BRPI0806864A2

BRPI0806864A2 - Método de seleção de embriões haplóides, método de desenvolvimento de uma linhagem indutora haplóide de milho transformada, método de produção de embriões haplóides e embriões diplóides não-viáveis em uma planta, método de seleção de embriões haplóides, linhagens indutoras haplóides de milho transgênico

Info

Publication number: BRPI0806864A2
Application number: BRPI0806864-0A2A
Authority: BR
Inventors: Mark E Williams; William J Gordon-Kamm
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int; Du Pont
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2014-04-29
Also published as: WO2008097791A2; US20120023612A1; AU2008214051A1; US9121032B2; US20120311736A1; MX2009008210A; US20080189801A1; WO2008097791A3; CN101652481A; US8269061B2; AR065103A1

Description

METODO DE SELEÇÃO DE EMBRIÕES HAPLÓIDES, MÉTODO DE DESENVOLVIMENTO DE UMA LINHAGEM INDUTORA HAPLÓIDE DE MILHO TRANSFORMADA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE EMBRIÕES HAPLÓIDES E EMBRIÕES DIPLÓIDES NÃO-VIÁVEIS EM UMA PLANTA, 5 MÉTODO DE SELEÇÃO DE EMBRIÕES HAPLÓIDES, LINHAGENS INDUTORAS HAPLÓIDES DE MILHO TRANSGÊNICO

A INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito ao campo do melhoramento vegetal e biotecnologia vegetal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Plantas homozigóticas são fundamentais para o desenvolvimento de produtos e comercialização de plantas. 15 Para obter plantas homozigóticas são exigidas várias gerações de autopolinização e análise de segregação. Este é um uso ineficiente de mão de obra e tempo. Por isso, seria útil desenvolver um método para reduzir os passos manuais de polinização normalmente necessários para obter 20 uma planta homozigótica e reduzir a quantidade de tempo necessário para obter uma população homozigótica de plantas. Uma maneira de obter plantas homozigóticas sem a necessidade de se autopolinizar várias gerações é produzir haplóides e, em seguida, duplicar os cromossomos 25 para formar haplóides duplicados. Um processo para auxiliar na seleção de embriões haplóides e eliminação de embriões diplóides aumentaria a eficiência da produção de haplóides duplicados. RESUMO DA INVENÇÃO

Métodos para identificar haplóides por impedimento do crescimento dos embriões diplóides são fornecidos. Métodos para identificar plantas haplóides, sementes, 5 embriões e células vegetais são fornecidos. Métodos para produzir linhagens indutoras haplóides e as linhagens indutoras haplóides são fornecidos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Uma planta haplóide tem um único conjunto (genoma)

de cromossomos e o número reduzido de cromossomos (n) da planta haplóide é igual ao do gameta.

Uma planta diplóide tem dois conjuntos (genomas) de cromossomos e o número cromossômico (2n) é igual ao do zigoto.

Uma célula haplóide é uma com um único genoma, masculino ou feminino.

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Um haplóide duplicado ou planta haplóide duplicada ou célula é um que é desenvolvido pela duplicação de um conjunto haplóide de cromossomos. Uma planta ou semente que é obtida a partir de uma planta haplóide duplicada e 25 por qualquer número de gerações pode ainda ser identificada como uma planta haplóide duplicada. Uma planta haplóide duplicada é considerada uma planta homozigótica. Uma planta é considerada haplóide duplicada se é fértil, mesmo se toda a parte vegetativa da planta 30 não consistir de células com o dobro do conjunto de cromossomos. Por exemplo, uma planta será considerada uma planta haplóide duplicada se contiver gametas viáveis, mesmo que eles sejam quiméricos.

Um "embrião haplóide" é definido como o embrião

formado após um núcleo espermático de um grão de pólen fusionar com os núcleos polares no saco embrionário para criar um endosperma triplóide (3N) e o embrião se forma sem a contribuição do genoma masculino.

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Um "embrião imaturo haplóide" é definido como o embrião formado após um núcleo espermático de um grão de pólen fusionar com os núcleos polares no saco embrionário para criar um endosperma triplóide (3N) e antes da 15 secagem. E o embrião se forma sem a contribuição do genoma masculino.

Um "embrião haplóide duplicado" é um embrião que tem uma ou mais células que contêm 2 conjuntos de cromossomos homozigotos.

"Calo" refere-se a uma massa de proliferação desdiferenciada de células ou tecidos.

As frases "contato", "entrar em contato com" ou

"colocada em contato com" podem ser usadas para significar "contato direto" ou "contato indireto". Por exemplo, um meio compreendendo um agente de duplicação pode ter contato direto com as células haplóides ou o meio compreendendo o agente de duplicação pode ser separado da célula haplóide por filtro de papel, tecidos vegetais, ou outras células, assim, o agente de duplicação é transferido através do filtro de papel ou células para a célula haplóide.

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0 termo "meio" inclui compostos no estado líquido, gasoso, ou no estado sólido.

Conforme utilizado aqui, o termo "planta" inclui a 10 referência a todas plantas, órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc), sementes e células vegetais e progênies da mesma. "Célula vegetal" , como utilizado neste documento, inclui, sem limitação, sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, 15 calos teciduais, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micrósporos.

A linhagem indutora haplóide inclui: 1) um

polinucleotídeo de letalidade do pólen ou um

polinucleotídeo do pólen de não-transmissão, 2)

polinucleotídeo de letalidade do embrião, e 3) um repressor de letalidade do embrião.

O polinucleotídeo de letalidade do pólen ou um 25 polinucleotídeo do de não-transmissão de pólen indica qualquer polinucleotídeo que impede o pólen de alcançar fertilização. O pólen de não-transmissão é mais eficaz se ocorrer na fase pós-meiótica ou gametofítica. O polinucleotídeo do pólen de não-transmissão pode 30 trabalhar através de diferentes mecanismos. Pode impedir que o pólen seja viável, por exemplo, por expressão de um composto tóxico.

0 polinucleotídeo de letalidade do embrião é 5 qualquer polinucleotídeo que impede o bom desenvolvimento do embrião ou causa o embrião a ser não-viável. 0 polinucleotídeo de letalidade do embrião pode retardar o crescimento do embrião, tanto que um pode ser capaz de distinguir um embrião que transporta polinucleotídeo de 10 letalidade do embrião de um embrião que não carrega o polinucleotídeo de letalidade do embrião.

O repressor de letalidade do embrião é qualquer polinucleotídeo que quando expresso motiva o polinucleotídeo de letalidade do embrião a ser não eficaz e permite que um embrião viável se desenvolva. Isto pode ser conseguido através de diversos mecanismos. Por exemplo, o repressor de letalidade do embrião pode desintoxicar a molécula expressa pelo polinucleotídeo de letalidade do embrião. Uma proteína repressora de embrião pode ser expressa tal que inibe a letalidade de uma outra proteína, por exemplo, através de uma interação proteína- proteína. Outra forma do repressor do embrião poder trabalhar é dissuadir ou impedir a expressão do polinucleotídeo de letalidade de embrião, por exemplo, expressando uma molécula que se liga ao promotor do polinucleotídeo de letalidade e bloqueando algumas ou todas as expressões. Outro exemplo que poderia ser utilizado no sistema é o silenciamento gênico. Por exemplo, o repressor de embrião pode ser um polinucleotídeo que impede o polinucleotídeo de embrião letal do funcionamento através do silenciamento gênico.

O polinucleotídeo de letalidade do embrião e o polinucleotídeo repressor de letalidade do embrião não estão limitados a serem expressos apenas no embrião. Os genes podem ser expressos em outros tecidos. É mais eficaz se o polinucleotídeo de letalidade do embrião não é expresso no endosperma de modo que a semente haplóide possa desenvolver normalmente. Outra consideração para o método de trabalho, no seu ótimo é a de que a expressão do polinucleotídeo de letalidade do embrião deva ser acompanhada pela expressão do polinucleotídeo repressor de letalidade do embrião. Sempre os polinucleotídeos que são herdados conjuntamente com o polinucleotídeo repressor de letalidade do embrião devem ser expressos a um nível de impedir os efeitos negativos do polinucleotídeo de letalidade do embrião.

Normalmente, o polinucleotídeo do pólen de não-

transmissão e o repressor de letalidade do embrião estão ligados na linhagem indutora desenvolvida. Eles podem ser estreitamente ligados. Para a conveniência, a maioria dos polinucleotídeos do pólen de não-transmissão e o 25 repressor de letalidade do embrião devem ser adjacentes uns aos outros, por exemplo, sobre o mesmo construto. Para resultados eficientes o polinucleotídeo do pólen de não-transmissão e o repressor de letalidade do embrião vão segregar juntos. Também tipicamente, o 30 polinucleotídeo do pólen de não-transmissão e o repressor de letalidade do embrião estão ligados, mas estão em um local diferente do que o polinucleotídeo de letalidade do embrião. Para resultados eficientes, o polinucleotídeo de letalidade do embrião vai segregar a partir do 5 polinucleotídeo do pólen de não-transmissão e o repressor de letalidade do embrião. Para a maior eficiência, o polinucleotídeo de letalidade do embrião não está relacionado com o polinucleotídeo do pólen de não- transmissão e o repressor de letalidade do embrião.

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A linhagem indutora desenvolvida pode ou não conter marcadores selecionáveis. Pode ou não ser desenvolvida usando transgenes que são marcadores selecionáveis.

A seguir são descritos os componentes típicos para

produzir uma linhagem indutora. 0 Constructo A compreende um polinucleotídeo do pólen de não-transmissão e repressor de letalidade de embrião, e um gene marcador selecionável. 0 Constructo B compreende um gene marcador

selecionável e um gene de letalidade de embrião. Para facilitar a separação após a polinização os dois constructos podem ser localizados em dois locais diferentes no genoma. Para mais eficiência o Constructo A e o Constructo B devem ser ligados.

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Constructo AeB podem ser co-transformados em linhagem indutora ou o processo de transformação pode ser feito seqüencialmente, mais convenientemente com o Constructo A primeiro e o Constructo B em segundo. A

primeira planta indutora T0 será heterozigota para ambos os construtos, AeB. Os resultados esperados da autopolinização desta planta são apresentados na Tabela 1.

Outra forma de introduzir os constructos na linhagem

indutora seria cruzar ou reproduzi-los na linhagem indutora. Por exemplo, Constructo AeB poderiam ser co- transformados em uma planta e, em seguida, reproduzidos em uma linhagem indutora. Para que o sistema seja o mais 10 eficiente em plantas, o repressor de embrião letal precisa estar presente com o polinucleotídeo de embrião letal. Portanto, um pode transformar com o constructo contendo o polinucleotídeo repressor de embrião letal para obter células transformadas estavelmente e, em 15 seguida, transformar com o constructo compreendendo o polinucleotídeo de embrião letal.

Tabela I. A autopolinização de uma planta T0 co- transformada em 2 locos segregantes (genótipo (AB-)). A 20 produção da planta T0 é possível porque tanto o embrião letal quanto o repressor de embrião letal são ambos expressos em embriões somáticos e calos embriogênicos. 0 pólen contendo o Constructo A é não-viável ou não- transmissível. Embriões contendo o Constructo B, mas não 25 o Constructo A são não-viáveis devido à expressão do gene do embrião letal sem o gene repressor do embrião letal. 0 genótipo A-BB terá duas doses de gene do embrião letal e uma dose do gene repressor do embrião. Assim, para a maior eficiência, a expressão de um único polinucleotídeo repressor deve ser fixada num nível que impeça letalidade de duas doses do polinucleotídeo do embrião letal.

Constructo A = pólen não-transmissão + repressor de 5 embrião letal + gene marcador selecionável "a"

Constructo B = embrião letal + marcador selecionável

"b"

Gametas Masculinos Gametas AB A- -B -- B não- não- Embrião Embrião transmissão de transmissão de viável viável pólen pólen A-BB A-B- não- não- Embrião Embrião transmissão de transmissão de viável viável pólen pólen A-B- A--- mas sensível ao agente marcador selecionável b B não- não- Embrião Embrião transmissão de transmissão de letal letal pólen pólen --BB --B- não- não- Embrião Embrião transmissão de transmissão de letal viável pólen pólen ---B- mas sensível ao agente marcador selecionável (a e b) Porque haverá embriões viáveis sem ambos construtos, 10 os embriões ou plantas de embriões que não contenham os dois construtos podem ser selecionados contra, contatando o tecido com o agente selecionável. Se o marcador selecionável é um marcador visual, ou algum outro tipo de marcador, isto também pode ser observado e os tecidos não 15 contendo dois marcadores podem ser selecionados em comparação. Qualquer tipo de marcador selecionável pode ser utilizado. As plantas restantes vão ser heterozigóticas para os dois construtos (A-B-) ou heterozigóticas para o constructo A e homozigótica para o constructo B, (A-BB). O resultado de autopolinização do 5 genótipo AB- resultará na progênie como visto anteriormente, Tabela I. O resultado de autopolinização do genótipo A-BB resultará apenas genótipos que são homozigotos para o Constructo B. Por conseguinte, todos os descendentes terão o marcador selecionável b. Este é o 10 genótipo desejado, A-BB. As plantas que são heterozigóticas para ambos os constructos irão produzir alguns descendentes que não contenham marcador selecionável b. A progênie resultante de autopolinização dos genótipos A-BB está descrita na Tabela 2.

