BRPI0720879B1 - Microvesicula derivada de levedura carreadora de fator tissular (tf), composiçao e composiçao farmaceutica que a compreende e processos para a sua fabricaqao - Google Patents

Abstract

MICROVESICULA DERIVADA DE FERMENTO CARREADOR DE FATOR DE TECIDO(TF), COMPOSIÇAO E COMPOSIÇAO FARMACEUTICA QUE A COMPREENDE E PROCESSOS PARA A SUA MANUFATURA Expdem-se microvesiculas derivadas de fermento portadoras de fator de tecido que compreendem uma membrana de fermento e uma protefna de fator de tecido, ou um fragmento da mesma, ou uma protefna de fator de tecido ou um fragmento da mesma fundida a outro peptfdeo como uma protefna de fusao tendo atividade pro-coagulante. Os ditos produtos podem ser usados como agentes pro-coagulantes no tratamento de hemorragias em um paciente.

Description

Campo da Invengao

[001] De uma maneira geral, a presente invengao refere-se ao tratamento de hemorragias em um paciente com um agente pro-coagulante. Mais especificamente, a invengao refere-se a microvesiculas derivadas de levedura carreadora de fator tissular que compreendem uma membrana de levedura e uma proteina de fator tissular, ou um fragmento desta, ou uma proteina de fator tissular ou um fragmento desta fundida a um outro peptideo como uma proteina de fusao que e dotada de atividade pro-coagulante, e as suas aplicagoes como um agente pro-coagulante de utilidade para tratar hemorragias em um paciente, bem como para promover angiogenese e migragao de celulas. A invengao refere-se ainda a processos para a produgao da dita microvesicula derivada de levedura carreadora de fator tissular.

Antecedentes da Invengao

[002] A hemostase e o mecanismo por meio do qual os seres vivos reagem a uma hemorragia e envolve a participagao de dois processos que se tornam funcionais imediatamente depois de uma lesao e permanecem ativos durante um longo periodo de tempo. 0 primeiro deles e conhecido como hemostase primaria e e caracterizado pela ocorrencia de vaso constrigao no sitio de lesao vascular e formagao de agregados de plaquetas. 0 segundo e conhecido como hemostase secundaria, sendo a fase em que e formado o coagulo de fibrina devido a agao das diferentes enzimas proteoliticas de cascata de coagulagao.

[003] Diversos cofatores e enzimas proteoliticas participam na segunda fase do processo de coagulagao do sangue, todos eles referidos como fatores de coagulagao, e consiste em varias fases que terminam com formagao de fibrina a partir da hidrolise de fibrinogenio devido a agao de trombina. A trombina e formada previamente pela hidrolise proteolitica de uma apoenzima, protrombina. Esta proteolise e realizada pelo Fator X (FXa) de coagulagao ativada, que se liga a superficie das plaquetas ativadas e somente na presenga do seu cofator, Fator V (FVa) de coagulagao ativada, e ions de calcio, e e capaz de hidrolisar a protrombina. A ativagao do Fator X (FX) de coagulagao pode ocorrer por dois caminhos separados, o caminho intrinseco e o caminho extrinseco.

[004] O caminho intrinseco consiste em uma serie de reagoes em que cada proenzima e hidrolisada, proporcionando a sua forma de protease ativa. Em cada etapa, a enzima proteolitica recentemente formada catalisara a ativagao da proenzima seguinte para proporcionar sucessivamente a forma ativa.

[005] No caminho extrinseco da coagulagao do sangue, o Fator tissular (TF) , exposto nas celulas adventicias no sitio da lesao, liga-se ao Fator VII de coagulagao circulante/Fator VII de coagulagao ativado (FVII/FVIIa) para formar o complexo TF::FVIIa e, na presenga de calcio, para agir como um substrato de forma que ocorre ativagao de FX. 0 caminho extrinseco e atualmente considerado o caminho mais relevante na coagulagao do sangue, e e aceito que na eventualidade de uma hemorragia produzida por uma lesao vascular, a coagulagao e disparada devida a ativagao do caminho extrinseco que envolve a interagao de TF com o seu ligante, FVII/FVIIa.

[006] O TF consiste em um componente de proteina (anteriormente referido como apoproteina-III de fator tissular) e um fosfolipidio. 0 TF especificamente liga-se ao FVII/FVIIa e desempenha uma fungao relevante no caminho extrinseco de coagulagao do sangue. As fungoes fisiologicas atribuidas ao TF sao amplamente conhecidas; por um lado, e um receptor especlfico para FVIIa e, uma vez que tenha sido formado o complexo TF::FVIIa, ele funciona como um substrato de forma que tern lugar a ativagao de FX. Com efeito, depois de uma lesao vascular, o TF, que e normalmente sequestrado na superficie de celulas adventicias que circundam externamente os vasos sanguineos, entra em contacto e interage com o seu ligante, FVII presente no sangue, para formar o complexo TF::FVII. Uma vez formado este complexo, ocorre a auto-ativagao de FVII,proporcionando a sua forma ativa (FVIIa).

[007] A glicosilagao e um processo especifico de sitio dirigido por enzima de acordo com o qual sacarideos sao adicionados a lipidios e proteinas. Acredita-se que este processo esta envolvido na estabilidade, duplicagao e transporte; muito embora nenhuma evidencia de sua fungao real tenha sido descrita para o TF.

[008] Foi amplamente aceito que o TF constitui o elemento principal responsavel pela rapidez com que a coagulagao e iniciada. Para a coagulagao comegar, e absolutamente necessario que FX seja ativado e comece a hidrolise da protrombina. A fonte deste FXa tern sido atribuida principalmente a interagao de FVIIa com o seu receptor, o TF.

[009] A purificagao de TF foi reportada a partir de varios tecidos tais como: cerebro humano, cerebro bovino; placenta humana; cerebro ovino; e, pulmao. E amplamente aceito que muito embora existam diferengas na estrutura da proteina de TF entre especies, nao existem diferengas funcionais quando medidas em ensaios de coagulagao in vitro.

[0010] E amplamente aceito que, a firn de demonstrar atividade biologica, o TF deve estar associado com fosfolipidios in vitro. Constatou-se que a remogao do componente de fosfolipidio do TF, por exemplo, pelo uso de uma fosfolipase, resulta em uma perda de sua atividade biologica in vitro. A relipidagao pode restabelecer a atividade de TF in vitro.

[0011] Embora algumas quantidades de proteina de TF "purificada" tenham sido disponibilizadas a partir de varios tecidos, a baixa concentragao da proteina de TF no sangue e nos tecidos e o alto custo, tanto economico quanto de esforgo, de purificar a proteina a partir de tecidos torna este material insuficiente. Consequentemente, existe uma necessidade no sentido de se contar com uma fonte alternativa de proteina de TF, vantajosamente a proteina de TF lipidada.

[0012] A proteina de TF foi expressa em varios sistemas mediante a utilizagao do cDNA humano clonado. Desta forma, reportou-se a sobre-expressao da proteina de TF em E. coli (Paborsky et al., Biochemistry 28, 8072 (1989)). Alem disso, a patente U.S. numero 6.261.803 expoe um processo para preparar-se TF recombinante funcional em um organismo hospedeiro procariotico. Consegue-se um alto rendimento na expressao da proteina de TF completa em E. coli.

[0013] Muito embora a expressao heterologa de proteinas em E. coli apresente algumas vantagens, a expressao de proteinas eucarioticas nas ditas bacterias esta associada com um grande numero de problemas, principalmente quando a proteina a ser expressa e uma proteina eucariotica glicosilada, devido a ausencia nas bacterias de seus proprios sistemas de glicosilagao.

[0014] Consequentemente, uma estrategia alternative consiste em emitir uma proteina de TF alterada a qual falta o dominio de transmembrana. Este TF chamado "soluvel" (ou TF "truncado") acumula-se no citoplasma das celulas bacterianas e pode ser expresso em quantidades relativamente grandes. Entretanto, neste sistema, a proteina de TF que e assim expressa esta usualmente presente no E. coli em um estado quase cristalino na forma dos chamados corpos de inclusao. Quando este e o caso, os corpos de inclusao tern de ser solubilizados por meio do uso de quantidades muito grandes de agentes caotropicos, e as proteinas que foram monomerizadas desta maneira tern uma vez mais de ser redobradas, com uma grande quantidade de esforgo e usualmente com tao somente um baixo rendimento, em uma confirmagao ativa, renaturada. Alem disso, em principio, o TF soluvel nao e adequado para o uso em reagentes de tempo de protrombina, uma vez que ele e desprovido do dominio para a interagao com fosfolipidios.

[0015] Outra abordagem para a sobre-expressao de proteina de TF consiste na utilizagao de um grande numero de sistemas de expressao conhecidos e empregados com exito que codificam produtos das fusoes de genes (por exemplo, com p-galactosidase, MalE, transferase de glutationa, His- marcado, e outros). Entretanto, estes sistemas nao sao adequados para a expressao de TF biologicamente ativo. Muito embora produtos de expressao possam ser detectados e o nivel de expressao tambem possa ser aumentado quando os ditos sistemas sao usados, os produtos de expressao assim obtidos estao por vezes associados com uma complete perda de funpao, a qual nao pode ser restabelecida, mesmo quando se utilizam metodos de renaturapao elaborados.

[0016] Os problemas de sobre-expressao da proteina de TF em E. coli podem ser contornados pela realizapao da expressao da dita proteina em um sistema eucariotico. Desta forma, a expressao em celulas de levedura, em cultures de celulas de insetos utilizando-se baculovirus como um vetor, ou em celulas de mamiferos cultivadas, por exemplo, celulas ovarianas de hamsters, ou em linhas de celulas humanas, e, em principio, adequada. Entretanto, estes sistemas padecem de desvantagens cruciais, entre outras; os rendimentos de proteinas recombinantes sao muito mais baixos quando comparados a produpao de E. coli recombinante.

[0017] As variedades de levedura combinam as vantagens dos sistemas hospedeiros distintos anteriormente. Por um lado eles imitam mais estreitamente a fisiologia nativa de uma proteina eucariotica do que E. coli, e, por outro lado, eles sao faceis de manusear, faceis de cultivar, apresentam crescimento muito mais rapido e muito maior economia. Diversos fatores, todavia, afetam a expressao de proteinas nA levedura desta forma. Estes fatores incluem, sendo que nao se fica confinado aos mesmos: a escolha das sequencias reguladoras de genes, tais como promotores, que controlam a expressao de uma proteina heterologa; as sequencias promotoras empregadas para controlar a expressao heterologa deverao ser tipicamente "fortes", isto e, elas deverao efetuar a expressao muito alta da proteina, e adequadamente controlavel, pelo que a expressao pode ser, a principio, eficientemente reprimida ate ser alcangada uma biomassa otima da cultura e, entao, rapidamente estabelecida para realizar expressao de proteina; e uma secregao eficiente da proteina heterologa expressa; a secregao da proteina expressa (expressao extracelular) e frequentemente preferida em relagao a expressao intracelular uma vez que esta ultima acarretara primeiro o arrombamento da celula, descarregando assim todo o conteudo celular, e entao isolando a proteina desejada a partir da fossa de material celular e detritos. Ainda, a secregao eficiente de uma proteina, por sua vez, depende de varios fatores incluindo: (i) a selegao das sequencias de sinal - sequencias de peptideos que sao usualmente as regibes N-terminais das proteinas secretadas naturalmente, e que encaminham a proteina para o caminho secretor celular, e, (ii) os componentes especificos do caminho secretor que interagem com as sequencias de sinais e efetuam a secregao da proteina vinculada.

[0018] Stone M.J. et al (Biochem. J. (1995) 310, 605-614) descrevem a expressao do dominio de superficie do TF (TF truncado) na Saccharomyces cerevisiae. Para a purificagao do TF, carregaram-se culturas em uma coluna de imuno-afinidade conjugada com um anticorpo anti-TF e a proteina e eluida e submetida a dialise. Este ensaio permitiu o acesso a quantidades de miligrama de TF truncado.

[0019] Brucato C.L. et al. (Protein Expression e Purification 26 (2002), 386-393) descreve a expressao da proteina de TF de coelho recombinante de extensao plena completamente formada em Pichia pastoris. A purificagao da proteina de TF e realizada por cromatografia de afinidade de metal imobilizada.

[0020] Nao existe ate agora processo conhecido para preparar grandes quantidades de TF recombinante biologicamente ativo, a partir de levedura com alto rendimento. Vantajosamente, o referido TF recombinante devera ser obtido sob um alto nivel de atividade, preferentemente, sob um nivel de atividade adequado para usos terapeuticos. Portanto, constitui um objeto da presente invengao gerar quantidades uteis de proteina de TF lipidada utilizando-se tecnicas recombinantes. Vantajosamente, a proteina de TF recombinante devera ser de utilidade para aplicagoes terapeuticas.

Sumario da Invengao

[0021] Em um primeiro aspecto, a invenpao refere- se a uma levedura carreadora de fator tissular (TF) derivado de microvesicula que compreende (i) uma membrana de levedura, e (ii) uma proteina de fator tissular (TF) ou uma variante desta que e dotada de atividade pro- coagulante, em que uma parte da dita proteina de fator tissular (TF) ou fragmento desta que tern atividade pro- coagulante e integrada na dita membrana.

