BRPI0806448A2

BRPI0806448A2 - levedura recombinante, método para preparar butiril-coa e método para preparar butanol

Info

Publication number: BRPI0806448A2
Application number: BRPI0806448-2A
Authority: BR
Inventors: Eleftherios Terry Papoutsakis; Yu Sin Jang; Sang Yup Lee
Original assignee: Biofuelchem Co Ltd
Priority date: 2007-02-08
Filing date: 2008-02-11
Publication date: 2011-09-06
Also published as: EP2109675A1; MY156388A; US20100143985A1; KR100971792B1; WO2008097064A1; AU2008213200A1; ZA200905464B; EP2109675A4; KR20080077080A; JP2010517562A; AU2008213200B2; CA2677309A1; CN101631864A

Abstract

LEVEDURA RECOMBINANTE, MéTODO PARA PREPARAR BUTIRIL-CoA e MéTODO PARA PREPARAR BUTANOL. Método para produzir butanol em levedura tendo a capacidade de biossintetizar butanol utilizando butiril-CoA como um intermediário, o método compreendendo produzir butiril-CoA em levedura tendo um gene codificando CoAT (acetil-CoA:butiril-CoA CoA-transferase) introduzido na mesma, através de vários caminhos e então convertendo o butiril-CoA em butanol.

Description

LEVEDURA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PREPARAR BUTIRIL-CoA e MÉTODO PARA PREPARAR BUTANOL

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método de produção de butanol em levedura tendo a capacidade de biossintetizar o butanol usando butiril-CoA como intermediário.

HISTÓRICO

Com o aumento excessivo nos preços do petróleo e a preocupação crescente com o aquecimento global e com os gases do efeito estufa, os biocombustíveis têm atraído cada vez mais atenção com relação à sua produção com o uso de microorganismos. O biobutanol, especificamente, tem uma vantagem em relação ao bioetanol, uma vez que ele é mais altamente miscível com os combustíveis fósseis graças ao seu baixo teor de oxigênio. Recentemente, emergindo como um combustível substituto da gasolina, o biobutanol tem crescido rapidamente. O mercado dos Estados Unidos para o biobutanol soma 370 milhões de galões por ano, com um preço de 3,75 dólares por galão. 0 butanol é superior ao etanol como substituto para a gasolina extraída do petróleo. Com alta densidade energética, baixa pressão de vapor, octanagem igual à da gasolina e conteúdo com baixo índice de impurezas, pode ser misturado à gasolina existente em proporções muito maiores do que o etanol, sem comprometer o desempenho, o consumo ou os padrões de poluição orgânica. A produção em massa do butanol por microorganismos pode conferir vantagens economicas e ambientais ao diminuir a importação de óleo cru e as emissões dos gases do efeito estufa.

O butanol pode ser produzido por meio da fermentação ABE (acetona-butanol-etanol) anaeróbica por cepas Clostridiais (Jones, D. T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986/ Rogers, P., Adv. Appl. Microbiol., 31:1, 1986; Lesnik, E. A. et al., Necleic Acids Research, 29: 3583, 2001). Esse método biológico tem sido a principal tecnologia para a produção do butanol e da acetona por mais de 40 anos, até os anos 50. As cepas Clostridiais são difíceis de serem mais aprimoradas devido às suas condições de crescimento complicadas e às insuficientes ferramentas de biologia molecular e tecnologia ômica para isso.

Assim, sugere-se que microorganismos como a levedura, que possuem excelente capacidade de produzir etanol e podem ser manipulados por meio de diversas tecnologias ômicas sejam desenvolvidos como cepas produtoras de butanol. Especialmente a levedura à qual pouca engenharia metabólica e tecnologia ômica tenham sido aplicadas para o desenvolvimento de cepas produtoras de butanol, tem vasto potencial para o desenvolvimento em cepas produtoras de butanol.

A Clostridium acetobutylicum produz butanol por meio do caminho de biossíntese do butanol mostrado na FIG. 1 (Jones, D. T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Desai, R.P. et al., J. Biotechnol., 71:191, 1999) . Duas cepas típicas, Clostridium sp. e E. coli, que têm sido estudadas para a produção do biobutanol são difíceis de usar em aplicações industriais devido à tolerância delas ao produto final, o butanol. Enquanto isso, uma bactéria recombinante capaz de produzir butanol na qual o caminho da biossíntese do butanol é introduzido e a produção de butanol usando tal bactéria foram divulgados (US 2007/0259410 Al; US 2007/0259411 Al), mas a produtividade foi modesta.

