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BRPI0817879B1 - Anticorpos isolados contra esclerostina, usos dos mesmos, e composição farmacêutica - Google Patents

Anticorpos isolados contra esclerostina, usos dos mesmos, e composição farmacêutica Download PDF

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Publication number
BRPI0817879B1
BRPI0817879B1 BRPI0817879-8A BRPI0817879A BRPI0817879B1 BR PI0817879 B1 BRPI0817879 B1 BR PI0817879B1 BR PI0817879 A BRPI0817879 A BR PI0817879A BR PI0817879 B1 BRPI0817879 B1 BR PI0817879B1
Authority
BR
Brazil
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antibody
sclerostin
seq
antibodies
binding
Prior art date
Application number
BRPI0817879-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Michaela Kneissel
Christine Halleux
Shou-Ih-Hu
Beate Diefenbach-Streiber
Josef Prassler
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Priority claimed from PCT/EP2008/063691 external-priority patent/WO2009047356A1/en
Publication of BRPI0817879A2 publication Critical patent/BRPI0817879A2/pt
Publication of BRPI0817879B1 publication Critical patent/BRPI0817879B1/pt

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Abstract

ANTICORPO CONTRA ESCLEROSTINA OU PROTEÍNA FUNCIONAL USO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE OS COMPREENDE, SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEOS, VETOR DE CLONAGEM OU DE EXPRESSÃO COMPREENDENDO A REFERIDA SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEOS,CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE COMPREENDENDO O REFERIDO VETOR DE CLONAGEM OU DE EXPRESSÃO, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO OU PROTEÍNA FUNCIONAL, KIT DIAGNÓSTICO E ME'TODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE UMA CÉLULA OU TECIDO QUE EXPRESSA ESCLEROSTINA IN VITRO. A presente invenção refere- se a anticorpos contra esclerostina e composições e métodos de uso para os referidos anticorpos para o tratamento de doenças relacionadas a anormalidades ósseas como,por exemplo, osteoporose.

Description

CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção está relacionada aos anticorpos contraesclerostina e composições e métodos de uso para os referidos anticorpos para o tratamento de um distúrbio patológico que é mediado por esclerostina ou doença relacionada a anormalidades ósseas como, por exemplo, osteoporose.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] O gene SOST codifica a proteína esclerostina que é umaglicoproteína secretada de 213 aminoácidos. A esclerostina é um membro da superfamília de fatores que contêm "nó de cistina". A esclerostina está relacionada à família de proteína DAN/Cerberus, que interfere diretamente com a sinalização de BMP por inibição da ligação de BMP aos receptores e, dessa forma, da cascata de sinalização de BMP (Avsian-Kretchmer, Mol. Endocrinol. 2004, 18(1): 1-12).
[003] A expressão de mRNA de esclerostina é detectada emseres humanos adultos predominantemente nos ossos e no rim. A proteína esclerostina é detectável predominantemente nos ossos. Dentro do osso, sua expressão está restrita às células de formação óssea maduras e terminalmente diferenciadas, os osteócitos.
[004] A esclerostina é um regulador negativo potente daformação óssea em homens e camundongos. A ausência de expressão de SOST dá origem à esclerosteose (Balemans e cols. Hum. Mol. Genet., 2001, 10(5): 537-43; Brunkow e cols. Am. J. Hum. Genet., 2001, 68(3): 577-89). Os pacientes sofrem de crescimento ósseo excessivo por toda a vida, o que resulta em densidade mineral e resistência óssea aumentadas. Eles não exibem outras anormalidades endocrinológicas - todas as complicações que apresentam durante sua vida estão relacionadas ao acúmulo ósseo anormal. Portadores heterozigotos para esse distúrbio recessivo também exibem massa óssea aumentada (Gardner e cols. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2005, 90(12): 6.392-5). O fenótipo pode ser recapitulado em camundongos deficientes em SOST e sua superexpressão resulta em osteopenia. Além disso, a doença de Van Buchem [MIM 239100] - uma cópia fenotípica de esclerosteose - é causada por desregulação de SOST em função da eliminação genômica de um intensificador ósseo de amplo espectro (Balemans e cols. J. Med. Gene, 2002, 39(2): 91-7; Loots e cols., Genome Res., 2005, 15(7): 928-35). Finalmente, SOST é infra-regulado pelo hormônio da paratireóide (PTH) - um princípio de formação óssea clinicamente validado - durante a formação óssea, sugerindo que parte da ação anabólica do PTH talvez seja mediada por meio de SOST (Keller e Kneissel Bone, 2005, 37(2): 148-58).
[005] A esclerostina se liga às BMPs (proteínas ósseasmorfogênicas) e pode atuar como um antagonista de BMP in vitro (Winkler e cols. EMBO J., 2003, 22(23): 6.267-76). A esclerostina também atua como um regulador negativo da sinalização canônica Wnt, diretamente por ligação ao LRP5/LRP6 (Li e cols. J. Biol. Chem., 2005, 20; 280(20); Semenov, J. Biol. Chem. 19 de outubro de 2006; van Bezooijen e cols. J. Bone Miner. Res., 10 de outubro de 2006), ou indiretamente (Winkler e cols. J. Biol. Chem., 2005, 28; 280(4): 2.498502).
[006] A ausência da expressão de esclerostina resulta emformação óssea elevada, enquanto a reabsorção óssea não é afetada (Esclerosteose, doença de Van Buchem) (Balemans e cols. 2001; Brunkow e cols. Am. J. Hum. Genet., 2001, 68(3): 577-89, Balemans e cols. 2006; Loots e cols., Genome Res., 2005, 15(7): 928-35).
[007] Poucos dos tratamentos disponíveis atualmente paradistúrbios esqueléticos podem aumentar a densidade óssea de adultos, e a maioria dos tratamentos disponíveis atualmente funciona primariamente por inibição de reabsorção óssea adicional, e não por estimulação de nova formação óssea.
[008] Um exemplo de um medicamento usado para o tratamentode perda óssea é o estrogênio. No entanto, não está claro se o estrogênio possui ou não quaisquer efeitos benéficos de longo prazo. Além disso, o estrogênio pode trazer o risco de aumento da prevalência de vários tipos de tumores como, por exemplo, câncer de mama e endometrial. Outras abordagens terapêuticas atuais para a osteoporose incluem bisfosfonatos (por exemplo, FosamaxTM, ActonelTM, BonvivaTM, ZometaTM, olpadronato, neridronato, skelid, bonefos), hormônio da paratireóide, calcilíticos, calcimiméticos (por exemplo, cinacalcet), estatinas, esteróides anabólicos, sais de lantânio e estrôncio e fluoreto de sódio. Essas substâncias terapêuticas, no entanto, estão frequentemente associadas a efeitos colaterais indesejáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] Uma modalidade da presente invenção fornece umanticorpo ou uma proteína funcional que compreende uma porção de ligação de antígeno do referido anticorpo para um alvo no polipeptídeo de esclerostina (SEQ ID NO: 155), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a proteína funcional se liga especificamente ao polipeptídeo de esclerostina e pode aumentar pelo menos um de formação óssea, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e resistência óssea em um mamífero.
[0010] Em uma modalidade, os anticorpos de acordo com ainvenção possuem a habilidade para reverter a inibição de esclerostina da mineralização óssea in vitro. Em uma modalidade relacionada, eles possuem a habilidade para reverter a inibição de esclerostina da via de sinalização mediada por wnt-1. Em outra modalidade relacionada, eles rompem a ligação esclerostina LRP6 e podem bloquear o efeito inibidor que a esclerostina possui em altas doses na fosforilação de Smad1 induzida por BMP. Em outra modalidade, os anticorpos da invenção se ligam a uma região de esclerostina entre os aminoácidos 112 e 126, inclusive (ou seja, a referida região consiste nos aminoácidos 112 a 126 de SEQ ID NO: 155) de SEQ ID NO: 155, e/ou a região entre os aminoácidos 160-174, inclusive (ou seja, a referida região consiste nos aminoácidos 160 a 174 de SEQ ID NO: 155) de SEQ ID NO: 155 e, mais especificamente, se ligam a uma região que compreende tanto ARLLPNAIGRGKWWR (SEQ ID NO: 156) quanto RLVASCKCKRLTRFH (SEQ ID NO: 157).
[0011] A esclerostina inibe a ativação de STF mediada por wnt1(Supertopflash, leitura repórter para sinalização Wnt canônica) em células HEK293. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção restauram a leitura repórter da sinalização Wnt de uma forma altamente reprodutível.
[0012] Foi demonstrado que o efeito inibidor observado dosanticorpos de acordo com a invenção sobre a ação da esclerostina no ensaio repórter da sinalização Wnt em células não osteoblásticas se traduz em indução de respostas de formação óssea em função da inibição de esclerostina in vivo. Na verdade, experimentos in vivo em roedores idosos mostram que os anticorpos de acordo com a invenção promovem forte anabolismo ósseo. O aumento da massa óssea alcançou o nível do efeito do tratamento diário intermitente com doses anabólicas extremamente elevadas de hormônio da paratireóide (que foi usado como um controle positivo).
[0013] Portanto, de acordo com outra modalidade preferida, osanticorpos de acordo com a invenção possuem afinidades para esclerostina na faixa reduzida de pM e inibem o impacto da esclerostina sobre a sinalização wnt com uma IC50 em torno de 10 nM.
[0014] Mais preferivelmente, em outra modalidade preferida, osanticorpos de acordo com a invenção se ligam a uma região de esclerostina composta entre os aminoácidos 112 e 126, inclusive (ou seja, a referida região consiste nos aminoácidos 112 a 126 de SEQ ID NO: 155) e entre os aminoácidos 160 e 174, inclusive (ou seja, a referida região consiste nos aminoácidos 160 a 174 de SEQ ID NO: 155) de SEQ ID NO: 155 e, mais especificamente, uma região que se sobrepõe pelo menos aos seguintes peptídeos ARLLPNAIGRGKWWR (SEQ ID NO: 156) e RLVASCKCKRLTRFH (SEQ ID NO: 157), respectivamente, e possuem afinidades para esclerostina na faixa reduzida de pM e inibem o impacto da esclerostina sobre a sinalização wnt com uma IC50 em torno de 10 nM. Esses anticorpos possuem a capacidade para aumentar massa óssea no esqueleto axial e apendicular de modelo animal em camundongo no nível do efeito do tratamento subcutâneo diário com uma dose extremamente elevada anabólica de hormônio da paratireóide (controle positivo) e são, portanto, úteis no tratamento de doenças relacionadas às anormalidades ósseas como, por exemplo, osteoporose.
[0015] Modalidades adicionais incluem composições quecompreendem os anticorpos da invenção em combinação com terapias alternativas para o tratamento de osteoporose como, por exemplo, bisfosfonatos, hormônio da paratireóide, agentes de liberação de hormônio da paratireóide (calcilíticos), anticorpos neutralizantes de LRP4 e anticorpos neutralizantes de DKK-1.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0016] Figura 1: Efeito de MOR05813_IgG2lambda no ensaio dewnt-1.
[0017] Figura 2: MOR05813_IgG2lambda na mineralizaçãoinduzida por BMP-2 em células MC3T3-1b.
[0018] Figura 3: Efeito de MOR05813_IgG2lambda no ELISA de LRP6-SOST.
[0019] Figura 4: Efeito de MOR05813_IgG2lambda no ensaio deFosfo-Smad1.
[0020] Figura 5: A - Efeito de knockdown para LRP4 (siRNA) sobrea ação inibidora de SOST no ensaio de wnt-1 em células Hek293 (Números pretos: relativos às atividades de STF na ausência de SOST, Números pretos em negrito: proporção de atividades de STF na presença/ausência de SOST); B - Especificidade do efeito da superexpressão de LRP4 sobre a IC50 de SOST e IC50 de Dkk1 no ensaio de wnt-1 em células Hek293; C - Especificidade do efeito da superexpressão de LRP4 sobre a ação inibidora de SOST e Dkk1 no ensaio de wnt-1 em células C28a2; D - Especificidade do efeito de knockdown para LRP4 (siRNA) sobre a ação inibidora de SOST e Dkk1 no ensaio de wnt-1 em células Hek293; E - Modulação da atividade de MOR05813 por LRP4.
[0021] Figura 6: Estudo em camundongo, pQCT in vivo -tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta o teor mineral ósseo total na metáfise proximal da tíbia.
[0022] Figura 7: Estudo em camundongo, pQCT in vivo -tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta a densidade mineral óssea total na metáfise proximal da tíbia.
[0023] Figura 8: Estudo em camundongo, pQCT in vivo -tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta a espessura cortical na metáfise proximal da tíbia.
[0024] Figura 9: Estudo em camundongo, uQCT in vivo -tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta o volume de osso esponjoso na metáfise proximal da tíbia.
[0025] Figura 10: Estudo em camundongo, uQCT in vivo -tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta a espessura trabecular na metáfise proximal da tíbia.
[0026] Figura 11: Estudo em camundongo, pQCT in vivo -tratamento de 5 semanas com MOR05813 aumenta a densidade mineral óssea total ainda mais na metáfise proximal da tíbia.
[0027] Figura 12: Estudo em camundongo, DEXA ex vivo -tratamento de 5 semanas com MOR05813 aumenta a densidade mineral óssea ainda mais na tíbia.
[0028] Figura 13: Estudo em camundongo, DEXA ex vivo -tratamento de 5 semanas com MOR05813 aumenta a densidade mineral óssea ainda mais no fêmur.
[0029] Figura 14: Estudo em camundongo, DEXA ex vivo -tratamento de 5 semanas com MOR05813 aumenta a densidade mineral óssea ainda mais na coluna.
[0030] Figura 15: Estudo em camundongo, histomorfometria exvivo - tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta as taxas de formação óssea no esqueleto apendicular (metáfise distal do fêmur).
[0031] Figura 16: Estudo em camundongo, histomorfometria exvivo - tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta a taxa de aposição mineral no esqueleto apendicular (metáfise distal do fêmur).
[0032] Figura 17: Estudo em camundongo, histomorfometria exvivo - tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta a superfície de mineralização no esqueleto apendicular (metáfise distal do fêmur).
[0033] Figura 18: Estudo em camundongo, histomorfometria exvivo - tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 aumenta as taxas de formação óssea no esqueleto axial (vértebra lombar).
[0034] Figura 19: Estudo em camundongo, histomorfometria exvivo - tratamento de 2,5 semanas com MOR05813 não afeta a reabsorção óssea no esqueleto apendicular (metáfise distal do fêmur), avaliada por superfície de osteoclasto.
[0035] Figura 20: ELISA que mostra o efeito de MOR05813_IgG2lambda sobre a ligação por SOST de LRP6. SOST 0,9 nM foi usado em cada caso.
[0036] Figura 21: Estudo em camundongo, pQCT in vivo após co-tratamento com MOR05813 e ácido zoledrônico, (A) Densidade mineral óssea total, (B) Teor mineral ósseo total, (C) Espessura cortical, e (D) Densidade mineral do osso esponjoso.
[0037] Figura 22: Estudo em camundongo, pQCT in vivo:tratamento com MOR05813 após pré-tratamento com alendronato (alen), (A) Densidade mineral óssea total, (B) Teor mineral ósseo total, (C) Espessura cortical, e (D) Densidade mineral do osso esponjoso.
[0038] Figura 23: Estudo em camundongo, pQCT in vivo após co-tratamento anabólico com MOR05813 e (i) anti-DKK1 ou (ii) PTH, (A) Densidade mineral óssea total, (B) Teor mineral ósseo total, (C) Espessura cortical, e (D) Densidade mineral óssea do osso esponjoso.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0039] A presente invenção está relacionada aos anticorposisolados, particularmente anticorpos humanos, que se ligam especificamente à esclerostina e que inibem propriedades funcionais da esclerostina. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são derivados de sequências particulares da cadeia pesada e leve e/ou compreendem características estruturais particulares como, por exemplo, regiões CDR que compreendem sequências de aminoácidos particulares. A invenção fornece anticorpos isolados, métodos de produção desses anticorpos, imunoconjugados e moléculas multivalentes ou multiespecíficas que compreendem esses anticorpos e composições farmacêuticas que contêm os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. A invenção também está relacionada aos métodos de utilização dos anticorpos para inibir um distúrbio ou condição associada à presença de expressão de esclerostina, por exemplo, no tratamento um distúrbio patológico que é mediado por esclerostina ou que está associado a um nível aumentado de esclerostina; por exemplo, uma doença relacionada aos ossos como, por exemplo, osteoporose.
[0040] A fim de que a presente invenção possa ser maisfacilmente compreendida, primeiro serão definidos alguns termos. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.
[0041] O termo "que compreende" engloba "que inclui", bem como"que consiste"; por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo além, por exemplo, X + Y.
[0042] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico xsignifica, por exemplo, x ± 10%.
[0043] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente";por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.
[0044] O termo "resposta imunológica" refere-se à ação, porexemplo, de linfócitos, células de apresentação de antígeno, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resultem em dano seletivo, destruição ou eliminação do corpo humano de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanas normais.
[0045] O termo "esclerostina" refere-se à esclerostina humanacomo definida em SEQ ID NO: 155. A esclerostina humana recombinante pode ser obtida de R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA; 2006 N° de Catálogo 1406-ST-025). Adicionalmente, esclerostina/SOST de camundongo recombinante está disponível comercialmente por R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA; 2006 N° de Catálogo 1589-ST-025). As Patentes U.S. Nos 6.395.511 e 6.803.453, e as Publicações de Patente U.S. 20040009535 e 20050106683, referem-se aos anticorpos anti-esclerostina em geral.
[0046] O termo "anticorpo", como aqui citado, inclui anticorposinteiros e qualquer fragmento de ligação de antígeno (ou seja, "porção de ligação de antígeno") ou cadeias únicas destes. Um "anticorpo" de ocorrência natural é uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável da cadeia leve (aquiabreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões dehipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), espaçadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema clássico do complemento.
[0047] O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo(ou simplesmente "porção de antígeno"), como aqui usado, refere-se a um comprimento total ou a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade para se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, esclerostina). Foi demonstrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça (hinge); um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento dAb (Ward e cols., 1989 Nature 341: 544-546), que consiste em um domínio VH; e uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada.
[0048] Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL eVH sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos usando métodos recombinantes, por um vinculador sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia única de proteína na qual as regiões VL e VH são pareadas para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); veja, por exemplo, Bird e cols., 1988 Science 242: 423-426; e Huston e cols., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5.879-5.883). Esses anticorpos de cadeia única também estão englobados dentro do termo "região de ligação de antígeno" de um anticorpo. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos com o uso de técnicas convencionais conhecidas por aqueles habilitados na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à sua utilidade da mesma forma que os anticorpos intactos.
[0049] O termo "anticorpo isolado", como aqui usado, refere-se aum anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos que possuem especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à esclerostina é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos além da esclerostina). Um anticorpo isolado que se liga especificamente à esclerostina pode, no entanto, ter reatividade cruzada para outros antígenos, por exemplo, moléculas de esclerostina de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outros materiais celulares e/ou substâncias químicas.
[0050] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição deanticorpo monoclonal", como aqui usados, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe especificidade e afinidade de ligação únicas para um epitopo em particular.
[0051] O termo "anticorpo humano", como aqui usado, visa incluiranticorpos que possuem regiões variáveis nas quais tanto as regiões framework quanto as regiões CDR são derivadas de sequências de origem humana. Além disso, caso o anticorpo contenha uma região constante, a região constante também é derivada dessas sequências humanas, por exemplo, sequências da linhagem germinativa humana, ou versões mutadas de sequências da linhagem germinativa humana ou anticorpo contendo sequências framework de consenso derivadas da análise de sequências framework humanas, como descrito em Knappik, e cols. (2000, J. Mol. Biol. 296, 57-86).
[0052] Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduosde aminoácidos não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio- específica in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", como aqui usado, não visa incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie mamífera, por exemplo, de camundongo, foram enxertadas em sequências framework humanas.
[0053] O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se aosanticorpos que exibem uma única especificidade de ligação que possuem regiões variáveis nas quais tanto as regiões framework quanto as regiões CDR são derivadas de sequências humanas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, que possui um genoma que compreende um transgene da cadeia pesada humana e um transgene da cadeia leve fundidos a uma célula imortalizada.
[0054] O termo "anticorpo humano recombinante", como aquiusado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, por exemplo, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir dela, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos recombinantes, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção (splicing) de todo ou de uma porção de um gene de imunoglobulina humana, sequências para outras sequências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis nas quais as regiões framework e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, esses anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando é usado um animal transgênico para sequências de Ig humana, mutagênese somática in vivo) e, dessa forma, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas às sequências de VH e VL de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinativa humana de anticorpos in vivo.
[0055] Como aqui usado, o termo "isótipo" refere-se à classe deanticorpos (por exemplo, IgM, IgE, IgG como, por exemplo, IgG1 ou IgG2) que é fornecida por genes da região constante de cadeia pesada.
[0056] As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "umanticorpo específico para um antígeno" são aqui usadas de forma intercambiável com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".
[0057] Como aqui usado, um anticorpo que "se ligaespecificamente ao polipeptídeo de esclerostina" visa se referir a um anticorpo que se liga ao polipeptídeo de esclerostina com uma KD de 1 x 10-8 M ou menos, 1 x 10-9 M ou menos, ou 1 x 10-10 M ou menos. Um anticorpo que "reage de forma cruzada com um antígeno diferente de esclerostina" visa se referir a um anticorpo que se liga àquele antígeno com uma KD de 0,5 x 10-8 M ou menos, 5 x 10-9 M ou menos, ou 2 x 10-9 M ou menos. Um anticorpo que "não reage de forma cruzada com um antígeno em particular" visa se referir a um anticorpo que se liga àquele antígeno com uma KD de 1,5 x 10-8 M ou mais, ou uma KD de entre 5 x 10-8 M e 10 x 10-8 M ou 1 x 10-7 M ou mais. Em certas modalidades, esses anticorpos que não reagem de forma cruzada com o antígeno exibem ligação essencialmente indetectável contra essas proteínas em ensaios de ligação padronizados.
[0058] Como aqui usado, um anticorpo que "bloqueia o efeitoinibitório da esclerostina em um ensaio celular de sinalização de Wnt" visa se referir a um anticorpo que restaura a sinalização induzida por Wnt na presença de esclerostina em um ensaio baseado em células super top flash (STF) com uma IC50 de menos de 1 mM, 100 nM, 20 nM, 10 nM ou menos. Esse ensaio de STF é descrito com mais detalhes nos exemplos abaixo.
[0059] Como aqui usado, um anticorpo que "bloqueia o efeitoinibidor de esclerostina em um ensaio celular de mineralização " visa se referir a um anticorpo que restaura a mineralização induzida por BMP2 na presença de esclerostina em um ensaio baseado em células com uma IC50 de menos de 1 mM, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM ou menos. Esse ensaio é descrito com mais detalhes nos exemplos abaixo.
[0060] Como aqui usado, um anticorpo que "bloqueia o efeitoinibidor de esclerostina em um ensaio de fosforilação de Smad1" visa se referir a um anticorpo que restaura a fosforilação de Smad1 induzida por BMP6 na presença de esclerostina em um ensaio baseado em células com uma IC50 de menos de 1 mM, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM ou menos. Esse ensaio é descrito com mais detalhes nos exemplos abaixo.
[0061] Como aqui usado, um anticorpo que "inibe a ligação deesclerostina ao LRP-6" refere-se a um anticorpo que inibe a ligação de esclerostina ao LRP-6 com a IC50 de 1 mM, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 1 nM ou menos. Este ensaio é descrito com mais detalhes nos exemplos abaixo.
[0062] Como aqui usado, um anticorpo que "aumenta a formaçãoe a massa e densidade ósseas" refere-se a um anticorpo que é capaz de levar a formação, massa e densidade ósseas ao nível do tratamento diário intermitente com uma dose anabólica elevada de PTH, como mostrado no exemplo 10.
[0063] O termo "Kassoc" ou "Ka", como aqui usado, visa se referir àtaxa de associação de uma interação antígeno-anticorpo em particular, enquanto o termo "Kdis" ou "KD," como aqui usado, visa se referir à taxa de dissociação de uma interação antígeno-anticorpo em particular. O termo "KD", como aqui usado, visa se referir à constante de dissociação, que é obtida a partir da proporção de KD para Ka (ou seja, KD/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados com o uso de métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para a determinação da KD de um anticorpo é pela utilização de ressonância de plasmon de superfície, ou com o uso de um sistema biossensor como, por exemplo, um sistema Biacore®.
[0064] Como aqui usado, o termo "afinidade" refere-se à potênciada interação entre anticorpo e antígeno em sítios antigênicos únicos. Dentro de cada sítio antigênico, a região variável do "braço" do anticorpo interage através de forças não covalentes fracas com antígeno em vários sítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade.
[0065] Como aqui usado, o termo "avidez" refere-se a uma medidainformativa da estabilidade ou potência global do complexo antígeno- anticorpo. Ela é controlada por três fatores principais: afinidade de epitopo do anticorpo; a valência tanto do antígeno quanto do anticorpo; e o arranjo estrutural das partes que interagem. Em última análise, esses fatores definem a especificidade do anticorpo, ou seja, a probabilidade de que aquele anticorpo em particular se ligue a um epitopo preciso do antígeno.
[0066] A fim de se obter uma sonda com avidez maior, pode serconstruído um conjugado dimérico, produzindo, dessa forma, interações de baixa afinidade (por exemplo, com o anticorpo da linhagem germinativa) mais facilmente detectadas por FACS. Além disso, outro meio para aumentar a avidez da ligação de antígeno envolve a geração de dímeros, trímeros ou multímeros de qualquer uma das construções aqui descritas dos anticorpos anti-esclerostina. Esses multímeros podem ser gerados por meio da ligação covalente entre módulos individuais, por exemplo, por imitação da ligação natural C-terminal ao N ou por imitação de dímeros de anticorpo que são mantidos juntos através de suas regiões constantes. As ligações criadas na interface Fc/Fc podem ser covalentes ou não covalentes. Além disso, outros parceiros de dimerização ou multimerização além de Fc podem ser usados em híbridos de esclerostina para a criação dessas estruturas de ordem superior. Por exemplo, é possível usar domínios de multimerização como, por exemplo, o domínio de trimerização descrito em Borean (WO 2004039841) ou o domínio de pentamerização descrito no Pedido de Patente publicado WO98/18943.
[0067] Como aqui usado, o termo "reatividade cruzada" refere-se aum anticorpo ou população de anticorpos que se ligam aos epitopos em outros antígenos. Isso pode ser causado pela baixa avidez ou especificidade do anticorpo ou por múltiplos antígenos distintos que possuem epitopos idênticos ou muito similares. A reatividade cruzada algumas vezes é desejável quando se deseja a ligação geral a um grupo relacionado de antígenos ou quando se tenta a marcação cruzada de espécies quando a sequência do epitopo do antígeno não é altamente conservada em termos evolutivos.
[0068] Como aqui usado, o termo "alta afinidade" para umanticorpo IgG refere-se a um anticorpo que possui uma KD de 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos ou 10-10 M ou menos para um alvo antígeno. No entanto, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isótipos do anticorpo. Por exemplo, a ligação de "alta afinidade" por um isótipo de IgM refere-se a um anticorpo que possui uma KD de 10-7 M ou menos ou 10-8 M ou menos.
[0069] Como aqui usado, o termo "indivíduo" inclui qualqueranimal humano ou não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, por exemplo, primatas não humanos, carneiro, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis etc.
[0070] Como aqui usado, o termo "otimizado" significa que umasequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma sequência de aminoácidos com o uso de códons que são preferidos na célula ou organismo de produção, geralmente uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia ou Trichoderma, a célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeos otimizada é projetada para reter completamente ou o máximo possível a sequência de aminoácidos codificada originalmente pela sequência de nucleotídeos de partida, que também é conhecida como a sequência "parental". As sequências otimizadas aqui apresentadas foram criadas geneticamente para ter códons que sejam preferidos em células de mamíferos; no entanto, a expressão otimizada dessas sequências em outras células eucarióticas também é aqui prevista. As sequências de aminoácidos codificadas por sequências de nucleotídeos otimizadas também são citadas como otimizadas.
[0071] Vários aspectos da invenção serão descritos com maisdetalhes nas subseções seguintes.
[0072] Ensaios padronizados para avaliar a habilidade de ligaçãodos anticorpos em relação à esclerostina de várias espécies são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, western blots e RIAs. Ensaios adequados são descritos com detalhes nos exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também pode ser avaliada por ensaios padronizados conhecidos na técnica como, por exemplo, por análise Biacore. Ensaios para avaliar os efeitos dos anticorpos sobre propriedades funcionais da esclerostina (por exemplo, ligação ao receptor, prevenção ou atenuação da osteólise) serão descritos com mais detalhes nos exemplos.
[0073] Consequentemente, será subentendido que um anticorpoque "inibe" uma ou mais dessas propriedades funcionais da esclerostina (por exemplo, atividades bioquímicas, imunoquímicas, celulares, fisiológicas ou outras atividades biológicas, ou semelhantes), como determinado de acordo com metodologias conhecidas na técnica e aqui descritas, está relacionado a uma diminuição estatisticamente significante na atividade particular em relação àquela observada na ausência do anticorpo (ou quando um anticorpo de controle de especificidade irrelevante está presente). Um anticorpo que inibe a atividade de esclerostina efetua essa diminuição estatisticamente significante em pelo menos 10% do parâmetro medido, em pelo menos 50%, 80% ou 90% e, em certas modalidades, um anticorpo da invenção pode inibir acima de 95%, 98% ou 99% da atividade funcional de esclerostina.