[0022] Em outros aspectos, a invenpao refere-se a uma composipao que compreende uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, a uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF de acordo com um medicamento, a uma composipao farmaceutica que compreende uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, a uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF para o tratamento de hemorragias em um paciente e a uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF para o tratamento de uma enfermidade que requer a promopao de migrapao celular e/ou angiogenese em um paciente.

[0023] De acordo com outro aspecto, a invenpao refere-se a um processo para a fabricapao de uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF que tern atividade pro-coagulante da invenpao, o qual compreende as etapas de: a) submeter uma cultura de celulas de levedura recombinantes que emitem proteina de TF ou um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante para fermentagao sob condigdes que permitem a expressao da dita proteina de TF, ou fragmento desta que tem atividade pro-coagulante; b) peletizar o produto resultante a partir da fermentagao da etapa a) , para proporcionar urn produto de fermentagao; c) submeter o dito produto de fermentagao proveniente da etapa b) a homogeneizagao, para obter-se um homogeneizado de fermentagao; d) submeter o dito homogeneizado de fermentagao proveniente da etapa c) a separagao para obter-se uma pilula e um extrato de levedura clarificado (CYE) que contem a dita microvesicula derivada de levedura carreadora de TF que e dotada de atividade pro-coagulante; e) coletar o dito extrato de levedura clarificado (CYE) que contem a dita microvesicula derivada de levedura carreadora de TF; e opcionalmente, f) se desejado, isolar ou purificar as ditas microvesiculas derivada de levedura carreadora de TF, dotadas de atividade pro-coagulante.

[0024] De acordo com um outro aspecto, a invengao refere-se a um processo para a preparagao de microvesiculas que compreende uma proteina de membrana de interesse a partir de uma celula hospedeira eucariotica que compreende as etapas de: a) desenvolver uma cultura da dita celula hospedeira eucariotica sob condipdes que permitem a expressao da dita proteina de membrana de interesse; b) submeter a frapao de celula da cultura de a) a homogenei zapao; c) submeter o homogeneizado obtido a partir da etapa b) a separapao, para obter-se uma pilula e um extrato de celula clarificado que contem as ditas microvesiculas derivadas de celulas que contem a proteina de membrana de interesse; d) purificar as ditas microvesiculas derivadas de celulas por divisao de dimensao.

[0025] Em outro aspecto, a invenpao refere-se a uma proteina lipidada de fator tissular (TF) modificado, selecionada a partir do grupo de: (i) Um fator tissular (TF) truncado desprovido de todo ou parte do dominio responsavel por ligapao a FVIIa, que tern atividade pro-coagulante, (ii) um mutante de proteina de TF que tern atividade pro-coagulante, em que o dominio responsavel pela ligapao a FVIIa nao e funcional; e (iii) um mutante de proteina de TF que e dotado de atividade pro-coagulante que carrega pelo menos um sitio de N-glicosilapao nao funcional.

[0026] Em outros aspectos, a invenpao refere-se a uma proteina lipidada de TF modificada de acordo com a invenpao para o uso como um medicamento, a uma composipao farmaceutica que compreende uma proteina lipidada de TF modificada e um veiculo farmaceuticamente aceitavel, a uma proteina lipidada de TF modificada para o tratamento de hemorragias em um paciente e para o tratamento de uma enfermidade que requer a promogao de migragao celular e/ou angiogenese em um paciente.

[0027] Em outro aspecto, a invengao refere-se a uma sequencia de polinucleotideos que codifica um fator tissular (TF) truncado desprovido da totalidade ou de parte do dominio responsavel pela ligagao a FVIIa, tendo atividade pro-coagulante, para um mutante de proteina de TF que tern atividade pro-coagulante, em que o dominio responsavel pela ligagao a FVIIa nao e funcional e para um mutante de proteina de TF que tern atividade pro-coagulante que carrega pelo menos um sitio de N-glicosilagao nao funcional.

[0028] A invengao tambem se refere a um vetor que compreende uma sequencia de polinucleotideos da invengao, a uma celula hospedeira que compreende um polinucleotideo da invengao ou o vetor da invengao, e a um anticorpo que se liga especificamente a uma proteina de TF modificada da invengao.

Descrigao Breve dos Desenhos

[0029] A Figura 1 mostra a estrategia de clonagem para a geragao de pTT10301. A Figura IA mostra o mapa do plasmidio pTT10301. Um fragmento de DNA de 1.050 bp que contem o promotor de GPD (pGPD), um sitio de BamHl unico e o terminador de PGK (PGKt) foi extirpado a partir de plasmidio pGl depois da digestao com enzimas de restrigao de DNA Hindlll e Xbal. 0 fragmento de DNA foi isolado por eletroforese de gel de agarose e purificado com um kit de extragao de DNA (Qiagen) e clonado no plasmidio Yep352, previamente digerido com HindiII e Xbal. 0 plasmidio pTT10301 resultante foi desenvolvido em E. coli e purificado com o kit JETstar de purificagao de DNA comercial (Genomed Gmbh). A Figura IB mostra a analise de endonuclease de restrigao do plasmidio pTT10301 gerado.

[0030] A Figura 2 mostra um tragado de hidropatia de proteina de TF humana. Estao representados os quatro dominios da proteina (sequencia lider, extracelular, transmembrana e dominios citoplasmicos).

[0031] A Figura 3 mostra a sequencia de cDNA da proteina de TF humana (Gene Bank #BC011029) . 0 quadro de leitura aberto (ORF) esta enquadrado bem como os codons de partida (ATG) e extremo (TAA). A sequencia de cDNA inclui os quatro dominios (peptideo de sinal, dominio extracelular, regiao de transmembrana e terminagao citoplasmatica) da proteina de TF humano (hTF). As setas mostram a sitioizagao de recozimento dos preparadores A [preparador de montante, codificagao dos primeiros quatro aminoacidos hTF maturado desprovido do peptideo de sinal e contendo um codon de iniciagao ATG no quadro com TF ORF] e B [preparador de jusante, com o codon de terminapao em negrito], os dois contendo um sitio BamHI de restripao (sublinhado).

[0032] A Figura 4 mostra uma representapao esquematica da estrategia de clonagem para gerar o plasmidio pTT10302 (Figura 4A). 0 fragmento de DNA obtido a partir da reapao de PCR foi digerido com BamHI e clonado no plasmidio pTT10301, previamente digeridos com BamHI e desfosforilado. 0 plasmidio resultante (pTT10302) foi desenvolvido em B. coli e purificado com o kit JETstar de purificapao de DNA comercial (Genomed Gmbh). A Figura 4B mostra a analise de restripao do plasmidio pTT10302 gerado.

[0033] A Figura 5 mostra a expressao de rTF em diferentes clones de levedura recombinantes. Analises de mancha-oeste dos extratos provenientes de levedura transformados com o plasmidio esgotado pTT10301 (C-) e com o vetor de expressao contendo a proteina hTF madura recombinante, pTT10302 (faixas 1-8), foram realizadas pelo uso do anticorpo monoclonal CD142 anti-humano de camundongo purificado (BID Biosciences Pharmingen). Os marcadores de peso molecular em kDa estao ilustrados no lado esquerdo da figura.

[0034] A Figura 6 mostra os resultados de uma mancha-oeste depois de tratamento de endoglicosilase de extratos yTT10301. Assim, os extratos provenientes de levedura de expressao de rTF (yTT10301) foram tratados com 500 unidades de endoglicosilase H (Endo H) (faixa 2) ou N- Glicosidase F (PNGase F) (faixa 3) durante 1 hora a 37°C, seguindo-se as instrugoes do fabricante. Estas amostras e o extrato nao tratado (faixa 1) foram analisadas por mancha- oeste com o mAb de TF anti-humano. Marcadores de peso molecular em kDa estao ilustrados no lado esquerdo da figura.

[0035] A Figura 7 ilustra fotografias de microscopic a laser confocais que mostram a expressao de rTF por levedura recombinante yTT10301. Esferoplastos provenientes de rTF emissores de levedura recombinantes foram fixados com paraformaldeido a 4% e incubados com um mAb contra um ATPase de levedura (Figura 7A) ou com um TF mAb anti-humano (Figura 7B) . Depois da incubagao com um anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado com fluoresceina, observaram-se as celulas por meio de microscopia confocal (1, 3, 5 e 7) ou por contraste de fase (2, 4, 6 e 8) . Obtiveram-se imagens em um microscopic a laser confocal BIO-RAD Radiance 2000.

[0036] A Figura 8 ilustra fotografias por microscopic a laser confocais que mostram que a expressao de rTF por levedura recombinante depende da presenga do plasmidio pTT10302. Esferoplastos provenientes de levedura recombinante (yTT10300) abrigando o plasmidio de expressao esgotado pTT10301 foram fixados com paraformaldeido a 4% e incubados com um mAb contra um ATPase de levedura (Figura 8A) ou com um mAb de TF anti-humano (Figura 8B) . Depois de incubagao com um anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado com fluoresceina, observaram-se as celulas por meio de microscopia confocal (1 e 3) ou por contraste de fase (2 e 4) . Obtiveram-se imagens em um microscopio a laser confocal BIO-RAD Radiance 2000.

[0037] A Figura 9 mostra que o rTF esta associado as membranas de levedura. Tratou-se um extrato a partir de yTT10301 com Triton X114 e depois de centrifugagao a fase aquosa e a pilula de detergente foram coletadas separadamente. A fase aquosa foi tratada novamente com Triton X114 (1% de concentragao final), e separaram-se duas fases como anteriormente. Misturou-se a segunda pilula de detergente com a primeira. 0 extrato completo (faixa 1), a primeira (faixa 2), a segunda (faixa 3) fases aquosas, e a fase de detergente (faixa 4) foram analisadas por SDS-PAGE e por mancha Coomassie (Figura 9A) ou por mancha-oeste que reagiu com um mAb contra TF humano (Figura 9B).

[0038] A Figura 10 e um grafico que mostra a evolugao dos parametros principals durante todo o processo de fermentagao. Uma alteragao na pressao de oxigenio (PO2) , que e o unico parametro nao controlado, reflete as mudangas nos requisites de oxigenio sofridas pelas celulas durante o processo. Sustou-se a fermentagao quando a PO2 atingiu uma condigao estacionaria (18 horas).

[0039] A Figura 11 e um diagrama que representa o esquema geral do processo de fermentagao para produzir CYE- TF.

[0040] A Figura 12 mostra os resultados de uma analise mancha-oeste para determinar a presenga de TF nos preparados obtidos a partir do primeiro teste de fermentagao. Cada faixa corresponde a 5 pl de ou sobrenadante (sn) ou pilula (pp) obtido pelo procedimento descrito na Figura 11. Amostras de proteina foram analisadas por mancha-oeste utilizando-se um mAb especlfico contra TF humano. 0 controle positivo (rTF) e um TF recombinante comercial (10 ng) produzido em E. coli (American Diagnostica, Inc.). Marcadores de peso molecular, em kDa encontram-se ilustrados no lado esquerdo da figura.

[0041] A Figura 13 mostra imagens por microscopia eletronica de amostras de CYE-TF. 0 produto CYE-TF foi adsorvido por grades de cobre revestidas de carbono previamente tratadas por uma descarga incandescente. A grade foi incubada com PBS que continha albumina de soro bovino a 3% (BSA) durante 1 hora anteriormente a incubagao com o mAb especlfico contra hTF ou com um anticorpo nao relacionado. As grades foram lavadas extensamente com PBS e incubadas com anticorpo de IgG anti-camundongo de coelho conjugado com ouro. Lavaram-se as grades e as amostras foram manchadas negativamente por tratamento com acetato de uranil a 1%. As imagens foram obtidas em um microscopio eletronico JEOL 1200 EXIT. As setas indicam a posigao de particulas de ouro coloidal.

[0042] A Figura 14 mostra um esquema do procedimento de clarificagao de CYE-TF por meio de Filtragem de Fluxo Tangencial. - A) 0 CYE-TF foi submetido a filtragem de fluxo tangencial (TFF) em um Sistema de Filtragem de Fluxo Transverso (Sartorius sartoflow Slice 200 Benchtop). 0 CYE-TF foi filtrado sucessivamente atraves de membranas de 0,45 pm, 0,2 pm e 0,1 pm (polissulfona, Sartorius). As membranas foram previamente equilibradas com Tampao de Fosfato (fosfato de sodio 20 mM, ate pH 7,4, 500 mM NaCI). 0 material remanescente retido depois da filtragem atraves das membranas de 0,2 pm e antes de 0,10 pm foi recuperado e usado como material de partida para as etapas de purificagao sucessivas. B) Utilizou-se dispersao de luz dinamica para se determinar a distribuigao de dimensao das microvesiculas.

[0043] A Figura 15 mostra um perfil de cromatografia por exclusao de dimensao do produto de CYE-TF em uma coluna Sephacryl S-500. A eluigao foi realizada a 4°C com Tampao de Fosfato e coletaram-se fragoes de 4 ml sob velocidade de fluxo de 1 ml/min. A eluigao de Proteina foi monitorada por medigao da densidade optica a 280 nm.

