BRPI0806600A2 - detecção de evento de planta transgênica - Google Patents
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Abstract
DETECçãO DE EVENTO DE PLANTA TRANSGêNICA. A presente invenção refere-se à detecção de materiais derivados de eventos de planta transgênica. Em particular, a invenção fornece métodos, reagentes, kits e materiais de referência para detectar a presença ou ausência em uma amostra de material genético derivado e atribuível a eventos de planta transgênica seletos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETECÇÃO DE EVENTO DE PLANTA TRANSGÊNICA".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se à detecção de materiais deriva- dos de eventos de planta transgênica. Em particular, a invenção fornece mé- todos, reagentes, kits e materiais de referência para detectar a presença ou ausência em uma amostra de material genético derivado e atribuível para selecionar eventos de planta transgênica.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Organismos geneticamente modificados (GMOs)1 em particular plantas geneticamente modificadas, estão ganhando importância na agricul- tura como também na produção e comercialização de alimentos e ração.
Porém, devido às preocupações existentes com relação ao im- pacto dos GMOs no ambiente e na saúde dos consumidores, a introdução de GMOs novos comumente requer aprovação regulatória e, em muitos paí- ses incluindo a União Européia, produtos alimentícios e de ração contendo ou produzidos de GMOs são submetidos à autorização e rotulagem compul- sória (vide, por exemplo, Regulation (EC) n° 1829/2003. OffJ Eur Communi- ties: Legis. 2003, L268: 1-23; Regulation (EC) n° 1830/2003. OffJ Eur Com- munities: Legis. 2003, L268: 24-28).
Por conseguinte, rastreio de GMOs no ambiente e pelo processo de cultivo e cadeia de produção de alimento ou ração é fundamental para avaliação do risco ambiental, como também necessário para preservar a confiança dos consumidores e satisfazer ou verificar a observância das regu- lações obrigatórias, incluindo rotulagem dos produtos de GMO.
Isto requer a disponibilidade de métodos que possam determinar a presença, identidade e/ou quantidade de GMOs ou materiais que originam ou derivados dos mesmos, por exemplo, em fontes de alimento e ração, in- gredientes e/ou artigos de consumo processados. Métodos com base em DNA são muito úteis neste respeito, não menos porque o DNA freqüente- mente suporta tratamentos de processamento alimentar físicos e químicos melhor que outras moléculas, tais como proteínas. Por exemplo, reação em cadeia da polimerase de tempo real (PCR) provou ser uma técnica específi- ca e sensível para a quantificação de ácidos nucleicos indicativos da pre- sença de DNA originando de GMOs.
Ensaios estão disponíveis para de forma não-ambígua concluir a presença ou ausência de material genético derivado de um evento de trans- formação de planta seleto em uma amostra. Comumente, tais ensaios po- dem detectar a presença de uma única seqüência de nucleotídeo evento- específica encontrada no evento de transformação da planta de interesse mas ausente de outros eventos. Por exemplo, tais seqüências de nucleotí- deo distintivas podem estar presentes nas junções entre a seqüência genô- mica endógena dos GMO e a seqüência da construção do gene transfor- mante no sítio de inserção genômico do último; detecção pode envolver am- plificação por PCR, por exemplo, ao longo da dita junção usando iniciadores específicos flanqueando a junção (vide, por exemplo, Hernandez et al. 2003. Transgenic Res 12: 179-189; Hernandez et al. 2004. J Cereal Sci 39: 99- 107; Berdal et al. 2001. Eur Food Res Technol 213: 432-438; Nielsen et al. 2004. Eur Food Res Technol 219: 421-427; ou Ronning et ai 2003. Eur Food Res Technol 216: 347-354).
Porém, estes ensaios evento-específicos podem ser frequente- mente obtidos apenas como kits de custo alto permitindo um número limita- do de testes, são confinados à detecção de material de um evento simples, e comumente empregam condições de reação muito particulares. Ainda, o número de GMOs gerados, autorizados e comercializados continua aumen- tando. Consequentemente, uma determinação não-ambígua da composição de GMO de uma amostra poderia em princípio requerer aplicar uma bateria cada vez mais crescente de ensaios de detecção evento-específicos sepa- rados em cada amostra, que é tanto laborioso quanto dispendioso.
Portanto, embora continue ser desejável empregar ensaios e- vento-específicos devido à natureza não-ambígua de seu resultado, existe uma necessidade de usar estes ensaios em uma maneira mais eficaz e alve- jada, tal como melhorar a detecção da detecção de GMOs, por exemplo, em termos de gasto de tempo, custo e intensidade de trabalho. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em aspectos, a presente invenção fornece métodos, reagentes, kits e materiais de referência que tratam uma ou mais das necessidades a- cima debatidas da técnica.
Em geral, a invenção consequentemente fornece métodos, rea- gentes, kits e materiais de referência melhorados para detectar material de- rivado de GMOs, e preferivelmente de plantas geneticamente modificadas, em amostras.
Mais particularmente, os inventores constataram que selecio- nando cuidadosamente certas características da seqüência a serem ensaia- das na amostra - em que as ditas características da seqüência não necessi- tam ser evento-específicas e podem de fato ser compartilhadas entre dois ou mais eventos - pode-se concluir se a amostra potencialmente contém mate- rial derivado de um ou mais eventos de transformação ou, inversamente, se a amostra não contém material derivado de um ou mais de tais eventos de transformação. Os ensaios da invenção podem desse modo fornecer uma indicação valiosa dos conteúdos dos GMOs potenciais da amostra e assim vantajosamente reduzir o número de testes subsequentes (tais como, por exemplo, ensaios evento-específicos), necessários para verificar a presença de material derivado de um ou mais eventos de transformação particulares na amostra; isto pode por sua vez melhorar a eficácia de custo, tempo e/ou trabalho dos métodos de detecção de GMOs. Por exemplo, os ensaios da invenção podem permitir reduzir consideravelmente o número de ensaios evento-específicos necessários para caracterizar a composição de GMOs da amostra.
Os inventores também meticulosamente avaliaram os eventos de transformação conhecidos, comercialmente significativos e/ou autoriza- dos para selecionar características de seqüência por serem ensaiadas em uma amostra, tal como reduzir o número de reações de teste individuais ne- cessárias por amostra embora assegurando informatividade adequada do perfilamento de GMO de acordo com a invenção.
A presente invenção integra a realização relevante acima em seus aspectos diversos.
Consequentemente, em um aspecto particularmente preferido (aqui aspecto "A1") a invenção diz respeito a um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em:
a) "Zm": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Zea mays, preferivelmente Zea mays ssp. mays,
b) "Bn": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Brassica napus,
c) "Gm": um ácido nucleico derivado e específico para taxono- mia de Glycine Iriaxi e um, mais que um ou todos ácidos nuclsicos selecio- nados de:
d) "p35S": um ácido nucleico derivado do promotor 35S do Vírus do Mosaico de Couve-flor,
e) "tNOS": um ácido nucleico derivado do terminador de 3' do gene de nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens,
f) "Cry1Ab": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais CryIAb de Bacillus thuringiensis,
g) "PAT/bar": um ácido nucleico derivado do gene de fosfinotrici- na acetiltransferase (PAT) ôarde Streptomyces hygroscopicus,
h) "PAT/pat": um ácido nucleico derivado do gene de fosfinotrici- na acetiltransferase (PAT) pat de Streptomyees viridoehromogenes, e
i) "CP4-EPSPS": um ácido nucleico derivado do gene de 5-Enol- piruvilchiquimato-3-fosfato sintase EPSPS de Agrobaeterium sp. CP4; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos sele- cionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, cruza- mentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; eventos MON 40- 3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e even- tos relacionados dos mesmos.
Aspecto A1 permite investigar a presença ou ausência potencial em uma amostra de material de numerosos eventos de planta transgênica pertencendo a várias taxonomias de planta distintas, embora executando um número relativamente limitado de etapas de detecção. Vantajosamente, os eventos de planta transgênica detectados pelo método do aspecto A1 a- brangem uma fração grande, ou ainda substancialmente maior, de eventos de planta transgênica presentemente autorizados e/ou comercializados, por exemplo, na Europa, isto é, eventos de planta transgênica que são particu- larmente prováveis de serem encontrados, por exemple, em amostras ambi- entais ou comerciais. Consequentemente, neste aspecto a invenção fornece um ensaio relativamente pouco exigente para inspecionar um espectro con- siderável de eventos de planta transgênica relevantes.
Preferivelmente, a etapa (1) do aspecto A1 pode envolver detec- tar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todo o ácido nucleico listado sob a) - i) como definido a- cima. Isto vantajosamente melhora a informação obtida mediante testagem da amostra e permite concluir a presença ou ausência potencial de material derivado de um número substancialmente alto de eventos de planta transgê- nica.
Enquanto na etapa (2) do aspecto A1 a detecção é particular- mente prevista para eventos de planta transgênica particulares existentes, será apreciado que outros eventos, incluindo qualquer evento transgênico futuro a ser gerado, podem ser também detectados desde que pertençam às taxonomias como definidas sob a) - c) e compreendam um ou mais dos áci- dos nucleicos como definidos sob d) - i). Esta observação se aplica mutatis mutandis à detecção de eventos em qualquer aspecto da invenção como descrita no seguinte.
Embora o método do aspecto A1 permita examinar simultanea- mente a presença ou ausência na amostra de eventos de planta transgênica que pertencem pelo menos a três taxonomias diferentes, os inventores tam- bém visam adaptar o método a taxonomias individuais. Isto pode de modo útil reduzir o número de etapas de detecção de ácido nucleico se a informa- ção for apenas requerida para uma taxonomia particular.
Consequentemente, em um outro aspecto ("A2") a invenção for- nece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em ácido nucleico listado sob a) co- mo definido acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos seleciona- dos daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho, tais como e- ventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON8IO, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS- 59122, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.
Preferivelmente, a etapa (1) do aspecto A2 pode envolver detec- tar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todo o ácido nucleico listado sob a) e d) - i) como definido acima. Isto aumenta a informação obtida mediante testagem da amostra e permite concluir a presença ou ausência potencial de material derivado de um número comparavelmente mais alto de eventos de planta transgênica de milho.
Em um outro aspecto ("A3") a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em ácido nucleico listado sob b) co- mo definido acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos seleciona- dos daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consis- tindo em eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Libe- rator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3 e eventos relacionados dos mesmos.
Preferivelmente, a etapa (1) do aspecto A3 pode envolver detec- tar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob b) e d) - i) como definidos acima. Isto aumenta a informação obtida mediante testagem da amostra e permite concluir a presença ou ausência potencial de material de- rivado de um número ccmparavelmsnte mais alto de eventos de pianía transgênica de óleo de semente de colza.
Em outra modalidade preferida, a etapa (1) do aspecto A3 en- volve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos com- preendendo ou consistindo em ácido nucleico listado sob b) e d), e), e g) - i) como definidos acima. É observado que muitos eventos de óleo de semente de colza, por exemplo, aquelas especificamente citadas na etapa (2) do as- pecto A3, podem não incluir ácido nucleico listado sob f) como definido aci- ma. Portanto, omissão do dito ácido nucleico listado sob f) da etapa (1) do aspecto A3 pode reduzir o número de testes sem perda de informação.
Em um outro aspecto ("A4"), a invenção oferece um método pa- ra examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de soja compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em ácido nucleico listado sob c) co- mo definido acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos seleciona- dos daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica de soja, tais como even- tos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.
Preferivelmente, a etapa (1) do aspecto A4 pode envolver detec- tar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob c) e d) - i) como definidos acima. Isto aumenta a informação obtida mediante testagem da amostra e permite concluir a presença ou ausência potencial de material de- rivado de um número comparavelmente mais alto de eventos de planta transgênica de soja.
Em outra modalidade preferida, a etapa (1) do aspecto A4 en- volve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos com- preendendo ou consistindo em ácido nucleico listado sob c) e d), e), h) e i) como definidos acima. É observado que muitos eventos de soja, por exem- plo, aqueles especificamente citados na etapa (2) do aspecto A4, podem não incluir os ácidos nucleicos listados sob f) e g) como definidos acima. Portan- to, omissão dos ditos ácidos nucleicos listados sob f) e g) da etapa (1) do aspecto A4 pode reduzir o número de testes sem perda de informação.
Será também apreciado que outros aspectos podem ensinar combinações de quaisquer dois dos aspectos acima A2 - A4. Por exemplo, isto pode vantajosamente reduzir o número de ações de testagem em casos onde a detecção de eventos transgênicos de taxonomias seletas for inten- cionada.
Consequentemente, em um outro aspecto ("A5"), a invenção o- ferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de milho e/ou de óleo de se- mente de colza de planta transgênica compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos listados sob a) e b) como definidos acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos sele- cionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de milho e/ou de óleo de semente de colza de planta transgênica, tais como eventos selecionados do grupo compreenden- do ou consistindo em eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON8IO, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, cruzamentos dos mesmos, e e- ventos relacionados dos mesmos; e eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3 e eventos relaciona- dos dos mesmos.
Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A5 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nuclei- cos listados sob a), b) e d) - i) como definidos acima.
Em ainda um outro aspecto ("A6"), a invenção oferece um méto- do para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de milho e/ou de planta transgênica de soja compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos listados sob a) e c) como definidos acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos sele- cionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de milho e/ou de planta transgênica de soja, tais como eventos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mes- mos; e eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamen- tos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.
Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A6 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nuclei- cos listados sob a), c) e d) - i) como definidos acima.
Em ainda um outro aspecto ("A7"), a invenção oferece um méto- do para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza e/ou de soja compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos listados sob b) e c) como definidos acima e um, mais que um ou todos ácidos nucleicos sele- cionados daqueles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica de óleo de semente de colza e/ou de soja, tais como eventos selecionados do grupo compreenden- do ou consistindo em eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mes- mos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3 e eventos relacionados dos mesmos; e eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cru- zamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.
Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A7 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em todos os ácidos nuclei- cos listados sob b), c) e d) - i) como definidos acima.
Em outra modalidade preferida, a etapa (1) do aspecto A7 en- volve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos com- preendendo ou consistindo em todos os ácidos nucleicos listados sob b), c) e d), e) e g) - i) como definidos acima, isto é, sem detectar o ácido nucleico listado sob f).
Consequentemente, em um aspecto ("A8"), a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou de óleo de semente de colza e/ou de soja compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em:
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob a), b) e c) como definidos acima, e
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos sele- cionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON8IO, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, cruza- mentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/ 90pHoe6/Ac, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; e eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.
Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A8 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo todos os ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima.
Como explicado, métodos dos aspectos acima A1 a A8 são bem apropriados para detectar a presença ou ausência potencial em uma amos- tra de material derivado de eventos de planta transgênica relevantes, tais como os que foram autorizados e/ou são comumente usados. Porém, será apreciado que os ditos métodos são também vantajosamente flexíveis e, nas modalidades, permitem avaliar melhor a presença ou ausência de material derivado de outros eventos transgênicos, tais como eventos não especifica- mente citados na etapa (2) dos aspectos acima A1 a A8. Isto desse modo permite colher até mesmo mais informação acerca da composição da amos- tra.
Consequentemente, nas modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1, A2, A5, A6 ou A8 pode também compreender detec- tar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico j) "mCry3A": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais modificado Cry3A de Bacillus thuringiensis; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende evento de milho MIR604, cruzamentos do mesmo com outros eventos de milho, e eventos relacionados a MIR604.
Em outras modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1, A2, A5, A6 ou A8 pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de um ou ambos ácidos nucleicos k) "cordapA": um ácido nucleico derivado do gene de di-hidrodipicolinato sintase insensível à lisina (cDHDPS) cordapA de Corynebacterium glutamicum e/ou I) "Glb1": um ácido nucleico derivado do promotor Glbl de milho; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende evento de milho LY038, cruzamentos do mesmo com outros eventos de milho, e eventos relacionados a LY038.
Em ainda outras modalidades, a etapa (1) de qualquer um dos aspectos acima A1, A2, A5, A6 ou A8 pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico m) "Cry3Bb1": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais Cry3Bb1 de Bacillus thu- ringiensis; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende evento de milho MON88017, cruzamentos do mesmo com outros eventos de milho, e eventos relaciona- dos a MON88017.
Consequentemente, nas modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1, A2, A5, A6 ou A8 pode também compreender detec- tar a presença ou ausência na amostra de um, mais que um, ou todos ácidos nucleicos listados sob j) - m) como definidos acima; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos aspectos pode também compreender um, mais que um, ou todos os eventos de milho MIR604, LY038 e MON88017, cruzamentos dos mesmos com outros even- tos de milho, e eventos relacionados a estes. Porém, embora a detecção dos respectivos ácidos nucleicos listados sob j) - m) como definidos acima possa prover detecção melhorada da presença de material dos eventos de milho MIR604, LY038 e/ou MON88017 na amostra, a detecção dos ácidos nuclei- cos listados sob d) - i) como definidos acima já permite tirar conclusões com relação à presença potencial de material dos ditos eventos MIR604, LY038 e/ou MON88017 em uma amostra (vide também Tabela 3).
Nas modalidades, a etapa (1) de qualquer um dos aspectos a- cima A1, A3, A5, A7 ou A8 pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico n) "Bxn": um ácido nucleico deri- vado do gene de nitrilase Bxn de Klebsiella pneumoniae spp. ozaenae; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respecti- vos outros aspectos compreende evento de óleo de semente de colza OXY235, cruzamentos do mesmo com outros eventos de óleo de semente de colza, e eventos relacionados a OXY235. Porém, embora a detecção do ácido nucleico listado sob n) como definido acima possa prover detecção melhorada da presença de material do evento de óleo de semente de colza OXY235 na amostra, a detecção dos ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima já permite tirar conclusões relativas à presença poten- cial de material do dito evento OXY235 em uma amostra (vide Tabela 3).
Desse modo, em um aspecto ("A9"), a invenção oferece um mé- todo para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou de óleo de semente de colza e/ou de soja compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em:
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob a), b) e c) como definidos acima, e
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob d) - i) como definidos acima, e
- opcionalmente, um, mais que um ou todos ácidos nucleicos se- lecionados daqueles listados sob j) - n) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos sele- cionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604, LY038 e MON88Q17, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacio- nados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; e eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos.
Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A9 pode preferivelmente envolve detectar a presença ou ausência na amostra de áci- dos nucleicos que compreendem todos os ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima.
Em outras modalidades vantajosas, os métodos dos aspectos acima A1 a A8 podem desse modo adicionalmente também avaliar a pre- sença ou ausência potencial em amostras de material derivado de eventos transgênicos pertencendo a outras taxonomias.
Consequentemente, nas modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1 a A8 (ou das modalidades acima dos ditos aspectos) pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico o) "Or": um ácido nucleico derivado e específico para taxo- nomia de Oryza sativa; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende um, mais que um, ou todos os eventos de arroz LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mes- mos, e eventos relacionados a estes.
Em outras modalidades, a etapa (1) de qualquer dos aspectos acima A1 a A8 (ou das modalidades acima dos ditos aspectos) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico p) "Bv": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Beta vulgarís; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende um, mais que um, ou todos os eventos de açúcar de beterraba T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes.
Em ainda outras modalidades, a etapa (1) de qualquer dos as- pectos acima A1 a A8 (ou das modalidades acima dos ditos aspectos) tam- bém compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nu- cleico q) "Gs": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Gossypiunr, e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende um, mais que um, ou todos os eventos de algodão LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes.
Em um outro desenvolvimento, a etapa (1) de quaisquer das modalidades do parágrafo precedente pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de um ou ambos ácidos nucleicos r) "CrylAc": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais CryIAc de Bacillus thuríngiensis e/ou s) "Cry2Ab2": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais Cry2Ab2 de Bacillus thuríngiensis; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) pode particularmente melhor detectar um ou ambos eventos de algodão MON 531. MON15985; cruzamentos dos mesmos com outros eventos de algodão, e eventos relacionados a estes.
Em ainda outras modalidades, a etapa (1) de qualquer dos as- pectos acima A1 a A8 (ou das modalidades acima dos ditos aspectos) tam- bém compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nu- cleico t) "St": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de So- lanum tuberosum; e o grupo de eventos como definidos na etapa (2) de qualquer um dos respectivos outros aspectos compreende o evento de bata- ta EH92-527-1 e eventos relacionados a este.
Em um outro desenvolvimento, a etapa (1) de quaisquer das modalidades do parágrafo precedente pode também compreender detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico u) "GBSS": um ácido nucleico derivado do gene de amido sintase ligada ao grânulo Gbss de So- lanum tuberosum, melhorando também a confiança de detecção do material do dito evento EH92-527-1.
Será apreciado que os métodos precedentes podem ser execu- tados em várias combinações adequadas, permitindo detectar eventos dese- jados e reduzindo o esforço.
Desse modo, em um aspecto ("A10"), a invenção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de mate- rial derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou ó- Ieo de semente de colza e/ou soja e/ou arroz e/ou açúcar de beterraba e/ou algodão e/ou batata compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em:
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob a), b), c), o), p) q) e t) como definidos acima, e
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob d) - i) como definidos acima, e
- opcionalmente, um mais que um ou todos ácidos nucleicos se- lecionados daqueles listados sob j) - n), r) s) e u) como definidos acima, e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos sele- cionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604, LY038, MON88017, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacio- nados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cru- zamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; eventos T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mesmos, e eventos rela- cionados a estes; eventos LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; e evento EH92-527-1 e eventos relacionados a este.
Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A10 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos que compreendem todos os ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima.
Em um aspecto preferido relacionado ("A11"), a invenção ofere- ce um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou óleo de semente de colza e/ou soja e/ou arroz e/ou açúcar de beterraba e/ou algodão e/ou batata compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em:
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob a), b), c), o), p) q) e t) como definidos acima, e
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos sele- cionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, BtIO1 MON810, MON863, TCI507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604 opcionalmente, LY038 e MON88Ü17, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235 opcionalmente, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e even- tos relacionados dos mesmos; eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacio- nados dos mesmos; eventos T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mes- mos, e eventos relacionados a estes; eventos LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; e evento EH92-527-1 e eventos relacionados a este.
Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A11 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos que compreendem todos os ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima.
Preferivelmente, em quaisquer dos métodos dos aspectos acima A1 a A11 ou de qualquer modalidade dos ditos aspectos, a presença ou au- sência de ácidos nucleicos em uma amostra é detectada usando amplifica- ção de amplicons compreendida nos respectivos ácidos nucleicos, tais co- mo, preferivelmente usando PCR e, mais preferivelmente usando PCR de tempo real.
Para permitir uso eficiente de amplificação de PCR nos métodos acima, os presentes inventores meticulosamente procuraram e testaram ini- ciadores e pares de iniciadores para selecionar os particularmente vantajo- sos nos ditos métodos.
Os pares de iniciadores preferidos identificados estão listados na Tabela 1. Eles requerem interalia as vantagens significativas a seguir. Os iniciadores substancialmente exibem a mesma temperatura de anelamento ou satisfatoriamente similar, desse modo permitindo a amplificação de PCR nos ácidos nucleicos diferentes a ser executada nas mesmas condições de ciclagem de temperatura e consequentemente no mesmo aparelho. Isto faci- lita grandemente o processamento dos métodos e reduz a quantidade de trabalho, disponibilidades e aparelho necessários. Os pares de iniciadores produzem amplicons de cerca de 100 pb, e assim permitem amplificar os ácidos nucleicos alvos ainda das amostras em que o material genético está, em grande parte, fragmentado, como pode ser o caso para alimento ou ra- ção processados. Os iniciadores e pares de iniciadores mostram especifici- dade adequada de amplificação, como também sensibilidade adequada para amplificação de tempo real. Além disso, para assegurar sensibilidade e uni- formidade dos métodos e kits fornecidos pela invenção, os iniciadores e pa- res de iniciadores foram assim projetados para gerar, a 40 ciclos e usando 10000 cópias de um modelo, fluorescência de pelo menos 2500 unidades de fluorescência relativa (RFU) e em que os valores de fluorescência assim ge- rados para os conjuntos de iniciador diferentes preferivelmente ficam dentro de uma margem de 3 vezes. Além disso, cada par de iniciadores foi assim projetado para amplificar nos respectivos ácidos nucleicos de substancial- mente todos os eventos de interesse, apesar da existência de disparidades de seqüência potenciais (por exemplo, devido ao uso de códon otimizado) nos ditos ácidos nucleicos entre tais eventos. Tabela 1. Pares de iniciador vantajosos para detecção de ácidos nucleicos listados sob a) - i), o), p), q) e t) como definidos acima, por PCR.
