BRPI0816389B1

BRPI0816389B1 - métodos de diminuição da quantidade de uma preparação de celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico e de hidrólise de um material celulósico

Info

Publication number: BRPI0816389B1
Application number: BRPI0816389-8A
Authority: BR
Inventors: Meredith K. Fujdala; Edmund A. Larenas
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2008-09-04
Publication date: 2020-11-17
Also published as: JP5300092B2; US20130337508A1; JP2013165726A; CN101796195A; CA2698765A1; MX2010002474A; JP2010537668A; US20100221784A1; BRPI0816389A2; EP2191005A1; WO2009035537A1; JP5785976B2

Abstract

COMPOSIÇÕES DE CELULASE TOTAL FÚNGICA FILAMENTOSA REALÇADA POR BETA-GLICOSIDADE E MÉTODOS DE USO. A presente invenção refere-se a composições de celulares total fúngica filamentosa realçada por beta- glicosidase. São também fornecidos métodos de hidrólise de um material celulósico composições de celulares total realçada por beta-glicosidade. A presente invenções também fornece métodos de diminuição da quantidade de uma celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico adicionando uma quantidade eficaz de beta-glicosidase

Description

1. REFERÊNCIA CRUZADAA PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos n° 60/970, 842, depositado em 7 de setembro de 2007, que é incorporado por referência aqui em sua totalidade.

2. CAMPO

[002] A presente invenção refere-se ao campo de enzimas, e em particular, métodos e composições para a hidrólise enzimática de materiais celulósicos.

3. INTRODUÇÃO

[003] Como os limites de método de recursos de energia não renovável, o potencial de celulose como um recurso renovável é enorme. A celulose pode ser convertida em açúcares, tal como glicose, e usada como uma fonte de energia por numerosos micro-organismos incluindo bactérias, levedura e fungos para propósitos industriais. Por exemplo, os materiais celulósicos podem ser convertidos em açúcares por enzimas, e os açúcares resultantes podem ser usados como uma matéria-prima de alimentação para micro-organismos industriais para produzir produtos tais como plásticos e etanol.

[004] A utilização de materiais celulósicos como uma fonte de carbono renovável depende do desenvolvimento de celulases economicamente praticáveis para a hidrólise enzimática de materiais celulósicos. As celulases são enzimas que catalisam a hidrólise de celulose para produtos tais como glicose, celobiose, e outros celooligosacarí- deos. As enzimas de celulase trabalham sinergicamente para hidroli- sar a celulose para glicose. Exo-celobioidrolases (CBHs) tais comoCBHI e CBHII, geralmente agem nas extremidades de celulose para gerar a celobiose, enquanto as endoglicanases (EGs) agem em locais randômicos na celulose. Juntamente estas enzimas hidrolisam a celulose em celo-oligosacarídeos menores tais como celobiose. A celobiose é hidrolisada para glicose por beta-glicosidase.

[005] Embora muitos micro-organismos sejam capazes de degradar a celulose, apenas alguns destes micro-organismos produzem quantidades significantes de enzimas capazes de hidrolisar completamente a celulose cristalina. Consequentemente, permanece uma ne-cessidade de desenvolver sistemas de enzima eficientes para hidrolisar a celulose para aplicações industriais. É, portanto, desejado melhorar a eficiência e economia da hidrólise enzimática de materiais celulósicos.

4. SUMÁRIO

[006] Os presentes ensinamentos fornecem composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase e métodos de uso. Geralmente, as composições celulase total melhorada por beta-glicosidase têm desempenho específico igual ou maior com relação às preparações de celulase total sozinhas. Em algumas modalidades, as composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase compreendem mais do que 10% a cerca de 80% (peso/peso proteína) de beta- glicosidase. Em algumas modalidades, as composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase compreendem a atividade de celulase total e atividade de β-glicosidase de cerca de 0,60 a 22 pNPG/CMC unidades.

[007] Os presentes ensinamentos também fornecem métodos de diminuição da quantidade de uma celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico adicionando uma quantidade eficaz β- glicosidase. Em algumas modalidades os métodos fornecem a dimi-nuição da quantidade de uma celulase total requerida para hidrolisarum material celulósico adicionando uma quantidade de β-glicosidase que é maior do que 10% (peso/peso proteína) à quantidade da celulase total. Em algumas modalidades, o método compreende a atividade de celulase total e atividade de β-glicosidase em que a relação de atividade de β-glicosidase para atividade de celulase é de cerca de 0,60 a 22 pNPG/CMC unidades. Os presentes ensinamentos também fornecem métodos de hidrólise de um material celulósico contatando um material celulósico com uma quantidade eficaz de uma composição de celulase total melhorada por beta-glicosidase.

[008] Estes e outros aspectos dos presentes ensinamentos são mencionados abaixo.

5. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009] O técnico versado entenderá que os desenhos são para os propósitos de ilustração apenas e não se destinam a limitar o escopo dos presentes ensinamentos de modo algum.

[0010] A figura 1 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando uma celulase total de Trichodermae β-glicosidase 1 de Trichodermaem 1 % de PASC mostrando o percentual de conversão total (A) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (B).

[0011] A figura 2 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando a celulase total de Trichoderma e β-glicosidase 1 de Trichoderma em 7% em peso/peso de Avicel mostrando o percentual de conversão total (A) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (B).

[0012] A figura 3 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando a celulase total de Trichoderma eβ-glicosidase 1 de Trichoderma em 7% em peso/peso de PCS mostrando a percentual de conversão total (A) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (B).

[0013] A figura 4 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando a celulase total de Trichoderma e β-glicosidase 1 de Trichoderma em 7% em peso/peso de bagaço de cana-de-açúcar mostrando a percentual de conversão total (A) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (B), e a conversão percentual aumentando a quantidade de beta-glicosidase (O-

[0014] A figura 5 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando a celulase total de TrichodermaRut C30 e β-glicosidase 1 de Trichoderma em 7% em peso/peso de PCS mostrando o percentual de conversão total (a) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (b).

[0015] A figura 6 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoderma e β-glicosidase 1 de Trichoderma purificada em 1 % em peso/peso de PASC mostrando o percentual de conversão total (a) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (b).

[0016] A figura 7 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoderma e β-glicosidase 1 de Trichoderma purificada em PCS em 7% em peso/peso mostrando o percentual de conversão total (a) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (b).

[0017] A figura 8 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoderma e β-glicosidase 3 de Trichoderma purificada em 1 % em peso/peso de PASC mostrando o percentual de conversão total (a) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (b)

[0018] A figura 9 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoderma e β-glicosidase 3 de Trichoderma em PCS em 7% em pe-so/peso mostrando o percentual de conversão total (a) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (b).

[0019] A figura 10 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoderma e β-glicosidase 7 de Trichoderma purificada em 1% em peso/peso de PASC. o percentual de conversão total é plotado quanto a uma determinada dose de celulase total de Trichoderma com e sem β-glicosidase 7.

6. DESCRIÇÃO DETALHADA DE VÁRIAS MODALIDADES

[0020] Deve-se entender que tanto a descrição geral antecedente quanto a seguinte descrição detalhada são exemplares e explanatórias e não são restritivas das composições e métodos descritos aqui. A menos que definidos de outros modo aqui, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como comumente entendido por alguém versado na técnica a qual esta invenção pertence. Neste pedido, o uso do singular inclui o plural a menos que de outros modo especificamente estabalecido. O uso de "ou" significa "e/ou" a menos que de outros modo estabelecido. Igualmente, os termos "compreender,""compreendendo,""compreende,""inclui,""incluindo" e "incluir não se destinam a ser limitantes. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as sequências de aminoácidos e nucleotídeos descritas em tais patentes e publicações, referidas aqui são expressamente incorporadas por referência.

[0021] Os tópicos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tidas por referência à especificação como um todo. Consequentemente, os termos aqui são mais totalmente definidos por referência à especificação como um todo.