[0044] A Figura 16 mostra um ensaio de mancha- oeste para detectar rTF. Submeteram-se a eletroforese 15 pl de cada fragao em 12,5%-SDS-PAGE Tris-Glicina gel. Depois da eletroforese, as proteinas foram transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram entao incubadas com um anticorpo monoclonal de camundongo comercial antiTF (American Diagnostica) durante 1 hora. As membranas foram entao incubadas com anticorpos IgG anti- camundongo de coelho, seguidas por incubagao com anticorpos IgG anti-coelho de cabra conjugados com peroxidase de raiz- forte. Detectaram-se proteinas imuno-reativas por quimiluminescencia utilizando-se kits de coloragao ECL Advanced Western (GE Healthcare).

[0045] A Figura 17 mostra um perfil de proteina de diferentes lotes de microvesiculas que contem rTF purificado por cromatografia de exclusao de dimensao. A) Proteinas provenientes de quatro lotes diferentes de microvesiculas purificadas que contem rTF (como indicado no topo da figura) foram fracionadas por SDS-PAGE, e o gel foi colorido com coomassie azul. Marcadores de peso Molecunlra estao ilustrados no lado esquerdo da figura. B) Analise densitometrica das diferentes bandas de proteina em cada lote realizadas depois da varredura do gel colorido.

[0046] A Figura 18 mostra uma analise de Cromatografia de Camada Fina (TLC). PA: acido fosfatidico (Sigma), PS: Fosfatidilserina (Fluka), PG: Fosfatidilglicerol (Sigma), CAR: Cardiolipin (Sigma), ERG: Ergosterol (Fluka), PE: Fosfatidil etanolamina (Sigma), PI: Fosfatidilinositol (Sigma), PC: Fosfatidilcolina (Sigma), MARCA: Triacilcliceridas (Sigma).

[0047] A Figura 19 mostra a sequencia de cDNA da proteina de TF humano (Gene Bank #BC011029) . 0 quadro de leitura aberto (ORF) e enquadrado desta forma que os codons de partida (ATG) e final (TAA). A sequencia de cDNA inclui os quatro dominios (peptideo de sinal, dominio extracelular, regiao de transmembrana e caudacitoplasmatica) da proteina de TF humano (hTF). As setas mostram o sitio de recozimento dos preparadores A [preparador de montante, codificagao dos primeiros quatro aminoacidos de hTF completamente formados desprovidos de peptideo de sinal e contendo um codon ATG de iniciagao no quadro com TF ORF] e E [preparador de jusante; nucleotideos de codificagao de histidinas em negrito], os dois contendo um sitio BamHI de restrigao (sublinhado).

[0048] A Figura 20 mostra a estrategia de clonagem para a geragao de pTT10303. A Figura 20A mostra que o fragmento de DNA obtido a partir da reagao de PCR foi digerido com BamHI e clonado no plasmidio pTT10301, previamente digerido com BamHI e desfosforilado. 0 plasmidio pTT10303 resultante foi desenvolvido em E. coli e purificado com o kit JETstar de purificagao de DNA comercial (Genomed Gmbh). A Figura 20B mostra a analise de restrigao do pTT10303 gerado.

[0049] A Figura 21 mostra os resultados de uma analise de mancha-oeste da expressao de rTF-his-marca. Analise de mancha-oeste de extratos a partir de cultures de levedura recombinante yTT10302 (faixas 1-4, correspondente aos clones 2 a 5) e rTF produzidos em E.coli (C+) . Fez-se reagir a mancha com o anticorpo monoclonal CD142 anti- humano de camundongo purificado (BD Biosciences Pharmingen) . Os marcadores de peso molecular em kDa estao ilustrados no lado esquerdo da figura.

[0050] A Figura 22 mostra tambem os resultados da expressao de rTF-his-marca. A Figura 22A mostra SDS-PAGE e coloragao de Coomassie azul de extratos a partir de levedura yTT10300 (faixa 1), yTT10301 expressor de rTF (faixa 2) , ou yTT10302 (clone #5) expressor de rTF-his- marcador (faixa 3). Controle positivo correspondente a 5 ng de um rTF produzido em E. coli (faixa 4) . A Figura 22B e uma analise de mancha-oeste destas amostras ilustradas na Figura 17A, utilizando-se o anticorpo monoclonal CD142 anti-humano de camundongo purificado (BD Biosciences Pharmingen). Marcadores de peso moleculares em kDa estao ilustrados no lado esquerdo da figura.

[0051] A Figura 23 mostra esquematicamente o processo para purificagao de 6HT-TF.

[0052] A Figura 24 mostra os resultados da purificagao de 6HT-TF por cromatografia de afinidade. 0 CYE-6HT-TF foi usado como material de partida. 0 extrato foi filtrado atraves de um filtro de dimensao de poro de 0,2 pm por filtragem tangencial e foi aplicado a uma coluna de cromatografia de afinidade de quelato de metal comercial de 5 ml (HiTrap®, Pharmacia Biotech) . A coluna foi submetida a tres lavagens consecutivas com tampao de partida (20 mM tampao de fosfato, 500 mM NaCI, pH 7,4) sem imidazol, com 10 mM de imidazol e com 100 mM de imidazol, respectivamente. Submeteu-se o 6HT-TF a eluigao com o mesmo tampao que continha fragoes de eluigao imidazol 1 M. Coletaram-se fragoes de eluigao de 2,5 ml (faixas 4 a 7, correspondentes respectivamente as fragoes #1, #2, #3, e #4) e submeteram-se a dialise contra 20 mM de tampao de fosfato, 50 mM de NaCI, pH 7,4. 0 extrato de levedura filtrado de partida (faixa 1), o material nao ligado (faixa 2), a ultima lavagem com tampao de partida contendo 100 mM e as primeiras quatro fragoes de eluigao foram analisadas por SDS-PAGE e mancha-oeste (Figura 24A) ou coloragao de prata (Figura 24B) . Marcadores de peso molecular em kDa encontram-se indicados no lado esquerdo da figura.

[0053] A Figura 25 mostra os resultados de uma analise de mancha-oeste do 6HT-TF purificado depois de tratamento de endoglicosilase. A fragao de 6HT-TF purificada foi tratada com 500 unidades de PNGase F (faixa 2) ou Endo H (faixa 3) seguindo-se as instrugbes do fabricante. Estas amostras e o eluado nao tratado (faixa 1) foram analisados por mancha-oeste com um TF mAb anti- humano. Marcadores de peso molecular em kDa encontram-se indicados no lado esquerdo da figura. imunoeletronmicroscopia de 6HT-TF purificado por cromatografia de afinidade. A primeira fragao de eluigao foi adsorvida para grades de cobre revestidas de colodio. A grade foi tratada para rotulagao de imuno-ouro com anticorpo monoclonal de anti-TF.

[0054] A Figura 26 mostra os resultados de uma analise de mancha-oeste do 6HT-TF purificado depois de tratamento de endoglicosilase. A fragao de 6HT-TF purificada foi tratada com 500 unidades de PNGase F (faixa 2) ou Endo H (faixa 3) seguindo-se as instrugbes do fabricante. Estas amostras e o eluado nao tratado (faixa 1) foram analisados por mancha-oeste com um TF mAb anti- humano. Marcadores de peso molecular em kDa encontram-se indicados no lado esquerdo da figura. imunoeletronmicroscopia de 6HT-TF purificado por cromatografia de afinidade. A primeira fragao de eluigao foi adsorvida para grades de cobre revestidas de colodio. A grade foi tratada para rotulagao de imuno-ouro com anticorpo monoclonal de anti-TF.

[0055] A Figura 27 e uma representagao esquematica de uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao. A Figura 22A mostra a representagao esquematica de uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao que compreende uma membrana derivada de levedura (1) e uma proteina de TF (2) (ou um fragmento desta que tern atividade pro-coagulante) integrada na dita membrana derivada de levedura (1) . Encontram-se representados o espago intra-microvesicula (3) e o espago extra-microvesicula (4) . As Figuras 22B e 22C mostram a arquitetura basica de uma microvesicula derivada de levedura de suporte de TF da invengao. Os lipideos da bicamada de lipideos de membrana derivada de levedura sao anfipaticos; eles sao dotados de cabegas polares hidrofilas (5) que apontam para o espago extra-microvesiculas (4) e duas terminagoes de hidrocarbonetos hidrofobos (6) que apontam para o espago intra-microvesiculas (3) . Na concretizagao ilustrada na Figura 22B, o dominio de N- terminal de uma proteina de TF (2) , ou fragmento desta que tern atividade pro-coagulante, fica voltado para o espago extra-microvesicula (4). Na concretizagao ilustrada na Figura 22C, o dominio de N-terminal da proteina de TF (2) , ou fragmento do mesmo que tern atividade pro-coagulante, fica voltado para o espago intra-microvesicula (3).

[0056]A Figura 28 mostra a sequencia de cDNA da proteina de TF humana (Gene Bank #BC011029) . 0 quadro de leitura aberto (ORF) esta enquadrado bem como os codons de partida (ATG) e extreme (TAA). A sequencia de cDNA inclui os quatro dominios (peptideo de sinal, dominio extracelular, regiao de transmembrana e terminagao citoplasmatica) da proteina de TF humane (hTF) . As setas mostram a sitioizagao de recozimento dos preparadores F [preparador de montante, codificagao dos primeiros quatro aminoacidos hTF maturado desprovido do peptideo de sinal e contendo um codon de iniciagao ATG no quadro com TF ORF] e E [preparador de jusante; nucleotideos de codificagao de histidinas em negrito], os dois contendo um sitio BamHI de restrigao (sublinhado).

[0057] A Figura 29. Estrategia de clonagem para a geragSo de pTT10304. A) 0 fragmento de DNA obtido a partir da reagao de PCR foi digerido com BamHI e clonado no plasmidio pTT10301, previamente digerido com BamHI e desfosforilado. 0 plasmidio pTT10304 resultante foi desenvolvido em E. coli e purificado com o kit JETstar de purificagao de DNA comercial (Genomed Gmbh). B) Analise de restrigao do vetor pTT10304 gerado.

[0058] A Figura 30 mostra uma representagao esquematica da posigao das mutagdes de pontos em sitios de glicosilagao em TF humane.

[0059] A Figura 31 mostra uma mancha-oeste perscrutada com anticorpo anti-TFl. PM1 refere-se a alteragao Ala-Asn na posigao 11, PM2 refere-se a mudanga Ala-Asn na posigao 124, e PM3 refere-se a mudanga Asn-Ala na posigao 137. PM1,2; 1,3; e 1,2,3 refere-se a combinagoes destas. TT103MH e o TF tipo silvestre.

[0060] A Figura 32. Curvas de resposta de dose da atividade pro-coagulante de TT-103 e rTF relipidado.- A atividade pro-coagulante foi medida em um coagulometro utilizando-se plasma humano normal combinado e diferentes concentragoes de seja TT-103 a partir de diferentes combinagoes ou rTF relipidado.

[0061] A Figura 33 mostra as atividades pro- coagulantes in vitro de TT-103 nao tratado (1) , TT-103 sendo submetido a tratamento de Triton X-100 (2), TT-103 sendo submetido a tratamento de Triton X-100 depois da dialise, permitindo a relipidagao de rTF (3) , lipossomos esgotados (4) e microvesiculas provenientes de levedura recombinante de rTF nao-expresso (5) . A quantidade de rTF determinada por ELISA foi a mesma (120 ng/ml) nas amostras 1, 2 e 3.

[0062] A Figura 34 mostra a atividade pro- coagulante de TT-103 em plasma heparinizado (TT-103) comparado com rTF relipidado, trombina e Thromborel S.

DESCRIQAO DETALHADA DA INVENGAO MicrovesiculaderivadadeleveduracarreadoradeTFda invengao

[0063] De acordo com um aspecto, a invengao refere-se a uma microvesicula derivada de levedura carreadora de fator tissular, doravante chamada de "Microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao", que compreende (i) uma membrana de levedura, e (ii) uma proteina de fator tissular (TF) ou uma variante desta que e dotada de atividade pro-coagulante, em que uma parte da dita proteina de fator tissular (TF) ou variante desta dotada de atividade pro-coagulante e integrada na dita bicamada de lipideos. A microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao tern atividade pro- coagulante e, deste modo, ela pode ser usada como um medicamento para o tratamento de hemorragias em um paciente.

[0064] Da maneira que e utilizado neste contexto, o termo "microvesicula derivada de levedura" refere-se um compartimento pequeno e fechado, que e substancialmente composto por membranas, ou fragmentos destas, a partir de celulas de levedura. Uma membrana refere-se, em geral, a uma camada organizada de umas poucas moleculas de espessura formando o limite de uma celula (isto e, a membrana de celula ou plasma) ou os limites de organelas intracelulares.

[0065] O componente (i) da microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao e uma membrana de levedura que se originara das celulas de levedura usadas na produpao da microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao. Tipicamente, uma membrana e composta de duas camadas de lipidios orientados (isto e, uma bicamada de lipidios) onde podem encontrar-se embutidas proteinas. Uma bicamada de lipidios, que e a estrutura basica das membranas de uma celula, e usualmente formada por moleculas anfipaticas (por exemplo, fosfolipidios, acidos graxos e outros) em um ambiente aquoso, sendo cada molecula orientada com o grupo hidrofilo no lado externo da camada e o grupo hidrofobo para o interior da camada. Tipicamente, proteinas sao implantadas na bicamada de lipidios; deste modo, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao contem proteinas provenientes das membranas de celulas de levedura, que sao normalmente integradas nas ditas membranas de celulas de levedura.

