo com a revelação podem evitar o esforço necessário para, o isolamento do produto e a potencial seleção de glicoformas do produto que pode ocorrer durante o isolamento.

Em certas modalidades, as técnicas de acordo com a revelação são aplicadas a glicanos que são segregados de células. Em algumas destas modalidades, os glicanos analisados são produzidos por células no contexto de um glicoconjugado {por exemplo, uma glicoproteína ou q11co1ipídeo).

De acorda cam a presente revelação, as técnicas aqui descritas podem ser usadas para detectar glicanos desejáveis ou indesejáveis, por exemplo, para detectar ou quantificar a presença de um ou mais contaminantes em um produto, ou para detectar ou quantificar a presença de um ou mais espécies ativas ou desejadas.

67/83

Em várias modalidades, os métodos podem ser usados para detectar bi©marcadores indicativos de, por exemplo, um esteado patológico, antes do aparecimento da sintomas e/ou o progresso do estado patológico para um estado não tratável ou menos tratável, detectando um ou mais glicanos específicos cuja presença ou nível (seja absoluta ou relativa) possa estar correlacionada com um estado patológico particular (incluindo a susceptibilidade a uma doença particular) e/ou mudança na concentração destes glicanos ao longo do tempo.

Em certas modalidades, os métodos aqui descritos facilitam a detecção de glicanos que estão presentes em níveis muito baixos em uma fonte (por exemplo, uma amostra biológica, preparação de glicanos, etc.). Nestas modalidades, é possível detectar e/ou opcionalmente quantificar os níveis de glicanos que estão presentes em níveis inferiores a cerca de 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,075%, 0,05%, 0,025% ou 0,01% em uma população de glicanos. Em algumas modalidades, é possível detectar e/ou opcionalmente quantificar os níveis :le glicanos compreendidos entre 0,1% e 5%, por exemplo, entre 0,1% e 2%, por exemplo, entre 0,1% e 1% de uma preparação de glicanos. Em certas modalidades, é possível detectar e/ou opcionalmente quantificar os níveis de glicanos de superfície celular em entre cerca de 0,1 fmol a cerca de 1 mmol.

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos permitem a detecção de ligações particulares que estão presentes em níveis baixos em uma população de glicanos. Por exemplo, os presentes métodos permitem a detecção de

ligações	particulares que es!	xão p		; níveis
inferiores	a	10%·, inferiores	a 5%	, inferiores	5 a 4 %,
inferiores	a	3%, inferiores a	2%,	inferiores	a 1,5%,
inferiores	a 1	.%, inferiores a	0,75%,	inferiores	a 0,5%,
inferiores	a 0,	25%, inxerxores a	0,1%,	inferiores «	i. 0,075%',
inferiores	a 0	,05%, inferiores	a o, o;	25%, ou infe	riores a

0,01% em una população de glicanos.

Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos permitem a detecção de níveis relativos de espécies de 10 glicanos individuais em uma população de glicanos. Por exemplo., a área sob cada pico de uma cromatografia líquida ode ser medida e expressa como uma percentagem do total.

Esta análise proporciona uma quantidade percentual relativa de cada espécie de glioano em uma população de glicanos.

Em algumas modalidades, as técnicas aqui descritas podem ser combinadas com uma ou mais tecnologias para a detecção, analise e/ou isolamento de glicanos ou glicoconjogados. Por exemplo,· em certas modalidades, os glicanos são analisados de acordo com a presente revelação usando um ou mais métodos disponíveis (para dar apenas alguns exemplos, ver Anumula, Anal. Síochem. 350(1):1,

2006; Klein et al., Anal. Blochem., 179 :162,

1989.; e/ou

Townsend, R. R. Carbohydrate Anal/sis Hlgh Permformance

Liquid Chromatography and Capàllary Blect-rophoresis, Ed.

