BRPI0815564B1

BRPI0815564B1 - ANTICORPOS QUE INIBEM A DIMERIZAÇÃO DE c-MET E USOS DOS MESMOS, HIBRIDOMA DE MURINO, ANTICORPO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, USO E MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE ENFERMIDADES INDUZIDAS POR UMASUPEREXPRESSÃO OU SUBEXPRESSÃO DO RECEPTOR DE c-MET

Info

Publication number: BRPI0815564B1
Application number: BRPI0815564-0A
Authority: BR
Inventors: Liliane Goetsch
Original assignee: Pierre Fabre Medicament
Priority date: 2007-07-12
Filing date: 2008-07-10
Publication date: 2020-01-21
Also published as: CL2008002015A1; HRP20150887T1; CA2694418A1; HUE026026T2; CA2888691C; CA2982484C; TN2010000016A1; ME02341B; US20140010818A1; KR101719084B1; ES2693542T3; EP2014681A1; PT2188312E; SI2188312T1; JP2010532982A; IL223106B; IL223105B; EP2535356A1; IL223109A0; AR109659A2

Abstract

anticorpos que inibem a dimerização de c-met e usos dos mesmos, hibridoma de murino, anticorpo, ácido nucleico isolado, vetor, método para produção de anticorpo, composição, uso e método de diagnóstico in vitro de enfermidades induzidas por uma superexpressão ou subexpressão do receptor de c-met a presente invenção refere-se a um processo para a seleção de anticorpos anti-c-met capazes de inibir a ativação dependente de ligante e independente de ligante de c-met. mais particularmente, o referido processo é baseado na inibição da dimerização de c-met. em outro aspecto, a presente invenção refere-se a tais anticorpos e composições compreendendo tais anticorpos para o preparo de um medicamento para tratar câncer. processo de diagnóstico e kits também são parte da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS QUE INIBEM A DIMERIZAÇÃO DE c-MET E USOS DOS MESMOS, HIBRIDOMA DE MURINO, ANTICORPO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, USO E MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE ENFERMIDADES INDUZIDAS POR UMA SUPEREXPRESSÃO OU SUBEXPRESSÃO DO RECEPTOR DE cMET.

CAMPO TÉCNICO [0001] A presente invenção refere-se a novos anticorpos capazes de se ligar especificamente ao receptor c-Met humano e/ou capaz de inibir especificamente a atividade de quinase de tirosina do referido receptor, especialmente anticorpos monoclonais originários de murino, quiméricos e humanizados, bem como as sequências de aminoácido e ácido nucleico que codificam esses anticorpos. Mais particularmente, anticorpos de acordo com a invenção são capazes de inibir a dimerização de c-Met. A invenção, da mesma forma, compreende o uso desses anticorpos como um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico de cânceres e qualquer patologia relacionada à superexpressão do referido receptor, bem como em processos ou kits para diagnóstico de enfermidades relacionadas à superexpressão de c-Met. A invenção, finalmente, compreende produtos e/ou composições compreendendo tais anticorpos em combinação com outros anticorpos e/ou compostos químicos direcionados contra outros fatores de crescimento envolvidos em progressão ou metástase de tumor e/ou compostos e/ou agentes anticâncer ou agentes conjugados com toxinas e seu uso para a prevenção e/ou tratamento de determinados cânceres.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Agentes direcionados à quinase de tirosina de receptor

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2/131 (RTK), tais como os inibidores trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, imatinib e gefitinib, têm ilustrado o interesse de direcionamento dessa classe de proteína para o tratamento de cânceres selecionados.

[0003] c-Met é o membro protótipo de uma subfamília de RTKs a qual também inclui RON e SEA. A família de RTK c-Met é estruturalmente diferente das outras famílias de RTK e é o único receptor de alta afinidade conhecido para o fator de crescimento de hepatócito (HGF), também denominado fator de dispersão (SF) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10: 2867-2878]. c-Met e HGF são amplamente expressas em uma variedade de tecidos e sua expressão está normalmente restrita à células de origem epitelial e mesenquimal, respectivamente [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6: 1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123: 223-235]. Elas são requeridas para desenvolvimento normal de mamíferos e foi mostrado que são particularmente importantes em migração celular, diferenciação morfogênica e organização das estruturas tubulares tridimensionais, bem como crescimento e angiogênese [F. Baldt et al., Nature 1995, 376: 768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995: 373:699702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263: 98-101]. Embora tenha sido mostrado que a regulação controlada de c-Met e HGF é importante no desenvolvimento, manutenção e reparo tecidual de mamíferos [Nagayama T, Nagayama M, Kohara S, Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, Itoh J, Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5; 999(2): 155-66; Tahara Y, Ido A, Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1): 146-51], sua desregulação está envolvida na progressão de cânceres.

[0004] Sinalização anormal acionada por inativação inapropriada de c-Met é uma das alterações mais frequentes observadas em cânceres humanos e exerce um papel crucial em tumorigênese e

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3/131 metástase [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4: 915925; L. Trusolino e Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4): 289300].

[0005] Ativação inapropriada de c-Met pode surgir através de mecanismos dependente de ligantes e independentes de ligantes, os quais incluem superexpressão de c-Met e/ou ativação parácrina ou autócrina ou obtendo uma mutação de função [J.G. Christensen, Burrows J. e Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226: 1-26]. Contudo, uma oligomerização do receptor de c-Met, na presença ou ausência do ligante, é requerida para regular a afinidade de ligação e cinética de ligação da quinase com relação ao ATP e substratos peptídicos contendo tirosina [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 17 de Agosto de 2004, 43: 10570-8]. A c-Met ativada recruta efetuadores de sinalização a seu sítio de multiancoragem localizado no domínio citoplásmico, resultando na ativação de diversas vias de sinalização chave, incluindo Ras-MAPK, PI3K, Src e Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1): 49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49): 5582-9]. Essas vias são essenciais para proliferação, invasão e angiogênese de células tumorais e para evasão de apoptose [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene,

2000, 19(49): 5582-9; Gu H, Neel BG, Trends Cell Biol. Março de 2003, 13(3): 122-30; Fan S, Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q, Cao Y, Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 27 de Abril de 2000, 19(18): 2212-23]. Além disso, uma faceta única da sinalização de cMet com relação à outras RTKs é sua interação reportada com complexos de adesão focal e parceiros de ligação de não-quinase, tais como integrinas α6β4 [Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM, Cell.

2001, 107: 643-54], CD44v6 [Van der Voort R, Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G, Gherardi E, Pals ST, J Biol Chem. 1999, 274(10): 6499-506], Plexina B1 ou

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4/131 semaforinas [Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, Tamagnone L, Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9): 720-4; Conrotto P, Valdembri D, Corso S, Serini G, 5 Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F, Giordano S, Blood. 2005, 105(11): 4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23: 5131-7], as quais podem ainda se somar à complexidade de regulação de função celular por esse receptor. Finalmente, dados recentes demonstram que a c-Met poderia estar envolvida em resistência do tumor ao gefitinib ou erlotinib, sugerindo que combinações de compostos que objetivam o EGFR e c-Met poderiam ser de interesse significativo [Engelman JA et al., Science, 2007, 316: 1039-43].

[0006] Nos últimos anos, muitas estratégias diferentes foram desenvolvidas para atenuar a sinalização à c-Met em linhagens de células cancerígenas. Essas estratégias incluem i) neutralização de anticorpos contra c-Met ou HGF/SF [Cao B, Su Y, Oskarsson M, Zhao P, Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci US. 2001, 98(13): 7443-8; Martens T, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant M, Schwall R, Westphal M, Lamszus K, Clin Cancer Res. 2006, 12(20): 6144-52] ou o uso do antagonista de HGF/SF, NK4, para prevenir ligação de ligante à c-Met [Kuba K, Matsumoto K, Date K, Shimura H, Tanaka M, Nakamura T, Cancer Res., 2000, 60: 6737-43], ii) pequenos inibidores do sítio de ligação de ATP à c-Met que bloqueiam a atividade de quinase [Christensen JG, Schreck R, Burrows J, Kuruganti P, Chan E, Le P, Chen J, Wang X, Ruslim L, Blake R, Lipson KE, Ramphal J, Do S, Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63: 7345-55], iii) polipeptídeo com domínio SH2 manipulado que interfere com o acesso ao sítio de multiancoragem e RNAi ou ribozima que reduz a expressão do receptor ou ligante. A maioria dessas abordagens mostra uma inibição

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5/131 seletiva de c-Met, resultando em inibição de tumor e mostrando que cMet poderia ser de interesse para intervenção terapêutica em câncer.

[0007] Dentro das moléculas geradas para direcionamento de cMet, algumas são anticorpos gerados pela Genentech [W096/38557], os quais se comportam como um agonista potente quando adicionados isoladamente em vários modelos e como um antagonista quando usados como um fragmento Fab. Uma forma monovalente manipulada desse anticorpo descrita como 5D5 one armed (OA5D5) e produzida como uma proteína recombinante em E. coli é também o assunto de um pedido de patente [WO2006/015371] pela Genentech. Contudo, essa molécula, que não pode ser considerada como um anticorpo em virtude de sua base particular, mostra também mutações que poderiam ser imunogênicas em seres humanos. Em termos de atividade, essa molécula não glicosilada é desprovida de funções efetuadoras e, finalmente, não existe dados claros demonstrando que o OA5D5 inibe a dimerização de c-Met. Além disso, quando testado no modelo in vivo G55, uma linhagem de célula de glioblastoma que expressa c-Met, mas não mRNA e proteína de HGF e que cresce independentemente do ligante, o anti-c-Met one armed não teve efeito significativo sobre o crescimento do tumor G55, sugerindo que o OA5D5 atua primariamente através de bloqueio de ligação de HGF e não é capaz de direcionar tumores ativados independentemente de HGF [Martens T. et al., Clin. Cancer Res., 2006, 12(20): 6144-6152]. [0008] Outro anticorpo que direciona a c-Met é descrito pela Pfizer como um anticorpo que atua predominantemente como antagonista de c-Met e, em alguns casos, como um agonista de c-Met [WO 2005/016382]. Nenhum dado mostrando qualquer efeito dos anticorpos da Pfizer sobre a dimerização de c-Met é descrito nesse pedido.

[0009] Um dos aspectos inovadores da presente invenção é gerar

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6/131 anticorpos monoclonais de camundongo sem atividade agonista intrínseca e inibição de dimerização de c-Met. Além de direcionamento de tumores dependente de ligantes, essa abordagem também confere ativações independente de ligantes de c-Met em virtude de sua superexpressão ou mutações dos domínios intracelulares os quais permaneceram dependentes de oligomerização para sinalização. Outro aspecto da atividade de tais anticorpos poderia ser um impedimento estérico para interação de c-Met com seus parceiros, que resultará em falha de funções de c-Met. Esses anticorpos serão, de preferência, humanizados e manipulados, mas não limitados a, como IgG1 humana para proporcionar funções efetuadoras, tais como ADCC e CDC, além de funções relacionadas ao bloqueio específico do receptor de c-Met.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [00010] Surpreendentemente, pela primeira vez, conseguiu-se gerar um anticorpo capaz de ligação à c-Met, mas também capaz de inibir a dimerização de c-Met. Se for verdade que, na técnica anterior, algumas vezes é sugerido que um anticorpo capaz de inibição da dimerização de c-Met com seus parceiros poderia ser interessante, nunca foi divulgado ou claramente sugerido um anticorpo capaz de fazer isso. Além disso, com relação à especificidade do anticorpo, não era evidente de maneira alguma como proceder a geração de tal anticorpo ativo.

[00011] Em um primeiro aspecto, um assunto da presente invenção é um processo para a geração e seleção de anticorpos de acordo com a invenção.

[00012] Mais particularmente, a invenção refere-se a um processo para a seleção de um anticorpo anti-c-Met ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, capaz de inibir a ativação dependente de ligante e independente de ligante de c-Met, o referido processo

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7/131 compreendendo as seguintes etapas:

i) varredura dos anticorpos gerados e seleção de anticorpos capazes de se ligar especificamente à c-Met;

ii) avaliação in vitro dos anticorpos selecionados da etapa i) e seleção de anticorpos capazes de inibir pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, 70% ou 80% da proliferação de células tumorais para pelo menos um tipo de tumor; e, então, iii) testagem dos anticorpos selecionados da etapa ii) e seleção de anticorpos capazes de inibir a dimerização de c-Met.

[00013] Conforme foi explicado acima, a inibição da dimerização de c-Met é um aspecto capital da invenção, uma vez que tais anticorpos representarão um interesse real por uma população maior de pacientes. Não apenas câncer c-Met-ativado dependente de ligante, conforme foi o caso para a presente invenção, mas também câncer cMet-ativado independente de ligante poderia ser tratado com anticorpos gerados através do processo da presente invenção.

[00014] A geração do anticorpo pode ser realizada através de qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica tal como, por exemplo, fusão de uma célula de mieloma com células de baço de camundongos imunizados ou outras espécies compatíveis com as células de mieloma selecionadas [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497]. Os animais imunizados poderiam incluir camundongos transgênicos com loci de imunoglobulina humana os quais, então, produzem diretamente anticorpos humanos. Outra possível modalidade poderia consistir no uso de tecnologias de phage display para selecionar bibliotecas.

[00015] A etapa de seleção i) pode ser realizada através de qualquer método ou processo conhecido por aqueles versados na técnica. Como exemplos não limitativos, podem ser mencionados ELISA, BIAcore, imuno-histoquímica, análise por FACS e seleções

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8/131 funcionais. Um processo preferido consiste em uma seleção através de ELISA sobre a proteína recombinante de c-Met e, então, através de análise por FACS sobre pelo menos uma linhagem de célula tumoral a fim de assegurar que os anticorpos produzidos serão capazes de reconhecer também o receptor nativo sobre células tumorais. Esse processo será descrito mais precisamente nos exemplos a seguir. [00016] Da mesma forma, a etapa ii) pode também ser realizada classicamente através de um método ou processo conhecido tal como, por exemplo, usando 3H-timidina ou qualquer outro agente de coloração de DNA, MTT, avaliação de ATP, etc. Um modelo de célula tumoral preferido na presente invenção pode consistir no modelo BcPC3.

[00017] Por inibição da dimerização de c-Met, deve ser entendido, de preferência, a homodimerização de c-Met.

[00018] Em uma modalidade preferida da etapa iii) de seleção do processo da invenção, a referida etapa iii) consiste em avaliação de anticorpos através de análise BRET sobre células expressando c-MetRLuc/c-Met-YFP e seleção de anticorpos capazes de inibir pelo menos 30%, de preferência 35%, 40%, 45%, 50%, 55% e, mais preferivelmente, 60% da sinal de BRET.

[00019] A tecnologia BRET é uma tecnologia conhecida como sendo representativa da dimerização de proteína [Angers et al., PNAS, 2000, 97: 3684-89].

[00020] A tecnologia BRET, usada na etapa iii) do processo, é bemconhecida por aqueles versados na técnica e será detalhada nos exemplos a seguir. Mais particularmente, BRET (Transferência de Energia por Ressonância de Bioluminescência) é uma transferência de energia não radioativa que ocorre entre um doador bioluminescente (Luciferase Renilla (Rluc)) e um aceitador fluorescente, um mutante de GFP (Proteína Fluorescente Verde) ou YFP (Proteína Fluorescente

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Amarela). No presente caso, EYFP (Proteína Fluorescente Amarela Intensificada) foi usada. A eficácia de transferência depende da orientação e da distância entre o doador e o aceitador. Então, a transferência de energia pode ocorrer apenas se as duas moléculas estiverem em proximidade íntima (1-10 nm). Essa propriedade é usada para gerar ensaios de interação proteína-proteína. Na verdade, de forma a estudar a interação entre dois parceiros, o primeiro é geneticamente fundido à Luciferase Renilla e o segundo ao mutante amarelo da GFP. Proteínas de fusão são, em geral, mas não obrigatoriamente, expressas em células de mamífero. Na presença de seu substrato membrana-permeável (coelenterazina), Rluc emite luz azul. Se o mutante de GFP estiver mais próximo do que 10 nm da Rluc, uma transferência de energia pode ocorrer e um sinal amarelo adicional pode ser detectado. O sinal BRET é medido como a proporção entre a luz emitida pelo aceitador e a luz emitida pelo doador. Assim, o sinal BRET aumentará à medida que as duas proteínas de fusão são mantidas em proximidade ou se uma alteração conformacional mantiver Rluc e o mutante de GFP mais próximos. [00021] Se a análise BRET consiste em uma modalidade preferida, qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica pode ser usado para medir a dimerização de c-Met. Sem limitação, as seguintes tecnologias podem ser mencionadas: FRET (Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência), HTRF (Fluorescência TempoDecomposta Homogênea), FLIM (Microscopia por Formação de Imagem por tempo de vida de Fluorescência) ou SW-FCCS (espectroscopia por relação cruzada de fluorescência com comprimento de onda único).

[00022] Outras tecnologias clássicas também poderiam ser usadas, tais como coimunoprecipitação, Alpha Screen, ligação cruzada química, Duplo Híbrido, Cromatografia por Afinidade, ELISA ou

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Western blot.

[00023] Em um segundo aspecto, um assunto da invenção é um anticorpo isolado ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, sendo obtidos através do referido processo. O referido anticorpo ou um de seus referidos fragmentos ou derivados é capaz de se ligar especificamente à c-Met humana e, se necessário, de preferência, além disso, capaz de inibir a fixação natural de seu ligante HGF e/ou capaz de inibir especificamente a atividade de quinase de tirosina da referida c-Met, o referido anticorpo sendo também capaz de inibir a dimerização de c-Met. Mais particularmente, os referidos anticorpos serão capazes de inibir a ativação dependente de ligante e independente de ligante de c-Met.

[00024] As expressões fragmentos e derivados funcionais serão definidas em detalhes depois na presente especificação.

[00025] Deve ser entendido aqui que a invenção não refere-se aos anticorpos na forma natural, isto é, eles não estão em seu ambiente natural, mas eles foram capazes de ser isolados ou obtidos através de purificação a partir de fontes naturais ou mesmo obtidos através de recombinação genética ou através de síntese química e que eles podem, então, conter aminoácidos não-naturais, conforme será descrito aqui adiante.

[00026] Mais particularmente, de acordo com outro aspecto da invenção, é reivindicado um anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, o referido anticorpo sendo caracterizado pelo fato de que ele compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade, CDR, escolhida de CDRs compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 1 a 17 e 56 a 61.

[00027] Qualquer anticorpo ou fragmentos ou derivados tendo pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80% de identidade, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade, após

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11/131 alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID NOs: 1 a 17 e 56 a 61 devem ser entendidos como um equivalente e, como uma consequência, como sendo parte da invenção.

[00028] Por regiões de CDR ou CDR(s), se pretende indicar as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve das imunoglobulinas, conforme definido pela IMGT.

[00029] A numeração única IMGT foi definida para comparar os domínios variáveis, seja qual for o receptor antigênico, o tipo de cadeia ou a espécie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) /Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) /Lefranc, M.-P., Pommié, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]. Na numeração única IMGT, os aminoácidos conservados sempre têm a mesma posição, por exemplo, cisteína 23 (1^a-CYS), triptofano 41 (CONSERVADO-TRP), o aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2a-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ou JTRP). A numeração única IMGT proporciona uma delimitação padronizada das regiões de estrutura principal (posições 1 a 26, FR2IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões de determinação de complementaridade: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. As lacunas representam posições desocupadas, os comprimentos das CDR-IMGT (mostradas entre colchetes e separadas por pontos, por exemplo, [8.8.13]) se tornam informação crucial. A numeração única IMGT é usada em representações gráficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. e Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857883 (2002) /Kaas, Q. e Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] e em estruturas 3D em IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. e Lefranc, M.-P., T cell receptor e MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

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12/131 [00030] Existem três CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. O termo CDR ou CDRs é usado aqui de forma a indicar, de acordo com o caso, uma dessas regiões ou várias ou mesmo o todo dessas regiões, as quais contêm a maioria dos resíduos de aminoácido responsáveis pela ligação por afinidade do anticorpo ao antígeno ou ao epítopo o qual elas reconhecem.

[00031] Por percentual de identidade entre duas sequências de ácido nucleico ou aminoácido no sentido da presente invenção, pretende-se indicar um percentual de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtidas após o melhor alinhamento (alinhamento ótimo), esse percentual sendo puramente estatístico e as diferenças entre duas sequências sendo distribuídas aleatoriamente e sobre todo o seu comprimento. As comparações de sequências entre duas sequências de ácido nucleico ou aminoácido são, tradicionalmente, realizadas comparando essas sequências após ter alinhado as mesmas de uma maneira ótima, a referida comparação sendo capaz de ser realizada por segmentos ou através de uma janela de comparação. O alinhamento ótimo das sequências para a comparação pode ser realizado, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2: 482], por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], por meio do método de busca por similaridade de Pearson e Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444), por meio de um software de computador usando esses algoritmos (LACUNA, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI ou mesmo através dos softwares de comparação BLAST N ou BLAST P).

[00032] O percentual de identidade entre duas sequências de ácido

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13/131 nucleico ou aminoácido é determinado comparando essas duas sequências alinhadas de uma maneira ótima e na qual a sequência de ácido nucleico ou aminoácido a ser comparada pode compreender adições ou deleções com relação à sequência de referência para alinhamento ótimo entre essas duas sequências. O percentual de identidade é calculado determinando o número de posições idênticas entre as duas sequências, dividindo-se esse número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado obtido por 100 de forma a obter o percentual de identidade entre essas duas sequências.

[00033] Por exemplo, é possível usar o programa BLAST, BLAST 2 sequences (Tatusova et al., Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein e nucleotide sequences, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250) disponível no site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, os parâmetros usados sendo aqueles fornecidos pelo padrão (em particular para os parâmetros penalidade por abertura de lacuna: 5 e penalidade por extensão de lacuna: 2, a matriz escolhida sendo, por exemplo, a matriz BLOSUM 62 proposta pelo programa), o percentual de identidade entre as duas sequências a serem comparadas sendo calculado diretamente pelo programa.

[00034] Por sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com uma sequência de aminoácido de referência, aquelas tendo, com relação à sequência de referência, determinadas modificações, em particular uma deleção, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido, um truncamento ou um alongamento, são preferidas. No caso de uma substituição de um ou mais aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, são preferidas substituições nas quais os aminoácidos substituídos são substituídos por aminoácidos equivalentes. A expressão aminoácidos equivalentes se destina aqui a indicar

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14/131 qualquer aminoácido capaz de ser substituído por um dos aminoácidos da estrutura básica sem, contudo, modificar essencialmente as atividades biológicas dos anticorpos correspondentes e tal como será definido depois, especialmente nos exemplos. Esses aminoácidos equivalentes podem ser determinados contando com sua homologia estrutural com os aminoácidos os quais eles substituem ou resultados de exames comparativos de atividade biológica entre os diferentes anticorpos capazes de serem realizados.

[00035] À guisa de exemplo, menção é feita às possibilidades de substituição capaz de ser realizada sem resultar em uma modificação profunda da atividade biológica do anticorpo modificado correspondente.

[00036] Como um exemplo não limitativo, a tabela 1 a seguir proporciona possibilidades de substituição concebíveis com uma conservação da atividade biológica do anticorpo modificado. As substituições inversas, naturalmente, também são possíveis, nas mesmas condições.

Tabela 1

Resíduo original	Substituição(ões)
Ala (A)	Val, Gly, Pro
Arg (R)	Lys, His
Asn (N)	Gln
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (G)	Asp
Gly (G)	Ala
His (H)	Arg
Ile (I)	Leu

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Leu (L)	Ile, Val, Met
Lys (K)	Arg
Met (M)	Leu
Phe (F)	Tyr
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr, Cys
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Phe, Trp
Val (V)	Leu, Ala

00037] Deve ser entendido aqui que a invenção não refere-se a anticorpos na forma natural, isto é, eles não estão em seu ambiente natural, mas que eles foram capazes de serem isolados ou obtidos através de purificação a partir de fontes naturais ou mesmo obtidos através de recombinação genética ou através de síntese química e que eles podem, então, conter aminoácidos não-naturais, conforme será descrito aqui depois.

[00038] De acordo com uma primeira abordagem, o anticorpo será definido por sua sequência de cadeia pesada. Mais particularmente, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma CDR escolhida de CDRs compreendendo as sequências de aminoácido SEQ ID Nos. 1 a 9 e 56 a 58.

As sequências mencionadas são as seguintes:

SEQ ID No. 1:	GYIFTAYT
SEQ ID No. 2:	IKPNNGLA
SEQ ID No. 3:	ARSEITTEFDY
SEQ ID No. 4:	GYSFTDYT
SEQ ID No. 5:	INPYNGGT

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SEQ ID No. 6:

AREEITKDFDF

SEQ ID NO: 7:

SEQ ID NO: 8:

GYTFTDYN

INPNNGGT

SEQ ID NO: 9:

ARGRYVGYYYAMDY

SEQ ID NO: 56:

GYTFTSYW

SEQ ID NO: 57:

INPTTGST

SEQ ID NO: 58:

AIGGYGSWFAY [00039] As CDRs da cadeia pesada poderiam ser escolhidas aleatoriamente nas sequências anteriores, isto é, SEQ ID NOs: 1 a 9 e 56 e 58.

[00040] De acordo com um aspecto preferido, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais compreende uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma CDR escolhida de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que:

- CDR-H1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 1,4, 7 ou 56,

- CDR-H2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 2, 5, 8 ou 57 e

- CDR-H3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 3, 6, 9 ou 58.

[00041] De acordo com uma primeira modalidade do referido aspecto, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais compreende uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1, CDR-H2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2 e CDR-H3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 3.

[00042] Mais particularmente, o referido anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com essa primeira modalidade compreende uma cadeia pesada de sequência

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17/131 compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 18.

[00043] SEQ ID No. 18:EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFT AYTMHWVRQSLGESLDWIGGIKPNNGLANYNQKFKGKATLTVDKSS STAYMDLRSLTSEDSAVYY CARSEITTEFDYWGQGTALTVSS [00044] De acordo com uma segunda modalidade do referido aspecto, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, compreende uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência de aminoácido e SEQ ID No. 4, CDR-H2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 5 e CDR-H3 compreende a sequência de aminoácido e SEQ ID No. 6.

[00045] O anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com a referida segunda modalidade compreenderá, de preferência, uma cadeia pesada da sequência compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 19.

[00046] SEQ ID No. 19: EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYS FTDYTLNWVKQSHGKTLEWIGLINPYNGGTTYNQKFKGKATLTVDKS SSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAREEITKDFDFWGQGTTLTVSS [00047] De acordo com uma terceira modalidade do referido aspecto, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, compreende uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 7, CDR-H2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 8 e CDR-H3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 9.