6.1, Composições de Celulase Total Melhorada por Beta-Glicosidase

[0022] Composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase são fornecidas, bem como métodos de preparação e uso das mesmas. Geralmente as composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase descritas aqui têm desempenho específico de aproximadamente igual ou maior com relação a uma preparação de celulase total sozinha. Em algumas modalidades, as composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase descritas aqui têm desempenho específico de aproximadamente igual ou maior em sacarificação de material celulósico com relação a uma preparação de celulase total sozinha.

[0023] As composições de celulase total melhorada por beta- glicosidase podem incluir qualquer polipeptídeo tendo atividade de beta-glicosidase. O termo "beta-glicosidase" é definido aqui como uma beta-D-glicosida glicoidrolase classificada como EC 3.2.1.21, e/ou aquelas em certas famílias de GH, incluindo, porém não limitadas àquelas nas famílias de GH 1, 3, 9 ou 48, que catalisam a hidrólise de celobiose com a liberação de beta-D-glicose.

[0024] A beta-glicosidase pode ser obtida de qualquer microorganismo adequado, por meio recombinante ou pode ser obtida de fontes comerciais. Exemplos não-limitados, adequados de beta- glicosidase de micro-organismos incluem sem limitação bactérias e fungos. Bactérias adequadas incluem Acidothermus, Acetivibrio, Aeromona, Aeromonas, Alicyclobacillus, Anaerocellum, Acinetobacter, Actinobaci- llus, Alcanivorax, Alkalilimnicola, Alkaliphilus, Anabaena, Arthrobacter, Azoarcus, Azospirillum, Anaeromyxobacter, Butyrívibrio, Bacillus, Bac- teroides, Bdellovibrío, Bifidobacterium, Bordetella, Borrelia, Bradyrhi- zobium, Brucella, Burkholderia, Butyrívibrio, Campylobacter, Caldicellu- losiruptor, Caulobacter, Cellvibηo, Chromobacterium, Clavibacter, Colwellia, Corynebacterium, Cyanobocteria, Cytophaga, Eubacterium, Fibrobacter, Flavobacterium, Gloeobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Fusobacterium, Hahella, Kineococcus, Lactococcus, Listeria, Maricau-lis, Myxobacter, Mesoplasma, Methylococcus, Myxococcus, Microbis- pora, Oenococcus, Paenibacillus, Photobacterium, Photorhabdus Pec- tobacterium, Pseudomonas, Ruminococcus, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodoferax, Rhodopseudomonas, Saccharophagus, Salinispora, Salmonella, Solibacter, Synechocystis, Serratia, Shewa- nella, Sphingomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Thermotoga, Thermus, Treponema, Thermobifida, Vibrio, Xanthomo- nas, Acidovorax, Deinococcus geothermalis, Desulfotalea , Enterococcus, Erwinia, e Yersinia.

[0025] Em alguma modalidade, beta-glicosidase é obtida de fungos filamentosos. O termo "fungos filamentosos" significa quaisquer e todos os fungos filamentosos reconhecidos por aqueles versados na técnica. Em geral, os fungos filamentosos são micro-organismos euca- rióticos e incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eu- mycotina e Oomycota. Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede celular composta de quitina, beta-glucan, e outros polissacarídeos. Em algumas modalidades, os fungos filamentosos dos presentes ensinamentos são morfologicamente, fisiolo- gicamente, e geneticamente distintos de leveduras. Em algumas modalidades, os fungos filamentosos incluem, porém não estão limitados aos seguintes gêneros: Aspergillus, Acremonium, Aureobasidium, Be- auveria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Cryptococcus, Cyathus, En- dothia, Endothia mucor, Fusarium, Gilocladium, Humicola, Magna- porthe, Myceliophthora, Myrothecium, Mucor, Neurospora, Phanero- chaete, Podospora, Paecilomyces, Penicillium, Pyricularia, Rhizomu- cor, Rhizopus, Schizophylum, Stagonospora, Talaromyces, Trichoderma, Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichophyton, e Trametes pleurotus. Em algumas modalidades, os fungos filamentosos incluem, porém não estão limitados aos seguintes: A. ni-dulans, A. niger, A. awomari, A. aculeatus, A. kawachi,por exemplo, linhagem NRRL 3112, ATCC 22342 (NRRL 3112), ATCC 44733, ATCC 14331 e UVK 143f, A. oryzae,por exemplo, ATCC 11490, Peni- cillium N. crassa, Trichoderma reesei,por exemplo, NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767, e Trichoderma viride, por exemplo, ATCC 32098 e 32086.

[0026] Exemplos preferidos de beta-glicosidase que podem ser usadas incluem beta-glicosidase de Aspergillus aculeatus(Kawaguchi e outros, 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus kawachi (Iwashita e outros, 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 5546-5553), Aspergillus oryzae(WO 2002/095014), Cellulomonas biazotea (Wong e outros, 1998, Gene 207: 79-86), Penicillium funiculosum (WO 200478919), Saccha- romycopsis fibuligera (Machida e outros, 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54: 3147-3155), Schizosaccharomyces pombe (Wood e outros, 2002, Nature 415: 871-880), e Trichoderma reesei beta-glicosidase 1 (Patente US n° 6.022.725), beta-glicosidase 3 de Trichoderma reesei(Patente US n° 6.982.159), beta-glicosidase 4 de Trichoderma reesei(Patente US n° 7.045.332), beta-glicosidase 5 de Trichoderma reesei(Patente US n° 7.005.289), beta-glicosidase 6 de Trichoderma reesei(USPN 20060258554) beta-glicosidase 7 de Trichoderma reesei (USPN 20040102619).

[0027] Em algumas modalidades, a beta-glicosidase pode ser produzida expressando urn gene codificando beta-glicosidase. Por exemplo, beta-glicosidase pode ser secretada no espaço extracelular, por exemplo, por organismos Gram-positivos, (tais como Bacilluse Acti- nomycetes), ou hospedeiros eucarióticos (por exemplo, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces, e Pichia).

[0028] Deve-se entender, em algumas modalidades, que a beta- glicosidase pode ser superexpressa em um micro-organismo recombinante com relação aos níveis relativos. Em algumas modalidades, seuma célula hospedeira é empregada para expressão da beta- glicosidase, a célula pode ser geneticamente modificada para reduzir a expressão de uma ou mais proteínas que são endógenas à célula. Em uma modalidade, a célula pode conter um ou mais genes nativos, particularmente genes que codificam proteínas secretadas, que foram de- letadas ou inativadas. Por exemplo, um ou mais genes codificando protease (por exemplo, um gene codificando aspartil protease; vide Berka e outros, gene 1990 86: 153-162 e USP 6.509.171) ou genes codificando celulase podem ser detetados ou inativados. Em uma modalidade, a célula hospedeira Trichoderma sp. pode ser uma célula hospedeira T reesei contém deteções de inativação nos genes cbh1, cbh2 e eg11, e eg12, como descrito no WO 05/001036. Os ácidos nu- cleicos codificando beta-glicosidase podem estar presentes no geno- ma nuclear da célula hospedeira Trichoderma sp. ou podem estar presentes em um plasmídeo que replica na célula hospedeira Trichoderma, por exemplo.

