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BRPI0816689B1 - Composição de vacina, kit e método para a confecção de uma composição de vacina para a prevenção ou tratamento de infecção por streptococcus pyogenes - Google Patents

Composição de vacina, kit e método para a confecção de uma composição de vacina para a prevenção ou tratamento de infecção por streptococcus pyogenes Download PDF

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BRPI0816689B1
BRPI0816689B1 BRPI0816689-7A BRPI0816689A BRPI0816689B1 BR PI0816689 B1 BRPI0816689 B1 BR PI0816689B1 BR PI0816689 A BRPI0816689 A BR PI0816689A BR PI0816689 B1 BRPI0816689 B1 BR PI0816689B1
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BR
Brazil
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seq
gas57
antigen
vaccine composition
Prior art date
Application number
BRPI0816689-7A
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English (en)
Inventor
Immaculada Margarit y Ros
Guido Grandi
Chiara Zingaretti
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of BRPI0816689A2 publication Critical patent/BRPI0816689A2/pt
Publication of BRPI0816689B1 publication Critical patent/BRPI0816689B1/pt

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Abstract

atígenos de gas57 mutante e anticcorpos de gas57. a invenção fornece mutantes de gas57 que são incapazes de clivar il-8 e substratos similares, mas que ainda mantêm a capacidade de induzir proteção contra s. poyogenes. a invenção também fornece anticorpos que se ligam especificamente a gas57 e que inibem sua capacidade de clivar il-8 e substratos similares. os mutantes são úteis, entre outros, em composições de vacina par induzir proteção contra s. pyogenes. os anticorpos são úteis, por exemplo, como terapêuticos para o tratamento de infecções por s. pyogenes.

Description

Campo da invenção
[001] Esta invenção está no campo de imunologia e vacinologia. Em particular, ela se relaciona a antígenos derivados de Streptococcus pyogenes e seu uso em imunização.
Fundamento da invenção
[002] Antígeno GAS57 de S. pyogenes (Streptococcus Grupo A; GAS), expresso como proteína recombinante e purificado a partir de E. coli, induz atividade protetora contra um desafio letal com S. pyogenes em camundongos. No entanto, GAS57 é uma protease que cliva e inativa quimiocinas humanas como interleucina-8 (IL-8) (Edwards e cols., J. Infectious Diseases 192, 783-90, 2005; Hidalgo-Grass e cols., EMBO 1 25, 4628-37, 2006). Essa propriedade de GAS57 pode impedir seu uso em uma composição de vacina, devido a possíveis efeitos colaterais. Portanto, há uma necessidade na técnica por antígenos de GAS57 que sejam incapazes de clivar quimiocinas humanas, mas que ainda mantenham a capacidade de induzir proteção contra S. pyogenes. Há também uma necessidade na técnica por anticorpos que se liguem especificamente a antígenos de GAS57 e que prejudiquem a capacidade de GAS57 de clivar IL-8 e outros substratos.
Breve descrição das figuras
[003] FIG. 1. foto em gráfico de um SDS-gel de poliacrilamida que demonstra a clivagem de IL-8 por GAS57 de tipo selvagem.
[004] FIG. 2. Alinhamento BLAST de GAS57 de tipo selvagem (query, Id. de Seq. N°: 1) vs uma peptidase serina protease C5a (Sbjct, Id. de Seq. N°: 9).
[005] FIG. 3. foto em gráfico de de SDS-géis de poliacrilamida que demonstram que mutante em ponto de GAS57 D151A perdeu a capacidade de clivar IL-8.
[006] FIG. 4. Gráfico que mostra os resultados de um ensaio de ELISA que demonstra que o mutante em ponto de GAS57 D151A perdeu a capacidade de clivar IL-8.
[007] FIGS. 5A-B. Photomicrographs de SDS-géis de poliacrilamida que demonstram que mutantes únicos de GAS57 D151A e S617A e o mutante duplo D151A + S617A perderam a atividade proteolítica de GAS57.
[008] FIG. 6. Gráfico que mostra os resultados de um ensaio de ELISA que demonstra que mutantes únicos D151A e S617A e mutantes duplos de GAS57 D151A + S617A perderam a atividade proteolítica de GAS57.
[009] FIG. 7. Foto em gráfico de um SDS-gel de poliacrilamida que demonstra que GAS57 de tipo selvagem é modificado pós-tradução em dois fragmentos de polipeptídeo de 150,5 kDa e 23,4 kDa.
[010] FIG. 8. Foto em gráfico de um SDS-gel de poliacrilamida que demonstra que mutantes D151A, S617A e D151A + S617A de GAS57 não são modificados pós-tradução em dois fragmentos de polipeptídeo de 150,5 kDa e 23,4 kDa comparados ao tipo selvagem (setas pretas). Uma banda principal de 174 kDa que corresponde à proteína não processada é, ao contrário, presente nas linhas que correspondem a cepas de mutante inativo (seta cinza).
[011] FIGS. 9A-B. Resultados de ensaio de ELISA que demonstram a inibição dose-dependente de clivagem de IL-8 mediada por GAS57 por anti-soro policlonal contra GAS57 em duas diferentes condições de experimento. FIG. 9A, incubação de 8 horas, 0,1 μg/ml de GAS57. FIG. 9B, incubação de 24 horas, 0,05 μg/ml de GAS57.
[012] FIG. 10A-GG. Alinhamentos de antígenos de GAS57 de diferentes cepas/tipos M. A tríade catalítica (D, H, S) está em negrito. FIG. 10A, aminoácidos 1-50 (números de aminoácido no topo de cada uma das FIGS. 10A-GG referem- se à seqüência de aminoácidos de gas57M1 SF370, Id. de Seq. N°: 1); FIG. 10B, aminoácidos 51-100; FIG. 10C, aminoácidos 101-150; FIG. 10D, aminoácidos 151-200; FIG. 10E, aminoácidos 201-250; FIG. 10F, aminoácidos 251-300; FIG. 10G, aminoácidos 301-350; FIG. 11-1, aminoácidos 351400, FIG. 10I, aminoácidos 401-450; FIG. 10J, aminoácidos 451-500; FIG. 10K, aminoácidos 501-550; FIG. 10L, aminoácidos 551-600; FIG. 10M, aminoácidos 601-650; FIG. 10N, aminoácidos 651-700; FIG. 100, aminoácidos 701-750; FIG. 10P, aminoácidos 751800; FIG. 10Q, aminoácidos 801-850; FIG. 10R, aminoácidos 851-900; FIG. 10S, aminoácidos 901-950; FIG. 10T, aminoácidos 951-1000; FIG. 10U, aminoácidos 1001-1050; FIG. 10V, aminoácidos 1051-1100; FIG. 10W, aminoácidos 1101-1150; FIG. 10X, aminoácidos 1151-1200; FIG. 10Y, aminoácidos 1201-1250; FIG. 10Z, aminoácidos 1251-1300; FIG. 10AA, aminoácidos 1301-1350; FIG. 10BB, aminoácidos 1351-1400; FIG. 10CC, aminoácidos 1401-1450; FIG. 10DD, aminoácidos 1451-1500; FIG. 10EE, aminoácidos 1501-1550; FIG. 10FF, aminoácidos 1551-1600; FIG. 10GG, aminoácidos 1601-1650. gas57Ml_SF370, Id. de Seq. N°: 1; gas57M1_31075, Id. de Seq. N°: 10; gas57M1_31237, Id. de Seq. N°: 11; gas57M1_3348, Id. de Seq. N°: 12; gas57M2_34585, Id. de Seq. N°: 13; gas57M3,1_21398, Id. de Seq. N°: 14; gas57M44-61_20839, Id. de Seq. N°: 15; gas57M6,31_20022, Id. de Seq. N°: 16; gas57M11_20648, Id. de Seq. N°: 17; gas57M23_2071, Id. de Seq. N°: 18; gas57M18,3_40128, Id. de Seq. N°: 19; gas47M4_10092, Id. de Seq. N°: 20; gas57M4_30968, Id. de Seq. N°: 21; gas57M6,31_22692, Id. de Seq. N°: 22; gas57M68,5_22814, Id. de Seq. N°: 23; gas57M68_23623, Id. de Seq. N°: 24; gas57M2_10064, Id. de Seq. N°: 25; gas57M2_10065, Id. de Seq. N°: 26; gas57M77_10251, Id. de Seq. N°: 27; gas57M77_10527, Id. de Seq. N°: 28; gas57M77 20696, Id. de Seq. N°: 29; gas57M89_21915, Id. de Seq. N°: 30; gas57M89_23717, Id. de Seq. N°: 31; gas57M94 10134, Id. de Seq. N°: 32; gas57M28 10164, Id. de Seq. N°: 33; gas57M28_10218, Id. de Seq. N°: 34; gas57M29 10266, Id. de Seq. N°: 35; gas57M28 10299, Id. de Seq. N°: 36; gas57M28_30176, Id. de Seq. N°: 37; gas57M28_30574, Id. de Seq. N°: 38; gas57M6,921802, Id. de Seq. N°: 39; gas57M75 20671, Id. de Seq. N°: 40; gas57M75 30603, Id. de Seq. N°: 41; gas57M75 30207, Id. de Seq. N°: 42; gas57M22_20641, Id. de Seq. N°: 43; gas57M22 23465, Id. de Seq. N°: 44; gas57M3,1_30610, Id. de Seq. N°: 45; gas57M3,1_40603, Id. de Seq. N°: 46; gas57M3,28_24214, Id. de Seq. N°: 47; gas57M3,34_10307, Id. de Seq. N°: 48; gas57M4_40427, Id. de Seq. N°: 49; gas57M3_2721, Id. de Seq. N°: 50; gas57M12_10296, Id. de Seq. N°: 51; gas57M12_10035, Id. de Seq. N°: 52; gas57M12_20069, Id. de Seq. N°: 53; gas57M1222432, Id. de Seq. N°: 54; gas57M4_40499, Id. de Seq. N°: 55; and gas57M6,1_21259, Id. de Seq. N°: 56; gas57M75_20671, Id. de Seq. N°: 80.
[013] FIG. 11. Alinhamento de quimiocinas humanas. GAS57 cliva CXCL8 (IL-8) (Id. de Seq. N°: 81) entre os dois aminoácidos em negrito e sublinhado. CXCL4, Id. de Seq. N°: 57; CXCL7/NAP-2, Id. de Seq. N°: 58; CXCL1/GROa, Id. de Seq. N°: 59; CXCL2/GROβ, Id. de Seq. N°: 60; CXCL3/GROY, Id. de Seq. N°: 61; CXCL6/GCP-2, Id. de Seq. N°: 62; CXCL12/SDF-1α, Id. de Seq. N°: 63; CXCL12/SDF-1Y, Id. de Seq. N°: 64; CXCL12/SDF1β, Id. de Seq. N°: 65; CXCL9/MIG, Id. de Seq. N°: 66; CXCL10/IP10, Id. de Seq. N°: 67; e CXCL11, Id. de Seq. N°: 68.
[014] FIG. 12. Foto em gráfico de SDS-géis de poliacrilamida que demonstram a clivagem de quimiocinas CXC por GAS57.
Descrição detalhada da invenção
[015] A invenção fornece mutantes de Spy0416 ou GAS57 (aqui referido como "antígenos de GAS57 mutantes", "mutantes de GAS57", "antígenos de GAS57 mutante") que são incapazes de clivar quimiocinas humanas como IL-8, mas que ainda mantêm a capacidade de induzir proteção contra S. pyogenes. Mutantes de GAS57 da invenção são úteis em composições de vacina, para induzir proteção contra S. pyogenes. A invenção também fornece anticorpos que se ligam especificamente a GAS57 de tipo selvagem e que inibem a capacidade de GAS57 de clivar IL-8 e substratos similares. É contemplado que os anticorpos serão úteis como terápicos para a prevenção e/ou tratamento de infecções por S. pyogenes.
Antígenos de GAS57 mutante
[016] "GAS57" é também referido como ‘Spy0416’ (M1), ‘SpyM3_0298’ (M3), ‘SpyM18_0464’ (M18) e ‘prtS.’ GAS57 também foi identificado como uma proteinase envelope celular. Veja WO 02/34771 e US 2006/0258849. Há 49 seqüências de GAS57 de 17 diferentes tipos M (1, 2, 3, 4, 6, 11, 12, 18, 22, 23, 28, 44/61, 68, 75, 77, 89, 94); de acordo com o “Centers for Disease Control”, os 17 diferentes tipos M respondem por mais de 95% dos casos de faringite e cerca de 68% dos isolados de GAS invasivos nos Estados Unidos. As seqüências de aminoácidos de antígenos de GAS57 de tipo selvagem são apresentadas na listagem de seqüência como Id. de Seq. Nos:1, 10-56 e 80. GAS57 de tipo selvagem contém dois peptídeos não covalentemente associados (veja o Exemplo 5 e FIG. 7).
[017] Antígenos de GAS57 mutante de acordo com a invenção têm uma atividade proteolítica contra interleucina 8 (IL-8) que é reduzida em pelo menos 50% (por exemplo, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%) em relação ao GAS57 de tipo selvagem como detectado por SDS-PAGE ou ELISA (veja os Exemplos 2 e 3), mas são imunogênicos, por exemplo, eles conferem proteção contra desafio letal com GAS em um modelo de camundongo (Exemplo 4). Preferivelmente, um mutante de GAS57 da invenção também não cliva outras citocinas humanas, como CXCL1/GROα (por exemplo, Id. de Seq. N°: 59), CXCL2/GROβ (por exemplo, Id. de Seq. N°: 60), CXCL3/GROY (por exemplo, Id. de Seq. N°: 61), CXCL4 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 57), CXCL12/SDF-1α (por exemplo, Id. de Seq. N°: 63), CXCL12/SDF-1β (por exemplo, Id. de Seq. N°: 65), CXCL12/SDF-1Y (por exemplo, Id. de Seq. N°: 64), CXCL5/ENA78 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 82), CXCL6/GCP-2 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 62), CXCL7/NAP-2 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 58), CXCL9/MIG (por exemplo, Id. de Seq. N°: 66), CXCL10/IP10 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 67), CXCL11 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 68), CXCL13 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 83), CXCL14 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 84) e CXCL16 (por exemplo, Id. de Seq. N°: 85). Inesperadamente, mutantes de GAS57 da invenção são polipeptídeos únicos, em contraste com a GAS57 de tipo selvagem, que sofre processamento pós- tradução (maturação) para formar dois peptídeos não-covalentemente associados (Exemplos 5 e 6). A capacidade de obter tais antígenos na forma de um peptídeo único facilita a produção da proteína recombinante para objetivos de vacina.
[018] Os mutantes de GAS57 da invenção incluem aqueles com uma alteração de aminoácido (ou seja, uma substituição, deleção ou inserção) em um ou mais dos aminoácidos D151, H279 ou S617, numerados de acordo com a seqüência de GAS57 de tipo selvagem mostrada em Id. de Seq. N°: 1 (veja a FIG. 10).
[019] Os mutantes de GAS57 da invenção incluem alterações únicas, duplas ou triplas de aminoácidos ("mutantes únicos", "mutantes duplos", "mutantes triplos") nas posições D151, H279 e/ou S617. Assim, os mutantes de GAS57 podem compreender o seguinte: i. D151A (Id. de Seq. N°: 2), D151R, 151N, D151C, D151Q, D151E, D151G, D151H, D151I, D151L, D151K, D151M, D151F, D151P, D151S, D151T, D151W, D151Y ou D151V; ii. H279A, H279R, H279N, H279D, H279C, H279Q, H279E, H279G, H279I, H279L, H279K, H279M, H279F, H279P, H279S, H279T, H279W, H279Y ou H279V; iii. S617A (Id. de Seq. N°: 3), S617R, S617N, S617D, S617C, S617Q, S617E, S617G, S617H, S617I, S617L, S617K, S617M, S617F, S617P, S617T, S617W, S617Y ou S617V; iv. ΔD 151; ou ΔH279; ou ΔS617; e v. combinações destes, como D151A + S617A (Id. de Seq. N°: 4).