Atualmente, as leveduras são usadas com freqüência na indústria de fermentação do etanol e têm uma tolerância significativamente alta ao álcool. Geralmente, essas leveduras têm atividade metabólica e taxa de crescimento altas e crescem bem em ambiente com pH baixo, temperatura baixa e atividade de água baixa, como o bolor e também crescem, de modo geral, até mesmo em condições anaeróbicas. Espera-se que tais propriedades forneçam maiores vantagens na produção de butanol usando leveduras. Entretanto, conforme mostrado na FIG. 2, as leveduras não podem produzir naturalmente butanol em condições gerais. Também, tem havido uma tentativa de produzir butanol usando leveduras recombinantes, mas a produção de butanol foi insignificante (WO 2007/041269 A2).

Da mesma forma, os presentes inventores fizeram grande esforço para desenvolver um novo método de produção do etanol usando levedura e, como resultado, descobriram que um butiril-CoA intermediário, produzido na levedura usando diversos caminhos, é convertido em butanol pela ação do álcool/aldeído deidrogenase (AAD), completando assim a presente invenção. RESUMO DA INVENÇÃO

Assim, é objeto da presente invenção fornecer um método para produzir butanol, o método compreendendo a produção do butiril-CoA, que é um intermediário importante no caminho da biossintese do butanol em levedura, por meio de diversos caminhos e então produzir butanol usando o butiril-CoA produzido como um intermediário, bem como uma levedura recombinante com a capacidade de biossintetizar butanol.

A fim de atingir o objetivo acima, a presente invenção fornece uma levedura recombinante capaz de produzir butanol, em que é introduzido um gene CoAT codificante de (CoA-transferase) capaz de converter ácido orgânico em ácido orgânico CoA ao transferir uma porção de CoA para o ácido orgânico, oferecendo um método de produzir butiril-CoA e butanol, método esse compreendendo uma cultura da referida levedura recombinante em um meio contendo butirato.

A presente invenção também oferece um método para a produção de butanol, caracterizado pelas seguintes etapas de: co-cultura da levedura recombinante com um microorganismo com capacidade de produzir butirato, de modo que o butirato seja produzido pelo microorganismo com capacidade de produzir butirato, permitindo que a levedura recombinante produza butanol, utilizando o butirato produzido e recuperando o butanol do meio liquido da cultura. A presente invenção também oferece um método para produzir butiril-CoA e butanol, o método compreende o cultivo de levedura capaz de biossintetizar butiril-CoA a partir de ácidos graxos em um meio contendo ácido graxo.

Na presente invenção, a levedura mencionada tem, preferencialmente, um gene codificante de AAD (álcool/aldeido deidrogenase) , caracterizado por ter uma atividade AAD, ou recebe um gene codificante de AAD.

Outros recursos e aspectos da presente invenção ficarão evidentes na descrição detalhada a seguir e nas reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIG. 1 mostra o caminho da produção do butanol na Clostridium acetobutylicum.

FIG. 2 mostra uma parte do caminho metabólico do ácido butanóico na levedura. Na FIG. 2, a linha pontilhada indica os caminhos não presentes na levedura e a linha sólida indica os caminhos presentes na levedura.

FIG. 3 mostra um caminho previsto de produção do butanol usando um pool de butiril-CoA em uma levedura recombinante a partir de ácidos graxos.

FIG. 4 mostra o caminho que produz butanol em uma levedura recombinante de acordo com a presente invenção ao aumentar o pool de acetil-CoA em células de levedura usando butirato ou acetato em um meio.

FIG. 5 mostra um mapa genético de um vetor pYUC18.

FIG. 6 mostra um mapa genético do pYUC18.adhEl.

FIG. 7 mostra um mapa genético do pYUC18.adhEl.ctfAB.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO E

ASSOCIAÇÕES PREFERIDAS

Na presente invenção, dois métodos foram estudados para a produção de butiril-CoA na levedura: (1) um método de produção de butiril-CoA pela introdução de um gene codificando um CoAT (CoA transferase) em uma levedura tendo um gene codificando THL (uma enzima convertendo acetil-CoA em acetoacetil-CoA) de modo a cultivar uma levedura recombinante e a cultura da levedura recombinante em um meio contendo butirato; e (2) um método para a produção de butiril-CoA a partir de ácidos graxos usando o caminho da beta-oxidação na própria levedura.

