BRPI0809234A2 - Peptídeos de proteína associada a receptor (rap) cíclico - Google Patents

Description

PEPTÍDEOS CÍCLICOS DA PROTEÍNA ASSOCIADA AO RECEPTOR (RAP)

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente U.S. N0 60/919.238, depositado em 21 de março de 2007, aqui incorporado por referência em sua 5 totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada aos peptídeos cíclicos da proteína associada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (RAP), incluindo análogos destes, composições destes, e métodos de geração e métodos de utilização desses peptídeos cíclicos da RAP.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A proteína associada ao receptor (RAP), também conhecida como proteína relacionada-proteína associada ao 15 receptor de alfa-2-macroglobulina/lipoproteína de baixa densidade 1 (acesso Uniprot P30533, números de acesso Pfam PF06400 e PF06401) , é uma proteína de 39 kD única que se liga a quase todos os membros da família do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR). Localizada no 20 retículo citoplasmático e no aparelho de Golgi (Bu e Schwartz, Trends Ceil. Biol. 8(7): 272-6, 1998), RAP atua como um acompanhante para esses membros da família. Por exemplo, RAP se liga intimamente à proteína relacionada ao receptor de lipoproteína (LRP) nesses compartimentos,

2 5 evitando a associação prematura do receptor com ligantes co-expressos (Herz e Willnow, Atherosclerosis 118 Supl.: S37-41, 1995).

A RAP humana de comprimento total, incluindo sua seqüência sinalizadora, tem 357 aminoácidos. A RAP Madura contém 323 aminoácidos, dos quais os últimos quatro aminoácidos (HNEL) constituem um sinal de retenção do retículo citoplasmático. Há relatos de que a RAP é composta por três domínios fracamente homólogos (dl, d2 e d3). Todos os três domínios são capazes de ligação ao LRP, embora d3 5 se ligue com a maior afinidade. Diferentes publicações relataram definições ligeiramente diferentes dos limites dos três domínios de RAP (resíduos 1-100, 101-200 e 201- 323, ou 18-112, 113-218 e 219-323), e os domínios parecem ter características de ligação ligeiramente diferentes. Por 10 exemplo, há relatos de que dl inibe a ligação de alfa-2- macroglobulina ao LRP, enquanto d3 promove a dobragem adequada de LRP (veja Obermoeller e cols., J. Biol. Chem. 272 (16): 10.761-10.768 (1997)). Uma definição alternativa de quatro domínios (resíduos 1-92, 93-163, 164-216 e 217- 15 323) foi relatada por Medved e cols., J. Biol. Chem., 274 (2): 717-727 (1999).

Foram estudadas versões truncadas e/ou mutadas de RAP. Melman e cols., J. Biol. Chem., 276 (31): 29.338-29.346 (2001) relataram a geração de diversas fusões de fragmento GST/RAP que incluem resíduos 221-323, 221-275, 276-323, 221-290, 221-300 e 221-310 da RAP madura, e todas exibiam ausência ou baixa afinidade de ligação ao LRP. A partir desses dados, Melman e cols. concluíram que os resíduos 201-210 eram necessários para a ligação de LRP com alta afinidade. Melman e cols. também geraram mutantes de RAP contendo mutações nas posições 203-206 (sítio A), 282-289 (sítio B) e 314-319 (sítio C); mutações somente no sítio A ou somente no sítio B produziram uma pequena redução na atividade de ligação de LRP, enquanto mutações em ambos os sítios, AeB, reduziram significativamente a atividade de ligação de LRP. Medved e cols., supra, geraram duas fusões . de fragmentos OST/RAP do terminal C, uma que consiste nos resíduos 216-323 da RAP madura e outra que consiste nos resíduos 206-323. Rall e cols., J. Biol. Chem., 273 (37): 5 24.152-24.157 (1998) relataram a clivagem proteolítica da RAP madura em diversos fragmentos, e identificaram os resíduos 223-323 como uma região altamente resistente à protease. Obermoeller e cols., supra, também geraram um fragmento de RAP que consiste nos resíduos 191-323 da RAP

madura, e estudaram as interações de ligação com vários domínios de LRP. McCormick e cols., Biochemistry, 44: 5.794-803 (2005) construíram uma fusão GSP/fragmento de RAP que contém os resíduos 221-323 de RAP, e avaliaram sua ligação ao acompanhante do retículo citoplasmático ERp57.

Andersen e cols., Biochemistry 42, 9.355-64 (2003) testaram fragmentos do domínio de RAP quanto à ligação ao receptor de apoE 2 e relataram que somente o terceiro domínio (resíduos 216-323) se ligaru. Andersen e cols., J. Biol. Chem. 275, 21.017-24 (2000) testaram RAP d3 (resíduos 216-

2 0 3 23) quanto à ligação a vários fragmentos de LRP. Andersen

e cols., Biochemistry 40, 15.408-17 (2001) também testaram uma variante RAPd3, truncada no terminal C aos resíduos 219-309, quanto à habilidade para se ligar a um fragmento de LRP fundido à ubiqüitina (U-CR56) , e observaram uma

diminuição significativa na afinidade por U-CR56. Lee e cols. Mol. Cell 22, 423-30 (2006) construíram mutantes de RAP de comprimento total nos quais cada histidina conservada foi mutada para alanina, todas as histidinas no domínio 1 foram mutadas para alanina, todas as histidinas

3 0 no domínio 2 foram mutadas para alanina, e todas as histidinas no domínio 3 foram mutadas para alanina. Migliorini e cols., J. Biol. Chem. 278, 17.986-92 (2003) construíram uma biblioteca contendo clones com mutações aleatórias nos resíduos 206-323 de RAP, e relataram que a 5 mutação da lisina na posição 256 ou da lisina na posição 270 de RAP aboliram a ligação de RAP ao LRP.

A família de receptores da proteína relacionada ao receptor de lipoproteína (LRP) compreende um grupo de proteínas transmembrana da superfície celular que medeiam uma ampla variedade de fenômenos fisiológicos. Todos os receptores são homólogos ao LDLR e compartilham uma organização de domínio similar, o que inclui grupos de domínios do receptor de LDL da classe A, ou repetições do tipo complemento (CR), que são parte de uma família grande de seqüências de proteínas conservadas. Dados estruturais sobre membros dessa família sugerem que as seqüências de CR adotam uma dobragem característica, o módulo receptor de LDL-IiJce (terminologia da "Classificação Estrutural de Proteínas", SCOP) . As seqüências de CR são encontradas em vários tipos diferentes de proteínas, incluindo a família LDLR e a família da serina protease transmembrana do tipo

II (matriptase).

Os mecanismos de ação de membros da família da LRP incluem tanto a endocitose de ligantes ligados quanto a 25 transdução de sinal do espaço extracelular (1). LRP participa em várias funções celulares, que incluem, sem limitação, o metabolismo de lipoproteínas (2, 3), controle de metaloproteases da matriz e fatores da coagulação (4-6), especificação do destino da célula (3, 7), diretrizes da 30 migração da célula neural (7, 8), indução de proliferação em células tumorais (9, 10), ligação de rinovírus (11, 12),

. sinalização por neurotransmissores (23, 14) , aquisição de antígenos por células apresentadoras de antígeno (25), transcitose de ligantes através da barreira hematencefálica 5 (16-19), recuperação de proteínas do filtrado glomerular (20) , transporte de hormônios endócrinos (21) , efluxo de peptídeo β amilóide do cérebro (22), ativação de deposição óssea (23) e regulação de proliferação de células endoteliais (24) . A capacidade do LDLR para assumir tantos 10 papéis deriva, em parte, do conjunto diverso de ligantes aos quais esses receptores são capazes de se ligar. Outra característica dessa família de receptores consiste nos diversos padrões de distribuição tecidual, e freqüentemente únicos, de cada LDLR.

A família da serina protease transmembrana do tipo II

inclui corina e as matriptases ST14, matriptase-2 e matriptase-3. A matriptase (MT-SP1, ST14, TADG-15) está superexpressa em diversos tumores epiteliais (carcinomas) (25-33). Após transativação facilitada pelo inibidor do ativador de hepatócito-1 (HAI-I), matriptase promove o crescimento tumoral e metástase por degradação de componentes da matriz extracelular diretamente ou por ativação de outras proteases, por exemplo, ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), resultando em eventos de degradação da matriz (26, 34, 3 5) . Além das famílias de LDLR e matriptase, várias outras proteínas possuem domínios de CR. Uma dessas proteínas, o antígeno FDC-8D6 (CD320) , possui um par desses domínios e tem um papel importante na diferenciação de células B em folículos linfáticos (36, 37) . Os papéis importantes que as proteínas que contêm CR . desempenham em processos fisiopatológicos, juntamente com os perfis de distribuição tecidual únicos de alguns membros dessas famílias, tornam essas proteínas alvos farmacológicos úteis. Fármacos seletivos à proteína teriam um impacto direto sobre a função de uma proteína-alvo, diminuindo os efeitos de suporte que a proteína possui sobre um estado de doença de particular. Alternativamente, o fármaco se beneficiaria da distribuição tecidual da proteína-alvo para liberar eficientemente outras moléculas terapêuticas a um tecido particular afetado por uma doença. Apesar das evidências consideráveis da importância das proteínas que contêm CR na fisiologia e fisiopatologia de mamíferos, há poucos exemplos de fármacos que atuam seletivamente em membros específicos das famílias do LDLR ou da proteína que contém CR. A habilidade para criar moléculas que se ligam a membros específicos dessas famílias forneceria um meio para o desenvolvimento desses fármacos.

Por exemplo, WO 2006/138343 (Zankel e cols.) relata

dados que mostram que uma fusão de GDNF à RAP (que cruza a barreira hematencefálica) produziu um conjugado que retinha a conformação homodimérica ligada por dissulfeto de GDNF. O conjugado de RAP-GDNF se ligou e ativou o receptor para 25 GDNF (GFRa-I) com a mesma afinidade (Kd) que GDNF, e reteve a atividade biológica in vitro, como evidenciado por hipercrescimento de neurite induzido por RAP-GDNF em células PC12 em cultura.

Considerando a participação disseminada das proteínas que contêm CR por toda a fisiologia de mamíferos, há necessidade de fragmentos e variantes de RAP que retenham . as características de ligação de RAP originais, ou que possuam seletividade de ligação aumentada por proteínas que contêm CR específicas, e também exibam outras propriedades 5 desejáveis, tais como estabilidade ou facilidade de produção e fabricação aumentadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO As repetições do tipo complemento (CR) são uma grande família de seqüências de proteínas conservadas que adotam uma dobragem característica. As proteínas que contêm CR incluem membros da família do receptor de LDL, a família da serina protease transmembrana do tipo II (matriptase) e outras proteínas como, por exemplo, antígeno FDC-8D6 (CD320) . A proteína associada ao receptor (RAP) se liga a muitas dessas proteínas que contêm CR com alta afinidade. A seqüência de 323 aminoácidos da RAP madura é apresentada no ID. DE SEQ. N°: 95. A seqüência de aminoácidos do domínio 3 da RAP madura (aminoácidos 201-323), 123 aminoácidos de comprimento, é apresentada no ID. DE SEQ. N°: 96. Os aminoácidos 243-313 são apresentados no ID. DE SEQ. N°: 97. Os aminoácidos 249-303 de RAP são apresentados no ID. DE SEQ. N0: 98.

A invenção fornece peptídeos cíclicos da RAP (incluindo análogos ou derivados) que se ligam às proteínas 25 que contêm CR com alta afinidade, conjugados e composições que compreendem esses peptídeos cíclicos, e usos terapêuticos e diagnósticos desses peptídeos, por exemplo, como inibidores ou intensificadores dessas proteínas que contêm CR, ou para a liberação direcionada de agentes

3 0 diagnósticos ou terapêuticos aos tecidos que expressam essas proteínas que contêm CR. Os peptídeos cíclicos da RAP , podem exibir propriedades desejáveis, tais como afinidade aumentada, seletividade de ligação aumentada para uma proteína que contém CR, estabilidade e/ou facilidade de 5 fabricação aumentada.

Os peptídeos cíclicos da RAP da invenção são baseados na seqüência de aminoácidos da RAP madura, de preferência o domínio 3, possuem preferivelmente um comprimento de menos de 123 aminoácidos e contêm uma ligação covalente entre dois aminoácidos não consecutivos. Em algumas modalidades, a ligação covalente estabiliza a estrutura tridimensional do peptídeo da RAP. Em algumas modalidades, a ligação covalente fornece um aumento da afinidade de ligação, de tal forma que o peptídeo cíclico da RAP se liga a uma proteína que contém CR com uma Kd de cerca de 1 x IO"8 M ou menos ("menos" significando melhor afinidade). Essas afinidades de ligação podem ser medidas por qualquer método conhecido na técnica como, por exemplo, radioimunoensaio, ELISA, análise por tecnologia baseada em ressonância de plasmônio de superfície (SPR) (por exemplo, Biacore) ou ensaio de exclusão cinética (por exemplo, KinExA). Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard e cols., Ann N.Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949) . Em modalidades exemplares, a afinidade de ligação por uma proteína de CR é de cerca de 1 x 10‘9, IO'10, 10'11, IO'12, 10' 13, IO'14 M ou menos. A invenção fornece peptídeos da RAP de vários tamanhos, incluindo cerca de 103, cerca de 99, cerca de 95, cerca de 90, cerca de 85, cerca de 82, cerca de 80, cerca de 78, cerca de 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57 ou 56 aminoácidos de comprimento ou menos. Em algumas modalidades, a ligação covalente é formada entre aminoácidos que estão separados por cerca de 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 5 7 ou 5 6 aminoácidos.

Os peptídeos cíclicos da RAP da invenção podem compreender uma seqüência de aminoácidos baseada na seqüência da RAP humana madura (ID. DE SEQ. N°: 95) . Em uma modalidade, a seqüência de aminoácidos do peptídeo cíclico 10 da RAP perdeu pelo menos 200 e até 243 aminoácidos do terminal N da RAP madura. Dessa forma, o peptídeo cíclico da RAP pode não possuir os aminoácidos 1-200, 1-220, 1-225, 1-230, 1-235, 1-240, 1-241, 1-242, 1-243 ou, alternativamente, 1-244, 1-245, 1-246, 1-247 ou 1-248 da 15 RAP madura. Em uma modalidade relacionada, a seqüência de aminoácidos do peptídeo da RAP não possui ainda pelo menos

4 e até 11 aminoácidos do terminal C da RAP madura. Dessa forma, o peptídeo cíclico da RAP pode não possuir os aminoácidos 314-323 ou 313-323 ou, alternativamente, 304- 323, 305-323, 306-323, 307-323, 308-323, 309-323, 310-323, 311- 323 ou 312-323 da RAP madura. Em outra modalidade, a seqüência de aminoácidos do peptídeo da RAP compreende uma porção contínua da RAP madura que possui (a) pelo menos 71 aminoácidos de comprimento e (b) compreende os aminoácidos 256-270. Em uma modalidade relacionada, a seqüência de aminoácidos do peptídeo da RAP compreende uma porção contínua do domínio 3 da RAP madura que possui (a) pelo menos 71 aminoácidos de comprimento e (b) compreende os aminoácidos 256-270. Porções exemplares de RAP que podem 3 0 formar a base para um peptídeo cíclico da RAP incluem os 'aminoácidos 200-323, 221-323, 200-319, 221-319, 243-319, 244-319, 249-319, 200-313, 221-313, 243-313, 244-313, 249- 313, 200-303, 221-303, 243-303, 15 244-303, 246-311, 246- 313 OU 249-303 da RAP madura (ID. DE SEQ. N°: 95).

5 Como aqui descritos, podem ser preparados peptídeos

cíclicos da RAP que exibem afinidade por e seletividade para proteínas que contêm CR que é similar àquela da RAP nativa (por exemplo, uma diferença de cerca de 5 vezes ou menos, comparados com a RAP nativa). Também podem ser preparados peptídeos cíclicos da RAP que exibem afinidade aumentada por e/ou seletividade alterada para uma ou mais proteínas que contêm CR, comparados com a RAP nativa. Em uma modalidade, o peptídeo cíclico da RAP exibe pelo menos afinidade aumentada em 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 7 vezes, 10 vezes, ou 20 vezes (em relação à RAP nativa) e/ou seletividade de ligação aumentada para uma proteína que contém CR selecionada do grupo que consiste em LDLR (P01130) , LRPl (P98157), LRPlB (Q9NZR2), LRP2 (P98164), LRP3 (075074), LRP4 (075096), LRP5 (075197), LRP 6 (075581), LRP8 (Q14114), receptor relacionado à sortilina, SorLA (Q92673), LRP10 (Q7Z4F1), LRPll (Q86VZ4), LRPl2 (Q9Y561), FDC-8D6 (CD320), VLDLR (P98155), TADG-15 (ST14, Q8WVC1), TMPS3 (P57727), TMPS4 (Q9NRS4), TMPS6 (Q8IU80), Q6ICC2, Q6PJ72, Q76B61, Q7RTY8, Q7Z7K9, Q86YD5, Q8NAN7, Q8NBJ0, Q8WW88, Q96NT6, Q9BYE1, Q9BYE2, Q9NPF0 e corina (Q8IZR7). Essa seletividade de ligação pode ser calculada, por exemplo, pela proporção da afinidade de ligação do peptídeo por uma proteína que contém CR em particular em relação ã afinidade de ligação 3 0 do peptídeo por pelo menos outra proteína que contém CR. 0 peptídeo pode exibir seletividade de ligação por uma proteína que contém CR em relação a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 outras proteínas que contêm CR.

Os peptídeos cíclicos da RAP da invenção também podem ser compostos por seqüência da RAP nativa ou podem incluir mutações à seqüência nativa. Em modalidades exemplares, os peptídeos cíclicos da RAP da invenção compreendem uma seqüência de aminoácidos pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 97 ou ID. DE SEQ. N°: 98. Em algumas modalidades, o peptídeo cíclico da RAP possui menos do que cerca de 8 5 aminoácidos de comprimento, compreende 5 0 aminoácidos contíguos que são pelo menos 70% idênticos ao ID. DE SEQ. N°: 98, e se liga a uma proteína que contém CR com uma Kd da afinidade de ligação de cerca de 1 x IO'8 M ou menos. Em algumas modalidades, o peptídeo cíclico da RAP inclui uma mutação em uma, duas, três, quatro, cinco ou seis ou mais posições em qualquer uma das regiões selecionadas de: aminoácidos 200-319, 300-319 ou 247-257 da RAP madura. Em modalidades exemplares, o peptídeo cíclico da RAP inclui uma mutação em uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em 175, 205, 213, 217, 226, 230, 232, 239, 241, 242, 246, 247, 249, 250, 251, 256, 257, 261, 266, 267, 268, 270, 273, 279, 280, 287, 290, 294, 296, 297, 298, 305, 308, 311, 312, 313, 314 ou 315 da RAP madura (ID. DE SEQ. N°: 95). Em outras modalidades, o peptídeo cíclico da RAP compreende uma mutação em três ou mais das seguintes posições: 205, 217, 249, 251, 256, 257, 266, 270, 294, 296, 297, 305. Em uma modalidade, o peptídeo cíclico da RAP contém pelo menos uma mutação nas posições 251, 256 e 27 0 da RAP madura.

Em um aspecto, o peptídeo cíclico da RAP se liga seletivamente a uma proteína de matriptase. Contempla-se 5 que um peptídeo específico para matriptase pode compreender os aminoácidos 243-313 ou 249-303 da RAP madura (ID. DE SEQ. N°: 95) e contém ainda uma mutação em qualquer uma das posições 251, 256, 257, 266, 270 ou 280 da RAP madura. Contempla-se ainda que os peptídeos específicos para 10 matriptase da RAP contêm pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis mutações nas posições 251, 256, 257, 266, 270 e/ou 280 da RAP madura.

Em outro aspecto, o peptídeo cíclico da RAP se liga seletivamente a uma proteína do VLDLR. Contempla-se que um 15 peptídeo específico para VLDLR pode compreender os aminoácidos 243-313 ou 249-303 da RAP madura (ID. DE SEQ. N° : 95) e contém ainda uma mutação em qualquer uma das posições 251, 256, 270 ou 296 de RAP. Contempla-se ainda que os peptídeos da RAP específicos para VLDLR contêm pelo 20 menos uma, duas, três ou quatro mutações nas posições 251, 256, 270 e/ou 296 da RAP madura.

Em um aspecto adicional, o peptídeo cíclico da RAP se liga seletivamente a uma proteína de FDC-8D6 (CD320). Contempla-se que o peptídeo específico para FDC-8D6 pode 25 compreender os aminoácidos 243-313 ou 24 9-303 da RAP madura (ID. DE SEQ. N°: 95) e contém ainda uma mutação em qualquer uma das posições 251, 256, 270, 279 ou 305 de RAP. Contempla-se ainda que os peptídeos da RAP específicos para FDC-8D6 contêm pelo menos uma, duas, três, quatro ou cinco 30 mutações nas posições 251, 256, 270, 279 e/ou 305 da RAP madura.

Qualquer uma das mutações precedentes pode incluir a substituição de um aminoácido do grupo acídico (D, E) com um aminoácido do grupo básico (K, R) , ou vice-versa.

Qualquer uma das mutações precedentes também pode incluir a substituição de um aminoácido do grupo (A, C, D, E, G, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, s, T, V) com um aminoácido do grupo (F, Y, W, H) . Em uma modalidade adicional, o peptídeo cíclico da RAP compreende três, quatro, cinco, seis ou mais

das seguintes mutações : V175L, R205S, S213T, E217K, L226M, H249Y, E230V, S232P, E239G, E246G, E251L, E251K, E251T, E251G, E251P, E251N, E251R, K256R, K256V, K256A, K256I, K256P, K256L, I266F, I266T, K2 5 7Y, Q261R, A2 6 7V, H268R, K2 7 0P, K2 7 0D, K270N, K270G, K270E, K27 0W, L271M, H273Y, D279Y, V283M, R2 8 7H, H290Y, H290L, E294V, R2 9 6L, T297I, K298R, K3 0 5T, K306M, S312F, G313D, E246C, L247G, G280A, L311A, S312C, Q309C, F250C, L3080, L311G, E241C e I315C comparado com a RAP madura (ID. DE SEQ. N°: 95).

Em qualquer uma das modalidades precedentes, os

2 0 peptídeos da RAP podem conter uma cisteína no terminal N ou

perto do terminal N do peptídeo e uma cisteína no terminal C ou perto do terminal C do peptídeo, permitindo a ciclização do peptídeo e a estabilização das alfa-hélices por meio da formação de ligação dissulfeto entre as duas

cisteínas. Opcionalmente, uma glicina ou prolina pode ser interposta entre as cisteínas e as alfa-hélices (por exemplo, Cys-Gly no terminal N e Gly-Cys no terminal C). A introdução de glicinas permite uma quebra na alfa-hélice para uma ligação dissulfeto inter-helicoidal não nativa

3 0 adjacente. A invenção também contempla combinações ou arranjos oligoméricos de pelo menos 2, 3, 4, 5 ou 6 peptídeos cíclicos da RAP da invenção. Os arranjos podem ser arranjos de repetição do mesmo peptídeo cíclico da RAP ou arranjos 5 de peptídeos cíclicos da RAP diferentes. As várias combinações podem ser contíguas ou separadas por vinculadores peptídicos (por exemplo, com comprimento de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos) que exibem cada peptídeo cíclico da RAP em uma configuração tridimensional que permite que 10 os domínios se liguem a pares de CR diferentes dentro da mesma proteína que contém CR ou se liguem a pares de CR de proteínas que contêm CR diferentes.

Em outro aspecto, a invenção fornece um conjugado que compreende o peptídeo cíclico da RAP (ou arranjo de 15 peptídeos cíclicos da RAP) conjugado a um agente diagnóstico ou terapêutico. Em uma modalidade, o polipeptídeo e o agente diagnóstico ou terapêutico estão ligados por meio de um vinculador. Em uma modalidade adicional, o referido vinculador é um vinculador peptídico.

2 0 Em outra modalidade, o conjugado que compreende o polipeptídeo da invenção é submetido à transeitose in vivo. Em modalidades exemplares, o agente terapêutico ligado ao polipeptídeo da invenção é selecionado do grupo que consiste em um fator de crescimento neuronal derivado de 25 célula glial (GDNF), fator de crescimento neuronal derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento neuronal (NGF) ou outros fatores de crescimento neural conhecidos na técnica, um domínio 10 de desintegrina e metaloproteinase [Homo sapiens] ADAMlO, ou outras proteases que atuam em APP ou 30 Abeta, MESD (uma proteína acompanhante para LRP5/6 que é necessária para o transporte dos receptores às superfícies celulares), agentes quimioterápicos para o câncer, inibidores de protease, moléculas pró-apoptóticas, antígenos autoimunes ou enzimas lisossômicas. Em uma 5 modalidade relacionada, o conjugado que compreende o peptídeo cíclico da RAP (ou arranjo de peptídeos cíclicos da RAP) está conjugado a um agente ativo. Em uma modalidade adicional, o agente ativo é um agente quimioterápico. Ainda em uma modalidade adicional, o agente quimioterápico é um 10 radioisótopo.

Ainda em outro aspecto, a invenção contempla um método de liberação do agente diagnóstico ou terapêutico a um tecido em particular de um indivíduo por administração àquele indivíduo de um conjugado que compreende o referido 15 agente e um peptídeo cíclico da RAP (ou arranjo deste) da invenção. Em uma modalidade, o agente diagnóstico ou terapêutico conjugado a um peptídeo cíclico da RAP é liberado a um tecido específico por transcitose através de barreiras epiteliais ou endoteliais. Em uma modalidade, o

2 0 agente é liberado através da barreira hematencefálica. Em uma modalidade relacionada, o indivíduo sofre de uma doença neurológica incluindo, sem limitação, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, outros distúrbios de desmielinização 25 relacionados, um câncer do sistema nervoso central, lesão cerebral traumática, lesão da medula cerebral, acidente vascular cerebral ou isquemia cerebral, esclerose em placa, vasculite cerebral, epilepsia, doença de Huntington, síndrome de Tourette, síndrome de Guillain-Barré, doença de 30 Wilson, doença de Pick, distúrbios neuroinflamatórios, encefalite, encefalomielite ou meningite de origem viral, fúngica ou bacteriana ou outras infecções do sistema nervoso central, doenças de príon, ataxias cerebelares, degeneração cerebelar, síndromes de degeneração 5 espinocerebelar, ataxia de Friedreich, ataxia

telangiectasia, amiotrofia espinhal, paralisia supranuclear progressiva, distonia, espasticidade muscular, tremor, retinite pigmentosa, demência senil, demência subcortical, demência aterosclerótica, demência associada à AIDS, ou outras demências, degeneração estriatonigral,

encefalomiopatias mitocondriais, lipofuscinose neuronal ceróide, distúrbios de armazenamento lisossômico com envolvimento do sistema nervoso central, leucodistrofias, distúrbios de defeitos do ciclo da uréia, encefalopatias hepáticas, encefalopatias renais, encefalopatias

metabólicas, porfiria, envenenamentos com compostos neurotóxicos, dano cerebral induzido por radiação, ou distúrbios psiquiátricos como, por exemplo, psicose, ansiedade, depressão, déficits de atenção, distúrbios da 20 memória, distúrbios cognitivos, distúrbios do apetite, obesidade, dependência, desejo ou dependência farmacológica. A invenção ainda fornece um método de liberação de uma proteína terapêutica a um compartimento lisossômico em uma célula em um tecido em particular de um

2 5 indivíduo, que compreende o contato da referida célula com uma quantidade eficaz de um conjugado que compreende a referida proteína terapêutica conjugada a um peptídeo cíclico da RAP da invenção. Em uma modalidade, o indivíduo sofre de uma doença de armazenamento lisossômico (LSD).

Em outra modalidade, a invenção contempla um método de tratamento de câncer ou câncer metastático, ou um método de redução de efeitos tumorigênicos ou metastáticos associados a uma proteína que contém CR. Esses métodos envolvem a administração a um indivíduo de um peptídeo cíclico da RAP (ou arranjo deste) que se liga seletivamente à proteína tumor igênica que contém CR, ou a um conjugado que compreende um agente terapêutico para o câncer conjugado ao referido peptídeo cíclico da RAP (ou arranjo). Essas proteínas tumorigênicas que contêm CR incluem, sem limitação, LRP5, LRP6, qualquer uma das matriptases ou antígeno FDC-8D6. O peptídeo cíclico da RAP da invenção pode diminuir os efeitos tumorigênicos associados à proteína-alvo que contém CR ao interferir diretamente com suas funções, por exemplo, por bloqueio da ligação ou sítios ativos. Alternativamente, o conjugado que compreende

o peptídeo cíclico da RAP da invenção conjugado a um agente terapêutico para o câncer pode ser usado para ter como alvo tecidos que superexpressam essas proteínas que contêm CR com o fármaco antitumoral. Por exemplo, tecidos que

2 0 superexpressam matriptase incluem carcinomas, por exemplo,

carcinomas ovarianos, cervicais, de próstata, de mama, de pulmão, do cólon ou gástricos.

Em outra modalidade, a invenção contempla um método de liberação de agentes terapêuticos ao fígado para tratar 25 distúrbios hepáticos, incluindo hepatite ou câncer do fígado. Esses métodos envolvem a administração a um indivíduo de um conjugado que compreende um agente terapêutico conjugado a um peptídeo cíclico da RAP (ou arranjo deste) que retém as características de ligação da

3 0 RAP nativa ou que se liga seletivamente com afinidade ainda 'maior ao LRPl. Em algumas modalidades, os métodos incluem a liberação de agentes quimioterápicos/citotóxicos ao fígado para tratar carcinoma hepatocelular e outras doenças hepáticas.

5 Ainda em outra modalidade, a invenção contempla um

método de tratamento de osteoporose ou de outra doença associada à atividade reduzida de osteoblastos e/ou aumentada de osteoclastos, que compreende a administração de um peptídeo cíclico da RAP ou conjugado que compreende 10 um agente ativo conjugado a um peptídeo cíclico da RAP, que se liga seletivamente ao LRP5 e, dessa forma, inibe fatores que antagonizam a diferenciação de osteoblastos e deposição óssea, bem como promovem a atividade de osteoclastos. Espera-se que esses métodos de tratamento aumentem a 15 atividade de osteoblastos e/ou reduzam a atividade de osteoclastos, reduzindo, dessa forma, a perda óssea ou promovendo o fortalecimento ósseo.

Em um aspecto relacionado, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um conjugado que

2 0 compreende um peptídeo cíclico da RAP conjugado a um agente

diagnóstico ou terapêutico, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto diferente, a invenção fornece um peptídeo cíclico da RAP conjugado a uma porção ou marcador 25 detectável. Quando o peptídeo cíclico da RAP possui seletividade de ligação para uma proteína que contém CR em particular, o peptídeo cíclico da RAP pode ser usado para detectar a presença dessa proteína que contém CR. Ele também pode ser usado para detectar os padrões de expressão

3 0 da proteína que contém CR, incluindo, por exemplo, a 'superexpressão associada à tumorigenicidade. A invenção ainda fornece métodos de utilização desse peptídeo cíclico da RAP para diagnosticar condições associadas ã superexpressão ou subexpressão de uma proteína que contém 5 CR.

Em outros aspectos, a presente invenção apresenta um método de produção de um peptídeo da RAP, sinteticamente ou por meios recombinantes, que pode ciclizar naturalmente ou pode ainda ser modificado quimicamente para ciclizar por 10 meio de ligação covalente. A invenção fornece ácidos nucléicos que codificam qualquer um dos peptídeos da RAP citados anteriormente, vetores que compreendem esses ácidos nucléicos, células hospedeiras que contêm esses ácidos nucléicos ou vetores, e métodos de produção desses 15 peptídeos, que compreendem as etapas de cultivo das células hospedeiras em um meio de cultura adequado e o isolamento do peptídeo das referidas células hospedeiras ou do referido meio de cultura.

Outras características e vantagens da invenção ficarão 20 evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deve-se entender, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas da invenção, são apresentados apenas como ilustração, pois várias alterações e modificações dentro do 25 espírito e do escopo da invenção ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é uma ilustração representativa de uma

3 0 repetição do tipo complemento, e se baseia na seqüência da sétima repetição do tipo complemento da proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade

I (LRP1 CR7, PDB 1J8E) , como determinado por Simonovic e cols. (43) , que mostram a superfície da alça de ligação de 5 cálcio formada por resíduos nas posições marcadas A, B, C, D. 0 cálcio é representado como uma esfera.

A Figura 2 mostra um alinhamento de seqüências de CR selecionadas para análise de ligação e seleção de mutante de RAP ou anticorpo de CR. Os pares e tripletos específicos usados estão indicados por colchetes na esquerda. 0 substrato de separação (LRP2 CR8 9) está indicado pelo colchete vermelho (cor mais clara). 0 motivo AxcBxCxD dentro do alinhamento está indicado, com as posições AeC para cada seqüência de CR sublinhadas. A concatenação da cadeia de caracteres de aminoácidos em A, C, A' e C' para cada par de CR está indicada à direita. Os aminoácidos sombreados são idênticos ao aminoácido predominante na posição alinhada; os aminoácidos em negrito são homólogos ao aminoácido predominante na posição alinhada. As seqüências estão alinhadas com Clustal W (44) e formatadas com BOXSHADE.

A Figura 3 mostra uma análise de SDS-PAGE de proteínas de CR. Proteínas redobradas, purificadas, foram desnaturadas em tampão de carga de SDS na presença ou 25 ausência de DTT 2 mM. As amostras tratadas foram resolvidas em géis Bis-Tris 12% NuPAGE, como descrito em Métodos. Os géis foram corados com Azul Brilhante Coomassie. Cada par de raias é marcado no fundo com a proteína de CR associada testada. Os tamanhos do marcador de peso molecular estão 30 indicados. São mostrados resultados típicos. Abreviações: LI é LRPl; L2 é LRP2; L6 é LRP 6; M é MAT (matriptase, ST14) ; V é VLDLR; YWR LRP2 CR89; YWD = LRP2 CR89 R1088D; YDWR = LRP2 CR89 V1047D; YDWD = LRP2 CR89 V1047D R1088D; WWR LRP2 CR89 Y1042W; WDWR LRP2 CR89 Y1042W V1047D; WWD = 5 LRP 2 CR89 Y1042W R1088D; WDWD = LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D.

A Figura 4 revela a ligação de RAP d3 às proteínas de CR selecionadas usando uma série de diluições de RAP d3 preparada a partir de 100-1,25 nM.

As Figuras 5A-B revelam a ligação de RAP d3, MegaRAPl

d3 (RAPv2A d3) e variantes da seqüência intermediária para LRP2 CR89 e LRPl CR3-5. A Figura 5A ilustra a ligação de mutantes de RAP d3 e revertentes RAPv2A d3 ao LRP2 CR8 9. A Figura 5B ilustra a ligação de mutantes de RAP d3 e 15 revertentes RAPv2A d3 ao LRPl CR3-5. Os dados foram tabulados e ajustados por regressão não linear pressupondo um único sítio de ligação (GraphPad Prism). Os valores de Kd com desvios padrões foram derivados a partir da análise de regressão.

2 0 A Tabela 2 mostra dados para a ligação de variantes

RAP d3 e RAP v2 (RAP v2A) ao LRPl CR3-5 e LRP2 CR8 9. NF indica que a ligação poderia ser medida ou que os dados poderiam ser ajustados de forma confiável usando regressão não linear pressupondo um único sítio de ligação. O

2 5 percentual de ligação máxima é a proporção da OD na maior concentração testada para cada ligante e a maior OD medida para todos esses ligantes naquela concentração.

A Figura 6 mostra a ligação de MegaRAPl d3 e RAP d3 às variantes de LRP2 CR89. Abreviações usadas na figura: LRP2 CR89 Y1042W (WWR) , LRP2 CR89 V1047D (YDWR) , LRP2 CR89 R1088D (YVWD) , LRP2 CR89 V1047D R1088D (YDWD) , LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D (WDWD), LRP2 CR89 Y1042W V1047D (WDWR) , LRP2 CR89 Y1042W R1088D (WVWD) .

A Tabela 3 mostra dados para a ligação de RAP d3 e 5 RAPv2A d3 às variantes de LRP2 CR8 9. NF indica que a ligação não podia ser medida ou que os dados não podiam ser ajustados de forma confiável usando regressão não linear pressupondo um único sítio de ligação.

0 percentual de ligação máxima é a proporção da OD na maior concentração testada para cada ligante e a maior OD medida para todos esses ligantes naquela concentração.

A Tabela 4 mostra seqüências da variante de RAP d3 isoladas por bibliotecas de apresentação em fago de mutante de panning em pares de CR diferentes. São mostradas apenas 15 as posições variáveis. A numeração de aminoácido corresponde à RAP madura. São mostrados o nome da variante (d3) , o par de CR usado para seleção por afinidade (CR) , a constante de dissociação aparente (Kd) para o complexo entre o par de CR variante e alvo (quando determinado) , e 20 as identidades de aminoácidos nas posições variáveis.

A Figura 7 mostra a ligação de variantes RAP d3 aos pares de CR. RAP d3, MegaRAPl d3, VRAP2 d3, MatRAPl d3 e MatRAP2 d3 foram incubados em concentrações de 8 0 nM com LRPl CR3-5, LRP 6 CR12, LRP6 CR23, LRP6 CR1-3, LRP2 CR89, 25 LRP2 CR2728, LRP 2 CR3031, LRP2 CR3435, LRP2 CR34-36, VLDLR CR78, VLDLR CR6-8, MAT CR12, MAT CR23 e MAT CR34 . As amostras foram testadas duas vezes, em duplicata, e os valores combinados. As médias e os desvios padrões foram então calculados. Os valores em branco obtidos dos poços 30 incubados na ausência de ligante foram usados para corrigir os dados de absorbância. Os coeficientes de variância (CV) não excederam 2 0% (média de 6%) para qualquer condição testada, e não são mostrados.

A Figura 8 mostra as seqüências de aminoácidos completas de variantes RAP d3 aqui isoladas.

A Figura 9 mostra o efeito positivo que o truncamento da variante MatRAPl tanto no terminal N quanto no terminal C possui sobre afinidade de ligação. Variantes truncadas foram produzidas como descrito para variantes de

comprimento total.

A Figura 10 mostra a ligação de 320RAP1 e a variante truncada correspondente ao par de CR-alvo do antígeno FDC8D6 .

As Figuras IlA e IlB mostram a ligação relativa de

peptídeos da RAP ao cluster de rhLRPl 2 e ao ectodomínio de rmVLDLR, respectivamente.

A Figura 12 mostra o efeito de mRAPc conjugado à toxina sobre a viabilidade celular de células CHO que expressam LRP e deficientes em LRP.

As Figuras 13A, 13B e 13C ilustram as estruturas

químicas do peptídeo cíclico de RAP, Heptide, conjugados a diferentes agentes citotóxicos.

As Figuras 14A, 14B e 14C mostram a inibição de RAP, e a ligação de uPA-PAI-I ao receptor LRPl por peptídeo mRAPc

2 5 e mRAP conjugada à estreptavidina.

A Figura 15 ilustra a biodistribuição de peptídeo cíclico da RAP após administração intravenosa em animais.

DESCRIÇÃO DETALHADA

RAP é funcionalmente bidentada, com tanto o primeiro e

3 0 o terceiro domínios (dl e d3) se ligando com baixa afinidade nanomolar aos pares em tandem particulares de ^repetições do tipo complemento (CR) dentro do LDLR. 0 domínio 3, que consiste em aproximadamente 110 aminoácidos, demonstrou ter a maior afinidade por pares de CR 5 relevantes. Para minimizar a imunogenicidade, maximizar a eficiência de produção e aumentar a potência, é útil minimizar RAP àquelas seqüências que participam diretamente na ligação ao receptor. No entanto, foi demonstrado que a dobragem estável de d3 exige seqüências dentro de RAP que 10 não participam diretamente na formação da superfície de contato com o receptor. Essas seqüências adicionais, encontradas dentro da região do terminal N de d3 e da região do terminal C de d2 são, portanto, necessárias para assegurar a dobragem estável e a ligação com alta afinidade 15 ao receptor. d3 isolado não se liga tão firmemente ao receptor quanto o faz d3 dentro do contexto de RAP de comprimento total. Versões truncadas de d3 desprovidas das seqüências de estabilização da dobragem também se ligam deficientemente ao receptor. Dados estruturais derivados do

2 0 complexo entre RAP d3 e LDLR CR34 indicam que as seqüências de RAP d3 de ligação ao receptor são encontradas dentro de duas alfa-hélices antiparalelas de comprimento aproximadamente igual unidas por uma alça flexível. A montagem helicoidal pareada possui uma torção em sentido

2 5 anti-horário pronunciada e parece um "U" torcido esticado.