[00048] O anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com a referida terceira modalidade compreenderá, de preferência, uma cadeia pesada da sequência compreendendo a sequência aminoácido SEQ ID No. 20.

[00049] SEQ ID No. 20: EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTF

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TDYNMDWVKQSHGMSLEWIGDINPNNGGTIFNQKFKGKATLTVDKS

SSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARGRYVGYYYAMDYWGQGTSVTVS

S [00050] De acordo com a quarta modalidade do referido aspecto, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, compreende uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que CDR-H1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 56, CDR-H2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 57 e CDR-H3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 58.

[00051] O anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com a referida quarta modalidade compreenderá, de preferência, uma cadeia pesada da sequência compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 62.

[00052] SEQ ID No. 62: QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFT SYWMNWVKQRPGQGLEWIGYINPTTGSTDYNQKLKDKATLTADKSS NTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAIGGYGSWFAYWGQGTLVTVSA [00053] Em uma segunda abordagem, o anticorpo será agora definido por sua sequência de cadeia leve. Mais particularmente, de acordo com um segundo aspecto particular da invenção, o anticorpo ou um de seus derivados ou fragmentos funcionais é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma CDR escolhida de CDRs compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 10 a 17 e 59 a 61.

As sequências mencionadas são as seguintes:

SEQ ID No. 10	ESVDSYANS F
SEQ ID No.	11	RAS
SEQ ID No.	12	QQSKEDPLT

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SEQ ID No.	13	ESIDTYGNSF
SEQ ID No.	14	QQSNEDPFT
SEQ ID No.	15	ENIYSN
SEQ ID No.	16	AAT
SEQ ID No.	17	QHFWGPPYT
SEQ ID No.	59	SSVSSTY
SEQ ID No.	60	TTS
SEQ ID No.	61	HQWSSYPFT

[00054] As CDRs da cadeia leve poderia ser escolhidas aleatoriamente nas sequências anteriores, isto é, SEQ ID Nos. 10 a 17 e 59 a 61.

[00055] De acordo com outro aspecto preferido, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, compreende uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma CDR escolhida de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que:

- CDR-L1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 10, 13, 15 ou 59,

- CDR-L2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 11, 16 ou 60 e

- CDR-L3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 12, 14, 17 ou 61.

[00056] De acordo com uma primeira modalidade do referido outro aspecto, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, compreende uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 10, CDR-L2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 11 e CDR-L3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 12.

[00057] Mais particularmente, o referido anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com essa primeira

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20/131 modalidade compreende uma cadeia leve da sequência compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 21.

[00058] SEQ ID No. 21: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCR

ASESVDS

YANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLT INPVEADDVATYYCQQSKEDPLTFGSGTKLEMK [00059] De acordo com uma segunda modalidade do referido outro aspecto, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, compreende uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 13, CDR-L2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 11 e CDR-L3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 14.

[00060] O anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com a referida modalidade compreenderá, de preferência, uma cadeia leve da sequência compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 22.

[00061] SEQ ID No. 22:

GIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRVSESIDTY

GNSFIHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTIN PVEADDSATYYCQQSNEDPF TFGSGTKLEMK [00062] De acordo com uma terceira modalidade do referido outro aspecto, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, compreende uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 15, CDR-L2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 16 e CDR-L3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 17.

[00063] O anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com a referida terceira modalidade

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21/131 compreenderá, de preferência, uma cadeia leve da sequência compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 23.

[00064] SEQ ID No. 23: DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIY

SNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLVDGVPSRFSGSGSGTQYSLKIN

SLQSEDFGSYYCQHFWGPPYTFGGGTKLE [00065] De acordo com uma quarta modalidade do referido outro aspecto, o anticorpo da invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, compreende uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-L1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 59, CDR-L2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 60 e CDR-L3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID No. 61.

[00066] O anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com a referida modalidade compreenderá, de preferência, uma cadeia leve da sequência compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 63. SEQ ID No. 63: QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASS SVSSTY

LYWYQQKPGSSPKLWIYTTSILASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMET EDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLDIK [00067] De acordo com uma terceira abordagem, o anticorpo será agora definido por sua sequência de cadeia leve e sua sequência de cadeia pesada. O anticorpo da invenção ou um de seus derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 18, 19, 20 ou 62 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 21, 22, 23 ou 63.

[00068] Mais particularmente, um anticorpo preferido ou um de seus derivados ou fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, denominado 224G11, compreende uma cadeia pesada

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22/131 compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo, respectivamente, a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 1, 2 e 3; e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo, respectivamente, a sequência de aminoácido SEQ ID

Nos. 10, 11 e 12.

[00069] Em outro aspecto, o anticorpo 224G11 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 21.

[00070] Outro anticorpo preferido ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com a invenção, denominado 227H1, compreende uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo, respectivamente, a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 4, 5 e 6; e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo, respectivamente, a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 13,11 e 14.

[00071] Em outro aspecto, o anticorpo 227H1 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 19 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 22.

[00072] Ainda outro anticorpo preferido ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, denominado 223C4, compreende uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo, respectivamente, a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 7, 8 e 9; e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo respectivamente a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 15, 16 e 17.

[00073] Em outro aspecto, o anticorpo 223 C4 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 20 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido

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SEQ ID No. 23.

[00074] Ainda outro anticorpo preferido ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, denominado 11E1, compreende uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo, respectivamente, a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 56, 57 e 58; e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo respectivamente a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 59, 60 e 61.

[00075] Em outro aspecto, o anticorpo 11E1 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 62 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 63.

[00076] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibridoma de murino capaz de secretar a anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção, especialmente um hibridoma originário de murino, tal como depositado no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, National Collection of Microorganism Cultures) (Institut Pasteur, Paris, França).

[00077] Os anticorpos monoclonais de acordo com a invenção ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais são caracterizados pelo fato de que os referidos anticorpos são secretados pelo hibridoma depositados no CNCM em 14/03/2007 sob os números CNCM 1-3724 (correspondendo a 11E1), 1-3731 (correspondendo a 224G11), 1-3732 (correspondendo a 227H1) e em 06/07/2007 sob o número 1-3786 (correspondendo a 223C4). Esses hibridomas consistem em um hibridoma de murino resultando na fusão celular de esplenócitos de camundongo imunizado com uma linhagens de célula de mieloma (Sp20 Agl4).

[00078] A tabela 2 a seguir reagrupa elementos referentes aos anticorpos preferidos.

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Tabela 2

	224G11 1-3731	227H1 1-3732	223C4 1-3786	11E1 1-3724
	SEQ	SEQ	SEQ	SEQ	SEQ	SEQ	SEQ	SEQ
	ID	ID	ID	ID	ID	ID	ID	ID
	Prot.	Nucl.	Prot.	Nucl.	Prot.	Nucl.	Prot.	Nucl.
CDR- H1	1	24	4	27	7	30	56	64
CDR- H2	2	25	5	28	8	31	57	65
CDR- H3	3	26	6	29	9	32	58	66
Cadeia H.	18	41	19	42	20	43	62	70
CDR-L1	10	33	13	36	15	38	59	67
CDR-L2	11	34	11	34	16	39	60	68
CDR-L3	12	35	14	37	17	40	61	69
Cadeia L.	21	44	22	45	23	46	63	71

[00079] A partir da tabela 2, está claro que CDR-L2 dos anticorpos 227H1 e 224G11 são similares. Esse exemplo sustenta claramente as reivindicações do presente pedido que abrangem anticorpos compreendendo pelo menos uma CDR aleatoriamente escolhida das sequências de CDR descritas.

[00080] De acordo com uma modalidade preferida, a invenção refere-se a anticorpos monoclonais.

[00081] O termo Anticorpo Monoclonal é usado de acordo com seu significado comum para denotar um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos,

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25/131 exceto quanto à possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades mínimas. Em outras palavras, um anticorpo monoclonal consiste em um anticorpo homogêneo resultante da proliferação de um único clone de células (por exemplo, células de hibridoma, células hospedeiras eucariotas transfectadas com DNA que codifica o anticorpo homogêneo, células hospedeiras procariotas transformadas com o DNA que codifica o anticorpo homogêneo, etc.) e o qual é geralmente caracterizado por cadeias pesadas de um única classe e subclasse e cadeias leves de um único tipo. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único antígeno. Além disso, em contraste a preparações de anticorpos policlonais que, tipicamente, incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes ou epítopo, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno.

[00082] Na presente descrição, os termos polipeptídeos, sequências polipeptídicas, sequências de aminoácido, peptídeos e proteínas, com referência a compostos de anticorpo ou sua sequência, são permutáveis.

[00083] De acordo com um aspecto da mesma forma particular, a presente invenção refere-se a um anticorpo quimérico ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo, além disso, compreende as regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada derivadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga ao camundongo, especialmente o homem e, de uma maneira preferida, pelo fato de que as regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano são, respectivamente, a região Kappa e Gama-1, Gama-2 ou Gama-4. [00084] No presente pedido, IgG1 é preferida para proporcionar funções efetuadoras e, mais preferivelmente, ADCC e CDC.

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26/131 [00085] Aqueles habilitados reconhecerão que funções efetuadoras incluem, por exemplo, ligação a C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citoxicidade celular mediada depende de antropo (ADCC); fagocitose; e sub-regulação de receptores na superfície celular (por exemplo, receptor de células de B; BCR).

[00086] Os anticorpos de acordo com a presente invenção são, de preferência, anticorpos monoclonais específicos, especialmente originários de murino, quiméricos humanizados, os quais podem ser obtidos de acordo com métodos-padrão bem-conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00087] Em geral, para o preparo de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ou derivados funcionais, especialmente originários de murino, é possível se referir a técnicas as quais são descritas, em particular, no manual Antibodies (Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, páginas 726, 1988) ou à técnica de preparo de hibridomas descrita por Kohler e Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).

[00088] Os anticorpos monoclonais de acordo com a invenção podem ser obtidos, por exemplo, de uma célula animal imunizada contra c-Met ou um de seus fragmentos contendo o epítopo especificamente reconhecido pelos referidos anticorpos monoclonais de acordo com a invenção. A referida c-Met ou um de seus referidos fragmentos pode ser especialmente produzida de acordo com métodos de trabalho usuais, através de recombinação genética começando com uma sequência de aminoácido contida na sequência de cDNA que codifica a c-Met ou através de síntese de peptídeo começando a partir de uma sequência de aminoácido compreendida na sequência peptídica da c-Met.

[00089] Os anticorpos monoclonais de acordo com a invenção

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27/131 podem, por exemplo, ser purificados sobre uma coluna de afinidade sobre a qual a c-Met ou um de seus fragmentos contendo o epítopo especificamente reconhecido pelos referidos anticorpos monoclonais de acordo com a invenção foi previamente imobilizada. Mais particularmente, os referidos anticorpos monoclonais podem ser purificados através de cromatografia sobre proteína A e/ou G, seguido ou não por cromatografia de troca iônica direcionada à eliminação dos contaminantes de proteína residual, bem como o DNA e a LPS em si, seguido ou não por cromatografia de exclusão sobre um gel de Sepharose™ de forma a eliminar os agregados potenciais em virtude da presença de dímeros ou outros multímeros. De uma maneira ainda mais preferida, o todo dessas técnicas pode ser usado simultânea ou sucessivamente.

[00090] Anticorpos quiméricos ou humanizados são, da mesma forma, incluídos nos anticorpos de acordo com a presente invenção.

[00091] Por anticorpo quimérico, entende-se um anticorpo o qual contém uma região variável natural (cadeia leve e cadeia pesada) derivado de um anticorpo de uma determinada espécie em combinação com as regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo de uma espécie heteróloga à referida determinada espécie (por exemplo, camundongo, cavalo, coelho, cão, vaca, galinha, etc.).

[00092] Os anticorpos ou seus fragmentos do tipo quimérico de acordo com a invenção podem ser preparados usando as técnicas de recombinação genética. Por exemplo, o anticorpo quimérico pode ser produzido através de clonagem de um DNA recombinante contendo um promotor e uma sequência que codifica a região variável de um anticorpo monoclonal não-humano, especialmente de murino, de acordo com a invenção e uma sequência que codifica a região constante de um anticorpo humano. Um anticorpo quimérico da

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28/131 invenção codificado por tal gene recombinante será, por exemplo, uma quimera de camundongo-homem, a especificidade desse anticorpo sendo determinada pela região variável do DNA de murino e seu isotipo determinado pela região constante derivada do DNA humano. Para os métodos de preparo de anticorpos quiméricos é possível, por exemplo, se referir aos documentos Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74, 1988), Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6851-6855, 1984) ou le brevet US 4.816.567.

[00093] Por anticorpo humanizado, entende-se um anticorpo o qual contém regiões de CDR derivadas de um anticorpo de origem nãohumana, as outras partes da molécula de anticorpo sendo derivadas de um (ou de vários) anticorpo humano. Além disso, alguns dos resíduos dos segmentos do esqueleto (denominado FR) podem ser modificados de forma a conservar a afinidade de ligação (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 15341536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988).

[00094] Os anticorpos humanizados de acordo com a invenção ou seus fragmentos podem ser preparados através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica (tais como, por exemplo, aqueles descritos nos documentos de Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1142, 1992; ou Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992).

[00095] Outros métodos de humanização são conhecidos por aqueles versados na técnica como, por exemplo, o método de Enxertagem de CDR descrito pela Protein Design Lab (PDL) nos pedidos de patente EP 0 451261, EP 0 682 040, EP 0 9127, EP 0 566 647 ou US 5.530.101, US 6.180.370, US 5.585.089 e US 5.693.761. Os seguintes pedidos de patente também podem ser mencionados: US 5.639.641; US 6.054.297; US 5.886.152 e US 5.877.293.

[00096] Por fragmento funcional de um anticorpo de acordo com a

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29/131 invenção, entende-se, em particular, um fragmento de anticorpo, tais como fragmentos Fv, scFv (sc para um única cadeia), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos ou qualquer fragmento cujo tempo de meia-vida foi aumentado através de modificação química, tal como a adição de (poli)alquileno glicol, tal como (poli)etileno glicol (PEGuilação) (fragmentos peguilados denominados Fv-PEG, scFvPEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ou Fab'-PEG)(PEG para Poli(Etileno) Glicol) ou através de incorporação em um lipossoma, os referidos fragmentos tendo pelo menos uma das CDRs característica de sequência SEQ ID Nos. 1 a 17 e 56 a 61 de acordo com a invenção e, especialmente, pelo fato de que ele é capaz de exercer, de uma maneira geral, uma atividade mesmo parcial do anticorpo do qual ele é derivado tal como, em particular, a capacidade de reconhecer e se ligar à c-Met e, se necessário, inibir a atividade da c-Met.

[00097] De preferência, os referidos fragmentos funcionais serão constituídos ou compreenderão uma sequência parcial da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo do qual eles são derivados, a referida sequência parcial sendo suficiente para reter a mesma especificidade de ligação que o anticorpo do qual ela é derivada e uma afinidade suficiente, de preferência, pelo menos = 1/100, de uma maneira mais preferida pelo menos 1/10 daquela do anticorpo do qual ela é derivada com relação à c-Met. Tal fragmento funcional conterá no mínimo 5 aminoácidos, de preferência 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 50 e 100 aminoácidos consecutivos da sequência do anticorpo do qual ela é derivada.

[00098] De preferência, esses fragmentos funcionais serão fragmentos do tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diacorpos, os quais, em geral, têm a mesma especificidade de ligação que o anticorpo do qual eles são derivados. Em uma modalidade mais preferida da invenção, esses fragmentos são selecionados dentre

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30/131 fragmentos divalentes, tais como fragmentos F(ab')2. De acordo com a presente invenção, os fragmentos de anticorpo da invenção podem ser obtidos começando a partir de anticorpos, tal como descrito acima, através de métodos tais como digestão por enzimas tais como pepsina ou papaína e/ou através de de clivagem das ligações em ponte de dissulfeto por meio de redução química. De outra maneira, os fragmentos de anticorpo compreendidos na presente invenção podem ser obtidos através de métodos de recombinação genética da mesma forma bem-conhecidos por aqueles versados na técnica ou mesmo através de síntese de peptídeo por meio, por exemplo, de sintetizadores automáticos de peptídeo, tais como aqueles fornecidos pela companhia Applied Biosystems, etc.

[00099] Por fragmento divalente, entende-se quaisquer fragmentos de anticorpo compreendendo dois braços e, mais particularmente, fragmentos F(ab')2.

[000100] Mais particularmente, a invenção compreende os anticorpos ou seus fragmentos funcionais de acordo com a presente invenção, especialmente anticorpos quiméricos ou humanizados obtidos através de recombinação genética ou através de síntese química.

[000101] Por derivados de um anticorpo de acordo com a invenção, entende-se uma proteína de ligação compreendendo uma base de proteína e pelo menos uma das CDRs selecionadas do anticorpo original de forma a manter a capacidade de ligação. Tais compostos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica e serão descritos em maiores detalhes na especificação a seguir.

[000102] Mais particularmente, o anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o derivado consiste em uma proteína de ligação compreendendo uma base sobre a qual pelo menos uma CDR

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31/131 foi enxertada para a conservação das propriedades de reconhecimento paratópicas do anticorpo original.

[000103] Uma ou várias sequências das 6 sequências de CDR descritas na invenção podem estar presentes sobre uma base de proteína. Nesse caso, a base de proteína reproduz a parte principal de proteína com uma duplicação apropriada da(s) CDR(s) enxertada(s), assim, permitindo que as mesmas mantenham suas propriedades de reconhecimento paratópicas do antígeno.

[000104] Aqueles versados na técnica saberão como selecionar a base de proteína sobre a qual pelo menos uma CDR selecionada do anticorpo original poderia ser enxertada. Mais particularmente, sabe-se que, para ser selecionada, tal base deverá mostrar várias características, como segue (Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187):

- boa conservação filogenética,

- arquitetura robusta com uma organização molecular tridimensional bem-conhecida (tal como, por exemplo, cristalografia ou RMN),

- pequeno tamanho

- nenhum ou apenas um baixo grau de modificações póstraducionais,

- facilidade de produzir, expressar e purificar [000105] Tal base de proteína pode ser, mas sem limitação, uma estrutura selecionada do grupo consistindo em fibronectina e, de preferência o décimo domínio de fibronectina do tipo III (FNfn10), lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol, 2001, 74(4): 257-75), o derivado de proteína Z do domínio B de proteína A estafilocócica, tioredoxina A ou qualquer proteína com domínio repetido, tal como repetição de anquirina (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), repetição de armadilo, repetição rica em leucina ou

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32/131 repetição de tetratricopeptídeo.

[000106] Também poderia ser mencionado um derivado de base de toxinas (tal como, por exemplo, toxinas de escorpião, inseto, planta ou molusco) ou inibidores de proteína de sintase de óxido nítrico neuronal (PIN).

[000107] Como um exemplo não limitativo de tais construções híbridas pode ser mencionada a inserção da CDR-H1 (cadeia pesada) de um anticorpo anti-CD4, isto é, o anticorpo 13B8.2, em um dos loops expostos da PIN. As propriedades de ligação da proteína de ligação obtida permanecem similares ao anticorpo original (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). Também pode ser mencionada a enxertagem da CDR-H3 (cadeia pesada) de um anticorpo antilisozima VHH sobre um loop da neocarzinostatina (Nicaise et al., 2004).

[000108] No caso da presente invenção, uma CDR interessante a ser conservada poderia ser, sem limitação, CDR-L2, uma vez que ela é conservada em dois anticorpos idênticos da invenção, isto é, 227H1 e 224G11.

[000109] Conforme mencionado acima, tal base de proteína pode compreender de 1 a 6 CDR(s) do anticorpo original. Em uma modalidade preferida, mas sem qualquer limitação, aqueles versados na técnica poderiam selecionar pelo menos uma CDR da cadeia pesada, a referida cadeia pesada sendo conhecida por estar particularmente envolvida na especificidade do anticorpo. A seleção da(s) CDR(s) será evidente para aqueles versados na técnica através de um método conhecido (BES et al., FEBS letters 508, 2001,67-74).

[000110] Como uma evidência, esses exemplos não são limitativos e qualquer outra base conhecida ou descrita deve ser incluída na presente especificação.

[000111] De acordo com um novo aspecto, a presente invenção refere-se um ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que ele

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33/131 é escolhida dos ácido nucleicos a seguir:

a) um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica um anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais, de acordo com a invenção;

b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA selecionado do grupo de sequências de:

- uma sequência de ácido nucleico compreendendo as sequências SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26 e as sequências SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 e SEQ ID No. 35;

- uma sequência de ácido nucleico compreendendo as sequências SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29 e as sequências SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 34 e SEQ ID No. 37;

- uma sequência de ácido nucleico compreendendo as sequências SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 32 e as sequências SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 39 e SEQ ID No. 40; e

- uma sequência de ácido nucleico compreendendo as sequências SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 66 e as sequências SEQ ID No. 67, SEQ ID No. 68 e SEQ ID No. 69;

c) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo de sequências consistindo em:

- uma sequência de ácido nucleico compreendendoas sequências SEQ ID No. 41 e SEQ ID No. 44;

- uma sequência de ácido nucleico compreendendoas sequências SEQ ID No. 42 e SEQ ID No. 45;

- uma sequência de ácido nucleico compreendendoas sequências SEQ ID No. 43 e SEQ ID No. 46, e

- uma sequência de ácido nucleico compreendendoas sequências SEQ ID No. 70 e SEQ ID No. 71;

d) Os ácidos nucleicos de RNA correspondentes aos ácidos nucleicos conforme definido em b) ou c);

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e) os ácidos nucléicos complementares aos ácidos nucléicos conforme definido em a), b) e c); e

f) um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos, capaz de se hibridizar, sob condições de alta estringência, com pelo menos uma das CDRs de sequências SEQ ID Nos. 24 a 40 e 64 a 69. [000112] Por ácido nucleico, nucleico ou sequência de ácido nucleico, polinucleotídeo, oligonucleotídeo, sequência de polinucleotídeo, sequência de nucleotídeo, termos os quais serão empregados indiferentemente na presente invenção, entende-se uma ligação precisa de nucleotídeos, a qual pode ser modificada ou não modificada, que permite que um fragmento ou uma região de um ácido nucleico seja definida, contendo ou não contendo nucleotídeos nãonaturais e sendo capaz de corresponder a um DNA fita dupla, um DNA fita simples, bem como aos produtos de transcrição dos referidos DNAs.

[000113] Deve também ser entendido aqui que a presente invenção não refere-se à sequências de nucleotídeo em seu ambiente cromossômico natural, isto é, no estado natural. Ela refere-se à sequências as quais foram isoladas e/ou purificadas, isto é, elas foram selecionadas direta ou indiretamente, por exemplo, através de cópia, seu ambiente tendo sido pelo menos parcialmente modificado. Assim, da mesma forma, ela se destina a indicar aqui os ácidos nucleicos isolados obtidos através de recombinação genética, por exemplo, por meio de células hospedeiras ou obtidos através de síntese química.

[000114] Uma hibridização sob condições de alta estringência significa que as condições de temperatura e condições de resistência iônica são escolhidas de uma forma tal que elas permitem a manutenção da hibridização entre dois fragmentos de DNA complementar. À guisa de ilustração, condições de alta estringência da etapa de hibridização para fins de definição dos fragmentos de

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35/131 polinucleotídeo descritos acima são, vantajosamente, as seguintes. [000115] A hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA é realizada em duas etapas: (1) pré-hibridização a 42°C durante 3 horas em tampão de fosfato (a 20 mM, pH de 7,5) contendo 5 x SSC (1 x SSC corresponde a NaCl a 0,15 M + solução de citrato de sódio a 0,015 M), 50 % de formamida, 7 % de dodecil sulfato de sódio (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de sulfato de dextrano e 1 % de DNA de esperma de salmão; (2) hibridização real durante 20 horas em uma temperatura dependente do tamanho da sonda (isto é : 42°C, para um tamanho de sonda > 100 nucleotídeos) seguido por 2 lavagens de 20 minutos a 20°C em 2 x SSC + 2% de SDS, 1 lavagem de 20 minutos a 20°C em 0,1 x SSC + 0,1 % de SDS. A última lavagem é realizada em 0,1 x SSC + 0,1 % de SDS durante 30 minutos a 60°C para um tamanho de sonda > 100 nucleotídeos. As condições de hibridização de alta estringência descritas acima para um polinucleotídeo de tamanho definido podem ser adaptadas por aqueles versados na técnica para oligonucleotídeos de maior ou menor tamanho, de acordo com o ensinamento de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2^a Ed. Cold Spring Harbor).

[000116] A invenção, da mesma forma, refere-se a um vetor compreendendo um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[000117] A invenção direciona especificamente a vetores de clonagem e/ou vetores de expressão, os quais contêm uma sequência de nucleotídeo de acordo com a invenção.

[000118] Os vetores de acordo com a invenção contêm, de preferência, elementos os quais permitem a expressão e/ou a secreção das sequências de nucleotídeo em uma determinada célula hospedeira. O vetor deve, portanto, conter um promotor, sinais de início e término de tradução, bem como regiões apropriadas de

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36/131 regulação de transcrição. Ele deve ser capaz de ser mantido de uma maneira estável na célula hospedeira e pode, opcionalmente, ter sinais particulares os quais especificam a secreção da proteína traduzida. Esses diferentes elementos são escolhidos e otimizados por aqueles versados na técnica como uma função da célula hospedeira usada. Para esse efeito, as sequências de nucleotídeo de acordo com a invenção podem ser inseridas em vetores de reprodução autônoma no hospedeiro escolhido ou ser vetores integrativos do hospedeiro escolhido.

[000119] Tais vetores são preparações através de métodos atualmente usados por aqueles versados na técnica e os clones resultantes podem ser introduzidos em um hospedeiro apropriado através de métodos-padrão, tais como lipofecção, eletroporação, choque térmico ou métodos químicos.

[000120] Os vetores de acordo com a invenção são, por exemplo, vetores de origem plasmídica ou viral. Eles são úteis para transformação de células hospedeiras de forma a clonar ou expressar as sequências de nucleotídeo de acordo com a invenção.

[000121] A invenção, da mesma forma, compreende as células hospedeiras transformadas por ou compreendendo um vetor de acordo com a invenção.

[000122] A célula hospedeira pode ser escolhida de sistemas procariotas ou eucariotas, por exemplo, células bacterianas mas, da mesma forma, células de levedo ou células animais, em particular células de mamífero. Da mesma forma, é possível usar células de inseto ou células de planta.

[000123] A invenção, da mesma forma, refere-se a animais, exceto o homem, os quais compreendem pelo menos uma célula transformada de acordo com a invenção.