[0066] Em uma concretizapao particular, a dita microvesicula derivada de levedura deriva de membranas de celulas de levedura ou ou seus fragmentos, tais como, por exemplo, membranas de plasma de celulas de levedura ou os seus fragmentos. De acordo com outra concretizapao particular, a dita microvesicula derivada de levedura deriva de membranas de organelas de celulas de levedura intracelular, ou de seus fragmentos, tais como nucleo, aparelho Golgi, reticulo Endoplasmatico, e assemelhados.

[0067] A dita microvesicula derivada de leveduras prosseguira, de um modo geral, a partir das celulas de levedura usadas na sua produpao (por exemplo, depois de sujeipao do produto de fermentapao dA levedura a um tratamento de homogeneizapao como ilustrado no processo exposto no Exemplo 1) . Praticamente qualquer celula de levedura pode ser usada para produzir a dita microvesicula derivada de leveduras, vantajosamente celulas de levedura nao floculantes, e, preferentemente, a celula de levedura classificada como uma celula de levedura "Considerada Geralmente como Segura" (ou GRAS) pela Federal Drug Administration (FDA) para consumo humano, uma vez que as ditas substancias aprovadas como GRAS do nao requerem aprovapao pre-comercial por parte da FDA porque elas sao substancialmente inocuas para animais, incluindo seres humanos. Exemplos ilustrativos, mas nao limitativos, de celulas de levedura que podem ser usadas no processo para produzir a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao sao as chamadas especies de levedura de solupao que produzem alcool, gas de acido carbonico, levedura de Baker, e assemelhados pela metabolizapao de um liquido de material de fermentapao. Especificamente, celulas de levedura preferidas incluem celulas de levedura provenientes de Saccharomyces sp., e assemelhados, por exemplo, a variedade S. cerevisiae T73 ura3_, um derivado da variedade S. cerevisiae T73, uma variedade amplamente usada na produpao de vinho (Exemplo 1) ou Pichia sp.

[0068] O componente (ii) da microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao e uma proteina de fator tissular (TF) ou uma variante desta dotada de atividade pro-coagulante.

[0069] Tai como usado neste context© o termo "variante de TF" refere-se a qualquer polipeptidio derivado de TF por substituipao, inserpao ou adipao de um ou mais aminoacidos.

[0070] Em uma concretizapao particular, o dito componente (ii) da microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao e uma proteina de TF.

[0071] O termo "fator tissular" ou "TF", tai como usado neste contexto, inclui TF nativo ou do tipo silvestre (wt) de qualquer especie de animal, incluindo seres humanos, bem como seus mutantes mantendo pelo menos uma das funpdes do dito TF wt, vantajosamente, uma funpao do TF wt no que diz respeito a coagulapao.

[0072] A proteina de TF e uma glicoproteina de membrana integral que e amplamente distribuida no reino animal que, como e encontrado naturalmente, consiste em um componente proteinico (proteina) e um fosfolipidio. Alguns sitios de glicosilapao estao presentes em uma proteina de TF para a adipao de cadeias laterals de oligossacarideos para a dita proteina retribuir uma proteina de TF em uma forma glicosilada. Na dependencia do grau de glicosilagao, diferentes formas glicosiladas da proteina de TF poderao ser disponibilizadas. Sob este aspecto, o TF completamente formado contem tres sitios de glicosilagao N encadeados potenciais da forma Asn-Xaa-Ser/Thr (Asn1:L-Leu12-Thr13, Asn124-Val125-Thr126 e Asn137-Asn138-Thr139) . A glicosilagao N encadeada nA levedura envolve tipicamente um nucleo interne de cerca de dez residues de manose, vinculados a asparagina por meio de dois residues GlcNAc, e uma cadeia externa ramificada de 50-100 residues de manose. Portanto, a glicosilagao N vinculada podera adicionar potencialmente tantos quantos 300 residues de manose ao TF, um aumento na massa molecular em cerca de 60 kDa. Alem disso, e igualmente possivel que varios residuos de manose pudessem ser vinculados a varios sitios de glicosilagao 0 vinculados (mais de 25) . Em uma concretizagao particular, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao compreende uma proteina de TF glicosilada. Tal como usado neste contexto, o termo "glicosilado" inclui qualquer grau de glicosilagao.

[0073] Na Figura 27A encontra-se ilustrada uma representagao esquematica de uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao.

[0074] A proteina de TF tern uma estrutura de dominio, isto e, ela e uma proteina com regioes funcionais independentes. Em uma concretizagao particular, a dita proteina de TF e a proteina de TF humano (hTF). Cada um dos dominios da proteina de hTF tem caracteristicas estruturais e funcionais unicas: (1) um peptidio de sinal ou uma regiao com uma sequencia lider de 32 que e processada pos- translacionalmente quando a proteina e processada a partir da forma imatura para a forma completamente formada; (2) um dominio extracelular hidrofilo N-glicosilado que compreende cerca de 219 aminoacidos terminals; (3) um fragmento de cerca de 23 aminoacidos, principalmente hidrofobos, que se acreditam ser aminoacidos de dominio de transmembrana; e (4) a extremidade carboxilica de 21 aminoacidos que se acreditam ser os aminoacidos que formam parte do fragmento citoplasmico de proteina. A estrutura de dominio da proteina de hTF permite a produgao de, por exemplo, o dominio extracelular da proteina ou seus fragmentos funcionais. A sequencia de aminoacidos da proteina de hTF e conhecida e pode ser consultada em bases de dados de proteinas tais como, por exemplo, NCBI (hTF, Numero de acesso: P13726).

[0075] Adicionalmente, a proteina de TF pode ser um elemento de uma proteina de fusao, a dita proteina de fusao contendo uma primeira regiao que compreende uma proteina de TF ligada a uma segunda regiao que compreende outro peptidio ou proteina. A dita segunda regiao pode ser ligada a regiao amino-terminal da dita proteina de TF, ou, alternativamente, a dita segunda regiao pode ser ligada a regiao carboxil-terminal da dita proteina de TF. Tanto a primeira quanto a segunda regiao podem ser diretamente ligadas uma a outra ou podem ser ligadas atraves de um polipeptidio de ligagao entre as ditas primeira e segunda regides.

[0076] Em uma concretizapao particular, a dita proteina de fusao compreende uma proteina de TF e uma marca, usualmente um marcador de peptidio, ligada ao dominio de C-terminal ou N- terminal da dita proteina de TF. 0 dito marcador e geralmente um peptidio ou sequencia de aminoacidos que pode ser usada no isolamento ou purificagao da dita proteina de fusao. Desta forma, 0 dito marcador e capaz de ligagao a um ou mais ligantes, tais como, por exemplo, um ou mais ligantes de uma matriz de afinidade, tai como um suporte ou globulo de cromatografia com alta afinidade. Um exemplo do dito marcador e um marcador de histidina (marcador de His ou HT), tai como um marcador que compreende 6 residuos de histidina (His6 ou H6) , que pode ligar-se a uma coluna de niquel (Ni2+) ou cobalto (Co2+) com alta afinidade. A marcador de His, tai como ilustrada nos Exemplos 2 e 3, tern o aspecto desejavel de que ela pode aglutinar os seus ligantes sob condigoes que sao desnaturantes para a maior parte das proteinas e dilaceradoras para a maior parte das interagoes proteina- proteina. Desta forma, ela pode ser usada para remover a proteina chamariz marcada com H6 em seguida a dilaceragao das interapoes proteina-proteina com as quais o chamariz participou.

[0077] Exemplos ilustrativos adicionais, nao limitativos de marcas de utilidade para isolar ou purificar a proteina de fusao incluem a marcador Arg, marcador FLAG, marcador Strep, um epitopo capaz de ser reconhecido por um anticorpo, tal como a marca-c-myc (reconhecida por um anticorpo anti-c-myc), marca-SBP, marca-S, peptidio de ligaQao de calmodulin, dominio de ligapao de celulose, dominio de ligapao de quitina, marca-S-transferase de glutationa, proteina de ligapao de maltose, NusA, TrxA, DsbA, marca-Avi, e assemelhados. (Terpe K. , Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525), uma sequencia de aminoacidos tais como Ala-His-Gly-His-Arg-Pro; Pro-Ile- His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser; Gly-Met- Thr-Cys-X-X-Cys; p-galactosidase, e outras.

[0078] Em uma concretizapao particular, 0 dito marcador e uma marca-His ligada ao dominio C-terminal da dita proteina de TF. De acordo com outra concretizapao, 0 dito marcador e uma marca-His ligada ao dominio N-terminal da dita proteina de TF.

[0079] A dita proteina de fusao tambem e dotada de atividade pro-coagulante. A atividade pro-coagulante da dita proteina de fusao pode ser ensaiada tal como mencionado anteriormente, por exemplo, por qualquer um dos ensaios de coagulapao mencionados no Exemplo 4, tais como por um ensaio de coagulagao de plasma in vitro, ou por um ensaio de coagulagao in vitro no sangue total nao- anticoagulado, ou por um ensaio in vivo em um modelo de animal de hemorragia seria ou por um ensaio in vivo em um modelo de animal de hemorragia letal, tais como aqueles ensaios mencionados no Exemplo 4.

[0080] A dita proteina de fusao pode ser obtida por meios convencionais, por exemplo, por meio de expressao de gene da sequencia de nucleotidios que codifica a dita proteina de fusao em uma celula de levedura adequada. A marcador eventual pode ser usada, se desejado, para o isolamento ou purificagao da dita proteina de fusao.

[0081] De acordo com outra concretizagao particular, o dito componente (ii) da microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao e um fragmento de TF que tern atividade pro-coagulante.

[0082] Tai como usado neste contexto, o termo "fragmento da proteina de TF que tern atividade pro- coagulante" inclui qualquer peptidio a partir do qual TF que, quando e lipidado, tern atividade pro-coagulante. A atividade pro-coagulante de um fragmento de TF pode ser facilmente ensaiada por meio de qualquer ensaio convencional, por exemplo, por meio de qualquer um dos ensaios de coagulagao mencionados no Exemplo 4. A titulo de mera ilustragao, a atividade pro-coagulante de um fragmento de TF pode ser determinada por um ensaio de coagulagao em plasma in vitro, ou por um ensaio de coagulagao in vitro em sangue total nao-anticoagulado, ou por um ensaio in vivo em um modelo de animal de hemorragia seria ou por um ensaio in vivo em um modelo de animal de hemorragia letal, tais como aqueles ensaios mencionados no Exemplo 4.

[0083] A sequencia de aminoacidos do dito fragmento da proteina de TF que tem atividade pro- coagulante pode ser identica aquela do fragmento correspondente da proteina de TF nativa, ou, alternativamente, pode ter insergoes, supressoes ou modificagoes de um ou mais aminoacidos com relagao a proteina de TF nativa, desde que o fragmento resultante da proteina de TF tenha atividade pro-coagulante.

[0084] Em uma concretizagao particular, o fragmento de TF que tem atividade pro-coagulante compreende uma proteina de TF completamente formada. 0 termo "TF completamente formado" como usado neste contexto, refere-se a uma proteina de TF a cuja sequencia de aminoacidos falta o peptidio de sinal. De acordo com uma concretizagao preferida, a dita proteina de TF completamente formada compreende a proteina de TF humana completamente formada. Alem disso, em uma concretizagao especifica, a dita proteina de TF humana completamente formada tem a sequencia de aminoacidos ilustrada na SEQ ID NO: 1.

[0085] De acordo com outra concretizagao particular, o fragmento da proteina de TF que tem atividade pro-coagulante e uma proteina de TF em que a totalidade ou parte do dominio responsavel pela ligapao ao FVIIa esta ausente e, consequentemente, a proteina resultante e incapaz de ligapao ao FVIIa. 0 dito fragmento de uma proteina de TF que tern atividade pro-coagulante, mas onde falta o dominio responsavel pela ligapao ao FVIIa e por vezes chamado de "proteina de TF truncada" ou "forma truncada de TF" nesta descripao. Por extensao, a dita "proteina de TF truncada" pode incluir mutantes de proteina de TF que sao dotados de atividade pro-coagulante em que o dominio responsavel pela ligapao ao FVIIa nao e funcional.

[0086] De acordo com uma concretizapao particular, a dita proteina de TF truncada compreende o dominio de interapao para o Fator X, a regiao de transmembrana e a caudacitoplasmatica e carece, parcialmente ou totalmente, do dominio responsavel pela ligapao ao FVIIa. Alem disso, de acordo com uma concretizapao especifica, a dita proteina de TF truncada e uma forma truncada da proteina de TF humana que contem o dominio de interapao para o Fator X (aa 174-251), a regiao de transmembrana (aa 252-274), e a caudacitoplasmatica (aa 275-295) e um marcador de histidina extra (Exemplo 3) . Os inventores descobriram agora, surpreendentemente, que a dita forma truncada da proteina de TF, a qual e desprovida do dominio responsavel pela ligapao ao FVIIa, e dotada de atividade pro-coagulante (Exemplo 4, Tabela 3).