A invenção fornece uma forma substancialmente truncada de RAP d3 estabilizada por uma única ligação covalente intramolecular, por exemplo, uma ligação dissulfeto. A forma não ciclizada truncada, sem a ligação covalente

3 0 intramolecular, possui afinidade de ligação por LRP 1 reduzida. Em contraste, o peptídeo cíclico da RAP possui . afinidades de ligação ao receptor aumentadas indistinguíveis daquelas de d3 de RAP de comprimento total. A habilidade para estabilizar a estrutura tridimensional 5 helicoidal dentro de um fragmento de RAP d3 com uma única ligação covalente não nativa, em vez das grandes regiões peptídicas presentes na RAP nativa, fornece afinidade aumentada e resulta em diversas vantagens. A invenção permite a fabricação rápida dos pequenos peptídeos da RAP, 10 por exemplo, por síntese peptídica de fase sólida, sem a necessidade de organismos recombinantes, permite imunogenicidade potencial reduzida, e fornece maior facilidade de conjugação aos agentes ativos.

Os peptídeos cíclicos da RAP da invenção possuem aplicações farmacêuticas potenciais com base em duas propriedades gerais dos receptores-alvo: em primeiro lugar, vários receptores participam no estabelecimento na e progressão de estados de doença. Reagentes que se ligam seletivamente a esses receptores, portanto, podem ser usados para alterar o comportamento dos receptores e os efeitos fisiopatológicos por eles apoiados. Em segundo lugar, vários receptores possuem distribuições teciduais únicas. Reagentes que se ligam seletivamente a esses receptores, portanto, podem ser usados para carregar seletivamente outras substâncias farmacológicas àqueles tecidos nos quais um receptor-alvo é expresso predominantemente. A invenção também contempla o uso dessas composições na prevenção, acompanhamento e tratamento de doenças, incluindo, sem limitação, doenças proliferativas celulares, tais como doenças neoplásicas, doenças autoimunes, doenças cardiovasculares, doenças com anormalidades hormonais, doenças degenerativas, doenças do envelhecimento, doenças do sistema nervoso central (por exemplo, doença de Alzheimer, epilepsia, hiperlipidemias) , 5 doenças e condições psiquiátricas (por exemplo, esquizofrenia, distúrbios do humor, tais como depressão e ansiedade), doenças infecciosas, doenças autoimunes, doenças por deficiência de enzimas, doenças de armazenamento lisossômico, tais como aquelas descritas 10 acima, e semelhantes.

Os membros da família do LDLR são bem expressos no endotélio capilar e em tipos de células do sistema nervoso central (SNC), incluindo neurônios e astrócitos (por exemplo, receptor de LDL, Megalina, LRP1). A família do 15 receptor de LDL efetua a endocitose do ligante ligado e foi demonstrado que efetua a transcitose de ligantes através de células epiteliais polarizadas no rim, tireóide e através de células endoteliais capilares no cérebro. LDLR, portanto, compreende um pool de receptores relacionados em

2 0 termos de composição e funcionalmente expressos em

diferentes níveis em diferentes tecidos. Exemplos incluem o VLDLR expresso em tecido muscular, LRPlB expresso em tecido neuronal, Megalina expressa tanto no rim quanto no tecido neuronal, e LRPl expresso no fígado e no tecido muscular 25 liso vascular. Os peptídeos cíclicos da RAP da invenção podem ser usados para visar qualquer um desses receptores, bem como tecidos que expressam outras proteínas que contêm CR, como aqui descrito.

Em modalidades mais gerais, os peptídeos cíclicos da

3 0 RAP seletivos ao receptor da invenção, isoladamente, em arranjos ou conjugados a agentes terapêuticos, constituem um meio pelo qual proteínas que contêm CR podem ser moduladas especificamente (ativadas ou inibidas). Há pelo menos quatro mecanismos pelos quais a modulação poderia ser 5 efetuada: bloqueio competitivo da ligação de ligante por associação direta do peptídeo cíclico da RAP com sítios de ligação de ligante; bloqueio não competitivo da ligação de ligante por modificação alostérica induzida pelo peptídeo cíclico da RAP de sítios de ligação de ligante; depuração 10 de receptores ou outra proteína que contém CR da superfície celular após entrecruzamento entre os mesmos receptores ou receptores diferentes induzido pela ligação de um peptídeo cíclico da RAP; ou, alternativamente, liberação aos tecidos de agentes ativos anexados a um peptídeo cíclico da RAP 15 seletivo (por exemplo, proteases, inibidores de protease, outras enzimas, radioisótopos, agentes pró-apoptóticos, toxinas, moléculas terapêuticas (fármacos), outras porções de ligação ao receptor etc.).

A. Definições

A menos que definido de forma diferente, todos os

termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem os mesmos significados comumente compreendidos por aqueles habilitados na técnica à qual esta invenção pertence. As referências seguintes fornecem àqueles habilitados uma 25 definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Singleton, e cols., "DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY" (2a ed. 1994); "THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY" (Walker ed., 1988); "THE GLOSSARY OF GENETICS" , 5a ED., R. Rieger, e cols. (eds.),

3 0 Springer Verlag (1991) ; e Hale e Marham, "THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY" (1991).

Cada publicação, pedido de patente, patente e outras referências aqui citadas é aqui incorporada por referência em sua totalidade, na medida em que não seja inconsistente 5 com a presente revelação.

Deve-se observar que, como usadas nesta especificação e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente de forma diferente.

Como aqui usados, os seguintes termos possuem os

significados atribuídos a eles, a menos que especificado de forma diferente.

Um "peptídeo cíclico da RAP", como aqui usado, significa um peptídeo com menos do que cerca de 100 15 aminoácidos de comprimento e pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar ao ID. DE SEQ. N°: 98 (aminoácidos 249-303), e que contém uma ligação covalente entre dois aminoácidos não consecutivos. Em modalidades exemplares, a ligação covalente é uma ligação 20 dissulfeto entre duas cisteínas.

Um "conjugado de RAP" ou "conjugado" refere-se a um composto que compreende um peptídeo cíclico da RAP da invenção anexado a um agente ativo. Como aqui usado, o termo "conjugado" significa que o(s) agente(s) 25 terapêutico(s) e o peptídeo cíclico da RAP estão ligados fisicamente, por exemplo, por ligações químicas covalentes, forças físicas como, por exemplo, interações de van der Waals ou hidrofóbicas, encapsulação, combinação, ou combinações destes.

0 termo "mutação", como aqui usado, significa inserção, eliminação ou substituição de um aminoácido em uma seqüência peptídica. Um peptídeo que possui uma ou mais mutações em relação à seqüência de aminoácidos nativa ou do tipo selvagem é considerado como sendo um "análogo".

5 0 termo "derivado", quando se refere à modificação

covalente de peptídeos, por exemplo, por conjugação a agentes terapêuticos ou diagnósticos, marcação (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), adesão covalente de polímero como, por exemplo, pequilação 10 (derivatização com polietileno glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos não naturais. Os derivados da invenção reterão as propriedades de ligação de moléculas da invenção não derivatizadas. A conjugação de anticorpos dirigidos ao câncer a um agente 15 citotóxico, por exemplo, isótopos radioativos (por exemplo, I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterápicos, ou toxinas, pode aumentar a destruição de células cancerosas.

Uma "repetição de complemento" ou "CR", também conhecida como um domínio do receptor de lipoproteína de 20 baixa densidade da classe A (LDL-A, Pfam), é um membro de uma família de domínios de proteína definida por seis cisteínas e um cluster de aminoácidos acídicos, entre outras características. Verificou-se que várias repetições de complemento se dobram em uma estrutura definida 25 denominada módulo receptor de LDL-IiJce ("Classificação Estrutural de Proteínas" , SCOP) . Os domínios de CR constituem o determinante de ligação de ligante de muitos receptores, incluindo receptores que pertencem ao LDLR. Foi demonstrado que uma seqüência linear de aminoácidos dentro

3 0 de cada CR, com o motivo AxcBxCxD, em que c é uma cisteína conservada, x é qualquer aminoácido, e B e D são aspartato, glutamato ou asparagina, participa na ligação de cálcio e na ligação de ligantes. Foi demonstrado que pares imediatamente adjacentes de domínios de CR específicos se 5 ligam à RAP. Foi demonstrado que os aminoácidos nas posições AeC nos dois domínios de CR de um par de CR de ligação à RAP (A, C, A1 e C') participam na ligação de RAP.

Uma "proteína que contém CR" é uma proteína que contém uma ou mais CRs. Exemplos não limitantes de proteínas que contêm CR incluem: LDLR (P01130) , LRPl (P98157), LRPlB (Q9NZR2), LRP2 (P98164), LRP3 (075074), LRP4 (075096), LRP5 (075197), LRP6 (075581), LRP8 (Q14114), receptor relacionado à sortilina, SorLA (Q92673), LRPlO (Q7Z4F1), LRPll (Q86VZ4), LRP12 (Q9Y561), FDC-8D6 (CD320). VLDLR (P98155) , TADG-15 (ST14/matriptase/MT-SPl, Q8WVC1) , TMPS 3 (P57727), TMPS4 (Q9NRS4), TMPS6 (Q8IU80), Q6ICC2, Q6PJ72, Q76B61, Q7RTY8, Q7Z7K9, Q86YD5, Q8NAN7, Q8NBJ0, Q8WW88, Q96NT6, Q9BYE1, Q9BYE2, Q9NPF0 e corina (Q8IZR7). É fornecida a referência ao número de acesso Uniprot que identifica cada uma dessas proteínas.

A Kd da afinidade de ligação é medida por métodos convencionalmente conhecidos na técnica.

"Seletividade", "seletividade de ligação" ou "se liga seletivamente" refere-se às diferenças na afinidade de um 25 ligante por diferentes receptores. Um ligante é seletivo para um receptor em particular caso ele se ligue àquele receptor com uma afinidade que é pelo menos 3 vezes maior do que a outros receptores. Por exemplo, RAP se liga ao LRPl, LRPlB, LRP2, SorLA, apoER2 e VLDLR com afinidades 30 quase idênticas. Portanto, RAP não é seletiva para um desses receptores em relação aos outros. No entanto, embora RAP se ligue fortemente ao LRPl, LRPlB, LRP2, SorLA, apoER2 e VLDLR, com constantes de dissociação de menos de 5 nM, ela se liga apenas fracamente ao LDLR, LRP5 e LRP6, com 5 afinidades que são pelo menos 10 vezes menores do que para LRPl. Portanto, RAP é seletiva para LRPl, LRPlB, LRP2, SorLA, apoER2 e VLDLR em relação a LDLR, LRP5 e LRP6. A proteína de revestimento HRV2 se liga fortemente ao VLDLR, mas não se liga a outro LDLR. Portanto, a proteína de 10 revestimento HRV2 mostra seletividade em sua ligação, com uma preferência por VLDLR em relação a outro LDLR. Reelina se liga a apoER2 e VLDLR, mas não a outros LDLRs. Portanto, reelina é seletiva para apoER2 e VLDLR em relação a outros LDLRs.

0 termo "liberação crescente relativa", como aqui

usado, refere-se ao efeito pelo qual o acúmulo no local de liberação desejado (por exemplo, cérebro ou tecido que expressa uma proteína que contém CR) de um conjugado que compreende um agente ativo conjugado a um peptídeo cíclico

2 0 da RAP da invenção está aumentado em relação ao acúmulo do agente ativo não conjugado.

0 termo "que codifica" refere-se à propriedade inerente de seqüências de nucleotídeos específicas em um polinucleotídeo, por exemplo, um gene, um cDNA, ou um mRNA, 25 para servir como modelos para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos que possuem uma seqüência de nucleotídeos definida (ou seja, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma seqüência de aminoácidos definida e as propriedades biológicas dela resultantes. Dessa forma, um 30 gene codifica uma proteína caso a transcrição e tradução de mRNA produzida por aquele gene produza a proteína em uma célula ou em outro sistema biológico. Tanto a fita codificadora, a seqüência de nucleotídeos que é idêntica à seqüência de mRNA e é normalmente fornecida em listagens de 5 seqüências, quanto a fita não codificadora, usada como modelo para a transcrição, de um gene ou cDNA, podem ser denominadas como codificadoras da proteína ou outro produto daquele gene ou cDNA. A menos que especificado de forma diferente, uma "seqüência de nucleotídeos que codifica uma 10 seqüência de aminoácidos" inclui todas as seqüências de nucleotídeos que são versões degeneradas entre elas e que codificam a mesma seqüência de aminoácidos. Seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas e RNA podem incluir íntrons.

0 termo "polinucleotídeo recombinante" refere-se a um

polinucleotídeo que possui seqüências que não são unidas juntas naturalmente. Uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo recombinante é denominada uma "célula hospedeira recombinante". 0 gene é expresso na célula

2 0 hospedeira recombinante para produzir, por exemplo, um "polipeptídeo recombinante" .

0 termo "seqüência de controle da expressão" refere-se a uma seqüência de nucleotídeos em um polinucleotídeo que regula a expressão (transcrição e/ou tradução) de uma 25 seqüência de nucleotídeos ligada operacionalmente a ela. 0 termo "ligado operacionalmente" refere-se a um relacionamento funcional entre duas partes em que a atividade de uma parte (por exemplo, a habilidade para regular a transcrição) resulta em uma ação na outra parte 30 (por exemplo, transcrição da seqüência). Seqüências de controle da expressão podem incluir, por exemplo, e sem limitação, seqüências de promotores (por exemplo, indutíveis ou constitutivos), intensificadores,

finalizadores da transcrição, a códon de início (ou seja, 5 ATG), sinais de splicing para íntrons e códons de parada.

0 termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende seqüências de controle de expressão ligadas operacionalmente a uma seqüência de nucleotídeos a ser 10 expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de atuação cis suficientes para expressão; outros elementos para a expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou sistema de expressão in vitro. Vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, por 15 exemplo, cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, naked ou contidos em lipossomos) e vírus que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

O termo "amplificação" refere-se a qualquer meio pelo qual uma seqüência de polinucleotídeos é copiada e, dessa

2 0 forma, expandida em um número maior de moléculas do

polinucleotídeo, por exemplo, por transcrição reversa, reação em cadeia de polimerase e reação em cadeia de ligase.

0 termo "hibridização estringente" e "condições 25 estringentes de lavagem e de hibridização" no contexto de experimentos de hibridização de ácido nucléico são seqüência-dependentes, e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Um guia detalhado para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen

3 0 (19 93) "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Aeid Probes" - Parte I Capítulo 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nova York. Geralmente, condições altamente estringentes de 5 hibridização e de lavagem são selecionadas para que sejam aproximadamente 50C menores do que o ponto térmico de fusão (Tm) para a seqüência específica em uma força iônica e em um pH definidos. O Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) em que 50% da seqüência-alvo hibridiza para 10 uma sonda que combina perfeitamente. Condições muito estringentes são selecionadas para serem iguais à Tm para uma sonda em particular.

Um exemplo de condições de lavagem altamente estringentes é NaCl 0,15 M a 720C por cerca de 15 minutos. 15 Um exemplo de condições de lavagem estringentes é uma lavagem com 0,2X SSC a 650C por 15 minutos (veja Sambrook e cols. para uma descrição do tampão SSC) . Freqüentemente, uma lavagem com alta estringência é precedida por uma lavagem com baixa estringência para remover o sinal de 20 fundo da sonda. Um exemplo de lavagem com estringência média para um dúplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é Ix SSC a 450C por 15 minutos. Um exemplo de lavagem com baixa estringência para um dúplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40°C por 15 25 minutos. Em geral, uma proporção de sinal para ruído de 2x (ou maior) em relação àquela observada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridização em particular indica detecção de uma hibridização específica.

0 termo "polipeptídeo" ou "peptídeo" refere-se a um

3 0 polímero composto por resíduos de aminoácidos ligados por meio de ligações peptídicas, variantes estruturais de ocorrência natural e análogos de ocorrência não natural deste. Polipeptídeos sintéticos podem ser sintetizados, por exemplo, com o uso de um sintetizador de polipeptídeo 5 automatizado. 0 termo "proteína" tipicamente se refere a polipeptídeos grandes. 0 termo "peptídeo" tipicamente se refere a polipeptídeos curtos.

Os termos "idêntico" e "percentual de identidade", no contexto de duas ou mais seqüências de polinucleotídeos ou 10 de polipeptídeos, referem-se a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são iguais ou que possuem uma percentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são iguais, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, como medida usando um dos seguintes 15 algoritmos de comparação de seqüências ou por inspeção visual. De preferência, o percentual de identidade existe em relação a uma região das seqüências que possui pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, pelo menos cerca de 100 resíduos, pelo menos cerca de 150 resíduos ou ao

2 0 longo de todo o comprimento de um ou ambos os biopolímeros em comparação.

O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), 25 pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2.444 (1988), pelas implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e 30 TFASTA na Suíte de Programas "Wisconsin Genetics", Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual.

Outro exemplo de algoritmo que é adequado para a determinação do percentual de identidade de seqüências e 5 similaridade de seqüências é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul e cols., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) .

O termo "percentual de similaridade", quando usado com relação à seqüência de polipeptídeos, descreve a 10 percentagem de resíduos de aminoácidos que são (1) iguais ou (2) que diferem apenas por substituições conservadoras (ou seja, são similares), quando comparada e alinhada para correspondência máxima, como medida usando algoritmos de comparação de seqüências convencionais ou por inspeção 15 visual.

O termo "substancialmente pura" ou "isolada" significa que uma espécie em questão é a espécie predominante presente (ou seja, em uma base molar, mais abundante do que qualquer outra espécie macromolecular individual na

2 0 composição), e uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie em questão compreende pelo menos cerca de 50% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura significa que cerca de 80%, 90%, 95%, 25 99% ou mais da espécie macromolecular presente na composição é a espécie purificada de interesse. A espécie em questão é purificada até a homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) se a 30 composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. Espécies solventes, pequenas moléculas . (<500 Dáltons), estabilizantes (por exemplo, BSA) e espécies de íons elementares não são consideradas espécies macromoleculares para a finalidade desta definição. Em 5 algumas modalidades, os conjugados da invenção são substancialmente puros ou isolados. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende um peptídeo cíclico da RAP substancialmente purificado ou isolado ou conjugado deste com um agente ativo.

O termo "de ocorrência natural", como aplicado a um

objeto, refere-se ao fato de que o objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeos ou de polinucleotídeos que está presente em um organismo que pode ser isolada de uma fonte na natureza

e que não foi modificada intencionalmente pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.

0 termo "detecção" refere-se à determinação da presença, ausência ou quantidade de um analito em uma amostra, e pode incluir a quantificação da quantidade do

2 0 analito em uma amostra ou por célula em uma amostra.

O termo "porção detectável" ou "marcador" refere-se a uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos. Por exemplo, marcadores úteis incluem 32P, 35S, corantes

fluorescentes, reagentes eletrodensos, enzimas (por exemplo, como comumente usadas em um ELISA), biotinaestreptavidina, digoxigenina, haptenos e proteínas para as quais estão disponíveis anti-soros ou anticorpos monoclonais, ou moléculas de ácido nucléico com uma

3 0 seqüência complementar a um alvo. A porção detectável freqüentemente gera um sinal mensurável, por exemplo, um sinal radioativo, cromogênico ou fluorescente, que pode ser usado para quantificar a quantidade de porção detectável ligada em uma amostra. A porção detectável pode ser 5 incorporada ou anexada a um iniciador ou sonda, tanto covalentemente quanto por meio de ligações iônicas, de van der Waals ou de hidrogênio, por exemplo, incorporação de nucleotídeos radioativos ou nucleotídeos biotinilados que são reconhecidos por estreptavidina. A porção detectável 10 pode ser detectável direta ou indiretamente. A detecção indireta pode envolver a ligação de uma segunda porção detectável direta ou indiretamente à porção detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser o ligante de um parceiro de ligação, por exemplo, biotina, que é um 15 parceiro de ligação para estreptavidina, ou uma seqüência de nucleotídeos, que é o parceiro de ligação para uma seqüência complementar, para a qual pode especificamente hibridizar. 0 próprio parceiro de ligação pode ser detectável diretamente, por exemplo, um anticorpo pode, ele 20 próprio, ser marcado com uma molécula fluorescente. 0 parceiro de ligação também pode ser detectável indiretamente, por exemplo, um ácido nucléico que possui uma seqüência de nucleotídeos complementar pode ser uma parte de uma molécula de DNA ramificada que, por sua vez, é 25 detectável por meio de hibridização com outras moléculas de ácido nucléico marcadas (veja, por exemplo, PD. Fahrlander e A. Klausner, Bio/Technology (1988) 6: 1.165) . A quantificação do sinal é obtida, por exemplo, por contagem de cintilação, densitometria ou citometria de fluxo.

3 0 0 termo "vinculador" refere-se a uma molécula que une duas outras moléculas, tanto covalentemente quanto por meio de ligações iônicas, de van der Waals ou de hidrogênio, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico que hibridiza para uma seqüência complementar na extremidade 51 e para outra 5 seqüência complementar na extremidade 3' unindo, dessa forma, duas seqüências não complementares.

0 termo "tumor" ou "neoplasia" ou "câncer", como aqui usado, inclui tumores primários e/ou metástases. Esses tumores são geralmente tumores sólidos, ou são tumores 10 difusos com acúmulos localizados. São conhecidos muitos tipos desses tumores e neoplasia. Tumores cerebrais primários incluem glioma, meningioma, neurinoma, adenoma da hipófise, meduloblastoma, craniofaringioma, hemangioma, epidermóide, sarcoma e outros. Carcinomas incluem, por 15 exemplo, carcinomas ovarianos, cervicais, de próstata, de mama, de pulmão, do cólon ou gástricos. O carcinoma hepatocelular, ou hepatoma, é o quinto câncer mais comum no mundo, e as taxas de incidência vêm crescendo firmemente. O carcinoma hepatocelular é uma doença de hepatócitos. 20 Cinqüenta por cento de todos os tumores intracranianos são metástases intracranianas. Os tumores e neoplasia cerebrais podem estar associados ao tecido cerebral e neural, ou podem estar associados às meninges, crânio, vasculatura ou qualquer outro tecido da cabeça e pescoço. Os tumores ou 25 neoplasias para tratamento de acordo com a invenção podem ser malignos ou benignos, e podem ter sido tratados previamente com quimioterapia, radiação e/ou outros tratamentos.

O termo "quantidade eficaz" significa uma dosagem

3 0 suficiente para produzir um resultado desejado em uma condição da saúde, patologia e doença de um indivíduo ou para fins diagnósticos. 0 resultado desejado pode compreender uma melhora subjetiva ou objetiva no receptor da dosagem. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" 5 refere-se àquela quantidade de um agente eficaz para produzir o efeito benéfico desejado sobre a saúde.

0 termo "pequena molécula orgânica" refere-se às moléculas orgânicas de um tamanho comparável àquelas moléculas orgânicas geralmente usadas em substâncias

farmacêuticas. 0 termo exclui biopolímeros orgânicos (por exemplo, proteínas, ácidos nucléicos etc.). Pequenas moléculas orgânicas preferidas variam em tamanho até cerca de 5.000 Da, até cerca de 2.000 Da ou até cerca de 1.000 Da.

Um "indivíduo" submetido a um procedimento diagnóstico

ou a um tratamento é um animal humano ou não humano, incluindo um mamífero ou um primata.

O termo "tratamento" refere-se ao tratamento profilático ou tratamento terapêutico ou tratamento

diagnóstico.

Um tratamento "profilático" é um tratamento administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença, ou exibe apenas sinais iniciais, com o objetivo de diminuir o risco de desenvolvimento da patologia. Os

2 5 compostos conjugados da invenção podem ser dados como um

tratamento profilático para reduzir a probabilidade de desenvolver uma patologia ou para minimizar a gravidade da patologia, se desenvolvida.

Um tratamento "terapêutico" é um tratamento

3 0 administrado a um indivíduo que exibe sinais ou sintomas da patologia com o objetivo de diminuir ou eliminar esses sinais ou sintomas. Os sinais ou sintomas podem ser bioquímicos, celulares, histológicos, funcionais, subjetivos ou objetivos. Os compostos conjugados da 5 invenção podem ser dados como um tratamento terapêutico ou para diagnóstico.

O termo "diagnóstico" significa a identificação da presença ou natureza de uma condição patológica. Métodos diagnósticos diferem em sua especificidade e seletividade. 10 Embora um método diagnóstico em particular possa não fornecer um diagnóstico definitivo de uma condição, basta que o método forneça uma indicação positiva que auxilie no diagnóstico.

O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere15 se a qualquer um dos veículos, tampões e excipientes farmacêuticos padronizados como, por exemplo, uma solução salina tamponada com fosfato, solução aquosa 5% de dextrose, e emulsões como, por exemplo, uma emulsão óleo/água ou água/óleo, e vários tipos de agentes 20 umidif icantes e/ou adjuvantes, que são aprovados por uma autoridade reguladora competente como adequados à administração a seres humanos. Veículos e formulações farmacêuticas adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 19a Edição (Mack Publishing Co., 25 Easton, 1995). Veículos farmacêuticos preferidos dependem do modo de administração desejado do agente ativo. Modos de administração típicos incluem a administração enteral (por exemplo, oral) ou parenteral (por exemplo, injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal ou

3 0 intratecal; ou administração tópica, transdérmica ou transmucosa, incluindo administração intrapulmonar). Um "sal f armaceuticamente aceitável" é um sal que pode ser formulado em um composto para uso farmacêutico, incluindo, por exemplo, sais de metal (sódio, potássio, magnésio, 5 cálcio etc.) e sais de amônia ou aminas orgânicas.

A. Proteínas que contêm CR e seu papel

"LDLR" refere-se a membros da família do receptor de lipoproteína de baixa densidade, que incluem a proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 10 I (LRPl) . LRPl é uma proteína grande de 4.525 aminoácidos (600 kDa) , que é clivada por furina para produzir duas subunidades de 515 (alfa) kD e 8 5 (B) kDa que permanecem ligadas não covalentemente. LRPl é expressa na maioria dos tipos de tecido, mas é encontrada primariamente no fígado. 15 Outros membros da família do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) incluem LDL-R (132 kDa) ; LRP2 (megalina, gp330) ; LRP/LRP1 e LRPlB (600 kDa) ; VLDL-R (130 kDa); LRP5; LRP6; apoER-2 (LRP-8, 130 kDa); Mosaico LDL-R (LR11, 250 KDa); e outros membros como, por exemplo, LRP3, 20 LRP6, e LRP-7. Recursos característicos da família incluem expressão na superfície celular; repetições extracelulares de domínio de ligação de ligante (DxSDE); a necessidade de Ca++ para a ligação de ligante; ligação de RAP e apoE; repetições do domínio de homologia do precursor de EGF 25 (YWTD); uma única região que transpõe a membrana; sinais de internalização no domínio citoplasmático (FDNPXY); e endocitose mediada por receptor de vários ligantes. Alguns membros da família, incluindo LRPl, LRP5, LRP6, apoER2 e VLDLR, participam em vias de transdução de sinal.

3 0 RAP d3 é dobrada como um hairpin helicoidal antiparalelo. A primeira hélice, aproximadamente D237-V277,

^ está conectada por uma volta composta pelos resíduos G278- G28 0, a uma segunda hélice, resíduos E281-R317. As duas hélices são próximas, em uma configuração "perna direita 5 (hélice 2) cruzada sobre a perna esquerda (hélice 1)". CR3 da LDLR entra em contato com RAP d3 primariamente em K270, enquanto CR4 forma contatos com RAP d3 primariamente em K2 5 6. K2 5 6 e K27 0 são, ambas, a mesma face da hélice 2. RAP R282 e R285 estão dirigidas na bolsa de quelação de cálcio 10 carregada negativamente de CR3, enquanto RAP K253 tem um papel similar na ligação de CR4. 0 par de CR de LDLR só se associa aos resíduos entre aproximadamente H24 9-T3 03 do hairpin helicoidal antiparalelo de RAP d3. Fora dessa região há uma extensão do terminal N da hélice 1 e uma 15 extensão do terminal C da hélice 2. Essas porções das hélices 1 e 2 presumivelmente ajudam a estabilizar o feixe helicoidal. Além disso, a hélice 1 é precedida por uma volta, S232-T236, uma hélice curta e uma seqüência adicional que compreende os resíduos entre R206-Q231.

Foi sugerido que a hélice curta e as seqüências

adicionais também são importantes para a estabilidade da dobragem de RAP d3.

i. Peptídeos da RAP seletivos para LRPl

A RAP nativa se liga fortemente ao LRPl, que é 25 altamente expresso em hepatócitos. Um aspecto da invenção contempla a conjugação de fármacos quimioterápicos ou outros agentes para o tratamento de distúrbios hepáticos aos peptídeos cíclicos da RAP para liberar compostos terapêuticos ao fígado para o tratamento de doenças 30 hepáticas. A administração de um conjugado de RAP para tratar doenças hepáticas solucionaria vários problemas ^associados ao tratamento de doenças hepáticas como, por exemplo, a depuração do agente pelo fígado, na medida em que a maioria desses fármacos seria liberada diretamente 5 aos hepatócitos quase imediatamente após a injeção. Adicionalmente, como o conjugado de RAP seria submetido à endocitose por meio de LRPl, os mecanismos de resistência farmacológica na membrana plasmática (MDR, P-glicoproteína) seriam evitados.

ii. Peptídeos da RAP seletivos para LRP2

Foi demonstrado que LRP2 é expressa no endotélio capilar cerebral e medeia o transporte de apoJ para o parênquima do cérebro (Lundgren, e cols., (1997) J. Histochem. Cytochem. 45, 383-392; Zlokovic, e cols., (1996)

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 4.229-4.234; Shayo, e cols., (1997) Life Sei. 60, PL115-118). Espera-se que os peptídeos cíclicos da RAP da invenção e conjugados destes que se ligam seletivamente ao LRP 2 com maior afinidade do que outros LDLRs tenham distribuição aumentada no cérebro. Por

2 0 exemplo, foi demonstrado que GDNF promove a sobrevida e o

crescimento de neurônios estriatonigrais em indivíduos com doença de Parkinson (Lin, e cols., (1993) Science 260, 1.130-1.132). No entanto, GDNF não penetra no cérebro a partir da vasculatura. Seria de se esperar que fusões de

peptídeos da RAP seletivos para LRP2 ao GDNF aumentassem a distribuição de GDNF para o cérebro.

iii. Peptídeos de RAP seletivos para VLDLR Similarmente, verificou-se que VLDLR é expressa no endotélio capilar cerebral e medeia o transporte de

3 0 lipoproteína lipase através do endotélio da aorta (Wyne, e cols., (1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16, 407- .415; Obunike, e cols., (2001) J. Biol. Chem. 276, 8.934- 8.941) . Espera-se que os peptídeos cíclicos da RAP da invenção e conjugados destes que se ligam seletivamente à VLDLR tenham uma distribuição aumentada para o cérebro. VLDLR também foi implicada na formação de células espumosas por mediação da captação de ácidos graxos livres em excesso (FFA) em macrófagos vasculares (Hiltunen, e cols., (1998) Circulation 97, 1.079-1.086; Qu, e cols., (2004) J. Huazhong. Univ. Sei. Technolog. Med. Sei. 24, 1-4, 8). Espera-se que os peptídeos cíclicos da RAP e conjugados destes que se ligam seletivamente à VLDLR bloqueiem a associação de partículas de lipoproteína com macrófagos e inibam a formação de célula espumosa. Espera-se também que esses peptídeos cíclicos da RAP e conjugados destes limitem a transferência de FFA da lipoproteína circulante em adipócitos, tornando mais lenta a progressão em direção à obesidade em indivíduos suscetíveis (Goudriaan, e cols. , (2001) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21, 1.488-1.493; Goudriaan, e cols. (2004) J. Lipid Res. 45, 1.475-1.481; Tacken, e cols., (2001) Curr. Opin. Lipidol. 12, 275-279; Yagyu, e cols., (2002) J. Biol. Chem. 277, 10.037-10.043). Seria esperado que o nível elevado de expressão de VLDLR na superfície luminal do endotélio muscular, juntamente com o nível baixo de expressão de VLDLR no fígado, conduzissem a distribuição de peptídeos cíclicos da RAP e conjugados destes ao tecido muscular após administração intravenosa. Agentes com efeitos terapêuticos sobre o tecido muscular poderiam ser anexados aos peptídeos cíclicos da RAP

3 0 seletivos para VLDLR para aumentar a distribuição desses agentes ao músculo.

iv. Proteínas que contêm CR associadas a tumores ou metástase

A superexpressão de pelo menos três proteínas que

5 contêm CR, LRP5, LRP6 e ST14 (TADG-15) , foi associada independentemente à tumorigenicidade ou carcinogênese aumentada (Li, e cols., (2004) Oncogene 23, 9.129-9.135,Hoang7 e cols., (2004) Int. J. Cancer 109, 106-111; Tanimoto, e cols., (2005) Br. J. Cancer 92, 278-283,10 Santin, e cols., (2004) Int. J. Cancer 112, 14-25; Santin, e cols., (2003) Cancer 98, 1898-1904; Tanimoto, e cols., (2001) Tumour Biol. 22, 104-114). Espera-se que os peptídeos cíclicos da RAP da invenção ou conjugados destes que se ligam seletivamente a essas proteínas forneçam um 15 meio para diminuir seus efeitos tumorigênicos. Os peptídeos cíclicos da RAP podem interferir com as funções da proteína que contém CR diretamente. Alternativamente, o peptídeo cíclico da RAP pode ser conjugado a um agente terapêutico para o câncer para liberar de forma dirigida aos tecidos

2 0 que superexpressam a proteína que contém CR. Por exemplo, a

matriptase (MT-SP1, ST14, TADG-15) está superexpressa em diversos tumores epiteliais (carcinomas) [25-33) .

Após a transativação facilitada por inibidor do ativador de hepatócito-1 (HAI-I), a matriptase promove o 25 crescimento tumoral e metástases por degradação de componentes da matriz extracelular diretamente ou por ativação de outras proteases como, por exemplo, ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), resultando em eventos de degradação da matriz {26, 34, 35). O domínio de

3 0 protease adjacente ao arranjo de CR no ectodomínio de matriptase (ST14) foi implicado na invasividade e , tumorigenicidade aumentadas de células que superexpressam matriptase (ST14). A matriptase está ancorada nas membranas laterais ou basolaterais de células epiteliais por meio de B um domínio transmembrana do terminal N do tipo II (Pfistermueller, e cols. (1996) FEBS Lett. 396, 14-20). A seqüência inserida na membrana é seguida por um domínio SEA extracelular, dois domínios CUB, quatro domínios de CR e um domínio de tripsina no terminal C da proteína. A mutagênese das seqüências de CR dentro da matriptase resulta em uma incapacidade da protease mutante resultante em se tornar ativada (Qiu, e cols. (2003) Neuroscience 122, 291-303). Similarmente, um anticorpo que se liga ao terceiro domínio de CR de matriptase bloqueia a ativação da enzima (Basu, e cols. (2001) Immunity 14, 303-13) . Espera-se que um peptídeo cíclico da RAP com afinidade por um dos dois pares de CR dentro de matriptase que incluam o terceiro domínio de CR interfira com a ativação proteolítica, de uma forma similar ã inibição observada pelo anticorpo para essa região. Espera-se que um peptídeo da RAP desse tipo diminua os efeitos metastáticos e tumorigênicos da superexpressão de matriptase em tecidos afetados. Espera-se também que um conjugado que compreende um peptídeo cíclico da RAP seletivo para matriptase e um inibidor de protease bloqueie especificamente os efeitos de matriptase relacionados à sua atividade proteolítica.

Peptídeos cíclicos da RAP seletivos para LRP6 poderiam ser projetados para infra-regular LRP6 em células tumorais, ou por indução de endocitose de LRP6 ou por interferência

3 0 com eventos de transdução de sinal Wnt mediados por LRP6. Similarmente, peptídeos cíclicos da RAP seletivos para LRP6 conjugados a agentes terapêuticos (por exemplo, fármacos quimioterápicos para o câncer) ou agentes diagnósticos podem ser usados para direcionar a liberação aos tecidos 5 que superexpressam LRP6.

v. Peptídeos da RAP seletivos para LRP5 e doenças ósseas

Foi demonstrado que a sinalização Wnt aumentada por meio de LRP5 aumenta a diferenciação de osteoblastos, inibe 10 atividade de osteoclastos e aumenta a deposição óssea (Westendorf, e cols., (2004) Gene 341, 19-39; Zhang, e cols., (2004) Mol. Cell. Biol. 24, 4.677-4.684) . Esse mecanismo de sinalização foi validado com camundongos knockout para APC (polipose adenomatosa dos cólons) 15 específica para osteoblasto e com mutantes de LRP5 que são insensíveis à DKK (Dickkopf)-1 e à inibição mediada por esclerostina (Zhang, e cols., (2004) Mol. Cell. Biol. 24, 4.677-4.684; Holmen, e cols., (2005) J. Biol. Chem.). Espera-se que os peptídeos cíclicos da RAP específicos para 20 LRP5 que interferem com ligação ao inibidor, ou que aumentam a sinalização Wnt por outros meios (por exemplo, a estabilização de LRP5, sem bloqueio da ligação de Wnt) tenham efeitos similares. Por exemplo, espera-se que as fusões entre peptídeos cíclicos da RAP específicos para um

2 5 dos dois pares de CR de LRP5 e para a proteína acompanhante

do tipo beta-propeller Mesd interfiram com o antagonismo mediado por DKK-I da sinalização Wnt por meio de LRP 5 (Hsieh, e cols., (2003) Cell 112, 355-367; Herz, e cols., (2003) Cell 112, 289-292). Espera-se que esses peptídeos

3 0 cíclicos da RAP que interferem com a inibição de LRP5 (por exemplo, reduzem a ligação de DKK-I à ou a inibição de LRP5) e conjugados destes possuam efeitos terapêuticos no tratamento de osteoporose ou de outras doenças associadas ã atividade reduzida de osteoblastos e/ou à atividade 5 aumentada de osteoclastos. Similarmente, espera-se que os peptídeos cíclicos da RAP que inibem a sinalização Wnt por meio de LRP5 tenham efeitos terapêuticos no tratamento de doenças associadas ã atividade aumentada de osteoblastos, por exemplo, osteopetrose.

vi. Peptídeos de RAP seletivos para FDC-8D6

O antígeno FDC-8D6 (CD320) possui um par desses domínios, e tem um papel importante na diferenciação de células B em folículos linfáticos (36, 37) . 0 Iinfoma não Hodgkin (NHL) envolve a proliferação e migração extranodal 15 de uma classe de células imunológicas denominadas células B. 0 NHL é a principal causa de morte por câncer em homens entre 20 e 39 de idade. Estudos demonstraram que a proteína do antígeno FDC-8D6 (CD320) facilita o crescimento de células B neoplásicas {36, 37) . 0 antígeno 8D6 contém um 20 único par de domínios de CR. Espera-se que agentes como, por exemplo, os peptídeos cíclicos da RAP que se ligam e bloqueiam a função de 8D6, tornem mais lenta a progressão do linfoma não Hodgkin em seres humanos.

B. Tratamento

2 5 As condições de doença específicas tratáveis por

administração dos peptídeos cíclicos da RAP ou conjugados da invenção são tão variadas quanto os tipos de proteínas que contêm CR visadas e as porções de fármaco que podem estar presentes no conjugado. Dessa forma, condições de doença incluem doenças proliferativas celulares, tais como doenças neoplásicas, doenças autoimunes, doenças . cardiovasculares, doenças com anormalidades hormonais, doenças degenerativas, doenças do envelhecimento, doenças do sistema nervoso central (por exemplo, doença de Alzheimer, epilepsia, hiperlipidemias), doenças e condições psiquiátricas (por exemplo, esquizofrenia, distúrbios do humor, tais como depressão e ansiedade), doenças infecciosas, doenças por deficiência de enzimas, doenças de armazenamento lisossômico, tais como aquelas descritas acima, e semelhantes.

