BRPI0801417B1

BRPI0801417B1 - Processo para obtenção de composição farmacêutica de retinóides, produto derivado de retinóides e uso

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Publication number: BRPI0801417B1
Application number: BRPI0801417-5A
Authority: BR
Inventors: Lucas Antônio Miranda Ferreira; Gisele Assis Castro Goulart; Rodrigo Lambert Oréfice; Cleida Aparecida De Oliveira; Germán Arturo Bohórquez Mahecha; Vicente Tadeu Lopes Buono
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais
Priority date: 2008-03-13
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2019-04-09
Also published as: WO2009111852A3; WO2009111852A2; BRPI0801417A2; BRPI0801417B8

Abstract

processo para obtenção de composição farmacêutica de retinóides, produto derivado de retinoides e uso. a presente invenção descreve o desenvolvimento de uma composição farmacêutica de nanopartículas lipídicas sólidas contendo retinóldes e aminas lipofilicas com aplicação cosmética. a invenção relata também, o processo para obtenção da composição com elevadas taxas de encapsulação de ácido retinóico em nanopartículas lipídicas sólidas através da formação de par iônico entre o ácido retinóico e aminas lipofílicas bem como seu uso.

Description

A presente invenção descreve o desenvolvimento de uma composição de nanopartículas lipídicas sólidas contendo retinóides e aminas lipofílicas com aplicação cosmética. A invenção relata também, o processo para obtenção de composição com elevadas taxas de encapsulação de ácido retinóico em nanopartículas lipídicas sólidas através da formação de par iônico entre o ácido retinóico e aminas lipofílicas bem como seu uso.

Os retinóides são usados no tratamento de diversas doenças e são eficazes no tratamento de distúrbios inflamatórios da pele, doenças malignas da pele, distúrbios hiperproliferativos, fotoenvelhecimento e outros. Retinóides tópicos podem normalizar a queratinização desordenada dos folículos pilosos, reduzir a inflamação e intensificar a penetração de outros fármacos tópicos.

O ácido retinóico todo-trans (AR, tretinoína, all-trans retinoic acid) vem sendo usado no tratamento da acne vulgar há quase quatro décadas. Um importante uso do AR é reduzir a hiperqueratose que leva a formação de microcomedões, a lesão inicial da acne. Os corneócitos foliculares se tornam menos coesos em decorrência da eliminação dos desmossomos, redução dos tonofilamentos, aumento da autólise e deposição intracelular de glicogênio nos queratinócitos (Wolf, M. J.; Harris, C. C.; Donaldson, G. L Corn endosperm: Proteín distribution and amino acid composition in amylomaize vs normal dent hybrid. Cereal Chem. (1975), 52, 765-770).

Além de tratar a acne, o AR melhora a pele humana que sofreu fotolesão (Kligman et al., 1986. Lindy P. Fox, Hans F. Mercke David R. Brickers. Farmacologia Dermatológica. In: Goodman and Gilman. As Bases Farmacológicas da Terapêutica. Laurence L. Brunton (Org.). The McGraw-HilI Companiesjnc. Rio de Janeiro, (2006) p. 1523). Efeitos epidérmicos incluem aumento da espessura da camada epidérmica e granulosa, diminuição das atividades dos melanócitos e maior secreção de substância similar ao glicosaminoglicano para o espaço intercelular. Na derme os efeitos são vasodilatação, angiogênese e aumento da síntese de colágeno dérmico papilar. Clinicamente, isto se traduz em modesta atenuação das rugas finas e grossas,

2/26 textura mais fina, tom mais róseo e redução da hiperpigmentação (Green, C. E., Gordon, G. R., Cohen, P. M., Nolen, H. W., Peters, J. H., and Tyson, C. A.

In vitro metabolism of glycol ethers by human and rat hepatocytes. Occup. Hyg. (1996) 2, 67-75). Em ensaios clínicos, o enrugamento, a hiperpigmentação 5 mosqueada e a aspereza melhoram na maioria dos pacientes tratados com retinóides, sendo a taxa de resposta aproximadamente duas vezes maior que a dos casos de controle que usaram protetores solares e emolientes (Stern, 2004. Lindy P. Fox, Hans F. Mercke David R. Brickers. Farmacologia Dermatológica. In: Goodman and Gilman. As Bases Farmacológicas da 10 Terapêutica. Laurence L. Brunton (Org.). The McGraw-HilI Companies.lnc. Rio de Janeiro, 2006. p. 1523).

Para este tipo de aplicação o estado da técnica relata o desenvolvimento de uma formulação de AR em que o fármaco está incorporado em microesponjas (Gollnick H, Cunliffe W, Berson D, Dreno B, Finlay A, Leyden JJ, Shalita AR 15 and Thiboutot D. Management of acne: A report from a Global Alliance to improve outcomes in acne. Journal of American Academy of Dermatology (2003) 49: S1-S38). As microesponjas não apenas diminuem a irritação por alentecer a liberação do fármaco, como também aumentam sua eficácia, direcionando a liberação para o folículo sebáceo (Webster GF. Topical tretinoin in acne therapy. The Journal of American Academy of Dermatology (1998) 39:

S38-S44).

Na terapia tópica da acne, o AR tem se mostrado eficiente em pacientes com acne inflamatória leve a moderada. No entanto, a aplicação tópica do AR é acompanhada por uma alta incidência de reações adversas que diminuem a 25 adesão do paciente e comprometem a eficácia da terapia. Uma das alternativas para diminuição das reações adversas associadas com esta terapia seria o uso de sistemas nano ou microestruturados do AR. Estes sistemas apresentam diversas vantagens em relação aos medicamentos convencionais, uma vez que são capazes de proporcionar direcionamento do fármaco para a unidade 30 pilosebácea (UPS), local de desenvolvimento da acne.

Alguns estudos relatam a alteração favorável da estabilidade química e atividade biológica do AR quando incorporado em nanopartículas lipídicas

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sólidas, assim como sua preparação, caracterização físico-química e poss%is vias de administração (Soo-Jeong Lim, Mi-Kyung Lee, Chong-Kook Kím. Altered chemical and biological activities of all-trans retinoic acid incorporated in solid lipid nanoparticle powders. Journal of Controlled Release (2004) 100:5361).

Outros estudos avaliam sistemas de liberação envolvendo nanopartículas, preparo e eficiência de encapsulação (Soo-Jeong Lim, ChongKook Kím. Formulation parameters determining the physicochemical chàracteristics of solid lipid nanoparticles loaded with all-trans retinoic acid.

International Journal of Pharmaceutics (2002) 243:135-146).

Sistemas de liberação são conhecidos pelos efeitos no tratamento de distúrbios de pele com melhora da estabilidade físico-química do composto veiculado (Yoko Yamaguchia, Teruaki Nagasawa, Natsumi Nakamura, Mitsuko Takenaga, Masako Mizoguchi, Shin-ichi Kawai, Yutaka Mizushima, Rie 15 Igarashi. Successful treatment of photo-damaged skin of nano-scale at RA particles using a novel transdermal delivery. Journal of Controlled Release 104 (2005) 29-40).

Estes sistemas podem, ainda, sofrer diferenciação como nanopartículas de uma fração vegetal da proteína do glúten do trigo, denominada gliadin 20 (Isabel Ezpeleta, Juan M. Irache, Serge Stainmesse, Christiane Chabenat, Jacques Gueguen, Yves Popineau, Anne-Marie Orecchioni. Gliadin nanoparticles for the controlled release of all-transretinoic acid International Journal of Pharmaceutics (1996) 131:191-200).

A terapia tópica da acne leve a moderada com o AR (all-trans retinoic 25 acid) ocupa um lugar proeminente entre as alternativas terapêuticas. No entanto, a aplicação tópica do AR é frequentemente acompanhada de uma alta incidência de reações adversas (Ellis, C. N., Millikan, L. E., Smith, E. B., Chalker, D. M., Swinyer, L. J., Katz, I. H., Berger, R.S., Mills, O. H. Jr._t Baker, M., Verschoore, M. and Loesche, C. “Comparison of adapalene 0.1% solution 30 and tretinoin 0.025% gel in topical treatment of acne vulgaris” Br. J. Dermatol.