[0087] Os autores da presente invenpao descobriram agora, surpreendentemente, que o dito fragmento de TF, a quern falta a totalidade ou parte do dominio responsavel pela ligapao ao FVIIa, tern atividade pro-coagulante. Este resultado foi surpreendente uma vez que e amplamente conhecido que o TF age no caminho extrinseco de coagulapao do sangue por ser exposto nas celulas adventicias nas ligapoes dos locais de lesao ao Fator VII de coagulapao circulante/Fator VII de coagulapao ativado (FVII/FVIIa) para formar o complexo TF::FVIIa que, na presenpa de calcio, funciona como um substrato de forma tal que ocorre a ativapao de FX. E aceito que na eventualidade de uma hemorragia produzida por uma lesao vascular, a coagulapao seja disparada devido a ativapao do caminho extrinseco que envolve a interapao de TF com o seu ligante, FVII/FVIIa.

[0088] De acordo com outra concretizapao, o TF modificado contem uma ou mais mutapoes no dominio que e responsavel pela ligapao ao FVIIa, que resulta em que o TF modificado e incapaz de ligar-se ao dito FVIIa ou o faz com uma afinidade substancialmente reduzida. Sao conhecidas na tecnica mutapoes de ponto no dominio de ligapao ao FVIIa do TF que cancelam a ligapao ao dito FVIIa (por exemplo, aquelas descritas por Kelley, R.F. et al., 1995, Biochemistry, 34:10383-10392, cujo conteudo fica portanto incorporado por referencia na sua totalidade).

[0089] Os autores da presente invenpao tambem observaram que a atividade pro-coagulante do TF bem como a sua expressao em celulas hospedeiras de levedura e aumentada quando o dito TF realiza mutapoes nos sitios de glicosilapao que impedem a ligapao de pelo menos uma das tres cadeias de glicosil N-ligadas encontradas no TF do tipo silvestre. Desta forma, em uma concretizapao particular, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao compreende um fragmento da proteina de TF nao glicosilado que tem atividade pro-coagulante. Tai como mencionado anteriormente, o termo "glicosilado" inclui qualquer grau de glicosilapao. Em uma concretizapao preferida, a variante de TF e um polipeptidio em que pelo menos um dos sitios de N-glicosilapao do TF tem modificado de maneira a tornar o mesmo nao funcional, isto e, incapaz de servir como um sitio de aceitapao para a adipao de cadeias de glicosidos. Os sitios de N-glicosilapao na sequencia de TF que podem ser modificados sao aqueles anteriormente mencionados, isto e, o sitio Asni:L-Leu12-Thr13, o sitio Asn124-Val125-Thr126 e/ou o sitio Asn137-Asn138-Thr139. Qualquer modificapao das regioes de consenso de N- glicosilapao e adequada na medida em que a adipao da cadeia de glicosil N-ligado seja abolida ou substancialmente inibida. Preferentemente, a modificapao e introduzida no residue Asn correspondente as posipoes 11, 124 e/ou 136 no TF humano completamente formado, uma vez que este e o residuo que serve como aceitante para a fixapao da cadeia de glicosil. Da maneira que e utilizado neste contexto, "locais correspondentes aos locais 11, 124 e/ou 136 no TF humano completamente formado" refere-se aos sitios de N- glicosilagao em outros ortologos de TF que possam aparecer em uma posigao diferente na cadeia de polipeptidios, mas que combinam com os sitios de N-glicosilagao no TF humano completamente formado quando as sequencias humanas e ortologas sao alinhadas com base na similaridade de sequencias. Um algoritmo adequado para alinhamento ou multiplas sequencias de TF e, assim, para identificar sitios de N-glicosilagao em ortologos de TF correspondentes aos locais em TF humano completamente formado TF, e o programa PILEUP que faz parte do GCG Software Package(Genetics Computer Grupo, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wis.). 0 PILEUP cria um alinhamento de multiplas sequencias a partir de um grupo de sequencias relacionadas utilizando alinhamentos no sentido de pares, progressives, para mostrar a relagao e percentual de identidade de sequencias. Ele tambem traga uma arvore ou dendrograma que mostra as relagoes de agrupamento usadas para criar o alinhamento. 0 PILEUP utiliza uma simplificagao do metodo de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle, J.Mol. Evol., 35: 351-360 (1987). Preferentemente, os residuos Asn nas posigoes 11, 124 e/ou 136 sao substituidos por Ala. Desta forma, em uma concretizagao preferida, a variante de TF que faz parte das microvesiculas e selecionada a partir do grupo de N11A, N124A, N137A, N11A e N124A, N11A e N137A, N124A e N137A e N11A, N124A e N137A no TF humano completamente formado TF. Em qualquer outro ortologo, as mutapoes ocorrerao nos correspondentes residues de Asn que formam os locais de consenso de glicosilagao N-encadeado.

[0090] Adicionalmente, como no caso de uma proteina de TF, o fragmento da proteina de TF dotado de atividade pro-coagulante usado na execupao desta invenpao pode ser um elemento de uma proteina de fusao, a dita proteina de fusao contendo uma primeira regiao que compreende o seu dito fragmento de proteina de TF que tern atividade pro-coagulante, ligada a segunda regiao que compreende outro peptidio ou proteina. A dita segunda regiao pode ser ligada a regiao amino-terminal da dita proteina de fragmento de TF ou, alternativamente, a dita segunda regiao pode ser ligada a regiao carboxil-terminal do dito fragmento de proteina de TF. Tanto a primeira quanto a segunda regioes podem ser ligadas diretamente ou ligadas atraves de um polipeptidio vinculador entre dita primeira e segunda regioes.

[0091] Em uma concretizapao particular, a dita proteina de fusao compreende um fragmento da proteina de TF dotado de atividade pro-coagulante e a marcador ligada ao dominio de C-terminal ou N-terminal da dita proteina de fragmento de TF. 0 dito marcador e de uma maneira geral um peptidio ou sequencia de aminoacidos que pode ser usada no isolamento ou purificagao da dita proteina de fusao. Exemplos ilustrativos, nao-limitativos de marcas adequadas para a produgao desta proteina de fusao incluem aqueles mencionados anteriormente em conexao com a proteina de fusao em que a primeira regiao foi uma proteina de TF. Em uma concretizagao particular, o dito marcador e uma marca- His ligada ao dominio de C-terminal da dita proteina de TF ou seu fragmento dotado de atividade pro-coagulante. De acordo com outra concretizagao, o dito marcador e uma marca-His ligada ao dominio de N-terminal da dita proteina de TF ou seu fragmento dotado de atividade pro-coagulante. Esta proteina de fusao tambem tem atividade pro-coagulante, sendo que a sua atividade pro-coagulante pode ser ensaiada tai como mencionada anteriormente, por exemplo, por meio de qualquer um dos ensaios de coagulagao mencionados no Exemplo 4.

[0092] De acordo com a invengao, uma parte da dita proteina de TF ou seu fragmento que tem atividade pro- coagulante e integrada na dita membrana de levedura. Normalmente, a dita parte compreende a regiao lipofila da dita proteina ou fragmento (isto e, o dominio central de TF) , enquanto que as suas regioes hidrofilas (isto e, a regiao amino-terminal e a regiao carboxil-terminal da dita proteina de TF) ficam voltadas para o lado exoplasmatico ou lado endoplasmatico da membrana. Informagao relacionada com as regides lipofilas e hidrofilas da proteina de TF pode ser obtida a partir da Figura 2 que mostra um tragado de hidropatia de uma proteina de TF. 0 Exemplo 1, Segao 1.4 mostra que a dita proteina de TF ou seu fragmento que tern atividade pro-coagulante e integrada na membrana (isto e, ela e uma proteina associada a. membrana) .

[0093] De acordo com uma concretizagao particular, o dominio N-terminal da proteina de TF ou do seu fragmento que tern atividade pro-coagulante fica voltado para o lado exoplasmatico da dita membrana, enquanto que de acordo com outra concretizagao particular o dominio N-terminal da dita proteina de TF ou fragmento que tern atividade pro- coagulante fica voltado para o lado endoplasmatico da dita membrana (Figura 27).

[0094] A dimensao da microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao pode variar dentro de uma faixa relativamente ampla, usualmente a dita dimensao e igual ou mais baixa do que 1 pm, tipicamente igual a ou mais baixa do que 0,1 pm. Em uma concretizagao particular, a dimensao da microvesicula carreadora de TF derivada de leveduras da invengao varia entre 0,1 ate 0,01 pm, conforme determinado por meio de microscopia eletronica (Exemplo 1, Segao 1.6). Processo para produzir microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao A microvesicula carreadora de TF derivada de leveduras da invenQao pode ser obtida, tipicamente, por meio de tecnicas recombinantes. Desta maneira, de acordo com outro aspecto, a invenpao refere-se a um processo para a fabricapao de uma microvesicula carreadora de TF derivada de levedura que tern atividade pro-coagulante (isto e, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao), doravante chamado de o "processo da invenpao", que compreende: a) submeter uma cultura de celulas de levedura recombinantes que expressam proteina de TF ou um fragmento desta que tern atividade pro-coagulante para fermentapao sob condipoes que permitem a expressao da dita proteina de TF, ou seu fragmento que tern atividade pro-coagulante; b) peletizar o produto resultante da fermentapao da etapa a), para proporcionar um produto de fermentapao; c) submeter o dito produto de fermentapao proveniente da etapa b) a homogeneizapao, para proporcionar um homogenado de fermentapao; e d) submeter o dito homogenado de fermentapao proveniente da etapa c) a separapao, para proporcionar uma pilula e um extrato de levedura clarificado (CYE) que contem a dita microvesicula carreadora de TF derivada de levedura que tern atividade pro-coagulante (isto e, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao); e) coletar o dito extrato de levedura clarificado (CYE) que contem a dita microvesicula carreadora de TF derivada de levedura que tem atividade pro-coagulante; e, opcionalmente, f) se desejado, isolar ou purificar as ditas microvesiculas carreadoras de TF derivadas de levedura que tem atividade pro-coagulante.

[0095] As celulas de levedura recombinantes que expressam proteina de TF ou um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante podem ser obtidas por metodos recombinantes convencionais conhecidos daqueles versados na tecnica. Sucintamente, a celula de levedura e transformada com um vetor de expressao de levedura que compreende a codificagao de sequencia de nucleotidios para a proteina de TF ou um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante, encadeada operacionalmente a um promotor funcional de levedura.

[0096] A codificagao de cDNA para proteina de TF ou um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante pode ser amplificada pela reagao de cadeia de polimerase (PCR) utilizando-se uma biblioteca de cDNA como gabarito e os preparadores apropriados. 0 Exemplo 1 expoe a amplificagao da codificagao do cDNA para a proteina de hTF completamente formada; o Exemplo 2 expoe a amplificagao da codificagao de cDNA para a proteina de hTF completamente formado com 18 nucleotidios extras (codificagao para seis histidinas) na extremidade 3' ; e o Exemplo 3 expoe a amplificagao da codificagao de cDNA para uma forma truncada da proteina de hTF (TTF) r que contem o dominio de interapao para o Fator X, a regiao de transmembrana, e a caudacitoplasmatica com 18 nucleotidios extras (codificagao para seis histidinas) na extremidade 3' .

[0097] Da maneira que e utilizado neste contexto, "vetor" refere-se a uma molecula de acido nucleico capaz de transportar outro acido nucleico ao qual ela foi vinculada. 0 termo "vetor de expressao de levedura" tai como usado neste contexto, refere-se a construpoes de expressoes de DNA, por exemplo, segmentos de acido nucleico, plasmidios, cosmidios, fagios, virus ou particulas de virus capazes de sintetizarem as proteinas em aprepo codificadas por seus genes recombinantes respectivos (isto e, proteina de TF ou um fragmento desta que tern atividade pro-coagulante) carreados pelo vetor em uma levedura. Alternativamente, segmentos de acido nucleico tambem podem ser usados para criar celulas de levedura transgenicas, utilizando-se recombinapao nao direcional ou homologa, em que o gene ou genes de interesse sao integrados de forma estavel no genoma de levedura. Normalmente, o vetor de expressao de levedura compreende a codificapao de sequencias de nucleotidios para TF ou um fragmento destes que tern atividade pro-coagulante vinculada operacionalmente a um promotor que e funcional em celulas de levedura (isto e, um promotor funcional de levedura).

[0098] Os vetores para o uso com a invenpao sao, por exemplo, vetores capazes de replicapao e/ou expressao autonoma de acidos nucleicos aos quais eles estao encadeados nas celulas de levedura. No presente relatorio, os termos "plasmidio" e "vetor" sao usados permutavelmente quando o plasmidio e a forma mais comumente usada de um vetor. Alem disso, a invenpao destina-se a incluir essas outras formas de vetores de expressao que servem a funpoes equivalentes e que se tornam conhecidas na tecnica subsequentemente a este assunto. 0 dito vetor de expressao de levedura pode ser um vetor de expressao episomal de levedura ou um vetor de expressao integrativa de levedura, e eles podem ser obtidos por meio de tecnicas convencionais conhecidas da pessoa versada na tecnica.