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Consequentemente, a invenção fornece métodos como defini- dos em qualquer um dos aspectos acima A1 a A11 ou em qualquer modali- dade dos ditos aspectos, em que a presença ou ausência dos ácidos nuclei- cos dentre aqueles listados sob a) - i), o), p), q) e t) como definidos acima em uma amostra é detectada usando amplificação de PCR usando os res- pectivos pares de iniciadores como mostrados na Tabela 1.
Onde a Tabela 1 listas mais que um iniciador direto e/ou reverso para amplificação em um certo ácido nucleico (tal como, por exemplo, para "CP4-EPSPS"), qualquer um ou qualquer combinação do(s) dito(s) inicia- dor(es) direto(s) pode ser usada junto com qualquer um ou com qualquer combinação do(s) dito(s) iniciador(es) reverso(s) para obter amplificação.
Deve-se apreciar que embora as seqüências de iniciadores lis- tados na Tabela 1 tenha sido aperfeiçoada para prover amplificação ótima, os métodos presentes podem desempenhar-se adequadamente quando u- sar os iniciadores variantes que exibem um certo grau restrito de variação de seqüência vis-à-vis os iniciadores na Tabela 1 =
Consequentemente, os aspectos acima e outras modalidades abrangem métodos em que os ácidos nucleicos de interesse são detectados por amplificação de PCR usando iniciadores variantes que incluem uma ou mais das variações de seqüência vis-à-vis os iniciadores correspondentes listados na Tabela 1, tais como, por exemplo, uma ou mais deleção, inserção e/ou substituição, desde que tais iniciadores variantes/pares de iniciadores ainda possam alcançar amplificação adequada de seus respectivos ampli- cons. Preferivelmente, tais iniciadores variantes mostrariam pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, até mesmo mais preferivelmen- te pelo menos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüên- cia aos iniciadores listados na Tabela 1. Alinhamentos de seqüência e de- terminação de identidade de seqüência podem ser feitos, por exemplo, u- sando a Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) originalmente descrito por Altschul et ai 1990 (J Mol Biol 215: 403-10), tal como o algoritmo de "seqüências de Blast 2" descrito por Tatusova e Madden 1999 (FEMS Mi- crobiol Lett 174: 247-250).
Deve-se também apreciar que os iniciadores listados na Tabela 1 ou variantes dos mesmos podem ser vantajosamente derivatizados. Por exemplo, os ditos iniciadores ou variantes dos mesmos podem ser marcados para permitir a detecção dos produtos amplificados, tais como, por exemplo, em aplicações de PCR de tempo real. Consequentemente, tal derivatização pode, por exemplo, requerer introduzir uma ou mais metade de marcação e/ou uma ou mais metade auxiliar (por exemplo, uma metade de extinção, uma metade FRET etc), e opcionalmente onde requerido modificar a se- qüência de iniciador para permitir a introdução e/ou funcionamento apropria- do da dita proção ou porções. Uma pessoa versada na técnica é em geral instruída acerca dos modos para modificar os iniciadores e pares de inicia- dores para propósitos de marcação. O uso de iniciadores e pares de inicia- dores assim derivatizados pode ser particularmente útil em PCR de tempo real, e particularmente onde dois ou mais produtos de amplificação diferen- temente marcados serao seguidos nas reacoes de amplificacao multiplexa- das.
Consequentemente, os aspectos acima e outras modalidades abrangem métodos onde os ácidos nucleicos de interesse são detectados por amplificação de PCR usando derivados dos iniciadores e pares de inici- adores listados na Tabela 1 ou de variantes dos mesmos.
Por meio de um exemplo, em um aspecto preferido ("A12"), a in- venção oferece um método para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica (em particular um ou mais eventos de planta transgênica de milho e/ou óleo de semente de colza e/ou soja e/ou arroz e/ou açúcar de beterraba e/ou al- godão e/ou batata) compreendendo as etapas de:
(1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo ou consistindo em:
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob a), b), c), o), p) q) e t) como definidos acima, e
- um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados da- queles listados sob d) - i) como definidos acima; e
(2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica, tais como eventos sele- cionados do grupo compreendendo ou consistindo em: eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON8IO, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604 opcionalmente, LY038 e MON88017, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235 opcionalmente, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e even- tos relacionados dos mesmos; eventos MON 40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacio- nados dos mesmos; eventos T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mes- mos, e eventos relacionados a estes; eventos LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados a estes; e evento EH92-527-1 e eventos relacionados a este;
em que na etapa (1) a presença ou ausência de ácidos nuclei- cos em uma amostra é detectada usando amplificação de PCR usando os respectivos iniciadores e pares de iniciadores como mostrados na Tabela 1, ou variantes ou derivados dos mesmos.
Por razões esclarecidas acima, a etapa (1) do aspecto A12 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos que compreendem todos os ácidos nucleicos listados sob d) - i) como definidos acima. Em uma modalidade preferida, a etapa (1) do aspecto A12 pode preferivelmente envolver detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo pelo menos ácidos nuclei- cos listados sob a) - i) como definidos acima.
Em um aspecto, a invenção também fornece iniciadores e pares de iniciadores e variantes ou derivados dos mesmos adequados para ampli- ficação de amplicons de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima. Em particular, em vista do esforço signi- ficativo investido pelos presentes inventores para a identificação dos pares de iniciadores listados na Tabela 1, a invenção fornece os iniciadores e pa- res de iniciadores listados na Tabela 1, como também variantes e derivados dos mesmos, opcionalmente em qualquer combinação adequada dos ditos iniciadores e/ou pares de iniciadores ou variantes ou derivados dos mesmos.
Adicionalmente, a invenção também fornece produtos de ampli- ficação obteníveis usando os iniciadores preferidos e pares de iniciadores, vetores e plasmídeos compreendendo os ditos produtos de amplificação, e micro-organismos recombinantes transformados e abrigados pelos ditos ve- tores e plasmídeos.
Por conseguinte, nas modalidades preferidas, a invenção tam- bém refere-se a E. coli recombinante como depositado sob o Tratado de Bu- dapeste com a Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM), Laboratorium voor Moleculaire Biologie - Plasmidencollectie (BCCM/LMBP) (Universiteit Gent, Technologiepark 927, B-9052 Gent-Zwijnaarde, Bélgica) em 10 de janeiro de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5452, LMBP 5453, LMBP 5454, LMBP 5455, LMBP 5456, LMBP 5457, LMBP 5458, LMBP 5459 e LMBP 5460, em 6 de março de 2007 sob o número de acesso de LMBP LMBP 5451, e em 19 de abril de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5587, LMBP 5588, LMBP 5589 e LMBP 5590, como também a plasmídeos recombinantes isolados obteníveis do dito E. coli re- combinante, como também a inserções isoladas dos ditos plasmídeos, prefe- rivelmente inserções de EcoRI-EcoRI isoladas dos mesmos.
Tais plasmídeos ou vetores ou inserções dos mesmos, e suas combinações, são particularmente úteis como controles positivos, referên- cias e/ou calibradores para os respectivos amplicons nas reações de amplifi- cação dos métodos acima.
Além disso, a invenção também abrange kits compreendendo um ou mais reagentes úteis nos métodos de um ou mais dos aspectos e modalidades acima. Por exemplo, tais kits podem compreender um ou mais dos iniciadores e/ou pares de iniciadores acima, particularmente como lista- dos na Tabela 1, ou variantes ou derivados dos ditos iniciadores, e/ou um ou mais dos produtos de amplificação, vetores ou plasmídeos acima compreen- dendo tais, ou inserções dos ditos vetores ou plasmídeos, e/ou um portador de dados compreendendo instruções para um dispositivo de computação programável para realizar a etapa (2) dos métodos da invenção (vide abai- xo). Tais kits podem também convenientemente conter instruções para o usuário executar os métodos da invenção e interpretar os dados assim obti- dos.
A invenção também ensina um modo descomplicado e direto pa- ra executar a etapa (2) dos aspectos e modalidades acima, isto é, concluir a presença ou ausência potencial na amostra de material derivado dos vários eventos de planta transgênica de interesse. Em particular, os resultados ad- quiridos para uma amostra na etapa (1) dos aspectos e modalidades acima são representadas como um conjunto "Gsam" consistindo em, isto é, repre- sentando uma coletânea de, aqueles ácidos nucleicos selecionados dos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima que fo- ram detectados na dita etapa (1) como estando presente na amostra (etapa (i)).
Além disso, qualquer evento de planta transgênica de interesse pode ser representado como um conjunto "Gx" (onde X designa o evento de interesse), consistindo em, isto é, representando uma coletânea de, aqueles ácidos nucleicos selecionados dos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima que são encontrados no dito evento e desse modo seriam detectados na etapa (1) se a amostra contivesse o material derivado do dito evento, ou um cruzamento envolvendo tal, ou um evento relacionado (etapa (ii)).
Em modalidades exemplares particulares, o conjunto Gx pode ser preferivelmente selecionado de conjuntos que especificamente represen- tam os eventos citados acima, por exemplo, conjuntos compreendendo: con- juntos de evento de milho Getue e {Zm; p35S; CryIAb; PAT/bar}, GBtn e {Zm; p35S; tNOS; CryIAb; PAT/pat}, Gbho e {Zm; p35S; tNOS; CryIAb; PAT/pat}, Gmonsio £ {Zm; p35S; tNOS; CrylAb}, Gmon863 e {Zm; p35S; tNOS}, Gjc1507 e {Zm; p35S; PAT/pat}, Gnk60S e {Zm; p35S; tNOS; CP4- EPSPS}, Gt25 € {Zm; p35S; PAT/pat}, Gga2i e {Zm; tNOS}, GDAS-59122 e {Zm; p35S; PAT/bar}, Gmir604 e {Zm; tNOS; mCry3A}, Glyoss e {Zm; p35S; tNOS; cordapA; Glb1}, e Gmonssoi? e {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS; Cry3Bb1}, conjuntos de evento de óleo de semente de colza GTopas 19/2 e {Bn; p35S; PAT/pat}, Gmsi e {Bn; tNOS; PAT/bar}, GRF1 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, Grf2 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, GMSi/rfi e {Bn; tNOS; PAT/bar}, GMSi/rf2 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, Gms8 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, Grf3 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, Gmss/rfs e {Bn; tNOS; PAT/bar}, Ggt73 e {Bn; CP4-EPSPS}, Gt45 e {Bn; p35S; PAT/pat}, GLiberator PHoe6/Ac e {Bn; p35S; PAT/pat}, GGs40/90PHoe6/Ac e {Bn; p35S; PAT/pat}, Goxy235 e {Bn; p35S; Bxn}; conjuntos de evento de soja GMon4o-3-2 e {Gm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, GMon89788 e {Gm; CP4-EPSPS}, GA2704-12 e {Gm; p35S; PAT/pat}, e GA5547-127 e {Gm; p35S; PAT/pat}, conjunto de e- vento de arroz Gll62 e {Or; p35S; PAT/bar}, Gll06 e {Or; p35S; PAT/bar} e GLL60i e {Or; p35S; tNOS; PAT/bar}, conjunto de evento de açúcar de beter- raba G-i-120-7 e {Bv; p35S; PAT/pat}, GH7-1 e {Bv; p35S; CP4-EPSPS}, e GA5-15 e {Bv; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, conjunto de evento de algodão GLLcotton25 s IQs- p35S· tNOS: PAT/barV Gun»^» ρ íGs: d35S: tNOS: CP4-EPSPSV E {Gs; p35S; tNOS; PAT/bar}, GMON1445 E {Gs; p35S; tNOS; CP4-EPSPS} GMon53i e {Gs; p35S; tNOS; crylAc} e GMoni5985 e {Gs; p35S; tNOS; crylAc; cry2Ab2}, e conjunto de evento de batata GEh92-527-i e {St; tNOS; Gbss}; em que as designações entre chaves {} referem-se àqueles ácidos nucleicos como listados sob a) - u) acima que são encontrados em tais eventos e po- dem ser desse modo detectados nos materiais derivados dos mesmos. Será entendido que se a etapa de detecção (1) envolver ácidos nucleicos adicio- nais diferentes daqueles listados sob a) - u) acima, tais ácidos nucleicos po- dem ser vantajosamente inclusos nos conjuntos acima.
Será entendido que onde os métodos acima não testam a pre- sença de todos os ácidos nucleicos sob a) - u) acima, os conjuntos de amos- tra como também os conjuntos de evento podem ser definidos em termos daqueles ácidos nucleicos a presença destes é eficazmente testada. Por meio de exemplo e não-limitação, onde a presença dos ácidos nucleicos lis- tados sob j) - n), r) s) e u) como definidos acima, que correspondem aos tra- ços específicos além daqueles definidos sob d) - i), não for testada, então os conjuntos que correspondem aos vários eventos podem ser definidos de uma maneira mais estreita, em particular: conjuntos de evento de milho Gmir6O4 e {Zm; tNOS}, Gly038 e {Zm; p35S; tNOS}, GMon88oi7 e {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}; conjuntos de evento de óleo de semente de colza G0XY235 e {Bn; p35S}; conjuntos de evento de algodão GMons3i e {Gs; p35S; tNOS}, Gmon 15985 e {Gs; p35S; tNOS}; e conjuntos de evento de batata Geh92-527-i e {St; tNOS}.
Consequentemente, a presença de material derivado de um e- vento X de interesse na amostra pode ser depois determinada executando o respectivo conjunto de operações lógicas de interesse Gx como segue (iii da etapa):
- se Gx for igual a Gsam (Gx = Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica x, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;
- se Gx for um subconjunto apropriado de Gsam (Gx c= (Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cru- zamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este. está potencialmen- te presente na amostra;
- se Gx não for igual a Gsam β Gx não for um subconjunto apro- priado de Gsam, (Gx * Gsam e Gx cζ Gsam), então o material derivado do e- vento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
Em modalidades preferidas, estas operações lógicas podem ser vantajosamente realizadas por um dispositivo de computação.
Será apreciado que embora o algoritmo acima para uso na eta- pa (2) dos métodos presentes seja aqui explicado com relação a concluir a presença de material de certos eventos usando detecção de ácidos nuclei- cos particulares, o dito algoritmo é em princípio facilmente aplicável a méto- dos que visam concluir a presença de qualquer evento, tal como eventos diferente ou adicionais àqueles especificamente mencionados acima, usan- do detecção de qualquer ácido nucleico, tal como ácidos nucleicos diferentes ou adicionais àqueles listados sob a) - u) acima.
Estes e outros aspectos e modalidades preferidas da invenção são descritos nas seções a seguir e nas reivindicações em anexo. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 (A-F) ilustra seqüências de amplicons amplificados se- lecionados usando os conjuntos de iniciadores listados na Tabela 4 e pre- sentes nos vetores de clonagem, particularmente em pUC18, tais como os plasmídeos listados na Tabela 5. Como pode ser apreciado, as seqüências podem incluir seqüências parciais de sítios de clonagem múltiplos flanque- ando os amplicons inseridos.
Figura 2 (A) resulta do teste de PCR de multiplexação para p35S/tNOS, (B) Curva de dissociação do teste de multiplexação específico para p35S/tNOS.
Figura 3 fornece representação gráfica dos dados usando có- pias de modelo +/- 8300 como listadas na Tabela 8.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Como aqui usado, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" in- cluem referentes singulares e plurais a menos que o contexto claramente declare do contrário.
Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendido de", como aqui usado, são sinônimos com "incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém", e são inclusivos ou ilimitados e não excluem membros, elementos ou etapas de método não-citados adicionais.
O termo "cerca de", como aqui usado, quando referir-se a um valor mensurável tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal, e similares, é significado abranger variações de +/-20% ou menos, preferivelmente +/-10% ou menos, mais preferivelmente +/-5% ou menos, até mesmo mais preferivelmente +/-1% ou menos, e ainda mais preferivel- mente +/-0,1% ou menos de e a partir do valor especificado, desde que tais variações sejam apropriadas para executarem-se na invenção descrita. É para ser entendido que o valor ao qual o modificador "cerca de" refere-se é também especificamente, e de preferência, descrito.
A citação de faixas numéricas através de pontos finais inclui to- dos os números e frações subsomadas dentro daquela faixa, como também os pontos finais citados.
Todos os documentos citados no presente relatório descritivo são por este meio incorporados por referência em sua totalidade. Em parti- cular, os ensinamentos de todos os documentos aqui especificamente referi- dos são incorporados por referência.
Consequentemente, em alguns aspectos, mais particularmente aspectos A1 - A12 como descritos na seção Sumário, a invenção diz respei- to aos métodos para examinar uma amostra para a presença ou ausência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica compreen- dendo as etapas de (1) detectar a presença ou ausência na amostra de áci- dos nucleicos compreendendo ou consistindo em um, mais que um ou tudo (a escolha particular dependendo da meta de um ensaio dado) de ácidos nucleicos listados sob a) - u) na seção Sumário, e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em al- auns ou todos daòueles detalhados na seção Sumário.
Um "evento de planta transgênica" ocorre com uma transforma- ção independente das células da planta com ácido nucleico heterólogo, tipi- camente uma construção de ácido nucleico compreendendo um ou mais transgenes de interesse; regeneração de uma população de plantas resul- tantes de uma inserção da construção ou uma parte da mesma incluindo o(s) dito(s) transgene(s) de interesse no genoma das plantas; e seleção de uma planta particular caracterizada pela dita inserção em uma ou mais, pre- ferivelmente uma, localização de genoma particular. O termo "evento de planta transgênica" desse modo abrange a planta transformante assim sele- cionada original, como também qualquer progênie sucessiva da mesma compreendendo o ácido nucleico inserido incluindo o(s) transgene(s) de inte- resse; por exemplo, a dita progênie pode ser hemizigota ou homozigota para a dita inserção; a dita progênie pode ser obtida, por exemplo, através de propagação vegetativa ou através de cruzamento sexual.
O termo "planta", como aqui usado, em geral abrange células da planta; protoplastos da planta; tecidos da planta; células da planta ou cultura de tecido da qual um organismo de planta pode ser regenerado; caules ou aglomerações da planta; organismos da planta e partes da mesma, tal como, sem limitação, flores, tépalas, pétalas, sépalas, anteras, pólen, sementes, fruta, pericarpo, vagens, folhas, petíolos, talos, raízes, rizomas, estolhos, tubérculos, brotos, e similares. O termo como aqui usado em geral abrange plantas de quaisquer taxonomias classificadas na técnica dentro do reino Plantae. Além disso, planta como entendido aqui pode preferivelmente per- tencer às plantas terrestres (embriófitos) incluindo, sem limitação, plantas não-vasculares (briófitos) e plantas vasculares (traqueófitos); mais preferi- velmente, às plantas vasculares (traqueófitos) incluindo, sem limitação, Iico- podiófita, equisetófita, pteridófita, psilotófita, ofioglossófita, e plantas de se- mente (espermatófitos); até mesmo mais preferivelmente às plantas de se- mente (espermatófitos) incluindo, sem limitação, plantas portando sementes (gimnospermas) tais como, por exemplo, pinófita, cicadófita, ginkgófita e gnetófita e plantas florescentes (angiospermas) tais como magnoliófita, inclu- indo monocotiledônea (LiIiopsida) e dicotiledônea (Magnoliopsida). Plantas preferidas podem ser as comumente aplicadas em agricultura ou horticultu- ra. Por meio de exemplo e não-limitação, piantas de plantação preferidas podem incluir milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, tabaco, tomate, batata, óleo de semente de colza (semente colza), soja, açúcar de beterraba, ervilha, girassol, algodão, amendoim, flores (por exemplo, cravo) etc.
O termo "material" em geral refere-se à substância física. O ter- mo "material derivado de um evento de planta transgênica" abrange o even- to de planta transgênica como tal, incluindo, por meio de exemplo e não- limitação, o organismo do evento de planta transgênica; qualquer parte do organismo do evento de planta transgênica, tal como, por exemplo, flores, tépalas, pétalas, sépalas, anteras, pólen, sementes, frutas, pericarpo, va- gens, folhas, petíolos, talos, raízes, rizomas, estolhos, tubérculos ou brotos, ou porções dos mesmos; células, protoplastos, tecidos, caules ou aglomera- ções do evento de planta transgênica; ou material obtido submetendo qual- quer do acima a uma ou mais etapas de processamento a jusante. Estas etapas de processamento a jusante podem compreender qualquer ação u- sada para processar os materiais de planta particulares em agricultura, horti- cultura ou em quaisquer indústrias a jusante, por exemplo, indústria alimen- tícia incluindo indústria de bebida, indústria de ração, indústria têxtil (por e- xemplo, algodão, linho, bambu etc), indústria de combustível (por exemplo, óleo de semente de colza), indústria de lubrificante (por exemplo, óleo de rícino), indústria de tinta (por exemplo, óleo de linhaça, óleo de tung), indús- tria de cosméticos e farmacêutica etc.
Por meio de exemplo e não-limitação, tal processamento a ju- sante pode incluir colheita; remoção das camadas externas indesejadas, por exemplo, descascamento, retirada da pele etc; secagem, por exemplo, se- cagem ao ar, secagem ao sol, secagem por pulverização, secagem por con- gelação, concentração de suco etc; diminuição, por exemplo, moagem, tritu- ração, corte, fatiamento etc; liquefação, por exemplo, coleta de suco; preser- vação, por exemplo, engarrafamento a vácuo, estanhagem, enlatamento, pasteurização, adição de conservantes etc; pressão, por exemplo, coleta de
óleo; hidrogenacao, por exemplo, saturacao do oleo vegetal; maceracao; emulsificação; tratamento térmico, por exemplo, cozimento, cozimento por pressão, cozimento a vapor, assadura em forno, defumação, fritura, grelhar etc; fermentação, por exemplo, através de levedura, bactérias e/ou fungos; congelação; e similares.
O termo "amostra", como aqui usado, refere-se amplamente a uma parte representativa ou fração de um material maior todo sendo apre- sentado para inspeção, tal como, por exemplo, para controle de qualidade. Preferivelmente, uma amostra a ser examinada pelos métodos da invenção pode ser suspeita de potencialmente compreender material derivado de um ou mais eventos transgênicos de interesse. Por meio de exemplo, tal suspei- ta pode existir para qualquer amostra representativa de material que é co- nhecido como compreendendo, ou suspeito de provável ou possivelmente compreender, plantas ou partes das mesmas ou material derivado delas. Em um exemplo preferido, a amostra pode ser representativa de material que é conhecido como compreendendo, ou suspeito de provável ou possivelmente compreender, plantas ou partes das mesmas ou material derivado delas, em que as ditas plantas ou partes das mesmas pertencem à mesma taxonomia como um evento transgênico de interesse cuja presença na amostra é para ser examinada. Por exemplo, uma amostra pode ser representativa de plan- tas ou partes das mesmas, por exemplo, plantas colhidas ou ceifadas ou partes das mesmas (tais como, sem limitação, frutas, sementes, vagens, flores etc), ou representativa de um material intermediário ou final obtido a- plicando um ou mais etapas de processamento a jusante a este, ou de pro- dutos compreendendo tal material, por exemplo, de produtos processados de alimento ou ração.
Consequentemente, em uma modalidade a amostra pode com- preender plantas ou partes das mesmas, incluindo flores, tépalas, pétalas, sépalas, anteras, pólen, sementes, frutas, pericarpo, vagens, folhas, petío- los, talos, raízes, rizomas, estolhos, tubérculos ou brotos, ou porções das mesmas, células da planta, protoplastos da planta e/ou tecidos da planta, e/ou material derivado da planta, preferivelmente material de alimento ou ração, incluindo material processado de alimento ou ração.
