BRPI0817474B1

BRPI0817474B1 - Célula hospedeira microbiana transgênica, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, composição detergente, e, métodos para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, e para produzir um produto de fermentação

Info

Publication number: BRPI0817474B1
Application number: BRPI0817474-1A
Authority: BR
Inventors: Maiyuran Suchindra; Harris Paul; Ding Hanshu; Brown Kimberly
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2018-04-24
Also published as: US20120156755A1; BRPI0817474A2; US20120276640A1; WO2009042871A1; US8227667B2; US8124394B2; EP2195424A1; US20100240095A1; CN101874109B; CN101874109A; DK2195424T3; US8377693B2; EP2195424B1

Description

(54) Título: CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO, E PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO (51) Int.CI.: C12N 9/42; C11D 3/386; C12N 15/56; C12N 5/10 (30) Prioridade Unionista: 28/09/2007 US 60/976207 (73) Titular(es): NOVOZYMES A/S (72) Inventor(es): SUCHINDRA MAIYURAN; PAUL HARRIS; HANSHU DING; KIMBERLY BROWN “CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL

CELULÓSICO, E PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO”

Referência a uma Listagem de Sequência

Este pedido contém uma listagem de sequência em forma legível por computador. A forma legível por computador é aqui incorporada por referência.

Referência a um Depósito de Material Biológico

Este pedido contém uma referência a um depósito de material biológico, depósito este que é aqui incorporado por referência.

Fundamentos da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de celobioidrolase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos assim como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Descrição da Técnica Relacionada

Celulose é um polímero do açúcar simples glicose covalentemente ligado pelas ligações beta-1,4. Muitos microorganismos produzem enzimas que hidrolisam glicanos ligados em beta. Estas enzimas incluem endoglicanases, celobioidrolases, e beta-glicosidases. As endoglicanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindoo ao ataque pelas celobioidrolases. As celobioidrolases sequencialmente

Petição 870170084681, de 03/11/2017, pág. 13/19 liberam moléculas de celobiose das extremidades do polímero de celulose. A celobiose é um dímero ligado em beta-1,4 solúvel em água de glicose. As beta-glicosidases hidrolisam celobiose para glicose.

A conversão de estoques de alimentação celulósicos em etanol 5 tem as vantagens da pronta disponibilidade de grandes quantidades de estoque de alimentação, a desejabilidade de evitar queimar ou enterrar os materiais, e a limpeza do combustível de etanol. Madeira, resíduos agrícolas, safras herbáceas, e resíduos sólidos municipais foram considerados como estoques de alimentação para a produção de etanol. Estes materiais primariamente consistem de celulose, hemicelulose, e lignina. Uma vez que a celulose é convertida para glicose, a glicose pode ser facilmente fermentada pela levedura em etanol.

A WO 2004/056981 divulga celobioidrolases a partir de Chaetomium thermophilum e Myceliophthora thermophila. Gusakov et al.,

2007, Biotechnology Bioengineering 97: 1028-1038, descrevem uma celobioidrolase isolada a partir de Chrysosporium lucknowense.

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

Sumário da Invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de celobioidrolase selecionados do grupo que consiste de:

(a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de severidade alta com (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID

NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ü);

(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: l;e (d) uma variante que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase, selecionada do grupo que consiste de:

(a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ED NO: 2;

(b) um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de severidade alta com (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii);

(c) um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; e (d) um polinucleotídeo que codifica uma variante que 25 compreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nuciéico, vetores de expressão recombinante, células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos, e métodos de produzir um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase.

A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma das moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. A presente também diz respeito a um tais moléculas de RNA inibidoras de filamento duplo (dsRNA), em que opcionalmente o dsRNA é uma das moléculas de siRNA ou uma de miRNA.

A presente invenção também diz respeito a métodos de usar os polipeptídeos tendo celobioidrolase em detergentes e na conversão de celulose para glicose e várias substâncias.

A presente invenção também diz respeito a plantas que compreendem um polinucleotídeo isolado que codifica um tal polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um tal polipeptídeo tendo celobioidrolase, que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica um tal polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção diz respeito ainda às construções de ácido nucléico que compreendem um gene que codifica uma proteína, em que o gene é operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo que codifica um peptideo de sinal que compreende ou que consiste de aminoácidos de 1 a 17 da SEQ ID NO: 2, em que o gene é estranho à sequência de nucleotídeo.

Breve Descrição das Figuras

As Figuras IA e 1B mostram a sequência de DNA genômico e a sequência de aminoácido deduzida de uma celobioidrolase de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente).

A Figura 2 mostra um mapa de restrição de pSMail80.

A Figura 3 mostra um mapa de restrição de pSMail82.

Definições

Atividade de celobioidrolase: O termo “atividade de celobioidrolase” é aqui definida como uma atividade de 1,4-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-Dglicosídicas em celulose, celotetriose, ou qualquer glicose ligada em beta-1,4 contendo polímero, que libere celobiose da extremidade redutora ou não redutora da cadeia. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Lever et al. pode ser utilizado para avaliar a hidrólise da celulose em forragem de milho, enquanto que os métodos de van Tilbeurgh et al. e Tomme et al. podem ser usados para determinar a atividade de celobioidrolase em um derivado de dissacarídeo fluorescente.

Atividade de Endoglicanase: O termo “atividade de endoglicanase” é aqui definida como uma endo-1,4-(1,3; 1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endoidrólise de ligações de 1,4beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tal como carbóxi metil celulose e hidróxi etil celulose), lichenin, ligações de beta-1,4 em beta1,3 glicanos misturados tais como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal, e outros materiais de planta contendo componentes celulósicos. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de endoglicanase é determinada usando a hidrólise de carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268.

Atividade de beta-glicosidase: O termo “atividade de beta6 glicosidase” é aqui definida como uma atividade de beta-D-glicosídeo glicoidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-Dglicose de terminal não redutor com a liberação de beta-D-glicose. A celobiase é sinônimo com beta-glicosidase. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glicosidase é determinada a 25°C usando 1 mM de 4-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo como substrato em 50 mM de citrato de sódio pH 4,8. Uma unidade de atividade de beta-glicosidase é definida como 1,0 pmol de 4-nitrofenol produzido por minuto a 25°C, pH 4,8.

Família 6 ou Família GH6 ou Cel6: O termo “Família 6” ou “Família GH6” ou “Celó” é aqui definido como um polipeptídeo que cai na Família 6 da glicosídeo hidrolase de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosil hidrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat e Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosil hidrolases, Biochem. J. 316:

695-696. De acordo com uma tal classificação, a SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro destes pertence à Família 6 e é prognosticada ser uma celobioidrolase II.

Polipeptídeo isolado: O termo “polipeptídeo isolado” como aqui usado refere-se a um polipeptídeo que é isolado a partir de uma fonte.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é pelo menos 1 % puro, preferivelmente pelo menos 5 % puro, mais preferivelmente pelo menos 10 % puro, mais preferivelmente pelo menos 20 % puro, mais preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro, e o mais preferivelmente pelo menos

90 % puro, como determinado pela SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” denota aqui uma preparação de polipeptídeo que contém no máximo 10 %, preferivelmente no máximo 8 %, mais preferivelmente no máximo 6 %, mais preferivelmente no máximo 5 %, mais preferivelmente no máximo 4 %, mais preferivelmente no máximo 3 %, ainda mais preferivelmente no máximo 2 %, o mais preferivelmente no máximo 1 %, e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 % em peso de outro material de polipeptídeo com o qual o mesmo está nativa ou recombinantemente associado. É, portanto, preferido que o polipeptídeo substancialmente puro é pelo menos 92 % puro, preferivelmente pelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, mais preferivelmente pelo menos 99 %, o mais preferivelmente pelo menos 99,5 % puro, e o mais preferivelmente 100 % puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura, isto é, que a preparação de polipeptídeo é essencialmente livre de outro material de polipeptídeo com o qual o mesmo está nativa ou recombinantemente associado. Isto pode ser realizado, por exemplo, preparando-se o polipeptídeo pelos métodos recombinantes bem conhecidos ou pelos métodos de purificação clássicos.

Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” é aqui definido como um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase isto é na sua forma final a seguir da tradução e quaisquer modificações pós traducionais, tais como o processamento de terminal N, truncagem de terminal C, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 18 a 482 da SEQ ID NO: 2 com base no programa de alinhamento de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prognostica os aminoácidos de 1 a 17 da SEQ ID NO: 2 são um peptídeo de sinal.

Sequência codificadora de polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificadora de polipeptídeo maduro” é aqui definida como uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de celobioidrolase. Em um aspecto preferido, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 52 a 1809 da SEQ ID NO: 1 com base no programa de alinhamento de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prognostica os nucleotídeos de 1 a 51 codificam um peptídeo de sinal.

Identidade: A relacionabilidade entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro “identidade”.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácido é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferivelmente a versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). A saída de Needle rotulada “identidade mais longa” (obtida usando a opção -não resumida) é usada como a identidade percentual e é calculada como segue:

(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento Número Total de Intervalos no Alinhamento)

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de desoxirribonucleotídeo é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS da NCBI NUC4.4). a saída de Needle rotulada “identidade mais longa” (obtida usando a opção —não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculada como segue:

(Desoxirribonucleotídeos Idêntico χ 100)/(Comprimento de Alinhamento — Número Total de Intervalos no Alinhamento)

Sequência homóloga: O termo “sequência homóloga” é aqui definido como uma proteína prognosticada que dá um valor E (ou contagem de expectativa) de menos do que 0,001 em uma pesquisa tfasty (Pearson, W. R., 1999, em Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener e S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219) com o celobioidrolase de Myceliophthora thermophila da SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro destes.

Fragmento de polipeptídeo: O termo “fragmento de polipeptídeo” é aqui definido como um polipeptídeo tendo um ou mais (diversos) aminoácidos deletados do terminal amino e/ou carboxila do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; ou uma sequência homóloga destes; em que o fragmento tem atividade de celobioidrolase. Em um aspecto preferido, um fragmento contém pelo menos 415 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 435 resíduos de aminoácido, e o mais preferivelmente pelo menos 455 resíduos de aminoácido, do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga desta.

Subsequência: O termo “subsequência” é aqui definido como uma sequência de nucleotídeo tendo um ou mais (diversos) nucleotídeos deletados das extremidades 5’ e/ou 3’ da sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; ou uma sequência homóloga destes; em que a subsequência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase. Em um aspecto preferido, uma subsequência contém pelo menos 1245 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 1305 nucleotídeos, e o mais preferivelmente pelo menos 1365 nucleotídeos da sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga desta.

Variante alélica: O termo “variante alélica” denota aqui qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através da mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. As Mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por um variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo isolado: O termo “polinucleotídeo isolado” como aqui usado refere-se a um polinucleotídeo que é isolado a partir de uma fonte. Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo é pelo menos 1 % puro, preferivelmente pelo menos 5 % puro, mais preferivelmente pelo menos 10 % puro, mais preferivelmente pelo menos 20 % puro, mais preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro, e o mais preferivelmente pelo menos 90 % puro, como determinado pela eletroforese em agarose.

Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo “polinucleotídeo substancialmente puro” como aqui usado refere-se a uma preparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ou não desejados e em uma forma adequada para o uso dentro de sistemas de produção de proteína geneticamente engendrado. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10 %, preferivelmente no máximo 8 %, mais preferivelmente no máximo 6 %, mais preferivelmente no máximo 5 %, mais preferivelmente no máximo 4 %, mais preferivelmente no máximo 3 %, ainda mais preferivelmente no máximo 2 %, o mais preferivelmente no máximo 1 %, e ainda o mais preferivelmente no máximo 0,5 % em peso de outro material de polinucleotídeo com o qual o mesmo está nativa ou recombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro, entretanto, pode incluir regiões não traduzidas 5’ e 3’ que ocorrem naturalmente, tal como promotores e terminadores. É preferido que o polinucleotídeo substancialmente puro é pelo menos 90 % puro, preferivelmente pelo menos 92 % puro, mais preferivelmente pelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, o mais preferivelmente pelo menos 99 %, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 99,5 % puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção são preferivelmente em uma forma substancialmente pura, isto é, que a preparação do polinucleotídeo é essencialmente livre de outros materiais de polinucleotídeo com o qual o mesmo está nativa ou recombinantemente associado. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética, ou qualquer combinações destas.

Sequência codificadora: Quando aqui usado o termo “sequência codificadora” significa uma sequência de nucleotídeo, que diretamente especifica a sequência de aminoácido do seu produto de proteína. Os limites da sequência codificadora são no geral determinado por uma matriz de leitura aberta, que usualmente começa com o códon de partida ATG ou códons de partida alternativos tais como GTG e TTG e termina com um códon de parada tal como TAA, TAG, e TGA. A sequência codificadora pode ser um DNA, cDNA, sequência de nucleotídeo sintética, ou recombinante.

cDNA: O termo “cDNA” é aqui definido como uma molécula de DNA que pode ser preparada pela transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, unida, obtida de uma célula eucariótica. O cDNA carece de sequências de intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial, primário é um precursor para o mRNA que é processado através de uma série de etapas antes de aparecer como mRNA unido maduro. Estas etapas incluem a remoção de sequências de intron por um processo chamado de união. O cDNA derivado de mRNA carece, portanto, de qualquer uma das sequências de intron.

Construção de ácido nucléico: O termo “construção de ácido nucléico” como aqui usado refere-se a uma molécula de ácido nucléico, de filamento único ou duplo, que é isolada a partir de um gene que ocorre naturalmente ou que é modificado para conter segmentos de ácidos nucléicos em uma maneira que de outro modo não existiría na natureza ou que é sintética. O termo construção de ácido nucléico é sinônimo com o termo “cassete de expressão” quando a construção de ácido nucléico contém as sequências de controle requerida para a expressão de uma sequência codificadora da presente invenção.