[020] Os antígenos de GAS57 mutante da invenção também incluem polipeptídeos de fusão que compreendem um antígeno mutante de GAS57 como acima revelado e outro antígeno de GAS. Os antígenos de GAS são revelados, por exemplo, em WO 02/34771, e incluem, sem limitação, GAS25 (Spy0167; gi13621460) GAS39 (Spy0266; gi13621542 ), GAS40 (Spy0269; gi13621545), GAS42 (Spy0287; gi13621559), GAS45 (M5005_Spy0249; gi71910063), GAS58 (Spy0430; gi13621663), GAS84 (SPy1274; 13622398) ,GAS95 (SPy1733; 13622787), GAS117 (Spy0448; gi13621679), GAS130 (Spy0591;gi13621794), GAS137 (Spy0652; gi13621842), GAS159 (Spy1105; gi13622244), GAS193 (Spy2025; gi3623029), GAS202 (Spy1309; gi13622431), GAS217 (Spy0925, gi1362208), GAS236 (Spy1126; gi13622264), GAS253 (Spy1524; gi13622611), GAS277 (Spy1939; gi13622962), GAS294 (Spy1173; gi13622306), GAS309 (Spy0124; gi13621426), GAS366 (Spy1525; gi13622612), GAS372 (Spy1625; gi13622698), GAS384 (Spy1874; gi13622908), GAS389 (Spy1981; gi13622996), GAS504 (Spy1751; gi13622806), GAS509 (Spy1618; gi13622692), GAS290 (SPy1959; gi13622978), GAS511 (Spy1743; gi13622798), GAS527 (Spy1204; gi3622332), GAS529 (Spy1280; gi3622403) e GAS533 (Spy1877; gi13622912). Os antígenos de GAS também incluem GAS68 (Spy0163; gi13621456), GAS84 (Spy1274; gi13622398), GAS88 (Spy1361; gi13622470), GAS89 (Spy1390; gi13622493), GAS98 (Spy1882; gi13622916), GAS99 (Spy1979; gi13622993), GAS102 (Spy2016, gi13623025), GAS146 (Spy0763; gi13621942), GAS195 (Spy2043; gi13623043), GAS561 (Spy1134; gi13622269), GAS179 (Spy1718, gi13622773) e GAS681 (spy1152; gi1362228).
[021] A invenção também inclui equivalentes de mutantes de GAS57 que são polipeptídeos únicos, que não clivam IL-8 como determinado por SDS-PAGE ou ELISA, que são imunogênicos, e que conferem proteção contra desafio letal com GAS em um modelo de camundongo. Tais equivalentes podem incluir antígenos de GAS57 mutante com deleções, inserções e/ou substituições de aminoácidos nas posições diferentes de D151, H279 ou S617, incluindo deleções de até cerca de 40 aminoácidos no terminal N ou C (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos). Tais equivalentes assim incluem mutantes de GAS57 que têm deleções, inserções e/ou substituições nas posições diferentes de D151, H279 ou S617, além de terem uma alteração de aminoácido em um ou mais dos aminoácidos D151, H279 ou S617 e S617, como acima descrito.
Moléculas de ácido nucléico
[022] A invenção inclui moléculas de ácido nucléico que codificam antígenos de GAS57 mutantes. A invenção também inclui moléculas de ácido nucléico que compreendem seqüências de nucleotídeos que têm pelo menos 50% de identidade de seqüência a tais moléculas. Dependendo da seqüência em particular, o grau de identidade de seqüência é preferivelmente maior que 50% (por exemplo, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais). A identidade entre as seqüências de nucleotídeos é preferivelmente determinada pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman como implementado no programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando uma pesquisa “affine gap” com parâmetros de “gap open penalty” = 12 e “gap extension penalty” = 1.
[023] A invenção também fornece moléculas de ácido nucléico que podem hibridizar a essas moléculas. As reações de hibridização podem ser realizadas sob condições de diferentes "rigores". Condições que aumentam o rigor de uma reação de hibridização são amplamente conhecidas e publicadas na técnica. Veja, por exemplo, a página 7.52 de Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Exemplos de condições relevantes incluem (em ordem de rigor crescente): temperaturas de incubação de 25°C, 37°C, 50°C, 55°C e 68°C; concentrações de tampão de 10X SSC, 6X SSC, 1X SSC e 0,1X SSC (em que SSC é 0,15 M NaCl e 15 mM tampão de citrato) e seus equivalentes que usam outros sistemas de tampão; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50% e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 ou mais etapas de lavagem; tempo de incubação e lavagem de 1, 2 ou 15 minutos; e soluções de lavagem de 6X SSC, IX SSC, 0,1X SSC ou água deionizada. As técnicas de hibridização e sua otimização são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook, 1989; Ausubel e cols., eds., Short Protocols in Molecular Biology, 4â ed., 1999; Patente U.S. 5.707.829; Ausubel e cols., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 30, 1987.
[024] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucléico da invenção hibridizam a um alvo sob condições de baixo rigor; em outras modalidades, as moléculas de ácido nucléico da invenção hibridizam sob condições de médio rigor; em modalidades preferidas, as moléculas de ácido nucléico da invenção hibridizam sob condições de alto rigor. Um exemplo de uma condição de hibridização de baixo rigor é 50°C e 10X SSC. Um exemplo de uma condição de hibridização de médio rigor é 55°C e 1X SSC. Um exemplo de condição de hibridização de alto rigor é 68°C e 0,1X SSC. Produção de antígenos de GAS57 mutante Produção recombinante
[025] A redundância do código genético é bem conhecida. Portanto, qualquer molécula de ácido nucléico (polinucleotídeo) que codifica proteína de GAS57 de tipo selvagem ou uma proteína de GAS57 mutante da invenção pode ser usada para produzir aquela proteína de modo recombinante. Exemplos de seqüências de nucleotídeos que codificam GAS57 de tipo selvagem, GAS57 mutante D151A, GAS57 mutante S617A e GAS mutante D151A + S617A são fornecidos nos Id. de Seq. Nos: 5, 6, 7 e 8, respectivamente. Moléculas de ácido nucléico que codificam GAS57 de tipo selvagem tambem podem ser isoladas da bactéria de S. pyogenes adequada com o uso de técnicas padrão de purificação de ácido nucléico ou podem ser sintetizadas com o uso de uma técnica de amplificação, como a reação em cadeia de polimerase (PCR), ou pelo uso de um sintetizador automático. Veja Caruthers e cols., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215 223, 1980; Horn e cols. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225 232, 1980; Hunkapiller e cols., Nature 310, 105-11, 1984; Grantham e cols., Nucleic Acids Res. 9, r43-r74, 1981.
[026] As moléculas de cDNA podem ser feitas com técnicas padrão de biologia molecular, com o uso de mRNA como um modelo. As moléculas de cDNA podem assim ser replicadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas na técnica. Uma técnica de amplificação, como PCR, pode ser usada para obter cópias adicionais de polinucleotídeos da invenção, com o uso de DNA genômico ou cDNA como um modelo.
[027] Se desejado, os polinucleotídeos podem ser geneticamente criados com o uso de métodos geralmente conhecidos na técnica para alterar seqüências que codificam antígenos por uma variedade de razões, incluindo, sem limitação, alterações que modificam a clonagem, processamento e/ou expressão do polipeptídeo ou produto de mRNA. O embaralhamento de DNA por fragmentação aleatória e remontagem de PCR de fragmentos de gene e oligonucleotídeos sintéticos pode ser usado para criar geneticamente as seqüências de nucleotídeos. Por exemplo, mutagênese sítio-direcionada pode ser usada para inserir novos sítios de restrição, alterar padrões de glicosilação, modificar preferência de códon, produzir variantes de junção, introduzir mutações, e assim por diante.
[028] As modificações de seqüência, como a adição de uma seqüência tag de purificação ou otimização de códon, podem ser usadas para facilitar a expressão. Por exemplo, a seqüência líder N-terminal pode ser substituída por uma seqüência que codifica para uma proteína tag como polihistidina ("HIS") ou glutationa S-transferase ("GST"). Tais proteínas tag podem ser usadas para facilitar a purificação, detecção e estabilidade da proteína expressa. Códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular podem ser selecionados para aumentar a taxa de expressão de proteína ou para produzir um transcrito de RNA que tenha propriedades desejadas, como uma meia-vida que é mais longa que aquela de um transcrito gerado a partir da seqüência de ocorrência natural. Esses métodos são bem conhecidos na técnica e são também descritos em WO05/032582.
Vetores de expressão
[029] A molécula de ácido nucléico que codifica um antigeno de GAS57 mutante pode ser inserida em um vetor de expressão que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da seqüência codificadora inserida. Métodos que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão que contêm seqüências e elementos de controle de transcrição e tradução adequados. Esses métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Células hospedeiras
[030] Células hospedeiras para a produção de antígenos de GAS57 mutante podem ser procarióticas ou eucarióticas. E. coli é uma célula hospedeira preferida, mas outros hospederios adequados incluem Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por exemplo, M tuberculosis), leveduras, baculovirus, células de mamífero etc.
[031] Uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida por sua capacidade de modular a expressão das seqüências inseridas ou de processar o polipeptídeo expresso no modo desejado. Tais modificações do polipeptídeo incluem, sem limitação, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. O processamento pós-tradução que cliva uma forma "pré/pró" do polipeptídeo também pode ser usado para facilitar a correta inserção, dobra e/ou função. Diferentes células hospedeiras que têm maquinaria celular específica e mecanismos característicos para atividades pós-tradução são disponíveis pela “American Type Culture Collection” (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) e podem ser escolhidas para assegurar a correta modificação e processamento de uma proteína estranha. Veja WO 01/98340.
[032] As construções de expressão podem ser introduzidas nas células hospedeiras com o uso de técnicas bem estabelecidas que incluem, sem limitação, transferência de DNA mediada por transferrina-policátion, transfecção com ácidos nucléicos naked ou encapsulados, fusão celular mediada por lipossomo, transporte intracelular de glóbulos de látex revestidos com DNA, fusão de protoplasto, infecção viral, eletroporação, métodos de "gene gun", e transfecção medida por DEAE ou fosfato de cálcio.
[033] As células hospedeiras transformadas com vetores de expressão podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão e recuperação da proteína a partir da cultura de células. A proteína produzida por uma célula transformada pode ser secretada ou contida de forma intracelular dependendo da seqüência de nucleotídeos e/ou do vetor de expressão usados. Aqueles habilitados na técnica compreendem que os vetores de expressão podem ser destinados a conter seqüências de sinal que direcionam a secreção de antígenos solúveis através de uma membrana de célula procariótica ou eucariótica. Purificação
[034] Seqüências de exportação de sinal podem ser incluídas em um antígeno de GAS57 mutante recombinantemente produzido de modo que o antígeno possa ser purificado a partir do meio de cultura de células com o uso de métodos conhecidos. Alternativamente, antígenos de GAS57 mutante recombinantemente produzidos da invenção podem ser isolados de células hospedeiras geneticamente construídas e separados de outros componentes na célula, como proteínas, carboidratos ou lipídeos, com o uso de métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, cromatografia de exclusão por tamanho, fracionamento de sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, cromatografia por afinidade, e eletroforese preparatória em gel. Uma preparação de antígeno de GAS57 mutante purificado é pelo menos 80% pura; preferivelmente, as preparações são 90%, 95% ou 99% puras. A pureza das preparações pode ser avaliada por qualquer meio conhecido na técnica, como eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida. Quando adequado, antígenos de GAS57 mutante podem ser solubilizados, por exemplo, com uréia.
Síntese química
[035] Antígenos de GAS57 mutante podem ser sintetizados, por exemplo, com o uso de técnicas de fase sólida. Veja, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 54, 1963; Roberge e cols., Science 269, 202 04, 1995. A síntese da proteína pode ser realizada com o uso de técnicas manuais ou por automação. A síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, com o uso de “Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer” (Perkin Elmer). Opcionalmente, os fragmentos de um antígeno de GAS57 mutante podem ser separadamente sintetizados e combinados com o uso de métodos químicos para produzir uma molécula de comprimento total.
Anticorpos de GAS57
[036] A invenção também fornece anticorpos que se ligam especificamente a GAS57 de tipo selvagem e que reduzem ou eliminam substancialmente a capacidade de GAS57 de clivar IL-8. Alguns anticorpos da invenção também se ligam especificamente a GAS57 mutante como acima descrito. Anticorpos preferidos também reduzem ou eliminam a capacidade de GAS57 de clivar outros substratos como homólogos de IL-8 (por exemplo, CXCLI/GROα, CXCL2/GROβ, CXCL3/GROY, CXCL4, CXCL12/SDF-1α, CXCL12/SDF-1 β, CXCL12/SDF-1Y, CXCL5/ENA 78, CXCL6/GCP-2, CXCL7INAP- 2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP10, CXCL11, CXCL13, CXCL14 e CXCL16). Um anticorpo "se liga especificamente" a GAS57 de tipo selvagem ou mutante se ele fornece um sinal de detecção pelo menos 5, 10 ou 20 vezes maior que um sinal de detecção fornecido com proteínas não-GAS57 quando usadas em um ensaio imunoquímico. Preferivelmente, os anticorpos que se ligam especificamente a GAS57 de tipo selvagem ou mutante não detectam proteínas não-GAS57 em ensaios imunoquímicos e podem imunoprecipitar GAS57 de tipo selvagem da solução. Anticorpos de acordo com a invenção podem reduzir a atividade proteolítica de GAS57 contra interleucina 8 (IL-8) em pelo menos 50% (por exemplo, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%) em relação a GAS57 de tipo selvagem como detectado por SDS-PAGE ou ELISA.
[037] Em modalidades preferidas, os anticorpos da invenção bloqueiam a progressão de lesões necróticas em animais imunizados com antígeno recombinante de GAS57 de tipo selvagem ou mutante e que recebem GAS.
[038] "Anticorpo" como aqui usado inclui moléculas intactas de imunoglobulina, bem como fragmentos destas que se ligam especificamente a GAS57 de tipo selvagem e, em alguns casos, a um antígeno de GAS57 mutante. Esses incluem moléculas de anticorpo híbrido (quimérico) (por exemplo, Winter e cols., Nature 349, 293-99, 1991; Patente U.S. 4.816.567); fragmentos F(ab’)2 e F(ab) e moléculas Fv; heterodímeros não-covalentes (por exemplo, Inbar e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2659-62, 1972; Ehrlich e cols., Biochem 19, 4091-96, 1980); moléculas Fv de cadeia única (sFv) (por exemplo, Huston e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5897-83, 1988); construções de fragmento de anticorpo dimérico e trimérico; minibodies (por exemplo, Pack e cols., Biochem 31, 1579-84, 1992; Cumber e cols., J. Immunology 149B, 120-26, 1992); moléculas de anticorpio humanizado (por exemplo, Riechmann e cols., Nature 332, 323-27, 1988; Verhoeyan e cols., Science 239, 1534-36, 1988; e Publicação de Patente U.K. No. GB 2.276.169, publicada em 21 de setembro de 1994); e quaisquer fragmentos funcionais obtidos a partir de tais moléculas, bem como anticorpos obtidos através de processos não convencionais como apresentação de fago. Geração de anticorpos de GAS57
[039] Um antígeno de GAS57 mutante ou de tipo selvagem pode ser usado para imunizar um mamífero, como um camundongo, rato, coelho, porquinho da Índia, macaco ou humano, para produzir anticorpos policlonais. Se desejado, um antígeno de GAS57 pode ser conjugado a uma proteína carreadora, como albumina sérica bovina, tiroglobulina e hemocianina keyhole limpet. Dependendo da espécie do hospedeiro, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica. Tais adjuvantes incluem, sem limitação, adjuvante de Freund, géis minerais (por exemplo, hidróxido de alumínio) e substâncias ativas de superfície (por exemplo, lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina keyhole limpet e dinitrofenol). Entre os adjuvantes usados em humanos, BCG (bacilo de Calmette- Guerin) e Corynebacterium parvum são especialmente úteis.
[040] Anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a um antígeno de GAS57 de tipo selvagem ou mutante podem ser preparados com o uso de qualquer técnica que forneça a produção de moléculas de anticorpo por linhagens de células contínuas em cultura. Essas técnicas incluem, sem limitação, a técnica de hibridoma, a técnica de hibridoma de célula b humana, e a a técnica de hibridoma de EBV (Kohler e cols., Nature 256, 495-97, 1985; Kozbor e cols., J. Immunol. Methods 81, 31 42, 1985; Cote e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 202630, 1983; Cole e cols., Mol. Cell Biol. 62, 109-20, 1984).