[0099] Desta forma, de acordo com uma concretizagao, o dito vetor de expressao de levedura e um vetor de expressao epissomica de levedura. 0 termo "vetor de expressao epissomica de levedura", tal como usado neste contexto, refere-se a um vetor de expressao que e mantido como uma molecula de DNA extra-cromossomica no citoplasma de levedura. Em uma concretizapao particular, o dito vetor de expressao epissomica de levedura, adicionalmente a codificagao de sequencia de nucleotidios para a proteina de TF ou um fragmento desta que tern atividade pro-coagulante vinculada operacionalmente a um promotor funcional de levedura, compreende ainda: (i) um gene de selepao de levedura; (ii) uma origem de replicagao de levedura; (iii) um gene de selegao bacteriana; e (iv) um sinal de termino de transcrigao de levedura. Vantajosamente, o dito vetor de expressao epissomica de levedura compreende ainda um sitio de restrigao unico para clonagem do gene selecionado (proteina de TF ou um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante) sob o controle do promotor funcional de levedura e seguido pelo sinal de termino de transcrigao de levedura.

[00100] Praticamente qualquer promotor funcional de levedura, gene de selegao de levedura, origem de replicagao de levedura, gene de selegao bacteriana, sinal de termino de transcrigao de levedura, e sitio de restrigao para clonagem, pode ser usado na fabricagao do dito vetor de expressao epissomica de levedura; nao obstante, em uma concretizagao particular, utiliza-se o promotor de deidrogenase gliceraldeido-3-fosfato (pGPD) como o promotor funcional de levedura; de acordo com outra concretizagao particular, o gene URA3 (URA3) e usado como o gene de selegao de levedura; de acordo com outra concretizagao particular, utiliza-se a origem de replicagao de 2 micrometros (2p) de levedura como a origem de replicagao de levedura; de acordo com outra concretizagao particular, utiliza-se o gene de resistencia a ampicilina (Amp) como o gene de selegao bacteriana; e de acordo com outra concretizagao particular, utiliza-se o sinal de termino de transcrigao da quinase de fosfoglicerato (PGKt) como o sinal de termino de transcrigao de levedura especifico. Desta forma, em uma concretizagao especifica (Exemplos 1- 3) , o vetor de expressao epissomica de levedura compreende (i) o gene de URA3; (ii) o gene de Amp para selecionar e propagagao do vetor em E. coli; (iii) a origem de replicagao de 2p levedura; (iv) o pGPD; (v) o sinal de termino de transcrigao de levedura especifico de PGKt; e (vi) um sitio de restrigao de BamHI unico que permite a clonagem de genes selecionados sob o controle do pGPD, e seguido pela sequencia de PGKt.

[00101] De acordo com outra concretizagao, o dito vetor de expressao de levedura e um vetor de expressao integrante de levedura. 0 termo "vetor de expressao integrante de levedura", tai como usado neste contexto, refere-se a um vetor que e capaz de integrar o genoma de levedura. Em uma concretizagao particular, o referido vetor de expressao integrante de levedura compreende: (i) um gene de selegao bacteriano; e (ii) um cassete de expressao inserido em um gene de selegao de levedura, sendo que o dito cassete de expressao compreende ainda um promotor funcional de levedura, um sinal de termino de transcrigao de levedura e a sinal de termino de transcrigao de levedura e um sitio de restrigao unico para clonagem do gene selecionado (proteina de TF ou um fragmento desta que tern atividade pro-coagulante).

[00102] Praticamente qualquer gene de selegao bacteriana, cassete de expressao inserido em um gene de selegao de levedura, promotor funcional de levedura, sinal de termino de transcrigao de levedura, e sitio de restrigao unico para clonagem do gene selecionado, pode ser usado na fabricagao do dito vetor de expressao integrante de levedura; nao obstante, em uma concretizagao particular, o gene de resistencia a ampicilina (Amp) e usado como o gene de selegao bacteriano; de acordo com outra concretizagao particular, o cassete de expressao pGPD-BamHI-PGKt inserido na regiao central do gene URA3 e usado como cassete de expressao que contem um promotor funcional de levedura a (pGDP), um sinal de termino de transcrigao de levedura (PGKt), e sitio de restrigao unico (BamHI) para clonagem do gene selecionado na regiao central do gene URA3.

[00103] Virtualmente qualquer celula de levedura suscetivel de ser transformada com o dito vetor de expressao de levedura que compreende a codificagao de sequencia de nucleotidio para a proteina de TF ou um fragmento desta que tern atividade pro-coagulante, vinculada operacionalmente a um promotor funcional de levedura, pode ser usada na presente invengao. A transformagao de celulas de levedura com o dito vetor de expressao de levedura pode ser realizada por meios convencionais conhecidos pela pessoa versada na tecnica (Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

[00104] De acordo com uma concretizagao preferida, a dita levedura e uma levedura nao floculante (isto e, celulas de leveduras que quando sao disperses em um processo de fermentagao nao se floculam (agregam)). Vantajosamente, a dita celula de levedura e uma celula de levedura GRAS. Exemplos ilustrativos, nao limitativos, de celulas de levedura que podem ser usadas no processo da invenpao sao as chamadas especies de levedura de licor (leveduras usados para produzir um licor) que produzem alcool, gas de acido carbonico, levedura de padaria, e assemelhados, pela metabolizagao de um liquido de material de fermentagao. Especificamente, os preferidos sao selecionados a partir de S. cerevisiae. Exemplos de tai levedura de licor incluem celulas de levedura de cerveja, celulas de levedura de vinho, e celulas de levedura de saque. De acordo com uma concretizagao preferida da invengao, a celula de levedura e uma celula de levedura de vinho, tai como S. cerevisae T73 ura3_ (Exemplos 1-3).

[00105] Uma vez que a celula de levedura e transformada, a etapa seguinte consiste em submeter a cultura de celulas de levedura recombinantes que expressam proteina de TF ou um fragmento desta que tem atividade pro- coagulante a fermentagao sob condigoes que permitem a expressao da dita proteina de TF, ou seu fragmento que tem atividade pro-coagulante. De acordo com uma concretizagao particular, a dita celula de levedura e desenvolvida em um meio adequado em que a dita celula de levedura pode expressar o produto heterologo desejado (proteina de TF ou seu fragmento que tern atividade pro-coagulante). Meios de cultura apropriados para o desenvolvimento de celulas de levedura sao amplamente conhecidos daqueles versados na tecnica e serao selecionados a partir daqueles mais apropriados em vista das celulas de levedura a serem cultivadas. Qualquer material para produzir um produto de fermentapao pode ser usado, na medida em que ele seja adequado para fermentapao causada pelas celulas de levedura nao aglutinantes empregadas, e materials conhecidos poderao ser utilizados a vontade. Por exemplo, maltes, sucos de frutas, liquidos de apucar, liquidos de cereais sacarificados, e assemelhados sao normalmente usados individualmente ou em combinapao conforme for apropriado na produpao de licores. Desta forma, nutrientes e assemelhados podem ser adicionados aos mesmos quando for necessario.

[00106] As condipdes de fermentapao nao sao diferentes das condipoes conhecidas em essencia e podem ser fixadas pela pessoa versada na tecnica. Em uma concretizapao particular, a fermentapao e seguida pelo controle da evolupao dos parametros principals durante o processo de fermentapao e e sustada quando a pressao de oxigenio (PO2) alcanpa uma condipao estacionaria.

[00107] O produto de fermentapao resultante proveniente da etapa de fermentapao a) e entao peletizado por metodos convencionais, tais como por centrifugagao, e novamente suspense em tampao de lise adequado antes da sujeigao do dito produto a homogeneizagao. As leveduras podem ser homogeneizadas por meio de metodos convencionais, por exemplo, por alta pressao em um homogeneizador para proporcionar um homogenado de fermentagao.

[00108] O homogenado de fermentagao e entao submetido a to separagao por meio de metodos convencionais, tais como por centrifugagao, para proporcionar uma pilula e um extrato de levedura clarificado (CYE) que contem a dita microvesicula carreadora de TF derivada de leveduras que tem atividade pro-coagulante (isto e, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao) que pode ser coletada separadamente. Um esquema geral para o processo da invengao encontra-se exposto na Figura 11.

[00109] A presenga da proteina de TF ou de um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante pode ser determinada por meio de metodos convencionais, tais como, por analise de mancha-oeste mediante utilizagao de um anticorpo monoclonal de proteina anti-TF especifica (mAb). Alem disso, a atividade pro-coagulante do CYE pode ser determinada por meio de qualquer ensaio convencional, tai como por qualquer um dos ensaios de coagulagao mencionados no Exemplo 4, por exemplo, tipicamente por um ensaio de coagulagao in vitro em plasma ou em sangue total nao- anticoagulado, e assemelhado.

[00110] Outros exames de amostras de CYE por microscopia imunoeletronica mostraram a presenga de microvesiculas derivadas de leveduras rotulados por mAb anti-TF na superficie das ditas microvesiculas. As ditas microvesiculas, que compreendem proteina de TF ou um fragmento desta que tern atividade pro-coagulante, sao igualmente dotadas de atividade pro-coagulante e correspondem as microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras da invengao.

[00111] Opcionalmente, se desejado, as ditas microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras que tern atividade pro-coagulante previamente obtidos de acordo com o processo da invengao podem ser concentradas, isoladas ou purificadas por meio de metodos convencionais conhecidos pela pessoa versada na tecnica. A titulo de ilustragao, a purificagao por meio de cromatografia de afinidade de proteinas que contem um marcador de peptidio (por exemplo, uma marca-His, ou outra assemelhada), seja no termino C- ou N-, constitui um metodo amplamente padronizado para se obterem preparados altamente purificados de um grande numero de proteinas. Como qualquer metodo cromatografico, o dito metodo pode ser facilmente aumentado. Procedimentos de purificagao alternativos, tais como cromatografia de imunoafinidade, podem ser realizados, muito embora eles requeiram a disponibilidade de estoques bem padronizados de anticorpos mono ou policlonais anti-TF especificos, especialmente para uma produpao aumentada.

[00112] Desta forma, o metodo de isolamento e purificagao dependera, entre outras coisas, da natureza da proteina de TF ou seu fragmento que tern atividade pro- coagulante, isto e, se ela for uma proteina de fusao que tem a marcador para ligapao a um ou mais ligantes de uma matriz de afinidade, tai como um suporte de cromatografia ou globulo com alta afinidade (por exemplo, uma marca-His, ou assemelhado), ou um epitope capaz de ser reconhecido por um anticorpo, tai como c-myc-marcador (reconhecido por um anticorpo anti-c-myc), e outros assemelhados.

[00113] A Figura 23 mostra esquematicamente um metodo para purificar microvesiculas derivadas de leveduras carreadores de uma proteina de TF recombinante (ou um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante) na forma da proteina de fusao fundida a uma marca-His [isto e, (microvesiculas derivadas de levedura carreadora de (proteina marca-His de TF) ou "Produto de Droga 6HT-TF" como mencionado na Figura 23]. Sucintamente, um extrato de levedura clarificado (CYE) obtido de acordo com o processo anteriormente exposto, que contem microvesiculas derivadas de levedura carreadora (TF-his-marcador de proteina), e filtrado (por exemplo, atraves de um filtro de dimensao de poro de 0,2 pm por filtragem de fluxo tangencial) antes de ser carregado sobre uma coluna de afinidade apropriada (por exemplo, coluna de afinidade HiTrap®); entao, depois de aplicagao da amostra, o fluxo passante e recuperado (material nao ligado), e a coluna e submetida a diversas lavagens e, depois da ultima lavagem, as microvesiculas derivadas de levedura carreadora (TF-his-marcador de proteina) sao submetidas a eluigao mediante adigao a coluna de um tampao apropriado (por exemplo, um tampao que contem imidazol) e as fragoes de eluigao sao coletadas e submetidas a dialise para proporcionar as microvesiculas derivadas de levedura carreadora (TF-his-marcador de proteina) derivadas de leveduras.

[00114] Desta forma, de acordo com outra concretizagao, as microvesiculas derivadas de levedura de carreador de TF da invengao podem ser purificadas por um equipamento AKTA prime. 0 AKTA prime e um sistema cromatografico de liquido automatizado proveniente da General Electric Healthcare que pode ser usado para o desenvolvimento de protocolos de purificagao padrao que poderao ser facilmente aumentados para grandes produgoes.