A levedura pode produzir acil-CoAs com cadeias curtas (scl) e cadeias médias (mel) em peroxissomo e citosol pelo caminho da beta-oxidação usando diversos ácidos graxos (Leaf, T. A. et al., Microbiology-Ukl 142:1169, 1996; Carlson, R. et al., J. Biotechnol., 124:561, 2006; Zhang, Β. et al.r Appl. Environ. Microbiol. , 72:536, 2006), mas ainda não há relato sobre a produção de butanol usando esse processo.

Os presentes inventores tentaram cultivar uma levedura recombinante tendo um gene (adhEl) codificante de AAD (álcool/aldeido deidrogenase) derivado da Clostridium acetobutylicum ATCC 824 introduzido aqui para produzir butanol a partir de butiril-CoA intermediário a ser produzido pelos dois métodos descritos. Além disso, os presentes inventores analisaram se o butanol é produzido mesmo quando a levedura sem atividade AAD Clostridial é cultivada em meio contendo ácidos graxos.

Como resultado, foi confirmado que: (1) quando uma levedura recombinante, obtida pela introdução de um gene codificante de CoAT e um gene codificante de AAD na levedura tendo um gene codificante de THL, foi cultivada em um meio contendo butirato, foi produzido butanol; (2) mesmo quando uma levedura recombinante tendo um gene codificante de AAD introduzido aqui foi cultivada em meio contendo ácidos graxos, foi produzido butanol; e (3) quando a levedura sem atividade AAD Clostridial é cultivada em meio contendo ácidos graxos, é produzido butanol. Tais resultados sugerem que o butiril-CoA, produzido a partir de ácidos graxos pelo caminho da beta-oxidação, foi convertido em butanol por AAD que foi expresso por si mesmo. Isso indica indiretamente que a levedura, usada na presente invenção tem um gene que demonstrou possuir atividade AAD.

A partir dos resultados acima foi possível observar que a levedura, tendo um gene que demonstrou possuir atividade AAD, pode ser usada para produzir butanol a partir do butiril-CoA sintetizado por meio de diversos caminhos. Alternativamente, quando a levedura sem atividade AAD é usada, a levedura recombinante contendo gene codificante de AAD aqui introduzida (por exemplo, adhEl derivada de Clostridium acetobutylicum ATCC 824), pode ser usada para produzir butanol a partir do butiril-CoA.

Da mesma forma, em um aspecto, a presente invenção refere-se à levedura recombinante tendo a capacidade de produzir butanol, na qual um gene codificante de CoAT (CoA-transferase) capaz de converter ácido orgânico em ácido orgânico CoA, transferindo uma porção de CoA para o ácido orgânico é introduzido; e a um método para a produção de butiril-CoA e butanol, método esse compreendendo a cultura de levedura recombinante em um meio contendo butirato.

Na presente invenção, tal levedura de preferência tem um gene codificante de enzima (THL) convertendo acetil-CoA em acetoacetil-CoA, tal CoAT é de preferência acetil-CoA:butiril-CoA CoA-transferase e o gene codificante de CoAT é de preferência ctfAB derivado de Clostridium sp. , mas o escopo na presente invenção não é portanto limitado.

Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se ao método para produzir butiril-CoA e butanol, que compreende a cultura de levedura capaz de biossintetizar butiril-CoA a partir de ácidos graxos em um meio contendo ácido graxo.

Em um exemplo da presente invenção, a capacidade de produzir butanol de uma levedura recombinante [S. cerevisea (pYUC18.adhEl)] contendo um gene (adhEl) codificante de AAD (álcool/aldeido deidrogenase) derivado da Clostridium acetobutylicum ATCC 824 introduzido aqui, foi analisada a fim de examinar se a levedura recombinante produziria um butiril-CoA intermediário a partir do acetil- CoA ou ácidos graxos de cadeia curta, média ou longa pelas enzimas presentes na própria levedura. A levedura recombinante foi cultivada a fim de produzir butanol a partir do butiril-CoA produzido na própria levedura por meio de butiraldeido. Especificamente, foi previsto que, quando vários acil-CoAs (butiril-CoA, acetil-CoA, etc.) fossem usados na levedura recombinante, a produção do butanol se tornaria possível. Além disso, foi previsto que o butanol seria produzido a partir do butiril-CoA por AAD (álcool/aldeido deidrogenase), introduzido ou presente na levedura recombinante (FIG. 3).