[0074] Os termos "bloquear de forma cruzada", "bloqueado deforma cruzada" e "bloqueio cruzado" são aqui usados de forma intercambiável para significar a habilidade de um anticorpo ou de outro agente de ligação para interferir com a ligação de outros anticorpos ou agentes de ligação à esclerostina em um ensaio de ligação competitiva padronizado.
[0075] A habilidade ou extensão na qual um anticorpo ou outroagente de ligação é capaz de interferir com a ligação de outro anticorpo ou molécula de ligação à esclerostina e, portanto, se ele pode ser considerado como bloqueando de forma cruzada de acordo com a invenção, pode ser determinada com o uso de ensaios padronizados de competição por ligação. Um ensaio adequado envolve o uso da tecnologia Biacore (por exemplo, com o uso do instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suécia)), que pode mediar a extensão das interações com o uso da tecnologia de ressonância de plasmon de superfície. Outro ensaio para medida do bloqueio cruzado usa uma abordagem baseada em ELISA.
[0076] Detalhes adicionais sobre ambos os métodos serãoapresentados nos exemplos.
[0077] De acordo com a invenção, um anticorpo de bloqueiocruzado ou outro agente de ligação de acordo com a invenção se liga à esclerostina no ensaio de bloqueio cruzado Biacore descrito, de tal forma que a ligação registrada da combinação (mistura) dos anticorpos ou agentes de ligação esteja entre 80% e 0,1% (por exemplo, 80% a 4%) da ligação teórica máxima, especificamente entre 75% e 0,1% (por exemplo, 75% a 4%) da ligação teórica máxima e, mais especificamente, entre 70% e 0,1% (por exemplo, 70% a 4%) e, mais especificamente, entre 65% e 0,1% (por exemplo, 65% a 4%) da ligação teórica máxima (como definido acima) dos dois anticorpos ou agentes de ligação em combinação.
[0078] Um anticorpo é definido como tendo bloqueio cruzado noensaio ELISA como descrito nos exemplos se o anticorpo anti- esclerostina da fase em solução é capaz de causar uma redução entre 60% e 100%, especificamente entre 70% e 100% e, mais especificamente, entre 80% e 100%, do sinal de detecção de esclerostina (ou seja, a quantidade de esclerostina ligada pelo anticorpo revestido), quando comparado com o sinal de detecção de esclerostina obtido na ausência do anticorpo anti-esclerostina da fase em solução (ou seja, os poços de controle positivo).
Anticorpos monoclonais
[0079] Os anticorpos da invenção incluem os anticorposmonoclonais humanos, isolados da forma descrita nos exemplos. As sequências de aminoácidos de VH de anticorpos isolados da invenção são mostradas nas SEQ ID NOs: 69-77. As sequências deaminoácidos de VL de anticorpos isolados da invenção são mostradas nas SEQ ID NOs: 80-88, respectivamente. As sequências deaminoácidos da cadeia pesada de comprimento total preferidas correspondentes de anticorpos da invenção são mostradas nas SEQ ID NOs: 113-121. As sequências de aminoácidos da cadeia leve de comprimento total preferidas correspondentes de anticorpos da invenção são mostradas nas SEQ ID NOs: 124-132, respectivamente. Outros anticorpos da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, embora tenham pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento ou mais de identidade nas regiões CDR com as regiões CDR reveladas nas sequências descritas acima. Em algumas modalidades, a invenção inclui sequências de aminoácidos mutantes nas quais no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões CDR, quando comparadas com as regiões CDR reveladas na sequência descrita acima.
[0080] Além disso, sequências de nucleotídeos parentais dacadeia pesada variável são mostradas nas SEQ ID NOs: 89-90. Sequências de nucleotídeos parentais da cadeia pesada variável são mostradas nas SEQ ID NOs: 100-101. Sequências de nucleotídeos da cadeia leve de comprimento total otimizadas para expressão em uma célula de mamífero são mostradas nas SEQ ID NOs: 146-154. Sequências de nucleotídeos da cadeia pesada de comprimento total otimizadas para expressão em uma célula de mamífero são mostradas nas SEQ ID NOs: 135-143. Sequências de aminoácidos da cadeia leve de comprimento total codificadas por sequências de nucleotídeos otimizadas da cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 124-132. Sequências de aminoácidos da cadeia pesada de comprimento total codificadas por sequências de nucleotídeos otimizadas da cadeia pesada são mostradas nas SEQ ID NOs: 113-121. Outros anticorpos da invenção incluem aminoácidos ou ácidos nucléicos que foram mutados, embora possuam pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 por cento ou mais de identidade para as sequências descritas acima. Em algumas modalidades, a invenção inclui sequências de aminoácidos mutantes nas quais no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões variáveis, quando comparadas com as regiões variáveis reveladas na sequência descrita acima, retendo ainda substancialmente a mesma atividade terapêutica.
[0081] Na medida em que cada um desses anticorpos pode seligar à esclerostina, as sequências da cadeia leve de comprimento total e as sequências da cadeia pesada de comprimento total, VH, VL (sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos), podem ser "misturadas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação anti-esclerostina da invenção. A ligação à esclerostina desses anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada com a utilização dos ensaios de ligação descritos acima e nos exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando essas cadeias são misturadas e combinadas, uma sequência de VH de um pareamento VH/VL em particular deve ser substituída com uma sequência de VH estruturalmente similar. Da mesma forma, uma sequência da cadeia pesada de comprimento total de um pareamento de cadeia pesada de comprimento total / cadeia leve de comprimento total em particular deve ser substituída com uma sequência da cadeia pesada de comprimento total estruturalmente similar. Da mesma forma, uma sequência de VL de um pareamento VH/VL em particular deve ser substituída com uma sequência de VL estruturalmente similar. Do mesmo modo, uma sequência da cadeia leve de comprimento total de um pareamento de cadeia pesada de comprimento total / cadeia leve de comprimento total em particular deve ser substituída com uma sequência da cadeia leve de comprimento total estruturalmente similar. Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado ou uma região de ligação de antígeno deste que possui: uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 69-77; e uma região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 80-88; em que o anticorpo se liga especificamente à esclerostina.
[0082] Em outro aspecto, a invenção fornece:
[0083] um anticorpo monoclonal isolado que possui: uma cadeiapesada de comprimento total que compreende uma sequência de aminoácidos que foi otimizada para expressão na célula de um mamífero selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 113121; e uma cadeia leve de comprimento total que compreende uma sequência de aminoácidos que foi otimizada para expressão na célula de um mamífero selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 124-132; ou
[0084] uma proteína funcional que compreende uma porção deligação de antígeno desta.
[0085] Em outro aspecto, a invenção fornece:
[0086] um anticorpo monoclonal isolado que possui: uma cadeiapesada de comprimento total que compreende uma sequência de nucleotídeos que foi otimizada para expressão na célula de um mamífero selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 135143; e uma cadeia leve de comprimento total que compreende uma sequência de nucleotídeos que foi otimizada para expressão na célula de um mamífero selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 146-154; ou,
[0087] uma proteína funcional que compreende uma porção deligação de antígeno desta.
[0088] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece anticorpos quecompreendem as CDR1s, CDR2s e CDR3s da cadeia pesada e da cadeia leve dos anticorpos, ou combinações destas. As sequências de aminoácidos das CDR1s de VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 1-11. As sequências de aminoácidos das CDR2s de VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 12-22. As sequências de aminoácidos das CDR3s de VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 23-33. As sequências de aminoácidos das CDR1s de VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 34-44. As sequências de aminoácidos das CDR2s de VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 45-55. As sequências de aminoácidos das CDR3s de VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 56-66. As regiões CDR são delineadas usando o sistema de Kabat (Kabat, E.A., e cols., 1991 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, "U.S. Department of Health and Human Services", Publicação NIH N° 91-3242).
[0089] Considerando que cada um desses anticorpos pode se ligarà esclerostina e que a especificidade de ligação de antígeno é fornecida primariamente pelas regiões CDR1, 2 e 3, as sequências de CDR1, 2 e 3 de VH e as sequências de CDR1, 2 e 3 de VL podem ser "misturadas e combinadas" (ou seja, CDRs de diferentes anticorpos podem ser misturadas e combinadas), embora cada anticorpo deva conter uma CDR1, 2 e 3 de VH e uma CDR1, 2 e 3 de VL para criar outras moléculas de ligação anti-esclerostina da invenção. A ligação à esclerostina desses anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada com a utilização dos ensaios de ligação descritos acima e nos exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando sequências de CDR de VH são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VH em particular deve ser substituída com sequência(s) de CDR estruturalmente similares. Da mesma forma, quando sequências de VL de CDR são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de VL em particular deve ser substituída com sequência(s) de CDR estruturalmente similares. Ficará evidente para aqueles habilitados na técnica que novas sequências de VH e VL podem ser criadas por substituição de uma ou mais sequências da região CDR de VH e/ou VL com sequências estruturalmente similares das sequências de CDR aqui mostradas para anticorpos monoclonais da presente invenção.
[0090] Um anticorpo monoclonal isolado, ou região de ligação deantígeno deste, possui: uma CDR1 da região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-11; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1222; uma CDR3 da região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 23-33; uma CDR1 da região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 34-44; uma CDR2 da região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 45-55; e uma CDR3 da região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56-66; em que o anticorpo se liga especificamente à esclerostina.
[0091] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 14; uma CDR3 daregião variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 25; uma CDR1 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 36; uma CDR2 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 47; e uma CDR3 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 58.
[0092] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 15; uma CDR3 daregião variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 26; uma CDR1 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 37; uma CDR2 daregião variável da cadeia leve do SEQ ID NO: 48; e uma CDR3 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 59.
[0093] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 5; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 16; uma CDR3 daregião variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 27; uma CDR1 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 38; uma CDR2 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 49; e uma CDR3 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 60.
[0094] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 6; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 17; uma CDR3 daregião variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 28; uma CDR1 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 39; uma CDR2 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 50; e uma CDR3 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 61.
[0095] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 18; uma CDR3 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 29; uma CDR1 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 40; uma CDR2 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 51; e uma CDR3 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 62.
[0096] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 8; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 19; uma CDR3 daregião variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 30; uma CDR1 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 41; uma CDR2 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 52; e uma CDR3 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 63.
[0097] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 9; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 20; uma CDR3 daregião variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 31; uma CDR1 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 42; uma CDR2 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 53; e uma CDR3 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 64.
[0098] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 10; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 21; uma CDR3 daregião variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 32; uma CDR1 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 43; uma CDR2 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 54; e uma CDR3 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 65.
[0099] Em certa modalidade, o anticorpo compreende: uma CDR1da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 11; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 22; uma CDR3 daregião variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 33; uma CDR1 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 44; uma CDR2 daregião variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 55; e uma CDR3 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 66.
[00100] Como aqui usado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis da cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas ou leves de comprimento total que são "o produto de" ou "derivadas de" uma sequência da linhagem germinativa em particular se as regiões variáveis ou as cadeias de comprimento total do anticorpo são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Esses sistemas incluem a imunização de um camundongo transgênico que carrega genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou a avaliação de uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana apresentada em fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina da linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal por comparação da sequência de aminoácidos do anticorpo humano com as sequências de aminoácidos de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana e seleção da sequência de imunoglobulina da linhagem germinativa humana mais próxima em termos de sequência (ou seja, o maior % de identidade) com a sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em particular pode conter diferenças de aminoácidos quando comparado com a sequência da linhagem germinativa, em função, por exemplo, de mutações somáticas de ocorrência natural ou da introdução intencional de mutação sítio-dirigida. No entanto, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em termo de sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina da linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano, quando comparada com as sequências de aminoácidos de imunoglobulina da linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências da linhagem germinativa murídea). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos 95% ou até mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em termos de sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência da linhagem germinativa humana em particular exibirá no máximo 10 diferenças de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir no máximo 5, ou até mesmo no máximo 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa.
[00101] Em algumas modalidades, sequências de aminoácidos de imunoglobulina da linhagem germinativa são selecionadas entre aquelas que compreendem as sequências da cadeia pesada variável que consistem em SEQ ID NO: 67-68, respectivamente, e as sequências da cadeia leve variável que consistem em SEQ ID NO: 7879, respectivamente.
Anticorpos homólogos
[00102] Ainda em outra modalidade, um anticorpo da invenção possui sequências de aminoácidos de comprimento total da cadeia pesada e leve; sequências de nucleotídeos de comprimento total da cadeia pesada e leve, sequências de nucleotídeos da cadeia pesada e leve da região variável, ou sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve da região variável que são homólogas às sequências de aminoácidos e de nucleotídeos dos anticorpos aqui descritos, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-esclerostina da invenção.
[00103] Por exemplo, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado (ou uma proteína funcional que compreende uma porção de ligação de antígeno desta) que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que: a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6777; a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 7888; o anticorpo se liga especificamente à esclerostina, e o anticorpo exibe pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: o anticorpo bloqueia o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio celular de sinalização de Wnt, o anticorpo bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio celular de mineralização ou bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio de fosforilação de Smad1 ou o anticorpo inibe a ligação de esclerostina ao LRP-6 ou o anticorpo aumenta a formação e a massa e densidade ósseas.
[00104] Em um exemplo adicional, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado (ou uma proteína funcional que compreende uma porção de ligação de antígeno desta) que compreende uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total, em que: a cadeia pesada de comprimento total compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111-121; a cadeia leve de comprimento total compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 122-132; o anticorpo se liga especificamente à esclerostina, e o anticorpo exibe pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: o anticorpo bloqueia o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio celular de sinalização de Wnt, o anticorpo bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio celular de mineralização ou bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio de fosforilação de Smad1 ou o anticorpo inibe a ligação de esclerostina ao LRP-6 ou o anticorpo aumenta a formação e a massa e densidade ósseas.
[00105] Em outro exemplo, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado (ou uma proteína funcional que compreende uma porção de ligação de antígeno desta), que compreende uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total, em que: a cadeia pesada de comprimento total é codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 133-143; a cadeia leve de comprimento total compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 144-154; o anticorpo se ligaespecificamente à esclerostina, e o anticorpo exibe pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: o anticorpo bloqueia o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio celular de sinalização de Wnt, o anticorpo bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio celular de mineralização ou bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio de fosforilação de Smad1 ou o anticorpo inibe a ligação de esclerostina ao LRP-6 ou o anticorpo aumenta a formação e a massa e densidade ósseas.
[00106] Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais, duas ou mais ou três das propriedades funcionais discutidas acima. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
[00107] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos de VH e/ou VL podem ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas acima. Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos de VH e/ou VL podem ser idênticas, exceto uma substituição de aminoácido em, no máximo, 1, 2, 3, 4 ou 5 posições de aminoácidos. Um anticorpo que possuiregiões VH e VL com alta (ou seja, 80% ou mais) de identidade para as regiões VH e VL das SEQ ID NOs: 67-77 e SEQ ID NOs: 78-88,respectivamente, pode ser obtido por mutagênese (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucléico que codificam as SEQ ID NOs: 89-99 e 100-110, respectivamente, seguida por teste do anticorpo alterado codificado quanto à função retida (ou seja, as funções apresentadas acima) com o uso dos ensaios funcionais aqui descritos.
[00108] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos da cadeia pesada de comprimento total e/ou da cadeia leve de comprimento total podem ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas acima. Um anticorpo que possui uma cadeia pesada de comprimento total e cadeia leve de comprimento total que possui alta (ou seja, 80% ou mais) identidade para as cadeias pesadas de comprimento total de qualquer uma das SEQ ID NOs: 111-121 e cadeias leves de comprimento total de qualquer uma das SEQ ID NOs: 122-132, respectivamente, pode ser obtido por mutagênese (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucléico que codificam as SEQ ID NOs: 133-143 e SEQ ID NOs: 144154, respectivamente, seguida por teste do anticorpo alterado codificado quanto à função retida (ou seja, as funções apresentadas acima) com o uso dos ensaios funcionais aqui descritos.
[00109] Em outras modalidades, as sequências de nucleotídeos da cadeia pesada de comprimento total e/ou da cadeia leve de comprimento total podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas acima.
[00110] Em outras modalidades, as regiões variáveis das sequências de nucleotídeos da cadeia pesada e/ou da cadeia leve podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas acima.
[00111] Como aqui usado, o percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, % de identidade = # de posições idênticas/# total de posições x 100), levando-se em conta o número de lacunas (gaps) e o comprimento de cada lacuna que precisa ser introduzida para o alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação do percentual de identidade entre duas sequências podem ser efetuadas com o uso de um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.
[00112] O percentual de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinado usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de ponderação de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, o percentual de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinado com a utilização do algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970) que foi incorporado no programa GAP na suíte de programas GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz de Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e uma ponderação de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4, e uma ponderação de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[00113] Adicional ou alternativamente, as sequências de proteínas da presente invenção podem ainda ser usadas como uma "sequência interrogada" para a realização de uma pesquisa contra bases de dados públicas para, por exemplo, a identificação de sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser realizadas usando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, e cols., 1990 J. Mol. Biol. 215: 403-10. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para a obtenção de sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de anticorpo da invenção. Para a obtenção de alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e cols., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17): 3.389-3.402. Quando se utilizam os programas BLAST eGapped BLAST, podem ser usados os parâmetros padronizados dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Veja http:www.ncbi.nhn.nih.gov.
Anticorpos com modificações conservadoras
[00114] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção possui uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais dessas sequências de CDR possui sequências de aminoácidos especificadas baseadas nos anticorpos aqui descritos ou modificações conservadoras destas, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-esclerostina da invenção. Consequentemente, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado, ou uma proteína funcional que compreende uma porção de ligação de antígeno deste, que consiste em uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve que compreende sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que: as sequências de aminoácidos da CDR1 da região variável da cadeia pesada são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-11, e modificações conservadoras destes; as sequências de aminoácidos da CDR2 da região variável da cadeia pesada são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12-22, e modificações conservadoras destes; as sequências de aminoácidos da CDR3 da região variável da cadeia pesada são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 23-33, e modificações conservadoras destes; as sequências de aminoácidos da CDR1 das regiões variáveis da cadeia leve são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 34-44, e modificações conservadoras destes; as sequências de aminoácidos da CDR2 das regiões variáveis da cadeia leve são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 45-55, e modificações conservadoras destes; as sequências de aminoácidos da CDR3 das regiões variáveis da cadeia leve são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56-66, e modificações conservadoras destes; o anticorpo se liga especificamente à esclerostina, e o anticorpo exibe pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: o anticorpo bloqueia o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio celular de sinalização de Wnt, o anticorpo bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio celular de mineralização ou bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio de fosforilação de Smad1 ou o anticorpo inibe a ligação de esclerostina ao LRP-6 ou o anticorpo aumenta a formação e a massa e densidade ósseas.
[00115] Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais, duas ou mais ou três ou mais das propriedades funcionais listadas discutidas acima. Esses anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.
[00116] Em outras modalidades, um anticorpo da invenção otimizado para expressão em uma célula de mamífero possui uma sequência da cadeia pesada de comprimento total e uma sequência da cadeia leve de comprimento total, em que uma ou mais dessas sequências possuem sequências de aminoácidos especificadas baseadas nos anticorpos aqui descritos ou modificações conservadoras destas, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-esclerostina da invenção. Consequentemente, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado otimizado para expressão em uma célula de mamífero que consiste em uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total, em que: a cadeia pesada de comprimento total possui sequências de aminoácidos selecionadas do grupo das SEQ ID NOs: 111-121, e modificações conservadoras destes; e a cadeia leve de comprimento total possui sequências de aminoácidos selecionadas do grupo das SEQ ID NOs: 122-132, e modificações conservadoras destes; o anticorpo se liga especificamente à esclerostina; e o anticorpo exibe pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: o anticorpo bloqueia o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio celular de sinalização de Wnt, o anticorpo bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio celular de mineralização ou bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio de fosforilação de Smad1 ou o anticorpo inibe a ligação de esclerostina ao LRP-6 ou o anticorpo aumenta a formação e a massa e densidade ósseas.
[00117] Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais, duas ou mais ou três ou mais das propriedades funcionais listadas discutidas acima. Esses anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.
[00118] Como aqui usado, o termo "modificações conservadoras de sequências" visa se referir às modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo que contém a sequência de aminoácidos. Essas modificações conservadoras incluem substituições, adições e eliminações de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção por técnicas padronizadas conhecidas na técnica como, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida e mediada por PCR.
[00119] Substituições de aminoácidos conservadoras são aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Dessa forma, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral, e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função retida com o uso dos ensaios funcionais aqui descritos.
Anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que os anticorpos anti-esclerostina da invenção
[00120] Em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que os vários anticorpos anti-esclerostina específicos da invenção aqui descritos. Foi verificado de forma surpreendente que todos os anticorpos descritos nos exemplos são capazes de:
[00121] bloquear o efeito inibitório da esclerostina em um ensaiocelular de sinalização de Wnt;
[00122] bloquear o efeito inibidor em um ensaio celular demineralização ;
[00123] inibir a ligação de esclerostina ao LRP-6; e,
[00124] aumentar a formação, massa e densidade ósseas,
[00125] ligar ao mesmo epitopo em esclerostina com alta afinidade, o referido epitopo sendo um epitopo conformacional que inclui aminoácidos tanto de SEQ ID NO: 156 quanto de SEQ ID NO: 157. Sem se fixar a qualquer modelo específico, propõe-se aqui que as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 156 e SEQ ID NO: 157 delineiam uma região do epitopo conformacional no polipeptídeo de esclerostina que é reconhecida pelos anticorpos da invenção.
[00126] Portanto, podem ser identificados anticorpos adicionais com base em sua habilidade para competir de forma cruzada (por exemplo, para inibir competitivamente a ligação, de uma forma estatisticamente significante) com outros anticorpos da invenção em ensaios de ligação de esclerostina padronizados. A habilidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de anticorpos da presente invenção à esclerostina humana demonstra que o anticorpo de teste pode competir com aquele anticorpo pela ligação à esclerostina humana; um anticorpo desse tipo pode, de acordo com uma teoria não limitante, se ligar ao mesmo epitopo ou a um epitopo relacionado (por exemplo, um epitopo estruturalmente similar ou espacialmente próximo) na esclerostina humana que o anticorpo com o qual ele compete. Em certa modalidade, o anticorpo que se liga ao mesmo epitopo na esclerostina humana que os anticorpos da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano. Esses anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados como descrito nos exemplos.
Anticorpos criados geneticamente e modificados
[00127] Um anticorpo da invenção pode ainda ser preparado com o uso de um anticorpo que possui uma ou mais das sequências de VH e/ou VL aqui mostradas como material de partida para criar geneticamente um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas em relação ao anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser criado geneticamente por modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (ouseja, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDRe/ou dentro de uma ou mais regiões framework. Adicional oualternativamente, um anticorpo pode ser criado geneticamente pormodificação de resíduos dentro da região constante (ou regiões constantes), por exemplo, para alterar a função (ou funções) efetora do anticorpo.
[00128] Um tipo de criação genética de região variável que pode ser realizada é o enxerto de CDR. Anticorpos interagem com antígenos- alvo predominantemente por meio de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada e leve (CDRs). Por essa razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequências fora das CDRs. Como as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações antígeno-anticorpo, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos por construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específico enxertadas em sequências framework de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja, por exemplo, Riechmann, L. e cols., 1998 Nature 332: 323-327; Jones, P. e cols., 1986 Nature 321: 522525; Queen, C. e cols., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10.02910.033; Patente U.S. N° 5.225.539 para Winter, e Patentes U.S. Nos 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 e 6.180.370 para Queen e cols.).
[00129] Consequentemente, outra modalidade da invenção pertence a um anticorpo monoclonal isolado, ou uma proteína funcional que compreende uma porção de ligação de antígeno deste, que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências da CDR1 que possuem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 111; sequências da CDR2 que possuem uma sequência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1222; sequências da CDR3 que possuem uma sequência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2333, respectivamente; e uma região variável da cadeia leve que possui sequências da CDR1 que possuem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 34-44; sequências da CDR2 que possuem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 45-55; e sequências da CDR3 que consistem em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5666, respectivamente. Dessa forma, esses anticorpos contêm as sequências de CDR de VH e VL de anticorpos monoclonais, embora ainda possam conter diferentes sequências framework desses anticorpos.
[00130] Essas sequências framework podem ser obtidas de bases de dados públicas de DNA ou de referências publicadas que incluem sequências do gene de anticorpo da linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA da linhagem germinativa para genes da região variável da cadeia pesada humana e leve podem ser encontradas na base de dados de sequências da linhagem germinativa humana "VBase" (disponível na Internet em www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E. A., e cols., 1991,"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, "U.S. Department of Health and Human Services", Publicação NIH N° 91-3242; Tomlinson, I. M., e cols., 1992, J. Mol. Biol. 227: 776-798; e Cox, J. P. L. e cols., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827-836; em que o conteúdo de cada uma dessas referências é aqui expressamente incorporado por referência.
[00131] Um exemplo de sequências framework para uso nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente similares às sequências framework usadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, sequências de consenso e/ou sequências framework usadas por anticorpos monoclonais da invenção. As sequências da CDR1, 2 e 3 de VH, e as sequências da CDR1, 2 e 3 de VL podem ser enxertadas em regiões framework que possuam sequência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina da linhagem germinativa do qual a sequência framework deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões framework que contêm uma ou mais mutações, quando comparadas com as sequências da linhagem germinativa. Por exemplo, foi verificado que em certos casos é benéfico mutar resíduos dentro das regiões framework para manter ou intensificar a habilidade de ligação de antígeno do anticorpo (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 e 6.180.370 para Queen e cols.).
[00132] Outro tipo de modificação da região variável é a mutação de resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para aumentar, dessa forma, uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, um processo conhecido como "maturação da afinidade." A mutagênese sítio-dirigida ou a mutagênese mediada por PCR pode ser efetuada para introduzir a mutação (ou mutações), e o efeito sobre a ligação de anticorpo, ou sobre outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo, como aqui descrito e fornecido nos exemplos.
[00133] Podem ser introduzidas modificações conservadoras (como discutido acima). As mutações podem ser substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Além disso, tipicamente no máximo um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.
[00134] Consequentemente, em outra modalidade, a invenção fornece anticorpos monoclonais anti-esclerostina isolados, ou uma proteína funcional que compreende uma porção de ligação de antígeno destes, que consistem em uma região variável da cadeia pesada que possui: uma região CDR1de VH que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que possui as SEQ ID NOs: 1-11 ou uma sequência de aminoácidos que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, quando comparada com as SEQ ID NOs: 1-11; uma região CDR2 de que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12-22, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, quando comparada com as SEQ ID NOs: 12-22; uma região CDR3 de VH que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 23-33, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, quando comparada com as SEQ ID NOs: 23-33; uma região CDR1 de VL que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3444, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, quando comparada com as SEQ ID NOs: 34-44; uma região CDR2 VL que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 45-55, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, quando comparada com as SEQ ID NOs: 45-55; e uma região CDR3 de VL que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5666, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, quando comparada com as SEQ ID NOs: 56-66.
Enxerto de domínios de ligação de antígeno em frameworks ou arcabouços (scaffolds) alternativos
[00135] Uma ampla variedade de frameworks ou arcabouços de anticorpo / imunoglobulina pode ser empregada, desde que o polipeptídeo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que se ligue especificamente à esclerostina. Esses frameworks ou arcabouços incluem os 5 idiótipos principais de imunoglobulinas humanas, ou fragmentos destes (tais como aqueles aqui revelados em outra seção), e incluem imunoglobulinas de outras espécies animais, preferivelmente que possuam aspectos humanizados. Anticorpos de cadeia pesada única, tais como aqueles identificados em camelídeos, são de interesse particular a esse respeito. Novos frameworks, arcabouços e fragmentos continuam a ser descobertos e desenvolvidos por aqueles habilitados na técnica.
[00136] Em um aspecto, a invenção pertence à geração de anticorpos não baseados em imunoglobulina com o uso de arcabouços não-imunoglobulina sobre os quais as CDRs da invenção podem ser enxertadas. Podem ser empregados frameworks e arcabouços não imunoglobulina conhecidos ou futuros, desde que compreendam uma região de ligação específica para a proteína-alvo da SEQ ID NO: 155. Esses compostos são aqui conhecidos como "polipeptídeos que compreendem uma região de ligação alvo-específica". Exemplos de frameworks não imunoglobulina são ainda descritos nas seções abaixo (anticorpos de camelídeos e arcabouço não-anticorpo).
Anticorpos de camelídeos
[00137] Proteínas de anticorpo obtidas de membros da família do camelo e do dromedário (Camelus bactrianus e Camelus dromaderius) incluindo novos membros mundiais como, por exemplo, espécies de lhama (Lama paccos, Lama glama e Lama vicugna), foram caracterizadas com relação ao tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para indivíduos humanos. Certos anticorpos IgG dessa família de mamíferos como encontrados na natureza são desprovidos de cadeias leves e são, dessa forma, estruturalmente distintos da estrutura quaternária típica de quatro cadeias que possui duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, para anticorpos de outros animais. Veja PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 publicado em 3 de março de 1994).