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Tabela 2. Autopolinização de plantas Ti tendo genótipo A-BB. Toda a progenia viável da autopolinização de plantas A-BB serão plantas A-BB.

Gametas Masculinos Gametas AB -B AB não- Embrião transmissão viável A- de pólen BB -B não- Embrião transmissão letal de pólen --BB 0 genótipo desejado, A-BB, produz apenas um genótipo

de pólen viável, -B. Quando esta linhagem indutora transgênica é atravessada como um macho a uma fêmea do tipo selvagem, isso resultará na ablação de todos os embriões diplóides, Tabela 3. No entanto embriões haplóides maternos não herdam o embrião letal do progenitor masculino e, portanto, são viáveis. Os haplóides maternos não contêm os transgenes do Constructo A ou Constructo B.

Embora o embrião haplóide materno não herde o DNA do

progenitor masculino, o pólen que transporta o gene de embrião letal terá um núcleo espermatozóide que funde com núcleos polares no saco embrionário para criar um endosperma triplóide (3N). Assim, o gene de embrião letal 10 não pode ser expresso no endosperma ou aleurona, ou se é expresso nestas células não vai matar o embrião haplóide.

Tabela 3. Cruzamento da linhagem indutora haplóide, com o genótipo A-BB, com uma linhagem feminina do tipo

selvagem, ----. Pólen contendo Constructo A e embriões

contendo Constructo B são não viáveis devido à expressão do embrião letal sem a expressão do repressor do embrião letal. Diplóides herdam Constructo B do sexo masculino e são não viáveis. Haplóides maternos não herdam Constructo 20 B e são viáveis. Quaisquer embriões maternos que se desenvolvam normalmente serão haplóides.

Gametas Masculinos (linhagem indutora) Gametas AB -B Sem Femininos contribuição (tipo masculina não- Embrião Haplóide transmissão letal materno de pólen 0 desenvolvimento de uma linhagem indutora também poderia ser produzido sem quaisquer marcadores selecionáveis. Também poderia ser produzido com apenas um marcador selecionável em ambos os constructos ou com o mesmo marcador selecionável em ambos os construtos. Poderia utilizar qualquer número de técnicas conhecidas no estado da técnica para monitorar e reproduzir os transgenes. Por exemplo, testes de progenia, PCR, 5 marcadores moleculares, ou ELISA podem ser utilizados para monitorar os transgenes. Também qualquer combinação de técnicas poderia ser utilizada. Por exemplo, se um primeiro constructo = não-transmissão de pólen + repressor de embrião letal e um segundo constructo = 10 embrião letal, PCR quantitativo poderia ser utilizado para determinar qual a descendência que continha qual constructo e em que dose, estado homozigótico ou estado heterozigótico.

Outro método da invenção inclui co-transformação com

a não-transmissão do pólen e genes repressores de embrião letal em um constructo e um gene marcador selecionável em um segundo constructo. Após a obtenção dos tecidos transformados uma segunda co-transformação pode ser 20 realizada com o embrião letal e um segundo marcador selecionável. Após plantas transgênicas serem desenvolvidas, marcadores selecionáveis podem ser separados para longe dos outros transgenes.

Outro método pode ser utilizado com aplicação

química ou contato agindo como o repressor de embrião letal. Pode-se obter plantas com apenas Constructo B se uma substância química for usada para reprimir o polinucleotídeo de embrião letal. Por exemplo, poderia transformar os constructos em duas plantas diferentes e, em seguida, reproduzir ambos os construtos na linhagem indutora. 0 produto químico que reprime a letalidade do embrião teria de ser utilizado para a planta transformada com Constructo B até ambos os construtos estarem contidos 5 na mesma planta. Em seguida, selecionaria a linhagem indutora que contivesse os dois construtos segregados, A e B. 0 traço de integração através dos retrocruzamentos é bem conhecido no estado da técnica.

Sistemas de indução haplóides foram desenvolvidos

para diferentes plantas para produzir tecidos haplóides, plantas e sementes. O sistema de indução haplóide pode produzir plantas haplóides a partir de qualquer genótipo por cruzamento de uma linhagem selecionada (como feminina), com uma linhagem indutora. Essas linhagens indutoras de milho incluem, mas não estão limitadas a, Stock 6 e derivados de Stock 6 (Coe, 1959, Am. Nat. 93: 381-382; Sarkar e Coe, 1966, Genetics 54: 453-464; Sarkar et al, 1972, Development of maternal-haploidy-inducer lines in maize (Zea mays L.) Indian J. Agric. Sei. 42: 781-786; Lashermes e Beckert, 1988, Genetic control of maternal haploidy in maize (Zea mays L.) and selection of haploid inducing lines. Theor. Appl. Genet. 76: 405-410; Chalyk, S.T. 1994, Properties of maternal haploid maize plants and potential application to maize breeding. Euphytica 79, 13-18; Bordes, J.R. et al . 1997, Haploidization of maize (Zea mays L.) through induced gynogenesis assisted by glossy markers and its use in breeding. Agronomie 17: 291-297; Eder J. e S. Chalyk, 2002 In vivo haploid induction in maize. Theor. Appl. Genet. 104: 703-708) RWS (Rober, Gordillo, e Geiger, 2005, Maydica 50 (2005) 275-283), KEMS (Deimling, Roeber, e Geiger, 1997, Vortr. Pflanzenzuchtg 38:203 -224), ou KMS e ZMS (Chalyk, Bylieh & Chebotar, 1994, MNL 68:47;

Chalyk & Chebotar, 2000, Plant Breeding 119:363-364), e indeterminate gametophyte (ig) mutation (Kermicle 1969 Science 166: 1422-1424). As divulgações são incorporadas neste documento por referência.

Vasta hibridização cruzada também pode ser usada

para produzir haplóides. Em cevada, este método é muitas vezes referido como o método bulbosum (Kasha e Kao, 197 0, Nature 225: 874-876). Este método de produção haplóide ocorre devido à eliminação dos cromossomos a partir da polinização materna.

Quando uma linhagem indutora é usada para polinizar uma planta diplóide, embriões haplóides são derivados. Um núcleo espermático do pólen funde com os núcleos polares 20 no saco embrionário para criar um endosperma triplóide (3N) . O endosperma triplóide irá conter 2 conjuntos de cromossomos femininos e 1 conjunto de cromossomos masculinos, que neste caso é a linhagem indutora. O embrião haplóide contém um único conjunto de cromossomos, 25 que são derivados da planta feminina.

No desenvolvimento de milho haplóide, Rnj é um alelo comumente utilizado para rastreamento haplóide / diplóide de sementes maduras (Nanda e Chase, 1966. An embryo marker for detecting monoploids of maize (Zea mays L) . Crop Sci. 6: 213-215; Greenblatt e Bock, 1967. A commercially desirable procedure for detection of monoploids in maize. J. Hered. 58:9-13). Níveis de expressão R-nj demonstraram ser correlacionados com os 5 parâmetros da maturação do núcleo (Alexander e Cruz, 1983, Grain fill characteristics of early maize (Zea mays L) strains selected for variable R-nj expression, Euphytica 32: 839-844.). Chromosome doubling of haploid maize seedlings using nitrous oxide gas at the flower 10 primordial stage. Plant breeding 121: 370-377; e Kato

A., 2003, Chromosome doubling method, Publicação US 2003/0005479) .

0 gene marcador R-nj da antocianina usado para distinguir haplóides e diplóides na fase de semente madura não é expresso até tarde no desenvolvimento embrionário. Para identificar tecido haplóide numa fase anterior, embriões haplóides podem ser identificados através de um marcador transgênico, lecl-GFP, que está presente na linhagem indutora. A utilização de lecl-GFP é valiosa, porque o gene permite identificar embriões não- haplóides numa fase precoce do desenvolvimento do embrião (Pedido de Patente US 09/718.754, Patente US 6.486.382) . A ausência da expressão do marcador GFP é usada para identificar embriões haplóides. Embora os embriões haplóides possam ser identificados numa fase inicial, o sistema GFP exige um trabalho intenso de processo de triagem para determinar quais embriões expressam o marcador GFP e quais embriões não expressam o marcador GFP. A utilização de um marcador letal em uma linhagem indutora só permite formação embrionária haplóide e, assim, elimina a necessidade de um processo menos eficiente de rastreio. Este sistema aumentaria a eficiência do processo de haplóide duplicado.

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Vários tipos de sistemas podem ser utilizados na linhagem indutora, a fim de aumentar a eficiência do processo de haplóide duplicado: 1) sistemas de toxicidade/antídoto 2) sistemas reguladores

transcricionais 3) sistemas de silenciamento gênico.

Um exemplo de um sistema de toxicidade/antídoto que pode ser utilizado é o sistema Barnase/Barstar. Barnase é o nome da ribonuclease extracelular produzida por Bacillus amyloliquefaciens. O inibidor da barnase é chamado barstar e é produzido intracelularmente pelo mesmo organismo que secreta barnase. A função do barstar é proteger a B. amyloliquefaciens dos efeitos tóxicos da barnase intracelular, tornando-a inativa (Hartley, R. W. (1989) Barnase and barstar: Two small proteins to fit and fold together. Trends Biochem. Sei. 14: 450-454). Ambos os genes foram clonados e sequenciados (Hartley, R.W. (1988) Barnase and barstar: Expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease. J. Mol. Biol. 202: 913-915). Foi demonstrado que a expressão de barnase é letal para células vegetais, e que barstar pode proteger uma célula vegetal contra os efeitos da barnase (Mariani et al. , (1990) Induction of male- sterility in plants by a chimeric ribonuclease gene. Nature 347: 737-741; Mariani et al. (1992) A chimeric ribonuclease-inhibitor gene restores fertility to male sterile plants. Nature 357: 384-387; Beals, T.P. e Goldberg, R.B. (1997) A novel cell ablation strategy blocks tobacco anther dehiscence. Plant Cell 9: 1527- 1545; Williams et al. , (1997) Male sterility through recombinant DNA technology. Em Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement, K.R. Shivanna and V.K. Sawhney, eds (Cambridge, UK: Cambridge University Press) pp 237-257). A transmissão de um transgene através do pólen pode ser evitada através de uma ligação entre o transgene e o gene de letalidade do pólen composto de um gene citotóxico sob o controle de um promotor pólen- específico (gametófito) (Twell (1995) Diptheria toxin- mediated cell ablation in developing pollen: vegetative cell ablation blocks generative cell migration. Protoplasma 187: 144-154; Williams et al. , (1997) Male sterility through recombinant DNA technology. Em Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement, K.R. Shivanna and V.K. Sawhney, eds (Cambridge, UK: Cambridge University Press) pp 237-257). Este tipo de construção pode ser mantido porque é transmitido através da fêmea. Muitos promotores pólen-específicos têm sido identificados. Outros experimentos da invenção incluem constructos que podem dissuadir a viabilidade da antera ou qualquer constructo que impeça a transmissão de pólens viáveis. Barstar inibe a função (RNase) da proteína barnase na linhagem indutora haplóide. Embriões diplóides são ablacionados porque o PTU (unidade de transcrição da planta) de barstar está ligado ao PTU de não-transmissão do pólen e, portanto, não está presente nos embriões diplóides para inibir barnase. O sistema barstar pode ser melhorado por meio da otimização da região codificadora do gene barstar. Pode-se também otimizar o sistema aumentando a afinidade do barstar para barnase. Outras 5 formas de melhorar o sistema incluem o aumento da expressão de barstar sobre o nível de expressão de barnase de modo a que o nível de expressão seja, por exemplo, cerca de 1.5X, 2X ou, pelo menos, 3X o nível da expressão da barnase. Pode ter barnase regulada por um 10 promotor preferido do embrião, por exemplo, Iecl, e ter barstar regulado por um promotor constitutivo, por exemplo, Ubi. Pode também adicionar íntrons, como íntrons Adh, ou adicionar potenciadores, como potenciadores 3 5S a fim de aumentar a expressão. íntrons talvez sejam 15 necessários no polinucleotídeo que expressa um produto tóxico para ter o efeito de impedir a expressão de produto tóxico na Agrobacterium.