Sequências de controle: O termo “sequências de controle” é aqui definida incluir todos os componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha à sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não são limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de propeptídeo, promotor, sequência de peptídeo de sinal, e terminador de transcrição. Em um mínimo, a sequências de controle incluem um promotor, e sinais de parada transcricional e traducional. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligadores com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região codificadora da sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” denota aqui uma configuração em que uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificadora da sequência de polinucleotídeo tal que a sequência de controle direciona a expressão da sequência codificadora de um polipeptídeo.

Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pós transcricionais, tradução, modificação pós traducional, e secreção.

Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” é aqui definido como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção e é operavelmente ligado a nucleotídeos adicionais que fornecem a sua expressão.

Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira”, como aqui usado, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação, transfecção, transdução, e outros com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo “modificação” significa aqui qualquer modificação química do polipeptídeo que consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; ou uma sequência homóloga desta; assim como a manipulação genética do DNA que codifica um tal polipeptídeo. A modificação pode ser uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção de um ou mais (diversos) aminoácidos assim como substituições de uma ou mais (diversas) cadeias laterais de aminoácido.

Variante artificial: Quando aqui usado, o termo “variante artificial” significa um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase produzido por um organismo que expressa uma sequência de polinucleotídeo modificada da sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID

NO: 1; ou uma sequência homóloga desta. A sequência de nucleotídeo modificada é obtida através da intervenção humana pela modificação da sequência de polinucleotídeo divulgada na SEQ ID NO: 1; ou uma sequência homóloga desta.

Descrição detalhada da invenção Polipeptídeos Tendo Atividade de Celobioidrolase

Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados que compreendem uma sequência de aminoácido tendo um grau de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, o mais preferivelmente pelo menos 95 %, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, que têm atividade de celobioidrolase (daqui em diante “polipeptídeos homólogos”). Em um aspecto preferido, os polipeptídeos homólogos têm uma sequência de aminoácido que difere em dez aminoácidos, preferivelmente em cinco aminoácidos, mais preferivelmente em quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente em três aminoácidos, o mais preferivelmente em dois aminoácidos, e ainda o mais preferivelmente em um aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:

2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou um fragmento desta tendo atividade de celobioidrolase. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende os aminoácidos de 18 a 482 da SEQ ID NO: 2, ou uma variante alélica desta; ou um fragmento desta tendo atividade de celobioidrolase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende os aminoácidos de 18 a 482 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste da sequência de aminoácido da

SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou um fragmento desta tendo atividade de celobioidrolase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste dos aminoácidos de 18 a 482 da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou um fragmento desta tendo atividade de celobioidrolase. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste dos aminoácidos de 18 a 482 da SEQ ID NO: 2.

Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de celobioidrolase que são codificados pelos polinucleotídeos que hibridizam preferivelmente sob condições de severidade muito baixa, mais preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade de média a alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta, e o mais preferivelmente condições de severidade muito alta com (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ED NO: 1, (iii) uma subsequência de (i) ou (ii), ou (iv) um filamento complementar de comprimento total de (i), (ii) , ou (iii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Uma subsequência da sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subsequência pode codificar um fragmento de polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase. Em um aspecto preferido, o filamento complementar é o filamento complementar de comprimento total da sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ED NO: 1.

A sequência de nucleotídeo da SEQ ED NO: 1; ou uma subsequência desta; assim como a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; ou um fragmento desta; podem ser usadas para planejar sondas de ácido nucléico para identificar e clonar polipeptídeos que codificam o DNA tendo atividade de celobioidrolase a partir de cepas de gêneros ou espécies diferentes de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com o genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente nesse lugar. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas deve ter pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35, e o mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos no comprimento. E, entretanto, preferido que a sonda de ácido nucléico tenha pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucléico pode ter pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos, ou o mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos no comprimento. Sondas ainda mais longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucléico que têm preferivelmente pelo menos 600 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 700 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos, ou o mais preferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos no comprimento. Sondas tanto de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com P, H, S, biotina, ou avidina). Tais sondas são abrangidas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA ou cDNA genômica preparada a partir de tais outras cepas, portanto, pode ser triada quanto ao DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codificam um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase. Genômico ou outro DNA de tais outras cepas podem ser separados pela eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado sobre nitrocelulose ou outro material carregador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que sejam homólogos com a SEQ ID NO: 1, ou uma subsequência desta, o material carregador é preferivelmente usado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, a hibridização indica que a sequência de nucleotídeo hibridiza a uma sonda de ácido nucléico rotulada que corresponde à sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; a sequência de cDNA contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; o seu filamento complementar de comprimento total; ou uma subsequência desta; sob condições de severidade muito baixa a muito alta. As moléculas com as quais a sonda de ácido nucléico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, película de raio X.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico tem os nucleotídeos de 52 a 1809 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é uma sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, ou uma subsequência desta. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é a SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é a sequência de polinucleotídeo contida no plasmídeo pSMail82 que está contido na E. coli NRRL B-50059, em que a sua sequência de polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é a região que codifica o polipeptídeo maduro contida no plasmídeo pSMail82 que está contido na£. coli NRRL B-50059.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento, condições de severidade muito baixa a muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % de SDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e 25 % de formamida para as severidades muito baixas e baixas, 35 % de formamida para as severidades médias e médias-altas, ou 50 % de formamida para as severidades altas e muito altas, seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão idealmente por 12 a 24 horas.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando 2X SSC, 0,2 % de SDS preferivelmente a 45°C (severidade muito baixa), mais preferivelmente a 50°C (severidade baixa), mais preferivelmente a 55°C (severidade média), mais preferivelmente a 60°C (severidade média-alta), ainda mais preferivelmente a 65°C (severidade alta), e o mais preferivelmente a 70°C (severidade muito alta).

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos no comprimento, as condições de severidade são definidas como pré-hibridização, hibridização, e lavagem pós-hibridização de cerca de 5°C a cerca de 10°C abaixo da T_m calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5 % de NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM de ATP, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão idealmente por 12 a 24 horas.

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos no comprimento, o material carregador é lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1 % de SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando 6X SSC de 5°C a 10°C abaixo da T_m calculada.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de celobioidrolase codificados pelos polinucleotídeos que compreendem ou que consistem de sequências de nucleotídeo que têm um grau de identidade com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 de preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, o mais preferivelmente pelo menos 95 %, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, que codificam um polipeptídeo ativo. Ver aqui a seção de polinucleotídeo.

Em um quarto aspecto, a presente invenção diz respeito a variantes artificiais que compreendem uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais (ou diversos) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, ou uma sequência homóloga destes. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, isto é substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetam significantemente a dobra e/ou atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões de terminal amino ou carboxila pequenas, tais como um resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilite a purificação pela mudança da carga líquida ou um outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que no geral não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As mudanças que ocorrem mais habitualmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile,

Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrão, aminoácidos não padrão (tais como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina, e alfa-metil serina) podem ser substituídos no lugar dos resíduos de aminoácido de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos no lugar dos resíduos de aminoácido. Os “aminoácidos não naturais” foram modificados depois da síntese de proteína e/ou têm uma estrutura química na(s) sua(s) cadeia(s) lateral(is) diferente daquela dos aminoácidos padrão. Os aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados, e preferivelmente, são comercialmente disponíveis, e incluem ácido pipecólico, tiazolidina ácido carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metilprolina, e 3,3dimetilprolina.

Altemativamente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza tal que a propriedade físico-química dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato, mudança do pH ideal, e outras.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo precursor podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese loco-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em cada resíduo nas moléculas, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade biológica (isto é, a atividade de celobioidrolase) para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade das moléculas. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também podem ser determinados pela análise física da estrutura, como determinado por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou rotulação de fotoatividade, em conjunção com a mutação de aminoácidos de sítio de contato putativos. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados com um polipeptídeo de acordo com a invenção.

As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido único ou múltiplo podem ser fabricadas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de triagem relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erro, demonstração de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente U.S. No. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada à região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de triagem de alto desempenho, automatizados para detectar a atividade de polipeptídeos clonados, mutageneizados expressados pelas células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893896). As moléculas de DNA mutageneizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos possibilitam a determinação rápida da importância dos resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados aos polipeptídeos de estrutura desconhecida.

O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, tal como aminoácidos de 18 a 482 da SEQ ID NO: 2, é 10, preferivelmente 9, mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente no máximo 6, mais preferivelmente 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, o mais preferivelmente 2, e ainda o mais preferivelmente 1.

Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de Celobioidrolase

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de” como aqui usado em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeo é produzida pela fonte ou por uma cepa em que a sequência de nucleotídeo da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido a partir de uma dada fonte é extracelularmente secretado.

Um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphilococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, ou Oceanobacillus tendo atividade de celobioidrolase, ou um polipeptídeo bacteriano Gram negativo tal como um polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campilobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisscria ou Ureaplasma tendo atividade de celobioidrolase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis tendo atividade de celobioidrolase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendo atividade de celobioidrolase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces livídans tendo atividade de celobioidrolase.

Um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção também pode ser um polipeptídeo fungico, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia tendo atividade de celobioidrolase; ou mais preferivelmente um polipeptídeo fungico filamentoso tal como um Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis,

Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium,

Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania,

Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophillum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella ou Xilaria tendo atividade de celobioidrolase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de

Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformís tendo atividade de celobioidrolase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum,

Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminaarum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride tendo atividade de celobioidrolase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Myceliophthora thermophila, Myceliophthora fergusii, Myceliophthora hinnulea, Myceliophthora histoplasmoides, Myceliophthora indica, Myceliophthora lutea, Myceliophthora sulphurea, Myceliophthora thcrmophila ou Myceliophthora vellerea.

Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Myceliophthora thermophila tendo atividade de celobioidrolase. Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 tendo atividade de celobioidrolase, por exemplo, o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

Deve ser entendido que para as espécies anteriormente mencionadas a invenção abrange tanto os estados perfeitos quanto os imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independente do nome da espécie pelo qual são conhecidos. Aqueles habilitados na técnica facilmente reconhecerão a identidade de equivalentes apropriados.

As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em várias coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research

Center (NRRL).

Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados e obtidos a partir de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas mencionadas acima. As técnicas para isolar microorganismos dos habitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo pode ser depois obtido pela triagem de similaridade de uma biblioteca genômica ou de cDNA de um tal microorganismo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando-se técnicas que são bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Os polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que um outro polipeptídeo é fundido ao terminal N ou ao terminal C do polipeptídeo ou fragmento destes. Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo-se uma sequência de nucleotídeo (ou uma porção desta) que codifica um outro polipeptídeo a uma sequência de nucleotídeo (ou uma porção destes) da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidos na técnica, e incluem ligar as sequências codificadoras que codificam os polipeptídeos de modo que eles estejam na matriz e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador.

Um polipeptídeo de fusão pode compreender ainda um sítio de clivagem. Na secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado o que libera o polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase da proteína de fusão. Os exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não são limitadas a, um sítio Kex2 que codifica o dipeptídeo Lys-Arg (Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-76; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 24520 251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 34883493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381), um sítio Ile-(Glu ou Asp)-Gly-Arg, que é clivado por uma protease do Fator Xa depois do resíduo de arginina (Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512); um sítio Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que é clivado por um enterocinase depois da lisina (Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987); um sítio His-Tyr-Glu ou sítio His-Tyr-Asp, que é clivado pela Genenase I (Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248); um sítio Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, que é clivado pela trombina depois do Arg (Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 3527

48); um sítio Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que é clivado pela TEV protease depois do Gin (Stevens, 2003, supra); e um sítio Leu-Glu-Val-LeuPhe-Gln-Gly-Pro, que é clivado por uma forma geneticamente engendrada de protease de rinovírus 3C humano depois do Gin (Stevens, 2003, supra).

Polinucleotídeos

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que compreendem ou que consistem de sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção.

Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto mais preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste da sequência contida no plasmídeo pSMail82 que é contida na E. coli NRRL B-50059. Em um outro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste da sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste dos nucleotídeos 52 a 1809 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto mais preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste da sequência que codifica o polipeptídeo maduro contida no plasmídeo pSMail82 que está contido na E. coli NRRL B-50059. A presente invenção também abrange sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos que compreendem ou que consistem da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro destes, que diferem da SEQ ID NO: 1 ou a sequência que codifica o polipeptídeo maduro destes em virtude da degenerescência do código genético. A presente invenção também diz respeito às subsequências da SEQ ID NO: 1 que codificam fragmentos da SEQ ID NO: 2 que têm atividade de celobioidrolase.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos mutantes que compreendem ou que consistem de pelo menos uma mutação na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo são conhecidas na técnica e incluem isolação de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma combinação destes. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir de tal DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, usando-se a reação da cadeia da polimerase (PCR) bem conhecida ou triagem de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucléico tais como a reação da cadeia de ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação com base na sequência de nucleotídeo (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Myceliophthora, ou um outro organismo ou um relacionado e assim, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou variante de espécie do polipeptídeo que codifica a região da sequência de nucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que compreendem ou que consistem de sequências de nucleotídeo que têm um grau de identidade com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 preferivelmente de pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, o mais preferivelmente pelo menos 95 %, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, que codifica um polipeptídeo ativo.