O tratamento visa englobar qualquer resultado final benéfico a um indivíduo associado à administração de um conjugado, incluindo uma probabilidade reduzida de adquirir uma doença, prevenção de uma doença, redução de velocidade, 15 interrupção ou reversão da progressão de uma doença ou uma melhora dos sintomas associados à condição de doença que aflige o hospedeiro, em que a melhora ou o benefício é usado em um sentido amplo para se referir a pelo menos uma redução na magnitude de um parâmetro, por exemplo, sintoma, 20 associado à condição patológica tratada, por exemplo, inflamação e dor a ela associada. Dessa forma, o tratamento também inclui situações nas quais a condição patológica, ou pelo menos os sintomas associados a ela, são inibidos completamente, por exemplo, têm sua ocorrência evitada, ou 25 interrompidos, por exemplo, terminados, de tal modo que o hospedeiro não sofra mais da condição patológica, ou pelo menos dos sintomas que caracterizam a condição patológica,

i. Doenças de armazenamento lisossômico Em algumas modalidades, o distúrbio tratado é uma doença de armazenamento lisossômico e o conjugado é administrado como uma composição farmacêutica em uma quantidade eficaz para diminuir a quantidade de grânulos de armazenamento presentes no tecido cerebral do referido mamífero. Tipicamente, os sintomas de um distúrbio desse 5 tipo são monitorados por meio de avaliação de rotina de história, exame físico, ecocardiografia,

eletrocardiografia, imagens de ressonância magnética, polissonografia, pesquisa do esqueleto, medidas da amplitude de movimento, fotografias corneanas e biópsia da

pele. A administração de um peptídeo cíclico da RAP ou de um conjugado deste em um distúrbio desse tipo resulta na normalização do retardo e regressão do desenvolvimento no referido indivíduo, redução do hidrocéfalo de alta pressão, redução da compressão da medula vertebral no referido

indivíduo e redução no número e/ou tamanho de cistos perivasculares em torno dos vasos cerebrais do referido indivíduo. Métodos de monitoramento e avaliação dessas seqüelas são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Aqueles habilitados na técnica são referidos à Patente U.S.

N0 6.585.971, à Patente U.S. N0 6.569.661 e à Patente U.S. N0 6.426.208 e à Publicação de Patente U.S. N0 20040009906 para descrições adicionais dessas seqüelas.

Em modalidades preferidas, o animal sofre de mucopolissacaridose I e possui cerca de 50% ou menos de uma

2 5 atividade normal de α-L-iduronidase. Nessas modalidades,

seria desejável administrar uma dose eficaz entre cerca de

0,0 01 mg/kg de peso corporal e 0,5 mg/kg de peso corporal de α-L-iduronidase humana como parte do conjugado, por exemplo, semanalmente a um indivíduo que sofre de uma

3 0 deficiência desta. Em outras modalidades, o indivíduo recebe uma dose entre cerca de 0,01 mg/15 cc de liquido cefalorraquidiano (LCR) e cerca de 5,0 mg/15 cc de LCR no mamifero da referida α-L-iduronidase humana semanalmente. As terapias aqui contempladas promovem a degradação de 5 glicosaminoglicano (GAG) em uma célula cerebral de um indivíduo que possui doença de armazenamento lisossômico. A célula cerebral pode ser um neurônio, uma célula neuroglial, uma célula ependimal. Tipicamente, as células cerebrais nas quais ocorre o acúmulo de grânulos e que 10 devem ser melhoradas por administração de um conjugado da invenção incluem neurônios, células gliais, células microgliais, astrócitos, células oligodendrogliais, células perivasculares, células periteliais, células meníngeas, células ependimais, células aracnóides de granulação, 15 células de membranas aracnóides, da dura-máter, da piamãter e do plexo corõide. A terapia em modalidades preferidas reduz os grânulos de armazenamento em células meníngeas, quando comparada com o número de grânulos lisossômicos de armazenamento presentes em uma célula 20 similar na ausência da administração do referido conjugado. Isso produz os efeitos terapêuticos de alívio dos sintomas de hidrocéfalo de alta pressão em alguns indivíduos, e a referida administração reduz a quantidade de LCR no tecido meníngeo do referido indivíduo.

Exemplos não limitantes de doenças de armazenamento

lisossômico tratáveis com os conjugados da invenção incluem Mucopolissacaridose tipo I, mucopolissacaridose tipo II/síndrome de Hunter, mucopolissacaridose tipo 11IA/s índrome de Sanfilippo, mucopolissacaridose tipo 11IB/s índrome de Sanfilippo, mucopolissacaridose tipo IIIC/síndrome de Sanfilippo, mucopolissacaridose tipo IIID/síndrome de Sanfilippo, mucopolissacaridose tipo IVA/síndrome de Morquio, mucopolissacaridose tipo IVB/síndrome de Morquio, mucopolissacaridose tipo VI, 5 mucopolissacaridose tipo Vll/síndrome de Sly, mucopolissacaridose tipo IX, aspartilglicosaminúria, doença de armazenamento de éster de colesterol/doença de Wolman, cistinose, doença de Danon, doença de Fabry, lipogranulomatose de Farber/doença de Farber, fucosidose, 10 galactosialidose tipos I/II, doença de Gaucher tipo Ι/doença de Gaucher tipo IIIII, leucodistrofia de célula globóide/doença de Krabbe, doença de armazenamento de glicogênio II/doença de Pompe, GMl-gangliosidose tipos I/II/III, GM2-gangliosidose tipo Ι/doença de Tay-Sachs, 15 GM2-gangliosidose tipo II/doença de Sandhoff, GM2- gangliosidose, α-manosidose tipos I/II, β-manosidose, leucodistrofia metacromática, leucodistrofia metacromática, mucolipidose tipo I/Sialidose tipos I/II, mucolipidose tipos II /III/doença da célula I, mucolipidose tipo 20 IlIC/polidistrofia pseudo-Hurler, deficiência múltipla de sulfatase, lipofuscinose ceróide neuronal, doença de Batten CLNl, lipofuscinose ceróide neuronal, doença de Batten CLN2, doença de Niemann-Pick tipos A/B - doença de NiemannPick, doença de Niemann-Pick tipo Cl - doença de Niemann

2 5 Pick, doença de Niemann-Pick tipo C2 - doença de Niemann

Pick, picnodisostose, doença Schindler tipos I/II - doença Schindler ou doença de armazenamento de ácido siálico.

ii. Distúrbios neurológicos

Em outras modalidades, o distúrbio tratado é uma

3 0 doença neurológica e o conjugado é administrado como uma composição farmacêutica em uma quantidade eficaz para evitar, acompanhar ou tratar esse distúrbio neurológico. Um distúrbio neurológico inclui, sem limitação, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla, 5 esclerose lateral amiotrófica, outros distúrbios de desmielinização relacionados, um câncer do sistema nervoso central, lesão cerebral traumática, lesão da medula cerebral, acidente vascular cerebral ou isquemia cerebral, esclerose em placa, vasculite cerebral, epilepsia, doença 10 de Huntington, síndrome de Tourette, síndrome de GuillainBarré, doença de Wilson, doença de Pick, distúrbios neuroinflamatórios, encefalite, encefalomielite ou meningite de origem viral, fúngica ou bacteriana, ou outras infecções do sistema nervoso central, doenças de príon, 15 ataxias cerebelares, degeneração cerebelar, síndromes de degeneração espinocerebelar, ataxia de Friedreich, ataxia telangiectasia, amiotrofia espinhal, paralisia supranuclear progressiva, distonia, espasticidade muscular, tremor, retinite pigmentosa, demência senil, demência subcortical, 20 demência aterosclerótica, demência associada à AIDS, ou outras demências, degeneração estriatonigral,

encefalomiopatias mitocondriais, lipofuscinose neuronal ceróide, distúrbios de armazenamento lisossômico com envolvimento do sistema nervoso central, leucodistrofias, distúrbios de defeitos do ciclo da uréia, encefalopatias hepáticas, encefalopatias renais, encefalopatias

metabólicas, porfiria, envenenamentos com compostos neurotóxicos, dano cerebral induzido por radiação, ou distúrbios psiquiátricos como, por exemplo, psicose, ansiedade, depressão, déficits de atenção, distúrbios da memória, distúrbios cognitivos, distúrbios do apetite, obesidade, dependência, desejo, ou dependência farmacológica.

Doença, de Alzheimer Em uma modalidade preferida, o distúrbio tratado é

doença de Alzheimer, que está ligada aos níveis elevados de um peptídeo de 40-42 aminoácidos, amilóide beta (Αβ) , dentro dos cérebros de pacientes afetados (Selkoe, e cols. (1996) J. Biol. Chem. 271, 18.295-18.298). Após sua

geração por uma série de eventos proteolíticos seqüenciais, Αβ se oligomeriza e, por fim, se acumula em placas insolúveis dentro do interstício neuronal. Foi demonstrado que tanto as formas solúveis quanto as insolúveis de Αβ são neurotóxicas in vitro e in vivo (Zerbinatti, e cols.,

(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 1.075-1.080; Tsai, e cols., (2004) Nat. Neurosci.; Schmitz, e cols. (2004) Am. J. Pathol. 164, 1.495-1.502; Gong, e cols. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 10.417-10.422; Bard, e cols. (2000) Nat. Med. 6, 916-919; Schenk, e cols. (1999)

2 0 Nature 400, 173-177; Hsia, e cols. (1999) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 96, 3.228-3.233). Também foi demonstrado que monômeros e oligômeros solúveis de Αβ induzem de forma reversível déficits de memória por inibição da potenciação de longo prazo (Gong, e cols. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci.

DrSAlOO, 10.417-10.422).

Αβ é um fragmento proteolítico da proteína precursora de amilóide ou APP, uma proteína da membrana da superfície celular de função indeterminada. A formação de Αβ é iniciada dentro da via secretora neuronal ou por meio de

3 0 endocitose de APP por LRPl, um membro da família do LDLR de receptores (Cam, e cols.. (2004) J. Biol. Chem. 279, 29.639-29.646). Ao alcançar o sistema endossômico, a APP é clivada pela enzima de clivagem de APP beta-site, ou BACE, uma protease da membrana. BACE corta APP na posição 671, 5 exatamente no terminal N em relação ao domínio transmembrana. A porção de APP restante é então cortada uma segunda vez por um complexo de três proteínas, presenilina1, presenilina-2 e nicastrina, que constituem o complexo de gama-secretase (Xia, e cols. (2003) J. Cell. Sci. 116, 10 2.839-2.844). As presenilinas clivam seus substratos dentro do folheto interno da bicamada lipídica. A etapa de clivagem por gama-secretase ocorre entre as posições 711 e 713, dentro do domínio transmembrana de APP. A clivagem por gama-secretase libera Αβ, que ou é retido dentro do 15 neurônio ou secretado no espaço extracelular. Em qualquer das localizações, ο Αβ é tóxico para os neurônios (Casas, e cols. (2004) Am. J. Pathol. 165, 1.289-1.300).

A clivagem seqüencial de APP por beta e gamasecretases é denominada a via amiloidogênica. Uma via alternativa predomina no cérebro normal: todo o ectodomínio de APP é liberado através de descarga do receptor, um processo proteolítico catalisado por alfa-secretase. 0 ectodomínio liberado é denominado sAPPa e ficou demonstrado que possui efeitos neuroprotetores e de melhora da memória (Furukawa, e cols. (1996) J. Neurochem. 67, 1.882-1.896; Meziane, e cols. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12.683-12.688). A liberação do ectodomínio de APP é o evento crucial na via não amiloidogênica. A proteólise nesse caso ocorre na posição 68 8, dentro da região de APP 3 0 que se torna Αβ durante a amiloidogênese (Allinson, e cols. (2003) J. Neurosci. Res. 74, 342-352). Portanto, as vias amiloidogênica e não amiloidogênica são mutuamente exclusivas. A liberação de sAPPa é catalisada por uma alfa-secretase, ADAMlO, também uma protease ligada à 5 membrana (Fahrenholz, e cols. (2 000) Ann. N.Y. Acad. Sci. 920, 215-222). ADAM10 é uma desintegrina e metaloproteinase (a disintegrin and metalloproteinase) , parte de uma família de enzimas "sheddases" que incluem a enzima de clivagem Notch (Kuzbanian) e a enzima de clivagem do precursor de 10 TNF-alfa (TACE, ADAMl7). Verificou-se que ADAM10 é responsável pela descarga do ectodomínio de BACE (Hussain, e cols. (2003) J. Biol. Chem. 278, 36.264-36.268).

Como os outros membros da família ADAM, ADAM10 possui um pró-domínio do terminal N, um domínio catalítico de 15 protease, um domínio de desintegrina, um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática. O pró-domínio se associa firmemente ao domínio catalítico, uma exigência para a dobragem adequada da enzima. Essa associação também permite que uma cisteína no pró-domínio se ligue de forma 20 reversível a um átomo de zinco no sítio ativo, mascarando a atividade proteolítica da enzima enquanto ela transita pela via secretora. Ao alcançar o trans-Golgi, a pró-proteína convertase furina na via secretora constitutiva reconhece os resíduos 211-214 (RKKR) de ADAM10, removendo por

2 5 clivagem o pró-domínio e tornando a enzima

proteoliticamente ativa.

Acredita-se que um aumento da liberação de Αβ por beta e gama-secretases, à custa da liberação de sAPPa por ADAM10, seja a base da doença de Alzheimer. Vários

3 0 programas estão em andamento para desenvolver inibidores farmacológicos de BACE ou do complexo gama-secretase a fim de afastar o processamento de APP da via amiloidogênica. Uma abordagem complementar é o aumento da produção de sAPPa à custa de Αβ por aumento dos níveis de alfa5 secretase no interstício cerebral. 0 desequilíbrio no processamento proteolítico de APP foi corrigido em modelos animais suplementando-se modestamente os níveis endógenos de uma protease neuronal em particular, ADAMlO. Os benefícios dos níveis aumentados de ADAMlO no cérebro foram 10 validados em modelos em camundongo de doença de Alzheimer (Postina, e cols. (2004) J. Clin. Invest. 113, 1.456-1.464; Lichtenthaler, e cols. (2004) J. Clin. Invest. 113, 1384- 1387). Verificou-se que ligeiros aumentos nos níveis cerebrais de ADAMlO evitam o fenótipo de doença.

A invenção contempla o tratamento da doença de

Alzheimer com base na administração intravenosa de uma fusão entre peptídeo cíclico da RAP e ADAM10. Uma modalidade preferida é um método de tratamento de Doença de Alzheimer que compreende a administração de um conjugado de ADAMlO-peptídeo cíclico da RAP e aumento da atividade cerebral de alfa-secretase, em que a referida administração é por meio de administração intravenosa, intracarotídea ou intratecal. Espera-se que os aumentos nos níveis de alfasecretase, por sua vez, desviem o processamento de APP afastando-o da via amiloidogênica. Prevê-se que a produção aumentada de sAPPa e seu corolário, a produção diminuída de Αβ, tenham um efeito terapêutico sobre pacientes que sofrem de doença de Alzheimer. Alternativamente, a invenção contempla tratamentos para a doença de Alzheimer que 3 0 compreendem a administração de fusões entre um peptídeo cíclico da RAP e outras proteases que atuam sobre APP ou Αβ, ou com inibidores de beta-secretase ou com inibidores de gama-secretase.

Em um aspecto relacionado, a invenção contempla a minimização dos efeitos periféricos de uma enzima sheddase ativa injetada por via intravenosa pela utilização de fusões de ADAMlO-RAP com o pró-domínio anexado. 0 próTUDAMl 0 - RAP pode ser isolado de linhas de produção padronizadas por co-expressão com o inibidor de furina, αΐ-antitripsina Portland (Srour, e cols. (2003) FEBS Lett. 554, 275-283; Benjannet, e cols. (1997) J. Biol. Chem. 272, 26.210-26.218). A ativação da fusão então ocorrerá por remoção do pró-domínio após depuração no tecido, seja durante a transcitose ou após alcançar o interstício cerebral. Durante a transcitose, a fusão se torna associada à membrana em função da associação ao LRP. 0 complexo fusão-receptor então transita na célula dentro de um endossomo. Estudos prévios in vivo e in vitro demonstraram a proteólise parcial de algumas proteínas em trânsito durante a transcitose (Lisi, e cols. (2003) J. Endocrinol. Invest. 26, 1.105-1.110). A endocitose de conjugado de ADAMl0 -RAP, seja mediante endocitose inicial em células endoteliais ou em endocitose final em neurônios, irá expor a fusão à furina no endossomo precoce (Mayer, e cols. (2004) J. Histochem. Cytochem. 52, 567-579; Bosshart, e cols. (1994) J. Cell. Biol. 126, 1.157-1.172; Rohn, e cols. (2000) J. Cell. Sci. 113 (Pt 12), 2.093-2.101). Uma abordagem alternativa â ativação retardada de ADAM10 é uma substituição do vinculador peptídico sensível à furina que 3 0 conecta o pró-domínio e o domínio catalítico com um vinculador peptídico sensível à ADAM. Na medida em que o pró-domínio modificado é clivado em linhas de produção, essa reação pode ser inibida por cultura na presença de inibidores de hidroxamato ou por co-expressão com TIMPl ou 5 TIMP3 (Amour, e cols. (2000) FEBS Lett. 473, 275-279) . Embora a meia-vida de fusões de RAP na periferia seja curta, o acúmulo de uma fusão de pró-ADAM10-RAP sensível à ADAM resultará na exposição da fusão à ADAM10 endógena ativa, na superfície do neurônio dentro do espaço

intersticial. Uma reação proteolítica em cadeia pode então ser prevista, com cada fusão de ADAM10-RAP ativada ativando subseqüentemente mais ADAM10-RAP. A co-administração intracarotídea com manitol, bem como a administração intratecal, pode não necessitar de ADAM10 inativa.

Distúrbios neurológicos adicionais contemplados pela

invenção serão descritos abaixo. Por exemplo, a doença de Parkinson (PD) é caracterizada por tremores e função reduzida de neurônios motores, rigidez e acinesia. Esses sinais neurológicos são conseqüência do mau funcionamento

2 0 da projeção aferente principal da substância negra, ou

seja, o trato estriatonigral. Os corpos celulares dos neurônios no sistema dopaminérgico são as células primárias envolvidas na progressão da PD. Exemplos de síndromes parkinsonianas primárias incluem a doença de Parkinson

(PD), paralisia supranuclear progressiva (PSP) e degeneração estriatonigral (SND), que é incluída com degeneração olivopontocerebelar (OPCD) e síndrome de Shy Drager (SDS) em uma síndrome conhecida como atrofia de múltiplos sistemas (MSA).

3 0 A esclerose lateral amiotrófica (ALS), freqüentemente chamada "doença de Lou Gehrig", é uma doença neurodegenerativa progressiva que ataca os neurônios motores no cérebro e na medula vertebral. A degeneração progressiva dos neurônios motores na ALS eventualmente leva 5 à sua morte, reduzindo a habilidade do cérebro para iniciar e controlar o movimento muscular.

A doença de Huntington (HD) , embora uma doença herdada geneticamente, resulta na degeneração de neurônios nos neurônios GABAérgicos espinhosos do meio estriatal (Hickey 10 e cols., Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 27: 255-65, 2003). Essa degeneração causa movimentos descontrolados, perda de faculdades intelectuais e distúrbios emocionais.

A esclerose múltipla (MS) é uma doença freqüente e 15 incapacitante do adulto jovem. Essa doença é caracterizada por uma reação inflamatória, provavelmente do tipo autoimune, e uma desmielinização freqüentemente associada à perda de oligodendrócitos, as células formadoras de mielina no sistema nervoso central. Os tratamentos disponíveis 20 atualmente abordam o fator inflamatório da MS, mas possuem pouca ou nenhuma eficácia na remielinização.

As composições da invenção são úteis para tratar cânceres do cérebro. Os tumores cerebrais mais comuns são gliomas, que começam no tecido glial. Astrocitomas, que 25 surgem de pequenas células em forma de estrela denominadas astrócitos, surgem mais freqüentemente no telencéfalo do adulto. Um astrocitoma de grau III é algumas vezes denominado astrocitoma anaplásico. Um astrocitoma de grau IV é normalmente denominado glioblastoma multiforme.

3 0 Gliomas do tronco cerebral ocorrem na parte mais baixa, semelhante a um tronco, do cérebro, o tronco cerebral controla muitas funções vitais. A maioria dos gliomas do tronco cerebral é composta por astrocitomas de grau elevado. Ependimomas normalmente se desenvolvem no 5 revestimento dos ventrículos. Eles também podem ocorrer na medula vertebral. Oligodendrogliomas surgem nas células que produzem mielina, a cobertura gordurosa que protege os nervos. Esses tumores normalmente surgem no telencéfalo. Eles crescem lentamente e normalmente não se disseminam no 10 tecido cerebral circundante. Os meduloblastomas se desenvolvem a partir de células nervosas primitivas que normalmente não permanecem no corpo após o nascimento. Por essa razão, os meduloblastomas são algumas vezes denominados tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET). A 15 maioria dos meduloblastomas surge no cerebelo; no entanto, eles também podem ocorrer em outras áreas. Os meningiomas crescem a partir das meninges. Eles são normalmente benignos. Como esses tumores crescem muito lentamente, o cérebro pode ser capaz de se ajustar à sua presença; os 20 meningiomas freqüentemente crescem muito antes que causem sintomas. Os schwanomas são tumores benignos que começam nas células de Schwann, que produzem a mielina que protege o nervo acústico. Os neuromas do acústico são um tipo de schwanoma. Craniofaringiomas se desenvolvem na região da 25 glândula hipófise perto do hipotálamo. Eles são normalmente benignos; no entanto, algumas vezes são considerados malignos, pois podem pressionar ou danificar o hipotálamo e afetar funções vitais. Tumores da célula germinativa surgem de células sexuais primitivas (em desenvolvimento), ou

3 0 células germinativas. 0 tipo mais freqüente de tumor de 'célula germinativa no cérebro é o germinoma. Os tumores da região pineal ocorrem na glândula pineal ou em torno dela. O tumor pode ser um pineocitoma de crescimento lento ou de crescimento rápido (pineoblastoma). A região pineal é de 5 acesso muito difícil, e esses tumores freqüentemente não podem ser removidos.

0 tratamento para um tumor cerebral depende de diversos fatores. Entre esses estão o tipo, a localização e o tamanho do tumor, bem como a idade e a saúde geral do 10 paciente. Normalmente, os tumores cerebrais são tratados com cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibição do crescimento e progressão de neuroblastoma e tumores neurais, que compreende a administração a um indivíduo que possui um 15 neuroblastoma ou um tumor neuronal de uma composição que compreende um peptídeo cíclico da RAP. Em um aspecto adicional o peptídeo cíclico da RAP pode ser conjugado a um agente útil para tratar tumores neurais.

GDNF

Em outra modalidade preferida, a invenção contempla um

método de tratamento de doença neurodegenerativa por administração do peptídeo cíclico da RAP conjugado a um fator de crescimento neuronal como, por exemplo, fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF). 25 Essas doenças neurodegenerativas incluem, sem limitação, doença de Parkinson. GDNF foi purificado originalmente de um sobrenadante da linhagem de células de glioma de rato como um fator trófico para neurônios de dopamina do mesencéfalo embrionário. In vivo, o homodímero de GDNF se

3 0 liga ao seu receptor GFRa-I (provavelmente também um 'dimero), e depois ο complexo de GDNF-GFRa-I se liga à proteína Ret, que se dimeriza. A dimerização de Ret causa a auto-fosforilação da tirosina 1062. Estudos mostraram que GDNF possui efeitos pronunciados sobre outras subpopulações 5 neuronais. Como GDNF protege os neurônios de dopamina em modelos animais de doença de Parkinson, e resgata neurônios motores in vivo, surgiram esperanças de que GDNF poderia ser usado como um agente terapêutico para tratar várias doenças neurodegenerativas. No entanto, GDNF não cruza a 10 barreira hematencefálica. A presente invenção fornece um método de transporte de GDNF através da barreira hematencefálica, que compreende a administração do peptídeo cíclico da RAP conjugado a GDNF.

iii. Distúrbios hepáticos Doenças hepáticas contempladas para tratamento com o

uso do peptídeo cíclico da RAP ou conjugados da invenção incluem, sem limitação, aqueles distúrbios discutidos abaixo. O carcinoma hepatocelular, ou hepatoma, é o quinto câncer mais comum no mundo e as taxas de incidência vêm 20 crescendo firmemente. 0 carcinoma hepatocelular é uma doença de hepatócitos. Os hepatócitos tumorigênicos retêm níveis elevados de expressão de LRPl. 0 carcinoma hepatocelular não responde bem à quimioterapia, pois as células tumorais mostram taxas elevadas de resistência 25 farmacológica e porque as quimioterapias usadas possuem toxicidades sérias, especialmente no coração e nos rins, em função da administração sistêmica (intravenosa).

A hepatite é um termo genérico para inflamação do fígado. A hepatite pode ser aguda ou crônica e inclui insuficiência hepática aguda ou crônica, por exemplo, viral '(por exemplo, vírus da hepatite A, B, C, D ou E ou não ABCDE, CMV, Epstein-Barr) , fúngica, por riquétsia ou infecções parasíticas, por álcool, toxinas químicas, fármacos (por exemplo, acetaminofeno, amiodarona, 5 isoniazida, halotano, clorpromazina, eritromicina), doença hepática metabólica (por exemplo, doença de Wilson, deficiência de alfa 1-antitripsina), câncer, doença hepática autoimune idiopática, cirrose (por exemplo, cirrose biliar primária), obstrução biliar. A infecção do 10 fígado pelo vírus da Hepatite A, B e/ou C pode levar a uma doença hepática lentamente progressiva que causa insuficiência hepática. A infecção aguda por hepatite é mais comumente causada pela hepatite A. A infecção tanto por hepatite B quanto por hepatite C pode persistir no 15 corpo e se transformar em infecções duradouras (crônicas). A Hepatite C pode causar condições críticas, incluindo cirrose e câncer.

Distúrbios ou condições hepáticas adicionais contempladas que são tratáveis com o uso das composições 20 conjugadas ao peptídeo cíclico da RAP incluem esteatite hepática (Patente U.S. 6.596.762), colestase (Patente U.S. N0 6.069.167), cirrose hepática, lesão hepática tóxica, condições pós-hepatectomia, obstrução biliar.

Fármacos candidatos para conjugação ao peptídeo 25 cíclico da RAP para o tratamento de doença hepática incluem, sem limitação: 5-fluoruracil, doxorrubicina (adriamicina), mitomicina C, cisplatina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposida, e outros agentes quimioterápicos apresentados na Tabela 1, adefovir, lamivudina, entecavir, 30 ribavirina, interferon alfa, interferon alfa-2a peguilado, interferon alfa-2b e outros antivirais, Vitamina E, ácido ursodesoxicólico, e outros agentes usados para tratar distúrbios hepáticos.

TABELA 1

Agentes alquilantes Produtos naturais Mostardas nitroqenadas Fármacos antimicóticos mecloretamina Taxanos ciclofosfamida pacIitaxei ifosfamida Alcalóides da vinca melfalan vinblastina (VLB) clorambucil vincristina Nitrosouréias vinorelbina carmustina (BCNU) Taxotere® (docetaxel) lomustina (CCNU) Estramustina semustina (metil-CCNU) fosfato de estramustina Etilenimina/Metil-melamina Epipodofilotoxinas trietilenomelamina (TEM) Etoposida trietileno tiofosforamida (tiotepa) Teniposida hexametilmelamina (HMM, Antibióticos altretamina) actinomicina D Alquil sulfonatos daunomicina busulfan (rubidomicina) Triazinas doxorrubicina dacarbazina (DTIC) (adriamicina) Antimetabólitos mitoxantroneidarrubicina bleomicina esplicamicina Análogos do ácido fólico (mitramicina) metotrexato mitomicina C Trimetrexato dactinomicina Pemetrexed (antifolato multi- afidicolina direcionado) Enzimas Análogos de pirimidina L-asparaginase -fluorurac i1 L-arginase fluordesoxiuridina gemcitabina Radiossensibilizantes citosina arabinosida (Ara C, metronidazol citarabina) misonidazol 5-azacitidina desmetilmisonidazol 2,2-difluordesoxi-citidina pimonidazol etanidazol Análogos de Purina nimorazol 6-mercaptopurina RSU 1069 6-tioguanina E09 azatioprina RB 6145 2'-desoxicoformicina (pentostatina) SR423 3 eritro-hidroxinonil-adenina (EHNA) Nicotinamida fosfato de fludarabina 5-bromodesoziuridina 2 -clorodesoxiadenosina (cladribina, 5 -iododesoxiuridina 2-CdA) bromodesoxicitidina Inibidores da topoisomerase do tipo Agentes diversos I Complexos de coordenação camptotecina de platina topotecan cisplatina irinotecan Carboplatina oxaliplatina Modificadores da resposta biológica Antracenodiona G-CSF Mi toxantrona GM-CSF Uréia substituída Agentes de diferenciação Hidroxiuréia derivados do ácido retinóico Derivados de Hormônios e antagonistas metilhidrazina Adrenocorticosteróides/antagonistas N-metilhidrazina (MIH) prednisona e equivalentes Procarbaz ina dexametasona aminoglutetimida Supressores adrenocorticais Progestinas mitotano (o,p'- DDD) caproato de hidroxiprogesterona aminoglutetimida acetato de medroxiprogesterona acetato de megestrol Citocinas interferon (α,β,γ) Estrogênios interleucina-2 Dietilestilbestrol etinil estradiol/equivalentes Fotossensibilizantes derivados de Antiestrogênio hematoporfirina tamoxifeno Photofrin® derivados de Androgênios benzoporfirina propionato de testosterona Npe 6 fluoximesterona/equivalentes estanho etioporfirina (SnET2) Antiandrogênios feoborida-a Flutamida bacterioclorofila-a análogos do hormônio de liberação naftalocianinas de gonadotropina ftalocianinas leuprolida zinco ftalocianinas Antiandrogênios não esteróides Radiação Flutamida Raios X luz ultravioleta radiação gama luz visível radiação infravermelha radiação de micro-ondas iv. Câncer

Matriptase é superexpressa em cânceres epiteliais, por exemplo, carcinomas como, por exemplo, carcinomas ovarianos, cervicais, de próstata, de mama, de pulmão, do 5 cólon ou gástricos. Outros exemplos incluem mesotelioma do pulmão, melanoma, câncer de pulmão de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular (fígado), tumor de tireóide, câncer da bexiga, glioblastoma, câncer endometrial, câncer renal, câncer pancreático ou câncer de 10 pele não melanoma. Os peptídeos cíclicos da RAP podem ser usados para inibir atividade de matriptase ou como agentes de direcionamento para liberação de agentes citotóxicos ou outros agentes terapêuticos para o câncer.

Foi determinado que LRP6 é superexpresso no câncer de cólon e de mama. Os peptídeos cíclicos da RAP podem ser usados para inibir a atividade de LRP6 ou como agentes de direcionamento para a liberação de agentes citotóxicos ou outros agentes terapêuticos para o câncer.

Outros exemplos de cânceres que podem ser tratados com o uso dos peptídeos cíclicos da RAP ou conjugados da invenção incluem Iinfoma, incluindo Iinfoma de Burkitt, Iinfoma não Hodgkin, Iinfoma de célula B, Iinfoma de célula T e leucemia.

v. Distúrbios do metabolismo ósseo

Distúrbios do metabolismo ósseo que podem ser tratados com o uso dos peptídeos cíclicos da RAP e conjugados da 10 invenção incluem distúrbios ósseos (por exemplo, anormal deposição óssea, perda óssea anormal ou enfraquecimento ósseo) associados com osteoporose, osteopetrose, inflamação óssea, artrite, artrite reumatóide, osteoartrite, hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatireoidismo 15 primário ou secundário, ou hipertireoidismo; hipercalcemia; estados de deficiência de vitamina D (por exemplo, raquitismo/osteomalácia, escorbuto, subnutrição), síndromes de mal-absorção, insuficiência renal crônica

(osteodistrofia renal), doença hepática crônica 20 (osteodistrofia hepática), envelhecimento ou imobilidade; osteoporose resultante de fármacos (glicocorticóides ou esteróides, heparina, álcool) ou doenças hereditárias (por exemplo, osteogênese imperfeita, homocisteinúria), metastático ósseo câncer, mieloma, fraturas ósseas, 25 enxertos ósseos, displasia fibrosa e/ou doença de Paget.

C. Conjugados de peptídeo cíclico da RAP e agente ativo

Um peptídeo cíclico da RAP e um agente ativo podem ser anexados através de qualquer meio conhecido na técnica. Eles podem ser ligados fisicamente, por exemplo, por ligações químicas covalentes, forças físicas como, por exemplo, interações de van der Waals ou hidrofóbicas, encapsulação, combinação, ou combinações destes. Em modalidades preferidas, o(s) agente(s) terapêutico(s) e o 5 peptídeo cíclico da RAP são ligados fisicamente por ligações químicas covalentes. Dessa forma, agentes quimioterápicos preferidos contêm um grupo funcional como, por exemplo, um grupo álcool, ácido, carbonil, tiol ou amina, para ser usado na conjugação ao peptídeo da RAP. A 10 adriamicina está na classe da amina e há também a possibilidade de ligar por meio do carbonil. 0 paclitaxel está na classe do álcool. Agentes quimioterápicos sem grupos de conjugação adequados podem ainda ser modificados para adicionar um grupo desse tipo. Todos esses compostos 15 são contemplados nesta invenção. No caso de múltiplos agentes terapêuticos, pode ser usada uma combinação de várias conjugações.

Em algumas modalidades, uma ligação química covalente que pode ser direta (sem átomos intervenientes) ou indireta 20 (por meio de um vinculador, por exemplo, uma cadeia de átomos ligados covalentemente) une o peptídeo da RAP e o agente ativo. Em algumas modalidades, o peptídeo da RAP e a porção de agente ativo do conjugado são ligados diretamente por ligações covalentes entre um átomo do peptídeo da RAP e 25 um átomo do agente ativo. Em outras modalidades, o peptídeo da RAP é conectado à porção de agente ativo por um vinculador que compreende uma ligação covalente ou um peptídeo de praticamente qualquer seqüência de aminoácidos ou qualquer molécula ou átomos capazes de conectar o

3 0 peptídeo da RAP à porção de agente ativo. Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma cadeia de átomos de 1 a cerca de 60, ou 1 a 30 átomos ou mais, 2 a 5 átomos, 2 a 10 átomos, 5 a 10 átomos, ou 10 a

2 0 átomos de comprimento. Em algumas modalidades, os átomos da cadeia são todos átomos de carbono. Em algumas modalidades, os átomos da cadeia são selecionados do grupo que consiste em C, O, N e S. Os átomos da cadeia e os vinculadores podem ser selecionados de acordo com sua solubilidade esperada (hidrofilicidade) de forma a fornecer um conjugado mais solúvel. Em algumas modalidades, o vinculador fornece um grupo funcional que é submetido ao ataque enzimático em um lisossomo. Em algumas modalidades, o vinculador fornece um grupo funcional que é submetido ao ataque por uma enzima encontrada no tecido ou órgão-alvo e o qual, mediante esse ataque ou hidrólise, serve como ligação entre o agente ativo e o peptídeo da RAP. Em algumas modalidades, o vinculador fornece um grupo funcional que é submetido à hidrólise sob as condições encontradas no local-alvo (por exemplo, pH baixo de um lisossomo) . Um vinculador pode conter um ou mais desses grupos funcionais. Em algumas modalidades, o comprimento do vinculador é suficientemente longo para reduzir o potencial para impedimento estérico (quando um agente ativo for grande) entre o sítio de ligação do peptídeo da RAP ou o sítio de ligação ativo do agente ativo, ou ambos.

Se o vinculador for uma ligação covalente ou um peptídeo e o agente ativo for um polipeptídeo, todo o conjugado poderá ser uma proteína de fusão. Os vinculadores de peptidil podem ser de qualquer comprimento. Vinculadores

3 0 exemplares têm cerca de 1 a 50 aminoácidos de comprimento, 5 a 50, 3a5, 5 a 10, 5al5oul0a30 aminoácidos de comprimento. Essas proteínas de fusão podem ser produzidas por métodos recombinantes de engenharia genética conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em algumas modalidades, 5 a porção de peptídeo da RAP do conjugado é formulada para ser degradada rapidamente ou ser clivada de modo a liberar o composto ativo. Em outras modalidades, o vinculador é submetido à clivagem sob condições ambientais intracelulares ou, mais preferivelmente, condições 10 ambientais lisossômicas, para liberar ou separar a porção de agente ativo da porção de peptídeo da RAP.

O conjugado pode compreender um ou mais agentes ativos ligados ao mesmo peptídeo da RAP. Por exemplo, as reações de conjugação podem conjugar de 1 a 5, cerca de 5, cerca de 15 1 a 10, cerca de 5 a 10, cerca de 10 a 20, cerca de 20 a 30, ou 30 ou mais moléculas de um agente ativo ao peptídeo da RAP. Essas formulações podem ser empregadas como misturas, ou podem ser purificadas em formulações estequiométricas específicas. Aqueles habilitados na 20 técnica são capazes de determinar qual formato e qual proporção estequiométrica são preferidos. Além disso, mais de um tipo de agente ativo pode ser ligado ao peptídeo da RAP, em que a liberação de mais de um tipo de um agente ao local ou compartimento-alvo é desejada. Várias espécies de 25 agente ativo podem ser anexadas ao mesmo peptídeo da RAP, por exemplo, conjugados de adriamicina-cisplatina e peptídeo da RAP. Dessa forma, os conjugados podem consistir em uma gama de proporções estequiométricas e incorporam mais de um tipo de agente ativo. Esses também podem ser

3 0 separados em misturas purificadas ou podem ser empregados em agregados.

Os peptídeos cíclicos da RAP da invenção, ou conjugados destes, também podem ser modificados da forma desejada para aumentar a estabilidade ou as propriedades farmacocinéticas (por exemplo, por PEGuilação).

Contempla-se que os peptídeos da RAP da invenção podem ser fundidos ou ligados às proteínas terapêuticas como, por exemplo, fator de crescimento neuronal derivado de célula glial (GDNF), fator de crescimento neuronal derivado do

cérebro (BDNF), fator de crescimento neuronal (NGF), outros fatores neurotróficos conhecidos na técnica, ADAMlO, outras protease que atuam em APP ou Abeta, MESD, agentes quimioterápicos para o câncer, inibidores de protease, antígenos autoimunes, moléculas pró-apoptóticas, enzimas

lisossômicas, DNA ou siRNA. Contempla-se que a fusão desses agentes aos peptídeos cíclicos da RAP com afinidade aumentada ou seletividade de ligação por proteínas que contêm CR irá facilitar o transporte aumentado através da barreira hematencefálica ou a outros locais teciduais. Em

2 0 um aspecto, contempla-se que a conjugação a um peptídeo

cíclico da RAP resulta em distribuição tecidual alterada ou liberação do conjugado aumentada após administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraventricular, intratecal ou intraparenquimatosa do conjugado.

Contempla-se ainda que a conjugação ao peptídeo

cíclico da RAP resulta em alterações na atividade farmacológica do agente ativo causadas por um ou mais dos seguintes efeitos: potência aumentada, ligação diminuída aos receptores ou tecidos que são diferentes do receptor ou

3 0 tecido-alvo visado, ligação aumentada aos receptores ou tecidos que são o receptor ou tecido-alvo visado, acesso aumentado aos receptores ou tecidos que são o receptor ou tecido-alvo visado, taxas de depuração alteradas pelo corpo e características alteradas da resposta imunológica à 5 proteína.

Contempla-se ainda que os peptídeos cíclicos da RAP da invenção podem ser conjugados a ácidos nucléicos terapêuticos, tais como DNA ou siRNA, a fim de melhorar a distribuição com seletividade tecidual dos referidos ácidos 10 nucléicos e facilitar a endocitose dos referidos ácidos nucléicos nas células (Kim e cols., (2004) Bioconjugate Chemistry 15, 326-332).

D. Agentes ativos

Os agentes ativos de acordo com a invenção incluem 15 agentes que podem afetar um processo biológico. Agentes ativos particularmente preferidos para uso nas composições de compostos e métodos da invenção são agentes terapêuticos, incluindo fármacos e agentes diagnósticos. O termo "fármaco" ou "agente terapêutico" refere-se a um 20 agente ativo que possui uma atividade farmacológica ou beneficia a saúde quando administrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Agentes particularmente preferidos são agentes biológicos de ocorrência natural (por exemplo, enzimas, proteínas, polinucleotídeos, anticorpos,

polipeptídeos, nanopartículas, gliconjugados). Exemplos de fármacos ou agentes terapêuticos incluem substâncias que são usadas na prevenção, diagnóstico, alívio, tratamento ou cura de uma doença ou condição. É particularmente contemplado que o agente não seja um agente que cause uma

3 0 doença. i. Agentes ativos de proteína

0 agente ativo pode ser uma não proteína ou uma proteína. 0 agente ativo pode ser uma proteína ou enzima ou qualquer fragmento destes que ainda retenha alguma, 5 substancialmente toda ou toda a atividade terapêutica ou biológica da proteína ou enzima. Em algumas modalidades, a proteína ou enzima é aquela que, se não expressa ou produzida ou se substancialmente reduzida em expressão ou produção, daria origem a uma doença, incluindo, sem 10 limitação, doenças de armazenamento lisossômico. De preferência, a proteína ou enzima é derivada ou obtida de um ser humano ou camundongo.