[041] Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos", a junção de genes de anticorpo de camundongo a genes de anticorpo humano para obter uma molécula com especificidade de antígeno e atividade biológica adequadas, podem ser usadas (Morrison e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-55, 1984; Neuberger e cols., Nature 312, 604-08, 1984; Takeda e cols., Nature 314, 452-54, 1985). Anticorpos monoclonais e outros tambem podem ser "humanizados" para prevenir que um paciente forme uma resposta imune contra o anticorpo quando ele é usado terapeuticamente. Tais anticorpos podem ser suficientemente similares em seqüência a anticorpos humanos a serem usados diretamente em terapia ou podem requerer alteração de uns resíduos chave. As diferenças de seqüência entre anticorpos de roedor e seqüências humanas podem ser minimizadas por substituição de resíduos que diferem daquelas nas seqüências humanas por metagênese direcionada sítio- dirigida de resíduos individuais ou por "grating" das regiões determinantes de complementaridade inteiras.
[042] Alternativamente, anticorpos humanizados podem ser produzidos com o uso de métodos recombinantes, como abaixo descrito. Os anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno particular podem conter sítios de ligação de antígeno que são parcialmente ou totalmente humanizados, como revelado em U.S. 5.565.332. Anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados in vitro como descrito em Simmons e cols., PLoS Medicine 4(5), 928-36, 2007.
[043] Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única podem ser adaptadas com o uso de métodos conhecidos na técnica para produzir anticorpos de cadeia única que se ligam especificamente a um antígeno particular. Anticorpos com especificidade relacionada, mas de composição idiotípica distinta, podem ser gerados por embaralhamento de cadeia a partir de bibliotecas de imunoglobina combinatórias aleatoriamente (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11.120-23, 1991).
[044] Anticorpos de cadeia única também podem ser construídos com o uso de um método de amplificação de DNA, como PCR, com o uso de cDNA de hibridoma como um modelo (Thirion e cols., Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11, 1996). Os anticorpos de cadeia única podem ser mono- ou bi-específicos, e podem ser bivalentes ou tetravalentes. A construção de anticorpos de cadeia única tetravalentes, bi-específicos, é ensinada, por exemplo, em Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159-63, 1997. A construção de anticorpos de cadeia única bivalentes, bi-específicos, é ensinada em Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1994.
[045] Uma seqüência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de cadeia única pode ser construída com o uso de síntese de nucleotídeo manual ou automatizada, clonada em uma construção de expressão com o uso de métodos padrão de DNA recombinante, e introduzida em uma célula para expressar a seqüência codificadora, como descrito abaixo. Alternativamente, os anticorpos de cadeia única podem ser produzidos diretamente com o uso, por exemplo, de tecnologia de fago filamentoso (Verhaar e cols., Int. J Cancer 61, 497-501, 1995; Nicholls e cols., J. Immunol. Meth. 165, 81-91, 1993).
[046] Os anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno de GAS57 também podem ser produzidos por indução da produção in vivo na população de linfócitos ou por rastreamento de bibliotecas de imunoglobulina ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos como revelado na literatura (Orlandi e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter e cols., Nature 349, 293 299, 1991).
[047] Os anticorpos quiméricos podem ser construídos como revelado em WO 93/03151. Proteínas de ligação que são derivadas de imunoglobulinas e que são multivalentes e multi-específicas, como os "diabodies" descritos em WO 94/13804, também podem ser preparadas.
[048] Os anticorpos podem ser purificados por métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados por afinidade por passagem em uma coluna à qual o antígeno relevante é ligado. Os anticorpos ligados podem então ser eluídos a partir da coluna com o uso de um tampão com uma alta concentração de sal.
Composições farmacêuticas
[049] A invenção também fornece composições para uso como medicamentos (por exemplo, como composições imunogênicas ou vacinas). As composições da invenção são úteis para prevenção e/ou tratamento de uma doença causada como um resultado de infecção por S. pyogenes e compreendem pelo menos um agente ativo, que pode ser um polipeptídeo, uma molécula de ácido nucléico ou um anticorpo. A referida doença pode ser, por exemplo, bacteremia, meningite, febre puerperal, escarlatina, erisipelas, faringite, impetigo, fascite necrotizante, miosite ou síndrome de choque tóxico.
[050] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser usadas profilaticamente ou terapeuticamente, mas serão tipicamente profiláticas. Portanto, a invenção inclui um método para o tratamento terapêutico ou profilático de uma infecção por Streptococcus pyogenes. O animal é preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um humano. Os métodos envolvem a administração ao animal de uma quantidade terapêutica ou profilática das composições imunogênicas da invenção. A invenção também fornece as composições imunogênicas da invenção para o tratamento terapêutico ou profilático de uma infecção por Streptococcus pyogenes em um animal.
[051] As composições que contêm um antígeno de GAS57 mutante ou uma molécula de ácido nucléico que codifica um antígeno de GAS57 mutante são preferivelmente composições imunogênicas, e são mais preferivelmente composições de vacina. O pH de tais composições está preferivelmente entre 6 e 8, preferivelmente cerca de 7. O pH pode ser mantido pelo uso de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirógeno. A composição pode ser isotônica com relação ao tecido humano (por exemplo, sangue).
[052] Algumas composições da invenção compreendem um ou mais antígenos de GAS57 mutante como aqui descrito. Outras composições da invenção compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucléico que codificam o antígeno de GAS57 mutante e, opcionalmente, outros antígenos que podem ser incluídos na composição (veja abaixo). Veja, por exemplo, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly e cols. (1997) Ann. Rev Immunol 15:617-648; Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480; Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2:441-447; Ilan (1999) Curr Opin Mol Ther 1:116-120; Dubensky e cols. (2000) Mol Med 6:723732; Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74; Donnelly e cols. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S190-193; Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66:84-90. Tipicamente, a molécula de ácido nucléico é uma molécula de DNA, por exemplo, na forma de um plasmídeo.
[053] Ainda outras composições da invenção compreendem pelo menos um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno de GAS57 de tipo selvagem como acima descrito ou uma molécula de ácido nucléico que codifica tal anticorpo.
[054] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem compreender mais de um tipo de agente ativo (por exemplo, um antígeno de polipeptídeo e uma molécula de ácido nucléico; um antígeno de polipeptídeo e um anticorpo; uma molécula de ácido nucléico e um anticorpo; um antígeno de polipeptídeo, uma molécula de ácido nucléico e um anticorpo).
[055] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem incluir um ou mais agentes ativos adicionais. Tais agentes incluem, sem limitação, (a) outro antígeno de GAS57 mutante da invenção, (b) um antígeno de polipeptídeo que é útil em uma vacina pediátrica, (c) um antígeno de polipeptídeo que é útil em uma vacina para idosos ou indivíduos imunocomprometidos, (d) uma molécula de ácido nucléico que codifica (a)-(c), e um anticorpo que se liga especificamente a (a)-(c).
Antígenos adicionais
[056] As composições da invenção podem ser administradas junto com um ou mais antígenos para uso em métodos terapêuticos ou profiláticos da presente invenção. Os antígenos preferidos incluem aqueles listados abaixo. Adicionalmente, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir infecções causadas por qualquer um dos patógenos abaixo listados. Além da combinação com os antígenos abaixo descritos, as composições da invenção também podem ser combinadas com um adjuvante como aqui descrito.
[057] Antígenos para uso com a invenção incluem, sem limitação, um ou mais dos seguintes antígenos apresentados abaixo, ou antígenos derivados de um ou mais dos patógenos apresentados abaixo: A. Antígenos Bacterianos
[058] Antígenos Bacterianos adequados para uso na invenção incluem proteínas, polissacarídeos, lipopolissacarídeos e vesículas de membrana externa que podem ser isolados, purificados ou derivados de uma bactéria. Além disso, os antígenos bacterianos podem incluir lisados de bactérias e formulações bacterianas inativadas. Os antígenos de bactérias podem ser produzidos por expressão recombinante. Os antígenos Bacterianos incluem preferivelmente epitopos que são expostos na superfície da bactéria durante pelo menos um estágio de seu ciclo de vida. Os antígenos Bacterianos são preferivelmente conservados em múltiplos sorotipos. Os antígenos Bacterianos incluem antígenos derivados de uma ou mais das bactérias apresentadas abaixo, bem como os exemplos de antígenos específicos identificados abaixo.
[059] Neisseria meningitidis: os antígenos de Neisseria meningitidis podem incluir proteínas (como aquelas identificadas nas Referências 1 — 7), sacarídeos (incluindo um polissacarídeo, oligossacarídeo ou lipopolissacarídeo) ou vesículas de membrana externa (Referências 8, 9, 10, 11) purificados ou derivados de sorogrupos de N. meningitides como A, C, W135, Y e/ou B. Antígenos de proteína de Meningitides podem ser selecionados de adesões, autotransportadores, toxinas, proteínas de aquisição de Fe e proteínas associadas a membrana (preferivelmente proteína de membrana extrena integral).
[060] Streptococcus pneumoniae: antígenos de Streptococcus pneumoniae podem incluir um sacarídeo (incluindo um polissacarídeo ou um oligossacarídeo) e/ou proteína de Streptococcus pneumoniae. Antígenos sacarídeos podem ser selecionados de sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F. Os antígenos de proteína podem ser selecionados de uma proteína identificada em WO 98/18931, WO 98/18930, Patente US No. 6.699.703, Patente US No. 6.800.744, WO 97/43303 e WO 97/37026. As proteínas de Streptococcus pneumoniae podem ser selecionadas da família de tríade de Poli Histidina (PhtX), a família da proteína de ligação de colina (CbpX), truncagens de CbpX, família LytX, truncagens de LytX, truncagem de CbpX-proteínas quiméricas de truncagem de LytX, pneumolisina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 ou Sp133.
[061] Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A): antígenos de Streptococcus Grupo A podem incluir uma proteína identificada em WO 02/34771 ou WO 2005/032582 (incluindo GAS 40), fusões de fragmentos de proteínas M de GAS (incluindo aquelas descritas em WO 02/094851, e Dale, Vaccine (1999) 17:193-200, e Dale, Vaccine 14(10): 944-948), proteína de ligação de fibronectina (Sfb1), proteína heme-associada de Streptococcus (Shp) e estreptolisina S (SagA). Outros antígenos de Streptococcus Grupo A incluem, sem limitação, GAS25 (Spy0167; gi13621460) GAS39 (Spy0266; gi13621542 ), GAS40 (Spy0269; gi13621545), GAS42 (Spy0287; gi13621559), GAS45 (M5005_Spy0249; gi71910063), GAS58 (Spy0430; gi13621663), GAS84 (SPy1274; 13622398) ,GAS95 (SPy1733; 13622787), GAS117 (Spy0448; gi13621679), GAS130 (Spy0591;gi13621794), GAS137 (Spy0652; gi13621842), GAS159 (Spy1105; gi13622244), GAS193 (Spy2025; gi3623029), GAS202 (Spy1309; gi13622431), GAS217 (Spy0925, gi1362208), GAS236 (Spy1126; gi13622264), GAS253 (Spy1524; gi13622611), GAS277 (Spy1939; gi13622962), GAS294 (Spy1173; gi13622306), GAS309 (Spy0124; gi13621426), GAS366 (Spy1525; gi13622612), GAS372 (Spy1625; gi13622698), GAS384 (Spy1874; gi13622908), GAS389 (Spy1981; gi13622996), GAS504 (Spy1751; gi13622806), GAS509 (Spy1618; gi13622692), GAS290 (SPy1959; gi13622978), GAS511 (Spy1743; gi13622798), GAS527 (Spy1204; gi3622332), GAS529 (Spy1280; gi3622403), GAS533 (Spy1877; gi13622912), GAS68 (Spy0163; gi13621456), GAS84 (Spy1274; gi13622398), GAS88 (Spy1361; gi13622470), GAS89 (Spy1390; gi13622493), GAS98 (Spy1882; gi13622916), GAS99 (Spy1979; gi13622993), GAS102 (Spy2016, gi13623025), GAS146 (Spy0763; gi13621942), GAS195 (Spy2043; gi13623043), GAS561 (Spy1134; gi13622269), GAS179 (Spy1718, gi13622773) e GAS681 (spy1152; gi1362228).
[062] Moraxella catarrhalis: antígenos de Moraxella incluem antígenos identificados em WO 02/18595 e WO 99/58562, de proteína de membrana externa (HMW-OMP), C-antígeno e/ou LPS; Bordetella pertussis: antígenos de Pertussis incluem holotoxina de pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente também combinação com antígeno de pertactina e/ou aglutinogênios 2 e 3; Staphylococcus aureus: antígenos de Staphylococcus aureus incluem polissacarídeos capsulares de S. aureus tipo 5 e 8 opcionalmente conjugados a exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa recombinante não tóxica, como StaphVAXTM, ou antígenos derivados de proteínas de superfície, invasinas (leucocidina, quinases, hialuronidase), fatores de superfície que inibem a captura fagocítica (cápsula, Proteína A), carotenóides, produção de catalase, Proteína A, coagulase, fator de coagulação e/ou toxinas de dano à membrana (opcionalmente desintoxicadas) que lisam membranas de célula eucariótica (hemolisinas, leucotoxina, leukocidina); Staphylococcus epidermis: antígenos de S. epidermidis incluem antígeno associado a secreções de S. epidermidis (SAA); Clostridium tetani (Tétano): antígenos de tétano incluem toxóide tetânico (TT), preferivelmente usado como uma proteína carreadora junto/conjugada às composições da presente invenção. Cornynebacterium diphtheriae (Difteria): antígenos de difteria incluem toxina diftérica, preferivelmente desintoxicada como CRM197. Adicionalmente, antígenos capazes de modular, inibir ou se associar com ribosilação de ADP são contemplados para combinação/co-administração/conjugação com as composições da presente invenção. Os toxóides diftéricos podem ser usados como proteínas carreadoras.
[063] Haemophilus influenzae B (Hib): antígenos de Hib incluem um antígeno de sacarídeo de Hib; Pseudomonas aeruginosa: antígenos de Pseudomonas incluem endotoxina A, proteína Wzz, LPS de P. aeruginosa, mais particularmente LPS isolado de PAO1 (sorotipo O5), e/ou proteínas de membrana externa, incluindo proteínas de membrana externa F (OprF) (Infect. Immun. 2001 May; 69(5): 3.510-3.515).
[064] Legionella pneumophila. Antígenos bacterianos podem ser derivados de Legionella pneumophila.
[065] Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B): antígenos de streptococcus de Grupo B incluem uma proteína ou antígeno sacarídeo identificado em WO 02/34771, WO 03/093306, WO 04/041157 ou WO 2005/002619 (incluindo proteínas GBS 80, GBS 104, GBS 276 e GBS 322, e incluindo antígenos sacarídeos derivados de sorotipos Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII e VIII).
[066] Neiserria gonorrhoeae: antígenos de Gonorrhoeae incluem uma proteina Por (ou porin), como PorB (veja, Zhu e cols., Vaccine (2004) 22:660 — 669), uma proteína de ligação de transferência, como TbpA e TbpB (veja Price e cols., Infection and Immunity (2004) 71(1): 277—283), uma proteína de opacidade (como Opa), uma proteína de redução-modificável (Rmp), e preparações de vesícula de membrana externa (OMV) (veja Plante e cols., J Infectious Disease (2000) 182:848 — 855), veja também, por exemplo, WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280, WO 02/079243).
[067] Chlamydia trachomatis: antígenos de Chlamydia trachomatis incluem antígenos derivados de sorotipos A, B, Ba e C (agentes de tracoma, uma causa de cegueira), sorotipos L1, L2 e L3 (associados com linfogranuloma venéreo), e sorotipos, D-K. Antígenos de Chlamydia trachomatis também podem incluir um antígeno identificado em WO 00/37494, WO 03/049762, WO 03/068811 ou WO 05/002619, incluindo PepA (CT045), LcrE (CT089), ArtJ (CT381), DnaK (CT396), CT398, OmpH-like (CT242), L7/L12 (CT316), OmcA (CT444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823) e MurG (CT761).
[068] Treponema pallidum (sífilis): antígenos de sífilis incluem antigeno TmpA.
[069] Haemophilus ducreyi (causador de cancróide): antígenos de Ducreyi incluem proteína de membrana externa (DsrA).