[00138] Uma região do anticorpo de camelídeo que é o pequeno domínio variável único identificado como VHH pode ser obtida por engenharia genética para gerar uma pequena proteína que possui alta afinidade por um alvo, resultando em uma proteína derivada de anticorpo de baixo peso molecular conhecida como um "nanobody de camelídeo". Veja a Patente U.S. número 5.759.808 emitida em 2 de junho de 1998; veja também Stijlemans, B. e cols., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1.256-1.261; Dumoulin, M. e cols., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. e cols. 2003 Bioconjugate. Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. e cols. 2002 Int. J. Cancer. 89: 456-62; e Lauwereys, M. e cols. 1998 EMBO J. 17: 3.512-3.520. Bibliotecas criadas geneticamente de anticorpos de camelídeos e fragmentos de anticorpo estão disponíveis comercialmente, por exemplo, por Ablynx, Ghent, Bélgica. Como ocorre com outros anticorpos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo de camelídeo pode ser alterada recombinantemente para se obter uma sequência que parece mais intimamente com uma sequência humana, ou seja, o nanobody pode ser "humanizado". Dessa forma, a baixa antigenicidade natural de anticorpos de camelídeos para humanos pode ser ainda mais reduzida.
[00139] O nanobody de camelídeo possui um peso molecular de aproximadamente um décimo daquele de uma molécula de IgG humana, e a proteína possui um diâmetro físico de apenas poucos nanômetros. Uma consequência do pequeno tamanho é a habilidade de nanobodies de camelídeos para se ligar aos sítios antigênicos que são funcionalmente invisíveis para proteínas de anticorpo maiores, ou seja, nanobodies de camelídeos são úteis como reagentes para a detecção de antígenos que de outro modo são crípticos com o uso de técnicas imunológicas clássicas, e como possíveis agentes terapêuticos. Dessa forma, ainda outra consequência do pequeno tamanho é que um nanobody de camelídeo pode inibir em consequência da ligação a um sítio específico em um sulco ou em uma fenda estreita de uma proteína-alvo e, assim, pode servir em uma capacidade que se parece de forma mais íntima com uma função de um fármaco de baixo peso molecular clássico do que aquela de um anticorpo clássico.
[00140] O baixo peso molecular e o tamanho compacto aindaresultam no fato de os nanobodies de camelídeos serem extremamente termoestáveis, estáveis até um pH extremo e à digestão proteolítica, e fracamente antigênicos. Outra consequência é que os nanobodies de camelídeos facilmente se movem do sistema circulatório para dentro dos tecidos, e até mesmo atravessam a barreira hematoencefálica e podem tratar distúrbios que afetam o tecido nervoso. Os nanobodies podem facilitar ainda mais o transporte de fármacos através da barreira hematoencefálica. Veja o Pedido de Patente U.S. 20040161738 publicado em 19 de agosto de 2004. Essas características, combinadas com a baixa antigenicidade para seres humanos, indicam grande potencial terapêutico. Além disso, essas moléculas podem ser totalmente expressas em células procarióticas como, por exemplo, E. coli, e são expressas como proteínas de fusão com bacteriófago e são funcionais.
[00141] Consequentemente, uma característica da presente invenção é um anticorpo ou nanobody de camelídeo que possui alta afinidade por esclerostina. Em certas modalidades aqui apresentadas, o anticorpo ou nanobody de camelídeo é produzido naturalmente no animal camelídeo, ou seja, é produzido pelo camelídeo após imunização com esclerostina ou um fragmento peptídico desta, com o uso de técnicas aqui descritas para outros anticorpos. Alternativamente, o nanobody anti-esclerostina de camelídeo é criado geneticamente, ou seja, produzido por seleção, por exemplo, a partir de uma biblioteca de fago que apresenta proteínas de nanobody de camelídeo adequadamente mutagenizadas usando procedimentos de panning com esclerostina como alvo, como descrito nos exemplos aqui apresentados. Nanobodies criados geneticamente podem ainda ser personalizados por engenharia genética para terem uma meia-vida em um indivíduo receptor de 45 minutos até duas semanas. Em uma modalidade específica, o anticorpo ou nanobody de camelídeo é obtido por enxerto das sequências de CDRs da cadeia pesada ou leve dos anticorpos humanos da invenção em nanobody ou em sequências framework de anticorpo de domínio único, como descrito, por exemplo, em PCT/EP93/02214 (WO94/04678).
Arcabouço não anticorpo
[00142] Frameworks ou arcabouços não-imunoglobulina conhecidos incluem, sem limitação, Adnectinas (fibronectina) (Substâncias Terapêuticas Compostas, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurique, Suíça), anticorpos de domínio (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) e Ablynx nv (Zwijnaarde, Bélgica)), lipocalina (Anticalin) (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemanha), pequenos produtos imunofarmacêuticos modulares (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxybodies (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), Proteína A (Affibody AG, Suécia) e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha), miméticos de epitopo de proteína (Poliphor Ltd, Allschwil, Suíça).
Adnectinas - Substâncias terapêuticas compostas
[00143] Os arcabouços de adnectina são baseados no domínio de fibronectina tipo III (por exemplo, o décimo módulo de fibronectina tipo III (domínio 10 Fn3)). O domínio de fibronectina tipo III possui 7 ou 8 fitas beta que estão distribuídas entre duas lâminas beta, as quais se compactam umas contra as outras para formar o núcleo da proteína, e que ainda contêm alças (análogas às CDRs) que conectam as fitas beta entre elas e estão expostas ao solvente. Há pelo menos três dessas alças em cada borda do sanduiche de lâmina beta, em que a borda é o limite da proteína perpendicular à direção das fitas beta (U.S. 6.818.418).
[00144] Esses arcabouços baseados em fibronectina não são uma imunoglobulina, embora o enovelamento global esteja intimamente relacionado com aquele no menor fragmento funcional de anticorpo, a região variável da cadeia pesada, que compreende toda a unidade de reconhecimento de antígeno na IgG de camelo e de lhama. Por causa dessa estrutura, o anticorpo não-imunoglobulina mimetiza as propriedades de ligação de antígeno que são similares em natureza e afinidade àquelas de anticorpos. Esses arcabouços podem ser usados em uma estratégia de randomização e embaralhamento de alças in vitro que é similar ao processo de maturação da afinidade de anticorpos in vivo. Essas moléculas baseadas em fibronectina podem ser usadas como arcabouços, em que as regiões de alça da molécula podem ser substituídas com CDRs da invenção usando técnicas padronizadas de clonagem.
Anquirina - Parceiros moleculares
[00145] A tecnologia se baseia na utilização de proteínas com módulos de repetição derivados de anquirina como arcabouços para abrigar regiões variáveis que podem ser usadas para a ligação a diferentes alvos. O módulo de repetição de anquirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos que consiste em duas a-hélices antiparalelas e um β-turn. A ligação das regiões variáveis é otimizada principalmente pela utilização de apresentação de ribossomo.
Maxybodies/Avímeros - Avidia
[00146] Avímeros são derivados de proteínas naturais que contêm domínio A como, por exemplo, LRP-1. Esses domínios são usados pela natureza para interações proteína-proteína e em humanos em mais de 250 proteínas que se baseiam estruturalmente em domínios A. Avímeros consistem em diversos monômeros diferentes de "domínio A" (2-10) ligados por meio de vinculadores de aminoácidos. Podem ser criados avímeros que se ligam ao antígeno-alvo com o uso da metodologia descrita, por exemplo, em 20040175756, 20050053973, 20050048512 e 20060008844.
Proteína A - Affibody
[00147] Ligantes de afinidade Affibody® são proteínas simples pequenas compostas por um feixe de três hélices baseado no arcabouço de um dos domínios de ligação de IgG da Proteína A. A Proteína A é uma proteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Esse domínio do arcabouço consiste em 58 aminoácidos, 13 dos quais são randomizados para gerar bibliotecas de Affibody® com um grande número de variantes de ligantes (veja, por exemplo, U.S. 5.831.012). As moléculas de Affibody® mimetizam anticorpos, e possuem um peso molecular de 6 kDa, comparado com o peso molecular de anticorpos, que é de 150 kDa. Apesar de seu pequeno tamanho, o sítio de ligação de moléculas de Affibody® é similar àquele de um anticorpo.
Anticalins - Pieris
[00148] Anticalins® são produtos desenvolvidos pela empresa Pieris ProteoLab AG. Eles são derivados de lipocalinas, um grupo disseminado de proteínas pequenas e robustas que estão normalmente envolvidas no transporte ou armazenamento fisiológico de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. Várias lipocalinas naturais ocorrem em tecidos ou em líquidos corporais humanos.
[00149] A arquitetura da proteína é reminiscente de imunoglobulinas, com alças hipervariáveis no topo de uma framework rígida. No entanto, em contraste com anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, as lipocalinas são compostas por uma única cadeia polipeptídica com 160 a 180 resíduos de aminoácidos, sendo apenas um pouco maiores do que um domínio de imunoglobulina único.
[00150] O conjunto de quatro alças, que constitui a bolsa de ligação, exibe plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade de cadeias laterais. O sítio de ligação pode, dessa forma, ser remodelado em um processo proprietário a fim de reconhecer moléculas-alvo prescritas de formato diferente com alta afinidade e especificidade.
[00151] Uma proteína da família das lipocalinas, a proteína de ligação de bilina (BBP) de Pieris brassicae, foi usada para o desenvolvimento de anticalins por mutagênese do conjunto de quatro alças. Um exemplo de um pedido de patente que descreve "anticalins" é PCT WO199916873.
Proteínas de Afilina - Scil
[00152] Moléculas de Affilin™ são proteínas não-imunoglobulina pequenas que são projetadas para afinidades específicas contra proteínas e pequenas moléculas. Novas moléculas de Affilin ™ podem ser selecionadas muito rapidamente de duas bibliotecas, cada uma delas baseada em uma proteína de arcabouço de origem humana diferente.
[00153] As moléculas de Affilin™ não exibem qualquer homologia estrutural com as proteínas de imunoglobulina. As proteínas Scil empregam dois arcabouços de Affilin™, um dos quais é gama cristalino, uma proteína estrutural do cristalino do olho humano, e o outro é formado por proteínas da superfamília da "ubiquitina". Ambos os arcabouços humanos são muito pequenos, apresentam estabilidade à temperatura elevada e são quase resistentes às alterações de pH e aos agentes desnaturantes. Essa alta estabilidade é causada principalmente pela estrutura de lâmina beta expandida das proteínas. Exemplos de proteínas derivadas de gama cristalina são descritos em WO 200104144 e exemplos de proteínas "ubiquitina-like" são descritos em WO 2004106368.
Miméticos de epitopo de proteína (PEM)
[00154] PEM são moléculas peptídeo-like cíclicas, de tamanho médio (peso molecular de 1-2 kDa), que mimetizam estruturas secundárias beta-hairpin de proteínas, a principal estrutura secundária envolvida em interações proteína-proteína. Mais geralmente, qualquer polipeptídeo que mimetize a estrutura 3D do epitopo dos anticorpos revelados é parte da presente invenção. Modalidades preferidas são polipeptídeos de 30-100 aminoácidos que compreendem pelo menos os seguintes polipeptídeos E1-L-E2, em que E1 é a SEQ ID NO: 156 e E2 é a SEQ ID NO: 157 e L é um vinculador polipeptídico que permite que E1 e E2 reproduzam a estrutura 3D da região reconhecida pelos anticorpos da invenção. De acordo com uma modalidade preferida, L é um vinculador que consiste em 10-20 aminoácidos selecionados entre os aminoácidos glicina ou serina. De preferência, o vinculador L compreende o peptídeo GGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: X/SEQ ID NO: 158) ou GGGGSGGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: Y/SEQ ID NO: 159); mais preferivelmente, o vinculador L consisteessencialmente em SEQ ID NO: X ou SEQ ID NO: Y.
[00155] Esses polipeptídeos devem reter alta afinidade pelos anticorpos da invenção. Esses polipeptídeos também podem ser usados vantajosamente como imunógenos para despertar anticorpos contra esclerostina.
[00156] Esses polipeptídeos também podem ser usados como antagonista ou agonista de esclerostina e, portanto, possuem aplicações similares àquelas descritas para os anticorpos da presente invenção.
[00157] Polipeptídeos com uma ou mais substituições ou eliminações de aminoácidos, preferivelmente não de menos de 1, 2 ou 3 substituições ou eliminações de aminoácidos na sequência de E1 e/ou E2, também são parte da invenção. Esses polipeptídeos ainda podem ser criados geneticamente para aumentar a meia-vida ou aprimorar a solubilidade. Especialmente, construções de fusão desses polipeptídeos com proteínas séricas, por exemplo, fragmentos Fc de IgG ou albumina sérica humana, podem ser geradas para aumentar a meia-vida, similarmente ao Fc criado geneticamente descrito no parágrafo seguinte para fragmentos de moléculas de anticorpo da invenção.
Criação genética de framework ou Fc
[00158] Os anticorpos criados geneticamente da invenção incluem aqueles nos quais foram feitas modificações aos resíduos framework dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para aprimorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, essas modificações da framework são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem consiste em se "mutar de forma retrógrada" um ou mais resíduos framework para a sequência da linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que passou por mutação somática pode conter resíduos framework que diferem da sequência da linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Esses resíduos podem ser identificados por comparação das sequências framework do anticorpo com as sequências da linhagem germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências da região framework à sua configuração da linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser "mutadas de forma retrógrada" para a sequência da linhagem germinativa, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR. Esses anticorpos "mutados de forma retrógrada" também são englobados pela invenção.
[00159] Outro tipo de modificação framework envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região framework, ou até mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epitopos de célula T para, dessa forma, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem também é denominada "desimunização" e é descrita com mais detalhes na Publicação de Patente U.S. N° 20030153043 por Carr e cols.
[00160] Em adição ou como alternativa às modificações feitas dentro das regiões framework ou CDR, os anticorpos da invenção também podem ser projetados geneticamente para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo como, por exemplo, a meia- vida sérica, a fixação de complemento, ligação ao receptor Fc e/ou a citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser anexadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas modalidades será descrita em detalhes abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é aquela do índice EU de Kabat.
[00161] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modificada de tal forma que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é adicionalmente descrita na Patente U.S. N° 5.677.425 por Bodmer e cols. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.
[00162] Em outra modalidade, a região Fc de dobradiça de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região da interface do domínio CH2-CH3 do fragmento Fc-dobradiça, de tal forma que o anticorpo tenha a ligação à proteína A estafilocócica (SpA) deficiente em relação à ligação nativa de SpA ao domínio Fc-dobradiça. Essa abordagem é descrita com mais detalhes na Patente U.S. N° 6.165.745 por Ward e cols.
[00163] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado paraaumentar sua meia-vida biológica. São possíveis abordagens. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S. N° 6.277.375 para Ward. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epitopo de ligação ao receptor selvagem retirado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito nas Patentes U.S. Nos 5.869.046 e 6.121.022 por Presta e cols.
[00164] Ainda em outras modalidades, a região Fc é alterada por substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente, de tal forma que o anticorpo possua uma afinidade alterada por um ligante efetor, mas retenha a habilidade de ligação de antígeno do anticorpo parente. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Essa abordagem é descrita com mais detalhes nas Patentes U.S. Nos 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter e cols.
[00165] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente, de tal forma que o anticorpo possua ligação de C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento reduzida ou abolida (CDC). Essa abordagem é descrita com mais detalhes na Patente U.S. No 6.194.551 por Idusogie e cols.
[00166] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos são alterados para, dessa forma, alterar a habilidade do anticorpo para fixar complemento. Essa abordagem é adicionalmente descrita na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer e cols.
[00167] Ainda em outra modalidade, a região Fc é modificada para aumentar a habilidade do anticorpo para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor Fcy por modificação de um ou mais aminoácidos. Essa abordagem é adicionalmente descrita na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação em IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e foram descritas variantes com ligação aprimorada (veja Shields, R.L. e cols., 2001 J. Biol. Chem. 276: 6.591-6.604).
[00168] Ainda em outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, pode ser feito um anticorpo aglicosilado (ou seja, o anticorpo é desprovido de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, por aumento da afinidade do anticorpo pelo "antígeno". Essas modificações de carboidrato podem ser obtidas, por exemplo, por alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, pode ser feita uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação framework da região variável para, dessa forma, eliminar a glicosilação naquele sítio. Essa aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Uma abordagem desse tipo é descrita com mais detalhes nas Patentes U.S. Nos 5.714.350 e 6.350.861 por Co e cols.
[00169] Adicional ou alternativamente, pode ser feito um anticorpo que possui um tipo alterado de glicosilação, por exemplo, um anticorpo hipofucosilado que possui quantidades reduzidas de resíduos de fucosil ou um anticorpo que possui estruturas GlcNac bissectadas aumentadas. Foi demonstrado que esses padrões alterados de glicosilação aumentam a habilidade de ADCC de anticorpos. Essas modificações de carboidratos podem ser obtidas, por exemplo, por expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com maquinário de glicosilação alterado. Células com maquinário de glicosilação alterado foram descritas na técnica e podem ser usadas como as células hospedeiras nas quais se expressam os anticorpos recombinantes da invenção para, dessa forma, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1.176.195 por Hang e cols. descreve uma linhagem celular com um gene FUT8 funcionalmente rompido, que codifica uma fucosil transferase, de tal forma que os anticorpos expressos em uma linhagem celular desse tipo exibem hipofucosilação. A Publicação PCT WO 03/035835 para Presta descreve uma linhagem de células CHO variante, células Lecl3, com habilidade reduzida para anexar fucose aos carboidratos ligados por Asn(297), o que também resulta na hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (veja também Shields, R.L. e cols., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26.733-26.740). A Publicação PCT WO 99/54342 por Umana e cols. descreve linhagens celulares criadas geneticamente para expressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteínas (por exemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)), de tal forma que os anticorpos expressos nas linhagens celulares criadas geneticamente exibam estruturas GlcNac bissectadas aumentadas, o que resulta em atividade ADCC aumentada dos anticorpos (veja também Umana e cols., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180).
[00170] Outra modificação dos anticorpos que é contemplada pela invenção é a peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, para aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, sérica) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento deste, tipicamente é reagido com polietileno glicol (PEG), por exemplo, um éster reativo ou derivado aldeído de PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG se tornam anexados ao anticorpo ou ao fragmento de anticorpo. A peguilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero reativo hidrossolúvel análogo). Como aqui usado, o termo "polietileno glicol" visa englobar qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas como, por exemplo, mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para a peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Veja, por exemplo, EP 0.154.316 por Nishimura e cols. e EP 0.401.384 por Ishikawa e cols.
[00171] Outra modificação dos anticorpos que é contemplada pela invenção é um conjugado ou uma fusão de proteína pelo menos da região de ligação de antígeno do anticorpo da invenção à proteína sérica, por exemplo, albumina sérica humana ou um fragmento desta, para aumentar a meia-vida da molécula resultante. Uma abordagem desse tipo é descrita, por exemplo, em Ballance e cols. EP 0322094.
[00172] Outra possibilidade é uma fusão pelo menos da região de ligação de antígeno do anticorpo da invenção às proteínas capazes de ligação às proteínas séricas, por exemplo, albumina sérica humana, para aumentar a meia-vida da molécula resultante. Uma abordagem desse tipo é descrita, por exemplo, em Nygren e cols., EP 0.486.525.
Métodos para a criação genética de anticorpos alterados
[00173] Como discutido acima, os anticorpos anti-esclerostina que possuem sequências de VH e VL ou sequências da cadeia pesada e leve de comprimento total aqui mostrados podem ser usados para criar novos anticorpos anti-esclerostina por modificação de sequências da cadeia pesada e/ou cadeia leve de comprimento total, sequências de VH e/ou VL, ou a região constante (ou regiões constantes) a elas anexadas. Dessa forma, em outro aspecto da invenção, as características estruturais de um anticorpo anti-esclerostina da invenção são usadas para criar anticorpos anti-esclerostina estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, por exemplo, ligação à esclerostina humana, e que também inibem uma ou mais propriedades funcionais da esclerostina (por exemplo, ligação ao receptor, prevenção ou atenuação da osteólise).
[00174] Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos da presente invenção, ou mutações destas, podem ser combinadas recombinantemente com regiões framework e/ou outras CDRs conhecidas para criar anticorpos anti-esclerostina adicionais da invenção, criados recombinantemente, como discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção prévia. O material de partida para o método de criação genética é uma ou mais das sequências de VH e/ou VL aqui fornecidas, ou uma ou mais regiões CDR destas. Para criar o anticorpo produzido geneticamente, não é necessário realmente preparar (ou seja, expressar como uma proteína) um anticorpo que possua uma ou mais das sequências de VH e/ou VL aqui fornecidas, ou uma ou mais regiões CDR destas. Em vez disso, as informações contidas na(s) sequência(s) são usadas como o material de partida para criar uma(s) sequência(s) de "segunda geração" derivada da(s) sequência(s) original, e depois a(s) sequência(s) de "segunda geração" é preparada e expressa como uma proteína.
[00175] Consequentemente, em outra modalidade, a invenção fornece um método para a preparação de um anticorpo anti- esclerostina que consiste em: uma sequência de anticorpo da região variável da cadeia pesada que possui uma sequência de CDR1 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-11, uma sequência de CDR2 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12-22 e/ou uma sequência de CDR3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 23-33; e uma sequência de anticorpo da região variável da cadeia leve que possui uma sequência de CDR1 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 34-44, uma sequência de CDR2 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 45-55 e/ou uma sequência de CDR3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 56-66; alteração de pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo da região variável da cadeia pesada e/ou da sequência de anticorpo da região variável da cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e expressão da sequência de anticorpo alterada como uma proteína.
[00176] Consequentemente, em outra modalidade, a invenção fornece um método para a preparação de um anticorpo anti- esclerostina otimizado para expressão em uma célula de mamífero que consiste em: uma sequência de anticorpo de cadeia pesada de comprimento total que possui uma sequência selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 111-121; e uma sequência de anticorpo de cadeia leve de comprimento total que possui uma sequência selecionada do grupo de 122-132; alteração de pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de cadeia pesada de comprimento total e/ou da sequência de anticorpo de cadeia leve de comprimento total para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e expressão da sequência de anticorpo alterada como uma proteína.
[00177] A sequência de anticorpo alterada também pode ser preparada por avaliação de bibliotecas de anticorpos que possuem sequências da CDR3 fixas selecionadas entre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 23-33 ou determinantes de ligação essenciais mínimos como descrito em US20050255552 e diversidade em sequências da CDR1 e da CDR2. A avaliação pode ser realizada de acordo com qualquer tecnologia de avaliação adequada à avaliação de anticorpos de bibliotecas de anticorpos como, por exemplo, a tecnológica de apresentação em fago.
[00178] Técnicas padronizadas de biologia molecular podem ser usadas para a preparação e expressão da sequência de anticorpo alterada. O anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) é aquele que retém uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-esclerostina aqui descritos, cujas propriedades funcionais incluem, sem limitação, especificamente ligação à esclerostina humana; e o anticorpo exibe pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: o anticorpo bloqueia o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio celular de sinalização de Wnt, o anticorpo bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio celular de mineralização ou bloqueia o efeito inibidor de esclerostina em um ensaio de fosforilação de Smad1 ou o anticorpo inibe a ligação de esclerostina ao LRP-6 ou o anticorpo aumenta a formação e a massa e densidade ósseas.
[00179] O anticorpo alterado pode exibir uma ou mais, duas ou mais ou três ou mais das propriedades funcionais discutidas acima.
[00180] As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas com o uso de ensaios padronizados disponíveis na técnica e/ou aqui descritos, tais como aqueles apresentados nos exemplos (por exemplo, ELISAs).
[00181] Em certas modalidades dos métodos de criação genética de anticorpos da invenção, podem ser introduzidas mutações aleatoriamente ou seletivamente ao longo de todo ou parte de uma sequência codificadora do anticorpo anti-esclerostina, e os anticorpos anti-esclerostina modificados resultantes podem ser avaliados quanto à atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais, como aqui descrito. Foram descritos na técnica métodos mutacionais. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para a criação e avaliação de mutações de anticorpos usando mutagênese por saturação, montagem por ligação sintética, ou uma combinação destes. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 por Lazar e cols. descreve métodos de utilização de métodos computacionais de avaliação para otimizar as propriedades físico-químicas de anticorpos.
Moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos da invenção
[00182] Outro aspecto da invenção pertence às moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos da invenção. exemplos de sequências de nucleotídeos da cadeia leve de comprimento total parentais são mostrados nas SEQ ID NOs: 144-145. exemplos desequências de nucleotídeos da cadeia pesada de comprimento total parentais são mostrados nas SEQ ID NOs: 133-134. exemplos desequências de nucleotídeos da cadeia leve de comprimento total otimizadas para expressão em uma célula de mamífero são mostrados nas SEQ ID NOs: 146-154. exemplos de sequências de nucleotídeos da cadeia pesada de comprimento total otimizadas para expressão em uma célula de mamífero são mostrados nas SEQ ID NOs: 135-143.
[00183] Os ácidos nucléicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado de células, ou podem ser ácidos nucléicos em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucléico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos ou proteínas celulares, por técnicas padronizadas, incluindo tratamento alcalino/SDS, coligação com CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose, e outras bem conhecidas na técnica. Veja F. Ausubel, e cols., ed. 1987 "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova York. Um ácido nucléico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA, e pode ou não conter sequências intrônicas. Em uma modalidade, o ácido nucléico é uma molécula de cDNA. O ácido nucléico pode estar presente em um vetor como, por exemplo, um vetor de apresentação em fago, ou em um vetor de plasmídeo recombinante.
[00184] Os ácidos nucléicos da invenção podem ser obtidos com o uso de técnicas padronizadas de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados por camundongos transgênicos que carregam genes de imunoglobulina humana, como descrito adicionalmente abaixo), cDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo feitas pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação padronizada por PCR ou técnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, com o uso de técnicas de apresentação em fago), o ácido nucléico que codifica o anticorpo pode ser recuperado de vários clones de fago que são membros da biblioteca.
[00185] Após os fragmentos de DNA que codificam os segmentos de VH e VL serem obtidos, esses fragmentos de DNA podem ainda ser manipulados por técnicas padronizadas de DNA recombinante, por exemplo, para converter os genes da região variável nos genes da cadeia de anticorpo de comprimento total, nos genes do fragmento Fab ou em um gene de scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL- ou VH é ligado operativamente a outra molécula de DNA, ou a um fragmento que codifica outra proteína, por exemplo, uma região constante de anticorpo ou um vinculador flexível. O termo "ligado operativamente", como usado nesse contexto, significa que os dois fragmentos de DNA estão unidos de uma forma funcional, por exemplo, de tal forma que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam in-frame, ou de tal forma que a proteína seja expressa sob controle de um promotor desejado.
[00186] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligando-se operativamente o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes da região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., e cols., 1991 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, "U.S. Department of Health and Human Services", Publicação NIH N° 91-3242) e fragmentos de DNA que englobam essas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padronizada. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. De preferência, a região constante de cadeia pesada é selecionada entre isótipos de IgG2. Para um gene da cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser ligado operativamente a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante da cadeia pesada CH1.
[00187] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como em um gene da cadeia leve Fab) ligando-se operativamente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes da região constante de cadeia leve humana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., e cols., 1991 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, "U.S. Department of Health and Human Services", Publicação NIH N° 91-3242) e fragmentos de DNA que englobam essas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padronizada. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.
[00188] Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA quecodificam VH- e VL são ligados operativamente a outro fragmento que codifica um vinculador flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de tal forma que as sequências de VH e VL possam ser expressas como uma proteína contigua de cadeia única, com as regiões VL e VH unidas pelo vinculador flexível (veja, por exemplo, Bird e cols., 1988 Science 242: 423-426; Huston e cols., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5.879-5.883; McCafferty e cols., 1990 Nature 348: 552-554).
Geração de anticorpos monoclonais da invenção
[00189] Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, a técnica padronizada de hibridização de célula somática de Kohler e Milstein, 1975 Nature 256: 495. Podem ser empregadas muitas técnicas para a produção de anticorpo monoclonal, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.
[00190] Um sistema animal para a preparação de hibridomas é o sistema murídeo. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Protocolos e técnicas de imunização para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Também são conhecidos parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murídeo) e procedimentos de fusão.
[00191] Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murídeo preparado como descrito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido do hibridoma murídeo de interesse e criado geneticamente para conter sequências de imunoglobulina não murídea (por exemplo, humana) com o uso de técnicas padronizadas de biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murídeas podem ser ligadas às regiões constantes humanas com o uso de métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.816.567 para Cabilly e cols.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murídeas podem ser inseridas em uma framework humana com o uso de métodos conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.225.539 para Winter, e as Patentes U.S. Nos 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 e 6.180.370 para Queen e cols.
[00192] Em certa modalidade, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Esses anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra esclerostina podem ser gerados com o uso de camundongos transgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imunológico humano, em vez do sistema de camundongo. Esses camundongos transgênicos etranscromossômicos incluem camundongos aqui denominados camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são aqui denominados coletivamente como "camundongos de Ig humana".
