BRPI0819869B1 - Processo enzimático para a produção de um mosto de cervejeiro a partir de cereal não maltado, e, uso de um processo para produção de cerveja - Google Patents
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Abstract
processo enzimático para a produção de um mosto de cervejeiro a partir de cereal não maltado, e, uso de um processo para produção de cerveja a invenção diz respeito a um processo para a produção de mosto, que compreende o tratamento enzimático de grão para moer na forma até 100% não maltada (grão), para o processamento adicional em produtos de bebida de alta qualidade. pela adição de uma combinação de enzimas exógenas (a-amilase, isoamilase/pululanase, atividade que gera fan (proteases) e atividade de beta-glicanase) ao malte moído e pela ativação térmica simultânea da ß-amilase endógena que gera maltose, é possível obter um mosto com base em até mesmo 100% de cevada. a invenção diz respeito ainda a um processo para a produção de uma cerveja ou produto de cerveja de alta qualidade e à cerveja de alta qualidade produzida de acordo com o processo.
Description
PROCESSO ENZIMÁTICO PARA A PRODUÇÃO DE UM MOSTO DE CERVEJEIRO A PARTIR DE CEREAL NÃO MALTADO, E, USO DE UM PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE CERVEJA.
REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [001] Este pedido contém uma listagem de sequência na forma legível por computador. A forma legível por computador é aqui incorporada por referência.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO [002] A invenção diz respeito a um processo para a produção de um mosto de cervejeiro, que compreende um tratamento enzimático de um grão para moer que compreende até 100% da forma não maltada (grão) e diz respeito ainda ao mosto obtenível pelo processo.
[003] A invenção diz respeito ainda ao uso do dito mosto para o processamento adicional em produtos de bebida de alta qualidade e diz respeito a um processo para a produção de uma cerveja ou produto de cerveja de alta qualidade e à cerveja de alta qualidade produzida de acordo com o processo. Além disso, a invenção diz respeito às misturas de enzima.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [004] A maceração é o processo de converter amido do malte de cevada moída e auxiliares em açúcares fermentáveis e não fermentáveis para produzir mosto da composição desejada. A maceração tradicional envolve misturar malte de cevada moída e auxiliares com água em uma temperatura e volume ajustados para continuar as mudanças bioquímicas iniciadas durante o processo de maltagem. O processo para maceração é conduzido em um período de tempo em várias temperaturas de modo a ativar as enzimas endógenas responsáveis pela degradação de proteínas e carboidratos. Depois do processo para maceração o malte moído é filtrado para se obter o mosto para a fermentação até a cerveja. Tradicionalmente, a cerveja foi fermentada a partir da cevada maltada, lúpulos, levedura e água. A maltagem de cereais,
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 10/70 / 56 tais como a cevada, ativa as enzimas endógenas necessárias para a degradação do amido. Entretanto, o processo de maltagem é consumidor de energia e tempo e deste modo um tanto dispendioso. Assim, um modo de reduzir custos é substituir um pouco do malte com auxiliares facilmente disponíveis tais como amido refinado ou carboidratos facilmente fermentáveis e/ou substituindo com cereais não maltados, tais como cevada, milho, arroz, sorgo e trigo. Entretanto, os cereais não maltados carecem de enzimas endógenas, que podem resultar em sacarificação incompleta, viscosidade do malte moído/mosto aumentada, dificuldades de filtração, fermentabilidade, dificuldades de filtração da cerveja, instabilidade coloidal e aroma deficiente. As enzimas exógenas tais como alfa-amilase e β-glicanase foram previamente adicionadas para compensar quanto a falta de enzimas de malte. A técnica anterior que segue descreve a substituição de parte dos cereais maltados com cereais não maltados e enzimas exogenamente adicionadas.
[005] A ZA9803237 descreve um processo para produzir uma cerveja pela fermentação de um mosto obtido em parte de cevada não maltada e um malte moído de enzimas de alfa-amilase, β-glicanase e proteinase. Wieg et al. Process Biochemistry, 1970 também descrevem um processo para a fabricação de bebida fermentada com uma mistura de cevada maltada e não maltada e uma combinação de enzimas de alfa-amilase, β-glicanase e proteinase. Além disso, WO 04/011591 descreve um processo para produzir um mosto adicionando uma protease e uma celulase a um malte moído de cevada maltada e não maltada. Um resumo da fabricação de bebida fermentada de cevada é dado por Wieg et al. Brewing science, 1987. Um outro modo para produzir mosto é conhecido da Japanese Happoshu beers. No Japão, as taxas sobre as bebidas alcoólicas contendo malte são relativamente altas, que é o motivo pelo qual as cervejas Happoshu são fabricadas com uma quantidade tão inferior quanto 25% de cevada maltada. Usualmente, o malte moído preparado em um tal teor baixo de malte é impossível filtrar de modo a
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 11/70 / 56 obter o mosto, visto que o malte moído é muito espesso para filtrar. Existe apenas poucas descrições técnicas disponíveis que dizem respeito à composição do malte moído de Happoshu. Entretanto, é conhecido que é necessário adicionar enzimas exógenas ao malte moído de modo a obter filtrabilidade, por exemplo, proteinases, β-glicanase e amilases. As cervejas Happoshu têm características de sabor diferentes mesmo comparadas com as cervejas tradicionais do tipo de alta fermentação mais simples. A JP 2004173533 descreve a produção de uma tal cerveja com o uso de cevada prensada e menor quantidade de malte. Enzimas diferentes são usadas para ajudar por exemplo na sacarificação.
[006] Os mostos obtidos nas referências da técnica anterior são fundamentados no grão para moer que compreende quantidade considerável de malte. A composição de enzima em cereais brutos é substancialmente diferente dos cereais maltados e as enzimas endógenas e exógenas envolvidas na degradação de amido estão trabalhando juntas em uma maneira complexa durante a maceração e é no geral assumido que algum malte deve estar presente no grão para moer. Assim mesmo com enzimas exogenamente adicionadas alguns dos problemas mencionados acima por exemplo com filtrabilidade, fermentabilidade e turbidez de mostos com base em cereais não maltados ainda existe. Consequentemente, muito poucas tentativas têm sido feitas para substituir quantidades grandes ou todo dos cereais maltados com cereais não maltados.
[007] Um exemplo é Goode et al. que descrevem a produção de um mosto a partir de 100% de substrato de cevada bruta e uma combinação de enzimas de duas alfa-amilases diferentes e uma beta-glicanase. A alfa amilase tem um efeito positivo sobre a separação do malte moído, mas a velocidade de filtração caiu quando altas quantidades de cevada não maltada estavam presentes. Também na US 3081172 produzir um mosto a partir de matéria prima não maltada é sugerido, entretanto, nada é mencionado a cerca de FAN
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 12/70 / 56 (Nitrogênio Amino Livre), da quantidade de açúcares fermentáveis e outros parâmetros cruciais do mosto resultante.
[008] Consequentemente, problemas tais como fermentabilidade baixa, composição de aminoácidos não ótimas e alta viscosidade e turbidez do mosto não são solucionados e estes obstáculos tendem a aumentar com quantidades crescentes de cereais não maltados.
[009] Uma outra desvantagem com a fabricação de bebida fermentada com cereais não maltados da técnica anterior é que o tempo de maceração prolongado pode ser necessário de modo que as enzimas exógenas e endógenas no malte moído produzam um mosto que seja comparável por exemplo com respeito à fermentabilidade com um mosto produzido a partir de cereais maltados. O tempo de maceração prolongado evidentemente não é econômico e pode neutralizar as vantagens econômicas de substituir cereais maltados com não maltados.
[0010] Assim até agora nenhuma combinação de enzimas compensou totalmente as enzimas do malte, tal que a mesma quando da adição junto com até 100% de cereais não maltados substituiria totalmente um grão para moer com base em cereais maltados.
[0011] Assim embora produzir mosto a partir da cevada tenha sido tentado desde os idos de 1960 nenhum processo de fabricação de bebida fermentada real com base na matéria prima de quantidade alta de cereais não maltados foi desenvolvido.
[0012] Considerando um desejo para reduzir os custos relacionados com a maltagem de cereais e além disso obter um mosto adequado para produzir uma cerveja comparável em características de sabor com as cervejas tradicionais, existe uma necessidade quanto a um método para obter um malte moído com base em até 100% de cereais não maltados. O processo deve ser facilmente adaptável à sistemas de fabricação de bebida fermentada usados na fabricação de bebida fermentada com base em matéria prima maltada. Assim
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 13/70 / 56 o malte moído deve ser filtrável e além disso, outros parâmetros tais como a composição de aminoácido e a quantidade de açúcares fermentáveis devem ser comparáveis ao malte moído com base nos cereais maltados correspondentes mesmo se o(s) cereal(is) é/são 100% cereal(is) não maltado(s). Finalmente, o tempo de maceração deve ser comparável com aquele da maceração de matéria prima maltada enquanto ainda retenha as boas características, por exemplo, o perfil de açúcar do malte moído e o produto de cerveja.
[0013] Assim, é um objetivo da invenção desenvolver um processo para produzir um mosto a partir de um grão para moer que compreende mais do que 70% e ainda até 100%, de cereais não maltados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0014] Surpreendentemente verificou-se que pela adição de uma combinação adequada de enzimas exógenas à combinação e pela ativação/inativação térmica de enzimas endógenas, é agora possível obter um mosto com base em até 100% de cereais não maltados, tais como a cevada. [0015] Um processo para a produção de um mosto de cervejeiro, que compreende:
a. obter um malte moído pela maceração de um grão para moer, do qual pelo menos 70% em peso são de cereal(is) não maltado(s) que compreende(m) atividade de β-amilase e do qual menos do que 30% em peso são de cereal(is) maltado(s), em uma temperatura na qual enzimas exógenas (adicionadas) e a β-amilase endógena são ativas;
b. contactar o malte moído com enzimas exógenas que compreendem:
i. uma atividade de α-amilase, ii. uma atividade de pululanase, iii. uma atividade proteolítica, e iv. uma atividade de β-glicanase;
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c. interromper a maceração e filtrar o malte moído para obter o mosto.
[0016] Em uma forma de realização preferida, o(s) cereal(is) não maltado(s) são da família Triticeae, por exemplo cevada, espelta, trigo, centeio.
[0017] Em uma outra forma de realização o(s) cereal(is) não maltado(s) são qualquer cereal(s) não maltado(s), tal(is) como mas não limitados à cevada, espelta, trigo, centeio, milho, aveia ou arroz ou qualquer mistura dos mesmos. Assim em uma outra forma de realização da invenção o grão para moer compreende uma mistura de cereais não maltados, tais como, mas não limitados a uma mistura de cevada não maltada e trigo não maltado, uma mistura de arroz não maltado e cevada não maltada.
[0018] Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um processo, onde o grão para moer compreende ainda outras fontes de carboidrato, tais como xaropes de fermentação ou qualquer mistura dos mesmos.
[0019] Em uma outra forma de realização, as enzimas exógenas da etapa b. acima compreendem ainda uma atividade de xilanase, uma atividade de lipase, e/ou uma atividade de fitase.
[0020] Em uma forma de realização preferida, a temperatura de maceração está em uma faixa que otimiza a atividade de β-amilase e reduz a atividade de lipoxigenase.
[0021] Uma forma de realização preferida da invenção diz respeito a um processo onde a pululanase é termoestável tendo uma atividade de enzima relativa acima de 60% em um período de 30 min, a 65°C e no nível de pH 5.
[0022] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um mosto produzido pelo processo da invenção. Além disso, a invenção diz respeito ao uso do mosto para a produção de cervejas de qualquer tipo, por exemplo os tipos cerveja de baixa fermentação clara e escura, os tipos cerveja de alta
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 15/70 / 56 fermentação clara e escura, cervejas de trigo, todas as cerveja porter, cerveja tipo stout, ice concentrada (por exemplo, eisbock), tipos de vinho de cevada ou happoushu.
[0023] Em um outro aspecto, o mosto produzido de acordo com a invenção compreende um ou mais aminoácidos selecionados de:
a. prolina em uma concentração a menos do que 2 mM, preferivelmente menos do que 1 mM e o mais preferivelmente menos do que 0,5 mM no mosto;
b. serina em uma concentração acima de 0,1 mM, preferivelmente acima de 0,125 mM e o mais preferivelmente acima de 0,15 mM; e
c. metionina em uma concentração acima de 0,05 mM, preferivelmente acima de 0,08 mM e o mais preferivelmente acima de 0,10 mM.
[0024] A invenção diz respeito ainda a uma mistura de enzimas que compreende:
i. uma atividade de α-amilase, ii. uma atividade de pululanase, em que a pululanase é termoestável iii. uma atividade proteolítica, e iv. uma atividade de β-glicanase;
[0025] Em uma forma de realização particular a mistura de enzimas que compreende:
i. uma atividade de α-amilase, ii. uma atividade de pululanase, iii. uma atividade proteolítica, iv. uma atividade de β-glicanase; e
v. uma atividade de xilanase.
[0026] Em uma outra forma de realização a mistura de enzimas
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 16/70 / 56 compreende ainda a atividade de lipase.
FIGURAS [0027] A Figura 1 mostra a turbidez (NTU) de um mosto produzido a partir de quantidade crescente de cevada quando apenas Ultraflo Max é exogenamente adicionada.
[0028] A Figura 2 mostra a fermentabilidade de um mosto produzido a partir de 100% de cevada não maltada ou 100% de cevada maltada. DEFINIÇÕES [0029] Por toda esta divulgação, vários termos no geral entendidos pelas pessoas habilitadas na técnica são usados. Vários termos são usados com significados específicos, entretanto e são intencionados como definidos pelo seguinte.
[0030] A expressão “maltagem” é um processo por meio do qual grãos são feitos germinar e são depois secados.
[0031] A expressão “grão maltado” é entendido como qualquer grão de cereal, em particular cevada, que foi submetido a um processo de maltagem.
[0032] A expressão “grão não maltado” é entendido como qualquer grão de cereal, em particular cevada, que não foi submetido a um processo de maltagem. Os termos não maltado e não-maltado podem ser usados intercambiavelmente no presente contexto.