Os métodos da invenção detectam a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos, isto é, de material genético e preferivelmente DNA genômico, originando ou derivado dos eventos de planta transgênica de interesse. A presença ou ausência de tais ácidos nucleicos são indicati- vas, respectivamente, da presença ou ausência na amostra deste material e potencialmente outro derivado dos respectivos eventos de planta transgêni- ca; tal como, por exemplo, materiais copurificadores ou cosseparadores com os ditos ácidos nucleicos durante as várias etapas de processamento aplica- das aos eventos de planta transgênica.
É conhecido que os ácidos nucleicos, e particularmente DNA genômico, são comparavelmente duráveis e podem tolerar uma variedade de etapas de processamento aplicadas aos materiais de planta na agricultu- ra e indústria, por exemplo, em indústria de alimentos ou ração, de modo que as moléculas de DNA de comprimentos que permitem detecção se- quência-específica dos mesmos podem ser encontradas seguindo tais eta- pas e até mesmo nos produtos finais.
Consequentemente, uma amostra preferida da invenção com- preende ácidos nucleicos, mais preferivelmente DNA genômico, até mesmo mais preferivelmente DNA genômico tendo pelo menos tamanhos que permi- tem detecção específica para seqüência do mesmo, tal como, por exemplo, em média, pelo menos cerca de 20 pb, por exemplo, pelo menos cerca de 30 pb, preferivelmente pelo menos cerca de 50 pb, por exemplo, pelo menos cerca de 75 pb, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 pb, por e- xemplo cerca de 150 pb, ou até mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 200 pb, ou pelo menos cerca de 300 pb, ou pelo menos cerca de 500 pb, ou pelo menos cerca de 1 kb, ou mais.
Embora possa ser assumido que a maioria das etapas de pro- cessamento às quais um evento de planta transgênica seria comumente ex- posto na prática manteriam os ácidos nucleicos detectáveis como acima no produto eventual, e desse modo na amostra dos mesmos a ser examinada, os inventores também tencionam um controle positivo visado para verificar se a dita amostra compreende os ácidos nucleicos detectáveis derivados de planta.
Em particular, o método da invenção pode também compreen- der detectar a presença ou ausência na amostra de um ácido nucleico deri- vado de planta genérica. Em uma modalidade preferida, tal ácido nucleico derivado de planta genérica é derivado de um gene presente e preferivel- mente altamente conservado (por exemplo, > 80%, preferivelmente > 90%, mais preferivelmente > 95%, até mesmo mais preferivelmente > 96%, > 97%, > 98% ou > 99% de identidade de seqüência) entre várias taxonomias de planta; preferivelmente pelo menos dentro dos espermatófitos; ou pelo me- nos dentro dos angiospermas, tais como entre e/ou dentro da monocotiledô- nea e dicotiledônea; ou preferivelmente pelo menos entre taxonomias de planta comumente usadas na agricultura e indústria, tal como, sem limitação, entre milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, tabaco, tomate, batata, óleo de se- mente de colza (colza), soja, açúcar de beterraba, ervilha, girassol, algodão, amendoim e flores (por exemplo, cravo); ou preferivelmente pelo menos en- tre as taxonomias de planta compreendendo ou consistindo naqueles even- tos em planta transgênica testados na amostra.
Em modalidades preferidas, o dito ácido nucleico derivado de planta genérica é derivado da subunidade pequena cloroplástica de gene Rubisco ou do gene CHL-tRNA sintetase.
Como mencionado, os métodos da invenção incluem na etapa (1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos com- preendendo ou consistindo em um, mais que um ou todos daqueles listados sob a) - u) na seção Sumário. O termo "detectar" ou "detecção", como aqui usado, abrange quaisquer meios de determinar a presença ou ausência de um ácido nucleico dado na amostra.
Preferivelmente, a presença de uma molécula de ácido nucleico particular em uma amostra pode ser detectada usando um ou mais reagen- tes especificamente hibridando com a(s) respectiva(s) sequência(s) de nu- cleotídeo compreendida(s) dentro da dita molécula de ácido nucleico.
Os termos "hibridação" e "hibridar com" referem-se a um pro- cesso pelo qual um filamento de ácido nucleico anela-se com ais) seauên- cia(s) complementar(es) ou substancialmente complementar(es) compreen- dida(s) no mesmo filamento de polinucleotídeo ou outro através pareamento de base, preferivelmente pareamento de base de Watson-Crick.
Os termos "complementar" e "complementaridade" referem-se à ligação normal dos polinucleotídeos sob condições salinas permissivas (re- sistência iônica) e de temperatura através de pareamento de base, preferi- velmente pareamento de base de Watson-Crick. Por meio de exemplo, pa- reamento de base de Watson-Crick complementar ocorre entre as bases A e T, A e U ou G e C. Por exemplo, a seqüência A-G-T (isto é, 5'-A-G-T-3') é desse modo seqüência complementar A-C-T (isto é, 5'-A-C-T-3').
O "grau de complementaridade" de um filamento de ácido nucle- ico (A) para um filamento de ácido nucleico (B) pode ser expressado como a proporção (porcentagem) dos nucleotídeos do filamento de ácido nucleico (A) que seriam esperados parear, isto é, formar pareamento de base de Watson-Crick, com nucleotídeos do filamento de ácido nucleico (B), quando os ditos filamentos de ácido nucleico (A) e (B) forem anelados, preferivel- mente em condições de severidade alta.
"Complementar", como aqui usado, desse modo refere-se a completamente complementar, de modo que todos respectivos nucleotídeos dos filamentos de ácido nucleico se ligariam quando os filamentos anelas- sem. Por meio de exemplo, um filamento de ácido nucleico relativamente mais curto mostraria complementaridade total para um filamento de ácido nucleico relativamente mais longo, se o filamento posterior compreendesse uma seqüência completamente complementar à seqüência do filamento an- terior. "Substancialmente complementar" refere-se a em grande parte mas não completamente complementar, em particular, para pelo menos 85% complementar, por exemplo, pelo menos 90% complementar, preferivelmen- te pelo menos 95% complementar, por exemplo, pelo menos 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% complementar.
"Especificamente híbrida com" e "hibridação específica" reflete uma situação quando um reagente híbrida com a uma seqüência dada mais facilmente que hibridaria com uma seqüência não-relacionada aleatória. Pcr exemplo, um reagente especificamente hibridando com uma seqüência de nucleotídeo dada (A) preferivelmente exibe pouca ou nenhuma hibridação com outros polinucleotídeos, e preferivelmente com homólogos ou ortólogos da seqüência de ácidos nucleicos (A), sob condições onde especificamente hibridaria com o dito polinucleotídeo (A).
Preferivelmente, reagentes que podem especificamente hibridar com a(s) respectiva(s) sequência(s) de nucleotídeo compreendida(s) dentro das moléculas de ácido nucleico listadas sob a) - u) acima podem ser son- das ou iniciadores.
Uma "sonda" é um ácido nucleico isolado ao qual é desejavel- mente ligado uma marcação detectável ou porção repórter, por exemplo, um isótopo radioativo (por exemplo, 32P, 33P), ligante, agente quimiluminescente, fluoroforo (por exemplo, fluoresceína, tetracloro-fluoresceína, TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Texas Red etc), vitamina (por exemplo, biotina), esteróide (por exemplo, digoxina), enzima (por exemplo, HRP1 AP etc) etc. Uma tal sonda é complementar ou substancialmente complementar a uma seqüência compreendida em um filamento de um ácido nucleico-alvo, no caso da presente invenção, de um ácido nucleico, preferivelmente DNA ge- nômico, listado sob a) - u) acima. Sondas de acordo com a presente inven- ção podem ser ácidos desoxirribonucleicos, ácidos ribonucleicos, ou ácidos nucleicos compreendendo tanto deoxirribo como ribonucleotídeo; podem compreender bases-padrão de purina e/ou pirimidina (A, G1 T1 C, U e/ou I), mas também outras bases de nucleotídeo naturais, química ou bioquimica- mente modificadas (por exemplo, metiladas), não-naturais, ou derivatizadas; podem incluir cadeia principal compreendendo açúcares e grupos fosfato, como podem tipicamente ser encontrados no RNA ou DNA, como também um ou mais açúcares modificados ou substituídos (tais como, 2'-0-alquilado, por exemplo, 2'-0-metilado ou 2-0-etilado; ou 2'-0,4'-C-alquinelado, por e- xemplo, 2'-0,4'-C-etilado) ou um ou mais grupos fosfato modificados ou substituídos - por exemplo, análogos de cadeia principal nos ácidos nuclei- cos podem incluir fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster de alauila. Sulfamatoj 3'-tioaceta!, metüeno (meti- limino), 3-N-carbamato, carbamato de morfolino, e ácidos nucleicos de pep- tídeo (PNAs).
Sondas podem ser pelo menos 10 nucleotídeos em comprimen- to, por exemplo, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo me- nos 14 nucleotídeos em comprimento, preferivelmente pelo menos 15 nucle- otídeos, por exemplo, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18 ou pelo menos 19 nucleotídeos em comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, ou pelo menos 24 nucleotídeos em comprimento, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 25 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100 ou pelo menos 200 ou mais nucleotídeos em comprimento.
"Iniciadores" são ácidos nucleicos isolados, preferivelmente áci- dos desoxirribonucleicos ou, em outros exemplos preferidos, ácidos ribonu- cleicos ou PNAS, complementares ou substancialmente complementares a uma seqüência compreendida em um ácido nucleico-alvo (no caso da pre- sente invenção, para uma seqüência compreendida em um ácido nucleico, preferivelmente DNA genômico, compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima), que podem ser anelados ao dito ácido nucleico- alvo e podem agir como um ponto de iniciação da síntese de um produto de extensão de iniciador na presença dos nucleotídeos e um agente para poli- merização de ácido nucleico, tal como polimerase DNA-dependente ou RNA- dependente.
Um iniciador necessita ser suficientemente longo para preparar a síntese de uns produtos de extensão na presença de um agente para po- limerização. Um iniciador típico pode ser desse modo pelo menos 10 nucleo- tídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13 ou pelo menos 14 nucleotídeos em comprimento, preferivelmente pelo menos 15 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18 ou pelo menos 19 nucleotídeos em compri- mento, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos em comprimento. Outros iniciadores preferidos são entre cerca de 10 e cerca de 40 nucleotí- deos em comprimento, mais preferivelmente entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, o mais preferivelmente entre cerca de 20 e cerca de 25 nucleotídeos muito tempo.
"Pares de iniciador" referem-se às combinações de iniciadores que são adequadas para amplificação de amplicons de dentro dos ácidos nucleicos alvos (no caso da presente invenção, de dentro dos ácidos nuclei- cos, preferivelmente DNA genômico, compreendendo ou consistindo naque- les listados sob a) - u) acima) através dos métodos de amplificação de ácido nucleico adequados. Consequentemente, a habilidade para amplificar um amplicon de dentro de um ácido nucleico-alvo dado usando um par de inici- adores projetado para especificamente hibridar dentro do dito ácido nucleico- alvo indica a presença (e quantidade opcionalmente) do dito ácido nucleico- alvo na amostra.
Métodos exemplares mas não-limitativos para preparar e usar sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook el al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 ("Sambrook et al. 1989"); Current Protocols in Molecular Biology1 ed. Ausubel et al., Greene Publishing e Wiley-I nterscience, Nova Iorque, 1992 (com atualizações periódicas) ("Au- subel et ai. 1992"); e Innis et ai, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego1 1990. Pares de iniciador de PCR podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, usando programas de computação intencionados para aquele propósito tal como Iniciador 3 (Rozen e Skaletsky. 2000. Iniciador 3 na WWW para usuários gerais e para programadores biólogos. Em: Krawetz S, Misener S (eds) Bio- informatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ1 páginas 365-386) ou o pacote GCG® v. 11.1.2 de Accel- rys.
Hibridização específica das sondas, iniciadores ou pares de ini- ciadores da invenção para suas respectivas seqüências complementares dentro dos ácidos nucleicos alvos, por exemplo, aqueles compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima, pode ser preferivelmente alcançada sob condições de hibridação de severidade alta.
Condições de "severidade alta" incluem condições equivalentes às condições exemplares a seguir para ligar ou hibridar a 65°C em uma so- lução que consiste em 5 χ SSPE (43,8 g/l NaCI, 6,9 g/l NaH2PO4-H2O e 1,85 g/l EDTA, pH ajustado em 7,4 com NaOH), 0,1% SDS, 5 χ reagente de De- nhardfs (50 χ Denhardt1S contêm por 500 ml: 5 g Ficoll (Tipo 400, Pharmaci- a), 5 g BSA (Fração V; Sigma) e 100 pg/ml DNA de esperma de salmão desnaturado), seguido lavando em uma solução compreendendo 5 χ SSPE, 0,1% SDS a 65°C quando uma sonda de cerca de 500 nucleotídeos em comprimento for empregada. Outras condições exemplares para hibridação em "severidade alta" para as seqüências de ácido nucleico em aproximada- mente 20 a 100 nucleotídeos em comprimento, preferivelmente aproxima- damente 30 a 100 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, entre 30 a 50 nucleotídeos em comprimento, incluem condições equivalentes à hibridação em 6 χ SSC a 45°C, seguido por um ou mais lavagens em 0,2 χ SSC, 0,1% SDS ou mesmo 0,1 χ SSC, 0,1% SDS a 65°C. Numerosas condições equi- valentes podem ser empregadas para variar as condições de severidade; fatores tais como o comprimento e natureza (DNA, RNA, composição de ba- se) da sonda e natureza do alvo (DNA, RNA, composição de base, presen- tes na solução ou imobilizados etc) e a concentração dos sais e outros com- ponentes (por exemplo, a presença ou ausência de formamida, sulfato de dextrana, polietileno glicol) são considerados e a solução de hibridação pode ser variada para gerar condições de hibridação de severidade baixa ou alta diferentes mas equivalentes às condições acima listadas. Além disso, a téc- nica sabe as condições que promovem hibridação sob condições de severi- dade alta (por exemplo, aumentando a temperatura das etapas de hibrida- ção e/ou lavagem, o uso de formamida na solução de hibridação etc.). Orien- tação para executar reações de hibridação pode ser encontrada, por exem- plo, em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 6.3.1-6.3.6, 1989, e edições atualizadas mais recentes, todos destas são incorporadas por referência.
Com relação à amplificação de amplicons de dentro dos ácidos nucleicos alvos usando pares de iniciadores, "condições rigorosas" ou "con- dições de severidade alta" são condições que permitem um par de iniciado- res hibridar com apenas sua respectiva seqüência de ácido nucleico-alvo e produzir um único produto de amplificação, isto é, o amplicon, substancial- mente sem produzir produtos de amplificação não-intencionados, isto é, não- específicos. Por exemplo, preferivelmente menos que 20%, mais preferivel- mente menos que 10%, até mesmo mais preferivelmente menos que 5%, por exemplo, menos que 4%, menos que 3%, ou menos que 2%, ainda mais preferivelmente menos que 1%, por exemplo, menos que 0,1% ou menos que 0,01% da quantidade total (por exemplo, peso) do produto de amplifica- ção em uma reação de amplificação seria não-específico quando tal reação for executada em condições rigorosas (por exemplo, como analisada por eletroforese em gel quantitativa, ou por determinação da Tm, ou similares).
Qualquer método convencional pode ser usado para detectar hi- bridação específica de uma sonda com um ácido nucleico-alvo na amostra. Por exemplo, ácidos nucleicos, preferivelmente DNA, de uma amostra pode ser imobilizado e desnaturado em um suporte sólido e assim hibridado com as respectivas sondas (por exemplo, "southern blotting", "slot blotting", "dot blotting" etc.). Se uma sonda - e por conseguinte sua marcação detectável - for retida no suporte sólido, isto indica que o alvo nucleico para o qual a son- da é específica está presente na amostra.
Similarmente, qualquer método de amplificação de ácido nuclei- co existente pode ser usado para amplificar amplicons de dentro das se- quências-alvo de interesse, assim indicando a presença das sequências-alvo correspondentes na amostra: incluindo mas não-limitados à reação em ca- deia de polimerase (PCR) (US 4.683.202; US 4.965.188), amplificação de deslocamento de filamento (SDA) (US 5.455.166; EP 0684315), LCR, TAS, 3SR, NASBA (US 5.409.818; EP 0329822), RCA e amplificação Q-beta.
Em uma modalidade particularmente preferida, os métodos da invenção empregam reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar os amplicons de dentro dos ácidos nucleicos alvos selecionados compreen- dendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima. Os termos "reação em cadeia da polimerase" e "PCR" amplamente abrangem qualquer método referido como tal na técnica e em particular métodos para amplificação de seqüências de ácido nucleico-alvo, especialmente seqüências de DNA-alvo, usando polimerase(s) de DNA estável(is) ao calor e dois iniciadores, especi- almente iniciadores de oligonucleotídeo, um complementar ao (+)-filamento em uma extremidade da seqüência a ser amplificada e o outro complemen- tar ao (-)-filamento na outra extremidade. O termo abrange modificações da PCR prototípica, tal como, por exemplo, PCR de alta fidelidade, PCR "hot- start", PCR "touch-down", PCR "nested", PCR do tipo multiplex, PCR quanti- tativa, PCR quantitativa de tempo real, PCR "long-range", RT-PCR etc. (Vi- de, por exemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990).
Produtos de amplificação obtidos usando os métodos de amplifi- cação acima, e em particular usando PCR, podem ser avaliados, por exem- plo, para sua presença ou ausência, para sua especificidade e/ou quantida- de, por quaisquer dos modos comuns na técnica. Por exemplo, o tamanho (como uma indicação de especificidade de amplificação) e/ou quantidade de um produto de amplificação podem ser avaliados usando eletroforese em gel, tal como, por exemplo, eletroforese em gel de agarose ou de poliacrila- mida, onde os produtos de amplificação são visualizados usando tinturas de ligação de DNA adequadas, tais como, por exemplo, brometo de etídio.
Alternativamente, os produtos de amplificação podem ser avali- ados por métodos que empregam hibridação de sondas com seqüências específicas dentro dos produtos de amplificação. Por exemplo, um produto de amplificação pode ser imobilizado e desnaturado em um suporte sólido e subseqüentemente hibridado com uma sonda marcada.
Do contrário, o produto de amplificação pode ser marcado, por exemplo, incluindo uma marcação detectável (por exemplo, um fluoroforo) em um ou ambos iniciadores e/ou em virtude dos nucleotídeos de substrato incorporados no produto de amplificação durante a amplificação, e o produto de PCR assim obtido pode ser subseqüentemente desnaturado e hibridado com sondas específicas (oligonucleotídeo) prendidas a um suporte sólido. A presença e quantidade da marcação detectável nas posições seletas no su- porte sólido desse modo indicam a especificidade e quantidade, respectiva- mente, do produto de amplificação. Por exemplo, tal configuração é adequa- da para o uso com arranjos de sonda, por exemplo, microarranjos.
Em outros modos exemplares, produtos de amplificação podem ser avaliados usando clonagem e sequenciação; sequenciação direta; piros- sequenciação mediada por oligonucleotídeo (Ahmadian et al. 2000. Anal Bi- ochem 280: 103-110); cromatografia, por exemplo, DHPLC, ensaios de liga- ção de oligonucleotídeo (Landegren et al. 1988. Science 241: 1077; Egger- ding et al. 1995. Hum Mutat 5: 153-165; Nickerson et al. 1990. PNAS 87: 8923-8927); Ensaio de Proteção de RNAse; etc.
Uma maneira particularmente vantajosa de avaliar o produto de amplificação é amplificação de tempo real, especialmente PCR de tempo real. O termo "amplificação de tempo real" é intencionado significar qualquer técnica de amplificação, preferivelmente PCR ("PCR de tempo real") que torna possível monitorar a evolução de uma reação de amplificação contínua (vide, por exemplo, Real-Time PCR: An Essential Guide1 eds. Edwards efa/., Horizon Scientific Press, 2004; Marras SAE et al. 2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization pro- bes. Clin Chim Acta 363: 48-60; para debate de várias plataformas de PCR de tempo real).
Por meio de exemplo e não-limitação, amplificação de tempo re- al, especialmente PCR de tempo real, como intencionada aqui abrange sis- temas completamente convencionais, tais como, por exemplo, o sistema de TaqMan® desenvolvido por Applied Biosystems, que conta com a liberação e detecção de uma sonda fluorogênica durante cada rodada de amplificação de DNA (Holanda etal. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. PNAS 88: 7276-80). O método usa a atividade da exonuclease de 5' da Taq polimerase durante a extensão do iniciador para clivar uma sonda fluorogênica dual-marcada hibridada com o DNA-alvo entre os inicia- dores de PCR. Antes da clivagem, um fluoroforo repórter, tal como 6- carboxifluoresceína (6-FAM) na extremidade 5' da sonda é extinguido por 6- carbóxi-tetrametilrodaniina (TAMRA) através de transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET). Seguindo a digestão, FAM é liberado. A fluorescência resultante medida em tempo real por volta de 518 nm durante a fase de registro de acumulação de produto é proporcional ao número de cópias da sequência-alvo.
Outros sistemas de detecção por amplificação de tempo real, especialmente PCR de tempo real, podem também utilizar FRET, tal como, por exemplo, sistemas com base em balizas moleculares. Balizas molecula- res são sondas de polinucleotídeo unifilamentares que possuem uma estru- tura de grampo de cabelo. A porção da alça é uma seqüência de sonda complementar a uma seqüência dentro de um amplicon a ser avaliado, e o talo é formado por seqüências complementares curtas localizadas nas ex- tremidades opostas da baliza molecular. A baliza molecular é marcada com um fluoroforo (por exemplo, 6-FAM) em uma extremidade e um extintor (por exemplo, TAMRA) na outra extremidade. Quando livre na solução, o talo mantém o fluoroforo e o extintor em proximidade íntima, causando a fluores- cência do fluoroforo a ser extinguido através de FRET. Porém, quando liga- do a seu alvo complementar, o híbrido de sonda-alvo força o talo a desenro- lar-se, separar o fluoroforo do extintor, e restabelecer a fluorescência. Con- sequentemente, quando a quantidade de um amplicon aumenta durante a amplificação, esta pode ser monitorada como um aumento na fluorescência da baliza correspondente (vide, por exemplo, Manganelli et ai 2001. Real- time PCR using molecular beacons. Methods Mol Med 54: 295-310; Marras SAE. 2006. Selection of fluorophore and extintor pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes. Methods Mol Biol 335: 3-16; Marras SAE et al. 2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. Clin Chim Acta 363: 48-60 para mais debate de detecção das balizas moleculares).
Um sistema de detecção e amplificação de PCR de tempo real particularmente vantajoso para o uso na presente invenção é o sistema de Light Upon Extension (LUX®) comercializado por Invitrogen (Carlsbad, CA) e descrito em detalhes em Nazarenko et ai 2002 (Nucieic Acids Research 30: e37) e Nazarenko et ai 2002 (Nucleic Acids Research 30: 2089-2095). Este sistema emprega pares de iniciadores em que usualmente um dos iniciado- res do dito par de iniciadores é marcado por um fluoroforo (tal como, por e- xemplo, FAM ou JOE ou Alexa Fluor 546). A estrutura particular do iniciador "livre" extingue o sinal do fluoroforo ligado a este, enquanto que a intensida- de de sinal do fluoroforo aumenta quando o iniciador assumir uma confor- mação estendida uma vez incorporado no produto de amplificação. A se- qüência dos iniciadores da presente invenção, tal como dos iniciadores pre- feridos particularmente como listados nas Tabelas 1 e 4, pode ser trabalhada para executar com a tecnologia de LUX®, seguindo as instruções das publi- cações acima de Nazarenko et ai 2002 ou usando ferramentas de software fornecidas por Invitrogen em www.invitrogen.com/lux. A tecnologia de LUX® é particularmente bem adaptada para multiplexação (isto é, executar em uma reação simples) de duas ou mais amplificações usando conjuntos de iniciadores diferentes, uma vez que cada um dos conjuntos de iniciadores pode ser marcado usando um fluoroforo diferente.