(1998) 139(S52), 41-47; Webster, G. F. “Topical tretinoin in acne therapy J. Am. Acad. Dermatol. (1998) 39, S38-S44).

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grande potencial para penetração folicular, representa uma alternativa interessante para diminuir tais reações adversas. Os sistemas micro e nanoparticulados poliméricos e os lipossomais têm sido investigados para penetração folicular (Jung S, Otberg N, Thiede G, Richter H, Sterry W, Panzner

S and Landemann J. Innovative liposomes as a transfollicular drug delivery system: penetration into porcine hair follicles. The Journal of Investigative Dermatology (2006)126(8): 1728-1732; Vogt A, Mandt N, Landemann J, Schaefer H and Blume-Peytavi U. Follicular targeting - A promising tool in 10 selective dermatotherapy. The Journal of Investigative Dermatology.

Symposium Proceedings/The Society for Investigative Dermatology (2005) 10(3): 252-255; Vogt A, Combadiere B, Hadam S, Stieler KM, Landemann J, Schaefer H, Autran B, Sterry W and Blume-Peytavi U. 40nm, but not 750 or

1.500nm, nanoparticles enter epidermal CD1a+ cells after transcutaneous application on human skin. The Journal of Investigative Dermatology (2006) 126(6):1316-1322; Mordon S, Sumian C and Devoisselle JM. Site-specific methylene blue delivery to pilosebaceous structures using highly porous nylon microspheres: an experimental evaluation. Lasers in Surgery and Medicine (2003) 33: 119-125; Rolland A, Wagner N, Chatelus A, Shroot B and Schaefer

H. Site-specific drug delivery to pilosebaceous structures using polymeric microspheres. Pharmaceutical Research (1993) 10 (12): 1738-1744).

Entretanto, estes sistemas são de difícil transposição para a escala industrial e

NLS representam uma alternativa atraente para encapsulação do AR (Dingler A and Gohla S. Production of solid lipid nanoparticles (SLN): scaling up 25 feasibilities. Journal of Microencapsulation (2002) 19(1): 11-16.; Müller RH, Radtke M and Wissing SA. Solid lipid nanoparticles (SLN) and nanostructured lipid carriers (NLC) in cosmetic and dermatological preparations. Advanced Drug Delivery Reviews (2002) 54 (Suppl. 1): S131-S155).

Dentre os sistemas particulados, as nanopartículas lipídicas sólidas 30 (NLS) são alternativas interessantes para fármacos lipofílicos, tais como o AR. A encapsulação do AR, um lipídeo ácido, em NLS é usualmente baixo, exceto se uma relação tensoativo/lipídeo alta for usada (Lim, S. and Kim, C.

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% / “Formulation parameters determining the physicochemical characteristics of solid lipid nanoparticles loaded with all-trans retinoic acid” Int. J. Pharm. (2002). 243: 135-146; Hu, L., Tang, X. and Cui, F. “Solid lipid nanoparticles (SLNs) to improve oral bioavailability of poorly soluble drugs”. J. Pharm. Pharmacol.

(2004) 56, 1527-1535; Lim, S., Lee, M. and Kim, C. “Altered chemical and biological activities of all-trans retinoic acid incorporated in solid lipid nanoparticles powders” J. Control. Release (2004) 100, 58-61). Isto favorece a localização interfacial do AR e compromete benefícios da encapsulação na matriz lipídica. A associação de tensoativos é um fator importante na melhora 10 da eficiência da encapsulação em NLS (Mehnert W and Mãder K. Solid lipid nanoparticles production, characterization and applications. Advanced Drug

Delivery Reviews (2001) 47: 165-196; Bunjes H, Koch MH and Westesen K. Influence of emulsifiers on the crystallization of solid lipid nanoparticles. Journal of Pharmaceutical Sciences (2003)92 (7); 1509-1520).

Na presente invenção foi mostrado que a eficiência de encapsulação do

AR em NLS elevou-se com o aumento do equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) dos tensoativos. Adicionalmente, a adição de um co-surfactante (colesterol) proporcionou aumento significativo na eficiência de encapsulação. No entanto, independente das associações dos tensoativos usadas neste trabalho, a 20 eficiência de encapsulação do AR nas NLS foi baixa.

O aumento do caráter lipofílico da droga, através da formação de par iônico com uma amina, foi uma opção inovadora da presente invenção para contornar estes obstáculos, pois proporcionou um aumento ainda mais significativo na eficiência de encapsulação.

Outros estudos demonstram que sistemas de liberação podem ser influenciados pela formação de par iônico de desenvolvimento da acne (Michele Trotta, Elena Ugazio, Elena Peira, Caterina Pulitano. Influence of ion pairing on topical delivery of retinoic acid from microemulsions. Journal of Controlled Release (2003) 86:315-321.1).

A patente européia EP1674093A1 descreve um método para ajustar o tamanho de nanopartículas contendo ácido retinóico que compreendem micelas do princípio ativo revestido com sais inorgânicos de metais polivalentes

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ΟΦ ο><V c>, visando a possibilidade de uso dessas nanopartículas em cosméticos e preparações farmacêuticas ou não farmacêuticas, pretendidas para a aplicação na pele.

Enquanto a patente EP0836476B1 descreve novas formulações contendo ésteres de ácido retinóico, em associação com hidroquinona para tratamento de distúrbios na pele como acne, rugas, cicatrizes, marcas, manchas, psoríase e micoses cutâneas.

O depósito de patente USRE36068 descreve um método para tratamento de distúrbios na pele usando retinóides para aplicação tópica em quantidades 10 efetivas, em um veículo não tóxico e dermatologicamente aceitável para um programa de terapia de manutenção.

No entanto, em nenhuma das patentes citadas, foi descrita ou reivindicada, a formação de par iônico do ácido retinóico com uma amina, como opção inovadora para proporcionar um aumento significativo na eficiência de 15 encapsulação e reduzir os efeitos adversos.

A formulação da presente invenção caracteriza-se peto uso da mistura de excipientes aceitáveis farmaceuticamente combinados a retinódes, aminas lipofílicas, seus sais farmaceuticamente aceitáveis incluída em nanopartículas lipídicas sólidas (NLS), e no mínimo um outro composto farmacologicamente 20 ativo incluído ou não em NLS, microencapsulados em polímeros biodegradáveis como por exemplo PLA, PLGA e ou misturas desses. Podem ser preparadas formulações com um excipiente ou misturas desses. Exemplos de excipientes incluem água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, a solução de Ringer, solução de dextrose, a solução de Hank, soluções 25 salinas biocompatíveis contendo ou não polietileno glicol. Veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sesame, etil-oleato, ou triglicerídeo também podem ser usados. Outras formulações úteis incluem agentes capazes de aumentar a viscosidade, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, ou dextran para a obtenção dos géis ou formulações mucoadesívas que facilitam 30 muito a sua aplicação.

Os excipientes também podem conter quantidades menores de aditivos, como substâncias que aumentam isotonicidade e estabilidade química de ,Y^da% ü* >

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Y substância ou tampões. Exemplos de tampões incluem tampão fosfato, tampão' bicarbonato e tampão Tris, enquanto exemplos de conservantes incluem timerosal, m- ou o-cresol, formalin e benzil-álcool. As formulações padrões podem ser líquidos ou sólidos. Desta forma, uma formulação não-líquida, o excipiente pode incluir dextrose, albumina de soro humano, conservantes, etc. para qual água ou solução salina estéril pode ser acrescentada antes da administração.

A presente invenção usa as composições poliméricas, as nanopartículas lipídicas sólidas, as emulsões, as múltiplas emulsões, como carregadores do 10 ácido retinóico seu derivados e aminas lipofílicas. Essas formulações podem ser administradas via tópica, injeção intramuscular, injeção intravenosa, subcutânea, formulação oral, inalação ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados.