[0033] A expressão “grão para moer” é entendido como o material contendo amido ou contendo açúcar que é a base para a produção de cerveja. Este pode incluir cereal maltado e não maltado assim como auxiliar.
[0034] A expressão “cereais” é entendido como grãos que são qualquer material contendo amido usado como matéria prima por exemplo para a produção de cerveja tal como, mas não limitados a, cevada, trigo, sorgo, milho, arroz, aveia e centeio. Os cereais podem ser maltados ou não maltados.A expressão “auxiliares” é usualmente entendida como matéria
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 17/70 / 56 prima que pode ser adicionada ao ingrediente principal do grão para moer, que tradicionalmente são cereais maltados. Assim visto que os grãos não maltados usualmente apenas compreendem uma pequena parte do grão para moer, os cereais não maltados são tipicamente definidos como um auxiliar junto com carboidratos líquidos tais como açúcares e xaropes. Os auxiliares podem ser sólidos ou líquidos ou ambos, onde a parte sólida pode ser cereais não maltados, tais como cevada, milho e arroz ao passo que a parte líquida pode ser de carboidratos facilmente fermentáveis tais como açúcar e xaropes.
[0035] Neste contexto, entretanto, o que seria considerado como auxiliar pode ser o ingrediente principal. Assim cereais não maltados que em um contexto tradicional são um auxiliar podem de acordo com a presente invenção compreender 100% da matéria prima.
[0036] Consequentemente, os cereais não maltados estão usualmente compreendidos na expressão auxiliar entretanto visto que os cereais não maltados preferivelmente compreendem mais do que 70% da matéria prima e os cereais maltados preferivelmente são menos do que 30% da matéria prima os termos são nestes contextos mais facilmente entendido como:
[0037] O grão para moer pode compreender cereais maltados e não maltados e auxiliares. Auxiliares são neste contexto entendidos como a parte do grão para moer que não é maltado ou cereal não maltado. Assim os auxiliares de acordo com a presente invenção são preferivelmente a parte líquida tal como xaropes de fermentação e açúcares.
[0038] Ao passo que cereais não maltados são qualquer cereal não maltado, assim qualquer grão contendo amido tal como, mas não limitado a, cevada, milho, arroz, centeio, aveia, sorgo e trigo. Consequentemente grão para moer de 100% de grãos não maltados pode compreender cevada não maltada e outros cereais não maltados que não cevada tais como arroz e trigo. [0039] Em uma outra forma de realização da invenção o grão para moer compreende uma mistura de cereais não maltados, tais como, mas não
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 18/70 / 56 limitados a uma mistura de cevada não maltada e trigo não maltado, uma mistura de arroz não maltado e cevada não maltada. Assim o grão para moer pode compreender 50% de cevada não maltada e 50% de outros cereais não maltados, tais como trigo e arroz.
[0040] Em uma forma de realização especialmente preferida da invenção o(s) cereal(is) não maltado(s) compreende(m) mais do que 70% do grão para moer e os cereais maltados compreendem menos do que 30% do grão para moer.
[0041] A expressão “malte moído” é entendida como uma pasta fluida contendo amido que compreende malte de cevada moída, outro material contendo amido, ou uma combinação destes, macerados em água para compor o mosto.
[0042] As expressões “Processo para maceração” ou perfil de maceração ou simplesmente maceração são entendidas como o processo de combinar grãos com água e aquecer a mistura com paradas em certas temperaturas para permitir que as enzimas no malte moído rompam o amido no grão em açúcares, para criar um mosto.
[0043] “Interrupção da maceração” ou extinção da maceração é quando a temperatura do malte moído é elevada. Isto libera cerca de 2% mais amido e torna o malte moído menos viscoso.
[0044] A expressão “mosto” é entendida como o líquido não fermentado que escoa a seguir da extração do grão para moer durante a maceração. Os termos mosto de cervejeiro e mosto são usados intercambiavelmente por todo o pedido.
[0045] A expressão “grãos usados” é entendido como os sólidos drenados que permanecem quando o grão para moer foi extraído e o mosto separado.
[0046] A expressão “cerveja” é aqui entendida como um mosto fermentado.
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 19/70 / 56 [0047] A expressão “produto de cerveja” é aqui entendida como compreendendo “malte moído”, “mosto”, “grãos usados” e “cerveja”.
[0048] A expressão “DP1” significa glicose.
[0049] A expressão “DP2” significa maltose.
[0050] A expressão “DP3” significa maltotriose.
[0051] Os termos “DP4+” ou “DP4/4+” significam dextrina, ou maltooligossacarídeos de um grau de polimerização de 4 ou superior.
[0052] A expressão “Fru” significa frutose.
[0053] A expressão “RDF” significa grau real de fermentação.
[0054] A expressão “FAN” significa Nitrogênio Amino Livre.
[0055] A expressão “Plato” (°P) significa gramas de extrato por 100 g de mosto (grama de extrato/100 g de mosto).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0056] Pela adição de uma combinação de enzimas exógenas, por exemplo α-amilase, isoamilase/pululanase, atividade que gera FAN (proteases) e atividades que promovem a filtrabilidade (beta-glicanase e/ou xilanase), ao malte moído e pela ativação térmica simultânea da β-amilase endógena que gera maltose, é possível obter um mosto com base em até mesmo 100% de cereal(is) não maltado(s).
[0057] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um processo para a produção de um mosto de cervejeiro, que compreende:
a. obter um malte moído pela maceração de um grão para moer, do qual pelo menos 70% em peso são de cereal(is) não maltado(s) que compreende(m) atividade de β-amilase e do qual menos do que 30% em peso são cereal(is) maltado(s), a uma temperatura na qual enzimas exógenas (adicionadas) e a β-amilase endógena são ativas;
b. contactar o malte moído com enzimas exógenas que compreendem:
i. uma atividade de α-amilase,
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 20/70 / 56 ii. uma atividade de pululanase, iii. uma atividade proteolítica, e iv. uma atividade de β-glicanase;
c. interrupção da maceração e filtração do malte moído para se obter o mosto.
[0058] Em um aspecto preferido, a invenção diz respeito a um processo, onde o grão para moer compreende pelo menos 70% em peso de cereal(is) não maltados, tal(is) como pelo menos 75% em peso, mais preferivelmente pelo menos 80% em peso, mais preferivelmente pelo menos 85% em peso, mais preferivelmente pelo menos 86% em peso, mais preferivelmente pelo menos 87% em peso, mais preferivelmente pelo menos 88% em peso, mais preferivelmente pelo menos 89% em peso, mais preferivelmente pelo menos 90% em peso, mais preferivelmente pelo menos 91% em peso, mais preferivelmente pelo menos 92% em peso, mais preferivelmente pelo menos 93% em peso, mais preferivelmente pelo menos 94% em peso, mais preferivelmente pelo menos 95% em peso, mais preferivelmente pelo menos 96% em peso, mais preferivelmente pelo menos 97% em peso, mais preferivelmente pelo menos 98% em peso, ainda mais preferivelmente 99% em peso e o mais preferivelmente 100% em peso de cereal(is) não maltado(s).
[0059] Deve ser entendido que os pelo menos 70% em peso de cereal(is) não maltado(s) podem ser um ou mais cereal(is) em que pelo menos um dos cereais contém atividade de β-amilase. Em um aspecto da invenção o grão para moer compreende menos do que 30% em peso de cereais maltados, mais preferivelmente menos do que 25% em peso, mais preferivelmente menos do que 20% em peso, mais preferivelmente menos do que 15% em peso, mais preferivelmente menos do que 10% em peso, mais preferivelmente menos do que 5% em peso de e ainda mais preferivelmente menos do que 3% em peso e o mais preferivelmente o grão para moer compreende 0% em peso
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 21/70 / 56 de cereais maltados.
[0060] Em uma forma de realização preferida, o(s) cereal(is) não maltado(s) são da família Triticeae. Preferidos dentro desta família são a cevada, espelta, trigo e centeio. Triticeae é uma família dentro da subfamília Pooideae de gramíneas que inclui os gêneros com muitas espécies domesticadas, EA Kellogg, R Appels, RJ Mason-Gamer-SYSTEMATIC BOTANY, 1996. Os gêneros de safra principais são encontrados nesta família que inclui trigo, cevada e centeio. Em uma outra forma de realização preferida o grão para moer compreende cereais não maltados outros que não da família Triticeae, tais como, mas não limitados a arroz, milho, aveia, sorgo.
[0061] Em uma outra forma de realização preferida o(s) cereal(is) não maltado(s) são selecionado(s) do grupo que compreende cevada, espelta, trigo, centeio, milho, aveia ou arroz ou qualquer mistura dos mesmos.
[0062] Assim em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um processo, onde o grão para moer compreende ainda um ou mais cereal(is) não maltado(s) adicional(is) tal(is) como grão para moer de milho, amido de milho e arroz. O grão para moer pode, portanto, compreender uma mistura de cereais não maltados, tais como mas não limitados a uma mistura de cevada não maltada e trigo não maltado ou uma mistura de arroz não maltado e cevada não maltada.
[0063] Em uma forma de realização particular preferida da invenção o cereal não maltado é cevada.
[0064] Ainda em um outro aspecto o grão para moer compreende ainda de 0 a 50% em peso de outras fontes de carboidrato, tais como xaropes de fermentação ou qualquer mistura dos mesmos.
[0065] Em uma outra forma de realização, a enzimas exógenas da etapa b. acima compreendem ainda uma atividade de xilanase, preferivelmente da família GH10 (família 10 da glicosil hidrolase) que pode melhorar a filtração de mosto e cerveja.
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 22/70 / 56 [0066] Em uma outra forma de realização, as enzimas exógenas da etapa b. acima compreendem ainda uma atividade de lipase, que pode melhorar a filtração do mosto e reduzir o turvamento.
[0067] Em uma outra forma de realização as enzimas exógenas da etapa b. acima compreendem ainda uma atividade de fitase.
[0068] Em uma outra forma de realização as enzimas exógenas da etapa b. acima compreendem ainda uma ou mais das seguintes atividades; uma atividade de xilanase, uma atividade de lipase, e/ou uma atividade de fitase.
[0069] Em uma forma de realização preferida a temperatura de maceração, isto é a temperatura na qual as enzimas exógenas (adicionadas) e a β-amilase endógena são ativas, está em uma faixa que otimiza cada uma das atividades de enzima diferentes, em cada etapa de aquecimento. O processo para maceração é preferivelmente realizado em três etapas cada uma otimizada para as enzimas diferentes. Estas etapas podem ser aludidas como paradas de enzima ou etapas de enzima.
[0070] Assim uma forma de realização especial da invenção diz respeito ao perfil de temperatura de um Processo para maceração para produzir um mosto de cervejeiro, em que
Uma primeira etapa é realizada entre 50 e 58°C, Uma segunda etapa é realizada entre 60 e 65°C, e Uma terceira etapa é realizada entre 70 e 80°C.
[0071] As enzimas diferentes no processo para maceração tanto exógenas quanto endógenas têm temperaturas ótimas diferentes e o processo para maceração pode ser conduzido em temperaturas diferentes por um certo período de tempo de modo a deixar as enzimas reagirem. Estes períodos são frequentemente aludidos como paradas de enzima.
[0072] Na primeira etapa, que seria chamada de etapa proteolítica, a temperatura está preferivelmente dentro da faixa de otimização por exemplo
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 23/70 / 56 da enzima proteolítica, a temperatura está preferivelmente entre 45°C e 58°C, tal como preferivelmente entre 46°C e 57°C, tal como preferivelmente entre 47°C e 56°C, tal como preferivelmente entre 48°C e 55°C, tal como preferivelmente entre 49°C e 54°C, tal como preferivelmente entre 50°C e 54°C, tal como preferivelmente entre 51°C e 54°C, tal como preferivelmente entre 52°C e 54°C, o mais preferivelmente entre 53°C e 54°C, tal como 54°C. [0073] Na segunda etapa a temperatura está preferivelmente dentro da faixa de otimização por exemplo das enzimas que convertem amido, tal como a β-amilase e pululanase. Esta etapa é frequentemente aludida como a etapa de sacarificação e a temperatura está preferivelmente entre 60°C e 72°C, tal como preferivelmente entre 60°C e 70°C, tal como preferivelmente entre 62°C e 68°C, tal como preferivelmente entre 63°C e 67°C, tal como preferivelmente entre 64°C e 66°C e o mais preferivelmente entre 64°C e 65°C, tal como 64°C. [0074] Na terceira etapa, que também pode ser aludida como interrupção da maceração ou extinção da maceração, esta libera cerca de 2% mais amido e torna o malte moído menos viscoso, permitindo que a cuba filtrante processe mais rápido. A temperatura da extinção da maceração é preferivelmente entre 72°C e 82°C, tal como preferivelmente entre 73°C e 81°C, tal como preferivelmente entre 74°C e 80°C, tal como preferivelmente entre 75°C e 79°C, tal como preferivelmente entre 76°C e 78°C, o mais preferivelmente a temperatura está entre 78°C e 80°C, tal como 80°C.
[0075] A lipoxigenase endógena é conhecida ser uma fonte de sabor desagradável e em uma forma de realização preferida, a temperatura de maceração, na primeira etapa de maceração aludida acima está em uma faixa que reduz a atividade da lipoxigenase com pelo menos 50%, preferivelmente 55%, preferivelmente 60%, preferivelmente 65%, preferivelmente 70%, preferivelmente 75%, preferivelmente 80%, preferivelmente 85% o mais preferivelmente 90% em relação à atividade na maceração a 54°C.
[0076] A invenção diz respeito ainda a uma mistura de enzimas que
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 24/70 / 56 compreende:
i. uma atividade de α-amilase, ii. uma atividade de pululanase, em que a pululanase é termoestável iii. uma atividade proteolítica, e iv. uma atividade de β-glicanase;
ou em uma outra forma de realização da invenção diz respeito a uma mistura de enzimas que compreende:
v. uma atividade de α-amilase, vi. uma atividade de pululanase, vii. uma atividade proteolítica, viii. uma atividade de β-glicanase; e ix. uma atividade de xilanase.