A fim de confirmar essa previsão, a levedura recombinante foi cultivada em meio dropout SC contendo ácido láurico / ácido oleico. Como resultado, foi possível observar que o butanol foi produzido a partir do acil-CoA, incluindo butiril-CoA, sintetizado a partir do caminho da beta-oxidação. Também foi observado que o butanol foi produzido em uma cepa sem atividade AAD Clostridial. Acredita-se que isso deva ser atribuído às enzimas envolvidas na síntese do acil-CoA, presente na própria levedura recombinante com atividade AAD. Especificamente, pode ser previsto que a razão pela qual o butanol é produzido pela cultura da levedura recombinante [S. cerevisea (pYUCl8.adhEl)] e a própria levedura apresentando atividade AAD, em meio contendo ácido graxo, deve-se ao fato de o ácido graxo ser convertido em scl-acil-CoA ou mcl-acil-CoA, como por exemplo, butiril-CoA, pela ação das enzimas (acil-CoA sintases) (FIG. 3) . Assim, foi possível confirmar na presente invenção que as enzimas (acil-CoA sintases) presentes na levedura, que convertem ácidos graxos em scl-acil-CoA ou mcl-acil-CoA, como por exemplo, o butiril-CoA, contribuem para a produção do butanol (Marchesini, S. et al., J. Biol. Chem. 278:32596, 2003; Zhang, B. et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:536, 2006).

Em outro exemplo da presente invenção, os experimentos foram realizados para examinar se a levedura recombinante, tendo um gene codificando álcool/aldeído deidrogenase (AAD) e um gene codificando CoA transferase (CoAT), derivado da Clostridium acetobutylicum ATCC 824 introduzido aqui, pode aumentar o pool de butiril-CoA nas células usando butirato de origem externa para sintetizar butanol usando a mesma. A levedura recombinante [S. cerevisea (pYUC18.adhEl.ctfAB)] foi cultivada a fim de produzir butiril-CoA usando butirato externo e produzir butanol a partir do butiril-CoA por meio de butiraldeído. A enzima CoAT derivada da Clostridium acetobutylicum ATCC 824 é altamente vantajosa para aumentar o pool de butiril-CoA nas células da levedura, uma vez que ela transfere uma porção de CoA do acetoacetil-CoA para o butiril-CoA ou acetil-CoA (FIG. 4) (Bermejo, L. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:1079, 1998). Especificamente, foi previsto que quando a levedura recombinante contendo um gene codificante de AAD (adhEl) e um gene codificante de CoAT (.ctfAB) aqui introduzido é cultivado em um meio contendo butirato, o pool de butiril-CoA nas células de levedura pode ser aumentado, aumentando assim a produção do butanol. Também foi previsto que, quando a levedura recombinante é cultivada em um meio contendo butirato e ácido graxo, o pool de butiril-CoA nas células de levedura ainda pode ser aumentado, aumentando assim a produção do butanol (FIG.4).

Para confirmar essa suposição, a levedura recombinante [S. cerevisea (pYUC18.adhEl.ctfAB)] foi cultivada em meio contendo butirato e, como resultado, pode ser observado que o butanol foi produzido a partir do butirato por meio do butiril-CoA. Acredita-se que isso deva ser atribuído a enzima CoAT presente na própria levedura recombinante envolvida na produção do butiril-CoA. Pode ser confirmado na presente invenção que o CoAT presente na levedura recombinante que converte butirato ou acetato em butil-CoA ou acetil-CoA, contribuiu para a produção do butanol. Além disso, foi observado que, quando a levedura recombinante foi cultivada em meio contendo butirato e ácido graxo, a produção de butanol aumentou ainda mais. Isso sugere que muito mais butiril-CoA foi biossintetizado a partir do butirato e ácido graxo através de enzimas CoAT e no caminho da beta-oxidação.

Na presente invenção, o ácido graxo tem, preferencialmente, 4-24 átomos de carbono e contém pelo menos um selecionado do grupo constituído por ácido oléico e ácido láurico. Na presente invenção, os genes codificantes de AAD e CoAT são adhEl e ctfAB derivados de Clostridium sp., respectivamente, mas o escopo da presente invenção não é limitada a isso. Por exemplo, os genes derivados de outros microorganismos podem ser usados sem limitação na presente invenção, enquanto puderem ser introduzidos e expressos na levedura receptora para mostrar as mesmas atividades enzimáticas dos genes descritos acima.

Enquanto isso, além do método de acrescentar butirato externo diretamente à levedura recombinante, um método de co-cultura também pode ser usado para produzir butirato. Especificamente, uma cepa capaz de produzir butirato pode ser cultivada conjuntamente com a levedura recombinante da presente invenção, de tal forma que o butirato precursor possa ser produzido pela cepa produzindo butirato e o butirato produzido possa ser convertido em butanol por meio do butiril-CoA pela levedura recombinante presente.