[0029] A beta-glicosidase pode ser usada no estado em que se encontra ou a beta-glicosidase pode ser purificada. O termo "no estado em que se encontra" como usado aqui se refere a uma preparação de enzima produzida por fermentação que sofre por mínima ou nenhuma recuperação e/ou purificação. Por exemplo, uma vez que a beta- glicosidase é secretada por uma célula em um meio de cultura celular, um meio de cultura celular contendo beta-glicosidase pode ser usado. Alternativamente, a beta-glicosidase pode ser recuperada de um meio de cultura celular por qualquer método conveniente, por exemplo, por precipitação, centrifugação, afinidade, filtragem ou qualquer outro método conhecido na técnica, incluindo Chen, H.; Hayn, M.; Esterbauer, H. "Purification and characterization of two extracellular b-glucosidases from Trichoderma reesei", Biochimica et Biophysica Acta, 1992, 1121, 54-60. Por exemplo, cromatografia de afinidade (Tilbeurgh e outros,(1984) FEBS Lett. 16:215); métodos cromatográficos de permuta de ion (Goyal e outros, (1991) Biores. Technol. 36:37; Fliess e outros, (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314; Bhikhabhai e outros, (1984) J. Appl. Biochem. 6:336; e Ellouz e outros, (1987) Chromatography 396:307), incluindo permuta de ion usando materiais com poder de alta resolução (Medve e outros, (1998) J. Chromatography A 808:153; cromatografia de interação hidrofóbica (Tomaz e Queiroz, (1999) J. Chromatography A 865:123; divisão de duas fases (Brum- bauer, e outros, (1999) Bioseparation 7:287); precipitação de etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica-gel ou em uma resina de permuta de cátion tai como DEAE; cromatofocagem; precipitação de sulfato de amónio; ou filtragem de gel usando, por exemplo, Sephadex G-75, podem ser empregados.

[0030] Em algumas modalidades, a beta-glicosidase pode ser usada sem a purificação dos outros componentes de um meio de cultura celular. Em algumas modalidades, um meio de cultura celular pode ser concentrado, por exemplo, e em seguida usado sem outra purificação da proteína dos componentes de um meio de cultura celular, ou usado sem qualquer outra modificação.

[0031] Onde a beta-glicosidase é obtida de um micro-organismo, a enzima pode ser recuperada usando métodos de recuperação bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a enzima pode ser recuperada de um meio de cultura celular por procedimentos convencionais incluindo, porém não limitados à centrifugação, filtragem, extração, secagem por spray,evaporação, ou precipitação. Em algumas modalidades, a beta- glicosidase purificada pode ser usada. O termo "beta-glicosidase purificada" como usado aqui significa beta-glicosidase que é livre de outros componentes do organismo da qual ela é obtida. A beta- glicosidase pode ser purificada, com apenas quantidades menores de outras proteínas que estão presentes. O termo "purificada" como usa-do aqui também se refere à remoção de outros componentes, particularmente outras enzimas presentes na célula de origem da beta- glicosidase. Em algumas modalidades, beta-glicosidase pode ser "substancialmente pura," isto é, livre de outros componentes do microorganismo em que ela é produzida. A beta-glicosidase pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, porém não limitados à cromatografia (por exemplo, permuta de íon, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amónio), ou extração. Em algumas modalidades, a beta- glicosidase é pelo menos 25% pura, preferivelmente pelo menos 50% pura, mais preferivelmente pelo menos 75% pura, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% pura, mais preferivelmente pelo menos 95% pura, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99% pura, com determinado por SDS-PAGE.

[0032] A beta-glicosidase pode também ser obtida de fontes comerciais. Exemplo de preparação de beta-glicosidase comercial adequada para uso na presente invenção para uso na presente invenção incluem, por exemplo, NOVOZYM® 188, (a beta-glicosidase de Asper-gillus niger), Agrobacterium sp., e Thermatoga marítima disponível de Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray,Co. Wicklow, Ireland.

[0033] Celulases totais melhoradas por beta-glicosidase geralmente compreendem beta-glicosidase e uma preparação de celulase total. Entretanto, deve-se entender que as composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase podem ser produzidas por meio recombinante. Por exemplo, expressando beta-glicosidase em microorganismo capaz de produzir uma celulase total.

[0034] Em algumas modalidades a composição de celulase totalmelhorada por beta-glicosidase compreende uma preparação de celulase total e beta-glicosidase. São também fornecidas composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase que compreendem uma preparação de celulase total e beta-glicosidase, a mesma compreendendo mais do que 10% de beta-glicosidase.

[0035] Em algumas modalidades a composição de celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma preparação de celulase total e beta-glicosidase, em que a quantidade de uma preparação de celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico para açúcares solúveis é reduzida pela beta-glicosidase.

[0036] A beta-glicosidase está presente nas composições em uma quantidade com relação à quantidade de preparação de celulase total. Em algumas modalidades, a composição compreende uma preparação de celulase total e beta-glicosidase, em que a beta-glicosidase está presente em uma quantidade com relação à quantidade de preparação de celulase total em uma relação de peso:peso, tal como relação de proteína:proteína.

[0037] Em algumas modalidades, a composição compreende uma preparação de celulase total e beta-glicosidase, em que a quantidade de beta-glicosidase está na faixa de mais do que 10% a 90 %, com relação à proteína total, por exemplo, 11% a 90%, 15% a 85%, 20% a 80%, 25% a 75%, 30% a 70%, 35% a 65%, 40% a 60%, 45% a 55%, e 50% com relação ao exemplo de proteína total.

[0038] Em algumas modalidades, as composições compreendem uma preparação de celulase total e beta-glicosidase em que a quantidade de beta-glicosidase é maior do que 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%,27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%,39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%,51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%,63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% ou maior com relação à proteína total, por exemplo.

[0039] Como acima descrito, em algumas modalidades, as composições geralmente compreendem beta-glicosidase e a preparação de celulase total. Como usado aqui, a frase "preparação de celulase total" refere-se tanto às composições contendo celulase de ocorrência natural quanto de ocorrência não natural. Uma composição "de ocorrência natural" é aquela produzida por uma fonte de ocorrência natural e que compreende um ou mais componentes do tipo celobioidrolase, um ou mais do tipo endoglucanase, e uma ou mais beta-glicosidases em que cada um destes é encontrado na relação produzida pela fonte. Uma composição de ocorrência natural é aquela que é produzida por um organismo não modificado com respeito às enzimas celulolíticas de modo que a relação das enzimas de componente seja inalterada daquela produzida pelo organismo nativo. Uma composição "de ocorrência não natural" abrange aquelas composições produzidas por:(1) combinação de enzimas celulolíticas de componente em uma relação de ocorrência natural ou ocorrência não natural, isto é, relação, alterada; ou(2) modificação de um organismo para superexpressar ou sub-expressar uma ou mais enzimas celulolíticas; ou(3) modificação de um organismo de modo que pelo menos uma enzima celulolítica seja deletada. Consequentemente, em algumas modalidades, a preparação de celulase total pode ter um ou mais das várias EGs e/ou CBHs, e/ou beta-glicosidase deletadas. Por exemplo, EG1 pode ser deletada sozinha ou em combinação com outras EGs e/ou CBHs.

[0040] Em geral, a preparação de celulase total inclui enzimas in-cluindo, porém não-limitadas à:(4) endoglucanases (EG) ou 1,4-β-d-glucan-4- glucanoidrolases (EC 3.2.1.4),(11) exoglucanases, incluindo 1,4-β-d-glucan glucanoidrola- ses (também conhecidas como celodextrinases) (EC 3.2.1.74) e 1,4-β- d-glucan celobioidrolases (exo-celobioidrolases, CBH) (EC 3.2.1.91), e (iii) β-glicosidase (BG) ou β-glicosida glucoidrolases (EC 3.2.1.21).

[0041] Na presente invenção, a preparação de celulase total pode ser de qualquer micro-organismo que é útil para a hidrólise de um material celulósico. Em algumas modalidades, a preparação de celulase total é uma celulase total de fungos filamentosos. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota.

[0042] Em algumas modalidades, a preparação de celulase total é uma celulase total de uma espécie de Acremonium, Aspergillus, Eme- ricella, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Peni- cillium, Scytalidium, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma.