[070] Enterococcus faecalis ou Enterococcus faecium: Antígenos incluem uma repetição de trissacarídeo ou outros antígenos derivados de Enterococcus fornecidos na Patente U.S. No. 6.756.361. Helicobacter pylori: antígenos de H. pylori incluem antígeno Cag, Vac, Nap, HopX, HopY e/ou urease. Staphylococcus saprophyticus: Antígenos incluem o antígeno de hemaglutinina de 160 kDa de S. saprophyticus.
[071] Antígenos de Yersinia enterocolitica incluem LPS (Infect Immun. 2002 August; 70(8): 4414).
[072] E. coli: antígenos de E. coli podem ser derivados de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroagregadora (EAggEC), que adere difusamente E. coli (DAEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), e/ou E. coli entero- hemorrágica (EHEC).
[073] Bacillus anthracis (anthrax): antígenos de B. anthracis são opcionalmente desintoxicados e podem ser selecionados de A-componentes (fator letal (LF) e fator de edema (EF)), ambos podem partilhar um B-componente comum conhecido como antígeno protetor (PA).
[074] Yersinia pestis (peste): antígenos da peste incluem antígeno capsular F1 (Infect. Immun. 2003 Jan; 71(1)): 374-383, LPS (Infect. Immun. 1999 Oct; 67(10): 5395), antígeno de Yersinia pestis V (Infect. Immun. 1997 Nov; 65(11): 4.476-4.482);
[075] Mycobacterium tuberculosis: antígenos de tuberculose incluem lipoproteínas, LPS, antígenos de BCG, uma proteína de fusão de antígeno 85B (Ag85B) e/ou ESAT-6 opcionalmente formulado em vesículas lipídicas catiônicas (Infect. Immun. Outubro de 2004; 72(10): 6.148), antígenos de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) associados a isocitrato desidrogenase (Proc. Natl Acad Sci U.S.A. 2004 Aug 24; 101(34): 12.652), e/ou antígenos MPT51 (Infect. Immun. Julho de 2004; 72(7): 3.829).
[076] Rickettsia: Antígenos incluem proteínas de membrana externa, incluindo a proteína de membrana externa A e/ou B (OmpB) (Biochem Biophys Acta. 2004 Nov 1;1.702(2):145), LPS, e antígeno de proteína de superfície (SPA) (J. Autoimmun. 1989 Jun; 2 Supl:81).
[077] Listeria monocytogenes. Os antígenos bacterianos podem ser derivados de Listeria monocytogenes.
[078] Chlamydia pneumoniae: Antígenos incluem aqueles identificados em WO 02/02606.
[079] Vibrio cholerae: Antígenos incluem antígenos de proteinase, LPS, particularmente lipopolissacarídeos de Vibrio cholerae II, polissacarídeos O1 Inaba O-específicos, V. cholera O139, antígenos de vacina IEM108 (Infect. Immun. 2003 Oct;71(10):5.498-504), e/ou toxina de Zonula occludens (Zot).
[080] Salmonella typhi (febre tifóide): Antígenos incluem polissacarídeos capsulares preferivelmente conjugados (Vi, ou seja, vax-TyVi).
[081] Borrelia burgdorferi (doença de Lyme): antígenos incluem lipoproteínas (como OspA, OspB, OspC e OspD), outras proteínas de superfície como proteínas relacionadas a OspE (Erps), proteínas de ligação de decorin (como DbpA), e proteínas VI antigenicamente variáveis, como antígenos associados a P39 e P13 (uma proteína de membrana integral, Infect Immun. 2001 May; 69(5): 3.323-3.334), Proteína de Variação Antigênica VlsE (J Clin Microbiol. 1999 Dec; 37(12): 3997).
[082] Porphyromonas gingivalis: Antígenos incluem proteína de membrana externa de P. gingivalis (OMP).
[083] Klebsiella: Antígenos incluem OMP, incluindo OMP A, ou um polissacarídeo opcionalmente conjugado a toxóide tetânico.
[084] Antígenos bacterianos adicionais da invenção podem ser antígenos capsulares, antígenos de polissacarídeo ou antígenos de proteína de qualquer um dos acima. Antígenos bacterianos adicionais também podem incluir uma preparação de vesícula de membrana externa (OMV). Adicionalmente, os antígenos incluem bactérias vivas, atenuadas, e/ou versões purificadas de qualquer uma das bactérias acima mencionadas. Os antígenos da presente invenção podem ser derivados de bactérias gram-negativas ou gram-positivas. Os antígenos da presente invenção podem ser derivados de bactérias aeróbicas ou anaeróbicas.
[085] Adicionalmente, qualquer um dos sacarídeos derivados das bactérias acima (polissacarídeos, LPS, LOS ou oligossacarídeos) podem ser conjugados a outro agente ou antígeno, como uma proteína carreadora (por exemplo, CRM197). Tal conjugação pode ser conjugação direta efetuada por aminação redutora de porções carbonil no sacarídeo aos grupos amino na proteína, como fornecido na Patente U.S. No. 5.360.897 e Can J Biochenz Cell Biol. Maio de 1984; 62(5): 270-5. Alternativamente, os sacarídeos podem ser conjugados através de um ligante, como com succinamida ou outras ligações fornecidas em Bioconjugate Técnicas, 1996 e CRC, Chemistry of Proteína Conjugation and Cross-Linking, 1993.
B. Antígenos virais
[086] Antígenos virais adequados para uso na invenção incluem formulações de vírus inativado (ou morto), vírus atenuado, formulações de vírus dividido, formulações de subunidade purificada, proteínas virais que podem ser isoladas, purificadas ou derivadas de um vírus, e partículas Vírus-Like (VLPs). Os antígenos virais podem ser derivados de vírus propagados em cultura de células ou outro substrato. Alternativamente, os antígenos virais podem ser expressos de modo recombinante. Os antígenos virais incluem preferivelmente epitopos que são expostos na superfície do vírus durante pelo menos um estágio de seu ciclo de vida. Os antígenos virais são preferivelmente conservados em múltiplos sorotipos ou isolados. Os antígenos virais incluem antígenos derivados de um ou mais dos vírus apresentados abaixo bem como os exemplos de antígenos específicos identificados abaixo.
[087] Ortomixovírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Ortomixovírus, como Influenza A, B e C. Os antígenos de Ortomixovírus podem ser selecionados de uma ou mais das proteínas virais, incluindo hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), nucleoproteína (NP), proteína de matriz (M1), proteína de membrana (M2), um ou mais dos componentes da transcriptase (PB1, PB2 e PA). Os antígenos preferidos incluem HA e NA.
[088] Os antígenos de Influenza podem ser derivados de cepas interpandêmicas (anuais) de gripe. Alternativamente, os antígenos de influenza podem ser derivados de cepas com o potencial de causar um surto pandêmico (ou seja, cepas de influenza com nova hemaglutinina comparada à hemaglutinina em cepas atualmente em circulação, ou cepas de influenza que são patogênicas em aves e têm o potencial de serem transmitidas horizontalmente na população humana, ou cepas de influenza que são patogênicas para seres humanos).
[089] Vírus Paramyxoviridae: os antígenos virais podem ser derivados de vírus Paramyxoviridae, como Pneumovírus (RSV), Paramixovírus (PIV) e Morbilivírus (sarampo).
[090] Pneumovírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Pneumovírus, como vírus sincicial respiratório (RSV), vírus sincicial respiratório bovino, vírus da Pneumonia de camundongo, e vírus da rinotraqueíte de peru. Preferivelmente, o Pneumovírus é RSV. Os antígenos de Pneumovírus podem ser selecionados de uma ou mais das seguintes proteínas, incluindo fusão de proteínas de superfície (F), Glicoproteína (G) e proteína hidrofóbica pequena (SH), proteínas de matriz M e M2, proteínas de nucleocapsídeo N, P e L, e proteínas não estruturais NS1 e NS2. Os antígenos de Pneumovírus incluem F, G e M. Veja, por exemplo, J Gen Virol. 2004 Nov; 85(Pt 11):3229). Os antígenos de Pneumovírus também podem ser formulados ou derivados de vírus quiméricos. Por exemplo, vírus RSV/PIV quiméricos podem compreender componentes de RSV e PIV.
[091] Paramixovírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Paramixovírus, como vírus Parainfluenza tipos 1 — 4 (NV), caxumba, vírus Sendai, vírus símio 5, vírus parainfluenza Bovino e vírus da doença de Newcastle. Preferivelmente, Paramixovírus é PIV ou caxumba. Os antígenos de Paramixovírus podem ser selecionados de uma ou mais das seguintes proteínas: Hemaglutinina — Neuraminidase (FIN), proteínas de fusão F1 e F2, Nucleoproteína (NP), fosfoproteína (P), proteína grande (L), e proteína de matriz (M). Proteínas preferidas de Paramixovírus incluem HN, F1 e F2. Os antígenos de Paramixovírus também podem ser formulados ou derivados de vírus quiméricos. Por exemplo, vírus quiméricos RSV/PIV podem compreender componentes de RSV e PIV. As vacinas de caxumba disponíveis comercialmente incluem vírus da caxumba atenuados vivos, em forma monovalente ou em combinação com a vacina de sarampo e rubéola (MMR).
[092] Morbilivírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Morbilivírus, como sarampo. Os antígenos de Morbilivírus podem ser selecionados de uma ou mais das seguintes proteínas: hemaglutinina (H), Glicoproteína (G), Fator de fusão (F), proteína grande (L), Nucleoproteína (NP), Polimerase fosfoproteína (P) e Matriz (M). As vacinas de sarampo disponíveis comercialmente incluem vírus de sarampo atenuados vivos, tipicamente em combinação com caxumba e rubéola (MMR).
[093] Picornavírus: os antígenos virais podem ser derivados de Picornavírus, como Enterovírus, Rinovírus, Heparnavírus, Cardiovírus e Aftovírus. Antígenos derivados de Enterovírus, como Poliovírus, são preferidos.
[094] Enterovírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Enterovírus, como Poliovírus tipos 1, 2 ou 3, vírus Coxsackie A tipos 1 a 22 e 24, vírus Coxsackie B tipos 1 a 6, Echovírus (ECHO)) tipos 1 a 9, 11 a 27 e 29 a 34, e Enterovírus 68 a 71. Preferivelmente, o Enterovírus é poliovírus. Os antígenos de enterovírus são preferivelmente selecionados de uma ou mais das seguintes proteínas de Capsídeo VP1, VP2, VP3 e VP4. As vacinas de pólio comercialmente disponíveis incluem vacina de pólio inativada (IPV) e vacina de poliovírus oral (OPV).
[095] Hepadnavírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Hepadnavírus, como vírus da Hepatite A (HAV). As vacinas de HAV comercialmente disponíveis incluem vacina de HAV inativada.
[096] Togavírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Togavírus, como um Rubivírus, um Alfavírus ou um Arterivírus. Antígenos derivados de Rubivírus, como vírus da Rubéola, são preferidos. Os antígenos de Togavírus podem ser selecionados de E1, E2, E3, C, NSP-1, NSPO-2, NSP-3 ou NSP-4. Os antígenos de Togavírus são preferivelmente selecionados de El, E2 ou E3. As vacinas de rubéola comercialmente disponíveis incluem um vírus vivo adaptado ao frio, tipicamente em combinação com vacinas de caxumba e sarampo (MMR).
[097] Flavivírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Flavivírus, como encefalite derivada de carrapato (TBE), Dengue (tipos 1, 2, 3 ou 4), febre amarela, encefalite japonesa, encefalite do Nilo Ocidental, encefalite de St. Louis, encefalite da primavera-verão Russa, encefalite de Powassan. Os antígenos de Flavivírus podem ser selecionados de PrM, M, C, E, NS-1, NS-2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5. Os antígenos de Flavivírus são preferivelmente selecionados de PrM, M e E. A vacina de TBE comercialmente disponível inclui vacinas de vírus inativado.
[098] Pestivírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Pestivírus, como diarréia viral bovina (BVDV), febre suína clássica (CSFV) ou doença da fronteira (BDV).
[099] Hepadnavírus: os antígenos virais podem ser derivados de um Hepadnavírus, como vírus da Hepatite B. Os antígenos de Hepadnavírus podem ser selecionados de antígenos de superfície (L, M e S), antígenos de núcleo (HBc, HBe). As vacinas de HBV comercialmente disponíveis incluem vacinas de subunidade que compreendem a proteína de antígeno de superfície S.
[0100] Vírus da Hepatite C: os antígenos virais podem ser derivados de um vírus da Hepatite C (HCV). Os antígenos de HCV podem ser selecionados de um ou mais de E1, E2, E1/E2, poliproteína NS345, poliproteína NS 345-núcleo, núcleo, e/ou peptídeos de regiões não estruturais (Houghton e cols., Hepatology (1991) 14:381).
[0101] Rabdovírus: Os antígenos virais podem ser derivados de um Rabdovírus, como um Lyssavirus (vírus da raiva) e Vesiculovírus (VSV). Os antígenos de Rabdovírus podem ser selecionados de glicoproteína (G), nucleoproteína (N), proteína grande (L), proteínas não estruturais (NS). A vacina de vírus da raiva comercialmente disponível compreende vírus morto que cresceu em células diplóides humanas ou células pulmonares fetais de rhesus.
[0102] Caliciviridae; os antígenos virais podem ser derivados de Calciviridae, como vírus Norwalk, e Vírus Norwalk-like, como Vírus do Havaí e Vírus da montanha nevada.
[0103] Coronavírus: Os antígenos virais podem ser derivados de um Coronavírus, SARS, coronavírus respiratório humano, bronquite infecciosa das aves (IBV), vírus da hepatite de camundongo (MI-TV), e vírus da gastroenterite suína transmissível (TGEV). Os antígenos de coronavírus podem ser selecionados de spike (S), envelope (E), matriz (M), nucleocapsídeo (N) e Hemaglutininesterase glicoproteína (HE). Preferivelmente, o antígeno de coronavírus é derivado de um vírus da SARS. Os antígenos virais das SARS são descritos em WO 04/92360; Retrovírus: Os antígenos virais podem ser derivados de um Retrovírus, como um Oncovírus, um Lentivírus ou um Spumavírus. Os antígenos de oncovírus podem ser derivados de HTLV-1, HTLV-2 ou HTLV-5. Os antígenos de Lentivírus podem ser derivados de HIV-1 ou HIV-2. Os antígenos de Retrovírus podem ser selecionados de gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu e vpr. Os antígenos de HIV podem ser selecionados de gag (p24gag e p55gag), env (gp160 e gp41), pol, tat, nef, rev vpu, miniproteínas, (preferivelmente p55 gag e gp140v delete). Os antígenos de HIV podem ser derivados de uma ou mais das seguintes cepas: HIVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVLAI, HIVMN, HIV-1CM235, HIV-1US4.
[0104] Reovírus: Os antígenos virais podem ser derivados de um Reovírus, como um Ortoreovírus, um Rotavírus, um Orbivírus ou um Coltivírus. Os antígenos de reovírus podem ser selecionados de proteínas estruturais A.1, À2, A.3, μ1, μ2, o1, o2 ou o3, ou proteínas não estruturais oNS, μNS,
[0105] ou o1s. Os antígenos preferidos de Reovírus podem ser derivados de um Rotavírus. Os antígenos de rotavírus podem ser selecionados de VP1, VP2, VP3, VP4 (ou o produto clivado VP5 e VP8), NSP 1, VP6, NSP3, NSP2, VP7, NSP4 ou NSP5. Os antígenos preferidos de rotavírus incluem VP4 (ou o produto clivado VP5 e VP8) e VP7.
[0106] Parvovírus: Os antígenos virais podem ser derivados de um Parvovírus, como Parvovírus B19. Os antígenos de parvovírus podem ser selecionados de VP-1, VP-2, VP-3, NS-1 e NS-2. Preferivelmente, o antígeno de parvovírus é a proteína de capsídeo VP-2.
[0107] Vírus da hepatite delta (HDV): Os antígenos virais podem ser derivados de HDV, particularmente δ-antfgeno de HDV (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.378.814).
[0108] Vírus da hepatite E (HEV): Os antígenos virais podem ser derivados de HEV.
[0109] Vírus da hepatite G (HGV): Os antígenos virais podem ser derivados de HGV.