[00193] O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém miniloci de gene de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e Y) e cadeia leve K humanas não rearranjadas, junto com mutações visadas que inativam os loci endógenos da cadeia μ e k (veja, por exemplo, Lonberg, e cols., 1994 Nature 368 (6474): 856-859). Consequentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou k de camundongo e, em resposta à imunização, os transgenes da cadeia pesada e leve humana introduzidos passam por mudança de classe e mutação somática para gerar anticorpo monoclonal IgGk humano de alta afinidade (Lonberg, N. e cols., 1994 supra; revisado em Lonberg, N., 1994 "Handbook of Experimental Pharmacology", 113: 49-101;Lonberg, N. e Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 e Harding, F. e Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546). A preparação e o uso de camundongos HuMAb, e as modificações genômicas realizadas por esses camundongos, são ainda descritos em Taylor, L. e cols., 1992 Nucleic Acids Research 20: 6.287-6.295; Chen, J. e cols., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon e cols., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3.720-3.724; Choi e cols., 1993 Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. e cols., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon e cols., 1994 J. Immunol. 152: 2.912-2.920; Taylor, L. e cols., 1994 International Immunology 579-591; e Fishwild, D. e cols., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, cujos conteúdos são aqui especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Veja ainda as Patentes U.S. Nos 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.789.650, 5.877.397, 5.661.016, 5.814.318, 5.874.299 e 5.770.429, todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. N° 5.545.807 para Surani e cols.; Publicações PCT Nos WO 92/103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT N° WO 01/14424 para Korman e cols.
[00194] Em outra modalidade, os anticorpos humanos da invenção podem ser despertados com o uso de um camundongo que carrega sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomos como, por exemplo, um camundongo que carrega um transgene da cadeia pesada humana e um transcromossomo da cadeia leve humana. Esses camundongos, aqui denominados "camundongos KM", são descritos em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478 para Ishida e cols.
[00195] Além disso, sistemas alternativos de animais transgênicos que expressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para despertar os anticorpos anti- esclerostina da invenção. Por exemplo, pode ser usado um sistema transgênico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.). Esses camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.939.598, 6.075.181, 6.114.598, 6. 150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati e cols.
[00196] Além disso, sistemas alternativos de animais transcromossômicos que expressam genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para despertar os anticorpos anti-esclerostina da invenção. Por exemplo, camundongos que carregam tanto um transcromossomo da cadeia pesada humana quanto um transcromossomo da cadeia leve humana, denominados "camundongos TC", podem ser usados; esses camundongos são descritos em Tomizuka e cols., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727. Além disso, foram descritas na técnica vacas que carregam transcromossomos da cadeia pesada humana e leve (Kuroiwa e cols., 2002 Nature Biotechnology 20: 889-894), e podem ser usadas para despertar os anticorpos anti-esclerostina da invenção.
[00197] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados com o uso de métodos de apresentação em fago para avaliar bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Esses métodos de apresentação em fago para o isolamento de anticorpos humanos estão estabelecidos na técnica ou descritos nos exemplos abaixo. Veja, por exemplo: Patentes U.S. Nos 5.223.409, 5.403.484 e 5.571.698 para Ladner e cols.; Patentes U.S. Nos5.427.908 e 5.580.717 para Dower e cols.; Patentes U.S. Nos5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty e cols.; e Patentes U.S. Nos 5.885.793, 6.521.404, 6.544.731, 6.555.313, 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths e cols.
[00198] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados com o uso de camundongos SCID nos quais células imunológicas humanas foram reconstituídas, de tal forma que uma resposta de anticorpo humano possa ser gerada mediante imunização. Esses camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson e cols.
Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos
[00199] Para a geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos da invenção, esplenócitos e/ou células de linfonodos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linhagem de célula imortalizada apropriada, por exemplo, uma linhagem de células de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser avaliados quanto à produção de anticorpos antígeno-específicos. Por exemplo, suspensões de células únicas de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas a um sexto do número de células não secretoras de mieloma de camundongo P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com PEG 50%. As células são plaqueadas a aproximadamente 2 x 145 em placas de microtitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo Soro de Clone fetal 20%, meios condicionados "653" 18%, origen 5% (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e 1X HAT (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a fusão). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio no qual o HAT é substituído com HT. Os poços individuais podem então ser avaliados por ELISA quanto aos anticorpos monoclonais humanos IgM e IgG. Após a ocorrência de crescimento intenso do hibridoma, pode ser observado meio normalmente após 10-14 dias. Os hibridomas que secretam anticorpo podem ser substituídos, avaliados novamente, e, se ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes por limitação da diluição. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.
[00200] Para purificar os anticorpos monoclonais humanos, hibridomas selecionados podem ser desenvolvidos em frascos giratórios de dois litros para purificação do anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia por afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto rendimento para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 usando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotas e armazenados a -80°C.
Geração de transfectomas que produzem anticorpos monoclonais
[00201] Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção gênica, como é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1.202).
[00202] Por exemplo, para a expressão dos anticorpos, ou fragmentos de anticorpo destes, DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento total podem ser obtidos por técnicas padronizadas de biologia molecular (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão, de tal forma que os genes sejam ligados operativamente às sequências de controle da transcrição e tradução. Nesse contexto, o termo "ligados operativamente" significa que um gene de anticorpo está ligado em um vetor de tal forma que as sequências de controle da transcrição e tradução dentro do vetor desempenhem sua função desejada de regulação da transcrição e tradução do gene do anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle da expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em um vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodos padronizados (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento e vetor do gene de anticorpo, ou ligação da extremidade romba, caso não esteja presente nenhum sítio de restrição). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isótipo de anticorpo inserindo-as em vetores de expressão que já codificam regiões constantes da cadeia pesada e regiões constantes da cadeia leve do isótipo desejado, de tal forma que o segmento de VH esteja ligado operativamente ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento de VL esteja ligado operativamente ao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinalizador que facilita a secreção da cadeia do anticorpo por uma célula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vetor de tal forma que o peptídeo sinalizador esteja ligado in frame ao terminal amino do gene da cadeia do anticorpo. O peptídeo sinalizador pode ser um peptídeo sinalizador de imunoglobulina ou um peptídeo sinalizador heterólogo (ou seja, um peptídeo sinalizador de uma proteína não imunoglobulina).
[00203] Além dos genes da cadeia do anticorpo, os vetores de expressão recombinante da invenção carregam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência reguladora" visa incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia do anticorpo. Essas sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel ("Gene Expression Technology. Methods in Enzymology" 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Será observado por aqueles habilitados na técnica que o design do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores como, por exemplo, a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado etc. Sequências reguladoras para expressão em células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que dirigem altos níveis de expressão de proteína em células de mamíferos, por exemplo, promotores e/ou intensificadores derivados do citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40),adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, podem ser usadas sequências reguladoras não virais como, por exemplo, o promotor de ubiquitina ou o promotor de P-globina. Além disso, podem ser usados elementos reguladores compostos por sequências de diferentes fontes, por exemplo, o sistema promotor SRa, que contém sequências do promotor precoce de SV40 e a repetição terminal longa do vírus da leucemia de célula T humana tipo 1 (Takebe, Y. e cols., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 466-472).
[00204] Além dos genes da cadeia do anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinante da invenção podem carregar sequências adicionais, por exemplo, sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes de marcador selecionável. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel e cols.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, por exemplo, G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis incluem o gene de diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para seleção com G418).
[00205] Para expressão das cadeias leves e pesadas, o vetor de expressão (ou vetores de expressão) que codifica as cadeias pesadas e leves é transfectado em uma célula hospedeira por técnicas padronizadas. As várias formas do termo "transfecção" visam englobar uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com cálcio- fosfato, transfecção com DEAE-dextrana, e semelhantes. Teoricamente é possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. A expressão de anticorpos em células eucarióticas, em particular células hospedeiras de mamíferos, é discutida porque essas células eucarióticas e, em particular, células de mamíferos, têm maior probabilidade do que as células procarióticas para montar e secretar um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo. Foi relatado que genes procarióticos de expressão de anticorpo são ineficazes para a produção de rendimentos elevados de anticorpo ativo (Boss, M. A. e Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6: 12-13).
[00206] Células hospedeiras de mamíferos para a expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem células de ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas por Urlaub e Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4.216-4.220, usadas com um marcador selecionável de DH FR, por exemplo, como descrito em R.J. Kaufman e P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159: 601-621, células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para uso com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão é o sistema de expressão gênica GS mostrado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338,841. Quando vetores de expressão recombinante que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos por cultivo das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura com o uso de métodos padronizados de purificação de proteína.
Moléculas biespecíficas
[00207] Em outro aspecto, a presente invenção apresenta moléculas biespecíficas ou multiespecíficas que compreendem um anticorpo anti-esclerostina, ou um fragmento deste, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou regiões de ligação de antígeno deste, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas-alvo diferentes. O anticorpo da invenção pode, na verdade, ser derivatizado ou ligado a mais de uma molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação e/ou moléculas-alvo diferentes; essas moléculas multiespecíficas também são englobadas pelo termo "molécula biespecífica", como aqui usado. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser ligado funcionalmente (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de algum outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação como, por exemplo, outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de tal forma que resulte uma molécula biespecífica.
[00208] Consequentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem pelo menos uma primeiraespecificidade de ligação para esclerostina e uma segundaespecificidade de ligação para um segundo epitopo-alvo. Por exemplo, o segundo epitopo-alvo é outro epitopo de esclerostina diferente do primeiro epitopo-alvo. Outro exemplo é uma molécula biespecífica que compreende pelo menos uma primeira especificidade de ligação para esclerostina e uma segunda especificidade de ligação para um epitopo dentro de Dkk-1. Outro exemplo é uma molécula biespecífica que compreende pelo menos uma primeira especificidade de ligação para esclerostina e uma segunda especificidade de ligação para um epitopo dentro de LRP4.
[00209] Adicionalmente, para uma invenção na qual a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além do primeiro e segundo epitopos-alvo.
[00210] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo deste, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv ou um Fv de cadeia única. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo deste como, por exemplo, um Fv ou uma construção de cadeia única, como descrito em Ladner e cols. na Patente U.S. N° 4.946.778, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência.
[00211] Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murídeos, quiméricos e humanizados.
[00212] As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas por conjugação das especificidades de ligação constituintes, com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugada entre elas. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, diversos agentes de acoplamento ou de entrecruzamento podem ser usados para conjugação covalente. Exemplos de agentes de entrecruzamento incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S- acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o- fenilnodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e sulfossuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1- carboxilato (sulfo-SMCC) (veja, por exemplo, Karpovsky e cols., 1984 J. Exp. Med. 160: 1.686; Liu, M.A. e cols., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8.648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. N° 78, 118-132; Brennan e cols., 1985 Science 229: 81-83, e Glennie e cols., 1987 J. Immunol. 139: 2.367-2.375.Agentes de conjugação São SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis por Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[00213] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados por pontes de sulfidrila das regiões de dobradiça do C-terminal das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particularmente preferida, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, por exemplo, um, antes da conjugação.
[00214] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única que compreende um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única que compreende dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para a preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 5.260.203, Patente U.S. N° 5.455.030, Patente U.S. N° 4.881.175, Patente U.S. N° 5.132.405, Patente U.S. N° 5.091.513, Patente U.S. N° 5.476.786, Patente U.S. N° 5.013.653, Patente U.S. N° 5.258.498 e Patente U.S. N° 5.482.858.
[00215] A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos proteína-anticorpo de interesse particular pelo emprego de um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.
Anticorpos multivalentes
[00216] Em outro aspecto, a presente invenção fornece compostos multivalentes que compreendem pelo menos duas porções de ligação de antígeno idênticas ou diferentes dos anticorpos da invenção de ligação à esclerostina. De preferência, considerando a natureza trimérica da esclerostina, os compostos da invenção fornecem pelo menos três ou quatro porções de ligação de antígeno dos anticorpos. As porções de ligação de antígeno podem ser ligadas em conjunto por meio de fusão de proteína ou ligação covalente ou não covalente. Alternativamente, foram descritos métodos de ligação para as moléculas biespecíficas. Compostos tetravalentes podem ser obtidos, por exemplo, por entrecruzamento dos anticorpos da invenção com um anticorpo que se liga às regiões constantes dos anticorpos da invenção, por exemplo, a região Fc ou de dobradiça.
[00217] Domínios de trimerização são descritos, por exemplo, em Borean patent EP 1.012.280 B1. Módulos de pentamerização são descritos, por exemplo, em PCT/EP97/05897.
Composições farmacêuticas
[00218] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, que contém um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou região (ou regiões) de ligação de antígeno destes, da presente invenção, formulados juntos com um veículo farmaceuticamente aceitável. Essas composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos que se ligam a epitopos diferentes no antígeno-alvo ou que possuem atividades complementares.
[00219] As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia combinada, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir um anticorpo anti-esclerostina da presente invenção combinado com pelo menos outro agente antiinflamatório ou antiosteoporótico. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia combinada são descritos com mais detalhes abaixo na seção sobre os usos dos anticorpos da invenção. As composições são formuladas preferivelmente em pH fisiológico.
[00220] Como aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, e semelhantes, que são fisiologicamente compatíveis. O veículo deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, ou seja, anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.
[00221] Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parente e não transmite quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (veja, por exemplo, Berge, S.M., e cols., 1977 J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Exemplos desses sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos atóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiódico, de fósforo, e semelhantes, além de ácidos orgânicos atóxicos como, por exemplo, ácidos mono- e di-carboxílicos alifáticos, ácidos alcanóico fenil-substituídos, ácidos hidróxi alcanóico, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos, e semelhantes. Sais de adição básica incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sais de sódio, potássio, magnésio, cálcio, e semelhantes, bem como aminas orgânicas atóxicas, tais como N,N'- dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína, e semelhantes.
[00222] Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes hidrossolúveis, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio, e semelhantes; antioxidantes lipossolúveis, tais como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol, e semelhantes; e agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.
[00223] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (como, por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), e misturas adequadas destes, óleos vegetais como, por exemplo, azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis como, por exemplo, etil oleato. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento como, por exemplo, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário, no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.
[00224] Essas composições também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umidificantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, supra, e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e semelhantes. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser produzida pela inclusão de agentes que retardam a absorção como, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00225] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto quando quaisquer meios ou agentes são incompatíveis com o composto ativo, o uso destes nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[00226] As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo ou outra estrutura ordenada adequada à alta concentração de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como, por exemplo, lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário, no caso de dispersão, e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, pode-se incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis como, por exemplo, manitol, sorbitol ou cloreto de sódio, na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser produzida pela inclusão, na composição, de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00227] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade necessária em um solvente adequado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguida por esterilização por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que geram um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução deste previamente esterilizada por filtração.
[00228] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de transporte para produzir uma forma de dosagem única irá variar, dependendo do indivíduo tratado e do modo de administração em particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de transporte para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, em um total de cem por cento, essa quantidade irá variar de cerca de 0,01 por cento até cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de cerca de 0,1 por cento até cerca de 70 por cento, ou de cerca de 1 por cento até cerca de 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00229] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzida ou aumentada proporcionalmente, como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformizar a dosagem. O termo "forma de dosagem unitária", como aqui usado, refere-se às unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. As especificações para as formas de dosagem unitária da invenção são ditadas e dependem diretamente das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido, e das limitações inerentes à técnica de produção de um composto ativo desse tipo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
[00230] Para a administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e, mais normalmente, 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar consiste na administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a seis meses. Os regimes de dosagem para um anticorpo anti-esclerostina da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por administração intravenosa, com o anticorpo sendo dado usando uma das seguintes posologias de dosagem: a cada quatro semanas por seis dosagens, depois a cada três meses; a cada três semanas; 3 mg/kg de peso corporal uma vez, seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
[00231] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultânea ou sequencialmente, quando então a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro das faixas indicadas. O anticorpo normalmente é administrado em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanais, mensais, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares, como indicado pela medida dos níveis sanguíneos de anticorpo para o antígeno-alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para se obter uma concentração plasmática de anticorpo de cerca de 1-1.000 μg/ml e, em alguns métodos, cerca de 25-300 μg/ml.
[00232] Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, quando então é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência podem variar, dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguida por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar, dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes ao longo de um período de tempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente elevada em intervalos relativamente curtos às vezes é necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada ou até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. A seguir, o paciente pode entrar em um regime profilático.
[00233] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados a fim de se obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para se obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração em particular, sem que sejam tóxicos para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de diversos fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições da presente invenção específicas empregadas, ou do éster, sal ou amida destas, a via de administração, o momento da administração, a taxa de excreção do composto específico empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e a história médica prévia do paciente tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos na área médica.
[00234] Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-esclerostina da invenção pode resultar em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou uma prevenção de déficit ou incapacitação em decorrência da doença.
[00235] Uma composição da presente invenção pode ser administrada por uma ou mais vias de administração com o uso de um ou mais entre vários métodos conhecidos na técnica. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a via e/ou o modo de administração irão variar, dependendo dos resultados desejados. As vias de administração para os anticorpos da invenção incluem a via intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parenteral", como aqui usada, significa outros modos de administração além da administração enteral e tópica, normalmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinhal, epidural e intra-esternal.
[00236] Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado por uma via não parenteral, por exemplo, pela via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
[00237] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra a liberação rápida, por exemplo, uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microencapsulada. Podem ser usados polímeros biocompatíveis e biodegradáveis, por exemplo, etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação dessas formulações estão patenteados ou geralmente conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Veja, por exemplo, "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1978.
[00238] As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição terapêutica da invenção pode seradministrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, por exemplo, os dispositivos mostrados nas Patentes U.S. Nos5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 ou 4.596.556. exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. N° 4.487.603, que mostra uma bomba de micro-infusão implantável para a dispensa de medicação em uma taxa controlada; Patente U.S. N° 4.486.194, que mostra um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. N° 4.447.233, que mostra uma bomba de infusão de medicação para a liberação de medicação em uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. N° 4.447.224, que mostra um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para liberação contínua de fármacos; Patente U.S. N° 4.439.196, que mostra um sistema de liberação osmótica de fármacos que possui compartimentos multicamerados; e Patente U.S. N° 4.475.196, que mostra um sistema de liberação osmótica de fármacos. Essas patentes são aqui incorporadas por referência. Muitos outros implantes, sistemas de liberação e módulos desse tipo são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[00239] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonaishumanos da invenção podem ser formulados para assegurar a distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreirahematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomos. Para métodos de fabricação de lipossomos, veja, por exemplo, Patentes U.S. 4.522.811, 5.374.548 e 5.399.331. Os lipossomos podem compreender uma ou mais porções que são transportadas seletivamente para células ou órgãos específicos, aumentando, dessa forma, a liberação direcionada do fármaco (veja, por exemplo, V.V. Ranade, 1989 J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Porções de direcionamento exemplares incluem folato ou biotina (veja, por exemplo, Patente U.S. 5.416.016 para Low e cols.); manosídeos (Umezawa e cols., 1988 Biochem. Biophys. Res.Commun. 153: 1.038); anticorpos (P.G. Bloeman e cols., 1995 FEBS Lett. 357: 140; M. Owais e cols., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39: 180); receptor de proteína A tensoativo (Briscoe e cols., 1995 Am. J. Physiol. 1.233: 134); p120 (Schreier e cols., 1994 J. Biol. Chem. 269: 9.090); veja também K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4: 273.
Usos e métodos da invenção
[00240] Os anticorpos da presente invenção possuem utilidades diagnósticas e terapêuticas in vitro e in vivo. Por exemplo, essas moléculas podem ser administradas à células em cultura, por exemplo, in vitro ou in vivo, ou em um indivíduo, por exemplo, in vivo, para tratar, evitar ou diagnosticar diversos distúrbios. O termo "indivíduo", como aqui usado, visa incluir animais humanos e não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, por exemplo, primatas não humanos, carneiro, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e repteis.
[00241] Os métodos são particularmente adequados para o tratamento, prevenção ou diagnóstico de distúrbios relacionados à esclerostina e/ou distúrbios de densidade mineral óssea aberrante, por exemplo, osteoporose.
[00242] A invenção também fornece métodos para o aumento do teor mineral e/ou densidade mineral dos ossos. As composições da presente invenção também podem ser úteis para a melhora do resultado final em procedimentos ortopédicos, procedimentos dentais, cirurgia de implante, substituição articular, enxerto ósseo, cirurgia óssea cosmética e reparo ósseo como, por exemplo, consolidação de fraturas, cicatrização de não união, cicatrização de união retardada e reconstrução facial. Uma ou mais composições podem ser administradas antes, durante e/ou depois do procedimento, substituição, enxerto, cirurgia ou reparo.
[00243] Como aqui usado, o termo "distúrbio relacionado à esclerostina" inclui distúrbios nos quais a densidade mineral óssea (BMD) está anormalmente e/ou patologicamente baixa em relação aos indivíduos saudáveis. Distúrbios caracterizados por BMD baixa e/ou fragilidade óssea incluem, sem limitação, osteoporose primária e secundária, osteopenia, osteomalácia, osteogênese imperfeita (osteogenesis imperfecta - OI), necrose avascular (osteonecrose), fraturas e cicatrização de implantes (implantes dentais e implantes de quadril), perda óssea em decorrência de outros distúrbios (por exemplo, associada à infecção por HIV, cânceres ou artrite). Outros "distúrbios relacionados à esclerostina" incluem, sem limitação, artrite reumatóide, osteoartrite, artrite e a formação e/ou presença de lesões osteolíticas.
[00244] Como aqui usado, o termo "distúrbio relacionado à esclerostina" inclui condições associadas ou caracterizadas por níveis aberrantes de esclerostina. Essas incluem cânceres e condições osteoporóticas (por exemplo, osteoporose ou osteopenia), algumas das quais superpostas com os "distúrbios relacionados à esclerostina", como aqui definidos. O termo "cânceres relacionados à esclerostina" pode incluir mieloma (por exemplo, mieloma múltiplo com lesões osteolíticas), câncer de mama, câncer de cólon, melanoma, câncer hepatocelular, câncer epitelial, câncer esofagiano, câncer cerebral, câncer de pulmão, câncer de próstata ou câncer pancreático, bem como quaisquer metástases destes.
[00245] O termo "distúrbio relacionado à esclerostina" também pode incluir condições renais e cardiovasculares, causadas, pelo menos em parte, pela expressão de esclerostina no rim e no sistema cardiovascular. Os referidos distúrbios incluem, sem limitação, distúrbios renais como, por exemplo, doenças glomerulares (por exemplo, glomerulonefrite aguda e crônica, glomerulonefrite rapidamente progressiva, síndrome nefrótica, glomerulonefrite focal proliferativa, lesões glomerulares associadas a doenças sistêmicas como, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Goodpasture, mieloma múltipla, diabetes, doença renal policística, neoplasia, doença falciforme e doenças inflamatórias crônicas), doenças tubulares (por exemplo, necrose tubular aguda e insuficiência renal aguda, doença renal policística, rim com esponja medular, doença cística medular, diabetes nefrogênico e acidose renal tubular), doenças túbulo-intersticiais (por exemplo, pielonefrite, nefrite túbulo- intersticial induzida por fármacos e toxinas, nefropatia hipercalcêmica e nefropatia hipocalêmica), insuficiência renal aguda e rapidamente progressiva, insuficiência renal crônica, nefrolitíase, gota, doenças vasculares (por exemplo, hipertensão e nefroesclerose, anemia hemolítica microangiopática, doença renal ateroembólica, necrose cortical difusa e infartos renais) ou tumores (por exemplo, carcinoma de célula renal e nefroblastoma).
[00246] Os referidos distúrbios também incluem, sem limitação, distúrbios cardiovasculares como, por exemplo, doença cardíaca isquêmica (por exemplo, angina pectoris, infarto do miocárdio e doença cardíaca isquêmica crônica), doença cardíaca hipertensiva, doença cardíaca isquêmica pulmonar, doença cardíaca isquêmica valvular (por exemplo, febre reumática e doença cardíaca reumática, endocardite, prolapso da valva mitral e estenose da valva aórtica), doença cardíaca congênita (por exemplo, lesões obstrutivas valvulares e vasculares, defeito septal atrial ou ventricular e ductus arteriosus patente) ou doença miocárdica (por exemplo, miocardite, cardiomiopatia congestiva e cardiomiopatia hipertrófica).
[00247] Quando os anticorpos para esclerostina são administrados junto com outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem (ou seja, sequencialmente) ou simultaneamente.
[00248] De acordo com uma modalidade adicional da invenção, os anticorpos da invenção podem ser empregados como adjunto ou adjuvante para outra terapia, por exemplo, uma terapia que utiliza um inibidor da reabsorção óssea, por exemplo, como uma terapia para osteoporose, em particular uma terapia que emprega cálcio, uma calcitonina ou um análogo ou derivado desta, por exemplo, calcitonina de salmão, enguia ou humana, calcilíticos, calcimiméticos (por exemplo, cinacalcet), um hormônio esteróide, por exemplo, um estrogênio, um agonista parcial de estrogênio ou combinação estrogênio-progestágeno, um SERM (Modulador Seletivo do Receptor de Estrogênio), por exemplo, raloxifeno, lasofoxifeno, bazedoxifeno, arzoxifeno, FC1271, Tibolone (Livial ®), um SARM (Modulador Seletivo do Receptor de Androgênio), um anticorpo RANKL (por exemplo, denosumab), um inibidor de catepsina K, vitamina D ou um análogo desta ou PTH, um fragmento de PTH ou um derivado de PTH, por exemplo, PTH (1-84) (por exemplo, PreosTM), PTH (1-34) (por exemplo, ForteoTM), PTH (1-36), PTH (1-38), PTH (1-31)NH2 ou PTS 893. De acordo com outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser empregados em combinação com outras abordagens terapêuticas atuais para a osteoporose, incluindo bisfosfonatos (por exemplo, FosamaxTM (alendronato), ActonelTM (risedronato sódico), BonvivaTM (ácido ibandrônico), ZometaTM (ácido zoledrônico), AclastaTM/ReclastTM (ácido zoledrônico), olpadronato, neridronato, skelid, bonefos), estatinas, esteróides anabólicos, sais de lantânio e estrôncio, e fluoreto de sódio.
[00249] Em uma modalidade específica, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um agente modulador de LRP4, ou seja, um agente que modula a expressão ou atividade de LRP4, por exemplo, um anticorpo neutralizante de LRP4.
[00250] Em outra modalidade específica, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um agente modulador de DKK1, ou seja, um agente que interfere ou neutraliza o antagonismo da sinalização Wnt mediado por Dkk-1, por exemplo, um anticorpo neutralizante de DKK1.
[00251] Dessa forma, a invenção também fornece o uso de um anticorpo ou uma proteína funcional da invenção e (i) ácido zoledrônico, (ii) um anticorpo anti-DKK1, (iii) alendronato, (iv) um anticorpo anti-LRP4, (v) hPTH e/ou (vi) agentes de liberação de hormônio da paratireóide (calcilíticos), na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio patológico que é mediado por esclerostina ou que está associado a um nível aumentado de esclerostina.
[00252] Em outra modalidade, a invenção fornece o uso de um anticorpo ou uma proteína funcional da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio patológico que é mediado por esclerostina ou que está associado a um nível aumentado de esclerostina, em que o medicamento é usado em conjunto com (i) ácido zoledrônico, (ii) um anticorpo anti-DKK1, (iii) alendronato, (iv) um anticorpo anti-LRP4, (v) hPTH e/ou (vi) agentes de liberação de hormônio da paratireóide (calcilíticos).
[00253] Em outra modalidade, a invenção fornece o uso de (i) ácido zoledrônico, (ii) um anticorpo anti-DKK1, (iii) alendronato, (iv) um anticorpo anti-LRP4, (v) hPTH e/ou (vi) agentes de liberação de hormônio da paratireóide (calcilíticos), na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio patológico que é mediado por esclerostina ou que está associado a um nível aumentado de esclerostina, em que o medicamento é usado em conjunto com um anticorpo ou uma proteína funcional da invenção.
[00254] Em outra modalidade, a invenção fornece o uso de um anticorpo ou uma proteína funcional da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio patológico que é mediado por esclerostina ou que está associado a um nível aumentado de esclerostina, em que o paciente recebeu uma administração prévia de (i) ácido zoledrônico, (ii) um anticorpo anti- DKK1, (iii) alendronato, (iv) um anticorpo anti-LRP4, (v) hPTH e/ou (vi) agentes de liberação de hormônio da paratireóide (calcilíticos).
[00255] Em outra modalidade, a invenção fornece o uso de (i) ácido zoledrônico, (ii) um anticorpo anti-DKK1, (iii) alendronato, (iv) um anticorpo anti-LRP4, (v) hPTH e/ou (vi) agentes de liberação de hormônio da paratireóide (calcilíticos), na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio patológico que é mediado por esclerostina ou que está associado a um nível aumentado de esclerostina, em que o paciente recebeu uma administração prévia de um anticorpo ou de uma proteína funcional da invenção.
[00256] Em uma modalidade das combinações citadas acima, o hPTH é hPTH(1-34).