Em modalidades preferidas da invenção, quando o agente ativo conjugado ao peptídeo cíclico da RAP for uma proteína 15 ou enzima, ou fragmento desta que possui uma atividade biológica da proteína ou enzima, o agente ativo terá uma seqüência de aminoácidos idêntica à seqüência de aminoácidos para a porção correspondente da proteína ou enzima humana ou mamífera. Em outras modalidades, a porção

2 0 de agente ativo do conjugado é uma proteína ou enzima

nativa à espécie do ser humano ou mamífero. Em outras modalidades, a proteína ou enzima, ou fragmento desta, é substancialmente homóloga (ou seja, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, mais preferivelmente 98% ou, mais preferivelmente 25 ainda, 99% idêntica em termos de seqüência de aminoácidos ao longo de um comprimento de pelo menos 10, 25, 50, 100, 150 ou 200 aminoácidos, ou todo o comprimento do agente ativo) para uma seqüência nativa da proteína ou enzima humana ou mamífera correspondente.

3 0 Caso o composto seja uma proteína, o composto poderá ser uma enzima, ou qualquer fragmento de uma enzima que ainda retenha alguma, substancialmente toda ou toda a atividade da enzima. De preferência, no tratamento de doenças de armazenamento lisossômico, a enzima é uma enzima 5 encontrada em uma célula, em que ela não é expressa ou produzida, ou sua expressão e produção estão substancialmente reduzidas, dando origem a uma doença de armazenamento lisossômico. De preferência, a enzima é derivada ou obtida de um ser humano ou camundongo. De 10 preferência, a enzima é uma enzima de armazenamento lisossômico como, por exemplo, α-L-iduronidase, iduronato2-sulfatase, heparano N-sulfatase, a-N

acetilglicosaminidase, arilsulfatase A,

galactosilceramidase, ácido-alfa-glicosidase, tripeptidil peptidase, hexosaminidase alfa, esfingomielinase ácida, βgalactosidase, ou qualquer outra enzima de armazenamento lisossômico.

Em algumas modalidades, portanto, no tratamento de doenças humanas de armazenamento lisossômico (LSDs), o

2 0 peptídeo cíclico da RAP conjugado compreende um agente

ativo de proteína ou enzima que está deficiente nos lisossomos de um indivíduo ou paciente a ser tratado. Essas enzimas incluem, por exemplo, alfa-L-iduronidase, iduronato-2-sulfatase, heparano N-sulfatase, alfa-Nacetilglicosaminidase, arilsulfatase A,

galactosilceramidase, ácido-alfa-glicosidase, tioesterase, hexosaminidase A, esfingomielinase ácida, alfagalactosidase, ou qualquer outra enzima de armazenamento lisossômico. Uma tabela de doenças de armazenamento

3 0 lisossômico e com às respectivas proteínas deficientes que são úteis como agentes ativos é a seguinte:

Doença de armazenamento Deficiência de proteína lisossômico Mucopolissacaridose tipo I L-Iduronidase Mucopolissacaridose tipo II Iduronato-2 -sulfatase síndrome de Hunter Mucopolissacaridose tipo Heparano-N-sulfatase IIIA síndrome de Sanfilippo Mucopolissacaridose tipo α-N-Acetilglicosaminidase IIIB síndrome de Sanfilippo Mucopolissacaridose tipo IIIC Acetil CoA:Nsíndrome de Sanfilippo acetiltransferase Mucopolissacaridose tipo IIID N-Acetilglicosamina 6- síndrome de Sanfilippo sulfatase Mucopolissacaridose tipo IVA Galactose 6-sulfatase síndrome de Morquio Mucopolissacaridose tipo IVB β-Galactosidase síndrome de Morquio Mucopolissacaridose tipo VI N-Acetilgalactosamina 4- sulfatase Mucopolissacaridose tipo VII β-Glucuronidase síndrome de Sly Mucopolissacaridose tipo IX Hialuronoglicosaminidase Aspartilglicosaminúria Aspartilglicosaminidase Doença de armazenamento de Lipase ácida éster de colesterol/doença de Wolman Cistinose Transportador de cistina Doença de Danon Lamp-2 Doença de Fabry α-Galactosidase A Lipogranulomatose de Ceramidase ácida Farber/doença de Farber Fucosidose α-L-Fucosidase Galactosialidose tipos I/II Proteína protetora Doença de Gaucher tipo Glicocerebrosidase (βI/doença de Gaueher tipo glicosidase) IIIII Leueodistrofia de célula Galactocerebrosidase globóide/doença de Krabbe Doença de armazenamento de a-Glicosidase glicogênio II/doença de Pompe GMl - gangliosidose tipos β-Galactosidase I/II/III GM2 - gangliosidose tipo β-Hexosaminidase A l/doença de Tay-Sachs GM2 - gangliosidose tipo β-Hexosaminidase A II/doença de Sandhoff GM2 - gangliosidose GM2-ativador deficiência α-manosidose tipos I/II α-D-Manosidase β-manosidose β-D-Manosidase Leucodistrofia metacromática Arilsulfatase A Leucodistrofia metacromática Saposina B Mucolipidose tipo 1/Sialidose Neuraminidase tipos I/II Mucolipidose tipos Il/III Fosfotransferase doença da célula I Mucolipidose tipo Fosfotransferase IlIC/polidistrofia pseudo- subunidade γ Hurler Deficiência múltipla de Múltiplas sulfatases sulfatase Lipofuscinose ceróide Palmitoil proteína neuronal, doença de Batten tioesterase CLNl Lipofuscinose ceróide Tripeptidil peptidase I neuronal, doença de Batten CLN2 Doença de Niemann-Pick tipos Esfingomielinase ácida A/B Doença de Niemann-Pick Doença de Niemann-Pick tipo Tráfico de eolesterol Cl Doença de Niemann-Pick Doença de Niemann-Pick tipo Tráfico de eolesterol C2 Doença de Niemann-Pick Picnodisostose Catepsina K Doença Schindler tipos I/II α-Galactosidase B Doença Schindler Doença de armazenamento de Transportador de ácido ácido siálico siálico Dessa forma, as doenças de armazenamento lisossômico

que podem ser tratadas ou evitadas com o uso dos métodos da presente invenção incluem, sem limitação,

mucopolissacaridose I (MPS I) , MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, leucodistrofia metacromática (MLD), doença de Krabbe, doença de Pompe, lipofuscinose ceróide, doença de TaySachs, doença de Niemann-Pick AeBe outras doenças lisossômicas.

Dessa forma, pela tabela acima, para cada doença, o agente conjugado compreenderia preferivelmente um agente ativo de enzima específico deficiente na doença. Por . exemplo, para métodos que envolvem MPS I, o composto ou a enzima preferida é α-L-iduronidase. Para métodos que envolvem MPS II, o composto ou a enzima preferida é iduronato-2-sulfatase. Para métodos que envolvem MPS IIIA,

0 composto ou a enzima preferida é heparano N-sulfatase. Para métodos que envolvem MPS IIIB, o composto ou a enzima preferida é α-Ν-acetilglicosaminidase. Para métodos que envolvem leucodistrofia metacromática (MLD), o composto ou

a enzima preferida é arilsulfatase A. Para métodos que envolvem Krabbe, o composto ou a enzima preferida é galactosilceramidase. Para métodos que envolvem Pompe, o composto ou a enzima preferida é α-glicosidase ácida. Para métodos que envolvem CLN, o composto ou a enzima preferida 15 é tripeptidil peptidase. Para métodos que envolvem TaySachs, o composto ou a enzima preferida é hexosaminidase alfa. Para métodos que envolvem Niemann-Pick AeB, o composto ou a enzima preferida é esfingomielinase ácida.

O peptídeo cíclico da RAP conjugado pode compreender uma ou mais porções de agente ativo (por exemplo, 1 a 10 ou

1 a 4 ou 2 a 3 porções) ligadas ao peptídeo cíclico da RAP. Por exemplo, as reações de conjugação podem conjugar de 1 a

4 ou mais moléculas de alfa-L-iduronidase a um único peptídeo cíclico da RAP. Essas formulações podem ser

2 5 empregadas como misturas, ou podem ser purificadas em

formulações estequiométricas específicas de peptídeo cíclico da RAP-agente. Aqueles habilitados na técnica são capazes de determinar qual formato e qual proporção estequiométrica são preferidas. Além disso, um ou mais

3 0 agentes ativos diferentes podem ser ligados a certa molécula de um peptídeo cíclico da RAP para facilitar uma degradação mais completa dos substratos armazenados. Esses agentes conjugados ao peptídeo cíclico da RAP podem consistir em uma gama de proporções estequiométricas. Esses 5 também podem ser separados em misturas purificadas ou podem ser empregados em agregados. Pode ser importante a ordem do peptídeo cíclico da RAP em relação ã LSD na fusão. Portanto, em algumas modalidades, o peptídeo cíclico da RAP se situa no terminal N em relação à enzima de LSD e, em 10 outras modalidades, o peptídeo cíclico da RAP se situa no terminal C em relação à enzima de LSD.

Os agentes ativos conjugados ao peptídeo cíclico da RAP podem entrar ou ser transportados para o interior ou acabar residindo nos lisossomos de uma célula dentro ou 15 fora do SNC. A taxa de passagem do agente conjugado pode ser modulada por qualquer composto ou proteína que possa modular a atividade de transporte do receptor. A célula pode ser de qualquer tecido ou sistema orgânico afetado pela doença de armazenamento lisossômico. A célula pode 20 ser, por exemplo, uma célula endotelial, epitelial, muscular, cardíaca, óssea, pulmonar, gordurosa, renal ou hepática. Em algumas modalidades, a célula é preferivelmente uma célula encontrada dentro da barreira hematencefálica. Em algumas modalidades, a célula é um 25 neurônio ou uma célula cerebral. Em outras modalidades, a célula é uma célula da periferia ou uma que não é isolada da circulação geral por um endotélio como, por exemplo, aquela da barreira hematencefálica.

ii. Agentes farmacológicos ativos Geralmente, o agente farmacológico ativo pode ser de ' qualquer tamanho. Fármacos preferidos são pequenas moléculas orgânicas que são capazes de ligação ao alvo de interesse. Uma porção de fármaco do conjugado, quando uma pequena molécula, geralmente possui um peso molecular de 5 pelo menos cerca de 50 D, normalmente pelo menos cerca de 100 D, em que o peso molecular pode ser de até 500 D ou mais, mas normalmente não excederá cerca de 2.000 D.

A porção de fármaco é capaz de interagir com um alvo no hospedeiro no qual o conjugado é administrado durante a 10 prática dos métodos em questão. O alvo pode ser diversos tipos diferentes de estruturas de ocorrência natural, e os alvos de interesse incluem alvos tanto intracelulares quanto extracelulares, e esses alvos podem ser proteínas, fosfolipídeos, ácidos nucléicos e semelhantes, sendo que 15 proteínas são de particular interesse. Alvos proteináceos específicos de interesse incluem, sem limitação, enzimas, por exemplo, quinases, fosfatases, redutases,

ciclooxigenases, proteases e semelhantes; alvos que compreendem domínios envolvidos em interações proteína

2 0 proteína, tais como os domínios SH2, SH3, PTB e PDZ, proteínas estruturais, por exemplo, actina, tubulina etc., receptores da membrana, imunoglobulinas, por exemplo, IgE, receptores de adesão celular, tais como integrinas etc., canais de íons, bombas transmembrana, fatores de 25 transcrição, proteínas de sinalização, e semelhantes.

Em algumas modalidades, o agente ativo ou fármaco possui um hidroxil ou um grupo amino para reação com o reagente isocianato ou o agente ativo é modificado quimicamente para introduzir um hidroxil ou um grupo amino para reação com o reagente isocianato. Em algumas modalidades, o agente ativo ou fármaco .compreende uma região que pode ser modificada e/ou participar na ligação covalente, de preferência, sem perda da atividade biológica desejada do agente ativo. As porções 5 de fármaco freqüentemente compreendem carbono cíclico ou estruturas heterocíclicas e/ou aromáticas ou estruturas poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima. Também são de interesse como porções de fármaco as estruturas encontradas entre biomoléculas, 10 proteínas, enzimas, polissacarídeos e ácidos polinucléicos, incluindo peptídeos, sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinações destes.

Agentes ativos adequados incluem, sem limitação, 15 agentes psicofarmacológicos, tais como (1) depressores do sistema nervoso central, por exemplo, anestésicos gerais (barbituratos, benzodiazepinas, esteróides, derivados de ciclohexanona e agentes variados), sedativos-hipnóticos (benzodiazepinas, barbituratos, piperidinedionas e trionas, 20 derivados de quinazolina, carbamatos, aldeídos e derivados, amidas, ureidas acíclicas, benzazepinas e fármacos relacionados, fenotiazinas etc.), fármacos modificadores do tônus muscular voluntário central (anticonvulsivantes, tais como hidantoínas, barbituratos, oxazolidinedionas, 25 succinimidas, acilureidas, glutarimidas, benzodiazepinas, álcoois secundários e terciários, derivados de dibenzazepina, ácido valpróico e derivados, análogos de GABA etc.), analgésicos (morfina e derivados, derivados de oripavina, derivados de morfinano, fenilpiperidinas,

3 0 derivados de 2,6-metano-3-benzazocaína, difenilpropilaminas e isoésteres, salicilatos, derivados de p-aminofenol, .derivados de 5-pirazolona, derivados do ácido arilacético, fenamatos e isoésteres etc. ) e antieméticos (anticolinérgicos, anti-histamínicos, antidopaminérgicos 5 etc.), (2) estimulantes do sistema nervoso central, por exemplo, analépticos (estimulantes respiratórios, estimulantes convulsivantes, estimulantes psicomotores), antagonistas narcóticos (derivados da morfina, derivados de oripavina, derivados da 2,6-metano-3-benzoxacina, derivados 10 de morfinano) nootrópicos, (3) substâncias

psicofarmacológicas, por exemplo, sedativos ansiolíticos (benzodiazepinas, propanediol carbamatos) antipsicõticos (derivados da fenotiazina, derivados da tioxantina, outros compostos tricíclicos, derivados e isoésteres da butirofenona, derivados da difenilbutilamina, benzamidas substituídas, derivados da arilpiperazina, derivados de indol etc.), antidepressivos (compostos tricíclicos, inibidores da MAO etc.), (4) fármacos do aparelho respiratório, por exemplo, antitussígenos centrais (alcalóides do ópio e seus derivados); agentes farmacodinâmicos, tais como (1) fármacos do sistema nervoso periférico, por exemplo, anestésicos locais (derivados do éster, derivados de amida) , (2) fármacos que atuam nas junções sinápticas ou neuroefetoras, por exemplo, agentes colinérgicos, agentes de bloqueio colinérgico, agentes de bloqueio neuromuscular, agentes adrenérgicos, agentes antiadrenérgicos, (3) fármacos ativos no músculo liso, por exemplo, espasmolíticos (anticolinérgicos, espasmolíticos musculotrópicos), vasodilatadores, estimulantes do músculo liso, (4) histaminas e anti-histamínicos, por exemplo, histamina e derivado desta (betazol), anti-histamínicos (antagonistas Hl, antagonistas H2), fármacos do metabolismo da histamina, (5) fármacos cardiovasculares, por exemplo, cardiotônicos (extratos de plantas, butenolidas, 5 pentadienolidas, alcalóides de espécies de eritrophleum, ionóforos, estimulantes adrenoceptores etc.), fármacos antiarrítmicos, agentes anti-hipertensivos, agentes antilipidêmicos (derivados do ácido clofíbrico, derivados do ácido nicotínico, hormônios e análogos, antibióticos, 10 ácido salicílico e derivados), fármacos antivaricosos, hemostáticos, (6) fármacos do sistema sangüíneo e hematopoiético, por exemplo, fármacos antianêmicos, fármacos da coagulação sangüínea (hemostáticos, anticoagulantes, antitrombóticos, trombolíticos, proteínas 15 sangüíneas e suas frações) , (7) fármacos do trato gastrintestinal, por exemplo, digestivos (estomáquicos, coleréticos), fármacos anti-úlcera, agentes antidiarréicos, (8) fármacos que agem localmente; agentes quimioterápicos, tais com (1) agentes antiinfecciosos, por exemplo, 20 ectoparasiticidas (hidrocarbonetos clorados, piretrinas, compostos sulfurados), anti-helmínticos, agentes

antiprotozoários, agentes antimaláricos, agentes antiamebíase, fármacos anti-leischmaniose, agentes antitricomonas, agentes anti-tripanossoma, sulfonamidas,

2 5 fármacos antimicobacterianos, quimioterápicos antivirais etc., e (2) citostáticos, ou seja, agentes antineoplásicos ou fármacos citotóxicos, tais como agentes alquilantes, por exemplo, cloridrato de mecloretamina (mostarda nitrogenada, Mustargen, HN2), ciclofosfamida (Cytovan, Endoxana), 30 Ifosfamida (IFEX), clorambucil (Leukeran), melfalan (mostrada fenilalanina, L-sarcolisina, Alkeran, L-PAM), Busulfan (Myleran), tiotepa (trietilenotiofosforamida), carmustina (BiCNU, BCNU), lomustina (CeeNU, CCNU), estreptozocina (Zanosar) e semelhantes; alcalóides de 5 plantas, por exemplo, vincristina (Oncovin), Vinblastina (Velban, Velbe), paclitaxel (Taxol), e semelhantes; antimetabólitos, por exemplo, metotrexato (MTX), mercaptopurina (Purinathol, 6-MP), tioguanina (6-TG), fluoruracil (5-FU), citarabina (Cytosar-U, Ara-C), 10 azacitidina (Mylosar, 5-AZA) e semelhantes; antibióticos, por exemplo, dactinomicina (actinomicina D, Cosmegen), doxorrubicina (adriamicina) , daunorrubicina (duanomicina, cerubidina), idarrubicina (idamicina), bleomicina

(Blenoxane), picamicína (mitramicina, Mithracin), Mitomicina (Mutamicina) e semelhantes, e outros agentes proliferativos anti-celulares, por exemplo, hidroxiuréia (Hydrea), procarbazina (Mutalane), dacarbazina (DTIC-Dome), cisplatina (Platinol) carboplatina (Paraplatin),

asparaginase (Elspar), etoposida (VePesid, VP-16-213), 20 amsarcrina (AMSA, m-AMSA) , mitotano (Lysodren), mitoxantrona (Novatrone) , e semelhantes. Agentes quimioterápicos preferidos são aqueles que, na forma livre, demonstram toxicidade sistêmica inaceitável nas doses desejadas. A toxicidade sistêmica geral associada aos

2 5 níveis terapêuticos desses agentes pode ser reduzida por

sua ligação ao peptídeo cíclico da RAP. São particularmente preferidos compostos cardiotóxicos que são substâncias terapêuticas úteis, mas que têm a dose limitada por cardiotoxicidade. Um exemplo clássico é a adriamicina

3 0 (também conhecida como doxorrubicina) e seus análogos como, por exemplo, daunorrubicina. A ligação do peptídeo cíclico da RAP a esses fármacos pode evitar o acúmulo do agente ativo no coração e a cardiotoxicidade associada.

Agentes ativos adequados incluem, sem limitação: antibióticos, tais como: aminoglicosídeos, por exemplo, amicacina, apramicina, arbecacina, bambermicinas, butirosina, dibecacina, diidroestreptomicina, fortimicina, gentamicina, isepamicina, canamicina, micronomicina, neomicina, netilmicina, paromicina, ribostamicina, sisomicina, espectinomicina, estreptomicina, tobramicina, trospectomicina; anfenicóis, por exemplo, azidamfenicol, cloranfenicol, florfenicol e teimafenicol; ansamicinas, por exemplo, rifamida, rifampina, rifamicina, rifapentina, rifaximina; beta-Iactamas, por exemplo, carbacefemas, carbapenemas, cefalosporinas, cefamicinas, monobactamas, oxafemas, penicilinas; lincosamidas, por exemplo, clinamicina, lincomicina; macrolídeos, por exemplo, claritromicina, dirtromicina, eritromicina etc.;

polipeptídeos, por exemplo, anfomicina, bacitracina, capreomicina etc.; tetraciclinas, por exemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina etc.; agentes

antibacterianos sintéticos, tais como 2,4-

diaminopirimidinas, nitrofuranos, quinolonas e análogos destas, sulfonamidas, sulfonas;

Agentes ativos adequados incluem, sem limitação:

agentes antifúngicos, tais como: polienos, por exemplo, anfotericina B, candicidina, dermostatina, filipina, fungicromina, hachimicina, hamicina, lucensomicina, mepartricina, natamicina, nistatina, pecilocina,

perimicina; antifúngicos sintéticos, tais como alilaminas, por exemplo, butenafina, naftifina, terbinafina; imidazóis, por exemplo, bifonazol, butoconazol, clordantoína, clormidazol etc., tiocarbamatos, por exemplo, tolciclato, triazóis, por exemplo, fluconazol, itraconazol, terconazol;

5 Agentes ativos adequados incluem, sem limitação: anti

helmínticos, tais como: arecolina, aspidina, aspidinol, diclorofeno, embelina, kosin, naftaleno, niclosamida, peletierina, quinacrina, alantolactona, amocarzina, amoscanato, ascaridol, befênio, bitoscanato, tetracloreto 10 de carbono, carvacrol, ciclobendazol, dietilcarbamazina etc. ;

Agentes ativos adequados incluem, sem limitação: antimalãricos, tais como: acedapsona, amodiaquina, arteeter, artemeter, artemisinina, artesunato, atovaquona, 15 bebeerina, berberina, chirata, clorguanida, cloroquina, clorprogaunil, cinchona, cinchonidina, cinchonina, cicloguanil, gentiopicrina, halofantrina,

hidroxicloroquina, cloridrato de mefloquina, 3- metilarsacetina, pamaquina, plasmocid, primaquina, pirimetamina, quinacrina, quinidina, quinina, quinocida, quinolina, arsenato de sódio dibásico;

Agentes ativos adequados incluem, sem limitação: agentes antiprotozoãrios, tais como: acranil, tinidazol, ipronidazol, etilstibamina, pentamidina, acetarsona,

2 5 aminitrozol, anisomicina, nifuratel, tinidazol, benzidazol, suramina, e semelhantes.

Fármacos adequados para uso como agentes ativos também estão listados em "Goodman and Gilman1S. The Pharmacological Basis of Therapeutics" (9a Edição) (Goodman e cols. eds) (McGraw-Hill) (1996); e 1999 "Physician's Desk Reference" (1998) .

Agentes ativos adequados incluem, sem limitação: agentes antineoplásicos, como revelados nas Patentes U.S.

Nos 5. 880 . 161, 5.877.206 / 5.786.344, C ; . 76C I . 041, 5 .753 . 668, 5 . 698 . 529, 5 . 684 . 004 , 5 . 665 .715, 5 . 654 . 484 , 5 . 624 . 924, 5 .618 . 813, 5 . 610 . 292, 5 . 597 . 831, 5 . 530 . 026, 5 .525. 633, 5 . 525 . 606, 5 . 512 . 678, 5 . 508 .277, 5 . 463 . 181, 5 .409 . 893 , 5 .358 . 952, 5 . 318 . 965, 5 . 223 . 503 , 5 . 214 . 068, 5 . 196 . 424, 5 . 109 . 024 , 5 . 106 . 996, 5 . 101 .072, 5 . 077 . 404 , 5 . 071. 848, 5 . 066 .493, 5 . 019 . 390, 4 . 996 , .229, 4 . 996 . 206, 4 . 970. 318, 4 . 968 . 800, 4 . 962 . 114, 4 . 927 . .828, 4 . 892 . 887, 4 . 889 . 859, 4 .886 .790, 4 . 882 . 334, 4 . 882 , . 333 , 4 . 871. 746 , 4 .863 . 955, 4 . . 849 . 563, 4 . 845 . 216, 4 . 833 , . 145, 4 . 824 . 955, 4 . 785 . 085, 4 . . 684 . 747 , 4 . 618 . 685, 4 . 611, . 066 , 4 . 550 . 187, 4 . 550 . 186, 4 . . 544 . 501, 4 . 541. 956, 4 . 532 , .327, 4 . 490 . 540, 4 .399. 283, 4 . .391 . 982, 4 . 383 . 994, 4 . 294 . . 763 , 4 . 283 . 394 , 4 .246. 411, 4 , .214 . 089, 4 . 150 . 231, 4 . 147 . . 798 , 4 . 056 . 673, 4 . 029 . 661, 4 . . 012 .448; agentes psicofarmacológicos/psicotrópicos, como revelados nas Patentes U.S. Nos 5 . 192 . 799, 4 . 427 . 694, 5 . .387 . 586, 4 . 788. 188, 4 .613 . . 600, 4 . 440 . 781, 5 . 036 . 070, 4 . . 424 .202, 5 . 256 . 664, 4 . 778 . .800, 4 . 590 . 180, 4 . 427 . 694 , 4 . . 778 .800, 4 . 440. 781, 5 . 192 . . 799, 4 . 753 . 951, 4 .560. 684, 4 . .424 . 202, 4 . 753 . 951, 5 .686 . .482, 5 . 120 . 733 , 4 .690. 930, 4 . , 548 , . 938, 4 . 397 . 853, 4 .590 . .180, 5 . 478 . 828, 5 . 036. 070, 4 . . 645 , . 773 , 4 . 529 . 727, 4 .358 . .451, 4 . 690 . 930, 5 .461. 062, 4 . 977 . . 167 , 4 . 631. 285, 4 .459 . .306, 4 . 324 . 787 , 4 . 645 . 773, 5 . 387 . . 593 , 4 . 904 . 663 , 4 .617. .314 , 4 . 443 . 451, 4 .314 . 081, 4 . 313 . . 896, 4 . 294 . 828 , 4 .277 . ,476, 4 . 267 . 328, 4 .264 . 499, 4 . 231. . 930, 4 . 194 . 009, 4 .188 . 388, 4 . 148 . 796, 4 . 128 . 717, 4 . 062 . . 858, 4 . 031. 226, 4 .020 . 072, 4 . 018 . 895, 4 . 018 . 779, 4 . 013 . 672, 3 . , 994 . . 898, 3 . 968 . 125, 3 . 939 . 152 , 3 . 928 , . 356 - 3 . 880 . 834, 3 . 668 . 210; agentes cardiovasculares, ο ο 3 revelados nas ί Patentes U. S . Nos 4 . 966 . 967 , 5 . . 661. . 129 5 . 552 .411, 5 . 332 . . 737 . 5 .389 . 675 . 5, . 198 , .449, 5 , . 079 . . 247 5 4 . 966 . 967, 4 . 874 . . 760, 4 . 954 . 526, 5. . 051, .423 , 4 , . 888 . . 335 4 . 853 .391, 4 . 906. . 634 , 4 . 775 . 757, 4 . . 727 , .072, 4 , . 542 . . 160 4 . 522 . 949, 4 . 524 . , 151, 4 . 525 .479, 4 . .474 , . 804 , 4 , . 520 . . 026 4 . 520 . 026, 5 . 869 . 478, 5 . 859 . 239, 5. . 837 . . 702 , 5 , . 807 . . 889 5 . 731 .322 , 5 . 726 . 171, 5 . 723 .457, 5 . . 705 . . 523 , 5 , . 696 . . 111 5 . 691. .332, 5 . 679. 672, 5 . 661 . 129, 5 . . 654 . .294, 5 , . 646. . 276 5 . 637 . .586, 5 . 631. 251, 5 . 612 .370, 5 . . 612 . .323, 5 , . 574 . . 037 5 . 563 , . 170, 5 . 552 . 411. 5 . 552 .397, 5 . . 547 . .966, 5 , .482, . 925 5 .457 , .118, 5 . 414 . 017, 5 .414 , . 013, 5 . .401. . 758, 5 , .393 . . 771 5 , .362 . . 902, 5 . 332. 737, 5 .310 . .731, 5. .260 . .444, 5 . . 223 . . 516 5 , . 217 . . 958, 5 . 208 . 245, 5 .202 , . 330, 5. . 198 . .449, 5 . . 189. . 036 5 , . 185 , .362, 5 . 140. 031, 5 .128 , . 349, 5 . . 116 . . 861, 5 . . 079. . 247 5 , . 070 . . 099, 5 . 061. 813 , 5 . 055 . .466, 5 . . 051. .423, 5 . . 036 . . 065 5 . . 026 . .712, 5 . 011. 931, 5 .006 . . 542, 4 . . 981. .843, 4 . . 977. . 144 4 . . 971. .984, 4 . 966. 967, 4 . 959 . .383, 4 . , 954 . .526, 4 . . 952 . . 692 4 . . 939 . . 137, 4 . 906 . 634 , 4 . 889 . . 866, 4 . . 888 . . 335, 4 . . 883 . . 872 4 . , 883 . , 811, 4 . 847. 379, 4 .835 . .157, 4 . . 824 . . 831, 4 . . 780 . . 538 4 . . 775 . , 757 , 4 . 774 . 239, 4 . 771. . 047, 4 . , 769 . ,371, 4 . . 767 . , 756 4 . 762 . .837, 4 . 753 . 946, 4 .752 . . 616, 4 . , 749 . ,715, 4 . . 738 . , 978 4 . 735 . ,962, 4 . 734 . 426, 4 .734 . .425, 4 . . 734 . ,424 , 4 . . 730 . . 052 4 . 727 . 072, 4 . 721. 796, 4 .707 . , 550, 4 . 704 . ,382, 4 . . 703 . , 120 4 . 681. 970, 4 . 681. 882, 4 .670. , 560, 4 . 670 . ,453, 4 . . 668 . , 787 4 . 663 . 337, 4 . 663 . 336, 4 .661. .506, 4 . 656 . 267, 4 . . 656 . , 185 4 . 654 . 357 , 4 . 654 . 356, 4 .654 . 355, 4 . 654 . 335, 4 . . 652 . , 578 4 . 652 . 576, 4 . 650 . 874 , 4 .650 . 797, 4 . 649 . 139, 4 . , 647 . , 585 4 . 647 . 573 , 4 . 647 . 565, 4 .647 . 561, 4 . 645 . 836, 4 . , 639. ,461 4 . 638 . 012, 4 . 638 . , 011, 4 .632 .931, 4 .631 . 283 , 4 . 628 . 095 .4 . 626 . 548 , 4 . 614 . . 825, 4 . 611 . 007, 4 . 611 . 006, 4 . 611. 005 4 . 609 .671, 4 . 608 . .386, 4 .607 . 049, 4 .607 . 048, 4 . 595 . 692 4 . 593 . 042, 4 . 593 . , 029, 4 .591 . 603, 4 . 588 . 743 , 4 . 588 . 742 4 . 588 .741, 4 . 582 . , 854 , 4 .575 . 512, 4 . 568 . 762, 4 . 560 . 698 4 . 556 .739, 4 . 556 . ,675, 4 .555 . 571, 4 . 555 . 570, 4 . 555 . 523 4 . 550 . 120, 4 . 542 . 160, 4 . 542 .157, 4 . 542 . 156, 4 . 542 . 155 4 . 542 .151, 4 .537. 981, 4 .537 . 904, 4 . 536 . 514, 4 . 536 . 513 4 .533 . 673 , 4 .526 . 901, 4 . 526 . 900, 4 . 525 .479, 4 . 524 . 151 4 . 522 . 949, 4 . 521. 539, 4 . 520 . 026, 4 . 517 . 188, 4 .482 . 562 4 .474 .804, 4 .474 . 803, 4 .472 .411, 4 .466 . 979, 4 .463 . 015 4 .456 .617, 4 .456 . 616, 4 .456 . 615, 4 .418 . 076, 4 .416 . 896 4 . 252 . 815, 4 .220 . 594, 4 . 190 . 587, 4 . 177 . 280, 4 . 164 . 586 4 .151 .297, 4 . 145 . 443, 4 .143 . 054, 4 . 123 . 550, 4 . 083 . 968 4 . 076 . 834 , 4 . 064 . 259, 4 . 064 . 258, 4 . 064 . 257, 4 . 058 . 620 4.001, .421, 3 . 993 . 639, 3 . 991 . 057, 3 , . 982 . 010, 3 . 980. 652 3 . 968 . 117 , 3 . 959 . 296, 3 . 951 . 950, 3 , . 933 . 834, 3 . 925. 369 3.923. . 818 , 3 . 898 . 210, 3 .897 . 442, 3 .897 . 441, 3 . 886 . 157 3 . 883. . 540, 3 . 873 . 715, 3 . 867 .383, 3 , . 873 . 715, 3 . 867 . 383 3.873, .715, 3.867.383, 3 .691.216, 3. 624 .126 / Agentes , antimicrobianos, como revelados nas Patentei U.S. Nos 5 . 902.594, 5 . 874 . 476, 5. 874 . 436, 5 . 859. 027 5.856, .320, 5 . 854 . 242, 5 .811 . 091, 5 . .786 . 350, 5 . 783 . 177 5.773. .469, 5 . 762 . 919, 5 .753 .715, 5. , 741 . 526, 5 . 709. 870 5.707. . 990, 5 . 696 . 117, 5 .684 . 042, 5 . . 683 . 709, 5 . 656 . 591 5.643. . 971, 5 . 643 . 950, 5 .610 . 196, 5 . . 608 . 056, 5 . 604 . 262 5.595. , 742, 5 .576 . 341, 5 .554 .373, 5 . . 541 .233, 5 . 534 . 546 5.534 . ,508, 5 .514 . 715, 5 .508 .417, 5 . .464 . 832, 5 . 428 . 073 5.428 . 016, 5 .424 . 396 , 5 .399 .553, 5 . .391 . 544, 5 .385 . 902 5.359 . 0 66, 5 .356 . 803 , 5 .354 , . 862, 5 . , 346 , . 913, 5 . 302 . 592 .288 . 693, 5 . 266 . 567, 5 . 254 . 685, 5 . 252 . 745, 5 . 209 , .930, .5 . 196 . 441, 5 . 190, . 961, 5 . 175 .160, 5 . 157 .051, 5 . 096 , .700, . 093 . 342 , 5 . 089, .251, 5 . 073 . 570, 5 . 061 . 702, 5 . 037 , .809, . 036 . 077, 5 . 010, , 109, 4 , . 970 . 226, 4 , . 916 .156, 4 . 888 . .434, 4 . 870 . 093, 4 . 855 , .318, 4 , . 784 . 991, 4 , . 746 .504, 4 . 686 . . 221, 4 , . 599 . 228, 4 . 552 . .882, 4 . . 492 , . 700, 4 . .489, .098, 4 .489. . 085, 4 , .487 . 776 , 4 . 479 , . 953 , 4 . .477 , .448, 4 . .474 , .807, 4 .470 . . 994, 4 . . 370 . 484 , 4 . 337 . , 199, 4 . . 311, . 709, 4 . .308 . .283, 4 .304 . . 910, 4 . . 260 . 634, 4 . 233 . ,311, 4 . . 215 , . 131, 4 . . 166 , .122, 4 . 141. . 981, 4 . . 130 . 664 , 4 . 089. , 977, 4. , 089 . , 900, 4 . , 069 . .341, 4 . 055 . , 655, 4 . . 049 . 665 , 4 . 044 . , 139, 4 . , 002 . , 775, 3 . , 991. .201, 3 . 966 . . 968, 3 . . 954 . 868 , 3 . 936 . 393, 3. 917 . ,476, 3 . , 915 . .889, 3 . 867 . , 548, 3 . , 865 . 748 , 3 . 867 . 548 , 3 . , 865 . , 748 , 3 . , 783 . , 160, 3 . 764 . ,676, 3 . 764.677;

Agentes antiinflamatórios , como revelados nas Patentes U. S. NOs ! 5. 872 . 109, 5 . 837 . 735, 5 . 827 . 837, 5 . 821 .250, . 814 . 648, 5 . 780 . 026, 5 . 776 . 946 , 5 . 760 . 002, 5 . 750 .543, . 741 . 798 , 5 . 739 . 279, 5 . 733 . 939, 5 . 723 .481, 5 . 716 . 967, . 688 . 949, 5 . 686 . 488, 5 . 686 , .471, 5 . 686 .434 , 5 . 684 .204 , . 684 . 041, 5 .684 . 031, 5 .684 , . 002 , 5 . 677 .318, 5 . 674 .891, . 672 . 620, 5 . 665 . 752, 5 . 656 , . 661, 5 . 635 . 516, 5 . 631 .283, . 622 . 948, 5 . 618 . 835, 5 .607 , . 959, 5 .593 . 980, 5 . 593 . 960, . 580 . 888 , 5 . 552 . 424 , 5 . 552 . .422, 5 . 516 . 764, 5 . 510 .361, . 508 . 026 , 5 . 500 . 417 , 5 .498 . .405, 5 .494 . 927, 5 . 476 . 876, . 472 . 973 , 5 .470 . 885, 5 .470 . . 842, 5 .464 . 856, 5 . 464 . 849, . 462 . 952, 5 .459 . 151, 5 .451. .686, 5 . 444 . 043, 5 . 436 .265, . 432 . 181, RE034918 , 5 . 393 . 756, 5 . . 380 , . 738, 5 . 376 . 670, . 360 .811, 5 .354 . 768 , 5 .348 . . 957 , 5 . 347 . 029, 5 . 340 . 815, . 338 .753, 5 . 324 . 648, 5 .319 . , 099, 5 .318 . 971, 5 . 312 . 821, . 302 . 597 , 5 .298 . 633 , 5 .298 . 522 , 5 .298 .498 , 5 . 290 .800, 5 . ,290 . 788, 5 . 284 . 949, 5 . 280 . 045, 5 .270 . 319, 5 . 266 . 562 5 . ,256 . 680, 5 . 250 . 700, 5, . 250 . 552, 5 , . 248 . 682, 5 . 244 . 917 5 . . 240 . 929, 5 . 234 . 939 , 5 . 234 . 937 , 5 . 232 . 939, 5 . 225 . 571 5 . . 225 . 418 , 5 . 220 . 025, 5 . 212 . 189, 5 , . 212 . 172, 5 . 208 .250 5 . ,204 .365, 5 . 202 . 350, 5, . 196 .431, 5 , . 191. 084 , 5 . 187 . 175 5 . , 185 .326, 5 . 183 . 906, 5, . 177 . 079, 5 , . 171. 864, 5 .169 . 963 5 . , 155 . 122, 5 . 143 . 929, 5, . 143 .928, 5 , . 143 . 927, 5 . 124 .455 5 . 124 . 347, 5 . 114 . 958 , 5 , . 112 . 846, 5 . . 104 . 656, 5 . 098 . 613 5 . 095 . 037 , 5 . 095 . 019, 5 , . 086 .064, 5 , . 081 . 261, 5 . 081 .147 5 . 081 . 126, 5 . 075 . 330, 5, . 066 . 668, 5 . . 059 . 602, 5 . 043 .457 5 . 037 . 835, 5 . 037 . 811, 5, , 036 . 088, 5 , , 013 . 850, 5 . 013 . 751 5 . 013 . 736 , 5 . 006 . 542, 4 , , 992 .448 , 4 , . 992 . 447, 4 . 988 .733 4 . 988 . 728 , 4 . 981 . 865, 4 , . 962 . 119, 4 , . 959 . 378, 4 . 954 . 519 4 . 945 . 099, 4 . 942 . 236, 4 , , 931 .457, 4 , , 927 . 835, 4 . 912 . 248 4 . 910 . 192 , 4 . 904 . 786, 4 . . 904 . 685, 4 . . 904 . 674 , 4 . 904 .671 4 . 897 . 397, 4 . 895 .953, 4 , . 891 .370, 4 , . 870 . 210, 4 . 859 . 686 4 . 857 . 644, 4 . 853 .392, 4 , , 851 .412, 4 . , 847 . 303, 4 . 847 .290 4 . 845 .242, 4 . 835 . 166, 4 . , 826 . 990, 4 . , 803 . 216, 4 . 801 . 598 4 . 791 . 129, 4 . 788 . 205, 4 , , 778 . 818, 4 . , 775 . 679, 4 . 772 .703 4 . 767 . 776, 4 . 764 . 525, 4 , . 760 . 051, 4 , , 748 . 153, 4 . 725 . 616 4 . 721 . 712 , 4 . 713 .393 , 4 , . 708 . 966, 4 . , 695 . 571, 4 . 686 .235 4 . 686 .224, 4 . 680 .298, 4 , ,678 . 802, 4 , . 652 . 564, 4 . 644 . 005 4 . 632 . 923 , 4 . 629 . 793, 4 , , 614 . 741, 4 . , 599 . 360, 4 .596 . 828 4 . 595 . 694 , 4 . 595 . 686, 4 , , 594 .357, 4 . , 585 . 755, 4 . 579 . 866 4 . 578 . 390 , 4 . 569 . 942 , 4 , , 567 . 201, 4 , , 563 . 476 , 4 . 559 . 348 4 . 558 . 067, 4 . 556 . 672, 4 . ,556 . 669, 4 . , 539 . 326, 4 . 537 . 903 4 . 536 . 503 , 4 . 518 . 608, 4 . , 514 .415, 4 . , 512 . 990, 4 . 501 . 755 4 . 495 . 197, 4 .493 . 839, 4 . ,465 .687, 4 . ,440 . 779, 4 .440 .763 4 . 435 .420, 4 .412 . 995, 4 . ,400 . 534 , 4 . 355 . 034 , 4 . 335 . 141 4 . 322 , . 420 , 4 . 275 . 064 , 4 . ,244 . 963, 4 . 235 . 908, 4 . 234 .593 4.226. 887, 4 , .201 .778, 4 . 181 . 720, 4 . 173 . . 650, 4 . . 173 , . 634, 4.145 . 444 , 4 , . 128 .664, 4 . 125 .612, 4 . 124 , .726, 4 , . 124 , .707, 4.117. 135, 4 , . 027 , . 031, 4 . 024 .284, 4 . 021. .553, 4 . . 021, . 550, 4.018. 923 , 4 . . 012 , . 527, 4 . 011 .326, 3 . 998 . . 970 , 3 . . 998 . . 954, 3.993. 763 , 3 . . 991, .212, 3 . 984 .405, 3 . 978 . , 227 , 3 . . 978 . . 219, 3.978. 202 , 3 . . 975 , .543, 3 . 968 .224, 3 . 959. .368, 3 . .949. . 082, 3.949. 081, 3 . , 947 . .475, 3 . 936 .450, 3 . 934 . , 018, 3 . . 930 . . 005, 3.857. 955, 3 . , 856 . .962, 3 . 821 .377, 3 .821. ,401, 3 . . 789 . . 121, 3.789. 123 , 3 . , 726 . .978, 3 . 694 .471, 3 . 691. ,214, 3 . . 678 . . 169, 3.624 . 216 ; Agentes imunossupressores , como revelados nas Patentes U.S. Nos 4 . 450 . 159, 4 . 450 . 159, 5 . 905 . 085, 5 . 883 .119, 5.880. , 280 , 5 . 877 .184, 5 . 874 .594, 5 . 843 .452 , 5 . 817 . 672, 5.817. 661, 5 . 817 . 660, 5 . 801 . 193, 5 .776, . 974 , 5 . 763 .478, 5.739. 169, 5 . 723 .466, 5 . 719 . 176, 5 .696 , . 156, 5 . 695 . 753 , 5.693 . 648, 5 . 693 . 645, 5 . 691 . 346, 5 .686 .469, 5 . 686 .424 , 5.679. 705, 5 . 679 . 640, 5 . 670 .504, 5 . 665 . 774 , 5 . 665 . 772 , 5.648. 376, 5 . 639 .455, 5 . 633 . 277, 5 .624 . 930, 5 . 622 . 970, 5.605. 903, 5 . 604 . 229, 5 . 574 . 041, 5 . 565 , . 560, 5 . 550 . 233, 5.545. 734 , 5 . 540 . 931, 5 . 532 , . 248, 5 .527, . 820, 5 . 516 . 797, 5.514 . 688 , 5 . 512 .687, 5 . 506 .233, 5 . 506 , . 228 , 5 .494 . 895, 5.484. 788, 5 .470 . 857, 5 .464 , . 615, 5 .432 , . 183 , 5 .431 . 896, . 385. 918 , 5 . 349 . 061, 5 . 344 , . 925, 5 , . 330 , . 993 , 5 . 308 . 837, .290. 783 , 5 .290 . 772, 5 .284 , . 877, 5 , .284 , . 840 , 5 . 273 . 979, .262. 533, 5 .260 . 300, 5 .252 , . 732, 5 , . 250 . . 678 , 5 . 247 . 076, 5.244 . 896, 5 . 238 . 689, 5 .219 . .884, 5 , .208 . .241, 5 . 208 .228, 5.202. 332, 5 . 192 . 773, 5 .189 , . 042, 5 , .169. . 851, 5 . 162 .334, 5.151. 413, 5 . 149 . 701, 5 .147 . . 877, 5 , . 143 . . 918, 5 . 138 . 051, 5.093 . 338 , 5 .091 . 389 , 5 .068 . . 323 , 5 , . 068 , . 247 , 5 . 064 . 835, . 061. 728 , 5 . 055 . 290, 4 .981 . .792, 4 , , 810 . . 692, 4 . 410 . 696, 4.346.096, 4.342.769, 4.317.825, 4.256.766, 4.180.588, 4.000.275, 3.759.921;

Agentes imunomoduladores, como revelados nas Patentes

U.S. Nos 4 . 446 . 128, 4 . 524 . 147, 4 . 720. 484, 4 . 722 . 899, 4 . 748 . 018 , 4 . 877 .619, 4 . 998 . 931, 5 . 049 .387 , 5 . 118 . 509, . 152 . 980, 5 . 256 .416, 5 . 468 . 729, 5 . . 583 . 139, 5 . 604 . 234, . 612 . 060, 5 . 612 .350, 5 . 658 . 564 , 5 , . 672 . 605, 5 .681. 571, 5.708, . 002, 5 . 723 .718, 5 . 736 .143, 5 . . 744 . .495, 5 .753 . 687, 5.770, .201, 5 . 869 . 057 , 5 . 891 . 653 , 5 , . 939 .455, 5 . 948 . 407, 6.006, . 752 , 6 . 024 . 957, 6 . 030 . 624 , 6. . 037, .372, 6 . 037. 373 , 6.043. .247, 6 . 060 . 049, 6 . 087 . 096, 6 . , 096 , .315, 6 .099. 838, 6.103. . 235 , 6 . 124 .495, 6 . 153 . 203 , 6 . . 169 . 087 , 6 . 255 . 278, 6.262. . 044 , 6 .290 . 950, 6 . 306 . 651, 6 . . 322 , . 796, 6 . 329 . 153, 6.344. .476, 6 .352 .698, 6 . 365 . 163 , 6 . .379, . 668, 6 .391. 303, 6.395. . 767, 6 .403 . 555, 6 .410 . 556, 6 . .412, .492, 6 .468 . 537, 6.489. .330, 6 . 521 .232, 6 . 525 . 035, 6 . . 525 , . 242 , 6 . 558 . 663 , 6.572. . 860 ; Agentes analgésicos, como revelados nas Patentes U.S.