Para descrição dos modos adicionais para detectar e avaliar os produtos de amplificação em tempo real (por exemplo, usando sondas adja- centes; sondas de 5-nuclease tais como Taqman®; sonda Light-up; iniciado- res Scorpion Duplex; iniciadores Amplifluor; e outros formatos de sonda de hibridação fluorescente alternativos, vide, por exemplo, Marras SAE et al. 2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. Clin Chim Acta 363: 48-60, esp. seção 6 e refe- rências dentro deste).
Em modalidades preferidas, a amplificação de tempo real, prefe- rivelmente PCR de tempo real, da invenção usa (substancialmente) reagen- tes não-específicos para seqüência para detectar e avaliar a acumulação dos produtos de amplificação. Estes sistemas usualmente empregam fluoro- cromos (tinturas fluorescentes) que se ligam ao DNA (isto é, ligação de DNA), preferivelmente ao DNA bifilamentar, em um modo substancialmente não-específico para seqüência, e em tal ligação sua fluorescência é alcan- çada ou melhorada. Consequentemente, o aumento observado na fluores- cência é indicativo da aparência e quantidade do produto de amplificação acumulado (bifilamentar). Se os ditos fluorocromos ligam preferencial ou ex- clusivamente ao DNA bifilamentar e/ou se sua fluorescência é preferencial ou exclusivamente melhorada quando ligados ao DNA bifilamentar, então a especificidade do produto de amplificação pode ser determinada executando sua "curva de fundição", isto é, diagrama de fluorescência vs. temperatura, e determinando a Tm do produto, isto é, temperatura na qual 50% do produto são fundidos e tidos desse modo perdeu sua fluorescência melhorada. A observação de uma Tm esperada simples para um produto de amplificação (ou Tm múltipla esperada na amplificação de multiplexação) confirma a es- pecificidade da amplificação.
Fluorocromos exemplares para o uso nos métodos de detecção não-específicos para seqüência acima incluem, sem limitação, aglutinantes de sulco principal, aglutinantes de sulco secundário, tinturas intercaladas, ou similares; tais como, por exemplo, SYBR Green I (2-[N-(3-dimetilaminopro- pil)-N-propilamino]-4-[2,3-di-hidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metilideno]-1- fenil-quinolínio; Zipper et al. 2004. Nucleic Acid Res 32: e103), brometo de etídio, Hoechst 33258, PicoGreen® (Molecular Probes), preferivelmente SY- BR Green I ou PicoGreen®.
Em uma outra modalidade preferida, as reações de amplificação de tempo real dos métodos presentes podem ser multiplexadas, isto é, dois ou mais amplicons diferentes podem ser amplificados usando dois ou mais pares de iniciadores correspondentes na(s) mesma(s) amostra(s) na mesma reação. Os iniciadores visados pelos presentes inventores, em particular os iniciadores listados em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4 ou variantes ou derivados dos mesmos, podem ser particularmente adaptados para mul- tiplexar aplicações inter alia porque eles desempenham-se adequadamente em condições de reação substancialmente iguais ou similares (por exemplo, composição de reação e condições de ciclagem da temperatura), como tam- bém porque eles produzem produtos similarmente dimensionados.
É bem entendido que multiplexação em geral requer que produ- tos de amplificação diferentes que surgem na reação podem ser distingui- dos. No contexto presente, se os métodos não-específicos para seqüência (por exemplo, SYBR Green ou outra tintura de ligação de DNA) forem usa- dos para detectar os produtos de amplificação, multiplexação pode ser parti- cularmente prevista onde os produtos de amplificação tiverem Tm suficien- °20 temente dissimilar a ser distinguida executando uma curva de fundição (por exemplo, Tm diferindo em cerca de 5°C ou mais). Porém, onde os métodos de detecção específicos para amplicon forem usados (por exemplo, iniciado- res diferentemente marcados ou sondas diferentemente marcadas para am- plicons diferentes), multiplexação longa dos testes presentes é em princípio possível.
Consequentemente, alvo para a detecção acima descrita usan- do sondas e/ou modelo para a amplificação usando pares de iniciadores, seria ácido nucleico que origina dos respectivos eventos de planta transgê- nica compreendidos na amostra. Preferivelmente, este ácido nucleico-alvo e/ou modelo seria DNA genômico que origina dos ditos eventos transgênicos que, devido à sua estabilidade maior, é esperado que seja melhor preserva- do na amostra que outros tipos de ácido nucleico, tais como, por exemplo, hnRNA ou mRNA. Não obstante, a invenção também contempla a detecção de mRNA ou cDNA (por exemplo, ensaios de RT-PCT correspondentes), ou DNA derivado de plasmídeo onde aplicável.
O presente método desse modo preferivelmente emprega ampli- ficação usando pares de iniciadores projetados especificamente para hibri- dar dentro e amplificar os amplicons correspondentes de dentro dos ácidos nucleicos a presença ou ausência destes na amostra necessita ser detecta- da, tal como, preferivelmente, ácidos nucleicos compreendendo ou consis- tindo naqueles listados sob a) - u) acima, como um meio para detectar a presença ou ausência dos ditos ácidos nucleicos na amostra.
Neste respeito, os presentes inventores perceberam que se o material de um evento de planta transgênica foi exposto a uma ou mais eta- pas de processamento a jusante, por exemplo, como descritas acima, os ácidos nucleicos, tais como DNA genômico dos mesmos, podem ser frag- mentados. Portanto, para aumentar as chances dos respectivos amplicons serem representativamente amplificados do DNA assim fragmentado, a in- venção também ensina vantajosamente reduzir o tamanho dos amplicons.
Consequentemente, nas modalidades preferidas, os amplicons são menos que cerca de 300 pb, por exemplo, menos de 280 pb, menos de 260 pb, menos de 240 pb, ou menos de 220 pb, mais preferivelmente menos que cerca de 200 pb, por exemplo, menos de 190 pb, menos de 180 pb, me- nos de 170 pb ou menos de 160 pb, até mesmo mais preferivelmente menos que cerca de 150 pb, por exemplo, menos de 140 pb, menos de 130 pb, me- nos de 120 pb ou menos de 110 pb, ainda mais preferivelmente menos que cerca de 100 pb, e ainda mais preferivelmente menos que cerca de 90 pb, por exemplo cerca de 85 pb, cerca de 80 pb, cerca de 75 pb, cerca de 70 pb, cerca de 65 pb, cerca de 60 pb, cerca de 55 pb ou cerca de 50 pb.
Em outras modalidades preferidas, os amplicons são entre cerca de 50 pb e cerca de 150 pb, entre cerca de 50 pb e cerca de 100 pb, preferi- velmente entre cerca de 50 pb e cerca de 90 pb, mais preferivelmente entre cerca de 60 pb e cerca de 80 pb, e ainda mais preferivelmente entre cerca de 65 pb e cerca de 75 pb. Como explicado, os métodos acima detectam ácidos nucleicos particulares, preferivelmente DNA genômico, em uma amostra. Pode ser apreciado que alguns protocolos de detecção robustos, por exemplo, alguns protocolos de PCR, poderiam ser executados nas amostras sem purificação anterior ou enriquecimento de seus ácidos nucleicos constituintes. Por outro lado, as detecções da invenção podem ser executadas mais consistente- mente se os ácidos nucleicos, tais como preferivelmente DNA genômico, forem enriquecidos primeiro ou isolados da amostra. Métodos para isola- mento dos ácidos nucleicos, tais como DNA genômico, das amostras, parti- cularmente amostras compreendendo material de planta, são a muito esta- belecidos na técnica e incluem métodos com base em, através de exemplo e não-limitação, extração de solvente orgânico (por exemplo, extração de fe- nol-clorofórmio) e precipitação de etanol ou álcool isopropílico; ligação às resinas de troca iônica; separação de densidade de cloreto de césio; croma- tografia de coluna giratória, separação magnética etc (vide, por exemplo, Milligan 1992. Plant DNA isolation. págs 59-88 em Hoelzel, ed. Molecular genetic analysis of populations: a practical approach. IRL Press, Oxford, UK).
Qualidade de DNA assim isolado pode ser avaliada, por exem- plo, através de eletroforese em gel e/ou medindo a razão de absorbância de A260/A280· Preferivelmente, a razão de A260/A280 para ácidos nucleicos usados nos métodos de detecção da invenção pode ser entre 1,6 e 2,3, mais prefe- rivelmente entre 1,6 e 2,0, até mesmo mais preferivelmente entre 1,7 e 1,9, ainda mais preferivelmente entre 1,75 e 1,85 e o mais preferivelmente cerca de 1,8. Quantidade de DNA assim isolado pode ser avaliada, por exemplo, medindo a absorbância Α2βο (Sambrook 1989), ou preferivelmente usando fluorocromos PicoGreen® ou SYBR Green I (Ahn et ai 1996. Nucleic Acids Res 24: 2623-5; Schneeberger et aí. 1995. PCR Methods Appl 4: 234-8).
Em uma modalidade preferida, a preparação de material de áci- do nucleico, particularmente DNA genômico, para uso nos métodos da in- venção pode também requerer fragmentação para obter tamanhos médios inferiores dos fragmentos de ácido nucleico, tais como, por exemplo, usando digestão enzimática ou sonicação como conhecido na técnica. Comprimento médio preferível dos ácidos nucleicos assim fragmentados pode ser entre 200 e 2000 pb, mais preferivelmente entre 300 e 1500 pb, até mesmo mais preferivelmente entre 500 e 1000 pb, por exemplo, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 700, cerca de 800 cerca de 900 ou cerca de 1000 pb.
Os métodos acima desse modo detectam a presença ou ausên- cia de ácidos nucleicos seletos em uma amostra, preferivelmente usando sistemas de detecção e protocolos como descritos antes. Como aqui usado, a "presença" de um ácido nucleico dado em uma amostra é em geral conclu- ída quando o valor de intensidade do sinal (quantidade de sinal) obtido para aquele ácido nucleico usando um ensaio de detecção adequado (por exem- plo, sinal fluorescente, sinal quimiluminescente, sinal de reação enzimática etc) na amostra for maior, de preferência estatisticamente de modo significa- tivo maior, que o em um controle negativo.
Um controle negativo não contém o ácido nucleico que é ensai- ado, mas pode ser vantajosamente comparável à amostra em outros respei- tos, preferivelmente a maioria dos outros respeitos, por exemplo, no tipo e quantidade de material de planta contido nele, etapas de processamento às quais o material foi exposto a jusante etc.
Preferivelmente, os métodos de detecção da invenção podem ser executados em ácidos nucleicos, mais preferivelmente em DNA genômi- co, isolado da amostra (vide acima). Em tal circunstância, o controle negati- vo pode consistir essencialmente de ácidos nucleicos isolados, não compre- endendo o ácido nucleico sujeito à detecção. Preferivelmente, o método de detecção depois empregará a mesma ou aproximadamente a mesma quan- tidade de ácidos nucleicos isolados da amostra e, para referência, o controle negativo. Também preferivelmente, a pureza e/ou qualidade dos ácidos nu- cleicos isolados da amostra e do controle negativo podem também ser as mesmas ou aproximadamente as mesmas; também preferivelmente, o mesmo método de isolamento pode ser usado para isolar ácidos nucleicos da amostra e o controle negativo.
Nas situações acima, a presença de um ácido nucleico dado em uma amostra pode ser preferivelmente concluída quando o valor de intensi- dade do sinal (quantidade de sinal) obtido para aquele ácido nucleico na amostra for pelo menos 2 x maior que no controle negativo, por exemplo, pelo menos 3 x ou pelo menos 4 x maior, mais preferivelmente pelo menos 5 x maior, por exemplo, pelo menos 6 x maior, pelo menos 7 x maior, pelo me- nos 8 x maior ou pelo menos 9 x maior, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 10 x maior, por exemplo, pelo menos 15 x maior, ainda mais preferivelmente pelo menos 20 x maior, por exemplo, pelo menos 30 x maior ou pelo menos 40 x maior, ainda mais preferivelmente pelo menos 50 x mai- or, por exemplo, pelo menos 100 x maior, pelo menos 200 x maior, pelo me- nos 300 x maior, pelo menos 400 x maior, pelo menos 500 x maior, pelo me- nos 1000 x maior ou até maior que o sinal no controle negativo.
Consequentemente, quando o valor de sinal (quantidade de si- nal) obtido para o ácido nucleico ensaiado na amostra não for maior (por exemplo, for o mesmo, aproximadamente o mesmo ou inferior) que o valor de sinal obtido para o ácido nucleico ensaiado no controle negativo, ou pre- ferivelmente não for maior pelos múltiplos preferidos citados acima, a "au- sência" do dito ácido nucleico na amostra pode ser em geral concluída.
Em modalidades preferidas, a presença ou ausência na amostra de um ácido nucleico de interesse é avaliada por amplificação de tempo real, preferivelmente PCR de tempo real. Nestes sistemas, uma medida comum usada para expressar a quantidade do modelo por um ácido nucleico dado em uma amostra é o valor Ct. Brevemente, o valor Ct estabelece o número de ciclo no qual a fluorescência atribuível ao produto de amplificação provin- do (ARn) passar de um valor de fluorescência de limiar arbitrário, o conjunto fica acima da fluorescência de linha base mas dentro da fase exponencial de amplificação (isto é, dentro da porção que pareceria linear em um diagrama de log 2 de fluorescência vs. N° de ciclo de dados).
Consequentemente, em amplificação de tempo real, a presença de um ácido nucleico dado em uma amostra pode ser em geral concluída quando Ct da amostra ("Ct de SAM") for inferior que o Ct de um controle ne- gativo ("Ct de NC"); e pode ser preferivelmente concluída quando Ct de SAM ≤ (Ct de NC - 1), por exemplo, Ct de SAM ≤ (Ct de NC - 2), Ct de SAM ≤ (Ct de NC - 3) ou Cf de SAM < (Cf de NC - 4), mais preferivelmente quando Cf de SAM < (Cf de NC - 5), por exemplo, Cf de SAM < (Cf de NC - 6), Cf de SAM < (Cf de NC - 7), Cf de SAM < (Cf de NC - 8) ou Cf de SAM < (Cf de NC - 9), até mesmo mais preferivelmente quando Cf de SAM < (Cf de NC - 10), por exemplo, Cf de SAM < (Cf de NC -11), Cf de SAM < (Cf de NC - 12), Ct de SAM < (Cf de NC - 13), Cf de SAM < (Cf de NC - 13) ou Cf de SAM < (Cf de NC - 14), ainda mais preferivelmente quando Cf de SAM < (Cf de NC - 15), por exemplo, Cf de SAM < (Cf de NC -16), Cf de SAM < (Cf de NC -17), Cf de SAM < (Cf de NC -18) ou Cf de SAM < (Cf de NC -19), ainda mais pre- ferivelmente quando Cf de SAM < (Cf de NC - 20), por exemplo, Cf de SAM < (Cf de NC - 25), Cf de SAM < (Cf de NC - 30) ou Cf de SAM < (Cf de NC - 35).
Consequentemente, em amplificação de tempo real, quando Cf de SAM não for inferior (por exemplo, for o mesmo, aproximadamente o mesmo ou maior) que o Cf de NC, ou preferivelmente não for inferior pelos diferenciais preferidos citados acima, a "ausência" do dito ácido nucleico na amostra pode ser em geral concluída.
Como observado acima, em sistemas de amplificação de tempo real que não empregam sondas específicas para seqüência (por exemplo, quando produto de amplificação for detectado usando tinturas de DNA não- específicas para seqüência tais como, por exemplo, SYBR Green I), a espe- cificidade do produto de amplificação pode ser verificada executando uma análise da curva de fundição e determinando a Tm. Presença do produto de amplificação específico pode ser concluída quando a Tm observada for idên- tica ou substancialmente idêntica (preferivelmente dentro de um intervalo de ± 3°C, mais preferivelmente ± 2°C, ainda mais preferivelmente ± 1°C, até mesmo mais preferivelmente ± 0,5°C, e ainda mais preferivelmente ± 0,2°C ou ± 0,1 °C) para a temperatura de fundição calculada e/ou experimental- mente determinada do amplicon esperado.
Além disso, amplificação específica pode ser preferivelmente concluída quando a análise da curva de fundição do produto de amplificação exibir uma Tm só. Alternativamente ou além disso, amplificação específica pode ser preferivelmente concluída quando o produto de amplificação exibir um tamanho simples, esperado em eletroforese em gel. Porém, a aparência do(s) produto(s) de amplificação não-específico(s) poderia ser até certo pon- to tolerável na prática, preferivelmente se tais produto(s) de amplificação não-específico(s) constituíssem menos que 50%, mais preferivelmente me- nos que 40%, até mesmo mais preferivelmente menos que 30%, ainda mais preferivelmente menos que 20%, ainda mais preferivelmente menos que 10%, também mais preferivelmente menos que 5%, até mesmo mais preferi- velmente menos que 2% e o mais preferivelmente menos que 1%, por e- xemplo, menos que 0,5% ou menos que 0,1%, da quantidade total (p/p) do produto de amplificação. Tal(is) produto(s) de amplificação não-específico(s) pode(m) ser observado(s), por exemplo, pelo surgimento de um ou mais pi- cos de Tm adicionais na análise da curva de fundição e/ou aparência de um ou mais tamanhos de produto adicionais na eletroforese em gel.
Em um outro desenvolvimento da invenção, é observado que amplicons amplificados usando o mesmo conjunto de iniciador nos ácidos nucleicos que originam de eventos diferentes podem apresentar valores de Tm distintos, presumivelmente devido a algumas diferenças na seqüência entre tais amplicons. Por meio de exemplo e não-limitação, os amplicons amplificados usando conjunto de iniciador SEQ ID NO: 11 e 12 (Tabela 4) em Bt11 e Bt176 mostram uma tal diferença em sua Tm. Consequentemen- te, o valor de Tm observado pode servir como uma outra informação distinti- va para usar no método da invenção, de modo que uma indicação até mes- mo mais detalhada da presença ou ausência de ácidos nucleicos de tais e- ventos particulares é obtida.
Alternativamente ou além disso, em uma outra variação, um áci- do nucleico particular pode ser amplificável usando um conjunto de iniciador particular de um ou mais eventos, enquanto o mesmo iniciador não amplifi- caria o ácido nucleico correspondente em um ou mais outros eventos, pre- sumivelmente devido a algumas diferenças de seqüência nos sítios de liga- ção do iniciador. Embora tal situação necessitasse que o uso de dois ou mais conjuntos de iniciador para amplificar o ácido nucleico correspondente de eventos diferentes (e pode neste respeito ser menos vantajoso que sele- cionar um conjunto de iniciador que amplifica o ácido nucleico de todos os eventos de planta de interesse), pode dar a vantagem de fornecer informa- ção adicional acerca da presença ou ausência de ácidos nucleicos de even- tos particulares na amostra. Por exemplo, o ácido nucleico de CryIAb pode ser vantajosamente detectado de MON8IO usando o conjunto de iniciador SEQ ID NO: 30 e 31 e de Bt11 e Bt176 usando o conjunto de iniciador SEQ ID NO: 11 e 12 (Tabela 4).
Uma pessoa versada pode apreciar que as reações de amplifi- cação, por exemplo, PCR1 podem dar origem a um subproduto de "iniciador- dímero" não-específico. Tais produtos de iniciador-dímero podem ser tipica- mente de modo fácil distinguidos do(s) produto(s) de amplificação específi- co(s) por seu tamanho diferente, o mais freqüentemente menor, e/ou Tm. Conseqüentemente, uma pessoa versada poderia reconhecer e minimizar o efeito de tais artefatos na análise da reação de amplificação. Os iniciadores preferidos da invenção, tais como aqueles listados nas Tabelas 1 e 4, foram projetados para minimizar o efeito de iniciador dímero.
Uma outra questão é a sensibilidade dos métodos de detecção usados na presente invenção que pode ser vantajosamente expressa como "limite de detecção" (LOD) dos mesmos, referindo-se aqui à quantidade de concentração mais baixa de um analito (aqui de um ácido nucleico dado a ser detectado) em uma amostra que pode ser confiantemente detectada, embora não necessariamente quantificada. "Confiantemente detectada", como aqui usado, significa que as amostras contendo a quantidade de LOD ou concentração do analito darão um resultado positivo > 50% de detecções repetidas, preferivelmente > 60%, mais preferivelmente > 70%, até mesmo mais preferivelmente > 80%, ainda mais preferivelmente > 90%, e o mais preferivelmente > 95% ou até mesmo > 99% de detecções repetidas.
Preferivelmente, LOD dos métodos de detecção adequado para o uso na invenção, expresso aqui como o número de cópia de LOD de um ácido nucleico dado de interesse em uma amostra submetida à detecção, pode ser 10.000 ou menos, por exemplo, 9.000 ou menos, 8.000 ou menos, 7.000 ou menos ou 6.000 ou menos, mais preferivelmente 5.000 ou menos, por exemplo, 4.000 ou menos, 3.000 ou menos ou 2.000 ou menos, até mesmo mais preferivelmente 1.000 ou menos, por exemplo, 900 ou menos, 800 ou menos, 700 ou menos ou 600 ou menos, ainda mais preferivelmente 500 ou menos, por exemplo, 400 ou menos, 300 ou menos ou 200 ou me- nos, ainda mais preferivelmente 100 ou menos, por exemplo, 90 ou menos, 80 ou menos, 70 ou menos ou 60 ou menos, e o mais preferivelmente 50 ou menos, com modalidades preferidas exemplares incluindo 40 ou menos, 30 ou menos, 20 ou menos ou até mesmo 10 ou menos, tal como, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Os iniciadores preferidos da invenção, tais como aqueles listados nas Tabelas 1 e 4, foram projetados para alcançar sensibili- dade particularmente alta (LOD baixo).
Como aqui usado, o termo "milho" refere-se a Zea mays, preferi- velmente Zea mays spp. mays, e inclui todas as variedades de planta que podem ser criadas com milho, incluindo espécies de milho selvagens; os termos "colza", "óleo de semente de colza" ou "óleo de canola" referem-se alternadamente a Brassica napus, e incluem todas as variedades de planta que podem ser criadas com colza, incluindo espécies de colza selvagens; os termos "soja" ou "feijão-soja" referem-se alternadamente a Glycine max, e incluem todas as variedades de planta que podem ser criadas com soja, in- cluindo espécies de soja selvagens; o termo "arroz" refere-se a Oryza sativa, incluindo, sem limitação, ssp. indica e japonica, e inclui todas as variedades de planta que podem ser criadas com arroz, incluindo espécies de arroz sel- vagens; o termo "açúcar de beterraba" refere-se a Beta vulgaris, e inclui to- das as variedades de planta que podem ser criadas com açúcar de beterra- ba, incluindo espécies de açúcar de beterraba selvagens; o termo "algodão" refere-se a espécies de Gossypium, preferivelmente Gossypium hirsutum, e inclui todas as variedades de planta que podem ser criadas com algodão, incluindo espécies de algodão selvagens; o termo "batata" refere-se a Sola- num tuberosum, e inclui todas as variedades de planta que podem ser cria- das com batata, incluindo espécies de batata selvagens.
Eventos de planta transgênica são referidos aqui por suas de- signações como comumente empregadas na técnica e familiares a uma pes- soa versada. Não obstante, por meio de ajuda também, a Tabela 2 abaixo resume mais informação suficiente para identificação específica dos eventos citados.
Tabela 2. Identificação dos eventos de planta transgênica.
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Os identificadores únicos (UI) listados acima representam um
sistema para classificação única dos eventos de planta transgênica começa- da estabelecida pela Organisation for Economic Co-operation and Develop- ment (OECD) e descrita em suas publicações ENV/JM/MONO(2002)7: "O- ECD Guidance for the Designation of a Unique Identifier for Transgenic Plants", de 20 de outubro de 2004, e ENV/JM/MONO(2002)7/REV1 de 7 de novembro de 2006. Os ditos identificadores únicos são usados, reconheci- dos e atribuídos internacionalmente, incluindo na Europa (vide, por exemplo, Commission Regulation (EC) N0 65/2004 de 14 de janeiro de 2004 que esta- belece um sistema para o desenvolvimento e atribuição de identificadores únicos para organismos geneticamente modificados).