[0043] Em algumas modalidades, a preparação de celulase total é uma celulase total de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus Japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto, preparação de celulase total é uma celulase total de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium gra- minearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium ro- seum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium spo- rotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. Em outro aspecto, a preparação de celulase total é uma celulase total de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neu-rospora crassa, Penicillium purpurogenum, Penicillium funiculosum, Scytalidium thermophilum, ou Thielavia terrestris. Em outro aspecto, a preparação de celulase total a Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei,por exemplo, RL-P37 (Sheir-Neiss e outros, Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984) páginas 46-53; Montenecourt B. S., Can., 1-20, 1987), QM9414 (ATCC n° 26921), NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56466, 56767, ou Trichoderma viride,por exemplo, ATCC 32098 e 32086, celulase total.

[0044] Em algumas modalidades, a preparação de celulase total é uma celulase total de Trichoderma reesei Rut C30,que está disponível da American Type Culture Collection como Trichoderma reesei ATCC 56765.

[0045] Em algumas modalidades, a celulase total é Penicillium funiculosum,que está disponível da American Type Culture Collection como Penicillium funiculosum ATCCnúmero: 10446. A preparação de celulase total pode também ser obtida de fontes comerciais. Exemplos de preparações de celulase comerciais para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLUCLAST® (disponível de Novozymes A/S) e LAMINEX®, IndiAge® e Primafast® (disponível Genencor Division, Danisco US. Inc.).

[0046] Na presente invenção, a preparação de celulase total pode ser de qualquer método de cultivo de micro-organismo conhecido na técnica resultante na expressão de enzimas capazes de hidrolisar um material celulósico. A fermentação pode incluir cultivo em frasco de ativação, fermentação de pequena ou grande escala, tais como fermentações contínuas, batelada, alimentação em bateladas, ou estado sólido em laboratório ou fermentadores realizados em um meio adequado e sob condições que permitem a celulase ser expressa ou isolada.

[0047] Geralmente, o micro-organismo é cultivado em um meio de cultura celular adequado para a produção de enzimas capazes de enzimas capazes de hidrolisar um material celulósico. O cultivo ocorre em meio de nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios de cultura adequados, faixas de temperatura e outras condições adequadas para o desenvolvimento e produção de celulase são conhecidos na técnica. Como um exemplo não limitante, a faixa de temperatura normal para a produção de celulase por Trichoderma ree- seí é 24°C a 28°C.

[0048] Geralmente, a preparação de celulase total é usada como é produzida por fermentação com nenhuma ou mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, uma vez que as celulases são secretadas por uma célula em um meio de cultura celular, um meio de cultura celular contendo as celulases pode ser usado. Em algumas modalidades a preparação de celulase total compreende os teores não fracionados de materiais de fermentação, incluindo meio de cultura celular, células e enzimas extracelulares. Alternativamente, a preparação de celulase total pode ser processada por qualquer método conveniente, por exemplo, por precipitação, centrifugação, afinidade, filtragem ou qualquer outro método conhecido na técnica. Em algumas modalidades, a preparação de celulase total pode ser concentrada, por exemplo, e em seguida usada sem outra purificação. Em algumas modalidades a preparação de celulase total compreende agentes químicos que diminuem a viabilidade celular ou matam as células. Em algumas modalidades, as células são lisadas ou permeabilizadas usando métodos conhecidos na técnica.

[0049] Em algumas modalidades, a celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma preparação de celulase total e beta- glicosidase, em que a quantidade de celulase total está na faixa demenos do que 90% a 10% com relação à proteína total, por exemplo, 89% a 10%, 85% a 15 %, 80% a 20%, 75% a 25%, 65% a 30%, 60% a 35%, 65% a 40%, 60% a 45%, 55% a 50 % com relação à proteína total, por exemplo.

[0050] Em algumas modalidades, a celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma preparação de celulase total e beta- glicosidase em que a concentração de preparação de celulase total é menor do que 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%,69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%,57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%,45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%,33%, 32%, 31%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%,23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%,11%, 10%, com relação à proteína total, por exemplo.

[0051] Em algumas modalidades, a composição de celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma preparação de celulase total e beta-glicosidase, em que a quantidade de beta- glicosidase está na faixa de 10% a 90% da proteína total e a celulase total compreende menos do que 90% a 10% de proteína total, por exemplo, a beta-glicosidase compreende 11 % e a celulase total compreende 89% de proteína total, beta-glicosidase compreende 12% e a celulase total compreende 88% de proteína total, beta-glicosidase compreende 13% e a celulase total compreende 87% de proteína total, beta-glicosidase compreende 14% e a celulase total compreende 86% de proteína total, beta-glicosidase compreende 15% e a celulase total compreende 85% de proteína total, beta-glicosidase compreende 16% e a celulase total compreende 84% de proteína total, beta-glicosidase compreende 17% e a celulase total compreende 83% de proteína total, beta-glicosidase compreende 18% e a celulase total compreende 82% de proteína total,beta-gli∞sidase compreende 19% e a celulase total compreende 81 % de proteína total, beta-glicosidase compreende 20% e a celulase total compreende 80% de proteína total, beta-glicosidase compreende 21% e a celulase total compreende 79% de proteína total, beta-glicosidase compreende 22% e a celulase total compreende 78% de proteína total, beta-gli∞sidase compreende 23% e a celulase total compreende 77% de proteína total, beta-glicosidase compreende 24% e a celulase total compreende 76% de proteína total, beta-glicosidase compreende 25% e a celulase total compreende 75% de proteína total, beta-glicosidase compreende 26% e a celulase total compreende 74% de proteína total, beta-gli∞sidase compreende 27% e a celulase total compreende 73% de proteína total, beta-glicosidase compreende 28% e a celulase total compreende 72% de proteína total, beta-glicosidase compreende 29% e a celulase total compreende 71% de proteína total, beta-glicosidase compreende 30% e a celulase total compreende 70% de proteína total, beta-glicosidase compreende 31 % e a celulase total compreende 69% de proteína total, beta-glicosidase compreende 32% e a celulase total compreende 68% de proteína total, beta-glicosidase compreende 33% e a celulase total compreende 67% de proteína total, beta-glicosidase compreende 34% e a celulase total compreende 66% de proteína total, beta-glicosidase compreende 35% e a celulase total compreende 65% de proteína total, beta-glicosidase compreende 36% e a celulase total compreende 64% de proteína total, beta-glicosidase compreende 37% e a celulase total compreende 63% de proteína total, beta-glicosidase compreende 38% e a celulase total compreende 62% de proteína total, beta-glicosidase compreende 39% e a celulase total compreende 61% de proteína total, beta-glicosidase compreende 40% e a celulase total compreende 60% de proteína total, beta-glicosidase compreende 41% e a celulase total compreende 59% de proteína total, beta-glicosidase compreende 42% e a celulase total compreende 58% de proteína total,beta-glicosidase compreende 43% e a celulase total compreende 57% de proteína total, beta-glicosidase compreende 44% e a celulase total compreende 56% de proteína total, beta-glicosidase compreende 45% e a celulase total compreende 55% de proteína total, beta-glicosidase compreende 46% e a celulase total compreende 54% de proteína total, beta-glicosidase compreende 47% e a celulase total compreende 53% de proteína total, beta-glicosidase compreende 48% e a celulase total compreende 52% de proteína total, beta-glicosidase compreende 49% e a celulase total compreende 51% de proteína total, beta-glicosidase compreende 50% e a celulase total compreende 50% de proteína total, beta-glicosidase compreende 51 % e a celulase total compreende 49% de proteína total, beta-glicosidase compreende 52% e a celulase total compreende 48% de proteína total, beta-glicosidase compreende 53% e a celulase total compreende 47% de proteína total, beta-glicosidase compreende 54% e a celulase total compreende 46% de proteína total, beta-glicosidase compreende 55% e a celulase total compreende 45% de proteína total, beta-glicosidase compreende 56% e a celulase total compreende 44% de proteína total, beta-glicosidase compreende 57% e a celulase total compreende 43% de proteína total, beta-glicosidase compreende 58% e a celulase total compreende 42% de proteína total, beta-glicosidase compreende 59% e a celulase total compreende 41% de proteína total, beta-glicosidase compreende 60% e a celulase total compreende 40% de proteína total, beta-glicosidase compreende 61% e a celulase total compreende 39% de proteína total, beta-glicosidase compreende 62% e a celulase total compreende 38% de proteína total, beta-glicosidase compreende 63% e a celulase total compreende 37% de proteína total, beta-glicosidase compreende 64% e a celulase total compreende 36% de proteína total, beta-glicosidase compreende 65% e a celulase total compreende 35% de proteína total, beta-glicosidase compreende 66% e a celulase total compreende 34% de proteína total,beta-gli∞sidase compreende 67% e a celulase total compreende 33% de proteína total, beta-glicosidase compreende 68% e a celulase total compreende 32% de proteína total, beta-glicosidase compreende 69% e a celulase total compreende 31 % de proteína total, beta-glicosidase compreende 70% e a celulase total compreende 20% de proteína total, beta-gli∞sidase compreende 71% e a celulase total compreende 29% de proteína total, beta-glicosidase compreende 72% e a celulase total compreende 28% de proteína total, beta-glicosidase compreende 73% e a celulase total compreende 27% de proteína total, beta-glicosidase compreende 74% e a celulase total compreende 26% de proteína total, beta-gli∞sidase compreende 75% e a celulase total compreende 25% de proteína total, beta-glicosidase compreende 76% e a celulase total compreende 24% de proteína total, beta-glicosidase compreende 77% e a celulase total compreende 23% de proteína total, beta-glicosidase compreende 78% e a celulase total compreende 22% de proteína total, beta-gli∞sidase compreende 79% e a celulase total compreende 21% de proteína total, beta-glicosidase compreende 80% e a celulase total compreende 20% de proteína total, beta-glicosidase compreende 81 % e a celulase total compreende 19% de proteína total, beta-glicosidase compreende 82% e a celulase total compreende 18% de proteína total, beta-gli∞sidase compreende 83% e celulase total compreende 17% de proteína total, beta-glicosidase compreende 84% e a celulase total compreende 16% de proteína total, beta-glicosidase compreende 85% e a celulase total compreende 15% de proteína total, beta-glicosidase compreende 86% e a celulase total compreende 14% de proteína total, beta-gli∞sidase compreende 87% e a celulase total compreende 13% de proteína total, beta-glicosidase compreende 88% e a celulase total compreende 12% de proteína total, beta-glicosidase compreende 89% e a celulase total compreende 11% de proteína total, beta-glicosidase compreende 90% e a celulase total compreende 10% de proteína total.

