BRPI0818534B1 - métodos para aumentar a longevidade, tamanho de órgão e/ou tamanho de semente, para produzir uma planta com longevidade, tamanho de órgão e/ou tamanho de semente aumentado, e para prolongar o período de crescimento em uma planta - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODOS PARA AUMENTAR A LONGEVIDADE, TAMANHO DE ÓRGÃO E/OU TAMANHO DE SEMENTE, PARA PRODUZIR UMA PLANTA COM LONGEVIDADE, TAMANHO DE ÓRGÃO E/OU TAMANHO DE SEMENTE AUMENTADO, E PARA PROLONGAR O PERÍODO DE CRESCIMENTO EM UMA PLANTA (51) Int.CI.: C12N 15/82; C07K 14/405; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 11/10/2007 GB 0719919.3 (73) Titular(es): PLANT BIOSCIENCE LIMITED (72) Inventor(es): MICHAEL BEVAN; YUNHAI LI (85) Data do Início da Fase Nacional: 09/04/2010 “MÉTODOS PARA AUMENTAR A LONGEVIDADE, TAMANHO DE ÓRGÃO E/OU TAMANHO DE SEMENTE, PARA PRODUZIR UMA PLANTA COM LONGEVIDADE, TAMANHO DE ÓRGÃO E/OU TAMANHO DE SEMENTE AUMENTADO, E PARA PROLONGAR O

PERÍODO DE CRESCIMENTO EM UMA PLANTA”

Campo da Invenção

Esta invenção diz respeito a métodos de controlar o tamanho das sementes e órgãos de plantas.

Fundamentos da Invenção

O tamanho de sementes e órgãos é um traço agronômica e ecologicamente importante que está sob o controle genético (Alonso-Blanco, C. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4710-7 (1999); Song, X. J. Nat Genet 39, 623-30 (2007); Weiss, J. Int J Dev Biol 49, 513-25 (2005); Dinneny, J. R. Development 131, 1101-10 (2004); Disch, S. Curr Biol 16, 272-9 (2006);

Science 289, 85-8 (2000); Horiguchi, G. Plant J 43, 68-78 (2005); Hu, Y Plant J 47, 1-9 (2006); Hu, Y. Plant Cell 15, 1951-61 (2003); Krizek, B. A. Dev Genet 25, 224-36 (1999); Mizukami, Y. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 942-7 (2000); Nath, U. Science 299, 1404-7 (2003); Ohno, C. K. Development 131, 1111-22 (2004); Szecsi, J. Embo J 25, 3912-20 (2006); White, D. W. Proc

Natl Acad Sci U S A 103, 13238-43 (2006); Horvath, B. M. Embo J 25, 490920 (2006); Garcia, D. Plant Cell 17, 52-60 (2005). O tamanho final das sementes e órgãos é constante dentro de uma dada espécie, ao passo que a variação de tamanho de semente e órgão interespécie é acentuadamente maior, sugerindo que as plantas têm mecanismos reguladores que controlam o crescimento de semente e órgão em uma maneira coordenada e conveniente.

A despeito da importância do tamanho da semente e de órgão, entretanto, pouco é conhecido a cerca dos mecanismos moleculares e genéticos que

Petição 870180023033, de 22/03/2018, pág. 14/28 “MÉTODOS PARA ALTERAR O FENÓTIPO DE UMA PLANTA, PARA PRODUZIR UMA PLANTA E UM POLIPEPTÍDEO, PARA IDENTIFICAR UM POLIPEPTÍDEO, PARA AUMENTAR O TAMANHO DE ÓRGÃOS DE PLANTA, SEMENTES OU AMBOS, E PARA

PROLONGAR O PERÍODO DE CRESCIMENTO EM UMA PLANTA, PLANTA, PROTEÍNA, GENES DE DAI OU DAR ISOLADO, DAI OU DAR ISOLADO, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, E, VETOR”

Campo da Invenção

Esta invenção diz respeito a métodos de controlar o tamanho 10 das sementes e órgãos de plantas.

Fundamentos da Invenção

O tamanho de sementes e órgãos é um traço agronômica e ecologicamente importante que está sob o controle genético (Alonso-Blanco, C. Proc Natl Acad Sei U S A 96, 4710-7 (1999); Song, X. J. Nat Genet 39,

623-30 (2007); Weiss, J. Int J Dev Biol 49, 513-25 (2005); Dinneny, J. R.

Development 131, 1101-10 (2004); Disch, S. Curr Biol 16, 272-9 (2006); Science 289, 85-8 (2000); Horiguchi, G. Plant J 43, 68-78 (2005); Hu, Y Plant J 47, 1-9 (2006); Hu, Y. Plant Cell 15, 1951-61 (2003); Krizek, B. A. Dev Genet 25, 224-36 (1999); Mizukami, Y. Proc Natl Acad Sei U S A 97, 942-7 (2000); Nath, U. Science 299, 1404-7 (2003); Ohno, C. K. Development 131,

1111-22 (2004); Szecsi, J. Embo J 25, 3912-20 (2006); White, D. W. Proc Natl Acad Sei U S A 103, 13238-43 (2006); Horvath, Β. M. Embo J 25, 490920 (2006); Garcia, D. Plant Cell 17, 52-60 (2005). O tamanho final das sementes e órgãos é constante dentro de uma dada espécie, ao passo que a variação de tamanho de semente e órgão interespécie é acentuadamente maior, sugerindo que as plantas têm mecanismos reguladores que controlam o crescimento de semente e órgão em uma maneira coordenada e conveniente. A despeito da importância do tamanho da semente e de órgão, entretanto, pouco é conhecido a cerca dos mecanismos moleculares e genéticos que controlam o tamanho de órgão e semente final nas plantas.

A regulagem genética do tamanho de semente tem sido investigado em plantas, incluindo no tomate, soja, milho, e arroz, usando o mapeamento de local de traço quantitativo (QTL). Até agora, na literatura publicada, dois genes (Song, X. J. Nat Genet 39, 623-30 (2007); Fan, C. Theor. Appl. Genet. 112, 1164-1171 (2006)), subjacentes a dois QTLs principais para o tamanho de grão do arroz, foram identificados, embora os mecanismos moleculares destes genes permaneçam para ser elucidados. Na Arabidopsis, onze locais que afetam o peso e/ou o comprimento de semente em cruzamentos entre os acessos Ler e Cvi, foram mapeados {Alonso-Blanco, 1999 supra}, mas os genes correspondentes não foram identificados. Estudos recentes têm revelado que AP2 e ARF2 estão envolvidos no controle do tamanho de semente. Infelizmente, entretanto, os mutantes ap2 e ar£2 têm fertilidade inferior ao tipo selvagem (Schruff, M. C. Development 137, 25115 261 (2006); Ohto, Μ. A. Proc. Natl. Acad. Sei USA 102, 3123-3128 (2005);

Jofuku, K. D. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102, 3117-3122 (2005)). além disso estudos usando plantas mutantes têm identificado vários reguladores positivos e negativos que influenciam o tamanho de órgão pela atuação sobre a proliferação ou expansão celulares {Krizek, Β. A. Dev Genet 25, 224-36 (1999); Mizukami, Y. Proc Natl Acad Sei U S A 97, 942-7 (2000); Nath, U.

Science 299, 1404-7 (2003); Ohno, C. K. Development 131, 1111-22 (2004); Szecsi, J. Embo J 25, 3912-20 (2006); White, D. W. Proc Natl Acad Sei U S A 103, 13238-43 (2006); Horvath, Β. M. Embo J 25, 4909-20 (2006); Garcia, D. Plant Cell 17, 52-60 (2005). Horiguchi, G. Plant J 43, 68-78 (2005); Hu, Y

Plant J 47, 1-9 (2006) Dinneny, J. R. Development 131, 1101-10 (2004)).

A identificação de um fator ou fatores que controlam o tamanho final tanto de sementes quanto de órgãos não apenas ajudará a conhecer melhor os mecanismos do controle de tamanho em plantas, mas também pode ter aplicações práticas substanciais por exemplo na melhora de rendimento de safra e biomassa de planta para a geração de biocombustível. Sumário da Invenção

Os presentes inventores identificaram uma Proteína contendo os domínios UIM e LIM (chamada de DAI) que é um regulador chave no controle do tamanho final de sementes e órgãos pela restrição da duração do crescimento proliferativo. Um alelo (chamado de alelo dal-1) é aqui mostrado atuar como uma mutação interferente negativa dominante para as proteínas relacionadas com DARs ou DAI. A super expressão do gene mutante dal-1 (R358K) no tipo selvagem causa um aumento no tamanho da semente e de órgão em plantas do tipo selvagem, indicando que o alelo dal-1 interfere com DARs em uma maneira dependente da dosagem. As mutações que reduzem ou abolem a função de EOD1/BB, que codifica uma E3 ubiquitina ligase, sinergisticamente realçam os fenótipos de dal-1, indicando que EAI atua em paralelo com EOD1/BB para limitar o tamanho de sementes e órgãos. A caracterização funcional de DAI e EOD1/BB fornece discernimento no mecanismo de controle do tamanho final da semente e de órgão e pode ser uma ferramenta valiosa para melhorar o rendimento de safra e aumento da biomassa de planta.

Aspectos da invenção fornecem uma proteína isolada que é

DAI e um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína que é DAI. Também são fornecidas proteínas relacionadas com DAI e que codificam ácido nucleico. As proteínas de DAI e relacionadas com DAI (DARs) são coletivamente aqui aludidas como proteínas DA.

Outros aspectos da invenção fornecem uma proteína isolada (DA1R358K) que interfere com a função da proteína de DAI e proteínas relacionadas com DAI e um ácido nucleico isolado que codifica uma tal proteína.

Um outro aspecto da invenção fornece um método para produzir plantas tendo fertilidade normal mas que tenham uma ou mais características selecionadas de longevidade maior, tamanho de órgão ampliado, tamanho de semente ampliado.

Um outro aspecto da invenção fornece uma planta tendo fertilidade normal mas que tem uma característica selecionada de longevidade mais longa, tamanho de órgão ampliado, tamanho de semente ampliado, e combinações destas características Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra que dal-1 tem sementes e órgãos grandes. (A e B) sementes secas de Col-0 (A) e dal-1 (B). (C e D) Embriões maduros de Col-0 (C) e dal-1 (D). (E e F) mudas de 9 dias de idade de Col-0 (E) e dal-1 (F). dal-1 tem cotilédones maiores do que WT. (G) As quintas folhas de Col-0 (esquerda) e dal-1 (direita), dal-1 tem folhas maiores e mais redondas comparadas com o tipo selvagem Col-0. (H e I) as flores de Col-0 (H) e dal-1 (I). (J e K) Silíquas de Col-0 (J) e dal-1 (K). (L) Peso de semente médio de Col-0, dal-1, dal-kol, darl-1, e dal-koldarl-1 é dado em mg por 100 sementes. Os desvios padrão (SD) são mostrados (n = 5). As plantas foram cultivadas sob condições idênticas. (M-0) diâmetro de haste (M), número de célula epidérmica em seções transversais de haste (N), e área de pétala (0) de Col-0, dal-1, DA1COM#2, e 358:^1^⁵⁸¾. (P e Q) Massa de 5 flores frescas (estágio 14) (P) e folhas (I^a _a 7^a) de plantas de 35 dias de idade (Q). (R) Área celular de embriões (E), pétalas (P) e folhas (L) em Col-0 e dal-1. Os valores são dados como média ± SD em relação ao respectivo valor do tipo selvagem, ajustado a 100 %. (S) Níveis de expressão relativa de DAI em Col-0 e 35S::DA1^R3581 as mudas foram medidas pela RT-PCR em tempo real quantitativa. Barras de escala: 200 pm (A e Β), 100 pm (C e D), 1 mm (E e F), 0,5 cm (G), 1 mm (H a K).

A Figura 2 mostra a análise cinemática do crescimento de pétala e folha. (A) Crescimento de pétalas mutantes Col-0 e dal-1. As pétalas maiores de cada série são de flores abertas (estágio 14). (B) índice Mitótico em pétalas WT e mutantes dal-1. O eixo do tempo em (B) corresponde àquele em (A). (C) Crescimento da quinta folha de Col-0, dal-1, DA1COM#2, e 35S::DA1 #5 com o tempo. DAE é dias depois da emergência.

A Figure 3 mostra a identificação e expressão do gene DAI. 5 (A) estrutura do gene DAI, mostrando os sítios mutados dos alelos dal-1, soda-1, soda-2, e soda-3. O códon de partida (ATG) e o códon de parada (TGA) são indicados. As caixas fechadas indicam a sequência codificadora e as linhas entre as caixas indicam introns. Os sítio de inserção de T-DNA (dalkol, dal-ko2 e dal-ko3) nos genes DAI são mostrados. (B a G) atividade promotora de DAI monitorada pela expressão de transgene pDAl::GUS. O tingimento de GUS nas mudas (B e C), um embrião (D), raízes (E), e pétalas (F e G). (H e I) As flores de Col-0 (Ei) e mutante duplo dal-koldarl-1 (I). (J) Silíquas de Col-0 (esquerda) e mutante duplo dal-koldarl-1 (direita). (K) Area de pétala de Col-0, mutantes duplos dal-kol, darl-1, dal-koldarl-1. O mutante duplo dal-koldarl-1 demonstra um fenótipo dal-1 incluindo flores e pétalas grandes, silíquas amplas e achatadas, e estilos curtos. (L) A análise de RT-PCR quantitativa revelou que a expressão de DAI é lentamente induzida por ABA. Mudas WT de 7 dias de idade foram tratadas com 10 pm de ABA por 2, 4, 6, 18 e 30 horas. (M e N) Sementes Col-0 e dal-1 -1 tipo selvagem foram cultivados em meio MS com 2 pm de ABA sob condições de luz constantes. O mutante dal-1 (N) exibe o estabelecimento de mudas insensíveis a ABA comparadas com Col-0 tipo selvagem (Μ). (O) mudas de 4 dias de idade de Col-0 (esquerda), dal-1 (centro) e DAICOM #2 (direita) foram transferidas para o meio MS com 5 pm de ABA por 3 semanas. As mudas de dal-1 mutantes continuam a crescer na presença de níveis baixos de ABA que inibem o crescimento de mudas Col-0 do tipo selvagem. Barras de escala: 1 mm (Β, Η, I, M, e N), 50 pm (D e E), 0,5 mm (C e J), 0,1 mm (F e G), 0,5 cm (O).

A Figura 4 mostra mutações em EOD1/BB sinergisticamente realçam os fenótipos de dal-1. (A) Flores de Col-0, dal-1, eodl-2 e eodl2dal-l mutantes duplos. (B) Plantas que crescem no solo de Col-0, eodl-2, eodl-2 e eodl-2dal-l mutantes duplos. (C) Peso de semente médios de Col-0, dal-1, eodl-2 e eodl-2dal-l mutantes duplos são mostrados como mg por 100 sementes. Os desvios padrão são mostrados (n = 5). As plantas foram cultivadas sob condições idênticas. (D) Área de pétala de Col-0, dal-1, eodl-2 e eodl-2dal-l mutante duplo. Os valores de desvio padrão são mostrados (n > 50), (E) Um modelo de DAI e EOD1/BB no controle do tamanho da semente e de órgão. Barras de escala: 2 mm (A), 50 mm (B).

A Figura 5 mostra que dal-1 tem sementes grandes. Os lotes pré pesados de Col-0 tipo selvagem (A), dal-1 (B), DA1COM#2 (C), 35S::DA1^R358145 (D), e sementes mutantes dal-koldarl-1 de plantas individuais foram passadas através de uma série de peneiras de arame de tamanho de malha decrescente (em pm) como descrito em Métodos

Suplementares. (Ε) O peso de semente médio por planta. Os valores de desvio padrão foram dados (n = 5). As plantas foram cultivadas sob condições idênticas.

A Figura 6 mostra o desenvolvimento de semente em plantas tipo selvagem e dal-1. (A a L), óvulos limpos (A, B) e sementes (C a L) do tipo selvagem (A, C, E, G, I e K), e dal-1 (B, D, F, H, J e L) retratados com ópticas de contraste diferenciais. Barras de escala: 50 pm (A a L).

A Figura 7 mostra que a planta dal-1 tem flor grande com pétalas extras e silíqua deformada com carpelos extras. (A) Flor do tipo selvagem. (B e C) Flores dal-1 com pétalas extras. (D) Silíqua tipo selvagem, (E a G) silíquas dal-1 com carpelos extras. Barras de escala: 1 mm (A a C), 2 mm (D a G).

A Figura 8 mostra que o mutante dal-1 tem a proliferação de célula prolongada. (A e B) pCyclinBl;l::GUS atividade nas primeiras folhas (9 dias depois da germinação) de mudas tipo selvagem (A) e dal-1 (B) cultivadas em meio MS contendo 1 % de glicose. (C) O nível de expressão de gene SAG12 na quinta das folhas de plantas Col-0 tipo selvagem e dal-1 foi detectado pelo uso da análise de RT-PCR em tempo real quantitativa. DAE é dias depois da emergência.

A Figura 9 mostra a clonagem com base no mapa de clonagem de DAI. (A) Mapeamento fino do local DAI. O local DAI foi mapeado para o cromossoma 1 (Chr 1) entre os marcadores T16N11 e CER451450. O local DAI foi ainda estreitado para uma região de DNA genômico de 30 kb entre os marcadores T29M8-26 e F18014-52 e co-segregaram com o marcador

CAPS DA1CAPS. O número de recombinantes identificados a partir das plantas F2 é mostrado. (Β) A mutação em dal-1 foi identificada usando o marcador de CAPS DA 1 CAPS 1. (C a E) Níveis de expressão de DAI (C) e DAR1 (D) em linhagens do tipo selvagem e T-DNA foram revelados pela análise de RT-PCR.

A Figura 10 mostra a identificação de proteínas relacionadas com DAI em Arabidopsis e homólogos de DAI em outras espécie. As proteínas relacionadas com DAI em Arabidopsis são mostradas na Figura 10A e as proteínas relacionadas com DAI em outra espécie são mostradas na Figura 10B.

A Figura 11 mostra que a mutação R358K em DAI é responsável pelo tamanho da semente e de órgão aumentado. (A) Área de pétala de Col-0, dal-1, dal-kol, dal-ko2, dal-ko3, dal-l/Col-0 F_b dalkol/dal-1 F_b dal-ko2/dal-l F_b dal-ko3/dal-l F_b dal-kol/Col-0 F_b dalko2/Col-0 F_b dal-ko3/Col-0 Fj₅ e dal-kol/dal-1 F_b Os valores de desvio padrão são dados (n > 50). (Β) O peso de semente médio de Col-0, dal-1, dal-kol, dal-kol/dal-1 F_b e dal-kol/Col-0 Fi é dado em mg por 100 sementes. Os valores de desvio padrão são dados (n = 5). As plantas foram cultivadas sob condições idênticas.

A Figura 12 mostra que as mutações em um realçador de dal-1 (EOD1/BB) sinergisticamente realçam os fenótipos de semente e órgão grandes de dal-1. (A) O eodl-ldal-1 mutante duplo tem um peso de semente aumentado comparado com dal-1. Peso de semente médio de dal-1 e eodlldal-1 mutante duplo é dado em mg por 100 sementes. Os valores de desvio padrão são mostrados (n = 5). As plantas foram cultivadas sob condições idênticas. (Β) O mutante duplo eodl-ldal-1 tem flor maior do que dal-1. (C) a estrutura de gene E0D1/BB, mostrando os sítios mutados dos dois alelos eodl. O códon de partida (ATG) e o códon de parada (TGA) são indicados. As caixas fechadas indicam a sequência codificadoras e as linhas entre as caixas indicam introns. O sítio mutado em eodl-1 e o sítio de inserção de TDNA em eodl-2 também são mostrados. (D) Plantas de oito semanas de idade de Col-0, dal-1, eodl-2, e eodl-2dal-l são mostradas. A planta eod2-ldal-1 tem um período de cultivo mais longo do que a dal-1. (E) Plantas de oito semanas de idade de Ler, dal-l^Ler, bb-1, e bb-ldal-l^Ler são mostradas. A planta bb-ldal-l^Lertem um período de cultivo mais longo do que a dal-l^Ler. Barras de escala: 1 mm (B), 5 cm (D e E). (F) Área de pétalas de Ler, dal-l^Ler bb-1, e bb-1 dal-l^Ler mutante duplos. Valores de desvio padrão são mostrados (n > 50). Mutações em BB sinergisticamente realçam o fenótipo de tamanho de pétala de dal-1, sugerindo que DAI e BB atuam em caminhos paralelos.