A modificação de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se às formas que não ocorrem naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir em algum modo engendrado do polipeptídeo isolado a partir de sua fonte nativa, por exemplo, variantes artificiais que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, ou semelhantes. A sequência variante pode ser construída com base na sequência de nucleotídeo apresentada como a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, por exemplo, uma subsequência desta e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que não dão origem a uma outra sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeo, mas que corresponde ao uso de códon do organismo hospedeiro intencionado para a produção da enzima, ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que podem dar origem a uma sequência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Estará evidente àqueles habilitados na técnica que tais substituições podem ser feitas fora das regiões críticas para a função das moléculas e ainda resultar em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácido essenciais à atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção, e portanto preferivelmente não submetido à substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese loco-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, supra). Na última técnica, as mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado nas moléculas, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de celobioidrolase para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade das moléculas. Os sítios de interação de substrato-enzima também podem ser determinados pela análise da estrutura tri-dimensional como determinado por técnicas tais como a análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulação de fotoatividade (ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, supra; Smith et al., 1992, supra; Wlodaver et al., 1992, supra).

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam sob condições de severidade muito baixa, preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade de média a alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta, e o mais preferivelmente condições de severidade muito alta com (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii); ou variante alélicas e subsequências desta (Sambrook et al., 1989, supra), como aqui definidos. Em um aspecto preferido, o filamento complementar é o filamento complementar de comprimento total da sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados obtidos por (a) hibridizando uma população de DNA sob condições de severidade muito baixa, baixa, média, média-alta, alta, ou muito alta com (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii); e (b) isolando o polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase. Em um aspecto preferido, o filamento complementar é o filamento complementar de comprimento total da sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Construções de ácido nucleico

A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo isolado da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais (diversas) sequências de controle que direcionam a expressão da sequência codificadora em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado em uma variedade de modos para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação da sequência de polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessário dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar as sequências de polinucleotídeo que utiliza os métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.

A sequência de controle pode ser uma sequência promotora apropriada, uma sequência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. A sequência promotora contém sequências de controle trancricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de nucleotídeo que apresente atividade transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e podem ser obtidos a partir de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos a partir do operon lac da E. coli, o gene da agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene da levansucarase de Bacillus subtilís (sacB), gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amil), gene da amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene da alfa-amilase de Bacillus amiloliquefaciens (amyQ), gene da penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), genes xilA e xilB de Bacillus subtilis, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), assim como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Outros promotores são descritos em “Useful proteins from recombinant bactéria” no Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira fungica filamentosa são promotores obtidos dos genes para a TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), protease equivalente à tripsina de Fusarium oxisporum (WO 96/00787), beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase de Trichoderma reesei, endoglicanase I de Trichoderma reesei, endoglicanase II de Trichoderma reesei, endoglicanase III de Trichoderma reesei, endoglicanase IV de Trichoderma reesei, endoglicanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, assim como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae)·, e promotores mutantes, truncados, e híbridos destes.

Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos a partir dos genes para a enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenoase de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), e 310 fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

A sequência de controle também podem ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora é operavelmente ligada ao terminal 3 ’ da sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes para a TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, e protease equivalente a tripsina de Fusarium oxisporum.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras de levedura são obtidas a partir dos genes para a enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência de controle também pode ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é operavelmente ligada ao terminal 5’ da sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

Os líderes preferidos para as células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para a TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Os líderes adequados para as células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para a enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada ao terminal 3’ da sequência de nucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As sequências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para a TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease equivalente à tripsina de Fusarium oxisporum, e alfa-glicosidase de Aspergillus niger.

As sequências de poliadenilação úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

A sequência de controle também pode ser uma sequência de peptídeo de sinal codificadora que codifica uma sequência de aminoácido ligada ao terminal amino de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeo codificado no caminho secretor da célula. A extremidade 5’ da sequência codificadora da sequência de nucleotídeo pode inerentemente conter uma sequência de peptídeo de sinal codificadora naturalmente ligada na matriz de leitura de tradução com o segmento da sequência codificadora que codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a extremidade 5’ da sequência codificadora pode conter uma sequência de peptídeo de sinal codificadora que é estranha à sequência codificadora. A sequência de peptídeo de sinal codificadora estranha pode ser requerida onde a sequência codificadora não contém naturalmente uma sequência de peptídeo de sinal codificadora. Altemativamente, a sequência de peptídeo de sinal codificadora estranha pode simplesmente pode simplesmente a sequência de peptídeo de sinal codificadora natural de modo a realçar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de peptídeo de sinal codificadora que direcione o polipeptídeo expressado no caminho secretor de uma célula hospedeira de escolha, isto é, secretada em um meio de cultura, pode ser usado na presente invenção.

As sequências de peptídeo de sinal codificadoras eficazes para as células hospedeiras bacterianas são as sequências de peptídeo de sinal codificadoras obtidas a partir dos genes para a amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As sequências de peptídeo de sinal codificadoras eficazes para células hospedeiras fungicas filamentosas são a sequência de peptídeo de sinal codificadoras obtidas a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens, endoglicanase de Humicola insolens V, e lipase de Humicola lanuginosa.

Os peptídeos de sinal úteis para as células hospedeiras de levedura são obtidas a partir dos genes para o fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de peptídeo de sinal codificadoras úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

Em um aspecto preferido, o peptídeo de sinal compreende ou consiste dos aminoácidos de 1 a 17 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, a sequência de peptídeo de sinal codificadora compreende ou consiste dos nucleotídeos de 1 a 51 da SEQ ID NO: 1.

A sequência de controle também pode ser uma sequência de propeptídeo codificadora que codifica uma sequência de aminoácido posicionada no terminal amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um propeptídeo é no geral inativo e pode ser convertido a um polipeptídeo ativo maduro pela divagem catalítica ou autocatalítica do própeptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência de pró-peptídeo codificadora pode ser obtida a partir dos genes para a protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Onde tanto as sequências de peptídeo de sinal quanto a de própeptídeo estão presentes no terminal amino de um polipeptídeo, a sequência de pró-peptídeo é posicionada próxima ao terminal amino de um polipeptídeo e a sequência de peptídeo de sinal é posicionada próxima ao terminal amino da sequência de pró-peptídeo.

Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que permitam a regulagem da expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas regulatórios são aqueles que causam a expressão do gene a ser ligado ou desligado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procarióticos incluem os sistemas de operador lac, tac, e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor da TAKA alfa-amilase, o promotor da glicoamilase de Aspergillus niger, e o promotor da glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados como sequências regulatórias. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação de gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene da diidrofoliato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes da metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo seria operavelmente ligado com a sequência regulatória.

Vetores de expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes que compreende um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada transcricional e traducional. Os vários ácidos nucleicos e sequências de controle aqui descritos podem ser unidos entre si para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (diversos) sítios de restrição convenientes para possibilitar a inserção ou substituição da sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Altemativamente, uma sequência de polinucleotídeo da presente invenção pode ser expressada inserindo-se a sequência de nucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico que compreende a sequência em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificadora está localizada no vetor de modo que a sequência codificadora é operavelmente ligada com as sequências de controle apropriadas para a expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode realizar a expressão da sequência de nucleotídeo. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor deva ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.

O vetor pode ser um vetor que replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossoma, ou um cromossoma artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) o mesmo foi integrado. Além disso, um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, pode ser usado.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um ou mais (diversos) marcadores selecionáveis que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou semelhantes. Um marcador selecionável é um gene, o produto do qual fornece resistência a biocida ou viral, resistência aos metais pesados, prototrofia aos auxótrofos, e outros.

Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibiótico tal como resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol, ou tetraciclina. Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura são ADE2, EHS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célula hospedeira filamentosa fúngica incluem, mas não são limitados a, amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoil transferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pirG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), assim como equivalentes destes. Preferido para o uso em uma célula de AspergiUus são os genes amdS e pirG de AspergiUus nidulans ou AspergiUus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a sequência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma pela recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter sequências de nucleotídeo adicionais para direcionar a integração pela recombinação homólogo no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos integracionais preferivelmente devem conter um número suficiente de ácidos nucléicos, tais como de 100 a 10.000 pares de base, preferivelmente de 400 a 10.000 pares de base, e o mais preferivelmente de 800 a 10.000 pares de base, que têm um alto grau de identidade com a sequência alvo correspondente para realçar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser sequências de nucleotídeo não codificaras ou codificaras. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira pela recombinação não homóloga.

Para a replicação autônoma, o vetor pode compreender ainda uma origem de replicação que possibilita o vetor replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador plasmídico que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. Os termos “origem de replicação” ou “replicador plasmídico” são aqui definidos como uma sequência de nucleotídeo que possibilita um plasmídeo ou vetor replicar in vivo.

Os exemplos de origem bacteriana de replicação são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação na E. coli, e pUBl 10, pE194, pTAlOóO, e pAMBl que permitem a replicação em Bacillus.

Os exemplos de origens de replicação para o uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem 2 micron de replicação, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMAI e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). A isolação do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizadas de acordo com os métodos divulgados na WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserido em uma célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópia do polinucleotídeo pode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e desse modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando-se as células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospedeiras

A presente invenção também diz respeito às células hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo isolado da presente invenção, que são vantajosamente usadas na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor que compreende um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico auto-replicante como descrito mais no princípio. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer progênie de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá um grande grau depende do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota.

A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria

Gram positiva ou uma bactéria Gram negativa. As bactérias Gram positivas incluem, mas não limitadas a, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphilococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Gcobacillus, e Oceanobacillus. As bactéria Gram negativas incluem, mas não limitadas a, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campilobacter, Helicobacter,

Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, e Ureaplasma.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de

Bacillus. As células de Bacillus úteis na prática da presente invenção incluem, mas não são limitadas às células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii,

Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuríngiensis.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus amiloliquefaciens. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus clausii. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus licheniformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus subtilis.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus. As células de Streptococcus úteis na prática da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus equisimilis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus pyogenes. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus uberis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces. As células de Streptomyces úteis na prática da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces achromogenes. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces avermitilis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces coelicolor. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces griseus. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces lividans.

A introdução de DNA em uma célula de Bacillus, por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), pelo uso de células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), pela eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou pela conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli, por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces, por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), pela conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou pela transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas, por exemplo, pode ser efetuada pela eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Métodos 64: 391-397) ou pela conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus, por exemplo, pode ser efetuada pela competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios. 68: 189-2070, pela eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou pela conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

A célula hospedeira também pode ser uma eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta, ou fungo.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula fungica. “Fungos” como aqui usado inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definidos por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8^aedição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assim como os Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula de levedura. “Levedura” como aqui usado inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencente aos Fungos Imperfeitos (Blastomycetes). Visto que a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M., e Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Série N^s 9, 1980).

Ainda em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrcrwia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolitica.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula fungica filamentosa. “Fungos Filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definida por Hawksworth ct al., 1995, supra). Os fungos filamentosso são no geral caracterizados por um composto de parede micelial de quitina, celulose, glicano, quitosano, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é pelo alongamento hifal e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo pelas leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é pelo brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Ainda em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira filamentosa fungica é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandcra, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlcbia, Piromyccs, Pleurotus, Schizophillum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira filamentosa fungica é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira filamentosa fungica é uma célula de Fusarium bactridioides,

Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminaarum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou

Fusarium venenatuma. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira filamentosa fungica é uma célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum,

Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular em uma maneira conhecida por si. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos na EP 238 023 e Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Os métodos adequados para transformar espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J. N. e Simon, M. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Produção

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Myceliophthora. Em um aspecto mais preferido, a célula é Myceliophthora thermophila. Em um aspecto mais preferido, a célula é Myceliophthora thermophila CBS 202.75.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante, como aqui descrita, sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma sequência de nucleotídeo mutante tendo pelo menos uma mutação na sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar o polipeptídeo.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada pelo cultivo em frasco agitado, e fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lote, lote alimentado, ou de estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitam que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não é secretado no meio, o mesmo pode ser recuperado a partir de lisados de célula.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo como aqui descrito.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente pelos procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J. C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obter polipeptídeos substancialmente puros.

Plantas

A presente invenção também diz respeito a plantas, por exemplo, uma planta transgênica, parte de planta, ou célula de planta, que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Altemativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usado como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade, e propriedade reológica, ou para destruir um fator antinutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Os exemplos de plantas monocot são gramas, tais como a grama dos prados (grama azul, Poá), grama forrageira tal como Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho.

Os exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoço, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, semente de colza, e o organismo modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Os exemplos de partes de planta são hastes, calo, folhas, raiz, frutos, sementes, e tubérculos assim como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos de célula de planta específicos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacúolos, peroxissomas e citoplasma também são considerados ser uma parte de planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem do tecido, é considerado ser uma parte de planta. Do mesmo modo, partes de planta tais como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção também são considerados partes de planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

Também incluídos dentro do escopo da presente invenção estão a progênie de tais plantas, partes de planta, e células de planta.

A planta ou célula de planta transgênica que expressam um polipeptídeo da presente invenção podem ser construídas de acordo com 15 métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída pela incorporação de uma ou mais (diversas) construções de expressão que codificam um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeiro da planta ou genoma de cloroplasto e propagando a planta ou célula de planta modificadas resultantes em uma planta ou célula de planta transgênica.

A construção de expressão é convenientemente uma construção de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção operavelmente ligado com sequências regulatórias apropriadas requeridas para a expressão da sequência de nucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar as células hospedeiras nas quais a construção de expressão foi integrada e as sequências de DNA necessárias para a introdução da construção na planta em questão (o último depende do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha de sequências regulatórias, tais como sequências promotoras e terminadoras e sequências de sinal ou trânsito opcionalmente é determinada, por exemplo, com base em quando, onde, e como o polipeptídeo é desejado ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser desenvolvimental, de estágio ou específica de tecido, e o produto de gene pode ser alvejado a um tecido ou parte de planta específicos tais como sementes ou folhas. As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, os promotores 35S-CaMV, da ubiquitina do milho 1, e da actina do arroz 1 podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos depósitos de armazenagem tais como sementes, tubérculos de batata, e frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de depósito metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene da proteína de semente desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo oleaginoso de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor napA da proteína de armazenagem de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, como descrito na WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, o promotor do gene da adenina metiltransferase do vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668674), ou um promotor indutível por ferimento tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Do mesmo modo, o promotor pode ser indutível pelos tratamentos abióticos tais como temperatura, seca, ou alterações na salinidade ou induzido pelas substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios, hormônios de planta tais como etileno, ácido abscísico, e ácido giberélico, e metais pesados.