Z. El Rassi, pp 181-209, 1995, cada um dos quais aqui é

dado	como integralment	;e incorporado por	citação).	Por
exempl	o, em algumas	moda1idade s, os	glicanos	são
caract	erizados usando u	m ou mais métodos	cromatográfi	COS ,

métodos eletroforétícos, métodos de ressonância nuclear e combinações destes. Métodos exemplificativos incluem, por

9 / 8 3 exemplo, NMR, espectroscopia de massa, cromatograf ia líquida, cromatografia bi-dimensional, SDS-PAGE, coloração de anticorpos, coloração com lecitina, quant.it icação de monossacarídeos, eletroforese capilar, eletroforese de hidrato de carbono assistida por fluoróforo (FACE), cromatograf.ia eletrocinética micelar (MEKC) , tratamentos com exoglicosidase ou endoglicosidase e combinações destes. Os especialistas na técnica estarão cientes de outros métodos que podem ser usados para caracterizar glicanos juntamente com os métodos IMAC aqui descritos.

Em algumas modalidades, a estrutura e composiçãcs cios

glicanos pode	ser analisada	por métodos cromatográficos
i nc lu i ndo ma s	cão limitado	a cromatografia líqu;	ida (LC) ,
cromatografi a	líquida de	alto desempenho	(HPLC),
cromatografia	líquida de	ultra eficiência	(UPLC),
cromatograf ia	em camada fina	(TLC) , cromatografia	em coluna
de amida e com	binações destas	»

Em algumas modalidades, a estrutura e composição dos glicanos podem ser analisadas por espectrometria de massa (MS) e métodos relacionados, incluindo mas não limitados a MS tandem, LC-MS, LC-MS/MS, espectrometria de massas por dessorção e ionização a laser assistida por matriz (MA1.DXMS) , espectrometria de massa com transformada de Fourier (FTMS), separação de mobilidade iônica com espectrometria de massa (IMS-MS) , dissociação por transferência de elétrons (ETD-MS) e combinações destes.

Em algumas modalidades, a estrutura e composição dos glicanos podem ser analisadas por métodos eletroforéticos, incluindo mas não limitado a eletroforese capilar (CE), CE~ MS, eletroforese em gel, eletroforese em gel de agarose,

70/ 8 3 eletrofore.se em gel de acrilamida, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. (SDS-PAGE) seguido por Western blotting usando anticorpos gue reconhecem estruturas de glicano específicas e combinações destes.

Em algumas modalidades, a estrutura e composição dos glicanos podem ser analisadas por ressonância magnética nuclear {NMR) e métodos relacionados, incluindo mas não limitado a NMR uni-dimensional (1D-NMR), NMR bí-dimensional (2D-NMR) , correlação de espectroscopia magnética-NMR com .10 rotação no ângulo (COSY-NMR) , correlação de espectroscopia magnética-NMR (TOCSY-MÍR) , NMR coerência heteronuclear quãntica simples (HSQC-NMR) , coerência heteronuclear quântica múltipla (HMQC-NMR), espectroscopia de NMR rotacional de efeito de Overhauser (ROESY-NMR), 15 espectroscopia nuclear de efeito de Overhauser (NOESY-NMR) e combinações destes.

A presente revelação serâ agora ilustrada mais especificamente com referência aos exemplos a seguir. No entanto, deve ser entendido que a presente revelação não 20 está limitada, de modo algum, a estes exemplos.

Exemplos

Exemplo 1; Digestão Gradativa de l!7-glica.nos com Exogi i cosi dades .Materiais e Métodos

Preparação da Amostra

Os N-glicanos foram libertados de uma glicoproteína exemplifícativa purificada por N-glicanase F, seguido por uma etapa de limpeza para remover sais, detergentes, proteínas e material não-glicano. As proteínas foram 30 primeiro desnaturadas por calor e depois tratadas com um excesso de N-glicanase F de ura dia para o aut.ro a 37 C na presença de SDS. Os glicanos libertados foram isolados dos sais e enzima usando uma coluna de carbono grafitizado (por exemplo, EnviCarb). Os N-glicanos foram marcados de forma 5 fluorescente na extremidade redutora (N-glicano-2AB) e o marcador em excesso foi removido por uma etapa adicional de limpeza. 0 marcador 2-AB foi primeiro dissolvido em 30% ácido acético em solução de DMSO e cianoboro-hidreto de sódio foi adicionado a uma concentração final de 1,2 M.

Cerca de 5-10 ul desta solução marcadora foram adicionados aos glicanas secos e aquecidos a 65 °C durante 3 horas para permitir que o marcador atingisse o término. Os glicanos marcados foram então isolados do marcador livre e sais aplicando a amostra a um cartucho de Glycoclean S, lavando 15 com 96% acetonitrilo e eluindo com água.