Os exemplos das cepas de co-cultura para produzir produtos específicos por meio dos precursores incluem Ruminococcus albus e Wolinella succinogenes. A fermentação da glicose por meio da cultura pura da R. albus produz CO2, H2 e etanol como produtos finais, além do ácido acético como produto principal. Entretanto, quando a R. albus é co-cultivada com a W. succinogenes, o hidrogênio é removido e assim o etanol não é produzido. Neste, a Pvr. succinogenes pode produzir acetato a partir do acetil-CoA para formar ATP, e assim a produção do ATP por mol de glicose pode ser aumentada em comparação com o caso da R. albus. Especificamente, a co-cultura com W. succinogenes ê mais eficiente na produção do ácido acético como produto final por meio do fornecimento do ATP exigido, comparado à cultura pura da R. albus (Stams, A.J., Antonie Van Leeuvienhoek, 66: 271, 1994).

Os microorganismos capazes de produzir butirato incluem os microorganismos Clostridium sp. (Clostridium butyricum, Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum, etc.) e microorganismos intestinais (Megasphaera elsdenii, Mitsuokella multiacida, etc.) (Alam, S. et al., J. Ind. Microbiol., 2:359, 1988; Andei, J.G. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol23:21-26, 1985; Barbeau, J.Y. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 29:447, 1988; Takamitsu, T. et al., J. Nutr., 132:2229, 2002). Quando a cepa produzindo butirato é co-cultivado com a levedura recombinante da presente invenção, o butirato será produzido pela cepa e a levedura recombinante da presente invenção pode produzir butanol usando o butirato produzido.

Da mesma forma, em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se a um método de produção de etanol, caracterizado pelas seguintes etapas de: co-cultura da levedura recombinante com um microorganismo tendo capacidade de produzir butirato, de modo que o butirato seja produzido pelo micro-organismo tendo capacidade de produzir butirato, permitindo que a levedura recombinante produza butanol, utilizando o butirato produzido e recuperando o butanol do meio liquido da cultura. Embora somente os microorganismos Clostridium sp. e os microorganismos intestinais tenham sido mencionados como cepas produzindo butirato que podem ser usados em uma co-cultura, será óbvio aos especialistas na área que qualquer cepa pode ser usada sem limitação na presente invenção, enquanto puder produzir butirato e ser co-cultivada com a levedura recombinante.

Exemplos

A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos exemplos. Deve ser entendido, entretanto, que esses exemplos são somente para fins ilustrativos e que o escopo da presente invenção não se limita a isso.

Especialmente, embora os exemplos a seguir ilustrem a S. cerevisea como levedura, o uso de outras leveduras também será óbvio aos especialistas na área. Além disso, embora os exemplos a seguir ilustrem somente um gene derivado de uma cepa especifica como gene a ser introduzido, os especialistas na área apreciarão o fato de que qualquer gene pode ser usado como gene a ser introduzido, desde que seja expresso em uma célula receptora para mostrar a mesma atividade do gene acima.

Também, deve-se observar que, embora somente um meio de cultura especifico e método sejam exemplificados a seguir, o liquido sacarifiçado, como por exemplo, o soro, CSL (água da maceração do milho) etc., e outros meios e diversos métodos de cultura, como por exemplo, a cultura semidescontinua, cultura continua etc. (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003/ Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Bioteehnol., 54:23, 2000; Lee et al., Bioteehnol. Bioeng., 72:41, 2001) também estão dentro do escopo da presente invenção.

Exemplo 1: Preparação do DNA recombinante para a produção de etanol a partir do butiril-CoA aqui apresentado

C. aeetobuty lieum ATCC 824 adhEl (gene codificante de AAD) , que é um gene na etapa final do caminho da biossintese do butanol, foi amplificado e clonado em um vetor de expressão pYUC18, obtendo-se assim um vetor pYUC18.adhE1.

A expressão vetor pYUC18 foi construída pela inserção de uma origem de replicação, um promotor, uma seqüência de terminação da transcrição, que tem atividade na levedura em um vetor de clonagem de E. eoli pUCl8 (Amersham) como uma espinha dorsal. pYDl (Invitrogen) como modelo foi amplificado por PCR usando primers de NOs de ID de SEQ: 1 2 para 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 20 seg., recozimento a 55°C por 30 seg. e extensão a 72°C por 30 seg., obtendo-se assim um fragmento de PCR (promotor GAL). Também, a reação de PCR foi realizada usando-se primers de NOs. de ID de SEQ: 3 e 4 da mesma maneira conforme descrito acima, obtendo-se assim um fragmento de PCR (seqüência da terminação da transcrição, TRPl ORF, replicon). Então, o primeiro e o segundo fragmentos de PCR como modelos foram simultaneamente submetidos ao PCR usando-se primers de NOs de ID de SEQ: 1 e 4, obtendo-se assim um fragmento PCR final no qual o primeiro e o segundo fragmentos de PCR foram unidos um ao outro. 0 fragmento PCR ampliado foi digerido com HindIII-SacI e clonado no vetor pUC18 digerido com á mesma enzima (HindIII-SacI) , construindo-se assim o vetor de expressão da levedura pYtJCl8 (FIG. 5) .