Metodo para a purificagao de microvesiculas que compreendem uma proteina de membrana de interesse a partir de um hospedeiro eucariotico

[00115] Os autores da presente invengao tambem observaram que as vesiculas presentes no extrato clarificado derivado das celulas expressoras de TF podem ser, alem disso, enriquecidas utilizando-se divisao de dimensao. Sem com isso se pretender ficar vinculado a qualquer teoria, acredita-se que a divisao de dimensao utilizando uma membrana que tern uma dimensao de poro definida permite a eliminagao de outros componentes do extrato de celulas que sao prejudiciais a atividade pro- coagulante da proteina. Acredita-se que o metodo desenvolvido pelos inventores e de uma maneira geral aplicavel a purificagao de qualquer proteina de membrana em uma hospedeira eucariotica na dita membrana. Desta forma, em um outro aspecto, a invengao refere-se a um processo para a fabricagao de uma preparagao de microvesiculas que compreende uma proteina de membrana de interesse que compreende as etapas de: (a) desenvolver uma cultura de uma celula hospedeira eucariotica sob condigoes capazes de permitirem a expressao da dita proteina de membrana de interesse; (b) submeter as celulas da cultura de (a) a homogenei zagao; (c) submeter o homogenado proveniente da etapa (b) a separagao, para proporcionar uma pilula e um extrato de celulas clarificado que contem as ditas microvesiculas derivadas de celulas que contem a proteina de membrana de interesse; (d) purificar as ditas microvesiculas derivadas de celulas por meio de divisao de dimensao.

Etapa (a) : Desenvolvimento de uma cultura de uma celula hospedeiraeucariotica

[00116] As hospedeiras eucarioticas que podem ser usadas no contexto da presente invenpao incluem quaisquer celulas que podem ser cultivadas no laboratorio ou em uma instalapao de produpao, mas, com maior preferencia, uma celula que pode ser manipulada geneticamente de maneira a permitir expressao dentro da celula de uma proteina de membrana de interesse. Hospedeiras que podem ser usadas na presente invenpao incluem levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) , celulas de insetos, celulas de plantas ou sistemas de celulas de mamiferos (por exemplo, COS, CHO, BHK, 293,3T3).

[00117] As hospedeiras eucarioticas usadas podem seja expressar a sua proteina como parte do proteoma normal ou podem ter sido modificadas pela introdupao de um acido nucleico exogeno que codifica a proteina de membrana de interesse. Nos dois casos, as celulas precisam ser cultivadas sob condipoes que permitem a expressao da proteina de membrana de interesse. Se a proteina de membrana de interesse for codificada por um acido nucleico, este acido nucleico pode ser colocado em um vetor sob o controle do promotor. Exemplos de promotores amplamente conhecidos que sao adequados para a execupao da invenpao incluem promotores constitutivos, tais como aqueles encontrados em alguns virus eucarioticos (virus polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus de sarcoma aviario, virus de hepatite B, promotor de gen metalotioneina, promoter de quinase de timidina de virus simplex de herpes, regibes de LTR de retrovirus, promotor de imunoglobulina, promotor de actina, promotor de EF-lalfa bem como promotores capazes de serem induzidos em que a em que expressao do gene de jusante requer adigao da substancia de um sinal exogeno para a cultura, tai como o promotor de tetraciclina, NFKappaB/luz UV, Cre/lox, promotores de choque termico, promotores de polimerase II de RNA regulavel descritos em WO/2006/135436, bem como promotores especificos de tecido, tais como o promotor de PSA descrito na W02006012221.

[00118] As celulas sao cultivadas utilizando-se qualquer meio de cultura adequado. A pessoa versada na tecnica apreciara que o meio de cultura tem de ser selecionado na dependencia do tipo de celula hospedeira a ser usada. Entretanto, uma ampla variedade de meios para cada tipo de celula encontra-se disponivel para aquelas pessoas versadas na tecnica, tais como descritos em Sambrook, J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory- Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) e Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992)).

[00119] Praticamente qualquer proteina de membrana pode ser expressa e purificada de acordo com o metodo da invengao. Se a proteina de interesse for uma proteina de membrana, entao a proteina pode ser expressa como tai, porque ela sera visada para o sistema de membrana da celula hospedeira desde que ela contenha uma sequencia de sinais. As proteinas de membranas que podem ser expresses utilizando-se o metodo da invenQao incluem receptores, transportadores tais como receptores de estrogeno, transportadores de aminoacidos, receptores androgenos, receptores de pituitaria, receptores de transferrina, receptores de progesterone, e transportadores de glicose. E igualmente possivel expressar proteinas soluveis utilizando-se o metodo da invengao se estas proteinas soluveis forem fundidas a uma sequencia de sinais no termino-N e a um dominio de transmembrana no termino-C. Desta maneira, a proteina de fusao sera inserida nas membranas da celula hospedeira e purificada nas microvesiculas. De acordo com uma concretizapao preferida, a proteina de membrana de interesse e rTF, um fragmento desta ou um mutante de N-glicosilapao desta tal como descrita anteriormente.

Etapa (b): Homogeneizapao

[00120] Na etapa (b) , as celulas da cultura sao homogeneizadas de maneira tal a proporcionarem um homogenado. As celulas precisam ser separadas em relagao ao meio de cultura utilizando-se qualquer tecnica disponivel para a pessoa versada (centrifugapao, sedimentapao, filtragem e assemelhados). Uma vez que as celulas estejam isoladas, estas sao submetidas a homogeneizapao de maneira a romper as paredes das celulas e membranas de plasma e para liberar o conteudo intracelular para o tampao em que e realizada a homogeneizagao. 0 rompimento das celulas e realizado utilizando-se qualquer metodo adequado conhecido na tecnica, tai como alta pressao, cavitagao de nitrogenio, choque osmotico utilizando-se um tampao hipotonico, tratamento com ultra-som, homogeneizagao mecanica, metodos de rompimento de tecido enzimoliticos, sonificagao. A homogeneizagao e realizada com a ausencia de qualquer detergente. Preferentemente, a homogeneizagao e realizada por alta pressao.

Etapa (c): Separagao do homogenado

[00121] O homogenado e entao fracionado por meios convencionais a firn de separar celulas nao rompidas e agregados grandes em relagao ao conteudo liberado a partir das celulas. Preferentemente, o fracionamento e realizado por centrifugagao a 13000xg. 0 sobrenadante obtido depois da centrifugagao e um extrato de celulas clarificado que compreende o material soluvel, bem como diferentes populagoes de microvesiculas de diferentes dimensoes que resultam da fragmentagao do sistema de membranas celulares.

Etapa (d): Purificagao de Divisao de Dimensao

[00122] O extrato de celulas clarificado obtido na etapa (c) e entao fracionado com base na dimensao das microvesiculas que formam o dito extrato de maneira a selecionar aqueles que tem uma dimensao de diametro especifica. Os autores da presente invenQao verificaram que podem ser usadas tecnicas de purificapao de divisao de dimensao para proporcionarem uma preparaQao de microvesiculas de pureza suficiente que pode ser administrada terapeuticamente sem etapas de purificapao adicionais, tais como cromatografia e outros metodos anteriormente considerados necessaries. Sem com isso se pretender ficar delimitado por qualquer teoria particular da invenpao acredita-se que as etapas de processamento dos extratos de celulas clarificados atraves de um fracionamento de divisao de dimensao resultam em um produto com uma carga de contaminantes reduzida. Alem disso, os contaminantes sao da dimensao e natureza que eles podem ser facilmente separados em relapao a microvesicula por meio de uma simples etapa de purificapao por divisao de dimensao.

[00123] A filtragem de membranas e uma tecnica amplamente conhecida no campo da tecnica de bioprocessamento. Uma membrana e definida como uma estrutura que tern dimensoes laterals muito maiores do que a sua espessura, atraves da qual pode ocorrer a transferencia de massa sob uma variedade de forpas de acionamento. Conquanto muitos filtros possam ser considerados membranas, os filtros tambem incluem materials cujas dimensoes laterals nao sao usualmente 100 vezes maiores do que a sua espessura e cuja funpao de separapao e principalmente por captura de especies ou particulas atraves da sua espessura. Os parametros mais comuns usados para caracterizar membranas caem em tres categories gerais. Estas sao propriedades de transporte, caracteristicas de poros (geometricas), e propriedades de superficie (ou predominantemente quimicas). Nao obstante, as propriedades de transporte dependem significativamente das caracteristicas de poro e superficie. Muito embora a separagao de membranas possa ser mais lenta e um processo de volume mais baixo do que outros processes de separagao, a sua eficiencia torna-o um metodo que pode ser usado para recuperar pequenas quantidades de produtos valiosos.

[00124] Os sistemas de filtros de membranas podem ser concebidos em uma variedade de maneiras de forma a terem propriedades de filtragem diferentes. Os criterios de concepgao incluem: operagao em extremidade morta (com ou sem agitagao) ou modalidade de fluxo transversal; recuperagao plena ou parcial da mistura alimentada; aplicagao de pressao de transmembrana externa por meio de bombeamento, manta de gas inerte, ou evacuagao do lado permeado do dispositivo; e o uso de folhas planas (seja de forma simples ou acumulada), feixe de fibras ocas, ou membranas tubulares. Os metodos de separagao por divisao de dimensao utilizam uma membrana de divisao de dimensao que pode ser uma dialise ou outra membrana assemelhada como sera do conhecimento daqueles normalmente versados na tecnica. Materials de membrana de dialise adequados de utilidade na filtragem por membrana de divisao de dimensao da invengao incluem aqueles comercialmente disponiveis, tais como aqueles produzidos a partir de polietersulfona, policarbonato, nylon, polipropileno, e assemelhados. Fornecedores destes materials de membranas de dialise incluem Akzo-Nobel, Millipore, Inc., Poretics, Inc., e Pall Corp., a titulo de exemplo.

[00125] De acordo com uma concretizagao preferida, o fracionamento de dimensao baseado em membrana e uma filtragem de fluxo tangencial (TFF), tambem conhecida como "filtragem de fluxo transverse". A filtragem de fluxo tangencial e um processo de separagao acionado por pressao em que fluido e bombeado tangencialmente ao longo da superficie da membrana. Uma pressao aplicada serve para forgar uma parte do fluido incluindo contaminantes atraves da membrana para a dimensao de filtrado. Particulados e macromoleculas que sao excessivamente grandes para passar atraves dos poros de membrana sao retidos no lado de montante. Em contraste com as tecnicas de filtragem por fluido normal (NFF) em que os componentes retidos sao formados na superficie da membrana, a filtragem de fluxo tangencial varre os componentes retidos por meio do fluxo do fluido.

[00126] A TFF e classificada com base na dimensao dos componentes que estao sendo separados. Uma classificagao das dimensoes de poros das membranas e fornecida tipicamente como um valor em micrometros e indica que particulas maiores do que a classificapao serao retidas pela membrana. Um limite de peso molecular nominal (NMWL), por outro lado, e uma indicapao de que a maior parte das macromoleculas dissolvidas com pesos moleculares mais altos do que o NMWL e algumas com pesos moleculares mais baixos do que o NMWL serao retidas pela membrana. Uma forma do componente, sua capacidade de deformar-se, e sua interapao com outros componentes na solupao afetam todas elas a retenpao. Diferentes fabricantes de membranas utilizam diferentes criterios para designer as classes de NMWL para uma familia de membranas, mas aqueles normalmente versados na tecnica serao capazes de determinar a classificapao apropriada empiricamente.

[00127] A ultrafiltragem e uma das formas mais amplamente usadas de TFF e e usada para separar proteinas a partir de componentes tampao para permuta de tampao, dessalinizapao, ou concentrapao, mas tambem pode ser usada para filtragem dos extratos de celulas clarificados da invenpao. Dimensoes de proso tipicas para filtragem de microvesiculas variam de 0,2 ate 0,1 de micrometro. De acordo com uma concretizapao preferida, a TFF contem uma primeira membrana que tern uma dimensao de poro de 0,2 de micrometro e uma segunda membrana que tern uma dimensao de poro de 0,1 de micrometro, de forma que o espapo entre membranas acumula microvesiculas que tern um diametro entre 0,2 e 0,1 micrometros.

[00128] Na operagao da unidade de TFF, usa-se uma bomba para gerar fluxo da corrente de alimentagao atraves do canal entre duas superficies de membrana. Durante cada passagem de fluido sobre a superficie da membrana, a pressao aplicada forga uma parte do fluido atraves da membrana e dentro da corrente de filtrado. 0 resultado e um gradiente na concentragao de material de alimentagao a partir das condigoes de massa no centro do canal para as condigdes de parede mais concentrada na superficie da membrana. Existe tambem um gradiente de concentragao ao longo do comprimento do canal de alimentagao a partir da entrada para a saida (retentor) quando progressivamente mais fluido passa para o lado do filtrado. 0 fluxo de material de alimentagao ao longo da extensao da membrana provoca uma queda de pressao da alimentagao para a extremidade de retentor do canal. 0 fluxo no lado de filtrado da membrana e tipicamente baixo e havera pouca restrigao, de maneira tai que a pressao ao longo d comprimento da membrana no lado de filtrado e aproximadamente constante.

[00129] As membranas podem ser fabricadas a partir de varios materials que oferecem alternatives nas caracteristicas de lavagem e compatibilidade quimica. Materials que sao adequados incluem celulose, polietersulfona e outros materials conhecidos daqueles versados na tecnica. Em determinadas concretizagoes utiliza-se polietersulfona. As membranas de polietersulfona tipicas tendem a adsorver proteina bem como outros componentes biologicos, conduzindo a sujeira da membrana e fluxo diminuido. Algumas membranas sao modificadas hidrofilamente para serem mais resistentes a sujeira, tais como a Biomax (Millipore).