A Figura 13 mostra que a análise genética entre dal-1 e ant-5, axrl-12, ap2-7, e arf2-7. (A e Β) O fenótipo de tamanho de pétala de ant5dall^Ler e axrl-12dal-l mutante duplo é essencialmente aditivo, comparado com as suas linhagens precursoras. (C e D) O fenótipo de tamanho de semente de ap2-7dal-l e arf2-7dal-l mutante duplos é também essencialmente aditivo, comparado com as suas linhagens precursoras.

A Figura 14 mostra uma análise filogenética de proteínas equivalentes a DAI. Gráfico esquerdo: Uma árvore filogenética de matriz de distância foi criada usando o software PHYLIP (VERSÃO 3.66) com os parâmetros pré-determinados (o modelo JTT de evolução de sequência de proteína e o algoritmo de união de vizinho). A árvore foi depois importada no software MEGA 4.0 para rearranjo. Os valores de comando de entrada (os números dos ramos indicam o número de vezes da partição da espécie nos dois conjuntos que são separados por aquele ramo ocorrido entre as árvores, apenas mostrados em 70) foram obtidos por 100 réplicas. Os dados para a árvore foi a região de 250 aminoácidos do terminal C das sequências de proteína equivalente a DAI de tamanho natural. O gráfico da direita mostra uma visão geral simplificada da evolução da planta com base na árvore hiperbólica apresentada em (http://ucjeps.berkeley.edu/TreeofLife/ hyperbolic.php). Os ciados que são relacionados com o texto são retidos no gráfico. As espécies que foram analisadas são sublinhadas.

A Figure 15 (A-D) mostra silíquas de Col-0, BrDAlaCOM (linhagem transgênica 35S::BrDAla), OsDAlCOM (linhagem transgênica 35S::OsDAl) e dal-1. (E-H) folhas Roseta de Col-0, dal-1, BrDAlbCOM (linhagem transgênica 35S::BrDAlb) e 35S::BrDAla^R7K (super expressam 35S::BrDAla em Col-0). (I) estrutura do gene DAI mostrando os sítios mutados de dal-1 e sítios de inserção de T-DNA (dal-kol, dal-ko2 e dalko3).

Descrição Detalhada das Formas de Realização da Invenção

Em vários aspectos, a invenção fornece polipeptídeos DA isolados codificados pelos genes DA e sequências de ácido nucléico aqui descritos.

Os polipeptídeos DA incluem tanto polipeptídeos DA-1 quanto polipeptídeos relacionados com DA-1 (DAR), e seus homólogos funcionais, como aqui descritos.

Os polipeptídeo DAs, incluindo os polipeptídeos DA-1 e os polipeptídeos relacionados com DA-1 (DAR), possuem uma estrutura de domínio característica.

Um polipeptídeo DA pode compreender um domínio UIM1 e um domínio UIM2. Um domínio UIM1 pode consistir da sequência da SEQ ID NO: 3 e um domínio UIM2 pode consistir da sequência da SEQ ID NO: 4.

p—pLpbAl pb.Sbp-.pp p (SEQ ID NO: 3) p—pLpbAl pb.Sbp-spp p (SEQ ID NO:4) em que:

p é um resíduo de aminoácido polar, por exemplo, C, D, Ε, H, K, N, Q, R, S ou T;

b é um resíduo de aminoácido grande, por exemplo, E, F, Η, I, K, L, M, Q, R, W ou Y;

sé um resíduo de aminoácido pequeno, por exemplo, A, C, D,

G, N, P, S, T ou V;

é um resíduo de aminoácido alifático, por exemplo, I, L ou V; . é ausente ou é qualquer aminoácido, e - é qualquer aminoácido.

Os exemplos de sequências de domínio UIM1 e UIM2 adequados são apresentados abaixo. Outros exemplos de sequências de domínio UIM1 e UIM2 podem ser identificados usando técnicas de análise de sequência padrão como aqui descritas (por exemplo, Simple Modular Architecture Research Tool (SMART); EMBL Heidelberg, DE).

Um polipeptídeo DA pode compreender um domínio LIM. Um domínio LIM pode consistir da sequência da SEQ ID NO: 5;

pCs.Cscslh s ..... bhlp tb.sp.aH.. .pCFpCs..p CppsLss...

.p.ab.pcsp baCpps... (SEQ ID NO: 5) em que:

c é um resíduo de aminoácido carregado, por exemplo, D, E,

Η, K, R;

p é um resíduo de aminoácido polar, por exemplo, C, D, Ε, H,

K, N, Q, R, S ou T;

h é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, por exemplo, A, C,

F, G, Η, I, L, Μ, T, V, W e Y;

t é um resíduo de aminoácido minúsculo, por exemplo, A, G ou S;

a é um resíduo de aminoácido aromático, por exemplo, F, H,

Wou

Y·;

b é um resíduo de aminoácido grande, por exemplo, E, F, Η, I, K, L, M, Q, R, W ou Y;

s é um resíduo de aminoácido pequeno, por exemplo, A, C, D, 10 G, N, P, S, T ou V;

é um resíduo de aminoácido alifático, por exemplo, I, L ou V;

. é ausente ou é qualquer aminoácido; e

- é qualquer aminoácido.

Os exemplos de sequências de domínio LIM adequados são 15 apresentados abaixo. Outros exemplos de sequências de domínio LIM podem ser identificados usando técnicas de análise de sequência padrão (por exemplo, Simple Modular Architecture Research Tool (SMART); EMBL

Heidelberg, DE).

Um polipeptídeo DA pode compreender uma região de 20 terminal de carboxila tendo pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % de identidade de aminoácido para os resíduos de 250 a 532 da SEQ ID NO: 1 que definem o domínio de terminal C de DAI.

Um polipeptídeo DA pode compreender ainda R em uma posição equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1.

Uma posição em uma sequência de aminoácido que é equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1 pode ser facilmente identificada usando ferramentas de análise de sequência padrão. Os exemplos de sequências com um resíduo R em uma posição equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1 são aqui mostrado em outro lugar.

Em algumas formas de realização preferidas, um polipeptídeo DA pode compreender:

um domínio UIM da SEQ ID NO: 3 um domínio UIM da SEQ ID NO: 4 um domínio LIM da SEQ ID NO: 5, e uma região de terminal C tendo pelo menos 20 % de identidade de sequência com os resíduos de 250 a 532 da SEQ ID NO: 1.

Um polipeptídeo DA preferido pode compreender ainda R em uma posição equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1.

Por exemplo, um polipeptídeo DA pode compreender uma sequência de aminoácido apresentada em uma entrada de base de dados selecionada do grupo que consiste de SGN-U317073, SGN-U277808, SGNU325242, AT4G36860, SGN-U209255, AB082378,l, AT2G39830,

CAN69394,1, OSO3G16090, 9234.M000024, 29235.M000021, AT5G66620, AT5G66630, AT5G66610, AT5G66640, AT5G17890, SGN-U320806, AB096533,l, CAL53532,1, OS06G08400, SGNU328968, OS03G42820 e OS12G40490 ou pode ser variante ou um fragmento de uma destas sequências que retém atividade de DA.

Um polipeptídeo DA pode compreender uma sequência de aminoácido de AtDAl, AtDARl, AtDAR2, AtDAR3, AtDAR4, AtDAR5, AtDARó, AtDAR7, BrDAla, BrDAlb, BrDARl, BrDAR2, BrDAR3-7, BrDALl, BrDAL2, BrDAL3, OsDAl, OsDAR2, OsDAL3, OsDAL5, PpDALl, PpDAL2, PpDAL3, PpDAL4, PpDAL5, PpDALÓ, PpDAL7, PpDAL8, SmDALl e SmDAL2 (como mostrado no Alinhamento E).

Outros exemplos de entradas de base de dados de sequências de polipeptídeos DA são mostrados na Tabela 6 e Tabela 11. Outras sequências de polipeptídeo DA que incluem as características apresentadas acima podem ser identificadas usando ferramenta de análise de sequência padrão.

Em algumas formas de realização preferidas, um polipeptídeo DA pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 (AT1G19270; NP_173361.1 GI: 15221983) ou pode ser um fragmento ou variante desta sequência que retém atividade de DA.

Um polipeptídeo DA que é uma variante de uma sequência DA de referência, tal como a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência mostrada no alinhamento E, pode compreender uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % de identidade de sequência com a sequência de referência.

Um polipeptídeo DA que é uma variante da SEQ ID NO: 1 pode compreender um domínio UIM1 tendo a sequência QENEDIDRAIALSLLEENQE (SEQ ID NO: 6) e um domínio UIM2 tendo a sequência DEDEQIARALQESMWGNSP (SEQ ID NO: 7).

Um polipeptídeo DA que é uma variante da SEQ ID NO: 1 pode compreender um domínio LIM tendo a sequência:

ICAGCNMEIGHGRFLNCLNSLWHPECFRCYGCSQPISEYEFSTSGNYPF HKAC (SEQ ID NO: 8)

As variantes de sequência de aminoácido particulares podem diferir do polipeptídeo DA-1 da SEQ ID NO: 1 pela inserção, adição, substituição ou deleção de 1, 2, 3, 4, 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 50 aminoácidos ou mais do que 50 aminoácidos.

A similaridade e identidade de sequência são habitualmente definidas com referência ao algoritmo GAP (Wisconsin Package, Accelerys, San Diego USA). GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências completas que maximiza o número de emparelhamentos e minimiza o número de intervalos. No geral, parâmetros de default são usados, com uma penalidade de criação de intervalo = 12 e penalidade de extensão de intervalo = 4.

O uso de GAP pode ser preferido mas outros algoritmos 5 podem ser usados, por exemplo, BLAST (que usa o método de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (que usa o método de Pearson e Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448) ou o algoritmo de SmithWaterman (Smith e Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197) ou o programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) supra, no geral utilizando parâmetros de default. Em particular, o algoritmo de psi-Blast (Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402) pode ser usado.

A comparação de sequência pode ser feita no tamanho natural da sequência relevante aqui descrita.

Em vários aspectos, a invenção fornece genes de DA e 15 sequências de ácido nucléico que codificam polipeptídeos DA, como aqui descritos.

Por exemplo, um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo DA pode compreender uma sequência de nucleotídeo apresentada em uma entrada de base de dados selecionada do grupo que consiste de SGN20 U317073, SGN-U277808, SGN-U325242, AT4G36860, SGN-U209255,

A3082378,l, AT2G39830, CAN69394,1, OSO3G16090, 9234.M000024, 29235.M000021, AT5G66620, AT5G66630, AT5G66610, AT5G66640, AT5G17890, SGN-U320806, AB096533,l, CAL53532,1, 0506G08400, SGN-U328968, OS03G42820 e OS12G40490 ou pode ser variante ou um fragmento de uma destas sequências.

Outras entradas de base de dados de sequências de ácido nucléico que codificam polipeptídeos DA são mostradas na Tabela 7.

Em algumas formas de realização preferidas, um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo DA pode compreender a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 2 ou qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 16 ou pode ser uma variante ou fragmento desta sequência que codifica um polipeptídeo que retém atividade de DA.

Uma sequência variante pode ser um mutante, homólogo ou alelo de uma sequência DA de referência, tal como a SEQ ID NO: 2; qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 16; ou uma sequência tendo uma entrada de base de dados apresentada acima, e pode diferir da sequência DA de referência em uma ou mais de adição, inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos no ácido nucléico, levando à adição, inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos no polipeptídeo codificado. Naturalmente, mudanças para o ácido nucléico que não fazem nenhuma diferença para a sequência de aminoácido codificada são incluídos. Um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo DA pode compreender uma sequência tendo pelo menos 20 % ou pelo menos 30 % de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico DA de referência, preferivelmente pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 %. A identidade de sequência é descrita acima.

Um fragmento ou variante pode compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo DA funcional isto é, um polipeptídeo que retém uma ou mais características funcionais dos polipeptídeos codificados pelo gene DA do tipo selvagem, por exemplo, a capacidade para modular a duração do crescimento proliferativo.

Um ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que é uma variante de uma sequência de ácido nucléico DA de referência, tal como a SEQ ID NO: 2 ou qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 16, pode seletivamente hibridizar sob condições de severidade com esta sequência de ácido nucléico ou o seu complemento.

As condições severas incluem, por exemplo, para hibridização de sequências que são de cerea de 80 a 90 % idênticas, hibridização durante a noite a 42° C em Na₂HPO4 0,25 M, pH 7,2, 6,5 % de SDS, 10 % de sulfato de dextrano e uma lavagem final a 55° C em 0,lX SSC, 0,1 % de SDS. Para a detecção de sequências que são maiores do que cerca de 90 % idênticas, as condições adequadas incluem hibridização durante a noite a 65° C em Na₂HPO₄ 0,25 M, pH 7,2, 6,5 % de SDS, 10 % de sulfato de dextrano e uma lavagem final a 60° C em 0,lX SSC, 0,1 % de SDS.

Uma alternativa, que pode ser particularmente apropriada com preparações de ácido nucléico de planta, é uma solução de 5x SSPE (final NaCI 0,9 M, fosfato de sódio 0,05 M, EDTA 0,005 M pH 7,7), 5X solução de Denhardt, 0,5 % de SDS, a 50° C ou 65° C durante a noite. As lavagens podem ser realizadas em 0,2x SSC/0,1 % de SDS a 65° C ou de 50 a 60° C em lx SSC/0,1 % de SDS, como requerido.

Os ácidos nucléicos como aqui descritos podem ser total ou parcialmente sintéticos. Em particular, eles podem ser recombinantes em que as sequências de ácido nucléico que não são encontradas juntas na natureza (não ficam contiguamente) foram ligadas ou de outro modo artificialmente combinadas. Altemativamente, elas podem ter sido sintetizadas diretamente por exemplo, usando um sintetizador automatizado.

O ácido nucléico naturalmente pode ser de filamento duplo ou simples, cDNA ou DNA genômico ou RNA. O ácido nucléico pode ser total ou parcialmente sintético, dependendo do projeto. Naturalmente, a pessoa habilitada entenderá que onde o ácido nucléico inclui RNA, referência à sequência mostrada deve ser interpretada como referência ao equivalente de RNA, com U substituído no lugar de T.

Em vários aspectos, a invenção fornece polipeptídeos DA dominantes negativos e que codificam ácidos nucléicos. Um polipeptídeo DA dominante negativo pode aumentar um ou mais de tamanho de órgão, tamanho de semente ou longevidade sem afetar a fertilidade, na expressão em uma planta.

Um alelo negativo dominante de um polipeptídeo DA pode compreender um polipeptídeo DA tendo uma mutação, por exemplo, uma substituição ou deleção, em uma posição equivalente à posição 358 da SEQ IDNO: 1.

Por exemplo, um alelo negativo dominante de um polipeptídeo DA pode compreender uma mutação do resíduo R conservado em uma posição equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1. Em formas de realização preferidas, o resíduo R conservado pode ser substituído no lugar de K. A posição R358 da SEQ ID NO: 1 está localizada dentro da região conservada de terminal C (aminoácidos 250 a 532 da SEQ ID NO: 1). Um resíduo R em uma posição em uma sequência de polipeptídeo DA que é equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1 pode ser identificado alinhandose estas regiões conservadas de terminal C usando análise de sequência padrão e ferramentas de alinhamento.

O ácido nucleico que codifica um alelo negativo dominante de uma proteína DA pode ser produzido por qualquer técnica conveniente. Por exemplo, a mutagênese loco dirigida pode ser utilizada em um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo DA para alterar o resíduo R conservado na posição equivalente a R358 na SEQ ID NO: 1, por exemplo para K. Reagentes e kits para a mutagênese in vitro são comercialmente disponíveis. O ácido nucleico mutado que codifica o alelo negativo dominante de uma proteína DA e pode ser ainda clonado em um vetor de expressão e expressado em células de planta como descrito abaixo para alterar fenótipo de planta.

O ácido nucleico que codifica o polipeptídeo DA pode ser expressado na mesma espécie ou variedade de planta a partir da qual o mesmo foi originalmente isolado ou em uma espécie ou variedade de planta diferente (isto é, uma planta heteróloga).

“Heterólogo” indica que o gene/sequência de nucleotídeos em questão ou uma sequência que regula o gene/sequência em questão, foram introduzidos dentro das ditas células da planta ou um ancestral desta, usando engenharia genética ou meios recombinantes, isto é, pela intervenção humana. As sequências de nucleotídeo que são heterólogas para uma célula de planta podem não ser de ocorrência natural em células deste tipo, variedade ou espécie (isto é, exógena ou estranha) ou pode ser sequências que não são de ocorrência natural em que o ambiente sub-celular ou genômico das células ou pode ser sequências que não são naturalmente reguladas nas células isto é, operavelmente ligadas a um elemento regulador não natural. “Isolado” indica que a molécula isolada (por exemplo, polipeptídeo ou ácido nucléico) existe em um ambiente que é distinto do ambiente no qual o mesmo ocorre na natureza. Por exemplo, um ácido nucléico isolado pode ser substancialmente isolado com respeito ao ambiente genômico no qual o mesmo naturalmente ocorre. Um ácido nucléico isolado pode existir em um ambiente outro que não o ambiente no qual o mesmo ocorre na natureza.

Um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo DA como aqui descrito pode ser operavelmente ligado a uma sequência reguladora heteróloga, tal como um promotor, por exemplo um promotor constitutivo, indutível, específico de tecido ou específico de desenvolvimento.

Muitas sequências reguladoras adequadas são conhecidas na técnica e podem ser usadas de acordo com a invenção. Os exemplos de sequências reguladoras adequadas podem ser derivadas de um vírus de planta, por exemplo o promotor do gene do Vírus Mosaico da Couve Flor 35S (CaMV 35S) que é expressado em um nível alto virtualmente em todos os tecidos de planta (Benfey et al, (1990) EMBO J 9: 1677-1684). Outros elementos reguladores constitutivos adequados incluem o promotor 19S do vírus mosaico da couve flor; o Promotor do vírus mosaico da escrofulária; e promotor do gene da nopalina sintase (nos) (Singer et al., Plant Mol. Biol. 14: 433 (1990); An, Plant Physiol. 81: 86 (1986)).

As construções para a expressão dos genes DA sob o controle de um promotor constitutivo forte (o promotor 35S) são exemplificados abaixo mas aqueles habilitados na técnica avaliarão que uma ampla variedade de outros promotores pode ser utilizada com vantagem em contextos particulares.

Um promotor específico de tecido pode ser utilizado para expressar a forma negativa dominante do polipeptídeo DA em um órgão ou tecido específicos para aumentar o tamanho deste tecido ou órgão em relação aos tecidos ou órgãos nos quais o promotor específico de tecido não é ativo e a forma negativa dominante do polipeptídeo DA não é expressada. Por exemplo, para aumentar o tamanho de sementes, a forma negativa dominante do polipeptídeo DA pode ser preferencialmente expressada em tecido de semente, usando um promotor específico de semente. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser expressado integumento em desenvolvimento usando um promotor específico de integumento tal como o promotor INO (Meister R. M., Plant Journal 37: 426-438 (2004)) ou em embriões usando um promotor específico de embrião tal como o promotor H4 da histona (Devic M. Plant Journal 9; 205-215 (1996)).

Altemativamente ou além disso, poder-se-ia selecionar um promotor indutível. Deste modo, por exemplo, a forma negativa dominante do polipeptídeo DA pode ser expressada em tempos ou lugares específicos de modo a se obter mudanças desejadas no crescimento de órgão. Promotores indutíveis que incluem o sistema de expressão de gene AlcA indutível em álcool (Roslan et al., Plant Journal; Out de 2001; 28(2): 225-35) podem ser utilizados.

O ácido nucleico DA pode estar contido em uma construção de ácido nucleico ou vetor. A construção ou vetor são preferivelmente adequados para a transformação em e/ou expressão dentro de uma célula de planta.

Um vetor é, inter alia, qualquer plasmídeo, cosmídeo, fago ou vetor binário de Agrobacterium na forma de filamento duplo ou único linear ou circular, que pode ser auto transmissível ou mobilizável ou não, e que pode transformar hospedeiro procariótico ou eucariótico, em particular um hospedeiro de planta, pela integração no genoma celular ou existe extracromossomicamente (por exemplo, plasmídeo de replicação autônoma com uma origem de replicação).

São especificamente incluídos vetores transportadores pelo qual é intencionado um veículo de DNA capaz, naturalmente ou por planejamento, de replicação em dois organismos diferentes, que podem ser selecionados de Actinomyces e espécie, bactérias e células eucarióticas (por exemplo, de planta superior, de mamífero, levedura ou füngica) relacionados.