Informação detalhada com relação aos eventos de planta trans- gênica de interesse acima e outros, tal como, por exemplo, informação sobre taxonomias de hospedeiro, construções de transformação, seqüências inse- ridas etc pode ser acessada pelos portais publicamente disponíveis de vá- rias autoridades reguladoras incluindo, por exemplo, OECD BioTrack Pro- duct Database (http://www2.oecd.org/biotech/default.aspx), a US FDA (http://www.cfsan.fda.gov/), o European Community Register of GM Food and Feed (http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm), a base de dados de Aqbios (www.agbios.com) ou a base de dados de EC GMO Compass (http://www.gmo-compass.org/), como também na literatura cientí- fica etc. Uma pessoa versada está bem ciente e pode usar tais fontes de base de dados.
Além disso, os métodos de detecção evento-específicos e mé- todos de detecção construção-específicos (por exemplo, vide Codex Alimen- tarium) estão disponíveis e permitem de forma não-ambígua distinguir os eventos acima e outros. Por exemplo, o European Community Reference Laboratory (CRL) (http://gmo-crl.jrc.it/; http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm) lista dos métodos validados para detecção evento-específica, como forneci- do pelos fabricantes, descritos na literatura científica ou desenvolvidos pelo próprio CRL.
Como observado acima, a invenção permite concluir a presença ou ausência em uma amostra de material derivado de eventos seletos, cru- zamentos dos mesmos, ou eventos relacionados dos mesmos.
O termo "cruzamentos dos mesmos" neste contexto refere-se à progênie obtida por um ou mais cruzamentos subsequentes de dois ou mais eventos compatíveis (isto é, eventos capazes de serem cruzados, particu- larmente eventos que pertencem à mesma taxonomia), de modo que a dita progênie resultante compreenda inserções transgênicas dos dois ou mais eventos parentais sendo cruzados.
O termo "eventos relacionados dos mesmos" neste contexto re- fere-se aos eventos que foram gerados introduzindo nas mesmas taxonomi- as as mesmas construções transformantes como que dos respectivos even- tos citados, mas não obstante são distintos dos eventos citados, por exem- plo, podem tipicamente diferirem no número e/ou sítio de integrações genô- micas da construção transformante. Freqüentemente, tais eventos podem estar sujeitos à autorização. Em outras circunstâncias, tais eventos relacio- nados podem estar presentes como contaminantes indesejados. Conse- quentemente, detectar os elementos genéticos de dentro das construções transformantes, o método da invenção vantajosamente permite detectar tais eventos.
Como observado acima, os métodos da invenção envolvem de- tecção da presença ou ausência em amostras de um ou mais ácidos nuclei- cos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) como defi- nidos acima.
Neste respeito, a citação de "um ácido nucleico derivado e es- pecífico para" uma taxonomia dada, tal como definido para os ácidos nuclei- cos listados sob a) "Zm", b) "Bn", c) "Gm", o) "Or", p) "Bv", q) "Gs", e t) "St", significa que o dito ácido nucleico na amostra origina do material genético, preferivelmente DNA genômico, da dita taxonomia dada e não está presente - e desse modo não seria detectável usando o método de detecção escolhi- do - no material genético que origina de outras taxonomias, tais como as taxonomias restantes listadas acima. Por meio de exemplo e não-limitação, o dito ácido nucleico ou derivado da taxonomia dada não pode ter nenhum homólogo em outras taxonomias ou seus homólogos em outras taxonomias podem ter seqüências suficientemente distintas de modo que eles não sejam detectados pelo método de detecção escolhido. Por exemplo, em um sítio de detecção, por exemplo, em um sítio ao qual uma sonda ou um ou mais inici- adores de amplificação hibridaria dentro do ácido nucleico dado, tais homó- logos podem apresentar menos de 100% de identidade de seqüência, prefe- rivelmente menos que 95%, até mesmo mais preferivelmente menos que 90%, ainda mais preferivelmente menos que 85%, ainda mais preferivelmen- te menos que 80%, e o mais preferivelmente menos que 75%, em modalida- des exemplares preferidas menos que 70%, menos que 65%, menos que 60%, menos que 55% ou menos de 50% de identidade de seqüência com o ácido nucleico dado.
Também, o termo ácido nucleico "derivado de" como especial- mente usado em a) - u) significa que os ditos ácidos nucleicos originam de suas respectivas taxonomias, elementos genéticos, genes, estrutura de leitu- ra aberta etc, embora eles - quando encontrados na amostra - possam em parte diferir estruturalmente dos mesmos.
Por exemplo, processamento a jusante do material de planta pode causar alterações na estrutura de ácido nucleico (por exemplo, DNA), e talvez notavelmente pode causar fragmentacao do mesmo. Além disso às vezes fragmentos ou variantes funcionais de elementos de comprimento to- tal podem ser usados em plantas transgênicas. Consequentemente, ácidos nucleicos "derivados de" aqueles citados sob a) - u) acima podem ser, por exemplo, fragmentos dos mesmos, desde que tais fragmentos permitam sua atribuição específica aos ácidos nucleicos originais. Por exemplo, tais frag- mentos podem incluir pelo menos 15 pb contínuos da seqüência da qual eles são derivados, preferivelmente pelo menos 20 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 30 ou pelo menos 40 pb contínuos, mais preferivelmente pelo menos 50 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 60 ou pelo menos 70 pb contínuos, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 80 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 90 pb contínuos, ainda mais preferivelmente pelo me- nos 100 pb contínuos, por exemplo, pelo menos 150 pb contínuos, ainda mais preferivelmente pelo menos 200 pb contínuos, por exemplo, pelo me- nos 300 pb contínuos, pelo menos 400 pb contínuos ou pelo menos 500 pb contínuos ou mais e podem até mesmo incluir elementos de comprimento total.
Outras modificações de ácidos nucleicos esperados do proces- samento a jusante do material de planta, por exemplo, desaminação parcial etc, são também contempladas sob o termo "derivado de". Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico a) "Zm" é deri- vado do gene de álcool desidrogenase I endógeno (adh-1) de Zea mays. Uma seqüência exemplar mas não-limitativa do gene adh-1 de Zea mays é encontrada sob o número de acesso AF123535.1 na base de dados de GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Em uma outra modalidade preferida, o ácido nucleico b) "Bn" é derivado do gene de acetil-CoA carboxilase endógena (acc) ou o gene de cesso X77576.1 na base de dados de GenBank; uma seqüência exemplar do gene de cruciferina de Brassica napus é encontrada sob o número de acesso X14555.1 na base de dados de GenBank.
Em uma outra modalidade preferida, o ácido nucleico c) "Gm" é derivado do gene de Iectina endógena (Iec) de Glycine max. Uma seqüência exemplar mas não-limitativa do gene Iee de Glyeine max é encontrada sob o número de acesso K00821.1 na base de dados de GenBank.
Em uma outra modalidade preferida, o ácido nucleico o) "Or" é derivado do gene de fosfolipase D endógena (p/d) de Oryza sativa. Uma se- qüência exemplar mas não-limitativa do gene pld de Oryza sativa é encon- trada sob o número de acesso AB001919.
Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico p) "Bv" é deriva- do do gene de Glutamina sintetase endógena (GluA3) de Beta vulgaris. Uma seqüência exemplar mas não-limitativa do gene GluA3 de Beta vulgaris é encontrada sob o número de acesso AY026353.1 na base de dados de GenBank.
Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico q) "Gs" é deri- vado do gene do homólogo de sinopse de Arabidopsis endógena 7 (sah-7) de Gossypium. Uma seqüência exemplar mas não-limitativa do gene sah-7 de Gossypium é encontrada sob o número de acesso AY117067 (Autores: Senchina et al. 2003. Mol Biol Evol 20 (4): 633-643) na base de dados de GenBank.
Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico t) "St" é deriva- do do gene de UDP-glicose pirofosforilase endógena (UGPase) de Solanum tuberosum. Uma seqüência exemplar mas não-limitativa do gene UGPase de Solanum tuberosum é encontrada sob o número de acesso U20345 na base de dados de GenBank.
Em uma outra modalidade preferida, o ácido nucleico derivado de planta genérica é derivado do gene RBCL cloroplástico endógeno (rbcl) de Zea mays. Uma seqüência exemplar mas não-limitativa do gene rbcl de Zea mays é encontrada sob o número de acesso Z11973.1 na base de da- dos no GenBank.
Uma pessoa versada seria capaz de projetar e verificar sondas ou pares de iniciadores específicos das seqüências acima citadas para uso nas etapas de detecção do presente método.
As referências aos elementos de seqüência e genes citados neste relatório descritivo para os ácidos nucleicos listados sob d) - n), r), s) e u) são conhecidas a uma pessoa versada no campo de modificação genética de plantas. Consequentemente, uma pessoa versada entende que estas seqüências de designações referem-se e também apreciaria o nível de alte- rações para estas seqüências que são comuns na geração de plantas trans- gênicas.
Em uma modalidade, o presente ácido nucleico em um evento transgênico pode incluir a estrutura de leitura aberta ou uma parte funcional da mesma (isto é, uma parte que alcança o efeito desejado na planta trans- gênica) dos genes citados aqui, esp. os genes listados sob f) - n), r), s) e u) acima.
Não obstante, por meio de mais esclarecimento e não-limitação, nós aqui abaixo listamos as seqüências exemplares para os genes particula- res e elementos referidos sob d) - n), r), s) e u), e um ácido nucleico derivado de planta genérica exemplar:
Elemento de sequência/gene Número de acesso no GenBank
Ppromotor 35S de CMV V00140 (genoma de CAMV inteiro)
TerminadordeNOS V00087.1
ORF de CryIAb AF465640 ORF do gene bar AY346130.1
ORF do gene pat DQ156557.1
ORF do gene EPSPS AY125353.1
ORF do gene Cry3A modificado AR836206.1
PromotorGIbI CS155614.1
ORF do gene Cry3Bb1 CS410008.1
ORF do gene Bxn E01313.1
ORFdogeneCryIAc EF094884.1
ORF do gene Cry2Ab2 DQ361266.1
ORFdogeneGbss X58453.1
Gene rbcL de cloroplasto de Zea mays Z11973.1
Será apreciado que os ácidos nucleicos na verdade presentes nos eventos de planta transgenica podem compreender sequencias que po- dem diferir até certo ponto das seqüências exemplares acima. Por exemplo, tais diferenças podem incluir deleções, adições e/ou substituições, mutila- ções de base (por exemplo, inclusão de fragmentos funcionais), fusões a outros elementos (por exemplo, fusão para transporte de membrana ou si- nais de classificação de organela) etc.
As seqüências atuais dos elementos acima e outros encontra- dos nos eventos transgênicos têm sido em muitas circunstâncias determina- das e acessíveis por meio de GenBank e outras bases de dados de seqüên- cia. Consequentemente, alinhamentos de seqüência serão executados para identificar regiões dentro dos ácidos nucleicos mais adequadas para deriva- ção de sondas ou amplicons dos mesmos.
Consequentemente, uma sonda ou um amplicon (e conjunto de iniciador correspondente) pode ser vantajosamente derivado de umas por- ções de cada um dos ácidos nucleicos acima que são encontrados na maio- ria dos eventos transgênicos e/ou mostrando a identidade de seqüência mais alta entre os vários eventos transgênicos. Tal sonda ou par de iniciado- res aumentará a chance de detecção daquele ácido nucleico particular de vários eventos transgênicos. Uma pessoa versada pode seguir esta instru- ção para executar os alinhamentos de seqüência necessários. Como exposto na seção Sumário, a invenção também fornece uma maneira vantajosa de concluir a presença ou ausência potencial de ma- terial de um ou mais eventos de planta transgênica de interesse a serem usados na etapa (2) dos métodos acima. Em particular, os resultados obti- dos para a amostra na etapa (1) são representados como um conjunto Gsam simbolizando uma coletânea daqueles ácidos nucleicos, escolhidos daqueles compreendendo ou consistindo nos listados sob a) - u) acima, que foram detectados como presentes na amostra; e comparando o dito conjunto Gsam com um ou mais conjuntos de interesse Gx representando os eventos indivi- duais a serem avaliados. Os conjuntos de interesse Gx consistem, isto é, representam uma coletânea daqueles ácidos nucleicos selecionados dos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima que são encontrados nos respectivos eventos e desse modo seriam detectados na etapa (1) (na proporção que a dita etapa (1) detecte a presença dos ditos ácidos nucleicos) se a amostra contivesse material derivado dos respectivos eventos, ou um envolvendo tal cruzamento, ou um evento relacionado.
A Tabela 3 a seguir lista que ácidos nucleicos daqueles listados sob a) - u) acima estão presentes nos eventos de interesse particulares:
Tabela 3. Características dos eventos.
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Como já explicado:
- se Gx for igual a Gsam (Gx = GSAM), então o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;
- se Gx for um subconjunto apropriado de Gsam (Gx c Gsam), en- tão o material derivado do evento de planta transgênica X, ou de um cruza- mento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;
- se Gx não for igual a Gsam e Gx não for um subconjunto apro- priado de Gsam, (Gx φ Gsam e Gχ <z Gsam), então o material derivado do e- vento de planta transgênica X, ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
Em uma outra modalidade preferida, se Gx for igual a Gsam, e se nenhum conjunto ou a soma de dois ou mais conjuntos representando os eventos (em particular, conjuntos representando os eventos selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em: GBt176, GBt11, GBt10, GMON810, GMON863, GTC1507, GNK603, GT25, GQA21, GDAS-59122, GMIR604, GLY038, GMON88017, Gjopas 19/2, GMS1, GRF1, GRF2, GmS1/RF1, GmS1/RF2, GmS8, GRF3, GmS8/RF3, GQT73, G745, GLiberator pHoe&Ac, GGS40/90pHoe6/Ac, GOXY235, GmON40-3-2. GMON89788, Ga2704-12, Ga5547-127, GLL62, GLL06, Gll.601, Gt120-7, GH7-1, G45.75, Ga cotton 25, Gmoni445, Gmon531, Gmoni5985 e Geh92-527-i) diferente de Gxfor igual a Gx, então o mate- rial derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está presente na amostra.
Em um outro desenvolvimento desta maneira de avaliação, áci- dos nucleicos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u) acima são atribuídos os respectivos valores únicos. Consequentemente, o conjunto Gsam é depois atribuído a um valor "VGsam" sendo um múltiplo dos valores únicos atribuídos àqueles ácidos nucleicos detectados na etapa (1) como estando presentes na amostra; e um conjunto de interesse Gx é atribu- ído a um valor "VGx" sendo um múltiplo dos valores únicos atribuídos àque- les ácidos nucleicos selecionados dos compreendendo ou consistindo na- queles listados sob a) - u) acima que são encontrados no dito evento e des- se modo seriam detectados na etapa (1).
Consequentemente, em um exemplo preferido, ácidos nucleicos nZm", "Bn", "Gm", "p35S", "tNOS", "CrylAb", "PAT/bar", "PAT/pat", "CP4- EPSPS", "mCry3A", "cordap A", "Glb1", "Cry3Bb1", "Bxn", "Or", "Bv", "Gs", "CrylAc", "Cry2ab2", "St" e "Gbss" seriam atribuídos os respectivos valores Únicos "VZm", "VBn", "VGm", "Vp35s", "VtNOS", "Vcry1Ab", "VPAT/bar", "VPAT/paf". "VCP4-EPSPS", "VmCry3A", "Vcordap A", "VGib1", "VCry3Bb1", "VBxn", "VOr", "VBVB, "VGs", "VCry1Ac" , "VCry2ab2", "Vst" e "VGbss";
e a cada conjunto de interesse Gx seria atribuído um respectivo valor "VGx" escolhido dos valores do grupo compreendendo ou consistindo em valores "VGBt176","VGB11", "VGbt10", "VGMON810", "VGMON863", "VGTC1507", "VGNK603", "VGT25", "VGGA21", "VGDAS-59122", "VGMIR604", "VGLY038", "VGMON88017", "VGTopas 19/2", "VG/MS1", "VGRF1", "VGRF2". "VGMSI/RF1", "VGMS1/RF2", "VGMS8", "VGRF3", "VGmS8/RF3", "VGgT73m. "VG T45", 'VGuberator pHoe6/Ac", "VGGS40/90pHoe6/Ac" > "VGoxy235"i "VGMOMO-3-2 , 'VGMON89788 , "VGA2704-12 , "VGA5547-127" , "VGLL62", "VGOXYY235", "VGMON40-3-2", "VGMON89788","VGA2704-12", "VGA5547-127", "VGLL62", "VGMON531", "VGMON15985" ou "VGEH92-527-1", em que
- VGBt 176 = VZm x Vp35S x VCryIAb x VpAT/bar, - VGBtH = VZm x VP35S x V//VOS x VCryIAb x VpAT/pat, - VGBtIO = VZm x Vp35S x V«V0S x VCryIAb x VpAT/pat, - VGM0N8W = VZm x Vp35S x VWOS x sJCry 1 Ab, - VGMON863 = Vzm x Vp3ss x VtNOS, - Vgtci507 = Vzm x Vp35s x VpAT/pat, - VGNK603 = Vzm x Vp35S x VfA/OS x VcP4-EPSPS, - Vg725 = Vzm x Vp35s x VPAT/pat, - VQGA21 = Vzm x VtNOS, ~ VGDAS-59122 = Vzm x Vp35S x VpAT/bar, - VGMIR604 = Vzm x Vf/vos x VmCry3A, - VGLY038 = VZm x Vp35s x Vf/vos x VcorClapA x Vq/üí,
- VQMON88017 = Vzm x Vp35S x Vf/vOS x VcP4-EPSP x Vcry3Bb1,
- VGropas 19/2 = Ven x Vp35s x VpAT/pat,
- VQMSI = VBn x Vwos x VpAmar, - Vgrfí = Ven x VfNOS x VpAT/bar,
- VGRF2 = VBn x VtNOS x VpAT/bar, ~ VqmS8 = Ven x Vf/voS x VpAT/bó bar, - V"GRF3 = V"Bn X V"tNOS x V"pAT/bar,
- V"GMS1/RF1 - V"Bn x V"tNOS x V"pAT/bar,
- V"GMS1/RF2 = V"Bn x V"tNOS x V"pAT/bar,
- V"GMS8/RF3 = V"Bn x V"tNOS x V"pAT/bar,
- V"GGT73 = V"Bn x VCP4-EPSPS,
- V"GT45 - V"Bn x V"p35S x V"pAT/pat,
- V"GLiberatorpHoe6/Ac = V"Bn x V"p35S x V"PAT/pat,
- VGGS40/90pHoe6/Ac = V"Bn x V"p35S x V"PAT/pat,
- VGOXY235 = Ven x Vp35S x Vexn,
- VQMQN40-3-2 = VGm x Vp35S x Vf/voS x VcP4-EPSPS,
- VGMON89788 = VGm x VcP4-EPSPS,
- VGA2704-12 = VGm x Vp35S x VPAT/pat,
- V" GA5547-127 = V"GM x Vp35S x V"PAT/pat,
-" VGLL62 = Voz- x Vp35s x VpAT/bar,
- VGLL06 = VOr x Vp35s x VpAT/bar,
- VGLL601 = VOr x VP35S x vTNoS x VpAT/bar,
- VGT120-7 = VBv x VP3SS x VpAT/pat,
- VQH7-1 - VBv X VP35S x VcP4-EPSPS,
- VgA5-15 = VBv x VP35S x VtNOS x VcP4-EPSPS,
- Vgll cotton 25 = Vgs x Vp35s x VtNOS x VpAT/bar,
- VQMONI445 = VGs x VP35S x VtNos x VCP4-EPSPS,
- VQMON531 = VGs x Vp3ss x VtNOS x VcrylAc,
- VgMONI5985 = Vgs x Vp35s x VtNOS x VcrylAc x VcrylAc,
- OU VGEH92-527-1 = Vst x VfA/OS x VQbss-
Observe que mesmo que os métodos não testem a presença de todos os ácidos nucleicos a) - u), os acima valores devem ser definidos em termos daqueles ácidos nucleicos a presença do qual é testada eficazmente. Por meio de exemplo e não-limitação, onde a presença dos ácidos nucleicos listados sob j) - n), r) s) e u) como definidos acima, que correspondem a tra- ços específicos além daqueles definidos sob d) - i), não for testada, então os valores que correspondem aos vários eventos podem ser definidos de uma maneira mais estreita, em particular: valores do evento de milho VGMir604 = Vzm x VtNOS, VGly038 - Vzm x Vp35S x VtNOS, VGmON88017 ~ VZm x Vp35s x VfNOS x Vqp4-epsp, valor do evento óleo de semente de colza VGoxy23s = Ven x VP35s; valores do evento de algodão VGMons3i = VGs χ Vp35s x VtNos, VG- mon15985 = VGs χ Vp35s x V^osl e valor do evento de batata VGeh92-527-1 = Vst x Vtnos-
Por conseguinte, a etapa (iii) desta modalidade compreenderia executar para cada conjunto de interesse Gx operações lógicas:
- se VGsam/VGx for igual a 1, então o material derivado do even- to de planta transgênica Xou de um cruzamento do mesmo, ou de um even- to relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;
- se VGsWVGx for igual a um valor ou um múltiplo de dois ou mais valores selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em valores Vzm, vsn, vem, VP3ss, VtNos, vcryiab, vparnar, vpat/pat, Vcp4-epsps, Vm. Cry3A, VCordap A, Vcibl, Vcry3Bb1, Vsxn, Vor, Vbv, Vqs, VcrylAc, Vcry2ab2, Vst and Vgòss, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencial- mente presente na amostra;
- se VGsam/VGx não for igual a 1 e não for igual a um valor ou um múltiplo de dois ou mais valores selecionados de um grupo compreen- dendo ou consistindo em valores VZm, VBn, VGm, Vp35s, VtNos, VCryiAb, VPAT/bar, VpAT/pat, VcP4-EPSPS, VmCry3A, VcorcIap A, Vqim, Vcry3Bb1, Vfíxn, Vor, VBv, VQs, VcrylAc, Vcry2ab2, VSt e Vg/jss, então o material derivado do evento de planta transgêni- ca Xou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
Em uma outra variante preferida da modalidade acima, se VG- sam/VGx for igual a 1, e se nenhum valor ou o múltiplo de dois ou mais valo- res dos conjuntos que representam os eventos (em particular, valores sele- cionados de um grupo compreendendo ou consistindo em: VGBti76, VGBtn, VGBt10, VGmON810, VGmON863, VGtci507, VGnk603, VG T25, VGgA21, VGdAS-59122, VGmIR604, VGlY038, VGmON88017, VGropas 19/2, VGms1, VGrf1, VGrf2, VGmS1/RF1, VGms1/rf2, VGms8, VGrf3, VGmS8/RF3, VGg773, VG 745, VGuberator pHoe6/Ac, VGgs40/90pHoe6/Ac· VGoXY235. VGMON4Q-3-2, VGmON89788, VGA2704-12, VGa5547-127, VGLL62, VGt/_06, VGLL601, vGΤ120-7, VGH7-1, VG^5-Í5, VG/./. cotton 25, VGmON1445, VGΜΟΛ/53Ϊ, VGmo/v15985 e VGEH92-527-i) diferente de VGx igual a VGx, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está presente na amostra.
Em uma outra modalidade preferida, os valores únicos atribuí- dos aos ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo naqueles listados sob a) - u), isto é, valores selecionados do grupo compreendendo ou consis- tindo em Vzm, Ven, Vem, Vp35S, Vf/vos, VcrylAb, VpAT/bar, VpAT/pat, VcP4-epsps, Vm. Cry3A, Vcordap A, VGlbl, Vcry3Bb1, ^Bxn, Vor, ^Bv, Vgs> ^CryIAc, Vcry2ab2, ^St © ^Gbss, são números únicos primos, e a etapa (iii) compreende executar para cada conjunto de interesse Gx operações lógicas,
- se VGsamNGx for igual a 1, então o material derivado do even- to de planta transgênica Xou de um cruzamento do mesmo, ou de um even- to relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;
- se VGsamNGx for um número inteiro maior que 1, então o ma- terial derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra;
- se VGsamNGx não for um número inteiro, então o material de- rivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
Os inventores perceberam que o uso de números primos para representar os traços individuais ensaiados (ácidos nucleicos), como descri- tos no parágrafo anterior, é particularmente direto e vantajosamente agiliza e facilita a análise dos dados.