[0077] As misturas de enzima podem compreender ainda a atividade de lipase.
[0078] Os termos “mistura de enzimas” e “combinação de enzima” são usados intercambiavelmente por todo o pedido. Os termos devem ser entendidos como uma mistura ou combinação de enzimas ou atividades enzimáticas diferentes. As enzimas na mistura ou combinação podem ser adicionadas em qualquer ordem ou juntas. As enzimas se não adicionadas juntas podem ser adicionadas em qualquer ordem e não são necessariamente adicionadas na ordem listada acima.
[0079] As enzimas de acordo com a invenção podem ser adicionadas em qualquer tempo da maceração ou antes da maceração. Assim as enzimas podem ser adicionadas aos ingredientes do malte moído, por exemplo, a água e/ou o grão para moer antes, durante ou depois de formar o malte moído. As enzimas podem ser adicionadas juntas ou separadamente.
[0080] Em um aspecto preferido, a atividade de α-amilase é fornecida por uma α-amilase de origem fúngica, por exemplo de Aspergillus niger, ou
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 25/70 / 56 origem bacteriana, por exemplo Bacillus. Assim a α-amilase pode ser uma variante de α-amilase bacteriana tendo termoestabilidade aumentada no pH ácido e/ou concentração de Ca2+ baixa. Preferivelmente, a atividade de αamilase no malte moído é de 0,1 a 1,0 KNU(S)/g, mais preferivelmente de 0,2 a 0,4 KNU(S)/g e o mais preferivelmente de 0,25 a 0,35 KNU(S)/g de peso seco de cereal(is). Preferivelmente A α-amilase tem pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98% e o mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 (uma variante da α-amilase de B. stearothermophilus com as mutações I181* G182* N193F, descritas na WO99/19467 e disponível como Termoamil® SC da Novozymes A/S).
[0081] Em uma forma de realização preferida da invenção, a atividade de desramificação do amido é fornecido por uma pululanase. Em uma outra forma de realização da invenção a atividade de desramificação é fornecida por outras enzimas de desramificação, tais como, mas não limitadas a uma isoamilase ou dextrinase limitante. Em uma certa forma de realização da invenção a atividade de desramificação é fornecida por uma mistura de enzimas de desramificação, tais como, mas não limitadas a um pululanase e uma isoamilase.
[0082] Assim em uma forma de realização preferida da invenção, uma atividade da enzima pululanase (E.C. 3.2.1.41) é exogenamente fornecida e presente no malte moído. A pululanase pode ser adicionada aos ingredientes do malte moído, por exemplo, à água e/ou ao grão para moer antes, durante
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 26/70 / 56 ou depois de formar o malte moído.
[0083] As pululanases de acordo com a presente invenção são preferivelmente pululanases por exemplo de Pyrococcus ou Bacillus, tal como Bacillus acidopullulyticus por exemplo aquelas descritas em FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106, ou a pululanase está disponível da Novozymes como Promozyme 400L e tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2. A pululanase também pode ser de Bacillus naganoencis, ou Bacillus deramificans por exemplo tal como derivada de Bacillus deramificans (Patente US 5.736.375) e tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 7. A pululanase também pode ser uma pululanase engendrada, por exemplo a partir de uma cepa de Bacillus.
[0084] Outras pululanases podem ser derivadas de Pyrococcus woesei descritas na PCT/DK91/00219, ou a pululanase pode ser derivada de Fervidobacterium sp. Ven 5 descrita na PCT/DK92/00079, ou a pululanase pode ser derivada de Thermococcus celer descrita na PCT/DK95/00097, ou a pululanase pode ser derivada de Pyrodictium abyssei descrita na PCT/DK95/00211, ou a pululanase pode ser derivada de Fervidobacterium pennavorans descrita na PCT/DK95/00095, ou a pululanase pode ser derivada de Desulforococcus mucosus descrita na PCT/DK95/00098.
[0085] O mais preferivelmente a pululanase é derivada de Bacillus acidopullulyticus. Uma enzima de pululanase preferida a ser usada nos processos e/ou composições da invenção é uma pululanase tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 55%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 65%, tal como pelo menos 66%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos
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95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% ou ainda 100% idêntica à sequência mostrada na SEQ ID NO: 8 (NS26062, PulC, de Bacillus acidopullulyticus); em particular quando alinhada usando o Programa Needle usando Matrix: BLOSUM62; Penalidade de início de intervalo : 10,0; Penalidade de extensão de intervalo: 0,5; Matriz de Identidade Isenta de Intervalo. Os termos Pul C, NS26062 e pululanase C são usados intercambiavelmente por todo o pedido. [0086] A pululanase é adicionada na dosagem de 0,1 a 3 PUN/g DM, tal como de 0,2 a 2,9, tal como de 0,3 a 2,8, tal como de 0,3 a 2,7 tal como de 0,3 a 2,6 tal como de 0,3 a 2,5 tal como de 0,3 a 2,4, tal como de 0,3 a 2,3, tal como de 0,3 a 2,2, tal como de 0,3 a 2,1, tal como de 0,3 a 2,0, tal como de 0,3 a 1,9, tal como de 0,3 a 1,8, tal como de 0,3 a 1,7, tal como de 0,3 a 1,6, o mais preferivelmente a pululanase é adicionada em dosagem tal como de 0,3 a 1,5, preferivelmente de 0,4 a 1,4, mais preferivelmente de 0,5 a 1,3, mais preferivelmente de 0,6 a 1,2, mais preferivelmente de 0,7 a 1,1, mais preferivelmente de 0,8 a 1,0, mais preferivelmente de 0,9 a 1,0. Em uma forma de realização particular da invenção a enzima é adicionada em 0,3 PUN/g de DM, tal como 0,4 PUN/g de DM, tal como 0,5 PUN/g de DM em uma forma de realização particularmente preferida da invenção a dose de enzimas não é maior do que 1 PUN/g de DM. Preferivelmente a atividade de isoamilase e/ou pululanase no malte moído é de 0,1 a 2,0 PUN/g, mais preferivelmente de 0,5 a 1,0 PUN/)/g de peso seco de cereal(is).
[0087] A atividade relativa das enzimas de desramificação, tais como as pululanases, pode variar consideravelmente em temperaturas diferentes por exemplo como demonstrado no exemplo 2 do pedido. As enzimas de desramificação estão trabalhando juntas com as outras enzimas no malte moído, em particular a β-amilase, que é usualmente endógena e a α-amilase que pode ser endógena ou exogenamente adicionada. Assim uma enzima de desramificação preferida de acordo com a invenção é uma enzima tendo alta
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 28/70 / 56 atividade de enzima relativa na faixa de temperatura na qual tanto a β-amilase quanto a α-amilase são ativas. A α-amilase é usualmente ativa em uma temperatura mais alta do que a β-amilase e a etapa de sacarificação do processo para maceração, a etapa onde o amido é convertido em açúcares fermentáveis pela α-amilase, β-amilase e uma enzima de desramificação, é preferivelmente conduzida em uma temperatura alta, tal como pelo menos 63°C. Assim a enzima de desramificação de acordo com a invenção é preferivelmente termoestável e termoativa. Os termos “termoestável” e “termoativa” são usados intercambiavelmente por todo o pedido.
[0088] Neste contexto uma enzima termoestável é uma enzima tendo uma atividade de enzima relativa acima de 60% medida em um período de 30 min, a 65°C e no nível de pH 5.
[0089] A atividade relativa, que neste contexto é a atividade de enzima relativa, é calculada ajustando-se a atividade mais alta a 100% (máxima) e ajustando as atividades em outras temperaturas em relação à máxima da temperatura.
[0090] Assim preferivelmente a enzima de desramificação é uma pululanase e ainda mais preferivelmente a atividade da pululanase é fornecida por uma pululanase que é termoestável tendo uma atividade de enzima relativa acima de 60% em um período de 30 min, a 65°C e ao nível de pH 5. Um exemplo de uma pululanase termoestável é dada no exemplo 2.
[0091] Em uma forma de realização a atividade de enzima relativa da pululanase está acima de 60%, tal como acima de 61%, tal como acima de
62%, tal como acima de 63%, tal como acima de 64%, tal como acima de
65%, tal como acima de 66%, tal como acima de 67%, tal como acima de
68%, tal como acima de 69%, tal como acima de 70%, tal como acima de
71%, tal como acima de 72%, tal como acima de 73%, tal como acima de
74%, tal como acima de 75%, tal como acima de 76%, tal como acima de
77%, tal como acima de 78%, tal como acima de 79%, tal como acima de
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80%, tal como acima de 81%, tal como acima de 82%, tal como acimade
83%, tal como acima de 84%, tal como acima de 85%, tal como acimade
86%, tal como acima de 87%, tal como acima de 88%, tal como acimade
89%, tal como acima de 90%, tal como acima de 91%, tal como acimade
92%, tal como acima de 93%, tal como acima de 94%, tal como acimade
95%, tal como acima de 96%, tal como acima de 97%, tal como acimade
98%, tal como acima de 99% e ainda 100% a 65°C, quando medida em um período de 30 minutos, no pH 5,0.
[0092] Em uma forma de realização particular preferida da invenção uma pululanase termoestável tem uma atividade de enzima relativa acima de 80% em um período de 30 min, a 65°C e no nível de pH 5.
[0093] Em uma certa forma de realização a pululanase tem acima de
80%, tal como acima de 85%, tal como acima de 90% tal como acima de 95%, ou ainda 100% de atividade de enzima remanescente em um período de 30 min sob as condições de maceração com 12°P de cevada, na temperatura de gelatinização da cevada não maltada e no pH na faixa de 5,6 a 6,2, comparada com a atividade antes da incubação na temperatura de gelatinização da cevada não maltada.
[0094] Em uma outra forma de realização a atividade de protease é fornecida por um sistema de enzimas proteolíticas tendo uma atividade de geração de FAN adequada que inclui endo-proteases, exopeptidases ou qualquer combinação destas, preferivelmente uma metalo-protease. Preferivelmente a atividade de protease no malte moído é de 0,0005 a 0,002 AU/g, mais preferivelmente de 0,001 a 0,0015 AU/g de peso seco do(s) cereal(is). Preferivelmente, a protease tem pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 30/70 / 56 pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95% mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97% mais preferivelmente pelo menos 98% e o mais preferivelmente pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 (uma metalo-protease de Bacillus amiloliquefaciens, descrita na WO9967370, disponível como Neutrase® da Novozymes A/S).
[0095] Em uma outra forma de realização, a atividade de β-glicanase (E.C. 3.2.1.4.) é adicionada ao malte moído. Preferivelmente a atividade de βglicanase no malte moído é de 0,1 a 1,5 FBG/g, tal como de 0,2 a 1,2 FBG/g, tal como de 0,4 a 1,0 FBG/g, tal como de 0,5 a 1,0 FBG/g de peso seco do(s) cereal(is). A β-glicanase também é chamada de celulase e pode ser de origem fúngica ou bacteriana. Tal como de Aspergillus orzyae, Aspergillus niger ou de bacilo tal como B subtilis. A atividade de β-glicanase adicionada também pode originar do malte. Em uma forma de realização particular preferida da invenção a β-glicanase é adicionada junta com a xilanase em uma combinação de enzima chamada de Ultraflo Max. Ultraflo Max é uma combinação de enzima de Xilanase e β-glicanase, a combinação está descrita no pedido WO2005/059084 A1.
[0096] Em uma outra forma de realização, a atividade de xilanase é fornecida por uma xilanase da família 10 da glicosil hidrolase. Preferivelmente a atividade de xilanase no malte moído é de 0,02 a 0,1 FXUS/g, mais preferivelmente de 0,04 a 0,08 FXU-S/g de peso seco do(s) cereal(is). Preferivelmente, a xilanase tem pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94% mais preferivelmente
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 31/70 / 56 pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97% mais preferivelmente pelo menos 98% e o mais preferivelmente pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4 (descrita na WO 94/21785, disponível como Shearzyme® da Novozymes A/S).
[0097] Em uma outra forma de realização, a atividade de lipase é fornecida por uma lipase tendo atividade para triglicerídeos e/ou galactolipídeos e/ou fosfolipídeos. Preferivelmente, a atividade de lipase é fornecida por uma lipase de Fusarium (que inclui F. oxysporum e F. heterosporum), Aspergillus (que inclui A. tubigensis), Rhizopus (que inclui R. oryzae) ou Thermomyces (que inclui T. lanuginosus) ou uma variante destes. Um exemplo é Lipopan X (Lipopan Xtra), uma variante da lipase de Thermomyces lanuginosus com as substituições G91A +D96W +E99K +P256V +G263Q +L264A +I265T +G266D +T267A +L269N +270A +271G +272G +273F (+274S), descrita na WO2004099400A2. Preferivelmente, a lipase tem pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97% mais preferivelmente pelo menos 98% e o mais preferivelmente pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade com os resíduos de 1 a 316 ou de 1 a 273 da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 5 (lipase/fosfolipase de Fusarium oxysporum, descritas na EP 869167, disponíveis da Novozymes A/S como Lipopan® F). Preferivelmente, a atividade de lipase no malte moído é de 0 a 50 LU/g, tal como de 0 a 40 LU/g, tal como de 0 a 30 LU/g, tal como de 0 a 20 LU/g de peso seco do(s) cereal(is). Em uma forma de realização
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 32/70 / 56 especialmente preferida da invenção a lipase é a Lipozyme TL ou lipolase, esta lipase tem um efeito significantemente bom sobre a velocidade de filtração e redução da turvação. Assim em uma forma de realização especialmente preferida da invenção a lipase tem pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97% mais preferivelmente pelo menos 98% e o mais preferivelmente pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9. A lipase também pode ser Lipex, uma variante da Lipozyme tendo pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98% e o mais preferivelmente pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 10. As lipases degradam o lipídeo da cevada por exemplo os triglicerídeos em glicerídeos parciais e ácidos graxos livres. Isto leva a uma turbidez mais baixa e filtração do malte moído e propriedades da filtração muito melhorada.