Uma construção ou vetor que compreende ácido nucléico como descrito acima não precisam incluir um promotor ou outra sequência reguladora, particularmente se o vetor deve ser usado para introduzir o ácido nucléico dentro de células para a recombinação no genoma.

As construções e vetores pode compreender ainda marcadores genéticos selecionáveis que consiste de genes que conferem fenótipos selecionáveis tais como resistência aos antibióticos tais como canamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfuron, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas, glifosato e d-aminoácidos.

Aqueles habilitados na técnica são bem capazes de construir vetores e planejar protocolos para a expressão de gene recombinante, em particular em uma célula de planta. Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, fragmentos de terminador, sequências de poliadenilação, sequências realçadoras, genes marcadores e outras sequências como apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 3^a edição, Sambrook & Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Aqueles habilitados na técnica podem construir vetores e planejar protocolos para a expressão de gene recombinante, por exemplo em uma célula microbiana ou de planta. Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação, sequências realçadoras, genes marcadores e outras sequências como apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 3^a edição, Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press e Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992.0s procedimentos e vetores específicos anteriormente usados com amplo sucesso em plantas são descritos por Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721), e Guerineau e Mullineaux, (1993) Plant transformation and expression vectors. Em: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148.

Quando da introdução de uma construção de gene escolhida em uma célula, certas considerações devem ser levadas em conta, bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. O ácido nucléico a ser inserido deve ser montado dentro de uma construção que contenha elementos reguladores eficazes que direcionará a transcrição. Deve estar disponível um método de transportar a construção para dentro da célula. Uma vez que a construção esteja dentro da membrana celular, a integração no material cromossômico endógeno ocorrerá ou não.

Finalmente, o tipo de célula alvo é preferivelmente tal que as células possam ser regeneradas em plantas inteiras.

Aqueles habilitados na técnica também avaliarão que na produção de construções para se obter a expressão dos genes de acordo com esta invenção, é desejável usar um método de construção e transformação que realce a expressão do ácido nucléico que codifica a forma negativa dominante do polipeptídeo DA. A integração de uma cópia única do gene dentro do genoma da célula de planta pode ser benéfica para minimizar os efeitos de silenciamento de gene. Do mesmo modo, o controle da complexidade da integração pode ser benéfico sob este aspecto. De interesse particular sob este aspecto é a transformação de células de planta que utilizam uma construção de expressão de gene mínima de acordo, por exemplo, com a Patente EP N° EP1407000B1, aqui incorporada por referência para este propósito.

Técnicas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica podem ser usadas para introduzir construções de ácido nucléico e vetores em células de planta para produzir plantas transgênicas com as propriedades aqui descritas.

A transformação com Agrobacterium é um método amplamente usado por aqueles habilitados na técnica para transformar espécies de planta lenhosa, em particular espécies de madeira dura tal como choupo. A produção de plantas transgênicas estáveis, férteis é agora rotina na técnica (ver por exemplo Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 10721074; Zhang, et al. (1988) Pant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274276; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, et al. (1991) International Rice Research

Institute, Manila, Filipinas 563-574; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, 603-618; D’Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, et al. (1992) Plant Molecular

Biology 18, 189-200; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194200; Vasil,

I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 15891594; WO92/14828; Nilsson, O. et al (1992) Transgenic Research 1, 209220).

Outros métodos, tais como bombardeamento de microprojétil ou partícula (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616), eletroporação (EP 290395, WO 8706614), microinjeção (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), captação de DNA direta (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), captação de DNA mediada por lipossoma (por exemplo, Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)) ou o método de turbilhonamento (por exemplo, Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d)) podem ser preferidos onde a transformação pela Agrobacterium é ineficiente ou ineficaz, por exemplo em algumas espécies de gimnosperma.

Os métodos físicos para a transformação de células de planta são revisados em Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11.

Altemativamente, uma combinação de técnicas diferentes podem ser utilizadas para realçar a eficiência do processo de transformação, por exemplo, bombardeamento com micropartículas revestidas com Agrobacterium (EP-A-486234) ou bombardeamento de microprojétil para induzir ferimentos seguidos pelo co-cultivo com Agrobacterium (EP-A486233).

A seguir da transformação, uma planta pode ser regenerada, por exemplo, a partir de células únicas, tecido de calo ou discos de folha, como é padrão na técnica. Quase qualquer planta pode ser totalmente regenerada a partir de células, tecidos e órgãos da planta. As técnicas disponíveis são revisadas em Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II e III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, e Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.

A escolha particular de uma tecnologia de transformação será determinada pela sua eficiência para transformar certas espécies de planta assim como a experiência e preferência da pessoa que pratica a invenção com uma metodologia particular de escolha. Estará evidente para a pessoa habilitada que a escolha particular de um sistema de transformação para introduzir ácido nucleico em células de planta não é essencial ou uma limitação da invenção, nem o é a escolha da técnica para a regeneração da planta.

Um outro aspecto da invenção fornece um método para alterar o fenótipo de uma planta que compreende:

expressar um ácido nucleico que codifica um polipeptideo DA negativo dominante dentro das células da dita planta em relação às plantas de controle.

Os polipeptideos DA negativos dominantes adequados e métodos para a expressão em células de planta são descritos acima.

Uma planta com fenótipo alterado produzida como descrito acima pode ter um período prolongado de crescimento proliferativo e pode demonstrar um ou mais de longevidade aumentada, tamanho de órgão aumentado e tamanho de semente aumentado em relação às plantas de controle. Preferivelmente, a fertilidade de plantas tendo o fenótipo alterado é normal. Os métodos aqui descritos podem ser úteis, por exemplo, no aumento dos rendimentos da planta, melhora do rendimento de grão em plantas de safra, e/ou para aumentar a biomassa de planta, por exemplo, na produção de biocombustíveis.

O efeito de alelos negativos dominantes de proteínas DA é aqui mostrado ser realçado pela redução ou abolição da expressão ou função da proteína Big Brother (BB) na planta.

Big Brother (BB) é uma ubiquitina ligase E3 que é conhecida reprimir o crescimento de órgão de planta (Disch, 2006). Uma proteína BB pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 (At3g63530 NP 001030922.1 GI: 79316205) ou a sequência de uma entrada de base de dados mostrada na tabela 9 ou pode ser um fragmento ou variante de qualquer uma destas sequências que retém a atividade de BB ou é capaz de interferir com a função de BB.

Um polipeptídeo BB que é uma variante de uma sequência BB de referência, por exemplo a SEQ ID NO: 9 ou a sequência de uma entrada de base de dados mostrada na Tabela 9, pode compreender uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % de identidade de sequência com a sequência de referência. A identidade de sequência é descrita em mais detalhes acima.

As variantes de sequência de aminoácido particulares podem diferir do polipeptídeo BB da SEQ ID NO: 9 pela inserção, adição, substituição ou deleção de 1, 2, 3, 4, 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 50 aminoácido ou mais do que 50 aminoácidos.

Em algumas formas de realização, um polipeptídeo BB pode compreender um A em uma posição que corresponde à posição 44 da SEQ ID NO: 9.

Um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo BB pode por exemplo compreender um nucleotídeo apresentado em uma entrada de base de dados mostrada na tabela 10 ou pode ser uma variante ou fragmento desta.

Em algumas formas de realização preferidas, um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo BB pode compreender a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 10 (NM 001035845.1 GI: 79316204) ou pode ser uma variante ou fragmento desta sequência que codifica um polipeptídeo que retém a atividade de BB.

Uma sequência variante pode ser um mutante, homólogo ou alelo de uma sequência BB de referência, tal como a SEQ ID NO: 10 ou uma sequência tendo uma entrada de base de dados apresentada na tabela 10, e pode diferir da sequência BB de referência em uma ou mais de adição, inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos no ácido nucléico, levando à adição, inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos no polipeptídeo codificado. Naturalmente, as mudanças para o ácido nucléico que não fazem nenhuma diferença para a sequência de aminoácido codificada são incluídas. Um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo BB pode compreender uma sequência tendo pelo menos 20 % ou pelo menos 30 % de identidade de sequência com a sequência BB de referência de ácido nucléico, preferivelmente pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 %. A identidade de sequência é descrita acima.

Um fragmento ou variante pode compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo BB funcional isto é, um polipeptídeo que retém uma ou mais características funcionais do polipeptídeo codificado pelo gene BB do tipo selvagem, por exemplo, atividade de ubiquitina ligase E3.

Um método para alterar um fenótipo de planta como aqui descrito pode compreender ainda reduzir ou abolir a expressão ou atividade de um polipeptídeo BB na dita planta.

Isto pode realçar ou aumentar o efeito da expressão de um polipeptídeo DA dominante negativo em um ou mais de tamanho de órgão, tamanho de semente ou longevidade.

Os métodos para reduzir ou abolir a expressão ou atividade de um polipeptídeo BB na dita planta são bem conhecidos na técnica e são descritos em mais detalhes abaixo.

A expressão da proteína ativa pode ser abolida pela mutação das sequências de ácido nucléico na célula de planta que codificam o polipeptídeo BB e regeneração de uma planta a partir da célula mutada. Os ácidos nucléicos podem ser mutados pela inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos. As técnicas para a inativação ou silenciamento de genes alvo são bem conhecidas no ramo.

Por exemplo, um alelo E0D1 de um polipeptídeo BB pode ser gerado pela introdução de uma mutação, tal como uma deleção, inserção ou substituição, em uma posição que corresponde à posição 44 da SEQ ID NO: 9, por exemplo, uma substituição de A para T. Uma posição em uma sequência de polipeptídeo BB que é equivalente à posição 44 da SEQ ID NO: 9 pode ser identificada usando a análise de sequência padrão e ferramentas de alinhamento. Outras mutações adequadas para abolir a expressão de uma proteína ativa estará facilmente evidente para a pessoa habilitada.

A expressão de proteína ativa pode ser reduzida usando técnicas de supressão. A supressão da expressão de polipeptídeos alvos em células de planta é bem conhecida na técnica. Supressores de ácido nucleico adequados podem ser cópias de todos ou parte do gene BB alvo inserido na orientação de anti-sentido ou de sentido ou ambos em relação ao gene BB, para obter a redução na expressão do gene BB. Ver, por exemplo, van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, e US-A5.231.020. Outros refinamentos deste método pode ser encontrado na WO95/34668 (Biosource); Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16, 12: 3675-3684; e Voinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: pg 553.

Em algumas formas de realização, os supressores de ácido nucleico podem ser supressores de sentido de expressão do polipeptídeo BB.

Um supressor de ácido nucleico de sentido adequado pode ser um RNA de filamento duplo (Fire A. et al Nature, Vol 391, (1998)). O silenciamento mediado pelo dsRNA é específico de gene e é frequentemente chamado de interferência de RNA (RNAi). RNAi é um processo de duas etapas. Primeiro, o dsRNA é clivado dentro da célula para produzir RNAs interferentes curtos (siRNAs) de cerca de 21 a 23 nt de comprimento com fosfato no terminal 5’ e projeções curtas em 3’ (~2 nt). Os siRNAs alvejam a sequência de mRNA correspondente especificamente para a destruição (Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001).

siRNAs (algumas vezes chamados de microRNAs) infraregulam a expressão de gene pela ligação aos RNAs complementares e deflagram a eliminação de mRNA (RNAi) ou interrompem a tradução do mRNA em proteína. O siRNA pode ser derivado pelo processamento de RNAs de filamento duplo longos e quando encontrados na natureza são tipicamente de origem exógena. Os RNAs micro-interferentes (miRNA) são RNAs não codificadores pequenos endogenamente codificados, derivados pelo processamento de grampos de cabelo curtos. Tanto siRNA quanto miRNA podem inibir a tradução de mRNAs que carregam sequências alvo parcialmente complementares sem a clivagem do RNA e degradam mRNAs que carregam as sequências totalmente complementares.

Consequentemente, a presente invenção fornece o uso de sequências de RNAi com base na sequência de ácido nucléico BB para a supressão da expressão do polipeptídeo DA. Por exemplo, uma sequência de RNAi pode corresponder a um fragmento da SEQ ID NO: 10 ou outra sequência de ácido nucléico BB aludida acima ou uma variante desta.

As moléculas de siRNA são tipicamente de filamento duplo e, de modo a otimizar a eficácia da infra-regulagem mediada pelo RNA da função de um gene alvo, é preferido que o comprimento e a sequência da molécula de siRNA seja escolhida para garantir o reconhecimento correto do siRNA pelo complexo RISC que medeia o reconhecimento pelo siRNA do alvo de mRNA e de modo que o siRNA seja curto o bastante para reduzir uma resposta do hospedeiro.

Os ligandos de miRNA são tipicamente de filamento único e têm regiões que são parcialmente complementares permitindo que os ligandos formem um grampo de cabelo. miRNAs são sequências de RNA que são transcritas a partir do DNA, mas não são traduzidas em proteína. Uma sequência de DNA que codifica um miRNA é mais longo do que o miRNA. Esta sequência de DNA inclui a sequência de miRNA e um complemento inverso aproximado. Quando esta sequência de DNA é transcrita em uma molécula de RNA de filamento único, a sequência de miRNA e seu par de base de complemento inverso para formar um segmento de RNA parcialmente de filamento duplo. O planejamento das sequências de microRNA é debatida em John et al, PLoS Biology, 11(2), 1862-1879, 2004.

Tipicamente, as moléculas de RNA intencionadas a imitar os efeitos de siRNA ou miRNA têm entre 10 e 40 ribonucleotídeos (ou seus análogos sintéticos), mais preferivelmente entre 17 e 30 ribonucleotídeos, mais preferivelmente entre 19 e 25 ribonucleotídeos e o mais preferivelmente entre 21 e 23 ribonucleotídeos. Em algumas formas de realização da invenção utilizando siRNA de filamento duplo, a molécula pode ter projeções 3’ simétricas, por exemplo, de um ou dois (ribo)nucleotídeos, tipicamente uma projeção UU de dTdT 3’. Com base na divulgação aqui fornecida, a pessoa habilitada pode facilmente planejar sequências de siRNA e miRNA adequadas, por exemplo usando recursos tais como descobridor de siRNA da Ambion, ver http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html. As sequências de siRNA e miRNA podem ser sinteticamente produzida e exogenamente adicionadas para causar a infra-regulagem do gene ou produzidas usando sistemas de expressão (por exemplo, vetores). Em uma forma de realização preferida, o siRNA é sinteticamente sintetizado.

Os RNAs de filamento duplo mais longo podem ser processados na célula para produzir siRNAs (ver por exemplo Myers (2003) Nature Biotechnology 21: 324-328). A molécula de dsRNA mais longa pode ter projeções 3’ ou 5’ simétricas, por exemplo, de um ou dois (ribo) nucleotídeos ou pode ter extremidades abruptas. As moléculas de dsRNA mais longas podem ter 25 nucleotídeos ou mais longa. Preferivelmente, as moléculas dsRNA mais longas estão entre 25 e 30 nucleotídeos no comprimento. Mais preferivelmente, as moléculas de dsRNA mais longas estão entre 25 e 27 nucleotídeos de comprimento. O mais preferivelmente, as moléculas de dsRNA mais longas têm 27 nucleotídeos no comprimento.

dsRNAs de 30 nucleotídeos ou mais no comprimento podem ser expressados usando o vetor pDECAP (Shinagawa et al., Genes e Dev., 17, 1340-5, 2003).

Uma outra alternativa é a expressão de uma molécula de RNA de grampo de cabelo curto (shRNA) na célula. shRNAs são mais estáveis do que siRNAs sintéticos. Um shRNA consiste de repetições invertidas curtas separadas por uma sequência de alça pequena. Uma repetição invertida é complementar ao alvo de gene. Na célula o shRNA é processado pelo DICER em um siRNA que degrada o mRNA do gene alvo e suprime a expressão. Em uma forma de realização preferida o shRNA é produzido endogenamente (dentro de uma célula) pela transcrição de um vetor. shRNAs podem ser produzidos dentro de uma célula pela transfecção da célula com um vetor que codifica a sequência de shRNA sob o controle de um promotor da RNA polimerase III tal como os promotores H1 ou 7SK humanos ou um promotor da RNA polimerase II. Altemativamente, o shRNA pode ser sintetizado exogenamente (in vitro) pela transcrição a partir de um vetor. O shRNA pode ser depois introduzido diretamente na célula. Preferivelmente, a molécula de shRNA compreende uma sequência parcial de SHR. Por exemplo, a sequência de shRNA está entre 40 e 100 bases no comprimento, mais preferivelmente entre 40 e 70 bases no comprimento. A haste do grampo de cabelo tem preferivelmente entre 19 e 30 pares de base no comprimento. A haste pode conter emparelhamentos G-U para estabilizar a estrutura do grampo de cabelo.

As moléculas de siRNA, moléculas de dsRNA mais longas ou moléculas de miRNA podem ser fabricadas recombinantemente pela transcrição de uma sequência de ácido nucleico, preferivelmente contida dentro de um vetor. Preferivelmente, a molécula de siRNA, a molécula de dsRNA mais longa ou molécula de miRNA compreendem uma sequência parcial da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ou uma variante desta.

Em outras formas de realização, os supressores de ácido nucléico podem ser supressores de anti-sentido da expressão de dois ou mais polipeptídeos DA. No uso de sequências de anti-sentido para inffa-regular a expressão de gene, uma sequência de nucleotídeo é colocada sob o controle de um promotor em uma “orientação inversa” tal que a transcrição produza RNA que é complementar ao mRNA normal transcrito a partir do filamento de “sentido” do gene alvo. Ver, por exemplo, Rothstein et al, 1987; Smith et al., (1988) Nature 334, 724-726; Zhang et al.,(1992) The Plant Cell 4, 15751588, English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188. A tecnologia de antisentido também é revisada em Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149, e Flavell (1994) PNAS USA 91, 3490-3496.

Um supressor de ácido nucléico de anti-sentido pode compreender uma sequência de anti-sentido de pelo menos 10 nucleotídeos de uma sequência de nucleotídeo é um fragmento da SEQ ID NO: 10 ou outra sequência BB aludida acima ou uma variante desta.

Pode ser preferível que exista identidade de sequência completa na sequência usada para a infra-regulagem da expressão de uma sequência alvo, e a sequência alvo, embora a complementaridade ou similaridade totais de sequência não sejam essenciais. Um ou mais nucleotídeos podem diferir na sequência usada do gene alvo. Assim, uma sequência utilizada em uma infra-regulagem da expressão de gene de acordo com a presente invenção pode ser uma sequência do tipo selvagem (por exemplo, gene) selecionada daquelas disponíveis ou uma variante de uma tal sequência.

A sequência não precisa incluir uma matriz de leitura aberta ou especificar um RNA que seria traduzível. Pode ser preferido que haja homologia suficiente para as respectivas moléculas de RNA de anti-sentido e de sentido a hibridizar. Pode haver infra regulagem da expressão de gene mesmo onde exista cerca de 5 %, 10 %, 15 % ou 20 % ou mais de desemparelhamentos entre a sequência usada e o gene alvo. Eficazmente, a homologia deve ser suficiente para que a infra-regulagem da expressão de gene ocorra.

Os supressores de ácido nucléico podem ser operavelmente ligados aos promotores específicos de tecido ou indutíveis. Por exemplo, promotores específicos de tegumento e semente podem ser usados para infra10 regular especificamente dois ou mais ácidos nucléicos DA em óvulos e sementes em desenvolvimento para aumentar o tamanho de semente final.

O ácido nucléico que suprime a expressão de um polipeptídeo BB como aqui descrito pode ser operavelmente ligado a uma sequência reguladora heteróloga, tal como um promotor, por exemplo um promotor constitutivo, indutível, específico de tecido ou específico de desenvolvimento como descrito acima.

A construção ou vetor pode ser transformado em células de planta e expressados como descrito acima.

Uma planta que expressa a forma negativa dominante do 20 polipeptídeo DA e, opcionalmente tendo a expressão reduzida ou abolida de um polipeptídeo BB, pode ser sexual ou assexualmente propagada ou a progênie ou descendentes podem ser cultivados.

Um outro aspecto da invenção fornece um método para produzir uma planta com um fenótipo alterado que compreende:

incorporar um ácido nucléico heterólogo que codifica um polipeptídeo DA negativo dominante em uma célula de planta por meios de transformação, e;

regenerar a planta a partir de uma ou mais células transformadas.

O fenótipo alterado da planta produzida pelo método é descrito em mais detalhes acima. O método pode ser útil, por exemplo, na produção de plantas tendo rendimentos aumentados, por exemplo, plantas de safra tendo rendimento de grau aumentado, em relação às plantas de controle.