[0110] Herpes Vírus humano: Os antígenos virais podem ser derivados de um Herpesvírus humano, como vírus Herpes Simples (HSV), vírus Varicela-zoster (VZV), vírus de Epstein-Barr (EBV), Citomegalovírus (CMV), Herpesvírus Humano 6 (HHV6), Herpesvírus Humano 7 (HHV7) e Herpesvírus Humano 8 (HHV8). Os antígenos de Herpesvírus Humano podem ser selecionados de proteínas precoces imediatas (α), proteínas precoces (β) e proteínas tardias (y). Os antígenos de HSV podem ser derivados de cepas HSV-1 ou HSV-2. Os antígenos de HSV podem ser selecionados de glicoproteínas gB, gC, gD e gH, proteína de fusão (gB), ou proteínas imunes de escape (gC, gE ou gI). Os antígenos de VZV podem ser selecionados de proteínas de núcleo, nucleocapsídeo, tegumento ou envelope. Uma vacina de VZV atenuado vivo é comercialmente disponível. Os antígenos de EBV podem ser selecionados de proteínas de antígeno precoce (EA), antígeno de capsídeo viral (VCA) e glicoproteínas do antígeno de membrana (MA). Os antígenos de CMV podem ser selecionados de proteínas de capsídeo, glicoproteínas de envelope (como gB e gH) e proteínas do tegumento.
[0111] Papovavírus: Antígenos podem ser derivados de Papovavírus, como Papilomavírus e Poliomavírus. Papilomavírus incluem HPV sorotipos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 e 65. Preferivelmente, os antígenos de HPV são derivados de sorotipos 6, 11, 16 ou 18. Os antígenos de HPV podem ser selecionados de proteínas de capsídeo (L1) e (L2), ou E1 — E7, ou fusões destes. Os antígenos de HPV são preferivelmente formulados em partículas vírus-like (VLPs). Os vírus Polyomyavirus incluem vírus BK e vírus JK. Os antígenos de Polyomavirus podem ser selecionados de VP1, VP2 ou VP3.
[0112] Também são fornecidos antígenos, composições, métodos e micróbios incluídos em Vaccines, 4- edição (Plotkin and Orenstein ed. 2004); Medical Microbiology 4- edição (Murray e cols. ed. 2002); Virology, 3- edição (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2- edição (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds. 1991), que são contemplados junto com as composições aqui descritas.
C. Antígenos Fúngicos
[0113] Antígenos fúngicos para uso na invenção podem ser derivados de um ou mais dos seguintes fungos apresentados abaixo.
[0114] Os antígenos fúngicos podem ser derivados de Dermatófitos, incluindo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum e/ou Trichophyton faviforme.
[0115] Os patógenos fúngicos podem ser derivados de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp e Cladosporium spp.
[0116] Processos para a produção de antígenos fúngicos são bem conhecidos na técnica (veja Patente US No. 6.333.164). Em um método preferido, uma fração solubilizada extraída e separada de uma fração insolúvel que pode ser obtida de células fúngicas das quais a parede celular foi substancialmente removida ou pelo menos parcialmente removida, em que o processo compreende as etapas de: obtenção de células fúngicas vivas; a obtenção de células fúngicas das quais a parede celular foi substancialmente removida ou pelo menos parcialmente removida; explosão das células fúngicas das quais a parede celular foi substancialmente removida ou pelo menos parcialmente removida; obtenção de uma fração insolúvel; e extração e separação de uma fração solubilizada da fração insolúvel.
D. Antígenos STD
[0117] As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos derivados de uma doença sexualmente transmitida (STD). Tais antígenos podem fornecer a profilaxia ou terapia para STDs como clamídia, herpes genital, hepatite (como HCV), verrugas genitais, gonorréia, sífilis e/ou cancróide (veja WO00/15255). Os antígenos podem ser derivados de uma ou mais STDs virais ou bacterianas. Os antígenos de STD viral para uso na invenção podem ser derivados, por exemplo, de HIV, vírus herpes simples (HSV-1 e HSV- 2), papilomavírus humano (HPV) e hepatite (HCV). Os antígenos de STD bacterianos para uso na invenção podem ser derivados, por exemplo, de Neiserria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, E. coli e Streptococcus agalactiae. Exemplos de antígenos específicos derivados desses patógenos são acima descritos.
E. Antígenos respiratórios
[0118] As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos derivados de um patógeno que causa doença respiratória. Por exemplo, os antígenos respiratórios podem ser derivados de um vírus respiratório como Ortomixovírus (influenza), Pneumovírus (RSV), Paramixovírus (Ply), Morbilivírus (sarampo), Togavírus (Rubéola), VZV e Coronavírus (SARS). Os antígenos respiratórios podem ser derivados de uma bactéria que causa doença respiratória, como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bacillus anthracia e Moraxella catarrhalis. Exemplos de antígenos específicos derivados desses patógenos são descritos acima.
F. Antígenos de vacina pediátrica
[0119] As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos adequados para uso em pediatria. Esses indivíduos têm tipicamente menos que cerca de 3 anos de idade, ou menos que cerca de 2 anos de idade, ou menos que cerca de 1 ano de idade. Os antígenos pediátricos podem ser administrados múltiplas vezes no período de 6 meses, 1, 2 ou 3 anos. Os antígenos pediátricos podem ser derivados de um vírus que pode visar populações pediátricas e/ou um vírus ao qual as populações pediátricas são suscetíveis a infecção. Os antígenos virais pediátricos incluem antígenos derivados de um ou mais de Ortomixovírus (influenza), Pneumovírus (RSV), Paramixovírus (PIV e caxumba), Morbilivírus (sarampo), Togavírus (Rubéola), Enterovírus (polio), HBV, Coronavírus (SARS) e Varicela-zoster vírus (VZV), vírus de Epstein Barr (EBV). Os antígenos bacterianos pediátricos incluem antígenos derivados de um ou mais de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A), Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani (Tétano), Corynebacterium diphtheriae (Difteria), Haemophilus influenzae B (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B) e E. coli. Exemplos de antígenos específicos derivados desses patógenos são descritos acima.
G. Antígenos adequados para uso em pessoas idosas ou imunocomprometidas
[0120] As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos adequados para uso em pessoas idosas ou imunocomprometidas. Tais indivíduos podem precisar ser vacinados mais freqüentemente, com doses maiores ou com formulações com adjuvante para melhorar sua resposta imune aos antígenos visados. Os antígenos que podem ser direcionados para uso em pessoas idosas ou imunocomprometidas incluem antígenos derivados de um ou mais dos seguintes patógenos: Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A), Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Clostridium tetani (Tétano), Corynebacterium diphtheriae (Difteria), Haemophilus influenzae B (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B), Enterococcus faecalis, Helicobacter pylori, Clamydia pneumoniae, Orthomyxovírus (influenza), Pneumovírus (RSV), Paramixovírus (PIV e caxumba), Morbilivírus (sarampo, Togavírus (Rubéola), Enterovírus (polio), HBV, Coronavírus (SARS), Varicela- zoster vírus (VZV), vírus de Epstein Barr (EBV), Citomegalovírus (CMV). Exemplos de antígenos específicos derivados desses patógenos são descritos acima.
H. Antígenos adequados para uso em vacinas para adolescentes
[0121] As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos adequados para uso em adolescentes. Adolescentes podem necessitar de um reforço de um antígeno pediátrico previamente administrado. Os antígenos pediátricos que podem ser adequados para uso em adolescentes são descritos acima. Além disso, os adolescentes podem receber antígenos derivados de um patógeno de STD para assegurar imunidade protetora ou terapêutica antes do início da atividade sexual. Os antígenos de STD que podem ser adequados para uso em adolescentes são descritos acima.
I. Formulações de Antígeno
[0122] Em outros aspectos da invenção, os métodos de produção de micropartículas que têm antígenos adsorvidos são fornecidos. Os métodos compreendem: (a) o fornecimento de uma emulsão por dispersão de uma mistura que compreende (i) água, (ii) um detergente, (iii) um solvente orgânico, e (iv) um polímero biodegradável selecionado do grupo que consiste em um ácido poli(α- hidroxi), um ácido polihidroxi butírico, uma policaprolactona, um poliortoéster, um polianidrido e um policianoacrilato. O polímero é tipicamente presente na mistura em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 30% em relação ao solvente orgânico, enquanto o detergente é tipicamente presente na mistura em uma proporção peso-a-peso detergente-para-polímero de cerca de 0,00001:1 a cerca de 0,1:1 (mais tipicamente cerca de 0,0001:1 a cerca de 0,1:1, cerca de 0,001:1 a cerca de 0,1:1, ou cerca de 0,005:1 a cerca de 0,1:1); (b) remoção do solvente orgânico da emulsão; e (c) adsorção de um antígeno na superfície das micropartículas. Em algumas modalidades, o polímero biodegradável está presente em uma concentração de cerca de 3% a cerca de 10% em relação ao solvente orgânico.
[0123] As micropartículas para uso nesta especificação são formadas de materiais que são esterilizáveis, atóxicos e biodegradáveis. Tais materiais incluem, sem limitação, ácido poli(α-hidroxi), ácido polihidroxi butírico, policaprolactona, poliortoéster, polianidrido, PACA e policianoacrilato. Preferivelmente, as micropartículas para uso com a presente invenção são derivadas de um ácido poli(α-hidroxi), em particular, de uma poli(lactida) (“PLA”) ou um copolímero de D,L-lactida e glicolida ou ácido glicólico, como poli(D,L- lactida-co-glicolida) (“PLG” ou “PLGA”), ou um copolímero de D,L-lactida e caprolactona. As micropartículas podem ser derivadas de qualquer um dos vários materiais de iniciação poliméricos que têm uma variedade de pesos moleculares e, no caso dos copolímeros como PLG, uma variedade de proporções de lactida:glicolida, a seleção destes será uma matéria de escolha, dependendo em parte da macromolécula co-administrada. Esses parâmetros são discutidos mais completamente abaixo.
[0124] Antígenos adicionais também podem incluir uma preparação de vesícula de membrana externa (OMV).
[0125] Métodos adicionais de formulação e antígenos (especialmente antígenos de tumor) são fornecidos na Patente U.S. No. De série 09/581.772.
J. Referências de antígenos
[0126] As seguintes referências incluem antígenos úteis junto com as composições da presente invenção: 1 Pedido de patente internacional WO99/24578 2 Pedido de patente internacional WO99/36544. 3 Pedido de patente internacional WO99/57280. 4 Pedido de patente internacional WO00/22430. 5 Tettelin e cols. (2000) Science 287:1809-1815. 6 Pedido de patente internacional W096/29412. 7 Pizza e cols. (2000) Science 287:1816-1820. 8 PCT WO 01/52885. 9 Bjune e cols. (1991) Lancet 338(8775). 10 Fuskasawa e cols. (1999) Vaccine 17:2951-2958. 11 Rosenqist e cols. (1998) Dev. Biol. Strand 92:323-333. 12 Constantino e cols. (1992) Vaccine 10:691-698. 13 Constantino e cols. (1999) Vaccine 17:1251-1263. 14 Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332. 15 Rubin (20000) Pediatr Clin North Am 47:269-285,v. 16 Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207. 17 Pedido de patente internacional depositado em 3 de julho de 2001 reivindicando prioridade de GB 0016363.4; WO 02/02606; PCT IB/01/00166. 18 Kalman e cols. (1999) Nature Genetics 21:385-389. 19 Read e cols. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406. 20 Shirai e cols. (2000) J. Infect. Dis 181(Suppl 3):S524-S527. 21 Pedido de patente internacional WO99/27105. 22 Pedido de patente internacional WO00/27994. 23 Pedido de patente internacional WO00/37494. 24 Pedido de patente internacional WO99/28475. 25 Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188. 26 Iwarson (1995) APMIS 103:321-326. 27 Gerlich e cols. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80. 28 Hsu e cols. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915. 29 Gastofsson e cols. (1996) N. Engl. J. Med. 334-:349-355. 30 Rappuoli e cols. (1991) TIBTECH 9:232-238. 31 Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0. 32 Del Guidice e cols. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70. 33 Pedido de patente internacional WO93/018150. 34 Pedido de patente internacional WO99/53310. 35 Pedido de patente internacional W098/04702. 36 Ross e cols. (2001) Vaccine 19:135-142. 37 Sutter e cols. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308. 38 Zimmerman & Spann (1999) Am Fan Physician 59:113-118, 125-126. 39 Dreensen (1997) Vaccine 15 Suppl"S2-6. 40 MMWR Morb Mortal Wkly rep 1998 Jan 16:47(1):12, 9. 41 McMichael (2000) Vaccinel9 Suppl 1:S101-107. 42 Schuchat (1999) Lancer 353(9146):51-6. 43 Pedido de patente GB 0026333.5, 0028727.6 & 0105640.7. 44 Dale (1999) Infect Disclin North Am 13:227-43, viii. 45 Ferretti e cols. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663. 46 Kuroda e cols. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; veja as páginas 1.2181.219. 47 Ramsay e cols. (2001) Lancet 357(9251):195-196. 48 Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36. 49 Buttery & Moxon (2000) J R Coil Physicians Long 34:163-168. 50 Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii. 51 Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:663-567. 52 Patente Européia 0 477 508. 53 Patente U.S. No. 5.306.492. 54 Pedido de patente internacional WO98/42721. 55 Conjugate Vaccines (eds. Cruse e cols.) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10:48-114. 56 Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 012323368 & 012342335X. 57 Pedido de Patente Européia 0372501. 58 Pedido de Patente Européia 0378881. 59 Pedido de Patente Européia 0427347. 60 Pedido de patente internacional W093/17712. 61 Pedido de patente internacional W098/58668. 62 Pedido de Patente Européia 0471177. 63 Pedido de patente internacional WO00/56360. 64 Pedido de patente internacional WO00/67161.
[0127] Os conteúdos de todas as patentes, pedidos de patente e artigos de revistas acima citados são incorporados por referência como se totalmente aqui apresentados.
[0128] Quando um antígeno de sacarídeo ou carboidrato é usado, ele é preferivelmente conjugado a uma proteína carreadora para melhorar a imunogenicidade. Veja Ramsay e cols. (2001) Lancet 357(9251):195-196; Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36; Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163-168; Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii; Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567; patente européia 0 477 508; Patente US No. 5.306.492; WO98/42721; Conjugate Vaccines (eds. Cruse e cols.) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10:48-114; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 ou 012342335X. As proteínas carreadoras preferidas são toxinas ou toxóides bacterianos, como toxóides diftérico ou tetânico. O toxóide diftérico CRM197 é particularmente preferido.
[0129] Outros polipeptídeos carreadores incluem a proteína de membrana externa de N. meningitidis (EP-A0372501), peptídeos sintéticos (EP-A-0378881 e EP-A 0427347), proteínas heat shock (WO 93/17712 e WO 94/03208), proteínas de pertussis (WO 98/58668 e EP A 0471177), proteína D de H. influenzae (WO 00/56360), citocinas (WO 91/01146), linfocinas, hormônios, fatores de crescimento, toxina A ou B de C. difficile (WO 00/61761), proteínas de captação de ferro (WO 01/72337) etc. Quando uma mistura compreende sacarídeo capsular de serigrafos A e C, pode ser preferível que a proporção (w/w) de sacarídeo MenA:sacarídeo MenC seja maior que 1 (por exemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou maior). Diferentes sacarídeos podem ser conjugados ao mesmo tipo de proteína carreadora ou de tipo diferente. Qualquer reação de conjugação adequada pode ser usada, com qualquer ligante adequado quando necessário.
[0130] Antígenos de proteína tóxicos podem ser desintoxicados quando necessário, por exemplo, desintoxicação de toxina de pertussis por meio químico e/ou genético. Veículos farmaceuticamente aceitáveis
[0131] As composições da invenção compreenderão tipicamente, além dos componentes acima mencionados, um ou mais “veículos farmaceuticamente aceitáveis". Esses incluem qualquer veículo que não induza em si a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição. Os veículos adequados são tipicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e agregados lipídicos (como gotas de óleo ou lipossomos). Tais veículos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A composição também pode conter um diluente, como água, solução salina, glicerol etc. Adicionalmente, uma substância auxiliar, como um agente umectante ou emulsificante, substância de tamponamento de pH, e outros, pode estar presente. Uma discussão completa de componentes farmaceuticamente aceitáveis é disponível em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20â ed., ISBN: 0683306472. Agentes Imunorreguladores
Adjuvantes
[0132] As vacinas da invenção podem ser administradas junto com outros agentes imunorreguladores. Em particular, as composições ainda compreendem um adjuvante. Adjuvantes para uso com a invenção incluem, sem limitação, um ou mais do seguinte conjunto apresentado abaixo: A. Composições que contêm mineral
[0133] Composições que contêm mineral adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, como sais de alumínio e sais de cálcio. A invenção inclui sais minerais como hidróxidos (por exemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por exemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos etc. (por exemplo, veja capítulos 8 e 9 de Vaccine Design. (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.), ou misturas de diferentes compostos minerais (por exemplo a mistura de um fosfato e um adjuvante de hidróxido, opcionalmente com um excesso do fosfato), com os compostos tomando qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa etc.), e com absorção ao sal sendo preferida. As composições que contêm mineral também podem ser formuladas como um partícula de sal de metal (WO00/23105).