[000124] De acordo com outro aspecto, um assunto da invenção é

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37/131 um processo para a produção de um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que ele compreende os seguintes estágios:

a) cultura em um meio e condições de cultura apropriadas de uma célula hospedeira de acordo com a invenção; e

b) a recuperação dos referidos anticorpos ou um de seus fragmentos funcionais assim produzidos começando a partir do meio de cultura ou das referidas células cultivadas.

[000125] As células transformadas de acordo com a invenção podem ser usadas em processos para preparo de polipeptídeos recombinantes de acordo com a invenção. Os processos para preparo de um polipeptídeo de acordo com a invenção na forma recombinante, caracterizado pelo fato de que eles empregam um vetor e/ou uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção são, em si, compreendidos na presente invenção. De preferência, uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção é cultivada sob condições as quais permitem a expressão do referido polipeptídeo e o referido peptídeo recombinante é recuperado.

[000126] Conforme foi dito, a célula hospedeira pode ser escolhida de sistemas procariotas ou eucariotas. Em particular, é possível identificar sequências de nucleotídeo de acordo com a invenção que facilitam a secreção em tal sistema procariota ou eucariota. Um vetor de acordo com a invenção trazendo tal sequência pode, portanto, vantajosamente, ser usado para a produção de proteínas recombinantes destinadas a serem secretadas. Na realidade, a purificação dessas proteínas recombinantes de interesse será facilitada pelo fato de que elas estão presentes no sobrenadante da cultura de célula ao invés de no interior das células hospedeiras.

[000127] Da mesma forma, é possível preparar os polipeptídeos de acordo com a invenção através de síntese química. Tal processo de

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38/131 preparo é, da mesma forma, um assunto da invenção. Aqueles versados na técnica conhecerão os processos de síntese química, por exemplo, as técnicas empregando fases sólidas [Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2^a ed., (1984)] ou técnicas usando fases sólidas parciais, através de condensação de fragmentos ou através de uma síntese clássica em solução. Os polipeptídeos obtidos através de síntese química e sendo capazes de conter aminoácidos não-naturais correspondentes são, da mesma forma, compreendidos na invenção.

[000128] Os anticorpos ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais capazes de serem obtidos através de um processo de acordo com a invenção são, da mesma forma, compreendidos na presente invenção.

[000129] A invenção também refere-se ao anticorpo da invenção como um medicamento.

[000130] A invenção, da mesma forma, refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo, como forma de princípio ativo, um composto consistindo em um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção, de preferência, misturado com um excipiente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

[000131] Outra modalidade complementar da invenção consiste em uma composição tal como descrito acima a qual compreende, além disso, como um produto combinado para uso simultâneo, separado ou sequencial, um anticorpo antitumoral.

[000132] Mais preferivelmente, o referido segundo anticorpo antitumoral poderia ser escolhido de anticorpos anti-IGF-IR, antiEGFR, anti-HER2/neu, anti-VEGFR, anti-VEGF, etc., ou quaisquer outros anticorpos antitumorais conhecidos por aqueles versados na técnica. É evidente que o uso, como segundo anticorpo, de fragmentos ou derivados funcionais dos anticorpos mencionados acima é parte da

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39/131 invenção.

[000133] Como um anticorpo mais preferido, anticorpos anti-EGFR são selecionados tal como, por exemplo, o anticorpo C225 (Erbitux).

[000134] Uso simultâneo deve ser entendido como significando a administração dos dois compostos da composição de acordo com a invenção em uma forma farmacêutica única e idêntica.

[000135] Uso separado deve ser entendido como significando a administração, ao mesmo tempo, dos dois compostos da composição de acordo com a invenção em formas farmacêuticas distintas.

[000136] Uso sequencial deve ser entendido como significando a administração sucessiva dos dois compostos da composição de acordo com a invenção, cada um em uma forma farmacêutica distinta.

[000137] De um modo geral, a composição de acordo com a invenção aumenta consideravelmente a eficácia do tratamento de câncer. Em outras palavras, o efeito terapêutico dos anticorpos anti-cMet de acordo com a invenção é potencializado de uma maneira inesperada através da administração de um agente citotóxico. Outra principal subsequente vantagem produzida por uma composição de acordo com a invenção refere-se à possibilidade de uso de menores doses eficazes de princípio ativo, o que permite os riscos de aparecimento de efeitos secundários sejam evitados ou sejam reduzidos, em particular os efeitos do agente citotóxico.

[000138] Além disso, essa composição de acordo com a invenção permitirá que o efeito terapêutico esperado seja obtido mais rapidamente.

[000139] A composição da invenção também pode ser caracterizada pelo fato de que ela compreende, além disso, como um produto combinado para uso simultâneo, separado ou sequencial, um agente citotóxico/citostático.

[000140] Por agentes terapêuticos anticâncer ou agentes

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40/131 citotóxicos/citoestáticos entende-se uma substância a qual, quando administrada a um indivíduo, trata ou previne o desenvolvimento de câncer no corpo do indivíduo. Como um exemplo não limitativo de tais agentes, podem ser mencionados agentes de alquilação, antimetabólitos, antibióticos antitumor, inibidores mitóticos, inibidores de função de cromatina, agentes antiangiogênese, antiestrogênios, antiandrogênios ou imunomoduladores.

[000141] Tais agentes são, por exemplo, citados na edição de 2001 de VIDAL, na página destinada aos compostos relacionados à coluna de cancerologia e hematologia Citotóxicos, esses compostos citotóxicos citados por referência a esse documento são citados aqui como agentes citotóxicos preferidos.

[000142] Mais particularmente, os seguintes agentes são preferidos de acordo com a invenção.

[000143] Agente de alquilação refere-se a qualquer substância a qual pode se reticula ou alquilar qualquer molécula, de preferência. ácido nucleico (por exemplo, DNA), dentro de uma célula. Exemplos de agente de alquilação incluem mostarda de nitrogênio, tal como mecloretamina, clorambucol, melfaleno, cloridrato, pipobromeno, prednimustina, fosfato dissódico ou estramustina; oxazoforinas, tais como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida ou ifosfamida; aziridinas ou imina-etilenos, tais como, tiotepa, trietilenamina ou altetramina; nitrosoureia, tal como carmustina, estreptozocina, fotemustina ou lomustina; sulfonatos de alquila, tais como, bussulfano, treossulfano ou improssulfano; triazenos, tal como dacarbazina; ou complexos de platina, tais como cis-platina, oxaliplatina e carboplatina.

[000144] Anti-metabólitos refere-se à substâncias que bloqueiam o crescimento celular e/ou metabolismo através de interferência com determinadas atividades, usualmente síntese de DNA. Exemplos de

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41/131 anti-metabólitos incluem metotrexato, 5-fluoruracila, floxuridina, 5fluorodeoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, arabinosídeo de citosina, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodeoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, deóxicoformicina e pentostatina.

[000145] Antibióticos antitumor refere-se a compostos os quais podem prevenir ou inibir a síntese de DNA, RNA e/ou proteína. Exemplos de antibióticos antitumor incluem doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina e procarbazina.

[000146] Inibidores mitóticos impedem a progreção normal do ciclo celular e mitose. Em geral, inibidores de microtúbulo ou taxoides, tais como paclitaxel e docetaxel são capazes de inibir a mitose. Vinca alcaloides, tais como vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina, também são capazes de inibir a mitose.

[000147] Inibidores da função de cromatina ou inibidores de topoisomerase refere-se a substâncias as quais inibem a função normal de proteínas de modelamento de cromatina, tais como topoisomerase I ou topoisomerase II. Exemplos de inibidores de função de cromatina incluem, para topoisomerase I, camptotecina e seus derivados, tais como topotecano ou irinotecano e, para topoisomerase II, etoposídeo, fosfato de etoposídeo e teniposídeo.

[000148] Agente antiangiogênese refere-se a qualquer fármaco, composto, substância ou agente o qual inibe o crescimento de vasos sanguíneos. Agentes antiangiogênese exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, razoxina, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, BMS-275291, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, esqualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974, interleucina-12, IM862, angiostatina e vitaxina.

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42/131 [000149] Antiestrogênio ou agente antiestrogênico refere-se a qualquer substância a qual reduz, antagozina ou inibe a ação do estrogênio. Exemplos de agentes antiestrogênio são tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno, anastrozola, letrozola e exemestano.

[000150] Antiandrogênios ou agente antiandrogênio refere-se a qualquer substância a qual reduz, antagoniza ou inibe a ação de um androgênio. Exemplos de antiandrogênio são flutamida, nilutamida, bicalutamida, esprironolactona, acetato de ciproterona, finasterida e cimitidina.

[000151] Imunomoduladores são substâncias as quais estimulam o sistema imune. Exemplos de imunomoduladores incluem, interferon, interleucina, tal como aldesleucina, OCT-43, denileucina diflitox e interleucina-2, fatores de necrose tumoral, tal como tasonermina ou outros moduladores, tais como lentinano, sizofirano, roquinimex, pidotimod, pegademase, timopentina, poli I:C ou levamisola em conjunto com 5-fluorouracila.

[000152] Para maiores detalhes, aqueles versados na técnica poderiam se referir ao manual editado pela the Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique e intitulado Traité de chimie thérapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edição TEC & DOC, 2003.

[000153] Também podem ser mencionados como agentes químicos ou agentes citotóxicos todos os inibidores de quinase tais como, por exemplo, gefitinib ou erlotinib.

[000154] Em uma modalidade particularmente preferida, a referida composição como um produto combinado de acordo com a invenção é caracterizada pelo fato de que o referido agente citotóxico é acoplado quimicamente ao referido anticorpo para uso simultâneo.

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43/131 [000155] De forma a facilitar o acoplamento entre o referido agente citotóxico e o referido anticorpo de acordo com a invenção, é especialmente possível introduzir moléculas espaçadoras entre os dois compostos a serem acoplados, tais como (poli)alquileno glicóis, tal como polietileno glicol ou mesmo aminoácidos ou, em outra modalidade, usar derivados ativos dos referidos agentes citotóxicos nos quais foram introduzidas funções capazes de reação com o referido anticorpo de acordo com a invenção. Esses métodos de acoplamento são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica e não serão expandidos na presente descrição.

[000156] A invenção refere-se, em outro aspecto, a uma composição caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos referidos anticorpos ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais é conjugado com uma toxina celular e/ou um radioelemento.

[000157] De preferência, a referida toxina ou o referido radioelemento é capaz de inibir pelo menos uma atividade celular de células expressando a c-Met, de uma maneira mais preferida capaz de prevenir o crescimento ou a proliferação da referida célula, especialmente de inativar totalmente a referida célula.

[000158] De preferência também, a referida toxina é uma toxina enterobacteriana, especialmente exotoxina A de Pseudomonas.

[000159] Os radioelementos (ou radioisótopos), de preferência conjugados aos anticorpos empregados para a terapia, são radioisótopos os quais emitem raios gama e, de preferência, iodo¹³¹, ítrio⁹⁰, ouro¹⁹⁹, paládio¹⁰⁰, cobre⁶⁷, bismuto²¹⁷ e antimônio²¹¹. Os radioisótopos os quais emitem raios beta e alfa podem, da mesma forma, ser usados para a terapia.

[000160] Por toxina ou radioelemento conjugado a pelo menos um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção, entende-se qualquer meio que permite que a referida toxina

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44/131 ou o referido radioelemento se liguem ao referido pelo menos um anticorpo, especialmente através de acoplamento covalente entre os dois compostos, com ou sem a introdução de uma molécula de ligação.

[000161] Dentre os agentes que permitem a ligação de uma maneira química (covalente), eletroestática ou não-covalente de todos ou parte dos componentes do conjugado, menção pode ser particularmente feita a benzoquinona, carbodiimida e mais particularmente EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, ácido ditiobis-nitrobenzoico (DTNB), tioacetato de Nsuccinimidil S-acetila (SATA), os agentes de ligação em ponte tendo um ou mais grupos fenilazida que reagem com raios ultravioleta (U.V.) e, de preferência, N-[-4-(azidosalicilamino)butil]-3'-(2-piridilditio)propionamida (APDP), 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP), 6-hidrazino-nicotinamida (HYNIC).

[000162] Outra forma de acoplamento, especialmente para os radioelementos, pode consistir no uso de um quelante de íons bifuncional.

[000163] Dentre esses quelatos, é possível mencionar os quelatos derivados de EDTA (ácido etilenodiaminatetra-acético) ou de DTPA (ácido dietilenetriaminapenta-acético), os quais foram desenvolvidos para ligação de metais, especialmente metais radioativos e imunoglobulinas. Assim, DPA e seus derivados podem ser substituídos por diferentes grupos sobre a cadeia de carbono de forma a aumentar a estabilidade e a rigidez do completo de ligante-metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); Patente US 4.831.175).

[000164] Por exemplo, ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA) e seus derivados, os quais têm sido usados amplamente em medicina e em biologia há muito tempo em sua forma livre ou na forma de um

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45/131 complexo com um íon metálico, tem a característica acentuada de formação de quelatos estáveis com íons metálicos e de ser acoplado com proteínas de interesse terapêutico ou diagnóstico, tais como anticorpos para o desenvolvimento de radioimunoconjugados em terapia de câncer (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)).

[000165] Da mesma forma, de preferência, o referido pelo menos um anticorpo que forma o referido conjugado de acordo com a invenção é escolhido de seus fragmentos funcionais, especialmente dos fragmentos com deleção de seu componente Fc, tais como os fragmentos scFv.

[000166] Conforme já mencionado, em uma modalidade preferida da invenção, o referido agente citoestático/citotóxico e a referida toxina e/ou um radioelemento é acoplado quimicamente a pelo menos um dos elementos da referida composição para uso simultâneo.

[000167] A presente invenção compreende a composição descrita como um medicamento.

[000168] A presente invenção, além disso, compreende o uso da composição de acordo com a invenção para o preparo de um medicamento.

[000169] Em outro aspecto, a invenção lida com o uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais e/ou de uma composição conforme descrito acima para o preparo de um medicamento destinado a inibir o crescimento e/ou a proliferação de células tumorais.

[000170] Outro aspecto da invenção consiste no uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais e/ou de uma composição conforme descrito acima ou do uso mencionado acima para o preparo de um medicamento destinado à prevenção ou ao tratamento de câncer.

[000171] Também é compreendido na presente invenção um método

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46/131 destinado a inibir o crescimento e/ou a proliferação de células tumorais em um paciente compreendendo a administração, a um paciente que precisa do mesmo, de um anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais de acordo com a invenção, de um anticorpo produzido através de um hibridoma de acordo com a invenção ou uma composição de acordo com a invenção.

[000172] A presente invenção ainda compreende um método para a prevenção ou o tratamento de câncer em um paciente que precisa do mesmo compreendendo a administração, ao paciente, de um anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados funcionais de acordo com a invenção, de um anticorpo produzido por um hibridoma de acordo com a invenção ou uma composição de acordo com a invenção.

[000173] Em um aspecto preferido particular, o referido câncer é um câncer escolhido de câncer de próstata, osteosarcomas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, glioblastoma ou câncer de cólon.

[000174] Conforme explicado antes, uma vantagem da invenção é permitir o tratamento de cânceres relacionados à ativação de Met dependentes e independentes de HGF.

[000175] A invenção, em ainda outro aspecto, abrange um método de diagnóstico in vitro de enfermidades induzidas por uma superexpressão ou uma subexpressão do receptor de c-Met começando a partir de uma amostra biológica na qual a presença anormal do receptor de c-Met é suspeita, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que ele compreende uma etapa em que a referida amostra biológica é contatada com um anticorpo da invenção, sendo possível que o referido anticorpo seja, se necessário, rotulado.

[000176] De preferência, a referida enfermidade relacionada à presença anormal do receptor de c-Met no referido método diagnóstico será câncer.

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47/131 [000177] O referido anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais pode estar presente na forma de um imunoconjugado ou de um anticorpo rotulado, de modo a obter um sinal detectável e/ou quantificável.

[000178] Os anticorpos rotulados de acordo com a invenção ou seus fragmentos funcionais incluem, por exemplo, anticorpos denominados imunoconjugados os quais podem ser conjugados, por exemplo, com enzimas tais como peroxidase, fosfatase alcalina, beta-Dgalactosidase, oxidase de glicose, amilase de glicose, anidrase carbônica, acetilcolinesterase, lisozima, de-hidrogenase de malato ou de-hidrogenase de 6-fosfato de glicose ou por uma molécula, tal como biotina, digoxigenina ou 5-bromodeoxiuridina. Rótulos fluorescentes podem, da mesma forma, ser conjugados aos anticorpos ou seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção e incluem especialmente fluoresceína e seus derivados, fluorocromo, rodamina e seus derivados, GFP (GFP para Proteína Fluorescente Verde), dansila, unbeliferona, etc. Em tais conjugados, os anticorpos da invenção ou seus fragmentos funcionais podem ser preparados através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Eles podem ser acoplados a enzimas ou aos rótulos fluorescentes diretamente ou por intermédio de um grupo espaçador ou de um grupo de ligação, tal como um polialdeído, tal como glutaraldeído, ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA), ácido dietileno-triaminapentaacético (DPTA) ou na presença de agentes de acoplamento, tais como aqueles mencionados acima para os conjugados terapêuticos. Os conjugados contendo rótulos do tipo fluoresceína podem ser preparados através de reação com um isotilcianato.

[000179] Outros conjugados podem, da mesma forma, incluir rótulos quimioluminescentes, tais como luminol e os dioxetanos, rótulos bioluminescentes, tais como luciferase e luciferina ou mesmo rótulos

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48/131 radioativos, tais como iodo¹²³, iodo¹²⁵, iodo¹²⁶, iodo¹³³, bromo, tecnécio^99m, índio¹¹¹, índio^113m, gálio⁶⁷, gálio⁶⁸, ruténio⁹⁵, ruténio⁹⁷, ruténio¹⁰³, ruténio¹⁰⁵, mercúrio¹⁰⁷, mercúrio²⁰³, rênio^99m, rênio¹⁰¹, rênio¹⁰⁵, escândio⁴⁷, telúrio^121m, telúrio^122m, telúrio^125m, túlio¹⁶⁵, túlio¹⁶⁷, túlio¹⁶⁸, flúor¹⁸, ítrio¹⁹⁹, iodo¹³¹. Os métodos conhecidos por aqueles versados na técnica existentes para acoplamento dos radioisótopos terapêuticos aos anticorpos, seja diretamente ou através de um agente quelante tal como EDTA, DTPA mencionados acima podem ser usados para os radioelementos os quais podem ser usados em diagnóstico. Da mesma forma, é possível mencionar rotulação com Na[I¹²⁵] através do método com cloramina T [Hunter W.M. e Greenwood F.C. (1962) Nature 194: 495] ou mesmo com tecnécio^99matravés da técnica de Crockford et al. (Patente US 4.424.200) ou ligação através de DTPA, conforme descrito por Hnatowich (Patente US 4.479.930).

[000180] Assim, os anticorpos ou seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção podem ser empregados em um processo para a detecção e/ou a quantificação de uma superexpressão ou de uma subexpressão, de preferência uma superexpressão do receptor de cMet em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que ele compreende as seguintes etapas:

a) o contato da amostra biológica com um anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção; e

b) a demonstração do completo de anticorpo/c-Met possivelmente formado.

[000181] Em uma modalidade particular, os anticorpos ou seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção podem ser empregados em um processo para a detecção e/ou a quantificação do receptor de c-Met em uma amostra biológica, para o monitoramento da eficácia de um tratamento terapêutico e/ou profilático de um câncer

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49/131 dependente de c-Met.

[000182] Mais geralmente, os anticorpos ou seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção podem ser vantajosamente empregados em qualquer situação onde a expressão do receptor de cMet deve ser observada de uma maneira qualitativa e/ou quantitativa. [000183] De preferência, a amostra biológica é formada por um fluído biológico, tal como soro, sangue íntegro, células, uma amostra tecidual ou biópsias de origem humana.

[000184] Qualquer procedimento ou teste convencional pode ser empregado de forma a realizar tal detecção e/ou dosagem. O referido teste pode ser um teste de competição ou em sanduich ou qualquer teste conhecido por aqueles versados na técnica dependente da formação de um complexo imune do tipo anticorpo-antígeno. Seguindo as aplicações de acordo com a invenção, o anticorpo ou seus fragmentos funcionais podem ser imobilizados ou rotulados. Essa imobilização pode ser realizada sobre numerosos suportes conhecidos por aqueles versados na técnica. Esses suportes podem incluir especialmente vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon ou células naturais ou modificadas. Esses suportes podem ser solúveis ou insolúveis.

[000185] À guisa de exemplo, um método preferido leva a processos imunoenzimáticos de acordo com a técnica ELISA, através de imonofluorescência ou da técnica de radioimunoensaio (RIA) ou equivalente.

[000186] Assim, a presente invenção, da mesma forma, compreende os kits ou conjuntos necessários para a realização de um método de diagnóstico de enfermidades induzidas por uma superexpressão ou uma subexpressão do receptor de c-Met ou para realização de um processo para a detecção e/ou a quantificação de uma superexpressão ou uma subexpressão do receptor de c-Met. Em uma

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50/131 amostra biológica, de preferência, uma superexpressão do referido receptor caracterizado pelo fato de que o referido kit ou conjunto compreende os seguintes elementos:

a) um anticorpo ou seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção;

b) opcionalmente, os reagentes para a formação do meio favorável à reação imunológica;

c) opcionalmente, os reagentes que permitem a demonstração de complexos de anticorpo/c-Met produzidos pela reação imunológica.

[000187] Um assunto da invenção é, da mesma forma, o uso de um anticorpo ou uma composição de acordo com a invenção para o preparo de um medicamento destinado ao direcionamento específico de um composto biologicamente ativo à células expressando ou superexpressando o receptor de c-Met.

[000188] Entende-se aqui por composto biologicamente ativo qualquer composto capaz de modular, especialmente de inibir a atividade celular, em particular, seu crescimento, sua proliferação, transcrição ou tradução gênica.

[000189] Um assunto da invenção é também um reagente diagnóstico in vivo compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção ou seus fragmentos funcionais, de preferência rotulado, especialmente radiorrotulado e seu uso em formação de imagem médica, em particular, para detecção de câncer relacionado à expressão ou superexpressão, por uma célula, do receptor de c-Met.

[000190] A invenção, da mesma forma, refere-se a uma composição como um produto combinado ou a um conjugado ou radioelementos de toxina/anti-c-Met de acordo com a invenção como um medicamento.

[000191] De preferência, a referida composição como um produto

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51/131 combinado ou o referido conjugado de acordo com a invenção será misturado com um excipiente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

[000192] Na presente descrição, veículo farmaceuticamente aceitável se destina a indicar um composto ou uma combinação de compostos que entram em uma composição farmacêutica sem provocar reações secundárias e o qual permite, por exemplo, facilitação da administração do(s) composto(s) ativo(s), um aumento em sua expectativa de vida e/ou em sua eficácia no corpo, um aumento em sua solubilidade em solução ou mesmo um aprimoramento em sua conservação.

[000193] Esses veículos farmaceuticamente aceitáveis são bemconhecidos e será adaptados por aqueles versados na técnica como uma função da natureza e/ou do modo de administração do(s) composto(s) ativo(s) escolhido(s).

[000194] De preferência, esses compostos serão administrados através da via sistêmica, em particular através da via intravenosa, através da via intramuscular, intradérmica, intraperitoneal ou subcutânea ou através da via oral. De uma maneira mais preferida, a composição compreendendo os anticorpos de acordo com a invenção será administrada várias vezes, de uma maneira sequencial.

[000195] Seus modos de administração, dosagens e formas farmacêuticas ótimas podem ser determinados de acordo com critérios geralmente levados em conta no estabelecimento de um tratamento adaptado a um paciente tal como, por exemplo, a idade ou o peso corporal do paciente, a gravidade de sua condição geral, a tolerância ao tratamento e os efeitos secundários notados.