Em algumas formas de realização, um método pode compreender ainda reduzir ou abolir a expressão ou atividade de um polipeptídeo BB na célula de planta ou planta.

Isto pode ser realizado antes, ao mesmo tempo ou depois da incorporação do ácido nucléico que codifica o polipeptídeo DA negativo dominante. Por exemplo, em algumas formas de realização, a expressão ou atividade de um polipeptídeo BB pode ser abolida ou reduzida em uma ou mais células de planta que já incorporam o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo DA negativo dominante. Em outras formas de realização, o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo DA negativo dominante pode ser incorporado em uma ou mais células de planta que têm a expressão abolida ou reduzida de um polipeptídeo BB.

Uma planta assim produzida pode compreender um ácido nucléico heterólogo que codifica um polipeptídeo DA negativo dominante e pode possuir expressão ou atividade abolida ou reduzida de um polipeptídeo

BB em uma ou mais de suas células de planta.

A expressão ou atividade de um polipeptídeo BB pode ser reduzida ou abolida como descrito acima. Por exemplo, um método pode compreender incorporar um ácido nucléico heterólogo em uma célula de planta por meios de transformação, em que o ácido nucléico codifica um ácido nucléico supressor, tal como um siRNA ou shRNA, que reduz a expressão de um polipeptídeo BB.

Os ácidos nucléicos heterólogos que codificam o polipeptídeo DA negativo dominante e supressor de ácido nucléico BB podem estar no mesmo vetor de expressão ou diferentes e podem ser incorporados na célula de planta pelas técnicas convencionais.

Os polipeptídeos DA negativos dominantes e supressores o ácido nucléico BB são descritos em mais detalhes acima.

Uma planta produzida como descrito acima pode ser sexual ou assexualmente propagada ou cultivada para produzir progênie ou descendentes. A progênie ou descendentes da planta regenerada a partir de uma ou mais células podem ser sexual ou assexualmente propagados ou cultivados. A planta ou a sua progênie ou descendentes podem ser cruzados com outras plantas ou com sigo mesmo.

Uma planta adequada para o uso nos presentes métodos é preferivelmente uma planta superior, por exemplo uma planta agrícola selecionada do grupo que consiste de Lithospermum erythrorhizon, Taxus spp, tabaco, curcúbitas, cenoura, brássica de planta, melões, pimenta de caiena, videiras, alface, morango, brássica de semente oleaginosa, beterraba açucareira, trigo, cevada, milho, arroz, sojas, ervilhas, sorgo, girassol, tomate, batata, pimentão, crisântemo, cravo, linhaça, cânhamo e centeio.

Um outro aspecto da invenção fornece uma planta que expressa um polipeptídeo DA dominante negativo e opcionalmente tem reduzida ou abolida a expressão de um polipeptídeo BB, em que a dita planta demonstra um fenótipo alterado em relação ao controle.

O polipeptídeo DA negativo dominante pode ser polipeptídeo heterólogo.

Uma planta adequada pode ser produzida por um método aqui descrito.

Como descrito acima, a planta pode ter um ou mais de longevidade aumentada, tamanho de órgão aumentado, duração aumentada de crescimento proliferativo e tamanho de semente aumentado em relação às plantas de controle. A planta pode ter fertilidade normal em relação às plantas de controle.

Uma planta de acordo com a presente invenção pode ser uma que não produza sempre cria com as características dos pais em uma ou mais propriedades. As variedades de planta podem ser excluídas, particularmente variedades de planta registráveis de acordo com o Plant Breeders Rights.

Além de uma planta que expressa um polipeptídeo DA dominante negativo, por exemplo, uma planta produzida por um método aqui descrito, a invenção abrange qualquer clone de uma tal planta, semente, progênie e descendentes auto-polinizados ou híbridos, e qualquer parte ou propágulo de qualquer um destes, tais como cortes e semente, que possam ser usados em reprodução ou propagação, sexual ou assexual. Também abrangida pela invenção está uma planta que é uma progênie, clone ou descendente sexual ou assexualmente propagados de uma tal planta ou qualquer parte ou propágulo da dita planta, progênie, clone ou descendente.

Os presentes inventores têm mostrado que reduzir ou abolir a expressão ou atividade de dois ou mais polipeptídeos DA também produz um fenótipo alterado caracterizado pela fertilidade normal e um ou mais de longevidade aumentada, tamanho de órgão aumentado, duração aumentada de crescimento proliferativo e tamanho de semente aumentado.

Um outro aspecto da invenção fornece um método para alterar o fenótipo de uma planta que compreende:

reduzir ou abolir a expressão ou atividade de duas ou mais proteína ativas DA em uma ou mais células da planta.

Um outro aspecto da invenção fornece um método para produzir uma planta com um fenótipo alterado que compreende:

reduzir ou abolir a expressão ou atividade de duas ou mais proteína ativas DA em uma célula de planta, e;

regenerar a planta a partir da célula de planta.

O fenótipo da planta a seguir da redução ou abolição da expressão é descrita em mais detalhes acima.

A expressão da proteína ativa pode ser abolida pela mutação de sequências de ácido nucléico na célula de planta que codifica as duas ou mais proteínas DA e regenerar uma planta a partir da célula mutada. Os ácidos nucleicos podem ser mutados pela inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos. As técnicas para a inativação ou silenciamento de genes alvos são bem conhecidos na técnica.

A expressão de polipeptídeos alvos em células de planta pode ser reduzida pelas técnicas de supressão. O uso de supressores de ácido nucléico para suprimir a expressão de polipeptídeos alvo em células de planta é bem conhecido na técnica e é descrita em mais detalhes acima.

Os supressores de ácido nucléico que reduzem a expressão de dois ou mais polipeptídeos DA podem ser operavelmente ligados a promotores específicos de tecido ou indutíveis. Por exemplo, promotores específicos de tegumento e semente podem ser usados para infra-regular especificamente dois ou mais ácidos nucleicos DA em óvulos e sementes em desenvolvimento para aumentar o tamanho de semente final.

Outros aspectos da invenção dizem respeito à super-expressão de polipeptídeos DA em células de planta. Um método para alterar o fenótipo de uma planta pode compreender:

expressar um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo DA dentro das células da dita planta.

A planta pode ter um fenótipo alterado caracterizado pela fertilidade normal e uma ou mais de longevidade reduzida, tamanho de órgão reduzido, duração reduzida de crescimento proliferativo e tamanho de semente reduzido em relação às plantas de controle.

O ácido nucléico que codifica um polipeptídeo DA pode ser expressado em uma célula de planta como descrita acima mutatis mutandis para os polipeptídeos DA dominantes negativos.

Um outro aspecto da invenção fornece um método para identificar um polipeptídeo DA dominante negativo que compreende:

fornecer um ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo DA, incorporar uma ou mais mutações no ácido nucléico, introduzir o ácido nucléico em uma célula de planta por meios de transformação;

regenerar a planta a partir de uma ou mais células transformadas e, identificar o fenótipo da planta regenerada.

Um fenótipo alterado que inclui fertilidade normal e um ou mais de longevidade aumentada, tamanho de órgão aumentado e tamanho de semente aumentado em relação às plantas de controle é indicativo de que o ácido nucléico mutado codifica um alelo DA negativo dominante.

Um outro aspecto da invenção fornece um método para 15 produzir um polipeptídeo DA negativo dominante que compreende:

fornecer uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo DA de planta, identificar um resíduo R no polipeptídeo DA de planta codificado em uma posição equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1 e mutar o ácido nucléico para alterar o dito resíduo R no polipeptídeo DA de planta codificado, a sequência de ácido nucléico mutante codificando um polipeptídeo DA dominante negativo.

O ácido nucléico mutado que codifica um polipeptídeo DA 25 dominante negativo que é identificado ou produzido como descrito acima pode ser usado para produzir plantas tendo o fenótipo alterado, como descrito acima.

“e/ou” onde aqui usado deve ser interpretado como divulgação específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo “A e/ou B” deve ser interpretado como a divulgação específica de cada um de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, exatamente como se cada um fosse aqui individualmente apresentado.

A menos que o contexto dite de outro modo, as descrições e 5 definições das características apresentadas acima não são limitadas a nenhum aspecto ou forma de realização particulares da invenção e aplicam-se igualmente a todos os aspectos e formas de realização que são descritas.

Tendo sido no geral descrita a invenção acima, certos aspectos e formas de realização da invenção serão agora ilustrados por via de exemplo para prolongar a descrição escrita e capacidade legal da invenção, e para garantir a divulgação adequada do melhor modo de praticar a invenção. Aqueles habilitados na técnica avaliarão, entretanto, que o escopo desta invenção não deve ser interpretado como sendo limitado pelos detalhes destes exemplos. Ao invés, variações, extensões, modificações e equivalentes destas extensões específicas e genéricas destes detalhes podem ser feitas sem divergir do escopo da invenção compreendido por esta divulgação. Portanto, para uma avaliação do escopo desta invenção e os direitos exclusivos aqui reivindicados, referência deve ser feita às reivindicações anexas a esta divulgação, incluindo seus equivalentes.

Todos os documentos mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Os conteúdos de todas as entradas de base de dados mencionados neste relatório descritivo também são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Isto inclui as versões de quaisquer sequências que são correntes na data de depósito deste pedido.

Exemplos

Os dados apresentados abaixo mostram que “DAI” é um regulador chave no término do crescimento de semente e órgão, e codifica uma nova proteína contendo domínios UIM e LIM. DAI é mostrada controlar tanto o tamanho da semente quanto o de órgão pela restrição da duração do crescimento proliferativo. eodl, um realçador de dal-1, é alélico para bb, sugerindo que o DAI e a ubiquitina ligase E3 de BB, “Big Brother” {Disch,

S. Curr Biol 16, 272-9 (2006); Science 289, 85-8 (2000)) podem atuar em caminhos paralelos para controlar o tamanho final de sementes e órgãos de planta. E possível que DAI e EOD1/BB possam compartilhar componentes a jusante que controlam o tamanho da semente e de órgão.

Estudo anterior tem mostrado que BB atua como um regulador negativo do crescimento de órgão, mais provavelmente pela marcação de proteínas celulares para a degradação (Disch, S. Curr. Biol. 16, 272-279 (2006)). DAI contém dois motivos UIM prognosticado, que pode ter a função de ligar ubiquitina e promover a ubiquitinação (Hurley, J. H. Biochem. J. 399, 361-372 (2006)).

A expressão do gene DAI é induzida pelo fito-hormônio ácido abscísico (ABA), e o mutante dal-1 é insensível ao ABA, fornecendo indicação de que ABA regula negativamente o crescimento de órgão através de DAI. Os efeitos inibidores de ABA sobre o crescimento foram a muito tempo reconhecidos como resultando de uma inibição da divisão celular (Lui, J. H. Plant 194, 368-373 (1994), compatível com o fato de que ABA pode induzir a expressão de um inibidor da cinase dependente de ciclina (ICK1), um regulador importante da progressão do ciclo celular (Wang, H. Cell Biol. Int. 27, 297-299 (2003)). No desenvolvimento de semente, a transição de sementes em desenvolvimento para sementes maduras também está correlacionado com um aumento no teor de ABA da semente (Finkelstein, R. R. Plant Cell 14 Supl. SI5-45 (2002)), o que sugere que ABA possa ser uma das marcas ambientais sentidas pelas plantas para controlar o tamanho final de sementes e órgãos, pela indução de reguladores do crescimento negativos tais como DAI. Nós aqui relatamos que um tal regulador de crescimento negativo é DAI.

Pela condução da análise genética dos mutantes duplos abi4ldal-1 e abi5-ldal-l, nós descobrimos que o fenótipo de tamanho de órgão grande de dal-1 é independente dos caminhos ABI4 e ABI5.

Nós também mostramos aqui que supressores de dal-1 (sodl) 5 são moléculas que têm uma segunda mutação de sítio no gene mutante dal-1 que são prognosticados reduzir a função de gene, indicando que a mutação R358K em DAI é responsável pelo tamanho de semente aumentado e que o alelo dal-1 interfere com as atividades de DARs.

Nós também mostramos aqui que o alelo R358K de dal-1 10 também interfere com as funções de DAI em uma maneira dependente da dosagem, como evidenciado pelo fato de que as plantas que super expressam o alelo dal-1 (35S::DA1R358K) no tipo selvagem têm tamanho da semente e de órgão grande. Este resultado também demonstra que o gene mutante dal-1 (DA1R358K) pode ser usado para engendrar geneticamente aumentos significantes no peso de semente e biomassa.

Até agora, alguns mutantes (por exemplo, ap2 e arf2) que exibem sementes grandes usualmente têm efeitos negativos fortes na sua fertilidade e crescimento (Schruff, M. C. Development 137, 251-261 (2006); Ohto, Μ. A. Proc. Natl. Acad. Sei USA 102, 3123-3128 (2005); Jofuku, K. D.

Proc. Natl Acad. Sei. USA 102, 3117-3122 (2005)). Entretanto, os experimentos apresentados abaixo mostram que dal-1 tem massa de semente aumentada, tamanho de órgão grande, mas fertilidade normal, comparada com o tipo selvagem.

Métodos

Materiais de planta

O acesso da Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) foi usado como um tipo selvagem. Todos os mutantes estão no fundo Col-0, exceto quanto ao dal-1 Ler e bb-1, que estão no fundo de Landsberg erecta. Antes da análise, dal-1 e dal-1 Ler foram retrocruzados em Col-0 e Ler seis vezes, respectivamente. As linhagens de inserção de T-DNA foram obtidas da SIGnAL (Salk Institute) e NASC (Nottingham).

Triagem genética e clonagem com base em mapa dal-1 foi identificado como um novo mutante de tamanho de 5 semente e de órgão de uma das populações M2 tratadas com metanossulfonato de etila (EMS) do acesso Col-0. sodl-1, sodl-2, sodl-3 e eodl-1 foram identificados como supressores e realçadores de dal-1 a partir de uma das populações M2 tratadas com metanossulfonato de etila (EMS) de dal-1, respectivamente. As populações de mapeamento F2 foram geradas a partir de um único cruzamento de Ler/dal-1, Ler/sodl-3dal-l, e dallLer/eodl-ldal-1. Uma lista de sequências iniciadoras é fornecida na Tabela

2.

Plasmídeos e plantas transgênicas

As seguintes construções foram geradas: DAI COM,

35S::DA1-HA, 35S::GFP-DA1, 35S::DA1-GFP, 35S::DA1R358K, pDAl::GUS, e 35S::EOD1.

Análise morfológica e celular

A preparação de amostra, medição, microscopia, e tingimento histoquímico para a atividade de S-glicuronidase usaram métodos padrão (Jefferson R., EMBO J. Embo J 6, 3901-3907 (1987).

DAI limita o tamanho de sementes e órgãos

Para identificar repressores do crescimento de semente e/ou órgão, nós triamos quanto a mutantes (DA significa ‘grande’ em Chinês) com tamanho de semente e/ou de órgão grande a partir de uma população mutagenizada EMS no acesso Col-0 de Arabidopsis thaliana. O mutante de dal-1 tem tamanho da semente e de órgão grande, mas fertilidade normal, comparada com o tipo selvagem (Figs. la-lp), fornecendo indicação de que o crescimento de semente e órgão compartilham mecanismos reguladores comuns. A análise genética com cruzamentos recíprocos entre dal-1 e plantas do tipo selvagem revelou que dal-1 possui uma mutação em um único local nuclear.

Para revelar diferenças no tamanho de semente entre tipo selvagem e mutante dal-1, nós examinamos o tamanho de semente do mutante dal-1 pelo ffacionamento das sementes produzidas pelas plantas do tipo selvagem e dal-1 individuais pelo uso de uma série de peneiras de malha de arame. As sementes do tipo selvagem foram retidas apenas nas malhas de abertura de 180-300 pm enquanto as sementes mutantes demonstraram uma mudança na faixa para tamanhos de exclusão maiores, 180-355 pm (Figs. 5a e 5b). Mais do que 80 % das sementes do tipo selvagem foram retidas em malhas de abertura de 250 pm, ao passo que cerca de 70 % das sementes dal1 foram retidas em malhas de abertura de 300 pm. Para determinar se o aumento no tamanho de semente em dal-1 refletiu uma altemação no tamanho do embrião, nós isolamos embriões maduros do tipo selvagem e sementes dal-1 mutantes. embriões maduros dal-1 foram significantemente mais gordos e mais longos do que aqueles do tipo selvagem (Fig. lc e ld). Nós observamos que a cavidade da semente em sementes dal-1 é maior por todo o desenvolvimento do que aquela no tipo selvagem (Fig. 6). Além disso a massa de semente média de mutante dal-1 é aumentada para 132 % daquela do tipo selvagem (Tabela 5).

A fertilidade da planta dal-1 foi descoberta ser normal e o peso de semente médio por planta dal-1 é mais alto do que para a planta do tipo selvagem (Fig. 5). Portanto, nós concluímos que DAI contribui para a determinação do tamanho de semente e peso de semente em Arabidopsis. Nós também identificamos exemplos de genes relacionados com DAI e DAR de plantas de safra que demonstram genes relacionados com funções relacionadas podem ser alvejados pela fabricação da mutação interferente dominante R358K ou reduzir a expressão de proteínas relacionadas com DAI e DAR selecionadas usando métodos de interferência de RNA descritos acima.

Nós investigamos se DAI atua maternal ou zigoticamente. Como mostrado na Tabela 1, o efeito da mutação dal-1 sobre a massa de semente foi observado apenas quando plantas maternas foram homozigotas para a mutação. As sementes produzidas por uma mãe dal-1, independente do genótipo do doador de pólen, foram compativelmente mais pesadas do que aquelas produzidas pelas plantas maternais do tipo selvagem. Ao contrário, os pólens mutante dal-1 e tipo selvagem produziram sementes cujo peso foi comparável com aquele de plantas maternas do tipo selvagem. Estes resultados mostram que dal-1 é uma mutação de efeito materno que afeta a massa de semente.

Além da massa de semente aumentada, o mutante dal-1 exibiu tamanho de órgão maior do que o do tipo selvagem (Fig. le-m e o). Comparada com as do tipo selvagem, as plantas dal-1 têm flores grandes (Fig. Ih e i) que frequentemente têm pétalas e carpelos extras (Fig. 7). O tamanho médio das pétalas de dal-1 foi de cerca de 1,6 vezes aquele de pétalas do tipo selvagem comparáveis (Fig. lo). As silíquas do mutante dal-1 foram amplas, deformadas e achatadas, comparadas com a forma estreita, lisa, cilíndrica de silíquas do tipo selvagem (Fig. lj e lk). Os mutantes dal-1 também forma cotilédones e folhas maiores, assim como hastes mais espessas do que as do tipo selvagem (Fig. le,-g , i, e m). Compatível com isto, os mutantes dal-1 acumulam mais biomassa na forma de flores e folhas do que as plantas do tipo selvagem (Fig. lp e q). Quando juntos, estes resultados indicam que DAI limita o tamanho de sementes e órgãos em Arabidopsis.

DAI restringe a duração do crescimento proliferativo

O tamanho de semente e órgão é determinado tanto pelo número de célula quanto pelo tamanho. Para entender qual parâmetro é responsável para o tamanho grande da semente e de órgão em mutante dal-1, nós analisamos o tamanho da célula de embriões, pétalas e folhas. Como mostrado na Fig. Ir, o tamanho das células de embriões, pétalas e folhas dal1, foram comparáveis com aquela de células do tipo selvagem correspondentes. O número de célula epidérmica da haste em mutante dal-1 é aumentado para 180 % daquele das hastes do tipo selvagem (Fig. In). Estes resultados indicam que os efeitos induzidos pela dal-1 sobre a massa de semente e tamanho de órgão são devido ao número de célula aumentado.

Para determinar como DAI limita o tamanho da semente e de órgão, nós realizamos uma análise cinemática de embriões, pétalas, e folhas no tipo selvagem e no mutante dal-1. Nós manualmente polinizamos plantas mutantes dal-1 e do tipo selvagem com seus próprios grãos de pólen e examinaram a duração de desenvolvimento da semente. A maior parte das sementes do tipo selvagem se desenvolveram no estágio de dissecação em 8 dias depois da fertilização, ao passo que a maioria das sementes dal-1 se desenvolveram no estágio maduro em 10 dias depois da fertilização em nossas condições de cultivo, sugerindo que o período de desenvolvimento de semente do mutante dal-1 foi prolongado. A plotagem do tamanho de pétala primordial e folhas com o tempo revelou que a ampliação do órgão no mutante dal-1 é principalmente devido a um período de cultivo mais longo de tempo (Fig. 2a, c). Compatível com isto, as plantas dal-1 têm órgãos mais jovens e mais frescos em estágios de desenvolvimento mais precoces (Fig. lg) e tempo de vida mais longo do que as do tipo selvagem (Fig. 12 e, f).