.Reações de Exoglicosidase

Misturas de glicanos (0,25 nmol/çL ~ 0,5 nmol/uL/ foram submetidas a um tratamento gradativo com pelo menos duas exoglicosidases (1 u.L - 2 pL de glicosidase grau 20 sequência por 20 uL - 4 0 μΐ do volume da reação) selecionadas do grupo que consiste em sialidase, galactosidase, hexcsaminidase e fucosidase. Tipicamente, as reações foram realizadas ao pH -5,5. Depois de cada etapa de uma análise gradativa, a enzima foi inativada antes da 25 enzima seguinte ser adicionada.

Análise dos Produtos da Digestão

Os produtos da digestão foram resolvidos por cromatografia líquida (LC) era uma coluna de araida que é acoplada à espeotrometria de massa (MS) . A identificação 30 estrutural. dos picas de glicano foi obtida por espectrometria de massas por dessorção e ionização a laser assistida por matriz (MALDT-MS). Qs tempos de retenção de glicano foram comparados com aqueles padrões conhecidos e com aqueles de uma glicose ladder.

Re su11ados

Depois de um exaustivo tratamento gradativo com exoglicosidases, a maioria dos N-glicanos foram digeridos a. um núcleo M3N2 conservado com alguns pequenos picos aluindo mais tarde no cromatograma (Figura 2B). A espectrometria de massa (MS) confirmou que os picos pequenos correspondiam ã lactosamina (Figura 2B) . A Figura 2A apresenta o cromatograma do N-glicano antes da digestão.

Exemplo 2.- .Digestão Dimultânea de N-glicanos com Exoglicosidases Múl tipias

Materiais e Métodos

Preparação da Amostra e Análise dos Produtos da Digestão

Os N-glicanos foram preparados e os produtos da digestão foram analisados conforme descrito no Exemplo 1.

Reações de Exoglícosidase

Misturas de glicanos (0,25 nmol/ul ~ 0,5 nmol/ul) foram submetidas a um tratamento simultâneo com pelo menos duas exogliccsidases (1 μ ~ 2 pL de glicosidase grau sequência por 20 çL - 4 0 μΐ do volume da reação) selecionadas do grupo que consiste em sialidase, galactosidase, hexosaminidase e fucosidase. Tipicamente, as reações foram realizadas ao pH ~5, 5.

Resultados

Quando os N-glicanos foram tratados simultaneamente com duas ou mais exoglicosidases, a maior parte das estruturas dos F~glicanos desmontaram a um núcleo (M3N2) conservado. As extensões de lactosamina são eliminadas devido a presença simultânea das atividades da galactosidase e hexosaminidase. Conforme apresentado na

Figura 3, há algumas espécies com tempos de retenção por LC de 30 ~ 70 minutos que eram resistentes a todas as exoglicosidases usadas. O fato de que estas espécies são refratárias ao tratamento com exoglicosidase convencional., indica que as mesmas contêm modificações pouco comuns., que 10 podem ser identificadas por análise de MS e podem ser quantificadas medindo as áreas de pico como uma percentagem do total.

E.x<SMp2& 3: De ter.ml naçao da presença de Grupos de Lactosaraina em urn N-glicano Usando Digestão com 15 Sxoglicosidase Simultânea e Sequencial

Protocolos de digestão com exoglicosidase seqüencial vs simultânea podem ser usados para, obter informações sobre a estrutura e/ou composição de N-glicanos em uma preparação de glicanos. Por exemplo, pode ser determinada a presença 20 de grupos de laotosamina comparando os produtos de digestão gerados por uma digestão seqüencial e uma digestão simultânea, conforme indicado na Tabela 4 para a estrutura hipotética do glicano:

74/03

Todas as excglicosidases apresentadas na Tabela 4 são de ampla especificidade de substrato, isto e, as mesmas 5 clivarãc fora do terminal açúcar de uma extremidade não redatora independentemente do tipo de ligação. Uma comparação de tratamentos sequências (Q) e simultâneos (S) Rx.04 ou RxC>5 permite que seja confirmada a presença de grupos polilactosamina em uma preparação de glicanos.