N' DD 5 . . 292.736, 5 .688.825 / 5.554.789, 5 .455 .230, 5 .292 . . 736 5 .298 . 522, 5 . 216 . 165, 5 .438 . 064 , 5 . 204 . 365 , 5 . 017 , . 578 4 . 906 . 655, 4 . 906 . 655, 4 .994 .450, 4 . 749. 792, 4 .980. . 365 4 . 794 . 110, 4 . 670 . 541, 4 .737 .493 , 4 . 622 . 326, 4 , . 536 . . 512 4 . 719 . 231, 4 . 533 . 671, 4 . 552 . 866 , 4 . 539. 312 , 4 . 569 . . 942 4 . 681 . 879, 4 . 511. 724 , 4 .556 . 672, 4 . 721. 712 , 4 .474 , . 806 4 . 595 . 686, 4 . 440 . 779, 4 .434 .175, 4 . 608 . 374 , 4 , .395. .402 4 .400 .534, 4 . 374 . 139, 4 .361 . 583 , 4 . 252 . 816, 4 .251. . 530 5 . 874 .459, 5 . 688 . 825 , 5 .554 .789, 5 . 455 . 230, 5 , .438 . . 064 5 . 298 . 522 , 5 . 216 . 165, 5 .204 .365, 5 . 030 . 639, 5 , . 017 . . 578 5 . 008 .264 , 4 . 994 . 450, 4 , .980 . 365, 4 . 906. 655, 4 , . 847 . , 290 4 . 844 . 907, 4 . 794 . 110, 4 .791 . 129, 4 . 774 . 256 , 4 , . 749 . .792 4.737. .493, 4 . 721. 712, 4 . 719 . 231, 4 . 681. .879, 4 . . 670 . . 541, 4.667, . 039, 4 . 658 . 037 , 4 . 634 , . 708, 4 , . 623 . . 648 , 4 , . 622 , .326, 4.608. . 374 , 4 . 595 . 686 , 4 . 594 . . 188, 4 . . 569 , . 942 , 4 . . 556 , . 672, 4.552. . 866, 4 . 539 . 312, 4 . 536 . . 512 , 4 . . 533 . . 671, 4 . . 511. . 724 , 4.440. . 779, 4 .434 . 175, 4 .400. . 534, 4 . .395 . .402, 4 , .391. . 827, 4.374. . 139, 4 .361. 583 , 4 . 322 , .420, 4 , . 306 . .097, 4 , .252 . . 816, 4.251. . 530, 4 . 244 . 955, 4 . 232 . . 018, 4 . .209 . . 520, 4 . . 164 . .514, 4.147. . 872 , 4.133.819, 4 . 124 . , 713, 4 . . 117 . .012, 4 . . 064 . .272, 4.022. . 836, 3.966.944; Agentes colinérgicos, como revelados nas Patentes U.S.

Nos 5.219.872, 5.219.873, 5.073.560, 5.073.560, 5.346.911, 5.424.301, 5.073.560, 5.219.872, 4.900.748, 4.786.648,

4.798.841, 4.782.071, 4.710.508, 5.482.938, 5.464.842, 5.378.723, 5.346.911, 5.318.978, 5.219.873, 5.219.872,

5.084.281, 5.073.560, 5.002.955, 4.988.710, 4.900.748,

4.798.841, 4.786.648, 4.782.071, 4.745.123, 4.710.508;

Agentes adrenérgicos, como revelados nas Patentes U.S.

N' DS ^ , 091 . 528, 5.091.528, 5.482.961, 4 . 835 . 157 , 4 . 363 .808, 4 . 285 . 873, 4 . 082 . 843, 4 . 835 . 157 , 5 . 708 . 015, 5 . 594 . 027, 5 .580 . 892, 5 . 576 . 332, 5 . 510 .376, 5 . 334 . 601, 5 . 202 .347, 5 . 135 . 926, 5. 116 . 867, 5 . 091. . 528, 5 . 017 . 618, 4 . 829 . 086, 4 . 579 .867, 4 . 568 . 679, 4 .469 . 690, 4 . 395 . 559, 4 . 381 .309, 4 .343 . 800, 4 . 329 . 289, 4 .314 , . 943 , 4 . 311. 708, 4 . 304 . 721, 4 .296 . 117, 4 . 281. 189, 4 .278 , . 608, 4 . 247 . 710, 4 . 145 . 550, 4 . 145 . 425 , 4 . 139 . 535, 4 .011. . 321, 4 . 001. 421, 3 . 982 . 010, 3 . 940 .407, 3.852.468, 3 . 832.470; Agentes anti- histamínicos , como revelados nas Patentes U .S. Nos 5.874.479, 5 . 863 . 938 , 5. 856 . 364 , 5 . 770 .612, 5 .702 . 688 , 5 . 674 . 912, 5 .663 . . 208 , 5. 658 . 957, 5 . 652 .274, 5 . 648 . 380, 5 . 646 . 190, 5 . 641. . 814 , 5 . 633 . 285, 5 . 614 . 561, '5.602.183, 4.923.892, 4.782.058, 4.393.210, 4.180.583 3.965.257, 3.946.022, 3.931.197;

Agentes esteróides, como revelados nas Patentes U.S

Nos 5.863.538, 5.855.907 / 5.855.866, I 5.780.592, 5 . 776 . 427 5.^651.987, 5.346 . 887, 5 .256. 408, 5 . 252 .319, 5, .209, . 926 4.996.335, 4 . 927 .807, 4 . 910 . 192, 4 . 710 .495, 4 , . 049 , . 805 4.004.005, 3 . 670 . 079, 3 . 608 . 076, 5 . 892 . 028 , 5 . , 888 . . 995 5.883.087, 5 . 880 .115, 5 . 869 . 475, 5 . 866 .558, 5 , . 861, .390 5.861.388, 5 . 854 . 235, 5 . 837 . 698, 5 . 834 .452, 5 , . 830 . . 886 5.792.758, 5 . 792 . 757, 5 . 763 . 361, 5 . 744 .462 , 5 , . 741, . 787 5.741.786, 5 . 733 . 899, 5 . 731. 345, 5 . 723 . 638 , 5 . . 721. . 226 5.712.264 , 5 . 712 .263, 5 . 710 . 144, 5 . 707 .984, 5 , . 705 . .494 5.700.793, 5 . 698 . 720, 5 . 698 . 545, 5 . 696 . 106, 5 . . 677 , .293 5.674.861, 5 . 661 .141, 5 . 656 . 621, 5 . 646 . 136 , 5 . . 637 . . 691 5.616.574, 5 . 614 . 514, 5 . 604 . 215, 5 . 604 .213, 5 , . 599 . .807 5.585.482, 5 . 565 . 588, 5 . 563 . 259 , 5 . 563 .131, 5 . . 561, . 124 5.556.845, 5 . 547 . 949, 5 . 536 . 714 , 5 . 527 .806, 5 . . 506 . . 354 5.506.221, 5.494 . 907, 5 .491. 136, 5 .478 . 956, 5 , .426. . 179 5.422.262, 5.391 . 776, 5 .382 . 661, 5 .380 . 841, 5 , . 380 . . 840 5.380 . 839, 5.373 . 095, 5 .371. 078, 5 .352 . 809, 5 . . 344 . . 827 5.344.826, 5.338 . 837, 5 .336 . 686, 5 .292 . 906, 5 . . 292 . . 878 5 . 281.587, 5 .272 . 140, 5 .244 . 886, 5 . 236 . 912, 5 . . 232 . . 915 5 . 219.879, 5.218 . 109, 5 .215 . 972 , 5 . 212 . 166, 5 . . 206 . .415 5.194.602, 5 .166 . 201, 5 .166 . 055, 5 . 126 . 488 , 5 . . 116 , . 829 5.108.996, 5. 099 . 037, 5 .096. 892, 5 . 093 . 502, 5 . . 086 . . 047 5.084.450, 5 . 082 . 835, 5 . 081. 114, 5 . 053 .404 , 5 . . 041. .433 5.041.432, 5 . 034 . 548 , 5 .032 . 586, 5 . 026 . 882, 4 . . 996 . .335 4.975.537, 4 . 970 . 205, 4 .954 . 446, 4 . 950 .428, 4 , . 946 , . 834 4.937.237, 4.921 . 846, 4 .920 . 099, 4 . 910 . 226, 4 . . 900 . . 725 4.892.867, 4 . 888, . 336, 4 .885 . 280, 4 . 882 .322, 4 , . 882 . .319 4.882, . 315, 4 . 874 . 855, 4 . 868 .167, 4 , . 865 .767 , 4.861.875, 4 . 861. . 765, 4 . 861. 763 , 4 . 847 . 014 , 4 . . 774 . 236, 4.753.932, 4.711. . 856, 4 . 710 . 495 , 4 . 701. .450, 4 . . 701 .449, 4.689.410, 4.680. , 290, 4 . 670 . 551, 4.664, . 850, 4 . . 659 . 516, 4.647.410, 4.634. , 695, 4 . 634 . 693 , 4.588. . 530, 4 . , 567 . 000 , 4.560.557, 4.558. , 041, 4 . 552 . 871, 4.552, . 868, 4 . . 541 . 956 , 4.519.946, 4.515. 787, 4.512.986, 4.502.989, 4 . 495 . 102; cujas revelações são aqui incorporadas por referência.

A porção de fármaco do conjugado pode ser o fármaco 10 inteiro ou um fragmento ou porção de ligação deste que retenha sua afinidade e especificidade pelo alvo de interesse tendo, ao mesmo tempo, um sítio de ligação para ligação covalente ao ligante de proteína do vetor ou vinculador. Os conjugados desses fármacos podem ser usados 15 para os mesmos distúrbios, doenças e indicações que os próprios fármacos.

iii. Agentes quimioterápicos ativos contra o câncer preferidos

Agentes quimioterápicos para o câncer preferidos para

2 0 uso nos conjugados de peptídeo cíclico da RAP da invenção incluem todos os fármacos que podem ser úteis para o tratamento de tumores cerebrais ou outra neoplasia no cérebro ou ao seu redor, na forma livre ou, caso não sejam tão úteis para tais tumores na forma livre, úteis quando 25 ligados ao peptídeo cíclico da RAP. Esses agentes quimioterápicos são preferivelmente agentes quimioterápicos citotóxicos que incluem, sem limitação, adriamicina (também conhecida como doxorrubicina), cisplatina, paclitaxel, análogos destes, e outros agentes quimioterápicos que 30 demonstram atividade contra tumores ex vivo e in vivo. Esses agentes quimioterápicos também incluem agentes .alquilantes, antimetabólitos, produtos naturais (tais como alcalóides da vinca, epidofilotoxinas, antibióticos, enzimas e modificadores da resposta biológica), inibidores 5 da topoisomerase, inibidores de microtúbulos, venenos para células fusiformes, hormônios e antagonistas, e agentes variados, tais como complexos de coordenação de platina, antracenodionas, uréias substituídas etc. Aqueles habilitados na técnica conhecerão outros agentes 10 quimioterápicos.

Radioisótopos citotóxicos úteis no tratamento de cânceres ou neoplasias, incluindo, sem limitação, 131I (iodo), 125I, 111In (índio), 90Y (ítrio) , 67Cu (cobre), 127Lu, (lutênio) , 212Bi (bismuto) , 213Bi, 255Fm (férmio), 149Tb 15 (térbio) , 223Rd (rádio) , 213pb (chumbo) , 212Pb, 211At (astatina) , 89Sr (estrôncio) , 153Sm (samário) , 166Ho (hólmio) , 225Ac (actínio) , 186Re (rênio) , 67Ga (gãlio) , 68Ga e 99mTc (tecnécio) , podem ser conjugados a um peptídeo da RAP cíclico da invenção. Os radioisótopos podem ser ligados ao

2 0 polipeptídeo com o uso de agentes quelantes de metal comuns na técnica para esse fim, incluindo, sem limitação, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclo-11-dodecano-N,N1,N1',N1'' tetracético (DOTA), ácido 1,4,8,11-tetra

azaciclotetradecano-Ν,Ν',N11,N'11-tetracético (TETA),

dietileno triamina penta-acetato (DTPA), ácido

dimercaptosuccínico (DMSA) , ácido tetra-azaciclotridecanoN,N1,N1',N'''-tetracético (TRITA) e ácido 1,5,9,1 3-tetraazaciclohexadecano-N,N1,N11,N111-tetracético (HETA),

hidroxietilideno difosfonato (HEDP) , HEXA e ácido etilenodiaminatetracético (EDTA) , que permitem a "carga" do radioisótopo sobre o polipeptídeo.

Agentes quimioterápicos preferidos são aqueles que, na forma livre, demonstram toxicidade sistêmica inaceitável nas doses desejadas. A toxicidade sistêmica geral associada 5 aos níveis terapêuticos desses agentes é reduzida por sua ligação a um peptídeo cíclico da RAP. São particularmente preferidos compostos cardiotóxicos que são substâncias terapêuticas úteis, mas que têm a dose limitada por cardiotoxicidade. Um exemplo clássico é adriamicina (também 10 conhecida como doxorrubicina) e seus análogos como, por exemplo, daunorrubicina. A ligação de um peptídeo cíclico da RAP a esses fármacos diminui o acúmulo e a cardiotoxicidade associada para o coração,

iv. Glicoconjugados Glicoconjugados são quaisquer moléculas que incluam

uma porção de carboidrato. Exemplos incluem, sem limitação, glicoproteínas, oligossacarídeos, glicolipídeos e

proteoglicanos. Essas moléculas possuem funções benéficas, tais como aumento da biodisponibilidade de agentes

2 0 terapêuticos ou da habilidade para bloquear mecanismos patogênicos. Por exemplo, a alfa-L-iduronidase é um glicoconjugado (glicoproteína) que está distribuído eficientemente por todo o corpo por causa do determinante de oligomanose 7-bisfosfato anexado à enzima. 0 sulfato de 25 heparina é uma porção de carboidrato de um proteoglicano que é útil para o bloqueio das vias da coagulação em seres humanos. A adesão de um peptídeo cíclico da RAP adequado aos glicoconjugados com atividades terapêuticas pode fornecer um meio para o aumento da potência do 30 glicoconjugado por afetar a biodistribuição. Alternativamente, as fusões de peptídeo cíclico da RAPglicoconjugado podem ser projetadas para atuar como moléculas de ligação de receptor biespecíficas com a habilidade para afetar diretamente as funções de um ou mais 5 receptores em tecidos específicos,

v. Nanopartículas

Nanopartículas são montagens macromoleculares construídas a partir de polímeros biodegradáveis e não biodegradáveis ou a partir de outros materiais como, por 10 exemplo, lipídeos. Essas montagens podem ser projetadas para conter moléculas terapêuticas em cavidades dentro da partícula. Desse modo, as nanopartículas fornecem um meio de alterar a biodistribuição, farmacocinética,

imunogenicidade e potência de fármacos. A adesão de um peptídeo cíclico da RAP adequado, por sua vez, forneceria um meio de aumentar a especificidade de distribuição tecidual dessas moléculas.

E. Métodos de produção de peptídeos cíclicos da RAP Os peptídeos da RAP são ciclizados preferivelmente por meio da formação de uma ligação covalente, que pode ser formada com o uso de qualquer um dos métodos descritos na técnica. Em algumas modalidades, a ligação covalente é formada entre um aminoácido no terminal N e um aminoácido no terminal C do peptídeo. Em algumas modalidades, a ligação covalente é formada entre as cadeias laterais dos dois aminoácidos terminais. Em outras modalidades, a ligação covalente é formada entre a cadeia lateral de um aminoácido terminal e o grupo terminal do outro aminoácido terminal, ou entre os grupos terminais de cada aminoácido terminal. Por exemplo, são possíveis ligações cabeça-cauda, cadeia lateral-cadeia lateral, cadeia lateral-cabeça, cadeia lateral-cauda.

Os peptídeos da RAP que ciclizam naturalmente podem ser facilmente projetados por inserção de duas cisteínas em 5 uma localização desejada, e permitindo-se que as cisteínas formem naturalmente uma ligação dissulfeto. Uma glicina ou uma prolina pode ser inserida interna às cisteínas (por exemplo, cisteína mais do terminal C ao terminal N e cisteína mais do terminal N ao terminal C) para minimizar

qualquer distorção estrutural pela ligação covalente da estrutura tridimensional nativa do peptídeo da RAP.

0 acoplamento de ciclização cabeça-cauda da amina terminal ao grupo carboxil terminal pode ser realizado com o uso de vários métodos, por exemplo, usando ésteres de p

nitrofenila, o método da azida, ésteres de 2,4,5- triclorofenila e pentafluorfenila, o método de anidrido misto, uma carbodiimida com catalisadores como, por exemplo, HOBt ou HONSu ou HoAt ou HATU, DIC, DCC, ou ciclização em resina.

Além disso, a estrutura cíclica pode ser formada com

um grupo em ponte, a cadeia lateral de um resíduo de aminoácido do peptídeo ou um resíduo de aminoácido terminal do peptídeo. Um grupo em ponte é uma porção química que permite a ciclização de duas porções do peptídeo. Exemplos

2 5 não limitantes de grupos em ponte incluem amidas,

tioéteres, tioésteres, dissulfetos, uréias, carbamatos, sulfonamidas, e semelhantes. São conhecidos na técnica vários métodos para a incorporação de unidades que possuem esses grupos em ponte. Por exemplo, pontes de lactama (ou

3 0 seja, amidas cíclicas) podem ser formadas por meio de cadeias laterais de aminoácidos que possuem aminas e ácidos carboxílicos, por exemplo, de lisina ou ornitina e ácido glutâmico ou ácido aspártico. Um tioéster pode ser formado entre o terminal Cea cadeia lateral de um resíduo de Cys.

5 Alternativamente, um tioéster pode ser formado por meio de cadeias laterais de aminoácidos que possuem um tiol e um ácido carboxílico.

Alternativamente, pode ser formado um entrecruzamento por incorporação de um resíduo de lantionina (tio10 dialanina) para ligar resíduos de alanina que estão unidos covalentemente por uma ligação tioéter. Em outro método, um agente de entrecruzamento, por exemplo, ácido dicarboxílico, por exemplo, ácido subérico (ácido octanodióico) etc., pode introduzir uma ligação entre dois 15 grupos funcionais de uma cadeia lateral do aminoácido, por exemplo, um grupo amino livre, hidroxil, tiol, e combinações destes.

Uma ciclização catalisada por enzima também pode ser usada. Por exemplo, foi relatado que o domínio de 20 tioesterase de tirocidina sintetase pode ser usado para ciclizar um precursor tioéster, um mutante de subtilisina para ciclizar ésteres de peptídeo glicolato fenilalanilamida, e anticorpo ligase 16G3 para catalisar a ciclização de um p-nitrofeniléster. Para uma revisão sobre 25 a ciclização de peptídeos, veja Davies, J. Peptide Sci., 9: 471-501 (2003), aqui incorporado por referência em sua totalidade.

F. Produção de peptídeos da RAP

i. Síntese

3 0 Os peptídeos da presente invenção podem ser 'sintetizados por técnicas de síntese peptídica de fase em solução, fase sólida ou fase líquida de acordo com técnicas convencionais. Vários sintetizadores automáticos são disponíveis comercialmente e podem ser usados de acordo com 5 protocolos conhecidos. Veja, por exemplo, Stewart e Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2a Edição, Pierce Chemical Co., (1984); Tam e cols. , J. Am. Chem. Soc. 105: 6.442, 1983; Merrifield, Science 232: 341-347, 1986; e Barany e Merrifield, "The Peptides, Gross and Meienhofer", eds, 10 Academic Press, Nova York, 1 284; Barany e cols., Int. J. Peptide Protein Res. 30: 705-739, 1987; Bodanszky, "The Principies of Peptide Synthesis", 2a Edição, Springer, Nova York (1993); e Molina e cols., Pept. Res. 9: 151-5, 1996, Patente U.S. N0 5.424.398, e Fischer e cols., Journal of 15 Peptide Science 8: 529-542, 2002, cada um aqui incorporado por referência.

Por exemplo, podem ser usadas técnicas de fase em solução como, por exemplo, um processo de azida, um processo de cloreto ácido, um processo de anidrido ácido, 20 um processo de anidrido misto, um processo de éster ativo (por exemplo, éster de p-nitrofenila, éster de N-hidróxisuccinimida ou éster de cianometil), um processo de carbodiimidazol, um processo oxirredutor ou um processo de diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo.

Os métodos de síntese peptídica de fase sólida usam um

copoli(estireno-divinilbenzeno) que contém 0,1-1,0 mMol de aminas/g polímero. Esses métodos para síntese peptídica utilizam proteção de butiloxicarbonil (t-BOC) ou 9- fluorenilmetiloxi-carbonil (FMOC) de grupos alfa-amino.

3 0 Ambos os métodos envolvem a síntese em etapas, pela qual um único aminoácido é adicionado a cada etapa, começando no terminal C do peptídeo (veja Coligan, e cols., "Current Protocols in Immunology", Wiley Interscience, 1991, Unidade 9) . Ao término da síntese química, os peptídeos podem ser 5 desprotegidos para remover os grupos de bloqueio de aminoácido t-BOC ou FMOC e clivados do polímero por tratamento com ácido em temperatura reduzida (por exemplo, HF líquido-anisol 10% por cerca de 0,25 a cerca de 1 horas a 0°C) . Após evaporação dos reagentes, os peptídeos são 10 extraídos do polímero com solução de ácido acético 1%, que é então liofilizado para gerar o material bruto. 0 material bruto pode normalmente ser purificado por técnicas como filtração em gel em Sefadex G-15 usando ácido acético 5% como solvente. A liofilização de frações apropriadas da 15 coluna irá gerar o peptídeo ou derivado peptídico homogêneo, que pode então ser caracterizado por técnicas padronizadas como, por exemplo, análise de aminoácido, cromatografia de camada delgada, cromatografia líquida de alto desempenho, espectroscopia por absorção de

2 0 ultravioleta, rotação molar, solubilidade, e quantificado pela degradação em fase sólida de Edman.

As técnicas de fase líquida incluem a montagem sintética de cadeias polipeptídicas de forma reversível ligadas ao polietileno glicol, que é um híbrido entre as 25 químicas tradicionais de fase em solução e sólida. 0 processo pode ser realizado com o uso das técnicas de Nfluorenilmetoxicarbonil comumente usadas em síntese peptídica de fase sólida e íons fluoreto usados no lugar de base orgânica convencional de piperidina para a etapa 30 repetitiva de desproteção amino. Veja Fischer e cols., 'Journal of Peptide Science 8: 529-542, 2002.

ii. Células hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir proteínas quiméricas são células bacterianas, de leveduras, de insetos, de vertebrados não mamíferos ou de mamíferos; as células de mamíferos incluem, sem limitação, hamster, macaco, chimpanzé, cão, gato, bovinos, suínos, camundongo, rato, coelho, carneiro e células humanas. As células hospedeiras podem ser células imortalizadas (uma linhagem celular) ou células não imortalizadas (primárias ou secundárias) , e podem ser qualquer um de uma ampla variedade de tipos de células, tais como, sem limitação, fibroblastos, queratinócitos, células epiteliais (por exemplo, células epiteliais mamárias, células epiteliais intestinais), células do ovário (por exemplo, células de ovário de hamster chinês ou células CHO), células endoteliais, células gliais, células neurais, elementos formados do sangue (por exemplo, Iinfócitos, células da medula óssea), células musculares, hepatócitos e precursores desses tipos de células somáticas. As células hospedeiras podem incluir mutantes de células CHO que não expressam LRP como, por exemplo, CH013-5-1 (FitzGerald e COls., J. Biol. Chem., 129(6): 1.533-41, 1995).

As células que contêm e expressam DNA ou RNA que codifica a proteína quimérica são aqui denominadas células modificadas geneticamente. Células de mamíferos que contêm e expressam DNA ou RNA que codifica a proteína quimérica são denominadas células de mamíferos modificadas geneticamente. A introdução do DNA ou RNA nas células é feita por um método de transfecção conhecido como, por exemplo, eletroporação, microinjeção, bombardeamento com microprojéteis, precipitação com fosfato de cálcio, precipitação com fosfato de cálcio modificada, tratamento com lipídeo catiônico, fotoporação, metodologias de fusão, 5 transferência mediada por receptor ou precipitação com polibreno. Alternativamente, o DNA ou RNA pode ser introduzido por infecção com um vetor viral. Métodos de produção de células, incluindo células de mamíferos, que expressam DNA ou RNA que codifica uma proteína quimérica 10 são descritos nas Patentes U.S. Nos 6.048.729, 5.994.129 e 6.063.630. Os ensinamentos de cada um desses pedidos são aqui expressamente incorporados por referência em sua totalidade.

iii. Construções de ácido nuclêico Uma construção de ácido nuclêico usada para expressar

a proteína quimérica pode ser aquela que é expressa extracromossomicamente (no epissoma) na célula de mamífero transfectada ou aquela que se integra, aleatoriamente ou em um sítio-alvo pré-selecionado por meio de recombinação

2 0 homóloga, no genoma das células receptoras. Uma construção

que é expressa extracromossomicamente compreende, além das seqüências codificadoras da proteína quimérica, seqüências suficientes para expressão da proteína nas células e, opcionalmente, para replicação da construção. Ela 25 tipicamente inclui um promotor, DNA codificador da proteína quimérica e um sítio de poliadenilação. O DNA que codifica a proteína quimérica é posicionado na construção de tal forma que sua expressão esteja sob o controle do promotor. Opcionalmente, a construção pode conter componentes

3 0 adicionais, tais como um ou mais dos seguintes: um sítio de 'splice, uma seqüência intensificadora, um gene de marcador selecionável sob o controle de um promotor apropriado, e um gene de marcador amplificável sob o controle de um promotor apropriado.

5 Naquelas modalidades em que a construção de DNA se

integra no genoma das células, ela precisa incluir apenas as seqüências de ácidos nucléicos codificadoras da proteína quimérica. Opcionalmente, ela pode incluir um promotor e uma seqüência intensificadora, um sítio ou sítios de 10 poliadenilação, um sítio ou sítios de splice, seqüências de ácidos nucléicos que codificam um marcador ou marcadores selecionáveis, seqüências de ácidos nucléicos que codificam um marcador amplificável e/ou DNA homólogo ao DNA genômico na célula receptora à integração direcionada do DNA em um 15 sítio selecionado no genoma (seqüências de direcionamento de DNA ou DNA).

iv. Métodos de cultura de células

Células de mamíferos que contêm o DNA ou RNA codificador da proteína quimérica são cultivadas sob

2 0 condições adequadas ao crescimento das células e expressão do DNA ou RNA. Aquelas células que expressam a proteína quimérica podem ser identificadas com o uso de métodos conhecidos e métodos aqui descritos, e a proteína quimérica isolada e purificada com o uso de métodos conhecidos e 25 métodos também aqui descritos, com ou sem a amplificação da produção da proteína quimérica. A identificação pode ser realizada, por exemplo, por meio da avaliação de células de mamíferos modificadas geneticamente que exibem um fenótipo indicativo da presença de DNA ou RNA que codifica a 30 proteína quimérica, por exemplo, avaliação por PCR, avaliação por análise Southern Jblot, ou avaliação quanto ã expressão da proteína quimérica. A seleção de células que possuem DNA codificador da proteína quimérica incorporado pode ser feita pela inclusão de um marcador selecionável na 5 construção de DNA e pelo cultivo das células transfectadas ou infectadas que contêm um gene de marcador selecionável sob condições adequadas à sobrevida apenas daquelas células que expressam o gene de marcador selecionável. A amplificação adicional da construção de DNA introduzida 10 pode ser influenciada pelo cultivo de células de mamíferos modificadas geneticamente sob condições adequadas à amplificação (por exemplo, cultivo de células de mamíferos modificadas geneticamente que contêm um gene de marcador amplificável na presença de uma concentração de um fármaco 15 no qual apenas as células que contêm múltiplas cópias do gene de marcador amplificável possam sobreviver).

As células de mamíferos modificadas geneticamente que expressam a proteína quimérica podem ser identificadas, como aqui descrito, por detecção do produto de expressão. 20 Por exemplo, células de mamíferos que expressam proteína quimérica nas quais o veículo é um peptídeo cíclico da RAP podem ser identificadas por um imunoensaio de enzima em sanduíche. Os anticorpos podem ser dirigidos contra a porção de RAP ou a porção de agente ativo do conjugado.

v. Purificação de peptídeos da RAP

Os peptídeos da RAP podem ser purificados por meio de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) com o uso de métodos bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, "The Handbook of Analysis and

3 0 Purificação of Peptides and Proteins by Reversed-Phase “HPLC" , 3a Edição, Grace Vydac, W.R. Grace & Co., Columbia, MD (2002) . Gradientes de acetonitrila e água com ácido trifluoracético são freqüentemente usados como eluente. RPHPLC preparativa é usada rotineiramente para purificar 5 peptídeos sintéticos em quantidades de miligrama e grama, e para purificar quantidades de mg a kg de polipeptídeos produzidos de forma recombinante para uso terapêutico.

Os peptídeos da RAP também podem ser produzidos e purificados como descrito em WO 2006/138343 (Zankel e cols.), aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Os peptídeos da RAP também podem ser purificados por cromatografia por afinidade em glóbulos de agarose acoplados aos pares de CR apropriados. Essa técnica pode ser usada isoladamente ou como uma etapa adicional após a 15 purificação por RP-HPLC. Fragmentos de proteína que contém CR que compreende pares ou tripletos de CR são preparados da seguinte forma: fragmentos de DNA que codificam cada par ou tripleto de CR são amplificados por PCR de cDNA humano (BD Biosciences Marathon-ready®) usando polimerase e 20 reagentes HotStart PfuTurbo® (Stratagene). Cada fragmento amplificado é digerido seqüencialmente com BamHI e HindIII e depois ligado em pET30(+)a (EMD Biosciences) digerido de forma similar. Os plasmídeos resultantes codificam fragmentos de proteína que consistem em hexahistidina do 25 terminal N e S-peptídeos fundidos ao fragmento de CR. Todas as construções de expressão são seqüenciadas para verificar a integridade do inserto. Cada plasmídeo é então usado para transformar células BL21(DE3) CodonPlus-RIPL® (Stratagene). 0 fragmento de CR é expresso e re-dobrado como descrito

3 0 previamente, e purificado por cromatografia com Ni-NTA de * acordo com protocolos do fabricante (Qiagen) . Os glóbulos de agarose ativados (AffiGel 15, Bio-Rad) são transferidos para uma coluna plástica vitrificada de 10 ml (Pierce) . Os glóbulos são lavados duas vezes com três volumes de HEPES 5 10 mM, 100 mM de NaCl suplementado com tampão de CaCl2 5 mM. O fragmento de CR (2,5 mg/ml de glóbulos compactados em cinco volumes de coluna do mesmo tampão) é então adicionado e a mistura incubada de um dia para o outro com mistura em temperatura ambiente. Os glóbulos são então lavados com 10 tampão até que não haja mais proteína no eluato, como medido pelo ensaio de Bradford. Os glóbulos são armazenados em etanol 2 0% até o uso. Os peptídeos da RAP em TBS são adicionados aos glóbulos ligados à CR equilibrados (1 mg/ml de glóbulos compactados) e incubados com mistura em 15 temperatura ambiente por 2 horas. Os glóbulos são lavados com o mesmo tampão e os peptídeos ligados são eluídos em TBS suplementado com EDTA 10 0 mM.

G. Caracterização de conjugados de RAP i. Marcadores

2 0 Em algumas modalidades, o peptídeo cíclico da RAP ou

conjugado deste é marcado para facilitar sua detecção. Um "marcador" ou uma "porção detectãvel" é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos, ou outros meios 25 físicos. Por exemplo, marcadores adequados para uso na presente invenção incluem, por exemplo, marcadores radioativos (por exemplo, 32P) , fluoróforos (por exemplo, fluoresceína), reagentes eletrodensos, enzimas (por exemplo, como comumente usadas em um ELISA), biotina,

3 0 digoxigenina, ou haptenos e proteínas que podem ser ‘tornadas detectáveis, por exemplo, por incorporação de um marcador radioativo no hapteno ou peptídeo, ou usados para detectar anticorpos especificamente reativos com o hapteno ou peptídeo.

5 Como observado acima, dependendo do ensaio de

avaliação empregado, o agente ativo, o vinculador ou o peptídeo cíclico da porção RAP de um conjugado pode ser marcado. O grupo marcador ou detectável em particular usado não é um aspecto crítico da invenção, desde que ele não 10 interfira significativamente com a atividade biológica do conjugado. O grupo detectável pode ser qualquer material que possua uma propriedade física ou química detectável. Dessa forma, um marcador é qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, 15 imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos.

Exemplos de marcadores adequados para uso na presente invenção incluem, sem limitação, corantes fluorescentes (por exemplo, fluoresceína isotiocianato, vermelho Texas, rodamina, e semelhantes) , marcadores radioativos (por 20 exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P) , enzimas (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina e outras comumente usadas em um ELISA), e marcadores colorimétricos, tais como ouro coloidal ou vidro incolor ou glóbulos plásticos (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex 25 etc.).

0 marcador pode ser acoplado direta ou indiretamente ao componente desejado do ensaio de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. De preferência, o marcador em uma modalidade é ligado covalentemente ao biopolímero com o uso

3 0 de um reagente de isocianato para conjugação de um agente ativo de acordo com a invenção. Em um aspecto da invenção, os reagentes de isocianato bifuncionais da invenção podem ser usados para conjugar um marcador a um biopolímero para formar um conjugado de biopolímero marcador sem um agente 5 ativo a ele anexado. 0 conjugado do biopolímero marcador pode ser usado como um intermediário para a síntese de um conjugado marcado de acordo com a invenção, ou pode ser usado para detectar o conjugado do biopolímero. Como indicado acima, pode ser usada uma ampla variedade de 10 marcadores, com a escolha do marcador dependendo da sensibilidade necessária, facilidade de conjugação com o componente desejado do ensaio, necessidades de estabilidade, instrumentação disponível e suprimento de descarte. Marcadores não reativos são freqüentemente 15 anexados por meios indiretos. Geralmente, uma molécula ligante (por exemplo, biotina) é ligada covalentemente à molécula. O ligante se liga a outras moléculas (por exemplo, estreptavidina), que é inerentemente detectável ou se liga covalentemente a um sistema sinalizador, por 20 exemplo, uma enzima detectável, um composto fluorescente ou um composto quimioluminescente.

Os conjugados também podem ser conjugados diretamente a compostos geradores de sinais, por exemplo, por conjugação com uma enzima ou fluoróforo. Enzimas adequadas 25 para uso como marcadores incluem, sem limitação, hidrolases, particularmente fosfatases, esterases e glicosidases ou oxidotases, particularmente peroxidases. Compostos fluorescentes, ou seja, fluoróforos, adequados para uso como marcadores incluem, sem limitação, 30 fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona etc. Exemplos adicionais de fluoróforos adequados incluem, sem limitação, eosina, TRITC-amina, quinina, fluoresceína W, amarelo acridina, lissamina rodamina, B sulfonil cloreto de eritrosceína, 5 rutênio (tris, bipiridínio) , vermelho Texas, dinucleotídeo de nicotinamida adenina, dinucleotídeo de flavina adenina etc.