[0052] Em algumas modalidades, a celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma preparação de celulase total e beta- glicosidase, em que a quantidade de beta-glicosidase é aproximadamente igual à quantidade de preparação de celulase total em uma relação de peso:peso. Em algumas modalidades, a celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma preparação de celulase total e beta-glicosidase, em que a quantidade de beta-glicosidase é de cerca de 50% a quantidade de preparação de celulase total em uma relação de peso:peso.

[0053] Como acima descrito, a beta-glicosidase está geralmente presente nas composições em uma quantidade com relação à quantidade de preparação de celulase total. Em algumas modalidades, a composição compreende uma preparação de celulase total e beta- glicosidase, em que a beta-glicosidase está presente em uma quantidade com relação à quantidade de preparação de celulase total com base na atividade de enzima. Em algumas modalidades, as composições de acordo com a invenção podem ser caracterizadas por uma relação entre a atividade da beta-glicosidase e a atividade da preparação de celulase total. Em algumas modalidades, a composição compreende uma preparação de celulase total e beta-glicosidase, em que a atividade de beta-glicosidase e atividade da preparação de celulase total são fornecidas como uma relação de atividade enzimática.

[0054] As relações de atividade de enzima acima mencionadas referem-se às condições de ensaio padrões respectivas para uma beta-glicosidase e preparações de celulase total. A atividade da beta- glicosidase e a atividade da preparação de celulase total podem ser determinadas usando métodos conhecidos na técnica. Neste contexto, as seguintes condições podem ser usadas. A atividade de beta- glicosidase pode ser determinada por qualquer meio conhecido na técnica, tal como o ensaio descrito por Chen, H.; Hayn, M.; Esterbauer,H. "Purification and characterization of two extracellular b-glucosidases from Trichoderma reesei", Biochimica et Biophysica Acta, 1992,1121 , 54-60. Um pNPG significa 1 pmol de Nitrofenol liberado de para- nitrofenil-B-D-glucopiranosida em 10 minutos a 50°C (122°F) e pH 4,8. A atividade de celulase da preparação de celulase total pode ser determinada usando carboximetil celulose (CMC) como um substrato. Determinação de atividade de celulase total,

[0055] Avaliada em termos de atividade de CMC. Este método avalia a produção de terminações de redução criadas pela mistura de enzima agindo em CMC em que 1 unidade é a quantidade de enzima que libera 1 pmol de produto/minuto (Ghose, T. K., Measurement of Cellulse Activities, Pure & Appl. Chem. 59, páginas 257-268, 1987).

[0056] Em geral, a celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma relação de atividade de enzima em uma faixa de cerca de 0,5 a 25 pNPG/CMC unidades. Em algumas modalidades, a relação de atividade de enzima é de cerca de 1 a 20 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 1,5 a 15 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 2 a 10 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 2,5 a 8 pNPG/CMC unidades, de cerca de 3 a 7 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 3,5 a 6,5 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 4 a 6 pNPG/CMC unidade, ou de cerca de 4,5 a 5,5 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 5 a 6 pNPG/CMC. São especialmente adequadas, por exemplo, as relações de cerca de 5,5 pNPG/CMC unidades.

6.2 MÉTODOS

[0057] Além das composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase acima descritas, métodos de uso das composições descritos aqui são também fornecidos. Em um aspecto geral, os presentes ensinamentos envolvem a hidrólise de um material celulósico. Estes métodos geralmente incluem contatar um material celulósico com uma celulase total melhorada por beta-glicosidase e manter o material celu-lósico e celulase total melhorada por beta-glicosidase juntamente sob condições suficientes para realizar a hidrólise do material celulósico e desse modo produzir um produto. Em algumas modalidades, métodos de converter celulose em glicose são fornecidos.

[0058] Geralmente as composições de celulase total melhorada por beta-glicosidase têm desempenho específico de aproximadamente igual ou maior do que uma preparação de celulase total sozinha. Os métodos descritos aqui são geralmente mais baratos do que os métodos equivalentes usando celulase total sozinha. Em modalidades particulares, em comparação aos métodos de outros modo equivalentes usando uma celulase total sozinha, a celulase total melhorada por beta-glicosidase e os métodos descritos aqui requerem menos proteína total de celulase para hidrolisar um material celulósico. Usando em ensaio de sacarificação, por exemplo, os métodos objeto diminuíram a quantidade de celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico para cerca de metade de um método equivalente com celulase total sozinha. Em modalidades particulares, em comparação aos métodos de outros modo equivalentes usando a celulase total sozinha, a celulase total melhorada por beta-glicosidase e os métodos descritos aqui requerem menos atividade de celulase total para hidrolisar um material celulósico. Usando em ensaio de sacarificação, por exemplo, os métodos objeto diminuíram a quantidade de atividade de celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico para cerca da metade de um método equivalente com celulase total sozinha.

[0059] São fornecidos aqui métodos de diminuição da quantidade de uma preparação de celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico adicionando uma quantidade eficaz de beta- glicosidase e a quantidade da referida preparação de celulase total requerida para hidrolisar o referido material celulósico é diminuída. Em algumas modalidades, a celulase total melhorada por beta-glicosidasetem desempenho específico de aproximadamente igual ou maior com relação à referida preparação de celulase total sozinha. Geralmente a quantidade de beta-glicosidase é maior do que 10% da quantidade da celulase total em uma relação de peso:peso. Em algumas modalidades, a relação de atividade de beta-glicosidase para atividade de celulase total é maior do que 0,61 pNPG/CMC unidades.