Tabela 4, Pigeetã.G Sequencial vs. Simultânea com

Exogl1cosídasee

Conforme apresentado na Tabela 4, Rx04 (S) e RxOâ (Q) cada um representa a digestão do mesmo N-glicano com conjuntos idênticos de enzimas (sialidase, galaetosidase e hexosamixiidase de ampla especificidade) . No entanto, as sequenciais digestão distintos.

Do mesmo medo, um digestão do mesmo com conjuntos idênticos de enzimas (sial .ase, galactosidase, hexosamin ucosidase de especificidade).

entanto, as digestões simultâneas (S) e sequenciais (Q) geram produtos de digestão distintos, Este exemple demonstra uma maneira em que a comparação de produtos de digestão gerados por digestões simultâneas e sequenciais pode proporcionar informações sobre a estrutura e/ou c ompos i ç ão do g1icano.

O exemplo acima está também ilustrado na Figura 7, que demonstra como as estruturas de polilactosamina podem ser elucidadas por digestão sequencial vs simultânea. Na Figura 7, a amostra contém uma população de glicanos. Depois da digestão simultânea da população de glicanos com sialidase, galactosidase e hexosaminidase, a maioria dos glicanos e clivada até as estruturas de núcleo Man3Gn2 conforme indicado por cromatografia líquida (LC; Figura 7A) e espectrométria de massa s (MS; Figure 7B) . Alguns poucos picos selecionados com tempos de retenção mais prolongados correspondem a estruturas de tipo com alto teor de manose.

Depois da digestão sequencial com sialidase, galactosidase e hexosaminidase, no entanto, permanecem alguns picos, além dos picos que se associam a estruturas com alto teor de manose. Estes picos adicionais correspondem a glicanos com uma lactose ligada ao núcleo Man3C4.n2 permanecem como indicado nos dados de MS. A presença destes picos (na digestão sequencial e não na simultânea) corresponde a estruturas do tipo polilactosamina na amostra original.

76/83

Exemplo 4: Identificação de Ldffãçâeâ de ácido Siálico em ubi A-glicano (Zsando Digestão Simultânea e Següenclal cani Exogli cosidase

Protocolos de digestão com exoglicosidase seqüencial ve simultânea podem ser usados para obter informações sobre a estrutura e/cu composição· de N-glicanos em uma preparação de glicanos. Por exemplo, pode ser determinada, a presença de e/ou tipo de ligações de ácido siálico comparando os produtos de digestão gerados por uma digestão sequencial e uma digestão simultânea, conforme indicado na Tabela 5 para a estrutura hipotética do A-gücano:

A Tabela 5 apresenta um grupo de sialidases, cada um tendo uma especificidade diferente de ligação ao substrato.

O presente exemplo demonstra como as ligações do ácido siálico ao terminal <x-2,3 podem ser distinguidas das ligações a-2,6.

Tabela 5. Determinação das Digagões do ácido Giálico em M-

sialldase α-2/3α-2/3,$,8,9sialidase β-1/3,4,61,4hexos aminidase

Produtos da

Digestão galactosidase

Conforme apresentado na Tabela S, Rxl2 (S) e Rxl2 (Q) cada um representa a digestão do mesmo h^r-glicano com conjuntos idênticos de enzimas (a-2/3,6,8,3-sialidasa, β1/3,4,6-galactosidase e β-1,4-hexosaminida.se) , No entanto, as digestões simultâneas (S) e sequenciais (Q) geram produtos de digestão distintos. Conforme ilustrado, a comparação entre a digestão seqüencial e simultânea elucida as estruturas de polilactosamina e que o ácido siâlico 2,6ligado está presente na extensão polilactosamina, enquanto o ácido siãlico 2,3-ligado está no braço com apenas uma lactosamina. Este exemplo demonstra uma maneira em que a comparação dos produtos da digestão gerados por digestão simultânea e seqüencial pode proporcionar informações a cerca da estrutura e/ou composição do glieano.