Compostos quimioluminescentes adequados para uso como marcadores incluem, sem limitação, luciferina e 2,3- 10 diidroftalazinadionas, por exemplo, luminol. Para uma revisão sobre vários sistemas de marcação ou produtores de sinais que podem ser usados nos métodos da presente invenção, veja Patente a U.S. N0 4.391.904.

Meios para a detecção de marcadores são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Dessa forma, por exemplo, quando o marcador for um marcador radioativo, os meios para detecção incluirão um contador de cintilação ou película fotográfica como uma auto-radiografia. Quando o marcador for um marcador fluorescente, ele poderá ser detectado por excitação do fluoróforo com o comprimento de onda de luz apropriado e detecção da fluorescência resultante. A fluorescência pode ser detectada visualmente pelo uso de detectores eletrônicos, tais como dispositivos de carga acoplada (CCDs) ou fotomultiplicadores e semelhantes. Similarmente, marcadores enzimáticos podem ser detectados por fornecimento dos substratos apropriados para a enzima e detecção do produto de reação resultante. Marcadores colorimétricos ou quimioluminescentes podem ser detectados simplesmente observando-se a cor associada ao marcador. Outros sistemas de marcação e detecção adequados para uso nos métodos da presente invenção serão facilmente evidentes para aqueles habilitados na técnica. Esses moduladores e ligantes marcados podem ser usados no diagnóstico de uma doença ou condição de saúde.

5 ii. Ensaios de avaliação para conjugados e moduladores

de sua liberação

A presente invenção fornece um ensaio de avaliação para conjugados de peptídeo cíclico da RAP, em que os conjugados são testados quanto à sua habilidade para influenciar uma atividade mensurável de um receptor específico que pode estar situado em uma célula inteira, um extrato celular, semipurificado, purificado ou qualquer outro formato que permita a medida de sua atividade. A atividade pode ser qualquer atividade na expressão, função ou degradação de proteína que contém CR, incluindo, por exemplo, a quantidade ou momento dessas atividades. Essas atividades incluem, por exemplo, transcrição, processamento do transcrito, estabilidade da tradução ou do transcrito da seqüência gênica do receptor ou transcrito de mRNA. Essas atividades incluem, por exemplo, a síntese de novo receptor, a localização subcelular do receptor e a ativação da atividade biológica do receptor. Essas atividades incluem, por exemplo, a habilidade do receptor para se ligar a substâncias, adotar conformações, catalisar reações, se ligar a ligantes conhecidos e semelhantes. Essas atividades incluem, por exemplo, a quantidade ou estabilidade do receptor, o processamento e remoção ou degradação do receptor, e semelhantes. Em modalidades preferidas, o peptídeo cíclico da RAP usado é aquele que foi modificado ou que naturalmente possui uma afinidade de ligação maior pelo receptor visado do que por qualquer outro receptor.

A invenção contempla diversos formatos de avaliação diferentes. Alguns designs são considerados de baixo 5 rendimento e testam apenas um ou poucos compostos em série ou em paralelo. Ensaios de avaliação de alto rendimento são adequados para a avaliação de dezenas de milhares ou centenas de milhares de compostos em questão de semanas ou meses. Formatos de avaliação "in silico" empregam técnicas 10 de design lógico auxiliadas por computador para identificar moduladores potenciais da atividade biológica.

H. Composições farmacêuticas e sua administração Os conjugados e moduladores podem ser administrados por diversas vias. Para preparações orais, os conjugados podem ser usados isoladamente ou em combinação com aditivos apropriados para a produção de comprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, tais como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com aglutinantes, tais como celulose cristalina, derivados 2 0 de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegrantes, tais como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose sódica; com lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio; e, se desejado, com diluentes, agentes de tamponamento, agentes umidificantes, conservantes e agentes flavorizantes.

Os conjugados e moduladores podem ser formulados em preparações para injeção por sua dissolução, suspensão ou emulsificação em um solvente aquoso ou não aquoso, tais como óleos vegetais ou outros óleos similares, glicerídeos ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno glicol; e, se desejado, com aditivos convencionais, tais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, estabilizantes e conservantes.

5 Os conjugados, moduladores e ligantes de LDLR podem

ser utilizados em formulação em aerossol para serem administrados por meio de inalação. Os compostos da presente invenção podem ser formulados em propelentes pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluormetano, propano, nitrogênio e semelhantes.

Além disso, os conjugados e moduladores podem ser feitos em supositórios por mistura com diversas bases como, por exemplo, bases emulsificantes ou bases hidrossolúveis. Os compostos da presente invenção podem ser administrados 15 por via retal por meio de um supositório. O supositório pode incluir veículos como, por exemplo, manteiga de cacau, carbowaxes e polietileno glicóis, que se derretem na temperatura corporal, embora estejam solidificados em temperatura ambiente.

2 0 Podem ser fornecidas formas de dosagem unitária do

conjugado, modulador e ligante de LDLR para administração oral ou retal como, por exemplo, xaropes, elixires e suspensões, em que cada unidade de dosagem, por exemplo, uma colher de chá cheia, colher de sopa cheia, comprimido 25 ou supositório, contém uma quantidade predeterminada da composição que contém o agente ativo. Similarmente, formas de dosagem unitária para injeção ou administração intravenosa podem compreender o conjugado em uma composição como uma solução em água estéril, solução salina normal ou 30 outro veículo farmaceuticamente aceitável. No uso prático, o conjugado, modulador e ligante de LDLR de acordo com a invenção pode ser combinado como o ingrediente ativo em uma mistura íntima com um veículo farmacêutico de acordo com técnicas convencionais de 5 produção de compostos farmacêuticos. 0 veículo pode assumir uma ampla variedade de formas, dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, oral ou parenteral (incluindo intravenosa). Na preparação das composições para a forma de dosagem oral, qualquer um dos 10 meios farmacêuticos usuais pode ser empregado como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes flavorizantes, conservantes, agentes corantes e semelhantes, no caso de preparações orais líquidas como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções; ou veículos 15 como, por exemplo, amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desintegração e semelhantes, no caso de preparações orais sólidas como, por exemplo, pós, cápsulas duras e macias e comprimidos, com as 2 0 preparações sólidas orais sendo preferidas em relação às preparações líquidas.

Com relação às vias de administração transdérmicas, os métodos para a administração transdérmica de fármacos são revelados em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17* 25 Edição, (Gennaro e cols. Eds. Mack Publishing Co., 1985). Emplastros dérmicos ou cutâneos são um meio preferido para liberação transdérmica dos conjugados, moduladores e ligantes de LRP da invenção. Emplastros preferivelmente fornecem um intensificador da absorção como, por exemplo, 30 DMSO, para aumentar a absorção dos compostos. Outros métodos para a liberação transdérmica de fármacos são revelados nas Patentes U.S. Nos 5.962.012, 6.261.595 e 6.261.595, cada uma delas é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

5 Em modalidades específicas, contempla-se que a

administração terapêutica dos conjugados aqui descritos será feita por via intratecal no LCR. A administração intratecal da presente invenção pode compreender a introdução da composição farmacêutica em um ventrículo 10 cerebral. Alternativamente, a administração intratecal pode compreender a introdução da composição farmacêutica na área lombar. Ainda em outra modalidade alternativa, a administração intratecal compreende a introdução da composição farmacêutica na cisterna magna. Qualquer um 15 desses tipos de administração é feito preferivelmente por meio de uma injeção em bolo. Dependendo da gravidade dos sintomas e da responsividade do indivíduo à terapia, essa injeção em bolo pode ser administrada uma vez por semana, uma vez por mês, uma vez a cada 6 meses ou anualmente. Em

2 0 outras modalidades, a administração intratecal é obtida pelo uso de uma bomba de infusão. Evidentemente, a substância farmacêutica poderia ser administrada por via intratecal continuamente ao longo de um período de pelo menos vários dias ou, alternativamente, a administração 25 intratecal é administrada continuamente ao longo de um período de pelo menos quatro semanas. Evidentemente, quando a administração foi por meio de infusão contínua, a taxa de administração da dose da reposição de enzima pode ser grandemente reduzida, comparada com a administração de 30 injeção em bolo. Em modalidades preferidas, o agente ativo do conjugado é iduronidase e ele é liberado em uma quantidade que compreende cerca de 1 mg de iduronidase/20 kg de peso corporal do mamífero que está sendo tratado para MPS. Em modalidades particulares, a dose acima é liberada 5 para 15 cc de LCR. Nessa concentração, contempla-se que a concentração de enzima será de 18.000 unidades por ml de LCR. Deve-se entender que a dosagem mencionada anteriormente é meramente uma dosagem exemplar, e aqueles habilitados na técnica compreenderão que essa dosagem pode 10 ser variada.

Os métodos e as composições da invenção podem ser combinados com métodos e composições de indução de tolerância específica ao antígeno, antes da terapia de reposição de enzima. Tais métodos, que incluem a indução de 15 tolerância específica ao antígeno, compreendem a administração de um agente imunossupressor, como, por exemplo, ciclosporina A, e podem ainda compreender a administração de um agente antiproliferativo, incluindo, sem limitação, um análogo de nucleotídeo ou um 2 0 antimetabólito. 0 agente antiproliferativo pode ser azatioprina. Métodos adicionais são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. N0 10/141.668, publicado como Publicação U.S. N0 20030211113; e Pedido de Patente U.S. N0 10/429.314 publicado como Publicação U.S. N0 20040009906,

2 5 cada um deles aqui incorporado por referência.

Excipientes farmaceut i camente aceitáveis, tais como veículos, adjuvantes, veículos ou diluentes, são disponíveis comercialmente. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes

3 0 de ajuste do pH e de tamponamento, agentes de ajuste da tonicidade, estabilizantes, agentes umidificantes e semelhantes, são disponíveis comercialmente.

Aqueles habilitados na técnica observarão facilmente que os níveis de dose podem variar em função do composto 5 específico, da gravidade dos sintomas e da suscetibilidade do indivíduo aos efeitos colaterais. Dosagens preferidas para certo composto são facilmente determináveis por aqueles habilitados na técnica por vários meios, incluindo, sem limitação, avaliações de resposta-dose e 10 farmacocinéticas realizadas em pacientes, animais de teste e in vitro.

Em cada um desses aspectos, as composições incluem, sem limitação, composições adequadas para administração oral, retal, tópica, parenteral (incluindo subcutânea, 15 intramuscular e intravenosa) , pulmonar (inalação nasal ou bucal) ou nasal, embora a via mais adequada em certo caso dependerá, em parte, da natureza e da gravidade das condições tratadas e da natureza do ingrediente ativo. Vias de administração exemplares são as vias oral e intravenosa.

2 0 As composições podem ser apresentadas convenientemente em forma de dosagem unitária e preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia.

No uso prático, os moduladores de acordo com a invenção podem ser combinados como o ingrediente ativo em 25 uma mistura íntima com um veículo farmacêutico de acordo com técnicas convencionais de produção de compostos farmacêuticos. 0 veículo pode assumir uma ampla variedade de formas, dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, administração oral ou 30 parenteral (incluindo intravenosa). Na preparação das composições para a forma de dosagem oral, qualquer um dos meios farmacêuticos usuais pode ser empregado como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes flavorizantes, conservantes, agentes corantes e 5 semelhantes, no caso de preparações orais líquidas como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções; ou veículos como, por exemplo, amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desintegração e 10 semelhantes, no caso de preparações orais sólidas como, por exemplo, pós, cápsulas duras e macias e comprimidos, com as preparações sólidas orais sendo preferidas em relação às preparações líquidas.

Por causa de sua facilidade de administração, 15 comprimidos e cápsulas representam a forma de unidade de dosagem oral mais vantajosa, em que veículos farmacêuticos sólidos são obviamente empregados. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos por técnicas aquosas ou não aquosas padronizadas. A percentagem de um composto

2 0 ativo nessas composições pode, evidentemente, ser variada e

pode convenientemente estar entre cerca de 2 por cento e cerca de 6 0 por cento do peso da unidade.

Os conjugados, moduladores e ligantes da invenção são úteis para intervenção terapêutica, profilática e 25 diagnostica em animais e, em particular, em seres humanos. Como aqui descrito, os conjugados mostram acúmulo e/ou liberação preferencial do agente ativo em qualquer órgão, compartimento ou sítio-alvo, dependendo do biopolímero usado.

3 0 As composições da presente invenção podem ser administradas encapsuladas ou anexadas aos envelopes ou vesículas virais, ou incorporadas em células. Vesículas são partículas micelares que são normalmente esféricas e que são freqüentemente lipídicas. Lipossomos são vesículas 5 formadas por uma membrana bicamada. Vesículas adequadas incluem, sem limitação, vesículas unilamelares e vesículas ou lipossomos lipídicos multilamelares. Essas vesículas e esses lipossomos podem ser feitos a partir de uma ampla gama de compostos lipídicos ou fosfolipídicos, tais como 10 fosfatidilcolina, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina, glicolipídeos, gangliosídeos etc. com o uso de técnicas padronizadas como, por exemplo, aquelas descritas, por exemplo, na Patente U.S. N0 4.394.448. Essas vesículas ou esses lipossomos 15 podem ser usados para administrar compostos intracelularmente e para liberar compostos aos órgãos-alvo. A liberação controlada de uma composição p97 de interesse também pode ser obtida com o uso de encapsulação (veja, por exemplo, a Patente U.S. N0 5.186.941).

Qualquer via de administração que libere a composição

de conjugado de agente ativo de peptídeo cíclico da RAP ou modulador na corrente sangüínea, ou preferivelmente pelo menos fora da barreira hematencefálica, pode ser usada. De preferência, a composição é administrada perifericamente, 25 mais preferivelmente por via intravenosa ou por cateter cardíaco. Injeções intrajugulares e intracarotídeas também são úteis. As composições podem ser administradas local ou regionalmente, por exemplo, por via intraperitoneal ou subcutânea ou intramuscular. Em um aspecto, as composições 30 são administradas com um diluente ou veículo farmacêutico adequado.

As dosagens a serem administradas dependerão das necessidades individuais, do efeito desejado, do agente ativo usado, do biopolímero e da via de administração 5 escolhida. As dosagens preferidas de um conjugado variam de cerca de 0,2 pmol/kg a cerca de 25 nmol/kg, e dosagens particularmente preferidas variam de 2-250 pmol/kg; alternativamente, doses preferidas do conjugado estarão na faixa de 0,02 a 2.000 mg/kg. Essas dosagens serão 10 influenciadas pelo número de porções de agente ativo ou de fármaco associadas ao biopolímero. Alternativamente, as dosagens podem ser calculadas com base no agente ativo administrado.

Em modalidades preferidas, o conjugado compreende um 15 peptídeo cíclico da RAP. Por exemplo, doses de peptídeo cíclico da RAP-adriamicina que consistem em 0,005 a 100 mg/kg de adriamicina também são úteis in vivo. É particularmente preferida uma dosagem de peptídeo cíclico da RAP-adriamicina que consiste em 0,05 mg/kg a 20 mg/kg de 20 adriamicina. Aqueles habilitados na técnica podem determinar doses adequadas para os compostos ligados a um peptídeo cíclico da RAP com base, em parte, na dosagem recomendada usada para a forma livre do composto. A conjugação do agente ativo a um peptídeo cíclico da RAP

2 5 geralmente reduz a quantidade de fármaco necessária para obter o mesmo efeito.

Os conjugados e moduladores da invenção são úteis para intervenção terapêutica, profilática e diagnostica em animais e, em particular, em seres humanos. Os compostos de peptídeo cíclico da RAP podem mostrar acúmulo preferencial em tecidos particulares. Indicações médicas preferidas para usos diagnósticos incluem, por exemplo, qualquer condição associada a um órgão-alvo de interesse (por exemplo, pulmão, fígado, rim, baço). Em modalidades particularmente 5 preferidas, o órgão-alvo de interesse é o cérebro.

Os métodos em questão encontram utilidade no tratamento de diversas condições de doença diferentes. Em certas modalidades, é de interesse particular o uso dos métodos em questão em condições de doença nas quais um 10 agente ativo ou fármaco que possui a atividade desejada foi previamente identificado, mas nas quais o agente ativo ou fármaco não é liberado adequadamente ao local, área ou compartimento-alvo para produzir um resultado terapêutico plenamente satisfatório. Com esses agentes ativos ou 15 fármacos, os métodos em questão de conjugação do agente ativo a um peptídeo cíclico da RAP podem ser usados para aumentar a eficácia terapêutica e o índice terapêutico do agente ativo ou fármaco.

Diversos hospedeiros ou indivíduos são tratáveis de 20 acordo com os métodos em questão. Geralmente, esses hospedeiros são "mamíferos" , em que esses termos são usados de forma ampla para descrever organismos que estão dentro da classe Mawmalia, incluindo as ordens de carnívoros (por exemplo, cães e gatos), roedores (por exemplo, camundongos, 25 porquinhos-da-índia e ratos), e primatas (por exemplo, seres humanos, chimpanzés e macacos). Em muitas modalidades, os hospedeiros serão seres humanos.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar

3 0 modalidades preferidas da invenção. Deve ser observado por aqueles habilitados na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor para terem um bom funcionamento na prática da invenção e, dessa forma, podem ser consideradas como 5 constituindo modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles habilitados na técnica, à luz da presente revelação, devem observar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obtêm um resultado parecido ou similar, sem se

afastar do espírito e do escopo da invenção. Os exemplos a seguir fornecem protocolos exemplares para a geração, isolamento e caracterização da interação de peptídeos cíclicos da RAP com seus receptores preferidos.

EXEMPLO 1

Geração e análise de variantes de RAP

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais - O vetor de apresentação em fago M13 foi de Maxim Biotechnology. Vetor de expressão pET30(+)a e reagentes de purificação S-tag foram de EMD Biosciences.

Anticorpos anti-RAP foram produzidos em BioMarin Pharmaceutical, Inc. As enzimas de restrição e T4 DNA ligase foram de New England Biolabs. Um seqüenciador de DNA automatizado ABI 3100 da Avant foi usado para geração e análise de dedos de seqüências. Os reagentes de purificação

2 5 de tag de hexahistidina foram de Qiagen. 0 anticorpo

policlonal anti-RAP foi descrito previamente (49) .

Expressão, re-dobragem e purificação de proteínas de CR - Outros demonstraram elegantemente que as proteínas de CR podem ser expressas, purificadas e re-dobradas até sua

3 0 forma nativa in vitro [45, 50-54) . Para o trabalho aqui descrito, as seguintes seqüências de CR foram selecionadas para esse processo: um tripleto de CR de LRP6 (CR1-3), os dois pares de CR de LRP6 dentro do tripleto (CRI e 2, denominados CR12, CR2 e 3, denominados CR23), um tripleto 5 de CR de VLDLR humano (CR6 - 8) , um par de CR de VLDLR (CR78) , um tripleto de CR de LRP2 (CR34-36) , dois pares de CR de LRP2 (CR89, CR3435) , três pares de CR de matriptase/ST14/TADG-15 (CR12, CR23 e CR34), um tripleto de CR de LRPl (CR3-5) e o par de CR do antígeno FDC-8D6. Os 10 fragmentos de DNA que codificam cada um destes foi amplificado por PCR do cDNA humano (BD Biosciences Marathon-ready™ ou de um cDNA de LRP6 previamente clonado (9) usando HotStart PfuTurbo™ (Stratagene) e os iniciadores:

LRP6CR1F: 5'- GCGATAGGATCCCCAACATGTTCTCCTCAGCAGTTTACTT

GTTTCACGGGGGAAATTGACTGTATC -3'; (ID. DE SEQ. N°: 3).

LRP6CR2R: 5'- GCGATAAAGCTTTTATCAAAGCACTTCACAGTTCTTCTCA TCTGATTTGTCCTGGCAGTTTGCATCTCCA -3'; (ID. DE SEQ. N°: 4).

LRP6CR2F: 51 -GCGATAGGATCCCCTGTATGCTCAGAGTCCCAGTTCCAGTG TGCCAGTGGGCAGTGTATTGATGG -3'; (ID. DE SEQ. N°: 5).

LPR6 CR3 R: 5 ' - GCGATAAAGCTTTCACTAAGTCGGATAACAATCCAGTTCAT CTGACTTGTCACTGCAATCCAC -3'; (ID. DE SEQ. N°: 6).

VLDLRCR6F: 5'-GCGATAGGATCCCACACCAAGTGTCCAGCCAGCGAAATCC AGTGCGGCTCTGGCGAGTGC- 3'; (ID. DE SEQ. N°: 7).

VLDLRCR7F: 5'- GCGATAGGATCCACTTGCCGACCTGACCAATTTGAATGT

GAGGATGGCAGC -31; (ID. DE SEQ. N°: 8).

VLDLRCR8R: 5'- GCGATAAAGCTTTTATCATTCGTTTATATGACACTCTTT CAGGGGCTCATCACTCCAGTCCCTG -3'; (ID. DE SEQ. N°: 9).

LRP2CR8F: 5'- GCGATAGGATCCCCCACGGAGCAGTGTGGCTTATTTTCCT TCCCCTGTAAAAATGGC -3'; (ID. DE SEQ. N°: 10). LRP2CR9R: 5'- GCGATAAAGCTTTTATCATGCGTGGGTGGGGCAGTTGTGC TCATCACTGCCATCCACACAGTCGTTGCGTTTG -3'; (ID. DE SEQ. N°: 11) ·

LRP2CR34F: 5'- GCGATAGGATCCGATGGTGCATACTGCCAGGCTACTATG TTCGAATGCAAAAACCATGTTTGTATCCCGC -3'; (ID. DE SEQ. N°: 12).

LRP2CR3 5F: 5'- GCGATAGGATCCGATGTTCCCTGTAATTCACCAAACCGT TTCCGGTGTGACAACAATCGCTGC -3'; (ID. DE SEQ. N°: 13).

LRP2CR36R: 5'- GCGATAAAGCTTTTATCATATATTTTCAGCACATGTTCT TTCTTTTCCTTTATTGCAACCCAGTTCATCG -3'; (ID. DE SEQ. N°: 14). ST14F1: 5'- GCGATAGGATCCCCATGCCCGGGGCAGTTCACGTGCCGCACG

GGGCGGTGTATC- 3'; (ID. DE SEQ. N°: 15).

ST14F2 : 5'- GCGATAGGATCCTGCGACGCCGGCCACCAGTTCACGTGCAAG AACAAGTTCTGC- 3'; (ID. DE SEQ. N°: 16).

ST14F3: 5'- GCGATAGGATCCAGTTGTCCGGCCCAGACCTTCAGGTGTTCC AATGGGAAGTG -3'; (ID. DE SEQ. N°: 17).

ST14R1: 5'- GCGATAAAGCTTTTATCAACCCCTGCTCGTCGCTGTTGTCTC CGCAGTCGTTCACACTG- 3'; (ID. DE SEQ. N°: 18).

ST14R2: 5'- GCGATAAAGCTTTTATCAACTGCACCCCTGCTCGTCGCTGTT G- 3'; (ID. DE SEQ. N0: 19).

2 0 ST14R3 : 5'- GCGATAAAGCTTTTATCAGTCGCAGTCCTTCTCATCTGAGCC

GTCGCTACAGTCCTCCTTCCCG -3'; (ID. DE SEQ. N°: 20).

LRP1CR3F: 5'- GCGATAGGATCCCCCCAGTGCCAGCCAGGCGAGTTTGCC -3'; (ID. DE SEQ. N°: 21).

LRP1CR5R: 5’- GCGATAAGCTTTCAATAGGCACACGAAGCAGACTCATCAG AGCGG- 3' (ID. DE SEQ. N°: 22).

8D6AF: 5'- GCGATAGGATCCTCGTGCCCACCCACCAAGTTCCAGTGCCGCA CCAGTGGCTTATG- 3' (ID. DE SEQ. N°: 23).

8D6SAR: 5'- GCGATAAAGCTTTTATCATCCACAGCCGAGCTCGTCGCTGGA GTCGGGAC- 3' (ID. DE SEQ. N°: 24).

3 0 Cada fragmento amplificado foi digerido seqüencialmente com BamHI e HindIII e depois ligado em pET30(+)a digerido de forma similar. Os plasmídeos resultantes codificam proteínas que consistem em hexahistidina e S-peptídeos do terminal N fundidos ao 5 fragmento de CR. As reações de ligação foram transformadas em XL-Blue MRF1 (Stratagene) por eletroporação e plasmídeos isolados de colônias únicas. Três mutações, Y1040W, V1047D e R1088D, foram introduzidas no plasmídeo de expressão LRP2 CR8 9, tanto isoladamente quanto em combinação com o uso dos 10 reagentes QuikChange II XL de Stratagene e os iniciadores:

CR8 9YWF: 5'- GTGCCCAATTACTGGCTCTGTGATGGAG -3' (ID. DE SEQ. N0: 25);

CR8 9YWR: 5'- CTCCATCACAGAGCCAGTAATTGGGCAC -3' (ID. DE SEQ. N°: 26);

CR8 9V104 7DF: 5'- CTCTGTGATGGAGACGATGATTGTCATGATA -3'

(ID. DE SEQ. N0: 27) ;

CR8 9V104 7DR: 5'- TAT CATGACAAT CAT CGT CTC CAT CACAGAG -3' (ID. DE SEQ. N0: 28) ;

CR89R1088DF: 5'- CACACTGGCGCTGTGACAAAGACAACGACTGTGTGGA TGGC -3' (ID. DE SEQ. N°: 29);

CR89R108 8DR: 5'- GCCATCCACACAGTCGTTGTCTTTGTCACAGCGCCAG TGTG -3' (ID. DE SEQ. N°: 30).

Todas as construções de expressão foram seqüenciadas para verificar a inserção de seqüências e as junções com o 25 vetor de expressão. Cada plasmídeo foi então usado para transformar células BL21(DE3) CodonPlus-RIPL™ (Stratagene). A expressão das proteínas de CR foi induzida em células em fase de crescimento logarítmico desenvolvidas em LB suplementado com 34 pg/ml de cloranfenicol, 12,5 pg/ml de 30 tetraciclina e 15 pg/ml de canamicina por adição de IPTG 2 mM, seguida por redução em temperatura de incubadora até 320C e incubação por 4 horas com agitação a 250 x g. As células foram peletizadas e ressuspensas, a 3,5% do volume da cultura inicial em Tris-HCl 10 mM pH 8, NaH2PO4 100 mM, 5 uréia 8 M. As células ressuspensas foram então congeladas em nitrogênio líquido, rapidamente descongeladas até 37°C e sonificadas por 10 segundos em um ajuste de amplitude de 60 usando um processador ultra-sônico Cole-Parmer CP-130 conectado a uma sonda de 3 mm. Esse procedimento foi 10 repetido três vezes para efetuar a Iise completa das células. Os lisados foram clarificados por centrifugação duas vezes a 10.000 x g em uma centrífuga Sorvall RC-5 por 20 minutos a 15°C. Colunas de Ni-NTA (Qiagen Superflow™, leito compactado de 1,5 ml) foram usadas para purificar as 15 proteínas de CR. Resumidamente, a resina foi equilibrada com dois volumes de coluna de tampão de Iise. 0 lisado clarificado foi então suplementado até 20 mM com imidazol e incubado com a resina de Ni-NTA equilibrada de um dia para o outro a 4 °C. O fluxo direto foi descartado. As colunas

2 0 foram lavadas uma vez com um volume de coluna de tampão de Iise e depois três vezes com um volume de coluna de TBS pH 8 suplementado com imidazol 2 0 mM. Os glóbulos carregados com CR foram então removidos da coluna, e as proteínas de CR eluídas por incubação em temperatura ambiente por 3 0

2 5 minutos com um volume de coluna do mesmo tampão contendo imidazol 200 mM. Essa etapa foi repetida uma vez, e os eluatos reunidos em pool. As soluções de proteína de CR eluída foram então suplementadas até uréia 2 M, CaCl2 10 mM e DTT 5 mM. As soluções de proteína de CR purificada e 30 desnaturada foram transferidas para cassetes de 3.500 MWCO Slide-A-Lyzer™ (Pierce) e dialisadas seqüencialmente contra um excesso de 200 vezes de Tris-HCl 50 mM pH 8,5, CaCl2 10 mM, glutationa reduzida 1 mM, glutationa oxidada 0,5 mM em temperatura ambiente de um dia para o outro e 5 depois contra TBS suplementado com CaCl2 5 mM a 40C de um dia para o outro. As concentrações de proteína foram determinadas por ensaio de Bradford e a pureza confirmada por SDS-PAGE com coloração com Azul Brilhante Coomassie.

Preparação de biblioteca de apresentação em fago de RAP - 0 fagomídeo de apresentação em fago pHage 3.2 foi modificado para remover os sítios de PflMI e HindIII dentro da seqüência-líder de pIII usando os reagentes QuikChange II™ (Stratagene) . Além disso, o polivinculador de pHage 3.2 foi modificado por ligação a um vinculador de fita dupla contendo sítios de BamHI, NotI e AgeI. 0 fagomídeo modificado resultante foi denominado pHage 3.6. Um vetor descrito previamente para expressão de uma fusão entre RAP e L-iduronidase humana, pc3B-RAPIDU (49), foi digerido com BamHI e AgeI para obter um fragmento de DNA que codifica a seqüência de RAP humana. Essa seqüência começa no nucleotídeo 102 do cDNA de RAP e termina no nucleotídeo 1059. A proteína de RAP codificada não possui o peptídeo sinalizador de RAP no terminal Neo sinal de retenção do retículo citoplasmático no terminal C HNEL (ID. DE SEQ. N°: _) . Além disso, há um sítio de BamHI in-frame na extremidade 5' e uma seqüência in-frame que codifica o peptídeo AEAETG, incluindo um sítio de AgeI, na extremidade 31. A seqüência de RAP foi ligada em pHage 3.6 digerido de forma similar, criando uma fusão entre o peptídeo líder de M13 pIII, a seqüência de RAP e a seqüência de pIII. Essa construção foi denominada pHage 3.6 RAP. A seguir, duas posições dentro do terceiro domínio de RAP (RAP d3 K256 e K270), que previamente havia sido relatado previamente como sendo importante para ligação ao receptor, foram 5 mutagenizadas (55). Essas duas posições foram saturadas por amplificação por PCR separada das metades 5' e 3' de RAP d3 usando pares de iniciadores normais e mutagênicos:

RAP2KXF: 5'- CCCTCGGACGTCAGCGACATCAAGGGCAGCGTCCTG -3' (ID. DE SEQ. N0: 31) ;

RAP2KX2: 5'- CTCCAGCTGCTTCTGGTAGTGGTTGTGVNNCTCCTCGATTT

TGGCTTCGAAGTGCTTGAGCTCC T -3' (ID. DE SEQ. N°: 32);

RAP2KX1: 5'- AAGCAGCTGGAGATTGCGCACGAGNNBCTGAGGCACGCAGA GAGCGTGGGCGAACGGC-31 (ID. DE SEQ. N°: 33); e

RAPmutlR: 5'- GGTGCGGGGCCTCACCGGT -3' (ID. DE SEQ. N°:

34) .

Os fragmentos foram amplificados a partir de pc3BRAPIDU. Cada iniciador mutagênico substitui um dos códons de lisina selecionados com um dos 47 outros códons ou com um dos três códons de parada possíveis. Essa substituição 20 cria um pool de 2.304 combinações possíveis de nucleotídeos e 441 combinações possíveis de aminoácidos (ou códons de terminação). Tantos os fragmentos de RAP d3 5' quanto os de RAP d3 3'-PCR foram digeridos com PvuII em um sítio comum e depois combinados em uma reação de ligação com T4 DNA 25 ligase. Um produto de ligação heterodimérico que consiste nos fragmentos 5' e 3' fundidos no sítio de PvuII foi resolvido em géis de agarose FMC NuSieve GTG™ e purificados usando reagentes GFX™ de Amersham. 0 heterodímero foi quantificado por espectroscopia UV e

3 0 submetido a rodadas adicionais de mutagênese por PCR errorprone usando os reagentes GeneMorph II EZclone™ (Stratagene) e os iniciadores RAPKXF e RAPmutlR (descritos acima). A concentração de heterodímero foi mantida abaixo de 4 00 pg para cada 50 μΐ de reação para maximizar a 5 freqüência de mutação final. 0 DNA mutagenizado foi digerido com AgeI, purificado por GFX, quantificado por espectroscopia UV e usado para clonagem sem ligase em pHage

3.6 RAP usando os reagentes Stratagene EZclone™. Os produtos de reação da clonagem sem ligase foram purificados

usando colunas Qiagen MinElute™. Alíquotas dos produtos de clonagem purificados sem ligase (3 μΐ) foram usadas para transformar alíquotas 50 de μΐ de células XLIO-Gold™ quimicamente competentes. Alíquotas das células transformadas foram diluídas serialmente e plaqueadas em

placas de LB contendo 100 pg/ml de carbenicilina para determinar o número de transformantes primários. As células transformadas restantes foram plaqueadas em placas Nunclon de 25 x 25 cm. Um total de 119.500 colônias transformantes primárias foram recuperadas das placas com o auxílio de 350

2 0 ml de tampão Qiagen GigaPrep™ Pl. O DNA de plasmídeo foi

preparado usando reagentes e protocolos da Qiagen. A preparação de plasmídeo foi quantificada e digerida com BamHI e AgeI para confirmar a presença do inserto com tamanho apropriado.

Preparação de uma biblioteca de mutante de RAP d3

Uma biblioteca de mutante de RAP d3 foi preparada por PCR usando enzima e reagentes PfuUltra (Stratagene). As metades 5 1 e 3 ' da seqüência codificadora de d3 foram amplificadas separadamente usando os seguintes iniciadores purificados

3 0 por HPLC: M0RPHF4: 5'- GGCCCAGATCTACCGGTTTCTGCCTCGGC -3' (ID. DE SEQ. N0: 35) ;

D3HALFR2: 5'- GTGCGCAATCTCGAGCTGCTTCTGGTAGTGGTTGTGVNNC TCGATTTTGGCVNNGAAGTGCTTGAGCTCCTCCCGG -3' (ID. DE SEQ. N°: 5 36) ;

D3HALFF2: 5’- CCACTACCAGAAGCAGCTCGAGATTGCGCACGAGNNBCTG AGGCACGCAGAGAGCGTGGGCGACGGC -3' (ID. DE SEQ. N°: 37);

M0RPHR3: 5 ' - GAGTGCGGCCGCAAGCTTATCTTCTGCCTCGGC - 3 ' (ID. DE SEQ. N0: 38).

Os iniciadores substituem códons nas posições 251, 256

e 270 com NNB, resultando em todos os aminoácidos possíveis nessas posições. Além disso, um sítio de PvuII dentro da seqüência codificadora de RAP d3 foi removido com uma única substituição silenciosa de base. Os fragmentos amplificados 15 foram purificados usando reagentes Amersham GFX e depois montados por PCR sem iniciador usando PfuUltra. 0 pool montado de seqüências de variantes RAP d3 foi então quantificado e submetido à mutagênese usando reagentes GeneMorph II (Stratagene) . 0 DNA mutagenizado foi digerido 20 seqüencialmente com BamHI, PvuII e AgeI com purificação usando reagentes GFX após cada reação. O pool de fragmentos digeridos de variante de RAP d3 foi então ligado em pHage

3.6 digerido de forma similar (veja acima). Uma biblioteca de plasmídeo foi preparada por transformação de células 25 XLlO-Gold (Stratagene) e plaqueando-se em placas de 25 x 25 cm de LB suplementado com carbenicilina. As colônias foram recuperadas das placas e o DNA de plasmídeo preparado como acima.

Preparação de fago - Bibliotecas de plasmídeo (10 ng)

3 0 foram usadas para transformar XL-Blue MRF1 por eletroporação. Após incubação por 1 hora a 370C em 1 ml de 2 x YT suplementado com glicose 2%, culturas de células transformadas foram suplementadas até 10 0 pg/ml com carbenicilina e desenvolvidas por mais 6 horas. Após esse 5 intervalo, a cultura de 1 ml foi usada para inocular 10 ml de 2 x YT suplementado com glicose 2%, 100 pg/ml de carbenicilina e IO8 pfu/ml de fago helper M13K07 (New England Biolabs) em um frasco de Erlenmeyer de 50 ml. Essa cultura foi agitada a 250 x g por 2 horas a 37°C, e depois 10 centrifugada em uma centrífuga Sorvall RC-5 a 2;000 x g por 10 minutos para peletizar as células. As células foram ressuspensas em 10 ml 2 x YT com 100 pg/ml de carbenicilina e 10 0 pg/ml de canamicina e agitadas de um dia para o outro a 37°C. As culturas foram clarificadas por centrifugação 15 duas vezes a 10.000 x g e os sobrenadantes coletados. Os fagos foram precipitados por combinação do sobrenadante com um volume de TBS gelado e 0,2 volume de PEG 8000 2% (Sigma), NaCl 2,5 M, coletados por centrifugação a 10.000 x g e ressuspensos em TBS. A titulação de fagos foi

2 0 determinada por diluição serialmente de amostras de fago, incubação com XL-Blue MRF1 em fase logarítmica e plaqueamento em 2 x ágar YT suplementado com 100 μg/ml de carbenicilina.

Panning de fago - Proteínas de CR dobradas purificadas 25 foram usadas para revestir placas de 96 poços Nunc MaxiSorp™ a 1 pg/poço de um dia para o outro a 40C em TBS suplementado com CaCl2 5 mM. Os poços foram enxaguados e bloqueados com TBS Superblock™ (Pierce) suplementado com CaCl2 5 mM, antes da adição de fago. Bibliotecas de fago 30 purificado de IO9 cfu (IO10 cfu/ml) em TBS Superblock™ suplementado com CaCl2 5 mM e Tween-2 0 0,05% foram adicionadas aos poços revestidos e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. Os poços foram então lavados quinze vezes com TBSTC (20 mM Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM 5 suplementado com CaCl2 5 mM e Tween-20 0,05%) . Os fagos ligados foram eluídos em glicina-HCl 0,2 M pH 2,2 com 1 mg/ml de BSA e transferidos para tubos contendo 0,2 volume de Tris-HCl I M pH 9,1 para levar o pH até a neutralidade. Os fagos eluídos foram recuperados por mistura do eluato 10 com células XL-Blue MRF' em fase logarítmica. Os fagos resgatados foram amplificados por crescimento das células em cultura líquida a 3 0°C de um dia para o outro (16 horas). Além disso, alíquotas de células transformadas foram tituladas diluindo-se serialmente as amostras e 15 plaqueando-se em 2 x YT ágar contendo 100 pg/ml de carbenicilina. Os fagos foram purificados e concentrados dos sobrenadantes do meio por precipitação do PEG.

Expressão de proteínas de RAP d3 - Freqüências de RAP d3 foram amplificadas por PCR usando d3 RescueF: 5'

2 0 GCGATAGGATCCCTGGACCGCCTGCGCAGGGTCAGCCACC -3' (ID. DE SEQ.

N°: 3 9) e d3 Rescue R: 5'- GCGATAAAGCTTTTATCAAGATCTACCGGTTT CTGCCTCGGC- 3' (ID. DE SEQ. N°: 40), digeridos com BamHI e HindIII e ligados em pET30(+)a digerido de forma similar. As proteínas de RAP d3 foram expressas em BL21(DE3) 25 CodonPlus-RIPL™ e purificadas por cromatografia em Ni-NTA, como descrito acima. As concentrações de proteína foram medidas por ensaio de Bradford e a pureza foi avaliada por SDS- PAGE.