[0098] Em uma outra forma de realização, a atividade de fitase é fornecida por uma fitase de Aspergillus niger, Peniophora ou Citrobacter. Preferivelmente, a atividade de fitase no malte moído é de 0 a 5 FYT/g, mais preferivelmente de 0,5 a 1,5 FYT/g de peso seco do(s) cereal(is). Preferivelmente, a fitase tem pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 33/70 / 56 preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98% e o mais preferivelmente pelo menos 99% ou ainda 100% de identidade com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 6 (uma variante da fitase de Peniophora lycii, descrita na WO 2003/066847).
[0099] Em alguma forma de realização da invenção Flavourzyme é adicionada. Flavourzyme é uma composição de enzima obtida a partir de uma cepa de A. oryzae NN000562 originalmente obtida como ATCC 20386. FLAVOURZYME contém atividades de protease alcalinas e ácidas.
[00100] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um mosto produzido pelo processo da invenção.
[00101] Além disso, a invenção diz respeito ao uso do mosto para a produção de cervejas de qualquer tipo, por exemplo, os tipos cerveja de baixa fermentação clara e escura, tipos cerveja de alta fermentação clara e escura, cervejas de trigo, todas as cerveja porter, cerveja tipo stout, ice concentrada (por exemplo eisbock), tipos de vinho de cevada ou happoushu.
[00102] Os componentes contendo nitrogênio são componentes importantes do mosto porque eles afetam o caráter da cerveja, tal como o sabor e o padrão de fermentação. Os compostos contendo nitrogênio são nutrientes importantes para a levedura com a exceção de prolina que é dificilmente assimilada pela levedura assim é favorável ter uma quantidade pequena de prolina ou nenhuma prolina no mosto. Assim em um outro aspecto, o mosto compreende um ou mais aminoácidos selecionados de
a. prolina em uma concentração a menos do que 2 mM, preferivelmente menos do que 1 mM e o mais preferivelmente menos do que 0,5 mM no mosto;
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b. serina em uma concentração acima de 0,1 mM, preferivelmente acima de 0,125 mM e o mais preferivelmente acima de 0 a 15 mM; e
c. metionina em uma concentração acima de 0,05 mM, preferivelmente acima de 0,08 mM e o mais preferivelmente acima de 0,10 mM.
[00103] Assim em um aspecto a concentração de prolina está abaixo de 2 mM, tal como abaixo de 1,5 mM, tal como abaixo de 1 mM, tal como abaixo de 0,5 mM, tal como abaixo de 0,25 mM.
[00104] Em um outro aspecto a concentração de serina está acima de 0,1 mM, tal como 0,125 mM, tal como 0,15 mM, tal como 0,2 mM.
[00105] Em um outro aspecto a concentração de metionina está acima de 0,005 mM, tal como 0,008 mM, tal como 0,1 mM, tal como 0,125 mM, tal como 0,15 mM.
[00106] Verificou-se que mesmo com quantidades muito altas por exemplo acima de 80% de cereais não maltados tais como cevada não maltada um mosto pode ser produzido que tem uma alta quantidade de açúcares fermentáveis, que neste contexto é DP1-DP3 (glicose, maltose e maltotriose) e em um aspecto particular preferido da invenção a quantidade de maltose é alta comparada com a quantidade de glicose, que é favorável porque a mesma previne a pressão osmótica na levedura e regula a produção de éster e portanto o perfil de sabor e aroma da cerveja final.
[00107] Assim um aspecto da invenção diz respeito a um mosto, onde a concentração de maltose está acima de 45%, preferivelmente acima de 50%,
| preferivelmente | acima | de | 55%, | preferivelmente | acima | de | 56%, |
| preferivelmente | acima | de | 57%, | preferivelmente | acima | de | 58%, |
| preferivelmente | acima | de | 59%, | preferivelmente | acima | de | 60%, |
| preferivelmente | acima | de | 61%, | preferivelmente | acima | de | 62%, |
| preferivelmente | acima | de | 63%, | preferivelmente | acima | de | 64%, |
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 35/70 / 56 preferivelmente acima de 65%, o mais preferivelmente a concentração de maltose está acima de 70% da concentração total de carboidratos.
[00108] Em um outro aspecto a invenção diz respeito a um mosto onde a concentração de glicose está abaixo de 10%, preferivelmente abaixo de 9%, preferivelmente abaixo de 8%, preferivelmente abaixo de 7%, preferivelmente abaixo de 6%, preferivelmente abaixo de 5% o mais preferivelmente abaixo de 4%.
[00109] Ainda um outro aspecto da invenção diz respeito a um mosto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes onde a
| concentração total da glicose, maltose e maltotriose está acima de 50%, | |||||||
| preferivelmente | acima | de | 55%, | preferivelmente | acima | de | 60%, |
| preferivelmente | acima | de | 61%, | preferivelmente | acima | de | 62%, |
| preferivelmente | acima | de | 63%, | preferivelmente | acima | de | 64%, |
| preferivelmente | acima | de | 65%, | preferivelmente | acima | de | 66%, |
| preferivelmente | acima | de | 67%, | preferivelmente | acima | de | 68%, |
| preferivelmente | acima | de | 69%, | preferivelmente | acima | de | 70%, |
| preferivelmente | acima | de | 71%, | preferivelmente | acima | de | 72%, |
| preferivelmente | acima | de | 73%, | preferivelmente | acima | de | 74%, |
| preferivelmente | acima | de | 75%, | preferivelmente | acima | de | 76%, |
| preferivelmente | acima | de | 77%, | preferivelmente | acima | de | 78%, |
| preferivelmente | acima | de 79% e | preferivelmente | acima de | 80% da |
concentração total de carboidratos.
[00110] RDF (Grau real de fermentação) é calculado como RDF% = 100*(OE% P-ER%)/OE% P onde OE significa Extrato Original em%P e ER significa% P de Extrato Real medido por um densitômetro (referência da Analytica EBC). Assim em um aspecto da invenção o RDF no mosto é mais do que 60%, tal como pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 76%, tal como pelo menos 77%, tal como pelo menos 78%, tal como pelo menos 79%, tal como pelo menos 80%,
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 36/70 / 56 tal como pelo menos 81%, tal como pelo menos 82%, tal como pelo menos 83%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 86%, tal como pelo menos 87%, tal como pelo menos 88%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, tal como pelo menos 100%.
[00111] Algumas cervejarias adicionam xarope de fermentação, por exemplo xarope de fermentação com alto teor de maltose ao tacho de mosto que pode aumentar a quantidade de açúcares fermentáveis. Entretanto, embora o xarope de fermentação possa ser adicionado de acordo com a invenção isto não é necessário para aumentar a quantidade de açúcares fermentáveis ou RDF.
[00112] Em uma outra forma de realização a invenção diz respeito a um processo, em que a razão de maltose:glicose no mosto é mais alta do que 5:1, tal como mais alta do que 6:1, tal como mais alta do que 7:1, preferivelmente mais alta do que 8:1, preferivelmente mais alta do que 9:1, preferivelmente mais alta do que 10:1, preferivelmente mais alta do que 11:1 em uma forma de realização particular preferida a razão de maltose:glicose no mosto é mais alta do que 12:1.
[00113] Durante o processo para maceração o amido é degradado em açúcares fermentáveis e não fermentáveis e o material proteináceo é convertido aos aminoácidos livres que são usados pela levedura. De acordo com a invenção a matéria prima usada para a maceração pode ser de até 100% de cereais não maltados, tail como cevada não maltada, sem reduzir a fermentabilidade do mosto ou reduzir a quantidade de aminoácidos disponíveis para a levedura.
[00114] Além disso, a fabricação de bebida fermentada a partir de
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 37/70 / 56 cereais não maltados pode dar problemas com filtrabilidade devido ao excesso de amido não convertido e β-glicano ou xilano, que também podem causar a turvação da cerveja. A adição de enzimas que auxiliam a filtração tais como β-glicanase pode aumentar a filtrabilidade do mosto. Entretanto, quando o cereal não maltado compreende a parte principal do grão para moer, a βglicanase sozinha não é suficiente para fornecer mosto filtrável.
[00115] Surpreendentemente verificou-se que a adição de enzimas exógenas de acordo com a invenção, que compreendem atividade de αamilase, atividade de pululanase, atividade proteolítica, atividade de lipase e atividade de β-glicanase, ao malte moído preparado a partir de um grão para moer que compreende pelo menos 70% de cereal(is) não maltado(s) produziu um mosto que é comparável ou ainda melhor com respeito a por exemplo FAN, açúcares fermentáveis (DP1-DP3) e que é filtrável e também têm uma turbidez aceitavelmente baixa quando comparado a um mosto produzido a partir de um grão para moer maltado.
[00116] O tempo de cuba filtrante, o tempo que se leva para filtrar o malte moído na cuba filtrante, se esta estiver em um vaso separado, é influenciado por exemplo pela turbidez. Assim em um certo aspecto da invenção o mosto é filtrável e tem uma baixa turbidez e em uma forma de realização da invenção a turbidez está abaixo de 20 NTU (As unidades de turbidez de um nefelômetro calibrado, Unidades de Turbidez Nefelométrica), tal como abaixo de 19 NTU, tal como abaixo de 18 NTU, tal como abaixo de 17 NTU, tal como abaixo de 16 NTU, tal como abaixo de 15 NTU, tal como abaixo de 14 NTU, tal como abaixo de 13 NTU, tal como abaixo de 12 NTU, tal como abaixo de 11 NTU, tal como abaixo de 10 NTU.
[00117] Um modo de aumentar a quantidade de açúcares fermentáveis é aumentando-se o tempo de maceração por exemplo aumentando-se a etapa de sacarificação. Entretanto, em um outro aspecto importante da invenção o tempo de maceração necessário para produzir um mosto que é altamente
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 38/70 / 56 fermentável não é aumentado comparado com o tempo de maceração para produzir um mosto igualmente fermentável com base na mesma quantidade de malte.
[00118] Isto é surpreendente visto que no geral tempo de maceração mais longo é necessário quando o malte moído está fundamentado em altas quantidades de cereais não maltados por exemplo 70% de cevada para dar a mesma fermentabilidade e FAN como em um mosto produzido com quantidades correspondentes (70%) de malte.
[00119] Assim em uma forma de realização particular da invenção o processo para maceração é completado dentro de 160 minutos, preferivelmente dentro de 120 minutos.
[00120] Em uma forma de realização da invenção o processo para maceração que compreende todas as paradas de enzimas e todas as etapas de aquecimento, é completada dentro de 180 minutos, tal como dentro de 170 minutos, tal como dentro de 160 minutos, tal como dentro de 155 minutos, tal como dentro de 150 minutos, tal como dentro de 145 minutos, tal como dentro de 140 minutos, tal como dentro de 135 minutos, tal como dentro de 130 minutos, tal como dentro de 125 minutos, tal como dentro de 120 minutos, tal como dentro de 115 minutos, tal como dentro de 110 minutos, tal como dentro de 105 minutos, tal como dentro de 100 minutos, tal como dentro de 95 minutos, tal como dentro de 90 minutos, tal como dentro de 85 minutos, tal como dentro de 80 minutos, tal como dentro de 75 minutos, tal como dentro de 70 minutos, tal como dentro de 65 minutos, tal como dentro de 60 minutos.
[00121] Quando o malte é substituído com grãos tais como arroz e milho o grão para moer pode necessitar ser tratado pela decocção ou maceração de decocção ou decocção auxiliar, que é o processo onde uma proporção dos grãos são fervidos separadamente com α-amilase termoestável e depois retornados para o malte moído. Este processo é frequentemente
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 39/70 / 56 necessário para estes tipos de grãos visto que a temperatura de gelatinização é mais alta do que para a cevada, malte e por exemplo trigo. Assim a prégelatinização é necessária para tornar o amido acessível a todas as enzimas endógenas e adicionadas necessárias. O processo também pode ser usado para dar um sabor maltoso à cerveja.
[00122] Os cereais não maltados, tais como a cevada mostram um comportamento geral diferente na moagem do que os cereais maltados, como um exemplo a cevada tem teor de água mais alto, não é modificada e é muito mais dura do que o malte.
[00123] Para conduzir uma cuba filtrante com malte e obter um desempenho aceitável (rendimento e tempo de cuba filtrante) uma certa composição de grão para moer é necessária, a composição do grão para moer pode ser medida por um teste de peneiramento.
[00124] A composição do grão para moer fabricado pelos moinhos de rolo são principalmente influenciados pelo intervalo entre o(s) par(es) de rolo (moinho de dois rolos = um par, moinho de quatro rolos = dois pares). O primeiro par tem sempre uma abertura mais ampla do que o segundo. De modo a obter um desempenho de cuba filtrante comparado com um grão para moer fabricado de malte os inventores mudaram, este(s) intervalo (s) de rolo.
[00125] Verificou-se que um moinho de quatro rolos e um moinho de seis rolos (três pares) pode moer com intervalos de rolo ajustados são bem adequados para moer a cevada em grão para moer utilizável. Isto é importante visto que um bom desempenho de cuba filtrante apenas pode ser obtido com uma composição do grão para moer otimizada que é diferente da composição ótima do grão para moer de malte.
[00126] O teste de peneira foi realizado de acordo com o teste de peneiramento descrito em Anger, H.: MEBAK Band Rohstoffe. 1. Auflage Brautechnische Analysenmetoden. 2006, Freising: Selbstverlag der MEBAK.
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Tabela 1
Cevada moída comparada ao malte
| Cevada | Malte | |
| Peneira 1 | 25% | 18% |
| Peneira 2 | 15% | 8% |
| Peneira 3 | 38% | 33% |
| Peneira 4 | 10% | 21% |
| Peneira 5 | 3% | 10% |
| Fundo | 9% | 11% |
[00127] Os resultados mostram que para um desempenho de cuba filtrante com 100% de cevada bem sucedido, grão para moer mais grosso com mais foco na peneira 1-3 leva a um bom desempenho de cuba filtrante. Também pode ser observado que o grão para moer de cevada é significantemente diferente do grão para moer de malte.