[000196] Outras características e vantagens da invenção aparecerão na continuação da descrição com os exemplos e as figuras, em que: [000197] Figura 1: exemplos de perfis por FACS dos anticorpos anti

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52/131 c-Met selecionados;

[000198] Figuras 2 A e 2B: inibição in vitro de proliferação de BXPC3 por anticorpos que objetivam c-Met;

[000199] Figura 3: inibição de dimerização de c-Met;

[000200] Figura 4: reconhecimento de proteína por anticorpos anti-cMet;

[000201] Figuras 5A e 5B: Mapeamento de epítopo de 11E1 e 5D5 através de análise BIAcore;

[000202] Figuras 6A e 6B: efeito de MAbs sobre a fosforilação de cMet;

[000203] Figuras 7A e 7B: deslocamento de HGF rádio-rotulada por anticorpos anti-c-Met;

[000204] Figura 8: inibição de invasão por anticorpos anti-c-Met [nessa Figura, SVF significa Soro Fetal de Bezerro (FCS)];

[000205] Figura 9: efeito de anticorpos anti-c-Met sobre a cicatrização de ferimentos;

[000206] Figuras 10A e 10B: ensaio de dispersão;

[000207] Figura 11: ensaio de tubulogênese tridimensional;

[000208] Figuras 12A e 12B: efeito de anticorpos sobre a formação de esferoide;

[000209] Figura 13: atividade in vivo de Mabs anti-c-Met no modelo de xenoenxerto U87MG;

[000210] Figura 14: expressão de HGF por um conjunto de linhagens de células tumorais;

[000211] Figuras 15A e 15B: caracterização da linhagem de célula NCI-H441; com a Figura 15A correspondendo à análise de RT-PCR quantitativa e a Figura 15B correspondendo à análise por FACS ;

[000212] Figura 16: atividade in vivo de anticorpos anti-c-Met sobre o modelo de xenoenxerto NCI-H441;

[000213] Figura 17A: alinhamento de VL de 224G11 ao gene de

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53/131 linhagem germinativa de murino IGKV3-5*01;

[000214] Figura 17B: alinhamento de VL de 224G11 ao gene de linhagem germinativa de murino IGKJ4*01;

[000215] Figura 18A: alinhamento de VL de 224G11 aos genes de linhagem germinativa humana IGKV3-11*01 e IGKV4-1*01;

[000216] Figura 18B: alinhamento de VL de 224G11 ao gene de linhagem germinativa humana IGKJ4*02;

[000217] Figura 19A: versão humanizada baseada em IGKV3-11*01 de VL de 224G11 com mutações mencionadas;

[000218] Figura 19B: versão humanizada baseada em IGKV4-1*01 de VL de 224G11 com mutações mencionadas;

[000219] Figura 20A: alinhamento de VH de 224G11 ao gene de linhagem germinativa de murino IGHV1-18*01;

[000220] Figura 20B: alinhamento de VH de 224G11 ao gene de linhagem germinativa de murino IGHD2-4*01;

[000221] Figura 20C: alinhamento de VH de 224G11 ao genede linhagem germinativa de murino IGHJ2*01;

[000222] Figura 21A: alinhamento de VH de 224G11 ao genede linhagem germinativa humana IGHVl-2*02;

[000223] Figura 2IB: alinhamento de VH de 224G11 ao genede linhagem germinativa humana IGHJ4*01;

[000224] Figura 22: VH de 224G11 humanizada com mutações mencionadas;

[000225] Figura 23A: alinhamento de VL de 227H1 ao genede linhagem germinativa de murino IGKV3-5*01;

[000226] Figura 23B: alinhamento de VL de 227H1 ao genede linhagem germinativa de murino IGKJ4*01;

[000227] Figura 24A: alinhamento de VL de 227H1 ao genede linhagem germinativa humana IGKV3-11*01 e IGKV4-1*01;

[000228] Figura 24B: alinhamento de VL de 227H1 ao genede

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54/131 linhagem germinativa humana IGKJ4*02;

[000229] Figura 25A: versão humanizada baseada IGKV3-11*01 da

VL de 227H1 com mutações mencionadas;

[000230] Figura 25B: versão humanizada baseada IGKV4-1*01 da

VL de 227H1 com mutações mencionadas;

[000231] Figura 26A: alinhamento de VH de 227H1 ao genede linhagem germinativa de murino IGHV1-18*01;

[000232] Figura 26B: alinhamento de VH de 227H1 ao genede linhagem germinativa de murino IGHD1-1*02;

[000233] Figura 26C: alinhamento de VH de 227H1 ao genede linhagem germinativa de murino IGHJ2*01;

[000234] Figura 27A: alinhamento de VH de 227H1 ao gene de linhagem germinativa humana IGHV1-2*02;

[000235] Figura 27B: alinhamento de VH de 227H1 ao gene de linhagem germinativa humana IGHJ4*01;

[000236] Figura 28: VH de 227H1 humanizada com mutações mencionadas;

[000237] Figura 29A: alinhamento de VL de 223C4 ao gene de linhagem germinativa de murino IGKV12-46*01;

[000238] Figura 29B: alinhamento de VL de 223C4 ao genede linhagem germinativa de murino IGKJ2*01;

[000239] Figura 30A: alinhamento de VL de 223C4 ao genede linhagem germinativa humana IGKV1-NL1 *01;

[000240] Figura 30B: Alinhamento de VL de 223C4 ao genede linhagem germinativa humana IGKJ2*01;

[000241] Figura 31: VL de 223C4 humanizada com mutações mencionadas;

[000242] Figura 32A: alinhamento de 223C4 VH ao genede linhagem germinativa de murino IGHV1-18*01;

[000243] Figura 32B: alinhamento de 223C4 VH ao genede

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55/131 linhagem germinativa de murino IGHD6-3*01;

[000244] Figura 32C: alinhamento de 223C4 VH ao gene de linhagem germinativa de murino IGHJ4*01;

[000245] Figura 33A: alinhamento de 223C4 VH ao gene de linhagem germinativa humana IGHV1-2*02;

[000246] Figura 33B: alinhamento de 223C4 VH ao gene de linhagem germinativa humana IGHD1-26*01;

[000247] Figura 33C: alinhamento de 223C4 VH ao gene de linhagem germinativa humana IGHJ6*01; e [000248] Figura 34: VH de 223C4 humanizada com mutações mencionadas;

[000249] Figura 35: atividade antitumor do Mab 224G11 de murino isoladamente ou combinado com Navelbine® sobre o modelo de tumor de xenoenxerto NCI-H441 estabelecido;

[000250] Figura 36: avaliação de Mabs anti-c-Met sobre a proliferação de HUVEC;

[000251] Figura 37: avaliação de Mabs anti-c-Met sobre a formação de tubo em HUVEC;

[000252] Figura 38A: alinhamento de VL de 11E1 ao gene de linhagem germinativa de murino IGKV4-79*01;

[000253] Figura 38B: alinhamento de VL de 11E1 ao gene de linhagem germinativa de murino IGKJ4*01;

[000254] Figura 39A: alinhamento de VL de 11E1 ao gene de linhagem germinativa humana IGKV3D-7*01;

[000255] Figura 39B: alinhamento de VL de 11E1 ao gene de linhagem germinativa humana IGKJ4*02;

[000256] Figura 40: versão Humanizada de VL de 11E1 com mutações mencionadas;

[000257] Figura 41A: alinhamento de VH de 11E1 ao gene de linhagem germinativa de murino IGHV1-7*01;

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56/131 [000258] Figura 4IB: alinhamento de VH de 11E1 ao gene de linhagem germinativa de murino IGHD4-1*01;

[000259] Figura 41C: alinhamento de VH de 11E1 ao gene de linhagem germinativa de murino IGHJ3*01;

[000260] Figura 42A: alinhamento de VH de 11E1 aos genes de linhagem germinativa humana IGHV1-2*02 e IGHV1-46*01;

[000261] Figura 42B: alinhamento de VH de 11E1 ao gene de linhagem germinativa humana IGHJ4*03;

[000262] Figura 43: VH de 11E1 humanizada com mutações mencionadas;

[000263] Figuras 44A e 44B: ensaio de fosforilação de c-Met sobre células A549. Avaliação de Mabs purificados 11E1 e 224G11, na ausência ou presença de HGF, a 30 pg/ml (Figura 44A) ou dentro de uma faixa de dose de 0,0015 a 30 pg/ml de forma a determinar os valores de EC50 (Figura 44B);

[000264] Figura 45: combinação in vivo de Mab 224G11com

Navelbine® no modelo de xenoenxerto NCI-H441 em NSCLC;

[000265] Figura 46: combinação in vivo de Mab 224G11com

Doxorubicina no modelo de xenoenxerto NCI-H441 em NSCLC;

[000266] Figura 47: combinação in vivo de Mab 224G11com

Docetaxel no modelo de xenoenxerto NCI-H441 em NSCLC;

[000267] Figura 48: combinação in vivo de Mab 224G11com

Temozolomida no modelo de xenoenxerto NCI-H441 em NSCLC;

[000268] Figuras 49A, 49B, 49C e 49D: efeito de Mabs anti-c-Met sobre o efeito de crescimento de esferoide U87-MG;

[000269] Figuras 50A e 5OB: atividade in vitro de formas quiméricas e humanizadas de 224G11 no ensaio de fosfo-cMet;

[000270] Figura 51: configurações de análise Biacores;

[000271] Figura 52: atividade in vivo de 224G11 sobre células MDAMB-231 coimplantadas com células MRC5 como uma fonte de HGF

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57/131 humana sobre camundongos nus atímicos;

[000272] Figura 53: ensaio de ligação baseado em ELISA ao FccMet. A atividade de ligação anti-Fc-c-Met foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc de murino foram usados para detectar os anticorpos monoclonais de murino purificados 11E1, 224G11 e 227H1. As atividades de ligação dependentes de dose sobre Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico foram medidas a 450 nm;

[000273] Figura 54: ensaio de competição de HGF-cMet. Nesse ensaio baseado em ELISA, a ligação residual de Fc-c-Met recombinante ao HGF revestido sobre plástico na presença de anticorpos monoclonais de murino purificados 11E1, 224G11 e 227H1 foi detectada com um conjugado anti-Fc de murino e medida a 450 nm;

[000274] Figura 55: alinhamento de sequências de aminoácido dos domínios VH recombinantes 227H1-derivados. A sequência de aminoácido de VH de 227H1 é alinhada com a sequência de estrutura principal receptora humana selecionada, com apenas os aminoácidos mencionados que se verificou serem diferentes da sequência VH de 227H1 de murino. As sequências de VH de 227H1 HZ1, HZ2 e HZ3 correspondem às versões humanizadas implementadas do domínio VH de 227H1 de murino, com os resíduos de murino restantes em negrito. Em HZ3, 10 resíduos (*) foram automaticamente trocados por suas contrapartes humanas. Em HZ2, os sete resíduos do terceiro grupo (3) foram estudados. Em HZ1VH, os nove resíduos do segundo grupo (2) sofreram mutação para suas contrapartes humanas, apenas os seis resíduos do primeiro grupo (1) permanecem de murino;

[000275] Figura 56: ensaio de ligação a Fc-c-Met baseado em ELISA de anticorpos 227H1 recombinantes. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados

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58/131 de Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes quiméricos e humanizados 227H1-derivados. As atividades de ligação dependentes de dose sobre Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico de anticorpos 227H1 derivados de domínios VH humanizados foram medidas a 450 nm e, então, comparadas com aquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000276] Figura 57: ensaio de ligação a Fc-c-Met baseado em ELISA de anticorpos 227H1 recombinantes. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados de Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes quiméricos e humanizados 227H1-derivados. As atividades de ligação dependentes de dose sobre Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico do anticorpo 227H1 humanizado HZ4VH-derivado foram medidas a 450 nm e, então, comparadas àquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000277] Figura 58: ensaio de competição de HGF-cMet de anticorpos recombinantes e 227H1 de murino. Nesse ensaio baseado em ELISA, a ligação residual de Fc-cMet recombinante a HGF revestido sobre plástico na presença das diferentes formas do anticorpo 227H1 foi detectada com um anticorpo anti-c-Met biotinilado não relacionado. O anticorpo monoclonal 227H1 purificado de murino, anticorpos quiméricos e 227-H1-derivados humanizados HZ4VHderivados foram testados e comparados com relação à suas capacidades de competir com a ligação HGF-cMet quando medido a 450 nm;

[000278] Figura 59: sequência do domínio variável humanizado de VH de 227H1-HZ. * corresponde aos aminoácidos alterados para suas contrapartes humanas; ! corresponde aos aminoácidos humanizados durante a implementação HZ3 para HZ1; § corresponde aos aminoácidos humanizados no final da sequência VH de 227H1-HZ;

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59/131 [000279] Figura 60: alinhamento de sequências de aminoácido de domínios VH recombinantes 11E1-derivados. A VH da sequência de aminoácido de 11E1 é alinhada com a sequência de estrutura principal receptora humana selecionada, com mencionados apenas os aminoácidos que se descobriu serem diferentes da sequência VH de 11E1 de murino. As sequências HZ VH1, VH2 e VH3 de 11E1 correspondem às versões humanizadas implementadas do domínio VH de 11E1 de murino, com os resíduos de murino restantes em negrito. Em HZ VH3, sete resíduos (*) foram automaticamente trocados por suas contrapartes humanas. Em HZ VH2, os sete resíduos do terceiro grupo (3) foram estudados. Em HZ VH1, os cinco resíduos do segundo grupo (2) sofreram mutação para suas contrapartes humanas, apenas os cinco resíduos do primeiro grupo (1) permanecem de murino;

[000280] Figura 61: ensaio de ligação baseado em ELISA de FccMet a anticorpos recombinantes 11E1. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes quiméricos e humanizados 11E1-derivados. As atividades de ligação dependentes de dose sobre Fc-c-Met revestido sobre plástico de anticorpos 11E1 derivados de domínios VH humanizados foram medidas a 450 nm e, então, comparadas com aquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000281] Figura 62: alinhamento de sequência de aminoácido de domínios VL recombinantes 11E1-derivados. A VL da sequência de aminoácido de 11E1 é alinhada à sequência de estrutura principal receptora humana selecionada, mencionados apenas o aminoácidos que se verificou serem diferentes da VL de murino da sequência de 11E1. As sequências HZ VL1, VL2 e VL3 de 11E1 correspondem às versões humanizadas implementadas do domínio VL de murino de

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11E1, com os resíduos de murino restantes em negrito. Em HZ VL3, dez resíduos (*) foram automaticamente trocados por suas contrapartes humanas. Em HZ VL2, os oito resíduos do terceiro grupo (3) foram estudados. Em HZ VL1, os oito resíduos do segundo grupo (2) sofreram mutação para suas contrapartes humanas, apenas os quatro resíduos do primeiro grupo (1) permanecem de murino;

[000282] Figura 63: ensaio de ligação a Fc-c-Met baseado em ELISA de anticorpos 11E1 recombinantes. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes quiméricos e humanizados 11E1-derivados. As atividades de ligação dependentes de dose sobre Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico de anticorpos 11E1 derivados de domínios VL humanizados foram medida a 450 nm e, então, comparadas àquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000283] Figura 64: ensaio de ligação a Fc-c-Met baseado em ELISA de anticorpos 11E1 recombinantes. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes quiméricos e humanizados 11E1-derivados. As atividades de ligação dependentes de dose a Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico de anticorpos 11E1 derivados de domínios humanizados únicos ou duplos foram medidas a 450 nm e, então, comparadas com aquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000284] Figura 65: alinhamento de sequências de aminoácido de VH da sequência de domínio de 224G11. A sequência de aminoácido de VH de 224G11 é alinhada com à sequência VH de 227H1 (são sublinhados resíduos não-homólogos) e à sequência de estrutura principal receptora humana selecionada, mencionados apenas os aminoácidos que se verificou serem diferentes da sequência VH de

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224G11 de murino. A sequência VH0 de 224G11 HZ corresponde à versão humanizada 227H1-baseada/total-IMGT do domínio VH de

224G11 de murino. Nessa sequência, nenhum resíduo fora das CDRsIMGT permanece de murino;

[000285] Figura 66: ensaio de ligação a Fc-c-Met baseado em ELISA de anticorpos 224G11 recombinantes. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes derivados de 224G11 humanizados e derivados de HZVH0 quiméricos. As atividades de ligação dependentes de dose a Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico do anticorpo 224G11 derivado de domínio VH humanizado HZVH0 total-IMGT foram medidas a 450 nm e, então, comparadas àquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000286] Figura 67: ensaio de competição de HGF-cMet de anticorpos recombinantes e 224G11 de murino. Nesse ensaio baseado em ELISA, a ligação residual de Fc-cMet recombinante ao HGF revestido sobre plástico na presença das diferentes formas do anticorpo 224G11 foi detectada com um anticorpo anti-cMet biotinilado não relacionado. O anticorpo monoclonal 224G11 purificado de murino, anticorpos quiméricos e recombinantes derivados de 224G11 humanizados HZVH0-derivados foram testados e suas capacidades de competir pela ligação com HGF-cMet quando medida a 450 nm;

[000287] Figura 68: alinhamento de sequências de aminoácido de sequências de domínio VL de 224G11. A sequência de aminoácido de VL de 224G11 é alinhada às duas sequências de estrutura principal humanas receptoras selecionadas, mencionados apenas os aminoácidos que se verificou serem diferentes da sequência VL de 224G11 de murino. A sequência Hz VL3 de 224G11 corresponde à versão humanizada com CDR1 mais curta do domínio VH de 224G11

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62/131 de murino, enquanto que HZ VL6 corresponde à versão com CDR1 mais longa, com os resíduos de murino restantes em negrito. Para ambas as versões humanizadas básicas, os resíduos de murino restantes são classificação para um processo de humanização adicional, onde * corresponde aos aminoácidos humanizados nas versões básicas e 3, 2 e 1 correspondem aos grupos de resíduos para o design das versões humanizadas implementadas;

[000288] Figura 69: ensaio de ligação a Fc-c-Met baseado em ELISA de anticorpos 224G11 recombinantes. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes 22G11-derivados quiméricos e humanizados. As atividades de ligação dependentes de dose a Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico de anticorpos 224G11 derivados de domínios VL3 e VL6 humanizados foram medidas a 450 nm e, então, comparadas com aquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000289] Figura 70: ensaio de ligação a Fc-c-Met baseado em ELISA de anticorpos 224G11 recombinantes. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes 224G11-derivados quiméricos e humanizados. As atividades de ligação dependentes de dose a Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico de anticorpos 224G11 derivados de domínios VL humanizados foram medidas a 450 nm e, então, comparadas com aquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000290] Figura 71: ensaio de competição de HGF-cMet de anticorpos recombinantes e 224G11 de murino. Nesse ensaio baseado em ELISA, a ligação residual de Fc-cMet recombinante ao HGF revestido sobre plástico na presença das diferentes formas do anticorpo 224G11 foi detectada com um anticorpo anti-cMet biotinilado

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63/131 não relacionado. Anticorpo monoclonal 224G11 purificado de murino, anticorpos quiméricos e recombinante 224G11-derivado de HZ VL4 foram testados e suas capacidades de competir pela ligação com

HGF-cMet quando medida a 450 nm;

[000291] Figura 72: sequência de aminoácido da sequência de domínio VL VL4 do 224G11 humanizado. * corresponde aos aminoácidos trocados por suas contrapartes humanas na versão HZ VL6 básica; ! corresponde aos aminoácidos humanizados durante a implementação HZ VL6 para HZ VL4; § corresponde aos aminoácidos que permaneceram de murino na sequência VL4 do 224G11-HZ;

[000292] Figura 73: ensaio baseado em ELISA de ligação a Fc-cMet de anticorpos 224G11 recombinantes. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes quiméricos e humanizados 22G11-derivados. As atividades de ligação dependentes de dose sobre Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico de anticorpos 224G11 derivados de domínios humanizados únicos ou duplos foram medidas a 450 nm e, então, comparada com aquelas do anticorpo de origem/de referência;

[000293] Figura 74: ensaio de competição de HGF-cMet de anticorpos recombinantes e 224G11 de murino. Nesse ensaio baseado em ELISA, a ligação residual de Fc-c-Met recombinante ao HGF revestido sobre plástico na presença de diferentes formas do anticorpo 224G11 foi detectada com um anticorpo anti-c-Met biotinilado não relacionado. O anticorpo monoclonal 224G11 de murino purificado, anticorpos quiméricos e recombinantes 224G11-derivados totalmente humanizados foram testados e comparados com relação às suas capacidades de competir com a ligação ao HGF-cMet quando medido a 450 nm;

[000294] Figura 75: ensaio de ligação a Fc-cMet baseado em ELISA

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64/131 de anticorpos recombinantes 224G11. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes quiméricos e humanizados 22G11-5 derivados. As atividades de ligação dependentes de dose sobre Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico de mutantes únicos dos anticorpos 224G11 VL4derivados totalmente humanizados foram medidas a 450 nm e, então, comparadas com aquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência;

[000295] Figura 76: ensaio de ligação a Fc-cMet baseado em ELISA de anticorpos recombinantes 224G11. A atividade de ligação anti-FccMet foi medida em um ensaio baseado em ELISA onde conjugados anti-Fc humana foram usados para detectar anticorpos recombinantes quiméricos e humanizados 22G11-derivados. As atividades de ligação dependentes de dose sobre Fc-c-Met recombinante revestido sobre plástico de mutantes únicos e múltiplos dos anticorpos 224G11 VL4derivado totalmente humanizados foi medida a 450 nm e, então, comparada com aquelas do anticorpo quimérico de origem/de referência; e [000296] Figura 77: ensaio de competição de HGF-cMet de anticorpos recombinantes e 224G11 de murino. Nesse ensaio baseado em ELISA, a ligação residual de Fc-c-Met recombinante ao HGF revestido sobre plástico na presença de diferentes formas do anticorpo 224G11 foi detectada com um anticorpo anti-c-Met biotinilado não relacionado. Anticorpo monoclonal 224G11 de murino purificado, mutantes quiméricos e únicos ou múltiplos dos anticorpos recombinantes 224G11 VL4-derivatizados totalmente humanizados foram testados e comparados com relação à suas capacidades de competir com a ligação de HGF-cMet quando medida a 450 nm.

Exemplo 1: geração de anticorpos contra c-Met

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65/131 [000297] Para gerar anticorpos anti-c-Met, camundongos BALB/c de 8 semanas de idade foram imunizados 3 a 5 vezes subcutaneamente com uma linhagem de célula CHO transfectada que expressa c-Met sobre sua membrana plasmática (20 x 10⁶ células/dose/camundongo) ou 2 a 3 vezes com uma proteína de fusão do domínio extracelular de c-Met (10-15 pg/dose/camundongo) (R&D Systems, Catálogo n° 358MT) ou fragmentos dessa proteína recombinante misturados com adjuvante completo de Freund para a primeira imunização e adjuvante incompleto de Freund para as seguintes. Protocolos mistos, nos quais camundongos receberam células CHO-cMet e proteínas recombinantes também foram realizados. Três dias antes de fusão celular, os camundongos receberam um reforço i.p. ou i.v. com a proteína recombinante ou fragmentos. Então, os baços dos camundongos foram coletados e fundidos à células de mieloma SP2/0Ag14 (ATCC) e submetidos à seleção com HAT. Quatro fusões foram realizadas. Em geral, para o preparo de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais de acordo com a invenção, especialmente originários de murino, é possível se referir a técnicas as quais são descritas, em particular, no manual Antibodies (Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, página 726, 1988) ou à técnica de preparo de hibridomas descrita por Kohler e Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975). [000298] Os hibridomas obtidos foram inicialmente selecionados através de ELISA sobre a proteína recombinante c-Met e, então, através de análise por FACS sobre linhagens de célula A549 NSCLC, pancreática BxPC3 e glioblastoma U87-MG (perfis representativos foram apresentados na Figura 1) a fim de assegurar que os anticorpos produzidos eram capazes de reconhecer também o receptor nativo sobre células tumorais. Reagentes positivos nesses 2 testes foram amplificados, clonados e um conjunto de hibridomas foi recuperado,

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66/131 purificado e selecionado com relação à sua capacidade de inibir a proliferação celular in vitro no modelo BxPC3.

[000299] Para essa finalidade, 50 000 células BxPC3 foram colocadas em lâminas com 96 poços em meio RPMI, L-glutamina a 2 mM, sem SVF. 24 horas após colocação, os anticorpos a serem testados foram adicionados em uma concentração final oscilando de 0,0097 a 40 gg/ml, 60 min antes da adição de 100 ng/ml de hHGF. Após 3 dias, as células receberam um pulso de 0,5 gCi de [³H]timidina durante 16 horas. A magnitude de [³H]timidina incorporada em DNA insolúvel em ácido tricloroacético foi quantificada através de contagem de cintilação de líquido. Os resultados foram expressos como dados brutos para avaliar prontamente o efeito agonístico intrínseco de cada Mab (Figuras 2A e 2B).

[000300] Então, anticorpos que inibem pelo menos 50% da proliferação celular foram avaliados como sobrenadantes através de análise BRET sobre células transfectadas com c-Met. Para essa finalidade, linhagens de células CHO estáveis expressando C-MetRluc ou C-Met-Rluc e C-Met-K1100A-YFP foram geradas. As células foram distribuídas em microlâminas brancas com 96 poços em meio de cultura DMEM-F12/FBS a 5% um ou dois dias antes dos experimentos BRET. As células foram primeiro cultivadas a 37°C com 5% de CO2 de forma a permitir fixação das células à lâmina. Às células foram, então, fornecidos 200 gl de DMEM/poço durante a noite. Imediatamente antes do experimento, o DMEM foi removido e as células rapidamente lavadas com PBS. As células foram incubadas em PBS na presença ou ausência de anticorpos a serem testados ou compostos de referência, 10 min a 37°C antes da adição de coelenterazina, com ou sem HGF, em um volume final de 50 gl. Após incubação durante mais 10 minutos a 37°C, a aquisição de emissão de luz a 485 nm e 530 nm foi iniciada usando o luminômetro Mithras

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67/131 (Berthold) (1 s/comprimento de onda/poço, repetido 15 vezes).

[000301] A proporção BRET foi definida conforme previamente [Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 3684-3689] como: [(emissão a 530 nm)-(emissão a 485 nm) X Cf]/(emissão a 485 nm), onde Cf corresponde a (emissão a 530 nm) /(emissão a 485 nm) para células expressando a proteína de fusão Rluc apenas nas mesmas condições experimentais. Simplificação dessa equação mostra que a proporção BRET corresponde à proporção de 530/485 nm obtida quando os dois parceiros estavam presentes, corrigida pela proporção de 530/485 nm obtida sob as mesmas condições experimentais, quando apenas o parceiro fundido à luciferase de R. reniformis estava presente. Para fins de facilidade de leitura, os resultados são expressos em unidades de miliBRET (mBU); mBU corresponde à proporção BRET multiplicada por 1000.

[000302] Após esse segundo teste in vitro, 4 anticorpos i) sem atividade intrínseca como uma molécula inteira no teste funcional de proliferação, ii) que inibem significativamente a proliferação de BxPC3 (Figuras 2A e 2B) e iii) que inibem a dimerização de c-Met (Figura 3) foram selecionados. Esses 3 anticorpos do isotipo IgG1 kappa foram descritos como 11E1, 224G11, 223C4 e 227H1. Nos experimentos, o Mab 5D5, gerado pela Genentech e disponível na ATCC, foi adicionado como um controle para a atividade agonística intrínseca.

[000303] As Figuras 2A e 2B demonstram que 11E1, 224G11, 223C4 e 227H1 não tinham qualquer atividade agonista em contraste ao 5D5, o qual induziu a uma estimulação dose-dependente de proliferação celular na ausência de ligante. Uma inibição significativa de proliferação celular foi observada com os 4 anticorpos selecionados. 5D5 não teve efeito sobre a proliferação celular induzida por HGF nesse teste.

[000304] Quando avaliados com relação ao bloqueio de dimerização,

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68/131 efeitos significativos atingindo uma inibição de 32, 55, 69 e 52% de dimerização para 224G11, 223C4, 11E1 e 227H1, respectivamente, foram observados. Comparado com os sinais basais nos respectivos experimentos, o anticorpo 5D5 não tem efeito nesse modelo de dimerização.

Exemplo 2: reconhecimento de proteína por anticorpos anti-c-Met [000305] Para caracterizar o padrão de reconhecimento dos 3 anticorpos selecionados, 3 ELISAs foram configurados com a proteína c-Met recombinante, seu fragmento monomérico (obtido através de clivagem da proteína c-Met-Fc recombinante e o domínio SEMA recombinante).

[000306] Os resultados apresentados na Figura 4 demonstraram que os 4 anticorpos reconheciam proteínas diméricas e monoméricas. Para realizar esses ELISAs, a proteína c-Met dimérica humana (R&D Sytems, catn° 358MT) é revestida na concentração de 0,7 pg/ml em PBS durante a noite a 4°C. Após saturação das lâminas (Costar n°3690) com uma solução de gelatina a 0,5% durante 2 horas a 37°C, sobrenadantes de hibridoma são incubados 1 hora a 37°C. Uma vez enxaguadas com PBS, o anticorpo anti-HRP de camundongo (Jackson ImmunoResearch, catálogo n°115-035-164) é adicionado a cada poço em uma diluição de 1/5000 em tampão para ELISA (gelatina a 0,1%/Tween 20 a 0,05% em PBS) e as lâminas incubadas durante 1 hora a 37°C. Após 3 lavagens em PBS, a atividade da peroxidase é revelada através da adição de 50 pl de substrato TMB (Uptima). A reação é deixada ocorrer durante 5 min em temperatura ambiente. A reação é cessada através da adição de 50 pl/poço de uma solução a 1 M de H2SO4 e lida sobre um leitor para lâminas a 450 nm. O mesmo tipo de protocolo foi realizado sobre c-Met monomérica e o domínio SEMA mas, nesses casos, as proteínas foram revestidas a 5 e 3 pg/ml, respectivamente.