Em vista disso, os inventores também contemplam a aplicabili- dade geral do método de análise de dados aqui explicado usando números primos em outras aplicações, tais como, por exemplo, no campo de biologia molecular ou medicina molecular etc. Consequentemente, em uma aplica- ção, o método pode ser em geral usado para determinar a composição de uma amostra, em que a dita amostra pode conter dois ou mais eventos dife- rentes (a palavra evento como usada neste parágrafo tem um significado geral não-limitado a eventos de planta transgênica) ou material dos mesmos, em que cada evento é caracterizado por uma ou mais características ou tra- ços (as palavras características e traços como usadas neste parágrafo car- regam um significado geral não-limitado, embora preferivelmente incluindo, ácidos nucleicos). Consequentemente, a amostra como também cada even- to pode ser representada como um produto (isto é, operação "x") de valores únicos principais atribuídos a cada uma das características ou traços testa- dos, e a presença ou a ausência (potencial) do dito evento ou material do mesmo na dita amostra pode ser testada dividindo (isto é, operação Τ) o valor obtido para a amostra pelo valor calculado e atribuído a cada evento individual, e considerando o resultado da dita divisão como descrito acima mutatis mutandis.
Em uma modalidade preferida, as etapas de cálculo acima da etapa de método (2) são realizadas por um dispositivo de computação, por exemplo, uma calculadora ou um computador; e em outros aspectos a in- venção também contempla um dispositivo de computação que executa os cálculos acima, um portador de dados (por exemplo, um disquete, CD-ROM etc) compreendendo instruções para um dispositivo de computação progra- mável para realizar a etapa (2) do método da invenção, incluindo os cálculos acima, um kit compreendendo tal portador de dados ao lado de um ou mais reagentes também úteis nos métodos da invenção. Também, a invenção contempla uma aplicação baseada em rede que permite executar o algorit- mo da etapa (2), opcionalmente em que a informação acerca dos eventos potencialmente presentes na amostra pode ser acessada diretamente em uma base de dados associada por meio de um hipervínculo embutido.
Será apreciado que os identificadores "Gsam", "Gx", 'VGsam", "VGx" etc usados na descrição acima são arbitrariamente escolhidos aqui para representar os conceitos subjacentes de inter alia conjuntos e valores, respectivamente, e que outros identificadores (por exemplo, outras letras, palavras ou expressões) podem ser substituídos para representar os ditos conjuntos e valores.
Como mencionado, o método da invenção pode preferivelmente avaliar a presença ou ausência de ácidos nucleicos de interesse, especial- mente ácidos nucleicos selecionados do grupo compreendendo ou consis- tindo naqueles listados sob a) - u) acima, usando amplificação e particular- mente amplificação de PCR de amplicons.
Pode ser apreciado que uma pessoa versada pode ser em geral capaz de designar os conjuntos de iniciadores individuais para amplificação específica das seqüências de ácido nucleico conhecidas.
Não obstante, como já descrito, a Tabela 1 lista pares de inicia- dores particularmente vantajosos que foram projetados cuidadosamente pe- los inventores para fornecer numerosos benefícios quando usados na meto- dologia presente. Além disso, a Tabela 4 lista os iniciadores da Tabela 1 e também inclui iniciadores adicionais e pares de iniciadores que também de- sempenham-se muito satisfatoriamente no presente método, embora os ini- ciadores da Tabela 1 permanecendo a escolha principal dos inventores. Es- tes conjuntos de iniciador podem vantajosamente alcançar amplificação dos respectivos ácidos nucleicos quando presentes nos eventos de planta rele- vantes e de material variadamente processado de planta, e requer várias vantagens como descritas em outro lugar neste relatório descritivo.
Tabela 4. Seqüências de iniciador.
<table>table see original document page 70</column></row><table> <table>table see original document page 71</column></row><table> <table>table see original document page 72</column></row><table>
Onde a Tabela 4 incluir mais de uma fileira que concerne ampli- ficação em um certo ácido nucleico (tal como, por exemplo, várias fileiras para "CrylAb" e "CP4-EPSPS) por conjuntos de iniciador diferentes, qual- quer um ou mais dos ditos conjuntos de iniciador das ditas fileiras diferentes da Tabela 4 podem ser usados para amplificação. Onde a Tabela 4 lista, dentro de uma fileira so, mais que um iniciador direto e.ou reverso para am plificação em um certo ácido nucleico (tal como, por exemplo, para "Bn" (ACC), "Gm" (Iectin) ou ,,CP4-EPSPS"), qualquer um ou qualquer combina- ção do(s) dito(s) iniciador(es) direto(s) podem ser usados junto com qualquer um ou com qualquer combinação do(s) dito(s) iniciador(es) reverso(s) para obter amplificação.
Além disso, a invenção também fornece iniciadores variantes que incluem uma ou mais de variações de seqüência vis-a-vis os iniciadores listados na Tabela 4, tais como, por exemplo, uma ou mais deleção, inserção e/ou substituição, desde que tais iniciadores/pares de iniciadores ainda pos- sam alcançar amplificação adequada de seus respectivos amplicons. Prefe- rivelmente, tais iniciadores variantes mostrariam pelo menos 85%, mais pre- ferivelmente pelo menos 90%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência aos iniciadores listados na Tabela 4. Alinhamentos de seqüência e determinação de identi- dade de seqüência podem ser feitas, por exemplo, usando a Basic Local Alignament Search Tool (BLAST) originalmente descrita por Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10), tal como o algoritmo das "seqüências de Blast 2" descrito por Tatusova e Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247- 250).
Além disso, a invenção também contempla iniciadores e pares de iniciadores "nested" adequados para amplificação de amplicons dentro daqueles amplificados dos respectivos ácidos nucleicos usando os pares de iniciadores listados em quaisquer da Tabela 1 ou Tabela 4.
A invenção também contempla derivados, como descrito em ou- tro lugar neste relatório descritivo, dos iniciadores e pares de iniciadores lis- tados em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4.
Consequentemente, a invenção fornece os iniciadores e pares de iniciadores listados em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4, como também variantes e derivados dos mesmos, opcionalmente em qualquer combinação adequada dos ditos iniciadores e/ou pares de iniciadores ou variantes ou derivados dos mesmos.
Em um outro aspecto, a invenção fornece produtos de amplifica- ção obtenível dos respectivos ácidos nucleicos usando os iniciadores e pa- res de iniciadores acima, e particularmente usando pares de iniciadores ex- postos em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4 ou variantes ou derivados dos mesmos. Os ditos produtos de amplificação podem ser também proces- sados, tais como, por exemplo, isolados, clonados em vetores ou plasmí- deos adequados, transformados em hospedeiros recombinantes, por exem- plo, hospedeiros bacterianos adequados tais como E. coli, propagados com os mesmos e isolados dos mesmos, sequenciados etc.
Vantajosamente, os ditos produtos de amplificação, preferivel- mente clonados e reisolados, e possivelmente compreendidos em plasmí- deos ou vetores adequados, podem ser usados como controles positivos para verificar o funcionamento das etapas de detecção dos métodos da in- venção visados para a detecção do respectivo ácido nucleico em uma amos- tra. Alternativamente ou além disso, tais produtos de amplificação (clonados ou isolados) podem ser usados como calibradores para determinar a quanti- dade de modelos particulares em uma amostra, por exemplo, em PCR de tempo real.
Consequentemente, em um outro aspecto, a invenção fornece Ε. coli recombinante como depositado sob o Tratado de Budapeste com as Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) no dia 10 de janeiro de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5452, LMBP 5453, LMBP 5454, LMBP 5455, LMBP 5456, LMBP 5457, LMBP 5458, LMBP 5459 e LMBP 5460, no dia 6 de março de 2007 sob o número de a- cesso de LMBP LMBP 5451, e no dia 19 de abril de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5587, LMBP 5588, LMBP 5589 e LMBP 5590.
O dito E. coli recombinante compreende os produtos de amplifi- cação obtidos em eventos de modelo usando conjuntos de iniciador como listados na Tabela 5, clonados nos sítios de EcoRI do vetor de clonagem pUC18 MCS:
Tabela 5
<table>table see original document page 74</column></row><table> <table>table see original document page 75</column></row><table>
Além dos plasmídeos e E. coli depositados como listados na Tabela 5, a invenção também fornece outros plasmídeos exemplares, tais como, por exemplo, pUC18, contendo inserções amplificadas usando, por exemplo:
o par de iniciadores SEQ ID NO: 3 e 4 para o gene Brassica acc (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 44 na Figura 1 amplificada em OSR wt);
pares de iniciadores de CP4-EPSP SEQ ID NO: 18 e 19, e SEQ ID NO: 50 e 19 (inserções exemplares amplificadas, respectivamente, no evento 40-3-2 e evento NK603, para obter as respectivas seqüências inseri- das exemplares mostradas como SEQ ID NO: 45 e 46 na Figura 1) (iniciador SEQ ID NO: 17 pode também ser usado junto com o iniciador SEQ ID NO: 19; porém, iniciador SEQ ID NO: 17 contêm uma disparidade de seqüência no nucleotídeo 20 comparado à SEQ ID NO: 50, a última sendo, portanto, mais preferida);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 1 e 2 para o gene adh-1 de mi- lho (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 32 na Figura 1 amplificada em milho do tipo selvagem);
os pares de iniciadores SEQ ID NO: 5 e 49 para o gene de Iec- tina de soja (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 33 na Figura 1 ampli- ficada em soja do tipo selvagem);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 56 e 57 para um amplicon mais curto dentro do gene de adh-1 de Zea mays (seqüência inserida exem- plar SEQ ID NO: 70 na Figura 1);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 58 e 59 (SLTM) para um am- plicon de Iectina de Glycine max (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 71 na Figura 1);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 60 e 61 para um amplicon mais curto dentro do elemento p35S (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 72 na Figura 1);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 64 e 65 para um amplicon dentro do gene de GluA3 de Beta vulgaris (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 76 na Figura 1);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 66 e 67 para um amplicon dentro do gene sah-7 de Gossypium (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 77 na Figura 1);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 68 e 69 para um amplicon dentro do gene UGPase de batata (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 78 na Figura 1);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 11 e 12 para um amplicon dentro do traço de CryIAb (seqüência inserida exemplar SEQ ID NO: 73 na Figura 1 amplificada em material MON 810);
o par de iniciadores SEQ ID NO: 22 e 62 (RRS) ou 22 e 63 (GT 73) para um amplicon dentro do traço de CP4-EPSPS (seqüência inserida exemplar na Figura 1: SEQ ID NO: 74 amplificada em GT73 e SEQ ID NO: 75 amplificada em RRS).
É observado que devido ao tamanho mais curto do amplicon correspondente, o par de iniciadores SEQ ID NO: 22 e 23 ou SEQ ID NO: 22 junto com qualquer um ou ambos iniciadores SEQ ID NO: 62 e 63, pode ser preferivelmente usado para amplificar CP4-EPSPS tanto de material de plan- ta não processado (por exemplo, tecido de planta ou sementes) como tam- bém material processado (por exemplo, alimento ou ração), enquanto que os pares de iniciadores SEQ ID NO: 18 e 19 ou 50 e 19 que definem um ampli- con mais longo podem ser preferivelmente usados em material não proces- sado. Consequentemente, o par de iniciadores SEQ ID NO: 22 e 23 ou SEQ ID NO: 22 junto com qualquer um ou ambos iniciadores SEQ ID NO: 62 e 63, pode ser mais preferido nos métodos e kits presentes.
A invenção também fornece plasmídeos recombinantes isolados obteníveis das bactérias de E. coli recombinantes listadas na Tabela 5, como também inserções isoladas, preferivelmente inserções de EcoRI, dos mes- mos. A invenção também fornece qualquer outro micro-organismo recombi- nante transformado com os plasmídeos assim isolados.
Uma pessoa versada pode também apreciar que a invenção po- de também fornecer combinações dos ditos plasmídeos ou inserções dos mesmos, em que as ditas combinações são representativas daqueles ácidos nucleicos que os intencionados a detectar em uma amostra.
Além disso, a invenção também fornece o uso de plasmídeos recombinantes ou inserções como encontrados e obteníveis das bactérias da Tabela 5 ou outras explicadas acima para o uso como controles positivos e/ou calibradores nos métodos da presente invenção. Por exemplo, tais plasmídeos ou inserções dos mesmos podem ser incluídos nos métodos e kits da invenção em quantidades adequadas para também facilitar a tomar uma decisão se o ácido nucleico de um ou mais eventos estiver presente em uma quantidade que justifique quantificação também, ou estiver presente sob um limiar aceitável.
Em um outro desenvolvimento da invenção, é também contem- plado que quaisquer dos iniciadores da invenção, tais como em particular os iniciadores listados em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4 ou variantes ou derivados dos mesmos, possam ser usados em uma estratégia de cami- nhada de genoma para identificar seqüências adjacentes ao dito iniciador no DNA genômico de um evento. Similarmente, é contemplado que qualquer iniciador projetado em base da seqüência de qualquer amplicon da presente invenção, tal como em particular qualquer iniciador localizado dentro ou so- brepondo com quaisquer das seqüências de amplicon SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 78, ou uma variante ou derivado de tal iniciador, pode ser usado em uma estratégia de caminhada de genoma para identificar seqüências adjacentes ao dito amplicon no DNA genômico de um evento.
Este aspecto pode ser particularmente útil onde os métodos de amplificação presentes produzem um amplicon tendo características (por exemplo, comprimento, Tm ou seqüência) que não pode ser de forma não- ambígua atribuído a um evento particular. Em tal situação, a caminhada de genoma do amplicon em questão forneceria a informação de seqüência adi- cional acerca do evento e assim ajudaria a identificar o dito evento. Em mo- dalidades particularmente preferidas, o iniciador específico pode ser deriva- do dos amplicons p35 ou tNOS.
Em geral, estratégias de caminhada de genoma são bem- conhecidas na técnica. Exemplos incluem inter alia PCR reversa ou o méto- do de vectorette de Riley et ai. 1990 (Nucleic Acids Res 18: 2887-90) comer- cializado como Universal Vectorette® System (Sigma), como também simpli- ficações posteriores do mesmo (vide, por exemplo, Kilstrup & Kristiansen 2000. Nucleic Acids Res 28: e55).
Em uma modalidade particular, os inventores contemplam um método de caminhada de genoma de duas etapas. Em uma primeira etapa de amplificação, um iniciador marcado LUX® (ou diferente) da invenção é usado junto com uma mistura de iniciadores aleatórios (em geral cerca de 8 a 15 pb de comprimento), e preferivelmente condições de PCR de gradiente de severidade crescente são usadas. A marcação no iniciador permite seguir se a amplificação envolvendo o iniciador marcado está acontecendo. Em uma segunda etapa de amplificação, uma PCR "nested" é executada usando outro iniciador "nested" do amplicon, preferivelmente outro LUX® ou do con- trário marcado, junto com os ditos iniciadores aleatórios, e preferivelmente em condições de PCR de severidade alta. A marcação no iniciador permite seguir se a amplificação envolvendo o iniciador marcado está acontecendo. Eventualmente, o produto assim obtido é sequenciado, assim identificando as seqüências adjacentes ao amplicon.
Em outros aspectos, a invenção fornece kits de partes para exe- cutar os métodos da presente invenção, isto é, para examinar uma amostra para a presença ou ausência potencial de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica.
Em uma modalidade, um kit de acordo com a invenção pode compreender sondas adequadas para detecção de um ou mais ou todos os ácidos nucleicos listados sob a) - u) acima.
Em uma modalidade, um kit de acordo com a invenção pode compreender iniciadores, preferivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de amplicons de dentro de um ou mais ou todos os ácidos nucleicos listados sob a) - u) como definidos acima.
Em outra modalidade, o kit pode compreender iniciadores, prefe- rivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de um, mais que um, e preferivelmente todos ácidos nucleicos listados sob a) - i) acima.
Em outra modalidade, o kit pode compreender iniciadores, prefe- rivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de um, mais que um, e preferivelmente todos ácidos nucleicos listados sob a) - i), o), p), q) e t) acima.
Em outra modalidade, o kit pode compreender iniciadores, prefe- rivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de um, mais que um, ou todos ácidos nucleicos listados sob a) - c) acima e um, mais que um ou preferivelmente todos ácidos nucleicos listados sob d) - i) acima.
Em outra modalidade, o kit pode compreender iniciadores, prefe- rivelmente pares de iniciadores, adequados para amplificação de um, mais que um, ou todos ácidos nucleicos listados sob a) - c), o), p), q), t) acima e um, mais que um ou preferivelmente todos ácidos nucleicos listados sob d) - i) acima.
Além disso, o kit pode também compreender iniciadores ou pa- res de iniciadores para amplificação de uma seqüência de planta genérica, como descrito em outro lugar neste relatório descritivo.
Será apreciado que os iniciadores e pares de iniciadores para amplificação em vários ácidos nucleicos ensinados aqui podem ser incluídos em kits variadamente projetados, de acordo com a preferência sobre que eventos transgênicos deseja-se detectar.
Em uma modalidade preferida, e levando em conta as várias se- leções de ácidos nucleicos a ser amplificados como debatidos nos parágra- fos precedente, o kit pode compreender um ou mais, ou todos os iniciadores, preferivelmente um, mais que um ou todos os pares de iniciadores, como definido em qualquer uma da Tabela 1 ou Tabela 4, ou variantes ou deriva- dos dos mesmos.
Em uma modalidade particularmente preferida, um ou ambos i- niciadores de qualquer par de iniciadores incluídos no kit podem ser marca- dos.
Em outra modalidade particularmente preferida, qualquer par de iniciadores incluído no kit pode conter pelo menos um, e usualmente um, iniciador marcado com um fluoroforo adequado e projetado para permitir a detecção de tempo real usando o sistema de detecção LUX® acima descrito.
Em uma outra modalidade, o kit pode também compreender produtos de amplificação, por exemplo, clonados e reisolados e possivel- mente compreendidos em plasmídeos ou vetores adequados que podem ser usados como controles positivos e/ou calibradores nos métodos da inven- ção, como explicado acima. Por exemplo, quantidades ou diluições precisa- mente medidas de tais produtos de amplificação, por exemplo, clonados e reisolados e possivelmente compreendidos em plasmídeos ou vetores ade- quados, podem ser providas para tais propósitos. Como explicado acima, várias combinações de tais reagentes podem ser também visadas.
Em uma modalidade particular, o kit pode compreender um, mais que um ou todos os organismos de E. coli como listados na Tabela 5, e/ou plasmídeos obteníveis deles, e/ou inserções isoladas, preferivelmente inserções de EcoRI1 dos ditos plasmídeos, ou combinações dos mesmos.
Em uma outra modalidade, como já explicado, o kit pode tam- bém compreender um portador de dados contendo instruções para um dis- positivo de computação programável executar as ações da etapa (2) dos métodos da invenção.
Compreensivelmente, tais kits podem compreender outros com- ponentes, tais como componentes de hibridação úteis, PCR, detecção etc. Uma pessoa versada apreciará o uso potencial de tais componentes. Em uma modalidade preferida, o kit pode compreender um ou mais compartimentos de reação, por exemplo compartimentos de reação fornecidos dentro de uma tira ou placa de multipoços (formato de multipo- ços), cada compartimento compreendendo uma composição de todos os componentes necessários para uma reação de amplificação de PCR (por exemplo, nucleotídeos, sais, polimerase termoestável etc), e incluindo os pares de iniciadores desejados ou mais (onde multiplexados) como definidos acima, mas não incluindo DNA modelo. Consequentemente, a reação de PCR poderia ser iniciada uma vez o usuário introduzisse um DNA de amos- tra a ser analisado para a dita composição. Opcionalmente, para assegurar estabilidade, Taq ou outra polimerase termoestável pode também ser excluí- da da composição (mas pode ser incluída separadamente no kit), e pode necessitar ser adicionada pelo usuário. Em geral, a composição pode ser líquida, enquanto especialmente para o propósito de remessa e armazena- mento ela pode ser congelada. Porém, as composições Iiofilizadas são tam- bém visadas.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Condições de amplificação para pares de iniciadores seletos lis- tados nas Tabelas 1 e 4
PCR de tempo real com detecção de SYBR Green foi otimizada para amplificação dos amplicons de ácidos nucleicos "p35S", "tNOS", "Cry1Ab", "PAT/Bar", "PAT/pat" e "CP4-EPSPS" usando os respectivos pa- res de iniciadores listados nas Tabelas 1 e 4.
DNA foi isolado dos eventos contendo (controle positivo) ou não contendo (controle negativo) estes ácidos nucleicos, incluindo eventos Bt11, Bt176, MON810, MON40-3-2, TC1507, NK603, MS8/RF3 (vide Tabela 5), usando isolamento de CTAB de material de tecido de folha.
Reações de PCR continham SYBR Green Master Mix (Diageno- de, ref: GMO-GS2X-A300) 1 x, iniciador direto 250 nM, iniciador reverso 250 nM, DNA Modelo 50 ng em volume total de 20 μl. Ciclagem de PCR envol- veu Etapa 1: 1 x [50°C, 120 s]; Etapa 2: 1 x [95°C, 600 s]; e Etapa 3: 40 x [95°C, 15 s, 60°C, 60 s] com aquisição de fluorescência. Applied Biosystems Prism 7700 foi usado. Análise da curva de fundição foi feita em gradiente de 50°C a 95°C por 1200 s.