EXEMPLOS:
MATERIAIS E MÉTODOS
Enzimas
Atividade de alfa-amilase (KNU) [00128] A atividade amilolítica pode ser determinada usando-se amido de batata como substrato. Este método está fundamentado na decomposição de amido de batata modificado pela enzima e a reação é seguida misturandose as amostras da solução de amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente, uma cor azul escuro é formada, entretanto, durante a decomposição do amido a cor azul fica mais fraca e gradualmente vira para marrom avermelhado, que é comparada com um padrão de vidro colorido.
[00129] Uma Unidade de Quilo Novo de alfa amilase (KNU) é igual a 1000 NU. Um KNU é definido como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é a 37°C +/- 0,05; 0,0003 M de Ca2+; e pH 5,6) converte 5,26 g de substância seca de amido (Merck Amilum solubile) em dextrinas suficientemente pequena para não fazer uma reação de cor com o iodo
Atividade de desramificação (PUN)
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 41/70 / 56 [00130] A atividade de pululanase pode ser determinada em relação a um substrato de pululano. Pululano é um polímero de D-glicose linear que consiste substancialmente de unidades de maltotriosila unidas por ligações 1,6-alfa. As endopululanases hidrolisam as ligações 1,6-α aleatoriamente, liberando maltotriose, 63-alfa-maltotriosil-maltotriose, 63-alfa-(63-alfamaltotriosil-maltotriosil)-maltotriose, etc. o número de ligações hidrolisadas é determinado como carboidrato redutor usando um método de SomogyiNelson modificado.
[00131] Uma unidade de pululanase (PUN) é a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é depois de 30 minutos de tempo de reação a 40°C e pH 5,0; e com 0,2% de pululano como substrato) hidrolisa pululano, liberando carboidrato redutor com um poder de redução equivalente a 1 micromol de glicose por minuto.
Atividade proteolítica (AU) [00132] A atividade proteolítica pode ser determinada usando-se hemoglobina desnaturada como substrato. No método da Hemoglobina de Anson para a determinação da atividade proteolítica, a hemoglobina desnaturada é digerida e a hemoglobina não digerida é precipitada com ácido tricloroacético (TCA). A quantidade do produto de TCA solúvel é determinada usando-se o reagente de fenol, que dá uma cor azul com tirosina e triptofano.
[00133] Uma Unidade de Anson (AU) é definida como a quantidade de enzima que sob condições padrão (isto é 25°C, pH 7,5 e 10 min. De tempo de reação) digere a hemoglobina a uma taxa inicial tal que seja liberada uma quantidade de produto de TCA solúvel por minuto que dê a mesma cor com o reagente de fenol como um miliequivalente de tirosina.
Atividade de β-glicanase (FBG) [00134] Uma unidade fúngica de beta glicanase (FBG) é a quantidade de enzima, que, de acordo com as condições padrão esboçadas abaixo, libera
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 42/70 / 56 oligossacarídeos redutíveis ou reduz carboidrato com uma capacidade de redução equivalente a 1 mol de glicose por minuto.
[00135] A beta glicanase fúngica reage com beta glicano durante o processo de formação da glicose ou carboidrato redutor que é determinado como açúcar redutor de acordo com o método de Somogyi Nelson.
[00136] A amostra deve ser diluída para dar uma atividade entre 0,02~0,10 FBG/ml. As condições padrão de reação são: Substrato: 0,5% de beta glicano da cevada, temperatura: 30o C, pH: 5,0 e o tempo de reação 30 min.
[00137] Entretanto a atividade celulítica no produto comercial é medida em unidades de endo-glicanase (EGU), que pode ser convertida para FBG. Para celluclast a EGU pode ser convertida para FBG multiplicando-se a EGU por um fator de 3,2.
Xilanase (FXU(S)) [00138] A atividade xilanolítica pode ser expressada em unidades de FXU(S), determinada no pH 6,0 com remazol-xilano (4-O-metil-D-glicuronoD-xilano tingido com Azul Brilhante de Remazol R, Fluka) como substrato.
[00139] Uma amostra de xilanase é incubada com o substrato de remazol-xilano. A base de substrato de corante não degradado é precipitado pelo etanol. A cor azul remanescente no sobrenadante (como determinado espectrofotometricamente a 585 nm) é proporcional à atividade de xilanase e as unidades de xilanase são depois determinadas relativamente a um padrão de enzima nas condições padrão de reação, isto é Concentração de substrato 0,45% p/v, Concentração de enzima 0,04 a 0,14 FXU(S)/mL a 50,0°C, pH 6,0 e em tempo de reação de 30 minutos. A atividade de xilanase em FXU(S) é medida em relação a um padrão de enzima FXU(S) da Novozymes (obtenível da Novozymes), que compreende a preparação de xilanase de monocomponente Shearzyme de Aspergillus aculeatus.
Lipase (LU)
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 43/70 / 56 [00140] Uma Unidade de Lipase (LU) é a quantidade de enzima que libera 1 micromol de ácido butírico titulável por minuto a 30,0°C; pH 7,0; com Goma Arábica como emulsificador e tributirina como substrato.
Fitase (FYT) [00141] Uma unidade de fitase (FYT) é a quantidade de enzima que libera 1 micro-mol de orto-fosfato inorgânico por min. sob as seguintes condições: pH 5,5; temperatura 37°C; substrato: fitato de sódio (C6H6O24P6Na12) a uma concentração de 0,0050 mol/l.
Unidade de Leucina Amino Peptidase (LAPU) [00142] 1 unidade de Leucina Amino Peptidase (LAPU) é a quantidade de enzima, que decompõem 1 micro-M de substrato por minuto nas seguintes condições: 26 mM de L-leucina-p-nitroanilida como substrato, 0,1 M de tampão de Tris (pH 8,0), 40°C, tempo de reação de 10 minutos.
Método de maceração em laboratório [00143] A menos que de outro modo estabelecido, o método de maceração usado nos exemplos foi realizado como segue:
[00144] Primeiro, a cevada é moída até grão para moer fino (Bühler Unirvisale gab 0,2 mm), depois 50 g de cevada moída são adicionados a um copo de maceração e 200 g de água pré-aquecida (com cloreto de cálcio) são adicionados. O copo é colocado no banho de maceração (Lochner LB 12 Electronic com 12 copos), o diagrama de maceração é ajustado (por exemplo maceração a 50°C ou 54°C, manter a temperatura por 20 a 30 minutos, aumentar em 1°C/minuto até 64°C, manter por 40 a 60 minutos, aumentar em 1°C/minuto até 78 ou 80°C, manter por 10 a 20 minutos e reduzir a temperatura para 20°C). A solução de enzima é adicionada no início aos copos e a maceração é iniciada dando um período de maceração total de 140 a 160 minutos. Depois da maceração água é adicionada em um total de 300 g no copo e o malte moído é filtrado com um filtro Whatman 597 1/2 (Schleicher & Schuell) dobrado para se obter o mosto, onde depois o mosto
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 44/70 / 56 pode ser analisado.
[00145] As concentrações de açúcar/dextrina (carboidrato) do mosto foram analisadas em um sistema Waters HPLC (método da Novozymes: 345SM-2004,01/01) com pré-coluna (refil de Cátion H cat. 1250129) duas colunas BoiRad Aminex HPX 87 H aquecida a 60°C e fluxo de 0,4 ml/minuto com detecção RI (detector Waters 2410 RI).
[00146] RDF: Grau Real de Fermentação, foi determinado pelo método descrito no método MEBAK: 2,9,2. Principal: Redução de matéria seca do mosto, em%, pela fermentação a álcool e CO2 [00147] NTU: A turvação no mosto foi analisada pelo método MEBAK 2,15,1 [00148] No geral as doses de enzima são calculadas como segue:
[00149] Dosagem de enzima na dosagem alvo
| Enzima | Dosagem alvo/ g dm | Atividade específica | g de proteína enzimática (EP)/ 1000 kg dm de cevada. |
| Termoamil SC | 0,3 KNU(S)/g | 43 KNU(S)/mg | 6,98 g |
| Ultraflo Max | 300 ppm | 4000 EGU/g de proteína total | 52,5 g |
| 30 FXU/mg | 2,5 g | ||
| Pululanase NS26062 | 1,0 PUN/g | 57 PUN(G)/mg | 17,54 g |
| Neutrase | 0,001 AU/g | 60 AU/g | 33,3 g |
| Lipozyme TL | 20 LU/g | 6100 LU/mg | 3,28 g |
Exemplo 1 [00150] O propósito deste exemplo foi selecionar a pululanase mais adequada para a produção de mosto com base em RDF e DP2 (maltose). Um grão para moer que compreende 100% de cevada não maltada foi preparado como descrito acima.
[00151] A todos os copos foram depois adicionados 50 ppm de Na2SO3 e as enzimas:
α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g, β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max/Viscoflow XL): 300 ppm,
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Protease (Neutrase 0,8 ) 0,002 AU/g, Flavourzyme® 1000 L: 0,1 LAPU/g, e Pululanase como descrita na Tabela 2:
[00152] A maceração foi realizada e aos copos foi adicionada água municipal em um total de 300 g depois da maceração. O malte moído foi filtrado e os resultados na Tabela 1 abaixo foram obtidos analisando-se o mosto:
Tabela 1 100% cevada: RDF,% e açúcar de mosto.
| Dosagem de Enzima PUN/g | DP2 % do total | DP4+ % do total | RDF % | |
| - | 0,00 | 48,7 | 33,2 | 62,0 |
| Promozyme | 0,1 | 49,4 | 31,6 | 64,0 |
| Promozyme | 0,2 | 49,7 | 30,6 | 65,0 |
| Promozyme | 0,3 | 50,3* | 29,6* | 65,8* |
| Promozyme | 0,5 | 51,6 | 27,6 | 67,0 |
| - | 0,00 | 48,7 | 33,2 | 62,0 |
| NS26062 | 0,1 | 50,0 | 30,2 | 64,6 |
| NS26062 | 0,2 | 50,8 | 28,4 | 66,1 |
| NS26062 | 0,3 | 51,3* | 27,3* | 67,3* |
| NS26062 | 0,5 | 52,4 | 25,0 | 69,5 |
* Estimado pela regressão linear [00153] O RDF está acima de 60% para ambas as pululanases, entretanto RDF é mais alto quando NS26062 (PUL C) é adicionada. A quantidade de maltose (DP2) em relação à quantidade de dextrinas (DP4) também foi mais alta para ambas as pululanase mas novamente a quantidade de maltose em relação às dextrinas são mais altas para NS26062 (PUL C). Assim em conclusão: a NS26062 (pululanase C ou PulC) mostrou o melhor desempenho, comparado com Promozyme (promozyme 400 L) na atividade PUN, em RDF% e geração de maltose (DP2). Neste experimento a vantagem da NS26062 termoestável (pululanase C ou PULC) é claramente demonstrada.
Exemplo 2 [00154] O seguinte exemplo demonstra a temperatura ótimo diferente e a atividade relativa em temperaturas diferentes. A atividade de enzima
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 46/70 / 56 relativa de três pululanases diferentes foi analisada. O método de analisar a atividade de pululanase é pela detecção da capacidade de reduzir açúcar aumentada (reação de Somogyi-Nelson) nas seguintes condições:
Substrato: 0,2% de pululano, pH 5,0, tempo de reação 30 minutos, interrupção da reação enzimática pela adição do reagente de cobre de Somogyi, seguido pelo reagente de cor de Nelson e ferver em 20 minutos. [00155] A amostras foram incubadas a 30°C, 45°C, 55°C, 60°C, 62,5°C, 65°C e 70°C em 30 minutos. As amostras foram analisadas pelo espectrofotômetro na OD520 nm e a diferença entre a amostra e o branco (aumentou pela atividade de enzima) foi usada no cálculo dos resultados. [00156] A atividade mais alta foi ajustada a 100% (máximo) e as atividades em outras temperaturas ajustadas em relação à temperatura máxima.
Tabela 2 Atividade relativa de pululanases diferentes em temperaturas diferentes
| Temperatura em 30 minutos | PulC/NS26062% | Promozyme 400 L% | Promozyme D2/ Optimax 1000 L% |
| 30°C | 19,7 | 20,1 | 34,4 |
| 45°C | 47,3 | 56,8 | 68,1 |
| 55°C | 76,8 | 100,0 | 100,0 |
| 60°C | 86,8 | 87,9 | 80,0 |
| 62,5°C | 92,8 | 76,9 | 58,4 |
| 65°C | 100,0 | 37,2 | 51,1 |
| 70°C | 75,6 | 8,3 | 11,9 |
[00157] Este exemplo claramente demonstra que Pul C é a mais termoestável e termoativa das três pululanase visto que ela tem uma atividade mais alta significante relativa acima de 62,5°C e visto que a atividade mais alta medida em 30 minutos a 65°C. A pululanase Pul C têm a atividade mais alta de todas as três pululanase entre 62,5°C e 65°C, que é a temperatura preferida para maceração usando assim Pul C como enzima de desramificação em um Processo para maceração, é claramente vantajosa.
Exemplo 3 [00158] O propósito deste experimento foi avaliar a dosagem eficaz da
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 47/70 / 56 proteína enzimática (EP) por g dm (grama de matéria seca) de 3 das pululanases diferentes (NS26062/PulC, Promozyme 400 L e Promozyme D2 (Optimax 1000 L) na sacarificação de 100% de cevada não maltada ou 100% de cevada maltada quando aplicadas em maceração de infusão por 2 horas.
[00159] A todos os copos foram adicionadas combinação de enzimas 2 kg /1000 kg de cevada:
α-amilase (Termoamil SC) 0,3 KNU(S)/g, β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max/Viscoflow XL) 300 ppm, Protease (Neutrase) 0,001 AU/g,
Lipase (Lipozyme TL 20 LU/g)
Dosagens de pululanases diferentes foram adicionadas.
Atividade específica:
NS26062: 57 PUN/mg EP.
Promozyme 400 L: 136 PUN/mg EP
Promozyme D2: 236 NPUN/mg EP
Iso-amilase de Hayashibara Co Ltd: Atividade específica desconhecida [00160] As atividades específicas foram medidas depois que as pululanases foram purificadas pelas técnicas cromatográficas padrão.