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69/131 [000307] O Mab 5D5 introduzido como um controle positivo reconheceu, conforme esperado, a proteína SEMA. 224G11, 227H1 e

223C4 não se ligam ao domínio SEMA. 11E1 é capaz de se ligar ao

SEMA.

[000308] Para determinar se 11E1 e 5D5, ambos reconhecendo o domínio SEMA, competem por epítopos em sobreposição, análise BIAcore foi realizada. O sistema BIAcore, baseado no fenômeno de Ressonância de Plasmônio em Superfície, distribui dados através de monitoramento de eventos em tempo real. Ele é, então, útil para agrupar anticorpos nos assim denominados experimentos de mapeamento de epítopo. Um par de anticorpos incapaz de se ligar ao mesmo tempo sobre a molécula antigênica é classificado no mesmo grupo (sítios de ligação idênticos ou próximos). Em oposição, quando seus respectivos sítios de ligação estão suficientemente distintas para permitir uma ligação simultânea de ambos os anticorpos, esses últimos são classificados em dois grupos diferentes. Em tais experimentos, o antígeno é comumente usado como o ligante (imobilizado sobre a lasca sensora) e os anticorpos são usados sem qualquer rotulação como analitos (fase em solução).

[000309] Todos os experimentos descritos acima foram feitos sobre um instrumento BIAcore X (GE Healthcare Europe GmbH). Uma lasca sensora CM5 (BIAcore) ativada por um Mab anti-Tag-6His de camundongo (R&D System ref. MAB050) foi preparada seguindo as instruções do fabricante usando o kit de acoplamento de amina (BIAcore). O tampão de operação (HBS-EP) e tampão de regeneração (Glicina, HCl) são da BIAcore. Uma versão solúvel recombinante do receptor de HGF humano produzido como uma molécula quimérica cMet-Fc-Tag His era da R&D Systems (ref. 358-MT-CF). Os experimentos foram feitos a 25°C, em uma taxa de fluxo de 30 pl/min. Uma solução a 10 pg/ml de c-Met em tampão de operação foi injetada

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70/131 durante um minuto na célula de fluxo 2 (fc2), tipicamente, 270 RU da forma solúvel de c-Met foram capturados. A célula de fluxo 1 (fc1) foi usada como uma referência para verificar qualquer ligação nãoespecífica dos anticorpos à matriz da lasca sensora.

[000310] Injeções sequenciais de anticorpos a serem testadas foram realizadas. Um anticorpo foi injetado sobre ambas as células de fluxo durante 2 minutos. Um segundo anticorpo (ou o mesmo) foi, então, injetado nas mesmas condições. Se nenhuma ligação significativa foi observada, uma terceira injeção foi feita com outro anticorpo. A lasca sensora foi, então, regenerada através de uma única injeção de 30 s do tampão de regeneração. Anticorpos e c-Met-Fc foram descartados nesse estágio.

Análise dos resultados:

[000311] A capacidade de um anticorpo A de bloquear a ligação de um anticorpo B é calculada pela proporção BIA/C=(R2A/B/R1B)x100: onde R2A/B é a resposta correspondendo à ligação do MAb B quando ele é injetado após o Mab A e R1B é a resposta correspondendo à ligação do MAb B quando ele é injetado primeiro. Uma A BIA/C abaixo de 20% significa que A é capaz de bloquear a ligação de B, de modo que A e B têm sítios de ligação próximos.

[000312] O mapeamento de epítopo foi realizado com 2 Mabs, 11E1 e 5D5.

Tabela 3

2° Ab (B) 1° Ab (A)	11E1	5D5
11E1	6,5%	84,2%
5D5	98,4%	11,0%

[000313] Visualização da ligação em torno de 270RU de c-Met-Fc capturada pela injeções sequenciais de 2 minutos dos Mabs 5D5 (primeiro), 5D5 (segundo) e 11E1 (terceiro) em uma concentração de

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71/131 pg/ml cada demonstrou que 5D5 e 11E1 se ligam claramente a dois sítios distantes (Figura 5A). Essa observação foi confirmada pela sequência recíproca do anticorpo (Figura 5B).

[000314] A Tabela 3 resume a proporção de cálculo obtida com as diferentes sequências desses 2 anticorpos. Valores em preto (mais de 75%) significam que o Mab A não bloqueia a ligação do Mab B. Valores em negrito/itálico (abaixo de 20%) significam que os sítios de ligação de ambos os anticorpos (A e B) são idênticos ou suficientemente próximos para impossibilitar uma ligação simultânea. Exemplo 3: efeito de Mabs sobre a fosforilação de c-Met [000315] Para determinar a atividade de anticorpos anti-c-Met sobre a fosforilação de c-Met, um ensaio ELISA de fosfo c-Met foi configurado. Resumidamente, 500 000 células A549 foram cultivadas em cada poço de lâminas com 6 poços em meio F12K + FCS a 10%. 16 horas antes de adição de HGF (100 ng/ml), as células foram privadas e cada anticorpo a ser testado foi adicionado em uma concentração final de 30 pg/ml 15 minutos antes de estimulação com ligante. 15 minutos após a adição de HGF, tampão de lise gelado foi adicionado, as células foram raspadas e lisatos de célula coletados e centrifugados a 13 000 rpm durante 10 min a 4°C. Os sobrenadantes foram quantificados com um kit BCA (Pierce) e armazenadas a -20°C. Para o ensaio ELISA, um anticorpo anti-c-Met de cabra (R&D ref. AF276) foi usado como um anticorpo de captura (revestimento durante a noite a 4°C) e, após uma etapa de saturação (1 h em RT) com um tampão de TBS-BSA a 5%, 25 pg de proteína dos diferentes lisatos celulares foram adicionados a cada poço da lâmina com 96 poços. Após um tempo de incubação de 90 minutos em RT, as lâminas foram lavadas quatro vezes e um anticorpo anti-fosfo-c-Met (anti-pY12301234-1235 c-Met de coelho) foi adicionado. Após um tempo de incubação adicional de 1 hora e 4 lavagens, um anti-HRP de coelho

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72/131 (Biosource) foi adicionado durante 1 hora em RT e, então, substrato

Luminol foi adicionado antes de avaliação da luminescência com um dispositivo Mithras. Os resultados apresentados na Figura 6B demonstraram que 11E1, 224G11, 223C4 e 227H1 inibem a fosforilação de c-Met em 68, 54, 80 e 65%, respectivamente, comparado com o Mab 5D5, o qual mostrou uma inibição mais fraca de fosforilação de c-Met (42%). Nesse teste, um fraco efeito basal (menos de 20%) foi observado com os 4 anticorpos candidatos (Figura 6A). Conforme descrito nos vários exemplos apresentados nessa patente, esse fraco efeito basal não tem consequências sobre a atividade dos anticorpos em outros testes in vitro e in vivo. O 5D5 usado como um controle mostrou, nesse teste, um efeito basal significativo.

Exemplo 4: deslocamento de HGF rádio-rotulado por anticorpos anti-cMet [000316] Para determinar se os anticorpos anti-c-Met eram capazes de deslocar o HGF, experimentos de ligação foram configurados. Resumidamente, microlâminas com 96 poços FlashPlate de proteína A (Perkin Elmer) foram saturadas com gelatina a 0,5% em PBS (200 gl/poço, 2 h em temperatura ambiente) antes da adição de c-Met-Fc recombinante (R&D Systems) como uma proteína de revestimento. Dois mil gl de uma solução de c-Met-Fc a 1 gg/ml em PBS foram adicionados a cada poço. As lâminas foram, então, incubadas durante a noite a 4°C. Os sítios de proteína A residual livres foram ainda saturados com uma hIgG não relevante (0,5 gg/poço em PBS) durante 2 h em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas com PBS após cada etapa.

[000317] Para ensaios de competição, a ligação de [¹²⁵I]-HGF (atividade específica ~ 2.000 Ci/mmol) a 200 gM à c-Met imobilizada foi medida na presença de concentrações variadas dos anticorpos

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73/131 monoclonais anti-c-Met 11E1, 224G11, 223C4, 227H1 ou HGF (R&D Systems), oscilando de 0,1 pM a 1 pM em PBS, pH de 7,4. As lâminas foram incubadas em temperatura ambiente durante 6 h, então, contadas sobre um Contador de Cintilação Packard Top Count Microplate. A ligação não-específica foi determinada na presença de HGF a 1 pM. O anticorpo monoclonal 9G4, o qual não é direcionado à c-Met, mas reconhece especificamente uma proteína de E. coli, foi usado como um controle de isotipo de IgG1 de camundongo.

[000318] O percentual de ligação [¹²⁵I]-HGF específica total foi plotado como uma função da concentração de ligante sobre gráficos semilog. As concentrações de vários inibidores requeridos para inibir a ligação de rádio ligante em 50% (IC50) foram determinadas graficamente a partir das curvas de competição sigmoidais obtidas (Figuras 7A e 7B).

[000319] Conforme esperado, HGF não-rádiorrotulado foi capaz de deslocar totalmente a ligação de [¹²⁵I]-HGF à c-Met imobilizada, enquanto que o anticorpo de controle 9G4 não mostra qualquer atividade de bloqueio de HGF (Figuras 7A e 7B). Os anticorpos monoclonais anti-c-Met 11E1, 224G11, 223C4 e 227H1 foram capazes de inibir a ligação de [¹²⁵I]-HGF à c-Met imobilizada, com valores de IC50 de 20 nM, a 3 nM, a 2,7 nM e a 5,8 nM, respectivamente. Os valores de IC50 determinados para os anticorpos 224G11, 223C4 e 227H1 eram comparáveis ao valor de IC50 determinado para o HGF não-rádiorrotulado, o qual estava compreendido entre 3 e 5 nM, enquanto que o anticorpo 11E1 exibiu um maior valor de IC50.

Exemplo 5: inibição de invasão por anticorpos anti-c-Met [000320] Para avaliar o efeito de inibição dos anticorpos anti-c-Met sobre o processo de invasão, células A549 foram colocadas na câmara superior de câmaras de invasão BD BioCoat™ Matrigel™ (poços com 6,5 mm de diâmetro com membranas de policarbonato

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74/131 com um tamanho de 8 gm). As células A459 foram privadas de soro 24 horas antes de realização do ensaio de invasão. Então, 500 000 células A549 foram colocadas em um tampão de quimiotaxia (meio DMEM, BSA a 0,1%, Hepes a 12 mM) na poço superior de cada câmara, sobre o revestimento de Matrigel, com ou sem o anticorpo a ser testado (concentração final de Mab de 10 gg/ml). Após 1 hora de incubação das lâminas a 37°C com 5% de CO2, as câmaras inferiores foram enchidas com meio de crescimento contendo 400 ng/ml de rhHGF ou com meio de crescimento apenas. As câmaras foram incubadas durante mais 48 horas a 37°C com 5% de CO2. Ao final desse tempo de incubação, as células que permaneceram sobre a superfície superior do filtro foram gentilmente removidas com um cotonete, as células que migraram para a superfície inferior do filtro foram submetidas à lise, coradas com tampão corante CyQuant GR (Invitrogen) e contadas usando um leitor de fluorescência Berthold Mithras LB940. Todas as condições foram testadas como triplicatas.

[000321] Conforme esperado, o HGF induziu a uma invasão significativa de células tumorais comparado com aquela observada com FCS a 10% introduzido como um controle positivo (Figura 8). A IgG1 de murino 9G4 introduzida como um controle de isotipo não tem efeito significativo sobre a invasão basal ou induzida por HGF quando comparado a células colocadas na lâmina sem IgG. Nenhum efeito agonista foi percebido com h 11E1, 224G11, 223C4 e 227H1 quando adicionados isoladamente e inibição significativa e comparável da invasão HGF-induzida foi observada com os 3 Mabs.

Exemplo 6: inibição de cicatrização de ferimento pelos anticorpos antic-Met [000322] HGF estimula a motilidade. Para determinar se os anticorpos anti-HGF eram capazes de inibir a migração, células NCIH441 foram crescidas em alta densidade e um vão foi introduzido com

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75/131 a ponta de uma pipeta P200. As células foram, então, estimuladas a migrar através do vão com HGF (100 ng/ml) na presença ou na ausência de 11E1. Poços com 11E1 apenas também foram avaliados. Cada condição testada foi avaliada como seis réplicas e 3 experimentos independentes foram realizados. Após uma incubação durante a noite, as células foram visualizadas com uma Câmera Axio Vision (direciona x4).

[000323] HGF induziu a uma migração significativa, resultando em um fechamento completo do vão dentro de uma noite (Figura 9). A IgG1 irrelevante 9G4 usada como um controle de isotipo é sem qualquer efeito sobre a migração celular. Conforme esperado, um efeito agonista foi observado com o 5D5 quando adicionado isoladamente, mas uma inibição significativa de migração celular é observada com esse anticorpo na presença de HGF na porção do vão que permaneceu aberta. O fragmento Fab de 5D5 não teve qualquer efeito agonista quando adicionado isoladamente. Contudo, nenhuma atividade desse fragmento foi observada na presença de HGF. Conforme observado com o controle de isotipo 9G4, o MAb 11E1 não teve efeito agonista quando adicionado e se comportou como um antagonista total na presença de HGF.

Exemplo 7: ensaio de dispersão [000324] Células SK-HEP-1 foram cultivadas em baixa densidade (1 x 10⁴ células/poço) em uma lâmina com 24 poços em DMEM com FCS a 10% e crescidas durante 24 horas antes da adição, ao mesmo tempo, de HGF (100 ng/ml) e anticorpos a serem testados (10 pg/ml). Após 72 horas de incubação, as colônias foram fixadas e coradas com violeta cristal a 0,2% em metanol e avaliadas com relação à dispersão visualmente. Cada condição foi testada como uma triplicata e 3 experimentos independentes foram realizados.

[000325] A adição de HGF às células SK-HEP-1 induziu a uma

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76/131 dispersão celular significativa (Figuras 10A e 10B). O anticorpo 9G4 introduzido como um controle de isotipo não teve qualquer efeito isoladamente ou na presença de HGF. Conforme esperado,o anticorpo 5D5 mostrou um efeito agonista significativo isoladamente e nenhum efeito inibitório foi observado quando 5D5 foi adicionado com HGF (Figura 10A). Nenhum efeito agonístico foi observado com 11E1 (Figura 10A) nem com 224G11 (Figura 10B) adicionados isoladamente. Um efeito inibitório muito significativo desses anticorpos foi demonstrado na presença de HGF (Figuras 10A e 10B).

Exemplo 8: ensaio de tubulogênese tridimensional [000326] Células SK-HEP-1 foram cultivadas a 1 x 10⁴ células/poço em uma lâmina com 24 poços em DMEM com FCS a 10%/Matrigel (50/50) e incubadas durante 30 min antes da adição, ao mesmo tempo, de HGF (100 ng/ml) e anticorpos a serem testados (10 pg/ml). Após 7 dias de incubação, as células foram avaliadas com relação à formação de tubo visualmente. Cada condição foi testada como uma triplicata e 3 experimentos independentes foram realizados.

[000327] A adição de HGF induziu a uma formação significativa de tubo em SK-HEP-1 (Figura 11). O anticorpo 9G4 introduzido como um controle de isotipo não teve qualquer efeito isoladamente ou na presença de HGF. Conforme esperado, o anticorpo 5D5 mostrou um efeito agonista significativo isoladamente e nenhum efeito inibitório foi observado quando 5D5 foi adicionado com HGF. Nenhum efeito agonístico foi observado com 11E1, 223 C4 e 224G11 adicionados isoladamente e um efeito inibitório total foi demonstrado com 11E1 e 223C4 na presença de HGF. Uma inibição parcial, mas significativa, foi observada com o Mab 224G11.

Exemplo 9: formação de esferoide [000328] Para avaliar a capacidade de anticorpos anti-c-Met de inibir o crescimento de tumor in vitro, em um modelo mais próximo de uma

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77/131 situação in vivo, esferoides de células de glioblastoma humano U87MG (ATCC n°10 HTB-14) foram gerados. As células crescidas como uma monocamada foram soltas com tripsina-EDTA e resuspensas em meio de cultura de células completo (DMEM) suplementado com FBS a 10%. Os esferoides foram iniciados através de inoculação de 625 células em poços únicas de lâminas de fundo redondo com 96 poços em DMEM-FCS a 10%. Para impedir a adesão celular a um substrato, as lâminas foram pré-revestidas com poliHEMA em etanol a 95% e secas ao ar em temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas sob condições padrões de cultura de célula a 37°C, 5% de CO2 em incubadoras umidificadas. Anticorpos monoclonais purificados (10 pg/ml) foram adicionados após 3 e 7 dias de cultura de esferoide. HGF (400 ng/ml) foi adicionado uma vez após 4 dias de cultura. Os esferoides foram mantidos em cultura durante pelo menos 10 dias. Então, o crescimento de esferoide foi monitorado através de medição da área de esferoides usando um módulo de medição automática do software Axio Vision. A área foi expressa em pm². 8-16 esferoides foram avaliados para cada condição.

[000329] As Figuras 12A e 12B mostraram que, na presença de FCS a 10%, nenhuma estimulação foi observada quando HGF foi adicionado ao meio completo. Conforme esperado, o controle de isotipo 9G4 não teve efeito sobre o crescimento de esferoide. 11E1 e 223C4 reduziram significativamente o crescimento de esferoide na presença e ausência de HGF. Nenhum efeito foi observado com o fragmento Fab de 5D5.

Exemplo 10: atividade in vivo de Mabs anti-c-Met no modelo de xenoenxerto U87MG [000330] Camundongos atímicos de seis a oito semanas de idade foram alojados em gaiolas com filtro por cima esterilizadas, mantidos em condições estéreis e manipulados de acordo com as diretrizes

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Francesas e Européias. U87,MG, uma linhagem de células de glioblastoma, expressando c-Met e autócrina para o ligante HGF, foi selecionada para avaliações in vivo. Os camundongos foram injetados subcutaneamente com 5 x 106 células. Então, seis dias após implante das células, os tumores eram mensuráveis (aproximadamente 100 mm³), os animais foram divididos em grupos de 6 camundongos com tamanho de tumor comparável e tratados duas vezes por semana com 1 mg/dose de cada anticorpo a ser testado. Os camundongos foram acompanhados para a observação da taxa de crescimento do xenoenxerto e alterações do peso corporal. O volume do tumor foi calculado através da fórmula: π (Pi)/6 X comprimento X largura X altura.

[000331] Os resultados obtidos são resumidos na Figura 13 e demonstraram que todos os anticorpos testados inibem significativamente o crescimento in vivo de células U87-MG. O uso de um anticorpo de neutralização anti-IGF-IR (IgG1) no painel A demonstra que a inibição observada in vivo é especificamente relacionada à modulação do eixo HGF-cMet.

Exemplo 11: atividade in vivo de Mabs anti-c-Met no modelo de xenoenxerto NCI-H441 [000332] NCI-H441 é derivado de adenocarcinoma papilar de pulmão, expressa altos níveis de c-Met e demonstra fosforilação constitutiva de RTK c-Met.

[000333] Para determinar se essa linhagem de célula expressa altos níveis de c-Met e é capaz de produzir HGF, RT-PCR quantitativa e FACS ou ELISA (Quantikine HGF; R&D Systems) foram realizados. Para RT-PCR quantitativa, os níveis de HGF total ou transcrito de cMet em linhagens de célula foram avaliados através de PCR quantitativa usando a técnica-padrão TaqMan™. Os níveis de HGF ou transcrito de c-Met foram normalizados para a proteína Ribossômica

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79/131 do gene de controle housekeeping, grande, P0 (RPL0) e os resultados foram expressos como valores de expressão normalizados (método 2-ddCT).

[000334] Os conjuntos de primer/sonda para RPL0 eram dianteiro, 5'gaaactctgcattctcgcttcctg-3' (SEQ ID No. 47); reverso, 5'aggactcgtttgtacccgttga-3' (SEQ ID No. 48); e sonda 5'-(FAM)tgcagattggctacccaactgttgca-(TAMRA)-3' (SEQ ID No. 49). Os conjuntos de primer/sonda para HGF foram dianteiro, 5'aacaatgcctctggttcc-3' (SEQ ID No. 50); reverso, 5'-cttgtagctgcgtcctttac3' (SEQ ID No. 51); e sonda, 5'-(FAM)-ccttcaatagcatgtcaagtggagtga(TAMRA)-3' (SEQ ID No. 52). Os conjuntos de primer/sonda para cMet foram dianteiro, 5'-cattaaaggagacctcaccatagctaat-3' (SEQ ID No. 53); reverso, 5'-cctgatcgagaaaccacaacct-3' (SEQ ID No. 54); e sonda, 5'-(FAM)-catgaagcgaccctctgatgtccca-(TAMRA)-3' (SEQ ID No. 55). O protocolo de termo-ciclização consistia em fusão a 50°C durante 2 minutos e 95°C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos e 62°C durante 1 minuto.

[000335] Nenhum mRNA para HGF foi encontrado em NCI-H441 (Figura 14) e HGF não é detectável, através de ELISA, em sobrenadantes de NCI-H441. Nesses experimentos, U87-MG, uma linhagem de célula de glioblastoma conhecida como uma linhagem de célula autócrina para HGF, foi introduzida como um controle positivo. A análise por RT-PCR mostrou um nível significativo de mRNA de HGF em U87-MG e 1,9 ng de HGF/milhão de células foram detectados no sobrenadante de células U87-MG. RT-PCR quantitativa e análise por FACS, Figuras 15A e 15B, demonstraram que, conforme esperado, as células NCI-H441 superexpressam significativamente c-Met e que essa expressão era dramaticamente maior do que aquela observada para células U87-MG. Nesse experimento, a linhagem de células MCF-7 foi introduzida como um controle negativo. Tomados juntos,

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NCI-H441 aparece como uma linhagem de célula não-autócrina constitutivamente ativada capaz de crescer independentemente do ligante HGF, na qual uma dimerização independente de ligante de cMet ocorreu como uma consequência da superexpressão do receptor. [000336] A avaliação de anticorpos anti-c-met sobre a atividade in vivo dessa linhagem de célula não-autócrina pôde fornecer alguns insights sobre sua potência ao conferir a dimerização de c-Met. [000337] A Figura 16 demonstra que 224G11, 11E1 e 227H1 inibiram significativamente o crescimento in vivo de NCI-H441, sugerindo que, além de inibição dependente de ligante, esses anticorpos capazes de inibir a dimerização também são capazes de direcionar uma inibição independente de ligante de c-met. Conforme mencionado acima na especificação, com essa última propriedade, é mostrado que 224G11, 11E1 e 227H1 são diferentes do anticorpo anti-c-Met 5D5 com um braço (OA-5D5).

Exemplo 12: processo de humanização através de enxertagem de CDR do anticorpo 224G11

I - Humanização do domínio variável com cadeia leve Comparação da sequência de nucleotídeo da VL de 224G11 aos genes de linhagem germinativa de murino [000338] Como uma etapa preliminar, a sequência nucleotídica da VL de 224G11 foi comparada a sequências de genes de linhagem germinativa de murino, parte do banco de dados IMGT (http://imgt. cines. fr).

[000339] Genes de linhagem germinativa IGKV3-5*01 e IGKJ4*01 de murino com uma identidade de sequência de 99,31% pela região V e 94,28% para a região J, respectivamente, foram identificados. Com relação à identidade obtida, foi decidido usar diretamente as sequências de VL de 224G11 para buscar homologias humanas. [000340] Esses alinhamentos são representados nas Figuras 17A

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81/131 para o gene V e 17B para o gene J.

Comparação da sequência de nucleotídeo da VL de

224G11 com genes de linhagem germinativa humana [000341] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a VL de 224G11 foi buscado. Para essa finalidade, a sequência nucleotídica da VL de 224G11 foi alinhada às sequências de genes de linhagem germinativa humana, parte do banco de dados IMGT. Para otimização da seleção, alinhamentos entre as sequências protéicas foram feitos para buscar as melhores homologias.

[000342] Esses dois métodos complementares levaram à identificação de duas possíveis sequências V humanas receptoras para a VL de murino de CDRs de 224G11. Alinhamento nucleotídico proporciona um gene de linhagem germinativa humana IGKV3-11*01 com uma identidade de sequência de 75,99%, enquanto que alinhamento protéico proporciona o gene de linhagem germinativa humana IGKV4-1*01 com uma identidade de sequência de 67,30%. É notável que, em ambos os casos, os dois genes de linhagem germinativa mais próximos e as sequências analisadas mostrem diferentes comprimentos de aminoácido da CDR1 (10 aminoácidos na VL de 224G11; 6 aminoácidos em IGKV3-11*01; 12 aminoácidos em IGKV4-1*01). Para a região J, o melhor escore de homologia foi primeiro obtido com o IGKJ3*01 humano, mostrando uma identidade de sequência de 80%. Mas um número maior de nucleotídeos idênticos consecutivos e uma melhor adaptação de aminoácido foram encontrados no alinhamento com o gene de linhagem germinativa humana IGKJ4*02 (identidade de sequência de 77,14%). Assim, o gene de linhagem germinativa IGKJ4*02 foi selecionado como uma região J humana receptora para a VL de murino de CDRs de 11E1.

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82/131 [000343] Os alinhamentos são representados nas Figuras 18A para a região V e 18B para a região J.

Versão humanizada da VL de 224G11 [000344] Dada a possibilidade de duas regiões V humanas receptoras para a VL de murino de CDRs de 224G11, duas versões humanizadas do domínio de VL de 224G11 serão descritas. A primeira corresponde a um experimento inicial para uma estrutura principal humana com um comprimento de CDR1 mais curto (IGKV3-11*01), a segunda com um comprimento de CDR1 mais longo (IGKV4-1*01).

a) Versão humanizada baseada em IGKV3-11*01 da VL de 224G11 [000345] As etapas a seguir no processo de humanização consistem em ligação das sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGKV3-11*01 e IGKJ4*02 e também das CDRs da VL de murino de 224G11 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000346] Conforme representado na Figura 19A, os resíduos em negrito na sequência VL de 224G11 correspondem aos vinte e cinco aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VL de 224G11 e as frameworks humanas selecionadas (FR humana, isto é, IGKV3-11*01 e IGKJ4*02).