Reversão seqüencial de RAP d3 mutante e mutação direta

3 0 de RAP d3 do tipo selvagem - Cada mutação dentro da variante de RAP d3 selecionada por afinidade foi revertida individualmente no tipo selvagem usando reagentes Stratagene QuickChange II XL™ e os seguintes iniciadores:

V2AR1: 5'- AGGGTCAGCCACCAGGGCTACAGCACTGAGGCTAAGTTCGAGG AGCCCAGGGTGAT- 3' (ID. DE SEQ. N°: 41);

V2AR2: 5'- CAGCCACCAGGGCTACACCACTGAGGCTGAGTTCGAGGACCCA GGGTGATTGACC -3' (ID. DE SEQ. N°: 42);

V2AR3: 5'- GGAGGCGTTCCGGGAGGAGCTCAAGCACTTCAAAGCCAAAATT GAGGCCCACAACC- 3' (ID. DE SEQ. N°: 43);

V2AR4: 5'- CGTTCCGGGAGGAGCTCAAGTACTTCGAAGCCAAAATTGAGGC

CCACAACCACTAC -3' (ID. DE SEQ. N°: 44);

V2AR5: 5'- GCTCAAGTACTTCAAAGCCAAAATTGAGAAGCACAACCACTAC CAGAAGCAGCTGGAG -3' (ID. DE SEQ. N°: 45);

V2AR6 : 5 ' - AGAAGCAGCTGGAGATTGCGCACGAGAAGCTGAGGCACGCAGA

GAGCGTGGGCGACGG - 3' (ID. DE SEQ. N°: 46);

V2ARR1: 51 - ATCACCCTGGGCTCCTCGAACTTAGCCTCAGTGCTGTAGCCC TGGTGGCTGACCCT- 3' (ID. DE SEQ. N°: 47);

V2ARR2: 5'- GGTCAATCACCCTGGGCTCCTCGAACTCAGCCTCAGTGGTGT AGCCCTGGTGGCTG -3' (ID. DE SEQ. N°: 48);

2 0 V2ARR3: 5'- GGTTGTGGGCCTCAATTTTGGCTTTGAAGTGCTTGAGCTCCT

CCCGGAACGCCTCC- 3'(ID. DE SEQ. N°: 49);

V2ARR4: 5'- GTAGTGGTTGTGGGCCTCAATTTTGGCTTCGAAGTACTTGAG CTCCTCCCGGAACG- 3' (ID. DE SEQ. N°: 50);

V2ARR5: 5'- CTCCAGCTGCTTCTGGTAGTGGTTGTGCTTCTCAATTTTGGC

TTTGAAGTACTTGAGC- 3' (ID. DE SEQ. N°: 51);

V2ARR6: 5'- CCGTCGCCCACGCTCTCTGCGTGCCTCAGCTTCTCGTGCGCA ATCTCCAGCTGCTTCT- 3' (ID. DE SEQ. N°: 52).

RAP d3 do tipo selvagem foi mutagenizada usando o mesmo método e os seguintes iniciadores:

3 0 K256AF: 5'- CTTCGAAGCCAAAATCGAGGCGCACAACCACTACCAGAAGC -3' (ID. DE SEQ. N0: 53);

K2 56AR: 5'- GCTTCTGGTAGTGGTTGTGCGCCTCGATTTTGGCTTCGAAG -3' (ID. DE SEQ. N0: 54);

K2 7 OEF: 5'-GCTGGAGATTGCGCACGAGGAGCTGAGGCACGCAGAGAG -31 (ID. DE SEQ. N0: 55);

K2 7 0ER: 5'- CTCTCTGCGTGCCTCAGCTCCTCGTGCGCAATCTCCAGC 3' (ID. DE SEQ. N0: 56);

d3 E 2 51KF: 5'- GAGGAGCTCAAGCACTTCAAAGCCAAAATCGAGAAGCACA AC -3' (ID. DE SEQ. N°: 57);

d3E251KR: 5'- GTTGTGCTTCTCGATTTTGGCTTTGAAGTGCTTGAGCTCC

TC -3’ (ID. DE SEQ. N°: 58);

d3E217KF: 5'- CAGGGCTACAGCACTGAGGCTAAGTTCGAGGAGCCCAGGG TG -3' (ID. DE SEQ. N°: 59);

d3E217KR: 5'- CACCCTGGGCTCCTCGAACTTAGCCTCAGTGCTGTAGCCC TG -3' (ID. DE SEQ. N°: 60);

d3H24 9YF: 5'- GTTCCGGGAGGAGCTCAAGTACTTCGAAGCCAAAATCGAG -3' (ID. DE SEQ. N0: 61) ;

d3H24 9YR: 5'- CTCGATTTTGGCTTCGAAGTACTTGAGCTCCTCCCGGAAC -3' (ID. DE SEQ. N0: 62) .

2 0 Ensaios de ligação de fase sólida - Proteína de CR

redobrada purificada (1 mg) foi ligada às placas de 96 poços Nunc Maxisorp™ em TBS pH 8 suplementado com CaCl2 5 mM (TBSC) de um dia para o outro a 4 °C. Os poços foram lavados com TBSC e depois bloqueados com TBSC contendo 25 albumina sérica bovina 2% (BSA) . Os ligantes de RAP foram então incubados com o receptor imobilizado em uma gama de concentrações por 2 horas no tampão de bloqueio acima suplementado com Tween-20 0,05% em temperatura ambiente. Os poços de controle não continham ligante adicionado. Como um 30 controle adicional, para determinar se a ausência de cálcio afetava a ligação, EGTA 10 mM foi incluído no meio de incubação para algumas amostras. Os poços foram lavados com TBSTC e os ligantes ligados detectados com anti-RAP policlonal (BP41/42, 1:1.000, BioMarin). O excesso de 5 anticorpo primário foi removido e os poços lavados antes da incubação com o anticorpo secundário, IgG de cabra anticoelho conjugada à HRP (Bio-Rad). Após lavagem, soluções de substrato TMB (Bio-Rad) foram adicionadas para detectar HRP. 0 desenvolvimento de cor foi interrompido com

HCl 1 N. A absorção a 450 nm foi medida com um espectrofotômetro de microplacas (Molecular Devices). Os dados foram tabulados e os valores de Kd derivados por regressão não linear pressupondo ligação a um único sítio (GraphPad Prism).

Resultados

A fim de identificar pares de CR em tandem dentro do proteoma humano e analisar aquelas posições dentro dos pares que foram implicadas previamente na ligação à RAP, seqüências de 190 seqüências de CR humanas não redundantes

2 0 identificadas na base de dados Pfam (pfam.wustl.edu) foram

transferidas para uma planilha. Os pares de seqüências de CR em tandem foram então identificados, necessitando apenas atribuir como um par sendo aquele das duas seqüências de CR imediatamente adjacentes entre si dentro da seqüência da

proteína primária na qual foram encontradas. A imposição de um limite de 75 aminoácidos sobre a distância entre os primeiros aminoácidos de cada seqüência de CR, como definido na base de dados Pfam, testou adequadamente essa condição. Presumiu-se a necessidade de que tenha sido feito

3 0 um arranjo em tandem, já que a preponderância de dados históricos sobre a ligação de RAP às seqüências de CR definidas envolve esses pares. Pares superpostos foram incluídos, de tal forma que um arranjo linear de três seqüências de CR era composto por dois pares de CR. Houve 5 14 9 pares de CR em tandem identificados dessa forma. A conservação de seqüências na área da alça de ligação de cálcio facilitou a etapa seguinte na análise, a extração de quatro aminoácidos vinculados diretamente à ligação de RAP em estudos prévios (56, 57) . Há equivalentes à A e C pelo 10 motivo AxcBxCxD de cada seqüência de CR de um par de CR. As identidades de aminoácidos nas posições A e C da primeira seqüência de CR de cada par, juntamente com os aminoácidos nas posições A e C da segunda seqüência de CR de cada par (de agora em diante, A' e C') foram então concatenadas em 15 uma única cadeia tetramérica de caracteres (ACA1C') para fins de comparação. As cadeias de caracteres para cada par de CR foram comparadas com aquelas para todos os outros pares de CR, e a freqüência de cada um contada. Das 14 9 seqüências humanas de par de CR em tandem não redundantes

2 0 que foram identificadas nessa análise, a combinação mais comum de aminoácidos em A, C, A1 e C' foi WDWD, que foi encontrada 16 vezes. Além disso, houve um total de quatro pares de CR com a assinatura WEWD, dois com WEWE e seis com WDWE, para um total de 28 que se ajustam à nossa definição 25 de pares de CR canônicos. As assinaturas do par de CR canônico só foram encontradas na família do LDLR, especificamente em VLDLR, LRPl, LRP1B, LRP2, LRP4, apoER2 e SorLA. Foi demonstrado previamente que todos esses receptores se ligam à RAP com alta afinidade. Além de 30 combinações redundantes de freqüência menor, foram identificadas 101 combinações únicas, com todas as proteínas que contêm par de CR tendo pelo menos uma. Cada combinação tetramérica de aminoácidos em A, C, A1 e C1 foi então generalizada designando-se os aminoácidos a um de 5 seis grupos com base nas propriedades físico-químicas aproximadas de suas cadeias laterais. Aminoácidos alifáticos hidrofóbicos foram designados ao grupo 1 (I, L, Μ, V), aminoácidos hidrofílicos pequenos ao grupo 2 (A, C, G, P, S1 T) , aminoácidos básicos ao grupo 3 (Η, K, R) ,

aminoácidos acídicos ao grupo 4 (D, E) , aminoácidos de carboxamida ao grupo 5 (N, Q) e aminoácidos aromáticos ao grupo 6 (F, W, Y) . Como anteriormente, cada combinação generalizada foi então comparada com todas as outras combinações desse tipo e suas freqüências contadas.

Verificou-se que a combinação generalizada mais comum era 6464, com aminoácidos aromáticos a A e A' e aminoácidos acídicos a C e C1 . Esse grupo incluía todas as 2 8 das combinações canônicas específicas, e era responsável por 44 das 14 9 combinações de par de CR. Representativos dessa

2 0 classe de pares de CR foram encontrados em dez proteínas, incluindo duas fora da família do LDLR, corina e perlecana. Um total de 57 das combinações generalizadas eram únicas e, como anteriormente, pelo menos uma combinação única podia ser encontrada em cada ectodomínio do receptor LDLR, exceto

2 5 para o VLDLR. Outras proteínas contendo pares de CR com

combinações de aminoácidos generalizadas únicas nas posições selecionadas incluíam as serina protease matriptases transmembrana 1, 2 e 3 (MT-SPl, ST14, TADG-15), antígeno FDC-8D6, corina, fator do complemento Iea

3 0 proteína de sulfato de heparina proteoglicano, perlecana (25, 58) .

A partir de um grande número de pares de CR com combinações únicas de aminoácidos em A, C, A1 e C' dentro da alça de ligação de cálcio de cada CR, pares ou tripletos 5 de CR foram selecionados para testar sua ligação à RAP d3 (Figura 2) . Um par adicional derivado da proteína FDC-8D6 foi testado, designado 8D6 CR12, que possui a seqüência (GSSCPPTKFQCRTSGLCVPLTWRCDRDLDCSDGSDEEECRIEPCTQKGQCPPPPGLPC PCTGVSDCSGGTDKKLRNCSRLACLAGELRCTLSDDCIPLTWRCDGHPDCPDS SDELGC 10 G) (ID. DE SEQ. N°: 91). Os fragmentos de receptor selecionados compreendem pares únicos ou dois pares superpostos (tripletos) de seqüências de CR e visavam refletir a gama de combinações de aminoácidos nas posições selecionadas. Considerando-se que pares superpostos talvez 15 se dobre menos eficientemente do que pares isolados, um ou ambos os pares superpostos que constituem cada tripleto também foram expressos em alguns casos. As seqüências incluíram um tripleto de LRP6 CR, equivalente aos aminoácidos 1247-1363 de LRP6 humano de comprimento total 20 (N° de acesso Uniprot 075581), denominado LRP6 CR1-3; ambos os pares superpostos de CR compreendendo o tripleto de LRP6, LRP6 CR12 e LRP6 CR23, aminoácidos 1.247-1.322 e

1.323-1.363; um fragmento do VLDLR, aminoácidos 235-358 (N° de acesso Uniprot P98155), denominado VLDLR CR6-8; um par

2 5 de CR dentro do tripleto de VLDLR, denominado VLDLR CR78, contendo aminoácidos 295-358; três pares de CR da matriptase transmembrana serina protease, denominados MAT CR12 (ST14 CR12), aminoácidos 452-524, MAT CR23 (ST14 CR23) , aminoácidos 487-566 (N° de acesso Uniprot Q8WVC1) e 30 MAT CR34 (ST14 CR34), aminoácidos 525-602; o par de CR do antígeno FDC-8D6, aminoácidos 53-168 (N° de acesso Uniprot Q9NPF0) (ID. DE SEQ. N° : 94) e um tripleto de LRPl, denominado LRPl CR3-5, que compreende os aminoácidos 852- 973 (N° de acesso Uniprot P98157). LRPl CR3-5 consiste em 5 dois pares de CR canônicos superpostos com a assinatura WDWD, tendo sido demonstrado previamente que cada um deles se liga à RAP d3 com alta afinidade (56).

Diversos estudos prévios demonstraram que pares e tripletos de CR podem ser expressos em bactérias e re10 dobrados in vitro em estruturas nativas (45, 50-54, 56, 57, 59-62) . Cada proteína de CR re-dobrada purificada foi expressa e analisada por SDS-PAGE, tanto sob condições redutoras quanto sob condições não redutoras (Figura 3). A mobilidade de CR foi consistente com o peso molecular 15 previsto sob condições redutoras, e cada proteína foi considerada como sendo >90% pura. Sob condições não redutoras, cada proteína de CR migrou através do gel mais rapidamente do que esperado para o peso molecular previsto. Essa observação é consistente com uma estrutura dobrada

2 0 compacta dependente da formação intramolecular de ligação

dissulfeto. Embora várias combinações possíveis de ligação dissulfeto sejam possíveis, os estudos citados acima demonstram que o padrão nativo de ligação dissulfeto é favorecido durante a re-dobragem, especialmente na presença 25 de cálcio. Na maioria dos casos, e levando-se em conta a resolução relativamente baixa da análise eletroforética, a forma dobrada da proteína de CR pareceu ser uma banda única (Figura 3).

A ligação de RAP d3 do tipo selvagem a cada par de CR

3 0 ou conjunto de pares superpostos foi então medida por ensaio de fase sólida (Figura 4) . A Kd aparente par aa ligação de RAP d3 ao LRPl CR3-5 nesse ensaio foi de 11 nM, na mesma faixa que os valores relatados previamente (56, 57, 63). A ligação de RAP d3 ao LRP6 CR12, LRP6 CR23, LRP6 5 CRl-3, VLDLR CR78, LRP2 CR3536, LRP2 CR34-36 e MAT CR23 foi de menos de 5% àquela para LRPl CR3-5 nas maiores concentrações de ligante testadas. A ligação de RAP d3 à MAT CRl2 e CR34, medida em um conjunto de experimentos separado, também foi indetectável. A ligação de RAP d3 a 10 VLDLR CR6-8 e LRP2 CR89 foi ligeiramente maior, permitindo que as curvas fossem ajustadas de forma confiável aos isotermas de ligação. No entanto, as constantes de dissociação aparentes para a ligação de RAP d3 a esses fragmentos de receptor foram de mais de 3 00 nM.

Tendo estabelecido que RAP d3 does não se liga aos

pares de CR que contém combinações únicas de aminoácidos dentro da alça de ligação de cálcio, foi desenvolvido um sistema de seleção por afinidade para mutantes de RAP d3 que são capazes de se ligar a estes pares. Fusões de RAP a 20 outras proteínas foram expressas tanto em células de mamíferos quanto bacterianas, e foi demonstrado que retêm o comportamento de ligação ao receptor de RAP nativa (4 9, 64, 65) . Portanto, foram criadas bibliotecas de RAP de comprimento total fundida no terminal N à proteína 25 estrutural M13 pIII, como foi feito previamente com outras proteínas (66). Para criar um pool de mutantes de RAP, dois procedimentos mutagênicos foram aplicados ao terceiro domínio dentro da seqüência codificadora de RAP de comprimento total. Os códons para duas posições que

3 0 participam diretamente na ligação ao receptor (comprovado por estudos prévios), K256 e K270, foram inicialmente submetidas à mutagênese por saturação. Mutações adicionais foram então introduzidas aleatoriamente em RAP d3 usando PCR error-prone. Após esses procedimentos, um total de 3 8 clones selecionados aleatoriamente foi seqüenciado para determinar a freqüência de mutação. Dez clones (26%) tiveram inserções, eliminações ou substituições de base que resultaram em códons de parada dentro da seqüência de RAP. O fago recombinante que codifica estas seqüências será favorecido durante os processos de montagem de fago e infecção, já que apenas pIII do tipo selvagem se torna incorporado no capsídeo do fago. Verificou-se que mais quatro clones (11%) codificam RAP do tipo selvagem. Os restantes 24 clones (63%) das fusões fago de RAP-pIII codificavam proteínas de RAP com mutações em d3. Nenhum desses clones tinha a mesma combinação de aminoácidos nas posições 256 e 270, indicando que ocorreu uma gama de substituições, como esperado nesses sítios. A freqüência média de mutação exclusiva das posições 256 e 27 0 foi de 2,4 substituições de aminoácidos dentro dos últimos 110 aminoácidos de RAP (RAP d3) . Um dos 3 8 clones tinha uma eliminação in-frame de 7 códons, enquanto outro tinha uma inserção in-frame de uma seqüência não identificada que substitui parcialmente a extremidade 3 ' de RAP d3 . Não foram encontradas mutações dentro de dl ou d2 de RAP.

Uma segunda biblioteca de apresentação em fago foi preparada, que codificava apenas RAP d3. Essa biblioteca foi gerada de uma forma similar à biblioteca de RAP de comprimento total, exceto que uma posição adicional, 251,

3 0 foi submetida à mutagênese por saturação com base na importância aparente desse sítio em uma variante de uma avaliação anterior (veja abaixo). Com exceção das posições 251, 256 e 270, a biblioteca de mutante de RAP d3 teve uma freqüência média de mutação de 2 substituições de 5 aminoácidos dentro dos últimos 110 aminoácidos de RAP. Não houve hiper-representação aparente de seqüências de RAP do tipo selvagem nessa biblioteca.

Para testar se o sistema de panning de fago poderia ser usado para isolar seqüências de RAP com base na afinidade, uma preparação de fago que expressa RAP do tipo selvagem foi diluída mil vezes em uma preparação de fago que expressa uma RAP mutante (K256D, K270D) que supostamente tem habilidade de ligação de par de CR diminuída (55) . O pa.nning- foi realizado como descrito em Métodos. Os fagos recuperados foram amplificados e titulados. A seqüência de RAP d3 de dez colônias recuperadas foi seqüenciada. Após uma única rodada de panning, duas das dez colônias do experimento de panning continham RAP do tipo selvagem, um enriquecimento de 200 vezes em relação ao pool de partida. Como um teste adicional do sistema usando um pool de seqüências mais complexo, bibliotecas de apresentação em fago de RAP nas quais posições 256 e 270 foram randomizadas foram panned em LRPl CR3-5. Na biblioteca de fago inicial, a seqüência de RAP do tipo selvagem foi codificada por aproximadamente um de 10 fagos (com base no seqüenciamento de clones aleatórios antes da seleção). Após a primeira rodada de panning, a seqüência de RAP do tipo selvagem foi codificada por 7 dos 10 fagos. Esse resultado demonstra um 3 0 enriquecimento de 7 vezes para a seqüência selecionada de um pool complexo de seqüências após uma rodada de panning.

Com a conclusão de que as seqüências de RAP poderiam ser isoladas a partir de bibliotecas de apresentação em fago por seleção por afinidade, escolhemos primeiro um par de CR que não estivesse ligado por RAP do tipo selvagem, LRP2 CR8 9, e o usamos como substrato de separação com a biblioteca em fago de RAP de comprimento total mutagenizado duplamente. Após quatro rodadas de panning, três de oito clones escolhidos aleatoriamente eram idênticos. A seqüência comum tinha sete mutações: V175L, S213T, E217K, H249Y, E251K, K256A, K270E. Um segundo grupo de quatro clones tinha substituições idênticas nas posições 256 e 270 (K256A, K270R), mas tinha padrões de substituição variáveis fora desses dois sítios. Após uma quinta rodada de panning, sete de oito clones escolhidos aleatoriamente tinham o conjunto de mutações previamente observado, V175L, S213T, E217K, H249Y, E251K, K256A, K270E. Todas as mutações para essa seqüência, denominada RAPv2A ou MegaRAPl (ID. DE SEQ. N°: 93), estavam na região especificamente mutagenizada para fazer a biblioteca variante.

Para confirmar que a resolução da biblioteca tinha ocorrido em conseqüência da seleção por afinidade, fagos de RAP e MegaRAPl foram preparados e testados quanto ã ligação ao LRP 2 CR8 9. Com titulações de partida idênticas, foram 25 recuperadas 2,6 vezes mais unidades de formação de colônias (cfu) por panning com fago de MegaRAPl do que com fago de RAP do tipo selvagem. Foram obtidos resultados similares quando fagos ligados foram detectados com um anticorpo anti-pIII, indicando que as diferenças na infectividade 3 0 entre os dois fagos não eram responsáveis pelas diferenças nas titulações de fagos recuperados. Realizando-se a reação de ligação na presença de EDTA 50 mM, a ligação de MegaRAPl foi determinada como sendo dependente de cálcio, consistente com a necessidade de uma dobragem ordenada de CR como o receptor. Como os fagos de RAP e MegaRAPl tinham seqüências de dl idênticas e seqüências de d2 que diferiam por uma única substituição conservadora(V17 5L), formulamos a hipótese de que as diferenças em d3 eram responsáveis pelos aumentos da ligação ao LRP2 CR89. Conseqüentemente, RAP d3 e MegaRAPl d3 foram subclonadas e expressas para análises de ligação subseqüentes. Como as regiões de d3 expressas para estudos posteriores era composta pelos aminoácidos 201-319 da RAP madura, o efeito da mutação V17 5L sobre o comportamento de ligação de RAPv2A não foi determinado.

A seguir, a ligação de proteínas de RAP d3 e MegaRAPl d3 ao LRPl CR3-5 e LRP2 CR8 9 foi avaliada. A fim de compreender as contribuições relativas de cada mutação de MegaRAPl d3 para as diferenças na afinidade, também

2 0 preparamos diversas revertentes MegaRAPl d3 e mutantes

diretos de RAP d3, todos compreendendo variantes de seqüências intermediárias entre MegaRAPl d3 e RAP d3 do tipo selvagem (sem o sinal de retenção do terminal C de 4 aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 92) (Figura 5A e 5B, Tabela 25 2). Em todos os casos, EGTA 10 mM evitou a ligação tanto de RAP d3 quanto de MegaRAPl d3 às proteínas de CR. Como o cálcio era o único íon de metal divalente presente no tampão de ligação, essa observação é consistente com a ligação de RAP d3 e MegaRAPl d3 aos pares de CR carregados

3 0 com cálcio. RAP d3 se ligou ao LRPl CR3-5 com uma constante de dissociação de 16 nM e não mostrou afinidade significativa por LRP 2 CR89, consistente com os dados representados na Figura 4. Inversamente, MegaRAPl d3 se ligou ao LRP2 CR8 9 com uma constante de dissociação 5 aparente de 38 nM, mas sem afinidade significativa por LRPl CR3-5. Portanto, RAP d3 e MegaRAPl d3 do tipo selvagem possuem preferências de ligação invertidas por esses dois fragmentos de receptor. Dois revertentes de MegaRAPl d3, T213S e K217E, tinham afinidades ligeiramente aumentadas 10 por LRP2 CR8 9 e permaneceram incapazes de se ligar de forma detectável ao LRPl CR3-5. Três revertentes de MegaRAPl d3, Y249H, K251E e A256K, não se ligaram a qualquer fragmento de receptor, indicando que as mutações eram importantes para a interação entre MegaRAPl d3 e LRP2 CR8 9 e não eram 15 individualmente responsáveis pela ruptura da ligação ao LRPl CR3-5. Curiosamente, o revertente de E270K se ligou a ambos os fragmentos de receptor com maior afinidade do que MegaRAPl d3, gerando constantes de dissociação aparentes de 8 nM para LRP2 CR8 9 e 14 2 nM para LRPl CR3-5. Como o 20 mutante de MegaRAPl d3 foi selecionado com base na afinidade por LRP2 CR89, esse resultado é consistente com o fato de a diversidade da biblioteca de partida ser insuficiente para ser responsável por todas as variantes de seqüência possíveis. Alternativamente, as diferenças de

2 5 afinidade entre MegaRAPl d3 e MegaRAPl d3 E2 7 0K podem ter sido insuficientes para permitir que essa última predomine sobre o panning iterativo. Um revertente duplo, T213S, E270K, teve um comportamento de ligação que não era distinguível de MegaRAPl d3 em nossos ensaios. Como os dois 30 revertentes de sítio duplo nessas posições pareceram mostrar afinidade aumentada por LRP2 CR89, e também no caso de E270K, LRPl CR3-5, esse resultado indica uma ausência de efeito aditivo para os efeitos de ligação resultantes dessas reversões ou uma ausência de precisão dentro dessa 5 faixa de afinidade em nossos ensaios. 0 comportamento de ligação do revertente duplo K251E, E270K implica em uma forte dependência da afinidade de MegaRAPl d3 por LRP2 CR89 na mutação E251K. A diferença na afinidade de LRP2 CR89 entre esse revertente e o revertente de sítio único E270K é 10 de quase 20 vezes. O revertente duplo A256K, E270K resulta em uma perda de afinidade por LRP2 CR89 de 2 vezes, o que implica em um efeito moderadamente positivo que a mutação de MegaRAPl d3 K256A possui sobre a afinidade por esse fragmento. No entanto, a diferença mais marcante entre esse 15 revertente duplo e o revertente de sítio único E270K é o aumento de quase 3 0 vezes na afinidade por LRPl CR3-5. Portanto, a mutação K256A em MegaRAPl d3 é um determinante crucial da habilidade dessa variante para discriminar entre os dois fragmentos de receptor, exercendo seus efeito por

2 0 impactar negativamente a afinidade por LRPl CR3-5

melhorando, ao mesmo tempo, a afinidade por LRP2 CR89.

Dos mutantes diretos de RAP d3 testados, somente a combinação de E251K, K256A e K270E resultou em afinidade mensurável por LRP2 CR89. A constante de dissociação 25 aparente para a ligação desse mutante triplo ao LRP2 CR89 foi de 114 nM, ainda relativamente elevada, comparada com MegaRAPl d3. Essa diferença de afinidade presumivelmente estaria ainda menor com a adição da mutação H249Y. Mutantes de RAP d3 de sítio único em 217, 249 e 251 tiveram efeitos

3 0 mínimos sobre a ligação ao LRPl CR3-5 e não levaram a afinidade por LRP2 CR89 para a faixa mensurável. A mutação K27 0E, isoladamente ou em combinação com E251K, K256A ou ambos, não se ligou de forma mensurável ao LRPl CR3-5. 0 impacto negativo significativo de K256A ou K270E sobre a 5 ligação de RAP d3 ao LRPl foi relatado previamente em um estudo sobre mutantes de RAP com perda de função (55) . Os resultados aqui relatados são consistentes com esse trabalho. No geral, as contribuições positivas das mutações em 249, 251 e 256 em MegaRAPl d3 em direção à ligação de 10 LRP2 CR89 e as contribuições negativas das mutações em 256 e 27 0 sobre a ligação ao LRPl CR3-5 parecem ser primariamente responsáveis pelas diferenças entre MegaRAPl d3 e RAP d3 do tipo selvagem na ligação aos dois fragmentos de receptor.

Uma premissa desse trabalho foi que os aminoácidos em

A, C, A1 e C' dentro das alças de ligação de cálcio de um par de CR eram determinantes cruciais da afinidade de ligação por RAP e também seriam importantes para a ligação de variantes de RAP. Para testar essa idéia, foram preparados LRP2 CR89 mutantes nos quais os resíduos não canônicos nativos nessas posições foram substituídos seqüencialmente com os resíduos canônicos não nativos. Como definido acima, o trecho A, C, A', C' para LRP2 CR89 é YVWR. Os mutantes incluíram LRP2 CR8 9 Y1042W (WVWR) , LRP2 CR89 V1047D (YDWR) , LRP2 CR89 R1088D (YVWD) , LRP2 CR89 V1047D R1088D (YDWD), LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D (WDWD) , LRP2 CR89 Y1042W V1047D (WDWR) , LRP2 CR89 Y1042W R1088D (WVWD) . A ligação tanto à RAP d3 quanto à MegaRAPl d3 foi medida para cada mutante de LRP2 CR89 por ensaio de 3 0 fase sólida. Somente o mutante YVWD reteve ligação significativa à MegaRAPl d3, com uma perda de afinidade aproximada de 2 vezes em relação ao LRP2 CR89 (Figura 6 e Tabela 3). 0 mutante da posição C, com o trecho de seqüência tetramérico de YDWR, não se ligou de forma 5 mensurável à MegaRAPl d3, o que ocorreu com todas as outras mutações únicas ou combinações de mutações que envolvem A ou C. Curiosamente, a mutação nominalmente conservadora Y1042W isoladamente foi suficiente para evitar a ligação de MegaRAPl d3. A posição A1 em LRP2 CR89 é um triptofano, o 10 resíduo canônico para a ligação de RAP d3 do tipo selvagem, e não foi mutada em nossos estudos. Embora a substituição dos aminoácidos em A, C e C1 tenha tido um forte impacto negativo sobre a ligação de MegaRAPl d3, essas substituições não aumentam acentuadamente a afinidade por 15 RAP d3, apesar da substituição com aminoácidos preferidos por RAP d3 em outros pares de CR como, por exemplo, LRPl CR56. Observamos um pequeno aumento na ligação de RAP d3 às combinações WVWD e WDWD em A, C, A' e C' . Esses resultados sugerem que embora alguns aminoácidos na alça de ligação de 20 cálcio sejam importante para a definição do comportamento de ligação de RAP e RAPv2A, eles não são suficientes para fazê-lo isoladamente.

Como um teste da generalidade do método de avaliação, foram feitos experimentos de panning da biblioteca de fagos 25 em proteínas de CR adicionais. Seqüências variantes isoladas são reveladas na Tabela 4 e na Figura 8. Inicialmente, VLDLR CR6-8, que constitui os últimos três domínios de CR de VLDLR humano, foi usado como substrato para panning usando uma biblioteca de apresentação em fago 30 que codifica somente os mutantes de RAP d3. Após cinco rodadas de panning, cinco de oito clones escolhidos aleatoriamente tinham o mesmo conjunto de mutações: R205S, E251R, K256L, K270E, R296L, G313D. Essa variante de seqüência, VRAPl d3, foi expressa para estudos de ligação 5 em fase sólida. A ligação de VRAPl d3, MegaRAPl d3 e RAP d3 ao LRPl CR3-5, LRP2 CR89 e VLDLR CR6-8 foi comparada. Uma seqüência variante similar, E251T, K256I, K270E, R296L, foi selecionada em VLDLR CR78. Também fizemos panning em três pares de CR de matriptase humana, MAT CR12, MAT CR2 3 e MAT 10 CR34, usando a mesma biblioteca de d3. As bibliotecas de fago foram resolvidas para as seqüências predominantes pela sexta rodada de panning nos pares de matriptase. A seqüência predominante selecionada em MAT CR23 foi E251G, K256R, K270W. Essa variante foi denominada MatRAPl (RAP 15 vMA) . A seqüência predominante selecionada em MAT CR34 foi S232P, E239G, E246G, E251L, K256P, I266T, A267V, H268R, K270P, H273Y, R287H, H290Y, K298R, S312F. Essa variante foi denominada MatRAP2 (RAP vMB) . Experimentos de panning também foram realizados no par de CR do antígeno FDC-8D6. A 20 variante predominante selecionada foi K256S, K270S, L271M, D279Y, V283M, K305T, K306M. Essa variante foi denominada 320RAP1.

Para testar a extensão até a qual o comprimento de uma variante da seqüência de RAP d3 poderia ser minimizada, 25 seções truncadas seqüencialmente de MatRAPl foram preparadas por PCR, expressas, purificadas e testadas quanto à ligação como descrito acima (Figura 9). A remoção de 10 aminoácidos diminuiu ligeiramente a afinidade, mas a remoção de 31 e 4 2 aminoácidos do terminal N resultou em 3 0 aumentos incrementais na afinidade de até 3 vezes em relação à variante de d3 de comprimento total. Truncamentos adicionais no terminal N, começando com um adicional de 10 aminoácidos (total de 52), resultaram na perda completa da ligação. 0 truncamento subseqüente no terminal C da melhor 5 variante truncada no terminal N (MatRAPl N-42) resultou em aumentos significativos adicionais na afinidade de ligação, começando com um aumento de 2 vezes (6 vezes em relação ao comprimento total) com a remoção do vinculador do terminal C e do tag de afinidade, e depois um aumento de 4 vezes (12 10 vezes em relação ao comprimento total) após a remoção de um adicional de 6 aminoácidos do terminal C. Truncamentos adicionais no terminal C, começando cora um adicional de 19 aminoácidos, resultou na perda completa da ligação. A melhor variante truncada consistiu nos aminoácidos 243-313 15 (71 aminoácidos) . Para testar a generalidade dessa modificação no aumento da afinidade, fizemos truncamentos idênticos em 320RAP1. A forma truncada resultante dessa variante se ligou com um aumento de 3,5 vezes da afinidade pelo par de antígeno FDC-8D6, quando comparada com a

2 0 variante de comprimento total (Figura 10).

A constante de dissociação aparente para a ligação de VRAPl d3 ao VLDLR CR78 foi determinada como sendo de 44 ± 9 nM. Comparamos então a ligação de RAP d3, MegaRAPl d3, VRAPl d3, MatRAPl d3 e MatRAP2 d3, cada em uma concentração 25 de 80 nM, a catorze pares ou tripletos de CR, incluindo LRPl CR3-5, LRP2 CR89, LRP2 CR2728, LRP2 CR3031, LRP2 CR34-

36, LRP2 CR3 53 6, VLDLR CR78, VLDLR CR6-8, LRP6 CRl-3, LRP6 CRl2, LRP6 CR23, MAT CR12, MAT CR23 e MAT CR34 (Figura 7) . Como anteriormente, RAP d3 só se ligou ao LRPl CR3-5. MegaRAPl d3 se ligou apenas ao LRP2 CR89. VRAPl d3 se ligou tanto ao VLDLR CR7 8 quanto ao VLDLR CR6-8, um tripleto que inclui o par de CR78. MatRAPl e MatRAP2 se ligaram tanto ao MAT CR12 quanto ao MAT CR23, mas não se ligaram apreciavelmente aos outros pares de CR.

Além de panning em pares e tripletos de CR, proteínas

humanas que contêm par de CR inteiras foram usadas como alvos para o procedimento de panning de fago da variante de RAP d3. Essas proteínas disponíveis comercialmente incluíam os ectodomínios de corina, LRP6, antígeno FDC-8D6 e fator

do complemento I. 0 panning foi realizado exatamente como descrito para pares e tripletos isolados de CR.

EXEMPLO 2

Avaliação de variantes de RAP ou anticorpo CR-específico com a utilização de ensaios in vitro e in vivo

Variantes de RAP ou anticorpos CR-específicos são

úteis como agentes terapêuticos ou para o transporte de agentes terapêuticos ou diagnósticos através da barreira hematencefálica ou outros tipos de membranas de tecido para tratar diversas condições ou distúrbios humanos. Ensaios in

2 0 vitro de atividade ou transporte e a medida in vivo da

atividade ou distribuição da variante de RAP são exemplos de métodos para avaliar a eficácia de variantes de RAP. Exemplos desses ensaios serão revelados abaixo.

A preparação de anticorpos CR-específicos que se ligam

a qualquer um dos domínios de CR repetidos aqui descritos pode ser realizada com o uso de qualquer meio conhecido na técnica, e os anticorpos assim preparados podem ser avaliados quanto a ligação relativamente maior aos pares de CR desejados, comparados com outros pares de CR. Os

3 0 anticorpos assim selecionados serão então testados quanto à ligação à proteína que contém CR desejada, comparada com uma ou mais outras proteínas que contêm CR na família. Os anticorpos que preenchem esses critérios podem então ser avaliados, isoladamente ou conjugados a outros agentes 5 ativos, quanto à habilidade para ter como alvo tecidos desejados, alteração da atividade do receptor e/ou prevenção ou tratamento de doença em ensaios exemplares, como os descritos abaixo.

Ensaios antitumorais in vivo que usam variantes de RAP 10 seletivas para matriptase - Para avaliar o efeito antagônico que as variantes de RAP seletivas para matriptase ou um anticorpo CR-específico possuem sobre a formação e progressão tumoral, pelo menos dois modelos in vivo podem ser usados. O primeiro modelo utiliza 15 camundongos nude inoculados com linhagens de células tumorais humanas e é bem descrito na literatura. Esse sistema é útil para testar a habilidade de variantes de RAP ou um anticorpo CR-específico para retardar a progressão do tumor. O segundo modelo utiliza um modelo de camundongo 20 transgênico que superexpressa matriptase de camundongo sob controle do promotor de queratina, restringindo a expressão aos tecidos epiteliais. Esse modelo também foi descrito previamente (List e cols., Genes and Development, 2005, 19: 1.934-1.950) .

Ensaios in vitro de transporte de RAP seletiva para

LRP2 e VLDLR usando células MDCK recombinantes - Para avaliar o transporte de variantes de RAP ou anticorpos CRespecíf icos através de membranas celulares, são usados ensaios in vitro de transporte. Células MDCK transfectadas de forma estável que expressam um mini-receptor LRP2 humano (LB2) e VLDLR humano de comprimento total são cultivadas in vitro. Essas células são plaqueadas em insertos de membrana de poliacetato Transwell (Costar, Cambridge, MA) que possuem um tamanho de poro uniforme de 0,4 μηι. As células 5 são semeadas em uma densidade de 2 x 105/ml e cultivadas em DMEM suplementado com FBS 10%. 0 meio é trocado a cada três dias. As células são mantidas em uma incubadora de CO2 5% a 37°C. Os estudos de transcitose são realizados em triplicata. Vinte minutos antes do ensaio de transporte, o 10 inserto Transwell é equilibrado em tampão de transporte (solução salina balanceada de Hank com HEPES 25 mM e albumina 0,1%) a 37°C. O transporte é iniciado por adição de 125I-Variante de RAP (1 pCi/ml) e "mTc-albumina (2 pCi/ml) às câmaras superiores ou inferiores. A placa é 15 mantida a 37°C com agitação suave a 130 rpm durante todo o procedimento. Em 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos após a adição da proteína marcada, uma amostra de 10 μΐ é coletada da câmara inferior e das câmaras superiores de cada poço. Em 60 minutos, toda a solução nas câmaras

2 0 superiores e inferiores é transferida para tubos de ensaio separados no gelo. A radioatividade total de 125I e "mTc é medida simultaneamente em um contador γ com um programa de canal duplo. A quantidade de RAP e albumina intactas após o transporte é medida por precipitação de ácido e comparação

2 5 das contagens radioativas nas frações solúveis e insolúveis

da amostra.

Medida da distribuição tecidual de RAP e variantes de RAP em camundongos - Para determinar a habilidade das variantes de RAP ou anticorpos CR-específicos para efetuar

3 0 transcitose em tecidos in vivo, é medida a distribuição tecidual de variantes de RAP ou anticorpos CR-específicos era amostras de tecido de animais tratados.

Machos de camundongos CDl, pesando 25-35 gramas (Charles River Laboratories), são anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital 3 0 mg/kg e quetamina 3 0 mg/kg. Cada camundongo recebe uma injeção em bolo de 125IRAP ou variante de RAP ou anticorpo CR-específ ico e 131Ialbumina como um marcador do espaço vascular (1 pCi de cada proteína marcada em Ringer Iactato com albumina 1%) através da veia jugular esquerda. Em intervalos designados (1-60 minutos após injeção), o sangue é coletado por corte da artéria carótida comum direita, e o camundongo era decapitado. Amostras de tecido cerebral e periférico são coletadas e testadas quanto ao peso e à radioatividade. Os volumes de distribuição são calculados usando metodologias bem conhecidas na técnica. Uma diminuição da radioatividade em amostras de tecido indica que a variante de RAP está competindo pela ligação com a RAP do tipo selvagem marcada e está internalizada, ao contrário da RAP do tipo selvagem. Medida dos efeitos antiproliferativos de variantes de

RAP seletivas para LRP6 em ensaios de proliferação celular - a superexpressão de LRP6 foi correlacionada ao aumento da tumorigenicidade. A proteína de RAP é um aglutinante potente de LRP6, e variantes de RAP podem ser úteis para 25 inibir a interação RAP/LRP6, ou para liberar fármacos às células que expressam LRP6. Para examinar a habilidade de variantes de RAP para modular a proliferação celular mediada por LRP6, são realizados ensaios de proliferação celular.

Células HT1080 transfectadas com uma construção de expressão de LRP6 (Li, (2004) Oncogene 23, 9.129-9.135) semeadas em placas de 6 poços (5 x IO4 células por poço) . As variantes de RAP e outros compostos de teste ao incluídos no meio de crescimento a 5-50 nM. 0 meio é 5 trocado e as células coletadas todos os dias. As células são contadas e classificadas quanto à viabilidade usando um sistema de análise celular Vi-Cell. Os tempos de duplicação são obtidos sob as várias condições de teste por regressão não linear usando o software GraphPad Prism. Uma diminuição 10 da proliferação celular na presença de variantes de RAP indica que as variantes de RAP são inibidores eficazes da proliferação celular induzida por LRP6. Podem ser feitos ensaios similares com anticorpos CR-específicos.