[00161] Condições de Maceração: 54°C em 30 minutos, aumentar para 64°C em 10 minutos e manter 45 minutos, aumentar para 80°C em 16 minutos e manter 10 minutos, produzindo mosto com 12,6 Plato.
Tabela 3: Efeito de pululanase sobre a degradação de dextrina na maceração de 100% de cevada não maltada: mostrando a% de carboidrato não fermentável no mosto (dextrina/DP4+) com dosagens diferentes (g (grama) EP (proteína enzimática)/1000 kg de cevada não maltada. Alguns experimentos foram feitos várias vezes.
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| g EP/1000 kg dm de cevada não maltada | NS26062 PulC | Promozyme 400 L | Promozyme D2 | Iso-amilase Hayashibara |
| 0 (controle) | 30,5-30,8% | 30,5-30,8% | 30,5-30,8% | 30,5-30,8% |
| 8,77 | 20,1-21,4% 22,3% | - | - | - |
| 17,5 | 15,4-18,8% 17,9-18,3% | 19,8-20,4% | 27,4-27,5% | - |
| 26,3 | 13,6-16,1% 16,0-16,7% | - | - | - |
| 35,0 | 14,9-15,5% | 17,1% | - | - |
| 52,5 | 13,2% | |||
| 87,5 | - | 13,2- 13,7% | 21,9-22,4% | - |
| 175 | - | 11,8- 12,3% | 18,7-19,3% | - |
[00162] A Tabela 3 mostra que todas as três pululanases mas não a isoamilase de Hayashibara poderiam reduzir a quantidade de açúcares não fermentáveis (dextrina DP4+) e deste modo aumentariam a quantidade de açúcares fermentáveis. Entretanto, o melhor desempenho é claramente a pululanase NS26062 (Pul C), que reduziu a quantidade de açúcares não fermentáveis em relação à quantidade de enzimas muito mais do que a pululanase 400 L e a pululanase D2. Esta é uma demonstração evidente da vantagem de usar a PulC termoestável. É além disso demonstrado que uma DP4+ de menos do que 20%, que corresponde a mais do que 80% de glicose, maltose e maltotriose pode ser atingida em 120 minutos de maceração.
[00163] Assim a escolha da pululanase é importante para controlar a quantidade de açúcares fermentáveis e para a redução provável das dextrinas DP4+ não fermentáveis. Isto é importante visto que um bom perfil de açúcar (muitos açúcares fermentáveis comparados com açúcares não fermentáveis) promove uma boa fermentação do mosto.
Exemplo 4 [00164] O propósito deste exemplo foi avaliar o efeito da pululanase NS26062 sobre a formação de DP2 (maltose) no mosto. Um grão para moer que compreende 100% de cevada não maltada foi preparado como descrito acima.
[00165] A todos os copos foram depois adicionados 50 ppm de Na2SO3
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 49/70 / 56 + 3,0 ml de H3PO4 1 M e enzimas:
α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g, β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max/Viscoflow XL): 300 ppm ~ 0,23 EGU/g,
Protease (Neutrase 0,8 L): 0,002 AU/g,
As pululanases como descritas na Tabela 4.
[00166] A maceração foi realizada e aos copos foi adicionada água municipal a um total de 300 g depois da maceração. Ο malte moído foi filtrado e os resultados na Tabela 4 abaixo foram obtidos analisando-se o mosto:
Tabela 4. 100% de cevada: RDF,% e açúcar no mosto.
| Dosagem de enzima PUN/g (NS26062) | DP1 % do total | DP2 % do total | DP4+ % do total | RDF % | |
| - | 0 | 3,8 | 47,5 | 34,0 | 61,2 |
| NS26062 | 0,1 | 3,8 | 48,2 | 32,0 | 63,2 |
| NS26062 | 0,3 | 3,8 | 49,8 | 28,8 | 65,7 |
| NS26062 | 0,5 | 3,7 | 51,2 | 26,4 | 68,6 |
| NS26062 | 1 | 3,7 | 52,6 | 23,9 | 71,0 |
| NS26062 | 2 | 3,6 | 55,6 | 20,1 | 74,3 |
[00167] A concentração de maltose (DP2) foi aumentada aumentandose a dosagem de NS26062 (Pul C) e o aumento na% de maltose foi seguida por um aumento na atenuação (RDF%). A fração de dextrina (análise de HPLC DP4/4+) foi ao mesmo tempo decrescente.
[00168] Apenas a β-amilase da cevada pôde produzir maltose nesta reação e NS26062 (Pul C) facilitou a ação da beta-amilase da cevada.
[00169] Assim a NS26062 (Pul C) foi uma pululanase adequada, fornecendo um mosto com RDF alto e glicose baixa.
Exemplo 5 [00170] O propósito deste exemplo foi avaliar as três proteases Neutrase 0,8 L, Alcalase e Flavourzyme quanto ao desenvolvimento de FAN e formação de maltose. Um grão para moer que compreende 100% de cevada não maltada foi preparado como descrito acima. Depois a todos os copos (testes de 1 a 3 abaixo) foram adicionadas enzimas como indicado nas tabelas
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 50/70 / 56 a 7 abaixo. A maceração foi realizada e aos copos foi adicionada água municipal até um total de 300 g depois da maceração. O malte moído foi filtrado e os resultados nas tabelas 5 a 7 foram obtidos analisando-se o mosto:
Teste 1:
[00171] A todas as amostras foram adicionadas: α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g, β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max): 300 ppm (0,23 EGU/g) e atividades diferentes das proteases Alcalase e Neutrase 0,8 L como indicado na tabela 5.
Tabela 5. FAN e% de açúcar de mosto em dosagens diferentes de Alcalase e Neutrase 0,8 L (atividade de enzima por g dm de malte moído)
| Copo no | Alcalase AU/g | Neutrase 0,8 L AU/g | FAN mg/l/Plato | DP2 % do total | DP4/4+ % do total |
| 1 | - | - | 5,05 | 42,2 | 37,4 |
| 2 | - | 0,0005 | 6,73 | 45,4 | 35,5 |
| 3 | - | 0,001 | 7,32 | 44,6 | 35,8 |
| 4 | - | 0,0015 | 7,92 | 46,5 | 34,4 |
| 5 | - | 0,002 | 8,33 | 46,0 | 34,7 |
| 6 | - | 0,003 | 9,00 | 46,1 | 34,6 |
| 7 | 0,001 | 0,002 | 8,59 | 46,1 | 34,6 |
| 8 | 0,002 | 0,002 | 8,38 | 45,9 | 34,7 |
| 9 | 0,0025 | 0,002 | 8,35 | 46,5 | 34,3 |
| 10 | 0,003 | 0,002 | 8,59 | 46,9 | 34,1 |
| 11 | 0,004 | 0,002 | 8,92 | 46,6 | 34,2 |
| 12 | 0,005 | 0,002 | 9,29 | 47,1 | 34,0 |
Teste 2:
[00172] Todas as amostras foram adicionadas: α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g, β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max): 300 ppm (0,23 EGU/g), Flavourzyme: 0,1 LAPU/g, e as proteases Alcalase e/ou Neutrase 0,8 L como indicadas na tabela 6.
Tabela 6. FAN e% de açúcar de mosto em dosagens diferentes de Alcalase e Neutrase 0,8 L (atividade de enzima por g dm de malte moído)
| Copo no | Alcalase AU/g | Neutrase 0,8 L AU/g | FAN mg/l/Plato | DP2 % do total | DP4/4+ % do total |
| 1 | - | - | 5,47 | 43,8 | 36,0 |
| 2 | - | 0,0005 | 6,75 | 46,4 | 34,3 |
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| 3 | - | 0,001 | 7,20 | 47,5 | 33,7 |
| 4 | - | 0,0015 | 7,57 | 47,1 | 33,8 |
| 5 | - | 0,002 | 8,26 | 47,3 | 33,7 |
| 6 | - | 0,003 | 8,64 | 47,3 | 33,6 |
| 7 | 0,001 | 0,002 | 9,09 | 47,1 | 33,9 |
| 8 | 0,002 | 0,002 | 8,46 | 48,2 | 33,1 |
| 9 | 0,0025 | 0,002 | 8,64 | 47,9 | 33,4 |
| 10 | 0,003 | 0,002 | 8,49 | 47,3 | 33,8 |
| 11 | 0,004 | 0,002 | 8,96 | 47,5 | 33,6 |
| 12 | 0,005 | 0,002 | 10,15 | 47,4 | 33,7 |
Teste 3:
[00173] A todas as amostras foram adicionadas: α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g, β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max): 300 ppm 0,23 EGU/g, Flavourzyme: 0,1 LAPU/g e as proteases Alcalase ou Neutrase 0,8 L como indicado na tabela 7.
Tabela 7. FAN e% de açúcar de mosto em dosagens diferentes de Alcalase e Neutrase 0,8 L (atividade de enzima por g dm de malte moído)
| Copo no | Alcalase AU/g | Neutrase 0,8 L AU/g | FAN mg/l/Plato | DP2 % do total | DP4/4+ % do total |
| 1 | - | - | 5,24 | 44,8 | 35,3 |
| 2 | 0,001 | 5,37 | 44,8 | 35,3 | |
| 3 | 0,002 | 5,02 | 44,6 | 35,4 | |
| 4 | 0,0025 | 5,20 | 45,7 | 34,6 | |
| 5 | 0,003 | 5,29 | 44,2 | 35,7 | |
| 6 | 0,004 | 5,66 | 44,4 | 35,0 | |
| 7 | 0,005 | 5,91 | 45,0 | 35,0 | |
| 8 | - | 0,002 | 5,66 | 44,4 | 35,5 |
| 9 | 0,004 | 0,001 | 8,45 | 47,1 | 33,9 |
| 10 | 0,004 | 0,0015 | 8,96 | 47,7 | 33,4 |
| 11 | 0,004 | 0,002 | 9,65 | 48,3 | 33,0 |
| 12 | 0,004 | 0,003 | 10,25 | 48,7 | 32,6 |
[00174] Estes exemplos claramente demonstram que a adição das proteases Alcalase e Neutrase mas não Flavorzyme tem um efeito positivo sobre a geração de nitrogênio de amino disponível livre (FAN) particular e que a neutrase teve o efeito mais positivo na geração de FAN. Assim a escolha da protease é um parâmetro crítico para a geração de FAN.
Exemplo 6 [00175] Um grão para moer que compreende de 0 a 90% de cevada não
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 52/70 / 56 maltada foi preparado como descrito acima. Depois a todos os copos foram adicionadas as enzimas β-glicanase e xilanase. A maceração foi realizada e aos copos foi adicionada água municipal a um total de 300 g depois da maceração. O malte moído foi filtrado e os resultados na tabela 8 foram obtidos analisando-se o mosto:
[00176] O seguinte experimento é para demonstrar o efeito sobre a turbidez (NTU) com a quantidade aumentada de cevada não maltada, quando apenas a combinação de enzima de filtração β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max 300 ppm) é adicionada.
Tabela 8. NTU quando a quantidade crescente de cevada maltada é substituída com cevada não maltada, de 0% de cevada não maltada a 90% de cevada não maltada.
% de cevada NTU
019,8
819,7
1615,3
2412,4
3212
4010,2
4810,8
568,43
6410,9
7221
8035,7
9056,2 [00177] O resultado também é mostrado na Figura 1. Está evidente a partir deste experimento que a maceração da cevada não maltada com combinações de enzima simples (apenas enzimas de filtração) torna-se crescentemente difícil quando quantidade crescente de cevada não maltada é substituída no lugar da cevada maltada e quando a quantidade excede 80% a turbidez é tão alta que o mosto é difícil de filtrar. Assim quando se tem quantidade alta de cevada não maltada adicionar apenas enzimas de filtração não é suficiente para se obter um mosto que seja filtrável.
Exemplo 7 [00178] O propósito deste exemplo foi avaliar a turbidez (NTU) e a
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 53/70 / 56 filtração de mosto a partir da maceração de infusão de cevada a 100% com uma dosagem diferente de Lipopan F, Lipopan X e β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max). O estudo compreendeu dois testes independentes para Lipopan F e Lipopan X, respectivamente, isto é 2 x 12 copos como indicado na tabela 9 abaixo. Um grão para moer que compreende 100% de cevada não maltada foi preparado como anteriormente descrito. Depois a todos os copos foram adicionadas enzimas.
[00179] Para cada copo foram adicionados:
- 3,0 ml de H3PO4 1 M,
- 0,3 KNU(S)/g de α-amilase (Termoamil SC),
- 0,002 AU/g de protease (Neutrase 0,8 L),
- 0,5 PUN/g de pululanase (NS26062) e as enzimas na tabela 9.
[00180] A maceração foi realizada e aos copos foi adicionada água municipal para um total de 300 g depois da maceração. O malte moído foi filtrado e os resultados na tabela 9 abaixo foram obtidos analisando-se o mosto:
Tabela 9. Atividade de dose de enzima /g DM na maceração
| Copo no | Ultraflo Max EGU/g | Lipopan F LU/g | Lipopan X LU/g | NTU | Filtração ml/10 min | Filtração ml final |
| 1 | 0,24 | - | 116 | 105 | 194 | |
| 2 | 0,24 | 1 | 120 | 86,0 | 165 | |
| 3 | 0,24 | 5 | 78,3 | 110 | 195 | |
| 4 | 0,24 | 10 | 66,1 | 131 | 195 | |
| 5 | 0,24 | 20 | 50,1 | 168 | 210 | |
| 6 | 0,24 | 50 | 22,7 | 190 | 210 | |
| 7 | 0,16 | 50 | 19,7 | 170 | 208 | |
| 8 | 0,08 | 50 | 19,8 | 178 | 205 | |
| 9 | - | 50 | 18,5 | 142 | 195 | |
| 10 | 0,16 | 10 | 67,8 | 114 | 200 | |
| 11 | 0,08 | 10 | 69,2 | 130 | 200 | |
| 12 | - | 10 | 49,7 | 95 | 180 | |
| 1 | 0,24 | - | 110 | 105 | 200 | |
| 2 | 0,24 | 1 | 92,0 | 70,0 | 165 | |
| 3 | 0,24 | 5 | 50,0 | 100 | 200 | |
| 4 | 0,24 | 10 | 107 | 94,0 | 198 | |
| 5 | 0,24 | 20 | 5,91 | 135 | 205 | |
| 6 | 0,24 | 50 | 3,36 | 160 | 210 | |
| 7 | 0,16 | 50 | 3,53 | 150 | 205 | |
| 8 | 0,08 | 50 | 3,84 | 151 | 205 |
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| 9 | - | 50 | 4,96 | 100 | 200 | |
| 10 | 0,16 | 10 | 24,9 | 110 | 200 | |
| 11 | 0,08 | 10 | 21 | 110 | 200 | |
| 12 | - | 10 | 8,9 | 75 | 180 |
[00181] Ambas as lipases Lipopan F e Lipopan X acentuadamente reduziram a turbidez (NTU) do mosto.