[000347] Com relação ao vários critérios, tais como sua participação na interface VH/VL, na ligação a antígeno ou na estrutura da CDR, a classe de aminoácido muda entre resíduos de murino e humano, a localização do resíduo na estrutura 3D do domínio variável, três dos vinte e cinco resíduos diferentes foram identificados como tendo sofrido eventual mutação. Esses três resíduos definidos mais importantes e mutações em suas contrapartes humanas sendo M39 de murino para L humana, H40 para A e R84 para G. Esses resíduos classificados como um são mostrados na Figura 19A como resíduos

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83/131 em negrito na sequência HZ1VL de 224G11, onde eles permaneceram de murino.

[000348] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

[000349] Como o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os resíduos classificados como dois a seguir, isto é, resíduos 15 (L/P), 49 (P/A), 67 (L/R), 68 (E/A), 93 (P/S) e 99 (V/F) sobre os quais mutações poderiam também ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000350] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem eventualmente testados não estão limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais. Em outra modalidade preferida, todos os dezesseis outros resíduos classificados como três dentre os vinte e cinco aminoácidos diferentes poderiam ser reconsiderados.

[000351] Todas as mutações acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000352] A Figura 19A representa a VL de 224G11 humanizada baseada em IGKV3-11*01 implementada com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação foi feita.

b) Versão humanizada baseada em IGKV4-1*01 da VL de 224G11 [000353] As seguintes etapas no processo de humanização consistem em ligação de sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGKV4-1*01 e IGKJ4*02 e também das CDRs da VL de murino de 224G11 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

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84/131 [000354] Conforme representado na Figura 19B, os resíduos em negrito na sequência VL de 224G11 correspondem aos vinte e dois aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VL de

224G11 e as frameworks humanas selecionadas (FR humana, isto é,

IGKV4-1*01 e IGKJ4*02).

[000355] Com relação a vários critérios, tais como sua participação na interface VH/VL, na ligação ao antígeno ou na estrutura de CDR, as alterações de classe de aminoácido entre resíduos de murino e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D do domínio variável, quatro dos vinte e dois diferentes resíduos foram identificados como tendo sofrido eventual mutação. Esses quatro resíduos definidos mais importantes e mutações em suas contrapartes humanas sendo L4 de murino para M humana, M39 para L, H40 para A e R84 para G. Esses resíduos classificados como um são mostrados na Figura 19B como resíduos em negrito na sequência HZ2VL de 224G11, onde eles permaneceram de murino.

[000356] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

[000357] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes resíduos classificados como dois, isto é, resíduos 25 (A/S), 66 (N/T), 67 (L/R), e 93 (P/S) sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000358] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem eventualmente testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais. Em outra modalidade preferida, todos os catorze outros resíduos classificados como três dentre os vinte e dois diferentes aminoácidos poderiam ser reconsiderados.

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85/131 [000359] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000360] A Figura 19B representa a VL de HGF humanizada baseada em IGKV4-1*01 implementada com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

II - Humanização do domínio variável de cadeia pesada

Comparação da sequência nucleotídica da VH de 224G11 aos genes de linhagem germinativa de murino [000361] Como uma etapa preliminar, a sequência nucleotídica da VH de 224G11 foi comparada às sequências dos genes de linhagem germinativa de murino, parte do banco de dados IMGT (http://imgt.cines.fr).

[000362] Genes de linhagem germinativa IGHV1-18*01, IGHD2-4*01 e IGHJ2*01 de murino com uma identidade de sequência de 92,70% para a região V, 75,00% para a região D e 89,36% para a região J, respectivamente, foram identificados. Com relação à identidade obtida, foi decidido usar diretamente as sequências de VH de 224G11 para buscar homologias humanas.

[000363] Esses alinhamentos são representados nas Figura 20A para o gene V, 20B para o gene D e 20C para o gene J.

Comparação da sequência nucleotídica da VH de 224G11 aos genes de linhagem germinativa humana [000364] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a VH de 224G11 foi buscado. Para essa finalidade, a sequência nucleotídica da VH de 224G11 foi alinhada às sequências do gene de linhagem germinativa humana, parte do banco de dados IMGT. Para otimização da seleção,

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86/131 alinhamentos entre as sequências proteicas foram feitos para buscar melhores homologias.

[000365] Esses dois métodos complementares levam à identificação da mesma sequência V IGHV1-2*02 receptora humana para a VH de murino de CDRs de 224G11 com uma identidade de sequência de 75,00% a nível nucleotídico e 64,30% a nível proteico.

[000366] É notável que a região D pertence estritamente à região CDR3 no domínio VH. O processo de humanização é baseado em uma abordagem de enxertagem de CDR. Análise dos D-genes humanos mais próximos não é útil nessa estratégia.

[000367] Buscas por homologias para a região J levam à identificação do gene de linhagem germinativa humana IGHJ4*04 com uma identidade de sequência de 78,72%.

[000368] O gene de linhagem germinativa V humana IGHV1-2*02 e o gene de linhagem germinativa J humana IGHJ4*01 foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para a VH de murino de CDRs de 224G11.

[000369] Os alinhamentos são representados na Figura 21A para a região V e 21B para a região J.

Versão humanizada de VH de 224G11 [000370] As etapas seguintes no processo de humanização consistem em ligação das sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGHV1-2*02 e IGHJ4*01 e também das CDRs da VH de murino de 224G11 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000371] Conforme representado na Figura 22, os resíduos em negrito na sequência VH de 224G11 correspondem aos trinta aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio V de 224G11 e as frameworks humanas selecionadas (FR humana, isto é, IGHV1-2*02 e IGHJ4*01).

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87/131 [000372] Com relação a vários critérios, tais como sua participação conhecida na interface VH/VL, na ligação a antígeno ou na estrutura da CDR, as alterações de classe de aminoácido entre resíduos de murino e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D do domínio variável, quatro dos trinta diferentes resíduos foram identificados como tendo sofrido eventual mutação. Esses quatro resíduos definidos mais importantes e mutações em suas contrapartes humanas sendo D51 de murino para E humana, G55 para W, V80 para R e K82 para T. Esses resíduos classificados como um são mostrados na Figura 22 como resíduos em negrito na sequência HZVH de 224G11, onde eles permaneceram de murino. Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

[000373] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes resíduos classificados como dois, isto é, resíduos 25 (T/A), 48 (E/Q), 49 (S/G), 53 (I/M), 76 (AV), 78 (L/M) e 90 (D/E) sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000374] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem eventualmente testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais. Em outra modalidade preferida, todos os dezenove outros resíduos classificados como três entre os trinta diferentes aminoácidos poderiam ser reconsiderados.

[000375] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000376] A Figura 22 representa a VH humanizada de 224G11 com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

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Exemplo 13: processo de humanização através de enxertagem de CDR do anticorpo 227H1

I - Humanização do domínio variável de cadeia leve Comparação da sequência nucleotídica da VL de 227H1 aos genes de linhagem germinativa de murino [000377] Como uma etapa preliminar, a sequência nucleotídica da VL de 227H1 foi comparada às sequências dos genes de linhagem germinativa de murino, parte do banco de dados IMGT (http://im.gt. cines.fr).

[000378] Genes de linhagem germinativa de murino IGKV3-5*01 e IGKJ4*01 com uma identidade de sequência de 96,90% para a região V e 97,29% para a região J, respectivamente, foram identificados. Com relação à identidade obtida, foi decidido usar diretamente as sequências de VL de 227H1 para buscar homologias humanas.

[000379] Esses alinhamentos são representados nas Figuras 23A para o gene V e 23B para o gene J.

Comparação da sequência nucleotídica da VL de 227H1 aos genes de linhagem germinativa humana [000380] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a VL de 227H1 foi buscado. Para essa finalidade, a sequência nucleotídica da VL de 227H1 foi alinhada com as sequências do gene de linhagem germinativa humana, parte do banco de dados IMGT. Para otimização da seleção, alinhamentos entre as sequências proteicas foram feitos para buscar melhores homologias.

[000381] Esses dois métodos complementares levam à identificação duas possíveis sequências V humanas receptoras para a VL de murino de CDRs de 227H1. Alinhamento nucleotídico proporciona o gene de linhagem germinativa humana IGKV3-11*01 com uma

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89/131 identidade de sequência de 74,91%, enquanto que alinhamento proteico proporciona o gene de linhagem germinativa humana IGKV41*01, com uma identidade de sequência de 64,00%. É notável que, em ambos os casos, os dois genes de linhagem germinativa mais próximos e as sequências analisadas mostrem diferentes comprimentos de aminoácido da CDR1 (10 aminoácidos na VL de 227H1; 6 aminoácidos em IGKV3-11*01; 12 aminoácidos em IGKV41*01).

[000382] Para a região J, o melhor escore de homologia foi primeiro obtido com o IGKJ3*01 humano mostrando uma identidade de sequência de 78,38%. Mas um maior número de nucleotídeos consecutivos idênticos e uma melhor adaptação de aminoácido foram encontrados no alinhamento com o gene de linhagem germinativa humana IGKJ4*02 (identidade de sequência de 75,68%). Assim, o gene de linhagem germinativa IGKJ4*02 foi selecionado como região J humana receptora para a VL de murino de CDRs de 227H1.

[000383] Os alinhamentos são representados na Figuras 24A para a região V e 24B para a região J.

Versão humanizada de VL de 224G11 [000384] Dada a possibilidade de duas regiões V humanas receptoras para a VL de murino de CDRs de 227H1, duas versões humanizadas do domínio VL de 227H1 serão descritas. A primeira corresponde a um experimento inicial para uma estrutura principal humana com um comprimento de CDR1 mais curto (IGKV3-11*01), a segunda com um comprimento de CDR1 mais longo (IGKV4-1*01).

a) Versão humanizada de VL de 227H1 baseada em IGKV3-11 *01 [000385] As etapas seguintes no processo de humanização consistem em ligação das sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGKV3-11*01 e IGKJ4*02 e também das

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CDRs da VL de murino de 227H1 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000386] Conforme representado na Figura 25A, os resíduos em negrito na sequência VL de 227H1 correspondem aos vinte e seis aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VL de 227H1 e as frameworks humanas selecionadas (FR humana, isto é, IGKV3-11*01 e IGKJ4*02).

[000387] Com relação a vários critérios, tais como sua participação conhecida na interface VH/VL, na ligação a antígeno ou na estrutura da CDR, as alterações de classe de aminoácido entre resíduos de murino e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D do domínio variável, três dos vinte e seis diferentes resíduos foram identificados como tendo sofrido eventual mutação. Esses três resíduos definidos mais importantes e mutações em suas contrapartes humanas sendo I39 de murino para L humana, H40 para A e R84 para G. Esses resíduos classificados como um são mostrados na Figura 25A como resíduos em negrito na sequência HZ1VL de 227H1, onde eles permaneceram de murino.

[000388] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

[000389] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes resíduos classificados como dois, isto é, resíduos 15 (L/P), 25 (V/A), 49 (P/A), 67 (L/R), 68 (E/A), 93 (P/S) e 99 (S/F) sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000390] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem eventualmente testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais. Em outra modalidade

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91/131 preferida, todos os dezesseis outros resíduos classificados como três dentre os vinte e cinco diferentes aminoácidos poderiam ser reconsiderados.

[000391] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000392] Figura 25A representa a VL humanizada de 227H1 baseada em IGKV3-11*01 implementada com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

b) Versão humanizada de VL de 227H1 baseada em IGKV4-1 *01 [000393] As etapas seguintes no processo de humanização consistem em ligação das sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGKV4-1*01 e IGKJ4*02 e também das CDRs da VL de murino de 227H1 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000394] Conforme representado na Figura 25B, os resíduos em negrito na sequência VL de 227H1 correspondem aos vinte e quatro aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VL de 227H1 e as frameworks humanas selecionadas (FR humana, isto é, IGKV4-1*01 e IGKJ4*02).

[000395] Com relação a vários critérios, tais como sua participação conhecida in VH/VL 2 0 interface, na ligação a antígeno ou na estrutura da CDR, as alterações de classe de aminoácido entre resíduos de murino e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D do domínio variável, quatro dos vinte e quatro diferentes resíduos foram identificados como tendo sofrido eventual mutação. Esses quatro resíduos definidos mais importantes e mutações em suas contrapartes humanas sendo L4 de murino para M humana, 139 para

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L, H40 para A e R84 para G. Esses resíduos classificados como um são mostrados na Figura 25B como resíduos em negrito na sequência

HZ2VL de 227H1, onde eles permaneceram de murino.

[000396] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

[000397] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes resíduos classificados como dois, isto é, resíduos 25 (V/S), 66 (N/T), 67 (L/R), e 93 (P/S) sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000398] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem eventualmente testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais. Em outra modalidade preferida, todos os dezesseis outros resíduos classificados como três dentre os vinte e dois diferentes aminoácidos poderiam ser reconsiderados.

[000399] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000400] Figura 25B representa a VL humanizada de 227H1 baseada em IGKV4-1*01 implementada com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

II - Humanização do domínio variável de cadeia pesada Comparação da sequência nucleotídica da VH de 227H1 aos genes de linhagem germinativa de murino [000401] Como uma etapa preliminar, a sequência nucleotídica da VH de 227H1 foi comparada às sequências dos genes de linhagem germinativa de murino, parte do banco de dados IMGT

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93/131 (http://imgt.cines.fr).

[000402] Genes de linhagem germinativa de murino IGHV1-18*01, IGHD1-1*02 e IGHJ2*01 com uma identidade de sequência de 92,70% para a região V, 63,63% para a região D e 91,48% para a região J, respectivamente, foram identificados. Com relação à identidade obtida, foi decidido usar diretamente as sequências VH de 227H1 para buscar homologias humanas.

[000403] Esses alinhamentos são representados nas Figuras 26A para o gene V, 26B para o gene D e 26C para o gene J.

Comparação da sequência nucleotídica da VH de 227H1 aos genes de linhagem germinativa humana [000404] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a VH de 224G11 foi buscado. Para essa finalidade, a sequência nucleotídica da VH de 227H1 foi alinhada às sequências do gene de linhagem germinativa humana, parte do banco de dados IMGT. A sequência V receptora humana IGHV1-2*02 para uma VH de murino de CDRs de 224G11 com uma identidade de sequência de 72,92% foi, assim, identificada.

[000405] É notável que a região D pertence estritamente à região CDR3 no domínio VH. O processo de humanização é baseado em uma abordagem de enxertagem de CDR. Análise dos D-genes humanos mais próximos não é útil nessa estratégia.

[000406] Buscas por homologias para a região J levam à identificação do gene de linhagem germinativa humana IGHJ4*01 com uma identidade de sequência de 78,72%.

[000407] O gene de linhagem germinativa V humana IGHV1-2*02 e o gene de linhagem germinativa J humana IGHJ4*01 foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para a VH de murino de CDRs de 227H1.

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94/131 [000408] Os alinhamentos são representados na Figuras 27A para a região V e 27B para a região J.

[000409] Para otimização da seleção, aqueles versados na técnica também poderiam fazer alinhamentos entre as sequências proteicas de forma a auxiliá-los na escolha.

Versão humanizada de VH de 227H1 [000410] As etapas seguintes no processo de humanização consistem em ligação das sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGHV1-2*02 e IGHJ4*01 e também das CDRs da VH de murino de 227H1 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000411] Conforme representado na Figura 28, os resíduos em negrito na sequência VH de 227H1 correspondem aos trinta e dois aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VH de 227H1 e as frameworks humanas selecionadas (FR humana, isto é, IGHV1-2*02 e IGHJ4*01).

[000412] Com relação a vários critérios, tais como sua participação conhecida na interface VH/VL, na ligação a antígeno ou na estrutura da CDR, as alterações de classe de aminoácido entre resíduos de murino e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D do domínio variável, seis dos trinta e dois diferentes resíduos foram identificados como tendo sofrido eventual mutação. Esses seis resíduos definidos mais importantes e mutações em suas contrapartes humanas sendo L39 de murino para M humana, N40 para H, L55 para W, T66 para N, V80 para R e K82 para T. Esses resíduos classificados como um são mostrados na Figura 28 como resíduos em negrito na sequência HZVH de 227H1, onde eles permaneceram de murino.

[000413] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

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95/131 [000414] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes resíduos classificados como dois, isto é, resíduos 48 (K/Q), 49 (T/G), (I/M), 76 (A/V) e 78 (L/M) sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000415] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem eventualmente testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais. Em outra modalidade preferida, todos os vinte e um outros resíduos classificados como três entre os trinta diferentes aminoácidos poderiam ser reconsiderados.

[000416] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000417] Figura 28 representa a VH humanizada de 227H1 com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

Exemplo 14: processo de humanização através de enxertagem de CDR do anticorpo 223C4

I - Humanização do domínio variável de cadeia leve

Comparação da sequência nucleotídica da VL de 223C4 aos genes de linhagem germinativa de murino [000418] Como uma etapa preliminar, a sequência nucleotídica da VL de 223C4 foi comparada às sequências de genes de linhagem germinativa de murino, parte do banco de dados IMGT (http://imgt.cines.fr).

[000419] Genes de linhagem germinativa de murino IGKV12-46*01 e IGKJ2*01 com uma identidade de sequência de 99,64% para a região V e 94,59% para a região J, respectivamente, foram identificados. Com relação à identidade obtida, foi decidido usar diretamente as sequências VL de 223C4 para buscar homologias humanas.

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96/131 [000420] Esses alinhamentos são representados nas Figuras 29A para o gene V e 29B para o gene J.

Comparação da sequência nucleotídica da VL de 223C4 aos genes de linhagem germinativa humana [000421] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a VL de 223C4 foi buscado. Para essa finalidade, a sequência nucleotídica da VL de 223C4 foi alinhada às sequências do gene de linhagem germinativa humana, parte do banco de dados IMGT.

[000422] Genes de linhagem germinativa humana IGKV1-NL1*01 e IGKJ2*01 com uma identidade de sequência de 78,49% para a região V e 81,08% para a região J, respectivamente, foram identificados. Os genes de linhagem germinativa IGKV1-NL1*01 para a região V e IGKJ2*01 para a região J foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para a VL de murino de CDRs de 223C4.

[000423] Os alinhamentos são representados na Figuras 30A para a região V e 3OB para a região J.

[000424] Para otimização da seleção, aqueles versados na técnica também poderiam fazer alinhamentos entre as sequências proteicas de forma a auxiliá-los na escolha.

Versão humanizada de VL de 223C4 [000425] As etapas seguintes no processo de humanização consistem em ligação das sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGKV1-NL1*01 e IGKJ2*01 e também das CDRs da VL de murino de 223C4 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000426] Nesse estágio do processo, um modelo molecular dos domínios Fv de 223C4 de murino poderia ser desenvolvido e é útil na

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97/131 escolha dos resíduos de murino a serem conservados em virtude de seus papéis na manutenção da estrutura tridimensional da molécula ou no sítio de ligação a antígeno e função. Mais particularmente, 9 resíduos que sofreram eventual mutação foram identificados.

[000427] Em uma primeira etapa, resíduos envolvidos nas âncoras ou estrutura de CDR serão testados. Tais resíduos são os resíduos 66 (R/N) e resíduo 68 (E/V).

[000428] Em uma segunda etapa, resíduos expostos a solvente e, como tal, que também podem estar envolvidos em imunogenicidade, também serão testados. Esses são os resíduos 49 (A/S), 51 (K/Q), 69 (S/D), 86 (D/Q) e 92 (S/N).

[000429] Então, em uma terceira etapa, resíduos envolvidos na estrutura/duplicação do domínio variável também poderiam sofrer mutação. Esses resíduos são os resíduos 46 (P/Q) e o resíduo 96 (P/S).

[000430] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

[000431] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes resíduos, isto é, resíduos 9 (S/A), 13 (A/V), 17 (D/E), 18 (R/T), 54 (L/V), 88 (T/S), 90 (T/K), 100 (A/G) e 101 (T/S), sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000432] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000433] Figura 31 representa a VL humanizada de 223C4 com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

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II - Humanização do domínio variável de cadeia pesada Comparação da sequência nucleotídica da VH de 223C4 aos genes de linhagem germinativa de murino [000434] Como uma etapa preliminar, a sequência nucleotídica da VH de 223C4 foi comparada às sequências dos genes de linhagem germinativa de murino, parte do banco de dados IMGT (http://imgt.cines.fr).

[000435] Os genes de linhagem germinativa de murino IGHV1 -18*01, IGHD6-3*01 e IGHJ4*01 com uma identidade de sequência de 98,95% para a região V, 72,72% para a região D e 98,11% para a região J, respectivamente, foram identificados. Com relação à identidade obtida, foi decidido usar diretamente as sequências de VH de 223C4 para buscar homologias humanas.

[000436] Esses alinhamentos são representados nas Figuras 32A para o gene V, 32B para o gene D e 32C para o gene J.

Comparação da sequência nucleotídica da VH de 223C4 aos genes de linhagem germinativa humana [000437] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a VH de 223C4 foi buscado. Para essa finalidade, a sequência nucleotídica da VH de 223C4 foi alinhada às sequências do gene de linhagem germinativa humana, parte do banco de dados IMGT. Os genes de linhagem germinativa humana IGHV1-2*02, IGHD1-26*01 e IGHJ6*01 com uma identidade de sequência de 76,38% para a região V, 75,00% para a região D e 77,41% para a região J, respectivamente, foram identificados. Os genes de linhagem germinativa IGHV1-2*02 para a região V e IGHJ6*01 para a região J foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para as CDRs de VH de murino de 223C4.

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99/131 [000438] Os alinhamentos são representados na Figuras 33A para a região V, 33B para a região D e 33C para a região J.

[000439] Para otimização da seleção, aqueles versados na técnica também poderiam fazer alinhamentos entre as sequências proteicas de forma a auxiliá-los na escolha.

Versão humanizada de VH de 223C4 [000440] As etapas seguintes no processo de humanização consistem em ligação das sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGHV1-2*02 e IGHJ6*01 e também das CDRs da VH de 223C4 de murino às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000441] Nesse estágio do processo, um modelo molecular dos domínios Fv de 223C4 de murino poderia ser desenvolvido e é útil na escolha dos resíduos de murino a serem conservados em virtude de seus papéis na manutenção da estrutura tridimensional da molécula ou no sítio de ligação a antígeno e função. Mais particularmente, 14 resíduos como tendo sofrido eventual mutação foram identificados.

[000442] Em uma primeira etapa, resíduos envolvidos nas âncoras ou estrutura de CDR serão testados. Tais resíduos são os resíduos 40 (H/D), 45 (A/S), 55 (W/D), 66 (N/I) e 67 (Y/F).

[000443] Em uma segunda etapa, resíduos expostos a solvente e, como tal, que também podem estar envolvidos em imunogenicidade, também serão testados. Esses são os resíduos 1 (Q/E), 3 (Q/L), 5 (V/Q), 48 (Q/M) e 80 (R/V).

[000444] Então, em uma terceira etapa, resíduos envolvidos na estrutura/duplicação do domínio variável também poderiam sofrer mutação. Esses são os resíduos 9 (A/P), 13 (K/V), 22 (S/P) e 46 (P/H). [000445] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

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100/131 [000446] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes resíduos, isto é, resíduos 12 (V/L), 21 (V/I), 43 (R/K), 49 (G/S), 53 (M/I), 68 (A/N), 72 (Q/K), 75 (R/K), 76 (V/A), 78 (M/L), 82 (T/K), 84 (I/S), 92 (S/R), 93 (R/S), 95 (R/T) e 97 (D/E), sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000447] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000448] A Figura 34 representa a VH humanizada de 223C4 com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

Exemplo 15: atividade antitumor do Mab 224G11 de murino isoladamente ou combinado com o agente quimioterapêutico Navelbine® sobre o modelo de tumor de xenoenxerto NCI-H441 estabelecido [000449] Abordagens quimioterapêuticas de sucesso dependem, em parte, da resposta celular a indutores apoptóticos e do equilíbrio entre vias pró- e antiapoptóticas dentro da célula. O efeito proliferativo da cMet ativada sobre a sobrevivência celular foi documentado. Ele resulta principalmente de uma expressão aumentada das proteínas antiapoptóticas Bcl-x1 e Bcl-2 como uma consequência de sinalização PI3-K-mediada a qual, por sua vez, inibe a apoptose dependente de mitocôndria (caspase 9). Na verdade, é concebível que o sistema HGF/c-Met, com seu efeito regulatório acentuado sobre o processo apoptótico, também possa influenciar a sensibilidade de células cancerígenas a químio. Essa hipótese foi testada com o Navelbine®, um agente quimioterapêutico comercializado usado para o tratamento de câncer de pulmão (Aapro et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 40: 251-263; Curran et al., Drugs Aging. 2002, 19: 695-697). O modelo

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101/131 de xenoenxerto NSCLC NCI-H441 foi usado, uma vez que foi previamente descrito que essa linhagem de célula é sensível ao

Navelbine® (Kraus-Berthier et al., Clin. Cancer Res., 2000; 6: 297-304) e terapia objetivando a c-Met (Zou H. T. et al., Cancer Res. 2007, 67:

4408-4417).

[000450] Resumidamente, células NCI-H441 da ATCC foram rotineiramente cultivadas em meio RPMI 1640, FCS a 10% e LGlutamina a 1%. As células foram divididas dois dias antes de enxertagem, de modo que elas estavam na fase exponencial de crescimento. Dez milhões de células NCI-H441 foram enxertadas em PBS a camundongos nus Swiss de 7 semanas de idade. Três dias após implante, os tumores foram medidos e os animais foram divididos em 4 grupos de 6 camundongos com tamanho de tumor comparável. Os camundongos foram tratados i.p. com uma dose de carregamento de 2 mg de 224G11/camundongo e, então, duas vezes por semana durante 43 dias, com 1 mg de anticorpo/camundongo. O MAb 9G4 foi usado como um controle de isotipo.

[000451] Navelbine® foi fornecido através de injeções i.p. em uma dose de 8 mg/kg nos dias 5, 12, 19 pós-injeção de células. Para terapia combinada com 224G11 e Navelbine®, os dois compostos foram administrados separadamente. nessa experiência, os 2 compostos foram usados em sua dosagem ótima. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana e calculado através da fórmula: p/6 X comprimento X largura X altura.

[000452] A Figura 35 demonstra que 224G11 é tão eficiente quanto o Navelbine® quando usado isoladamente como uma terapia com um único agente. Um benefício significativo de combinação de ambas as terapias foi observado, com regressões completas do tumor observadas para 3 dos 6 camundongos no dia 63.