[NO do ID da SEQ: 1] PI: 5'- aaaaaagcttaacaaaagctggctagtacgg-3' [NO do ID da SEQ: 2] P2: 5'-

ggtacccggggatccgtcgacctgcagtccctatagtgagtcgtattac age-3' [NO do ID da SEQ: 3] P3: 5'-

ctgcaggtcgacggatccccgggtacccagtgtagatgtaacaaaatcg act-3' [NO do ID da SEQ: 4] P4: 5'-ctaggagctcctgggtccttttcatcacgt- 3'

O DNA cromossômico da Clostridium acetobutylicum ATCC 824 como modelo foi ampliado por PCR usando-se primers de NOs. de ID de SEQ: 5 e 6, obtendo-se assim um fragmento de PCR. 0 fragmento de PCR ampliado (gene adhEl) foi digerido com PstI-XmaI e clonado em um vetor de expressão pYUC18, construindo-se assim pYUC18.adhEl (FIG. 6).

[NO do ID da SEQ: 5] PI: 5'- aaaactgcagaagtgtatatttatgaaagtcacaacag-3' [NO do ID da SEQ: 6] P6: 5'- tccccccggggttgaaatatgaaggtttaaggttg-3' Exemplo 2: Preparação do DNA recombinante tendo AAD e CoAT aqui apresentado

C. acetobutylicum ATCC 824 adhEl (gene codificante de AAD) e ctfAB (gene codificante de CoAT) foi ampliada e clonada em um vetor de expressão pYUC18 construído no Exemplo 1, obtendo-se assim um vetor pYUC18.adhEl.ctfAB (FIG. 7).

0 DNA cromossômico da Clostridium acetobutylicum ATCC 824 como modelo foi ampliado por PCR usando-se primers de NOs. de ID de SEQ: 7 e 8, obtendo-se assim um fragmento de PCR. 0 fragmento de PCR ampliado (gene adhEl-ctfAB) foi digerido com SalI-XmaI e clonado em um vetor de expressão pYUC18 digerido com a mesma enzima, construindo-se assim pYUC18.adhEl.ctfAB (FIG. 7).

[NO do ID da SEQ: 7] P7: 5'- tacgcgtcgacaagtgtatatttatgaaagtcacaacag-3'

[NO do ID da SEQ: 8] P8: 5'- tccccccgggataccggcatgcagtatttctttctaaacagccatg-3'

Exemplo 3; Preparação da levedura recombinante tendo AAD e CoAT aqui introduzido

Cada pYUC18, pYUC18.adhEl e pYUC18.adhEl.ctfAB, preparado nos Exemplos 1 e 2 foi introduzido na cepa de S. cerevisea ATCC 208289 e as colônias foram avaliadas em um meio de seleção SC-Trp (base de nitrogênio de Bacto-Ievedura sem aminoácidos (0,67%, Difco), glicose (2%, CJ), mistura dropout (0,2%, suplemento TRP DO, BD Bioscience), Bacto-agar (2%, Difco) , construindo-se assim cepas de S. cerevisea (pYUCIS), S. cerevisea (pYUC18.adhEl) e S. cerevisea (pYUC18.adhEl.ctfAB).

Exemplo 4: Produção de butanol na levedura pela adição de ácido graxo

A produção de butanol foi tentada por meio da cultura de levedura recombinante S. cerevisea (pYUC18.adhEl), construída no Exemplo 3. A composição básica do meio usado na cultura foi o seguinte: base de nitrogênio Bacto-Ievedura sem aminoácidos (0,67%, Difco), glicose (2%, CJ), uracil (20 mg/l, Sigma), L-Ieucina (100 mg/l, Sigma), e L-histidina (20 mg/l, Sigma). Também, o meio basal foi complementado com 2,5 g/l de ácido oleico e 2,5 g/l de ácido láurico e ajustado para um pH de 5,7.