Um elemento realçador de promotor também pode ser usado para se obter expressão mais alta de um polipeptídeo da presente invenção na planta. Por exemplo, o elemento realçador de promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulgam o uso do primeiro intron do gene da actina 1 do arroz para realçar a expressão.

O gene marcador selecionável e qualquer uma de outras partes da construção de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

A construção de ácido nucléico é incorporada no genoma de planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas no ramo, incluindo transformação mediada por Agrobactéria, mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Presentemente, a transferência de gene mediada pela Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicots transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant

Molecular Biology 19: 15-38) e também pode ser usado para transformar monocots, embora outros métodos de transformação sejam frequentemente usados para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para gerar monocots transgênicos é o bombardeamento de partícula (partículas de ouro ou tungstênio microscópicas revestidas com o DNA de transformação) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocots está fundamentado na transformação de protoplasto como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

A seguir da transformação, os transformantes tendo incorporada a construção de expressão são selecionadas e regeneradas em plantas inteiras de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente o procedimento de transformação é planejado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes pelo uso, por exemplo, de co-transformação com duas construções de T-DNA separadas ou excisão específica de sítio do gene de seleção por uma recombinase específica.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Remoção ou Redução da Atividade de Celobioidrolase

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um mutante de uma célula precursora, que compreende romper ou deletar uma sequência de polinucleotídeo, ou uma porção destes, que codifica um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula precursora quando cultivada sob as mesmas condições.

A célula mutante pode ser construída pela redução ou eliminação da expressão de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, rompimentos, substituições, ou deleções. Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo é inativada. A sequência de nucleotídeo a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a região codificadora ou uma parte desta essencial para a atividade, ou um elemento regulador requerido para a expressão da região codificadora. Um exemplo de uma tal sequência reguladora ou de controle pode ser uma sequência promotora ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão da sequência de nucleotídeo. Outras sequências de controle para a modificação possível incluem, mas não são limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, sequência de peptideo de sinal, terminador de transcrição, e ativador transcricional.

A modificação ou inativação da sequência de nucleotídeo podem ser realizadas submetendo-se a célula precursora à mutagênese e selecionando quanto a mutantes de célula em que a expressão da sequência de nucleotídeo foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutageneizante físico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo-se a sequência de DNA à mutagênese gerada pela PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes agentes mutageneizantes.

Os exemplos de um agente mutageneizante físico ou químico adequado para o presente propósito incluem irradiação de ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, metano sulfonato de etila (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeo.

Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada incubando-se a célula precursora a ser mutageneizada na presença do agente mutageneizante de escolha sob condições adequadas, e triando e/ou selecionando quanto a mutantes de célula que exibem expressão reduzida ou nenhuma do gene.

A modificação ou inativação da sequência de nucleotídeo podem ser realizadas pela introdução, substituição, ou remoção de um ou mais (diversos) nucleotídeos no gene ou um elemento regulatório requerido para a transcrição ou tradução destes. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, a remoção do códon de partida, ou uma mudança na matriz de leitura aberta. Tal modificação ou inativação pode ser realizada pela mutagênese loco-dirigida ou mutagênese gerada pela PCR de acordo com métodos conhecidos na técnica. Embora, em princípio, a modificação possa ser realizada in vivo, isto é, diretamente na célula que expressa a sequência de nucleotídeo a ser modificada, é preferido que a modificação seja realizada in vitro como exemplificado abaixo.

Um exemplo de um modo conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de uma sequência de nucleotídeo por uma célula está fundamentado em técnicas de substituição de gene, deleção de gene, ou rompimento de gene. Por exemplo, no método de rompimento de gene, uma sequência de ácido nucléico que corresponde à sequência de nucleotídeo endógena é mutageneizada in vitro para produzir uma sequência de ácido nucléico defeituosa que é depois transformada na célula precursora para produzir um gene defeituoso. Pela recombinação homóloga, a sequência de ácido nucléico defeituosa substitui a sequência de nucleotídeo endógena. Pode ser desejável que a sequência de nucleotídeo defeituosa também codifica um marcador que pode ser usado para a seleção de transformantes em que a sequência de nucleotídeo foi modificada ou destruída. Em um aspecto particularmente preferido, a sequência de nucleotídeo é rompida com um marcador selecionável tal como aqueles aqui descritos.

Altemativamente, a modificação ou inativação da sequência de nucleotídeo pode ser realizada pelas técnicas de anti-sentido ou RNAi estabelecidas usando uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo. Mais especificamente, a expressão da sequência de nucleotídeo por uma célula pode ser reduzida ou eliminada pela introdução de uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo do gene que pode ser transcrito na célula e é capaz de hibridizar com o mRNA produzido na célula. Sob condições que permitam que a sequência de nucleotídeo de anti-sentido complementar hibridize com o mRNA, a quantidade de proteína traduzida é assim reduzida ou eliminada.

A presente invenção diz respeito ainda a uma célula mutante de uma célula precursora que compreende um rompimento ou deleção de uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou uma sequência de controle deste, que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo ou no polipeptídeo comparado com a célula precursora.

As células mutantes deficientes em polipeptídeo assim criadas são particularmente úteis como células hospedeiras para a expressão de polipeptídeos nativos e/ou heterólogos. Portanto, a presente invenção diz respeito ainda a métodos de produzir um polipeptídeo nativo ou heterólogo que compreende: (a) cultivar a célula mutante sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. O termo “polipeptídeos heterólogos” é aqui definido como polipeptídeos que não são nativos para a célula hospedeira, uma proteína nativa em que modificações foram fabricadas para alterar a sequência nativa, ou uma proteína nativa cuja expressão é quantitativamente alterada como um resultado de uma manipulação da célula hospedeira pelas técnicas de DNA recombinantes.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para produzir um produto de proteína essencialmente livre de atividade de celobioidrolase pela fermentação de uma célula que produz tanto um polipeptídeo da presente invenção assim como o produto de proteína de interesse pela adição de uma quantidade eficaz de um agente capaz de inibir a atividade de celobioidrolase ao caldo de fermentação antes, durante, ou depois que a fermentação foi completada, recuperar o produto de interesse do caldo de fermentação, e opcionalmente submeter o produto recuperado à purificação adicional.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para produzir um produto de proteína essencialmente livre da atividade de celobioidrolase cultivando-se a célula sob condições que permitam a expressão do produto, submetendo-se o caldo de cultura resultante a um tratamento de pH e temperatura combinados de modo a reduzir a atividade de celobioidrolase substancialmente, e recuperar o produto do caldo de cultura. Alternativamente, o tratamento de pH e temperatura combinados podem ser realizados em uma preparação de enzima recuperada do caldo de cultura. O tratamento de pH e temperatura combinados pode ser opcionalmente usado em combinação com um tratamento com um inibidor de celobioidrolase.

De acordo com este aspecto da invenção, é possível remover pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 99 % da atividade de celobioidrolase. A remoção completa de atividade de celobioidrolase pode ser obtida pelo uso deste método.

O tratamento de pH e temperatura combinados é preferivelmente realizado a um pH na faixa de 2 a 4 ou 9 a 11 e uma temperatura na faixa de pelo menos 60 a 70°C por um período suficiente de tempo para atingir o efeito desejado, onde tipicamente, 30 a 60 minutos são suficientes.

Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados pelos métodos conhecidos na técnica.

Os métodos da presente invenção para produzir um produto essencialmente livre de celobioidrolase é de interesse particular na produção de polipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fungicas tais como enzimas. A enzima pode ser selecionada, por exemplo, de uma enzima amilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulolítica, óxidoredutase, ou enzima que degrada a parede da célula de planta. Os exemplos de tais enzimas incluem uma aminopeptidase, amilase, amiloglicosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosil-transferase, desoxirribonuclease, endoglicanase, esterase, galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, glicose oxidase, glicosidase, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, liase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transferase, transglutaminase, ou xilanase. As células deficientes em celobioidrolase também podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse farmacêutico tais como hormônio, fatores de crescimento, receptores, e outros.

Deve ser entendido que o termo “polipeptídeos eucarióticos” incluem não apenas polipeptídeos nativos, mas também aqueles polipeptídeos, por exemplo, enzimas, que foram modificadas pelas substituições, deleções ou adições de aminoácido, ou outras tais modificações para realçar a atividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e outros.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma produto de proteína essencialmente livre de atividade de celobioidrolase que é produzido por um método da presente invenção.

Métodos de Inibir a Expressão de um Polipeptídeo Tendo Atividade de Celobioidrolase

A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma das moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o dsRNA tem de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex no comprimento.

O dsRNA é preferivelmente um RNA interferente pequeno (siRNA) ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferido, o dsRNA é RNA interferente pequeno (siRNAs) para inibir a transcrição. Em um outro aspecto preferido, o dsRNA é micro RNA (miRNAs) para inibir a tradução.

A presente invenção também diz respeito a tais moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNA), que compreendem uma porção da sequência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 para inibir a expressão de um polipeptídeo em uma célula. Embora a presente invenção não seja limitada por qualquer mecanismo particular de ação, o dsRNA pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de filamento único (ssRNA) de sequências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta ao dsRNA, o mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo chamado de interferência de RNA (RNAi).

Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados em produtos terapêuticos de silenciamento de gene. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para seletivamente degradar RNA usando os dsRNAis da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Os métodos para fabricar e usar moléculas de dsRNA para degradar seletivamente RNA são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, a Patente U.S. N² 6.506.559; Patente U.S. N² 6.511.824; Patente U.S. N²

6.515.109; e Patente U.S. N² 6.489.127.

Composições

A presente invenção também diz respeito às composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo “enriquecido” indica que a atividade de celobioidrolase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1.1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o componente enzimático maior, por exemplo, uma composição de mono-componente. Alternativamente, a composição pode compreender atividades múltiplas, tais como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfagalactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, alfa-glicosidase, betaglicosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. A(s) enzima(s) adicional(is) podem ser produzidas, por exemplo, por um microorganismo pertencente ao gênero AspergiUus, preferivelmente AspergiUus aculeatus, AspergiUus awamori, AspergiUus fumigatus,

AspergiUus foetidus, AspergiUus japonicus, AspergiUus nidulans, AspergiUus niger, ou AspergiUus oryzae; Fusarium, preferivelmente Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminaarum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatunr, Humicola, preferivelmente Humicola insolens ou Humicola lanuginosa', ou Trichoderma, preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidas na técnica e podem estar na forma de um líquido ou uma composição seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos são dados abaixo de usos preferidos das composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica. Usos

A presente invenção também é direcionada aos métodos para o uso dos polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase, ou composições destes, como descrito abaixo.

Degradação ou conversão de material celulósico

A presente invenção também diz respeito a métodos para degradar ou converter um material celulósico, que compreende: tratar o material celulósico com uma composição que compreende uma ou mais proteínas celulolíticas na presença de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto preferido, o método compreende ainda recuperar o material celulósico degradado ou convertido.

Os polipeptídeos e células hospedeiras da presente invenção podem ser usados na produção de monossacarídeos, dissacarídeos, e polissacarídeos como estoques de alimentação químicos ou de fermentação a partir de biomassa celulósica para a produção de etanol, plásticos, outros produtos ou intermediários. A composição que compreende o polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase pode estar na forma de um caldo de fermentação bruto com ou sem as células removidas ou na forma de uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada. A composição pode também compreender outras proteínas e enzimas úteis no processamento de biomassa, por exemplo, endoglicanase, celobioidrolase, beta-glicosidase, enzimas hemicelulolíticas, realçadores (WO 2005/074647, WO 2005/074656), etc. Alternativamente, a composição pode compreender uma célula hospedeira da presente invenção como uma fonte do polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase em um processo de fermentação com a biomassa. Em particular, os polipeptídeos e células hospedeiras da presente invenção podem ser usados para aumentar o valor de resíduos de processamento (grão de destiladores seco, grãos gastos da fabricação de bebida fermentada, bagaço de cana de açúcar, etc.) pela degradação parcial ou completa de celulose ou hemicelulose. A célula hospedeira também pode conter genes nativos ou heterólogos que codificam outras proteínas e enzimas, mencionadas acima, úteis no processamento de biomassa.

O polissacarídeo predominante na parede celular primária de biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemi-celulose, e o terceiro é pectina. A parede celular secundária, produzida depois que a célula parou de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada pela lignina polimérica covalentemente reticulada com a hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e assim um beta-(l-4)-D-glicano linear, embora as hemiceluloses incluam uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos, e mananas em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora no geral polimorfa, a celulose é encontrada em tecido de planta primariamente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glicano paralelas. As hemiceluloses usualmente ligam hidrogênio à celulose, assim como a outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

Nos métodos da presente invenção, o material celulósico pode ser qualquer material contendo celulose. A celulose é no geral encontrada, por exemplo, nas hastes, folhas, cascas, e sabugos de plantas ou folhas, ramos, e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não é limitado a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos municipais, papel usado, e polpa e resíduos de fábrica de papel. O material celulósico pode ser qualquer tipo de biomassa incluindo, mas não limitado a, recursos de madeira, resíduos sólidos municipais, papel usado, colheitas, e resíduos de colheita (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118, Tailor &. Francis, Washington D. C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconvertion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, r

Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). E aqui entendido que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede de célula de planta contendo lignina, celulose, e hemicelulose em uma matriz mista.