[00257] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar níveis de esclerostina, ou níveis de células que contêm esclerostina. Isso pode ser obtido, por exemplo, por contato de uma amostra (por exemplo, uma amostra in vitro) e uma amostra de controle com o anticorpo anti-esclerostina sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e esclerostina. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e esclerostina são detectados e comparados na amostra e no controle. Por exemplo, métodos de detecção padronizados, bem conhecidos na técnica, por exemplo, ELISA e ensaios de citometria de fluxo, podem ser realizados com o uso das composições da invenção.
[00258] Consequentemente, em um aspecto, a invenção ainda fornece métodos para detecção da presença de esclerostina (por exemplo, antígeno de esclerostina humana) em uma amostra, ou para a medida da quantidade de esclerostina, que compreende o contato da amostra, e de uma amostra de controle, com um anticorpo da invenção, ou uma região de ligação de antígeno deste, que se liga especificamente à esclerostina, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção deste e esclerostina. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença na formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativa da presença de esclerostina na amostra.
[00259] Também estão incluídos no escopo da invenção kits que consistem nas composições (por exemplo, anticorpos, anticorpos humanos e moléculas biespecíficas) da invenção e instruções para uso. O kit pode ainda conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo que possui uma atividade complementar que se liga a um epitopo no antígeno-alvo distinto do primeiro anticorpo). Por exemplo, esses kits podem compreender um anticorpo ou uma proteína funcional da invenção e um ou mais de (i) ácido zoledrônico, (ii) um anticorpo anti- DKK1, (iii) alendronato, (iv) um anticorpo anti-LRP4, (v) hPTH e (vi) agentes de liberação de hormônio da paratireóide (calcilíticos). Os kits tipicamente incluem um rótulo que indica o uso destinado do conteúdo do kit. O termo "rótulo" inclui qualquer material impresso, ou material registrado fornecido com o kit, ou que de algum outro modo acompanha o kit.
[00260] Após a invenção ter sido totalmente descrita, ela ainda será ilustrada pelos exemplos e reivindicações seguintes, que são ilustrativos e não têm a intenção de serem limitantes. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão ou serão capazes de verificar, usando no máximo experimentação de rotina, numerosos equivalentes para os procedimentos específicos aqui descritos. Esses equivalentes estão incluídos no escopo da presente invenção e nas reivindicações. O conteúdo de todas as referências citadas ao longo de todo este pedido, incluindo patentes concedidas e Pedidos de Patente publicados, é aqui incorporado por referência.
EXEMPLOS ENSAIOS FUNCIONAIS ENSAIO DE FOSFATASE ALCALINA (ALP) Células
[00261] As células MC3T3 1b são um clone de células MC3T3-JP que expressam OSE2-luc. Esse clone foi obtido após transfecção estável de MC3T3-JP (osteoblasto de camundongo MC3T3-E1, clone do Japão, Jp; uma gentileza do Dr. T. Kokkubo, Novartis, Japão) usando 8x-OSE2wt-mOG2luca em pcDNA3.1+.
Meio de cultura
[00262] As células MC3T3-1b foram cultivadas rotineiramente em meio essencial mínimo alfa (MEMα; Invitrogen, N° de Catálogo: 22561021) suplementado com soro fetal de bezerro 10% (FCS; N° de Catálogo Amimed: 2-01F100-I), 2 mM de L-glutamina (N° de Catálogo Gibco: 25030-024), 50 UI de penicilina/50 μg/mL de estreptomicina (N° de Catálogo Amimed: 4-01F00-H) e 10 mM de Hepes (N° de Catálogo Gibco: 15630-056) e 0,75 mg/ml de G418 (N° de Catálogo Gibco: 10131-027) (meio de manutenção de cultura).
Soluções de estoque
[00263] Dez mM de ácido ascórbico (N° de Catálogo Wako Pure Chemical: 013-12061) em DMEM-LG, 14 nM de BMP-2 (N° de Catálogo R&D: 355-BM-010) em 5 mM de ácido acético e albumina sérica bovina 0,1% (BSA, N° de Catálogo Sigma: A-8806); 1 M de β- glicerofosfato (N° de Catálogo Sigma: G9891) em solução de Tyrode; solução de Tyrode: 9,72 g de sal de Tyrode (N° de Catálogo Sigma: T2145) e 1 g de NaHCO3 em 1 litro de H2O, tampão de substrato de ALP: 25 mM de glicina e 0,5 mM de MgCl2, pH 10,5; solução de substrato de ALP: 5 mg de p -nitrofenil fosfato (substrato Sigma 104, N° de Catálogo Sigma: 50942-200TAB) em 3,75 ml de tampão de substrato de ALP, pH 10,5; 1 mM de p -nitrofenol (N° de CatálogoSigma: 104-1) em solução de substrato de ALP.
Ensaio
[00264] Para os ensaios de ALP, células MC3T3 1b foram desenvolvidas em meio de cultura de ensaio (que corresponde ao meio de manutenção de cultura na ausência de G418). As células MC3T3 1b foram semeadas em 200 μL a 3 x 104 células/mL, se a indução começasse 72 horas mais tarde, ou 2 x 104 células/ml, se a indução começasse 96 horas mais tarde. As placas foram incubadas por 72 horas ou 96 horas a 37°C e CO2 5%, antes de a indução ser iniciada com o uso de meio completo (por suplementação do meio de cultura com 10 mM de b-glicero-fosfato (bGP) e 50 μM de ácido ascórbico (AA)). Os anticorpos a serem testados foram diluídos com meio completo. O anticorpo, junto com BMP-2 (0,7 nM) e esclerostina (50 nM), foi adicionado aos poços (em triplicata) em um volume final de 200 μl de meio completo. Em cada placa, 4 controles internos foram incluídos em triplicata: um controle de solvente (BSA), controle de BMP-2 (0,7 nM), BMP-2 + esclerostina (BMP-2 (0,7 nM) e esclerostina (50 nM)) e um controle de esclerostina (50 nM). As placas foram incubadas por mais 72 horas a 37°C e CO2 5%. Ao final do período de indução, o ensaio foi terminado por remoção do meio e adição de 150 μl de solução de substrato de ALP (recém preparada) a cada poço. As placas foram incubadas por 3 - 30 minutos. Cem μL de 1 M de NaOH foram adicionados para interromper a reação e as placas foram agitadas em uma agitadora de placas. A densidade óptica (OD) foi lida contra um vazio a 405 nm e a atividade de ALP foi calculada em nmol/min. Cinquenta nM de esclerostina foram usados para se obter pelo menos 70% de inibição da produção de ALP induzida por BMP-2 [0,7 nM de BMP-2].
ENSAIO DE WNT
[00265] Esse ensaio foi estabelecido para o teste de anticorpos baseado na habilidade de esclerostina para inibir a indução mediada por Wnt1 do gene repórter de STF.
Transfecção de células HEK293
[00266] No dia 1, células HEK293 foram semeadas a 1,3-1,4 x 105 células por poço (em um volume de 0,5 ml) de uma placa de 24 poços de poli-D-lisina (N° de Catálogo BD-BioCoat: 356414) em DMEM (Gibco, N° de Catálogo: 61965-026) contendo soro fetal de bezerro 10% (FCS), L-glutamina 1% (Gibco, N° de Catálogo: 25030.024), aminoácidos não essenciais 1% (Gibco, N° de Catálogo: 11140) sem antibióticos. A transfecção foi realizada no dia 2 com Lipofectamina 2000 (Invitrogen, N° de Catálogo: 11668-019). Para cada poço a ser transfectado, a seguinte quantidade de plasmídeos foi adicionada até um volume final de 50 μL de OptiMEM®I (Gibco, N° de Catálogo: 31985-047): para os poços de controle (pcDNA3+, 480 ng; SuperTopFlash (STF) 20 ng; phRL-CMV, 0,5 ng) e para os poços de tratamento com Wnt1 (pcDNA-wnt1, 20 ng; pcDNA3+, 460 ng; SuperTopFlash (STF) 20 ng; phRL-CMV, 0,5 ng).
[00267] Em um segundo tubo, 1,6 μL de Lipofectamina 2000 foi diluído em 50 μL de OptiMEM®I e incubado em temperatura ambiente por 5 minutos. O conteúdo dos dois tubos foi então misturado por adição do conteúdo do tubo de lipídeo ao tubo de DNA e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir a formação de complexo DNA-lipídeo. O complexo DNA-lipídeo (100 μL) foi adicionado igualmente aos poços e incubado a 37°C em CO2 5% por 5 horas. Ao final da incubação de 5 horas, as células estavam prontas para tratamento com os reagentes de teste como, por exemplo, SOST, anticorpos etc.
Estabelecimento da inibição de dose-dependente de SOST
[00268] Para estabelecer a curva de dose-inibição, foi preparada uma série de diluições de duas vezes de rhSOST em DMEM contendo FCS 10%, L-glutamina 1% e aminoácidos não essenciais 1% sem antibióticos, começando a 160 nM. A concentração de rhSOST de estoque foi de 260 μg/mL em DMEM com FCS 1%. Rotineiramente, cada condição foi testada em duplicatas. Portanto, 1 mL de meio para cada condição foi preparado e 450 μL foram adicionados por poço após remoção de meio contendo a mistura de transfecção dos poços. O tempo de tratamento foi de 18-20 horas. Ao final da incubação, o ensaio de luciferase foi realizado como definido abaixo.
Teste de anticorpos anti-SOST
[00269] Os anticorpos foram pré-misturados com SOST antes da adição às células. Para essa finalidade, um meio DMEM (FCS 10%, L- glutamina 1% e aminoácidos não essenciais 1% sem antibióticos) com 20 a 30 nM de rhSOST foi preparado. A seguir, diferentes diluições de anticorpos testados foram adicionadas ao meio contendo SOST de acordo com o projeto experimental. Essas misturas foram preparadas 40 minutos antes do tratamento. Cada condição foi testada rotineiramente em duplicatas. Para fazê-lo, 1 mL de meio para cada condição foi preparado e 450 μL foram adicionados por poço após remoção de meio contendo a mistura de transfecção dos poços. O tempo de tratamento foi de 18-20 horas. Ao final da incubação, o ensaio de luciferase foi realizado como definido abaixo.
Ensaio de luciferase
[00270] Ao final da incubação, o meio foi removido, e 300 μl de 1X Tampão de Lise Passiva (Promega, N° de Catálogo: E194A) foram adicionados para lisar as células. A atividade de luciferase foi então medida usando o Sistema de Luciferase Dual-Glo (Promega, N° de Catálogo: E2940) com 30 μL de lisados em duplicatas. O ensaio foi realizado de acordo com o livreto de instruções fornecido com o kit. Tipicamente, 30 μL de Dual-Glo luciferase (luciferase de vaga-lume; para STF) e 30 μl de Dual-Glo Stop e Glo (luciferase de Renilla; para controle da eficiência de transfecção) de substratos foram usados. Os sinais luminescentes foram medidos com o instrumento Mithras LB940 (Berthold Technologies).
Cálculo dos dados
[00271] A proporção de luciferase de vaga-lume para a de Renilla foi calculada. Os resultados finais são expressos estabelecendo-se o valor de Wnt1 sem SOST como 1.
ENSAIO DE MINERALIZAÇÃO Células
[00272] As células MC3T3 1b são um clone de células MC3T3-JP que expressam OSE2-luc. Esse clone foi obtido após transfecção estável de MC3T3-JP (osteoblasto de camundongo MC3T3-E1, clone do Japão, Jp; uma gentileza do Dr. T. Kokkubo, Novartis, Japão) usando 8x-OSE2wt-mOG2luc em pcDNA3.1+.
Meio de cultura
[00273] As células MC3T3-1b foram cultivadas rotineiramente em meio essencial mínimo alfa (MEMα; Invitrogen, N° de Catálogo: 22561021) suplementado com soro fetal de bezerro 10% (FCS; N° de Catálogo Amimed: 2-01F100-I), 2 mM de L-glutamina (N° de Catálogo Gibco: 25030-024), 50 UI de penicilina/50 μg/mL de estreptomicina (N° de Catálogo Amimed: 4-01F00-H) e 10 mM de Hepes (N° de Catálogo Gibco: 15630-056) e 0,75 mg/ml de G418 (N° de Catálogo Gibco: 10131-027) (meio de manutenção de cultura).
Ensaio de mineralização
[00274] O cálcio associado à matriz depositado nos poços foi determinado em células MC3T3-1b usando o kit de Cálcio (Axon Lab, N° de Catálogo: AXON0012). As células foram semeadas a 6 x 103 células/poço ou 2 x 103 células/poço para aumentar a capacidade de resposta das células em placas de 96 poços em 100 μL de meio de cultura de ensaio (meio de manutenção de cultura sem G418) e incubadas por 3 dias até alcançarem a confluência. O meio de cultura de ensaio foi então trocado e os compostos a serem testados adicionados juntos com 10 mM de b-glicero-fosfato (bGP; N° de Catálogo Sigma: G9891) e 50 μM de ácido ascórbico (AA; N° de Catálogo Wako Pure Chemical: 013-12061). Antes de sua adição às células, esclerostina e os Fabs a serem testados foram pré-incubados em uma placa separada por 2 horas em temperatura ambiente; enquanto isso, as placas de ensaio de 96 poços receberam 2,1 ou 2,8 nM de BMP-2 (R&D Systems, N° de Catálogo: 355-BM-010) antes de receberem a mistura de esclerostina-Fab. As células foram incubadas por 14 dias e o meio de ensaio foi substituído a cada 3-4 dias. Resumidamente, ao final da incubação, as células foram lavadas duas vezes com 200 μL de PBS/poço, 50 μL de 0,5 M de HCl foram adicionados a cada poço e as placas foram congeladas a -20°C por um mínimo de 24 horas. No momento apropriado, as placas foram descongeladas em temperatura ambiente por 2 horas e 10 μL de cada poço foram transferidos para uma nova placa de 96 poços. Solução de Trabalho de Cálcio (1:5) foi então adicionada (200 μL) e 5-30 minutos mais tarde as placas foram lidas a 595 nm em uma leitora de microplacas.
[00275] A absorbância foi traduzida em μg de cálcio de acordo com uma curva-padrão, o valor do poço de controle (ácido ascórbico e beta-glicerofosfato) foi subtraído dos dados de cada poço e os resultados finais foram expressos como % de mineralização induzida por BMP-2.
WESTERN DA FOSFORILAÇÃO DE SMAD1 Materiais
[00276] - osteoblasto de camundongo MC3T3-E1, (clone do Japão,gentileza do Dr. T. Kokkubo, Novartis, Japão)
[00277] - células C3H10T1/2 (mesenquimais de embrião decamundongo; ATCC, N° de Catálogo: CCL-226)
[00278] - SCL não glicosilado, derivado de E. coli (Novartis,PSU5257)
[00279] - 15N SCL não glicosilado, derivado de E. coli (Novartis,PSU11274)
[00280] - hSOST-APP, glicosilado, derivado de HEK-EBNA(Novartis, BTP11100)
[00281] - rhSCL, glicosilado, derivado de células de mieloma decamundongo (R&D Systems, N° de Catálogo: 1406-ST/CF)
[00282] - anticorpo anti-hSOST (R&D Systems, N° de Catálogo:AF1406)
[00283] - Reagente de Extração PhosphoSafe (Novagen, N° deCatálogo: 71296-3)
[00284] - Coquetel de Inibidor de Protease Set III (Calbiochem, N°de Catálogo: 539134)
[00285] - Gel de NuPAGE Novex Tris-Acetato 7% 1,5 mm, 15 poços(Invitrogen, N° de Catálogo: EA03585)
[00286] - Tampão de Corrida de Tris-Acetato SDS 20x (Invitrogen,N° de Catálogo: LA0041)
[00287] - Antioxidante NuPAGE (Invitrogen, N° de Catálogo:NP0005)
[00288] - Membrana de Transferência Immobilon-P 0,45 μm(Millipore, N° de Catálogo: IPVH00010)
[00289] - Papel de cromatografia Wattman (Merck, N° de Catálogo:3587600)
[00290] Módulo de Blot XCell SureLock Mini-Cell e XCell II (Invitrogen)
[00291] - leitora de microplacas VersaMax (Bucher)
Cultura e extração de células
[00292] Células MC3T3-E1 e C3H10T1/2 foram cultivadas rotineiramente em meio essencial mínimo alfa (MEMα; Invitrogen, N° de Catálogo: 22561-021) ou em DMEM com glicose elevada (Invitrogen, N° de Catálogo: 41965-039), respectivamente. Todos os meios de cultura foram suplementados com soro fetal de bezerro 10% (FCS; BioConcept N° de Catálogo: 2-01F10-I, lote Z04459P), 2 mM de L-glutamina (Invitrogen N° de Catálogo: 25030-024), 50 UI depenicilina/50 ug/mL de estreptomicina (Invitrogen N° de Catálogo: 15140-122) e 10 mM de Hepes (Invitrogen N° de Catálogo: 15630-056) (meio de manutenção de cultura).
[00293] As células foram semeadas em meio de manutenção de cultura em placas de 6 poços (3 ml/poço) e desenvolvidas até a confluência (com 1,4 x 105 células MC3T3-1b/poço, a confluência foi alcançada no dia 3; com 1,0 x 105 células C3H10T1/2/poço, a confluência foi alcançada no dia 3). Após depleção do soro de um dia para o outro em meio de cultura contendo FBS 1%, o meio foi substituído por meio fresco suplementado com FBS 1%, BMP-6 (R&D Systems, N° de Catálogo: 507-BP) e a(s) substância(s) a ser testada. Antes de sua adição às células, BMP-6 e a(s) substância(s) a ser testada foram pré-incubadas por 1 hora em temperatura ambiente, como foi descrito para um fosfo-Smad 1/3/5 em C3H10T1/2 (Winkler, EMBO J., 2003, 22(23): 6.267-76). Quando são testados anticorpos anti-esclerostina, esses foram pré-incubados com esclerostina de um dia para o outro a 4°C, antes de serem incubados com 0,2 nM de BMP-6 por 1 hora em temperatura ambiente e serem finalmente adicionados às células confluentes. Após o tempo de tratamento apropriado, as células foram lavadas com 2 mL de PBS gelado. Cem μl/poço de Reagente de Extração PhosphoSafe e Coquetel de Inibidor de Protease diluído a 1:200 foram então adicionados às células que foram então incubadas no gelo por 5 minutos. As células foram raspadas dos poços e transferidas para um tubo microcentrífuga. O extrato de células foi mantido no gelo por 15 minutos, interrompidos por uma etapa de turbilhonamento a cada 5 minutos. A seguir, o extrato de células foi centrifugado por 5 minutos a 16.000 g e 4°C. Finalmente, o sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrífuga fresco para determinação de proteína.
[00294] A concentração de proteína no lisado de células foi determinada usando o Kit de Ensaio de Proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante. BSA foi usado como padrão. Para desnaturação, o lisado de células foi diluído a 1:2 com tampão de Laemmli (Bio-Rad, N° de Catálogo: 161-0737, contendo β-Mercaptoetanol (1:20, Merck, N° de Catálogo: 1.12006) recém adicionado) e fervido por 5 minutos a 95°C. Após resfriamento, as amostras foram armazenadas a -20°C até uso posterior.
Western blot
[00295] O anticorpo Smad (H-465) (Santa Cruz, N° de Catálogo: sc- 7153) é uma IgG policlonal de coelho, desenvolvida contra os aminoácidos 1-465 que representam Smad1 de comprimento total de origem humana. Ele deve reconhecer Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 e Smad8 de origem humana, de rato e camundongo. O anticorpo fosfo-Smad1 (Ser463/465)/ Smad5 (Ser463/465)/Smad8 (Ser426/428) (Cell Signalling, N° de Catálogo: 9511) é uma IgG policlonal de coelho, desenvolvida contra um fosfopeptídeo sintético que corresponde aos resíduos que circundam Ser463/465 de mad5 humano. Ele deve detectar níveis endógenos de Smad1 apenas quando fosforilado duplamente na serina 463 e na serina 465, bem como Smad5 e Smad8 apenas quando fosforilado nos sítios equivalentes de origem humana, de camundongo, rato, marta e xenopous. O anticorpo não reage de forma cruzada com outras proteínas relacionadas ao Smad.
[00296] O sistema XCell SureLock Mini Cell (Invitrogen) foi preparado de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de proteína (2 μg para uma análise Western de Smad, 5 μg para uma análise Western de Fosfo-Smad) foram carregadas em volume final igual em um Gel de NuPAGE Novex Tris-Acetato 7% em 1x Tampão de Corrida. Padrão pré-corado SeeBlue Plus2 (10 μl, 1:10; Invitrogen, N° de Catálogo: LC5925) e padrão de proteína Western MagicMark XP (10 μl, 1:100; (Invitrogen, N° de Catálogo: LC5602) foram usados como marcadores de peso molecular. O gel foi processado por 75 minutos com voltagem constante (150 V).
[00297] Os blocos de blotting e os papéis de filtro foram embebidos em 700 mL de Tampão de Transferência 1x NuPAGE. Uma membrana de transferência de PVDF primeiro foi embebida por 30 segundos em metanol e depois transferida em Tampão de Transferência 1x NuPAGE (Invitrogen, N° de Catálogo: NP0006, Tampão deTransferência: Metanol 10:1 recém preparado). As placas do cassete de gel foram separadas com uma faca de gel, um papel de filtro pré- embebido foi colocado no topo do gel, e quaisquer bolhas de ar capturadas foram cuidadosamente removidas. A placa foi virada de cabeça para baixo em papel Saran e, após remoção da placa, a membrana de transferência pré-embebida foi colocada no gel e quaisquer bolhas de ar foram removidas. Um segundo papel de filtro pré-embebido foi colocado no topo e quaisquer bolhas de ar foram removidas. Dois blocos de plaqueamento embebidos foram colocados no centro do catodo do Módulo de Blot Cell II. O sanduíche de gel/membrana foi cuidadosamente retirado e colocado nos blocos de blotting (com o gel mais próximo ao centro do catodo). Finalmente, 3 blocos de blotting pré-embebidos foram colocados na montagem da membrana e o centro do anodo foi adicionado em cima. O módulo de blot foi deslizado nos trilhos de guia na câmara de tampão inferior e a cunha foi travada em posição de acordo com as instruções do fabricante. O módulo de blot foi preenchido com Tampão de Transferência 1x NuPAGE até que a montagem de gel/membrana estivesse coberta. A câmara de tampão externa foi preenchida com 650 mL de água deionizada e a transferência de proteína para a membrana de PVDF foi realizada com voltagem constante (30 V) por 2 horas.
[00298] Após o blotting, a membrana primeiro foi lavada por 10 minutos em Tween 20 0,05% em PBS e depois bloqueada sob agitação suave por 1 hora em 25 mL de Tampão de Bloqueio SuperBlock T20 em temperatura ambiente. O anticorpo primário (Fosfo-Smad 1/5/8 ou Smad (H-465)) foi adicionado à membrana em uma diluição de 1:1.000 em Tampão de Bloqueio SuperBlock T20 (Pierce, N° de Catálogo: 37516) e a membrana foi incubada de um dia para o outro a 4°C sob agitação. A membrana foi então lavada 3 vezes por 10 minutos com Tween 20 0,05% (Fluka, N° de Catálogo: 93773) em PBS antes de ser incubada com o anticorpo secundário conjugado à RP (1:1.000 em Tampão de Bloqueio SuperBlock T20) por 60 minutos em temperatura ambiente sob agitação. Pelo menos 3 etapas de lavagem de 10 minutos cada foram realizadas antes de a membrana ser incubada por 5 minutos com uma Solução de Trabalho de Substrato SuperSignal West Femto (Pierce, N° de Catálogo: 34095). Finalmente, a membrana foi colocada em uma bolsa plástica e teve sua imagem obtida com Fluor-S MultiImager (Bio-Rad) e Câmera. Um tempo de exposição ótimo de 1 a 2 minutos foi determinado por comparação de imagens obtidas entre 30 segundos até 5 minutos.
Análise de dados
[00299] As atividades de quimioluminescência foram medidas usando Quantity One (Bio-Rad) e os valores de EC50 foram calculados usando o software XLfit4. Cada sinal de fosfo-Smad foi normalizado por seu sinal de Smad total correspondente.
ELISA DE LRP6 / ESCLEROSTINA
[00300] Noventa placas de microtitulação de 6 poços não tratadas foram revestidas com 100 μL/poço de LRP6/Fc (1 μg/mL, R&D Systems, N° de Catálogo: 1505-LR) diluídos em PBS. Como controle para ligação não específica (NSB), alguns poços foram preenchidos com 100 μL/poço de PBS. As placas foram cobertas com película plástica e incubadas de um dia para o outro em temperatura ambiente. Após o revestimento, as placas foram lavadas 3 vezes com 200 μL^o de Tween 20 0,05% (Fluka, N° de Catálogo: 93773) em PBS, e os poços foram bloqueados por 1 hora a 37°C por adição de 300 μL/poço de tampão de bloqueio SuperBlock (Pierce, N° de Catálogo: 37535) em TBS. Após incubação, a solução de bloqueio foi removida e 100 μL/poço de esclerostina (derivada de E. coli, Novartis; 1 - 1.000 ng/ml,) diluídos em BSA 1% em PBS foram adicionados. As placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente antes de serem lavadas 3 vezes com 200 μL/poço de Tween 20 0,05% em PBS. A seguir, 100 μL/poço de anticorpo anti-esclerostina (1 μg/mL) diluídos em BSA 1% em PBS foram adicionados e as placas incubadas por 2 horas em temperatura ambiente antes de serem lavadas 3 vezes com 200 μL/poço de Tween 20 0,05% em PBS. Finalmente, 100 μL/poço Ab anti-IgG de cabra conjugado à ALP (1:5.000; N° de Catálogo Sigma: A-7888) diluídos em BSA 1% (Sigma N° de Catálogo:A-7888) em PBS foram adicionados por 1 hora em temperatura ambiente, e as placas foram então lavadas 3 vezes com 200 μL/poço de Tween 20 0,05% em PBS. Para determinar a ALP, 100 μL/poço de solução de substrato de ALP (Sigma, N° de Catálogo: S0942) (1 comprimido por 5 mL de tampão de substrato de dietanolamina 1x; Pierce, N° de Catálogo: 34064) foram adicionados às placas por 90 minutos e a densidade óptica medida a 405 nm.
SUPEREXPRESSÃO DE LRP4 EM CÉLULAS HEK293
[00301] Células HEK293 (ATCC N° de Catálogo: CRL-1573) foram cultivadas rotineiramente em DMEM/F12 (Invitrogen N° de Catálogo: 21331-020) suplementado com FCS 10% (BioConcept N° de Catálogo: 2-01F10-I, lote Z04459P), 2 mM de L-glutamina (Invitrogen N° de Catálogo: 25030-024), 100 UI de penicilina/100 μg/mL deestreptomicina (Invitrogen N° de Catálogo: 15140-122) e 10 mM de HEPES (Invitrogen N° de Catálogo: 15630-056). As células Hek293 foram semeadas a 5 x 104 células/poço em um formato de placa de 48 poços de poli-D-Lisina e incubadas por 24 horas, antes da realização da transfecção com Lipofectamina 2000 (Invitrogen N° de Catálogo: 11668-019). Para cada poço a ser transfectado, a seguinte quantidade de plasmídeos foi adicionada até um volume final de 25 μL de OptiMEM®I (Gibco, N° de Catálogo: 31985-047) e misturada gentilmente: para os poços de controle (pmaxGFP, 62,5 ng, pcDNA3+, 125 ng; SuperTopFlash (STF) 62,5 ng; plasmídeo de luciferase de Renilla conduzido por SV40, 0,75 ng) e para poços de tratamento com Wnt1 (pmaxGFP, 62,5 ng, pcDNA-wnt1, 62,5 ng; pcDNA3+, 62,5 ng; SuperTopFlash (STF) 62,5 ng; plasmídeo de luciferase de Renilla conduzido por SV40, 0,75 ng) e para poços de tratamento com LRP4- Wnt1 (pcDNA3+-LRP4, 62,5 ng, pcDNA3+-wnt1, 62,5 ng; pcDNA3+, 62,5 ng; SuperTopFlash (STF) 62,5 ng; plasmídeo de luciferase de Renilla conduzido por SV40, 0,75 ng). Em um segundo tubo, 0,8 μL de Lipofectamina 2000 foi diluído até um volume final de 25 μL de OptiMEM®I e incubado em temperatura ambiente por 5 minutos. O conteúdo dos dois tubos foi então misturado por adição do conteúdono tubo de lipídeo ao tubo de DNA e incubado por 30 minutos emtemperatura ambiente para permitir a formação de complexo DNA-lipídeo. O complexo DNA-lipídeo (50 μL) foi adicionado igualmente aos poços e incubado a 37°C em CO2 5% por 5 horas. Ao final daincubação de 5 horas, as células estavam prontas para um tratamento de 20 horas com reagentes de teste como, por exemplo, SOST, DKK1 (N° de Catálogo R&D: 1096-DK), anticorpos etc. O ensaio de luciferase foi realizado como descrito sob "ensaio de Wnt", mas com a adição de 150 μL de Tampão de Lise Passiva em seu lugar.