Não foi encontrada no estado da técnica nenhuma patente que reivindique a formação de par iônico do ácido retinóico com uma amina, bem como das suas composições farmacêuticas e seus usos na base de nanopartículas lipídicas sólidas, formulações mucoadesivas ou géis de aplicacação tópica que podem ser usados como método para tratamento de acne.

A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos, mas não limitantes:

Exemplo 1: Preparação das NLS

As NLS foram preparadas por método de homogeneização a quente, utilizando o homogeneizador Ultra Turrax T-25 (Ika Labortechnik, Alemanha) e 25 um ultra sonicador com sonda de alta potência (Ultra-cell 750W; Sonics Materiais Inc, USA). A fase oleosa (FO) e a fase aquosa (FA) foram pesadas separadamente e aquecidas à 85°C. Mantendo-se a temperatura à 85°C, a FA foi lentamente vertida sobre a FO sob agitação constante (8,000 rpm) no Ultra Turrax T-25. Essa emulsão foi imediatamente submetida à vibração da sonda 30 Ultra-cell (750W) por 5 min (utilizando-se aproximadamente 20% da potência da sonda). A influência de diferentes tensoativos e um co-surfactante (colesterol-CH) nas características das NLS (EE, tamanho de partícula e

8/26 potential zeta) foi investigada. Neste estudo, tensoativos não iônicos derivados de álcoois graxos etoxilados com diferentes EHL foram testados (Tabela 1).

Tabela 1. Composição das formulações de NLS (% p/p).

Componentes	NLS A	NLS B	NLSC	NLS D
Fase oleosa
Compritol 888 ATO	10	10	10	10
Ácido retlnóico (AR)	0,1	0,1	0,1	0,1
Álcool cetilico 20 moles	2	1	1,4	2
Álcool cetflico 10 moles	-	1	-	-
Álcool cetilico 2 moles	-	-	0.6	-
Colesterol	-	-	-	0.5
Fase aquosa
Propilenoglicol	10	10	10	10
Azida	0,01	0,01	0,01	0,01
Agua destilada qps	100	100	100	100
EHL	15,7	14,3	12,6	15,7

A influência da formação do par iônico, entre o AR e diferentes aminas 5 lipofílicas e hidrofílicas, foi também investigada (Tabela 2). O pH das NLS contendo as aminas foi ajustado para 7,5 com solução de HCl 0,01 M (Digimed DM 20, Brasil). A relação molar amina: AR foi de 1:1. No entanto, a concentração das aminas nas NLS foi suficiente para consumir a acidez livre do Compritol 888 (Acidez máxima: 4 mg KOH/g de lípide) e reagir com o AR.

Tabela 2. Composição das NLS contendo aminas lipofílicas e hidrofílicas (% p/p).

Componentes	NLSE	NLSF	NLSG	NLSH
Fase oleosa
Compritol 888 ATO	10	10	10	10
Acido retinóico (AR)	0,1	0,1	0,1	0,1
Álcool cetilico 20 moles	2	2	2	2
Estearilamina (STE)	0.1	0,3	-	-
Laurilamina	-	-	0,2	-
Trietanolamina (TEA)	-	-	-	o,1
Fase aquosa

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Propilenoglicol	10	10	10	10
Azida	0,01	0,01	0,01	0,01
Água destilada qps	100	100	100	100

Exemplo 2: Análise do tamanho de partículas

O diâmetro médio das NLS na dispersão foi determinado por espectroscopia de fotocorrelação (PCS) usando Zetasizer 3000HSA sistema de tamanho de partícula (Malvern Instruments, UK) a um ângulo fixo de 90°, 5 temperatura de 25°C. As dispersões de NLS foram diluídas com água destilada e filtrada (membrana de éster de celulose, 0,45 pm, Millipore, USA) até uma contagem de 50 a 300 Kcps (1000 contagens por segundo).

A água utilizada para diluir as NLS era destilada e filtrada para remover qualquer partícula em suspensão. As NLS contendo RA foram analisadas após 10 filtração (membrana de éster de celulose, 3 pm, Millipore, USA) para remover cristais de AR.

Os dados obtidos do tamanho das partículas provenientes de medidas executadas em triplicata foram analisados com relação as suas intensidades. Os resultados foram fornecidos como diâmetro efetivo (diâmetro médio 15 avaliado pela intensidade) e índice de polidispersibilidade (PI), os quais expressam as medidas do tamanho e faixa de distribuição das partículas. O valor máximo aceitável para o PI foi 0,7.

As principais características das NLS obtidas com diferentes tensoativos e um co-surfactante (colesterol - CH) estão ilustradas na Tabela 3. O tamanho das NLS A, B e C foi 569 ± 28, 589 ± 2 e 593 ± 12 nm, respectivamente. A adição do CH (NLS D) proporcionou uma diminuição do tamanho médio (227 ± nm). Assim, diferentes tensoativos avaliados (EHL 15,7; 14,3 e 12,6) tiveram pouca influência sobre o tamanho, no entanto, o CH diminuiu significativamente o tamanho das NLS.

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Tabela 3: PCS Diâmetro médio, potencial zeta e EE de diferentes formulaçfoè^ m¹®' de NLS

Formulações	Diâmetro médio (nm)*	Potencial zeta (mV)*	EE (%)*
NLS A	569 ±28	-14,4 ± 0,3	13,1 ±0,7
NLSB	589 ±2	-11,2 ±0,8	11,0 ± 0,7
NLSC	593 ±12	-11,0 ±0,4	9,1 ±0,7
NLS D	227 ±5	-16,7 ±0,1	17,6 ± 1,3

* Dados sâo mostrados como a média ± desvio padrão *n = 3; EE (%) = eficiência de encapsulaçâo.

O tamanho das NLS E (622 ± 24 nm) e NLS F (663 ± 22 nm), ambas contendo uma amina lipofílica (STE), foi similar ao observado para as NLS G (591 ± 18 nm) e NLS H (588 ± 18 nm). Portanto, a presença de uma amina lipofílica (STE) proporcionou um tamanho de NLS similar ao observado com uma amina hidrofílica (TEA; NLS Η). A incorporação do AR teve pouca 10 influência sobre o tamanho das NLS (Tabela 4).

Tabela 4: PCS Diâmetro médio, potencial zeta e EE de diferentes formulações de NLS.

Formulações	Diâmetro médio (nm)*	Potencial zeta (mV)*	EE(%)*
Sem RA	com AR	sem AR	com AR
NLS A	575 ±19	569 ±28	-13,0± 1,1	-14,4 ± 0,3	13,1 ±0,7
NLSE	622 ±24	640 ±9	25,1 ±0,6	24,3 ±1,1	44,0 ±1.4
NLSF	663 ±22	651 ± 36	34,9 ±0,6	24,9 ± 0,5	93,5 ±2,8
NLSG	591 ±18	593 ±18	-7,0 ±0,3	-8,9 ±0,1	71,4 ± 1,7
NLS H	588 ±18	647 ±6	-8,2 ± 0,5	-12,0 ±0,4	42,4 ± 0,9

* Dados são mostrados como a média ± desvio padrão *n » 3; EE (%) = eficiência de encapsulaçâo.

Exemplo 3: Potential zeta

As medidas de potential zeta foram realizadas utilizando o equipamento Zetasizer 3000HSA (Malvern Instruments, UK), temperatura de 25°C. Antes das medidas, as dispersões de NLS foram diluídas em solução filtrada de 1 mM NaCI (membrana de éster de celulose, 0,45 pm, Millipore, USA) até uma

11/26 contagem de 100 a 1.000 Kcps. Todas as medidas foram

apw triplicata. As principais características das NLS obtidas com diferentes tensoativos e um co-surfactante (colesterol - CH) estão ilustradas na Tabela 3.

Os resultados demonstraram que a adição do CH (NLS D) não alterou significativamente o potencial zeta (-16,710,1) e os diferentes tensoativos avaliados (EHL 15,7; 14,3 e 12,6) tiveram pouca influência sobre o mesmo.