[0060] Os meios de detectar um decréscimo na celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico são conhecidos na técnica, por exemplo, em ensaio de sacarificação. Em algumas modalidades, o método de diminuição da quantidade de uma preparação de celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico adicionando uma quantidade eficaz beta-glicosidase, é fornecido, em que, a beta-glicosidase diminui a quantidade de celulase total requerida para hidrolisar acima de 30% do material celulósico em cerca de 48 horas a 50°C.

[0061] São fornecidos também métodos de hidrolisar um material celulósico que compreende contatar um material celulósico com uma quantidade eficaz de beta-glicosidase e da composição de celulase total, em que a quantidade de beta-glicosidase diminui a quantidade da composição de celulase total requerida para hidrolisar um material celulósico em algumas modalidades, a quantidade de beta-glicosidase é maior do que 10% da quantidade da celulase total em uma relação de peso:peso. Em algumas modalidades, em que a quantidade de be-ta-glicosidase é menor do que 80% da quantidade de celulase total em uma relação de peso:peso. Em algumas modalidades, a relação de atividade de beta-glicosidase para atividade de celulase total é maior do que 0,61 pNPG/CMC unidades.

[0062] A beta-glicosidase está geralmente em uma quantidade com relação à quantidade de preparação de celulase total. Em algumas modalidades, a beta-glicosidase está presente em uma quantida-de com relação à quantidade de preparação de celulase total em relação peso:peso, tal como relação proteínazproteína. Em algumas modalidades, quantidade de beta-glicosidase está na faixa de mais do que 10% a 90 %, com relação à proteína total, por exemplo, 11% a 90%, 15% a 85%, 20% a 80%, 25% a 75%, 30% a 70%, 35% a 65%, 40% a 60%, 45% a 55%, e 50% com relação ao exemplo de proteína total.

[0063] Em algumas modalidades, a quantidade de beta- glicosidase é maior do que 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%,29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%,53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90% ou maior com relação à proteína total, por exemplo.

[0064] Em algumas modalidades, a quantidade de beta- glicosidase no método é fornecida em relação entre a atividade da beta-glicosidase e da atividade da preparação de celulase total. Em algumas modalidades, quantidade de atividade de beta-glicosidase no método é fornecida como atividade de enzima com relação à atividade de enzima da preparação de celulase total. Em geral, as relações de atividade de enzima de uma beta-glicosidase para uma preparação de celulase total estão em uma faixa de cerca de 0,5 a 25 pNPG/CMC unidades. Em algumas modalidades, relação de atividade de enzima é de cerca de 1 a 20 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 1,5 a 15 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 2 a 10 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 2,5 a 8 pNPG/CMC unidades, de cerca de 3 a 7 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 3,5 a 6,5 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 4 a 6 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 4,5 a 5,5 pNPG/CMC unidades, ou de cerca de 5 a 6 pNPG/CMC. São especi-almente adequadas, por exemplo, relações de cerca de 5,5 pNPG/CMC unidades.

[0065] As composições descritas aqui podem ser adicionadas em quantidades eficazes de cerca de 0,001 a 10,0% em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025% a 4,0% em peso de sólidos, e mais preferivelmente de cerca de 0,005% a 5,0% em peso de sólidos.

[0066] Nos métodos da presente invenção, o material celulósico pode ser qualquer material contendo celulose. O material celulósico pode incluir, porém não está limitado à celulose, e hemicelulose. Em algumas modalidades, os materiais celulósicos incluem, porém não estão limitados à biomassa, material herbáceo, resíduos agriculturais, resíduos de silvicultura, lixo sólido municipal, papel usado, resíduos de polpa e papel.

[0067] Em algumas modalidades, o material celulósico inclui madeira, polpa de madeira, lodo de fabricação de papel, correntes de excreção de polpa de papel, tábua em partículas, resto de milho, fibra de milho, arroz, resíduo de processamento de papel e polpa, madeira e plantas herbáceas, polpa de fruta, polpa vegetal, pedra pomes, grão de destilaria, gramas, cascas de arroz, bagaço da cana-de-açúcar, algodão, juta, cânhamo, linho, bambu, sisal, abacá, palha, sabugos de milho, grãos de destilaria, folhas, palha de trigo, cabelo de coco, algas, gramíneas, e misturas dos mesmos.

[0068] O material celulósico pode ser usado no estado em que se encontra ou pode ser submetido ao pré-tratamento usando métodos convencionais conhecidos na técnica. Tais pré-tratamentos incluem pré-tratamento químico, físico e biológico. Por exemplo, técnicas de pré-tratamento físico podem incluir sem limitação vários tipos de moagem, esmagamento, vaporização/explosão por vapor, irradiação e hi- drotermólise. As técnicas de pré-tratamento química podem incluir semlimitação ácido diluído, alcalina, solvente orgânico, amónia, dióxido de enxofre, dióxido de carbono, e hidrotermólise controlada por pH. Técnicas de pré-tratamento biológico podem incluir sem limitação aplicar micro-organismos de solubilização de lignina.

[0069] Os métodos da presente invenção podem ser usados na produção de monossacarídeos, dissacarídeos, e polissacarídeos como cargas de alimentação químicas ou de fermentação para micro- organismo para a produção de produtos orgânicos, produtos químicos, combustíveis, plásticos, e outros produtos ou intermediários. Em particular, o valor de resíduos de processamento (grão de destilaria seco, grãos de consumo de fermentação, bagaço de cana-de-açúcar, etc.) pode ser aumentado por solubilização parcial ou completa de celulose ou hemicelulose. Além do etanol, alguns produtos químicos que podem ser produzidos a partir da celulose e hemicelulose incluem, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgânicos (por exemplo, ácido láctico), 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, etileno glicol, furfural, poli- hidroxialcanoatos, cis, ácido cis-mucônico, alimento de animal e xilose.

[0070] Os aspectos dos presentes ensinamentos podem ser também entendidos levando em consideração os seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitantes do escopo dos presentes ensinamentos. Será evidente para aqueles versados na técnica que muitas modificações, tanto nos materiais quanto nos métodos, podem ser praticadas sem afastar-se dos presentes ensinamentos.

7. EXEMPLOS EXEMPLO 7.1 Materiais e Métodos de Ensaios de Sacarificação

[0071] As celulases totais e beta-glicosidases usadas para os ensaios são com segue: celulase total de Trichoderma reesei disponível como LAMINEX BG de Genencor, USA; celulase total de Trichoderma reesei RUT-C30 (ATCC n° 56765); BGL1 de Trichoderma reesei (CEL3A) (Vide Patente US n° 6.022.725); BGL3 de Trichoderma reesei(CEL3B) (Vide Patente US n° 6.982.159), e BGL7 de Trichoderma ree- sei (CEL3E) (Vide USPN 20040102619). Todas as enzimas foram diluídas para concentrações desejadas em acetato de sódio a 50 mM, pH 5.

[0072] Com a exceção de Avicel, todos os substratos foram trazidos para os sólidos de percentagem desejada antes do uso nos ensaios. PCS e bagaço de cana-de-açúcar foram misturados para prover pipetagem precisa nas placas de microtítulo. Os materiais de substrato usados: resto de milho pré-tratado com PCS e bagaço de cana-de- açúcar foram ácido sulfúrico diluído pré-tratado por U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL), lavados e ajustados para o pH 5). O resto de milho pré-tratado com ácido (PCS) foi Celulose a 56%, Hemicelulose a 4%, Lignina a 29%. O bagaço pré- tratado com ácido (APB) foi Celulose a 53%, Hemicelulose a 3%, Lignina a 31%. Avicel (celulose cristalina, pura) foi adicionada à placa e em seguida apropriadamente diluída para 7% (7 mgs/ml) com acetato de sódio a 50 mM em pH 5. PASC (celulose dilatada por ácido fosfórico; celulose amorfa, pura, diluída em acetato de sódio a 50 mM, para 0,5% PASC em pH 5.