SUPEREXPRESSÃO DE LRP4 EM CÉLULAS C28A2
[00302] Células C28a2 (de Mary Goldring, "Harvard Institutes ofMedicine", Boston, MA, EUA) foram cultivadas no mesmo meio que as células HEK293 (veja acima), exceto que HEPES não estava presente e um suplemento de aminoácidos não essenciais (N° de Catálogo Gibco: 11140) foi adicionado. As células C28a2 foram semeadas a 1 x 105 células/poço em um formato de placa de 24 poços em meio de cultura sem antibiótico, e incubadas de um dia para o outro antes da realização da transfecção com Lipofectamina 2000 (Invitrogen N° de Catálogo: 11668-019). Para cada poço a ser transfectado, a seguinte quantidade de plasmídeos (600 ng/poço no total) foi adicionada até um volume final de 50 μL de OptiMEM®I (Gibco, N° de Catálogo: 31985047) e misturada gentilmente: para os poços de controle(SuperTopFlash (STF) 100 ng; plasmídeo de luciferase de Renilla conduzido por SV40, 2 ng e pcDNA3+, 500 ng para compensar) e para poços de tratamento com Wnt1 (plasmídeo de pcDNA-wnt1, 100 ng; plasmídeo de LRP5, 100 ng; SuperTopFlash (STF) 100 ng; plasmídeo de luciferase de Renilla conduzido por SV40, 2 ng e pcDNA3+, 300 ng) e para poços de tratamento com LRP4-Wnt1 (plasmídeo de pcDNA- wnt1, 100 ng; plasmídeo de LRP5, 100 ng; plasmídeo de LRP4, 100 ng; SuperTopFlash (STF) 100 ng plasmídeo de luciferase de Renilla conduzido por SV40, 2 ng e pcDNA3+, 200 ng). Em um segundo tubo, 1,6 μL de Lipofectamina 2000 foi diluído até 48,4 μL de OptiMEM®I e incubado em temperatura ambiente por 5 minutos. O conteúdo dos dois tubos foi então misturado por adição do conteúdo do tubo de lipídeo ao tubo de DNA e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir a formação de complexo DNA-lipídeo. O complexo DNA-lipídeo (100 μL) foi adicionado igualmente aos poços e incubado a 37°C em CO2 5% por 2 horas. Ao final da incubação de 2 horas, o meio de transfecção foi trocado por 450 μL/poço de meio sem antibiótico, e a células foram incubadas por 24 horas. As células foram então tratadas por 20 horas com reagentes de teste como, por exemplo, SOST ou DKK1 (N° de Catálogo R&D: 1096-DK). O ensaio de luciferase foi realizado como descrito sob "ensaio de Wnt".
KNOCKDOWN PARA LRP4 EM CÉLULAS HEK293
[00303] Células Hek293 Wnt1/STF/Renilla (um clone estável gerado pela transfecção estável de células Hek293 (ATCC N° de Catálogo: CRL-1573)) com plasmídeo de expressão de Wnt1, plasmídeo repórter SuperTopFlash e um plasmídeo de luciferase de Renilla conduzido por SV40) foram cultivadas rotineiramente em DMEM 4.500 g/L de glicose (Invitrogen N° de Catálogo: 41965-035) suplementado com FCS 10% (N° de Catálogo Amimed: 2-0F100-I), 2 mM de L-glutamina (Invitrogen N° de Catálogo: 25030-081), 100 UI/mL de penicilina/100 μg/mL de estreptomicina (N° de Catálogo Gibco: 15140-163), 6 μg/mL de puromicina (Invitrogen N° de Catálogo: ant-pr-1), 150 μg/mL de zeocina (Invitrogen N° de Catálogo: 45-0430) e 150 μg/mL de higromicina (Invitrogen N° de Catálogo: 10687-010). Os antibióticos de seleção foram deixados de fora durante os experimentos de knockdown. As células foram semeadas a 0,6 x 105 células/poço em um formato de placa de 24 poços de poli-D-Lisina e deixadas para adesão de um dia para o outro, antes da realização da transfecção de siRNAs de LRP4 com HiPerFect (N° de Catálogo Qiagen: 301707). As sequências senso e anti-senso do siRNA de LRP4 usadas foram as seguintes:LRP4a: TAAATTATCATAAAGTCCTAA /AGGACTTTATGATAATTTATT; (SEQ ID NOs: 160/161).LRP4b: ATAGTGGTTAAATAACTCCAG /GGAGTTATTTAACCACTATTT; (SEQ ID NOs: 162/163).LRP4c: TAAATTCTCGTGATGTGCCAT /GGCACATCACGAGAATTTATT; (SEQ ID NOs: 164/165).LRP4d: TTTCTTATAGCACAGCTGGTT /CCAGCTGTGCTATAAGAAATT; (SEQ ID NOs: 166/167).LRP4e: TAGACCTTTCCATCCACGCTG /GCGTGGATGGAAAGGTCTATT; (SEQ ID NOs: 168/169).
[00304] Para cada poço a ser transfectado, dois tubos de Eppendorf foram preparados: o primeiro cotinha 0,2 μL de um estoque de 20 nM de um dos siRNAs de LRP4 ou 0,1 μL de um estoque de 20 nM de dois siRNAs de LRP4 diferentes (a concentração total final em siRNA/poço é de 6,6 nM) e 50 μL de Optimem, e o segundo, 3 μL de HiPerFect e 47 μL de Optimem. O conteúdo do segundo tubo foi adicionado ao primeiro, turbilhonado rapidamente e deixado por 10 minutos em temperatura ambiente. Cem μL dessa mistura foram então adicionados ao respectivo poço e as células foram incubadas a 37°C sob CO2 5% por 30 horas. A seguir, a mistura de transfecção foi removida e substituída por meio de cultura sem antibiótico fresco (450 μL/poço) e deixada em incubação por mais 24 horas. Antes do tratamento com SOST ou DKK1, o meio foi removido, substituído por meio de cultura sem antibiótico fresco contendo a diluição apropriada de SOST ou DKK1 (N° de Catálogo R&D: 1096-DK) e as células foram incubadas por 20 horas a 37°C sob CO2 5%. A determinação de luciferase foi então realizada como descrito sob "ensaio de Wnt".
Modelos animais
[00305] Fêmeas de camundongos com oito meses de idade (n = 16 / grupo, Charles River, França) receberam a administração duas vezes por semana por via intravenosa de anticorpo anti-esclerostina ANTICORPO A (25 mg/kg, h/mIgG2a) (MOR05813) ou anticorpo de controle (anti-PC-h/mIgG2a). Os grupos de controle receberam diariamente por via subcutânea 100 microgramas/kg de PTH(1-34) ou veículo de PBS. O tratamento durou 2,5 semanas para todos os animais. Metade dos animais (n = 8 / grupo) foi sacrificada naquele ponto do tempo para análise histomorfométrica. O tratamento continuou para o restante dos animais (n = 8 / grupo) até 5 semanas.
[00306] A massa óssea e a geometria tibial dos animais foram medidas no início do tratamento por tomografia computadorizada quantitativa periférica (pQCT) e micro-tomografia computadorizada (microCT). Os animais foram distribuídos igualmente de acordo com o peso corporal e a densidade mineral óssea tibial total avaliada por pQCT em grupos. As alterações da densidade mineral, massa e geometria ósseas foram avaliadas após 2,5 e 5 semanas de tratamento. O peso corporal foi monitorado semanalmente. Os animais que foram sacrificados após 2,5 semanas de tratamento receberam a administração de dois marcadores de fluorócromo para marcação da mineralização óssea 10 e 3 dias antes da necropsia. O sangue foi coletado na necropsia. Foram feitas medidas de absorptiometria de raios-x de dupla energia (DEXA) na necropsia na tíbia, fêmur e vértebras lombares retiradas. Os ossos foram fixados, desidratados e embebidos para corte com micrótomo e análise histomorfométrica da dinâmica de formação óssea.
PROTOCOLO DE TRATAMENTO
[00307] Anticorpo de controle: anti-PC-h/mIgG2a,
[00308] Concentração: 2,5 mg/mL, volume de aplicação: 10 mL/kg
[00309] Veículo: 50 mM de Citrato, 140 mM de NaCl
[00310] Anticorpo anti-esclerostina: anti-SOST-MOR05813,h/mIgG2a, 2,45 mg/mL, volume de aplicação: 10 mL/kg
[00311] Veículo: 50 mM de Citrato, 140 mM NaCl
[00312] hPTH (1-34) (Bachem, Bubendorf, Suíça) 100 μg/kg
[00313] Veículo: PBS + BSA 0,1%GRUPOS DE TRATAMENTO:1 - Controle de isótipo iv. = anti-PC-mIgG2a2 - Anti-SOST-MOR05813 iv.3 - Controle de veículo sc. = PBS + BSA 0,1%4 - hPTH(1-34) sc.
CONDIÇÕES DE MANUTENÇÃO
[00314] Os animais foram abrigados em grupos de quatro a cinco animais a 25°C com um ciclo de claro-escuro de 12:12 horas. Eles foram alimentados com uma dieta de laboratório padronizada contendo 0,8% de fósforo e 0,75% de cálcio (NAFAG 3893.0.25, Kliba, Basiléia, Suíça). Alimentos e água foram fornecidos ad libitum.
DECLARAÇÃO DOBRE O BEM-ESTAR DOS ANIMAIS
[00315] A experimentação animal foi realizada de acordo com as regulações vigentes no Cantão da Cidade da Basiléia, Suíça.
MÉTODOS TOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA QUANTITATIVA PERIFÉRICA (PQCT)
[00316] Os animais foram colocados em uma posição lateral sob narcose por inalação (Isofluorano, 2,5%). A perna esquerda foi esticada e fixada nessa posição.
[00317] A massa óssea, densidade e geometria do corte transversal foram monitoradas na metáfise proximal da tíbia no nível da cabeça da fíbula média e 1,8 mm distal à extremidade proximal da tíbia, como detectadas na varredura exploratória usando um Stratec-Norland XCT- 2000 adaptado com um tubo de raios-X Oxford 50 AM e um colimador de 0,5 mm de diâmetro. O seguinte ajuste foi escolhido para as medidas: tamanho de voxel: 0,1 x 0,1 x 0,5 mm; velocidade de varredura: visão exploratória - 10 mm/s; varredura final - 3 mm/s, 1 bloqueio, modo de delineação 1, modo de camadas 2; limiar cortical: 610 mg/cm3, limiar interno: 610 mg/cm3.
TOMOGRAFIA MICRO-COMPUTADORIZADA (microCT)
[00318] Os animais foram colocados em uma posição lateral sob narcose por inalação (Isofluorano, 2,5%). A perna esquerda foi esticada e fixada nessa posição.
[00319] A estrutura do osso esponjoso foi avaliada na metáfise proximal da tíbia esquerda usando um Scanco vivaCT20 (Scanco Medical AG, Suíça). Os voxels não isométricos tinham uma dimensão de 10,5 x 10,5 x 10,5 μm. A partir de imagens de cortes transversos, o compartimento de osso esponjoso foi delineado a partir do osso cortical traçando-se seu contorno. Em todos os outros cortes, os limites foram interpolados com base no rastreamento para definir o volume de interesse. 143 cortes dentro da área da esponjosa secundária (começando abaixo das bordas laterais inferiores da placa de crescimento) foram avaliados. Um valor-limite de 370 foi usado para a avaliação tridimensional de parâmetros estruturais.
ABSORPTIOMETRIA DE RAIOS-X DE DUPLA ENERGIA (DEXA)
[00320] As medidas de DEXA ex vivo foram realizadas na tíbia esquerda, no fêmur esquerdo e nas vértebras lombares 1 - 4. Etanol (70%) foi usado para simulação de tecido mole. As medidas foram realizadas usando um instrumento Hologic QDR-1000 regular adaptado para medida de pequenos animais. Foi usado um colimador com 0,9 cm de diâmetro e modo de resolução ultra-elevado (espaçamento de linha de 0,0254 cm, resolução de 0,0127 cm).
MARCAÇÃO COM FLUORÓCROMO:
[00321] Alizarina (20 mg/kg, subcutânea, "alizarin complexone", Merck, Dietikon, Suíça) foi aplicada 10 dias antes da necropsia.
[00322] Calceína (30 mg/kg, subcutânea, Fluka, Buchs, Suíça) - 3 dias antes da necropsia.
HISTOLOGIA E HISTOMORFOMETRIA
[00323] Após dissecção, o fêmur direito e as vértebras lombares cinco e seis foram colocados por 24 horas em fixador de Karnovsky, desidratados em etanol a 4°C, e embebidos em resina (metilmetacrilato). Usando um Micrótomo 2050 Supercut (Reichert Jung, Arnsberg, Alemanha), um conjunto de cortes de micrótomo com espessura de 5 μm, não consecutivos, foi cortado no plano frontal do meio do corpo para avaliação da formação óssea baseada em marcação com fluorócromo. Os cortes foram examinados usando um microscópio Leica DM (Leica, Heerbrugg, Suíça) adaptado com uma câmera (SONY DXC-950P, Tóquio, Japão) e um software adaptado Quantimet 600 (Leica, Cambridge, Reino Unido). Foi coletado como amostra um corte por animal. As imagens microscópicas das amostras foram digitalizadas e avaliadas de forma semi-automática na tela. O perímetro ósseo, perímetro ósseo com marcação simples e dupla e a largura inter-marcação foram medidos (ampliação de X200). Os valores do perímetro mineralizado (percentual), as taxas de aposição mineral (micrômetros/dia) (corrigidas para obliquidade do corte no compartimento de osso esponjoso) e os valores da taxa diária de formação óssea (taxa diária de formação óssea/perímetro ósseo [micrômetros/dia]) foram calculados. Todos os parâmetros foram avaliados na esponjosa secundária da metáfise distal do fêmur e em uma vértebra lombar. Outro conjunto de cortes foi corado com fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP). A superfície de osteoclasto por superfície óssea (%) foi avaliada na esponjosa secundária.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
[00324] Os resultados são expressos como média +/- SEM. A análise estatística foi realizada usando o teste t de Student (bi- caudado; não pareado). O tratamento (anticorpo anti-esclerostina ou hPTH(1-34) foi testado quanto à diferença em relação ao controle (anticorpo de controle ou PBS), *, + p < 0,05, **, ++ p < 0,01.
Determinação da afinidade Determinação da afinidade de Fabs anti-esclerostina humana selecionados usando ressonância de plasmon de superfície (Biacore)
[00325] As constantes cinéticas kon e koff foram determinadas com diluições seriais do respectivo Fab que se liga ao antígeno de esclerostina imobilizado covalentemente usando o instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Uppsala, Suécia). Para imobilização covalente do antígeno, foi usada a química de acoplamento de amina padronizada EDC-NHS. As medidas cinéticas foram feitas em PBS (136 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1,76 mM de KH2PO4 pH 7,4) em uma taxa de fluxo de 20 μL/min usando uma faixa de concentração de Fab de 1,5 - 500 nM. O tempo de injeção para cada concentração foi de 1 minuto, seguido por uma fase de dissociação de 3 minutos. Para regeneração, foram usados 2 x 5 μL de 10 mM de glicina pH 1,5. Todos os sensogramas foram ajustados usando o software de avaliação de BIA 3.1 (BIAcore).
Análise de ligação baseada em eletroquimioluminescência (BioVeris) para medidas de afinidades de Fab de ligação de esclerostina em lisados
[00326] Para a medida da afinidade de fragmentos de anticorpo de ligação de esclerostina em lisados de E. coli (extratos BEL), a ligação foi analisada por uma Workstation BioVeris M-384 SERIES® (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido).
[00327] O experimento foi realizado em placas de microtitulação de polipropileno de 96 poços e PBS suplementado com BSA 0,5% e Tween 20 0,02% como tampão de ensaio. Proteína de esclerostina humana biotinilada foi imobilizada em glóbulos paramagnéticos de Estreptavidina M-280 (Dynal) de acordo com as instruções do fornecedor. Uma diluição de 1:25 da solução de estoque dos glóbulos foi adicionada por poço. Cem μl de extrato BEL diluído e glóbulos foram incubados de um dia para o outro em temperatura ambiente em uma agitadora. Para detecção, anti-(Fab)’2 humano (Dianova) marcado com BV-tagTM de acordo com as instruções do fornecedor (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido) foi usado.
[00328] Clones escolhidos aleatoriamente foram analisados com o método descrito acima. Os clones que geram os maiores valores foram escolhidos para análise posterior em titulação de equilíbrio de solução.
Determinação de afinidades de Fabs para esclerostina usando titulação de equilíbrio de solução (SET)
[00329] Para determinação da KD, foram usadas frações de monômero (pelo menos 90% do teor de monômero, analisado por SEC analítica; Superdex75, Amersham Pharmacia) de Fab. A determinação da afinidade baseada na eletroquimioluminescência (ECL) em solução e a avaliação dos dados foram realizadas basicamente como descrito por Haenel e cols., 2005. Uma quantidade constante de Fab (25 pM) foi equilibrada com diferentes concentrações (diluições seriais de 3n) de esclerostina não marcada humana, de camundongo ou de Cynomolgus (concentração de partida: 500 pM) em solução. Esclerostina humana biotinilada (0,5 μg/mL) acoplada aos glóbulos paramagnéticos de Estreptavidina M-280, Dynal) e anticorpo anti- (Fab)’2 humano (Dianova) marcado com BV-tagTM (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido) foram adicionados e incubados por 30 min. Subsequentemente, a concentração de Fab não ligado foi quantificada por meio da detecção da ECL usando um analisador M- SERIES® 384 (BioVeris Europe).
[00330] Os clones de Fab com afinidade aumentada foram identificados por um ensaio de avaliação da afinidade de alto rendimento baseado na ECL BioVeris. Após a seleção de hits, 4 subclones foram consolidados pelo mesmo método.
Ensaio da potência de inibição da ligação ao receptor usando BioVerisTM
[00331] Para o ensaio da potência de inibição da ligação baseado em_BioVerisTM, BMP-2 humana recombinante foi acoplada diretamente (química NHS/EDC) aos glóbulos magnéticos de ácido carboxílico M270 (Dynal) de acordo com as instruções do fornecedor. O ensaio foi realizado em uma placa de microtitulação de polipropileno de 96 poços (Nunc). Cinquenta μL/poço de Fab purificado em tampão de ensaio (PBS + Tween 20 1% (estringente) ou Tween 20 0,1% (menos estringente) + BSA 1%) foram diluídos em etapas de diluição de 1:3 (concentração de partida: 1.000 nM). Cinquenta μl/poço deesclerostina humana biotinilada (4 nM) foram adicionados a cada diluição de Fab. Após incubação por 90 minutos agitando a 400 rpm em um Termomixer Eppendorf a 22°C, 25 μL dos glóbulos revestidos com BMP-2 (2.7E07 glóbulos por mL) e estreptavidina diluída a 1:500 marcada com BV-tagTM de acordo com as instruções do fornecedor (BioVeris Europe) foram adicionados a cada poço e incubados por 30 minutos (800 rpm, 22°C). A detecção foi realizada pela Workstation BioVeris M-384 SERIES® (BioVeris Europe). Para determinação da EC50, foi usado um modelo de ajuste logístico de 4 parâmetros (XLfit, IDBS).
Produção de imunoglobulinas Conversão no formato de IgG1 humana e formato de IgG2a humana/de camundongo
[00332] A fim de expressar IgG de comprimento total, fragmentos do domínio variável de cadeias pesadas (VH) e leves (VL) foram subclonados de vetores de expressão de Fab em vetores de Ig pMorph® apropriados: pMorph®_h_Ig1 e pMorph®2_h/m_Ig2aquimérico humano/de camundongo. Enzimas de restrição EcoRI, MfeI, BlpI foram usadas para subclonagem do fragmento do domínio do VH em pMorph®_h_IgG1 ou pMorph®2_h/m_IgG2a e EcoRV, BsiWI, HpaI para subclonagem do fragmento do domínio VL em vetores pMorph®_h_IgK, pMorph®_h_IgÀ e pMorph®2_h/m_IgÀ,respectivamente.
[00333] As enzimas de restrição EcoRI, MfeI e BlpI foram usadas para subclonagem do fragmento do domínio VH empMORPH®_h_IgG1: o arcabouço do vetor foi gerado por digestão com EcoRI/BlpI e extração do fragmento de 6.400 bp, enquanto o fragmento de VH (350 bp) foi produzido por digestão com MfeI e BlpI e subsequente purificação. O vetor e o inserto foram ligados por meio de projeções compatíveis geradas pelos digeridos por EcoRI e MfeI, respectivamente, e por meio do sítio BlpI. Dessa forma, os sítios de restrição EcoRI e MfeI são destruídos.
[00334] As enzimas de restrição MfeI e BlpI foram usadas para subclonagem do fragmento do domínio VH empMORPH®2_h/m_IgG2a. Nessa nova geração de vetores de IgG, com outras modificações, o sítio EcoRI (que só permitia subclonagem por meio de projeções compatíveis) foi substituído pelo sítio MfeI, permitindo, dessa forma, a digestão por MfeI/ BlpI de ambos, o vetor e o inserto.
[00335] A subclonagem do fragmento do domínio VL em pMORPH®_h_IgK foi realizada por meio dos sítios EcoRV e BsiWI, enquanto a subclonagem em pMORPH®_h_IgÀ epMORPH®2_h/m_IgÀ foi feita usando Eco RV e Hpa I.
Expressão transitória e purificação de IgG humana
[00336] Células HEK293 ou HKB11 foram transfectadas com uma quantidade equimolar de vetores de expressão de cadeia pesada e leve de IgG. Nos dias 4 ou 5 pós-transfecção, o sobrenadante da cultura de células foi coletado. Após ajuste do pH do sobrenadante até o pH 8,0 e filtração estéril, a solução foi submetida à cromatografia em coluna padronizada com proteína A (Poros de 20 A, PE Biosystems).
Exemplo 1: Geração de proteínas de esclerostina recombinantes humanas e de Cynomolgus
[00337] O cDNA de comprimento total que codifica precursor de esclerostina humana (N° de Acesso GenBank AF326739) que apresenta um peptídeo sinalizador natural (aa 1-213, NPL 005002) foi clonado no vetor de expressão mamífero pRS5a por inserção nos sítios de restrição Asp718 e Xba1. Um tag de detecção e purificação de proteína (APP = EFRH) foi adicionado ao C-terminal do gene.
[00338] Após verificação da expressão em pequena escala em ensaios de transfecção transitória em placa de 6 poços, a geração de pools de transfecção estável foi iniciada por transfecção de quatro pools (1,0 x 10E6 células cada) por lipofecção. Quarenta e oito horas após transfecção, a seleção de transfectantes foi iniciada por adição do antibiótico Zeocin™ em uma concentração de 100 μg/mL. Após todos os quatro pools terem readquirido o crescimento normal, as titulações de proteína recombinante foram avaliadas por cromatografia analítica por afinidade em HPLC anti-APP e o maior pool produtor - Pool 2 - foi selecionado para adaptação ao meio sem soro e posterior aumento de escala. Simultaneamente, experimentos em larga escala de expressão transitória na escala 10-1 também foram realizados usando polietilenimina como veículo de plasmídeo DNA durante transfecção e o sistema de biorreator Wave™ (C20SPS-F, Artigo N° 100.001, Wave Biotech) como sistema de cultura. Os sobrenadantes da cultura de células de 12-22 litros foram coletados 7-10 dias pós- transfecção e concentrados por filtração de fluxo cruzado e diafiltração, antes da purificação.
[00339] SOST humano e de Cynomolgus foram purificados por cromatografia por imunoafinidade. Resumidamente, bateladas de 1020 litros de sobrenadantes de cultura de tecido foram concentradas até 1-2 litros por filtração de fluxo cruzado (valor de corte de 10 kDa) e aplicadas a 2 mL/min em uma coluna de Sefarose anti-APP de 50 mL preparada por acoplamento do monoclonal anti-Ab1-40/APP (6E10- A5) proprietário à Sefarose ativada por CNBr 4B de acordo com as instruções do fabricante (10 mg de anticorpo por mL de resina). Após lavagem basal com PBS, o material ligado foi eluído com 100 mM de glicina, pH 2,7, neutralizado e filtrado de forma estéril. A concentração de proteína foi determinada por A280 usando fatores de absorção computados. As proteínas purificadas foram finalmente caracterizadas por SDS-PAGE, sequenciamento do N-terminal e LC-MS. Uma alíquota de SOST humano purificado foi biotinilada em PBS por 1 hora a 37°C usando 1 mM de sulfo-NHS-lc-biotina (Uptima; UP54398A). O reagente em excesso foi então removido por diálise intensa contra PBS.
SOST humano derivado de E. coli'
[00340] SOST aa24-213 com tag de His6-PreScission (NPL006071, plasmídeo pXI504) e SOST aa24-213 (NPL006690, plasmídeo pXI515) foram produzidos por re-enovelamento. Tuner de E. coli (DE3) foram transformados com um dos plasmídeos.
[00341] A batelada PSU5257 foi fermentada em uma escala de 20 litros (V9405) usando meio TB modificado (versão lab 112). As células foram induzidas em uma OD600 de 3,90 com 1 mM de IPTG e induzidas por 3 horas e 30 minutos a 37°C. A coleta foi realizada usando uma centrífuga de fluxo contínuo, resultando em um pélete de célula líquido pesando 190 g.
[00342] A batelada PSU11274 foi fermentada em uma escala de 20litros em 16 L de meio mínimo M9-1 suplementado com cloreto de amônio marcado com 15N. As células foram induzidas com 1 mM de IPTG uma vez até uma OD600 de 1,5 ter sido alcançada, e coletadas em uma OD600 de 3,3 usando uma centrífuga de fluxo contínuo, resultando em um pélete de célula líquido pesando 50 g.
[00343] Os péletes de célula líquidos da fermentação acima foram lisados em 8 volumes de 50 mM de Tris pH 8,0 (contendo 5 mM de cada um de EDTA, DTT e Benzamidina-HCl) usando um emulsificador de Avestina C-50 e centrifugados por 30 minutos a 12.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o pélete resultante ressuspenso em 10 volumes de tampão de lise e centrifugado novamente. O processo foi repetido mais 3 vezes, quando então o tampão de lise foi substituído com água Milli-Q, contendo 5 mM de DTT. Os péletes foram lavados mais duas vezes sob essas condições. Os corpos de inclusão foram dissolvidos em 8 M de Guanidina-HCl (contendo 100 mM de DTT, 50 mM de Tris pH 8 e 5 mM de EDTA) por 3-4 horas em temperatura ambiente, e depois centrifugados a 20.000 rpm por 30 minutos, filtrados através de um filtro de 0,45 μM. O re-enovelamento foi iniciado por diluição rápida com 88 volumes (PSU11274) e 92 volumes (PSU5257) de tampão de re-enovelamento resfriado (0,5 M de Tris contendo 0,9 M de Arginina-HCl, 5 mM de GSH e 0,5 mM de GSSG pH 8). A solução foi armazenada a 4°C por 1 semana. Nesse estágio, as duas preparações foram tratadas de forma ligeiramente diferente, por causa da necessidade de remover o tag de his6 de PSU5257 antes do término do re-enovelamento.
PSU5257
[00344] A solução de enovelamento diluída foi diafiltrada contra 1,5 volume de 50 mM de Tris pH 8, 5 mM de GSH, 0,5 mM de GSSG por concentração de 2 vezes, e depois se diluindo de volta até o volume original. Isso foi feito 3 vezes, quando então foi adicionada protease PreScission, e a solução deixada por 48 horas a 4°C. Todas as concentrações/diafiltrações foram feitas usando um cassete de ultrafiltração Pellicon II com uma membrana com valor de corte de 10 KDa. Finalmente, a solução foi concentrada 10 vezes.
PSU11274
[00345] A solução de re-enovelamento diluída foi concentrada 10 vezes. LC-MS foi usada para confirmar a formação de todas as 4 pontes dissulfeto, antes da concentração.
[00346] Ambas as preparações foram então dialisadas contra 2 x 10 volumes de 50 mM de acetato de sódio pH 5. Após filtração sucessiva através de uma fibra de vidro e de uma membrana de 3,0 μm para remover proteína precipitada, a purificação foi realizada usando cromatografia de troca catiônica de alto rendimento em SP- Sefarose™. A coluna foi equilibrada com o tampão de diálise e subsequentemente eluída com um gradiente de NaCl de 0 - 1 M no mesmo tampão sobre 20 volumes de coluna. A esclerostina eluiu como um pico único com um ligeiro ressalto, que foi descartado. No caso de PSU5257, o pico principal foi coletado, o concentrado submetido à cromatografia por exclusão de tamanho usando uma coluna de Superdex 75™, equilibrada com 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl. Com PSU11274, a amostra foi fornecida diretamente após a troca catiônica.
[00347] O cDNA de SOST de macaco Cynomolgus (cySOST) foi amplificado por RT-PCR com iniciadores baseados na sequência de SOST do macaco verde africano (N° de Acedsso GenBank AF326742). O iniciador 5’(ATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTTGT) (SEQ ID NO: 170) corresponde ao N-terminal da sequência do peptídeo sinalizador e não está na proteína secretada final; o iniciador 3’ (AATCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAG) (SEQ ID NO: 171) corresponde a uma região que está conservada entre humanos, macaco verde africano e camundongo. O fragmento amplificado foi subclonado nos sítios Bam HI/Eco RI de pcDNA3.1(+), e a sequência foi confirmada. Esse plasmídeo serviu ainda como modelo para uma amplificação por PCR de cyno-SOST para adicionar um tag APP no C- terminal e sítios de recombinação attB para clonagem final em pDESTRS5a de acordo com a tecnologia Gateway [cySOST- pDESTRS5a].