Exemplo 16: inibidores de c-Met e angiogênese

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102/131 [000453] Além de seu papel direto na regulação de uma variedade de funções de células tumorais, a ativação de c-Met também foi implicada em angiogênese tumoral. Células endoteliais expressam cMet e o HGF estimula o crescimento, invasão e motilidade de células endoteliais (Nakamura Y. et al., Biochem. Biophys. Res., Commun. 1995, 215: 483-488; Bussolino F. et al., J. Cell Biol. 1992, 119: 629641). A regulação coordenada de crescimento, invasão e motilidade em células endoteliais vasculares pelo HGF/c-Met foi demonstrada como resultando na formação de tubos endoteliais capilares 3D in vitro (Rosen E.M. et al., Supplementum to Experientia 1991,59: 76-88).

[000454] Para determinar uma interferência potencial de MAbs antic-Met com angiogênese HGF-induzida, dois conjuntos de experimentos foram realizados, incluindo i) a avaliação de MAbs sobre a proliferação de HUVECs e ii) o teste de MAbs sobre a formação de tubo em HUVECs.

[000455] Para experimentos de proliferação, 7500 HUVECs foram colocadas em cada poço de uma lâmina com 96 poços previamente revestida com laminina. As células foram crescidas 24 horas no meio de ensaio EMB-2 suplementado com FBS a 0,5% e heparina. Então, MAbs a serem testados (0,15 a 40 pg/ml) foram adicionados durante 1 h antes da adição de 20 ng/ml de HGF. Após mais 24 horas, as células foram submetidas a um pulso de 0,5 pCi de [³H] Timidina. A magnitude de [³H] Timidina incorporada foi quantificada através de contagem de cintilação de líquido. Nesse experimento, o MAb 9G4 é um anticorpo irrelevante usado como um controle de isotipo de IgG1.

[000456] Os resultados, expressos como dados brutos na Figura 36, demonstram que, conforme esperado, o HGF é um indutor potente de crescimento de células HUVEC. Anticorpos avaliados na ausência de HGF não mostram qualquer atividade proliferativa agonista sobre as HUVECs, qualquer que seja a dose testada. Na presença de HGF,

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103/131 uma inibição dose-dependente dramática foi observada para ambos os

Mabs 11E1 e 224G11.

[000457] Para avaliação da formação de tubo em HUVEC, 25000 células incubadas 30 min com anticorpos a serem testados foram colocadas em lâminas com 48 poços revestidos com Matrigel. Então, HGF a 50 ng/ml foi adicionado e as lâminas foram incubadas a 37°C. O meio foi, então, coletado e CMFDA a 5 gM foi adicionado durante 15 min antes de observação microscópica.

[000458] Os resultados mostrados na Figura 37 demonstram que, conforme esperado, o HGF induz à formação significativa de tubo. O anticorpo 9G4 introduzido como um controle de isotipo de IgG1, não teve qualquer efeito sobre a formação de tubo HGF-induzida, enquanto que 11E1 e 224G11 inibiram dramaticamente a formação de tubo.

Exemplo 17: processo de humanização através de enxertagem de CDR do anticorpo 11E1

I - Humanização do domínio variável de cadeia leve

Comparação da sequência nucleotídica da VL de 11E1 aos genes de linhagem germinativa de murino [000459] Como uma etapa preliminar, a sequência nucleotídica da VL de 11E1 foi comparada às sequências dos genes de linhagem germinativa de murino, parte do banco de dados IMGT (http://imgt.cines.fr).

[000460] Os genes de linhagem germinativa de murino IGKV4-79*01 e IGKJ4*01 com uma identidade de sequência de 98,58% para a região V e 97,22% para a região J, respectivamente, foram identificados. Com relação à identidade obtida, foi decidido usar diretamente as sequências de VL de 11E1 para buscar homologias humanas.

[000461] Esses alinhamentos são representados nas Figuras 38A

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104/131 para o gene V e 38B para o gene J.

Comparação da sequência nucleotídica da VL de 11E1 aos genes de linhagem germinativa humana [000462] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a VL de 11E1 foi buscado. Para essa finalidade, a sequência nucleotídica da VL de 11E1 foi alinhada às sequências do gene de linhagem germinativa humana, parte do banco de dados IMGT.

[000463] Os genes de linhagem germinativa humana IGKV3-7*02 e IGKV3D-7*01 com uma identidade de sequência para ambos os genes de linhagem germinativa de 69,86% para a região V foram identificados. O gene de linhagem germinativa humana IGKV3-7*02 é conhecido no banco de dados IMGT como uma ORF, o que significa que essa sequência é encontrada no genoma humano, mas pode apresentar alguns problemas de recombinação, levando a anticorpos naturais derivados de IGKV3-7*02 não funcionais. Assim, o gene de linhagem germinativa IGKV3D-7*01 foi selecionado como a região V humana receptora para a VL de murino de CDRs de 11E1.

[000464] Para a região J, o melhor escore de homologia foi primeiro obtido com um gene de linhagem germinativa humana IGKJ3*01 mostrando uma identidade de sequência de 78,38%. Mas um maior número de nucleotídeos consecutivos idênticos e uma melhor adaptação de aminoácido foram encontrados no alinhamento com o gene de linhagem germinativa humana IGKJ4*02 (identidade de sequência de 75,68%). Assim, o gene de linhagem germinativa IGKJ4*02 foi selecionado como região J humana receptora para a VL de murino de CDRs de 11E1.

[000465] Os alinhamentos são representados na Figuras 39A para a região V e 39B para a região J.

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105/131 [000466] Para otimização da seleção, aqueles versados na técnica também poderiam fazer alinhamentos entre as sequências proteicas de forma a auxiliá-los na escolha.

Versão humanizada de VL de 11E11 [000467] As etapas seguintes no processo de humanização consistem em ligação das sequências de genes de linhagem germinativa selecionados IGKV3D-7*01 e IGKJ4*02 e também das CDRs da VL de murino de 11E1 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000468] Conforme representado na Figura 40, os resíduos em negrito na sequência VL de 11E1 correspondem aos trinta aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VL de 11E1 e as frameworks humanas selecionadas (FR humana, isto é, IGKV3D-7*01 e IGKJ4*02).

[000469] Com relação a vários critérios, tais como sua participação conhecida na interface VH/VL, na ligação a antígeno ou na estrutura da CDR, as alterações de classe de aminoácido entre resíduos de murino e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D do domínio variável, quatro dos trinta diferentes resíduos foram identificados como tendo sofrido eventual mutação. Esses quatro resíduos definidos mais importantes e mutações em suas contrapartes humanas sendo L4 de murino para M humana, Y40 para S, Y87 para F e T96 15 para P. Esses resíduos classificados como um são mostrados na Figura 40 como resíduos em negrito na sequência HZVL de 11E1, onde eles permaneceram de murino.

[000470] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

[000471] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes

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106/131 resíduos classificados como dois, isto é, resíduos 24 (S/R), 53 (W/L), (I/T), 67 (L/R), 86 (S/D), 95 (Q/E), 99 (A/F) ou 121 (E/D) sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

[000472] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem eventualmente testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais. Em outra modalidade preferida, todos os dezoito outros resíduos classificados como três entre os trinta diferentes aminoácidos poderiam ser reconsiderados.

[000473] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000474] Figura 40 representa a VL humanizada de E11E1 implementada com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

II - Humanização do domínio variável de cadeia pesada

Comparação da sequência nucleotídica da VH de 11E1 aos genes de linhagem germinativa de murino [000475] Como uma etapa preliminar, a sequência nucleotídica da VH de 11E1 foi comparada às sequências dos genes de linhagem germinativa de murino, parte do banco de dados IMGT (http://imgt.cines.fr).

[000476] Os genes de linhagem germinativa de murino IGHV1-7*01, IGHD4-1*01 e IGHJ3*01 com uma identidade de sequência de 94,10% para a região V, 66,67% para a região D e 100% para a região J, respectivamente, foram identificados. Com relação à identidade obtida, foi decidido usar diretamente as sequências de VH de 11E1 para buscar homologias humanas.

[000477] Esses alinhamentos são representados nas Figuras 41A para o gene V, 41B para o gene D e 41C para o gene J.

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Comparação da sequência nucleotídica da VH de 11E1 aos genes de linhagem germinativa humana [000478] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a VH de 11E1 foi buscado. Para essa finalidade, a sequência nucleotídica da VH de 11E1 foi alinhada às sequências do gene de linhagem germinativa humana, parte do banco de dados IMGT. Para otimização da seleção, alinhamentos entre as sequências proteicas foram feitos para buscar melhores homologias. Esses dois métodos complementares levam à identificação de duas possíveis sequências V receptoras humanas para uma VH de murino de CDRs de 11E1. Alinhamento nucleotídico proporciona o gene de linhagem germinativa humana IGHV1-2*02 com uma identidade de sequência de 75,69%, enquanto que o alinhamento protéico proporciona o gene de linhagem germinativa humana IGHV146*01 com uma identidade de sequência de 71,10%.

[000479] É notável que a região D pertence estritamente à região CDR3 no domínio VH. O processo de humanização é baseado em uma abordagem de enxertagem de CDR. Análise dos D-genes humanos mais próximos não é útil nessa estratégia.

[000480] Buscas por homologias para a região J levam à identificação do gene de linhagem germinativa humana IGHJ4*03 com uma identidade de sequência de 80,85%.

[000481] Buscando por similaridades globais e alinhamentos de sequência, o gene de linhagem germinativa V humana IGHV1-46*01 e o gene de linhagem germinativa J humana IGHJ4*03 foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para a VH de murino de CDRs de 11E1.

[000482] Os alinhamentos são representados na Figuras 42A para a região V e 42B para a região J.

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Versão humanizada de VH de 11H1 [000483] As etapas seguintes no processo de humanização consistem em ligação das sequências dos genes de linhagem germinativa selecionados IGHV 1-46*01 e IGHJ4*03 e também das CDRs da VH de murino de 11E1 às frameworks dessas sequências de genes de linhagem germinativa.

[000484] Conforme representado na Figura 43, os resíduos em negrito na sequência VH de 11E1 correspondem aos vinte e seis aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VH de 11E1 e as frameworks humanas selecionadas (FR humana, isto é, IGHV1-46*01 e 10 IGHJ4*03).

[000485] Com relação a vários critérios, tais como sua participação conhecida na interface VH/VL, na ligação a antígeno ou na estrutura da CDR, as alterações de classe de aminoácido entre resíduos de murino e humanos, localização do resíduo na estrutura 3D do domínio variável, cinco dos vinte e seis diferentes resíduos foram identificados como tendo sofrido eventual mutação. Esses cinco resíduos definidos mais importantes e mutações em suas contrapartes humanas sendo N40 de murino para H humana, Y55 para I, D66 para S, A80 para R e K82 para T. Esses resíduos classificados como um são mostrados na Figura 43 como resíduos em negrito na sequência HZVH de 11E1, onde eles permaneceram de murino.

[000486] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais.

[000487] Com o auxílio de um modelo molecular, outras mutações poderiam ser identificadas. Podem ser mencionados os seguintes resíduos classificados como dois, isto é, resíduos 53 (I/M), 71 (L/F), 76 (A/V), 78 (L/M) e 87 (A/V) sobre os quais mutações também poderiam ser consideradas em outra modalidade preferida.

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109/131 [000488] Naturalmente, os resíduos mencionados acima a serem eventualmente testados não são limitados, mas devem ser considerados como mutações preferenciais. Em outra modalidade preferida, todos os dezesseis outros resíduos classificados como três dentre os vinte-seis diferentes aminoácidos poderiam ser reconsiderados.

[000489] Todas as mutações mencionadas acima serão testadas individualmente ou de acordo com várias combinações.

[000490] A Figura 43 representa a VH humanizada VH de 11E1 implementada com as mutações mencionadas acima claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

Exemplo 18: efeito de Mabs purificados sobre a fosforilação de c-met [000491] No exemplo 3, o efeito de Mabs anti-c-Met sobre a fosforilação foi ensaiado com sobrenadantes dosados de cada hibridoma a ser avaliado. O teste foi realizado novamente com Mabs 11E1 e 224G11 purificados que foram avaliados em uma concentração final de 30 pg/ml (a 200 nM) ou em uma faixa de dose de 0,0015 a 30 pg/ml (a 0,01-200 nM) de forma a determinar a IC50 de cada anticorpo. O protocolo usado é o mesmo conforme aquele descrito no exemplo 3. [000492] Os resultados de 3 experimentos independentes são apresentados na Figura 44 e demonstram que, uma vez purificados, 11E1 e 224G11 não mostraram efeito agonista quando adicionados isoladamente à células A549 e, respectivamente, um efeito antagonista de 87 e 75% na presença de HGF. Conforme esperado, o Mab 5D5 introduzido como um controle positivo agonista, mostrou um efeito agonista significativo (58%) quando adicionado isoladamente e apenas um efeito antagonista moderado (39%) na presença de HGF. Com relação aos cálculos de EC50, 11E1 e 224G11 tinham IC50s nanomolares.

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Exemplo 19: combinação in vivo de 224G11 e Navelbine® sobre o modelo de xenoenxerto NCI-H441 [000493] Células NCI-H441 da ATCC foram rotineiramente cultivadas em meio RPMI 1640, FCS a 10%, L-Glutamina a 1%. As células foram divididas dois dias antes de enxertagem, estando na fase exponencial de crescimento. Dez milhões de células NCI-H441 foram enxertadas em camundongos nus atímicos. Cinco dias após implante, os tumores eram mensuráveis e os animais foram divididos em 6 grupos de 6 camundongos com tamanho comparável do tumor. Os camundongos foram tratados i.p. com uma dose de carregamento de 2 mg de Mab 224G11 /camundongo e, então, duas vezes por semana com 1 mg de anticorpo/camundongo até o Dia 38 ou com 3 injeções de Navelbine® (D5, D12, D19) a 8 mg/kg. Um terceiro grupo administrado com o tratamento combinado também foi incluído. Navelbine® foi fornecido através de injeções i.p. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana e calculado através da fórmula: π/6 X comprimento X largura X altura e os pesos dos animais foram monitorados a cada dia durante o período de tratamento com Navelbine®. Análise estatística foi realizada em cada tempo medido usando um t-teste ou um teste de Mann-Whitney. Nesse experimento, o volume médio do tumor de grupos tratados com uma única modalidade é reduzido em 72%, 76% e 99,8% para 224G11, Navelbine® e Navelbine® + 224G11, respectivamente, no dia 41 pós-primeira injeção. No dia 41, a terapia combinada melhorou significativamente o crescimento de tumor comparado com tratamentos com uma única terapia (p < 0,041 comparado com Navelbine® apenas e p < 0,002 comparado com 224G11 apenas no dia 41), 4 de 6 camundongos estando sem tumores no grupo com a terapia combinada. Os resultados são representados na Figura 45.

[000494] Esses resultados foram confirmados 50 dias após o final

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111/131 dos tratamento (D88), onde 66% dos camundongos que receberam o tratamento combinado permaneceram livres dos tumores.

Exemplo 20: combinação in vivo de 224G11 e Doxorubicina sobre o modelo de xenoenxerto NCI-H441 [000495] Células NCI-H441 da ATCC foram rotineiramente cultivadas em meio RPMI 1640, FCS a 10%, L-Glutamina a 1%. As células foram divididas dois dias antes de enxertagem, estando na fase exponencial de crescimento. Dez milhões de células NCI-H441 foram enxertadas em camundongos nus atímicos. Cinco dias após implante, os tumores eram mensuráveis e os animais foram divididos em grupos de 6 camundongos com tamanho comparável do tumor. Os camundongos foram tratados i.p. com uma dose de carregamento de 2 mg de Mab 224G11/camundongo e, então, duas vezes por semana com 1 mg de anticorpo/camundongo ou com 4 injeções de Doxorubicina (D5, D12, D19, D26) a 5 mg/kg. Um terceiro grupo administrado com o tratamento combinado também foi incluído. Doxorubicina foi fornecida através de injeções i.v. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana e calculado através da fórmula: π/6 X comprimento X largura X altura e os pesos dos animais foram monitorados a cada dia durante o período de tratamento com Doxorubicina. Análise estatística foi realizada em cada tempo medido usando um t-teste ou um teste de Mann-Whitney. As terapias únicas e o tratamento combinado mostraram atividade antitumor significativa comparado com o grupo de controle (p < 0,002 do D11 ao D39). Os resultados são representados na Figura 46.

[000496] Tratamento combinado também demonstra uma atividade anticrescimento de tumor significativa comparado com o tratamento com uma única modalidade entre D11 e D39, indicando que há um benefício em combinar Doxorubicina com um tratamento anti-c-Met.

Exemplo 21: combinação in vivo de 224G11 e Docetaxel sobre o

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112/131 modelo de xenoenxerto NCI-H441 [000497] Células NCI-H441 da ATCC foram rotineiramente cultivadas em meio RPMI 1640, FCS a 10%, L-Glutamina a 1%. As células foram divididas dois dias antes de enxertagem, estando na fase exponencial de crescimento. Dez milhões de células NCI-H441 foram enxertadas em camundongos nus atímicos. Cinco dias após implante, os tumores eram mensuráveis e os animais foram divididos em grupos de 6 camundongos com tamanho comparável do tumor. Os camundongos foram tratados i.p. com uma dose de carregamento de 2 mg de Mab 224G11/camundongo e, então, duas vezes por semana com 1 mg de anticorpo/camundongo ou com 4 injeções de Docetaxel (D5, D12, D19, D26) a 7,5 mg/kg. Um terceiro grupo administrado com o tratamento combinado também foi incluído. Docetaxel foi fornecido através de injeções. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana e calculado através da fórmula: π/6 X comprimento X largura X altura e os pesos dos animais foram monitorados a cada dia durante o período de tratamento com Docetaxel. Análise estatística foi realizada em cada tempo medido usando um t-teste ou um teste de Mann-Whitney. As terapias únicas e o tratamento combinado mostraram atividade antitumor significativa comparado com o grupo de controle (p < 0,002 do D11 ao D35). Os resultados são representados na Figura 47.

[000498] Tratamento combinado também demonstra uma atividade anticrescimento de tumor significativa comparado com o tratamento com uma única modalidade entre D18 e D35, indicando que há um benefício em combinar Docetaxel com um tratamento anti-c-Met.

Exemplo 22: combinação in vivo de 224G11 e Temozolomida sobre o modelo de xenoenxerto U87MG [000499] Células U87-MG da ATCC foram rotineiramente cultivadas em meio DMEM, FCS a 10%, L-Glutamina a 1%. As células foram divididas dois dias antes de enxertagem, estando na fase exponencial

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113/131 de crescimento. Cinco milhões de células U87-MG foram enxertadas em camundongos nus atímicos. Dezenove dias após implante, os tumores eram mensuráveis e os animais foram divididos em grupos de 6 camundongos com tamanho comparável do tumor. Os camundongos foram tratados i.p. com uma dose de carregamento de 2 mg de Mab 224G11/camundongo e, então, duas vezes por semana com 1 mg de anticorpo/camundongo ou com 3 injeções de Temozolomida (D19, D26, D33) a 5 mg/kg. Um terceiro grupo administrado com o tratamento combinado também foi incluído. Temozolomida foi fornecida através de injeções. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana e calculado através da fórmula: π/6 X comprimento X largura X altura e os pesos dos animais foram monitorados a cada dia durante o período de tratamento com Temozolomida. Análise estatística foi realizada em cada tempo medido usando um t-teste ou um teste de Mann-Whitney. As terapias únicas e o tratamento combinado mostraram atividade antitumor significativa comparado com o grupo de controle (p < 0,002 do D22 ao D32 (onde camundongos de controle foram sacrificados por razões éticas)). Os resultados são representados na Figura 48.

[000500] Tratamento combinado também demonstra uma atividade anticrescimento de tumor significativa comparado com o tratamento com uma única (P < 0,002 do dia 22 ao dia 43 (onde camundongos de controle foram sacrificados por razões éticas) para Temozolomida e do dia 29 ao dia 53 (último dia de tratamento) para 224G11. Tomados juntos, esses dados indicam que há um benefício em combinar Temozolomida com um tratamento anti-c-Met.

Exemplo 23: formação de esferoide [000501] Conforme já descrito no Exemplo 9 para outros Mabs, nós avaliamos a capacidade do Mab 224G11 de inibir o crescimento de tumor in vitro no modelo de esferoide U87-MG. Para essa finalidade,

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114/131 células U87-MG crescidas como uma monocamada foram soltas através de tripsina-EDTA e resuspensas em meio de cultura de células completo. Os esferoides foram iniciados através de inoculação de 625 células à poços únicas de lâminas de fundo redondo com 96 poços em DMEM-FCS a 2,5%. Para impedir a adesão celular a um substrato, as lâminas foram pré-revestidas com poliHEMA em etanol a 95% e secas ao ar em temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas sob condições padrões de cultura a 37°C, 5% de CO2 em incubadoras umidificadas. Anticorpos monoclonais purificados (10 gg/ml) foram adicionados após 4 e 10 dias de cultura de esferoide. Os esferoides foram mantidos em cultura durante 17 dias. Então, o crescimento de esferoide foi monitorado através de medição da área de esferoides usando um módulo de medição automática do software Axio Vision. A área foi expressa em gm². 8-16 esferoides foram avaliados para cada condição. O tamanho do esferoide foi medido antes de adição de anticorpos, após 10 dias de cultura e após 17 dias de cultura.

[000502] Nessas condições, esferoides homogêneos foram obtidos e nenhuma diferença estatística foi observada antes de adição de anticorpos (Figura 49A).

[000503] Conforme ilustrado nas Figuras 49B-49D, o controle de isotipo 9G4 não teve efeito sobre o crescimento de esferoides após 10 ou 17 dias de cultura. Enquanto que a adição de 5D5 não teve um grande efeito sobre o tamanho de esferoide, a adição de 224G11 e 11E1 inibiu acentuadamente o crescimento de tumor.

Exemplo 24: atividade in vitro de formas quiméricas e humanizadas de 224G11 no ensaio de fosfo-c-Met [000504] De forma a comparar a eficácia in vitro de formas de murino, quiméricas e humanizadas em um ensaio funcional, sobrenadantes de cultura resultantes do hibridoma 224G11 e células HEK293 transfectadas foram dosados e testados conforme descrito no

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Exemplo 3. Os dados resumidos na Figura 50 mostraram os resultados esperados para o anticorpo de murino não purificado, conforme já descrito na Figura 6B. Os anticorpos quiméricos e humanizados não purificados mostraram uma atividade comparável, quer quando adicionados isoladamente (Figura 50A) ou quando incubados na presença de HGF (Figura 50B).

Exemplo 25: determinação de constantes de afinidade (KD) de anticorpos anti-c-Met através de análise Biacore [000505] A afinidade de ligação de anticorpos 11E1 e 224G11 purificados foi investigada através do BIAcore X usando o Domínio Extracelular de c-Met recombinante (ECD) fundido a um domínio Fc de IgG1 (R&D Systems) como antígeno (MW = 129 kDa). Uma vez que as proteínas de fusão c-Met-Fc e anticorpos são compostos bivalentes, fragmentos Fab dos mAbs 11E1 e 224G11 (MW = 50 kDa) foram gerados através de clivagem com papaína, purificados e usados nesse ensaio para evitar interferência com o parâmetro avidez. Para o ensaio, um anticorpo de captura anti-Tag de histidina foi revestido sobre lascas sensoras CM5. O tampão de operação foi HBS-EP, a taxa de fluxo foi de 30 pl/min e o teste foi realizado a 25°C. Antígeno cMet solúvel (ECD_M1)2-Fc-(HHHHHH)2 foi capturado sobre a lasca sensora (em torno de 270 RU) e os anticorpos a serem testados foram usados em solução como analitos. A lasca sensora foi regenerada usando tampão de Glicina, HCl, pH de 1,5 sobre ambas as células de fluxo durante meio minuto.

[000506] A Figura 51 ilustra o princípio dessa análise. Os parâmetros cinéticos resultantes são resumidos na tabela 4 a seguir. Eles indicam que ambos os anticorpos anti-c-Met 11E1 e 224G11 se ligam à proteína de fusão c-Met-Fc recombinante com afinidades comparáveis, oscilando de cerca de 40 pM.

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Tabela 4

	Kon1 X 10-⁶ [1/M.s]	Kon1 X 10-⁶ [1/M.s]	Meia-vida [h]	K [pM]
Fab de 11E1	1,13 ± 0,01	4,68 ± 0,001	4,1	41,4 ± 0,5
Fab de 224G11	2,04 ± 0,01	7,79 ± 0,40	2,5	34,8 ± 1,9
Exemplo 26: atividad	e in vivo de 224G11 sobre células M	DA-MB-231

coimplantadas com células MRC5 como fonte de HGF humano em camundongos nus atímicos [000507] Células MDA-MB-213 e MRC5 da ATCC foram cultivadas em meio DMEM, FCS a 10%, L-Glutamina a 1%. As células foram divididas dois dias antes de enxertagem, estando na fase exponencial de crescimento. Cinco milhões de células MDA-MB-231 e 500 000 células MRC5 foram coinjetadas s.c. a camundongos nus atímicos. Doze dias após implante, os tumores eram mensuráveis e os animais foram divididos em grupos de 6 camundongos com tamanho de tumor comparável. Os camundongos foram tratados i.p. com uma dose de carregamento de 2 mg de Mab 224G11/camundongo e, então, duas vezes por semana com 1 mg de anticorpo/camundongo. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana e calculado através da fórmula: π/6 X comprimento X largura X altura.

[000508] Os resultados descritos na Figura 52 mostraram uma diferença significativa no crescimento médio dos tumores de camundongos tratados com 224G11 comparado com aqueles do grupo de controle.

Exemplo 27: elementos complementares sobre a humanização de anticorpos 227H1, 11E1 e 224G11

Procedimento Geral [000509] Humanização de anticorpos anti-cMet foi realizada independentemente para cada cadeia e sequencialmente, com relação

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117/131 aos aminoácidos analisados em cada domínio variável. O processo de humanização foi avaliado em uma primeira tentativa em um ensaio de ligação ELISA à Fc-cMet recombinante; as atividades de ligação dos anticorpos humanizados sendo comparadas ao anticorpo quimérico recombinante. Em uma segunda tentativa, os anticorpos humanizados antianti-cMet foram avaliados com relação às suas capacidades de deslocar a ligação de Fc-cMet sobre HGF recombinante revestido sobre plástico; esse ensaio de competição permite a comparação direta de versões de murino, quiméricas e humanizadas dos anticorpos antianti-cMet.

[000510] Nas Figuras 53 e 54 são exemplificadas as atividades antiligação à c-Met típicas dos anticorpos monoclonais de murino 227H1, 11E1 e 224G11.