[0134] Sais de alumínio podem ser incluídos nas vacinas aqui descritas de tal forma que a dose de Al3+ esteja entre 0,2 e 1,0 mg por dose.
[0135] Em uma modalidade, o adjuvante à base de alumínio para uso na presente invenção é alume (sulfato de alumínio potássio (AlK(SO4)2)), ou um derivado de alume, como aquele formado in-situ por mistura de um antígeno em tampão de fosfato com alume, seguido por titulação e precipitação com uma base como hidróxido de amônio ou hidróxido de sódio.
[0136] Outro adjuvante com base em alumínio para uso em formulações de vacina da presente invenção é adjuvante de hidróxido de alumínio (Al(OH)3) ou oxihidróxido de alumínio cristalino (AlOOH), que é um excelente adsorvente, tendo uma área de superfície de aproximadamente 500m2/g. Alternativamente, adjuvante de fosfato de alumínio (AlPO4) ou hidroxifosfato de alumínio, que contém grupos fosfato no lugar de alguns ou todos os grupos hidroxil de adjuvante de hidróxido de alumínio, é fornecido. Os adjuvantes de fosfato de alumínio preferidos aqui fornecidos são amorfos e solúveis em meio ácido, básico e neutro.
[0137] Em outra modalidade, o adjuvante da invenção compreende tanto fosfato de alumínio quanto hidróxido de alumínio. Em uma modalidade mais particular desta especificação, o adjuvante tem uma maior quantidade de fosfato de alumínio que de hidróxido de alumínio, como uma proporção de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou maior que 9:1, em peso de fosfato de alumínio para hidróxido de alumínio. Mais particularmente, os sais de alumínio na vacina são presentes a 0,4 a 1,0 mg por dose de vacina, ou 0,4 a 0,8 mg por dose de vacina, ou 0,5 a 0,7 mg por dose de vacina, ou cerca de 0,6 mg por dose de vacina.
[0138] Geralmente, os adjuvantes com base em alumínio preferidos, ou proporção de múltiplos adjuvantes com base em alumínio, como fosfato de alumínio para hidróxido de alumínio, são selecionados por otimização de atração eletrostática entre as moléculas de modo que o antígeno carrega uma carga oposta como o adjuvante no pH desejado. Por exemplo, adjuvante de fosfato de alumínio (ponto isoelétrico = 4) absorve lisozima, mas não albumina em pH 7,4. Se a albumina for o alvo, adjuvante de hidróxido de alumínio deve ser selecionado (iep 11.4). Alternativamente, pré-tratamento de hidróxido de alumínio com fosfato diminui seu ponto isoelétrico, o que o torna um adjuvante preferido para antígenos mais básicos. B. Emulsões oleosas
[0139] Composições de emulsões oleosas adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem emulsões de esqualeno-água como MF59 (esqualeno 5%, Tween 80 0,5% e Span 85 0,5%, formulados em partículas submícron com o uso de um microfluidificador). Veja WO 90/14837. Veja também Podda, Vaccine (2001) 19: 2.673-2.680; Frey e cols., Vaccine (2003) 21: 4.2344.237. MF59 é usado como o adjuvante na vacina de subunidade trivalente de vírus influenza FL-UADTM.
[0140] Adjuvantes particularmente preferidos para uso nas composições são emulsões óleo-em-água submícron. Emulsões óleo-em-água submícron preferidas para uso nesta especificação são emulsões esqualeno/água, contendo opcionalmente quantidades variáveis de MTP-PE, por exemplo, uma emulsão óleo-em-água submícron contendo 4-5% p/v de esqualeno, 0,25-1,0% p/v de Tween 80 TM (monooleato de polioxieltilenosorbitano), e/ou Span 85 TM 0,25-1,0% (trioleato de sorbitano) e, opcionalmente, N-acetilmuramil- L-alanil-D-isoglutaminil- L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfoforiloxi)-etilamina (MTP-PE), por exemplo, a emulsão óleo-em-água submícron conhecida como “MF59” (Publicação Internacional No. WO 90/14837; Patentes U.S. Nos. 6.299.884 e 6.451.325, e Ott e cols., em “Vaccine Design: The Subunity and Adjuvant Approach” (Powell, M.F. and Newman, M.J. eds.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296). MF59 contém 4-5% p/v de Esqualeno (por exemplo, 4,3%), 0,250,5% p/v de Tween 80 TM, e 0,5% p/v de Span 85 TM e, opcionalmente, contém várias quantidades de MTP-PE, formulada em partículas submícron usando um microfluidificador como, por exemplo, o microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA). Por exemplo, MTP-PE pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0-500 μg/dose, mais preferivelmente 0-250 μg/dose e, mais preferivelmente ainda, 0-100 μg/dose. Como aqui usado, o termo “MF59-0” refere-se à emulsão óleo-em-água submícron acima desprovida de MTP-PE, enquanto o termo MF59-MTP representa uma formulação que contém MTP-PE. Por exemplo, “MF59-100” contém 100 μg de MTP-PE por dose, e assim por diante. MF69, outra emulsão óleo-em-água submícron para uso nesta especificação, contém 4,3% p/v de esqualeno, 0,25% p/v de Tween 80 TM, e 0,75% p/v de Span 85 TM e, opcionalmente, MTP-PE. Ainda outra emulsão óleo- em-água submícron é MF75, também conhecida como SAF, que contém 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80 TM, 5% de polímero plurônico-bloqueado L121, e thr-MDP, também microfluidificada em uma emulsão submícron. MF75-MTP representa uma formulação de MF75 que inclui MTP, por exemplo, de 100-400 μg de MTP-PE por dose.
[0141] Emulsões óleo-em-água submícron, métodos de sua produção e agentes imunoestimulantes, por exemplo, muramil peptídeos, para uso nas composições, são descritos em detalhe na Publicação Internacional No. WO 90/14837 e nas Patentes U.S. Nos. 6.299.884 e 6.451.325.
[0142] O adjuvante completo de Freund (CFA) e o adjuvante incompleto de Freund (IFA) também podem ser usados como adjuvantes na invenção. C. Formulações de saponina
[0143] Formulações de saponina também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Saponinas são um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenóide que são encontrados na casca, folhas, caules, raízes e até mesmo nas flores de uma ampla gama de espécies de plantas. A saponina da casca da árvore Quillaia saponaria Molina foi amplamente estudada como adjuvante. A saponina também pode ser obtida comercialmente de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (mosquitinho) e Saponaria officianalis (saponária). Formulações de adjuvante de saponina incluem formulações purificadas, por exemplo, QS21, bem como formulações líquidas, por exemplo, ISCOMs.
[0144] As composições de saponina foram purificadas usando Cromatografia de Camada Delgada de Alto Rendimento (HP-TLC) e Cromatografia Líquida de Fase Reversa de Alto Rendimento (RP-HPLC). Foram identificadas frações purificadas específicas usando essas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. Preferivelmente, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é revelado na Patente U.S. No. 5.057.540. As formulações de saponina também podem compreender um esterol, por exemplo, colesterol (veja WO 96/33739).
[0145] Combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas únicas denominadas Complexos Imunoestimulantes (ISCOMs). ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídeo como, por exemplo, fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. Preferivelmente, o ISCOM inclui um ou mais de Quil A, QHA e QHC. ISCOMs são ainda descritos em EP0109942, WO 96/11711 e WO 96/33739. Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional. Veja WO 00/07621.
[0146] Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes à base de saponina pode ser encontrada em Barr, e cols., Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32: 247-271. Veja também Sjolander, e cols., Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32: 321-338. D. Virossomos e partículas vírus-LIKE (VLPs)
[0147] Virossomos e partículas vírus-like (VLPs) também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Essas estruturas geralmente contêm uma ou mais proteínas de um vírus opcionalmente combinadas ou formuladas com um fosfolipídeo. Eles são geralmente não patogênicos e não replicantes, e geralmente não contêm nada do genoma viral nativo. As proteínas virais podem ser produzidas recombinantemente ou isoladas de vírus inteiros. Essas proteínas virais adequadas para uso em virossomos ou VLPs incluem proteínas derivadas do vírus influenza (por exemplo, HA ou NA), do vírus da hepatite B (por exemplo, proteínas centrais ou do capsídeo), do vírus da hepatite E, vírus do sarampo, vírus Sindbis, Rotavírus, vírus da febre aftosa, Retrovírus, vírus Norwalk, vírus do papiloma humano, HIV, RNA-fagos, Qβ-fago (por exemplo, proteínas de revestimento), GA-fago, fr-fago, AP205 fago e Ty (por exemplo, proteína do retrotransposon Ty p1). VLPs são ainda discutidos em WO 03/024480, WO 03/024481, e em Niikura e cols., Virology (2002) 293: 273-280; Lenz e cols., Journal of Immunology (2001) 5.246-5.355; Pinto, e cols., Journal of Infectious Diseases (2003) 188: 327-338; e em Gerber e cols., Journal of Virology (2001) 75(10): 4.752-4.760. Virossomos são ainda discutidos em, por exemplo, Gluck e cols., Vaccine (2002) 20: B10-B16. Virossomos de influenza reconstituídos imunopotencializadores (IRIV) são usados como o sistema de liberação de subunidade de antígeno no produto intranasal trivalente INFLEXALTM {Mischler e Metcalfe (2002) Vaccine 20 Supl. 5: B17-23} e no produto INFLUVAC PLUSTM E. Derivados bacterianos ou microbianos
[0148] Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem derivados bacterianos ou microbianos, tais como: (1) Derivados atóxicos de lipopolissacarídeo enterobacteriano (LPS)
[0149] Tais derivados incluem Monofosforil lipídeo A (MPL) e MPL 3-O- desacilado (3dMPL). 3dMPL é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3 Des-O- acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma preferida de “pequena partícula” de monofosforil lipídeo A 3 Des-O-acilado é revelada em EP 0.689.454. Essas “pequenas partículas” de 3dMPL são suficientemente pequenas para serem esterilizadas por filtração através de uma membrana de 0,22 mícron (veja EP 0.689.454). Outros derivados atóxicos de LPS incluem miméticos de monofosforil lipídeo A, tais como derivados de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por exemplo, RC-529. Veja Johnson e cols. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9: 2.273-2.278. (2) Derivados de Lipídeo
[0150] Derivados de Lipídeo A incluem derivados de lipídeo A de Escherichia coli como, por exemplo, OM-174. OM-174 é descrito, por exemplo, em Meraldi e cols., Vaccine (2003) 21: 2.485-2.491; e Pajak, e cols., Vaccine (2003) 21: 836-842. (3) Oligonucleotídeos imunoestimulantes
[0151] Oligonucleotídeos imunoestimulantes adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem seqüências de nucleotídeos que contêm um motivo CpG (uma seqüência que contém uma citosina não metilada seguida por guanosina e ligada por uma ligação fosfato). RNA bacteriano de filamento duplo ou oligonucleotídeos que contêm seqüências palindrômicas ou poli (dG) também demonstraram ser imunoestimulantes.
[0152] Os CpGs podem incluir modificações/análogos de nucleotídeos como, por exemplo, modificações fosforotioato, e podem ser de filamento duplo ou de filamento simples. Opcionalmente, a guanosina pode ser substituída com um análogo como, por exemplo, 2’-desoxi-7-deazaguanosina. Veja Kandimalla, e cols., Ácido nucléicos Research (2003) 31(9): 2.393-2.400; WO 02/26757 e WO 99/62923 para exemplos de possíveis substituições análogas. O efeito adjuvante de oligonucleotídeos CpG é ainda discutido em Krieg, Nature Medicine (2003) 9(7): 831-835; McCluskie, e cols., FEMS Immunology and Medical Microbiology (2002) 32: 179-185; WO 98/40100; Patente U.S. No. 6.207.646; Patente U.S. No. 6.239.116 e Patente U.S. No. 6.429.199.
[0153] A seqüência CpG pode ser dirigida para TLR9, por exemplo, o motivo GTCGTT ou TTCGTT. Veja Kandimalla, e cols., Biochemical Society Transactions (2003) 31 (parte 3): 654-658. A seqüência CpG pode ser específica para a indução de uma resposta imune Th1, por exemplo, um ODN CpG-A, ou pode ser mais específica para a indução de uma resposta de célula B, por exemplo, um ODN CpG-B. ODNs CpG-A e CpG-B são discutidos em Blackwell, e cols., J. Immunol. (2003) 170(8): 4.061-4.068; Krieg, TRENDS in Immunology (2002) 23(2): 64-65 e WO 01/95935. Preferivelmente, o CpG é um ODN CpG-A.
[0154] Preferivelmente, o oligonucleotídeo CpG é construído de modo que a extremidade 5’ seja acessível para reconhecimento de receptor. Opcionalmente, duas seqüências de oligonucleotídeos CpG podem ser anexadas em suas extremidades 3’ para formar “imunômeros”. Veja, por exemplo, Kandimalla, e cols., BBRC (2003) 306: 948-953; Kandimalla, e cols., Biochemical Society Transactions (2003) 31 Parte 3):664-658; Bhagat e cols., BBRC (2003) 300: 853861 e WO 03/035836. (4) Toxinas de ribosilação de ADP e derivados detoxificados destas
[0155] Toxinas bacterianas de ribosilação de ADP e derivados detoxificados destas podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Preferivelmente, a proteína é derivada de E. coli (ou seja, enterotoxina termolábil de E. coli, “LT”), colérica (“CT”) ou de pertussis (“PT”). O uso de toxinas de ribosilação de ADP detoxificadas como adjuvantes mucosos é descrito em WO 95/17211, e como adjuvantes parenterais em WO 98/42375. Preferivelmente, o adjuvante é um mutante de LT detoxificado como, por exemplo, LT-K63, LT-R72 e LTR192G. O uso de toxinas de ribosilação de ADP e derivados detoxificados destas como adjuvantes, particularmente LT-K63 e LT-R72, pode ser encontrado nas seguintes referências: Beignon, e cols., Infection and Immunity (2002) 70(6): 3.012-3.019; Pizza, e cols., Vaccine (2001) 19: 2.534-2.541; Pizza, e cols., Int. J. Med. Microbiol. (2000) 290(4-5): 455-461; Scharton-Kersten e cols., Infection and Immunity (2000) 68(9): 5.306-5.313; Ryan e cols., Infection and Immunity (1999) 67(12): 6.270-6.280; Partidos e cols., Immunol. Lett. (1999) 67(3): 209-216; Peppoloni e cols., Vaccines (2003) 2(2): 285-293; e Pine e cols., (2002) J. Control Release (2002) 85(1-3): 263-270. A referência numérica para substituições de aminoácidos se baseia preferivelmente nos alinhamentos das subunidades A e B de toxinas de ribosilação de ADP apresentados em Domenighini e cols., Mol. Microbiol. (1995) 15(6): 1.165-1.167. F. Bioadesivos e mucoadesivos
[0156] Bioadesivos e mucoadesivos também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Bioadesivos adequados incluem microesferas de ácido hialurônico esterificadas (Singh e cols. (2001) J. Cont. Rele. 70: 267-276) ou mucoadesivos como derivados entrecruzados de ácido poli(acrílico), álcool polivinílico, polivinil pirolidona, polissacarídeos e carboximetilcelulose. Quitosana e derivados desta também podem ser usados como adjuvantes nas composições aqui descritas. Veja, por exemplo, WO 99/27960. G. Micropartículas
[0157] Micropartículas também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Micropartículas (ou seja, uma partícula de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 150 μm de diâmetro, mais preferivelmente aproximadamente 200 nm a 30 μn de diâmetro, e mais preferivelmente aproximadamente 500 nm a aproximadamente 10 μm de diâmetro) formadas de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um ácido poli(α-hidroxi), um ácido polihidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona etc.) com poli(lactida co-glicolida) são preferidas, opcionalmente tratadas para ter uma superfície negativamente-carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamente-carregada (por exemplo, com um detergente catiônico, como CTAB). H. Lipossomos
[0158] Exemplos de formulações em lipossomos adequadas para uso como adjuvantes são descritos na Patente U.S. No. 6.090.406, Patente U.S. No. 5.916.588 e EP 0.626.169. I. Formulações de éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno
[0159] Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno. Veja, WO 99/52549. Tais formulações também incluem tensoativos de éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol (WO 01/21207), bem como polioxietileno alquil éteres ou tensoativos de éster em combinação com pelo menos um tensoativo não iônico adicional como um octoxinol (WO 01/21152).