Existem muitos exemplos de sistemas reguladores 20 transcricionais que podem ser utilizados (Ramos et al. "The tetr family of transcriptional repressors" (2 005) Microbiology and Molecular Biology Reviews, vol. 69(2): 326-356). Alguns exemplos de famílias de reguladores estão indicados na Tabela 4.

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Tabela 4. Famílias de reguladores

Familia Ação Exemplos de funções Motivo Posição reguladas de ligação de DNA LysR Ativador/repressor Metabolismo do Hélice- N- carbono e do volta- terminal nitrogênio hélice AraC/XylS Ativador Metabolismo do Hélice- C- carbono, resposta volta- terminal ao stress e hélice patogênese TetR Repressor Biossíntese de Hélice- C- antibióticos, volta- terminal bombas de efluxo, hélice stress osmótico, etc. LuxR Ativador Sensoriamento de Hélice- C- quorum, biossíntese volta- terminal e metabolismo, etc. hélice Lacl Repressor Utilização de fonte Hélice- N- de carbono volta- terminal hélice ArsR Repressor Resistência ao Hélice- Central metal volta- hélice IcIR Repressor/ativador Metabolismo do Hélice- N- carbono, bombas de volta- terminal efluxo hélice MerR Repressor Resistência e Hélice- N- detoxificação volta- terminal hélice AsnC Ativador/repressor Biossíntese de Hélice- N- aminoácidos volta- terminal hélice MarR Ativador/repressor Resistência Hélice- Central múltipla a volta- antibióticos hélice NtrC Ativador Assimilação de Hélice- C- (EBP) nitrogênio, síntese volta- terminal de aminoácidos hélice aromáticos, flagelo, vias catabólicas, resposta a fagos etc. OmpR Ativador Metais pesados e Hélice C- virulência alada terminal DeoR Repressor Metabolismo do Hélice- N- açúcar volta- terminal hélice Cold Ativador Resistência a baixa Domínio Variável shock temperatura de ligação a RNA (CSD) GntR Repressor Metabolismo geral Hélice- N- volta- terminal hélice Crp Ativador/repressor Respostas globais, Hélice- C- repressão volta- terminal catabólica e hélice anaerobiose Um sistema regulador bem estudado que pode ser utilizado para identificar haplóides no início do desenvolvimento é o sistema repressor tet. O sistema operon da tetraciclina compreende elementos repressores e operadores. O sistema operon é controlado pela presença de tetraciclina, e auto-regula o nível de expressão de genes tet R e tetA. O produto de tetA remove a tetraciclina da célula. O produto de tetR é a proteína repressora que se liga aos elementos operadores com um Kd de cerca de 10 pM na ausência de tetraciclina, bloqueando, assim, a expressão ou tetA e tetR. O repressor TET pode ser otimizado para o milho e o promotor utilizado para parar o desenvolvimento do embrião pode ser modificado com seqüências do operador TET.

Outro exemplo de um sistema que pode ser utilizado para identificar haplóides cedo no desenvolvimento utiliza o sistema repressor Iac (Ulmasov et al. (1997) Plant Mol Biol 35-417-424; Wilde et al. (1992) EMBO J 11:1251-1259). Este sistema baseado em repressor/operador é derivado do operon procariótico, operon lactose de E. coli. Esse sistema controla a atividade de um promotor colocando seqüências do operador perto do sítio de início transcricional de um gene tal que essa expressão gênica do operon é inibida após a ligação da proteína repressora à seqüência do operador cognato. No entanto, na presença de um agente indutor, a ligação do repressor ao seu operador é inibida, ativando assim o promotor e permitindo a expressão gênica. No sistema Iac, isopropil- B-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) é o agente indutor comumente utilizado, enquanto que a tetraciclina, e/ou doxicilina são agentes indutores comumente usados para o 5 sistema tet. 0 repressor Iac tem sido amplamente caracterizado. 0 repressor Iac tem uma alta associação constante para o seu operador, e o IPTG reduz a afinidade do repressor para o operador em 300 vezes (Barkley & Bourgeois (1980) The Operon, Miller & Reznikoff, Eds., 10 Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 177- 220) , apenas repressão de 3 0 vezes tem sido relatada usando o repressor lactose (Ulmasov et al. (1997) Plant Mol Biol 35-417-424) . 0 repressor Iac do milho pode ser otimizado e o promotor utilizado para parar o 15 desenvolvimento do embrião pode ser modificado com seqüências do operador Iac.

0 silenciamento de gene também pode ser utilizado na ablação seletiva de sistema de embriões diplóides. A repressão da letalidade do embrião pode estar no RNA ou no estágio de proteína, por exemplo, RNA anti-senso, grampos "hairpins", e outros mecanismos de silenciamento de genes. Por exemplo, poderia ter o polinucleotídeo com grampo "hairpin" de barnase impulsionado por um forte promotor, como o UBI. Este constructo compreendendo a alça pode estar ligado a um constructo que não permite a fertilização do pólen. 0 outro constructo poderia incluir o polinucleotídeo de barnase impulsionado pelo promotor Iecl. Isso efetivamente desligaria barnase até o lócus do grampo ser segregado para longe. Qualquer polinucleotídeo que impede o desenvolvimento normal do embrião juntamente com um gene correspondente de silenciamento de constructo pode ser utilizado no sistema.

Exemplos de genes que podem ser conduzidos por um

promotor de pólen e utilizados para impedir o pólen fértil na invenção incluem DAM (GenBank J01600, Nucleic Acids Res. 11: 837-851 (1983), alfa-amilase (GenBank L2 5805, Plant Physiol. 105 (2): 759-760 (1994)); D8 10 (Physiol. Plant 100 (3): 550-560 (1997)); SacB (Plant Physiol. 110 (2): 355-363 (1996)), lipases e ribonucleases; tasselseed2 (ts2) (Calderon-Urrea M. e S. L. Dellaporta (1999) Development 126: 435-441); toxina difteria A (DTA) (Greenfield et al. Proc. Natl. Acad. 15 Sei. 80: 6853 (1983); Palmiter et al., Cell 50: 435 (1987) ) .

Exemplos de promotores pólen-específicos que podem ser usados incluem mas não estão limitados a PG47 (Rogers et al. (1991), Pollen specific cDNA clones from Zea mays, Biochem. Biophys. Acta 1089, 411-413.; Allen, R.L., e Lonsdale, D.M. (1992) Sequence analysis of three members of the maize polygalacturonase gene family expressed during pollen development, Plant Mol. Biol. 20, 343-345, Allen, R.L., e Lonsdale, D.M. (1993), Molecular characterization of one of the maize polygalacturonase gene family members which are expressed during late pollen development. The Plant Journal 3, 261-271, Patente US 5.412.085 e Patente US 5.545.546); gene pólen- específico do milho Zml3 (Hamilton et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:211-218; Guerrero et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 224: 161-168); promotores microsporo-específicos, como o gene promotor apg (Twell et al. , Sex. Plant Reprod. 6: 217-224 (1993)); além disso, inclui um gene de 5 pólen-expresso do girassol, SF3 (Baltz et al. (1992) The Plant Journal 2: 713-721), genes específicos do pólen de

B. napus (Arnoldo et al. (1992) J . Cell. Biochem, Abstract No. Y101204). Esses promotores são conhecidos na arte ou podem ser descobertos por técnicas conhecidas;

ver, por exemplo, Bhalla e Singh (1999) Molecular control of male fertility in Brassica Proc. IOth Annual Rapeseed Congress, Canberra, Australia; van Tunen et al. (1990) Pollen-specific chi promoters from petunia: tandem promoter regulation of the chiA gene, Plant Cell 2: 393-

40; Jeon et al. (1999); e Twell et al. (1993) Activation and developmental regulation of an Arabidopsis anther- specific promoter in microspores and pollen of Nicotiana tabacum, Sex. Plant Reprod. 6: 217-224.

Muitos exemplos de promotores de pólen e os

polinucleotídeos utilizados com eles para evitar pólens viáveis podem ser encontrados na Patente US 6.743.968 e na Publicação US 2005/0246796 (Pedido US No. 11/014.071).

Genes de cereal cujos promotores são associados à

semente precoce e desenvolvimento embrionário incluem Iecl (Patente US 7.122.658), glutelina de arroz ( "GluA- 3", Yoshihara e Takaiwa, 1996, Plant Cell Physiol 37: 107-11; "GluB-1", Takaiwa et al. , 1996, Plant Mol Biol

30: 1207-21; Washida et al. , 1999, Plant Mol Biol 40: 1- 12; " GT.3" , Leisy et al. , 1990, Plant Mol Biol 14:41-50), prolamina de arroz (Zhou & Fan, 1993, Transgenic Res 2:141-6), prolamina de trigo (Hammond-Kosack et al., 1993, EMBO J 12: 545-54), milho zein (Z4, Matzke et al .

de 1990, Plant Mol Biol 14:323-32), e cevada B-hordeiis (Entwistle et al. , 1991, Plant Mol Biol 17:1217-31). Promotores "preferidos de semente" incluem tanto os promotores "sementes-específicos" (os promotores ativos durante desenvolvimento da semente, tais como promotores 10 das proteínas do armazenamento de sementes) , bem como promotores "de germinação de sementes" (os promotores ativos durante a germinação das sementes). Ver Thompson et al. (1989) BioEssays 10: 108. Esses promotores preferidos de semente incluem, mas não estão limitados a, 15 Ciml (mensagem induzida por citocinina), CZ19B1 (milho 19 kDa zein), milps (mio-inositol-l-fosfato sintase); ver WO 00/11177 e Pat. US No. 6225529. Gamma-zein é um promotor endosperma-específico. Globulin-I (Glob-I) é um promotor embrião-especí f ico representante. 0 gene Glbl do milho 20 codifica globulina-1, uma proteína de grande armazenamento de embrião. (Kriz, AL, et al. (1986) Plant Physiol. 82: 1069-1075) Glbl é expresso no desenvolvimento de sementes de milho durante o desenvolvimento embrionário. (Belanger, FC, et al. (1989) 25 Plant Physiol . 91: 636-643). A região do promotor Glbl foi identificada, clonada, e introduzida em plantas de tabaco por transformação mediada por Agrobacterium. (Liu, S., et al. (1996) Plant Cell Reports 16:158-162) As plantas transformadas demonstraram que o promotor Glbl 30 tem desejável especificidade temporal e de tecidos. 0 promotor Glbl é regulado positivamente por ácido abscísico (ABA). (Kriz, A.L., et al. (1990) Plant Physiol. 92: 538-542; Paiva, R., et al. , (1994) Planta 192: 332-339) Níveis de hormônio vegetal ABA são conhecidos por oscilar em condições de frio ou dessecação (Himmelbach, A., et al. (1998) Phil. Trans. R. Soc. Lond. 353: 1439 - 1444). Assim, a atividade do promotor Glbl pode ser diferentemente afetada. De dicotiledôneas, promotores específicos de sementes incluem, mas não estão limitados a, β-phaseolina de feijão, napin, β- conglicinina, lecitina de soja, cruciferina, e coisas do gênero. Mais exemplos de promotores específicos de sementes de monocotiledôneas incluem, mas não estão limitados a, milho zein 15 kDa, zein 22 kDa; zein 27 kDa (Boronat, A., Martinez, M.C., Reina, M., Puigdomenech, P. e Palau, J.R..; Isolation and sequencing of a 28 kD glutelin-2 gene from maize: Common elements in the 5' flanking regions among zein and glutelin genes; Plant Sei. 47: 95-102 (1986)); gamma-zein; ceroso (Kloesgen, R.B., Gierl, A., Schwarz-Sommer, Z.S. e Saedler, H., Molecular analysis of the waxy locus of Zea mays, Mol. Gen. Genet. 203: 237-244 (1986)); shrunken 1; shrunken 2 (Shaw et al. , Plant Phys 98:1214-1216, 1992; Zhong Chen et al., PNAS USA 100: 3525-3530, 2003); globulina 1; mZE40-2, também conhecido como Zm-40, Patente US 6.403.862; um promotor ltp2 (Kalla, et al. , Plant Journal 6: 849-860 (1994); Pat. US n2 5525716), promotor ciml (ver Pat. US No. 6,225529); nuclc (Pat. US na 6407315); etc. Ver também WO 00/12733 e Pat. US No. 6.528,704, onde os promotores preferidos de sementes de genes endl e end2 são divulgados. Promotores específicos de embrião adicionais são divulgados em Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 8117-8122 (arroz homeobox, OSHl); e Postma-Haarsma et al. (1999) Plant Mol. Biol.