Além disso, conforme apresentado na Tabela 5, o tratamento Rxl5 (Q) cliva todas as antenas não sializadas em uma população de glicanos até o glieano trimanosil do núcleo. Os produtos da divagem compreendem espécies mono, bi, tri e tetra-antenáriascujo perfil pode ser definido por cromatografia. Esta definição do perfil proporciona uma leitura da composição antenária da mistura original de glicanos. Em. particular, esta de f. inação de perfil proporciona uma leitura da composição antenãria de ramos sializados. Com uma pluralidade de amostras, depois deste tratamento de glicosidase ter sido realizado, cada glicano individual terá tantos ramos quantos são sializados e estes podem ser separados por cromatografia. Isto está também 10 apresentado na Figura 4, que representa uma população exemplificativa dé N-glicanos que é submetida às condições de digestão de Rx05 (Q), conforme apresentado na Tabela 5.

Para a população de. N-glicanos apresentada na Figura 4, este exemplo demonstra como o tratamento sequencial pode 15 produzir uma população de produtos da digestão. Os produtos da digestão podem ser analisados e suas estruturas e/ou composições podem ser determinadas.

Exemplo 5,- identificação de Ligações Fucosil em um Í7~ glicano- Usando Digestão Simultânea e Eegüencial- com 20 Excglicosidase

Protocolos de digestão com exoglicosidase simultânea podem ser usados para obter informações sobre a estrutura e/ou composição de N-glicanos em uma preparação de glicanos. Por exemplo, a digestão com varias combinações de 25 exoglicosidases pode ser usada para distinguir fucosilação de braço (antenãria) α·-1/3,4 da fucosilação de núcleo a1,6 de um N-glicano previamente desializadc. Os afeitos de cada tratamento apresentado na Tabela 6 são ilustrados no caso da seguinte estrutura de glicano exemplif.icativa;

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Tabela á. Determinação de Ligações de Fucoail

Conforme apresentado na Tabela 6, a digestão com exoglicosidase com diferentes combinações de enzimas gera vários produtos de digestão. No exemplo aqui apresentado, 10 uma análise com base apenas na massa indica a presença de dois resíduos de fucose. No entanto, usando a abordagem acima referida, pode ser determinada a .localização dos dois resíduos de fucose (isto é, uma fucose está no núcleo e uma fucose está no ramo vs ambos os resíduos de fucose aparecem nos ramos). Este exemplo demonstra uma maneira em que a comparação dos produtos da digestão gerados por digestão

80/83 simultânea pode proporcionar informações a cerca da estrutura e/ou composição do glicano.

Exemplo 6? Fãpída Identificação de Glicanos Contendo Po 2 ϊ I a c t o sam i n a

Glicanos 27-ligados foram libertados de uma glicoproteína modelo usando Peptídeo; &-<31icosídase F (PNGase-F) , que produz uma amostra de glicano, A PNGase-F é uma amidase que cliva entre o GlcNAc mais interno e resíduos de asparagina com alto teor de manose, híbrida e oligossacarídeos complexos de glicoproteínas, 27- ligadas (Maley et al., 1989, Anal. Bioc/jem. , 180; 195; aqui dado como incorporado por citação). A PNGase F pode hidrolisar quase todos os tipos de cadeias de N-glicanos de glicopeptídeos e/ou glicoproteínas. A amostra de glicano resultante foi purificada usando cartuchos de extração em fase sólida de carbono grafitizado ativado. A mistura de glicano foi então marcada fluorescentemente com 2~ benzamida. A amostra de glicano foi dividida em duas partes iguais e cada parte foi feita reagir com um conjunto de exoglicosidases (isto é, sialídase, galactosidase e 27acetil-hexosaminidase) de uma forma simultânea e sequencial, respectivamente. Os produtos da reação foram subsequentemente analisados por HPLC fluorescente em fase normal usando uma coluna de amida ou MALDI-MS. Os resultados da análise estão apresentados na Figura 8 (cromatogramas) e Figura 9 (MALDI-MS).

Equivalentes e Âmbito

Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de certificar usando nada mais que experimentos rotineiros, muitos equivalentes a modalidades específicas

SI /83 de acordo com a revelação aqui descritos. O âmbito da presente revelação não pretende ser limitado à Descrição acima, mas, particularmente, e apresentado nas reivindicações apensas.

Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de certificar usando nada mais que experimentos rotineiros, muitos equivalentes a modalidades específicas de acordo com a revelação aqui descritos. 0 âmbito da presente revelação não pretende ser limitado â Descrição 10 acima, mas, particularmente, ê apresentado nas reivindicações apensas.