[0073] As enzimas foram dosadas com base na proteína total e a proteína total foi avaliada usando Kit de ensaio de proteína BCA, Pierce Cat. N° 23225 ou método de biureto. A carga total de enzima foi de 20 mg de proteína por grama de celulose. Diversas relações de preparações de celulase total para beta-glicosidase foram então usadas, por exemplo, relação 50:50 deveria ser de 10 mg/g de preparação de celulase total e 10 mg/g de beta-glicosidase.

[0074] Cento e Cinquenta microlitros de substrato por poço foram preenchidos em uma placa de microtítulo de fundo plano (MTP) usando uma pipeta de repetição. Vinte microlitros de solução de enzima apropriadamente diluída foram adicionados ao topo. No caso dePASC, a enzima foi adicionada à primeira placa. As placas foram cobertas com seladores de placa de alumínio e colocadas em incubadores a 37 ou 50 °C, com agitação, durantes os tempos especificados na tabela 1. A reação foi terminada adicionando-se 100 pl de glicina a 100 mM pH 10 a cada poço. Com mistura completa, os teores das mesmas foram filtrados através de uma placa de filtro de 96 poços Millipore (0,45 pm, PES). O filtrado foi diluído em uma placa contendo 100 pl de glicina a 10 mM pH 10 e a quantidade de açúcares solúveis avaliada por HPLC. As HPLCs série Agilent 1100 foram todas equipadas com uma coluna desacinzentamento/proteção (Biorad #125-01 18) e uma coluna de carboidrato com base em chumbo Aminex (Aminex HPX- 87P). A fase móvel foi água com uma taxa de fluxo de 0,6 ml/minutos.

[0075] Para experimentos de frasco de agitação, resto de milho pré-tratado com ácido diluído foi carregado em frascos de agitação de 500 ml de modo que a hidrólise de partida contivesse 7% celulose. Quatrocentos microlitros de tetraciclina e 300 microlitros de cicloexa- mida foram dosados para proibir o desenvolvimento microbiano. O volume hidrolisado de trabalho final foi trazido para até 100 ml com tampão (citrato de sódio a 0,1 M, pH 4,8). Finalmente, a enzima foi adicionada em uma carga de proteína total constante de 20 mg de proteí- na/g celulose antes de tamponar de cada frasco firmemente e colocar no agitador/incubador. Cada carga de enzima foi realizada a 37 e 50 °C e em duplicata durante 72 horas a 200 rpm. Os açúcares solúveis foram avaliados por HPLC como acima descrito.

EXEMPLO 7.2 Ensaio de Sacarificação de Celulase total e Beta- Glicosidase 1 em Substrato PASC

[0076] Um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo foi realizado usando uma preparação de celulase total de Trichoderma reesei com e sem BGL1 em PASC a 1%. A figura 1 mostra um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoder-ma reesei LAMINEX BG e BGL1 em PASC a 1%. A figura 1(a) mostra o percentual de conversão total plotado por uma determinada dose de celulase total com e sem BGL1. A figura 1(b) mostra quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas por celulase total sozinha e celulase total e BGL1 na mesma carga de proteína total.

[0077] A figura 1(a) mostra que a adição de 10 mg/g de BGL1 a 10 mg/g celulase total convertida tanto, ou mais, celulose em açúcares solúveis as 20 mg/g celulase total. Em outras palavras, aproximadamente a metade da celulase total poderia ser substituída com beta- glicosidase, resultando em uma mistura de enzima com desempenho específico igual ou melhor do que a celulase total sozinha. Além disso, o produto da mistura de celulase total beta-glicosidase teve uma proporção mais elevada de glicose para celobiose do que teve a celulase total sozinha quando carregada em proteína igual. A substituição de aproximadamente a metade da preparação de celulase total com BGL1 não afetaria a taxa de sacarificação total.

[0078] Usando os métodos conhecidos na técnica uma celulase total de linhagem produtora de T. reesei foi transformada por eletropo- ração com um polinucleotídeo codificando T. reesei BGL1 sob o promotor de CBH2 e com seleção de acetamidase (amdS). Os transfor- mantes estáveis foram desenvolvidos durante uma semana e avaliados por SDS-PAGE quanto ao nível de expressão de BGL1. Aqueles transformantes que mostraram expressão elevada de BGL1 (cerca de 50% da proteína total) com relação à total proteína celulase foram testados quanto à atividade na celulose dilatada por ácido fosfórico. Os resultados mostraram que diversos transformantes expressando BGL1 tiveram desempenho específico igual ou maior do que a celulase total de T. reesei que não foi transformada para superexpressar BGL1.

EXEMPLO 7.3 Ensaio de Sacarificação de Celulase total e Beta- Glicosidase 1 em Avicel, Resto de Milho Pré-tratado (PCS) e Bagaçode Cana-de-açúcar.

[0079] O efeito encontrado com a adição de BGL1 descrito na figura 1 não foi único para o substrato de PASC, que é celulose amorfa, pura. Um efeito similar foi também observada com outros materiais celulósicos: celulose cristalina (Avicel), resto de milho pré-tratado com ácido diluído (PCS) e bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com ácido diluído. A figura 2 mostra os resultados de experimentos, como acima descrito em PASC, realizados em Avicel em sólidos de celulose a 7%. A figura 2 mostra ensaio de sacarificação de placa microtítulo usando celulase total de Trichoderma reesei LAMINEX BG e BGL1 em Avicel a 7%. A figura 2(a) mostra o percentual de conversão total plo- tado por uma determinada dose de celulase total com e sem BGL 1. A figura 2 (b) mostra as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas por celulase total sozinha e celulase total e BGL1 na mesma carga de proteína total. Como com PASC, a substituição de aproximadamente metade da preparação de celulase total com BGL1 não altera o percentual de conversão total. A beta-glicosidase adicional aumentou a relação de celobiose para glicose, porém o efeito não é tão pronunciado quanto com PASC a celulase total sozinha produz uma relação de glicose para celobiose em Avicel. Os resultados de PCS e bagaço são similares àqueles observados com Avicel, tanto na conversão total quanto na relação de glicose para celobiose (Figuras 3 e 4). A figura 3 mostra o ensaio de sacarificação de placa microtítulo usando celulase total de Trichoderma reesei LAMINEX BG e BGL1 em PCS em celulose a 7%: (a) o percentual de conversão total é plotado por uma determinada dose de celulase total com e sem BGL1; (b) as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas por celulase total sozinha e celulase total e BGL1 na mesma carga de proteína total. Várias relações de celulase total para BGL1 em PCS a 7% foram também testadas em frascos de agitação. Os dados do frasco de agi-tação correlacionaram bem com o que foi observado nas placas de microtítulo (dados não-mostrados). A figura 4 é um gráfico mostrando o resultado de um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando uma celulase total de Trichoderma e β-glicosidase 1 de Tri-choderma em bagaço de cana-de-açúcar a 7% mostrando a percentual de conversão total (A) e as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas (B) e a conversão percentual aumentando a quantidade de beta-glicosidase (C).

EXEMPLO 7.4. Ensaio de sacarificação de Celulases Totais Fúngicas Filamentosas e Beta-Glicosidaseem RestoreMilho Pré-tratado.

[0080] Para observar se o efeito de adição de beta-glicosidase foi único para a linhagem de celulase total de T. reesei, o experimento com PCS em sólidos de celulose a 7% foi repetido com Rut C30 (outra celulase total de T. reesei). A figura 5 mostra um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Rut C30 e BGL1 em PCS em celulose a 7%: (a) um percentual de conversão total é plo- tado por uma determinada dose de celulase total de Rut C30 com e sem BGL1; (b) as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas por celulase total de Rut C30 sozinha e celulase total de Rut C30 e BGL1 na mesma carga de proteína total.