39: 257-71 (genes arroz KNOX). Promotores endosperma- específicos adicionais são divulgados em Albani et al. (1984) EMBO 3: 1405-15; Albani et al. (1999) Theor. Appl. Gen. 98: 1253-62; Albani et al. (1993) Plant J. 4: 343- 55; Mena et al. (1998) The Plant Journal 116: 53-62 10 (cevada DOF) ; Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J 12: 235-46 (milho ESR) e Wu et al. (1998) Plant Cell Physiology 39: 885-889 (GluA-3 de arroz, GluB-I, NRP33, RAG-I).

Exemplos de promotores constitutivos incluem o

promotor 1'- ou 2'- de Agrobacterium tumefaciens (ver, por exemplo, O1Grady (1995) Plant Mol. Biol. 29: 99-108). Outros promotores de planta incluem a pequena subunidade de promotor ribulose-1,3-difosfato-carboxilase, o promotor phaseolina, promotores de gene álcool desidrogenase (Adh) (ver, por exemplo, Millar (1996) Plant Mol. Biol. 31: 897-904), promotores de sintase de sacarose, promotores α-tubulina, promotores actina, como o promotor do gene da actina de Arabidopsis (ver, por exemplo, Huang (1997) Plant Mol. Biol. 1997 33: 125-139), cab, PEPCase, complexo do gene R, ACTll de Arabidopsis (Huang et al. Plant Mol. Biol. 33: 125-139 (1996)), Cat3 de Arabidopsis (Zhong et al. , Mol. Gen. Genet. 251: 196- 203 (1996)), o gene que codifica a proteína transportadora stearoil-acil desaturase de Brassica napus (Solocombe et al. (1994) Plant Physiol. 104: 1167-1176), GPcl de milho (Martinez et al. (1989) J. Mol. Biol 208: 551-565), Gpc2 de milho (Manjunath et al. (1997), Plant Mol. Biol. 33: 97-112), e outras regiões de início de 5 transcrição de vários genes vegetais conhecidos na arte. Ver também Holtorf (1995) "Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana, " Plant Mol. Biol. 29: 637-646. A seqüência do promotor do 10 gene E8 (ver, Deikman e Fischer (1988) EMBO J 7: 3315) e de outros genes também podem ser utilizadas, juntamente com os promotores específicos para espécies de monocotiledôneas (por exemplo, McElroy D., et al. (1994) Foreign gene expression in transgenic cereais, Trends 15 Biotech. 12:62- 68). Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados no WO 99/43838 e Pat. US No. 6072050; o promotor nuclear CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina do 20 arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 25 2723-2730); promotor ALS (Pat. US n s 5659026), e similares. No entanto, outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, Pat. US N 2 5608149; 5,608,144; 5.604.121, 5.569.597, 5.466.785, 5399, 680; 5268, 463; 5608, 142; e 6177611.

30 Além dos promotores apresentados aqui, promotores de origem bacteriana que operam nas plantas podem ser usados na invenção. Eles incluem, por exemplo, o promotor octopina sintase, o promotor nopalina sintase e outros 5 promotores derivados de plasmídios Ti. Ver, Herrera- Estrella et al. (1983) Nature 303:209. Promotores virais também podem ser utilizados. Exemplos de promotores virais incluem os promotores 35S e 19S do RNA do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) . Ver, Odell et al. , (1985) 10 Nature 313:810; e, Dagless (1997) Arch. Virol. 142: 183- 191. Outros exemplos de promotores constitutivos de vírus que infectam plantas incluem o promotor do vírus do mosaico do tabaco; vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) promotores 19S e 3 5S ou o promotor do vírus do mosaico da 15 escrofulária, por exemplo, o promotor 3 5S do vírus do mosaico da escrofulária (ver, por exemplo, Maiti (1997) Transgenic Res. 6: 143-156), etc. Alternativamente, novos promotores com características úteis podem ser identificados a partir de qualquer vírus, bactéria, ou 20 fonte vegetal através de métodos, incluindo a análise de seqüência, captura de potenciador ou promotor, e similares conhecidos no estado da técnica.

Promotores tecido-preferidos (tecido-específico) e 25 potenciadores podem ser utilizados para reforço da expressão do gene alvo dentro de um determinado tecido vegetal. Promotores tecido-preferidos (tecido-específico) incluem, por exemplo, os descritos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2) : 255-265; Kawamata et al. (1997) 30 Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3): 337-343, Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2): 525-535; Canevascini et al.

(1996) Plant Physiol. 112 (2): 513-524, Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23 (6): 1129-1138; Matsuoka et al.

(1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90 (20): 9586-9590; e 10 Guevara-Gareia et al. (1993) Plant J. 4 (3) : 495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para a expressão mais fraca ou expressão mais forte. Um promotor tecido-específico pode dirigir a expressão de seqüências encadeadas operacionalmente em tecidos que não 15 o tecido-alvo. Assim, tal como utilizado aqui, um promotor específico de tecidos é um que dirige a expressão preferencialmente no tecido-alvo, mas também pode levar a alguma expressão em outros tecidos também.

Em certos experimentos, promotores específicos de

senescência podem ser utilizados, por exemplo, piruvato, promotor ortofosfato diquinase (PPDK) de plantas C4 (milho), promotor de milho cab-Ml Ca+2, promotor do gene relacionado com Arabidopsis thaliana myb (Atmyb5), o 25 promotor ribulose-difosfato-carboxilase (RBCS) (por exemplo, os genes do tomate RBCSl, RBCS2 e RBCS3A, que são expressos em folhas e mudas cultivadas, enquanto RBCSl e RBCS2 são expressos em desenvolvimento de frutos de tomate, e/ou um promotor ribulose-difosfato- 30 carboxilase que é expresso quase exclusivamente em células mesófilas em lâminas e bainhas foliares em níveis elevados, etc), e coisas do gênero. Ver, por exemplo, Matsuoka et a., (1993) Tissue-specific light-regulated expression directed by the promoter of a C4 gene, maize 5 pyruvate, orthophosphate dikinase, in a C3 plant, rice, PNAS USA 90(20): 9586-90; (2000) Plant Cell Physiol. 41 (1): 42-48; (2001) Plant Mol. Biol. 45 (1): 1-15; Shiina, T. et al. , (1997) Identification of Promoter Elements involved in the cytosolic Ca+ 2 mediated photoregulation 10 of maize cab- ml expression, Plant Physiol. 115: 477-483; Casal (1998) Plant Physiol. 116: 1533-1538; Li (1996) FEBS Lett. 379: 117-121; Busk (1997) Plant J. 11: 1285- 1295, e Meier (1997) FEBS Lett. 415: 91-95, e Matsuoka

(1994) Plant J. 6: 311-319. Outros promotores folha- 15 específicos incluem, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2): 255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105: 357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778; Gotor et al. (1993J Plant J. 3: 509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) : 20 1129-1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (20): 9586-9590.

Em certos procedimentos, promotores específicos de senescência podem ser utilizados (por exemplo, um 25 promotor ativo do tomate durante a maturação do fruto, senescência e abscisão de folhas, um promotor do gene do milho que codifica para uma cisteína protease, e similares). Ver, por exemplo, Blume (1997) Plant J. 12: 731-746; Griffiths et al. , (1997) Sequencing, expression 30 pat tem and RFLP mapping of a senescence-enhanced cDNA from Zea Mays with high homology to oryzain gamma and aleurain, Plant Mol. Biol. 34 (5): 815-21; gene seel parcial de Zea mays para protease cisteína, região promotora e região codificadora 5', GenBank AJ494982;

Kleber-Janke, T. e Krupinska, K. (1997) Isolation of cDNA clones for genes showing enhanced expression in barley leaves during dark- induced senescence as well as during senescence under field conditions, Planta 203 (3):332-40, e Lee, R.H. et al. , (2001) Leaf senescence in rice 10 plants: cloning and characterization of senescence up- regulated genes, J. Exp. Bot. 52 (358): 1117-21.

Promotores raízes-preferidos são conhecidos e podem ser selecionados dentre muitos disponíveis na literatura ou isolados a partir de várias espécies compatíveis. Ver, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20 (2): 207-218 (gene específico da raiz de soja glutamina sintetase), Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10): 1051-1061 (gene raiz-específico elemento de controle no GRP 1.8 do feijão); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14 (3): 433-443 (promotor raiz- específico do gene mannopine sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) e Miao et al. (1991) Plant Cell 3 (1) : 11-22 (clone de cDNA de comprimento total codificando glutamina sintetase citosólica (GS), que se expressa nas raízes e nódulos da raiz da soja) . Veja também Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2 (7): 633-641, onde dois promotores raízes-específicos isolados de genes da hemoglobina da fixação de nitrogênio da não leguminosa Parasponia andersonii e as não leguminosas sem fixação de nitrogênio relacionadas Trema tomentosa são descritos. Os promotores destes genes foram ligados a um gene repórter β-glucuronidase e introduzidos em ambas a não leguminosa Nicotiana tabacum e a leguminosa Lotus corniculatus, e em ambos os casos a atividade de promotor específico de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem a sua análise dos promotores dos genes altamente expressos rolC e rolD de indução de raiz de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79 (1) : 69-76) . Eles concluíram que o potenciador e determinantes de DNA tecido-específicos são dissociados nesses promotores. Teeri et al. (1989) utilizou a fusão do gene IacZ para mostrar que o gene T-DNA de Agrobacterium que codifica octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2' é raiz específico na planta intacta e estimulado por ferimento no tecido foliar (ver, por exemplo, EMBO J. 8 (2): 343-350). 0 gene TRl', fundido a nptll (neomicina-fosfotransferase II) apresentou características semelhantes. Promotores raízes-preferidos adicionais incluem o gene promotor VfEN0D-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29 (4): 759-772); e promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol 25. (4): 681-691. Ver também, Pat. US ne 5.837.876, 5.750.386, 5.633.363, 5.459.252, 5.401.836; 5,110732 e 5023179.

0 uso de promotores que agem temporalmente também é contemplado por esta invenção. Por exemplo, promotores que atuam 0-25 dias após a polinização (DAP), 4-21, 4-12, ou 8-12 DAP podem ser selecionados, por exemplo, promotores, como ciml e ltp2. Promotores que atuam 0-14 dias após a polinização podem também ser utilizados, tais como SAGl2 (Ver WO 96/29858, Richard M. Amasino, publicado em 3 Out. 1996) e ZAGl ou ZAG2 (Ver R.J.

Schmidt, et al., Identification and Molecular Characterization of ZAGl, the Maize Homolog of the Arabidopsis Floral Homeotic Gene AGAMOUS, Plant Cell-5 (7): 729-37 (Julho 1993)). Outros promotores úteis incluem o zag2. I, Zap do milho (também conhecido como 10 ZmMADS; Pedido de Patente US N. 2 10/387,937; WO 03/078590), e do promotor do milho tbl (ver também Hubbarda et al. Genetics 162: 1927-1935, 2002).

Promotores broto-preferidos incluem, promotores 15 broto do meristema-preferidos, tais como promotores divulgados em Weigal et al. (1992) Cell 69: 853-859; Acesso No. AJ131822; Acesso No. Z71981; Acesso No. AF05987 0, o promotor ZAP (Pedido de patente US N. 3 10/387,937), o promotor do milho (Wang et al. (1999) 20 Nature 398: 236-239, e promotores broto-preferidos divulgados em Mc Avoy et al. (2003) Acta Hort. (ISHS) 625: 379-385.