	Nas reivindicações,	os	artigos	tais como	um	, uma.
	e o/a podem significar	um	ou	mais	de um, sa'	Ivo	indicado
	em contrário ou entã.o, βλ	ri dente	pelo	contexto.	Des	te modo,
15	por exemp1o, re ferênc ia	a	uma	nanopartícula	in·;	ului uma

pluralidade destas nanopartículas e referência a a célula inclui referência a uma ou mais células conhecidas dos especialistas na técnica, e assim por diante, As reivindicações ou descrições que incluem ou entre um ou 20 mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes, são usados ou então são relevantes a um dado produto ou processo, salvo indicado em contrário ou, então, são evidentes pelo contexto, A revelação inclui modalidades 25 em que exatamente um membro do grupo está presente, é usado ou então e relevante a um dado produto ou. processo. A revelação inclui modalidades em que mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes, são usados ou, então, são relevantes a um dado produto ou processe, Além disso, deve 30 ser entendido que a revelação abrange todas as variações,

82/83 combinações e permutações em que uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, termos descritivos, etc., de uma ou mais das reivindicações listadas são introduzidas em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que é 5 dependente de outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que seja dependente da mesma reivindicação de base. Além disso, onde as reivindicações citam uma composição, deve ser entendido que são incluídos 10 os métodos de uso da composição para qualquer dos fins aqui revelados, e são incluídos os métodos de preparar a composição de acordo com qualquer dos métodos de preparação aqui revelados ou outros métodos conhecidos na técnica, salvo indicado em contrário ou salvo se for evidente para 15 um especialista na técnica que surgiría uma contradição ou inconsistência.

Onde elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato do tipo grupo Markush, deve ser entendido que cada subgrupo dos elementos é também revelado 20 e quaisquer elementos podem ser removidos do grupo. Deve ser entendido que, em geral, onde a revelação, ou aspectos de acorda com a revelação, ê/são referidos como compreendendo elementos, características particulares, etc,, certas modalidades de acordo com a revelação ou 25 aspectos de acordo com a revelação consistem, ou consistem essencialmente nestes elementos, características, etc. A título de simplicidade, estas modalidades não foram aqui especifícamente apresentadas in haec verba. Observe-se. que o termo compreendendo pretende ser aberto e permite a 30 inclusão de elementos ou etapas adicionais.

83/83

Quando são dadas variações, pontos finais são incluídos. Além disso, deve ser entendido que salvo indicado em contrário ou então evidente pelo contexto e entendimento de um especialista na técnica, os valores que 5 são expressos como variações podem pressupor qualquer valor específico ou subvariação nas variações declaradas em modalidades diferentes de acordo com a revelação até o décimo da unidade do limite inferior da variação, salvo se o contexto claramente dita em contrário.

deve ser entendido qu quaIquer particular da presente revelação que se enquadra da anterior pode e xpliei t ame n te excluída de qualquer uma das reivindicações. Uma vez que estas modalidades são consideradas como sendo conhecidas dos especialistas na técnica, as mesmas devem ser excluídas mesmo se a exclusão não estiver explicitamente aqui apresentada. Qualquer modalidade particular das composições de acordo com a revelação (por exemplo, qualquer exoglicosidase, qualquer ligação glicosídica, qualquer condição de reação, qualquer método de purificação, qualquer método de análise de produto, etc.} pode ser excluída de qualquer uma ou mais reivindicações, por qualquer razão, seja ou não relacionada com a existência de técnica anterior.

As publicações discutidas acima e ao longo de todo o texto são dadas apenas por sua revelação anterior à data de depósito do presente pedido, Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm o direito de antedatar esta revelação em virtude de revelação anterior.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

   fornecer uma preparação de glicano;

   submeter uma primeira amostra da preparação de glicano a um primeiro procedimento de exoglicosidase;

   submeter uma segunda amostra da preparação de glicano a um segundo procedimento de exoglicosidase, em que o segundo procedimento de exoglicosidase difere do primeiro procedimento de exoglicosidase; em que um do primeiro ou do segundo procedimento de exoglicosidase compreende o tratamento seqüencial da amostra da preparação de glicano com pelo menos duas exoglicosidases, em que a preparação de glicano é exposta às exoglicosidases uma de cada vez; e o outro do primeiro ou segundo procedimento de exoglicosidase compreende o tratamento simultâneo da amostra da preparação de glicano com pelo menos duas exoglicosidases;

   caracterizar os produtos da divagem do primeiro e do segundo procedimentos de exoglicosidase; e comparar a caracterização dos produtos de divagem do primeiro procedimento de exoglicosidase com a caracterização dos produtos de divagem do segundo procedimento de exoglicosidase de modo que pelo menos uma característica de glicosilação da preparação do glicano é determinada.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de comparação compreende comparar a caracterização dos produtos de divagem do primeiro ou do segundo procedimento de exoglicosidase com os produtos de divagem de uma amostra