O potencial zeta das NLS A, E, F, G e H, na ausência do AR, foi de 13,011,1; 25,110,6; 34,910,6; -7,010,3 e -8,210,5, respectivamente (Tabela 4). Portanto, a adição das aminas aumentou o potencial zeta, entretanto este 10 fenômeno foi mais evidente para a amina lípofílica (STE) em comparação com a amina hidrofílica (TEA).

Na presença do AR, essas NLS apresentam os seguintes valores de potencial zeta: -14,410,3; 24,311,1; 24,910,5; -8,910,1 e -12,010,4. Novamente, a presença das aminas aumenta o potencial zeta e isto foi mais 15 evidente para a STE. No entanto, o comportamento do potencial zeta em função da concentração desta amina lípofílica, na ausência do AR, foi diferente daquele observado na presença do AR. Na ausência do AR, o aumento da concentração da STE aumenta o potencial zeta, no entanto, na presença do AR, quando a concentração de STE aumenta de 0,1 para 0,3%, o potencial 20 zeta não se altera indicando o aparecimento de um platô (Figura 1).

Na ausência do AR, o aumento da concentração da STE aumenta a quantidade de amina na interface aumentando o potencial zeta. Na presença do AR, a amina é parcialmente consumida pelo lipídeo ácido seguindo-se sua incorporação, na forma de par iônico AR-amina, na matriz lipídica ao invés da 25 interface. Conclui-se então que a incorporação das aminas aumentou significativamente o potencial zeta das NLS, sendo que este fenômeno foi mais evidente para a STE em comparação com as outras aminas investigadas (TEA e Laurilamina; Tabela 4 e Figura 1). Isto pode ser explicado pelo fato de a amina lípofílica apresentar maior potencial para localização interfacial em 30 comparação com aminas hidrofílicas.

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Exemplo 4: Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)

As análises de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) foram realizadas utilizando o equipamento DSC 2910 Differential Scanning Calorimeter (TA Instruments, USA). Para as medidas de DSC, uma taxa da 5 varredura de 10°C.min-1 foi empregada na escala de temperatura de 40-200°C, sob atmosfera inerte (nitrogênio). As NLSs foram liofilizadas (Liofilizador E-C Apparatus, USA; Bomba Edwards E2M18, UK) por 72h a -45°C, após congelamento rápido em nitrogênio líquido. Após a liofilização, as amostras foram colocadas diretamente em cadinhos de alumínio para a análise 10 (aproximadamente 10 mg do lipídeo).

A Figura 3 mostra as curvas de DSC dos principais componentes das NLS A e F (Figura 3A) e das respectivas formulações {Figura 3B), ambas com AR. Na Figura 3A visualiza-se o aspecto dos picos de fusão endotérmicos do lípide (Compritol 888 ATO), do fármaco (ácido retinóico - AR) e do lípide 15 formador do par iônico (estearilamina - STE), que apresentaram os respectivos pontos de fusão: 71,4°C; 181,7°C e 54,4°C. Quando se avalia a presença desses componentes nas formulações (Figura 3B), observa-se que na curva de DSC da NLS A há a presença do pico de fusão do AR (182,5°C), estando este ausente na curva de DSC da NLS F. É possível observar, ainda, uma leve 20 redução do ponto de fusão do lipídeo da matriz das NLS (71,4°C - lípide puro;

70,6°C - NLS A e 69°C - NLS F), bem como um alargamento gradativo desse pico (lípide puro, NLS A e NLS F, respectivamente). A STE, que faz parte da composição da NLS F, também não foi observada na curva de DSC dessa formulação, observa-se apenas o pico do Compritol, sugerindo que ambos (AR 25 e STE) estão em integração com o lipídeo.

Pode-se dizer então que as curvas de DSC dos principais componentes das NLS A e F (Figura 3A) e das respectivas formulações (Figura 3B), ambas com AR, também confirmam a eficiência da adição da STE na encapsulação do AR em NLS em baixas concentrações de tensoativos. A presença do pico de 30 fusão do AR (182,5° C) na curva de DSC da NLS A (Figura 3B) demonstra a presença do fármaco cristalizado fora do núcleo lipídico, e a ausência deste pico nas curvas de DSC onde o AR é combinado com a STE (NLS F, EE =

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93,5%) é uma forte evidência de que a interação entre os dois tenha levado à uma desestruturação da rede cristalina do AR. Assim, tem-se uma indicação clara da combinação extensa entre os componentes do par iônico. Da mesma maneira, não é detectada a presença da STE dissociada do núcleo lipídico na curva de DSC da NLS F. A STE não faz parte da composição da NLS A.

Quanto à redução do ponto de fusão (71,4° C - lipídeo puro; 70,6° C - NLS A e 69,0° C - NLS F), ainda que pequena, ao ser associada com o alargamento gradativo do pico do compritol (lipídeo puro, NLS A e NLS F, respectivamente), sugere a presença de um maior número de defeitos na estrutura cristalina 10 (Westesen K, Bunjes H and Koch MHJ. Physicochemical characterization of lipid nanoparticles and evaluation of their drug loading capacity and sustained release potential. Journal of Controlled Release (1997) 48: 223-236; Freitas C,

Muller RH.. Correlation between long-term stability of solid lipid nanoparticles (SLN ™) and crystallinity of solid lipid phase. European Journal of 15 Pharmaceutics and Biopharmaceutics (1999) 47:125-132), o que por sua vez está relacionado com o aumento da incorporação de fármaco (Jenning V and Gohla S. Encapsulation of retinoids in solid lipid nanoparticles (SLN®). Journal of Microencapsulation (2001) 19(2):149-158).

Exemplo 5: Análise de Eficiência de Encapsulação £ 20 A eficiência de encapsulação do AR em NLS foi avaliada através de dois métodos. O primeiro foi baseado na determinação da concentração de AR nas NLS antes (AR total) e após filtração (membrana de éster de celulose, 3 μπι, Millipore). A ausência de cristais de AR após filtração foi confirmada através de microscopia de luz polarizada (LEICA DML Microscope; DMLP and DMLM 25 Supplement; Leica Microsystems, Germany). Os cristais de AR, geralmente com tamanho de alguns micrômetros, apresentam formas características, podendo ser facilmente distinguidos das NLS (Jenning V and Gohla S. Encapsulation of retinoids in solid lipid nanoparticles (SLN®). Journal of Microencapsulation (2001) 19(2): 149-158). A influência do AR presente na 30 fase aquosa foi considerada desprezível devido à sua baixa solubilidade em água (Lim S and Kim C. Formulation parameters determining the physicochemical characteristics of solid lipid nanoparticles loaded with all-trans

14/26 retinoic acid. International Journal of Pharmaceutics (2002) 243:

concentração do AR nas NLS (antes e após filtração) foi determinada de acordo com metodologia preconizada pela USP 25 (The United States Pharmacopeia, 2003). De forma resumida: uma alíquota da dispersão de NLS foi solubilizada em tetrahidrofurano (THF) e posteriormente diluída em uma mistura de acetonitrila:água destilada:ácido fosfórico (80:19,9:0,1). A solução resultante mantém o AR solúvel, mas precipita o lipídeo. Essa dispersão foi filtrada em filtro de 0,45 μηι (Millex HV, Millipore, USA) e analisada por CLAE.

O segundo método consistiu na ultrafiltração (Filter Ultrafreee MC, 10.000 MW, Millipore, USA) da dispersão de NLS previamente filtrada (membrana de éster de celulose, 3 μιτι, Millipore, USA). A ultrafiltração foi conduzida a 10.000g por 30 minutos (Microcentrifuge Labnet, Denver Inst. Co., USA). A concentração de AR nas NLS antes (AR total) e após filtração (AR filtrado) e no ultrafiltrado (AR ultrafiltrado) foi determinada por CLAE. A concentração do AR nas NLS antes da filtração (AR total) foi sempre acima de 90% do total adicionado.