Para determinar como a divisão celular contribui para as dinâmicas de crescimento observadas, nós medimos o índice mitótico de pétalas e folhas no tipo selvagem e mutante. Um marcador de transgene da progressão do ciclo celular, uma fusão pCYCBl:l::GUS, foi usada para comparar o grau de proliferação celular nas pétalas em desenvolvimento de plantas do tipo selvagem e dal-1. As células nas pétalas dal-1 continuam a proliferar por um tempo mais longo do que aquelas nas pétalas do tipo selvagem (Fig. 2b). Similarmente, a parada do ciclo celular nas células de folhas também foi demorada (Fig. 8). A análise do nível de ploidia também indicou que o mutante dal-1 sai do ciclo celular mais tarde do que o tipo selvagem. Este resultado forneceu indicação de que dal-1 exibe proliferação de célula prolongada.

DAI codifica uma nova proteína contendo os domínios UIM e LIM

O local DAI foi mapeado fino para uma região de cerca de 30 quilobases (kb) usando marcadores com base na reação da cadeia da polimerase (Fig. 9). O sequenciamento de DNA revelou que o alelo dal-1 carrega uma única mutação de nucleotídeo de G para A no gene Atlg 19270 que co-segregou com o fenótipo dal-1 e resulta em uma mudança de uma arginina (R) para uma lisina (K) no aminoácido 358 da proteína prognosticada (Fig. 3a e Fig. 9a,b). Um plasmídeo binário (DAICOM) que carrega um fragmento genômico do tipo selvagem de 6,4 kb contendo a ORF inteira e um plasmídeo (35S::DA1) que carrega o promotor 35S mais o cDNA Atlgl9270 foram capazes de recuperar os fenótipos do mutante dal-1 (Fig. li-q e Fig. 2a), confirmando que o Atlg19270 é de fato o gene DAI.

DAI é prognosticado codificar uma proteína de 532 aminoácidos contendo dois motivos de interação de ubiquitina (UIM) (Hiyama, H. J. Bio. Chem. 274, 28019-28025 (1999)) e um domínio de ligação de zinco (LIM) presente em Lin-11, Isl-1, Mec-3 (Freyd, G. Nature 344, 876-879 (1990) no terminal N (ver as Sequências). O UIM é um motivo de peptídeo curto com a função dual de ligar ubiquitina e promover a ubiquitinação. Este motivo é conservado por todos os eucariotas e é presente em proteínas numerosas envolvidas em uma ampla variedade de processos celulares incluindo endocitose, tráfico de proteína, e transdução de sinal (Hurley J. H. Biochem. J. 399, 361-372 (2006)). O domínio LIM é um motivo de interação de proteína-proteína criticamente envolvido em uma variedade de processos biológicos fundamentais, incluindo organização de citoesqueleto, desenvolvimento de órgão e transdução de sinal (Dawid, I. B.

Trends Genet. 14, 156-162 (1998); Dawid, I. B. CR Acad. Sei. III 318, 295306 (1995); Kadrmas, J. L. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 920-931 (2004)). Sete outras proteínas prognosticadas em Arabidopsis compartilham similaridade de aminoácido extensiva (> 30 % de identidade) com DAI e foram nomeadas proteínas relacionadas com DAI (DARs) (ver o alinhamento de sequência D). As regiões conservadas entre DAI e DAR residem na porção de terminal C da molécula, indicando que estas regiões conservadas podem ser cruciais para a sua função. As proteínas que compartilham homologia significante com DAI fora do UIM e LIM também são encontradas em plantas e algas verdes, mas não em animais.

Os padrões de expressão espacial de DAI foram revelados pelos ensaios histoquímicos da atividade de β-glicuronidase (GUS) de plantas transgênicas contendo as fusões de promotor DA1::GUS (pDAl::GUS). O tingimento histoquímico mostra a expressão de gene DAI por toda a planta, incluindo cotilédones, folhas verdadeiras, flores, e embriões (Fig. 3b-h), compatível com os fenótipos de tamanho grande de plantas mutantes dal-1. Os níveis relativamente altos de atividade GUS foram detectadas em tecidos proliferativos (Fig. 3c-f). Além disso o promotor DAI também é ativo em raízes (Fig. 3b, c). Dados os efeitos de hormônios sobre o crescimento de órgão, nós testamos se qualquer uma das classes principais de fito-hormônios (ácido abscísico, ácido jasmônico, etileno, auxina, citocinina, giberelina, brassinosteróides e glicose) influenciaria a transcrição do gene DAI. O nível de expressão do gene DAI foi induzido lentamente por ABA (Fig. 3m), mas não por outros hormônios, sugerindo que o sinal ABA pode participar na regulagem de DAI. Compatível com isso, o mutante dal-1 é insensível a ABA (Fig. 3n), fornecendo indicação de que ABA pode ser um dos sinais ambientais que regulam o gene DAI para limitar o crescimento de semente e órgão.

Uma fusão de tradução de proteína fluorescente verde (GFP)47

DAI sob o controle do promotor 35S resgatou o fenótipo dal-1. Entretanto, nós não pudemos detecta o sinal GFP. Compatível com isto, nós também não pudemos detectar proteínas de DAI de plantas transgênicas que super expressam DAI com rótulos HA (35::DA1-HA) e GFP (35S::DA1-GFP) usando western blot fornecendo indicação de que a proteína de DAI é facilmente degradada ou clivada em plantas.

dal-1 atua como um tipo de mutação negativa dominante para as proteínas relacionadas com DAI

Para identificar os novos componentes do caminho DAI que determina o tamanho final do tamanho da semente e de órgão, nós triamos quanto a supressores dos fenótipos de tamanho grande de semente e de órgão de dal-1 (sod) e descobrimos três alelos sodl que foram mapeados para o local DAI original. Nós sequenciamos o gene DAI a partir destas linhagens e descobrimos que cada uma abrigou uma Segunda mutação de sítio que é prognosticada reduzir ou abolir a função de gene (Fig. 3 A). Estas mutações de sítio secundárias no gene mutante dal-1 suprimem o fenótipo dal-1 indicam que a mutação (R358K) dentro da sequência codificadora de DAI produz o tamanho grande da semente e de órgão. Compatível com isto, os rompimentos do gene DAI via inserções de T-DNA (dal-kol, dal-ko2 e dal-ko3) não demonstram nenhum fenótipo óbvio (Fig. 10). Para determinar se uma mudança de aminoácido encontrada no alelo dal-1 original foi necessário para o fenótipo dal-1, nós cruzamos dal-1 com tipo selvagem ou linhagens dal-ko. Todas as linhagens heterozigóticas (Fl) de cruzamentos entre Col-0 e dal-1 exibiram o fenótipo do tipo selvagem, ao passo que todas as plantas Fl de cruzamentos entre dal-1 e linhagens de T-DNA (dal-kol, dal-ko2 e dalko3) exibiram fenótipos similar ao dal-1 (Fig. S9). além disso o fenótipo dal1 também foi observado em plantas do tipo selvagem que carregam o transgene 35S::DA1R358K (Fig. li-r). Portanto, a mutação R358K em DAI é necessária e suficiente para causar o fenótipo dal-1.

Os alelos de perda de função não demonstram nenhum fenótipo óbvio. Nós portanto postulamos que DAI pode atuar redundantemente com DARs e a expressão do alelo dal-1 interfere com a capacidade de DARs para substituir DAI. Para testar esta hipótese, nós geramos mutantes duplos dal-koldarl-1. O mutante duplo dal-koldarl-1 demonstrou o fenótipo dal-1 original (Fig. 3i-l, Tabela 1 e Fig. 4e), indicando que dal-1 atua como um tipo de alelo interferente recessivo para DARs. Os fenótipos tamanho de semente e de órgão grande de plantas que super expressam o alelo dal-1 em Col-0 sugeriu que o alelo dal-1 também interfere com a atividade de DAI na maneira dependente da dosagem (Fig. liq)·

DAI atua em paralelo com EOD1/BB, independente de ANT, AXR1, ARF2 e

AP2

Em triagens de realçador, nós isolamos um alelo de um 15 realçador recessivo de dal-1 (eodl-1). As plantas eodl-ldal-1 exibem tamanho de semente e de órgão maior, mais pétalas extras e período de vida mais longo do que o dal-1 (Fig. 12a,b). Nós mapeamos a mutação eodl-1 e descobrimos que a mesma foi ligada ao gene Big Brother (BB) (At3g63530) que codifica uma ubiquitina ligase E3 e reprime o crescimento de órgão na

Arabidopsis {Disch, 2006}. O sequenciamento revelou que o alelo eodl-1 carrega uma única mutação de nucleotídeo de G para A no At3g63530 e resultou em uma mudança de uma Alanina (A) para uma Treonina (T) no aminoácido 44 da proteína BB prognosticada (Fig. 12c). A inserção de TDNA tanto no intron (eodl-2) quanto bb-1 também realçou os fenótipos dal-1 (Fig. 4 e Fig. 12d,e). Um plasmídeo binário (355::EOD1) que carrega o promotor 35S mais o cDNA At3g63530 foi capaz de recuperar o fenótipo do mutante eodl, indicando que EOD1 é o gene BB. Para determinar as relações entre EOD1/BB e DAI na limitação do tamanho de órgão, nós analisamos os níveis de expressão de mRNA de DAI em um mutante bb-1 e de BB em um mutante da 1-1. A expressão do gene DAI em um mutante bb-1 e do gene BB em uma planta dal-1 não é significantemente afetada, comparada com o tipo selvagem (Fig. 12a,b).

Para entender as relações genéticas entre EOD1/BB e DAI, nós medimos o tamanho da semente e pétala em mutantes duplos eodl-2dal-l e bb-1 dal-1 Ler e descobrimos que as mutações em EOD1/BB sinergisticamente realçam o fenótipo de dal-1 (Fig. 4, Fig. 11 d, e e 12a), fornecendo indicação de que os dois genes atuam em caminhos paralelos para limitar o tamanho da semente e de órgão em plantas (Fig. 4e).

Alelos aintegumenta (ant) exibem pétalas pequenas e plantas que super expressam ANT exibem aumento de órgão por causa de um período prolongado de crescimento de órgão {Krizek, Β. A. Dev Genet 25, 224-36 (1999); Mizukami, Y. Proc Natl Acad Sei U S A 97, 942-7 (2000)1, fornecendo indicação de que DAI e ANT funcionaria antagonisticamente em um caminho comum. Para testar isto, nós analisamos os níveis de expressão de mRNA de DAI em mutantes ant e de ANT e seu alvo a jusante CyclinD3;l no mutante dal-1. Os níveis de mRNA DAI não mostram mudanças robustas em mutantes ant (Fig. 12b). Similarmente, os níveis de mRNA tanto de ANT quanto de Cyclin3;l não são significantemente afetados pela mutação dal-1, como é o nível de mRNA de ARGOS {Hu, Y. Plant Cell 15, 1951-61 (2003)} (Fig. 11c, d, e). A análise genética também mostrou que o fenótipo de tamanho de pétala do mutante ant-5dal-l foi essencialmente aditiva, fornecendo indicação de que DAI e ANT atuam em caminhos independentes. Nós também geramos os mutantes duplos axrl-12dal-l, arf27dal-l e ap2-7dal-l, visto que os mutantes axrl, arf2 e ap2 têm tamanho de órgão e/ou semente alterados (Lincoln, C. Plant Cell 2, 1071-1080 (1990); Schruff, M. C. Development 137, 251-261 (2006); Ohto, Μ. A. Proc. Natl Acad. Sei USA 102, 3123-3128 (2005); Jofuku, K. D. Proc. Natl Acad. Sei. USA 102, 3117-3122 (2005)). A análise genética revelou que o fenótipo de tamanho da pétala do mutante axrl-12dal-l ou o fenótipo de tamanho de semente de arf2-7dal-l e ap2-7dal-l foram essencialmente aditivos (Fig. 12b,c,d,e), comparados com a suas linhagens precursoras. Portanto, nós concluímos que DAI parece atuar em paralelo com EOD1/BB, independente de ANT, ARX1, ARF2 e AP2.

A família da proteína de DAI em Arabidopsis thaliana

Como descrito acima, o gene DAI é prognosticado codificar uma proteína de 532 aminoácidos contendo dois motivos de interação de ubiquitina (UIM) típicos dos receptores de ubiquitina e um único domínio de ligação de zinco LIM definido pela sua conservação com os domínios Lin-11, Isl-1, e Mec-3 canônicos (Li et al. 2008). Em Arabidopsis, sete outras proteínas prognosticadas compartilham similaridade de aminoácido no terminal C extensiva (fora dos domínios UIM e LIM) com DAI e foram chamados de proteínas relacionadas com DAI (DAR), das quais quatro (DAR3, DAR5-7) são encontradas em um grupo em tandem no cromossoma

5. Usando SMART (http: //smart.embl-heidel berg.de/smart/showmotifs.pl), os domínios funcionais diferentes foram caracterizados (ver a Tabela 11).

UIM é o motivo que interage com a ubiquitina com dois resíduos de serina conservados requeridos para a ligação e forma uma estrutura de hélice α curta com ubiquitina (Haglund e Dikic 2005). LIM é um motivo de interação de proteína rica em cisteína, tem capacidade de ligação de zinco (Freyd et al. 1990). NB-ARC (significa “um adaptador de ligação de nucleotídeo compartilhado pelo APAF-1, certos produtos de gene R e CED4”) liga um módulo de interação de proteína-proteína a um domínio efetor, este é um novo motivo de sinalização compartilhado pelos produtos de gene de resistência da planta e reguladores da morte da célula em animais. LRRs são repetições ricas em leucina, são motivos de sequência curta e são considerados estar envolvidos nas interações de proteína-proteína. RPW8 pertence a uma família que consiste de diversas proteínas de resistência a mofo de amplo espectro de Arabidopsis thaliana.

Estas estruturas de proteína diversas fornecem indicação de que a família tem diversas funções e tem recentemente diversificado funcionalmente. A Tabela 11 pode ser usada para guiar a formação de mutantes duplos e triplos por exemplo, DAI, DAR1 são similares e foram mostrados funcionar redundantemente; é possível que DA6 e DAR7 também possam funcionar redundantemente entre si e DAI e DAR1 por causa das suas estruturas similares.

Caracterização de proteínas equivalentes a DAI (DAL) em 10 Physcomitrella patens, Selaginella moellendorffi, Brassica rapa,

Brachypodium distachyon e Oryza sativa

As sequências de aminoácido de Arabidopsis DAI e DAR1-7 foram usadas como questões para triar as bases de dados de Physcomitrella patens, Selaginella moellendorffi, Brassica rapa, Brachypodium distachyon e

Oryza sativa. Usando algoritmos BLAST diferentes, genes candidatos foram depois selecionados para a análise filogenética preliminar.

Proteínas equivalentes a DAI em plantas de solo precoces, Physcomitrella patens e Selaginella moellendorffi

Os ortólogos da família DAI em P. patens foram pesquisados 20 usando-se sequência de aminoácido DAI como questão em NCBI BLAST, e depois revisado em JGI P. patens BLAST (http: //genome.jgi-psf.org/ cgibin/runAlignment? db=Phypal _l&advanced=4). Oito genes (PpDALl-8) foram selecionados com base nas contagens, os valores E e análise filogenética preliminar. Todas as proteínas equivalentes a DAI de P. patens são mais curtas do que as sequências de aminoácido de DAI, devido à ausência dos dois domínios UIM no terminal N (ver a Figura 1), de acordo com o programa SMART (Simple Molecular Architecture Research Tool) (http: //smart.embl-heidelberg.de/). O projeto de sequenciamento de S. moellendorffi nos fornece uma oportunidade para investigar a ortologia da família DAI em planta vascular primária. Usando-se JGI 5. moellendorffi BLAST(http://genome.igi-psf.org/cgibin/runAlignment?db=Selmol&advanced =1), dois ortólogos foram encontrados, e comparando com as proteínas equivalentes a DAI de P. patens, eles tiveram comprimento de sequências de aminoácido similares com as proteínas da família DAI da Arabidopsis. As regiões que precedem o domínio LIM foram prognosticadas ser regiões de baixa complexidade pelo SMART, e nenhum motivo de sequência de proteína UIM evidente foi encontrado. Nós podemos concluir portanto que a estrutura da proteína de DAI característica não é encontrada em plantas inferiores. Proteínas equivalentes a DAI em Brassica rapa

Devido às relações evolucionárias de Arabidopsis e Brassica, os métodos BLAST de nucleotídeo para identificar ortólogos da família DAI de Brassica ortólogos foram usados. Na base de dados de Brassica (http: //www.brassica.bbsrc.ac.uk/), as sequências de cDNA de tamanho natural de Arabidopsis DAI e DAR1-7 foram usadas como questões. Por causa de uma duplicação de genoma inteiro recente, um gene de Arabidopsis provavelmente tem 2 ou 3 genes homólogos em Brassica rapa. Dois ortólogos de DAI e um ortólogo de DAR2 foram encontrados (Figura 1). Estes foram chamados genes DAL (Equivalentes a DA). Os ortólogos DAR3-7 de Brassica também foram encontrados em um grupo em tandem. O número de ortólogos de Brassica encontrado é menor do que o prognosticado provavelmente devido ao sequenciamento de genoma incompleto. As sequências parciais dos genes DAL de Brassica foram usados para planejar iniciadores para a amplificação específica de genes DAL de tamanho natural de B. rapa.

As proteínas equivalentes a DAI nas gramíneas Brachypodium distachyon e

Oryza sativa

Em Brachypodium distachyon, três ortólogos da família DAI principais foram identificados, e em Oryza sativa, quatro proteínas equivalentes a DAI foram encontradas usando PROTEIN BLAST no NCBI.

Os ortólogos DAI e DAR2 do arroz foram identificados e nomeados OsDAl e OsDAR2. No gene do arroz foi descoberto emparelhar DAR1 de Arabidopsis.

Na árvore filogenética da Figura 14 todas as proteínas 5 equivalentes a DA a partir de plantas vasculares formam um Ciado grande. Neste ciado, as proteínas equivalentes a DA de S. moellendorffi são altamente divergentes, mas é possível que as proteínas equivalentes a DA originem-se de briófitos, e funcionem como reguladores de tamanho desde a evolução das primeiras plantas vasculares (Lycophytes). Na árvore, um Ciado foi formado por AtDAR2, BrDAR2, BdDAL3 e OsDAR2. Estas sequências de proteína mostram similaridade maior, sugerindo que DAR2 evoluiu antes que as monocotiledôneas se originassem (ver o gráfico à direita da Figura 14) e é funcionalmente conservada durante a evolução. Um outro Ciado consiste de AtDAl, BrDAla e BrDAlb. A alta similaridade entre elas sugere que as proteínas de DAI de Brassica rapa tivessem a mesma função como AtDAl. O Ciado que consiste de OsDAl, BdDALl e BdDAL2 foi colocado separadamente deste Ciado (ver a Figura 14), indicando que as proteínas de DAI de grama podem ser de modo funcional levemente divergente daquelas nas Brassicaceae. Todas as DAR1 e DAR3-7 de Brassicaceae foram colocadas em um Ciado, indicando que estes genes provavelmente surgiram de DAI ou DAR2 na duplicação do genoma dentro das Brassicaceae. Esta hipótese foi parcialmente provada pela análise genética, que demonstrou, em Arabidopsis, que DAI e DAR1 são redundantes funcionais.

A análise funcional das proteínas equivalentes de DAI em Brassica rapa,

Oryza sativa

Em ambiente virtual, dois genes equivalentes a DAI de

Brassica rapa (BrDAla, BrDAlb) e um gene equivalentes a DAI do arroz (OsDAl) foram identificados. cDNAs de tamanho natural foram sintetizados e seqüenciados usando vetores TOPO direcionais. As características bioquímicas prognosticadas de AtDAl, BrDAla, BrDAlb e OsDAl são mostradas na Tabela 12. As proteínas que estes três genes codificam têm características bioquímicas muito similares, particularmente os dois de Brassica. De maneira interessante, embora a análise com base nas sequências de aminoácido mostrassem que BrDAla está mais próximo de AtDAl, BrDAlb foi prognosticado ter mais características bioquímicas similares a AtDAl (Tabela 12).