   2/7 de referência.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro ou o segundo procedimento de exoglicosidase compreende pelo menos um de:

   (a) tratar a amostra de preparação do glicano com uma exoglicosidase selecionada do grupo que consiste em uma sialidase, uma galactosidase, uma hexosaminidase, uma fucosidase, uma manosidase e combinação destas;

   (b) tratar a amostra de preparação do glicano com pelo menos duas exoglicosidases selecionadas do grupo que consiste em uma sialidase, uma galactosidase, uma hexosaminidase, uma fucosidase, uma manosidase e combinação destas.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um produto de divagem compreende um glicano sulfatado, um glicano fosforilado, um ácido siálico ligado a uma N-acetil glicosamina, um glicano acetilado, uma fucosilação antenária, uma extensão de lactosamina ou um núcleo pentassacarídico compreendendo três resíduos manose e 2 Nacetil glicosamina.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de fornecer a preparação do glicano compreende:

   a) fornecer uma pluralidade de glicoproteínas, cada glicoproteína compreendendo pelo menos um N-glicano, no qual o N-glicano está ligado a uma glicoproteína da pluralidade;

   b) remover pelo menos um N-glicano da pelo menos uma glicoproteína;

   3/7

   c) opcionalmente, isolar os N-glicanos removidos.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de caracterização compreende submeter os produtos de clivagem a um procedimento selecionado do grupo que consiste em métodos cromatograficos, cromatografia líquida (LC), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC), cromatografia de camada fina (CCF), cromatografia de coluna de amido, espectrometria de massa (MS), MS em tandem, LC-MS, LC-MS/MS, espectrometria de massa por desorção-ionização de laser em matriz (MALDIMS) , espectrometria de massa de transformada de Fourier (FTMS), espectrometria de massa com separação por mobilidade iônica (IMS-MS), dissociação por transferência de elétrons (ETD-MS), métodos eletroforéticos, eletroforese capilar (CE), CE-MS, eletroforese em gel, eletroforese em gel de agarose, eletroforese em gel de acrilamida, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de Western blotting usando anticorpos que reconhecem estrutura de glicano específicas, ressonância magnética nuclear (RMN), RMN unidimensional (1D-RMN), RMN bidimensional (2D-RMN), correlação de espectroscopia magnética - RMN com rotação no ângulo (COSY-NMR), RMN espectroscopia correlacionada total (TOCSY-RMN), RMN de coerência heteronuclear quantum simples (HSQC-RMN), RMN de coerência heteronuclear quantum múltipla (HMQC-RMN), RMN espectroscopia de efeito overhauser nuclear rotacional (ROESY-RMN), espectroscopia de efeito overhauser nuclear (NOESY-RMN) e combinações destes.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 1,

   4/7 caracterizado pelo fato de ainda compreender avaliar a presença de modificações na preparação do N-glicano selecionado do grupo que consiste em fosforilação, sulfatação, acetilação, extensões lactosamina e fucosilação antenária.
8. 8. Método de caracterização de uma pluralidade de proteínas ligadas a N-glicanos caracterizado pelo fato de que compreende:

   a) fornecer uma pluralidade de glicoproteínas, cada glicoproteína compreendendo pelo menos um N-glicano, em que o N-glicano está ligado a uma glicoproteína da pluralidade;

   em que o padrão de glicosilação de pelo menos um membro da pluralidade difere do padrão de glicosilação de pelo menos um outro membro da pluralidade;

   b) remover pelo menos dois N-glicanos de pelo menos uma glicoproteína;

   c) opcionalmente, isolar N-glicanos removidos;