Um promotor induzível é um promotor que é capaz de, 25 direta ou indiretamente, ativar a transcrição de uma ou mais seqüências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as seqüências de DNA ou genes não serão transcritos, ou serão transcritos em um nível inferior ao de um estado induzido. 0 indutor pode ser um 30 agente químico, como um metabólito, regulador do crescimento, herbicida ou composto fenólico, ou um estresse fisiológico diretamente imposto à planta, tais como frio, seca, calor, sal, toxinas. Promotores de plantas que são induzíveis após exposição a hormônios vegetais, tais como auxinas, podem ser utilizados. Por exemplo, a invenção pode utilizar os elementos de resposta a auxina do promotor subsequente El (AuxREs) a partir da soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397-407), o promotor auxina-responsivo de Arabidopsis GST6 (também responsivo ao ácido salicílico e peróxido de hidrogênio) (Chen (1996) Plant J. 10: 955- 966), o promotor auxina-induzível parC do tabaco; um elemento resposta da biotina vegetal (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-937) e o promotor responsivo ao estresse do hormônio ácido abscísico (Sheen

(1996) Science 274: 1900-1902). Promotores vegetais que são induzíveis após exposição a reagentes químicos que podem ser aplicados às plantas, como herbicidas ou antibióticos, também são usados para expressar

polinucleotídeos. 0 promotor pode ser um produto químico- promotor induzível, quando a aplicação do produto químico induz a expressão gênica, ou um promotor químico- repressivo, em que a aplicação do produto químico reprime a expressão gênica. Por exemplo, o promotor IN2-2 do 25 milho, ativado por herbicida protetor

benzenossulfonamida, pode ser utilizado (De Veylder

(1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); aplicação de diferentes herbicidas protetores induz distintos padrões de expressão gênica, incluindo a expressão na raiz,

hidatódios e no meristema apical do broto. Uma seqüência de codificação ACC sintase ou configuração de RNA também pode estar sob o controle de, por exemplo, promotores tetraciclina-induzível e tetraciclina-repressível (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229- 5 237; Pat. US n s 5814618 e 5789156, e, Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473 (descrevendo plantas de tabaco transgênicas contendo o gene arginina descarboxilase da Avena sativa L. (aveia) com um promotor tetraciclina- induzível) ; ou, um elemento ácido salicílico-responsivo 10 (Strange (1997) Plant J. 11: 1315-1324. Outros promotores químico-induzíveis são conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a, o promotor GST do milho, que é ativado por compostos hidrofóbicos electrofílicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-Ia 15 do tabaco, que é ativado pelo ácido salicíIico. Outras promotores químico-reguladores de interesse incluem promotores esteróide-responsivos (ver, por exemplo, o promotor glicocorticóide-induzível em Schena et al.

(1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14 (2): 247-257).

Exemplos de elementos reguladores induzíveis incluem um elemento regulador metalotioneína, um elemento regulador cobre-induzível, ou um elemento regulador 25 tetraciclina-induzível, a transcrição a partir da qual pode ser efetuada em resposta a íons de metal divalentes, cobre ou tetraciclina, respectivamente (Fürst et al. , Cell 55: 705-717, 1988; Mett et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 4567-4571, 1993; Gatz et al. , Plant J. 2: 30 397-404, 1992; Roder et al., Mol. Gen. Genet. 243: 32-38, 1994). Elementos reguladores induzíveis incluem também um elemento regulador ecdisona ou um elemento regulador glicocorticóide, a transcrição a partir da qual pode ser efetuada em resposta a ecdisona ou outros esteróides (Christopherson et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 6314-6318, 1992; Schena et al. , Proc. Natl. Sei. USA 88: 10421-10425, 1991; Pat. US n2 6504082); um elemento regulador responsivo ao frio ou um elemento regulador de choque térmico, a transcrição a partir da qual pode ser efetuada em resposta à exposição ao frio ou calor, respectivamente (Takahashi et al. , Plant Physiol. 99: 383-390, 1992), o promotor do gene da álcool- desidrogenase (Gerlach et al. PNAS USA 79: 2981-2985 (1982), Walker et al., PNAS 84 (19): 6624-6628 (1987)), induzido por condições anaeróbicas, e o promotor Iuz- induzível derivado do gene RBCS da ervilha ou gene psaDb da ervilha (Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2): 255- 265) , um elemento regulador luz-induzível (Feinbaum et al. , Mol. Gen. Genet. 226: 449, 1991; Lam e Chua, Science 248: 471, 1990; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (20): 9586-9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23 (6): 1129-1138), um elemento regulador hormônio vegetal-induzível (Yamaguchi-Shinozaki et al. , Plant Mol. Biol. 15: 905, 1990; Kares et al. , Plant Mol. Biol. 15: 225, 1990), e similares. Um elemento regulador induzível também pode ser o promotor do gene do milho In2-1 ou In2-2 que responde ao herbicida de proteção benzenossulfonamida (Hershey et al. , Mol. Gen. Gene 227: 229-237, 1991; Gatz et al. Mol. Gen. Genet. 243: 32-38, 1994), e do repressor Tet do transposon TnlO (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237, 1991). Promotores stress-induzíveis incluem promotores sal/estresse hídrico-induzíveis, como P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 129: 81-89); promotores frio-induzíveis, tais 5 como, corl5a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93: 1246-1252), corl5b (Wlihelm et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 1073-1077), wscl20 (Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al. (1997) Plant Mol Biol. 33: 897-909), CÍ21A (Schneider et al. (1997) Plant 10 Physiol. 113: 335-45); promotores seca-induzíveis, tais como, Trg-31 (Chaudhary et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 1247-57), rd29 (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18: 287-291); promotores osmóticos induzíveis, tais como Rabl7 (Vilardell et al. (1991) 15 Plant Mol. Biol. 17: 985-93) e osmotina (Raghothama et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 1117-28); e promotores calor induzíveis, tais como proteínas de choque térmico (Barros et al. (1992) Plant Mol. 19: 665-75; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14: 2741), smHSP (Waters et al. (1996) 20 J. Experimental Botany 47: 325-338), e o elemento choque térmico induzível do promotor da ubiquitina da salsa (WO 03/102198). Outros promotores stress-induzíveis incluem rip2 (Pat. US No. 5332808 e Publicação US No. 2003/0217393) e rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993) 25 Mol. Gen. Genetics 236: 331-340). Alguns promotores são induzíveis por ferimento, incluindo o promotor pmas de Agrobacterium (Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3): 495-505) e o promotor 0RF13 de Agrobacterium (Hansen et al. , (1997) Mol. Gen. Genet. 254 (3): 337-343).

30 O cassete de expressão utilizado na invenção pode incluir, o término 3' da seqüência nucleotídica heteróloga de interesse, uma região de terminação transcricional e traducional funcional em plantas. A 5 região de terminação pode ser nativa com a seqüência nucleotídica do promotor da presente invenção, pode ser nativa com a seqüência de DNA de interesse, ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídio Ti 10 de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. O término 3' de pinll (inibidor de proteinase da batata) pode ser utilizado. Ver Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425- 449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498. 15 Para as outras seqüências 3' terminais ver também, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Bailas 20 et al. 1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente seqüências condutoras 5'. Tais seqüências condutoras 25 podem atuar para melhorar a tradução. Condutores de tradução são conhecidos na arte e incluem: condutores de picornavírus, por exemplo, condutor EMCV (região não codificadora 5' da encefalomiocardite), Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86: 6126-6130; 30 condutor do potyvírus, por exemplo, condutor do TEV (Tobacco Etch Virus), Allison et al. (1986); condutor do MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus), Virology 154: 9-20; proteína de ligação de cadeia pesada da imunoglobulina humana (BIP), Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94;

condutor não traduzido da proteína capsidial do mRNA do vírus do mosaico da alfalfa (AMV KNA 4), Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625), condutor do vírus do mosaico do tabaco (TMV), Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-2 56; e condutor do maize chlorotic 10 mottle virus (MCMV) Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385. Ver também Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84: 965-968. 0 cassete pode conter também seqüências que realçam a tradução e/ou a estabilidade do mRNA, como íntrons.

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Qualquer tipo de transformação pode ser utilizado para obter a linha indutora de ablação seletiva. Protocolos de transformação, bem como protocolos para a introdução de seqüências nucleotídicas em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de células vegetais, ou seja, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, orientadas para a transformação. Os métodos de introdução de seqüências nucleotídicas em células vegetais e posterior inserção no genoma vegetal incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechnigues 4: 320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et al. , Pat US No. 5563055), a transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722), e aceleração de partículas balísticas (ver, por exemplo, Sanford et al. , Patent US No. 4945050; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim) e MeCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926). Ver também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421- 477; Sanford et al. (1987) ) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (soja); Finer e MeMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27p: 175-182 (soja), Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (soja ); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz), Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4305-4309 (milho), Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559-563 (milho); Tomes, Patente US No. 5.240.855; Buising et al. , Patente US na 5322783 e 5324646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, " in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (milho), Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; Bowen et al., Patente US No. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl.. Acad. Sei. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformação mediada por verga da cevadeira); D1Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (eletroporação), Li et al. (1993) 5 Plant Cell Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Ishida et al.

(1996) Nature Biotechnology 14: 745-750; Patente US 5.731.179; US 5.591.616; US 5.641.664; e US 5.981.840 (milho via Agrobacterium tumefaciens), as divulgações são

incorporadas aqui por referência.

Na planta a transformação por Agrobacterium é divulgada nos seguintes: Bechtold, N., J. Ellis, G. Pelletier (1993) C.R., Acad Sci Paris Life Sci 316: 1194- 15 1199; Bechtold, N., B. et al. (2000) Genetics 155: 1875- 1887; Bechtold, N. e G. Pelletier (1998) Methods Mol Biol. 82: 2 59-2 66; Chowrira, G.M., V. Akella, Lurquin e P. F. (1995) Mol. Biotechnol. 3: 17-23; Clough, S.J., e A.F. Bent (1998) Plant J. 16: 735-743; Desfeux, C., S.J. 20 Clough, e A.F. Bent. (2000) Plant Physiol. 123: 895-904; Feldmann, K.A., e M.D. Marks (1987) Mol. Gen. Genet. 208:

1-9; Hu C.-Y., e L. Wang. (1999) Em Vitro Cell Dev. Biol.-Plant 35: 417-420; Katavic, VGW Haughn, D. Reed, M. Martin, L. Kunst (1994) Mol. Gen. Genet. 245: 363-370; 25 Liu, F., et al. (1998) Acta Hort 467: 187-192; Mysore, K.S., C.T. Kumar, e S.B. Gelvin (2 000) Plant J. 21: 9-16; Touraev, A., E. Stoger, V. Voronin, e E. Heberle-Bors

(1997) Plant J. 12: 949-956; Trieu, A. T. et al. (2000) Plant J. 22: 531-541; Ye, G. N. et al. (1999) Plant J.

19: 249-257; Zhang, J.U. et al. (2000) Chem Biol. 7: 611- 621. As divulgações acima são aqui incorporadas por referência.

Vários tipos de tecidos vegetais podem ser 5 utilizados para transformação, tais como células embrionárias, células meristemáticas, células foliares, calos ou células derivadas de embriões, folhas ou células meristemáticas. No entanto, qualquer célula competente em transformação ou tecido pode ser utilizada. Vários 10 métodos para aumentar a frequência de transformação também podem ser empregados. Tais métodos são divulgados em WO 99/61619, WO 00/17364, WO 00/28058, WO 00/37645; US Na 09/496,444; WO 00/50614; US 01/44038 e WO 02/04649. As divulgações acima são aqui incorporadas por referência.

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Transformação de milho pode seguir um protocolo de transformação por bombardeamento bem estabelecido utilizado para a introdução de DNA em escutelos de embriões imaturos de milho (ver, por exemplo, Tomes et al. Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment. pp.197-213, em Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods. eds. O.L. Gamborg e G.C. Phillips. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995.). As células são transformadas pelo cultivo de embriões imaturos de milho (aproximadamente 1-1,5 milímetros de comprimento) em meio contendo sais N6, vitaminas Erikkson's, 0,69 g/L de prolina, 2 mg/L de 2,4-D e 3% de sacarose. Após 4-5 dias de incubação no escuro a 28°C, os embriões são eliminados do primeiro meio e cultivados em meio similar contendo 12% de sacarose. Os embriões são aclimatizados neste meio para 3 h antes da transformação. A superfície escutelar dos embriões imaturos é segmentada usando bombardeamento de partículas. Embriões são transformados utilizando a 5 arma de hélio Gun PDS-1000 da Bio-Rad em um tiro por amostra utilizando discos de ruptura de 650PSI. A descarga de DNA por tiro chega a 0.1667μg. Após bombardeio, todos os embriões são mantidos em meio de cultura de milho normal (sais N6, vitaminas Erikkson1s, 10 0,69g/L de prolina, 2mg/L de 2,4-D, 3% de sacarose) por

2-3 dias e depois transferidos para meio baseado em N6 contendo um agente seletivo. Placas são mantidas a 28°C no escuro e são observadas para recuperação de colônia com transferências para meio fresco de duas a três 15 semanas. Colônias recuperadas e plantas são pontuadas baseado no fenótipo selecionável ou telado transmitidos pelo gene marcador (s) introduzido (ou seja, resistência a herbicida, fluorescência ou produção de antocianina), e pela caracterização molecular através de PCR e análise de 20 Southern.