[0160] Éteres de polioxietileno preferidos são selecionados do seguinte grupo: polioxietileno-9-lauril éter (laureth 9), polioxietileno-9-esteoril éter, polioxietileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35-lauril éter, e polioxietileno-23-lauril éter. J. Polifosfazeno (PCPP)
[0161] Formulações de PCPP são descritas, por exemplo, em Andrianov e cols., “Preparation of hidrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions”, Biomaterials (1998) 19(1-3): 109-115 e Payne e cols., “Proteína Release from Polyphosphazene Matrices”, Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31(3): 185-196. K. Muramil peptídeos
[0162] Exemplos de muramil peptídeos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem N-acetil muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr- MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) e N-acetilmuramil- L-alanil-D-isoglutaminil-1-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)- etilamina MTP-PE). L. Compostos de imidazoquinolina
[0163] Exemplos de compostos de imidazoquinolina adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem Imiquamod e seus homólogos, descritos também em Stanley, Clin. Exp. Dermatol. (2002) 27(7): 571-577, Jones, Curr. Opin. Investig. Drugs. (2003) 4(2): 214-218; e as Patentes U.S. 4.689.338, 5.389.640, 5.268.376, 4.929.624, 5.266.575, 5.352.784, 5.494.916, 5.482.936, 5.346.905, 5.395.937, 5.238.944 e 5.525.612. M. Compostos de tio-semicarbazonas.
[0164] Exemplos de compostos de tio-semicarbazonas, bem como métodos de formulação, manufatura e rastreamento por compostos adequados para uso como adjuvantes na invenção, incluem aqueles descritos em WO04/60308. As tio- semicarbazonas são particularmente eficazes no estímulo de células mononucleares de sangue periférico humano para a produção de citocinas, como TNF-α. N. Compostos de triptantrina.
[0165] Exemplos de compostos de triptantrina, bem como métodos para a formulação, fabricação e teste de compostos adequados para uso como adjuvantes na invenção, incluem aqueles descritos em WO04/64759. Os compostos de triptantrina são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citocinas, por exemplo, TNF-α.
[0166] A invenção também pode compreender combinações de aspectos de um ou mais dos adjuvantes acima identificados. Por exemplo, as seguintes composições de adjuvantes podem ser usadas na invenção: (1) uma saponina e uma emulsão óleo-em-água (WO 99/11241); (2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) (veja WO 94/00153); (3) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) + um colesterol; (4) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol) (WO 9S/57659); (5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões óleo- em-água (Veja pedidos de Patente Européia 0835318, 0735898 e 0761231); (6) SAF, que contém Esqualano 10%, Tween 80 0,4%, 5% plurônico- polímero em bloco L121 e thr-MDP, tanto microfluidificado em uma emulsão submícron quanto turbilhonado para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior; (7) Sistema adjuvante RibiTM (RAS) (Ribi Immunochem), que contém Esqualeno 2%, Tween 80 0,2%, e uma ou mais célula componentes da parede bacteriana do grupo que consiste em monofosforilipídeo A (MPL), trehalose dimicolato (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (DetoxTM); e (8) um ou mais sais minerais (por exemplo, um sal de alumínio) + um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dPML). (9) um ou mais sais minerais (por exemplo, um sal de alumínio) + um oligonucleotídeo imunoestimulante (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos que inclui um motivo CpG). O. Imunomoduladores humanos
[0167] Imunomoduladores humanos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 etc.), interferons (por exemplo, interferon—Y), fator estimulante de colônia de macrófagos, e fator de necrose tumoral.
[0168] Sais de alumínio e MF59 são adjuvantes preferidos para uso com vacinas injetáveis contra influenza. Toxinas bacterianas e bioadesivos são adjuvantes preferidos para uso com vacinas liberadas por via mucosa, por exemplo, vacinas nasais.
[0169] Os conteúdos de todas as patentes, pedidos de patente e artigos de revistas acima citados são aqui incorporados por referência como se totalmente aqui apresentados.
Métodos terapêuticos
[0170] A invenção fornece as composições acima descritas para uso em terapia. A invenção fornece as composições acima descritas para indução ou aumento de uma resposta imune a S. pyogenes. A invenção fornece métodos para indução ou aumento de uma resposta imune a S. pyogenes com o uso das composições acima descritas. A resposta imune é preferivelmente protetora e pode incluir anticorpos e/ou imunidade mediada por célula (incluindo imunidade sistêmica e mucosa). As respostas imunes incluem respostas de reforço.
[0171] Adolescentes e crianças, incluindo bebês e lactentes, podem receber uma vacina para uso profilático; as vacinas terapêuticas são tipicamente administradas a adolescentes ou adultos. Uma vacina para crianças também pode ser administrada a adultos, por exemplo, para avaliar segurança, dosagem, imunogenicidade etc.
[0172] As doenças causadas por Streptococcus pyogenes que podem ser evitadas ou tratadas de acordo com a invenção incluem, sem limitação, faringite (como amidalite estreptocócica), escarlatina, impetigo, erisipelas, celulite, septicemia, síndrome de choque tóxico, fascite necrotizante, e seqüelas como febre reumática e glomerulonefrite aguda. As composições também podem ser eficazes contra outras bactérias estreptocócicas, por exemplo, GBS.
Testes para determinar a eficácia de uma resposta imune
[0173] Uma via para avaliar a eficácia de tratamento terapêutico envolve o monitoramento de infecção por GAS após a administração da composição da invenção. Uma via para avaliar a eficácia de tratamento profilático envolve o monitoramento de respostas imune contra os antígenos de GAS57 mutante nas composições da invenção após administração da composição.
[0174] Outra via para avaliar a imunogenicidade das proteínas componentes das composições imunogênicas da presente invenção é o rastreamento de antígenos de GAS57 mutante recombinantemente e rastreamento do soro do paciente ou secreções mucosas por imunoblot. Uma reação positiva entre a proteína e o soro do paciente indica que o paciente formou previamente uma resposta imune à proteína em questão; ou seja, a proteína é um imunógeno. Esse método também pode ser usado para identificar proteínas e/ou epitopos imunodominantes.
[0175] Outra via de checar a eficácia de tratamento terapêutico envolve o monitoramento da infecção por GAS após administração das composições da invenção. Uma via de checar a eficácia de tratamento profilático envolve o monitoramento de respostas imunes sistemicamente (como o monitoramento do nível de produção de IgG1 e IgG2a) e por via mucosa (como o monitoramento do nível de produção de IgA) contra GAS57 após administração da composição. Tipicamente, as respostas de anticorpo séricas específicas são determinadas pós-imunização, mas antes da dose, enquanto as respostas corporais mucosas de anticorpo específicas são determinadas pós-imunização e pós-dose.
[0176] As composições de vacina da presente invenção podem ser avaliadas em modelos animais in vitro e in vivo antes da administração ao hospedeiro, por exemplo, humano. Modelos de camundongo particularmente úteis incluem aqueles em que a imunização intraperitoneal é seguida por dose intraperitoneal ou dose intranasal.
[0177] A eficácia das composições imunogênicas da invenção também pode ser determinada in vivo por dose em modelos animais com GAS, por exemplo, porquinhos da Índia ou camundongos, com as composições imunogênicas. As composições imunogênicas podem ser derivadas ou não dos mesmos sorotipos como os sorotipos de dose.
[0178] Os modelos de eficácia in vivo incluem, mas não são limitados a: (i) um modelo de infecção de murídeo que usa sorotipos de GAS humano; (ii) um modelo de infecção de murídeo que é um modelo de murídeo que usa uma cepa de GAS adaptada a camundongo, como a cepa M23 que é particularmente virulenta em camundongo, e (iii) um modelo de primata que usa isolados de GAS humano.
[0179] A resposta imune pode ser uma ou ambas de uma resposta imune Th1 e uma resposta Th2. A resposta imune pode ser uma resposta imune melhorada ou aumentada ou uma resposta imune alterada. A resposta imune pode ser uma ou ambas de uma resposta imune sistêmica e uma resposta imune mucosa. Preferivelmente, a resposta imune é uma resposta sistêmica e/ou mucosa aumentada.
[0180] Uma imunidade sistêmica e/ou mucosa aumentada é refletida em uma resposta imune de Th1 e/ou Th2 aumentada. Preferivelmente, a resposta imune aumentada inclui um aumento na produção de IgG1 e/ou IgG2a e/ou IgA.
[0181] Preferivelmente, a resposta imune mucosa é uma resposta imune TH2. Preferivelmente, a resposta imune mucosa inclui um aumento na produção de IgA
[0182] Células TH2 ativadas aumentam a produção de anticorpo e são, portanto, valiosas na resposta a infecções extracelulares. Células TH2 ativadas podem secretar um ou mais de IL-4, IL- 5, IL-6 e IL-10. Uma resposta imune TH2 pode resultar na produção de IgG1, IgE, IgA e células B de memória para proteção futura.
[0183] Uma resposta imune TH2 pode incluir um ou mais de um aumento em uma ou mais das citocinas associadas com uma resposta imune TH2 (como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10), ou um aumento na produção de IgG1, IgE, IgA e células B de memória. Preferivelmente, a resposta imune TH2 aumentada incluirá um aumento na produção de IgG1.
[0184] Uma resposta imune TH1 pode incluir um ou mais de um aumento de CTLs, um aumento em uma ou mais das citocinas associadas a uma resposta imune TH1 (por exemplo, IL-2, IFNY e TNFβ), um aumento em macrófagos ativados, um aumento na atividade de NK ou um aumento na produção de IgG2a. Preferivelmente, a resposta imune TH1 aumentada incluirá um aumento na produção de IgG2a.
[0185] As composições imunogênicas aqui descritas, em particular, composições imunogênicas que compreendem um ou mais antígenos de GAS57 mutante da presente invenção, podem ser usadas tanto isoladamente quanto em combinação com outros antígenos de GAS opcionalmente com um agente imunorregulador capaz de despertar uma reposta Th1 e/ou Th2.
[0186] A invenção também compreende uma composição imunogênica que compreende um ou mais agentes imunorreguladores, como um sal mineral, como um sal de alumínio e um oligonucleotídeo que contém um motivo de CpG. Mais preferivelmente, a composição imunogênica inclui tanto um sal de alumínio quanto um oligonucleotídeo que contém um motivo de CpG. Alternativamente, a composição imunogênica inclui uma toxina de ribosilação de ADP, como uma toxina de ribosilação de ADP desintoxicada e um oligonucleotídeo que contém um motivo de CpG. Preferivelmente, um ou mais dos agentes imuno-reguladores incluem um adjuvante. O adjuvante pode ser selecionado de um ou mais do grupo que consiste em um adjuvante Th1 e adjuvante Th2.
[0187] As composições da invenção despertarão preferivelmente tanto uma resposta imune mediada por célula como uma resposta imune humoral para controlar de modo eficaz uma infecção por GAS. Essa resposta imune induzirá preferivelmente anticorpos de longa duração (por exemplo, neutralizantes) e uma imunidade mediada por célula que pode responder rapidamente após exposição a um ou mais antígenos de GAS.
[0188] Em uma modalidade particularmente preferida, a composição imunogênica compreende um ou mais antígenos de GAS57 mutante que despertam uma resposta de Th1 anticorpo neutralizante e um ou mais antígenos de GAS57 mutante que despertam uma resposta imune mediada por célula. Desse modo, a resposta do anticorpo neutralizante previne ou inibe uma infecção inicial por GAS enquanto a resposta imune mediada por célula capaz de despertar uma resposta celular aumentada previne a disseminação da infecção por GAS.
[0189] As composições da invenção geralmente serão administradas diretamente a um paciente. As composições da presente invenção podem ser administradas, isoladamente ou como parte de uma composição, por meio de diferentes vias. Certas vias podem ser favorecidas para certas composições, resultando na geração de uma resposta imune mais eficaz, preferivelmente, uma resposta de CMI, ou sendo menos prováveis de induzir efeitos colaterais, ou sendo de administração mais fácil.
[0190] Os métodos de liberação direta incluem injeção parenteral (por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intradérmica, intravenosa, intramuscular ou injeção intersticial), ou por administração retal, oral (por exemplo, comprimido, spray), vaginal, tópica, transdérmica (veja, por exemplo, WO 99/27961) ou transcutânea (veja, por exemplo, WO 02/074244 e WO 02/064162), intranasal (veja, por exemplo, WO 03/028760), ocular, aural, pulmonar ou outra administração mucosa.
[0191] Por via de exemplo, as composições da presente invenção podem ser administradas por via sistêmica ou uma via mucosa ou uma via transdérmica, ou elas podem ser administradas diretamente a um tecido específico. Como aqui usado, o termo “administração sistêmica" inclui, sem limitação, qualquer via de administração parenteral. Em particular, a administração parenteral inclui, sem limitação, injeção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, ou intra-esternal, intravenosa, intra-arterial, ou infusão renal por diálise. Preferivelmente, a administração parenteral sistêmica é por injeção intramuscular. Como aqui usado, o termo “administração mucosa” inclui, sem limitação, administração oral, intranasal, intravaginal, intra-retal, intratraqueal, intestinal e oftálmica.
[0192] A dosagem do tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas. Doses múltiplas podem ser usadas em um esquema de imunização primária e/ou em um esquema de imunização de reforço. Em um esquema de doses múltiplas, as várias doses podem ser dadas pela mesma via ou por vias diferentes, por exemplo, uma dose inicial parenteral e um reforço mucoso, uma dose inicial mucosa e um reforço parenteral etc.
[0193] As composições da invenção podem ser preparadas de várias formas. Por exemplo, a composição pode ser preparada como injetáveis, tanto como soluções ou suspensões líquidas. Formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada). A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido ou cápsula, como um spray ou como um xarope (opcionalmente com sabor). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como gotas. A composição pode estar na forma de um kit, projetado de tal forma que uma composição combinada seja reconstituída imediatamente antes da administração a um paciente. Esses kits podem compreender um ou mais antígenos de GAS57 mutante ou outros antígenos em forma líquida e um ou mais antígenos liofilizados.
[0194] As composições imunogênicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno de GAS57 mutante ou outros antígenos (ou moléculas de ácido nucléico que codificam os antígenos), bem como quaisquer outros componentes, por exemplo, antibióticos, como necessário. Uma “quantidade imunologicamente eficaz” é uma quantidade que, quando administrada a um indivíduo, tanto em uma dose única quanto como parte de uma série, aumenta uma resposta imune mensurável ou evita ou reduz um sintoma clínico.
[0195] As composições imunogênicas da presente invenção podem ser administradas em combinação com um regime de tratamento de antibiótico. Em uma modalidade, o antibiótico é administrado antes da administração do antígeno da invenção ou a composição que compreende um ou mais antígenos de GAS57 mutante da invenção.
[0196] Em outra modalidade, o antibiótico é administrado subseqüente à administração de um antígeno de GAS57 mutante da invenção. Exemplos de antibióticos adequados para uso no tratamento de uma infecção por GAS incluem, sem limitação, penicilina ou um derivado desta ou clindamicina, cefalosporinas, glicopeptídeos (por exemplo, vancomicina) e ciclo-serina.
[0197] A quantidade de agente ativo na composição varia, no entanto, dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata etc.), capacidade do sistema imune do indivíduo de sintetizar anticorpos, grau de proteção desejada, formulação da vacina, avaliação da situação médica pelo médico que a trata, e outros fatores relevantes. A quantidade estará em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de experimentos rotineiros.
Kits
[0198] A invenção também fornece kits que contêm um ou mais recipientes das composições da invenção. Tais composições podem estar em forma líquida ou podem ser liofilizadas, assim como antígenos individuais. Recipientes adequados para as composições incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados a partir de vários materiais, incluindo vidro ou plástico. Um recipiente pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica).