[000511] A Figura 53 mostra as atividade antiligação direta à c-Met de anticorpos de murino purificados detectados. Nesse ensaio, anticorpos monoclonais de murino anti-cMet mostram diferentes atividades antiligação à c-Met, mas ainda dependentes de dose.

[000512] A Figura 54 mostra as atividades de competição de ligação HGF-cMet de anticorpos purificados de murino. O ensaio de competição revela diferenças confiáveis entre esses anticorpos monoclonais antianti-cMet, com uma atividade competitiva moderada, não completa, mas confiável para o anticorpo monoclonal 11E1, enquanto que os anticorpos de murino 224G11 e 227H1 mostram um padrão similar de atividades competitivas, com um máximo de 100% de deslocamento de ligação ao HGF em uma alta concentração de anticorpo. O anticorpo monoclonal 224G11 mostrou o melhor valor de IC50.

[000513] É notável que as atividades de ligação direta dos anticorpos de murino não refletem suas propriedades competitivas de ligação ao HGF intrínsecas.

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118/131 [000514] Esses dois ensaios foram usados para caracterizar as versões quiméricas e humanizadas recombinantes dos anticorpos antianti-cMet de murino. Para essa finalidade, resumidamente, domínios variáveis antianti-cMet, seja de murino ou humanizados, foram clonados em vetores de expressão da série pCONplus da Lonza e anticorpos recombinantes IgG1/K-derivados foram expressos em células CHO. Os sobrenadantes de cultura foram concentrados e extensivamente submetidos à diálise contra PBS e, então, dosados com relação às concentrações de anticorpos expressos e diretamente usados para analisar as atividades antiligação à c-Met correspondentes. Ensaios de ligação direta e competição-HGF foram avaliados para melhor caracterizar as versões quiméricas ou humanizadas recombinantes.

Exemplo 27-1: humanização do domínio variável de cadeia pesada de 227H1 [000515] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a sequência VH de 227H1 de murino foi buscado. Com o auxílio do banco de dados IMGT, o gene de linhagem germinativa V humana IGHV1-2*02 e o gene de linhagem germinativa J humana IGHJ4*01 foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para a VH de murino de CDRs de 227H1.

[000516] A Figura 55 representa um alinhamento de aminoácido do domínio VH de 227H1 de murino com a estrutura principal selecionada. Na fileira FR humana, apenas o aminoácido que se verificou ser diferente do domínio VH do 227H1 de murino é representado. As fileiras HZ3VH, HZ2VH e HZ1VH correspondem às versões humanizadas implementadas do domínio VH de 227H1 com as mutações mencionadas acima (fileira trocado por) claramente

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119/131 identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

[000517] Em uma primeira série de experimentos, nós construímos e analisamos as atividades antiligação à c-Met das três versões humanizadas do domínio VH de 227H1 de murino quando expresso em combinação à cadeia leve quimérica do 227H1. Os resultados obtidos a partir do ensaio antiligação direta à c-Met são mostrados na Figura 56. Nesse experimento, nenhuma diferença nas capacidades de ligação dos anticorpos recombinantes quiméricos ou parcialmente humanizados 227H1-derivados testados foi observada. Nesse ponto, 26 dos 32 aminoácidos que se verificou serem diferentes entre um domínio VH de 227H1 de murino e a estrutura principal selecionada foram analisados e se descobriu não serem relevantes para a atividade antiligação à c-Met do domínio VH humanizado do 227H1, quando combinado com a cadeia leve quimérica.

[000518] Em conjunto com uma análise por mutagênese dirigida ao sítio dos últimos seis resíduos de murino na versão humanizada HZ1VH do domínio VH de 227H1, nós construímos uma versão totalIMGT humanizada original HZ4VH e testamos suas propriedades antiligação à c-Met. Os resultados são fornecidos na Figura 57 para o ensaio de ligação direta e na Figura 58 para o ensaio de competição de ligação ao HGF. É notável que ambas as versões quiméricas e humanizadas recombinantes de 227H1 mostram uma melhor atividade competitiva do que o anticorpo de murino de origem.

[000519] Todavia, dado os dados experimentais obtidos com relação às propriedades antiligação à c-Met do domínio VH humanizado totalIMGT do 227H1, a sequência de aminoácido resultante representada na Figura 59 foi selecionada e uma análise bioinformática foi, então, realizada para avaliar o nível de humanidade do assim denominado domínio variável HZ VH humanizado do 227H1.

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120/131 [000520] Para essa finalidade, uma comparação simples das sequências de estrutura principal com o banco de dados humano foi realizada usando as ferramentas IMGT. Dado o nível de humanização que nós obtivemos durante esse processo, dos 89 aminoácidos analisados correspondendo aos resíduos de estrutura principal, se descobriu que 89 eram confiáveis com uma origem humana. Apenas resíduos das CDRs podem ser diferentes mas, se assim, são diferentes do gene de linhagem germinativa humana correspondente e estão, obviamente, em posições hipervariáveis. Baseado no sistema de numeração IMGT e ferramentas de análise de homologia, nós primeiro humanizamos totalmente um domínio variável de anticorpo originário de murino.

Exemplo 27-2:hHumanização de anticorpo monoclonal 11E1

I - Humanização do domínio variável de cadeia pesada de 11E1 [000521] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a sequência VH de 11E1 de murino foi buscado. Com o auxílio do banco de dados IMGT, o gene de linhagem germinativa V humana IGHV1-46*01 e o gene de linhagem germinativa J humana IGHJ4*03 foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para a VH de murino de CDRs de 11E1.

[000522] A Figura 60 representa um alinhamento de aminoácido do domínio VH de 11E1 de murino com a estrutura principal humana selecionada. Na fileira FR humana, apenas o aminoácido que se verificou ser diferente do domínio VH de 11E1 de murino é representado. As fileiras HZ VH3, HZ VH2 e HZ VH1 correspondem às versões humanizadas implementadas do domínio VH de 11E1 com as mutações mencionadas acima (fileira trocado por) claramente

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121/131 identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

[000523] Em uma primeira série de experimentos, construíu-se e analisamos as atividades antiligação à c-Met das três primeiras versões humanizadas do domínio VH de 11E1 quando expresso em combinação com a cadeia leve quimérica de 11E1. Os resultados obtidos a partir do ensaio antiligação direta à c-Met são mostrados na Figura 61. Nesse experimento, uma capacidade de ligação similar dos anticorpos recombinantes quiméricos ou parcialmente humanizados 11E1-derivados testados foi observada. Nesse ponto, 19 dos 24 aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VH de 11E1 de murino e a estrutura principal humana selecionada foram analisados e se verificou não serem relevantes para a atividade antiligação à c-Met do domínio VH de 11E1 humanizado, quando combinado com a cadeia leve quimérica.

II - Humanização do domínio variável de cadeia leve de 11E1 [000524] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a sequência VL de 11E1 de murino foi buscado. Com o auxílio do banco de dados IMGT, o gene de linhagem germinativa V humana IGKV3D-7*01 e o gene de linhagem germinativa J humana IGKJ4*01 foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para a VL de murino de CDRs de 11E1.

[000525] A Figura 62 representa um alinhamento de aminoácido do domínio VL de 11E1 de murino com a estrutura principal humana selecionada. Na fileira Fr humana, apenas o aminoácido que se verificou ser diferente do domínio VL de 11E1 de murino é representado. As fileiras HZ VL3, HZ VL2 e HZ VL1 correspondem às

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122/131 versões humanizadas implementadas do domínio VL de 11E1 com as mutações mencionadas acima (fileira trocado por) claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita.

[000526] Em uma primeira série de experimentos, nós construímos e analisamos as atividades antiligação à c-Met das três primeiras versões humanizadas do domínio VL 11E1 de murino quando expresso em combinação com a cadeia pesada quimérica do 11E1. Os resultados obtidos a partir do ensaio antiligação direta à c-Met são mostrados na Figura 63. Nesse experimento, nós observamos capacidades de ligação similares dos anticorpos recombinantes quiméricos ou parcialmente humanizados 11E1-derivados testados. Nesse ponto, 26 dos 30 aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VL de 11E1 de murino e a estrutura principal humana selecionada foram analisados e não se verificou serem relevantes para a atividade antiligação à c-Met do domínio VL humanizado de 11E1, quando combinado com a cadeia pesada quimérica.

III - Humanização do anticorpo 11E1 [000527] Nesse estágio de humanização do anticorpo monoclonal 11E1, a sequência de anticorpo humanizado resultante teórica contém apenas cinco resíduos fora de CDRs provenientes do domínio VH de murino de origem e quatro resíduos fora das CDRs provenientes da sequência VL de murino de origem (veja Figura 60, fileira HZ VH1 e Figura 62, fileira HZ VL1). Então, foi decidido caracterizar imediatamente a versão humanizada de cadeias leve e pesada combinada do anticorpo 11E1. Os resultados são fornecidos na Figura 64 para o ensaio antiligação direta à c-Met.

[000528] Nesse experimento, foi observado capacidades de ligação similares para os anticorpos recombinantes quiméricos ou humanizados 11E1-derivados testados. Análise de propriedades

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123/131 competitivas de ligação ao HGF e análise por mutagênese dirigida ao sítio da contribuição dos nove resíduos de murino à esquerda que restaram foram realizadas independentemente ou em combinação nessa versão pré-humanizada VH1/VL1 selecionada do anticorpo monoclonal 11E1.

Exemplo 27-3: humanização de anticorpo monoclonal 224G11

I - Humanização de domínio variável de cadeia pesada de 224G11 [000529] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a sequência VH de 224G11 de murino foi buscado.

[000530] Com relação à alta homologia de sequência entre as sequências de domínio VH de 224G11 e 227H1 e conforme confirmado através do uso de ferramentas do banco de dados IMGT, o mesmo gene de linhagem germinativa V humana IGHV1-2*02 e gene de linhagem germinativa J humana IGHJ4*01 foram, assim, selecionados como sequências humanas receptoras para a VH de murino de CDRs de 224G11 .

[000531] Baseado nessa alta homologia, foi decidido transferir diretamente as informações de humanização obtidas a partir de humanização do domínio VH de 227H1 (veja Exemplo 27) e, então, criou-se uma versão humanizada total-IMGT, conforme representado na Figura 65, a qual representa um alinhamento de aminoácido dos domínios VH de 227H1 e 224G11 de murino com as frameworks selecionadas. Na fileira FR humana, apenas o aminoácido que se verificou ser diferente do domínio VH de 224G11 de murino é representado. A fileira HZ VH0 corresponde à versão humanizada total-IMGT do domínio VH de 224G11, conforme obtido para o domínio HZ VH de 227H1 total-IMGT.

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124/131 [000532] A versão humanizada total-IMGT do domínio VH do 224G11 de murino foi, então, construída e suas atividades antiligação à c-Met foram analisadas, quando expresso em combinação com a cadeia leve quimérica de 224G11. Os resultados obtidos a partir do ensaio antiligação direta à c-Met são mostrados na Figura 66, enquanto que a Figura 67 ilustra o ensaio de competição de ligação ao HGF. Dado os dados experimentais obtidos com relação às propriedades antiligação à c-Met do domínio VH de 224G11 humanizado total-IMGT, a sequência de aminoácido resultante, conforme representado na Figura 65, foi selecionada e uma análise bioinformática foi, então, realizada para avaliar o nível de humanidade do assim denominado domínio HZ VH0 de 224G11.

[000533] Dada a estratégia de humanização aplicada aqui, pode-se referir ao Exemplo 27 para a análise de humanidade da sequência HZ VHO de 224G11. Conforme descrito para a humanização do domínio VH de 227H1, nós confirmamos a confiabilidade do sistema de numeração IMGT e ferramentas de análise de homologia e também demonstramos a possibilidade de transferência da estratégia de humanização entre anticorpos sob os limites de sua homologia intrínseca.

II - Humanização do domínio variável de cadeia leve de 224G11 [000534] De forma a identificar o melhor candidato humano para a enxertagem de CDR, o gene de linhagem germinativa humana mostrando a melhor identidade com a sequência VL de 224G11 de murino foi buscado. Com o auxílio de ferramentas de análise do banco de dados IMGT, duas possíveis regiões V humanas receptoras para a VL de murino de CDRs de 224G11 foram identificadas. Assim, duas estratégias de humanização foram planejadas para o domínio VL de 224G11. A primeira corresponde a um experimento inicial para uma

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125/131 estrutura principal humana com um comprimento de CDR1 mais curto (IGKV3-11*01), a segunda com um comprimento de CDR1 mais longo (IGKV4-1*01).

[000535] A Figura 68 representa um alinhamento de aminoácido do domínio VL de 224G11 de murino com as duas frameworks selecionadas. Nas fileiras de FR Hu-FR mais curta e mais longa, apenas o aminoácido que se verificou ser diferente do domínio VL de 224G11 de murino é representado. As fileiras HZ VL3 e HZ VL6 correspondem às versões humanizadas básicas do domínio VL de 224G11 com as mutações mencionadas acima (fileira classificação) claramente identificadas. O número sob cada mutação proposta corresponde à classificação na qual a referida mutação será feita, quer a CDR1-estrutura principal mais curta ou mais longa seja selecionada.

[000536] Em um primeiro conjunto de experimentos, as duas versões humanizadas básicas do domínio VL de 224G11 de murino foram construídas e suas atividades antiligação à c-Met foram analisadas, quando expresso em combinação com a cadeia pesada quimérica de 224G11. Os resultados obtidos a partir do ensaio antiligação direta à cMet são mostrados na Figura 69. Nesse experimento, uma atividade antiligação à c-Met similar foi observada para as versões quiméricas e HZ VL6 (CDR1 mais longa), enquanto que quase nenhuma ligação foi detectada para o anticorpo recombinante 224G11-derivado HZ VL3 (CDR1 mais curta).

[000537] Em um segundo conjunto de experimentos, nós construímos e analisamos as atividades antiligação à c-Met das versões humanizadas implementadas do domínio VH HZ VL6-derivado de 224G11 quando expresso em combinação com a cadeia pesada quimérica de 224G11. Duas formas humanizadas adicionais foram analisadas; na versão HZ VL5, os sete resíduos do terceiro grupo

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126/131 (classificação 3) são humanizados e, na versão HZ VL4, os quatro resíduos à esquerda no primeiro grupo (resíduos de classificação 1) apenas permaneceram de murino. Os resultados obtidos a partir do ensaio antiligação direta à c-Met são mostrados na Figura 70. Nesse experimento, nenhuma diferença nas capacidades de ligação dos anticorpos recombinantes parcialmente humanizados ou quiméricos 224G11-derivados testados foi observada. Nesse ponto, 18 dos 22 aminoácidos que se verificou serem diferentes entre o domínio VL de 224G11 de murino e a estrutura principal CDR1 mais longa foram analisados e não se verificou serem relevantes para a atividade antiligação à c-Met do domínio VL do 224G11 humanizado, quando combinado com a cadeia pesada quimérica.

[000538] Então, foi testada a versão humanizada HZ VL4 do domínio VL de 224G11 no ensaio de competição de ligação ao HGF. Conforme mostrado na Figura 71, os resultados obtidos demonstram a atividade competitiva similar dos anticorpos derivados de 224G11 humanizados HZ VL4 e quiméricos recombinante e de murino.

[000539] Nesse estágio da humanização do domínio VL de 224G11, a sequência resultante contém apenas quatro resíduos fora das CDRs provenientes da sequência de origem de murino. Conforme mostrado na Figura 72, esses quatro resíduos §-rotulados são L4, M39, H40 e R84.

[000540] Baseado no sistema de numeração IMGT e ferramentas de análise de homologia, nós demonstramos que a estrutura principal mostrando diferenças estruturais em termos de comprimento de CDR ainda podem ser adequadas em um processo de humanização. Foi decidido caracterizar a versão humanizada de cadeias pesada e leve do anticorpo 224G11. Análise por mutagênese dirigida ao sítio da contribuição dos quatro resíduos de murino restantes foi, então, realizada quando expressa em combinação com uma versão

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127/131 humanizada VH0 da cadeia pesada.

III - Humanização de anticorpo 224G11 [000541] Em uma primeira série de experimentos, nós construímos e analisamos as atividades antiligação à c-Met da versão totalmente humanizada do anticorpo 224G11. Essa versão recombinante abrange os domínios VH e VL VH0 e VL4 humanizados, respectivamente. Os resultados obtidos a partir do ensaio antiligação direta à c-Met são mostrados na Figura 73. Nesse experimento, descobriu-se que a atividade antiligação à c-Met do 224G11 totalmente humano era similar àquela das versões humanizada e quimérica recombinante de uma única cadeia do 224G11. Foi, então, testada a versão totalmente humanizada do domínio VL de 224G11 no ensaio de competição de ligação ao HGF. Os resultados obtidos conforme mostrado na Figura 74 demonstram a atividade competitiva similar dos anticorpos derivados de 224G11 totalmente humanizados e quiméricos recombinantes e de murino de origem.

[000542] Nesse estágio de humanização do anticorpo 224G11, a sequência resultante contém apenas quatro resíduos fora das CDRs provenientes da sequência do domínio variável de cadeia leve de origem de murino. Foram, então, analisados variantes únicos por mutagênese dirigida ao sítio do domínio VL4 humanizado quando expresso em combinação com uma versão humanizada VH0 da cadeia pesada. Conforme exemplificado na Figura 75 para o ensaio de ligação direta, nós identificamos resíduos relevantes potenciais entre os quatro testados, sendo M39 e H40.

[000543] Foi decidido analisar múltiplos mutantes do domínio VL HZ VL4 humanizado de 224G11 quando expresso em combinação com o domínio VH HZ VH0 humanizado de 224G11. Conforme mostrado na Figura 76 para o ensaio de ligação direta e na Figura 77 para o ensaio de competição de ligação ao HGF, múltiplos mutantes de aminoácido

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128/131 do domínio VL4 foram analisados para identificar a melhor combinação humanizada. Baseado em análise de mutantes únicos, descobriu-se, sobre mutantes duplos e triplos que eles podem exibir as melhores atividades anti-cMet. O mutante VH0/VL4-2x corresponde ao domínio VH HZ VH0 de 224G11 expresso com o domínio VL HZ VL4 de 224G11 humanizado com a mutação dupla L4M/R84G. O mutante VH0/VL4-3x corresponde ao domínio VH HZ VH0 de 224G11 humanizado expresso com o domínio VL HZ VL4 de 224G11 humanizado com a mutação tripla L4M/M39L/R84G.

[000544] Dados os dados experimentais obtidos com relação às propriedades antiligação à c-Met do anticorpo totalmente humanizado 224G11, a análise bioinformática das sequências de domínio variável pesado e leve foi, então, realizada para avaliar o nível de humanidade das melhores versões humanizadas VH0/VL4-2x e VH0/VL4-3x. Foi previamente demonstrado a humanização totalIMGT do domínio VH0 VH de 224G11. Com relação ao nível de humanidade das versões de domínio VL humanizadas VL4-2x e -3x de 224G11, elas contêm apenas resíduos de murino M39 e/ou H40. Esses dois resíduos chave potenciais estão localizados no final da CDR1, M39 sendo a âncora de CDR N-terminal. Dado o problema de comprimento da CDR que foi defrontado durante a humanização do domínio VL de 224G11 e considerando essas posições como parte da definição de Kabat da VL CDR1, o nível de humanidade do anticorpo 224G11 totalmente humanizado mostraria uma imunogenicidade fortemente reduzida em virtude dos resíduos de murino mínimos conservados.

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RECEBIDO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL emitido de acordo com a Regra 7.1 pela

AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página

TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

PARA FINS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE

FORMULÁRIO INTERNACIONAL

PARA

Pierre Fabre Medicament

Institut de Recherche Pierre Fabre

Centre d’lmmunologie Pierre Fabre

5, avenue Napoléon III - BP 60497 74164 SAINT-JULIEN EN GENEVOIS

NOME E ENDEREÇO

DO

DEPOSITANTE

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo DEPOSITANTE: F50064-020(2bis)-224G11-Cl1A	Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL: CNCM I-3731
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microorganismo identificado sob I acima foi acompanhado por: [H uma descrição científica uma designação taxonômmica proposta (Marcar com um X onde aplicável)
III. RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
A presente Autoridade Depositária Internacional aceita o microorganismo identificado sob I acima, o qual foi recebido pela mesma em 14 de Março de 2007 (data do depósito original)¹
IV. RECEBIMENTO DE SICLITAÇÃO PARA CONVERSÃO
O microorganismo identificado sob I acima foi recebido por essa Autoridade Depositária Internacional em (data do depósito original) e uma solicitação para converter o depósito original em um depósito sob o Tratado de Budapeste foi recebida pela mesma em (data de recebimento da solicitação para conversão)
V. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL
Nome: COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) Endereço: Institut Pasteur 25, rue du Docteur Roux F-75724 Paris Cedex 15 (França)	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representar a Autoridade Depositária Internacional ou do(s) oficial(is) autorizado(s): Data: <signature> Georges 'WAGENER Paris, 25 de Abril de 2007

Onde a Regra 6.4(d) se aplica, tal data é a data na qual o estado de autoridade depositária internacional foi adquirido.

Formulário BP/4 (página única)

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TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

PARA FINS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE

FORMULÁRIO INTERNACIONAL

PARA

Madame Nathalie CORVAIA

Madame Liliane GOETSCH

Institut de Recherche Pierre Fabre

Centre d’lmmunologie Pierre Fabre

5, avenue Napoléon III - BP 60497 74164 SAINT-JULIEN EN GENEVOIS Cedex

NOME E ENDEREÇO DA PARTE

À QUAL A DESCLARAÇÃO DE VIABILIDADE

É FEITA

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE

Emitida de acordo com a Regra 10.2 pela

AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na página seguinte

I. DEPOSITANTE	II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Nome: PIERRE FABRE MEDICAMENT Institut de Recherche Pierre Fabre Centre d’lmmunologie Pierre Fabre Endereço: 5, avenue Napoléon III - BP 60497 74164 SAINT JULIEN EN GENEVOIS	Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL: CNCM-3731 Data de depósito ou da transferência¹ 14 de Março de 2007
III. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE
A viabilidade do microorganismo identificado sob II acima foi testada em 26 de M arço de 2007 . Nessa data, o referido microorganismo era Kl ³ viável □ ³ não mais viável

¹ Indicar a data do depósito original ou, onde um novo depósito ou uma transferência foi feita, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data da transferência).

² Nos casos mencionados na Regra 10.2(a)(ii) e (iii), refira-se ao teste de viabilidade mais recente.

³ Marcar com um X no quadro aplicável.

Formulário BP/9 (primeria página)

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IV. CONDIÇÕES SOB AS QUAIS O TESTE DE VIABILIDADE FOI REALIZADO⁴

V. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL
Nome: COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) Endereço: Institut Pasteur 25, rue du Docteur Roux F-75724 Paris Cedex 15 (França)	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representar a Autoridade Depositária Internacional ou do(s) oficial(is) autorizado(s): Georges Wagener <assinatura> Data: Paris, 25 de Abril de 2007

⁴ Preencher se a informação foi solicitada e se os resultados do teste foram negativos.

Formulário BP/9 (segunda e última página)

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 compreendendo, respectivamente, a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 1, 2 e 3; e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 compreendendo, respectivamente, a sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 10, 11 e 12.
2. Anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 21.
3. Hibridoma de murino capaz de secretar um anticorpo como definido na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido hibridoma é o hibridoma de murino depositado no CNCM, Institut Pasteur, Paris, em 14 de Março de 2007 sob o número 1-3731.
4. Anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.
5. Anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico, em que as regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada são derivadas de um anticorpo humano.
6. Anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é capaz de ligar especificamente à c-Met.
7. Anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que

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2/4 é capaz de inibir a ativação dependente de ligante e independente de ligante de c-Met.
8. Anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que inibe a dimerização de c-Met.
9. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que é escolhido dos seguintes ácidos nucleicos:

a) um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica um anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met como definido na reivindicação 1 ou 2;

b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA compreendendo a sequência SEQ ID No. 24 de CDR-H1, a sequência SEQ ID No. 25 de CDR-H2, a sequência SEQ ID No. 26 de CDR-H3 e a sequência SEQ ID No. 33 de CDR-L1, a sequência SEQ ID No. 34 de CDR-L2 e a sequência SEQ ID No. 35 de CDR-L3;

c) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA compreendendo a sequência SEQ ID No. 41 de cadeia pesada e a sequência SEQ ID NO. 44 de cadeia leve;

d) os ácidos nucleicos de RNA correspondentes dos ácidos nucleicos como definidos em b) e/ou c); e

e) os ácidos nucleicos complementares dos ácidos nucleicos como definidos em a), b) e c).
10. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido na reivindicação 9.
11. Método para a produção de um anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4-8, caracterizado pelo fato de que o método compreende:

a) cultura, em um meio e condições de cultura apropriados, de uma célula hospedeira que compreende um vetor como definido na

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3/4 reivindicação 10; e

b) recuperação dos referidos anticorpos ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met do meio de cultura ou das referidas células cultivadas.
12. Anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 8 ou obtido pelo método como definido na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.
13. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende, como um princípio ativo, um composto consistindo em um anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 8, ou obtido pelo método como definido na reivindicação 11 ou produzido pelo hibridoma como definido na reivindicação 3.
14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente como um produto combinado para uso simultâneo, separado ou sequencial, e em que o referido agente é um anticorpo antitumoral.
15. Composição de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um agente como um produto combinado para uso simultâneo, separado ou sequencial, em que o referido agente é um agente citotóxico/cistostático.
16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos referidos anticorpos ou um de seus fragmentos divalentes ligados à cMet, é conjugado com uma toxina celular e/ou um radioelemento.
17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento.
18. Uso de um anticorpo ou um de seus fragmentos diva

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4/4 lentes ligados à c-Met como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4-8 ou obtido pelo método como definido na reivindicação 11, ou produzido pelo hibridoma como definido na reivindicação 3 ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para a prevenção ou para o tratamento de câncer.
19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é um câncer escolhido de câncer de próstata, osteosarcomas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, glioblastoma ou câncer de cólon.
20. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é um câncer relacionado à ativação de c-Met selecionado dentre câncer que é dependente e/ou independente de HGF.
21. Método de diagnóstico in vitro de enfermidades induzidas por uma superexpressão ou uma subexpressão do receptor de cMet começando a partir de uma amostra biológica na qual a presença anormal do receptor de c-Met é suspeita, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende uma etapa em que a referida amostra biológica é contatada com o anticorpo ou um de seus fragmentos divalentes ligados à c-Met como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4-8, ou obtido pelo método como definido na reivindicação 11 ou produzido pelo hibridoma como definido na reivindicação 3, sendo possível que o referido anticorpo seja, se necessário, rotulado.