Os fenótipos de dal-1 são recuperados pelos genes BrDAla, BrDAlb e

OsDAl

Os cDNAs de BrDAla, BrDAlb e OsDAl de tamanho natural foram sub-clonados em vetores TOPO e transferidos para vetores de destinação binária pMDC32 pela recombinação LR. Estes vetores expressam cDNAs a partir do promotor 35S constitutivo. As plantas dal-1 foram transformadas para testar se os genes DAL tipo selvagem de Brassica e arroz complementariam os fenótipos de crescimento grande de plantas dal-1. As plantas transgênicas 35S::BrDAla e 35S::OsDAl mostraram complementação pelo menos parcial (ver a Figura 15A-D). de maneira interessante, embora BrDAlb não seja o homólogo mais próximo a AtDAl, as plantas transgênicas 35S::BrDAlb mostraram complementação completa do fenótipo dal-1 (ver as Figuras 15E-G), compatível com a alta similaridade bioquímica com AtDAl (ver a Tabela 12). Duas rodadas de transformantes foram triadas. Na primeira rodada, 10 das 40 plantas TI de 35S::BrDAla e 3 das 11 plantas TI de 35S::OsDAl mostram fenótipos de silíquas na Figura 15A-D. Na segunda rodada, 30 das 150 35S::BrDAlb mostraram os fenótipos de folhas de roseta na Figura 15E-G. Estes são dados convincentes de que BrDAlb funciona como DAI de Arabidopsis. Consequentemente nós demonstramos que DAI e genes relacionados têm funções similares no controle do tamanho de órgão e semente em Brassica e arroz, e provavelmente em muitos outros tipos de plantas.

BrDAla^R358K pode interferir com a função de AtDAl em plantas Col-0

A mutagênese loco dirigida foi usada para gerar a mutação equivalente a R358K no cDNA de BrDAla no vetor TOPO e depois o cDNA mutado foi transferido para vetores de destinação pMDC32 usando o sistema gateway. Os fenótipos dal-1 típicos foram observados em plantas Col-0 tipo selvagem que expressam 35S::BrDAla^R35SK (ver as Figuras 15E,F,H), incluindo fenótipos de órgão grande. Neste experimento de transformação, 60 plantas transgênicas Tl foram triadas e 7 destas foram descobertas ter fenótipos de órgão grande característicos observados em plantas dal-1.

Estabilidade da proteína de DAI.

Nós observamos que os transformantes que expressam as fusões da proteína GFP com o terminal C da proteína de DAI de tamanho natural complementa o fenótipo de órgão grande DAI , demonstrando que a proteína de fusão é totalmente funcional. Entretanto, nós não detectamos fluorescência de GFP em muitas linhagens transgênicas, para fornecer indicação de que os níveis de proteína de DAI GFP são muito baixos. Isto é sustentado pela observação de que a detecção da proteína de DAI com um bom anticorpo específico em extratos de planta é muito difícil. Nós portanto testamos a estabilidade da proteína de DAI em Arabidopsis usando a proteína de DAI expressada na E. coli e extratos de proteína isentas de célula de Arabidopsis. A proteína de DAI de tamanho natural expressada e purificada como uma proteína de fusão de GST de terminal N, foi incubada com extratos de proteína de Arabidopsis e ATP, e submetida à análise de Western usando um anticorpo DAI específico. A proteína de DAI foi descoberta ser rapidamente degradada sob estas condições. MG 132, um inibidor específico do proteassoma, foi descoberto abolir esta degradação. Portanto, DAI é rapidamente degradado pelo proteassoma em Arabidopsis. Os motivos UIM de DAI são prognosticados, com base no conhecimento da função UIM em células de animal, como estando envolvida na ubiquitinação. Pode ser que

DAI seja ubiquitinado e alvejado para a degradação como parte do mecanismo de controle do crescimento.

Precursor	F1 Peso de Semente
Feminino	Masculino
Col-0	Col-0	2,368 ± 0,023
Col-0	dal-1	2,427 ±0,031
dal-1	Col-0	3,189 ±0,042
dal-1	dal-1	3,231 ±0,046
0 peso de	semente médio	é dado em mg por 100
sementes. Os valores de desvio padrão foram dados
(n = 5). As plantas foram cultivadas juntas nas mesmas
condições.

Tabela 1 DAI atua matemalmente para controlar o peso de semente

Marcador	Iniciador direto	Iniciador inverso	Enzima íon de restrição
TlfiNll	TAATTTAATATTTCCTTCTTCCCC	TTACTTTGACTCACTTTCACCAC
F6A14	AATTAGAATAATAATGCADCGTTG	CGTTTCGCTATCGCTrTGCG
F14D16-12	TTG GTT TTC GTT GGG TCA AGG	TGTTTCTGCAGAAGOGAGGG
T29M8-26	ARTCACGTGGTGTTCTTAGCC	actcattttggcagcttggtg
DAICAPS	GACACCATGCAATGCCAACC	CTTTCAGCCTCATCCACGCA	Hnll
F18O14-78	CTCAGGCTCAGGTAAATGCG	TTCACGTCCGAAACGCATCC	Ssaffl
F18014-52	CTAACACGACCCACATGATCC	CTCGAGTTTCGTGGTTACGG	Nspl
T20B2	AGCATCCTCAAGGTATAAGCC	GOTGCTGCATTTCTGTCACC
CER451450	GGTTGCTCTAAATCACCTAACG	CTCACCAAGAATATGCATATGTG

As enzimas de restrição para os marcadores CAPS ou dCAPS são indicadas e as outras são marcadores SSLP

Tabela 2 Lista de marcadores moleculares com base na PCR.

Nome do gene	Iniciador direto	Iniciador inverso
RT-DAl	ATCGGTTGGTTTAACAAGATCTTT	AACCGGGAATCTACCGGTCA
RT-DAR1	ATGGAGTTTCTTCTCITTCTTGG	TTAAATCCATTTAGGAAATGTACCG
RT-ACTIB	GAGAAGATGACTCAGATC	ATCCTTCCTCATATCGAC
QRT-DA1	GACACCATGCAATGCCAACC	CTTTCAGCCTCATCCACGCA
QRT-TUB6	GGTGAAGGAATGGACGAGAT	GTCATCTCCAGTTGCGTCTT

Tabela 3 Lista de Iniciadores para a RT-PCR e QRT-PCR

Linhagens de T-DNA

SAI^K—12 60 92 SALK_110232 SALK054295 SALK_06710Q 5ΑΙλΚ_016122 SALK04S169

Lba

LP

AAGCCAGCTAAATATGATTGG

GAATTTGGTTCGGTTGGTTTG

TCCTCTTGGTTGAGAGACAAGC

ATTTAGTCGAAGCCATGCATG

TGAGGTGGCCTATTTTGATACC

GAGCGATGCATCTCTAACCAC

TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG

RP

ÃÃTCCCTTTOGftÃCTOTTTTC

TCACATGCCAGAAACAAGAGG

TCCATTTGGGTTCTTAAACCG

TTACAAGGAGCAGCATCATCC

CACAACCTTAGTCACTTCAGAAGG

AGTAGGAACAGAAAGCAGGGG

Tabela 4 Lista de Iniciadores para verificar T-DNA.

Genótipo	Peso de semente médio Βφ	% de aumento em relação ao tipo selvagem
Col-0	2,206 + 0,015
dal-1	2,915 ± 0,039	+32
CAICOM # 2	2,182 ± 0,022
DA1C0M 9 3	2,301 ± 0,018
3SS: . DAI*35’* # 2	3>5X3 £ 0s026	+14
35S: :DAl*istK # 5	2,672 ± 0,019	+21
dal~kol	2 ,231 ± 0,029
dar1-1	2 ,199 ± 0,032
dal-kol darl-1	2 ,727 ± 0,019	+24

As plantas foram cultivadas sob condições idênticas.

O peso de semente médio é dado em mg por 100 sementes. Os valores de desvio padrão foram dados (n = 5). Os aumentos percentuais no peso de semente foram calculados com base na comparação com aqueles das sementes do tipo selvagem produzidas sob condições de cultivo similares.

Tabela 5 DAI controla o peso de semente l:CA061229 produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] gi| 157335399|emb|CA061229.11 [157335399]

2: EAZ36049 proteína hipotética OsJO 19532 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gij 125596269|gb|EAZ36049.1| [125596269]

3: EAY99923 proteína hipotética Osl_021156 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] gi| 125554318|gb|EAY99923.1| [125554318]

4: NP 001056985

OsOógO182500 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi| 115466772|ref|NP_001056985.11 [115466772]

5: CA022922 produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] gi| 157348212|bem|CA022922.11 [ 157348212]

6:EAZ21100 proteína hipotética OsJ_035309 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi|125579954|gb|EAZ21100.11 [125579954]

7: NP 001067188

0sl2g0596800 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi| 115489402|ref]NP_001067188.11 [ 115489402]

8: CA022921 produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] gi| 1573482 ll|bem|CA022921.1| [157348211]

9: AAW34243 proteína contendo domínio LIM putativa [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi|57164484|gb|AAW34243.1| [57164484]

10: AAW34242 proteína contendo domínio LIM putativa [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi|57164483|gb|AAW34242.1| [57164483]

11: NP 001050702

0s03g0626600 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi1115454203 |ref]NP_001050702.11 [ 115454203]

12: EAY83760 proteína hipotética Os 1 037719 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] gi|125537272|gb|EAY83760.1|[125537272]

13:EAZ27845 proteína hipotética OsJ_011328 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi| 125587181 |gb|EAZ27845.11[125587181]

14: NP 001049668

0s03g0267800 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi1115452135 |reflNP_001049668,11 [ 115452135]

15:EAY91080 proteína hipotética Osl_012313 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] gi1125544941 |gb|EAY91080.11 [ 125544941 ]

16: AAP06895 proteína hipotética [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gi129893641 |gb| AAP06895.11 [29893641 ]

17:EAY89390 proteína hipotética Os 1 010623 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] gi| 125543251 |gb|EAY89390.11[125543251]

18: CA016347 produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] gi1157346464|emb|CA016347.11 [ 157346464]

19: CAN64300 proteína hipotética [Vitis vinifera] gi|147817187|emb|CAN64300.1|[147817187]

20: CAN69394 proteína hipotética [Vitis vinifera] gi|147768077|emb|CAN69394.1|[147768077]

Tabela 6

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) OsOógO 182500 (Os06g0182500) mRNA, cds completo gi1115466771 |reflNM_001063 520.11 [ 115466771 ]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: 001201-F 10, sequência de inserto completa gi|32990928|dbj|AK105719.1|[32990928]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA:

J023004G21, sequência de inserto completa gi|32979080|dbj|AK069056.1| [32979080]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0sl2g0596800 (0sl2g0596800) mRNA, cds completa gi1115489401 |ref]NM_001073 720.11 [ 115489401 ]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA:

J013039D10, sequência de inserto completa gi |329757781dbf] AK065760.11 [32975778]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA:

J013073011, sequência de inserto completa gi|32976683|dbj|AK066665.11 [32976683]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0s03g0626600 (0s03g0626600) mRNA, cds parcial gi| 115454202|reflNM_001057237.11[115454202]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: 001043-H07, sequência de inserto completa gi|32972053|dbf|AK062035.1|[32972053]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0s03g0267800 (0s03g0267800) mRNA, eds completa gi1115452134|reflNM_001056203.11 [ 115452134]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA:

J023020C05, sequência de inserto completa gi1329796101dbf] AK069586.11 [32979610]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) mRNA desconhecido

29050 isolado gi|29368349|gb|AY224559.11 [29368349]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) mRNA da proteína equivalente à resistência à doença 29050 isolado, eds parcial gi|29367476|gb|AY224475.1|[29367476]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) DNA genômico, cromossoma 6 gi|5 8531193 |dbf] AP008212.11 [5 8531193]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) DNA genômico, cromossoma 6, clone BAC: OSJNBb0036B04 gi|50657316|dbj|AP007226.1|[50657316]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) DNA genômico, cromossoma 12 gi|58531199|dbj|AP008218.11[58531199]

Oryza sativa cromossoma 12, BAC OSJNBa0056D07 da biblioteca OSJNBa do cromossoma 12 do cultivar Nipponbare da ssp. japonica de Oryza sativa (arroz), sequência completa gi|23897123|bem|AL928754.2|[23897123]

Oryza sativa cromossoma 12, BAC 0J1306 H03 da biblioteca

Monsanto do cromossoma 12 do cultivar Nipponbare da ssp. japonica de

Oryza sativa (arroz), sequência completa gi|20513132|emb|AL713904.3|[20513132]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) DNA genômico, cromossoma 3 gi|58530789|dbf]AP008209.1|[58530789]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) cromossoma 3 clone

OSJNBa0002I03 mapa E1419S, sequência completa gi157164481 |gb| AC091246,8| [57164481 ]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) cromossoma 3 clone

OJA1364E02, sequência completa gi1279018291gb | AC 139168.11 [27901829]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) cromossoma 3 clone

OJ1364E02, sequência completa gi|27901828|gb|AC135208.3|[27901828]

Oryza sativa cromossoma 3 BAC OSJNBb0013K08 sequência genômica, sequência completa gi|16356889|gb|AC092390.3|[l 6356889]

Oryza sativa (grupo do cultivar indica) clone OSE-97-192-H5 mRNA da proteína de ligação do íon zn, cds parcial gi|149390776|gb|EF575818.1|[149390776]

Oryza sativa (grupo do cultivar indica) clone de cDNA:

OSIGCRA102J03, sequência de inserto completa gi[ 116633496|emb|CT833300.11[116633496]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) OsOlg0916000 (Os01g0916000) mRNA, cds completa gi j 115441820|reflNM_001051725.11 [ 115441820]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) DNA genômico, cromossoma 1 gi|58530787|dbj|AP008207.1|[58530787]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) DNA genômico, cromossoma 1, clone PAC: PO413C03 gi| 19386744|dbf]AP003451.4j [ 193 86744]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) DNA genômico, cromossoma 1, clone PAC: P0004D12 gi|208049801dbj | AP003433.31 [20804980]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: 002101-004, sequência de inserto completa gi132991509|dbj| AK106300.11 [32991509]

Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) cDNA, clone:

J100024013, sequência de inserto completa gi| 160124661dbj | AK243101.11 [ 116012466]

Zea mays clone EL01N0524A08.d mRNA sequência gi|54653541|gb|BT018760.1|[54653541]

Zea mays PC0156068 sequência de mRNA gi|21212590|gb | AY109151.1 ] [21212590]

Zea mays clone EL01N0553E07 sequência de mRNA gi|85540336|gb|BT024085.1|[85540336]

Zea mays clone E04912705F06.C sequência de mRNA gi|54651736|gb|BT016955.1|[54651736)

Zea mays gene da nitrato redutase, região promotora gi|4894987|gb|AF 141939.1|AF 141939| [4894987]

Hordeum vulgare subsp. vulgare clone de cDNA: FLbaf82hl6, sequência de mRNA gi|151419042|dbf]AK250393.1|[151419042)

Vitis vinifera, sequência de shotgun de genoma inteiro, contig

VV78X106678.4, clone ENTAV 115 gi|123680846|emb|AM488121.1|[123680846]

Vitis vinifera contig W78X222701,5, sequência de shotgun de genoma inteiro gi|147817185|emb|AM484789.2|[147817185]

Vitis vinifera, sequência de shotgun de genoma inteiro, contig

VV78X165152.5, clone ENTAV 115 gi|123703056|emb|AM483648.1|[123703056]

Vitis vinifera contig VV78X263569.4, sequência de shotgun de genoma inteiro gi|147790377|emb|AM453516.2|[147790377]

Vitis vinifera contig VV78X179395.3, sequência de shotgun de genoma inteiro gi| 147769864|emb| AM45633 7.2| [ 147769864]

Vitis vinifera contig VV78X219892.2, sequência de shotgun de genoma inteiro gi|147780236|emb|AM461946.2|[147780236]

Vitis vinifera, sequência de shotgun de genoma inteiro, contig

VV78X014445.8, clone ENTAV 115 gi|123704690|emb|AM483793.1|[123704690]

Vitis vinifera contig VV78X193742.9, sequência de shotgun de genoma inteiro gi|147768076|emb|AM435996.2|[147768076]

Lotus japonicus DNA genômico, cromossoma 2, clone:

LjB06D23, BM0787, sequência completa gi|37591131 |dbj | AP006541.11 [37591131 ]

Agropyron cristatum pseudogene da subunidade da glutelina de peso molecular alto tipo Bsil y isolado, sequência completa gi|71159564|gb|DQ073532.1|[71159564]

Agropyron cristatum pseudogene da subunidade da glutelina de peso molecular alto tipo Btil y isolado, sequência completa gi|71159568|gb|DQ073535.11 [71159568]

Agropyron cristatum pseudogene da subunidade da glutelina de peso molecular alto tipo y Bfil isolado, sequência completa gi|71159563|gb|DQ073531.1|[71159563]

Pinus taeda gene da proteína da parede celular putativa (lp5), eds completa gi|2317763|gb|AF013805.1|[2317763]

Brassica rapa subsp. pekinensis clone KBrHOllGlO, sequência completa

	gi|110797257|gb|AC189577.1|[l 10797257] Brassica rapa subsp. pekinensis clone KBrB032C14, sequência
completa	gi11107969861gb| AC 189306.11 [ 110796986] Brassica rapa subsp. pekinensis clone KBrBOl 1P07, sequência
completa	gi j 110744010|gb| AC 189225.11 [ 110744010] Choupo sequências de cDNA gi1115416791 |emb|CT029673.11 [ 115416791 ] Choupo sequências de cDNA gi| 115416790|emb|CT029672.11 [ 115416790] Coffea arabica DNA de microssatélite, clone 26-4CTG gi|13398992|emb|AJ308799.1|[13398992] Medicago truncatula clone mth2-34ml4, sequência completa gi|61675739|gb|AC126779,19|[61675739]

Medicago truncatula cromossoma 5 clone mth2-5p5, SEQUÊNCIA COMPLETA gi|l 19359633|emb|CU302347.1|[l 19359633]

Medicago truncatula cromossoma 8 clone mth2-14m21, sequência completa

em folha

gi|50355770|gb|AC148241.21|[50355770] Solanum lycopersicum cDNA, clone: LEFL1035BCO2, HTC gi|148538338|dbf]AK247104.1|[148538338] Mimulus guttatus clone MGBa-44P14, sequência completa gi| 150010729|gb|AC 182564.21 [150010729]

Mimulus guttatus clone MGBa-64L10, sequência completa gi|154350257|gb|AC182570.2|[154350257]

Selaginella moellendorffii clone JGIASXY-5119, sequência completa gi|62510100|gb|AC158187.2|[62510100]

M. truncatula DNA sequência do clone MTH2-170H18 no cromossoma 3, sequência completa gi|115635794|emb|CT967314.8|[l 15635794]

Vigna unguiculata mRNA de glutelina 2, eds parcial gi|4973069|gb| AF 142332.11AF 1423 321 [4973069]

Tabela 7 clones de cDNA da Soja gb|CX71X863.1ICX711863 gb|BM52S343.1|BM525343 gbjBGlS6297.1|BG156297 gb|BM308148.X|BM308148 gb|AI856660.X|AI856660 gb|BP596520.X|BF596520 gb|BI472193.1|BI472193 gb|CO982042.X|CO982042 gb|BMX43278.X|BM143278 gb|AW831270.1|AW831270 gb|BE329874.X|BB329874 gb|BG652163.X|BG652163 gb|BI967821.X|BI967821 gb|BI321493.1|BI321493 gb|BV546579.l|BU546579 gb|C0984945.1(CO98494S gb|DM247614,1|DM247614 gb|BG726202.1(BG726202 gb|BI968915.1(BI96891S gb|BG043212.1|BG043212 gb|BG510065.1|BG510O65 gb|BG043153.1(BG043153 gb|AM832591.1|AW832591 gb|AI856369.l|AI8S6369 gbIΒΣ699452.X|BI699452 gb|BG650019.1|BG650019 gb]AW234002.1|AW234002 gb|AM3XO220.l|AM31O220 gb|AM394699.l|AM394699 gb|AM832462.X jAMS32462 gb|AM459788.1|AW4S9788 gbIBM731310.1IBM731310 gb|BI3X7518.1|BI317518 gb|AI988431.1|AI98843X gb|CA801874.1|CA801874 gb|BE0S7592.11BE0575 92 gb|AW102002.1|AWX02O02 gb|CA938750.11CA938750 gb|AW397679.1|AM397679