   d) clivar pelo menos uma ligação glicosídica terminal da extremidade não-redutora dos N-glicanos removidos pela submissão de pelo menos um N-glicano removido pelo tratamento seqüencial com pelo menos duas enzimas exoglicosidases para gerar uma pluralidade de produtos de divagem; e clivar pelo menos uma ligação glicosídica terminal da extremidade não-redutora do outro N-glicano removido por submissão do pelo menos um N-glicano removido pelo tratamento simultâneo com pelo menos duas enzimas exoglicosidases para gerar uma pluralidade de produtos de divagem;

   e) caracterizar os produtos de divagem; e

   f) opcionalmente, comparar a caracterização dos

   5/7 produtos de divagem a uma amostra de referência.
9. 9. Método para comparar grupos de uma glicoproteína caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

   fornecer uma primeira preparação do glicano a partir de um primeiro grupo de glicoproteínas;

   fornecer uma segunda preparação do glicano a partir de um segundo grupo de glicoproteínas;

   submeter cada uma da primeira e segunda preparações de glicano ao primeiro e segundo procedimentos de exoglicosidase, para especificamente clivar monossacarídeos da extremidade não-redutora dos glicanos N-ligados nas preparações glicano;

   em que o segundo procedimento de exoglicosidase difere do primeiro procedimento de exoglicosidase; em que uma do primeiro ou do segundo procedimento de exoglicosidase compreende o tratamento seqüencial da amostra de preparação do glicano com pelo menos duas exoglicosidases, em que a preparação do glicano é exposta à exoglicosidase uma de cada vez; e o outro do primeiro ou do segundo procedimento de exoglicosidase compreende o tratamento simultâneo da amostra de preparação do glicano com pelo menos duas exoglicosidases; e comparar os produtos de divagem obtidos a partir da primeira preparação do glicano com os produtos de divagem obtidos a partir da segunda preparação de modo que a

   consistência dos dois grupo é avaliada. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o procedimento de exoglicosidase compreende o tratamento da primeira e da segunda preparações de glicano com pelo menos uma

   6/7 exoglicosidase selecionada do grupo que consiste em uma sialidase, uma galactosidase, uma hexosaminidase, uma fucosidase, uma manosidase e combinações destes.
10. 11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um produto de divagem compreende uma glicoforma selecionada do grupo que consiste em:

    um núcleo pentassacarídico compreendendo três resíduos manose e 2 N-acetilglicosamina;

    uma fucosilação antenária;

    uma extensão lactosamina;

    um glicano sulfatado;

    um glicano fosforilado;

    um ácido siálico ligado a uma N-acetilglicosamina; e um glicano acetilado.
11. 12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de fornecer a preparação do glicano compreende:

    a) remover pelo menos um N-glicano de pelo menos uma glicoproteína a partir do primeiro ou do segundo grupo;

    b) opcionalmente, isolar os N-glicanos removidos.
12. 13. Método para monitorar a produção de uma glicoproteína caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    durante a produção da glicoproteína, remover pelo menos a primeira e segunda amostras contendo glicano do sistema de produção;

    submeter cada uma da primeira e segunda amostras contendo glicano ao primeiro e segundo procedimento de exoglicosidase, para especificamente clivar monossacarídeos das extremidades não-redutoras dos glicanos N-ligados mas amostras contendo glicano;

    em que o segundo procedimento de exoglicosidase difere do primeiro procedimento de exoglicosidase; em que um do 5 primeiro ou do segundo procedimentos de exoglicosidase compreende o tratamento seqüencial da amostra da preparação de glicano com pelo menos duas exoglicosidases, em que a preparação do glicano é exposta à exoglicosidases uma de cada vez; e a outra do primeiro ou do segundo procedimento 10 de exoglicosidase compreende o tratamento simultâneo da amostra da preparação de glicano com pelo menos duas exoglicosidases; e comparar os produtos de divagem obtidos a partir da primeira amostra contendo glicano com aquelas obtidas da 15 segunda amostra contendo glicano de modo que as diferenças sejam determinadas e então o progresso da produção da glicoproteína é monitorada.
13. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma amostra

    20 contendo glicano é removida quando o procedimento de exoglicosidase está cerca de 10% completo.
14. 15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma amostra contendo glicano é removida antes que o procedimento de

    25 exoglicosidase esteja cerca de 100% completo.
15. 16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma amostra contendo glicano é removida antes que os glicanos sejam 100% clivados.