Para todos os pares de iniciadores, produtos de amplificação específicos foram obtidos como mostrados por uma Tm específica simples e banda simples em eletroforese em gel de agarose. Os ensaios tiveram LOD baixo:
RBCL: iniciadores SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27; Tm = 76,5°C; tamanho = 95 pb; LOD = ± 0,039 ng DNA-alvo
ADH de Zea mays (amplicon mais longo): iniciadores SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; Tm = 79,5°C; tamanho = 138 pb; LOD = ± 0,016 ng DNA-alvo (± 6 genomas haplóides)
ADH de Zea mays (amplicon mais curto): iniciadores SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57; Tm = 75,5°C; tamanho = 83 pb; LOD = ± 0,016 ng DNA-alvo (± 6 genomas haplóides)
ACC de óleo de semente de colza: iniciadores SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 3; Tm = 79°C; tamanho = 103 pb; LOD = ± 0,05 ng DNA-alvo (± 20 genomas haplóides)
Cruciferina de óleo de semente de colza: iniciadores SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25; Tm = 80°C; tamanho = 85 pb; LOD = ± 0,015 ng DNA-alvo (±12 genomas haplóides)
Lectina de soja (amplicon mais longo): iniciadores SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 49; Tm = 81,5°C; tamanho = 178 pb; LOD = ± 0,016 ng DNA- alvo (±13 genomas haplóides)
Soja (lectina): iniciadores SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59 (S- LTM); Tm = 79,5°C; tamanho = 81 pb; LOD = ± 0,063 ng DNA-alvo (± 50 ge- nomas haplóides)
PLD de arroz: iniciadores SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21; Tm = 76,5°C; tamanho = 80 pb; LOD = ± 0,01 ng DNA-alvo (± 20 genomas ha- plóides)
GluA3 de açúcar de beterraba: iniciadores SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 65; Tm = 77°C; tamanho = 118 pb; LOD = ± 0,01 ng DNA-alvo (±13 genomas haplóides) SAH7 de algodão: iniciadores SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 67; Tm = 75,5°C; tamanho = 115 pb; LOD = ± 0,02 ng DNA-alvo (± 9 genomas haplóides)
UGPase de batata: iniciadores SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69; Tm = 81 °C; tamanho = 87 pb; LOD = ± 0,0002 ng DNA-alvo
p35S (amplicon mais longo): iniciadores SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8; Tm = 80,5°C; tamanho = 147 pb; LOD = ± 0,016 ng DNA-alvo (± 6 genomas haplóides)
p35S (amplicon mais curto): iniciadores SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61; Tm = 76°C; tamanho = 75 pb; LOD: RRS 100% ± 0,032 ng DNA- alvo (± 25 genomas haplóides); NK603 5% ± 6,25 ng DNA-alvo (± 62,5 ge- nomas haplóides)
tNOS-L: iniciadores SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29; Tm = 72°C; tamanho = 172 pb; LOD = ± 0,03 ng DNA-alvo (± 25 genomas haplói- des)
tNOS-D: iniciadores SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10; Tm = 72°C; tamanho = 69 pb; LOD = ± 0,03 ng DNA-alvo (± 25 genomas haplói- des)
Cry1Ab: iniciadores SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; Tm = 78,5°C; tamanho = 73 pb; LOD = ± 0,06 ng (+-12 genomas haplóides)
PAT/Bar: iniciadores SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14; Tm = 80°C; tamanho = 69bp; LOD = ± 0,125 ng (± 50 genomas haplóides)
PAT/pat: iniciadores SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16; Tm = 77°C; tamanho = 109 pb; LOD = ± 0,03 ng (± 12 genomas haplóides) CP4-EPSP: iniciadores SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 63; Tm = 80,5 ou 84,5°C; tamanhos = 108 pb; LOD: NK603 5% ± 3,125 ng (± 31 genomas haplóides), RRS 100% ± 0,032 ng (± 25 genomas haplóides), GT73 100% ± 0,016 ng (± 12 genomas haplóides)
CP4-EPSP: iniciadores SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19; Tm = 85°C; tamanhos = 94 pb ou 124 pb; LOD = ± 0,03 ng (± 25 genomas haplóides). Exemplo 2: Método simplificado exemplar de acordo com a invenção
Uma amostra hipotética foi feita acrescentando DNA de Bt176 ao DNA veículo não-relacionado. A amostra foi filtrada para a presença ou ausência de "p35S", "tNOS", "CrylAb", "PAT/Bar", "PAT/pat" e "CP4- EPSPS" usando os métodos de PCR de tempo real do Exemplo 1.
O presente método simplificado pretende concluir a presença ou ausência potencial na amostra de material derivado de Bt176, Bt11 e NK603.
Após testar, a amostra foi positiva para p35S, CryIAb e Pat/Bar, mas não para os outros ácidos nucleicos testados. Consequentemente, a amostra pode ser representada como conjunto GSam e {p35S; CrylAb; Pat/bar}. Neste ensaio exemplar (onde a presença de ácidos nucleicos de Zea mays não é examinada), o evento Bt176 é representado pelo conjunto Gbh76 e {p35S; CrylAb; Pat/bar}, evento Bt11 pelo conjunto GBtn e {p35S; tNOS; CrylAb; Pat/pat} e evento NK603 pelo conjunto GNk603 e {p35S; tNOS; CP4-EPSP}.
Consequentemente, uma vez que Gbti76 = Gsam. o material do evento Bt176 pode estar presente na amostra. Por outro lado, porque Gbh 1 * Gsam e Gbh 1 <t Gsam, o material de evento Bt11 não está presente na amos- tra. Similarmente, porque Gnk603 * GSam e Gnk603 <t Gsam, o material do even- to NK603 não está presente na amostra.
Em uma representação alternativa, Mp35S", "tNOS", "CrylAb", "PAT/Bar", "PAT/pat" e "CP4-EPSPS" são atribuídos os respectivos valores principais Vp35s = 3, VtNos = 5, VcryiAb = 7, VpAT/Bar =11, VpAT/pat = 13 e Vcp^-
EPSPS =17.
Por conseguinte, o conjunto Gsam é atribuído a um valor VGsam que é um múltiplo dos respectivos valores atribuídos aos ácidos nucleicos detectados nele, isto é, VGsam = Vp35s x de Voyí/u, x VpAT/Bar = 231. Além dis- so, o conjunto GBti76 é atribuído um valor VGbh76 que é um múltiplo dos valo- res atribuídos àqueles dos ácidos nucleicos testados que são encontrados no evento Bt176, isto é, VGBh76 = Vp35s x de \fCryiAb x VPAT/Bar = 231. Analo- gamente, o conjunto GBtn é atribuído a um valor VGstn = Vp35s χ VÍA/oS x V- CryiAb x VpAT/pat = 1365; e o conjunto GNk603 é atribuído a um valor VGNk603 = Vp35S X VtNOS X VCP4-EPSP = 255.
Consequentemente, porque VGsamA/Gbh76 - 1, o material do evento Bt176 pode estar presente na amostra. Por outro lado, porque VG- sam/VGbui = 0,169, isto é, não é 1 e não é um número inteiro maior que 1, o material do evento Bt11 não está presente na amostra. Similarmente, porque VGsam/VGnk603 = 0,906, isto é, não é 1 e não é um número inteiro maior que 1, o material do evento NK603 não está presente na amostra. Exemplo 3: Descrição exemplar de um kit de acordo com a invenção (arranjo de placa de 96 poços)
Ácidos nucleicos a serem filtrados: "Zm", "Bn", "Gm", "p35S", "tNOS", "CP4-EPSPS", "CrylAb", "PAT/bar", "PAT/pat" como definidos aci- ma usando pares de iniciadores como definidos na Tabela 1 acima, como também gene de planta genérica amplificado usando par de iniciadores SEQ ID NO: 26 e 27 (Tabela 4).
Opcionalmente, tal como na solicitação, o kit pode também in- cluir marcadores de taxonomia para arroz ("Or"), algodão ("Gs"), açúcar de beterraba ("Bv") e/ou batata ("St"), usando os pares de iniciadores corres- pondentes como definidos na Tabela 1.
Condições operacionais dos métodos de Q-PCR de SYBR Green
Reagentes: SYBR Green PCR Master Mix incluindo a HS Taq- polimerase; iniciadores 20 μΜ; água livre de nuclease
Equipamento: ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, Sistema de PCR de Tempo Real 7300, fluxo Laminar, Pipetas 20, 200 et 1000 μΙ, Pontas das pipetas estéreis, resistentes a aerossol, placas de rea- ção de 96 poços ópticas, tampas ópticas
Protocolo: A PCR é conduzida em um ABI PRISM® 7700 Se- quence Detection System ou o Sistema de PCR de Tempo Real 7300 se- guindo as instruções do fabricante. Um programa de PCR geral é usado.
Preparação da Mistura de PCR: A Mistura de PCR contém todos os componentes de uma reação de PCR exceto o DNA modelo. Esta opera- ção é realizada em um fluxo laminar que é apenas usado para este tipo de operação. Tabela 6: Mistura de reação para filtragem de Q-PCR
<table>table see original document page 86</column></row><table>
Preparação do DNA: O DNA modelo é extraído usando um mé- todo de extração de DNA de CTAB padrão e a concentração de DNA é me- dida por determinação de fluorescência de picogreen.
Arranjo de PCR: O arranjo de PCR é realizado em um fluxo la- minar. Os modelos de DNA e a Mistura de PCR são combinados em com- partimentos diferentes.
Operação de PCR: A PCR será conduzido seguindo as instru- ções do fabricante como descritas no Manual do Usuário.
As Condições do Ciclizador Térmico são listadas abaixo na Tabela 7.
Tabela 7: Condições Operacionais do Termociclizador
<table>table see original document page 86</column></row><table>
Subseqüentemente uma análise da "curva de fundição" é execu- tada usando um programa-padrão (por exemplo, fundição gradual 50°C a 95°C e monitoramento para diminuição da fluorescência) Configuração da Placa de 96 poços com filtragem de GMO para produtos de alimentos/ração
Abaixo é descrito o arranjo incluindo todos os marcadores de a- limentos/ração gerais, o marcador de arroz (detecção de eventos de arroz sem autorização) e o marcador de Transcriptase Reversa de CAMV (ausên- cia de controle de CaMV).
Arranjo da placa-96:
<table>table see original document page 87</column></row><table>
Controles positivos (+) seriam os amplicons correspondentes (plasmídeos ou inserções) como descritos aqui em particular nos ampli- cons da Tabela 5 em um certo número de cópias (por exemplo 100 có- pias/poço)
Seria tecnicamente previsto que os poços de amostra pudessem ser abertos seqüencialmente (por exemplo primeiro os controles positivos, depois as amostras, e último os controles NTC e negativos).
Os valores Ct e valores Tm para cada poço são registrados e usados na análise de decisão para determinação do conjunto Gm presente nas respectivas amostras.
Note que em princípio também cada fileira poderia ser produzida separadamente em um arranjo alternativo (por meio do qual flexibilidade aumentada pelo cliente é alcançada).
Exemplo 4: Multiplex PCR de p35S. tNOS
O presente exemplo mostra amplificação de multiplex PCR e- xemplar dos amplicons p35S e tNOS, em que a detecção é feita por SYBR Green e os produtos de amplificação são distinguidos em base de uma dife- rença em suas temperaturas de fundição (Tm).
Pares de iniciador usados (20 μΜ):
p35S: SEQ ID NO: 60 e 61
tNOS: SEQ ID NO: 9 e 10
Modelo (50 ng): Roundup Ready Soybean (RRS) 100% (controle positivo duplo)
Programa de PCR: 95°C 10', (95°C 15", 60°C 1') x 40 ciclos Programa de fundição: 50°C a 95°C em 20' Multiplexação dos métodos de PCR p35S e tNOS em SYBR Green é possível uma vez que ambos os amplicons são distinguíveis graças à Tm diferente (vide Figura 2). Assim é possível adquirir informação com uma PCR na presença de dois alvos diferentes que são p35S e tNOS. Exemplo 5: Possibilidades de multiplexação adicionais ao usar SYBR Green Experimentos análogos àqueles do exemplo 4 também definiram a viabilidade das combinações de multiplexação a seguir:
1. Adh-1 de milho (SEQ ID NO: 56 e 57) com SLTM de soja (SEQ ID NO: 58 e 59)
2. Adh-1 de milho (SEQ ID NO: 56 e 57) com cruciferina de óleo de semente de colza (SEQ ID NO: 24 e 25)
3. SLTM de soja (SEQ ID NO: 58 e 59) com sah-7 de algodão (SEQ ID NO: 66 e 67)
4. sah-7 de algodão (SEQ ID NO: 66 e 67) com cruciferina de óleo de semente de colza (SEQ ID NO: 24 e 25)
Exemplo 6: Parâmetros de PCR de tempo real usando os iniciadores da in- venção
Reações usando condições e iniciadores como definidos no e- xemplo 1 foram executadas em um número de cópia definido de plasmídeos de referência contendo as respectivas inserções de amplicon, e fluorescên- cia relativa (RFU) seguindo 40 ciclos (isto é, próximo ou tendo alcançado o planalto) foi determinada. Os resultados na Tabela 8 (os resultados usando +/- 8300 cópias modelos são também graficamente representados na Figura 3) mostram que os presentes métodos e iniciadores são capazes de gerar valores de RFU em planalto de pelo menos 2500, que fica dentro de uma margem de 3 vezes.
Tabela 8
<table>table see original document page 89</column></row><table> <table>table see original document page 90</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Scientific institute of Public Health (IPH) <120> Detecção de Evento de Planta Transgênica <130> IPH-OOl-EP-Prio2 <150> EP 07447008.9 <151> 2007-01-29 <150> EP 07108343.0 <151> 2007-05-16 <160> 55
<170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> lniciador: Zea Mays (adh-1)
<400> 1
cgtcgtttcc catctcttcc tcc
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> lniciador: Zea Mays (adh-1)
<400> 2
ccactccgag accctcagtc
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> lniciador: Brassica napus (ACC) <400> 3
ggcgcagcat cggct 15
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> lniciador: Brasicca napus (ACC)
<400> 4
gagaatgagg aggaccaagc tc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> lniciador: Glycine max (Iectina)
<400> 5
cattacctat gatgcctcca cc 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> lniciador: Glycine max (Iectina)
<400> 6
aagcacgtca tgcgattc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> lniciador: promotor 35S do virus do Mosaico de Cou- ve-flor <400> 7
gacagtggtc ccaaagatgg 20
<210> 8 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador: promotor 35S do virus do Mosaico de Cou- ve-flor <400> 8
gtcttgcgaa ggatagtggg 20
<210> 9 <211> 28 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador: terminador 3' do gene de nopalina sinte-
tase de Agrobacterium tumefaciens (TNOS-D) <400> 9
gattagagtc ccgcaattat acatttaa 28
<210> 10 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador: terminador 3' do gene de nopalina sinte-
tase de Agrobacterium tumefaciens <400> 10
ttatcctagk ttgcgcgcta tattt 25
<210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> lniciador: CrylAb de Bacillus thuringiensis <400> 11 accggttaca ctcccatcga 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> lniciador: CrylAb de Bacillus thuringiensis <400> 12 cagcacctgg cacgaactc 19 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> lniciador: gene de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) bar de Streptomyces hygroscopicus <400> 13 cgtcaaccac tacatcgaga caa 23 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> lniciador: gene de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) bar de Streptomyces hygroscopicus <400> 14 gtccactcct gcggttcct 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> iniciador: gene de fosfinotricina acetiltransferase
(PAT) pat de Streptomyces viridochromogenes <400> 15
ccgcggtttg tgatatcgtt 20
<210> 16 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> iniciador: gene de fosfinotricina acetiltransferase
(PAT) pat de Streptomyces viridochromogenes <400> 16
tcttgcaacc tctctagatc atcaa 25
<210> 17 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador: gene de 5-Enol-piruvilchiquimato-3-fosfa-
to sintase EPSPS de Agrobacterium sp. CP4 <400> 17
ggctctgagc ttcgtcctcc taagg 25
<210> 18 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220> <223> iniciador: gene de 5-Enol-piruvilchiquimato-3-fosfa-
to sintase EPSPS de Agrobacterium sp. CP4 <400> 18
atcagtggct acagcctgca t 21
<210> 19 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> iniciador: gene de 5-Enol-piruvilchiquimato-3-fosfa-
to sintase EPSPS de Agrobacterium sp. CP4 <400> 19
gaatgcggac ggttccggaa ag 22
<210> 20 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador: Oryza sativa <400> 20
gcttagggaa cagggaagta aagtt 25
<210> 21 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> iniciador: Oryza sativa <400> 21
cttagcatag tctgtgccat cca 23
<210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador: gene de 5-Enol-piruvilchiquimato-3-fosfa- to sintase EPSPS de Agrobacterium sp. CP4
<400> 22
gcatgcttca cggtgcaa 18
<210> 23 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> iniciador: gene de 5-Enol-piruvilchiquimato-3-fosfa- to sintase EPSPS de Agrobacterium sp. CP4
<400> 23
ggacctgtgg gagatagact tgtc 24
<210> 24 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> iniciador: Brassica napus (cruciferina) <400> 24
cagctcaaca gtttccaaac ga 22
<210> 25 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador: Brassica napus (cruciferina) <400> 25
cgaccagcct cagccttaag 20
<210> 26 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> iniciador: planta genérica (Rbcl) <400> 26
aggtctaadg grtaagctac 20
<210> 27 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> iniciador: planta genérica (Rbcl) <400> 27
agycttgatc gttacaaagg 20
<210> 28 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador: terminador 3' do gene de nopalina sinte-
tase de Agrobacterium tumefaciens (TNOS-L) <400> 28
cgttcaaaca tttggcaata aag 23
<210> 29 <211> 26 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> iniciador: terminador 3' do gene de nopalina sinte-
tase de Agrobacterium tumefaciens (TNOS-L) <400> 29 aaatgtataa ttgcgggact ctaatc 26
<210> BO <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> lniciador: CrylAb de Bacillus thuringiensis <400> 30
gacatcatct ggggyatctt 20
<210> 31 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> lniciador: CrylAb de Bacillus thuringiensis <400> 31
gcgctgttca tgtcgttgaa 20
<210> 32 <211> 166 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea Mays WT <400> 32
gaattcgagc tcggtacccg gggtatccgt cgtttcccat ctcttcctcc tttagtagct 60 accactatat aaatcagggc tcattttctc gctcctcaca ggctcatctc gctttggatc 120 gattggtttc gtaactggtg agggactgag ggtctcggag tgggtc 166
<210> 33 <211> 216 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220> <223> Amplicon de Glycine max WT <400> 33
gaattgcgcc cttcattacc tatgatgcct ccaccaacct cttgtgttgc ttctttggtt 60 catccttcgc agagaagcag ctatatcctc tccggatgtg gtcgatttga agacttctct 120 tcccgãgttg gggggttgag gataggggtt ctcgtgcgtg ccacgtggga ctcgacatag 180 cctggggaat cgcatgacgt gcttaagggc gaattc 216
<210> 34 <211> 179 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea mays BTll, amplificado usando inici- adores do promoter 35S do Virus do Mosaico de Couve- flor <400> 34
gctcgaattc gcccttgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggaacatcgt 60 ggaagaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac 120 tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacaagggcg aattcgtaa 179 <210> 35 <211> 100 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Glycine max 40-3-2, amplificado usando os iniei adores do terminador 3' do gene de nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens <400> 35
gctcgaattc gccctttatc ctaggttgcg cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa 60 atgtataatt gcgggactct aatcaagggc gaattcgtaa 100
<210> 36 <211> 98 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Glycine max 40-3-2, amplificado usando os iniciadores do terminador 3' do gene de nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens <400> 36
gctcgaattc gcccttacgc cttcctggtg caaatcgagc agctcatcaa ccagaggatc 60 gaggagttcg ccaggaacca ggaagggcga attcgtaa 98
<210> 37 <211> 105 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea Mays Btl76, amplificado usando os
iniciadores de CrylAb de Bacillus thuringiensis <400> 37
gctcgaattc gcccttaccg gttacactcc catcgacatc tccctctccc tcacgcagtt 60 cctgctcagc gagttcgtgc caggtgctga agggcgaatt cgtaa 105
<210> 38 <211> 105 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea Mays Btll, amplificado usando os
iniciadores de CrylAb de Bacillus thuringiensis <400> 38
gctcgaattc gcccttcagc acctggcacg aactcgctga gcagaaactg tgtcaaggac 60 aaggagatgt cgatgggagt gtaaccggta agggcgaatt cgtaa 105
<210> 39 <211> 101 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea Mays ΒΤ176, amplificado usando os iniciadores do gene de fosfinotricina acetiltransfe- rase (PAT) pat de Streptomyces hygroscopicus <400> 39
gctcgaattc gcccttcgtc aaccactaca tcgagacaag cacggtcaac ttccgtaccg 60 agccgcagga accgcaggag tggacaaggg cgaattcgta a 101
<210> 40 <211> 141 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea Mays BTll, amplificado usando os i- niciadores do gene de fosfinotricina acetiItransfe- rase (PAT) pat de Streptomyces viridochromogenes <400> 40
gctcgaattc gcccttccgc ggtttgtgat atcgttaacc attacattga gacgtctaca 60 gtgaacttta ggacagagcc acaaacacca caagagtgga ttgatgatct agagaggttg 120 caagaaaggg cgaattcgta a 141
<210> 41 <211> 127 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea Mays BTll, amplificado usando os
iniciadores de planta genérica (Rbcl) <400> 41
gctcgaattc gcccttaggt ctaaggggta agctacataa cagatatatt gatctgggtc 60 cccaggaacg ggctcgatgt gatagcatcg tcctttgtaa cgatcaaggc taagggcgaa 120 ttcgtaa 127
<210> 42 <211> 127 <212> <213> <220> <223>
DNA
Seqüência Artificial
Amplicon de Zea mays OSR wt, amplificado usando os iniciadores de planta genérica (Rbcl) <400> 42
gctcgaattc gcccttaggt ctaaggggta agctacatac gcaataaatt gagtttcttc 60 tcctggaacg ggctcgatgt ggtagcatcg tcctttgtaa cgatcaaggc taagggcgaa 120
ttcgtaa <210> <211> <212> <213> <220> <223>
127
43 205
DNA
Seqüência Artificial
Amplicon de BTll Zea Mays, amplificado usando os iniciadores do terminador 3' do gene nopalina sinte- tase dê Agrobacterium tumefaciens <400> 43
gctcgaattc gcccgttaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat 60 aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta 120 tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat 180 gtttgaacga agggcgaatt cgtaa 205
<210> 44 228 DNA
Seqüência Artificial
<211> <212> <213> <220> <22 3> <400>
Amplicon de Brassica napus 44
gctcgaattc gcccttggcg cagcatcggc tcttctgcat agtaccgttt ctccatcgac 60 caatggaacg aatgtctaat aggtgttcgt ccttcatctc gctcgattat acagctcacc 120 acacccacac ctgcggaaca caggctcgaa ctaacttctt cctctttgag aattttctcc 180 actctttctt gagcttggtc ctcctcattc tcaagggcga attcgtaa 228
<210> 45 <211> 123 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea mays 40-3-2, amplificado usando os
iniciadores de CP4-EPSP <400> 45
ctcgaattcg cccttgaatg cggacggttc cggaaaggcc agaggatttg cgggcggttg 60 cgggccggct gcttgcaccg tgaagcatgc aggctgtagc cactgataag ggcgaattcg 120 taa 123
<210> 46 <211> 156 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Zea mays NK603, amplificado usando os
iniciadores de CP4-EPSP <400> 46
gctcgaattc gcccttggct ctgagcttcg tcctcctaag gtcatgtctt ctgtttccac 60 ggcgtgcatg cttcacggtg caagcagccg gcccgcaacc gcccgcaaat cctctggcct 120 ttccggaacc gtccgcattc aagggcgaat tcgtaa 156
<210> 47 <211> 18 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> lniciador: CrylAb de Bacillus thuringiensis <400> 47
acgccttcct ggtgcaaa 18
<210> 48 <211> <212> <213> <220> <223> <400>
19 DNA
Seqüência Artificial
lniciador: CrylAb de Bacillus thuringiensis 48
cctggttcct ggcgaactc <210> 49 19 DNA
Seqüência Artificial
19
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
Glycine max (Iectina) 49
15 aagcacgtca tgcgattcc
19
<210> <211> <212> <213> <220> <223>
50 25 DNA
Seqüência Artificial
lniciador: gene de 5-Enol-piruviIchiquimato-3-fosfa- to sintase EPSPS de Agrobacterium sp CP4 <400> 50
ggctctgagc ttcgtcctct taagg 25
<210> 51 24 DNA
Seqüência Artificial
<211> <212> <213> <220> <223> <400>
lniciador: Oryza sativa 51
gcttagggaa cagggaagta aagt
24 <210> 52 <211> 112 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de arroz tipo selvagem, amplificado usando
os iniciadores do gene de fosfolipase D
<400> 52
gctcgaattc gcccttgctt agggaacagg gaagtaaagt tgaatggtga gtatgaacct 60 gcaggtcgcc ctttggatgg cacagactat gctaagaagg gcgaattcgt aa 112
<210> 53 <211> 136 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Soja Roundup-Ready, amplificado usando
os iniciadores de DP4-EPSP
<400> 53
gctcgaattc gcccttggac ctgtgggaga tagacttgtc gccgggaatg cggacggttc 60 cggaaaggcc agaggatttg cgggcggttg cgggccggct gcttgcaccg tgaagcatgc 120 aagggcgaat tcgtaa 136
<210> 54 <211> 136 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Amplicon de Brassica napus GT73, amplificado usando
os iniciadores de CP4-EPSP
<400> 54
gctcgaattc gcccttggac ctgtgggaga tagacttgtc acctggaata cggacggttc 60 cagaaagacc agaggactta cgagcagttg ctggacggct gcttgcaccg tgaagcatgc 120 aagggcgaat tcgtaa 136 <210> 55
<211> 117
<212> DNA
<21Β> Seqüência Artificial
<220>
<223> Amplicon de Brassica napus GT73, amplificado usando os iniciadores de cruciferina
<400> 55
gctcgaattc gcccttcagc tcaacagttt ccaaacgagt gccaactaga ccagctcaat 60 gcgctggagc cgtcacacgt acttaaggct gaggctggtc gaagggcgaa ttcgtaa 117
Claims (27)
1. Método para examinar uma amostra para a presença ou au- sência de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica compreendendo as etapas de: (1) detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nu- cleicos compreendendo: - um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados de: a) "Zm": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Zea mays, preferivelmente Zea mays ssp. mays, b) "Bn": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Brassica napus, c) "Gm": um ácido nucleico derivado e específico para taxono- mia de Glycine max, o) "Or": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Oryza sativa, p) "Bv": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Beta vulgaris, q) "Gs": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Gossypium, e t) "St": um ácido nucleico derivado e específico para taxonomia de Solanum tuberosurrr, e - um, mais que um ou todos ácidos nucleicos selecionados de: d) "p35S": um ácido nucleico derivado do promotor 35S do Vírus do Mosaico de Couve-flor, e) "tNOS": um ácido nucleico derivado do terminador de 3' do gene de nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens, f) "CrylAb": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais CryIAb de Bacillus thuringiensis, g) "PAT/bar": um ácido nucleico derivado do gene de fosfinotrici- na acetiltransferase (PAT) bar de Streptomyces hygroscopicus, h) "PAT/pat": um ácido nucleico derivado do gene de fosfinotrici- na acetiltransferase (PAT) pat de Streptomyces viridochromogenes, i) "CP4-EPSPS": um ácido nucleico derivado do gene de 5-Enol- piruvilchiquimato-3-fosfato sintase EPSPS de Agrobacterium sp. CP4; e (2) concluir a presença ou ausência na amostra do material deri- vado de um ou mais eventos de planta transgênica selecionados do grupo compreendendo: eventos Bt176, Bt11, BtIO1 MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, GA21, DAS-59122, MIR604, LY038, MON88017, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/ 90pHoe6/Ac, OXY235, cruzamentos dos mesmos incluindo MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, e eventos relacionados dos mesmos; eventos MON 40- 3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, cruzamentos dos mesmos, e even- tos relacionados dos mesmos, eventos LL62, LL06 e LL601, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; eventos T120-7, H7-1 e A5-15, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; e- ventos LL algodão 25, MON 1445, MON 531, MON15985, cruzamentos dos mesmos, e eventos relacionados dos mesmos; e evento EH92-527-1 e even- tos relacionados dos mesmos, em que na etapa (1) a presença ou ausência dos ácidos nuclei- cos em uma amostra é detectada usando amplificação de PCR1 preferivel- mente amplificação de PCR de tempo real, usando os respectivos pares de iniciadores da tabela a seguir, ou variantes ou derivados dos ditos pares de iniciadores: <table>table see original document page 109</column></row><table> <table>table see original document page 110</column></row><table>
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa (1) envolve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo todos os ácidos nucleicos listados sob d) - i).