[0081] Em proteína igual, celulase total de Rut C30 não hidrolisa tanto celulose quanto Laminex BG (A figura 3). Quando aproximadamente um quarto ou metade das proteínas celulases totais de Rut C30 são substituídas com BGL1, o percentual de conversão é maior do que a mesma quantidade de celulase total de Rut C30 sozinha (A figura 5). Neste caso, a adição de beta-glicosidase pode ser usada para reduzir a dose total de enzima requerida para alcançar uma taxa de conversão particular.

EXEMPLO 7.5 Ensaio de Sacarificação de Celulase Total e Beta- Glicosidase purificada 1 em PACS e Resto de Milho Pré-tratado(PCS).

[0082] A figura 6 mostra um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoderma reesei LAMINEX BG e BGL1 purificada em PASC a 1%: (a) o percentual de conversão total é plotado por uma determinada dose de celulase total de Trichoderma reesei e BGL1 com e sem BGL1; e (b) as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas por celulase total de Trichoderma reesei e BGL1 na mesma carga de proteína total. A figura 7 mostra um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoderma reesei LAMINEX BG e BGL1 purificada em PCS em celulose a 7%: (a) o percentual de conversão total é plotado por uma determinada dose de celulase total de Trichoderma reesei com e sem BGL1 e (b) as quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas por celulase total de Trichoderma reesei sozinha e celulase total de Trichoderma reesei e BGL1 na mesma carga de proteína total. O percentual de conversão de cerca de uma mistura 50:50 de BGL1 e celulase total, é agora mais elevado do que a mesma quantidade de celulase total sozinha quando usando 1 % PASC ou 7% PCS como o substrato (Figuras 6 e 7). Uma mistura de 15 mg/g celulase total de Trichoderma reesei e 5 mg/g de BGL1 também produz conversão maior do que 20 mg/g de celulase total de Trichoderma reesei tanto em PCS quanto PASC. Como com o BGL1 não purificada, a relação de glicose para celobiose aumenta com a adição de BGL1 purificada, com uma diferença mais dramática vista em PASC.

Exemplo 7.6 Ensaio de Celulase Total e Beta-Glicosidase 3 ou Beta- Glicosidase 7 em Avicel Resto de Milho Pré-tratado (PCS) e Bagaço de Cana-de-açúcar.

[0083] O benefício de adição beta-glicosidase à celulase total descrito acima não está limitado a BGL1. Duas outras T reesei beta- glicosidases, BGL3 e BGL7, foram também testadas com celulase totalno ensaio de sacarificação de placa microtítulo em PASC e PCS.

[0084] A figura 8 mostra o ensaio de sacarificação de placa microtítulo usando celulase total de Trichoderma reeseiLaminex BG e BGL3 purificada em PASC a 1%. (a) o percentual de conversão total é plota- do por uma determinada dose de celulase total de Trichoderma reesei com e sem BGL3. (b) As quantidades relativas de celobiose e glicose produzidas por celulase total de Trichoderma reesei sozinha e celulase total de Trichoderma reesei e BGL3 na mesma carga de proteína total. A adição de partes iguais de BGL3 purificada a celulase total tem um efeito similar, embora ligeralmente menos pronunciado sobre PASC do que aquele observado com BGL1 (figura 6a). Enquanto uma melhora sobre 10 mg/g de celulase total sozinha, a mistura de 10 mg/g de celulase total de Trichoderma reesei e 10 mg/g de BGL3 não produz conversão igual em 20 mg/g celulase total de Trichoderma reesei, como observado no caso de BGL1 (figura 6a). Porém a mistura de 15 mg/g celulase total de Trichoderma reesei com 5 mg/g BGL3 não produz um benefício de desempenho sobre a mesma carga de proteína total de celulase total de Trichoderma reesei sozinha, embora novamente não seja um benefício tão pronunciado quanto àquele observado com BGL1. A substituição de aproximadamente metade da celulase total de Trichoderma reesei proteína total com BGL3 também aumenta a relação de glicose para celobiose; embora o açúcar total seja levemente menor (figura 8b). O efeito é similar em PCS em celulose a 7%. A substituição de aproximadamente metade da proteína total com BGL3 resulta em percentual de conversão similar, porém não maior de celulose em açúcares solúveis (figura 9a); um resultado similar, porém menos pronunciado do que àquele observado com BGL1 (figura 7a). A relação de glicose para celobiose é também reduzida, porém a redução na concentração de celobiose é menor. Isto não surpreende porque a celobiose total produzida é menor em PCS do que em PASC.

[0085] Outra T. reesei beta-glicosidase, BGL7, foi também testada em PASC a 1% da mesma maneira como BGL1 e BGL3. A figura 11 mostra um ensaio de sacarificação de placa de microtítulo usando celulase total de Trichoderma reeseiLaminex BG e BGL7 purificada em PASC a 1%. O percentual de conversão total é plotado por uma determinada dose de celulase total de Trichoderma reesei com e sem BGL7. Embora exista alguma melhora a partir da adição de grandes quantidades de BGL7 (figura 10), não é tão pronunciada quanto àquela observada com BGL1 e BGL7 (figura 6a,7a). Em uma base de proteína igual, não existe nenhuma mistura de BGL7 e celulase total de Trichoderma reesei que produz desempenho específico maior do que a celulase total sozinha.

Exemplo 7.7 Atividade de Celulase total e Atividade de Beta- Glicosidase

[0086] A tabela 1 mostra a relação de unidades de atividade para celulase total de Trichoderma (WC) e beta-glicosidase 1. A carga de enzima no ensaio de sacarificação de placa microtítulo foi convertida de mg de proteína total em unidades de atividade multiplicando-se pelas unidades de atividade/mg proteína. Celulase total de Trichoderma reesei 14 CMC U/mg (Vide Berlin, A.; Maximenko, V.; Gilkes, N.; Saddler, J. "Optimization of enzyme complexes for lignocelulose hydrolysis" Biotechnol. Bioeng. 2007, 97(2), 287-296) enquanto a atividade da BGL1 foi avaliada usando o ensaio de pNPG (77 pNPG U/mg).

[0087] A tabela 1 lista as relações de celulase total de Trichoderma para BGL1 em uma base peso:peso, juntamente com as unidades de atividade correspondentes carregadas por grama de celulose no substrato. A divisão do valor de pNPG U/g pelo valor de CMC U/g produz uma relação de atividade de pNPG/CMC presente na mistura que é independente de carga de substrato ou enzima.TABELA 1

Claims

1. Método de diminuição da quantidade de uma preparação de celulase total de Trichoderma reesei requerida para hidrolisar um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar uma quantidade eficaz de beta-glicosidase BGL1 ou BGL3 para formar uma celulase total melhorada por beta-glicosidase, em que a quantidade de beta-glicosidase é maior do que 10% e menor do que 80% da quantidade da referida preparação de celulase total em uma relação peso:peso.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de beta-glicosidase é igual à quantidade de celulase total em uma relação de peso:peso.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida preparação de celulase total compreende uma ou mais celobioidrolasese endoglicanases.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a preparação de celulase total é uma celulase total de Trichoderma.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida celulase total de Trichoderma é uma formulação de caldo total.

6. Método de hidrólise de um material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende:contatar um material celulósico com uma quantidade eficaz de uma composição de celulase total melhorada por beta-glicosidase que compreende uma celulase total de Trichoderma reesei e uma beta-glicosidase BGL1 de Trichoderma reesei em que a composição de celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende mais do que 10% e menos do que 80% de beta-glicosidase BGL1 de Trichoderma reesei em uma relação peso:peso; emanter o material celulósico e composição de celulase total melhorada por beta-glicosidase juntos sob condições para hidrólise do material celulósico.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma quantidade de beta-glicosidase é igual à quantidade da celulase total em uma relação de peso:peso.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a celulase total melhorada por beta-glicosidase compreende uma ou mais celobioidrolasese endoglicanases.

10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida celulase total de Trichoderma é uma formulação de caldo total.