A eficiência de encapsulação foi calculada pela fórmula:

Eficiência encapsulação (%) = AR filtrado - AR ultrafiltrado x 100 AR total

O sistema de CLAE consistiu em um módulo de bomba Waters 515 (Milford, EUA), um auto-injetor Waters 717 Plus (Milford, EUA) e um detector UV-Vis Waters TM 486 (Milford, EUA). Uma coluna de fase reversa (Cis) com 125 mm de comprimento e partículas de 4 pm (LichroCart 125-4, Merck, Alemanha) foi usada. A fase móvel foi composta por uma mistura de acetonitrila: água: ácido fosfórico (80:19,9:0,1) e a detecção foi realizada a 340 nm, sob um fluxo de 1,0 mL/minuto, sendo injetados 20 μΙ de amostra. O tempo de retenção encontrado foi de aproximadamente 7.5 minutos. A análise de regressão linear dos cinco pontos analisados (0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 pg/mL) resultou na equação da reta: y = -2116 + 143277 x (r = 0,99946).

Os resultados de eficiência de encapsulação obtidos pelos dois métodos (determinação da concentração de AR antes e após filtração e ultrafiltração)

15/26 _òo^^daV ^F!s ^v<>. X ?s foram similares. A eficiência de encapsulação (EE) do AR para a NLS A (13,1%) foi maior do que aquela observada para as NLS B (11%) e NLS £ (9,1%). Entretanto, a encapsulação do AR na NLS D (17,6%) foi maior do que aquele observado para as demais formulações. Portanto, a adição do CH diminuiu significativamente o tamanho e aumentou a eficiência de encapsulação do AR nas NLS. No entanto, independente do sistema tensoativo usado, a encapsulação do AR nas NLS permaneceu baixo.

A fim de aumentar a eficiência de encapsulação do AR nas NLS, a influência da formação par tônico foi investigada. A eficiência de encapsulação do AR nas NLS A, E, F, Ge H foi de 13,1% ± 0,7; 44% ± 1,4; 93,5% ± 2,8; 71,4 ± 1,7 e 42,4 % ± 0,9, respectivamente. Portanto, a adição das aminas proporcionou um aumento considerável da eficiência de encapsulação do AR. A adição de uma amina hidrofílica (TEA) proporcionou um aumento de 13 para 44% na EE, no entanto, a encapsulação com as aminas lipofílicas (STE e Laurilamina) foi muito maior do que aquele observado com a TEA. Desta forma, o aumento da encapsulação do AR em NLS foi proporcional ao caráter lipofílíco da amina: STE > laurilamina > TEA. Portanto, a STE foi a amina que proporcionou maior aumento na encapsulação, sendo que, na relação molar AR:amina igual a 1:1, a EE foi de aproximadamente 94% (NLS F, Tabela 4), mesmo com uma relação tensoativo/lipídeo baixa.

Uma possível explicação para o aumento maior na eficiência de encapsulação observado com o par tônico formado com a STE pode ser o fato da mesma possuir a maior cadeia carbônica e, portanto, maior lipofilia, que por sua vez está relacionada com a formação de pares iônicos mais estáveis (Megwa SA, Cross SE, Benson HA and Roberts MS. lon-pair formation as a strategy to enhance topical delivery of salicylic acid. Journal of Pharmacy and Pharmacology (2000a) 52(8): 919-928; Megwa SA, Cross SE, Whitehouse MW, Benson HA and Roberts MS. Effect of ion pairing with alkyíamines on the invitro dermal penetration and local tissue disposition of salicylates. Journal of Pharmacy and Pharmacology (2000b) 52(8):929-940). A formação do par tônico entre o AR e ésteres de aminoácidos foi previamente descrita para avaliação da permeação tópica do AR utilizando microemulsões como veículo (Trotta M,

16/26

retinoic acid from microemulsions. Journal of Controlled Release (2003) 86:315

321). Também demonstraram que o par iônico formado entre o AR e ésteres de aminoácidos aumentou o lipofilicidade da droga, avaliada através do coeficiente 5 partição miristato de isopropila/etanol-tampão fosfato. No entanto, nenhum desses autores avaliou a formação do par iônico com estratégia para aumentar a eficiência de encapsulação do AR em NLS.

Exemplo 6: Solubilidade do ácido retinóico em octanol φ A solubilidade do AR em octanol contendo concentrações crescentes de

STE e TEA (0; 3,9; 7,7; 19,3 e 38,5 mM) foi avaliada através da adição de um excesso de AR até saturação das soluções das aminas. Essas suspensões foram mantidas sob agitação magnética durante 24 horas, temperatura de 25° C, em ausência de luz e atmosfera de nitrogênio, para evitar a oxidação do AR. Ao final de 24 horas, as suspensões foram filtradas em filtro de 0,45 pm (Millex

HV, Millipore, USA) para eliminação da droga insolúvel, diluídas na fase móvel e injetadas no CLAE para determinação da concentração do AR.

A Figura 2 mostra a influência das aminas lipofílicas (STE) e hidrofílicas (TEA) sobre a solubilidade do AR em octanol. Observa-se claramente um aumento da solubilidade do AR com a concentração das aminas. A solubilidade 0 20 do AR em octanol, na ausência de amina, aumentou de 9,5 mg/mL para 17,3 e 20,6 mg/mL na presença de 38,5 mM das aminas hidrofílicas (TEA) e lipofílicas (STE), respectivamente. Portanto, o aumepto da solubilidade do AR em octanol foi maior para a amina lípofílica (STE) em comparação com a amina hidrofílica (TEA).

Na presente invenção não foi possível avaliar a influência da amina sobre o coeficiente de partição octanol/água do AR devido ao fato de que a concentração de AR em água estava abaixo do limite de detecção do método de análise da droga (CLAE).

Assim, a influência das aminas foi avaliada, quantitativamente, apenas sobre a solubilidade do AR em octanol. Pode-se ver claramente que a solubilidade do AR foi aumentada em octanol para ambas aminas avaliadas (STE e TEA), contudo, este aumento foi mais evidente para a amina lípofílica \Ί/26 ,ί/ %

(STE) em comparação com a amina hidrofílica (TEA) (Figura 2). Estes dados sugerem que a presença da amina aumenta o caráter lípofílíco do AR, provavelmente através da formação do par iônico, e isto pode ter influenciado na EE em NLS.

Exemplo 7: Difração de raios-X

A difração de raios-X (2 Teta = 16 - 30°) foi realizada utilizando o equipamento PANalytícal X-ray generator PW 1710 (PANalytical, The Netherlands), equipado com um ânodo de cobre (Cu-Κα radiation, λ= φ 0,15418nm). As NLS foram liofilizadas (Liofilizador E-C Apparatus, USA;

Bomba Edwards E2M18, UK) por 72 h, a -45°C após congelamento rápido em nitrogênio líquido. O par iônico isolado (AR and STE) foi produzido através da reação dos dois componentes, como realizado na preparação de NLS. Os materiais puros (AR, Compritol 888 ATO) foram submetidos à análise direta. Filmes finos de todas as amostras foram produzidos para a análise de difração 15 de raios-X.

Os experimentos de DRX foram realizados para estudar melhor as interações entre os componentes das formulações e do par iônico. Este tipo de resultado pode fornecer novas informações sobre a formação do par iônico e pode confirmar os resultados estabelecidos por medidas de DSC.

Φ .20 A Figura 4 demonstra os dados obtidos por difração de raios-X para as

NLS e o Compritol (Figura 4A), e para o AR, STE e a mistura de AR e STE (Figura 4B). Na Figura 4A é possível observar os picos de difração de raios-X do lipídeo (Compritol 888 ATO). As NLS A e F mostraram reflexões ligeiramente mais largas do que as observadas para o lipídeo (Compritol), que 25 pode ser devido à presença de uma população maior com defeitos na estrutura cristalina das NLS A e F. É concebível que uma população maior de defeitos cristalinos possa ter contribuído para uma capacidade mais elevada taxa de encapsulação da droga (Jenning V and Gohla S. Encapsulatíon of retinoids in solid lipid nanoparticles (SLN®). Journal of Microencapsulation (2001) 30 19(2): 149-158; Jenning, V., Schãfer-Korting, M. and Gohla, S. Vitamin Aloaded solid lipid nanoparticles for topical use: drug release properties” J. Control. Release (2000a). 66, 115-126; Westesen K, Bunjes H and Koch MHJ.