100 ml do meio foram acrescentados a um frasco de cultura de 250 ml e a levedura recombinante de S. cerevisea (pYUC18.adhEl) foi inoculada no meio e cultivado em câmaras aeróbicas e anaeróbicas a 30°C. Após o processo de cultura, as amostras foram coletadas em intervalos de 12 horas e o butanol na amostra foi quantificado por cromatografia gasosa (GC, Agillent).

Como resultado, conforme mostrado na Tabela 1 abaixo pode ser observado que o butanol foi produzido não somente na cepa de S. cerevisea (pYUC18.adhEl) mas também na cepa de S. cerevisea (pYUC18). Isso sugere que o ácido graxo acrescentado ao meio foi convertido em diversos pools de acil-CoA, incluindo o butiril-CoA, pela beta-oxidação, e então convertido em butanol.

Tabela 1: A concentração de butanol (mg/l) dos sobrenadantes nas culturas de cepas de S. cerevisea mudaram com os ácidos graxos(5 g/l)

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Exemplo 5: Produção de butanol na levedura recombinante pela adição de butirato

A produção de butanol foi tentada por meio da cultura de levedura recombinante S. cerevisea (pYUC18.adhEl.ctfAB), construída no Exemplo 3. A composição do meio basal usado na cultura foi o mesmo do usado no Exemplo 4. Também, o meio basal foi complementado com 40 mM de ácido butírico e ajustado para um pH de 5.7.

100 ml do meio foram acrescentados a um frasco de cultura de 250 ml e a levedura recombinante de S. cerevisea (pYUC18.adhEl.ctfAB) foi inoculada no meio e cultivado em câmaras aeróbicas e anaeróbicas a 30°C. Após o processo de cultura, as amostras foram coletadas da cultura em intervalos de 12 horas e o butanol na amostra foi quantificado por cromatografia gasosa (GC, Agillent).

Como resultado, conforme mostrado na Tabela 2 abaixo, a produção do butanol foi observada na levedura S cerevisea (pYUC18) enquanto o butanol foi produzido na levedura recombinante S. cerevisea (pYUC18.adhEl.ctfAB). Isso sugere que, quando a cepa contendo CoAT introduzida aqui é cultivada em um meio complementado com butirato, o pool de butiril-CoA em células recombinantes aumenta e assim, o butanol é produzido pelas células recombinantes.

Tabela 2: A concentração de butanol (mg/l) 10 dos sobrenadantes nas culturas de levedura expostas a ácido butirico (40 mM)

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Também, o meio complementado com butirato foi adicionalmente complementado com ácido graxo e cada uma das leveduras foi cultivada no meio. Então, o butanol nas amostras coletadas das culturas foi quantificado. Como resultado, conforme mostrado na Tabela 3 abaixo, o butanol produzido no caso onde a levedura recombinante foi cultivada no meio complementado com butirato adicionalmente complementado com ácido graxo. Também, pode ser observado que a cepa recombinante S. cerevisea (pYUC18.adhEl.ctfAB) produziu butanol em uma concentração maior do que na cepa S cerevisea (pYUC18) . Isso sugere que a cepa recombinante S. cerevisea (pYUC18.adhEl.ctfAB), que tem (1) caminho metabólico convertendo ácido graxo em butiril-CoA pela ação do acil-CoA sintase e (2) o caminho metabólico convertendo butirato em butitil-CoA por meio da ação da CoAT é mais vantajoso para a síntese do butanol. Também, pode ser visto que o caminho metabólico biossintetizando butiril-CoA como intermediário desempenha um papel importante na produção do butanol.

Tabela 3: A concentração de butanol (mg/l) dos sobrenadantes nas culturas de levedura expostas a ácido butírico (20 mM) e ácidos graxos (5 g/l)

<table>table see original document page 22</column></row><table>

APLICAÇÃO INDUSTRIAL

Conforme descrito em detalhes acima, a presente invenção tem o efeito de oferecer um método para a produção de butanol em levedura, método compreendendo a produção de butiril-CoA em levedura usando diversos caminhos e então produzir butanol usando o butiril-CoA como um intermediário.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com relação às características específicas, seja evidente para os especialistas na área que essa descrição é somente para uma realização preferida e não limita o escopo da presente invenção. Assim, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas e equivalentes. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Biofuelchem Co., Ltd.