Em um aspecto preferido, o material celulósico é forragem de milho. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é fibra de milho. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é sabugo de milho. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é palha de arroz. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é papel e resíduo do processamento de polpa. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é planta lenhosa ou herbácea. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é bagaço. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é casca de laranja.

Três classes principais de enzimas são usadas para decompor a massa celulósica:

(1) As “endo-l,4-beta-glicanases” ou 1,4-beta-D-glicano-4glicano-hidrolases (EC 3.2.1.4), que atuam aleatoriamente sobre substratos de 1,4-beta-glicano solúveis e insolúveis.

(2) As “exo-l,4-beta-D-glicanases” incluindo tanto a 1,4-betaD-glicano glicoidrolases (EC 3.2.1.74), que liberam D-glicose de 1,4-beta-Dglicanos e hidrolisam D-celobiose lentamente, e celobioidrolases (1,4-beta-Dglicano celobioidrolases, EC 3.2.1.91), que liberam D-celobiose de 1,4-betaglicanos.

(3) As “beta-D-glicosidases” ou beta-D-glicosídeo glicoidrolases (EC 3.2.1.21), que atuam para liberar unidades de D-glicose a partir de celobiose e celodextrinas solúveis, assim como uma série de glicosídeos.

Os polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção são preferivelmente usados em conjunção com outras proteínas celulolíticas, por exemplo, endo-l,4-beta-glicanase e exo-l,4-betaD-glicanases, para degradar o componente de celulose do substrato de biomassa, (ver, por exemplo, Brigham et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 119-141, Tailor & Francis, Washington D.C.; Lee, 1997, Journal of Biotechnology 56: 1-24).

As endo-l,4-beta-glicanases e exo-1,4-beta-D-glicanases podem ser produzidas por qualquer método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J. W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991).

As quantidades ideais de um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase e outras proteínas celulolíticas dependem de diversos fatores incluindo, mas não limitado à mistura de proteínas celulolíticas componentes, ao substrato celulósico, à concentração de substrato celulósico, o(s) prétratamento^) do substrato celulósico, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismo de fermentação (por exemplo, levedura para a Sacarificação e Fermentação Simultâneas). O termo “proteínas celulolíticas” é aqui definido como aquelas proteínas ou misturas de proteínas mostradas como sendo capazes de hidrolisar ou converter ou degradar a celulose sob as condições testadas.

Em um aspecto preferido, a quantidade de polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase por g de material celulósico é de cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e o mais preferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.

Em um outro aspecto preferido, a quantidade de proteínas celulolíticas por g de material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e o mais preferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.

Nos métodos da presente invenção, a composição pode ser suplementada por uma ou mais atividades de enzima adicionais para melhorar a degradação do material celulósico. As enzimas adicionais preferidas são hemicelulases, esterases (por exemplo, lipases, fosfolipases e/ou cutinases), proteases, lacases, peroxidases, ou misturas destes.

Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s) adicional(is) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a fermentação, incluindo durante ou depois da propagação do(s) microorganismo(s) fermentação(ões).

As enzimas podem ser derivadas ou obtidas de qualquer origem adequada, incluindo, a origem bacteriana, fungica, levedura ou mamífera. O termo “obtida” significa aqui que a enzima pode ter sido isolada a partir de um organismo que naturalmente produz a enzima como uma enzima nativa. O termo “obtida” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro, em que a enzima recombinantemente produzida é nativa ou estranha ao organismo hospedeiro ou tem uma sequência de aminoácido modificada, por exemplo, tendo um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácido nativa ou uma enzima produzida pelos processos de embaralhamento de ácido nucléico conhecidos na técnica. Abrangidos dentro do significado de uma enzima nativa estão variantes naturais e dentro do significado de uma enzima estranha estão as variantes obtida recombinantemente, tal como pela mutagênese loco-dirigida ou embaralhamento.

As enzimas também podem ser purificadas. O termo “purificados” como aqui usado abrange enzimas livres de outros componentes do organismo a partir do qual são derivadas. O termo “purificados” também abrange enzimas livres de componentes do organismo nativo a partir do qual são obtidas. As enzimas podem ser purificadas, com apenas quantidades menores de outras proteínas estando presentes. A expressão “outras proteínas” dizem respeito em particular a outras enzimas. O termo “purificados” como aqui usado também refere-se à remoção de outros componentes, particularmente outras proteínas e o mais particularmente outras enzimas presentes na célula de origem da enzima da invenção. A enzima pode ser substancialmente pura.

As enzimas usadas na presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para o uso nos processos descritos aqui, tais como, por exemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células, um pó seco ou granulado, um granulado não empoável, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida. Os granulados podem ser produzidos, por exemplo, como divulgado nas Patentes U.S. N“ 4.106.991 e 4.661.452, e podem ser opcionalmente revestidos pelo processo conhecido na técnica. As preparações de enzima líquida, por exemplo, pode ser estabilizada pela adição de estabilizadores tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol e/ou ácido láctico ou um outro ácido orgânico de acordo com processo estabelecido. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o processo divulgado na EP 238.216.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para processar um material celulósico para muitos produtos orgânicos, produtos químicos e combustíveis úteis. Além do etanol, alguns produtos químicos de commodity e exclusivos que podem ser produzidos a partir de celulose incluem xilose, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgânicos (por exemplo, ácido láctico), 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, etileno glicol, furfural, polihidroxialcanoatos, cis, ácido cis-mucônico, e ração animal (Lynd, L. R., Wyman, C. E., e Gemgross, T. U., 1999, Biocommodity Engineering, Biotechnol. Prog., 15: 777-793; Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconvertion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Tailor & Francis, Washington, DC, 179212; e Ryu, D. D. Y., e Mandeis, M., 1980, Cellulases: biosynthesis and applications, Enz. Microb. Technol., 2: 91-102). Os benefícios de coprodução potencial estendem-se além da síntese de produtos orgânicos múltiplos a partir de carboidrato fermentável. Resíduos ricos em lignina que permanecem depois do processamento biológico podem ser convertidos para produtos químicos derivados de lignina, ou usados para a produção de energia.

Os métodos convencionais usados para processar o material celulósico de acordo com os métodos da presente invenção são bem entendidos por aqueles habilitados na técnica. Os métodos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

Um tal aparelho pode incluir um reator de batelada agitado, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, um reator de coluna de obturação-fluxo contínuo (Gusakov, A. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K., e Lee, J. M., 1983, Bioconvertion of waste cellulose by using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, Ο. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl.

Biochem. Biotechnol. 56: 141-153).

Os métodos convencionais incluem, mas não são limitados a, sacarificação, fermentação, hidrólise separadas e fermentação (SHF), sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF), hidrólise e fermentação híbridas (HHF), e conversão microbiana direta (DMC).

SHF usa etapas de processo separadas para primeiro hidrolisar enzimaticamente celulose para glicose e depois fermentar glicose para etanol. No SSF, a hidrólise enzimática da celulose e a fermentação da glicose para etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconvertion technology, no Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Tailor & Francis, Washington, DC, 179-212). O SSCF inclui a co-fermentação de açúcares múltiplos (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). O HHF inclui duas etapas separadas realizadas no mesmo reator mas em temperaturas diferentes, isto é, sacarificação enzimática de alta temperatura seguida pelo SSF em uma temperatura mais baixa que a cepa de fermentação pode tolerar. O DMC combina todos os três processos (produção de celulase, hidrólise da celulose, e fermentação) em uma etapa (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zil, W. El., e Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentais and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577).

“Fermentação” ou “processo de fermentação” referem-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreenda uma etapa de fermentação. Um processo de fermentação inclui, sem limitação, processos de fermentação usados para produzir os produtos de fermentação incluindo alcoóis (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol, e xilitol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glicônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glicônico, ácido glicurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido propiônico, ácido succínico, e ácido xilônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina, e treonina); gases (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2), e monóxido de carbono (CO)). Os processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos de laticínio fermentados), indústria do couro, e indústria do tabaco.

A presente invenção diz respeito ainda a métodos de produzir uma substância, que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma ou mais proteínas celulolíticas na presença de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado da etapa (a) com um ou mais microorganismos de fermentação; e (c) recuperar a substância da fermentação. A composição que compreende o polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase pode estar na forma de um caldo de fermentação bruto com ou sem as células removidas ou na forma de uma preparação de enzima semipurificada ou purificada ou a composição pode compreender uma célula hospedeira da presente invenção como uma fonte do polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase em um processo de fermentação com a biomassa.

A substância pode ser qualquer substância derivada da fermentação. Em uma forma de realização preferida, a substância é um álcool. Deve ser entendido que o termo “álcool” abrange um substância que contenha uma ou mais porções de hidroxila. Em uma forma de realização mais preferida, o álcool é arabinitol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é butanol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é etanol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é glicerol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é metanol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é 1,3propanodiol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é sorbitol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol Production from renewable resource, em Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin

Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, Μ. M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400408; Nigam, P., e Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xilitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T.

C., Qureshi, N. e Blaschek, Η. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

Em uma outra forma de realização preferida, a substância é um ácido orgânico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é ácido acético. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido acetônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido adípico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido ascórbico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido cítrico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido 2,5diceto-D-glicônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido fórmico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido fumárico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido glucárico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido glicônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido glicurônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido glutárico. Em uma outra forma de realização preferida, o ácido orgânico é o ácido 3-hidroxipropiônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido itacônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido láctico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido málico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido malônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido oxálico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido propiônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido succínico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R., e Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435448.

Em uma outra forma de realização preferida, a substância é uma cetona. Deve ser entendido que o termo “cetona” abrange uma substância que contenha uma ou mais porções de cetona. Em uma outra forma de realização mais preferida, a cetona é a acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

Em uma outra forma de realização preferida, a substância é um aminoácido. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido aspártico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o aminoácido é o ácido glutâmico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o aminoácido é glicina. Em uma outra forma de realização mais preferida, o aminoácido é lisina. Em uma outra forma de realização mais preferida, o aminoácido é serina. Em uma outra forma de realização mais preferida, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo,

Richard, A., e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poli(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

Em uma outra forma de realização preferida, a substância é um gás. Em uma outra forma de realização mais preferida, o gás é metano. Em uma outra forma de realização mais preferida, o gás é H₂. Em uma outra forma de realização mais preferida, o gás é CO₂. Em uma outra forma de realização mais preferida, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya, e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bactéria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V. N. em Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.

A produção de uma substância a partir de material celulósico tipicamente requer quatro etapas principais. Estas quatro etapas são prétratamento, hidrólise enzimática, fermentação, e recuperação. E exemplificado abaixo um processo para produzir etanol, mas deve ser entendido que processos similares podem ser usados para produzir outras substâncias, por exemplo, as substâncias descritas acima.

Pré-tratamento. Nas etapas de pré-tratamento ou pré-hidrólise, o material celulósico é aquecido para decompor a estrutura da lignina e carboidrato, solubilizar a maior parte da hemicelulose, e tomar a fração de celulose acessível às enzimas celulolíticas. O aquecimento é realizado diretamente com vapor ou em pasta fluida onde um catalisador também pode ser adicionado ao material para acelerar as reações. Os catalisadores incluem ácidos fortes, tais como ácido sulfúrico e SO₂, ou álcali, tal como hidróxido de sódio. O propósito do estágio de pré-tratamento é facilitar a penetração das enzimas e microorganismos. A biomassa celulósica também pode ser submetida a um pré-tratamento de explosão de vapor hidrotérmico (Ver o Pedido de Patente U.S. N² 20020164730).

Sacarifícação. Na etapa de hidrólise enzimática, também conhecida como sacarifícação, as enzimas como aqui descritas são adicionadas ao material pré tratado para converter a fração de celulose para glicose e/ou outros açúcares. A sacarifícação é no geral realizada em reatores de tanque agitado ou fermentadores sob pH, temperatura, e condições de mistura controlados. Uma etapa de sacarifícação pode durar até 200 horas. A sacarifícação pode ser realizada em temperaturas de cerca de 30°C a cerca de 65°C, em particular em tomo de 50°C, e em um pH na faixa entre cerca de 4 e cerca de 5, especialmente em tomo do pH 4,5. Para produzir glicose que pode ser metabolizada pela levedura, a hidrólise é tipicamente realizada na presença de uma beta-glicosidase.

Fermentação. Na etapa de fermentação, açúcares, liberados do material celulósico como um resultado do pré-tratamento e etapas de hidrólise enzimática, são fermentados para etanol por um organismo de fermentação, tal como levedura. A fermentação também pode ser realizada simultaneamente com a hidrólise enzimática no mesmo vaso, mais uma vez sob pH, temperatura, e condições de mistura controlada. Quando a sacarificação e fermentação são realizados simultaneamente no mesmo vaso, o processo é no geral chamado de sacarificação simultânea e fermentação ou SSF.

Qualquer substrato celulósico ou matéria prima adequados podem ser usados em um processo de fermentação da presente invenção. O substrato é no geral selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida a partir da fermentação, e o processo utilizado, como é bem conhecido na técnica. Os exemplos de substratos adequados para o uso nos métodos de presente invenção incluem materiais contendo celulose, tais como resíduos de madeira ou planta ou açúcares de peso molecular baixo DP 1-3 obtidos a partir do material celulósico processado que pode ser metabolizado pelo microorganismo de fermentação, e que pode ser fornecido pela adição direta ao meio de fermentação.