18/26 / Ao % °4?S - vsv* Physicochemical characterization of lipid nanoparticles and evaluation of their drug loading capacity and sustained release potential. Journal of Controlled Release (1997) 48:223-236). Estes dados estão de em concordância com os resultados estabelecidos pelas medidas de DSC.

Além disso, foi possível observar a presença de picos de difração de raios-X dos cristais de AR nas NLS A (figura 3A). O difratograma de raios-X do AR tem picos nos ângulos 2 Teta 20,2; 22,8 e 25,0° (figura 3B) que correspondem às distâncias entre planos cristalinos de 0,439; 0,389 e 0,357 nm, respectivamente. No difratograma das NLS A, a presença de picos de difração de raios-X do AR é facilmente identificada, mas estes picos não foram observados nas NLS F. Estas observações confirmaram os dados obtidos por DSC e pela avaliação da eficiência da encapsulação. Assim como nas curvas de DSC, a STE (2 Teta 21,5 e 24,1°, respectivamente 0,414 e 0,369 nm) e o AR (2 Teta 20,2; 22,8 e 25,0°, respectivamente 0,439; 0,389 e 0,357 nm) não foram identificados fora da matriz do lipídeo. O difratograma de raios-X mostrou claramente que o AR não existiu no estado cristalino nas NLS F, pois todos os picos bem definidos do material puro desapareceram.

As medidas de DRX também são úteis para determinar os parâmetros subcelulares e as formas polimórficas dos glicerídeos. Na figura 3A todos os difratogramas (Compritol 888 ATO, NLS A e NLS B) apresentam distâncias interpianares da forma β’. Entretanto, um terceiro pico pequeno em 0,460 nm apareceu nas NLS F e também nas NLS A indicando a formação (parcial) de βί. Os afastamentos curtos interpianares dos triglicerídeos podem ser descritos como α (subcélula hexagonal com espaçamento interplanar de 0,42 nm), p’(subcélula perpendicular ortorrômbica com espaçamentos interpianares bem definidos de 0,42 - 0,43 e 0,37 - 0,40 nm) e β (subcélula paralela triclínica com espaçamento interplanar bem definido de 0,46 nm). Entretanto, as formas intermediárias, como a forma βΐ apresentada por Precht (1988), podem ser encontradas. Informações adicionais sobre o par iônico são encontradas na figura 5B, onde os componentes (AR e STE) e o par iônico (AR da mistura + STE) foram avaliados. O perfil de difração do par iônico (AR + STE) demonstrou um aspecto amorfo, sem similaridade com aqueles observados

19/26 // epsV’ z^d3%.

o..

... '₄': para os componentes individuais. Os resultados da DRX revelaram também interações fortes entre o AR e a STE, e assim foi possível conseguir evidências da formação do par iônico entre o ácido lipídico (AR) e a amina (STE).

Os dados mostraram que a formação do par iônico melhorou a encapsulação do AR nas NLS. A extensa combinação entre os constituintes do par iônico e as NLS propiciou um aumento do número de defeitos na estrutura cristalina da matriz lipídica, o que permitiu a inclusão do AR na mesma.

Outras alternativas procuraram contornar a capacidade limitada de carreamento de fármacos nas NLS, mas uma perda parcial das propriedades de liberação controlada devem ser levadas em consideração. A utilização de uma relação elevada de tensoativo/lipídeo, que favorece a localização interfacial do AR (Kayali I, Ward AJI, Suhery T, Friberg SE, Simion A and Rhein LD. Interactions of retinoic acid with a model of stratum corneum lipids. Journal of Dermal Clinicai Evaluation Society (1991) 2:7-17), ou a utilização das misturas dos tensoativos, os quais acumulam na parte externa das NLS (Jenning, V. Feste Lipid-Nanopartikel (SLN™) ais Trãgersystem fürdie dermale Applikation von Retinol: Wirkstoffinkorporation, -freisetzung und Struktur, PhD Thesis, Berlin. In: Freitas, C., Müller, R. H. “Correlation between long-term stability of solid lipid nanoparticles (SLN™) and crystallinity of the lipid phase” Eur. J. Pharm. Biopharm. (1999)47, 125-132) foram relatados. A utilização dos óleos líquidos para permitir uma solubilidade mais elevada para as drogas lipofílicas é uma outra alternativa, mas fornece um teste padrão de liberação similar para uma emulsão, que se torna mais evidente com o aumento da concentração do óleo (Jenning, V., Thünemann, A. F. and Gohla, S. “Characterisation of a novel solid lipid nanoparticle carrier system based on binary mixtures of liquid and solid lipids” Int. J. Pharm. (2000b). 199, 167-177).

É importante considerar a seleção do lipídeo utilizado na matriz das NLS. Nanopartículas de mistura de triglicerídeos, como Compritol, são uma interessante alternativa para nanopartículas de triglicerídeos monoácidos com 30 respeito à capacidade de incorporação do fármaco porque misturas de triglicerídeos têm geralmente um grau mais baixo de ordem cristalina. (Westesen K, Bunjes H and Koch MHJ. Physicochemical characterization of

20/26 lipid nanoparticles and evaluation of their drug loading capacity and sustai, release potential. Journal of Controlled Release (1997) 48: 223-236; Jenning V and Gohla S. Encapsulation of retinoids in solid lipid nanoparticles (SLN®).

Journal of Microencapsulation (2001) 19(2): 149-158).

As medidas de difração de raios-X sugerem que na maioria das NLS, os arranjos dos cristais foram menos ordenados, com evidências do aumento do número de defeitos na estrutura cristalina (relatados para incorporação do fármaco na matriz lipídica).

Exemplo 8: Eficácia e toxicidade cutânea das NLS-AR no modelo animal (camundongos Rhino)

O estudo de avaliação da eficácia e toxicidade cutânea das NLS contendo AR foi conduzido utilizando camundongos rhino como modelo experimental. O camundongo rhino é um mutante sem pêlo que carrega o gene rh, um alelo recessivo para o gene sem pêlo. Após 4 semanas de vida, a camada de pêlo nos animais recém-nascidos é perdida irreversivelmente, estando associada com a formação dos pseudocomedões, denominados utriculos, os quais são histologicamente semelhantes às lesões acnéicas humanas, tais como os microcomedões. Assim, os camundongos rhino são extensivamente utilizados como modelo in vivo para avaliação da ação comedolítica de novos fármacos para o tratamento da acne.

Camundongos rhino sem pêlo (machos e fêmeas), adultos (7-9 semanas) foram utilizados nos experimentos. A criação e manutenção dos animais em experimentação foram conduzidas em um gabinete de biotério, onde os animais recebiam água e ração ad libitum. Toda água, maravalha e ração utilizados foram previamente esterilizadas. A temperatura (25 ± 1^o C) e umidade (56 ± 10%) foram monitoradas (termo-higrômetro) e controladas (arcondicionado ou aquecedor). O ciclo de luz (12 horas de claro e 12 horas de escuro) foi controlado. Os procedimentos experimentais utilizados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA-UFMG).

A eficácia da NLS (gelificada com 0,8% de hidroxietilcelulose) foi comparada a um gel comercial (Vitanol-A®, Stiefel), ambos contendo 0,01% de

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AR. Após atingirem 7 a 9 semanas de idade, os animais foram divididos em 3 grupos com 4 animais cada (2 machos e 2 fêmeas). No Grupo 1, os animais foram tratados com gel placebo; no grupo 2 com Vitanol-A® (gel) e no Grupo 3 com as NLS. 100 pL das formulações foram aplicados no dorso dos animais, uma vez ao dia, 5 dias por semana, durante 2 semanas. Os animais do grupo controle receberam o mesmo volume de gel sem AR.