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa (1) envolve detectar a presença ou ausência na amostra de ácidos nucleicos compreendendo todos os ácidos nucleicos listados sob a) - c) e d) - i).
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, - em que a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico j) "mCry3A": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais modificado Cry3A de Bacillus thu- ringiensis; e/ou - em que a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de um ou ambos ácidos nucleicos k) "cordapA": um ácido nucleico derivado do gene de di-hidrodipicolinato sintase insensível à Iisina (cDHDPS) cordapA de Corynebacterium glutamicum e/ou I) "Glb1": um ácido nucleico derivado do promotor Glbl de milho; e/ou - em que a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleíco m) "Cry3Bb1": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais Cry3Bb1 de Bacillus thuringiensis; e/ou - em que a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico n) "Bxn": um ácido nucleico deri- vado do gene de nitrilase Bxn de Klebsiella pneumoniae spp. ozaenae; e/ou - em que a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de um ou ambos dos ácidos nucleicos r) "CrylAc": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais CryIAc de Bacil- lus thuringiensis e/ou s) "Cry2Ab2": um ácido nucleico derivado do gene de proteína de cristais Cry2Ab2 de Bacillus thuringiensis; e/ou - em que a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de ácido nucleico u) "GBSS": um ácido nucleico de- rivado do gene amido sintase ligada ao grânulo Gbss de Solanum tubero- sum.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a etapa (1) também compreende detectar a presença ou ausência na amostra de um ácido nucleico derivado de planta genérica, preferivelmen- te derivado da subunidade pequena cloroplástica do gene Rubisco ou do gene CHL-tRNA sintetase.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a presença ou ausência do dito ácido nucleico derivado de planta genérica é detectada usando amplificação de PCR, preferivelmente amplificação de PCR de tem- po real, usando o par de iniciadores 5' AGGTCTAADGGRTAAGCTAC 3' (SEQ ID NO: 26) e 5' AGYCTTGATCGTTACAAAGG 3' (SEQ ID NO: 27), ou variante ou derivado do dito par de iniciadores.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que os produtos de amplificação são detectados usando um método de detecção que é substancialmente seqüência não-específico, preferivel- mente usando uma tintura fluorescente de ligação de DNA, mais preferivel- mente usando SYBR Green ou PicoGreen.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -7, em que a especificidade dos produtos de amplificação é também verifica- da, preferivelmente usando análise de curva de fundição (Tm) e/ou determi- nação de tamanho através de eletroforese em gel.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em que os produtos de amplificação são detectados por meio de uma marcação de fluoroforo presente em pelo menos um iniciador do par de ini- ciadores, tal como usando tecnologia de Light Upon Extention (LUX®).
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -9, em que a amostra compreende plantas ou partes das mesmas, incluindo flores, tépalas, pétalas, sépalas, anteras, pólen, sementes, frutas, pericarpo, vagens, folhas, petíolos, talos, raízes, rizomas, estolhos, tubérculos ou bro- tos, ou porções dos mesmos, células de planta, protoplastos de planta e/ou tecidos de planta, e/ou material derivado de planta, preferivelmente material de alimento ou ração, incluindo material processado de alimento ou ração.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -10, em que na etapa (1) a presença ou ausência dos ácidos nucleicos em uma amostra é detectada usando amplificação de PCR, preferivelmente am- plificação de PCR de tempo real, usando os respectivos pares de iniciadores da tabela a seguir, ou variantes ou derivados dos ditos pares de iniciadores: <table>table see original document page 112</column></row><table> <table>table see original document page 113</column></row><table>
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a etapa (2) compreende as etapas de: (i) definir um conjunto "GSam" consistindo em ácidos nucleicos detectados na etapa (1) como estando presentes na amostra; (ii) definir um ou mais conjuntos de interesse ("Gx") escolhidos do grupo de conjuntos compreendendo ou consistindo em conjuntos "Getne", IlO Il II/-» Il Iip Il Iip Il H/"N Il Iip Il ΙΙΛ || || fJBtH ι fjBtIO , OM0N8W , ^MON863 , ^jTC1507 , ^NK603 , ^Τ25 . , Iip Il IIO Il IIfN 11 Iip Il Iip Il Iip Il Ilp II Iip Il V3DAS-59122 , ^MIR604 . LY038 , MON88017 , fJTopas 19/2 ■ fjMSI ■ fjRFI , fjRF2 , Iip Il Iip Il Iip Il lip Il Iip Il Iip Il Iip Il Ilp fjMSIZRFI , fjMS1/RF2 . fjMSB , fjRFS , fjMS8/RF3 , VJQT73 . ^Τ45 , fjLiberator pHo- Il Iip Il Iip II. Iip Il Ilp Il Iip Il Iip e&Ac I fJGS40/90pHoe6/Ac , JOXY235 ■ ^ΜΟΝ40-3-2 , ^MON89788 , A2704-12 , JAS547- ^n Il Iip Il Iip Il Iip Il Iip Il Iip H Iip Il IIP Il IU 127 , «LL62 , fjLLOe , fjLLeOI , fJT120-7 . fjW-I , fjAS-IS > fjLL cotton 25 , "G MON1445, "G mon53i", "Gmoni5985" e "G EH92-527-"', correspondendo aos respec- tivos um ou mais eventos de planta transgênica de interesse ("X') escolhidos do grupo compreendendo ou consistindo em eventos Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, TC1507, NK603, T25, A21, DAS-59122, MIR604, LY038, MON88017, Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, MS1/RF1, MS1/RF2, MS8, RF3, MS8/RF3, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235; MON40-3-2, MON89788, A2704-12, A5547-127, LL62, LL06, LL601, T120-7, H7-1, A5-15, LL algodão 25, MON1445, MON531, MON15985 e EH92-527-1, em que: - Ge»76 e {Zm; p35S; CryIAb; PAT/bar}, - Get11 e {Zm; p35S; tNOS; CryIAb; PAT/pat}, - Gbmo e {Zm; p35S; tNOS; CryIAb; PAT/pat}, - Gmonsio e {Zm; p35S; tNOS; CrylAb}, - Gmon863 e {Zm; p35S; tNOS}, - Gtciso7 e {Zm; p35S; PAT/pat}, - Gnk603 e {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, - Gt25 e {Zm; p35S; PAT/pat}, - Gga2i e {Zm; tNOS}, - Gdas-59122 e {Zm; p35S; PAT/bar}, - G/w/r604 ξ {Zm; tNOS; mCry3A}, ou Gmir604 e {Zm; tNOS} - Gly038 e {Zm; p35S; tNOS; cordapA; Glb1}, ou Glyo38 e {Zm; p35S; tNOS}, - GMON88017 e {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS; Cry3Bb1}, ou GMON88017 e {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, - Gropas 19/2 e {Bn; p35S; PAT/pat}, - GMS1 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, - GRF1 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, - Grf2 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, - Gmsi/rfi e {Bn; tNOS; PAT/bar}, - Gmsizrf2 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, - G/MSS e {Bn; tNOS; PAT/bar}, - Grf3 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, - gMs8/rf3 e {Bn; tNOS; PAT/bar}, - Ggt73 e {Bn; CP4-EPSPS}, - G745 e {Bn; p35S; PAT/pat}, - GLiberatorpHoee/Ac e {Bn; p35S; PAT/pat}, - GGs40/90pHoe6/Ac e {Bn; p35S; PAT/pat}, - Goxy235 e {Bn; p35S; Bxn}, ou G0xy235 e {Bn; p35S}; - Gmon4Q-3-2 e {Gm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, - Gm0n89788 e {Gm; CP4-EPSPS} - GA2704.12 e {Gm; p35S; PAT/pat}, - GAS547-127 e {Gm; p35S; PAT/pat}, - Gll62 € {Or; p35S; PAT/bar}, - Gll06 € {Or; p35S; PAT/bar} - GLL601 € {Or; p35S; tNOS; PAT/bar}, - GT120-7 € {Bv; p35S; PAT/pat}, - GH7-1 € {Bv; p35S; CP4-EPSPS}, - GA5-15 € {Bv; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, - GLL C0tt0n 25 € {Gs; p35S; tNOS; PAT/bar}, - GMONU45 e {Gs; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, - Gmons3I e {Gs; p35S; tNOS; crylAc}, ou Gmon531 e {Gs; p35S; tNOS} - Gmoni5985 e {Gs; p35S; tNOS; crylAc; cry2Ab2} ou Gmon1598S e {Gs; p35S; tNOS}, e - GEH92-527-1 e {St; tNOS; Gbss} ou GEH92-527-i e {St; tNOS}; (iii) executar para cada conjunto de interesse Gx operações lógi- cas: - se Gx for igual a Gsam (Gx = Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra; - se Gx for um subconjunto apropriado de Gsam (Gx c Gsam), então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cru- zamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmen- te presente na amostra; - se Gx não for igual a Gsam e Gx não for um subconjunto apro- priado de Gsam, (Gx φ Gsam e Gx <2 Gsam). então o material derivado do e- vento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que se Gx for igual a Gsam. e se nenhum conjunto ou a soma de dois ou mais conjuntos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em Getne, Getu, G Bt10, GmON810, GmON863, Gtc1507, GnK603, Gt25, G QA21, G DAS-59122, GmiR604, GLY038, GMON88017,GTopas 19/2, GMS1, GRF1, GRF2, GMS1/RF1, GMS1/RF2, GMS8. GRF3, GMS8/RF3, GqT73, G745, Guberator pHoe6/Ac, GGS40/90pHoe6/Ac, GOXY235, GmON40-3-2, GMON89788, GA2704-12, GA5547-127, GLL62, GLL06, GLL601, GT120-7, GH7-1, GA5-15, GLL cottori 25, Gmonu4s, Gmon53u Gmoni5985 diferente de Gx for igual a Gx, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, estará presente na amostra.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, em que ácidos nucleicos selecionados do grupo compreendendo ou consistindo em "Zm", "Bn", "Gm", "p35S", "tNOS", "CrylAb", "PAT/bar", "PAT/pat", "CP4-EPSPS", "mCry3A", "cordap A", "Glb1", "Cry3Bb1", "Bxn", "Or", "Bv", "Gs", "CrylAc", "Cry2ab2", "St" e "Gbss" são atribuídos os respectivos valores únicos "VZm", "Vsrt", "Vem", "Vp35s", "Vf/vos"ι Cry 1 Ab", "VpAT/ba", "VPAT/pat", "VCP4-EPSPS", "Vm- Cry3À\ "Vcordap A, "VGIb", "VCry3Bb1", "VBxn", "vor", "^Bv", "Vgs", "V CrylAc", "V- Cry2ab2, "Vst" e "N/W,"; em que cada conjunto de interesse Gx é atribuído um valor "VGx" escolhido do grupo compreendendo, consistindo em valores "VGst176. "VGBt1l", "VGsfío", "VGMON8lÒ\ "VGMON863, "VGTC1507", "VGa/K603", "V"Gr25". "VGg^2í", "VGdAS-59122" 1 "VG/w/R60411, "VG/.yo3s", "VGmC)N88017\ "VGropas 79/2", "VGms/', "VGrp/', "VGrf2", "VG^sí/rfí", "VGMSURF2 , "VGMSS", "VGRF3", ''VGMS8/RF3'ι "VGg773", "VG745"· "VGLiberator pHoe6/Ac\ "VGGS40/90pHoe6/Ac", "VGoxy235". "VGMON40-3-2, "VGmON89788 , "VGA2704-12 , "VGa5547-127", "VGllO?", "VGllo6", "VGll6oi", "VGti20-7", "VGh7-i\ "VGas-ís", "VGll cotton 25 , "VG/wowms", "\/Gmon53i" , "VG moni5985% e "VG eh92-527-", em que: - VGetI76 = VZm x Vp35S x VcryIAb x VpAT/bar, - VGbm = Vzm Χ Vp35S x V/WOS x VcrylAb x VpAT/pat, - VGbuo = vzm x vp3ss x vwos x vcryiab x vpat/pat, - VGmON810 = VZm x Vp35S x VfWOS x VcrylAb, - VG/WOA/863 = Vzm x VP35S x VfWOS, - vgtci507 = vzm x vp35s x vpat/pat, - VG/VK603 = Vzm x Vp35S x Vf/vos x VcP4-EPSPS, - VG725 = Vzm x Vp35S x VρAVpaU - VGga21 = νzm x vtnost - VGdAS-59122 = Vzm x Vp35S x VpAT/bar, - VGmIR604 = Vzm x ViWOS x VmCry3A, OU VGmIR604 ~ Vzm x VtNOS, - VGly038 = Vzm x Vp35S x ViWOS x VcordapA x Vq/ò7, OU VGlY038 = Vzm x Vp35s x Vf NOS, - VGMON88OI7 = Vz/77 x Vp35S x VfWOS x VqP4-EPSP x Vcry3Bb1, OU VGmON88017 = Vzm x Vp35S x VfNOS x VcP4-EPSP, - VGropas 19/2 = Ven x VP35S x VpAT/pat, - VGMSI = Ven x ViWos x VpAT/bar, - VGrfi = Ven x Vfwos x vpat/bar, - VGre2 ~ VBn x VfWOS x VpAT/bar, - VG/WSS = Ven x VfWOS x VpAT/bar, - VGRF3 - VBn x VfWOS x VpAT/bar, - VGmS1/RF1 = VBn x VfWOS x VpAT/bar, - VGMS1/RF2 = Ven x VfWOS x VpAT/bar, - VGms8/RF3 = VBn x VfWOS x vpat/bar, - VG G773 = VB/7 χ VCP4-EPSPS, - VG745 = Vgn X Vp35S χ VpAT/pat, ~ VGLiberatorpHoe6/Ac = VBn x Vp35S x VpAT/pat, - VGGS40/90pHoe6/Ac = Ven x Vp35s x VpAT/pat, - VGoXY235 ~ VBn x Vp35S x Vsxn, OU VGox/235 = ^Bn x Vp35S, " VGMON40-3-2 = Vg/π x Vp35s x V/a/os x VcP4-EPSPS, - VGMON89788 = ^Gm x VcP4-EPSPS, - VGa2704-12 ~ Vcm x VP35S x VpAT/pat, ~ VGA5547-127 = Vgm x Vp35S x VpAT/pat, - VG/.L62 = Vor x VP35S x VpAT/bar, - VGll06 = Vor x VP35S x vpat/bar, ~ VGL/.60í = Vo x Vp35S x VfNOS x VpAT/bar, - VG7720-7 = Vbv x Vp35S x VPAT/pat, - VGh7-1 = Vev x Vp35s x VcP4-£psps, - VGa5-15 = Vb1/ x Vp35S x Ví/vos x VcP4-EPSPS, -VGll cotton 25 ~ VGs x Vp35S x VtNOS x VpAT/bar, ~ VGmON1445 = VQs x Vp35S x Vf/\/OS x VcP4-EPSPS, - VGmON531 = VGs x VP35S x Vf/vos x VQrylAc, OU VGMON531 = Vgs x Vp35S x VtNOS, ~ VGmonI5985 = Vqs x Vp35S x Vf/vOS x VcrylAc x Vcry2Ab2, OU VGMON15985 = Vgs x Vp35S x VtNOSi - e VGEH92-527-1 = Vst x VfNOS x Vgí)ss. OU VGEH92-527-1 = Vst x VfNOSt e em que o conjunto Gs>a/ií é atribuído um valor "VGsam" que é um múltiplo dos valores únicos atribuídos aos ácidos nucleicos detectados na etapa (1) como estando presente na amostra; e em que a etapa (iii) compreende executar para cada conjunto de interesse Gx operações lógicas: - se VGsamNGx for igual a 1, então o material derivado do even- to de planta transgênica Xou de um cruzamento do mesmo, ou de um even- to relacionado a este, está potencialmente presente na amostra; - se VGsamNGx for igual a um ou um múltiplo de dois ou mais valores selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em valo- res VZmt VBn, VGmt Vp35S, VtNOS, VcrylAb, VpAT/bar, VPAT/pat, VcP4-EPSPSt VmCry3A, Vcordap Α, VQlbl, Vcry3Bb1, ^Bxn, Vç>r, Vsv, Vgs, VCrylAc, Vcry2ab2, VSt β Vqòss, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente pre- sente na amostra; - se VGSam/VGx não for igual a 1 e não for igual a um valor ou um múltiplo de dois ou mais valores selecionados de um grupo compreen- dendo ou consistindo em valores VZm, Ve„, VGm, Vp35S, VtNos, VCryiAb, VPAmar, VpAT/pat, VcP4-EPSPS, VmCry3A, Vcordap A, VGlb1, Vcry3Bb1, Vexn, VOr, VBv, Vgs, VCrylAc, Vcry2ab2, Vst e VGbss, então o material derivado do evento de planta transgêni- ca Xou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que se VG- sa/wA/Gx for igual a 1, e se nenhum valor ou o múltiplo de dois ou mais valo- res de conjuntos selecionados de um grupo compreendendo ou consistindo em: VGeti76, VGetn, VGbho, VGmonsio, VGmon863, VGtciso7, VGnk603, VGt2s, VGGA21, VGdAS-59122, VGmiR604, VGlY038, VGmON88017, VGropas 19/2, VGMS1, V- GRFI, VGRF2, VGMS1/RF1, VGMS1/RF2, VGMS8, VGRF3, VGMS8/RF3, VGQT73, VGT45, V G Uberator pHoe6/Ac, VGGS40/90pHoe6/Ac, VGoXY235, VGmON40-3-2, VGmON89788, VGA2704-12, VGA5547-127, VGLL62, VGu.06, VGJ.L601, VG T120-7, VGH7-1, VGA5-15, V- G ll cotton 25, VG moni445, V G mo ν 531, VG moni5985 β VGeh92-527-i diferente de VGy for igual a VGx, então o material derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está presente na amostra.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, em que valores VZm, VBn, VGm, Vp35S, V(WOs, VCryiAb, VPAmar, VPAT,paU VcP4-EPSPS, VmCty3A, V0OrdapA, Vcibl, Vcry3Bb1, Vgxn, Vor, Vbv, Vqs, VcrylAc, VGry2ab2, Vst e VGbss são números primos únicos, e em que a etapa (iii) compreende executar para cada conjunto de interesse Gx operações lógicas, - se VGsWVGx for igual a 1, então o material derivado do even- to de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um even- to relacionado a este, está potencialmente presente na amostra; - se VGsamIVGx for um número inteiro maior que 1, então o ma- terial derivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está potencialmente presente na amostra; - se VG^samN^Gx não for um número inteiro, então o material de- rivado do evento de planta transgênica X ou de um cruzamento do mesmo, ou de um evento relacionado a este, está ausente da amostra.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -16, em que a etapa (2) é realizada por um dispositivo de computação.
18. Iniciadores e pares de iniciadores como definidos nas reivin- dicações 1, 6 e 11.
19. Produtos de amplificação obteníveis usando pares de inicia- dores como definidos nas reivindicações 1, 6 e 11; vetores e plasmídeos recombinantes compreendendo os ditos produtos de amplificação; micro- organismos recombinantes transformados com os ditos vetores e/ou plasmí- deos.
20. E. coli recombinante como depositado sob o Tratado de Bu- dapeste com a Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) em 10 de janeiro de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5452, LMBP 5453, LMBP 5454, LMBP 5455, LMBP 5456, LMBP 5457, LMBP -5458, LMBP 5459 e LMBP 5460, em 6 de março de 2007 sob o número de acesso de LMBP LMBP 5451, e em 19 de abril de 2007 sob os números de acesso de LMBP LMBP 5587, LMBP 5588, LMBP 5589 e LMBP 5590.
21. Plasmídeos recombinantes isolados obteníveis de quaisquer das bactérias de E. coli recombinante como definidos na reivindicação 20, ou inserções isoladas dos ditos plasmídeos, preferivelmente inserções isoladas de EcoRI-EcoRI dos mesmos.
22. Micro-organismo recombinante transformado com um plas- mídeo como definido na reivindicação 21.
23. Kit para examinar uma amostra para a presença ou ausência potencial de material derivado de um ou mais eventos de planta transgênica, o kit compreendendo um, mais que um ou todos os iniciadores, e preferivel- mente um, mais que um ou todos os pares de iniciadores como definidos nas reivindicações 1, 6 e 11, ou variantes ou derivados dos ditos pares de iniciadores.
24. Kit de acordo com a reivindicação 23, compreendendo pares de iniciadores ou variantes ou derivados dos mesmos para amplificação de pelo menos os ácidos nucleicos "Zmn1 "Bn", "Gm", "p35SH, "tNOS", "Cry1Ab", "PAT/bar", "PAT/pat" e "CP4-EPSPS" como definidos na reivindicação 1.
25. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou -24, adicionalmente compreendendo um ou mais ácidos nucleicos adequados como um controle positivo para a amplificação dos ácidos nucleicos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
26. Kit de qualquer uma das reivindicações 23 a 25, compreen- dendo uma ou mais bactérias de E. coli recombinante como definidas na reivindicação 20, micro-organismos recombinantes como definidos na reivin- dicação 22, plasmídeos recombinantes isolados ou inserções como definidos na reivindicação 21.
27. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, adicionalmente compreendendo um portador de dados compreendendo ins- truções para um dispositivo de computação programável para realizar a eta- pa (2) do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
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