O termo “meio de fermentação” será entendido referir-se a um meio antes que o microorganismo(s) de fermentação seja(sejam) adicionado(s), tal(is) como, um meio que resulta de um processo de sacarificação, assim como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

“Microorganismo de fermentação” refere-se a qualquer microorganismo adequado para o uso em um processo de fermentação desejado. Os microorganismos de fermentação adequados são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares, tais como glicose, xilose, arabinose, manose, galactose, ou oligossacarídeos direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Os exemplos de microorganismos de fermentação incluem organismos fúngicos, tais como levedura. A levedura preferida inclui cepas de Saccharomyces spp., e em particular, Saccharomyces cerevisiae. A levedura comercialmente disponível inclui, por exemplo, RED STAR®/Lesafffe Ethanol Red (disponíveis da Red Star/Lesaffre, USA) FALI (disponível da Fleischmann’s Yeast, uma divisão da Bums Philp Food Inc., USA), SUPERSTART® (disponíveis da Alltech), GERT STRAND® (disponíveis da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL® (disponíveis da DSM Specialties).

Em uma forma de realização preferida, a levedura é uma Saccharomyces spp. Em uma forma de realização mais preferida, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Saccharomyces uvarum. Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é uma Kluyveromyces. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é uma Candida. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Candida brassicae. Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é uma Clavispora. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Clavispora opuntiae. Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é uma Pachysolen. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é uma Bretannomyces. Em uma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Tailor & Francis, Washington, DC, 179-212).

As bactérias que podem eficientemente fermentar a glicose para etanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996, supra).

E bem conhecido na técnica que os organismos descritos acima também podem ser usados para produzir outras substâncias, como aqui descritos.

A clonagem de genes heterólogos em Saccharomyces cerevisiae (Chen, Z., Ho, N. W. Y., 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stípitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho, N. W. Y., Chen, Z, Brainard, A. P., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yaeast capable of effectivelly cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859), ou em bactérias tais como Escherichia coli (Beall,

D. S., Ohta, K., Ingram, L. O., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and others sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303), Klebsiella oxitoca (Ingram, L. O., Gomes, P. F., Lai, X., Moniruzzaman, M., Wood, Β. E., Yomano, L. P., York, S. W., 1998, Metabolic engineering of bactéria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214), e Zymomonas mobilis (Zhang, M., Eddy, C., Deanda, K., Finkelstein, M., e Picataggio, S., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda, K., Zhang, M., Eddy, C., e Picataggio, S., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470) tem levado à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses para etanol (co-fermentação).

A levedura ou um outro microorganismo tipicamente são adicionados à celulose degradada ou hidrolisada e a fermentação é conduzida por cerca de 24 a cerca de 96 horas, tal como de cerca de 35 a cerca de 60 horas. A temperatura é tipicamente entre cerca de 26°C a cerca de 40°C, em particular a cerca de 32°C, e de cerca do pH 3 a cerca do pH 6, em particular em tomo do pH 4 a 5.

Em uma forma de realização preferido, levedura ou um outro microorganismo são aplicados à celulose degradada ou hidrolisada e a fermentação é conduzida por cerca de 24 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente de 35 a 60 horas. Em uma forma de realização preferida, a temperatura é no geral entre cerca de 26 a cerca de 40° C, em particular de cerca de 32° C, e o pH é no geral de cerca do pH 3 a cerca do pH 6, preferivelmente em tomo do pH 4-5. A levedura ou um outro microorganismo é preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 10 a 10 , preferivelmente de aproximadamente 10 a 10 , em especial de aproximadamente 5 χ 10⁷ contagem viável por ml de caldo de fermentação. Durante uma fase de produção de etanol a contagem de célula de levedura deve estar preferivelmente na faixa de aproximadamente 10 a 10 , especialmente em tomo de aproximadamente 2 χ 10⁸. Orientação adicional com respeito ao uso de levedura para fermentação pode ser encontrada, por exemplo, em “The alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T. P. Lyons e D. R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é por meio deste incorporada por referência.

O processo mais amplamente usado na técnica é o processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) onde não existe nenhum estágio de contenção para a sacarificação, significando que a levedura e enzima são adicionadas juntas.

Para a produção de etanol, a seguir da fermentação a massa é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com o processo da invenção pode ser usado como, por exemplo, etanol combustível; etanol de beber, isto é, bebidas alcoólicas neutras potáveis, ou etanol industrial.

Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer um dos processos enzimáticos aqui descritos para melhorar ainda mais o processo de fermentação, e em particular, o desempenho do microorganismo de fermentação, tal como, realce de taxa e rendimento de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se a estimuladores para o crescimento dos microorganismos de fermentação, em particular, levedura. Os estimuladores de fermentação preferidos para o crescimento incluem vitaminas e minerais. Os exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina, e Vitaminas A, B, C, D, e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é por meio deste incorporada por referência. Os exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, e Cu.

Recuperação. O álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado pelos métodos convencionais de destilação. Etanol com uma pureza de até cerca de 96 % em vol. de etanol pode ser obtido, que pode ser usado como, por exemplo, etanol combustível, etanol bebível, isto é, bebidas alcoólicas neutras potáveis, ou etanol industrial.

Para outras substâncias, qualquer método conhecido na técnica pode ser usado incluindo, mas não limitado a, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, destilação, ou extração.

Nos métodos da presente invenção, o polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase e outras proteína(s) celulolítica(s) podem ser suplementados por uma ou mais atividades de enzima adicionais para melhorar a degradação do material celulósico. As enzimas adicionais preferidas são hemicelulases, esterases (por exemplo, lipases, fosfolipases e/ou cutinases), proteases, lacases, peroxidases, ou misturas destas.

Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s) adicional(is) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a fermentação, incluindo durante ou depois da propagação do(s) microorganismo(s) de fermentação(s).

Composições Detergentes

A presente invenção também diz respeito a composições detergentes, que compreendem um tensoativo e um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção. Os polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase pode ser adicionado a e assim toma-se um componente de uma composição detergente.

A composição detergente da presente invenção pode ser, por exemplo, formulada como uma composição detergente de lavar roupas manual ou por máquina incluindo uma composição de aditivo de lavar roupas adequada para o pré-tratamento de tecidos tingidos e uma composição de amaciante de tecido adicionada ao enxágue, ou formulada como uma composição detergente para o uso nas operações de limpeza de superfície dura doméstica, ou formuladas para operações de lavagem de louça manual ou por máquina.

Em um aspecto específico, a presente invenção fornece um aditivo de detergente que compreende os polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção. O aditivo de detergente assim como a composição detergente pode compreender uma ou mais outras enzimas tais como uma protease, lipase, cutinase, uma amilase, carboidrase, celulase, pectinase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, por exemplo, uma lacase e/ou peroxidase.

No geral a propriedade dos componentes enzimáticos devem ser compatíveis com o detergente selecionado, (isto é, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e os componentes enzimáticos devem estar presente em quantidades eficazes.

Proteases: As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, de planta ou microbiana. A origem microbiana é preferida. Mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. A protease pode ser uma serina protease ou uma metaloprotease, preferivelmente uma protease microbiana alcalina ou uma protease equivalente à tripsina. Os exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descritas na WO 89/06279). Os exemplos de protease equivalente às tripsinas são tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e a protease de Fusarium descrita na WO 89/06270 e WO 94/25583.

Os exemplos de proteases úteis são as variantes descritas na WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, e WO 98/34946, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 e 274.

As enzimas de protease comercialmente disponíveis preferidas incluem ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURALASE®, ESPERASE®, e KANNASE® (Novozymes A/S), MAXATASE®, MAXACAL®, MAXAPEM®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP®, FN2®, e FN3® (Genencor International Inc.).

Lipases: As lipases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. Os exemplos de lipases úteis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como descritos na EP 258 068 e EP 305 216 ou de H. insolens como descrito na WO 96/13580, uma lipase de Pseudomonas, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase de Bacillus, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422).

Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelas descritas na WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

As lipases comercialmente disponíveis preferidas incluem LIPOLASE®, LIPEX®, e LIPOLASE ULTRA® (Novozymes A/S).

Amilases: As amilases adequadas (a e/ou β) incluem aquelas de origem bacteriana ou füngica. Mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. As amilases incluem, por exemplo, aamilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de Bacillus licheniformis, descritos em mais detalhes na GB 1.296.839.

Os exemplos de amilases úteis são as variantes descritas na WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, e WO 97/43424, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, e 444.

As amilases comercialmente disponíveis são DURAMIL ,

TERMAMIL®, FUNGAMIL® e BAN® (Novozymes A/S), RAPIDASE® e PURASTAR® (da Genencor International Inc.).

Celulases: As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. As celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxisporum divulgadas na Patente U.S. N² 4.435.307, Patente U.S. N² 5.648.263, Patente U.S. N² 5.691.178, Patente U.S. N² 5.776.757 e WO 89/09259.

As celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidado de cor. Os exemplos de tais celulases são celulases descritas na EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase tais como aquelas descritas na WO 94/07998, EP 0 531 315, Patente U.S. N² 5.457.046, Patente U.S. N² 5.686.593, Patente U.S. N² 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

As celulases comercialmente disponíveis incluem CELLUZYME®, e CAREZYME® (Novozymes A/S), CLAZINASE®, e PURADAX HÁ® (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)® (Kao Corporation).

Peroxidases/Oxidases: As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem de planta, bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. Os exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e variantes destas como aquelas descritas NA WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257.

As peroxidases comercialmente disponíveis incluem GUARDZYME® (Novozymes A/S).

O(s) componente(s) enzimático(s) pode(m) ser incluído(s) em uma composição detergente pela adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou pela adição de um aditivo combinado que compreende todas as enzimas. Um aditivo de detergente da presente invenção, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, pasta fluida, etc. As formulações de aditivo de detergente preferidas são granulados, em particular granulados não empoáveis, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas fluidas.

Os granulados não empoáveis podem ser produzidos, por exemplo, como divulgado nas Patentes U.S. N~ 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos pelos métodos conhecidos na técnica. Os exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietileno glicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicérides de ácidos graxos. Os exemplos de materiais de revestimento que forma película adequados para a aplicação pelas técnicas de leito fluídico são dados na GB 1483591. As preparações de enzima líquida, por exemplo, podem ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método divulgado na EP 238.216.

A composição detergente da presente invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até 70 % de água e 0 a 30 % de solvente orgânico, ou não aquoso.

A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não iônicos incluindo semi-polares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zuiteriônicos. Os tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de 0,1 % a 60 % em peso.

Quando incluídos aqui o detergente usualmente conterá de cerca de 1 % a cerca de 40 % de um tensoativo aniônico tal como alquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), etóxissulfato de álcool, alcano secundário sulfonato, éster metílico de alfa-sulfo ácido graxo, ácido alquil- ou alquenil-succínico ou sabão.

Quando incluídos aqui o detergente usualmente conterá de cerca de 0,2 % a cerca de 40 % de um tensoativo não iônico tal como etoxilato de álcool, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminaóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, amida de poli-hidróxi alquil ácido graxo, ou derivados de N-acil N-alquila de glicosamina (“glicamidas”).

O detergente pode conter de 0 a 65 % de um formador de detergente ou agente de complexação tal como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminotetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquilou alquenil-succínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst).

O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Os exemplos são carboximetilcelulose, poli(vinilpirrolidona), poli(etileno glicol), poli(álcool vinílico), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinil-imidazol), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico, e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema de branqueamento que pode compreender uma fonte de H2O2 tal como perborato ou percarbonato que podem ser combinados com um ativador de branqueamento que forma perácido tal como tetraacetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato. Altemativamente, o sistema de branqueamento pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida, ou sulfona.

O(s) componente(s) enzimático (s) da composição detergente da presente invenção pode(m) ser estabilizado(s) usando agentes de estabilização convencionais, por exemplo, um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico tal como o ácido 4-formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada como descrito, por exemplo, na WO 92/19709 eWO 92/19708.

O detergente também pode conter outros ingredientes de detergente convencionais tais como condicionadores de tecido incluindo argilas, reforçadores de espuma, supressores de espumas, agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de solo, agentes de redeposição anti-sujeira, corantes, bactericidas, abrilhantadores ópticos, hidrótropos, inibidores de mancha, ou perfumes.

Nas composições detergentes qualquer componente enzimático, em particular os polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção, pode ser adicionado em uma quantidade que corresponde de 0,01 a 100 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, preferivelmente de 0,05 a 5 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, em particular de 0,1 a 1 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem.

Os polipeptídeos tendo atividade de celobioidrolase da presente invenção podem ser adiconalmente incorporados nas formulações de detergente divulgadas na WO 97/07202 que é por meio deste incorporada como referência.

Peptídeo de sinal

A presente invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico que compreendem um gene que codifica uma proteína, em que o gene é operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal que compreende ou que consiste de aminoácidos de 1 a 17 da SEQ ID NO: 2, em que o gene é estranho à sequência de nucleotídeo.

Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeo compreende ou consiste dos nucleotídeos de 1 a 51 da SEQ ID NO: 1.

A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinante e células hospedeiras recombinantes que compreendem tais construções de ácido nucleico.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir uma proteína que compreende (a) cultivar uma tal célula hospedeira recombinante sob condições adequada para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não é intencionado aqui a referir-se a um comprimento específico do produto codificado e, portanto, abrange peptídeos, oligopeptídeos, e proteínas. O termo “proteína” também abrange dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinação de sequências de polipeptídeo parciais ou completas obtidas a partir de pelo menos duas proteínas diferentes em que uma ou mais (diversas) podem ser heterólogas ou nativas à célula hospedeira. As proteínas incluem ainda variações alélicas que ocorrem naturalmente e engendradas das proteínas acima mencionadas e proteínas híbridas.

Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante deste, enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste, ou repórter. Em um aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidorredutase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase. Ainda em um aspecto mais preferido, a proteína é uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, invertase, lacase, uma outra lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.