A comparação da atividade comedolítica entre as formulações foi conduzida através de análises histológicas. Decorridas 72 horas após o término do tratamento, os animais foram heparinizados (Heparina Sódica, 70 10 Ul/kg de peso corporal), anestesiados (injeção intraperitoneal de Pentobarbital Sódico; 50 mg/kg de peso corporal) e submetidos à perfusão intracardíaca com solução salina de Ringer, seguida de perfusão com solução fixadora de formalina neutra tamponada a 10% (NBF). Em seguida, a pele dorsal foi removida com o auxílio de um bisturi e seccionada em 4 partes de 15 aproximadamente 1 cm², as quais foram conservadas sob refrigeração em um frasco contendo NBF.

Após a secção da pele, um dos 04 fragmentos obtidos foi removido do fixador, lavado com salina em tampão fosfato (PBS) para remoção do formaldeído e imersa em ácido acético 1% por aproximadamente 24 horas a 20 4°C. Em seguida, a derme foi removida da epiderme utilizando espátula e pinça com auxílio de microscópio estereoscópico. A epiderme isolada foi submetida à desidratação gradual (imersão em concentrações crescentes de etanol: 70, 80, 95 e 100%), seguida por 03 banhos e uma imersão de 15 dias no xilol. Decorridos 15 dias, a epiderme foi montada em lâminas de vidro, com 25 a face dérmica voltada para baixo, e recoberta por lamínula de vidro, utilizando-se o Entellan-new® (Merck, Alemanha) como meio de montagem.

Aproximadamente 24 horas após o sacrifício, um dos fragmentos da pele foi removido do fixador, lavado com PBS e desidratada (imersão em concentrações crescentes de etanol: 70, 80, 95 e 100%). As amostras foram 30 submetidas a banhos de xilol, seguidos por banhos de parafina, e foram, então, incluídas em parafina. Algumas amostras foram também incluídas em resina a base de glicolmetacrilato (Technovit 7100; Heraeus Kulzer,

22/26 • IÍWTTHIAM Ifcf

Alemanha). Neste caso, após desidratação, as amostras foram submetidas a processos de pré-infiltração e infiltração na resina, ovemight, e posterior inclusão. Após a inclusão das amostras em parafina ou metacrilato, cortes de 3 pm foram obtidos através da utilização do micrótomo MICROM HM 335E (Microm International GmbH, Alemanha). Esses cortes foram fixados em lâminas de vidro e corados com hematoxilina-eosina para avaliação histológica e morfométrica.

Para a avaliação do tamanho dos utrículos foram obtidas fotografias dos segmentos horizontais das amostras da pele de cada grupo experimental. As fotografias foram obtidas através da câmera digital Nikon Coolpix 995, acoplada ao fotomicroscópio óptico Nikon Eclipse E600 (ambos da Nikon Corp., Melville, NY, EUA), utilizando objetiva de aumento de 10X. Para cada utrículo foi medido o menor e o maior raio, sendo o valor considerado a média dessas duas medidas.

Para a avaliação quantitativa das alterações epidérmicas foram obtidas fotografias dos segmentos verticais das amostras da pele dos camundongos de cada grupo. As fotografias foram obtidas através do sistema fotográfico descrito acima utilizando objetiva de aumento de 40X. Foi realizada a medida da espessura da epiderme e camada granulosa, bem como a contagem dos grânulos de queratohialina, utilizando o programa Scion Image®. Antes de iniciar as medidas o tamanho de cada fotografia foi dimensionado através de uma régua calibrada.

A avaliação do potencial de irritação cutânea da NLS (gelificada com 0,8% de hidroxietilcelulose) foi comparada com o Vitanol-A® creme, ambos contendo 0,05% de AR. Após atingirem a idade de 7 a 9 semanas de vida, os animais foram divididos em 3 grupos experimentais: placebo (2 machos e 3 fêmeas), Vitanol-A® (2 machos e 4 fêmeas) e NLS (2 machos e 4 fêmeas). As fêmeas e machos de cada grupo foram mantidos em gaiolas separadas. As formulações foram aplicadas (100 pL) no dorso dos animais uma vez ao dia, 10 dias consecutivos, sendo espalhadas com auxílio de um bastão de vidro. Os animais do grupo controle receberam o gel sem as NLS-AR. Diariamente, os animais foram avaliados com relação aos sinais de irritação cutânea,

A ..

' A

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pontuada da seguinte forma:

Pele Normal (ausência de eritema, pele branca ou rósea); 1 = Eritema Leve (vermelhidão leve, com tonalidade ligeiramente diferente da área controle); 2 = Eritema Bem Definido (vermelhidão pronunciada, geralmente em toda a área); 3 = Eritema Moderado (vermelhidão intensa e difusa); 4 = Eritema Severo (vermelhidão extrema, com leve formação de escara).

A diferença estatística entre os grupos foi determinada através da análise de variância (ANOVA) seguida do teste pos-hoc de Newman-Keuls para comparação entre os grupos. As diferenças foram consideradas significativas quando P á 0,05.

Inicialmente foi avaliado o potencial comedolítico das duas formulações testadas (NLS e gel comercial Vitanol-A®), ambas contendo 0,01% de AR. Nesta etapa uma potente atividade comedolítica do AR foi demonstrada, além de um efeito estimulatório nos elementos celulares e fibrosos da pele, promovendo um espessamento das paredes dos utrículos, da epiderme e da derme. A espessura da epiderme aumentou em aproximadamente 134% para os grupos tratados com AR em relação ao grupo controle (Figura 5A). A diferença entre NLS e Vitanol-A® não foi estatisticamente significativa.

Considerando especificamente a espessura da camada granulosa da epiderme, a atividade da NLS foi significativamente maior (2.814 ± 406 gm) do que a observada para a formulação comercial (2.432 ± 197 μηπ) (P < 0,05). Em relação ao grupo placebo houve um aumento de 200 e 248% na espessura dessa camada para os animais tratados com Vitanol-A® e NLS, respectivamente (Figura 5B). Esse perfil de proliferação celular aumentado observado no grupo tratado com as NLS pode ser atribuído à maior penetração do AR nas camadas superiores da pele após a aplicação das NLS em comparação com o gel comercial.

Adicionalmente, enquanto o grupo placebo apresentou a maioria dos utrículos abertos para a superfície e, frequentemente, com queratina em seu interior, nos grupos tratados ocorreu remoção dos tampões foliculares, fazendo com que os utrículos apresentem-se mais alongados, assemelhandose à UPS normal. Os valores encontrados para o diâmetro médio dos utrículos

24126

4. 4 foram estatisticamente diferentes (P < 0,05) entre os grupos tratados com (NLS: 64 ± 6 pm; Vitanol-A®: 64 ± 5 pm) e placebo (116115 pm). Estes dados são similares àqueles previamente publicados (NAKANO etal., 2007; SAKUTA e KANAYAMA, 2005; VARANI et al., 2003).

Outro aspecto relevante observado nas características morfológicas das amostras é a presença de infiltrados inflamatórios na derme dos animais tratados com o AR, predominando eosinófilos, neutrófilos e leucócitos mononucleares. Pôde-se observar também que a reação inflamatória foi mais intensa nos animais tratados com o gel comercial do que naqueles que receberam as NLS. Portanto, um segundo estudo foi conduzido para comparar o potencial de irritação cutânea das formulações. Para este estudo, uma concentração maior de AR foi selecionada (0,05%), uma vez que, além de ser disponível comercialmente, facilita a observação da incidência de reações adversas e eventuais diferenças entre as formulações (NLS e Vitanol-A®).