[00182] Lipopan X é a mais eficiente (na atividade de enzima LU(g)) para a redução da turbidez no mosto, mas Lipopan F pode reduzir a turbidez a um nível dentro da especificação do mosto. A quantidade de enzimas de filtração pode ser reduzida a 100 ppm na presença de lipase sem reduzir a velocidade de filtração significantemente.
Exemplo 8 [00183] O propósito deste exemplo foi avaliar o efeito da protease Neutrase 0,8 L, fitase e a pululanase NS26062 (Pul C) sobre a geração de FAN e o perfil de açúcar de mosto em uma maceração padrão. Um grão para moer que compreende 100% de cevada não maltada foi preparado como descrito acima. Depois a todos os copos foram adicionadas α-amilase (Termoamil SC) 0,3 KNU(S)/g, 300 ppm de β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max), ajustados ao pH 5,3 e a protease Neutrase 0,8 L, as enzimas fitase e pululanase NS26062 (Pul C), foram adicionadas como indicado nas tabelas 10A e 10B abaixo e os resultados obtidos:
Tabela 10A. 100% de cevada: geração de FAN no mosto. As dosagens estão em unidade de atividade de enzima e ppm (100 ppm = 100g/1000 kg de cevada não maltada). FYT é a unidade de fitase, PUN é a atividade de pululanase e AU é a atividade proteolítica.
| Dosagens de Enzima | FAN mg/l/Plato |
| 0 | 5,09 |
| 1,5 FYT | 5,09 |
| 0,5 PUN | 5,11 |
| 1,5 FYT + 0,5 PUN | 5,22 |
| 0,002 AU | 8,58 |
| 0,002 AU + 1,5 FYT | 7,53 |
| 0,002 AU + 0,5 PUN | 7,85 |
| 0,002 AU + 1,5 FYT + 0,5 PUN | 7,91 |
| 0,002 AU + 0,5 PUN + 0,5 FYT | 7,87 |
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 55/70 / 56
0,002 AU + 0,5 PUN + 5 FYT 7,77
0,001 AU + 0,5 PUN + 5 FYT 7,35
| Tabela 10B. 100% de cevada: perfil do açúcar de mosto. | |||||
| Dosagem da Enzima Neutrase 0,8 L (AU) | DP1 % | DP2% | DP3% | DP4/4+ % | Fru % |
| 0 | 4,15 | 31,80 | 14,82 | 38,13 | 1,82 |
| 0,002 AU | 3,81 | 46,61 | 12,79 | 34,97 | 1,82 |
| 1,5 FYT | 4,13 | 42,11 | 14,78 | 37,14 | 1,85 |
| 0,5 PUN | 4,06 | 44,28 | 18,28 | 31,55 | 1,82 |
| 0 | 4,15 | 31,80 | 14,82 | 38,13 | 1,82 |
| 5,0 FYT + 0,5 PUN | 4,14 | 47,01 | 18,17 | 28,82 | 1,86 |
| 5,0 FYT + 0,5 PUN + 0,001 AU | 3,84 | 50,67 | 17,42 | 26,25 | 1,81 |
| 5,0 FYT + 0,5 PUN + 0,002 AU | 3,88 | 49,26 | 17,61 | 27,41 | 1,83 |
| 0 | 4,15 | 31,80 | 14,82 | 38,13 | - |
| 0,002 AU | 3,81 | 46,61 | 12,79 | 34,97 | - |
| 0,002 AU + 0,5 PUN | 3,81 | 47,78 | 17,74 | 28,87 | - |
| 0,002 AU + 0,5 PUN + 0,5 FYT | 3,88 | 49,26 | 17,61 | 27,41 | - |
| 0,002 AU + 0,5 PUN + 1,5 FYT | 3,91 | 50,12 | 17,56 | 26,58 | - |
| 0,001 AU + 0,5 PUN + 5,0 FYT | 3,84 | 50,67 | 17,42 | 26,25 | - |
| [00184] A Tabela 10 | A mostra | que a protease aumenta o | FAN no |
mosto e a tabela 10 B mostra que quando se adiciona fitase e pululanase à protease uma quantidade comparavelmente alta de DP1-DP3 pode ser gerada com as concentrações de protease de 0,001 e 0,002 AU respectivamente. Assim a concentração de protease pode ser reduzida na produção de mosto de maltose quando fitase e pululanase estão presentes sem reduzir a quantidade de açúcares fermentáveis (DP1-DP3).
Exemplo 9 [00185] O propósito deste exemplo foi para elucidar alguns parâmetros gerais com respeito ao mosto preparado em 100% de cevada não maltada de modo a identificar problemas críticos comparados com o mosto preparado com cevada maltada.
[00186] A maceração do malte (100%) sem nenhuma enzima adicionada e a maceração da cevada não maltada (100%), com combinação de enzima. O mosto foi fervido e a fermentação da cerveja realizada com 100% de malte (cevada) e um mosto de 100% de cevada não maltada.
Dados:
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 56/70 / 56 [00187] Maceração:
[00188] Cevada: Scarlet e malte do mesmo lote de Scarlet.
[00189] Malte moído: 10 kg de malte ou cevada, + 35 l de líquido de malte moído e pulverizações de 25 l a um total de 60 l.
[00190] Perfil: 54°C 30 minutos, aumentar para 64°C (1°C/minuto) e manter por 60 minutos, aumentar para 80°C (1°C/minuto) e manter por 10 minutos e transferir para filtração.
[00191] Combinação de Enzimas em malte moído de 100% de cevada:
• α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g dm • β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max): 300 ppm • Protease (Neutrase 0,8 L): 0,0015 AU/g dm • Pululanase (NS26062, Pul C): 1,0 PUN/g dm [00192] Composição de aminoácido do mosto (tabela 11) analisado:
[00193] O aminoácido livre analisado no mosto é organizado de acordo com o documento “Elucidation of the Role of Nitrogenous Wort Components in Yeast Fermentation” (J. Inst. Brew. 113(1), 3-8, 2007)
Tabela 11. FAN no mosto
Mosto de cevada maltada Mosto de cevada não maltada
| Grupo A, absorção rápida: | mM | mM |
| Ácido aspártico | 0,076 | 0,151 |
| Ácido glutâmico | 0,244 | 0,210 |
| Asparagina | 0,310 | 0,273 |
| Serina | 0,007 | 0,187 |
| Glutamina | 0,074 | 0,048 |
| Treonina | 0,210 | 0,188 |
| Arginina | 0,149 | 0,265 |
| Lisina | 0,216 | 0,354 |
| Soma | 1,286 | 1,675 (130%) |
Grupo B, absorção intermediária:
| Valina | 0,245 | 0,252 |
| Metionina | 0,047 | 0,111 |
| Leucina | 0,236 | 0,446 |
| Isoleucina | 0,114 | 0,163 |
| Histidina | 0,157 | 0,091 |
| Soma | 0,798 | 1,064 (133%) |
| Grupo C, absorção lenta: Glicina | 0,149 | 0,158 |
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 57/70 / 56
0,945 (108%)
Fenilalanina Tirosina Triptofano Alanina Soma
0,196
0,131
0,087
0,312
0,875
0,206
0,158
0,062
0,361
Grupo D, pouca ou nenhuma absorção
Prolina 2,500
0,413 (16,5%)
Soma Total
5,458
4,098 [00194]
A Tabela 11 mostra que quando a maceração com 100% de cevada não maltada e uma combinação de enzima que compreende atividade de α-amilase, atividade de β-glicanase, atividade de protease e uma atividade de pululanase um mosto pode ser produzido que tem consideravelmente menos do aminoácido não utilizável pela levedura prolina, que é claramente vantajoso visto que a presença deste aminoácido em um produto de cerveja resulta em um sabor desagradável. Além disso, a quantidade de aminoácidos nos grupos A e B, que podem ser rapidamente metabolizados pela levedura, é consideravelmente aumentada quando da maceração da cevada não maltada e da combinação de enzima que compreende atividade de α-amilase, atividade de β-glicanase, atividade de protease e uma pululanase. Assim está claro a partir deste exemplo que a concentração de prolina é menor do que 2 mM e a concentração de serina e metionina está acima de 0,1 mM e 0,05 mM respectivamente.
Exemplo 10 [00195] Os seguintes experimentos analisam o mosto obtido a partir do grão para moer que compreende 100% de cevada não maltada e 100% de malte. Os testes foram executados na Ziemann GmbH, Ludwigburg, Alemanha. Todas as análises foram feitas de acordo com a Analytica EBC ou MEBAK respectivamente. (van Erde, P., Analytica-EBC. 1998, Nürnberg: Verlag Hans Carl.; Anger, H., MEBAK Band Rohstoffe. 1. Auflage ed. Brautechnische Analysenmethoden. 2006, Freising: Selbstverlag der MEBAK).
[00196] A cevada usada foi uma cevada primaveril de duas fiadas da
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 58/70 / 56
Alemanha colhida em 2008.
[00197] As enzimas adicionadas foram:
• α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g cereal • β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max): 300 ppm • Protease (Neutrase 0,8 L): 0,001 AU/g dm • Pululanase (NS26062, Pul C): 2,0 PUN/g dm • Lipase (Lipozyme TL 100): 20 LU/g dm [00198] O perfil de maceração usado foi de 54°C a 30 min; aumentar a temperatura 1°C/min a 64°C e repousar por 60 min aumentar a temperatura 1°C/min para 78°C e repousar por 30 min, tempo de maceração total 144 min.
Tabela 12 Composição de mosto de cevada a 100% de bebidas fermentadas em comparação com as especificações de todo malte
| Análise | unidade | método | 100% de cevada não maltada | 100% de cevada maltada |
| Viscosidade (12%) | mPas | MEBAK II | 1,76 | < 1,8 |
| Valor de iodo | MEBAK II | 0,28 | < 0,35 | |
| RDF | % | MEBAK II | 69,2 | 68-72 |
| Nitrogênio sol (12%) | mg/100 ml | MEBAK II | 102,5 | |
| FAN (12%) | ppm | MEBAK II | 180 | |
| Turbidez | EBC | MEBAK II | < 80 NTU | < 80 NTU |
[00199] Os resultados mostram 100% de cevada não maltada em combinação com a combinação de enzima que compreende atividade de αamilase, atividade de β-glicanase, atividade proteolítica e atividade de desramificação de pululanase pode se igualar totalmente com a especificação do malte em todos os parâmetros chave como viscosidade, turbidez, fornecimento de Nitrogênio Amino Livre, rendimento e atenuação final estão todas dentro das especificações do malte (100% malte). O desempenho da cuba filtrante também foi investigado. A turbidez no mosto da cuba filtrante descreve a qualidade do desempenho da cuba filtrante. O componente de lipase na combinação de enzima foi capaz de reduzir o nível de turvação de modo normalmente significante mais alto da cevada não maltada aproxima-se
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 59/70 / 56 dos níveis de turvação abaixo de 80 NTU dentro de um tempo de cuba filtrante comparável.
[00200] Também o desempenho de fermentação foi testado: 8 hl de mosto de malte a 100% e 8 hl de mosto de cevada não maltada a 100% foram fermentados. O resultado é demonstrado na figura 2.
[00201] Ambos os mostos foram fermentados com a cepa W34 de levedura de fermentação de fundo, a figura 2 mostra a queda de extrato comparável de ambas as bebidas fermentadas. Além disso, nenhuma diferença na produção de etanol foi encontrada.
[00202] Finalmente a cerveja de cevada foi provada por um painel de sabor profissional no instituto para a tecnologia de fabricação de bebida fermentada 1 em Weihenetapahan, Alemanha. Os resultados mostram resultado comparável a uma cerveja de baixa fermentação padrão com indicações de estabilidade de aroma realçada.
Tabela 13. Avaliação de sabor da Weihenetapahan da cerveja a 100% de cevada não maltada
| 100% de cevada não maltada | 100% de cevada não maltada | 100% de cevada não maltada | 100% de cevada não maltada | |
| Fresca | Envelhecimento forçado | Fresca | Envelhecimento forçado | |
| Sabor | 4,0 | 3,5 | 3,8 | 3,5 |
| Aroma | 4,0 | 3,4 | 3,8 | 3,4 |
| Corpo | 4,0 | 3,8 | 4,0 | 3,8 |
| Amargor total | 4,1 | 3,9 | 4,1 | 3,9 |
| Total | 4,03 | 3,61 | 3,91 | 3,56 |
Avaliação Geral: DLG 5 = muito boa, 1 inaceitável.
Exemplo 11 [00203] O seguinte exemplo foi para avaliar parâmetros importantes diferentes quando da maceração em um grão para moer que compreende 30% de grão para moer de milho ou arroz (não maltados) com 70% de malte moído principal de cevada não maltada e uma combinação de enzimas que compreende a atividade de α-amilase, atividade de β-glicanase, atividade de protease e uma pululanase.
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 60/70 / 56 [00204] O processo usado foi a maceração por decocção onde parte do grão para moer de arroz ou milho foi fervida com α-amilase termoestável e depois misturada com o malte moído que compreende a cevada não maltada. As enzimas adicionadas a 70% de malte moído de cevada + 30% de grão de milho ou arroz moído:
• α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g dm • β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max): 300 ppm (0,23 EGU/g) • Protease (Neutrase 0,8 L): 0,001 e 0,002 AU/g dm [00205] A Pululanase também foi adicionada ao malte moído de cevada não maltada e a concentração foi variada, ver as tabelas 14 e 15, a pululanase adicionada é (NS26062, Pul C).