[0199] O kit também pode conter um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como solução salina tamponada por fosfato, solução de Ringer ou solução de dextrose. Ele também pode conter outros materiais úteis para o usuário final, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. O kit também pode conter um segundo ou terceiro recipiente com outro agente ativo, por exemplo, um antibiótico.
[0200] O kit também pode conter uma inserção que contém instruções escritas para os métodos de indução de imunidade contra S. pyogenes ou para o tratamento de infecções por S. pyogenes. A inserção pode ser uma inserção não aprovada ou pode ser uma inserção aprovada pela “Food and Drug Administration” (FDA) ou outra instituição reguladora.
[0201] Todas as patentes, pedidos de patente e referências citadas nesta revelação são expressamente incorporadas por referência. A revelação acima descreve de modo geral a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida em referência aos exemplos específicos a seguir, que são fornecidos apenas para objetivos de ilustração, e não devem limitar o escopo da invenção.
EXEMPLO 1 GAS57 recombinante de tipo selvagem purificado cliva IL-8 e outras citocinas de CXC
[0202] GAS57 de tipo selvagem foi expresso e purificado a partir de E. coli como proteína marcada com His ou não marcada. Todas as variantes foram expressas sem a seqüência líder N-terminal e sem o domínio de transmembrana C-terminal (veja Id. de Seq. Nos: 78 e 79). Em detalhe, o gene de gas57 foi amplificado por PCR a partir de genoma de M1_SF370 com o uso dos seguintes iniciadores: 57F, GTGCGT CATATG GCAGATGAGCTAAGCA (Id. de Seq. N°: 69) 57R, GCGT CTCGAGGGCTTTTGCTGTTGCTGAGGT (Id. de Seq. N°: 70) 57stopR, GCGTCTCGAGTTAGGCTTTTGCTGTTGCTGAGGT (Id. de Seq. N°: 71).
[0203] Os iniciadores 57F e 57R foram usados para obter a forma marcada com His, enquanto os iniciadores 57F e 57stopR foram usados para obter a forma não marcada. Os produtos de PCR foram digeridos com Nde1-Xho1 e ligados respectivamente com pET21b+ e pet24b+ cortado com as mesmas enzimas.
[0204] Células eletrocompetentes de E. coli BL21(DE3) foram transformadas com as reações de ligação. Colônias resistentes à canamicina que portam o plasmídeo com a inserção correta (pET21_57his e pET24_57) foram identificadas por PCR de colônia, e o gene de GAS57 foi seqüenciado a partir de um dos clones positivos.
[0205] O clone positivo que expressa GAS57 cresceu em cultura líquida a 25°C sob agitação, e a expressão das proteínas recombinantes foi obtida por adição à cultura de 1 mM IPTG. A purificação da proteína de GAS57 marcada com His foi realizada com o uso de cromatografia por afinidade de íon de metal (IMAC). A purificação da forma não marcada de GAS57 foi realizada com o uso de três etapas cromatográficas: cromatografia de troca iônica (Q Sefarose HP), cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de filtração a gel. As FIGS. 7 e 8 mostram análises de SDS-PAGE de proteínas de tipo selvagem purificadas.
[0206] Para testar a atividade proteolítica de GAS57, IL-8 foi incubada com duas diferentes concentrações de GAS57 purificado para aumentar os tempos e passagens em um SDS-gel de poliacrilamida para demonstrar a conversão da proteína de IL-8 original de 8 kDa na proteína clivada inativa de 6 kDa. Os resultados são mostrados na FIG. 1.
[0207] A FIG. 12 mostra os resultados de experimentos similares em que várias quimiocinas (10 μg/ml) foram incubadas com ou sem GAS57 (1 μg/ml) a 37°C por 24 horas. As amostras foram então passadas em 18% SDS-gel de poliacrilamida.
EXEMPLO 2 Preparação de mutantes de GAS57
[0208] Por comparação com C5a protease (FIG. 2), foram identificados três aminoácidos no GAS57 que supostamente constituem o sítio catalítico da protease: D151, H279 e S617. Para obter uma forma inativa da enzima, as substituições de nucleotídeos que resultam em alterações de aminoácido D151A e/ou S617A foram introduzidas na seqüência codificadora de GAS57 por Splicing by Overlapping Extension PCR (SOE-PCR). Substituição D151A Foram realizadas três reações de PCR:
Figure img0001
Figure img0002
[0209] O produto de PCR 3 foi então digerido com Nde-Sal e introduzido em pET21_57his digerido com as mesmas enzimas. Clones que contêm as substituições corretas in-frame (pET21_57hisD151A) foram selecionados por seqüenciamento de DNA. Substituição S617A Foram realizadas três reações de PCR:
Figure img0003
[0210] O produto de PCR 6 foi então digerido com Sal-Xho e introduzido em pET21_57his digerido com as mesmas enzimas. Clones que contêm as substituições corretas in-frame (pET21_57his_S617A) foram selecionados por seqüenciamento de DNA. Substituição D151,4+,561744
[0211] O produto de PCR 6 foi digerido com Sal-Xho e introduzido em pET21_57his_D151A digerido com as mesmas enzimas. Clones que contêm as substituições corretas in-frame (pET21_57his D151A+S617A) foram selecionados por seqüenciamento de DNA.
[0212] As proteínas mutantes únicas ou duplas foram expressas e purificadas como acima descrito para GAS57 de tipo selvagem no Exemplo 1. EXEMPLO 3 Mutação em ponto de D151A resulta na inativação da atividade proteolítica de GAS57
[0213] GAS57 mutante D151A foi expresso como uma proteína recombinante marcada com His. Dois tipos de ensaios demonstraram que esse mutante perdeu a capacidade de clivar IL-8. SDS-PAGE
[0214] IL-8 foi incubada com GAS57 de tipo selvagem ou o GAS57 mutante D151A. As misturas de incubação foram carregadas em SDS-PAGE e reveladas por coloração com prata. Os resultados são mostrados na FIG. 3. GAS57 de tipo selvagem (linhas 2 e 3) liberaram duas bandas: 8 kDa (forma ativa) e 6 kDa (IL-8 inatuiva clivada). Em contraste, o GAS57 D151A mutante liberou apenas uma banda, que correspondeu a IL-8 não clivada, como na reação de controle (sem enzima). ELISA
[0215] IL-8 foi incubada com GAS57 de tipo selvagem ou o GAS57 mutante D151A em três diferentes concentrações, e as misturas de incubação foram testadas para a presença de IL-8 não clivada com o uso de um anticorpo que é específico para a citocina, mas que é incapaz de reconhecer a forma inativa clivada. Os resultados são mostrados na FIG. 4, expressos como percentagem de IL-8 não clivada depois de reações de 0, 8 e 24 h, e foram calculados como se segue: [IL-8 na mistura de reação] x 100 [IL-8 na mistura de controle], em que "mistura de controle" é a mistura de reação sem a enzima em ponto de tempo 0.
[0216] Como mostrado na FIG. 4, GAS57 de tipo selvagem inativou quase completamente IL-8 depois de 8 horas, até mesmo na mais baixa concentração, enquanto nenhuma inativação fosse observada para IL-8 tratada com a enzima mutante.
EXEMPLO 4 GAS57 mutante S617A e GAS57 duplo mutante D151A + S617A não clivam IL-8
[0217] GAS57 mutante S617A e GAS57 duplo mutante D151A + S617A foram expressos como proteínas marcadas com His e foram testados em experimentos de inativação de IL-8 como descrito no Exemplo 2. SDS-PAGE
[0218] IL-8 foi incubada com GAS57 de tipo selvagem (marcado com His ou sem marcação), ou cada um dos GAS57 mutantes D151A, S617A e D151AS+S617A por 24 horas. As misturas de incubação foram carregadas em um SDS-gel de poliacrilamida e reveladas por coloração com prata. Os resultados de dois experimentos são mostrados nas FIGS. 5A e 5B. Tanto o GAS57 S617A mutante quanto o GAS D151 + S617A mutante são incapazes de clivar IL-8, mesmo em uma concentração 100 vezes maior que de GAS57 de tipo selvagem. ELISA
[0219] As mesmas amostras foram usadas para realizar um ensaio de ELISA que confirmou que as substituições de aminoácido únicas ou duplas eliminam a capacidade de GAS57 de clivar IL-8. Os resultados, que são mostrados na FIG. 6, demonstram que os mutantes liberam 100% de IL-8 não clivada depois de 24 h de incubação, comparados a 20-40% liberados por GAS57 de tipo selvagem.
EXEMPLO 5 A capacidade protetora de GAS57 mutantes é similar àquela obtida com GAS57 de tipo selvagem
[0220] Os GAS57 mutantes D151A e D151A + S617A foram usados para imunizar camundongos para testar sua capacidade de conferir proteção contra dose letal de GAS em comparação a GAS57 de tipo selvagem. Os resultados de dois experimentos (20 camundongos cada) são resumidos abaixo e expressos como média de sobrevivência %.
Figure img0004
EXEMPLO 6 Mutantes inativos purificados surgem como um peptídeo único comparado a GAS57 de tipo selvagem, que existe apenas na forma de dois fragmentos de proteína não covalentemente associados.
[0221] GAS57 de tipo selvagem é obtido principalmente na forma de dois fragmentos, um de cerca de 23 kDa e um de 150 kDa. Os dois fragmentos não são separados em purificação por afinidade de quelação de Ni ou por filtração a gel, mas aparecem como duas diferentes bandas em SDS-PAGE (FIG. 7). Seqüenciamento N-terminal confirmou que o fragmento de 23 kDa é a porção N- terminal de GAS57 (aminoácidos 34-244 de Id. de Seq. N°: 1), enquanto o fragmento de 150 kDa é a região C-terminal (aminoácidos 245-1603 de Id. de Seq. N°: 1).
[0222] Em contraste a GAS57 de tipo selvagem, os mutantes de GAS57 da invenção são obtidos como proteínas de maior peso molecular (174 kDa), e a banda de 23 kDa é ausente (veja a FIG. 8, que mostra os resultados de um experimento em que GAS57 de tipo selvagem parcialmente purificado e mutantes de GAS57 foram carregados em SDS-géis de poliacrilamida).
EXEMPLO 7 Inibição dose-dependente de clivagem de IL-8 mediada por GAS57 por anti- soro policlonal
[0223] Anti-soro de camundongos específico para GAS57, mutantes de tipo selvagem e inativos foram produzidos por imunização de camundongo CD1 com as proteínas recombinantes purificadas.
[0224] IL-8 (10 μg/ml) foi incubada com GAS57 de tipo selvagem com ou sem anti-soro de GAS57 (1:50 e 1:5.000) em duas diferentes condições: (1) 8 horas de incubação, 0,1 μg/ml de GAS57, e (2) 24 horas de incubação, 0,05 μg/ml de GAS57. As misturas de incubação foram então testadas para a presença de IL-8 não clivada por ELISA. Os resultados mostrados nas FIGS. 9A e 9B demonstraram uma inibição dose-dependente da clivagem de IL-8 mediada por GAS57 pelo anti-soro de camundongo.

Claims (17)

1. Composição de vacina caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno de GAS57 mutante purificado compreendendo uma alteração de aminoácido em duas ou mais posições de aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácidos D151, H279 e S617, em que as posições de aminoácido são numeradas de acordo com SEQ ID NO: 1 e em que a atividade proteolítica do antígeno de GAS57 mutante purificado contra interleucina 8 (IL-8) é reduzida em pelo menos 50% em relação a GAS57 de tipo selvagem como detectado por eletroforese SDS-gel de poliacrilamida ou por um ensaio de ELISA.
2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno de GAS57 mutante purificado compreende as substituições de aminoácido D151A e S617A.
3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno de GAS57 mutante purificado compreende SEQ ID NO: 4.
4. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o antígeno de GAS57 mutante purificado é uma proteína de fusão que compreende um segundo antígeno de GAS.
5. Composição de vacina, de acordo com a com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o antígeno de GAS57 mutante purificado está ligado a uma proteína carreadora.
6. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é selecionada do grupo que consiste em uma toxina bacteriana, um toxóide bacteriano, uma proteína de membrana externa de N. meningitidis, uma proteína heat shock, uma proteína de pertussis, proteína D de H. influenzae, uma acitocina, uma linfocina, um hormônio, um fator de crescimento, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile e uma proteína de captação de ferro.
7. Composição de vacina compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica o antígeno GAS57 mutante purificado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 8 ou suas sequências degeneradas que codificam a mesma sequências de polipeptídeos mostrada na SEQ ID NO: 4.
8. Composição de vacina caracterizada pelo fato de compreender: (a) um agente ativo selecionado de: (i) um antígeno de GAS57 mutante purificado que compreende uma mutação de aminoácido em duas ou mais posições de aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácidos D151, H279 e S617, em que as posições de aminoácido são numeradas de acordo com Id. de Seq. N°: 1 e em que a atividade proteolítica do antígeno de GAS57 mutante purificado contra interleucina 8 (IL-8) é reduzida em pelo menos 50% em relação a GAS57 de tipo selvagem como detectado por eletroforese SDS-gel de poliacrilamida ou por um ensaio de ELISA; (ii) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 8 ou suas sequências degeneradas que codificam a mesma sequência de polipeptídeos mostrada na SEQ ID NO: 4; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
9. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreender ainda um agente ativo que é útil em uma vacina pediátrica.
10. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um antígeno polipeptídico selecionado do grupo que consiste em antígenos polipeptídicos de N. meningitidis, S. pneumoniae, Bordetella pertussis, Moraxella catarrhalis, Clostridium tetani, Chorinebacterim diphteriae, vírus sincicial respiratório, polio vírus, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da rubéola e rotavírus; e (b) uma molécula de ácido nucléico que codifica o antígeno polipeptídico.
11. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo agente ativo que é útil em uma vacina para idosos ou pessoas imunocomprometidas.
12. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo é selecionado do grupo que consiste em: (a) um antígeno polipeptídico selecionado do grupo que consiste em antígenos polipeptídicos de Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureaus, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, influenza vírus e parainfluenza vírus; e (b) uma molécula de ácido nucléico que codifica o antígeno polipeptídico.
13. Kit caracterizado por compreender: (a) um recipiente que compreende um agente ativo selecionado de: (i) um antígeno de GAS57 mutante purificado que compreende uma mutação de aminoácido em dois ou mais posições de aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácidos D151, H279 e S617, em que as posições de aminoácido são numeradas de acordo com Id. de Seq. N°: 1 e em que a atividade proteolítica do antígeno de GAS57 mutante purificado contra interleucina 8 (IL-8) é reduzida em pelo menos 50% em relação a GAS57 de tipo selvagem como detectado por eletroforese SDS-gel de poliacrilamida ou por um ensaio de ELISA; (ii) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 8 ou suas sequências degeneradas que codificam a mesma sequência de polipeptídeos mostrada na SEQ ID NO: 4; e (b) instruções para uso da composição para tratar ou prevenir infecção por Streptococcus pyogenes.
14. Método de preparação de uma composição de vacina para a prevenção ou tratamento de infecção por Streptococcus pyogenes caracterizado por compreender a combinação de: (a) um agente ativo selecionado de: (i) um antígeno de GAS57 mutante purificado que compreende uma mutação de aminoácido em duas ou mais posições de aminoácido selecionado do grupo que consiste em aminoácidos D151, H279 e S617, em que as posições de aminoácido são numeradas de acordo com Id. de Seq. N°: 1 e em que a atividade proteolítica do antígeno de GAS57 mutante purificado contra interleucina 8 (IL-8) é reduzida em pelo menos 50% em relação a GAS57 de tipo selvagem como detectado por eletroforese SDS-gel de poliacrilamida ou por um ensaio de ELISA; (ii) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 8 ou suas sequências degeneradas que codificam a mesma sequência de polipeptídeos mostrada na SEQ ID NO: 4; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o agente ativo é o antígeno de GAS57 mutante ou os anticorpos e o antígeno de GAS57 mutante ou os anticorpos preparados por um método que compreende: (a) o cultivo de uma célula hospedeira que compreende uma construção de expressão que codifica o antígeno de GAS57 mutante ou os anticorpos; e (b) recuperação do antígeno de GAS57 mutante ou os anticorpos.
16. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de ser para uso em terapia.
17. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento ou prevenção de infecção por Streptococcus pyogenes.
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