A Figura 6 ilustra os índices de irritação observados nas fêmeas (Figura 6A) e machos (Figura 6B) dos grupos tratados com a formulação comercial e as NLS. Para ambos os sexos os índices de irritação observados nos animais tratados com as NLS foi significativamente menor (P < 0,05) do que o observado para o Vitanol-A® nos dias 2, 3, 4, 5, 9 e 10 (Figura 6A). Em relação aos machos, a realização da análise estatística não foi possível devido ao pequeno número de animais (n = 2), embora a tendência tenha sido a mesma observada anteriormente: maior índice de irritação nos animais tratados com a formulação comercial em comparação com a NLS (Figura 6B). É interessante mencionar que, ao compararmos as Figura 6A e 6B, é possível observar uma maior sensibilidade das fêmeas à ação do AR em relação aos machos. Porém, em ambos os grupos, os animais (machos e fêmeas) tratados com a formulação comercial apresentaram um nível de irritação maior, e permaneceram por mais tempo nesse nível, que os animais tratados com as NLS. As reações adversas observadas no presente estudo (eritema, ressecamento e descamação) são comumente observadas após a aplicação tópica de retinóides em diferentes modelos animais (MANDAWGADE; PATRAVALE, 2008; SHAH etal., 2007; VARANI etal., 2003, 2008).

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Durante todo o tratamento, o eritema e a descamação foram mais intensos nos animais tratados com a formulação comercial em comparação com o placebo e as NLS. Após 2 aplicações, os animais tratados com o Vitanol apresentaram eritema bem definido, enquanto que naqueles tratados com as NLS somente um eritema leve foi observado no mesmo intervalo de tempo. A intensidade da descamação foi muito maior nos animais que receberam o Vitanol-A® em comparação com aqueles tratados com a NLS-AR. Durante o tratamento também foi possível observar uma relação entre a irritação cutânea e o comportamento dos animais. Os animais tratados com a formulação comercial apresentavam uma nítida mudança comportamental (inquietos e resistência à aplicação do produto) quando comparados aos outros grupos (NLS e placebo). Nos animais do grupo placebo não foi observado nenhum nível de irritação cutânea ou comportamental.

O conjunto dos nossos dados mostrou que a eficácia comedolítíca das NLS-AR foi similar àquela observada para uma formulação convencional. Portanto, a formação do par iônico, fundamental para garantir a produção de NLS-AR com alta eficiência de encapsulação, não comprometeu a atividade do AR. Adicionalmente, a irritação cutânea induzida pelo AR carreado nas NLS foi menor do que aquela observada com um creme convencional contendo o fármaco livre. Assim, podemos concluir que as NLS-AR representam uma alternativa inovadora para diminuição da incidência de reações adversas locais (irritação cutânea) induzidas pelo AR, principalmente eritema e descamação, sem comprometer sua eficácia no contexto do tratamento tópico da acne.

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Breve descrição das figuras

Figura 1: Influência da concentração de STE no potential zeta de NLS com (NLS contendo AR) e sem AR (NLS sem AR).

Figura 2: Influência da concentração de amina (STE e TEA) na solubilidade AR em octanol.

Figure 3: As curvas de DSC dos principais componentes de NLS (Compritol 888 ATO, AR e STE - curva A) e formulações de NLS contendo AR sem e com aminas lipofílicas (NLS A e NLS F, respectivamente - curva B).

Figura 4: Dados obtidos por difração de raios-X das NLS e Compritol (Figura 4A), e por RA, STE e a mistura de AR e STE (Figura 4B).

Figura 5 - Avaliação da espessura da epiderme (Figura 5A) e da camada granulosa (Figura 5B) nos grupos controle (Placebo) e tratados com NLS ou gel comercial (Vitanol-A®), ambos contendo 0,01% de AR. Os resultados apresentados correspondem à média ± desvio padrão. *P < 0,05 em relação ao placebo. f P < 0,05 em relação ao gel comercial.

Figura 6- Irritação cutânea induzida pelo AR em camundongos rhino fêmeas (Figura 6A) e machos (Figura 6B) durante o tratamento com o gel de NLS e o creme comercial, ambos contendo AR a 0,05%. Cada animal foi pontuado de 1 a 4 com relação ao nível de irritação apresentado, tendo-se como base de comparação o grupo placebo. Os valores apresentados correspondem à média ± dp.

Claims

1. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

DE RETINÓIDES, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) Formação de par iônico através de reação química entre retinóides e aminas lipofílicas;

b) Incorporação do composto obtido em sistemas micro ou nanoparticulados;

c) Adição de tensoativos e co-tensoativos ao composto.

2. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa a compreender retinóides como: ácido trans-retinóico (all-transácido retinóico, ácido retinóico, tretinoína ou vitamina A ácida), ácido 9-cis retinóico (alitretinoína), ácido 13-cis retinóico (isotretinoína), Etretinato, Acitretina, Bexaroteno, Adapaleno, Tazaroteno.

3. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES para de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa a compreender preferencialmente o all-trans-ácido retinóico.

4. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa a compreender aminas lipofílicas tipo R-NH₂, sendo que o R pode ser representado por cadeias alifáticas de C₁ a C₄₀ ramificadas ou não, cadeias aromáticas, cadeias olefínicas.

5. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender preferencialmente aminas lipofílicas do tipo estearilamina.

6. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa b compreender preferencialmente a incorporação do composto obtido em nanopartículas lipídicas sólidas.

7. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa c compreender a adição de tensoativos e co-tensoativos como

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Spam, Tween, Polioxil 2 éter cetílico, Polioxil 10 éter cetílico, Polioxil 20 éter cetílico, Colesterol.

8. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa c compreender preferencialmente a adição do tensoativo Polioxil 20 éter cetílico.

9. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa c compreender preferencialmente a adição do co-tensoativo Colesterol.

10. PRODUTO DERIVADO DE RETINÓIDES caracterizado pela formação do par iônico entre all-trans-ácido retinóico e estearilamina.

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES, caracterizada por compreender:

a) Retinóides

b) Aminas lipofílicas

c) Tensoativos

d) Co-tensoativos

e) Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS).

12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela etapa a poder compreender os seguintes retinóides: ácido trans-retinóico (all-trans-ácido retinóico, ácido retinóico, tretinoína ou vitamina A ácida), ácido 9-cis retinóico (alitretinoína), ácido 13-cis retinóico (isotretinoína), Etretinato, Acitretina, Bexaroteno, Adapaleno, Tazaroteno, sendo preferível o all-trans-ácido retinóico em uma faixa de cocentração de 0,05 a 0,2% p/p.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela etapa b compreender o uso de aminas lipofílicas tipo R-NH2, sendo que o R é representado por cadeias alifáticas de C₁ a C₄₀ ramificadas ou não, cadeias aromáticas, cadeias olefínicas em uma faixa de concentração de 0,05 a 0,5% p/p, sendo

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3/4 preferível o uso de aminas lipofílicas do tipo estearilamina em uma faixa de concentração de 0,05 a 0,5% p/p.

14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelas etapas c e d, compreenderem a adição de tensoativos e co-tensoativos como Spam, Tween, Polioxil 2 éter cetílico, Polioxil 10 éter cetílico, Polioxil 20 éter cetílico e Colesterol em uma faixa de concentração de 0,2 a 4% p/p.

15. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por compreender preferencialmente o tensoativo Polioxil 20 éter cetílico em uma faixa de concentração de 0,2 a 4% p/p.

16. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por compreender preferencialmente o cotensoativo Colesterol em uma faixa de concentração de 0,2 a 4% p/p.

17. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com as reivindicações 11 a 16 caracterizada por compreender pelo menos, retinóides, aminas lipofílicas, colesterol, além de um ou mais excipientes fisiológica ou farmaceuticamente aceitáveis.

18. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com as reivindicações 11 a 17, caracterizadas por compreender pelo menos um composto adicional farmacológica ou fisiologicamente ativo.

19. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com as reivindicações de 11 a 17, caracterizada pelo fato das partículas apresentarem tamanho inferior a 800 nm, variando preferencialmente de 400 a 700 nm.

20. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com as reivindicações 11 a 17, caracterizada por ser administrada pelas vias: oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica, tópica ou ainda, como dispositivos que possam ser implantados ou injetados, sendo preferencialmente aplicada por via tópica.

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21. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo com as reivindicações de 11 a 17 caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar distúrbios na pele.

22. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE RETINÓIDES de acordo

5 com as reivindicações de 11 a 17 caracterizado por ser na preparação de produto cosmético.