[00348] A expressão foi feita por transfecção transitória em larga escala na escala de 10 litros no sistema de biorreator Wave™, coletada após 9 dias pós-transfecção e purificada como descrito acima.
Exemplo 2: Geração de anticorpos específicos para esclerostina humana pela biblioteca HuCAL GOLD®
[00349] Anticorpos terapêuticos contra a proteína de esclerostina humana foram gerados por seleção de clones que possuem afinidades de ligação elevada, usando como fonte de proteínas variantes de anticorpo uma biblioteca de apresentação em fago disponível comercialmente, a biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®.
[00350] A biblioteca HuCAL GOLD® é uma biblioteca de Fab (Knappik e cols., 2000) na qual todas as seis CDRs são diversificadas por mutação apropriada, e que emprega a tecnologia CysDisplayTM para ligação do Fab à superfície do fago (WO 01/05950, Lohning e cols., 2001).
Seleção por panning de anticorpos específicos para esclerostina da biblioteca
[00351] Para a seleção de anticorpos que reconhecem esclerostina humana, foram aplicadas várias estratégias de panning.
[00352] Em resumo, anticorpo-fagos HuCAL GOLD® foram divididos em três pools que compreendem diferentes genes de VH principais.
[00353] Esses pools foram individualmente submetidos a:
[00354] um panning de fase sólida, em que os antígenos (esclerostina humana e de camundongo) foram revestidos diretamente em placas de microtitulação de 96 poços Maxisorp (Nunc, Wiesbaden, Alemanha) ou
[00355] um panning de captura e de semi-solução, em que o antígeno (esclerostina biotinilada), respectivamente o complexo fago- antígeno, era capturado em fitas transparentes N/A ou
[00356] pannings em solução com esclerostina biotinilada, em que o complexo fago-antígeno era capturado por glóbulos magnéticos de estreptavidina (Dynabeads M-280; Dynal) para cada pool de panning.
- Panning de fase sólida em esclerostina
[00357] Para a primeira rodada do panning em esclerostina, os poços da placa Maxisorp foram revestidos de um dia para o outro com 300 μL (5 μg/mL) de esclerostina humana (produzida em células HEK) diluídos em PBS. Após duas etapas de lavagem com 400 μL de PBS, os poços foram incubados com tampão de bloqueio contendo leite em pó 5% diluído em PBS.
[00358] Antes das seleções, os fagos HuCAL GOLD® foram pré- adsorvidos em tampão de bloqueio (leite em pó 5% / PBS, Tween 20 0,5%) por 2 horas em temperatura ambiente para evitar a seleção inespecífica de anticorpos.
[00359] Após lavagem (2 x 400 μL de PBS) da placa Maxisorp revestida e bloqueada, 300 μL dos fagos pré-adsorvidos foram adicionados aos poços revestidos e incubados por 2 horas em temperatura ambiente, agitando gentilmente. Essa incubação foi seguida por 10 ciclos de lavagem com PBS e PBS / Tween 20 0,05% em temperatura ambiente.
[00360] Os fagos ligados foram eluídos por adição de 300 μL de 20 mM de DTT em 10 mM de Tris / HCl pH 8,0 por poço por 10 minutos em temperatura ambiente. O eluado foi removido e adicionado a 15 mL de células de E. coli TG1F+ desenvolvidas até uma OD600nm de 0,6 - 0,8. A infecção por fago de E. coli foi permitida por 45 minutos a 37°C, sem agitação. Após centrifugação por 5 minutos a 4.120 xg, cada um dos péletes bacterianos foi ressuspenso em 600 μL de meio 2xYT, plaqueado em placas de ágar LB-CG e incubado de um dia para o outro a 30°C. As colônias foram então raspadas das placas, e os fagos foram recuperados e amplificados.
[00361] A segunda e a terceira rodadas de seleção foram realizadas de forma idêntica à primeira rodada de seleção, com a única diferença que as condições de lavagem após ligação de fago foram mais estringentes. Na segunda rodada de seleção, para algumas condições de panning, esclerostina de camundongo foi usada como antígeno a fim de enriquecer quanto aos anticorpos de camundongo que apresentam reação cruzada. Para algumas condições de panning, outra batelada de esclerostina humana recombinante (produzida em E. coli) foi revestida.
- Panning de semi-solução em esclerostina
[00362] Foram realizados dois métodos diferentes para esse tipo de panning: um panning de captura de semi-solução e o procedimento- padrão de panning de semi-solução.
[00363] Em detalhe, para o panning de captura de semi-solução em esclerostina biotinilada, 100 μL do antígeno foram revestidos 2 horas em temperatura ambiente em fitas transparentes de NeutrAvidin (N/A) (de Pierce, nível de ativação de 100 μL, capacidade de ligação de 15 pmol por poço). As fitas de N/A foram bloqueadas de um dia para o outro a 4°C com 200 μL Chemiblock e lavadas duas vezes com PBS.
[00364] A solução de fago bloqueada (Chemiblock / Tween 20 0,05%) foi adicionada aos poços de N/A bloqueados por 30 minutos, e essa etapa foi repetida por mais 30 minutos a fim de remover ligantes de NeutrAvidin. A seguir, os fagos pré-depurados foram transferidos para a esclerostina biotinilada imobilizada em fitas transparentes N/A, selados com uma folha metálica e incubados de um dia para o outro em agitação em temperatura ambiente.
[00365] No dia seguinte, a solução de fago foi removida dos poços revestidos com antígeno e os poços foram lavados.
[00366] Para o panning de semi-solução padronizado, os fagos pré- depurados bloqueados (Chemiblock / Tween 20 0,05%) foramadicionados a um novo tubo de reação pré-bloqueado de 1,5 mL (Chemiblock / Tween 20 0,05%) e depois esclerostina humanabiotinilada foi adicionada até uma concentração final de 100 nM, e incubada de um dia para o outro em agitação em temperatura ambiente.
[00367] No dia seguinte, a solução de fago-antígeno do tubo dereação de 1,5 mL foi adicionada a novos poços bloqueados das fitas de NeutrAvidin, foi permitida a ligação por 30 minutos em temperatura ambiente e depois ele foi lavado.
[00368] Para ambos os procedimentos de panning, os fagos ligados foram eluídos após lavagem por adição de 300 μL de 20 mM de DTT em 10 mM de Tris/ HCl pH 8,0 por poço por 10 minutos em temperatura ambiente. O eluado foi removido e adicionado a 15 ml de células de E. coli TG1 desenvolvidas até uma OD600nm de 0,6-0,8. A infecção por fago de E. coli foi permitida por 45 minutos a 37°C, sem agitação. Após centrifugação por 5 minutos a 4.120 x g, cada um dos péletes bacterianos foi ressuspenso em 600 μL de meio 2xYT, plaqueado em placas de ágar LB-CG e incubado de um dia para o outro a 30°C. As colônias foram então raspadas das placas, e os fagos foram recuperados e amplificados.
[00369] A segunda e a terceira rodadas de seleção foram realizadas de forma idêntica à primeira rodada de seleção, com a única diferença que as condições de lavagem após ligação de fago foram mais estringentes.
- Panning de solução em esclerostina
[00370] Para esse tipo de panning, 200 μL de glóbulos magnéticos de estreptavidina (Dynabeads M-280; Dynal) foram lavados uma vez com PBS e bloqueados com Chemiblock por 2 horas em temperatura ambiente. Quinhentos μL de fagos foram bloqueados com Chemiblock por 1 hora em rotação em temperatura ambiente. Os fagos bloqueados foram pré-adsorvidos duas vezes contra 50 μL de glóbulos magnéticos de estreptavidina bloqueados por 30 min. O sobrenadante do fago foi transferido para um novo tubo de reação de 2 mL bloqueado, e diferentes concentrações de esclerostina humana biotinilada foram adicionadas (veja as Tabelas 5, 6 e 7) e incubadas por 1 hora em rotação em temperatura ambiente. Cem μL dos glóbulos magnéticos de estreptavidina bloqueados foram adicionados a cada pool de panning, e incubados por 10 minutos em um agitador. Os glóbulos foram coletados com um separador de partícula (Dynal MPC-E) por aproximadamente 2,5 minutos, e a solução foi removida cuidadosamente.
[00371] Após os ciclos de lavagem (Tabela 2), fagos ligados foram eluídos por adição de 300 μL de 20 mM de DTT em 10 mM de Tris / HCl pH 8,0 por poço por 10 minutos em temperatura ambiente. O eluado foi removido e adicionado a 15 ml de células de E. coli TG1F+ desenvolvidas até uma OD600nm de 0,6 - 0,8. A infecção por fago de E. coli foi permitida por 45 minutos a 37°C, sem agitação. Após centrifugação por 5 minutos a 4.120 x g, cada um dos péletes bacterianos foi ressuspenso em 600 μL de meio 2xYT, plaqueado em placas de ágar LB-CG e incubado de um dia para o outro a 30°C. As colônias foram então raspadas das placas, e os fagos foram recuperados e amplificados.
[00372] A segunda e a terceira rodadas de seleção foram realizadas de forma idêntica à primeira rodada, com a única diferença que as condições de lavagem após ligação de fago foram mais estringentes. Na segunda e terceira rodadas de seleção, para algumas condições de panning, a concentração de antígeno foi reduzida.
Subclonagem e expressão de fragmentos Fab selecionados Microexpressão de fragmentos Fab selecionados
[00373] Para facilitar a expressão rápida de Fabs solúveis, os insertos que codificam Fab dos fagos HuCAL GOLD® selecionados foram subclonados por meio de XbaI e EcoRI a partir do respectivo vetor de apresentação no vetor de expressão de E. coli pMORPH®X9_MH (Rauchenberger e cols., 2003). Após transformação dos plasmídeos de expressão em células de E. coli TG1 F-, clones únicos resistentes ao cloranfenicol foram escolhidos nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços estéril pré- preenchida com 100 μL de meio 2xYT-CG e desenvolvidos de um dia para o outro a 37°C. Cinco μL de cada cultura de E. coli TG-1 foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços estéril, fresca, pré-preenchida com 100 μL de meio 2xYT suplementado com 34 μg/mL de cloranfenicol e glicose 0,1% por poço. As placas de microtitulação foram incubadas a 30°C com agitação a 400 rpm em uma agitadora de microplacas até que as culturas estivessem ligeiramente turvas (aproximadamente 2-4 horas) com uma OD600nm de aproximadamente 0,5. A essas placas de expressão, 20 μL de meio 2xYT suplementado com 34 μg/mL de cloranfenicol e 3 mM de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo) foram adicionados por poço (concentração final: 0,5 mM de IPTG), as placas de microtitulação foram seladas com uma fita gás-permeável, e incubadas de um dia para o outro a 30°C com agitação a 400 rpm.
[00374] Geração de lisados de células inteiras (extratos BEL): a cada poço das placas de expressão, 40 μL de tampão de BEL foram adicionados e incubados por 1 hora a 22°C em uma agitadora de placa de microtitulação (400 rpm).
Expressão e purificação de anticorpos HuCAL®-Fab em E. coli'
[00375] A expressão de fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_MH em células de E. coli TG1 F- em escala maior foi realizada em culturas de frascos em agitação usando 750 mL de meio 2xYT suplementado com 34 μg/mL de cloranfenicol. As culturas foram agitadas a 30°C até que a OD600nm alcançasse 0,5. A expressão de Fab foi induzida por adição de 0,75 mM de IPTG (isopropil-β-D- tiogalactopiranosídeo) e cultivo por mais 20 horas a 30°C. As células foram coletadas e rompidas usando lisozima, e os fragmentos Fab foram isolados em cromatografia com Ni-NTA. Os pesos moleculares aparentes foram determinados por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) com padrões de calibração. As concentrações foram determinadas por espectrofotometria UV (Krebs e cols., 2001).
Exemplo 2: Identificação de anticorpos HuCAL® específicos para esclerostina Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) para detecção de Fabs de ligação de esclerostina em esclerostina revestida diretamente
[00376] Placas de 384 poços Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, EUA) foram revestidas com 20 μL de 2,5 μg/mL de antígeno (esclerostina humana - produzida em células HEK, esclerostina humana - produzida em células de E. coli e esclerostina de camundongo) em PBS, pH 7,4 de um dia para o outro a 4°C.
[00377] As placas foram bloqueadas com PBS/Tween 20 0,05% (PBST) contendo leite em pó 5% por 1 hora em temperatura ambiente. Após lavagem dos poços com PBST, extrato de BEL, Fabs HuCAL GOLD® purificados ou Fabs de controle diluídos em PBS foram adicionados aos poços e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. Para detectar os anticorpos primários, os seguintes anticorpos secundários foram aplicados: fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado à fosfatase alcalina (AP), IgG de cabra anti-humana, anti- camundongo (Jackson ImmunoResearch). Para a detecção de conjugados de AP, foram usados substratos fluorogênicos como, por exemplo, AttoPhos (Roche), de acordo com as instruções do fabricante. Entre todas as etapas de incubação, os poços das placas de microtitulação foram lavados com PBST três vezes e cinco vezes após a incubação final com o anticorpo secundário. A fluorescência foi medida em uma leitora de placas TECAN Spectrafluor.
Avaliação da captura com esclerostina biotinilada
[00378] Esse tipo de ELISA foi usado para avaliar Fabs HuCAL GOLD® após a realização de pannings de solução.
[00379] Placas de 384 poços Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, EUA) foram revestidas com 20 μL de 5 μg/mL IgG de carneiro anti-humana, específica para fragmento Fd ("The Binding Site", Birmingham, Reino Unido), diluída em PBS, pH 7,4.
[00380] Após bloqueio com BSA 3% em TBS, Tween 20 0,05% por 2 horas em temperatura ambiente, extratos periplasmáticos ou Fabs HuCAL GOLD® purificados foram adicionados e incubados 1 hora em temperatura ambiente. Após lavagem das placas cinco vezes com PBST, 20 μL de esclerostina biotinilada para ligação específica ou transferrina biotinilada para ligação não específica foram adicionados aos poços.
[00381] Subsequentemente, foi permitido que o antígeno de esclerostina biotinilada se ligasse aos fragmentos Fab HuCAL® capturados e, após lavagem, incubados com estreptavidina (Zymex) conjugada à fosfatase alcalina. Para a detecção de AP-estreptavidina, foram usados substratos fluorogênicos como, por exemplo, AttoPhos (Roche), de acordo com as instruções do fabricante (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). A emissão de fluorescência a 535 nm foi registrada com excitação a 430 nm.
Resultados:
[00382] Após os pannings, os pools de fagos enriquecidos foram subclonados pelo vetor da biblioteca pMORPH®23 (que permite uma apresentação eficiente de anticorpo na superfície do fago) no vetor de expressão pMORPH®X9_Fab_MH, que media a expressão periplasmática de Fabs solúveis. Os clones únicos foram retirados e os Fabs solúveis foram expressos por esses clones únicos. No total, aproximadamente 4.600 clones foram analisados em uma avaliação primária que foi realizada por ligação dos Fabs diretamente dos lisados bacterianos à esclerostina humana e de camundongo imobilizada em placas de microtitulação Maxisorp ou por captura de Fabs por meio de anticorpo anti-Fd às placas de microtitulação Maxisorp, seguida por ligação de esclerostina humana biotinilada. A detecção foi realizada em ELISA após marcação com um anticorpo anti-(Fab)’2 humano marcado com fosfatase alcalina ou com o uso de estreptavidina-fosfatase alcalina.
[00383] Os hits obtidos pela avaliação primária em esclerostina recombinante com sinais > 5 vezes em relação ao nível de base foram ainda analisados quanto à ligação à esclerostina humana de HEK e E. coli e à esclerostina de camundongo, tanto revestida diretamente quanto em solução usando esclerostina biotinilada. Os hits que reconhecem todos os derivados de esclerostina foram selecionados e sequenciados.
Caracterização de Fabs HuCAL GOLD® Determinação de afinidade com o uso de Biacore
[00384] A fim de caracterizar ainda mais os anticorpos anti- esclerostina, a afinidade à esclerostina humana, de camundongo e de Cynomolgus foi determinada. A proteína de esclerostina recombinante foi imobilizada em um chip CM5 Biacore e os Fabs foram aplicados na fase móvel em diferentes concentrações. Para uma determinação confiável de afinidades monovalentes, foram usados para as medidas de Biacore apenas lotes desses Fab que apresentassem > 90% de fração monomérica e uma cromatografia por exclusão de tamanho qualitativa.
[00385] As afinidades para esclerostina recombinante humana, de Cynomolgus e camundongo foram determinadas em Biacore. As afinidades variam de uma faixa subnanomolar a mais de 500 nM na esclerostina humana, até quase 5000 nM na esclerostina de Cynomolgus e até 4,500 nM na esclerostina de camundongo.
Exemplo 3: Identificação de candidatos de Fab anti-esclerostina humana que inibem a ligação de esclerostina à BMP-2 imobilizada com o uso do dispositivo BioVerisTM
[00386] Todos os Fabs gerados e purificados foram testados no ensaio de potência de inibição da ligação baseado em BioVeris quanto à sua habilidade para inibir a ligação de esclerostina à BMP-2 humana recombinante. Duas condições de estringência diferentes (Tween 20 0,1% versus 1% no sistema tampão) foram testadas. Nove de vinte e sete Fabs foram capazes de inibir a ligação de esclerostina à BMP-2 imobilizada sob condições estringentes de tampão.
Exemplo 4: Reversão da inibição de esclerostina da Produção de ALP induzida por BMP-2 em células MC3T3. Conversões de IgG de ligantes parentais e caracterização de IgG
[00387] Vinte e um candidatos foram convertidos em um formato de IgG1 humana por subclonagem no vetor de expressão pMORPH®_h_IgG1 e nas construções de cadeia leve correspondentes da série de vetor pMORPH®_h_Ig, respectivamente. A expressão foi realizada por transfecção transitória de células HEK293 ou HKB11 e as imunoglobulinas de comprimento total foram purificadas do sobrenadante da cultura de células. A funcionalidade de IgG1s após purificação foi avaliada por ligação de ELISA à esclerostina humana, de camundongo e de Cynomolgus imobilizada. IgGs em bioensaio primário
[00388] Todas as hIgGs purificadas foram tituladas e testadas noensaio de ALP. O ensaio era confiável com relação à inibição de esclerostina por BMP-2, mas os candidatos selecionados podem não mostrar inibição de esclerostina em todos os experimentos (variação da atividade de ensaio para ensaio, variação de placa para placa, alta variância dentro de poços em triplicata). Portanto, foi possível apenas uma classificação da atividade das IgGs.
Exemplo 5: Maturação da afinidade de Fabs anti-esclerostina selecionados por troca em paralelo de cassetes de LCDR3 e HCDR2
[00389] Os resultados dos testes das IgGs no ensaio de ALP permitiram apenas uma classificação. Por essa classificação, 4 Fabs foram selecionados em um risco elevado para maturação da afinidade. Todos os candidatos foram selecionados para serem otimizados como candidatos principais únicos em L-CDR3 e H-CDR2.
[00390] Para aumentar a afinidade e a atividade biológica dos quatro fragmentos de anticorpo selecionados, as regiões LCDR3 e HCDR2 foram otimizadas em paralelo por mutagênese do cassete usando mutagênese dirigida (Virnekas e cols., 1994), em que asregiões framework foram mantidas constantes. Antes da clonagem das bibliotecas de maturação, todos os fragmentos Fab parentais foram transferidos do vetor de expressão pMORPH®x9_MH no vetor de maturação CysDisplay™ pMORPH®25 por meio dos sítios de restrição XbaI / EcoRI. Esse vetor fornece a proteína de fago pIII fundida no N- terminal a um resíduo de cisteína, bem como uma cisteína do C- terminal fundida à cadeia Fd do anticorpo e, dessa forma, permite a apresentação ligada ao dissulfeto dos respectivos fragmentos Fab na superfície do fago.
[00391] Para a geração das bibliotecas de HCDR2, a região HCDR2 de cada Fab parental foi removida e substituída por uma vedação de 590 bp. Essa vedação de DNA facilita a separação de bandas do vetor de digestão única de bandas do vetor com digestão dupla e reduz o nível de fundo dos Fabs parentais de afinidade elevada durante os pannings de maturação. Em uma etapa subsequente, a vedação era removida dos plasmídeos que codificam o Fab de cada clone parental e substituída pelo cassete de maturação de HCDR2 altamente diversificado.
[00392] Em paralelo, a região LCDR3 de cinco dos quatro clones parentais foi substituída por um cassete de maturação de LCDR3 diversificado, sem clonagem intermediária de uma vedação.
[00393] Os tamanhos das bibliotecas de maturação variaram entre 1 x 107 e 4 x 108 clones com um nível de clonagem de fundo abaixo de 1%, e controle de qualidade por sequenciamento revelou uma boa qualidade de cada biblioteca. Apenas a biblioteca de LCDR3 do clone parental MOR04520 teve um tamanho reduzido (< 106) e muitos clones incorretos e, portanto, não foi incluída nos pannings de maturação.
[00394] Para cada biblioteca de maturação de LCDR3 e HCDR2, foram preparados fagos de apresentação de anticorpo, e as titulações de fago determinadas por titulação de spot.
Estratégias de panning para maturação de afinidade
[00395] Os fagos de apresentação de anticorpo das seguintes bibliotecas de maturação foram submetidos a pannings e avaliações separadas:
[00396] Líder 1: MOR04518 (maturação de L-CDR3)
[00397] Líder 1: MOR04518 (maturação de H-CDR2)
[00398] Líder 2: MOR04520 (maturação de H-CDR2)
[00399] Líder 3: MOR04532 (maturação de L-CDR3)
[00400] Líder 3: MOR04532 (maturação de H-CDR2)
[00401] Líder 4: MOR04799 (maturação de L-CDR3)
[00402] Líder 4: MOR04799 (maturação de H-CDR2)
[00403] Para cada biblioteca-líder, foram realizados três pannings diferentes. Para cada estratégia de panning, foram aplicadas diferentes condições de estringência. Para aumentar a estringência do panning e para selecionar off-rates aprimoradas, foi realizada intensa lavagem e competição com Fab parental purificado ou com esclerostina recombinante solúvel. Após os pannings de maturação, os pools enriquecidos em fagomídeo foram subclonados no vetor de expressão pMORPH®x9_MH. Cerca de 2.900 clones únicos foram escolhidos e os Fabs expressos por indução com IPTG.
Classificação e avaliação da afinidade por BioVerisTM quanto às afinidades aumentadas
[00404] Para identificação de Fabs específicos para esclerostina com afinidade aumentada, os lisados bacterianos de aproximadamente 2.900 clones únicos foram diluídos e verificados quando à ligação de Fab à esclerostina humana biotinilada imobilizada em glóbulos revestidos com estreptavidina. A ligação foi analisada com uma Workstation BioVeris. Aqueles clones que geram os maiores sinais indicam afinidade aumentada e, portanto, foram escolhidos para análise posterior por titulação de equilíbrio de solução.
[00405] Para essa finalidade, 176 clones únicos foram selecionados e as afinidades preliminares foram determinadas por meio da titulação de equilíbrio de solução (SET) de 4 pontos em BioVeris. A partir desses dados, 24 clones que apresentam as melhores afinidades foram selecionados. Esses Fabs foram purificados na escala de mg.
[00406] As afinidades finais foram determinadas usando uma medida por SET de 8 pontos e esclerostina humana, de camundongo e de Cynomolgus.
Fabs otimizados em bioensaio primário
[00407] Os Fabs otimizados foram testados no ensaio celular de ALP. A maioria deles era inativa; e a reversão variável da inibição de esclerostina foi observada com alguns Fabs. Portanto, uma seleção de clones foi convertida no formato de IgG2a humana/de camundongo e testada no mesmo ensaio, mas esses clones no formato de IgG2a humana/de camundongo não puderam reverter totalmente a inibição de esclerostina e o critério desejado da EC50 (< 10 nM) não pode ser atingido. O melhor candidato maturado, MOR05177 (VL maturada de MOR04518 parental), mostrou a 50 nM de Fab ou a 140 - 467 nM de IgG2a humana/de camundongo 75-85% de restauração do sinal de ALP.
Exemplo 6: Identificação de anticorpos anti-esclerostina por Fabs parentais e otimizados e IgGs em um novo bioensaio primário
[00408] Com base em novas publicações (Wu e cols. JBC 2005, He e cols. JBC 2005, Bezooyen e cols. ASBMR 2005, Winkler e cols. JBC 2005), que mostram que a esclerostina tem um impacto sobre a sinalização Wnt direta ou indiretamente, um novo bioensaio funcional foi desenvolvido.
[00409] Esse ensaio é baseado na habilidade da esclerostina para inibir a ativação de STF mediada por Wnt1 em células HEK293.
[00410] Nesse ensaio, foram testados todos os Fabs identificados nas avaliações iniciais mais todos os Fabs identificados na maturação da afinidade. Tornou-se óbvio que a afinidade aumentada de Fabs maturados se refletia na potência e eficácia aumentadas no ensaio de wnt-1.
[00411] O teste de todos os Fabs parentais identificou doisanticorpos adicionais como modelos promissores em placas para uma maturação da afinidade adicional. A figura 1 mostra a atividade de MOR05813_IgG2 lambda, um dos anticorpos mais potentes identificados no ensaio de wnt-1.
Exemplo 7: Caracterização de Fabs parentais e maturados por afinidade em outros bioensaios Atividade de Fabs parentais e maturados por afinidade no ensaio de mineralização
[00412] O ensaio de mineralização se baseia na habilidade de células MC3T3 para formar uma matriz mineralizada, o que indica sua capacidade para passar por diferenciação osteogênica. Uma forte mineralização (> 1 μg de cálcio depositado por poço (do formato de 96 poços)) foi medida após 14 dias em todas as concentrações de BMP-2 testadas. A adição de concentrações crescentes de esclerostina induziu uma inibição dose-dependente da mineralização induzida por BMP-2 (2,1 nM) (IC50: 120 nM) (dados não mostrados).
[00413] A figura 2 mostra um exemplo de mineralização na presença de MOR05813_Fab. O anticorpo podia restaurar a mineralização induzida por BMP-2 ao máximo de 80% da resposta inicial, enquanto um Fab anti-lisozima usado como controle negativo não teve nenhum efeito.
Atividade de Fabs parentais e maturados por afinidade em ELISA de LRP6 / esclerostina
[00414] O ELISA de LRP6 / esclerostina se baseia na habilidade de esclerostina para se ligar à LRP6. Para caracterizar ainda mais os Fabs produzidos, uma seleção de Fabs e IgGs foi testada nesse ensaio. Na presença de um anticorpo anti-esclerostina de R&D (1.000 ng/ml = aproximadamente 7 nM), a ligação de esclerostina (0,9 nM) à LRP6 foi inibida por 68% comparada com o controle (dados não mostrados).
[00415] MOR05813_IgG2 lambda inibiu a ligação de esclerostina àLRP6 até 90% a 90 nM, enquanto uma IgG anti-lisozima usada como controle negativo não teve nenhum efeito sobre a ligação de esclerostina à LRP6 (figura 3).
Atividade de Fabs parentais e maturados por afinidade no ensaio de fosfo-Smad1
[00416] O ensaio de fosfo-Smad1 (Western) se baseia na habilidade de BMP-6 para induzir a fosforilação de Smad1 em até 15 minutos em células MC3T3-E1. MOR05318_IgG2 lambda inibiu a ação da esclerostina sobre a fosforilação de Smad1 induzida por BMP-6 com uma EC50 de 115 nM e restaurou a fosforilação de Smad1 ao máximo de 66% da fosforilação induzida por BMP-6. A IgG anti- lisozima de controle negativo (IgG C) não teve nenhum efeito (figura 4).
Exemplo 8: Efeito de LRP4, um novo parceiro de interação com SOST, sobre a atividade do anticorpo anti-SOST
[00417] Com exceção do siRNA de LRP4, o knockdown para o mRNA de LRP4 não afetou a atividade de STF na ausência de SOST. No entanto, ele reduziu a habilidade de SOST para inibir a atividade de STF, entre 10 e 30%. Isso era verdadeiro para todos os cinco siRNA testados isoladamente (figura 5A) ou em diferentes combinações (dados não mostrados). Com a superexpressão, LRP4 diminuiu a IC50 de SOST por 5 e 16 vezes no ensaio de HEK e c28a2 supertopflash, respectivamente (figura 5B e C). Esse efeito era específico, no sentido de que a LRP4 superexpressa não teve nenhum efeito sobre a IC50 de DKK1. O knockdown de LRP4 (siRNA) diminuiu a ação inibidora de SOST na STF induzida por Wnt-1, enquanto não diminuiu a ação inibidora de DKK1 (figura 5D). Por sua vez, LRP4 diminuiu a ação do anticorpo anti-SOST ao aumentar a EC50 de MOR05813_IgG2a de 17,2 nM para 30 nM (figura 5E). Esses dados sugerem que LRP4 é um facilitador da ação de SOST.