O gene pode ser obtido de qualquer fonte procariótica, eucariótica, ou outra.

A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.

Exemplos

Materiais

Os produtos químicos usados como tampões e substratos foram produtos comerciais de pelo menos grau reagente.

Cepas

Myceliophthora thermophila CBS 202.75 foi usada como a fonte do gene para um polipeptídeo da Família 6 tendo atividade de celobioidrolase. Aspergillus oryzae cepa JaL355 (WO 2002/40694) foi usado para a expressão do gene Myceliophthora thermophila que codifica o polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase.

Meio

As placas de meio mínimo foram compostas por litro de 6 g de NaNO₃, 0,52 g de KC1, 1,52 g de KH₂PO₄, 1 ml de solução de elemento traço COVE, 20 g de ágar Noble, 20 ml de glicose a 50 %, 2,5 ml de MgSO₄-7H₂O, e 20 ml de uma solução a 0,02 % de biotina.

A solução de elementos traço COVE foi composta por litro de 0,04 g de Na₂B₄O₇10H₂O, 0,4 g de CuSO₄-5H₂O, 1,2 g de FeSO₄-7H₂O, 0,7 g de MnSO₄H₂O, 0,8 g de Na₂MoO₂-2H₂O, e 10 g de ZnSO₄-7H₂O.

O meio MDU2BP foi composto por litro de 45 g de maltose, 1 g de MgSO₄.7H₂O, 1 g de NaCl, 2 g de K₂SO₄, 12 g de KH₂PO₄, 7 g de extrato de levedura, 2 g de uréia, e 0,5 ml de solução de metais traço AMG; pH 5,0.

A solução de metal traço AMG foi composta por litro de 14,3 g de ZnSO₄-7H₂O, 2,5 g de CuSO₄-5H₂O, 0,5 g de NiCl₂-6H₂O, 13,8 g de FeSO₄-7H₂O, 8,5 g de MnSO₄-7H₂O, e 3 g de ácido cítrico.

O meio YEG foi composto por litro de 20 g de dextrose e 5 g de extrato de levedura.

Exemplo 1: Extração de DNA genômico de Myceliophthora thermophila CBS 202.75

Myceliophthora thermophila CBS 202,75 foi cultivada em 100 ml de meio YEG em um frasco agitado com defletor a 45°C e 200 rpm por 2 dias. Os micélios foram colhidos pela filtração usando MIRACLOTH® (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), lavados duas vezes em água deionizada, e congelados sob nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram triturados, por almofariz e pistilo, a um pó fino, e o DNA total foi isolado usando um Kit DNEASY® Plant Maxi (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Exemplo 2: Isolação de um gene da celobioidrolase da Família 6 (cel6a) de comprimento total de Myceliophthora thermophila CBS 202.75

Um gene da celobioidrolase da Família 6 (celóa) de comprimento total foi isolado a partir de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 usando um Kit GENOMAWALKER® Universal (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, DNA genômico total de Myceliophthora thermophila CBS 202.75 foi digerido separadamente com quatro enzimas de restrição diferentes (Dra I, Eco RV, Pvu II, e Stu I) que deixa extremidades abruptas. Cada lote de DNA genômico digerido foi depois ligado separadamente ao Adaptador do GENOMAWALKER® (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) para criar quatro bibliotecas. Estas bibliotecas foram depois utilizadas como padrões em reações de PCR usando dois iniciadores específicos de gene mostrados abaixo, um para a PCR primária e um para a PCR secundária. Os iniciadores foram planejados com base em uma sequência de gene da Família 6 de celobioidrolase (celóa) parcial de Myceliophthora thermophila (WO 2004/056981).

Iniciador MtCel6a-R4:

5’-ATTGGCAGCCCGGATCTGGGACAGAGTCTG-3’ (SEQ IDNO: 3) Iniciador MtCel6a-R5:

5’-CCGGTCATGCTAGGAATGGCGAGATTGTGG-3’ (SEQ IDNO: 4)

As amplificações primárias foram compostas de 1 μΐ (aproximadamente 6 ng) de cada biblioteca como padrão, 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 10 pmol de Iniciador Adaptador 1 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), 10 pmol de iniciador MtCel6a-R4, 2 μΐ de tampão IX ADVANTAGE® GC-Melt LA (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), e 1,25 unidades de Mistura de Polimerase Genômica ADVANTAGE® GC (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) em um volume final de 25 μΐ. As amplificações foram realizadas usando um EPPENDORF® MASTERCICLOR® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA) programado para prédesnaturar a 94°C por 1 minuto; sete ciclos cada um em uma temperatura de desnaturação de 94°C por 30 segundos; recozendo e alongando a 72°C por 5 minutos; e 32 ciclos cada a 67°C por 5 minutos.

As amplificações secundárias foram compostas de 1 μΐ de cada produto de PCR primária como padrão, 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 10 pmol de Iniciador Adaptador 2 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), 10 pmol de iniciador MtCel6a-R5, tampão IX ADVANTAGE® GC-Melt LA, e 1,25 unidades de Mistura de Polimerase Genômica ADVANTAGE® GC em um volume final de 25 μΐ. As amplificações foram realizadas usando um EPPENDORF®

MASTERCICLOR® 5333 programado para a pré-desnaturação a 94°C por 1 minuto; 5 ciclos cada um em uma temperatura de desnaturação de 94°C por 30 segundos; recozimento e alongamento a 72°C por 5 minutos; e 20 ciclos a 67°C por 5 minutos.

Os produtos de reação foram isolados pela eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando 40 mM de Tris base - 20 mM de acetato de sódio 1 mM de tampão de EDTA dissódico (TAE) onde uma faixa de produto de

3,5 kb da biblioteca Eco RV foi excisada do gel, purificada usando um Kit de Extração de Gel QIAQUICK® (QIAGEN, Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante, e sequenciada.

Exemplo 3: Caracterização da sequência genômica de Myceliophthora thermophila que codifica uma celobioidrolase da Família 6

O sequenciamento de DNA do fragmento de PCR de 3,5 kb foi realizado com um Sequenciador de DNA Automatizado Modelo 377 XL da Perkin-Elmer Applied Biosystems (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) usando a química de terminador de corante (Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60) e a estratégia de over o iniciador. Os seguintes iniciadores específicos de gene foram usados para o sequenciamento:

MtCel6a-F2:

5’-GCTGTAAACTGCGAATGGGTTCAG-3’ (SEQ ID NO: 5)

MtCel6a-F3:

5’-GGGTCCCACATGCTGCGCCT-3’ (SEQIDNO: 6)

MtCel6a-R8:

5’-AAAATTCACGAGACGCCGGG-3’ (SEQ ID NO: 7)

Os dados de sequência de nucleotídeo foram escrutinizados quanto a qualidade e todas as sequências foram comparadas entre si com o auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA). A sequência de 3,5 kb foi comparada e alinhada com uma sequência de gene da celobioidrolase da Família 6 (celóa) parcial de Myceliophthora thermophila (WO 2004/056981).

Um modelo de gene para a sequência de Myceliophthora thermophila foi construída com base na similaridade da proteína codificada com as proteínas da Família 6 da glicosídeo hidrolase homóloga de Thielavia terrestris, Chaetomium thermophilum, Humicola insolens, e Trichoderma reesei. A sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID NO: 2) são mostradas nas Figuras IA e 1B. O fragmento genômico codifica um polipeptídeo de 482 aminoácidos, interrompido pelos 3 introns de 96, 87, e 180 pares de base. A % do teor de G+C do gene e da sequência codificadora madura são de 61,6 % e 64 %, respectivamente. Usando o programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo de sinal de 17 resíduos foi prognosticado. A proteína madura prognosticada contém 465 aminoácidos com uma massa molecular de 49,3 kDa.

Um alinhamento global aos pares comparativo de sequências de aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle de EMBOSS com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácido deduzida do gene de Myceliophthora thermophila que codifica o polipeptídeo maduro CEL6A tendo atividade de celobioidrolase compartilhou 78,6 % e 77,6 % de identidade (excluindo intervalos) com as sequências de aminoácido deduzidas de duas proteínas da Família 6 da glicosídeo hidrolase de Chaetomium thermophilum e Humicola insolens, respectivamente (GeneSeqP números de acesso ADP84824 e AAW44853, respectivamente).

Exemplo 4: Clonagem do gene da celobioidrolase (cel6a) de Myceliophthora thermophila e construção de um vetor de expressão de

Aspergillus oryzae

Dois iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos mostrados abaixo foram planejados para amplificar pela PCR o gene da celobioidrolase de Myceliophthora thermophila a partir do DNA genômico preparado no

Exemplo 1. Um Kit de Clonagem InFusion (BD Biosciences, Paio Alto, CA, USA) foi usado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pAlLo2 (WO 2004/099228), sem a necessidade quanto a digestão de restrição e ligação.

MtCel6a-F4:

5’-ACTGGATTTACCATGGCCAAGAAGCTTTTCATCACC-3’ (SEQ ID NO: 8)

MtCel6a-R9:

-TCACCTCTAGTTAATTAATTAGAAGGGCGGGTTGGCGT-3 ’ (SEQIDNO: 9)

As letras em negrito representam a sequência codificadora. A sequência remanescente é homóloga aos sítios de inserção de pAlLo2.

Cinquenta picomoles de cada um dos iniciadores acima foram usados em uma reação de PCR composta de 100 ng de DNA genômico de Myceliophthora thermophila, 2 μΐ de Tampão IX ADVANTAGE® GC-Melt

LA, 0,4 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, e 1,25 unidades de Mistura de Polimerase Genômica ADVANTAGE® GC em um volume final de 25 μΐ. A amplificação foi realizada usando um EPPENDORF® MASTERCICLOR® 5333 programado para 1 ciclo a 94°C por 1 minuto; e 30 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 62°C por 30 segundos, e 72°C por 2 minutos. O bloco de aquecimento depois foi para um ciclo de embebimento de 4°C.

Os produtos de reação foram isolados pela eletroforese em gel de agarose a 1,0% usando tampão TAE onde uma faixa de produto de 1842 pares de base foi excisada do gel, e purificada usando um Kit de Extração de

Gel QIAQUICK® de acordo com as instruções do fabricante.

O plasmídeo pAlLo2 (WO 2004/099228) foi digerido com Nco I e Pac I, isolado pela eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão TAE, e purificado usando um Kit de Extração de Gel QIAQUICK® de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento de gene e o vetor digerido foram ligados juntos usando um Kit de Clonagem Infusion resultando em pSMail80 (Figura 2) em que a transcrição do gene da celobioidrolase foi sob o controle de um híbrido de promotores dos genes para a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae (promotor NA2-tpi). A reação de ligação (50 μΐ) foi composta de tampão IX InFusion (BD Biosciences, Paio Alto, CA, USA), IX BSA (BD Biosciences, Paio Alto, CA, USA), 1 μΐ de enzima de infusão (diluído 1:10) (BD Biosciences, Paio Alto, CA, USA), 100 ng de pAlLo2 digerido com Nco I e Pac I, e 50 ng do produto de PCR purificado celóa de Myceliophthora thermophila. A reação foi incubada na temperatura ambiente por 30 minutos. Um μΐ da reação foi usado para transformar células Supercompetentes E. coli XL10 SOLOPACK® Gold (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Um transformante de E. coli contendo pSMail80 foi detectado pela digestão de restrição e o DNA plasmídico foi preparado usando um BIOROBOT® 9600 (QIAGEN Inc., Valência, CA, USA). O inserto celóa de Myceliophthora thermophila em pSMail80 foi confirmado pelo sequenciamento de DNA.

O mesmo fragmento de PCR de 1842 pares de base foi clonado no vetor pCR®2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) usando um Kit TOPO TA CLONING®, para gerar pSMail82 (Figura 2). O inserto celóa de Myceliophthora thermophila em pSMail82 foi confirmado pelo sequenciamento de DNA. O pSMail82 de E. coli foi depositado com o Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, Peoria, IL, USA, em 6 de setembro de 2007.

Exemplo 6: Expressão do gene de celóa de celobioidrolase da Família 6 de Myceliophthora thermophila em Aspergillus oryzae JaL355

Protoplastos JaL355 de Aspergillus oryzae (WO 2002/40694) foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Três pg de pSMail80 foram usados para transformar Aspergillus oryzae JaL355.

A transformação de Aspergillus oryzae JaL355 com pSMail80 produziu cerca de 50 transformantes. Vinte transformantes foram isolados em placas de meio mínimo individual.

As placas de Meio Mínimo Confluente dos 20 transformantes foram lavadas com 5 ml de TWEEN® 20 a 0,01 % e inoculadas separadamente em 25 ml de meio MDU2BP em frascos de agitação de vidro de 125 ml e incubados a 34°C, 250 rpm. Depois de 5 dias de incubação, 5 μΐ do sobrenadante de cada cultura foram analisados em géis de Tris-HCl CRITERION® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) com uma Célula CRITERION® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante. O gel resultante foi tingido com BIO-SAFE Coomassie Stain (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram que a maioria dos transformantes tiveram uma faixa maior de aproximadamente 70 kDa.

Uma placa confluente de um transformante, designado transformante 14, foi lavada com 10 ml de TWEEN® 20 a 0,01 % e inoculada em uma Fembach de 2 litros contendo 500 ml de meio MDU2BP para gerar caldos para a caracterização da enzima. A cultura foi colhida no dia 5 e filtrada usando uma Membrana EXPRESS® Plus de 0,22 pm (Millipore, Bedford, MA, USA).