Transformação de milho também pode ser feita usando o método de descarga de DNA mediada por Agrobacterium, tal como descrito pela Patente dos Estados Unidos n. 25 5981840, com as seguintes modificações. Agrobacterias são cultivadas para a fase Iog em meio líquido mínimo A contendo ΙΟΟμΜ de espectinomicina. Os embriões são imersos em uma fase Iog de suspensão de Agrobacteria ajustada para obter uma concentração efetiva de 5 x 108 30 cfu/mL. Embriões são infectados por 5 minutos e em seguida co-cultivados em meio contendo acetosiringona durante 7 dias a 2O0C no escuro. Após 7 dias, os embriões são transferidos para o meio padrão da cultura (sais MS com macronutrientes N6, lmg/L de 2,4-D, lmg/L de Dicamba, 20g/L de sacarose, 0.6g/L de glucose, lmg/L de nitrato de prata, e lOOmg/L de carbenicilina), com um agente seletivo. Placas são mantidas a 28°C no escuro e são observadas para recuperação da colônia com transferências para meio fresco duas a três semanas. Colônias recuperadas e plantas são pontuadas baseado no fenótipo selecionável ou telado transmitido pelo gene marcador (s) introduzido (ou seja, resistência a herbicida, fluorescência ou produção de antocianina), e pela caracterização molecular através de PCR e análise de Southern.

Um marcador selecionável pode ser utilizado na recuperação de células transformadas. Genes marcadores incluem genes que codificam a resistência aos antibióticos, tais como a codificação de neomicina- fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes de resistência a compostos herbicidas, tais como o glufosinato de amônio (o ingrediente ativo em BASTA™), bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Por exemplo, um polinucleotídeo com resistência a herbicida que codifica glifosato N-acetiltransferase (GAT) poderia ser utilizado com o agente selecionável glifosato. Ver publicação PCT WO 02/36782 e Pedido US No. 10/427,692. O polinucleotídeo PAT (fosfinotricina acetiltransferase) poderia ser utilizado para a resistência à fosfinotricina (DeBlock et al. , 1987, Engineering herbicide resistance in plant by expression of a detoxifying enzyme, EMBO J. 6: 2513- 2518). Outro exemplo é um polinucleotídeo ALS 5 (acetolactato sintase) de resistência à imidazolinas (Sathasivan et al., 1990, Nucleotide sequence of a mutant acetolactate synthase gene from an imidazolinone- resistant Arabidopsis thaliana var, Columbia, Nucleic Aeids Res. 18:2188). Marcadores selecionáveis adicionais 10 incluem marcadores fenotípicos tais como β-galactosidase e proteínas fluorescentes, como a proteína verde fluorescente (GFP) (Su et al. (2 004) Bioteehnol Bioeng 85: 610-9 e Fetter et al. (2004) Plant Cell 16: 215-28), proteína fluorescente cian (CYP) (Boite et al. (2004) J. 15 Cell Science 117: 943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42), e proteína fluorescente amarela (PhiYFP™ de Evrogen, ver, Bolte et al. (2 004) J. Cell Science 117: 943-54). Para obter mais marcadores selecionáveis, ver geralmente, Yarranton (1992) Curr. 20 Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Yao et al.

(1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Mierobiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) em The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566, Brown et al. 25 (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713- 722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2549-2553; et al Deuschle. (1990) Science 248:480- 483; Gossen (19 93) Tese de Doutorado, Universidade de 30 Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) 5 Nucleic Acids Res. 19:4647-4653, Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al.

(1991) Antimicrob. Agents Chemother 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Tese de Doutorado, Universidade de 10 Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin), Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Tais 15 divulgações são aqui incorporadas por referência. Esta lista de genes marcadores selecionáveis não pretende ser uma limitação. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado na presente invenção.

Após embriões haplóides terem identificado as

células haplóides, embriões haplóides, sementes haplóides, mudas haplóides ou plantas haplóides podem ser tratados com um agente de duplicação de cromossomo. Plantas homozigóticas podem ser regeneradas a partir de 25 células haplóides, contactando células haplóides, como células de embrião haplóides, com agentes de duplicação cromossômica. As células haplóides podem entrar em contato com o agente de duplicação no momento da polinização, no momento após a polinização, tipicamente 6 30 horas a 21 dias após a polinização, 6 horas a 15 dias após a polinização, na fase de semente madura, na fase de mudas, ou na fase de planta. 0 embrião haplóide pode entrar em contato com o agente de duplicação quando um núcleo espermático de um grão de pólen funde com os núcleos polares no saco embrionário para criar um endosperma triplóide (3N) (quando o embrião haplóide é formado), no momento após a polinização, normalmente 6 horas a 21 dias após a polinização, 6 horas a 15 dias após a polinização, ou na fase de semente madura. 0 embrião haplóide pode ser isolado. Ele pode ser contido dentro do núcleo, óvulo, ou semente. Também pode ser sobre a espiga, no caso do milho, ou no espigão, como no caso de outros grãos como o trigo. A espiga compreendendo o embrião haplóide pode ser na planta ou isolada da planta. A espiga também pode ser secionada. Após a duplicação cromossômica, o embrião haplóide duplo vai conter 2 cópias maternalmente derivadas de cromossomos. A eficiência do processo de obtenção de plantas haplóides duplicadas de embriões haplóides pode ser superior a 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%.

Métodos de duplicação cromossômica são divulgados em Antoine-Michard, S. et al., Plant cell, tissue organ cult., Cordrecht, the Netherlands, Kluwer Academic Publishers, 1997, 48 (3): 203-207; Kato, A., Maize 25 Genetics Cooperation Newsletter 1997, 36-37; e Wan, Y. et al., TAG, 1989, 77: 889-892. Wan, Y. et al. , TAG, 1991, 81:205-211. As divulgações são incorporadas neste documento por referência. Métodos típicos envolvem contato com as células com colchicina, agentes anti- 30 microtúbulos ou herbicidas anti-microtúbulos, pronamida, óxido nitroso, ou qualquer inibidor mitótico para criar células haplóides duplicadas homozigóticas. A quantidade de colchicina utilizada é geralmente em média 0,01% - 0,2% ou cerca de 0,05% ou APM (5-225|iM) . A quantidade de 5 pronamida no meio é de aproximadamente 0,5-20μΜ. Exemplos de inibidores mitóticos conhecidos são incluídos, mas não estão limitados àqueles indicados na Tabela 5. Outros agentes podem ser utilizados com os inibidores mitóticos para melhorar a eficiência de duplicação. Esses agentes 10 podem ser dimetilsulfóxido (DMSO), adjuvantes, surfactantes, e coisas do gênero.

TABELA 5

Nome comum/ Nome CAS IUPAC da marca Colchicina e Derivados de Colchicina colchicina / (S)-N-(5,6,7,9-tetrahidro- ácido 1, 2,3,10-tetrametoxi- 9- acetiltrimetilcol oxobenzo (a) heptalen-7-il) - chicínico acetamida derivados de colchicina Carbamatos Carbetamida (R)-1- (2R)-N-etil-2- (etilcarbamoil)etil [[(fenilamino)carbonil]oxi]p carbanilato ro-panamida cloroprofam profam Benzamidas Pronamida / 3,5-dicloro-N-(1,1- 3,5-dicloro-N-(1,1-dimetil- propizamida dimetilpropinil)benza 2-propinil)benzamida mi da tebutam Ácidos Benzóicos Clortal dimetil (DCPA), Dicamba / dianat/ ácido 3,6-dicloro-o- ácido 3,6-dicloro-2- disugran anísico metoxibenzóico (dicamba-metil) (BANVEL, CLARITY) Agentes duplicadores cromossômicos dinitroanilina benfluralina / N-butil-N-etil-α,a,a- N-butil-N-etil-2,6-dinitro- benefina / trifluoro-2,6- 4- (BALAN) dinitro-p-toluidina (trifluorometil)benzenamina butralina (RS)-N-sec-butil-4- 4-(1,1-dimetiletil)-N-(1- tert-butil-2, 6- metilpropil)-2,6- dinitroanilina dinitrobenzenamina cloralina dinitramina Nl,Nl-dietil-2,6- N3,N3-dietil-2,4-dinitro-6- dinitro-4- (trifluorometil)-1,3- trifluorometil-m- benzenediamina fenilenodiamina etalfluralina N-etil-α,a,a- N-etil-N-(2-metil-2- (Sonalan) trifluoro-N-(2- propenil)-2,6-dinitro-4- metilalil)-2,6- (trifluorometil)benzenamina dinitro-p-toluidina flucloralina N- (2-cloroetil)-2,6- N- (2-cloroetil)-2,6-dinitro- dinitro-N-propil-4- N-propil-4- (trifluorometil)anili (trifluorometil)benzenamina na ou N- (2-cloroetil)- a,a,a-trifluoro-2,6- dinitro-N-propil-p- toluidina isopropalina 4-isopropil-2,6- 4-(1-metiIetil)-2,6-dinitro- dinitro-N,N- N,N-dipropilbenzenamina dipropiIaniIina metalpropalina a,a,a-trifIuoro-N-(2- N-(2-metil-2-propenil)-2,6- metilalil)-2,6- dinitro-N-propil-4- dinitro-N-propil-p- (trifluorometil)benzenamina toluidina nitralina 4-metilsulfonil-2,6- 4-(metilsulfonil)-2,6- dinitro-N,N- dinitro-N,N- dipropiIaniIina dipropilbenzenamina orizalina 3,5-dinitro-N4,N4- 4-(dipropilamino)-3,5- (SURFLAN) dipropilsulfanilamida dinitrobenzenosulfonamida pendimetalina N- (1-etilpropil)-2,6- N- (1-etilpropil)-3,4- (PROWL) dinitro-3,4-xilidina dimetil-2,6- dinitrobenzenamina prodiamina 5-dipropilamino- 2,4-dinitro-N3,N3-dipropil- α,α,α-trifluoro-4,6- 6- (trifluorometil)-1,3- dinitro-o-toluidina benzenediamina OU 2,6-dinitro-Nl,Nl- dipropil-4- trifluorometil-m- fenilenediamina profluralina N-ciclopropilmetil- N- (ciclopropilmetil)-2,6- a,a,a-trifluoro-2,6- dinitro-N-propil-4- dinitro-N-propil-p- (trifluorometil)benzenamina toluidina OU N-ciclopropilmetil- 2,6-dinitro-N-propil- 4- trifluorometilanilina trifluralina α,a,a-trifluoro-2 , 6- 2,6-dinitro-N,N-dipropil-4- (TREFLAN, TRIFIC, dinitro-N,N-dipropil- (trifluorometil)benzenamina TRILLIN ) p-toluidina Fosforoamidatos APM (Amiprofosmetil); amiprofosmetil Butamifos O-etil 0-6-nitro-m- O-etil O-(5-metil-2- tolil (RS)-sec- nitrofenil) (1- butilfosforamidotioat metilpropil)fosforamidotioat o o Piridinas Ditiopir Tiazopir metil 2- metil 2-(difluorometil)-5- difluorometil-5-(4,5- (4,5-dihidro-2-tiazolil)-4- dihidro-1,3-tiazol-2- (2-metilpropil)-6- il)-4-isobutil-6- (trifluorometil)-3- trifluorometilnicotin piridinocarboxilato ato O agente de duplicação cromossômica pode entrar em contato com o embrião várias vezes. Se o embrião é isolado o agente de duplicação pode entrar em contato imediatamente após o isolamento, e antes da germinação. Se o embrião é contido dentro da semente, pode entrar em contato com o agente de duplicação no momento após a polinização e antes da secagem. Se o embrião está isolado ou não pode entrar em contato com o agente de duplicação a qualquer hora entre as 6 horas após a polinização e 21 dias após a polinização. A duração do contato entre o agente de duplicação cromossômica pode variar. 0 contato pode ser de menos de 24 horas até cerca de uma semana. A duração do contato é geralmente cerca de 24 horas a 2 dias.

Métodos fornecidos podem ou não passar por uma fase de formação de calo. Os embriões haplóides podem ser colocados em um meio para promover "não-calo" . 0 termo "meio para promover não-calo" refere-se a um meio que não dá suporte a proliferação de massas desdiferenciadas de células ou tecidos. Um "meio para promover "não-calo"" preferido é usado para recuperar embrião, contendo sal e 5 típicas formulações de vitamina bem conhecidas na arte. Nesse resgate de embrião, ou cultura de embrião, meios contém pouca ou nenhuma auxina [para revisão ver Raghaven, V., 1966. Biol. Rev. 41: 1-58]. Meio de maturação de embrião representa também um outro preferido 10 "meio para promover "não-calo"". Meio para maturação do embrião é usado para promover o desenvolvimento dos embriões cultivados in vitro, prevenindo a germinação precoce e, normalmente, contém formulações padrão de sal / vitaminas (dependendo da espécie), níveis aumentados de 15 açúcar e / ou ácido abscísico adicionado exogenamente, com pouca ou nenhuma auxina. Outro tipo de meio é usado para brotar cultura, ou superbrotar. Este meio para superbrotar pode novamente conter pouca ou reduzida auxina, mas em vez disso conter níveis elevados de 20 citocinina que promovem a proliferação e crescimento do meristema.