Exemplo 9: Nova maturação
[00418] Para aumentar a afinidade e a atividade biológica de dois fragmentos de anticorpo recém selecionados com base nos resultados obtidos pelo bioensaios, as regiões LCDR3 e HCDR2 foram otimizadas em paralelo por mutagênese de cassete com o uso de mutagênese dirigida (Virnekas e cols., 1994), em que as regiões framework foram mantidas constantes. Antes da clonagem das bibliotecas de maturação, todos os fragmentos Fab parentais foram transferidos do vetor de expressão pMORPH®X9_MH no vetor de maturação CysDisplay™ pMORPH®25 por meio dos sítios de restrição XbaI/ EcoRI. Esse vetor fornece a proteína de fago pIII fundida ao N- terminal a um resíduo de cisteína, bem como uma cisteína do C- terminal fundida à cadeia Fd do anticorpo e, dessa forma, permite a apresentação em dissulfeto dos respectivos fragmentos Fab na superfície do fago.
[00419] Para a geração das bibliotecas de HCDR2, a região HCDR2 de cada Fab parental foi removida e substituída por uma vedação de 590 bp. Essa vedação de DNA facilita a separação de bandas do vetor de digestão única de bandas do vetor com digestão dupla e reduz o nível de fundo dos Fabs parentais de afinidade elevada durante os pannings de maturação. Em uma etapa subsequente, a vedação foi removida dos plasmídeos que codificam os Fab de cada clone parental e substituída pelo cassete de maturação de HCDR2 altamente diversificado.
[00420] Em paralelo, a região LCDR3 de cinco dos quatro clones parentais foi substituída por um cassete de maturação de LCDR3 diversificado, sem clonagem intermediária de uma vedação.
[00421] Os tamanhos das bibliotecas de maturação variaram entre 2 x 107 e 2 x 108 clones com um nível de clonagem de fundo abaixo de 1%, e o controle de qualidade por sequenciamento revelou uma boa qualidade de cada biblioteca. Para cada biblioteca de maturação de LCDR3 e HCDR2, foram preparados fagos de apresentação de anticorpo, e as titulações de fago determinadas por titulação de spot. Estratégias de panning para maturação de afinidade adicional
[00422] Os fagos de apresentação de anticorpo das seguintes bibliotecas de maturação foram submetidos a pannings e avaliações separadas:
[00423] Líder 1: MOR04525 (maturação de L-CDR3)
[00424] Líder 1: MOR04525 (maturação de H-CDR2)
[00425] Líder 2: MOR04529 (maturação de L-CDR3)
[00426] Líder 2: MOR04529 (maturação de H-CDR2)
[00427] Para cada biblioteca-líder ou pool, foram realizados três pannings diferentes, e para cada estratégia de panning foram aplicadas diferentes condições de estringência. Para aumentar a estringência do panning e para selecionar off-rates aprimoradas, foi realizada a competição com proteína de esclerostina recombinante solúvel durante períodos prolongados de incubação e de lavagem.
[00428] Após os pannings, os pools enriquecidos em fagomídeos foram subclonados no vetor de expressão pMORPH®X9_MH. Cerca de 1.600 clones únicos foram escolhidos e os Fabs expressos por indução com IPTG.
[00429] O critério de afinidade de mais de 100 pM para esclerostina humana foi satisfeito para derivados de ambos os Fabs parentais. A reatividade cruzada necessária com esclerostina de Cynomolgus e com esclerostina de camundongo de mais de 500 pM foi satisfeita para derivados de ambos os Fabs parentais. MOR04525 gerou mais clones que possuem afinidades maiores para todas as três espécies.
Exemplo 10: Caracterização de anticorpos anti-esclerostina em estudos in vivo
[00430] Fêmeas de camundongos com oito meses de idade (n = 16 / grupo, Charles River, França) receberam a administração duas vezes por semana por via intravenosa de anticorpo anti-esclerostina MOR05813 (24,5 mg/kg, mIgG2a) ou anticorpo de controle de isótipo (anti-PC-mIgG2a). Os grupos de controle receberam diariamente por via subcutânea 100 microgramas/kg de PTH(1-34) ou veículo (PBS + BSA 0,1%). O tratamento durou 2,5 semanas para todos os animais. Metade dos animais (n = 8 / grupo) foi sacrificada naquele ponto do tempo para análise histomorfométrica. Esses animais receberam marcadores de fluorócromo 10 e 3 dias antes da necropsia para avaliação histomorfométrica da dinâmica da formação óssea. O tratamento continuou para o restante dos animais (n = 8 / grupo) até 5 semanas.
[00431] Os animais foram monitorados quanto às alterações na massa óssea, densidade e geometria. A tomografia computadorizada quantitativa periférica [pQCT] in vivo demonstrou que MOR05177 é um forte anabólico ósseo na tíbia proximal de camundongos idosos, aumentando o teor mineral ósseo (figura 6) e a densidade óssea (figura 7). O efeito anabólico ósseo ocorreu tanto no compartimento ósseo cortical (figura 8) quanto no esponjoso (figura 9). Esses dados sugerem que o efeito inibidor de MOR05813 observado sobre a ação da esclerostina no ensaio repórter da sinalização Wnt em células não osteoblásticas se traduz em indução de respostas de formação óssea em consequência da inibição de esclerostina in vivo. A magnitude da resposta anabólica óssea em camundongos foi comparável ao anabolismo ósseo induzido por uma dose elevada de hPTH(1-34).
[00432] A análise por MicroCT demonstrou aumentos do volume ósseo trabecular (figura 9), principalmente relacionado a um espessamento de estruturas ósseas trabeculares, consistente com anabolismo ósseo (figura 10).
[00433] A densidade mineral óssea aumentou ainda mais em animais que foram tratados por até 5 semanas (figura 11). A densidade mineral óssea, como avaliada ex vivo por DEXA, estava aumentada no esqueleto apendicular (tíbia, fêmur) e axial (vértebras lombares) (figura 12 - 14). O efeito era comparável àquele medido no grupo de controle positivo tratado diariamente com 100 microgramas/kg de hPTH(1-34).
[00434] Análises baseadas no marcador histomorfométrico de fluorócromo da dinâmica de formação óssea demonstraram que o ganho de massa óssea era causado por um aumento substancial nas taxas de formação óssea no esqueleto apendicular (figura 15) e axial (figura 18). Os efeitos eram comparáveis àqueles de uma dose elevada de PTH(1-34). Os aumentos das taxas de formação óssea estavam relacionados aos aumentos das taxas de aposição mineral (figura 16) e da superfície de mineralização (figura 17). A reabsorção óssea não era aumentada pelo tratamento, como demonstrado pela medida da superfície de osteoclastos (figura 19).
Exemplo 11: Avaliação de anticorpos que bloqueiam de forma cruzada os anticorpos de ligação de esclerostina da presente invenção Ensaio de bloqueio cruzado Biacore
[00435] A seguir será descrito de forma geral um ensaio Biacore adequado para determinar se um anticorpo ou outro agente de ligação bloqueia de forma cruzada ou é capaz de bloquear de forma cruzada os anticorpos de acordo com a invenção. Será observado que o ensaio pode ser usado com qualquer um dos agentes de ligação de esclerostina aqui descritos.
[00436] A máquina Biacore (por exemplo, BIAcore 3000) é operada de acordo com as recomendações do fabricante.
[00437] A esclerostina pode ser acoplada, por exemplo, a um chip Biacore CM5, como usado rotineiramente na química de acoplamento de amina, por exemplo, acoplamento de amina de EDC-NHS, para criar uma superfície revestida com esclerostina. A fim de se obter níveis de ligação mensuráveis, tipicamente 200-800 unidades de ressonância de esclerostina podem ser acopladas ao chip (essa quantidade gera níveis de ligação mensuráveis e é, ao mesmo tempo, rapidamente saturável pelas concentrações do reagente de teste usado).
[00438] Uma forma alternativa de anexar esclerostina ao chip BIAcore é a utilização de uma versão "marcada" de esclerostina, por exemplo, esclerostina com tag de His no N-terminal ou C-terminal. Nesse formato, um anticorpo anti-His seria acoplado ao chip Biacore e depois a esclerostina com tag de His passaria sobre a superfície do chip e seria capturada pelo anticorpo anti-His.
[00439] Os dois anticorpos a serem avaliados quanto è sua habilidade para bloquear de forma cruzada um ao outro são misturados em uma quantidade estequiométrica, por exemplo, em uma proporção molar de um para um, de sítios de ligação em um tampão adequado para criar a mistura de teste. O tampão usado é tipicamente um tampão que é normalmente usado na química de proteína como, por exemplo, PBS (136 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1,76 mM de KH2PO4, pH 7,4). Quando se calcula as concentrações com base no sítio de ligação, presume-se que o peso molecular de um anticorpo seja o peso molecular total do anticorpo dividido pelo número de sítios de ligação-alvo (ou seja, esclerostina) naquele anticorpo.
[00440] A concentração de cada anticorpo na mistura de teste deve ser suficientemente elevada para assegurar a saturação dos sítios de ligação para aquele anticorpo nas moléculas de esclerostina que estão ligadas no chip BIAcore. Os anticorpos na mistura estão na mesma concentração molar (com base na ligação) e essa concentração tipicamente seria entre 1,0 mM e 1,5 mM (com base no sítio de ligação).
[00441] Também são preparadas soluções separadas contendo os anticorpos separados. O tampão usado para essas soluções separadas deve ser o mesmo tampão e na mesma concentração que foi usado para a mistura de teste.
[00442] A mistura de teste é passada sobre o chip BIAcorerevestido com esclerostina e a ligação registrada. A seguir, os anticorpos ligados são removidos por tratamento do chip com, por exemplo, um ácido, por exemplo, 30 mM de HCl por cerca de 1 minuto. É importante que as moléculas de esclerostina que estão ligadas ao chip não sejam danificadas.
[00443] A solução do primeiro anticorpo isoladamente é então passada sobre a superfície revestida com esclerostina e a ligação é registrada. A seguir, o chip é tratado para remover todo o anticorpo ligado, sem danificar a esclerostina ligada ao chip, por exemplo, como tratamento com ácido mencionado acima.
[00444] A solução do segundo anticorpo isoladamente é então passada sobre a superfície revestida com esclerostina e a quantidade de ligação registrada.
[00445] A ligação teórica máxima pode ser definida como a soma da ligação à esclerostina de cada anticorpo separadamente. Esse valor é então comparado com a real ligação da mistura de anticorpos medida. Caso a real ligação seja mais baixa do que a da ligação teórica, os dois anticorpos apresentam bloqueio cruzado entre eles.
ENSAIO DE BLOQUEIO CRUZADO BASEADO EM ELISA
[00446] O bloqueio cruzado de um anticorpo anti-esclerostina ou de outro agente de ligação de esclerostina também pode ser detectado pela utilização de um ensaio ELISA.
[00447] O princípio geral do ensaio ELISA envolve o revestimento de um anticorpo anti-esclerostina sobre poços de uma placa de ELISA. Uma quantidade em excesso de um segundo anticorpo anti- esclerostina, potencialmente apresentando bloqueio cruzado, é então adicionada em solução (ou seja, não ligado à placa de ELISA). Uma quantidade de esclerostina limitada é então adicionada aos poços.
[00448] O anticorpo que foi revestido nos poços e o anticorpo em solução competirão pela ligação do número limitado de moléculas de esclerostina. A placa é então lavada para remover a esclerostina que não se ligou ao anticorpo revestido e para também remover o segundo anticorpo, em fase de solução, bem como quaisquer complexos formados entre o segundo anticorpo, em fase de solução, e esclerostina. A quantidade de esclerostina ligada é então medida usando um reagente de detecção de esclerostina apropriado. Um anticorpo em solução que é capaz de bloquear de forma cruzada o anticorpo revestido será capaz de causar uma diminuição no número de moléculas de esclerostina às quais o anticorpo revestido pode se ligar em relação ao número de moléculas de esclerostina às quais o anticorpo revestido pode se ligar na ausência do segundo anticorpo, em fase de solução.
[00449] Esse ensaio é descrito com mais detalhes abaixo para dois anticorpos denominados Ab-X e Ab-Y. Quando Ab-X é escolhido para ser o anticorpo imobilizado, ele é revestido nos poços da placa de ELISA, e depois as placas são bloqueadas com uma solução de bloqueio adequada para minimizar a ligação não específica de reagentes que são subsequentemente adicionados. Uma quantidade em excesso de Ab-é então adicionada à placa de ELISA, de tal forma que os moles de sítios de ligação de esclerostina de Ab-Y por poço sejam pelo menos 10 vezes maiores do que os moles dos sítios de ligação de esclerostina de Ab-X que foram usados, por poço, durante o revestimento da placa de ELISA. A esclerostina é então adicionada, de tal forma que os moles de esclerostina adicionados por poço sejam pelo menos 25 vezes mais baixos do que os moles de sítios de ligação de esclerostina de Ab-X que foram usados para o revestimento de cada poço. Após um período de incubação adequado, a placa de ELISA é lavada e o reagente de detecção de esclerostina é adicionado para medir a quantidade de esclerostina especificamente ligada pelo anticorpo anti-esclerostina revestido (nesse caso, Ab-X). O sinal basal para o ensaio é definido como o sinal obtido nos poços com o anticorpo revestido (nesse caso, Ab-X), o segundo anticorpo de fase em solução (nesse caso, Ab-Y), apenas tampão de esclerostina (ou seja, sem esclerostina) e reagentes de detecção de esclerostina. O sinal do controle positivo para o ensaio é definido como o sinal obtido nos poços com o anticorpo revestido (nesse caso, Ab-X), apenas tampão do segundo anticorpo de fase em solução (ou seja, sem segundo anticorpo de fase em solução), esclerostina e reagentes de detecção de esclerostina. O ensaio ELISA precisa ser executado de tal forma que o sinal do controle positivo seja pelo menos 6 vezes o sinal basal.
[00450] Para evitar qualquer artefato (por exemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X e Ab-Y por esclerostina) resultante da escolha de qual anticorpo usar como o anticorpo de revestimento e qual usar como o segundo anticorpo (competidor), o ensaio de bloqueio cruzado precisa ser executado em dois formatos: 1) formato 1, em que Ab-X é o anticorpo que é revestido na placa de ELISA e Ab-Y é o anticorpo competidor que está em solução e 2) formato 2, em que Ab-Y é o anticorpo que é revestido na placa de ELISA e Ab-X é o anticorpo competidor que está em solução.
Exemplo 12: ELISA para detectar o efeito de MOR05813_IgG2lambda sobre a ligação por SOST de LRP6 ELISA DE LRP6 / ESCLEROSTINA
[00451] Noventa placas de microtitulação de 6 poços não tratadas foram revestidas com 100 μL/poço de LRP6/Fc (1 μg/mL, R&D Systems, N° de Catálogo: 1505-LR) diluídos em PBS. Como controle para a ligação não específica (NSB), alguns poços foram preenchidos com 100 μL/poço de PBS. As placas foram cobertas com película plástica e incubadas de um dia para o outro em temperatura ambiente. Após o revestimento, as placas foram lavadas 3 vezes com 200 μL^o de Tween 20 0,05% (Fluka, N° de Catálogo: 93773) em PBS, e os poços foram bloqueados por 1 hora a 37°C por adição de 300 μL/poço de tampão de bloqueio SuperBlock (Pierce, N° de Catálogo: 37535) em TBS. Após incubação, a solução de bloqueio foi removida e 100 μL/poço de esclerostina (derivada de E. coli, Novartis; 1 - 1.000 ng/mL) diluídos em BSA 1% em PBS foram adicionados. As placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente antes de serem lavadas 3 vezes com 200 μL/poço de Tween 20 0,05% em PBS. A seguir, 100 μL/poço de anticorpo anti-esclerostina (1 μg/mL) diluídos em BSA 1% em PBS foram adicionados e as placas incubadas por 2 horas em temperatura ambiente antes de serem lavadas 3 vezes com 200 μL/poço de Tween 20 0,05% em PBS. Finalmente, 100 μL/poço Ab anti-IgG de cabra conjugado à ALP (1:5.000; N° de Catálogo Sigma: A-7888) diluídos em BSA 1% (Sigma N° de Catálogo:A-7888) em PBS foram adicionados por 1 hora em temperatura ambiente, e as placas foram então lavadas 3 vezes com 200 μL/poço de Tween 20 0,05% em PBS. Para determinar a ALP, 100 μL/poço de solução de substrato de ALP (Sigma, N° de Catálogo: S0942) (1 comprimido por 5 mL de tampão de substrato de dietanolamina 1x; Pierce, N° de Catálogo: 34064) foram adicionados às placas por 90 minutos e a densidade óptica medida a 405 nm.
Atividade de Fabs parentais e maturados por afinidade em ELISA de LRP6 / esclerostina
[00452] O ELISA de LRP6 / esclerostina se baseia na habilidade de esclerostina para se ligar à LRP6. Para caracterizar ainda mais os Fabs produzidos, uma seleção de Fabs e IgGs foi testada nesse ensaio. Na presença de um anticorpo anti-esclerostina de R&D (1.000 ng/ml = aproximadamente 7 nM), a ligação de esclerostina (0,9 nM) à LRP6 foi inibida por 68% comparada com o controle (dados não mostrados). MOR05813_IgG2 lambda inibiu a ligação de esclerostina à LRP6 até 90% a 90 nM, enquanto uma IgG anti-lisozima usada como controle negativo não teve nenhum efeito sobre a ligação de esclerostina à LRP6 (figura 20).
Exemplo 13: Co-tratamento usando MOR05813 MOR05813 + ácido zoledrônico
[00453] Fêmeas de camundongos com oito meses de idade (n = 10/grupo, Charles River, França) foram ooforectomizadas para induzir perda óssea por privação de estrogênio ou deixadas intactas. Os animais receberam a administração duas vezes por semana por via intravenosa de anticorpo anti-esclerostina MOR05813 (24 mg/kg,h/mIgG2a) ou anticorpo de controle (anti-PC-h/mIgG2a, grupos de controle intactos e OVX). Grupos adicionais receberam uma aplicação única de ácido zoledrônico isoladamente (100 μg/kg) ou em combinação com o anticorpo anti-esclerostina MOR05813. O tratamento com anticorpo durou 3,5 semanas (7 aplicações).
[00454] A massa óssea e a geometria tibial dos animais foram medidas antes da ooforectomia por tomografia computadorizada quantitativa periférica (pQCT). Os animais foram distribuídos igualmente de acordo com o peso corporal e densidade mineral óssea tibial total em grupos. As alterações da densidade mineral, massa e geometria ósseas foram avaliadas ao final do período de tratamento.
[00455] Os resultados são expressos como média +/- SEM. A análise estatística foi realizada usando RS1 (série 1999 para Windows, Domain Manufacturing Corp., EUA). Os dados foram submetidos a uma análise de variância de uma via (ANOVA). A igualdade de variâncias foi testada pelo teste F de Levene e as diferenças entre grupos usando o teste de Dunnett ajustado por Bonferroni. Os grupos tratados foram testados quanto à significância de diferenças em relação ao grupo OVX tratado com anticorpo de controle (p < 0,05*, p < 0,01**).
[00456] A ooforectomia induziu perda óssea que pode ser bloqueada pelo tratamento com anticorpo em camundongos idosos (figura 21). Quando o anticorpo é usado em combinação com uma única injeção intravenosa do ácido bisfosfonato zoledrônico, a perda óssea é bloqueada e o ganho ósseo é induzido, como indicado por aumentos do teor mineral ósseo total (figura 21 A) e densidade (figura 21 B), bem como aumentos da espessura cortical (figura 21 C) edensidade mineral óssea esponjosa (figura 21 D).
Pré-tratamento com MOR05813 + alendronato
[00457] Fêmeas de camundongos OF1/IC com 4,52 meses de idade (n = 10/grupo, Charles River, França) receberam a administração duas vezes por semana por via intravenosa de anticorpo anti-esclerostina MOR05813 (10 mg/kg, h/mIgG2a) ouanticorpo de controle (anti-PC-mIgG2a, grupos controle intactos e OVX). Grupos adicionais receberam pré-tratamento com alendronato por 7 semanas (4 μg/kg/dia; 5 dias/semana) antes de receberem o anticorpo de controle ou anticorpo anti-esclerostina MOR05813. O tratamento com anticorpo durou 3,5 semanas (7 aplicações).
[00458] A massa óssea e a geometria tibial dos animais foram medidas antes do início do tratamento com anticorpo por tomografia computadorizada quantitativa periférica (pQCT). Os animais foram distribuídos igualmente de acordo com o peso corporal e a densidade mineral óssea tibial total em grupos. As alterações da densidade mineral, massa e geometria ósseas foram avaliadas ao final do período de tratamento.
[00459] Os resultados são expressos como média +/- SEM. Aanálise estatística foi realizada usando RS1 (série 1999 para Windows, Domain Manufacturing Corp., EUA). Os dados foram submetidos a uma análise de variância de uma via (ANOVA). A igualdade de variâncias foi testada pelo teste F de Levene e as diferenças entre grupos usando o teste de Dunnett ajustado por Bonferroni. Os grupos pré-tratados com alendronato foram testados quanto à significância de diferenças em relação aos grupos que não receberam pré-tratamento (p < 0,05*, p < 0,01**).
[00460] O pré-tratamento de longo prazo com o bisfosfonato alendronato não possui impacto negativo sobre a ação anabólica óssea do anti-esclerostina MOR05813, o que se reflete por aumentos do teor mineral ósseo total (figura 22 A) e da densidade (figura 22 B), bem como aumentos da espessura cortical (figura 22 C) e da densidade mineral óssea esponjosa (figura 22 D). Em função das propriedades anti-reabsorção persistentes do bisfosfonato além do período de administração, é observado um aumento do teor mineral ósseo total (figura 22 A) e da espessura cortical (figura 22 C).
MOR05813 + DKK1 ou hPTH
[00461] Fêmeas de camundongos desnudos (nude) de seis semanas de idade (n = 8/grupo) receberam a administração duas vezes por semana por via intravenosa de veículo, anticorpo anti- esclerostina MOR05813 (10, 20 e 40 mg/kg, IgG2), anticorpo anti-Dkk1 (10 mg/kg, IgG1), hPTH(1-34) (100 microgramas/kg) ou combinações destes. O tratamento com anticorpo durou 4 semanas (8 aplicações).
[00462] A massa óssea e a geometria tibial dos animais foram medidas antes do tratamento por tomografia computadorizada quantitativa periférica (pQCT). Os animais foram distribuídos igualmente de acordo com o peso corporal e densidade mineral óssea tibial total em grupos. As alterações da densidade mineral, massa e geometria ósseas foram avaliadas ao final do período de tratamento.
[00463] Os resultados são expressos como média +/- SEM. Aanálise estatística foi realizada usando RS1 (série 1999 para Windows, Domain Manufacturing Corp., USA). Os dados foram submetidos a uma análise de variância de uma via (ANOVA). A igualdade de variâncias foi testada pelo teste F de Levene e as diferenças entre grupos usando o teste de Dunnett ajustado por Bonferroni. Os grupos foram testados quanto à significância de diferenças em relação ao grupo tratado com veículo (p < 0,05*, p < 0,01**).
[00464] Os efeitos anabólicos ósseos aumentam com a dose de anti-esclerostina MOR05813 (figura 23). O co-tratamento com um anticorpo anti-Dkk1 resulta em um aumento acentuado do teor mineral ósseo total (figura 23 A) e da densidade (figura 23 B) e espessura cortical (figura 23 C) e um aumento sinérgico na densidade mineral óssea esponjosa (figura 23 D). O co-tratamento com hPTH(1-34)resulta em um aumento sinérgico de todos os parâmetros medidos (figura 23 A - D).REFERÊNCIASAvsian-Kretchmer O., Hsueh A.J. (2004) "Comparative genomic analysis of the eight-membered ring cystine knot-containing bone morphogenetic protein antagonists". Mol. Endocrinol. 18(1): 1-12.Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. 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Gene 39(2): 91-7.Brunkow M.E., Gardner J.C., Van Ness J., Paeper B.W., Kovacevich B.R., Proll S., Skonier J.E., Zhao L., Sabo P.J., Fu Y., Alisch R.S., Gillett L., Colbert T., Tacconi P., Galas D., Hamersma H., Beighton P., Mulligan J. (2001) "Bone dysplasia sclerosteosis results from loss of the SOST gene product, a novel cystine knot-containing protein". Am. J. Hum. Genet. 68(3): 577-89.Chen, B.P., Hai, T. "Expression vectors for affinity purification and radiolabeling of proteins using Escherichia coli as host". Gene 139, 73-75. 1994.Chen, Y., Wiesmann, C., Fuh, G., Li, B., Christinger, H. W., McKay, P., de Vos, A. M., Lowman, H. B. (1999). "Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen". J. Mol. Biol. 293, 865881.Gardner J.C., van Bezooijen R.L., Mervis B., Hamdy N.A., Lowik C.W., Hamersma H., Beighton P., Papapoulos S.E. 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Biol. 260, 359368.Rauchenberger, R., Borges, E., Thomassen-Wolf, E., Rom, E., Adar, R., Yaniv, Y., Malka, M., Chumakov, I., Kotzer, S., Resnitzky, D., Knappik, A., Reiffert, S., Prassler, J., Jury, K., Waldherr, D., Bauer, S., Kretzschmar, T., Yayon, A. e Rothe, C. (2003). "Human combinatorial Fab Library yielding specific and functional antibodies against the human fibroblast growth factor receptor 3". J. Biol. Chem. 278(40): 38.194-38.205.Semenov M.V., He X. "LRP5 mutations linked to high bone mass diseases cause reduced LRP5 binding and inhibition by SOST". J. Biol. Chem. 19 de outubro de 2006;van Bezooijen R.L., Svensson J.P., Eefting D., Visser A., van der Horst G., Karperien M., Quax P.H., Vrieling H., Papapoulos S.E., Ten Dijke P., Lowik C.W. (2006) "Wnt but not BMP Signaling is Involved in the Inhibitory Action of Sclerostin on BMP-Stimulated Bone Formation".Virnekas B., Ge L., Pluckthun A., Schneider K.C., Wellnhofer G., Moroney S.E. 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Claims (23)

1. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que (i) se liga ao polipeptídeo de esclerostina, e (ii) compreende:(a) uma CDR1 da região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste em SEQ ID NO: 4;(b) uma CDR2 da região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste em SEQ ID NO: 15;(c) uma CDR3 da região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste em SEQ ID NO: 26;(d) uma CDR1 da região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste em SEQ ID NO: 37;(e) uma CDR2 da região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste em SEQ ID NO: 48; e(f) uma CDR3 da região variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que consiste em SEQ ID NO: 59.
2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (i) se liga ao polipeptídeo de esclerostina humana, e (ii) pode aumentar a formação óssea, a densidade mineral óssea e o teor mineral ósseo em um mamífero.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo se liga ao referido polipeptídeo de esclerostina com uma KD de menos de 1 nM.
4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo pode bloquear o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio celular de sinalização Wnt.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo possui um IC50 de menos de 100 nM, medido em um ensaio celular de sinalização Wnt em linhagens de células HEK293 na presença de esclerostina.
6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo pode bloquear o efeito inibitório de esclerostina em um ensaio celular de mineralização.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo possui um IC50 de menos de 500 nM, medido em ensaio de mineralização induzido por BMP2 em células MC3T3 na presença de esclerostina.
8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que inibe a interação LRP6/esclerostina em um ensaio de inibição em solução.
9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que possui um IC50 de menos de 10 nM, medido por ELISA de LRP6/esclerostina.
10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que pode bloquear o efeito inibitório de esclerostina sobre a fosforilação de Smad1 induzida por BMP6 em um ensaio celular funcional.
11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que possui um IC50 de menos de 500 nM, medido em ensaio de fosforilação de Smad1 por BMP6 em uma linhagem de células MC3T3-E1 na presença de esclerostina.
12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência polipeptídica de VH de SEQ ID NO: 70.
13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência polipeptídica de VL de SEQ ID NO: 81.
14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência polipeptídica de VL apresentando a sequência de SEQ ID NO: 81 e uma sequência polipeptídica de VH apresentando a sequência de SEQ ID NO: 70.
15. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 114 e uma sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 125.
16. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.
17. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença relacionada aos ossos selecionada a partir do grupo que compreende osteoporose primária e secundária, osteopenia, osteomalácia, osteogênese imperfeita (OI), necrose avascular (osteonecrose), fraturas e cicatrização de implantes (implantes dentais e implantes de quadril), perda óssea em decorrência de outros distúrbios, tais como perda óssea associada à infecção por HIV, cânceres ou artrite.
18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que é em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda outros ingredientes ativos.
21. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18, 19 ou 20, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado por esclerostina ou que está associado a um nível aumentado de esclerostina.
22. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18, 19 ou 20, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso no tratamento de um distúrbio relacionado aos ossos em um indivíduo mamífero.
23. Anticorpo, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado(a) pelo fato de que o distúrbio relacionado aos ossos é pelo menos um de osteoporose primária e secundária, osteopenia, osteomalácia, osteogênese imperfeita (OI), necrose avascular (osteonecrose), fraturas e cicatrização de implantes (implantes dentais e implantes de quadril), perda óssea em decorrência de outros distúrbios como, por exemplo, perda óssea associada à infecção por HIV, cânceres ou artrite.
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