<120> METHOD FOR PREPARING BUTANOL THROUGH BUTYRYL-

CoA AS AN

INTERMEDXATE USING YEAST

<130> PF-B0793

<140> PCT/KR2008/000787

<141> 2008-02-11

<150> US60/900,248

<151> 2007-02-08

<160> 8

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pl primer

<400> 1

aaaaaagctt aacaaaagct ggctagtacg g 31

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <223> p2 primer

<400> 2

ggtacccggg gatccgtcga cctgcagtcc ctatagtgag tcgtattaca gc 52

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ρ3 primer <400> 3

ctgcaggtcg acggatcccc gggtacccag tgtagatgta acaaaatcga ct 52

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p4 primer

<400> 4

ctaggagctc ctgggtcctt ttcatcacgt 30

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p5 primer

2/4 <400> 5 aaaactgcag aagtgtatat 38

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ρ6 primer

<400> 6 tccccccggg gttgaaatat 35

ttatgaaagt cacaacag

gaaggtttaa ggttg

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ρ7 primer

<400> 7 tacgcgtcga caagtgtata tttatgaaag tcacaacag 39

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p8 primer

<400> 8 tccccccggg ataccggcat gcagtatttc tttctaaaca gccatg 46

Claims

1. Levedura recombinante capaz de produzir butanol, caracterizada pelo fato de que é introduzido um gene CoAT codificante de (CoA-transferase) capaz de converter ácido orgânico em ácido orgânico CoA, transferindo uma porção de CoA para o ácido orgânico.

2. Levedura recombinante capaz de produzir butanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de dito CoAT ser o acetil-CoA: butiril-CoA CoA transferase.

3. Levedura recombinante capaz de produzir butanol de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de dito gene codificante de CoAT ser o ctfAB derivado do Clostridium sp.

4. Levedura recombinante capaz de produzir butanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de dita levedura ter um gene codificando uma enzima (THL) convertendo acetil-CoA em acetoacetil-CoA.

5. Método para produzir butiril-CoA, caracterizado pelo fato de compreender a cultura da levedura recombinante de uma das reivindicações 1 a 4, em um meio contendo butirato.

6. Método para produzir butiril-CoA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de dito meio conter ainda ácido graxo.

7. Método para produzir butiril-CoA de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de dito ácido graxo ter 4 a 24 átomos de carbono.

8. Método para produzir butanol, caracterizado pelo fato de compreender a cultura da levedura recombinante de uma das reivindicações 1 a 4 em um meio contendo butirato para produzir butanol e recuperar o butanol produzido no meio liquido da cultura.

9. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de dita levedura ser expressa por si mesma tendo um gene codificando uma AAD (álcool/aldeido dehidrogenase) , mostrando atividade AAD.

10. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de dita levedura ser uma levedura recombinante tendo um gene codificando AAD introduzido na mesma.

11. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de dito gene codificando AAD ser o adhEl ou o adhE2 derivado de Clostridium sp.

12. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de dito meio conter também ácido graxo.

13. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de dito ácido graxo ter 4 a 24 átomos de carbono.

14. Método para produzir butanol, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: co-cultura da levedura recombinante de uma das reivindicações -1 a 4 com um microorganismo tendo capacidade de produzir butirato, de modo que o butirato seja produzido pelo micro- organismo tendo capacidade de produzir butirato; permitindo que a levedura recombinante produza butanol, utilizando o butirato produzido; e recuperando o butanol do meio liquido da cultura.

15. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de dita levedura ser expressa por si mesma tendo um gene codificando uma AAD (álcool/aldeido dehidrogenase), mostrando atividade AAD.

16. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de dita levedura ser um recombinante tendo um gene codificando AAD introduzido na mesma.

17. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de o gene codificando AAD ser o adhEl ou o adhE2 derivado de Clostridium sp.

18. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de dito meio conter também ácido graxo.

19. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de dito ácido graxo ter a 24 átomos de carbono.

20. Método para produzir butiril-CoA, caracterizado pelo fato de compreender cultura de levedura capaz de biossintetizar butiril-CoA a partir de ácidos graxos em um meio contendo ácido graxo.

21. Método para produzir butiril-CoA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de dito ácido graxo ter 4 a 24 átomos de carbono.

22. Método para produzir butanol, caracterizado pelo fato de compreender: cultura da levedura capaz de biossintetizar butiril-CoA a partir de ácidos graxos em um meio contendo ácido graxo para produzir butanol; e recuperando o butanol produzido a partir do meio liquido da cultura.

23. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de dito ácido graxo ter 4 a 24 átomos de carbono.

24. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de dita levedura ser expressa por si mesma tendo um gene codificando uma AAD (álcool /aldeído dehidrogenase), mostrando atividade AAD.

25. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de dita levedura ser uma levedura recombinante com o gene codificando AAD introduzido na mesma.

26. Método para produzir butanol de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de o gene codificando AAD ser o adhEl ou o adhE2 derivado Clostridium sp.