Uma auxina é definida como um hormônio vegetal endógeno, como ácido indol acético (IAA), derivados do IAA, como ácido indol-3-butérico, bem como compostos com atividade auxina-semelhantes, tais como 2,4-D; picloram, dicamba ; 3,4-D, 2,4,5-T e ácido naftaleno acético (NAA).

A citocinina é definida como um hormônio vegetal que ocorre naturalmente, tal como 2-isopentinel adenina (2iP), zeatina e dihidrozeatina, ou um composto sintético com atividade citocinina-semelhante como cinetina e BAP (beinzilaminopurina).

Células haplóides de embriões, sementes, plantas,

etc, podem ser identificadas por vários métodos, como, por contagem cromossômica, medição do comprimento das células guarda, ou pela utilização de um citômetro de fluxo.

10

Marcadores moleculares ou PCR quantitativo podem ser usados para determinar se um tecido ou planta é constituído por células haplóides duplicadas ou é constituído de células diplóides (células obtidas através de polinização normal).

Embriões haplóides que são obtidos por qualquer uma das técnicas acima podem ser cultivados para regenerar uma planta inteira. Tais técnicas são chamadas resgate de 20 embriões. Meios para resgate de embriões podem incluir determinados fitormônios e fontes de energia ou apenas as fontes de energia. 0 meio de crescimento também pode conter um agente de seleção, como um biocida e / ou herbicida. Este agente de seleção pode ser usado para 25 indicar um marcador, que foi introduzido através do processo de transformação. Para a transformação e regeneração de milho ver, Gordon-Kamm et al. , The Plant Cell 2: 603-618 (1990). Os métodos fornecidos podem ser executados com qualquer planta. Essas plantas incluem, mas não estão limitadas a Zea mays (também identificada como trigo ou milho), soja, óleo de Brassica, alfafa, arroz, centeio, 5 sorgo, girassol, tabaco, batata, amendoim, algodão, batata doce, mandioca, beterraba, tomate, aveia, cevada e trigo.

A geração de embriões em plantas é bem conhecida na 10 arte. Técnicas de resgate de embrião podem ser usadas para gerar embriões haplóides duplicados imaturos em plantas (Recent Research Developments in Genetics & Breeding. Vol. I, Parte II, 287-308 2004). A divulgação está aqui incorporada por referência.

15

A temperatura na qual os métodos podem ser realizados pode variar. Os métodos fornecidos podem ser executados em qualquer temperatura que não mate uma célula vegetal ou planta ou cerca de 16 graus Celsius a 32 graus Celsius.

Métodos são fornecidos de produção de embriões haplóides e embriões diplóides não viáveis em uma planta de milho. 0 método inclui, mas não se limita a produzir 25 cerca de 3% ou mais, cerca de 5% ou mais, ou cerca de 10% ou mais embriões haplóides viáveis. Para o cálculo do percentual, o número total de embriões é determinado pela adição do número de embriões haplóides para o número de embriões que não se desenvolvem corretamente. Os embriões 30 diplóides não-viáveis podem ser selecionados a qualquer momento após a polinização. 0 método inclui, mas não está limitado, a seleção em 7-15 dias, em 10-21 dias, ou no momento em que a semente haplóide está plenamente madura, por exemplo, durante ou após a secagem.

Métodos são fornecidos para seleção de embriões haplóides de milho por polinização de uma espiga de milho com o pólen de uma linhagem indutora de milho. A linhagem indutora possui um gene que se expressa no embrião e pode ser letal. Na outra localização do genoma a linhagem indutora do milho tem um gene que impede a transmissão do pólen. O gene que impede a transmissão do pólen está intimamente ligado a um gene que, quando expresso no embrião, inibe a letalidade do gene no primeiro local. Assim, quando a espiga do milho é polinizada por esta linhagem indutora não há transmissão de pólen que contém o gene que impede os efeitos letais do gene letal. Apenas o pólen com o gene que é letal para o desenvolvimento dos embriões é transmitido. Quando este pólen é utilizado e a fecundação normal ocorre resultando em um embrião diplóide, o embrião não vai desenvolver por causa da transmissão do gene letal. Quando este pólen é utilizado e a fertilização irregular ocorre resulta em um embrião haplóide. Esse embrião haplóide continuará a desenvolver- se. Devido à ablação dos embriões diplóides, embriões haplóides facilmente serão selecionados em um estágio inicial do desenvolvimento. Tendo o gene letal e o gene inibidor em diferentes locais no genoma, por exemplo, tendo os genes desvinculados, permite-se aos genes segregar a fim de que uma quantidade suficiente de pólen compreendendo o gene letal seja produzida. O gene que impede a transmissão de pólen está intimamente ligado, ou próximo, ao gene que inibe a ablação do embrião.

Outro método fornecido é o desenvolvimento de uma

linhagem indutora melhorada, chamada de linhagem indutora de ablação seletiva. Uma linhagem indutora de milho pode ser transformada com dois cassetes de expressão diferentes. 0 primeiro cassete de expressão inclui um polinucleotídeo que quando expresso no embrião é letal para o embrião ou impede o embrião do desenvolvimento normal. O segundo cassete de expressão inclui um polinucleotídeo que impede pólen transmissível ou viável do desenvolvimento e um polinucleotídeo que, quando expresso no embrião impede a morte ou o crescimento anormal que seria causado pelo polinucleotídeo no primeiro cassete de expressão. O processo de transformação pode ser feito por vários métodos, por exemplo, bombardeamento de partículas ou infecção por agrobacteria. 0 processo de transformação com os dois cassetes pode ser feito simultaneamente ou seqüencialmente com o cassete compreendendo o polinucleotídeo para evitar a letalidade do embrião sendo introgressado na primeira célula vegetal. Os cassetes de expressão precisam segregar nos gametas, por isso, é preferível que os dois cassetes de expressão não estejam estreitamente ligados. Como parte do método, qualquer linhagem de milho pode ser transformada com o primeiro, ou primeiro e segundo cassete de expressão. 0 primeiro e / ou segundo cassetes de expressão podem ser usados para transformar uma ou duas plantas de milho. Os cassetes de expressão podem então ser transferidos simultaneamente ou seqüencialmente em uma linhagem indutora de milho por cruzamento. 0 método pode incluir retrocruzamento de um 5 ou todos os trangenes em uma linhagem indutora de milho. O repressor poderia ser substituído e segregado para fora.

Em qualquer dos métodos divulgados a inibição pode 10 ser descrita por vários mecanismos. Por exemplo, a transcrição do polinucleotídeo letal pode ser prevenida. Este tipo de inibição poderia ser conseguido através de um polinucleotídeo repressor tet que expressa uma proteína que se liga ao gene letal e inibe a expressão. 15 Outros tipos de prevenção da letalidade podem estar no RNA, ou fase de proteína, por exemplo, RNA anti-senso, grampos "hairpins", e outros mecanismos de silenciamento de genes.

Em qualquer destes métodos e produtos, o gene que

impede a transmissão do pólen pode ser um gene letal com um promotor pólen-específico. Por exemplo, o gene pode expressar alfa-amilase (Gene Bank L25805), Plant Physiology 105 (2): 759-760 (1994) e pode ser controlado 25 com um promotor PG47 (Patente US 5.412.085; Patente US 5.545.546; J. Plant 3 (2): 261-271 (1993)). Em qualquer um desses métodos e produtos, a expressão do polinucleotídeo que provoca a ablação e o polinucleotídeo que inibe a ablação pode ser controlada por vários tipos 30 de promotores. Por exemplo, o promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotor induzível, ou um promotor tecido-preferido, como um promotor embrião- preferido. Seria mais eficaz se o promotor que dirige o polinucleotídeo que provoca a ablação do embrião não 5 expressasse no endosperma. Ou, se o promotor é expresso no endosperma a expressão seria baixa o suficiente para que ainda determinasse uma diferença de crescimento entre as sementes diplóides (fertilização normal) e as sementes haplóides. Um exemplo de promotor embrião-preferido é 10 Iecl.

A invenção divulgada inclui uma linhagem indutora de milho que compreende os dois cassetes de expressão, tal como descrito.

15

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são aqui incorporados por referência na mesma dimensão, como se cada publicação ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado a ser incorporado por referência.

Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração e não por meio de limitação.

EXEMPLOS

Genes gat codificando glifosato-N-acetiltransferase (GAT) . Ver publicação PCT W002/3 6782 e Pedido de Patente US No. 10/427 . 692 .

lecl-indica um polinucleotídeo ativador

transcricional cotilédone folhoso I. Ver Pedido de Patente US 09/435,054. Promotor Iecl é caracterizado na Patente US 7.122.658.

moCah- é um gene de milho otimizado que codifica para a proteína cianamida hidratase [CAH] de Myrothecium verrucaria que pode hidratar a cianamida à uréia não tóxica.

pinll- indica inibidor da protease da batata. Ver Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498.

Pro- indica uma seqüência promotora.

Term- indica uma seqüência terminadora.

Ubi Pró- indica um promotor ubiquitina. Ver Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689) UbilZM Pro- indica um promotor de milho ubiquitina.

EXEMPLO 1:

Sementes de linhagens indutoras haplóides, como Stock 6, RWS, KEMS, KMS ou ZMS, são plantadas e auto- polinizadas ou polinizadas em floração. As espigas são esterilizadas na superfície em 3 0% de Clorox bleach mais

0,5% de Micro detergente durante 20 minutos, e lavadas duas vezes com água estéril.

Para transformação de milho mediada por

Agrobacterium o método de Zhao é utilizado essencialmente como descrito na Pat. US No. 5981840, cujos conteúdos são incorporados por referência. Embriões (geralmente cerca de 7-14 dias após a polinização) são isolados a partir de uma planta de milho e os embriões são contactados com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias são capazes de transferir as seqüências nucleotídicas de interesse para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões. A Agrobacterium compreende o seguinte cassete de expressão.

Constructo C:

Promotor ZM-Iecl: intronUBlZM: barstar: terminador 3' pinll - promotor ZM-PG47: peptídeo de trânsito ZM-BTl: ZM-alfa-amilasel: terminador 3' ZM-IN2-1 - promotor UBlZM: intron UTR 5': GAT: terminador 3' PINII.

Nesta etapa os embriões são normalmente imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da 15 inoculação. Preferencialmente, a suspensão de Agrobacterium contém 100 μΜ de acetosiringona. Os embriões são co-cultivados por um tempo com a Agrobacterium.

Geralmente, esses embriões são cultivados em meio

sólido após o estágio de infecção. Após este período de co-cultivo um passo opcional de "descanso" duradouro de 6-7 dias é contemplado. Neste passo de repouso, os embriões são incubados na presença de, pelo menos, um 25 antibiótico conhecido por inibir o crescimento de Agrobaeterium, sem a adição de um agente seletivo para os transformantes vegetais. Em seguida, os embriões inoculados são cultivados em meio sólido contendo um agente seletivo para o GAT, que é o herbicida glifosato 30 (genes GAT codificando glifosato-N-acetiltransferase (GAT) . Ver publicação PCT W002/3 6782 e Pedido de Patente US No. 10/427, 692).

Após ter sido colocado sobre o meio de seleção o crescente calo transformado é transformado com um segundo cassete, Constructo D. Desta vez usando bombardeamento de partículas.

Constructo D:

Promotor ZM-Iecl: intron LS da batata: barnase: terminador 3' pinll - promotor UBlZM: intron 5' UTR: moPAT: terminador 3' PINII.

Este plasmídio de DNA é precipitado em Ι,ίμιη (diâmetro médio) de pellets de tungstênio usando um procedimento de precipitação de CaCl2 da seguinte forma: 100μL de partículas de tungstênio preparadas em água, 10μL (^g) de DNA em tampão TrisEDTA (^g total), 100μL de 2,5M de CaC12, 10μL de espermidina 0,1M.

Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensão de partículas de tungstênio, enquanto mantido no multitubo vortexer. A mistura final é sonicada brevemente e incubada sob constante agitação durante 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido retirado, lavado com 500μL de etanol 100%, e centrifugado por 30 segundos. Mais uma vez, o líquido é retirado, e 105μL de etanol 100% é adicionado aos pellets finais de partículas de tungstênio. Para o bombardeamento de partículas, as partículas de tungstênio / DNA são brevemente sonicadas e ΙΟμίΙ, sarapintado no centro de cada macrotransportador e secas a cerca de 2 minutos antes do bombardeamento. As placas de amostra são bombardeadas no nível #4, em arma 5 de partículas #HE34-1 ou #HE34-2. Todas as amostras recebem um único tiro em 650 PSI, com um total de dez alíquotas recolhidas de cada tubo de partículas / DNA preparados.

Após o bombardeio, o calo é mantido em meio 56OY por

2 dias e, em seguida, transferido para o meio de seleção contendo o agente de seleção para o gene PAT, bialophos, e subcultivados a cada 2 semanas.

Depois de aproximadamente 10 semanas de seleção, os

clones de calos resistentes selecionados são transferidos para o meio de regeneração para iniciar plantas. Após maturação do embrião somático (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para meio de 20 germinação e transferidos para a sala de cultura iluminada. Cerca de 7-10 dias depois, plântulas em desenvolvimento são transferidas para o meio livre de hormônios em tubos por 7-10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. As plantas são então transferidas para 25 insertos em potes (equivalentes a vaso de 2,5") contendo solo envasado e crescimento por 1 semana em uma câmara de crescimento, posteriormente crescimento em 1-2 semanas adicionais na casa de vegetação e, em seguida, transferidas para 600 vasos clássicos (1,6 litros) e cultivadas até a maturidade. As plantas são monitoradas e marcadas para o genótipo e / ou fenótipo de interesse.

Meio de bombardeamento compreende 4,0g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416), l,0mL/L do Mix de vitamina Eriksson (IOOOx SIGMA-1511), 0,5mg/L de tiamina HCl, 120,0g/L de sacarose, l,Omg/L de 2, 4-D, e 2,88g/L de L-prolina (trazida ao volume com DI H20 após ajuste para pH 5,8 com KOH), 2,0g/L de Gelrite (adicionado depois de elevado o volume com DI H20) ; e 8,5mg/L de nitrato de prata (adicionado depois de esterilizar o meio e arrefecer à temperatura ambiente). Meio de seleção (560R) compreende 4,0g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416), l,0mL/L do Mix de vitamina Eriksson (IOOOx SIGMA-1511), 0,5mg/L de tiamina HCl, 3 0,0g/L de sacarose e 2,0mg/L de 2,4-D (trazido ao volume com DI H20 após ajuste para pH 5,8 com KOH), 3,0g/L de Gelrite (adicionado depois de elevar o volume com DI H20); e 0,85mg/L de nitrato de prata e agente de seleção (ambos acrescentados após esterilizar o meio e arrefecer à temperatura ambiente).

EXEMPLO 2: Produção de embriões haplóides

Após uma ablação a linhagem indutora haplóide é produzida como indicada no Exemplo I. A linhagem indutora 25 pode ser usada para produzir embriões haplóides. Isto pode ser conseguido através do cultivo de sementes de milho Fl. Por exemplo, um milho reprodutor querendo produzir um superior puro com as melhores características da linhagem pura de elite A e da linhagem pura de elite B 30 cruza as duas linhagens para formar sementes híbridas Fl. Esta semente Fl é cultivada juntamente com a linhagem indutora de ablação. 0 calendário de plantio é de tal ordem que o pólen da linhagem indutora de ablação está pronto a tempo do florescimento de sementes híbridas Fl.

As espigas das plantas Fl são polinizadas com a linhagem indutora de ablação do pólen. Isto pode ser alcançado pelo plantio de linhas alternadas de Fl e a linhagem indutora, e várias combinações destas com Fl, ou fêmea, sendo as plantas despigadas antes da polinização. Os 10 cruzamentos também podem ser feitos por atirar ensacamento e controlar polinização por mão polinizadoras.

Após as sementes terem maturado as sementes podem ser colhidas e somente as sementes viáveis serão sementes haplóides. A semente haplóide é plantada e, em seguida, sofre duplicação cromossômica usando um agente de duplicação cromossômica como a pronamida.

EXEMPLO 3í Transformação e Regeneração de plantas de milho indutoras transgênicas

Sementes de milho Hi-II são plantadas. As espigas em

9 -12 dias após a polinização são colhidas e a superfície 25 esterilizada em 30% de Clorox bleach mais 0,5% de Microdetergente durante 20 minutos, e lavadas duas vezes com água estéril. Os embriões são isolados a partir de espigas utilizando um bisturi. Embriões são contactados com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias são 30 capazes de transferir as seqüências de nucleotídeo de interesse para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões. Neste exemplo, os embriões são co-transformados com 2 Agrobacterias.

Uma Agrobacteria compreende o seguinte cassete de

expressão.

Constructo E:

Promotor ZM-Iecl: intron UBlZM: barstar: terminador 3' pinll - promotor ZM-PG47: ZM-BTl peptídeo de trânsito: ZM-alfa-amilase 1: terminador 3' ZM-IN2-1 - promotor UBlZM: intron 5'UTR: GAT : terminador 3' PINII.

A segunda Agrobaeteria compreende o seguinte cassete de expressão.

Constructo F:

Promotor ZM-Ieel: intron LS da batata: barnase: terminador 3' pinll - promotor UBlZM: intron 5'UTR: moPAT: terminador 3' PINII.

O gene barnase inclui um intron a fim de impedir a expressão de barnase na Agrobacteria.

O meio de cultura de tecido e o processo são os 25 mesmos descritos acima com o agente de seleção, bialophos. Calo que só compreende o Constructo E será selecionado contra com o uso de bialophos. Calo que só compreende o Construa F não vai regenerar porque o constructo barstar não está disponível para evitar a 30 toxicidade do barnase. As plantas que serão regeneradas compreendem os Constructos EeF. Estas plantas serão utilizadas para retrocruzamento de ambos construtos em uma linhagem 5 indutora haplóide de milho. Durante o processo de retrocruzamento as linhagens co-transformadas serão avaliadas para determinar a ligação entre os construtos. Quanto mais próximos os constructos estiverem ligados menos transmissão de polinucleotídeos barnase através do 10 pólen irá ocorrer porque vai separar-se com o polinucleotídeo alfa-amilase expresso no pólen tornando o pólen não-viável.

Quando o cruzamento é feito com constructos não ligados, os embriões diplóides são eliminados porque o constructo contendo o barstar não é transmitido através do pólen, e eles só herdam barnase.

Barstar e barnase são ambos expressos no início da embriogênese em transgenes separados, não ligados na linhagem indutora haplóide. Assim, a linhagem indutora haplóide pode ser mantida.

EXEMPLO 4: Transformação e Regeneração de plantas de milho transgênicas indutoras utilizando Agrobacterium compreendendo dois construtos T-DNA.

Um Agrobacterium compreende os 2 seguintes cassetes de expressão.

30 RB: Promotor ZM-Iecl: intron UBlZM: barstar: terminador 3' pinll - promotor ZM-PG47: peptídeo de trânsito ZM-BTl: ZM-alfa-amilase 1: ZM-IN2-1 promotor terminador 3'-UBlZM: intron 5'UTR: GAT: terminador 3'

PINII: LB

RB: Promotor ZM-Iecl: intron LS da batata: barnase: terminador 3' pinll - promotor UB1ZM: intron 5'UTR: moPAT: terminador 3' PINII: LB

10

Transformação com Agrobacterium contendo cassetes pode aumentar a eficiência da produção de plantas transformadas estavelmente compreendendo os dois cassetes em locais no genoma que não estão ligados (Miller et al.

Transgenic Research 11: 381-396, 2002. High efficiency transgene segregation in co-transformed maize plants using an Agrobacterium tumefaciens 2 T-DNA binary system.)

Diferentemente do vetor, o processo para obter uma

linhagem indutora haplóide de ablação do milho pode ser a mesma indicada no Exemplo 3.

Claims

1.Método de seleção de embriões haplóides caracterizado por compreender: a) polinizar uma primeira planta de milho com o pólen de uma linhagem indutora haplóide de milho para produzir embriões onde a dita linhagem indutora haplóide de milho compreende um polinucleotídeo letal expresso pelo embrião, um polinucleotídeo de não-transmissão de pólen, e um polinucleotídeo inibidor expresso pelo embrião que impede a letalidade do dito polinucleotídeo letal expresso pelo embrião; b) produzir embriões haplóides e embriões diplóides não-viáveis; e c) selecionar embriões de milho haplóides.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo dito polinucleotídeo letal expresso pelo embrião ser barnase e o dito polinucleotídeo inibidor expresso pelo embrião ser barstar.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo dito polinucleotídeo inibidor expresso pelo embrião inibir a transcrição do dito polinucleotídeo letal expresso pelo embrião.

4. Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo dito gene inibidor expresso pelo embrião ser um polinucleotídeo repressor tet e o dito polinucleotídeo letal expresso pelo embrião ter um promotor para o qual o dito repressor tet se liga.

5. Método de desenvolvimento de uma linhagem indutora haplóide de milho transformada caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) obtenção de uma célula transformada pela transformação de uma célula de uma linhagem indutora de milho com um primeiro e um segundo cassete de expressão onde o dito primeiro cassete de expressão compreende um polinucleotídeo letal expresso pelo embrião e onde o dito segundo cassete de expressão compreende um polinucleotídeo de não-transmissão de pólen e um polinucleotídeo inibidor expresso pelo embrião que impede a letalidade do dito polinucleotídeo letal expresso pelo embrião; b) regenerar uma planta transformada a partir da dita célula transformada; c) autopolinizar a dita planta transformada para obter uma linhagem indutora haplóide de milho transformada.

6 . Linhagem indutora haplóide de milho de acordo com a reivindicação 5.

7. Linhagem indutora haplóide de milho transgênico caracterizada por compreender um primeiro e segundo cassete de expressão onde o dito primeiro cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que é letal para os embriões e onde o dito segundo cassete de expressão não é transmitido através de pólen e compreende um polinucleotídeo que inibe a letalidade do dito polinucleotídeo que é letal aos embriões.

8. Linhagem indutora haplóide de milho transgênico de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo dito polinucleotídeo que é letal para embriões ser um polinucleotídeo barnase e o dito polinucleotídeo que inibe a letalidade do dito polinucleotídeo que é letal para embriões ser um polinucleotídeo barstar.

9. Linhagem indutora haplóide de milho transgênico de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo dito polinucleotídeo que é letal para embriões compreender um promotor Iecl.

10. Linhagem indutora haplóide de milho transgênico de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo dito segundo cassete compreender um polinucleotídeo alfa-amilase que inibe a transmissão de pólen.

11. Linhagem indutora haplóide de milho transgênico de acordo com a reivindicação 10 caracterizada pelo dito polinucleotídeo alfa-amilase compreender um promotor PG47.

12. Linhagem indutora haplóide de milho transgênico de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo dito primeiro cassete de expressão compreender um operon e o dito segundo cassete de expressão compreender um polinucleotídeo repressor.

13. Linhagem indutora haplóide de milho transgênico de acordo com a reivindicação 12 caracterizada pelo dito operon ser um operon tet e o polinucleotídeo repressor ser um repressor tet.

14. Método de produção de embriões haplóides e embriões diplóides não-viáveis em uma planta.

15. Método de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pela percentagem de embriões haplóides na planta ser de pelo menos 3%.

16. Método de seleção de embriões haplóides caracterizado por compreender polinizar uma planta de milho com uma linhagem de milho indutora e produzir embriões haplóides e embriões diplóides não-viáveis onde a seleção de embriões haplóides ocorre quando a semente compreendendo o embrião está madura.

17. Método de acordo com a reivindicação 16 caracterizado pela seleção de embriões haplóides ocorrer até cerca de 21 dias após a polinização.

18. Método de acordo com a reivindicação 16 caracterizado pela seleção de embriões haplóides ocorrer a partir de cerca de 7 dias após a polinização até cerca de 15 dias após a polinização.

19. Linhagem indutora haplóide de milho transgênico caracterizada por compreender um primeiro e um segundo cassete de expressão onde o dito primeiro cassete de expressão compreende um polinucleotídeo barnase que está operacionalmente ligado a um promotor Iecl e é letal para os embriões e onde o dito segundo cassete compreende vim polinucleotídeo barstar que inibe a letalidade do dito polinucleotídeo que é letal para os embriões e onde o dito segundo cassete de expressão também compreende um polinucleotídeo alfa-amilase operacionalmente ligado a um promotor PG47 onde a expressão do dito polinucleotídeo alfa-amilase operacionalmente ligado a um promotor PG47 não permite a transmissão de pólen.