Tabela 8 emb|CA040855.1| produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] gb|EAY88740.1| proteína hipotética Osl_009973 [Oryza 5 sativa (grupo do cultivar indica)] gb|EAZ25768.1| proteína hipotética OsJ_009251 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] ref]NP_001049123.1|Os03g0173900 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] emb|CA021927.11 produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] emb|CAD41576,3|OsJNBa0088122.8 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gb|EAY95219.1| proteína hipotética Osl_016452 [Oryza 15 sativa (grupo do cultivar indica)] emb|CAH67282.1|OsIGBa0111L12.9 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] ref]NP_001053604.1|Os04g0571200 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] ref]NP_001063719.1|Os09g0525400 [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] gb|EAZ09811.11 proteína hipotética Osl_031043 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] gb|EAZ45411.1| proteína hipotética OsJ_028894 [Oryza sativa 25 (grupo do cultivar japonica)] reflNP_001062434. I|0s08g0548300 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] gb|EAZ07897.1| proteína hipotética Osl_029129 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] ref]NP_001063778.1|Os09g0535100 [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] emb|CAC 10211.11 proteína hipotética [Cicer arietinum] emb|CA044394.1| produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] gb|ABG73441.1|proteína da família do tipo C3HC4 de dedo de zinco [Oryza brachyantha] ref]NP_001056653.1|Os06g0125800 [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] gb|EAZ09879.11 proteína hipotética Os 1031111 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] gb|EAZ45482.1| proteína hipotética OsJ_028965 [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] dbj|BAD82497.1|Proteína de dedo de RING-H2 equivalente a 15 RHG1 a [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] emb|CAN71989.1| proteína hipotética [Vitis vinifera] dbj|BAD05399.1| Equivalente à proteína de dedo de zinco que liga DNA [Oryza sativa (j aponica emb|CAH65886.1|OsIGBa0148J22.5 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] emb|CAE02518.2|OsJNBb0003A12.5 [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] ref]NP_001052192.1|Os04g0185500 [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] emb|CA071872.1| produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] emb|CAO39354.1| produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] emb|CAE01827.2|OsJNBa0041A02.20 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] emb|CA071869.1| produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] emb|CAA85320.1|dedo de zinco de terminal C [Glycine max] gb|EAZ08608.11 proteína hipotética Osl_029840 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] gb|EAY75305.1| proteína hipotética Osl_003152 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] ref|NP_001043810.1|Os01g0667700 [Oryza sativa (grupo do 10 cultivar j aponica)] dbj|BAD73651.1|equivalente à proteína de dedo de zinco RING [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] emb|CA071875.1| produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] ref]NP_001062870. I|0s0990323100 [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] gb|EAZ35180.1| proteína hipotética OsJO 18663 [Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)] dbj|BAA74802.1| proteína de dedo de zinco que liga DNA 20 (Pspzf) [Pisum sativum] ref]NP_001056239.1|Os05g0550000 [Oryza sativa (grupo do cultivar j aponica)] gb|EAY98923.1| proteína hipotética Osl_020156 [Oryza sativa (grupo do cultivar indica)] emb|CAN83345.11 proteína hipotética [Vitis vinifera] emb|CAO43928.1| produto de proteína não denominada [Vitis vinifera] emb|CAN79375.1| proteína hipotética [Vitis vinifera]

Tabela 9 polipeptídeos BB identificados pelo Blastp

Ref]NM 001055658. l|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) Os03g0173900 (Os03g0173900) mRNA, cds completa dbj|AKO'63978.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: 001-124-008, sequência de inserto completa dbj| AP006425.1| Lotus japonicus DNA genômico, cromossoma 1, clone: LjT39B10, TM0315, sequência completa gb|AYl 10224.1 |Zea mays CL5837_1 sequência de mRNA refjNM 001060139.1| Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0s04g0571200 (0s04g0571200) mRNA, cds parcial dbj|AK071401.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: J023097G23, sequência de inserto completa refjNMOOl 068969.1| Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0s08g0548300 (0s08g0548300) mRNA, cds completa dbj|AKO‘73266.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: J033029A20, sequência de inserto completa emb|CT832808.1|Oryza sativa (grupo do cultivar indica) clone de cDNA: OSIGCSNO35L02, sequência de inserto completa refjNMOOl 070254.1| Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0s09g0525400 (0s09g0525400) mRNA, cds completa dbj |AKT 04112.11Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: 006-202-G09, sequência de inserto completa dbj|AK066238.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: J013059J01, sequência de inserto completa emb|CT832015.1|Oryza sativa (grupo do cultivar indica) clone de cDNA: OSIGCRA126H24, sequência de inserto completa dbj|AK250973.1|Hordeum vulgare subsp. vulgare clone de cDNA: FLbaflOlaO3, sequência de mRNA dbj|AK249803.1| Hordeum vulgare subsp. vulgare clone de cDNA: FLbaf58cl6, sequência de mRNA emb|CT832014.1|Oryza sativa (grupo do cultivar indica) clone de cDNA: OS1GCRA115D08, sequência de inserto completa gb|BT016451.1|Zea mays sequência de mRNA clone

Contig284 bem|AJ299062.1|CAR299062 Cicer arietinum mRNA parcial para a proteína hipotética (ORF1), clone Can 183 gb|AY109631.1|Zea mays CL5026 1 sequência de mRNA gb|AYl 08288. l|Zea mays PC0148716 sequência de mRNA ref]NM_001070313. l|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0s09g0535100 (0s09g0535100) mRNA, cds completa dbj|AK069888.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: J023039004, sequência de inserto completa gb|AYl03990.l|Zea mays PC0093361 sequência de mRNA emb|AM485242.1|Vitis vinifera, sequência de shotgun de genoma inteiro, contig W78X218805.2, clone ENTAV 115 gb|BT018037.1|Zea mays clone EL01N0530G02.C sequência de mRNA emb|CT829435.1|Oryza sativa (grupo do cultivar indica) clone de cDNA: OSIGCRA107A15, sequência de inserto completa reflNM_001063188.1| Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0s06g0125800 (Os06g0125800) mRNA, cds completa gb|AY2'25189.1| Oryza sativa (grupo do cultivar indica) mRNA da proteína de dedo de zinco, cds completa gb|AY207044.1|Oryza sativa (grupo do cultivar indica) mRNA da proteína de dedo de zinco, cds completa dbj|AKl04425.l|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: 006-205-F10, sequência de inserto completa dbj|AK068302.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)

Ί3 clone de cDNA: J013144A04, sequência de inserto completa gb|AYl 12568.1| Zea mays CL32837_1 sequência de mRNA emb|AM453896.2| Vitis vinifera contig W78X100953.6, sequência de shotgun de genoma inteiro gb|ACl57490.18|Medicago truncatula clone mth2-123f23, sequência completa gb|AC151824.13|Medicago truncatula clone mth2-45nl8, sequência completa ref]NM_001058727. l|Oryza sativa (grupo do cultivar 10 japonica) 0s04g0185500 (Os04g0185500) mRNA, eds completa gb|BTO19187.1|Zea mays clone Contig858.F sequência de mRNA dbj|AK064939.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: J013000P06, gb|AY110468.1 |Zea mays CL 16240 2 sequência de mRNA gb|AYl 10685.1 |Zea mays CL9024_l sequência de mRNA dbj|AK246964.1|Solanum lycopersicum cDNA, clone:

LEFL1004CA06, HTC em folha dbj|AP008214.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)

DNA genômico, cromossoma ref]NM 001050479.1] Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 0s01g0692700 (0s01g0692700) mRNA, eds parcial dbj|AKO65626.1|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) clone de cDNA: J013028F14, dbj|AP004704.31 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica)

DNA genômico, cromossoma 8, clone PAC: P0544G09 dbj|AP006265.2|Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) DNA genômico, cromossoma 8, clone BAC: OJ1112 E06

Tabela 10 ácido nucléico que codifica polipeptideos BB identificados pelo tBlastn

Comprimento Domínios de Função

DAI	532 aa	Dois UIM, Um LIM
DAR1	548 aa	três UIM, um LIM
DAR2	529 aa	Um LIM
DAR3	451 aa	Nenhum
DAR4	1614 aa	um NB-ARC, um LRR3, três LRR1, um LIM
DAR5	703 aa	Um RPW8, um LIM DARE 645aa Sete UIM, um LIM
DART	561 aa	Três UIM, um LIM
Tabela 11

Análise	AtDAl	BrDAla	BrDAlb	OsDAl
Comprimento	533 aa	533 aa	515 aa	487 aa
Peso Molecular	60470,46	60185,30	59041,38	55268,94
Ponto isoelétrico	5,98	5,89	5,96	6,08
Carga no pH 7	-12,15	-13,24	-13,04	-8,57

Tabela 12

Sequências

MGWFNKIFKGSNQRLRVGNNKHNHNVYYDNYPTASHDDEPSAADTDADNDEPHHTQEPST

SEDOTaNDQENEDIDRAIALSIJ^ENQBOTSISGiCfSHPWEDEQIARALQESMVWaíSP

RHKSGSTYDNGNAYGAGDLYGNGHMYGGGNVYANGDIYYPRPITFQMDFRICAGCNMEIG

HGRFLNCLNSLWHPECFRCYGCSQPISEYEFSTSGNYPFHKACYRERYHPKCDVCSHFIP

TNHAGLIEYRAHPFWVQKYCPSHEHDATPRCCSCERMEPRNTRYVELNDGRKLCLECLDS

AVMDTMCJCQPLYLQIQNFYEGLNMKVEQEVPLLLVERQALNEAREGEKNGHYHMPETRGL

CLSEEQTVSTVRKRSKHGTGKWAGNITEPYKLTRQCEVTAILILFGLFRLLTGSILAHEM

MHAWMRLKGFRTLSQDVEEGICQVMAHKWLDAELAAGSTNSNAASSSSSSQGLKKGPRSQ

YERKLGEFFKHQIESDASPVYGDGFRAGRLAVHKYGLRKTLEHIQMTGRFPV

SEQ ID NO: 1 atgggttggtttaacaagatctttaaaggctctaaçcaaaggctccgggttgggaataat aagcacaatcacaatgtttattacgataattatccgactgcttcacatgatgatgagcct agtgcggcggatacagatgc tgataatgatgaacct catcatact caggaaccatcta ca tctgaggataatacatcgaatgaccaggaaaatgaagacatagaccgtgcaattgcattg t cgc 111 tagaagagaat caagaacagacaag tataagcgggaaa tac t cga tgc cgg tg gatgaagatgagcaacttgctagagccctacaagaaagtatggtagttgggaattcaccc cgtcacaaaagtggaagtacatatgataatgggaatgcatatggagctggagatttatat gggaatggaca t atgt a t ggaggaggaaatgtata tgcaaa t ggaga ta t ttattatcca agacctattacttttcaaatggatttcaggatttgtgctggctgtaatatggagattggc catggaagatttctgaattgccttaattcactatggcatccagaatgttttcgatgttat ggctgcagtcagccgatttctgagtacgagttttcaacatcagggaactacccttttcac aaggcttgttacagggagagatatcatcctaaatgtgatgtctgcagccactttatacca acaaatcatgctggtcttattgaatatagggcacatcctttttgggttcagaagtattgt ccttctcacgaacacgatgctaccccgagatgttgcagttgtgaaagaatggagccacgg aat acgagata tg 11 gaa ct taacga tggacggaaac 11 tgcc 11 gag tgtt t ggac t cg gcgg t cat ggacac ca tgcaa tgc caac ctctgtact tgcaaa t acaaaa 111 ct a tgaa ggac t caaca t gaagg tagageaggaagt1 cca c t cc t c tt gg 11 gagagacaagc ac 11 aacgaagccagagaaggtgaaaagaatggtcactatcacatgccagaaacaagaggactc tgcctttcagaagaacaaactgttagtactgtaagaaagcgatcáaagcatggcacagga aaa t gggccgggaa t a 11 acagaacc 11 acaag 11 aa cacggcaa tgt ga agt taccgcc attctcatcttattcgggctccctaggttacttactggttcgattctagctcatgagatg atgcatgcgtggatgaggctcaaaggattccgaacactgagccaagatgttgaagaaggt atatgtcaagtgatggctcataaatggttagatgctgagttagctgctggttcaacaaat agcaatgctgcatcatcatcctcctcttctcaaggactgaaaaagggaccgagatctcag tacgagagaaagcttggtgagtttttcaagcaccaaatcgagtctgatgcttctccggtt ta t ggagacggg 11 cagagc t gggaggt tagc t gt t c acaagta cgg 111 gcgaaaaaca cttgagcatatacagatgaccggtagattcccggtttaa

SEQ ID NO: 2 p---pLpbAl pb.Sbp-.pp p

SEQ ID NO: 3

P---pLpbAl pb.Sbp-spp p

SEQ ID NO:4 pCs.Cscslh s.....bhlp tb.sp.aH.. .pCFpCs..p CppsLss... .p.ab.pcsp baCpps...

em que;

c é um resíduo de aminoácido carregado, por exemplo, D, E,

Η, K, R;

p é um resíduo de aminoácido polar, por exemplo, C, D, Ε, H,

K, N, Q,

R, S ou T;

h é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, por exemplo, A, C,

F, G, H,

I, L, Μ, T, V, W e Y;

t é um resíduo de aminoácido minúsculo, por exemplo, A, G ou S a é um resíduo de aminoácido aromático, por exemplo, F, H,

Wou Y;

b é um resíduo de aminoácido grande, por exemplo, E, F, Η, I, K, L, M, Q, R, W ou Y;

s é um resíduo de aminoácido pequeno, por exemplo, A, C, D, 10 G, N, P, S, T ou V;

é um resíduo de aminoácido alifático, por exemplo, I, L ou V; . é ausente ou é qualquer aminoácido; e - é qualquer aminoácido.

SEQ ID NO; 5

QENEDIDRAIALSLLEENQE SEQ ID NO; 6

DEDEQIARALQESMWGNSP SEQ ID NO: 7

ICAGCNMEIGHGRFLNCLNSLWHPECFRCYGCSQPISEYEFSTSGNYPFHKAC SEQ ID NO; S mngdnrpved ahytetgfpy aatgsymdfy ggaaqgplny dhaatmhpqd nlywtmntna 61 ykfgfsgsdn asfygsydmn dhlsrmsigr tnwdyhpmvn vaddpentva rsvqigdtde

121 hseaeecian ehdpdspqvs wqddldpdtm tyeelvelge avgtesrgls qelietlptk 181 kykfgsifsr kragexcvic qlkykigerq mnlpckhvyh seciskwlsi nkvcpvcnse 241 vfgepsih

SEQ ID NO; 9 acactctttc ctctctcttt cttctctctt tcttttctct ctctctcctc tgctcctccg tctctcgtct acagtgeect ccgcatcacc tttttccttg tcctatgaat ttggtcgaaa 121 tgcccttctc ctcctcctcc ttccactaat ctcaaaagat atatccttcg agactctccc 181 ttgccgtctc caattgccac tcaccgctcc aactctcttc gaattagctg aaatgaatgg

241 agataataga ccagtggaag atgctcatta 301 tggaagttac atggacfcttt atggtggtgc 361 cgcaactatg catcctcagg acaatctgta 421 tgggttttca ggatcagata atgcttcttt 481 atcgaggatg tccataggga gaacaaattg 541 tgatcctgaa aacacagttg cacgttccgt 601 agctgaagaa tgcattgcaa atgagcatga 661 tgacattgat cctgatacaa tgacctatga 721 aacagaaagc agggggttgt ctcaggaact 781 gtfctgggagc atcttctcca ggaaaagagc 841 gtacaagata ggggagaggc aaatgaatct 901 catttccaaa tggctaagca tcaacaaggt 961 ggagcccagc attcattgat cggcacaagg

1021 ttatatcgag gctcateaag taattgtttt 1081 aaagatgtcc acactatact ctctcatgtt 1141 ctagttccat tttcgcttgt gtgtgcttta 1201 atgctaagtc aaaaacgctg aatccatat

SEQ ID NO: 10 cacggagaca ggtttccctt atgctgctac ggctcagggg cctcttaact acgatcatgc ctggaccatg aataccaatg catacaagtt ctatggttca tatgacatga acgatcattt ggactatcat cccatggtga acgttgctga ccaaatcgga gacacagatg agcactctga tcccgacagt cctcaggtat cctggcaaga ggaattagta gagctggggg aagcagtagg catagaaacg cttcccacta aaaagtataa tgggg&g&gg tgtgtgatat gceagctcaa gccgtgcaag catgtgtatc attctgaatg ttgcccggtg tgtaacagcg aggtctttgg ggctcctcct cttcttttct ttttggcttt agtgtagtga aaaccccaaa aaatagtcta cagtccttct ctgtacatgt aatttttctt agtttaacag tcactcgtat tgtatactaa atggcctact cctcacggtc ttgtgatcag 61 aagtggctct gcgctttcct gaaggggacg 121 cgggtgacgg caggagaaga gaccacgctc 181 gaaccaccta gacataacaa tgaagaaatg 241 gatgccaaaa atacaaaaga gagaaaccat 301 agagcaatac aggacagtct gaacatgaat 361 tctcagaccc aggccaggtc gagaggatac 421 gggcatggcc attacttgag ctgcttggga 481 tcttcctgtc gccaccctat ccgtgagatg 541 cacaagctgt gctacaagga gcttcatcac 601 ccaacgaaca ggactggttt gatagagtac 661 tgtcctttgc atgagcatga tagaacacct 721 aggaacacaa agtatatgtc attaggggat 781 tctgcaatca tggacaccgg tgaatgtcaa 841 gaagggatga acatgaaact agaccagcag 901 cttaatgaag ctatggaagg agaaagcaaa 961 ctttgtctgt cagaggagca gactgtgacc 1021 aatcggttac tagatatgaa aacccaaccg 1081 gcaattcttg tattgtttgg cctccccagg 1141 ttgatgcatg ggtggttgcg cctcaaaggt 1201 ggtatatgcc aggtcatgtc ttacctgtgg 1261 agatatggac aggcttcaac atcttacgct 1321 ccgtccaaga agggtgggat ctctcacacc 1381 cagatcgcca atgacacatc atcagcatac 1441 gtgaacaagt atggccttcg ccaatcactg

1501 gtgtaa tgcagtcacg agaggagatc cggcttcatg aaggacggcg aggccaaccg acggcgccct tgggaagaac cagttagacc aaagaaggaa gaccatgcac ttgcccttgc tcttgcagac gacaagggag aaaacgatga agaactcgct ccttaccagc cttacaatcc ttgtgcaccc agggtctgtg ggggttgcaa gcatgagata atgtactggc accctcagtg cttccgctgt gagttcacct tgctaggtac agatccatac ccaaagtgtg acgtctgcct fccaatttatc agagcccatc cattctgggg acagaagtat cgttgctgta gctgtgagaa aatggagcca ggacgcagct tgtgcatgga atgcctggat ccgctatacc attccatcag agactactac atacccatgc tcttggttga acgtcaagcc ggaccgcatc atatgcctga aacacgaggc agtatactta ggaggcccag aattggtgca caaaagctaa ctaggagatg cgaagteact ctgctaacgg gctccattct tgcccatgaa taccggaacc taaaggcgga gattgaggaa ctggagtcag agatccttcc atccacttca tcatcttcgt cgtcctcctg tcgaccaeca gagaagaagc ttggagaatt cttcctgcat ggcgatggtt tcagagctgc ctatgcagct aaccatatac ggctaaccgg aggctttcct

SEQ ID NO: 11 (OsDAR2) atggagtttc 61 aggttgttgt 121 tattcagatg 181 cgttattccg 241 tccctttetg 301 atacaaatct 361 tgatgaagaa 421 tcaagctcaa 481 agagaaacag 541 acttgaggaa 601 tcctcctgga 661 agaatatgca 721 ggcgfcbkggc 781 gaggtgttct 841 catccaaaat 901 tacagggcac 961 cctagatgct 1021 gatggtagaa 1081 caaccgttgt 1141 cagataccta 1201 catggacatc 1261 acaacagtgt 1321 gagccttgca 1381 ccccgcgttt 1441 taaatggggt 1501 cacatgtggt 1561 tcttcgtctt 1621 gattttgaga 1681 gçatatgggg 1741 acccttgatc ttcttctctt tgatgccaat gtcaagctaa cggaaggatc aacaagaaca gaaactgaag cacatgagag atagaggaag cttgccaaag gatgagcagc tatgattctg ctggttgccg atcctgaatg caatgtcagg gtgatgtttg atcccttttg gatgcagaag gcagctgtga gcgcatggag aactgtgtct tgaatgtcta atctcgagat