Exemplo 7: Caracterização de celobioidrolase CEL6A de Myceliophthora thermophila

Forragem de milho foi pré-tratada no National Renewable

Energy Laboratory (NREL) do U.S. Department of Energy, Boulder, CO, USA, usando ácido sulfúrico diluído. As seguintes condições foram usadas para o pré-tratamento: 0,048 g de ácido sulfurico por g de biomassa seca a 190° C e 25 % p/p de sólidos secos por aproximadamente 1 minuto. Os sólidos insolúveis em água na forragem de milho pré-tratada (PCS) conteve

53,2 % de celulose, 3,6 % de hemicelulose e 29,8 % de lignina. Celulose e hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise com ácido sulfurico de dois estágios com a análise subsequente de açúcares pela cromatografia Líquida de Alto Desempenho usando o Procedimento Analítico Padrão NREL #002. A lignina foi determinada gravimetricamente depois de hidrolisar as frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfurico usando o Procedimento Analítico Padrão NREL #003. Antes da hidrólise enzimática, a PCS foi lavada com um volume grande de água destilada até que o pH fosse mais alto do que 4,0, depois peneirado através da peneira de malha 100, e finalmente autoclavada a 121°C por 30 minutos. O teor seco da PCS lavada e peneirada foi descoberto ser de 6,54 %.

O caldo de frasco agitado de celobioidrolase CEL6A de Myceliophthora thermophila preparado como descrito no Exemplo 6 foi dessalinizado usando uma coluna ECONO-PAC® 10DG (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). A concentração de proteína foi determinada usando um Kit de Ensaio de Proteína Microplate BCA® (Pierce, Rockford, IL, USA).

CEL7B endoglicanase I de Trichoderma reesei foi clonada e expressada em Aspergillus oryzae JaL250 como descrito na WO 2005/067531. A concentração de proteína foi determinada usando um Kit de Ensaio de Proteína Microplate BCA®. A CEL7B endoglicanase I de Trichoderma reesei foi dessalinizada e trocada em tampão em 150 mM de NaCl-20 mM de acetato de sódio pH 5,0 usando uma Coluna de Dessalinização HIPREP® 26/10 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway,

NJ, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

A beta-glicosidase Cel3A de Aspergillus oryzae foi recombinantemente preparada como descrito na WO 2004/099228, e purificada como descrito por Langston et al., 2006, Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteomics 1764: 972-978. A concentração de proteína foi determinada usando um Kit de Ensaio de Proteína Microplate BCA®. A betaglicosidase Cel3A de Penicillium brasilianum IBT 20888 foi recombinantemente produzida e dessalinizada usando uma Coluna de Dessalinização HIPREP® 26/10, como acima, e purificada ainda com uma coluna Mono Q® usando um Sistema AKTA FPLC (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

O gene da celobioidrolase CEL6A de Trichoderma reesei foi isolado a partir de Trichoderma reesei RutC30 como descrito na WO 2005/056772. O gene da celobioidrolase CEL6A de Trichoderma reesei foi expressado em Fusarium venenatum usando pEJG61 como um vetor de expressão de acordo com os procedimentos descritos no Pedido de Patente U.S. 20060156437. A fermentação foi realizada como descrito no Pedido de Patente U.S. 20060156437. A concentração de proteína foi determinada usando um Kit de Ensaio de Proteína Microplate BCA®. a celobioidrolase CEL6A de Trichoderma reesei foi dessalinizada e trocada em tampão em 20 mM de acetato de sódio-150 mM de NaCl pH 5,0 usando uma coluna de dessalinização HIPREP® 26/10 de acordo com as instruções do fabricante.

A hidrólise de PCS foi realizada em placas de 96 reservatórios profundos (Axygen Scientific, Union City, CA, USA) selada por um selador de placa (ALPS-300, Abgeno, Epsom, UK), com um volume de reação total de 1,0 ml. Para testar a atividade da celobioidrolase de Myceliophthora thermophila, a PCS foi carregada a 1 mg de celobioidrolase por g de celulose, junto com 0,5 mg de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae por g de celulose. A celobioidrolase CEL6A de Trichoderma reesei (1 mg por g de celulose) junto com beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (0,5 mg por g de celulose) foram usados como um controle para a comparação da celobioidrolase CEL6A de Myceliophthora thermophila. A hidrólise de PCS foi realizada no pH 5,0, 50°C em um Incubador Encamisado com CO2 TS Autoflow (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). As reações foram conduzidas em triplicatas e alíquotas foram tomadas durante o curso da hidrólise. As reações de hidrólise da PCS foram interrompidas misturando-se uma alíquota de 20 μΐ de cada hidrolisado com 180 μΐ de NaOH 0,1 M (reagente de parada). Diluições em série apropriadas foram geradas para cada amostra e o teor de açúcar redutor determinado usando um ensaio da hidrazida do ácido parahidroxibenzóico (PHBAH, Sigma, St. Louis, MO, USA) adaptado para um formato de microplaca de 96 reservatórios. Uma alíquota de 100 μΐ de uma amostra apropriadamente diluída foi colocada em uma microplaca de fundo cônico de 96 reservatórios. As reações foram iniciadas pela adição de 50 μΐ de

1,5 % (p/v) PHBAH em 2 % de NaOH para cada reservatório. As placas foram aquecidas descobertas a 95 °C por 10 minutos, depois que 50 μΐ de água destilada foram adicionadas a cada reservatório. Uma alíquota de 100 μΐ de cada reservatório foi transferida para uma placa de 96 reservatórios de fundo redondo e a absorbância a 410 nm foi medida usando uma Leitora de Microplaca SPECTRAMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Os padrões de glicose (0,1 a 0,0125 mg/ml diluídos com 0,4 % de hidróxido de sódio) foram usados para preparar uma curva padrão para traduzir os valores A₄ionm obtidos em equivalentes de glicose. Os equivalentes resultantes foram usados para calcular a porcentagem de conversão de celulose PCS para cada reação.

O grau de conversão de celulose para açúcar redutor (% de conversão) foi calculada usando a seguinte equação:

% de Conversão = RS (mg/mi)x 100 x 162 / (celulose (_mg/mi) x 180) =

RS (mg/ml) X 100 / (celulose (mg/ml) x Ijl 11)

Nesta equação, RS é a concentração de açúcar redutor em solução medida em equivalentes de glicose (mg/ml), e o fator 1,111 reflete o ganho de peso na conversão de celulose para glicose.

Os resultados estão resumidos na Tabela 1. A celobioidrolase CEL6A de Myceliophthora thermophila teve atividade similar ou levemente mais alta na PCS do que a celobioidrolase CEL6A de Trichoderma rcesei na presença de beta-glicosidase de Aspcrgillus oryzae.

Tabela 1. Conversão de celulose pela celobioidrolase CEL6A de Myceliophthora thermophila ou celobioidrolase CEL6A de Trichoderma recsei mais beta-glicosidase de Aspcrgillus oryzae

Teste	Nome da Enzima	Carga, mg/g	de	Conversão em 65 horas%
1	M. thermophila CBH + ieA. oryzae	1+0,5		5,0
2	T. reesei CBH + betaoryzae	1+0,5		3,7

CelóA de Myceliophthora thermophila dessalinizada foi purificada ainda nais através de uma coluna FENIL SUPEROSE® HR 16/10 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) usando um Sistema AKTA FPLC. A SDS-PAGE da amostra mostrou que a mesma foi pelo menos 90 % pura. Outras enzimas usadas abaixo também foram purificadas ainda mais, como acima, usando um Sistema AKTA FPLC, com pureza mais alta do que 90 %.

A hidrólise da PCS (40 g/L em reação) foi conduzida em placas de 96 reservatórios profundos e selada como descrito acima, com um volume de reação total de 1,0 ml. A celobioidrolase CelóA de Myceliophthora thermophila, em comparação com a celobioidrolase CelóA de Trichoderma reesei, foram testadas na hidrólise de PCS usando misturas de enzima artificial no pH 5, 50 e 55°C (Incubado Encamisado com CO₂ TS Autoflow). As misturas de enzima foram compostas de endoglicanase Cel7B de Trichoderma reesei (2 mg/g de celulose), beta-glicosidase GH3A de

Penicillium brasilianum (0,3 mg/g de celulose), e celobioidrolase Cel6A de Myceliophthora thermophila ou celobioidrolase Cel6A de Trichoderma reesei, (2 mg/g de celulose). As reações de hidrólise de PCS foram interrompidas misturando-se uma alíquota de 20 μΐ de cada hidrolisado com

180 μΐ de NaOH 0,1 M (reagente de parada). A análise das reações de hidrólise e cálculos foram realizados como descritos acima, os resultados da conversão de celulose estão resumidos na Tabela 2.

Tabela 2. Conversão de celulose pela endoglicanase Cel7B de Trichoderma reesei (2 mg/g de celulose), beta-glicosidase GH3A de Penicillium brasilianum (0,3 mg/g de celulose), e celobioidrolases CelóA de Myceliophthora thermophila ou CelóA de Trichoderma reesei (2 mg/g de celulose), pH 5, 50 e 55°C

Teste	Nome da Enzima (mg/g de celulose)	Temperatura, °C	Conversão a 72 h, %
1	endoglicanase Cel7B de T. reesei (2) + beta-glicosidase GH3A de P. brasilianum (0,3) + celobioidrolase CelóA de M. thermophila (2)	50	22,5
2	endoglicanase Cel7B de T. reesei (2) + beta-glicosidase GH3 A de P. brasilianum (0,3) + celobioidrolase CelóA T. reesei (2)	50	19,6
3	endoglicanase Cel7B de T. reesei (2) + beta-glicosidase GH3A de P. brasilianum (0,3) + celobioidrolase CelóA de M. thermophila (2)	55	25,9
4	endoglicanase Cel7B de T. reesei (2) + GH3A de P. brasilianum (0,3) + celobioidrolase CelóA de T. reesei (2)	55	18,2

A Tabela 1 mostrou que a celobioidrolase 6A de Myceliophthora thermophila superou a celobioidrolase 6A de Trichoderma reesei na hidrólise de PCS tanto a 50 quanto a 55°C, e especialmente a 55°C. Depósito de Material Biológico

O seguinte material biológico foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com a Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University

100

Street, Peoria, IL, USA, e dado o seguinte número de acesso:

Depósito Número de Acesso Data do Depósito

E. coli pSMail82 NRRL B-50059 6 de setembro de 2007

A cepa foi depositada sob condições que garantem que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente para uma pessoa determinada pelas leis de patente estrangeiras a ser intitulada para isso. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito está disponível como requerido pelas leis de patente estrangeiras em países em que as contrapartes do pedido objeto, ou sua progênie estão depositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção objeto em detrimento dos direitos de patente concedidos pela ação governamental.

A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, visto que estes aspectos são intencionados como ilustrações de diversos aspectos da invenção. Qualquer um dos aspectos equivalentes são intencionados a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas aqui mostradas e descritas tomar-se-ão evidentes àqueles habilitados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são intencionadas a cair dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições controlarão.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase, em que o polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 1 ou sua sequência codificadora do polipeptídeo maduro, em que o polinucleotídeo é heterólogo à célula hospedeira microbiana transgênica.
2. Célula hospedeira microbiana transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase consiste na SEQ ID NO: 2 ou no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.
3. Célula hospedeira microbiana transgênica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo consiste nos aminoácidos 18 a 482 da SEQ ID NO: 2.
4. Célula hospedeira microbiana transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo de SEQ ID NO:1 que codifica o polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase está contido no plasmídeo pSMai182, que está contido em E. coli NRRL B-50059.
5. Método para produzir um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira microbiana transgênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 sob condições adequadas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
6. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo sinal que consiste nos nucleotídeos 1 a 51 de SEQ ID NO: 1, em que o gene é heterólogo à sequência de nucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.
7. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação

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6, caracterizada pelo fato de que o peptídeo sinal consiste nos aminoácidos 1 a 17 de SEQ ID NO: 2.
8. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira microbiana transgênica para a produção da proteína, em que a célula hospedeira microbiana transgênica compreende a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 6 ou 7; e (b) recuperar a proteína.
9. Método para degradar ou converter um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico com uma composição de enzima que compreende uma ou mais proteínas celulolíticas na presença de um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase consistindo na SEQ ID NO: 2 ou no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do polipeptídeo ser codificado por um polinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 ou sua sequência codificadora do polipeptídeo maduro.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste dos aminoácidos 18 a 482 de SEQ ID NO: 2.
12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é codificado pelo polinucleotídeo de SEQ ID NO:1 contido no plasmídeo pSMai182, que está contido em E. coli NRRL B50059.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda recuperar o material celulósico degradado ou convertido.
14. Método para produzir um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) sacarificar um material celulósico com uma composição de

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3/4 enzima que compreende uma ou mais proteínas celulolíticas na presença de um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase consistindo na SEQ ID NO: 2 ou no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;

(b) fermentar o material celulósico sacarificado da etapa (a) com um ou mais microorganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da frmentação.
15. Composição detergente, caracterizada pelo fato de que compreende um tensoativo e um polipeptídeo tendo atividade de celobioidrolase consistindo na SEQ ID NO: 2 ou no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
16. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 ou sua sequência codificadora do polipeptídeo maduro, operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterológas que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
17. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a sequência codificadora do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 codifica um polipeptídeo consistindo nos aminoácidos 18 a 482 de SEQ ID NO: 2.
18. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 está contido no plasmídeo pSMai182, que está contido em E. coli NRRL B-50059.
19. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 ou sua sequência codificadora do polipeptídeo maduro, operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que direcionam a produção do polipeptídeo em uma célula hospedeira microbiana transgênica.

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20. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 codifica um polipeptídeo consistindo nos aminoácidos 18 a 482 de SEQ ID NO: 2.

21. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de SEQ ID NO:1 está contido no plasmídeo pSMai182, que está contido em E. coli NRRL B-50059.

Petição 870170097143, de 12/12/2017, pág. 9/9

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