[00206] A maceração foi realizada como segue: A cevada moída foi adicionada ao copo de maceração (40,0 g como tal) e adicionados 115 g de água a 60°C, CaCl (330 g/1000 kg de cevada) foi adicionado em adição com a combinação de enzima indicada acima. A mistura foi mantida a 54°C por 30 minutos, depois o malte moído de decocção é adicionado (15,4 g dm) e a temperatura mantida a 64°C em 60 minutos, aumentada para 80°C e mantida 10 minutos, esfriada e filtrada. Todos os maltes moídos puderam ser filtrados sem nenhum problema e nenhuma diferença significante entre as dosagens de enzima diferentes.
[00207] A preparação do malte moído de decocção foi realizada como segue: O grão para moer de arroz ou milho foi misturado com água (5,66 partes) a uma temperatura de 60°C a 70°C, CaCl2 (220 g/1000 kg de grão para moer) foi adicionado em adição com uma α-amilase (Termoamil SC 0,600 kg/1000 kg de grão para moer). A mistura foi aquecida a 85°C e mantida nesta temperatura por 20 minutos, o calor foi aumentado para 100°C (ebulição) e mantido nesta temperatura (ebulição) por 15 minutos. A mistura foi esfriada a 80°C e misturada com o malte moído contendo a cevada.
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 61/70 / 56 [00208] A maceração foi realizada e aos copos foi adicionada água municipal para um total de 300 g depois da maceração. O malte moído foi filtrado e os resultados na tabela 14 abaixo foram obtidos analisando-se o mosto. Em alguns exemplos o mosto foi fervido 10 minutos diluído 9,7 Plato e fermentado pela Fermentação Forçada, Analítica - EBC nr. 8,6.
Tabela 14: FAN, RDF e teor de açúcar de um mosto a partir do malte moído com base na decocção do malte moído de 30% de grão para moer de milho e 70% de cevada não maltada que são misturados.
| Copo No | Neutrase AU/g | NS26062 PUN/g | Perfil de carboidrato no mosto em% | Plato° | FAN ppm | RDF% | |||
| DP1: | DP2: | DP3: | DP4+: | ||||||
| 1 | 0,001 | - | 5,17 | 54,31 | 12,02 | 28,50 | 14,48 | 106 | 64,4 |
| 2 | 0,001 | 0,5 | 5,47 | 58,23 | 14,73 | 21,56 | 14,45 | 106 | 70,7 |
| 3 | 0,001 | 1,0 | 5,48 | 60,48 | 15,79 | 18,25 | 14,54 | 107 | 73,6 |
| 4 | 0,001 | 1,5 | 5,59 | 61,77 | 16,35 | 16,29 | 14,45 | 107 | 75,3 |
| 5 | 0,001 | 2,0 | 5,57 | 62,88 | 16,66 | 14,89 | 14,49 | 108 | 76,5 |
| 6 | 0,001 | 2,5 | 5,60 | 63,35 | 16,96 | 14,09 | 14,46 | 106 | 77,2 |
| 7 | 0,002 | - | 5,54 | 54,29 | 12,50 | 27,67 | 14,28 | 131 | 64,6 |
| 8 | 0,002 | 0,5 | 5,60 | 58,37 | 15,13 | 20,90 | 14,34 | 131 | 70,8 |
| 9 | 0,002 | 1,0 | 5,53 | 60,43 | 16,10 | 17,93 | 14,83 | 129 | 73,8 |
| 10 | 0,002 | 1,5 | 5,66 | 61,83 | 16,58 | 15,93 | 14,34 | 130 | 75,3 |
| 11 | 0,002 | 2,0 | 5,66 | 62,71 | 16,92 | 14,70 | 14,33 | 131 | 76,4 |
| 12 | 0,002 | 2,5 | 5,73 | 63,21 | 17,18 | 13,88 | 14,31 | 130 | 77,3 |
Tabela 15: FAN, RDF e teor de açúcar de um mosto a partir do malte moído com base na decocção do malte moído de 30% de grão para moer de arroz e 70% de cevada não maltada que são misturados.
| Copo No | Neutrase AU/g | NS26062 PUN/g | Perfil de carboidrato do mosto em% | Plato° | FAN ppm | RDF% | |||
| DP1: | DP2: | DP3: | DP4+: | ||||||
| 1 | 0,001 | - | 5,37 | 53,14 | 12,33 | 29,16 | 14,37 | 103 | 62,0 |
| 2 | 0,001 | 0,5 | 5,40 | 57,06 | 15,03 | 22,50 | 14,75 | 104 | 68,8 |
| 3 | 0,001 | 1,0 | 5,57 | 59,18 | 16,02 | 19,24 | 14,53 | 106 | 72,1 |
| 4 | 0,001 | 1,5 | 5,57 | 60,72 | 16,65 | 17,15 | 14,61 | 104 | 74,1 |
| 5 | 0,001 | 2,0 | 5,59 | 61,64 | 17,00 | 15,77 | 14,51 | 104 | 75,5 |
| 6 | 0,001 | 2,5 | 5,65 | 62,38 | 17,28 | 14,67 | 14,52 | 105 | 76,6 |
| 7 | 0,002 | - | 5,50 | 53,23 | 12,79 | 28,48 | 14,45 | 125 | 62,4 |
| 8 | 0,002 | 0,5 | 5,55 | 57,09 | 15,28 | 22,08 | 14,45 | 124 | 69,0 |
| 9 | 0,002 | 1,0 | 5,65 | 59,17 | 16,32 | 18,86 | 14,44 | 126 | 72,1 |
| 10 | 0,002 | 1,5 | 5,68 | 60,38 | 16,95 | 16,99 | 14,45 | 127 | 73,9 |
| 11 | 0,002 | 2,0 | 5,67 | 61,37 | 17,38 | 15,58 | 14,45 | 126 | 75,3 |
| 12 | 0,002 | 2,5 | 5,72 | 62,11 | 17,56 | 14,59 | 14,39 | 127 | 76,7 |
[00209] As Tabelas 14 e 15 mostram os perfis de açúcar, Plato, FAN e
RDF do mosto com base na maceração de um grão para moer que compreende 30% de milho ou arroz e 70% cevada não maltada (100% de grãos não maltados). O resultado mostra claramente que a quantidade de
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 62/70 / 56 açúcares fermentáveis (DP1-3) é muito alta (acima de 80%), o RDF está acima de 60% e aumentando com a concentração crescente de pululanase e o FAN é alto e aumentando com a concentração de protease crescente, quando o mosto é produzido a partir de 100% de grãos não maltados que compreendem 70% de cevada não maltada e 30% de grão para moer de milho ou arroz não maltado e uma combinação de enzima que compreende a atividade de α-amilase, atividade de β-glicanase, atividade de protease e uma pululanase. Não houve diferença significante entre o uso de grão para moer de arroz ou milho.
Exemplo 12 [00210] O seguinte exemplo foi para avaliar parâmetros importantes diferentes quando a maceração em um grão para moer que compreende o malte moído de 50% de cevada + 50% de trigo e as seguintes enzimas.
• α-amilase (Termoamil SC): 0,3 KNU(S)/g dm (matéria seca) • β-glicanase e xilanase (Ultraflo Max): 300 ppm/0,23 EGU/g dm • Protease (Neutrase): 0,001 AU/g dm • Lipase (Lipozyme TL): 20 LU/g dm • Pululanase (NS26062, Pul C): 0-3,0 PUN/g dm [00211] Em um exemplo a concentração de pululanase foi variada, ver a tabela 17, a pululanase adicionada é (NS26062, Pul C).
[00212] Nos outros dois exemplos a concentração da combinação de enzima por kg de matéria prima foi variada, ver a tabela 18.
[00213] O malte moído foi preparado misturando-se cevada e trigo moídos (25 g de cada (total 50,0 g) com 200 g de água adicionados aos copos de maceração, depois Ca2+ e a combinação de enzima indicada acima foram adicionados e a maceração iniciada.
[00214] O perfil de maceração foi como segue: o malte moído foi
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 63/70 / 56 aquecido a 54°C (1°C/min.) e mantida nesta temperatura por 30 minutos, a temperatura foi aumentada para 64°C dentro de 10 minutos e mantida nesta temperatura por 45 minutos, a temperatura foi aumentada para 80°C dentro de 16 minutos e mantida nesta temperatura por 10 minutos. Água a 300 g total foi adicionada e o malte moído foi filtrado.
[00215] O mosto foi filtrado e em alguns exemplos o mosto foi fervido 10 minutos diluído a 9,7 Plato e fermentado pela Fermentação Forçada.
[00216] Os resultados são mostrados nas tabelas 16 e 17.
Tabela 16: A combinação de enzima foi como descrita acima de Termoamil SC, Ultraflo Max, Neutrase e Lipozyme TL com concentrações diferentes (PUN/g) de pululanase (NS26062) adicionadas.
| Enzimas | Filtração | Plato | pH | NTU | RDF% | |
| ml depois de 10 minutos | ml total | |||||
| 0 PUN/g + combinação de enzimas | 158 | 208 | 12,96 | 5,80 | 4 | 64,2 |
| 0,5 PUN/g + combinação de enzimas | 179 | 215 | 12,84 | 5,70 | 4 | 69,8 |
| 1,0 PUN/g + combinação de enzimas | 159 | 206 | 13,06 | 5,70 | 3 | 72,0 |
| 1,5 PUN/g + combinação de enzimas | 154 | 213 | 13,08 | 5,70 | 3 | 72,5 |
| 2,0 PUN/g + combinação de enzimas | 159 | 209 | 13,05 | 5,50 | 3 | 73,0 |
| 2,5 PUN/g + combinação de enzimas | 146 | 206 | 13,10 | 5,6 | 3 | 73,4 |
| 3,0 PUN/g + combinação de enzimas | 159 | 208 | 13,08 | 5,70 | 3 | 73,6 |
[00217] A Tabela 16 mostra que um mosto fabricado a partir de um grão para moer que compreende 50% de trigo e 50% de cevada, que são 100% grãos não maltado e misturados com uma combinação de enzimas que compreende atividade de α-amilase, atividade de β-glicanase, atividade de protease, atividade de lipase e uma pululanase é filtrável e com baixa turbidez e importantemente o RDF é alto (acima de 65%) e aumentando com quantidades crescentes de pululanase NS26062 (Pul C).
[00218] Na tabela 17 a combinação de enzimas foi como descrita acima de Termoamil SC, Ultraflo Max, Neutrase e Lipozyme TL na mesma quantidade relativa, mas neste exemplo a quantidade da combinação em
Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 64/70 / 56 relação à quantidade de matéria prima foi variada. Todas as combinações foram com 1,0 PUN de pululanase (NS26062) adicionado.
Tabela 17: Doses diferentes de combinação de enzimas
| Enzimas | Filtração ml depois de 10 minutos ml total | ml total | pH | NTU | RDF% | |
| 100% de combinação de enzimas | 159 | 206 | 13,06 | 5,70 | 3 | 72,0 |
| 125% de combinação de enzimas | 169 | 208 | 13,12 | 5,70 | 4 | 72,0 |
| 150% de combinação de enzimas | 164 | 204 | 13,12 | 5,70 | 3 | 72,4 |
| 175% de combinação de enzimas | 145 | 204 | 13,06 | 5,70 | 3 | 72,9 |
| 200% de combinação de enzimas | 147 | 205 | 13,10 | 5,70 | 3 | 72,9 |
| 300% de combinação de enzimas | 150 | 204 | 13,21 | 5,70 | 3 | 73,5 |
[00219] Com todas as quantidades testadas de combinação de enzimas que compreende atividade de α-amilase, atividade de β-glicanase, atividade de protease, atividade de lipase e uma pululanase o mosto produzido teve uma quantidade muito alta de RDF acima de 70%, a mesma foi levemente crescente com quantidades crescentes de combinação de enzimas. Entretanto, um RDF alto e boa filtrabilidade foram obtidos com 2 kg/1000 kg de combinação de enzimas/matéria prima, que correspondeu a 100% da combinação de enzimas. Importantemente o tempo de maceração total foi de 2 horas.
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. Processo para a produção de um mosto de cervejeiro, caracterizado pelo fato de que compreende:a. obter um malte moído pela maceração de um grão para moer, do qual pelo menos 70% em peso é de cereal(is) não maltado(s) que compreende β-amilase e do qual menos do que 30% em peso é de cereal(is) maltado(s), a uma temperatura na qual as enzimas exógenas (adicionadas) e a β-amilase endógena são ativas;b. contactar o malte moído com enzimas exógenas que compreende:1. uma α-amilase, ii. uma pululanase, iii. uma protease, e iv. uma β-glicanase;v. uma lipase; e vi. uma xilanase;c. interromper a maceração e filtrar o malte moído para se obter o mosto, em que a etapa a) é realizada entre 45°C e 58°C, a etapa b) é realizada entre 60°C e 72°C, e a etapa c) é realizada entre 72°C e 82°C.
- 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grão para moer compreende pelo menos 75% em peso de cereal(is) não maltado(s).
- 3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o(s) cereal(is) não maltado(s) é/são cevada, espelta, trigo, centeio, milho, aveia ou arroz ou qualquer mistura dos mesmos.
- 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o cereal não maltado é cevada.Petição 870190051971, de 03/06/2019, pág. 66/70
- 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o grão para moer compreende ainda outras fontes de carboidrato, tais como xaropes de fermentação.
- 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as enzimas exógenas como definidas na etapa b na reivindicação 1 compreendem ainda uma fitase.
- 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a temperatura de maceração está em uma faixa que otimiza a β-amilase.
- 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a protease é fornecida por um sistema de enzimas proteolíticas, que incluem endo-proteases, exopeptidases ou qualquer combinação destas.
- 9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lipase é fornecida por uma lipase de Fusarium, Aspergillus ou Rhizopus.
- 10. Uso de um processo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a produção de cerveja.
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