Cgçtcttggt atcactcacc tgaggagacc ggctggtgcg gttaactgga atccaaatct fcggaafcctga catcatcagc agaaactcgg atgggttcag atattcgctt gtttggatac

3988t3SCtt cagaagatac tgattttgac tgtgattcca aagatgatga ctcaggtgga aagagaaacg ctagactaga tcgcaaaggc gaagtgtgtt agctgagatt tttttgctgc aaaccgtcct tcataacttt acgtgagttt ggagagatca tgagactaga aaagattggt ccgttgtgaa tcaatcctag tagaccagaa gacttatgct cgctgtggcg tgagtttttc gcaaggtaac gaccggtaca attaagaatg actaagatcc aatagagagg aaagaagaaa caagatgaca tgaggatgag agcagcagaa aagagctgaa agaggaagaa tattcaagaa tccatcatae ggacatggaa cacgcttgtg tatcacaaac attcctacaa tattgtcctt ccgaaagata gactcagcca tatgaaggct gctttaaacg ggaccctgtc gcaggctaca gtcactgcta çtçatgagat gtggaagaag ggctctacat attgcatcgt aagcaccaga caagctgttc tttccttaa tgtttctctt ttaaaggttc atagaagcct ttgaatgcge aaggaaagaa gatgaggatg gaagaggaaa gaagctgagc gttagacgcg agtatgaatg cccttccttg ggtttctgag ataagcccat tgtgttacaa atccagctgg cacatgagcg caaagtatct ttatggacac tgcacatgaa aagctatgga tgtctgaaga agttgataga ttctcatctt gatgcatgca ggatatgtca tgatagatat ccaagaaagg tagagtcaga ttacgcatgg egcaggtaag tagtcataag ggacactcct cattgcaetc agtcatcgga aggaggatga agaaggtagc tagaagagtt ccaaagctca tgggatctcc ttccttctag ttgcatgggt catagactgt ggagcagcat tctcattgag tgatggaaca gatacttgat taatgaatgc agtggaacag aggagagaaa acaaactgtc catgatcact atatggactt tggcttcgac ggttttagct tgcatcttct tgagaggtct ttcttcttcg tctgaagcga

SEQ ID NO:12 (BrDARl) atggattctt cttcatatgg 61 ggggctgggt çgtcgtcttc

121 cttttcaaga gtggctctaa 181 cagtttcaag aggacgagaa 241 tcgagagcct cacgggacaa 301 gatacgaacc gaccatatgg 361 ccttttcaca gtggattgaa 421 agacgaccac aaagaatatg 481 ggafcgcatgg gaacattctt 541 atcactgagc atgagttctc 601 gagctcactc atcctaaatg 661 ttgatcgaat atcgatgcca 721 gatagaaccg ctcgttgctg 781 acgttagacg atgggagaag 841 ggagattgtc aaccacttta 901 cttgagcaac aaatccccat 961 ggagagaaac acggatacca

1021 caaacagtca caagtgttct 1081 agaactcagc ctcaaaagct 1141 ggcctcccta gactattaac 1201 aggctcaaag ggtataggaa 1261 tcttacatgt ggcttgaatc 1321 acatcaactg ccacctcgtc 1381 aaaacaaacg tggagaagaa 1441 tctcctgctt acggaggggg 1501 cgtcgcacac ttgatcatat tgtttctcat gccagagaag cggtggeact tatggtcttt agaagaacta atatggttgg tccatctttc tggcggttgc tcatcctgat tctatcagga cgaagtttgt tccgttttgg tagctgcgaa tttatgttta ccatgcaata gcttcttgtt tcacatgcct taaaagaccg tacacgtaaa tggagcaatt ccttaaccct tgaagttctc atcatcatca acttggagag tttcagagca ccgcttcact gtcagccata aaatggaact ggtggtgctc cctttacctc gatcgtgcat tctatggata attccacctt aatagcgata tgcttctgtt accaaacctt caccatttta aaccaaaagt cgtttggagt gaatgcatgg cgtgactatt cagcgagaag gagacaaggg agactgggcg tgtgaagtca cttgcccacg gaggtagagg tcagatcctt tcatcatctt ttctttaagc gcaaatgcag ggaacgtttc tctccaatcc tgatgaaatg gcactaaccg cttcctcttc tgtcagtttc ataattcaga atgaaccgtc ttggattggg gtgattcatg accatcagat tcccaactaa attgcccctc catgggaggt aaactgcgat acgaaggaat ctctcaacga gtttatgttt ctcaocgtct ctgcgattct agctgatgca aaggtatctg cttcaagaag cttctaacaa atcagatagc cggtttgtaa ctttgtaa ttgtatcttt ggtgagtaaa tcatcctcct ggacgatcgg tctagctgac tttccctagg ctatcaagtc gaactatctg tcgttaccct ttgtctcaaa tgatgctggc tcacgaacac gagatattac aaccgacact gtacatgaaa cgctatcgtc gtctgaagaa tgttggtatg cgttctttac tggatggcta ccaagtcctc catgccctca gaaaggaggg tcatgacgca gtacggtctg

SEQ ID NO:13 (BrDAR2) atgccattga gagtgacata tctgatggaa gatcggaaaa gaaaaaggaa aaagcttttt gatttgggca gcggacttaa ccttaaacct gcaggatcct tttgaagctg aaactgatat 121 cgtcaaacaa gtgtcatcga atgatgctca cgttcaagaa gatgaacagc ttgctttggc 181 cattcaaaaa tctaaagaag acgaagagga aagaaggccc accagggact tagaagagca 241 tgcacatgag agaggagaaa ggcaaaataa ttatgacaac tcttcttctt tgaaagacaa 301 aaaagaagga cagacttctg aggagaaaac atgacaacat ttcctctgaa gctcgcttgg 361 atgagaatga ggagcagcgg attatctggg agagtttgaa ggataaaggt caaacaaagc 421 catctgaaga tgaggtcatt cctcctcgta gagcaagtgt ggtggttgcc actctgagat 481 tgaacaagga ggatcagtgg atgtctttgg tgttccttgg catcctgaat gtttctcttg 541 tggtgcttgc cgtaacccaa ttgctgtcca cgaggttcaa aaccatgtct caaactcaag 601 aggcaagttc cacaaaaact gctataaccg gtactgctat gtctgccaag agaaagttaa 661 gattagagag tacaatagcc atcctttctg gaaggagata tactgccctg ctcacgaaac 721 tgatggaact cccaagtgtt gcagctgcga gaggctagag cctagagaaa cggagttcgt 781 aatgctagat gatggaaggt ggctatgtct agaatgtatg gaetcagcgg ttatggatac 841 tgacgaagtc cagcctettc actttgaaat ccgtgacttc ttccatggct tgttcttgcc 301 agttgagaaa gagttttctc ttcttttggt ggagaaacaa gccctgaata aagctgagga 961 ggaagagaag attgtgtcaa aagggccaaa gatgggggag aacaagcagc taacaggaaa 1021 gaccacggaa tctcaaaggg ttgtgagtgg atgcccggtc actgcaattc tcatcttata 1081 tggacttcct agaggttact aacaggatct atcatggctc acgagatgat gcatgcttat 1141 cttagactca atgggacata ataatttgaa caaggttctg gaagaaggaa tatgccaagt 1201 gctagggcac atgtggttgg agactcagag atacgcccct attgatgttg ctgcagcttc 1261 ttcttcttct tcgtcaaatg cggcaaagaa aggggagtgg tctgaactcg agaagaagct 1321 ggtggatttt tacaagtatg agatagaaac agatgagtca gctgtctatg gtgaagggtt 1381 taggaaagtt aactatatgg ttacaaactc cagcctccag gaaaccctca aagagattct

1441 tccccgccgg ggttga

SEQ ID NO:14 BrDAR3-7 atgggttggt taaacaagat cttcaaaggc tctaaccaaa ggcaccccct ggggaatgaa 61 cactatcatc ataatggcgg ctattacgag aactacccgc acgaacattc tgagcctagt

121 gcagagacag atgctgatca tacgcaggag ccatctactt ctgaggagga gacatggaat 181 gggaaggaaa atgaagaagt agaccgtgta attgcattgt ctattttaga agaagagaat 241 caaagaccag agactaatac aggcgcctgg aaacacgcaa tgatggatga cgatgagcaa 301 cttgctagag ccatacaaga gagtatgata gctaggaatg gaactactta tgactttggg 361 aatgcatatg ggaatggaca tatgcatgga ggaggcaatg tatatgacaa tggtgatatt 421 tattatccaa gacctattgc tttctcaatg gacttcagga tctgtgctgg ctgcaatatg 481 gagattggcc atggaagata tctgaattgc ctcaacgcac tatggeatcc acaatgtttt 541 cgatgctatg gctgcagtca cccaatctct gagtacgagt tctcaacgtc tgggaattac 601 ccttttcaca aagcttgtta cagggagagg ttccatccaa aatgtgatgt ctgcagcctc 661 tttatttcaa caaaccatgc tggtettatt gaatatagag cacatccttt ctgggtccag 721 aagtattgcc cttctcacga acacgatgct acgccaagat gttgcagctg tgaaagaatg 781 gagccgcgga atacaggata ttttgaactc aacgatggac ggaagctttg ccttgagtgt 841 ctagactcat cggtgatgga cacttttcaa tgccagcctc tgtacttgca gatacaagag 901 ttctatgaag gacttaacat gacggtagag caggaggttc cacttctctt agttgagcgg 961 caggcactta acgaagccag agaaggtgaa aggaatggtc actatcacat gccagagaca

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SEQ ID NO:15 BrDAlb atgggttggt ttaacaagat cttcaaaggc tctacccaaa ggttccggct tgggaatgac catgaccaca atggctatta ccagagttat ccacatgatg agcctagtgc tgatactgat

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1021 aacgaagcca gagaaggtga aaagaatggt cactatcaca tgccagagac aagaggacte 1081 tgcctttcag aagagcaaac tgttagcact gtaagaaaga gatcgaagca tggcacagga 1141 aactgggctg ggaatatgat tacagagcct tacaagttga cacgtcaatg cgaggttact 1201 gccattctca tcttgtttgg gctccctagg ctactcaccg gttcgattct agctcatgag 1261 atgatgcacg cgtggatgcg gctcaaggga ttccggacgc tgagccaaga cgttgaagaa 1321 ggaatatgtc aagtgatggc tcataagtgg ttggaagcag agttagctgc tggttcaaga 1381 aacagcaatg ttgcgtcatc ttcatcttct agaggagtga agaagggacc aagatcgcag 1441 tacgagagga agcttggtga gtttttcaag caccaaatcg agtctgatgc ttctccggtt 1501 tatggagacg ggttcagggc tgggaggtta gcggttaaca agtatggttt gccaaaaaca 1561 cttgagcata tacagatgac cggtagattc ccggtttaa

SEQ ID NO:16 BrDAla atgggttggt tgaccaaatt ttttagaggt tcaacccaca aaatctogga agggcaatac cacagcaaac ccgcggagga gacgatatgg aatggaccct ctaattccgc agttgtgacg 121 gatgtcccgt cagaatttga caatgaagat atcgctcgtg ctatatcact ctctctatta 181 gaggaggaac aaagaaaggc aaaggcaata gaaaaggaca tgcatttgga ggaggatgaa 241 caacttgcaa gagctatcca ggaaagtttg aatgttgaat cgcctcctcg tgctcgtgaa 301 aatggcaacg ccaatggtgg caatatgtat caaccactgc catttatgtt ttcttctgga 361 ttcaggactt gtgccggatg tcacagtgag attggtcatg ggcgtttcct tagttgcatg 421 ggagctgttt ggcatccaga atgttttcgc tgtcatgctt gtaatcaacc aatatatgac 481 tatgagttct ccatgtcggg aaaccatcca taccataaaa catgctacaa ggagcgcttt 541 cacccaaaat gtgatgtctg caagcaattt attcctacaa atatgaatgg cctgattgaa 601 tatagagcac atcctttctg gttacaaaaa tactgtccat cacatgaggt ggacggtact 661 ccaagatgct gtagttgtga aagaatggag ccaagggaat caagatatgt attgctggac 721 gatggtcgca aactctgcct ggagtgcctt gattctgcag ttatggatac gagcgagtgc 781 caacctcttt atcttgaaat acaggaattt tatgaaggcc taaatatgaa agtggaacaa 841 caagttccct tgcttcttgt agaaagacag gcfcttaaatg aagccatgga aggagagaag 901 actggtcacc accatcttcc agaaacaaga ggtttatgct tatcagaaga gcaaactgtc 961 agcacgatat tgaggagacc aagaatggct ggaaataaag ttatggaaat gataacggag

1021 ccatataggt tgactcgtcg atgtgaagtg actgcaattc tcattcttta tggtctcoca 1081 agattgttga caggttcaat tttagctcat gagatgatgc atgcgtggtt gcgacttaaa 1141 ggatatcgca cacttagtcc agacgtagaa gagggcatat gccaagttct tgctcacatg 1201 tggattgagt cagagatcat tgcaggatca ggcagtaatg gtgcttcaac gtcttcatcc 1261 tcatcagcat ccacatcatc gaaaaagggg ggaagatctc agtttgagcg aaagcttggt 1321 gattttttca agcaccaaat tgagtcagat acctcaatgg cctatggcga tggttttaga 1381 gctggcaacc gagctgttct tcagtatggt ctaaagcgca cccttgagca tatccggtta 1441 acagggactt tcccattttg a

SEQ ID NO; 17 OsDAl

Alinhamentos de Sequência

A. sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 1) e nucleotídeo (SEQ ID NO: 2) de DAI e sítios de mutação de dal-1, sodl-1, sodl-2 e sodl3. Os domínios prognosticados usando-se o software SMART são mostradas.

B. Alinhamento de motivos UIM entre proteínas contendo motivo UIM diferentes. Os motivos UIM foram prognosticados usando-se o software SMART. As sequência UIM1 (valor E, 6,39e-02) e UIM2 (valor E, 7,34e-02) prognosticadas são mostradas em A.

C. Alinhamento de domínios LIM entre as proteínas contendo 5 o domínio LIM. No domínio LIM, existem sete resíduos de cisteína conservados e uma histidina conservada. 0 arranjo seguido por estes resíduos conservados é C-x(2)-C-x( 16,23 )-H-x(2)- [CH] -x(2)-C-x(2)-C-x( 16,21) - Cx(2,3)-[CHD]. O domínio LIM (valor E, 3,05e-10) foi prognosticado usandose o software SMART e é mostrado em A.

D. Alinhamento de DAI e proteínas relacionadas com DAI em Arabidopsis. As regiões conservadas entre DAI e DARs estão em suas regiões de terminal C. O alelo dal-1 tem uma única transição de nucleotídeo G para A no gene Atlgl9270 e é prognosticado causar uma mudança de arginina (R) para lisina (K) em um aminoácido conservado na posição 358.

Um asterisco indica resíduos de aminoácido idênticos no alinhamento. Dois pontos indicam substituições conservadas no alinhamento e um período indica substituições semi-conservadas no alinhamento.

E: Alinhamentos de aminoácido de proteínas equivalentes a DAI. As sequências de aminoácido de tamanho natural de proteínas equivalentes a DAI de Physcomitrella patens (Pp), Selaginella moellendorffi (Sm), Brassica rapa (Br), Arabidopsis thaliana (At), Brachypodium distachyon (Bd) e Oryza sativa (Os) foram alinhadas com o parâmetro predeterminado ClustalW (http: //www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index. html), e editaram parâmetros de demonstração no VetorNTi. A seta vermelha mostra a mutação no alelo dal-1. DAL significa equivalente a DAI.

A. cgtggggaacgtttfctfccctggaa fMgufaa^u^açetcaacaaQctcaaegaeeaaaMacetcegacacgaftsactttt tiattcatttctcctcKttgtMttxtcqttccâaaatattcgatactctcgatctcU cxtcgxgatcctcaxxaaataaaaatacgaxttttattctxctxttgxgagxgcacGaaa txtcxxgaccccggaxxagcgxag&axxcaagcacaxtccgggt.ttaxt.cgxgXaxgagx agacattgatcttgtcaaagttgcattcctttatataaaagaagtttaattxcctttttx cttttcttttctcttttttttttttttcccccatgtcatagattcttccccaaattttga agaaaggagagaacxaaagagtcccttxçgagatte-efcxtgcxgetxccctxgcfcgatT agatcatctttgcgatcctggattttgtgggggtxtcgXgaagcXXaXXgggatcttatc xgaxxcaggaxxxxcxeaaggcxgcaxxgecgcaxgagcagaxagxxxxaxxxaggcaxx axgggGxggxxxaacaagaxcxxxaaaggcxcXaaccaaaggcxccgggxxgggaaGaax

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Alinhamento Β

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G9T0E1/138-157

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Q9VTK7/621-64O

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Q9H3M9/235-252

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Q9LG27/1615-16

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Explicação de códigos de cor usados pelo CHROMA

Nome do Grupo	Aminoácidos	Demostrado com
Default	X	*
Único	X	1
Alanina	A	9
Cisteína	C	9
Ácido Aspártico	D	9
Ácido Glutâmico	E	9
Fenilalanina	F	9
Glicina	G	H
Histidina	H	9
Isoleucina	I	0
Lisina	K
Leucina	L	0
Metionina	M	eb
Asparagina	N
Prolina	P	Ξ
Glutamina	Q
Arginina	R
Serina	S
Treonina	T	□
Valina	V	B
Triptofano	w	BS
Tirosina	Y	a
Negativo	D.E	-
Ser/Hir	S,T	*
Alifático	I.L,V	s
Positivo	H.K.R	+
Minúsculo	A.G,S	t
Aromático		§
Carregado	MT f Jm*)* X	€
Pequeno	A,C,D,G,N,P,$,T.V	S
Polar	c:d,e,h.k;n?q,r5s,t	P
Grande	EsFAI,KfL!M,Q)R,W,Y	b
Hidrofóbico

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Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para aumentar a longevidade, tamanho de órgão e/ou tamanho de semente de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende;

   5 expressar um polipeptídeo DA negativo dominante dentro das células da dita planta, em que o polipeptídeo DA negativo dominante consiste de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 e 301 a 330, com uma mutação R para K em uma posição equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1.

   10
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende reduzir ou abolir a expressão de um polipeptídeo BB dentro das células da dita planta, em que o polipeptídeo BB consiste de uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 9.
3. 3. Método para produzir uma planta com longevidade,

   15 tamanho de órgão e/ou tamanho de semente aumentados, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (i) produzir uma célula de planta que expresse um polipeptídeo DA negativo dominante consistindo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 e 301 a 330 com uma mutação R para K em uma posição equivalente à posição

   20 358 da SEQ ID NO: 1, e (ii) regenerar a planta a partir de uma ou mais células transformadas.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente incorporar um ácido nucleico

   25 heterólogo que expresse um ácido nucleico supressor que reduza a expressão de um polipeptídeo BB consistindo da SEQ ID NO: 9 dentro da dita célula de planta por meios de transformação, em que o ácido nucleico supressor é um dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA ou um ácido nucleico anti-sentido.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de

   Petição 870180067899, de 06/08/2018, pág. 8/9

   1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende propagar sexual ou assexualmente ou cultivar a progênie ou os descendentes da planta que expressam a forma negativa dominante de um polipeptídeo DA.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de

   5 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta superior.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta agrícola selecionada do grupo que consiste de Lithospermum erythrorhizon, Taxus spp, tabaco, curcúbitas, cenoura, brássica de planta, melões, pimenta de caiena, videiras, alface, morango,

   10 brássica de semente oleaginosa, beterraba açucareira, trigo, cevada, milho, arroz, sojas, ervilhas, sorgo, girassol, tomate, batata, pimentão, crisântemo, cravo, linhaça, cânhamo e centeio.
8. 8. Método para prolongar o período de crescimento em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende expressar dentro de uma

   15 planta uma variante de DA1 ou DAR, em que a variante de DA1 ou DAR consiste de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 e 301 a 330, com uma mutação R para K em uma posição equivalente à posição 358 da SEQ ID NO: 1.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais mutações que rompem

   20 as funções de EOD1 (SEQ ID NO: 9), em que as ditas mutações interferem com a limitação da duração do crescimento proliferativo e aumentam o tamanho de semente e ou órgão.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir um ou mais transgenes que expressam

    25 construção(ões) de RNA de interferência que reduz(em) a expressão de EOD1 (SEQ ID NO: 9), em que os ditos transgenes interferem com a limitação da duração do crescimento proliferativo e aumentam o tamanho de semente e ou órgão.

    Petição 870180067899, de 06/08/2018, pág. 9/9

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