Medida dos efeitos antiproliferativos de variantes de RAP seletivas para LRP6 em ensaios de colônia em ágar macio Células HTlO8 0 transfectadas com uma construção de expressão de LRP 6 são cultivadas em placas de 6 poços revestidas com uma camada de ágar (meio DMEM com ágar 0,5% e FBS 5%) . As células são semeadas em uma segunda camada

2 0 contendo 2 x IO3 células em DMEM com ágar 0,33% e FBS 5%. 0 ágar e as células são cobertos com meio para evitar a secagem. Os compostos de teste, incluindo as variantes de RAP, são adicionados diretamente ao meio, e são incubados com as células. O meio é trocado a cada três dias. Poços em

2 5 triplicata são preparados para cada linhagem celular. Após

3 semanas de incubação, colônias maiores do que 0,1 mm de diâmetro são classificadas. Uma diminuição da formação de colônias na presença de variantes de RAP indica que as variantes de RAP são inibidores eficazes da proliferação

3 0 celular induzida por LRP6. Medida dos efeitos antitumorais de variantes de RAP seletivas para LRP6, seletivas para matriptase e seletivas para FDC-813 6 em um modelo de camundongo nude de tumorigenicidade - Para examinar os efeitos de variantes de 5 RAP sobre a inibição de LRP6, matriptase ou antígeno FDC8D6 in vivo, são usados modelos animais experimentais de tumorigenicidade. Podem ser feitos ensaios similares com anticorpos CR-específicos.

Fêmeas de camundongos nude atímicos (4-5 semanas de 10 idade) (Harlan Sprague-Dawley) (Indianapolis, IN) são injetadas por via subcutânea no flanco (9) com células HT1080 transfectadas com uma construção de expressão de LRP6 (6 x IO6 células em 200 μΐ de DMEM sem soro com matriz de Matrigel 50% (BD Biosciences) ) , células de carcinoma da 15 próstata CWR22R (matriptase) (67) ou células de Iinfoma de Burkitt L3055 (antígeno FDC-8D6) (36) . As variantes de RAP seletivas, ou somente veículo, são administradas por injeção na veia da cauda em PBS estéril em dias alternados aos camundongos que recebem células tumorais ou animais de

2 0 controle. Os tamanhos dos tumores são medidos a cada 7

dias, e os volumes do tumor calculados usando medidas da largura (a) e do comprimento (b) (a2 x b/2, em que a < b) .

Medida dos efeitos de variantes de RAP sobre a sinalização Wnt dependente de LRP5 em osteoblastos 25 cultivados - Foi demonstrado que a sinalização Wnt por meio de LRP5 aumenta a diferenciação de osteoblastos, inibe a atividade de osteoclastos e aumenta a deposição óssea (Westendorf, (2004) Gene 341, 19-39; Zhang, e cols., (2004) Mol. Cell. Biol. 24, 4.677-4.684; Mizuguchi, e cols.,

3 0 (2004) J. Hum. Genet. 49, 80-86) . Como RAP se liga a CR em LRP5, as variantes de RAP podem ser úteis para modular a sinalização Wnt através do receptor. A habilidade de variantes de RAP para modular a sinalização Wnt é medida com o uso de osteoblastos cultivados. Podem ser feitos 5 ensaios similares com anticorpos CR-específicos.

A linhagem de células osteoblásticas MG63 expressa grande quantidades de LRPl e não expressa VLDLR. Células SAOS-2 expressam grandes quantidades de VLDLR e quase não expressam LRPl (N° de Acesso na "American Type Culture Collection" (ATCC) HTB-85. Células MG63 e SAOS-2 são desenvolvidas em DMEM suplementado com FBS 10% a 37°C em CO2 10%. Os meios são suplementados com Wnt7a para induzir a via de sinalização Wnt, juntamente com tampão, DKK-1, Mesd, RAP ou variantes de RAP. Após lavagem em PBS gelado, as células são coletadas e homogeneizadas em um homogeneizador de vidro Dounce com Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, NaCl 14 0 mM, DTT 2 mM, PMSF 2 mM e 1 x inibidores de protease Complete™ (50 0 μΐ/poço). O homogeneizado é centrifugado por 10 minutos a500xg, eo sobrenadante é ainda centrifugado a 100.000 x g a 40C por 90 minutos. Os níveis de β-catenina são medidos no sobrenadante clarificado por Western blotting usando anticorpo específico para β-catenina de Cell Signaling Technology. As proteínas imunorreativas são detectadas usando o sistema ECL. Alternativamente, as células primeiro são transfectadas com 0,5 μg da construção de luciferase TOPFLASH TCF (Upstate Biotechnology), juntamente com 0,5 μg de vetor de expressão de β-catenina, 0,5 μg de vetor de expressão de Wntl ou vetor vazio pcDNA3. Um vetor de expressão de β-galactosidase (Promega, Madison, WI) é incluído como controle interno para eficiência da transfecção. Após 48 horas, o meio é trocado e tampão, DKK

1, Mesd, RAP ou variantes de RAP é adicionado. Após incubação por mais 6 horas, as células são lisadas e as 5 atividades de luciferase e de β-galactosidase são determinadas com kits de ensaio de enzima (Promega). A atividade de luciferase é determinada com um luminômetro usando o sistema de Ensaio Duplo de Luciferase (Promega). A atividade de luciferase é normalizada para a atividade da 10 β-galactosidase.

EXEMPLO 3

Produção e caracterização de peptídeos cíclicos da RAP

Peptídeos cíclicos da RAP foram produzidos e caracterizados quanto à afinidade de ligação da seguinte 15 forma: os peptídeos da RAP foram fabricados por Abgent (San Diego). Os peptídeos foram purificados por HPLC e caracterizados por espectrometria de massa. Ectodomínio de VLDLR recombinante de camundongo expresso e purificado por NSO e cluster II de ligação de ligante de LRPl humano

2 0 recombinante foram adquiridos de R&D Systems (Minneapolis). RAP d3 sem Tag foi expresso e purificado por GeneScript (San Diego) . RAP humana foi obtida do Dr. Guojun Bu (Washington University em St. Louis, School of Medicine). Ensaios de Bradford foram usados para quantificação de

2 5 proteína.

Os ensaios de ligação de fase sólida foram realizados da seguinte forma: ectodomínio de VLDLR murídeo recombinante (aa 1-798, hexahistidina do terminal C, 1 pg) ou cluster rhLRPl II (aa 786-1.165, Fc do terminal C, 1 pg)

3 0 foram ligados às placas de 96 poços Nunc MaxisorpTM em TBS pH 8 suplementado com CaCl2 5 mM (TBSC) de um dia para o outro a 4 °C. Os poços foram lavados com TBSC e depois bloqueados com TBSC contendo 2% BSA. Os peptídeos foram então incubados com o receptor imobilizado em uma gama de 5 concentrações por 2 horas no tampão de bloqueio acima suplementado com Tween-20 0,05% em temperatura ambiente. Foram feitas reações de ligação idênticas na presença de EDTA 5 0 mM para fornecer uma medida da ligação não específica. Os poços de controle não continham peptídeo 10 adicionado. Controles individuais estabeleceram ausência de reatividade cruzada entre anticorpos e receptores. Os poços foram lavados com TBSTC e os peptídeos ligados detectados com estreptavidina-HRP (Pierce) ou policlonal anti-RAP (1:1.000, Raptor Pharmaceutical). A ligação do anticorpo 15 policlonal anti-RAP para testar peptídeos foi confirmada qualitativamente por Western blotting (dados não mostrados). O excesso de estreptavidina-HRP ou anticorpo primário foi removido e poços lavados, antes da incubação com o anticorpo secundário, quando necessário, IgG de cabra 20 anticoelho conjugada à HRP (Bio-Rad) . A cor foi desenvolvida usando reagentes TMB (BioRad). A absorção a 450 nm foi medida com um espectrofotômetro de microplacas (Molecular Devices). A absorção obtida na presença de EDTA foi subtraída da absorção obtida na presença de cálcio, 25 antes da análise. Os dados foram tabulados e os valores de Kd derivados por regressão não linear pressupondo ligação a um único sítio (GraphPad Prism).

Um peptídeo de RAP d3 sem tag, purificado, expresso de forma bacteriana, que compreende os aminoácidos 201-319 da

3 0 RAP humana madura, foi adquirido de GeneScript. Esse peptídeo é desprovido do tetrapeptídeo HNEL do terminal C. Uma cisteína única foi incluída no terminal C para facilitar a marcação da afinidade. 0 peptídeo de RAP d3 foi ligado à maleimida-PE02-biotina (Pierce) e o conjugado 5 resultante purificado por dessalinização e captura do peptídeo não reagido com glóbulos de Sefarose ativados por tiol (GE Biosciences). Todos os outros peptídeos foram feitos por síntese peptídica de fase sólida. A inspeção dos dados estruturais para o complexo entre RAP d3 e LDLR CR3 e 10 4 sugeriu que um truncamento significativo de RAP d3 poderia ser feito sem remoção de resíduos que constituem a superfície de contato com pares de CR. Como algumas das seqüências que flanqueiam a superfície de contato foram implicadas na estabilização da dobragem, concluímos que um 15 dissulfeto não nativo poderia ser introduzido como um meio de estabilização da estrutura dobrada em sua ausência. Para criar uma versão minimizada de RAP d3, mRAPc (ID. DE SEQ. N°: 99), pares intimamente opostos de resíduos localizados no terminal N para H24 9 na hélice 1 e no terminal C para

2 0 T3 03 na hélice 2 na estrutura do complexo de RAP d3 LDLR CR3 e 4 foram identificados e substituídos com glicinas. Essas substituições foram A242G e R314G. A introdução de glicinas nesses sítios visava permitir uma quebra na hélice para uma ligação dissulfeto inter-helicoidal adjacente não 25 nativa. Duas cisteínas foram então substituídas antes e depois de G242 e G314 na hélice 1 e 2, respectivamente, para permitir a formação de uma ligação dissulfeto. Essas substituições foram E241C e I315C. Nenhum resíduo adicional foi incluído no terminal para C315 na hélice 2. A seqüência 30 biotina-GGSGG (ID. DE SEQ. N°: 102) foi adicionada ao terminal N para E241C na hélice 1 para permitir a detecção eficiente com conjugados de estreptavidina-repórter. O peptídeo foi ciclizado por meio da formação intramolecular de ligação dissulfeto durante a síntese de fase sólida.

5 Para um controle linearizado do peptídeo mRAPc, denominado mRAP, ambas as cisteínas foram substituídas com serinas. Como controle adicional para mRAPc, foi feito um peptídeo fora isso idêntico com as mutações K256A e K270E, mRAPcko. Foi demonstrado previamente que essas mutações reduzem 10 significativamente a afinidade de RAP d3 por LRPl.

A afinidade de ligação dos peptídeos por LRPl e VLDLR, outro receptor na família do LDLR, foi medida da seguinte forma: hrLRPl ou mVLDLR expresso e purificado por NSO (R&D Systems) foram usados para revestir poços em placas de 96 15 poços. Várias diluições dos peptídeos de teste foram incubadas com os receptores imobilizados na presença e ausência de EDTA 50 mM em triplicata. Os peptídeos ligados foram detectados com estreptavidina-HRP após intensa lavagem. Os valores de ligação medidos na presença de EDTA

2 0 foram subtraídos dos valores medidos na ausência de EDTA a fim de determinar os níveis da ligação dependente de cálcio. Os valores corrigidos foram tabulados e ajustados por regressão não linear pressupondo um sítio de ligação único usando GraphPad Prism. Os resultados são apresentados 25 nas Figuras 12A e 12B.

Embora mRAP (ID. DE SEQ. N°: 107) e mRAPcko não tenham afinidade mensurável por cluster II de hrLRPl, mRAPc ligouse com alta afinidade de forma cálcio-dependente com uma Kd de 10 ± 2 nM. Essa afinidade de ligação não era distinguível daquela de d3 de RAP de comprimento total nesse sistema (8 ± 1 nM) . Além disso, a ligação dos peptídeos a todo o ectodomínio de camundongo VLDLR foi medida. As afinidades de ligação foram novamente comparáveis, com constantes de dissociação de 5 ± 1 nM para 5 mRAPc e 1 ± 0,2 para d3 de RAP de comprimento total.

EXEMPLO 4 Caracterização de peptídeos cíclicos da RAP adicionais

Peptídeos cíclicos da RAP adicionais foram desenvolvidos como descrito acima, e testados quanto à sua habilidade para se ligar ao receptor LRPl.

Para gerar o peptídeo mRAP-8c, foi utilizada a seqüência peptídica truncada de RAP dos aminoácidos 246 a 312, e foram feitas substituições de aminoácidos da seguinte forma: E246C, L247G e L311G e S312C. 0 peptídeo 15 mRAP-8c é apresentado no ID. DE SEQ. N°: 100. Para gerar um peptídeo truncado mais ainda, mRAP-14c, foi usada uma RAP truncada que começa na posição 250 e termina na posição 309. Foram feitas substituições de aminoácidos para mRAP14c da seguinte forma: F250C e L308G e Q309C. Nenhuma 20 glicina foi substituída após a cisteína no caso de mRAP14c, porque a cadeia lateral F250C da hélice 1 já está apontada diretamente na hélice 2 na estrutura do complexo. A seqüência de mRAP-14c é apresentada no ID. DE SEQ. N° : 101. Outro peptídeo ciclizado truncado, Heptide, foi 25 desenvolvido. A seqüência de Heptide é derivada dos aminoácidos 24 6 a 313 de RAP. Foram feitas substituições de aminoácidos para gerar Heptide da seguinte forma: E246C, L247G, G280A, L311A e S312C. A seqüência de Heptide ê apresentada no ID. DE SEQ. N°: 103.

3 0 A ligação dos peptídeos mRAP-8c e mRAP-14c aos receptores LRPl e VLDLR foi avaliada como acima. mRAp-8c ligou-se ao receptor LRPl (cluster II) com uma afinidade de aproximadamente 4 a 6 nM (em dois ensaios separados) , enquanto mRAP-14c se ligou com uma afinidade de aproximadamente 21 nM. 0 peptídeo cíclico Heptide se ligou ao LRPl com uma afinidade de aproximadamente 3,5 nM.

Esses resultados demonstram que vários peptídeos cíclicos da RAP diferentes são capazes de se ligar ao receptor LRPl com alta afinidade.

EXEMPLO 5

Ligação de peptídeos cíclicos da RAP às células in vitro

A fim de determinar a habilidade dos peptídeos cíclicos da RAP para se ligar ao receptor na superfície de uma célula, a ligação foi avaliada na presença de linhagens celulares cultivadas. Para determinar se os peptídeos cíclicos de RAP poderiam ser ligados e endocitados por LRPl de comprimento total expresso em células em cultura, foi usado um ensaio de toxicidade dependente de endocitose. Duas linhagens celulares foram usadas, células de ovário de hamster chinês CHO-Kl que expressam apenas um receptor de RAP de alta afinidade, LRPl, e uma CHO-Kl mutante que não possui expressão de LRPl foi usada como controle. As células foram cultivadas em meio BioWhittaker UltraCHO (Lonza, Basel, Suíça) suplementado com soro bovino fetal 2,5%. As células foram semeadas em placas de cultura de tecido de 12 poços. 0 mRAPc biotinilado foi combinado com quantidades eqüimolares de um conjugado entre estreptavidina e a toxina bacteriana saporina (ZAP, Avanced Targeting Systems, San Diego, CA). A mistura foi diluída em MEM sem vermelho fenol (Mediatech, Manassas, VA) suplementado com FBS 10% até 10 0 nM. mRAPc conjugado (100 nM) e agentes de controle (somente mRAPc, 100 nM, somente estreptavidina-saporina, 100 nM, somente saporina, 1 mM) foram cultivados com células confluentes, e a morte celular 5 foi testada 4 8 horas mais tarde por meio do ensaio de MTT (Invitrogen, San Diego, CA) .

Os resultados são apresentados na Figura 12. O peptídeo mRAPc isoladamente não teve nenhum efeito sobre a sobrevida celular, independentemente do tipo de célula 10 usado. 0 conjugado de estreptavidina-saporina isoladamente reduziu o número de células viáveis por aproximadamente 10% para células CHO-Kl do tipo selvagem, sem nenhum efeito sobre as células deficientes em LRP. A combinação de mRAPc e do conjugado citotóxico reduziu o número de células 15 viáveis em quase 40% para CHO-Kl do tipo selvagem, com uma perda de apenas 5% para as células deficientes em LRP.

Esses dados sugerem que o peptídeo mRAPc pode aumentar significativamente a toxicidade do conjugado citotóxico de uma forma receptor-dependente por internalização da toxina por meio da via endocítica de LRPl.

Também foram feitos ensaios de inibição da ligação para determinar a habilidade do peptídeo mRAPc para interferir com a ligação de RAP d3 ao LRPl (cluster II) , bem como a ligação de ligantes de LRP, α-2-macroglobulina e 25 uPA/PAI-1. Para permitir a formação de complexo com estreptavidina ou um anticorpo anti-biotina, o peptídeo mRAPc foi adaptado com um resíduo de biotina no terminal N separado da seqüência de RAP por um vinculador pentapeptídico (GGSGG). Foram feitos ensaios de ligação de

3 0 fase sólida usando cluster II do LRPl humano recombinante (aminoácidos 786-1.165, com tagr Fc do terminal C, 1 pg, R&D Systems, Minneapolis, MN) para revestir placas de 96 poços Nunc MAXISORP™ em TBS pH 8 suplementado com CaCl2 5 mM (TBSC) de um dia para o outro a 4°C. Foram gerados dados 5 por ensaio ELISA. Os poços foram lavados com TBSC e bloqueados com TBSC contendo BSA 2%. Em ensaios que envolvem complexos entre estreptavidina e peptídeo biotinilado, ligantes de LRPl (RAP d3 (2 nM), a-2- macroglobulina ativada por tripsina (1 nM) ou uPA/PAI-1 (10 10 nM) foram incubadas com o receptor imobilizado, na presença ou ausência de inibidores, por 2 horas no tampão de bloqueio acima suplementado com Tween-20 0,05% em temperatura ambiente. Em ensaios que envolvem complexos do anticorpo anti-biotina e peptídeo biotinilado, todas as 15 soluções de inibidor foram pré-incubadas com LRPl-C2 imobilizado, antes da lavagem e subseqüente incubação com ligante. Como a competência de ligação de ligante de pares de CR exige cálcio, foram feitas reações de ligação idênticas na presença de EDTA 50 mM para fornecer uma

2 0 medida da ligação não específica. Os poços de controle não

continham inibidor adicionado. Os poços foram lavados com TBS suplementado com CaCl2 5 mM e Tween-20 0,05%. 0 ligante ligado foi detectado com conjugado de anti-S-peptídeo-HRP (Abcam, Cambridge, MA), anti-a-2-macroglobulina-HRP ou 25 anti-PAI-l-HRP. O excesso de conjugado de HRP foi removido e os poços lavados. A cor foi desenvolvida com o uso de reagentes TMB (BioRad, Hercules, CA) . A absorção a 450 nm foi medida com um espectrofotômetro de microplacas (Molecular Devices, Palo Alto, CA).

3 0 A habilidade de mRAPc, na presença e ausência de estreptavidina ou anticorpo anti-biotina, para inibir a ligação de RAP d3 recombinante ao LRP1-C2 foi medida. 0 grau de inibição (EC50) para o peptídeo monomérico foi de 32 + 12 nM (Figura 14A) . A EC50 para mRAPc combinado com meio mole equivalente de estreptavidina, mas fora isso sob condições idênticas, foi de 4 + 2 nM, um aumento de quase 8 vezes em relação ao peptídeo isoladamente (Figura 14) . A RAP Madura apresentou uma EC50 de 0,5 ± 2 nM, 64 vezes melhor do que o peptídeo monomérico mRAPc e cerca de 8 vezes melhor do que o peptídeo montado em estreptavidina. A estreptavidina isoladamente não teve nenhum efeito inibidor. O aumento multiplicado da inibição observado na presença de estreptavidina é consistente com um aumento da avidez mediante a multimerização do domínio de RAP minimizado.

Considerando a afinidade monovalente relativamente fraca do anticorpo anti-biotina por biotina (baixa KD nanomolar), foi formulada a hipótese de que a pré-montagem de um complexo multivalente que consiste em dois peptídeos

2 0 ligados ao receptor adequadamente próximos e um único

anticorpo estabilizaria o complexo peptídeo-anticorpo. Portanto, o anticorpo e o peptídeo, em uma proporção molar de um para três, foram incubados com o receptor imobilizado, antes da lavagem e adição subseqüente do 25 ligante de RAP d3. 0 mesmo procedimento foi realizado para os controles; somente peptídeo, somente anticorpo e RAP. Usando esse método, foi derivada uma EC50 para o peptídeo mRAPc isoladamente de 17 ± 1 nM (Figura 14B). A combinação de mRAPc com o anticorpo anti-biotina gerou uma EC5O de 2 ±

3 0 I nM. RAP de comprimento total gerou uma EC50 de 0,3 ± 7 nM. O anticorpo isoladamente não teve nenhum efeito inibidor. Como foi o caso com estreptavidina tetravalente, a adição do anticorpo bivalente aumentou significativamente a habilidade do peptídeo para inibir a ligação de RAP d3 ao 5 LRP1-C2. A seguir, foi determinado o efeito do mRAPc multimerizado. 0 mRAPc multimerizado foi comparado com o monômero de mRAPc e RAP de comprimento total na inibição de ligação de dois outros ligantes ao LRP1-C2, a-2- macroglobulina ativada por tripsina e o complexo uPA/PAI-I, 10 em uma única concentração de ligante. 0 complexo de estreptavidina e mRAPc inibiu a ligação do ligante heterólogo com uma EC50 de 1 ± 1 nM, 7 vezes melhor do que peptídeo monomérico isoladamente, a 7 + 1 nM (Figura 14C). Em ambos os casos, o complexo de estreptavidina e mRAPc 15 inibiu a ligação com uma EC50 aproximadamente média entre RAP e o monômero de mRAPc.

Esses resultados demonstram que a vantagem da avidez da RAP multivalente na ligação a receptores multivalentes. Os resultados mostram que uma seqüência peptídica sintética 20 multimerizada em estreptavidina ou uma imunoglobulina é capaz de recapitular parcialmente a potência inibidora da RAP de comprimento total contra três ligantes de LRPl.

EXEMPLO 6 Administração de peptídeos cíclicos da RAP in vivo

Os resultados prévios demonstram que os peptídeos da

RAP ciclizados truncados se ligam eficientemente aos receptores LRPl na superfície das células in vitro. A fim de medir a eficácia dos peptídeos cíclicos da RAP in vivo, foram feitos ensaios de biodistribuição.

3 0 Os estudos foram realizados em Charles River Laboratories in Montreal, Canadá. 0 peptídeo mRAPc biotinilado, proteína de RAP biotinilada ou tampão foram combinados com 35S-SLR-estreptavidina (0,7 mCi/ml, 300 Ci/mmol, GE Healthcare) e dialisados contra solução salina 5 tamponada com fosfato (PBS) com cassetes de diálise DTUBE™ (14 kD MWCO, EMD Biosciences/Merck, Darmstadt, Alemanha). Machos de ratos Sprague-Dawley (6-8 semanas) foram injetados com materiais de teste (2 μΐ /g; aproximadamente 2 0 pCi/rato) através de uma veia da cauda. 10 Os animais foram sacrificados trinta minutos pós-injeção com pentobarbital (200 mg/kg). Todos os indivíduos foram tratados de acordo com as diretrizes apresentadas pelo ''Canadian Council on Animal Care for the humane treatment of laboratory animais". As carcaças foram congeladas, 15 embebidas em carboximetilcelulose e cortadas para análise por auto-radioluminografia semiquantitativa de corpo inteiro (QWBA) usando um aparelho de imagens de fósforo Fuji BAS-2500. As áreas delineadas nitidamente dentro dos órgãos testados para cada animal foram selecionadas para 20 análise de luminescência ("Fuji Image Reader" v 1.1 e "Fuji Image Gauge" v 3.12). Os valores são registrados em unidades de luminescência foto-estimulada por unidade área (PSL/mm2) .

Considerando a potência de mRAPc multimérico na 25 inibição da ligação ao LRP1-C2, foi determinada a eficácia do peptídeo multimérico e sua habilidade para mimetizar o comportamento de biodistribuição in vivo de RAP de comprimento total após injeção intravenosa. 0 comportamento é caracterizado por um acúmulo primário no fígado 30 (Warshawsky e cols., J. Clin. Invest. 92: 937-944, 1993), em que o acesso ao sangue ao LRPl em hepatócitos é elevado (Beisiegele cols., Nature 341: 162-164, 1989; Moestrupe cols., Cell Tíssue Res. 269: 375-382, 1992). A preparação de estreptavidina marcada com 35S foi combinada com o 5 peptídeo mRAPc biotinilado, em uma proporção molar de vinte para um, ou com RAP biotinilada in vivo, em uma proporção molar de cinco para um, e injetada por via intravenosa nos ratos. Estreptavidina marcada isoladamente foi usada como controle. Há relatos de que a estreptavidina se acumula no 10 rim, mas não significativamente no fígado, após injeção intravenosa (Wilbur e cols., Bioconjug. Chem. 9: 100-107, 1998; Rosebrough e cols., J. Nucl. Med. 37: 1.380-1.384, 1996) .

A preparação de RAP biotinilada se distribuiu no 15 fígado em níveis 2,7 vezes maiores do que aquele da estreptavidina isoladamente, e em níveis similares ou menores em todos os outros tecidos testados (Figura 15). 0 peptídeo mRAPc, pré-montado em estreptavidina marcada, se distribuiu no fígado em níveis mais de 7 vezes maiores do

2 0 que aquele da estreptavidina isoladamente, e com níveis

similares ou menores comparados com o controle em todos os outros tecidos testados (Figura 15) . É notável que níveis elevados de ligantes de LRPl em competição no sangue foram aparentemente incapazes de bloquear a captação hepática do 25 complexo de peptídeo, uma observação feita previamente, bem como aqui, para RAP de comprimento total administrada por via intravenosa (veja Isbell e cols., Biochem. Biophys. Res. Comm. 364: 614-619, 2007).

Os resultados dos dados de biodistribuição sugerem que

3 0 versões de RAP menores, com base nos peptídeos, podem se mostrar úteis no desenvolvimento de agentes farmacológicos direcionados ao fígado.

EXEMPLO 7 Conjugados de peptídeos cíclicos da RAP

5 Os peptídeos da RAP e os peptídeos cíclicos da RAP

podem ser conjugados a vários agentes citotóxicos ou a outros agentes para liberação dos agentes a uma célula que expressa um receptor de RAP. Peptídeos conjugados são feitos com o uso de metodologias bem conhecidas na técnica. Conjugados exemplares de peptídeo cíclico da RAP são

descritos na Figura 13, que ilustra conjugado Heptide à difluormetilornitina (Heptide-Octa-difluormetilornitina) e Heptide conjugado ao quinase inibidor de tirosina SU6668 (Heptide-mono-SU6668) . O peptídeo Heptide na Figura 13A 15 (ID. DE SEQ. N°: 104) inclui o vinculador pentapeptídico GGSGG (ID. DE SEQ. N°: 102). 0 Heptide-mono-SU6668 é gerado por conjugação da porção de SU6668 à glicina do terminal N no heptide (Figura 13C, ID. DE SEQ. N°: 105) . 0 HeptideOcta-dif luormetilornitina (DMFO) é gerado por adição de uma 20 lisina à glicina do terminal do peptapeptídeo. Essa lisina do terminal N é modificada por adição de uma lisina (Kl) conectada ainda a duas lisinas (K2, K3), cada uma conjugada a duas porções de DMFO. A primeira lisina (Kl) está também conectada a um resíduo de ornitina que compreende duas 25 porções de DMFO, e ainda está conectada a um resíduo final de lisina (K4) conjugado a dois resíduos de DMFO (Figura 13B e ID. DE SEQ. N°: 106).

Conjugados adicionais podem ser feitos por aqueles habilitados na técnica com o uso de qualquer um dos agentes

3 0 aqui descritos ou conhecidos na técnica. EXEMPLO 8

Administração de peptídeos cíclicos da RAP conjugados in

vitro

Linhagens de células de hepatócitos são usadas para 5 avaliar a ligação de peptídeos cíclicos da RAP à superfície celular, bem como peptídeos cíclicos da RAP conjugados a um agente químico.

Linhagens de células de carcinoma hepatocelular (HCC), tais como Heb3B, HepG2 e Huh-7, ou linhagens de células de 10 hepatócitos humanos normais como, por exemplo, THLE-5b, ou hepatócitos primários (veja, por exemplo, Shimizu e cols., Metabolism. 56: 1.478-85, 2007; Agrawal e cols., Stem Cells. 21 de fevereiro de 2008), são cultivadas de acordo com metodologias conhecidas na técnica. As células 15 cultivadas são tratadas com peptídeo cíclico da RAP conjugado a agentes citotóxicos como, por exemplo, difluormetilornitina (peptídeo cíclico da RAP-octadifluormetilornitina) ou SU6668 (peptídeo cíclico da RAPmono-5U6668), peptídeo cíclico da RAP isoladamente ou 20 difluormetilorinitina ou SU6668 isoladamente. As células são tratadas com reagente nas seguintes concentrações: 0,05 a 50 μΜ de peptídeo cíclico da RAP-octadifluormetilornitina, 0,2 a 200 μΜ de peptídeo cíclico da RAP-mono-SU6668, 0,05 a 200 μΜ de peptídeo cíclico da RAP 25 isoladamente, 0,05 a 50 μΜ de difluormetilorinitina ou 0,2 a 200 μΜ de SU6668. Os peptídeos cíclicos da RAP conjugados são avaliados quanto ao seu efeito citostático e citotóxico sobre culturas de hepatócitos.

Após o tratamento com o peptídeo cíclico da RAP ou peptídeos cíclicos da RAP conjugados, os efeitos citotóxicos e citostáticos são medidos de acordo com metodologias conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Elmore e cols., In Vitr Mol. Toxicol. 14: 191-207, 2001; Miret e cols., J. Biomol. Screen. 11: 184-93, 2006), e a 5 extensão do crescimento celular ou da morte celular na presença dos agentes de teste é determinada.

A habilidade do peptídeo cíclico da RAP conjugado para reduzir o crescimento de células em cultura indica que os peptídeos cíclicos se ligam ao receptor na superfície das 10 células e são um meio eficaz para a liberação de agentes nas células, resultando em um efeito biologicamente mensurável.

EXEMPLO 9

Administração de peptídeos cíclicos da RAP in vivo

A fim de avaliar a ligação ao receptor de peptídeos

cíclicos da RAP in vivo, bem como avaliar a habilidade da molécula para liberar compostos citotóxicos às células in vivo, são usados modelos ortotõpicos de carcinoma hepatocelular humano.

Para a geração de tumores ortotópicos em animais,

linhagens de células de hepatocarcinoma humano são implantadas em camundongos atímicos, ratos ou outro animal apropriado, e permite-se que as células tumorais cresçam in vivo. As linhagens de células de HCC úteis para os modelos 25 ortotópicos incluem, sem limitação, aquelas linhagens celulares descritas acima, tais como Heb3B, HepG2 e Huh-7. Modelos ortotópicos de tumor de HCC são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Okubo e cols. (J. Gastroenterol. Hepatol. 2007 22: 423-8); Armengol e cols.,

3 0 (Clín. Cancer Res. 2 004 10: 2.150-7); e Yao e cols., (Clin. Cancer Res. 2003 9: 2.719-26).

Para estabelecer inicialmente uma faixa de dose para administração dos peptídeos cíclicos da RAP conjugados e controles in vivo, é feito um estudo de faixas de doses pequenas usando 5 camundongos por grupo, que recebem peptídeo cíclico de RAP conjugado (por exemplo, peptídeo cíclico da RAP-octa-difluormetilornitina (até 200 mg/kg/dia), peptídeo cíclico da RAP-mono-SU6668 (até 200 mg/kg/dia)), peptídeo cíclico da RAP isoladamente (até 200 mg/kg/dia), difluormetilornitina ou SU6668 isoladamente. Os agentes de teste são administrados por via intravenosa ou intraperitoneal diariamente por duas semanas (QDxl4) e os animais em questão testados quanto a mudanças no peso corporal, quaisquer observações clínicas e estudos de patologia clínica e histopatológico de tecidos no ponto final do estudo.

Para realizar um estudo de eficácia, são usados 8 a 10 camundongos por grupo, e 3 faixas de doses de teste dos compostos acima (peptídeo cíclico da RAP-octa20 difluormetilornitina, peptídeo cíclico da RAP-mono-SU666 8, peptídeo cíclico da RAP isoladamente, difluormetilorinitina ou SU6668) são administradas aos animais que recebem HCC células de humano e animais de controle. Os agentes de teste são administrados por via intravenosa ou 25 intraperitoneal, e são administrados em uma freqüência apropriada, por exemplo, diariamente por 4 semanas (QDx28), diariamente por 3 semanas (QDx21) ou diariamente por 2 semanas (QDxl4). Os animais em questão são então avaliados quanto a quaisquer alterações no peso corporal, observações

3 0 clínicas e medidas da eficácia in vivo, tais como volume do tumor, histopatologia hepática e patologia clínica geral, usando metodologias conhecidas na técnica.

A habilidade dos peptídeos cíclicos da RAP conjugados para reduzir o crescimento de células carcinoma 5 hepatocelular in vivo demonstra que os peptídeos cíclicos se ligam ao receptor celular na superfície da célula tumoral e são um meio eficaz para liberar agentes nas células, resultando em um efeito biologicamente mensurável. A demonstração de morte tumoral eficiente em modelos

animais sugere que os peptídeos cíclicos da RAP conjugados são um método eficiente para a liberação de agentes citotóxicos às células tumorais em seres humanos que sofrem de hepatocarcinoma ou de outras condições nas quais os receptores de RAP estão associados.

Todas as composições e/ou métodos aqui revelados e

reivindicados podem ser feitos e executados, sem experimentação desnecessária à luz da presente revelação. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, ficará

2 0 evidente para aqueles habilitados na técnica que variações

podem ser aplicadas às composições e/ou aos métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descritos, sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, ficará evidente que certos agentes

que estão química e fisiologicamente relacionados podem servir de substitutos para os agentes aqui descritos, sendo obtidos resultados iguais ou similares. Todos esses substitutos e modificações similares evidentes para aqueles habilitados na técnica são considerados como incluídos no

3 0 espírito, escopo e conceito da invenção, como definida pelas reivindicações em anexo.

As referências aqui citadas ao longo da especificação, na medida em que forneçam detalhes de procedimentos exemplares ou outros detalhes suplementares àqueles aqui apresentados, são aqui especificamente incorporadas por referência.

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PROSTATE 61, 228-35.

Claims (52)

1. Peptídeo cíclico da RAP caracterizado por possuir menos do que cerca de 8 5 aminoácidos de comprimento que compreende 50 aminoácidos contíguos que são pelo menos 70% idênticos ao ID. DE SEQ. N°: 97, e que se liga a uma proteína que contém CR com uma Kd da afinidade de ligação de cerca de 1 x IO"8 M ou menos.

2. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se ligar ao LRPl com uma Kd de cerca de 1 x IO"8 M ou menos.

3. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma mutação em qualquer uma das posições 251, 256, 257, 266, 270, 279, 280, 2 96 ou 3 05 da RAP madura.

4. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se ligar seletivamente ã matriptase.

5. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma mutação em qualquer uma das posições 251, 256, 257, 266, 270 ou 280 de RAP.

6. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma mutação na posição 251 de RAP.

7. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma mutação na posição 256 de RAP.

8. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma mutação na posição 257 de RAP.

9. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma mutação na posição 266 de RAP.

10. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma mutação na posição 270 de RAP.

11. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma mutação na posição 280 de RAP.

12 . Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se ligar seletivamente a uma proteína do VLDLR.

13. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender uma mutação em qualquer uma das posições 251, 256, 270 ou 296 de RAP.

14. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender uma mutação na posição 2 51 de RAP.

15. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender uma mutação na posição 256 de RAP.

16. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender uma mutação na posição 270 de RAP.

17. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender uma mutação na posição 296 de RAP.

18. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se ligar seletivamente a uma proteína de FDC-8D6 (CD320).

19. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender uma mutação em qualquer uma das posições 251, 256, 270,279 ou 305 de RAP.

20. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender uma mutação na posição 251 de RAP.

21. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender uma mutação na posição 256 de RAP.

22. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender uma mutação na posição 270 de RAP.

23. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender uma mutação na posição 27 9 de RAP.

24. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender uma mutação na posição 3 05 de RAP.

25. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender o ID. DE SEQ. N°: 97.

26. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado por conter pelo menos uma mutação adicional nas posições 271-319 de RAP.

27. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou -26, caracterizado por conter pelo menos uma mutação nas posições 205-250 de RAP.

28. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a referida mutação é a substituição de um aminoácido acídico com um aminoácido básico.

29. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido acídico é selecionado do grupo que consiste em D e E.

30. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido básico é selecionado do grupo que consiste em K e R.

31. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a referida mutação é uma substituição de um aminoácido básico com um aminoácido acídico.

32. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido básico é selecionado do grupo que consiste em K e R.

33. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido acídico é selecionado do grupo que consiste em D e E.

34. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a referida mutação é a substituição de um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Ai C, D, E, G, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T e V com um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F, Y, W, e H.

35. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, caracterizado por compreender uma mutação em três ou mais das seguintes posições: 175, 205, 213, 217, 226, 230, 232, 239, 241, 242, 246, 247, 249, 250, 251, 256, 257, 261, 266, 267, 268, 270, 273, 279, 280, 287, 290, 294, 296, 297, 298, 305, 308, 311, 312, 313, 314 ou 315.

36. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, caracterizado por compreender uma mutação em três ou mais das seguintes posições: 205, 217, 249, 251, 256, 257, 266, 270, 294, 296, 297, 305.

37. Peptídeo cíclico da RAP, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, caracterizado por compreender três ou mais das seguintes mutações: R205S, S213T, E217K, L226M, H249Y, E230V, S232P, E239G, E246G, E251L, E251K, E251T, E251G, E251P, E251N, E251R, K256R, K256V, K2 5 6A, K256I, K25 6P, K256L, I266F, I266T, K257Y, Q261R, A2 67V, H268R, K270P, K27 0D, K270N, K27 0G, K27 0E, K270W, L271M,, H273Y, D279Y, V283M, R287H, H290Y, H2 90L, E294V, R296L, T297I, K29 8R, , K305T, K3 06M , S312F, G313D E246C, L24 7G, G2 8 0A, L311A, S312C, Q309C, F250C, L308G,L311G, E241C e I315C.

38. Método de tratamento de uma doença por administração de um peptídeo cíclico da RAP de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo cíclico da RAP se liga seletivamente a uma proteína que contém CR que está envolvida na fisiopatologia da doença.

39. Composto caracterizado por compreender o peptídeo cíclico da RAP de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-37 conjugado a um agente diagnóstico ou terapêutico.

40. Composto, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o peptídeo cíclico da RAP e o agente diagnóstico ou terapêutico estão ligados por meio de um vinculador.

41. Composto, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido vinculador é um vinculador peptídico.

42. Composto, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico ê selecionado do grupo que consiste em um fator de crescimento neuronal derivado de célula glial (GDNF), fator de crescimento neuronal derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento neuronal (NGF), desintegrina e metaloproteinase domínio 10 (ADAMlO), uma proteína acompanhante para LRP5/6 (MESD), agentes quimioterápicos para o câncer, inibidores de protease, moléculas próapoptóticas, antígenos autoimunes, enzimas lisossômicas, nanopartícuias, glicoconjugados e ácidos nucléicos.

43. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um composto de qualquer uma das reivindicações 1-37 ou 39-42 em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

44. Método de liberação de um agente diagnóstico ou terapêutico no sistema nervoso central de um animal, caracterizado por compreender a administração de uma composição farmacêutica das reivindicações 4 3 a um indivíduo que dela necessita.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo é um ser humano que sofre de uma doença neurológica.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a doença neurológica é selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e um câncer do sistema nervoso central.

47. Método de liberação de um agente diagnóstico ou terapêutico a um tecido ou conjunto de tecidos específicos de um indivíduo, caracterizado por compreender a administração de uma composição farmacêutica da reivindicação 43 a um indivíduo que dela necessita.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o agente é liberado através da barreira hematencefálica.

49. Conjugado caracterizado por compreender um peptídeo cíclico da RAP de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-37 conjugado a um agente ativo.

50. Conjugado, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o peptídeo cíclico da RAP e o agente ativo estão ligados por meio de um vinculador.

51. Conjugado, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o agente ativo é um agente quimioterápico.

52. Conjugado, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é um radioisótopo.