[00130] Aqueles versados na tecnica reconhecerao que varios tipos de modulos de TFF serao de utilidade na pratica da invengao. Modulos de TFF de utilidade incluem, sendo que nao se fica limitado aos mesmos, modulos de placa plana (tambem conhecidos como cassetes), modulos enrolados em espiral, e modulos de fibra oca.

[00131] Para qualquer modulo dado, parametros de processo chave podem ser entao facilmente otimizados por aqueles normalmente versados na tecnica. Tais parametros incluem taxa de fluxo transversal, pressao de transmembrana (TMP), controle de filtrado, area de membrana, e concepgao de diafiltragem. A taxa de fluxo transversal depende de qual o modulo que e selecionado. De uma maneira geral, uma taxa de fluxo transversal mais alta proporciona sob TMP igual e aumenta a agao de varredura atraves da membrana e reduz o gradiente de concentragao no sentido da superficie de membrana. Muitas aplicagoes de TFF aplicam um ponto de ajuste de pressao e fluxo transversal e o filtrado flui descontrolado e irrestrito para fora do modulo. Este e o tipo de operagao mais simples, mas em algumas circunstancias podera ser desejado usar algum tipo de controle de filtrado alem daquele conseguido pela simples ajustagem da pressao com a valvula de retentor. A area de membrana e selecionada depois da determinagao do fluxo de processo e do volume total a ser processado e tambem e dependente do tempo de processo.

[00132] A concentragao pode ser tipicamente realizada por centrifugagao a 2000-4500g, tal como entre 2500-4000g, ou entre 2750-3500g, ou entre 3000-3500g, tal como a 3000g ou 3100g ou 3200g ou 3300g ou 3400g ou 3500g.

[00133] Tipicamente, a centrifugagao pode ser realizada durante varias horas, por exemplo, durante mais do que uma hora, tal como durante 1-10 horas.

[00134] Para reduzir ao minimo quaisquer efeitos negativos na estabilidade do polipeptidio de interesse a centrifugagao pode, em particular, ser realizada a uma temperatura na faixa de 2-200°C, tal como na faixa de 3-15 graus Celsius ou na faixa de 3-10°C ou na faixa de 3-6 graus Celsius.

[00135] Os tampoes preferidos para o uso na TFF sao tampoes de fosfato, tampao HEPES ou tampao TRIS. Entretanto, o tampao em determinadas concretizagoes tern uma concentragao de 5 mM ate 15 mM, incluindo concentragoes de pelo menos 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, concentrapdes de mM situadas entre elas. Em determinadas concretizapdes, o tampao tem um pH situado entre cerca de 7,2 ate 7,5. Desta forma, de acordo com uma concretizapao o tampao tem um pH def 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5 ou valores de pH fracionarios entre eles. De acordo com outra concretizagao, o tampao permutador de tampao compreende, alem disso, 0,10 M ate 0,20 M NaCI e 3,5% ate 4,5% de sacarina.

[00136] De acordo com uma concretizapao preferida, a preparapao de microvesicula obtida depois da etapa de fracionamento de dimensao e ainda aplicada a uma segunda etapa de purificapao que permite a separapao das microvesiculas que tem a quantidade de proteina/atividade mais alta a partir de qualquer outro produto presente na amostra.

[00137] De acordo com uma concretizapao, a dita segunda etapa de purificapao e realizada por uma segunda etapa de f racionamento de dimensao. De acordo com outra concretizapao, a segunda etapa de purificapao pode ser realizada por meio de cromatografia de afinidade. Se as microvesiculas contiverem TF, entao a cromatografia de afinidade e realizada utilizando-se um composto que mostra afinidade com o TF (por exemplo, um anticorpo) . Se as microvesiculas contiverem uma proteina de fusao que compreende TF e a marca, a cromatografia de afinidade pode ser realizada mediante utilizapao de um ligante que mostra afinidade no sentido da dita marca. Preferentemente, a marcador e um marcador de hexahistidina, caso este em que a cromatografia de afinidade e realizada utilizando-se uma coluna de afinidade de metal.

[00138] Uma vez que a preparagao de microvesiculas foi purificada, o eluado da etapa de fracionamento e entao testado quanto a presenga da proteina de interesse e aquelas fragoes que contem a quantidade mais alta de proteina ou a atividade mais alta sao entao agrupadas e usadas diretamente. 0 perfil de eluigao da coluna pode ser testado quanto a presenga da proteina, utilizando-se quaisquer meios disponiveis conhecidos na tecnica para detectar a presenga da proteina dada (ELISA, Mancha-oeste, RIA e assemelhadas) ou pode ser testada quanto a presenga da atividade da proteina de interesse. A pessoa versada na tecnica apreciara que o teste de atividade dependera da proteina que esta sendo purificada. De acordo com uma concretizagao preferida, a proteina de interesse e TF e a atividade que pode ser detectada para identificar aquelas fragoes que contem as vesiculas que compreendem a dita proteina e a atividade pro-coagulante como explicada no Exemplo 5.

Usos terapeuticos da microvesicula carreadora de TF derivada de leveduras da invengao

[00139] Diferentes ensaios mostraram que a microvesicula carreadora de TF derivada de leveduras da invengao exibem atividade pro-coagulante. Efetivamente,Exemplo 4 inclui: a) ensaios in vitro demonstrando que a microvesicula carreadora de TF derivada de leveduras da invenpao causam formagao de grumos de fibrina e coagulagao do sangue em condigoes saudaveis e em pacientes; a saber, os ditos ensaios mostram que as ditas microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras da invengao sao capazes de coagular: plasma proveniente de pacientes saudaveis (ensaios de coagulagao em plasma); deficientes de plasma em FVIII, em FIX ou em FXI (ensaios de coagulagao em plasma); plasma proveniente de deficiencia de plaquetas adquirida (ensaios de coagulagao em plasma Trombocitopenico); plasma proveniente de plasma deficiente em FXI na presenga de um anticorpo de anti-FVII (ensaios de coagulagao em plasma); sangue proveniente de pacientes saudaveis (ensaios de coagulagao em sangue total nao-anticoagulado) ; e sangue proveniente de pacientes hemofilicos (ensaios de coagulagao em sangue total nao-anticoagulado); b) ensaios in vivo demonstrando que A levedura carreadora de TF derivado de microvesicula da invengao e um agente de utilidade para tratamento anti-hemorragico em modelos de hemorragia grave (por aplicagao diretamente no vaso sanguineo previamente seccionado); a saber, os ditos ensaios mostram que a dita microvesicula carreadora de TF derivada de levedura e de utilidade como um agente hemostatico topico em animais experimentais nao tratados e tratados com heparina. c) Ensaios in vivo demonstrando que a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao e um agente de utilidade para tratamento anti-hemorragico topico em modelos de hemorragia letal (por aplicagao diretamente no vaso sanguineo previamente seccionado); a saber, os ditos ensaios mostram que a dita microvesicula carreadora de TF derivada de levedura e de utilidade como um agente hemostatico topico em um modelo de animal de hemorragia letal por segao proxima de caudas de camundongo deficientes em FVIII.

[00140] Estes resultados mostram claramente que a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao e um agente pro-coagulante ou anti-hemorragico de utilidade para o tratamento topico de hemorragias em um paciente.

[00141] Desta forma, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao pode ser usada como um medicamento, ou seja, como um agente pro-coagulante, ou como um agente anti-hemorragico, particularmente como um agente anti-hemorragico para aplicagao no tratamento de hemorragias em um paciente.

[00142] Consequentemente, em um outro aspecto, a invenpao refere-se a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao como um medicamento. Em uma concretizapao particular, a invenpao refere-se a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao como um medicamento topico com atividade pro- coagulante (anti-hemorragica) adequado para tratar hemorragias em um paciente.

[00143] Muito embora a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao pudesse ser aplicada topicamente para o tratamento de hemorragia em um paciente, isto e, sem mistura-la com um veiculo farmaceuticamente aceitavel, uma vez que os componentes do extrato de levedura clarificado (CYE) que compreendem as ditas microvesiculas carreadoras de TF derivadas de levedura obtidas de acordo com o processo da invenpao sao substancialmente inocuos para um paciente, em geral, para administrapao a um paciente, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao sera formulada em uma forma de administrapao farmaceutica adequada para a sua administrapao, preferentemente, para a sua administrapao topica para o tratamento topico (sitio) de hemorragias.

[00144] Desta forma, em um outro aspecto, a invenpao refere-se a uma composipao farmaceutica, doravante chamada de a composipao farmaceutica da invenpao, que compreende uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao e um veiculo, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitavel. A dita composipao farmaceutica e entao formulada em uma forma de administrapao farmaceutica adequada para a sua administrapao a um paciente.

[00145] Entao, para a sua administrapao a um paciente, as microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras da invenpao serao formuladas em uma forma de administrapao farmaceutica, preferentemente uma forma de administrapao farmaceutica adequada para a sua administrapao topica, para cuja finalidade os carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitaveis adequados para a preparapao da forma de administrapao farmaceutica desejada serao incorporados. A informapao relacionada com os ditos carreadores e excipientes, bem como sobre as ditas formas de administrapao adequadas para a administrapao do dito produto da invenpao, pode ser encontrada em tratados de farmacia galenica. Uma recapitulapao das diferentes formas de administrapao farmaceutica de drogas em geral, e de seus processos de preparapao, pode ser encontrada na publicapao intitulada "Tratado de Farmacia Galenica"("Galenic Pharmacy Treatise"), by C. Fauli i Trillo, 1st Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones.

[00146] Muito embora pudessem ser usadas diferentes formas de administrapao farmaceutica das microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras da invengao, na pratica a administrapao do dito produto topicamente e mais vantajosa; portanto, as ditas microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras da invenpao serao formuladas em uma forma farmaceutica adequada para a sua administrapao topica. Exemplos ilustrativos, nao limitativos, das ditas formas farmaceuticas, incluem aerossois, solupoes, suspensoes, emulsoes, geis, pomadas, cremes, curatives, emplastros, unguentos, colutorios, e assemelhados. Para esse firn a composipao farmaceutica da invenpao incluira os veiculos, carreadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitaveis requeridos para preparar a forma de administrapao farmaceutica das microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras da invenpao para administrapao topica.

[00147] Portanto, em uma concretizapao particular, a composipao farmaceutica da invenpao e uma composipao farmaceutica para a administrapao topica de microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras da invenpao que compreende o dito produto e um veiculo, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitavel adequado para a administrapao topica das microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras da invenpao. Exemplos ilustrativos, nao limitativos, dos veiculos, carreadores ou farmaceuticamente aceitaveis mas para a administrapao topica das ditas microvesiculas carreadoras de TF derivadas de leveduras podem ser encontrados em tratados de farmacia galenica.

[00148] Em uma concretizapao particular, a composipao farmaceutica da invenpao compreende microvesiculas de levedura carreadora de TF que compreende proteina de TF humana, ou um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante, tai como, por exemplo, TF humano completamente formado ou um TF humano truncado (isto e, uma proteina de TF humano em que todo ou parte do dominio responsavel pela ligapao a FVIIa esta ausente ou uma proteina de TF humano mutante que tem atividade pro- coagulante em que o dominio responsavel pela ligapao a FVIIa nao e funcional).

[00149] As microvesiculas derivadas de levedura carreadora de TF da invenpao estarao presentes na composipao farmaceutica da invenpao em uma quantidade terapeuticamente efetiva. A dita quantidade pode variar dentro de uma ampla faixa, por exemplo, entre cerca de 1,0 pg de proteina ativa/ml e 1,0 mg de proteina ativa /ml, preferentemente entre 0,05 pg de proteina ativa/ml e 10 pg de proteina ativa/ml, e ainda com maior preferencia entre cerca de 0,1 pg de proteina ativa /ml e 2,0 pg de proteina ativa/ml.

[00150] A dose de microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao a ser administrada ao paciente pode variar dentro de uma faixa muito ampla, por exemplo, entre cerca de 1,0 pg de proteina ativa/ml e 1,0 mg de proteina ativa/ml, preferentemente entre 0,05 pg de proteina ativa/ml e 10 pg de proteina ativa/ml, e ainda com maior preferencia entre cerca de 0,1 pg de proteina ativa/ml e 2,0 pg de proteina ativa/ml. A dose de microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao a ser administrada dependera de varios fatores, incluindo entre eles os aspectos da proteina de TF ou seu fragmento que tern atividade pro-coagulante usada, tais como, por exemplo, a sua atividade e semi-vida biologica, concentragao da proteina de TF ou seu fragmento que tern atividade pro-coagulante na formulagao, a condigao clinica do individuo ou paciente, o disturbio hemorragico a ser tratado e outros assemelhados. Por esta razao, as doses mencionadas neste contexto devem ser consideradas somente como orientagoes para aquela pessoa versada na tecnica, e esta pessoa devera ajustar as doses de acordo com as variaveis mencionadas anteriormente. Nao obstante, a composigao farmaceutica da invengao pode ser administrada uma ou mais vezes ao dia para propositos preventivos ou terapeuticos.

[00151] A composigao farmaceutica da invengao pode ser usada em conjunto com outras drogas adicionais de utilidade na prevengao e/ou tratamento da diatese hemorragica (por exemplo, fatores de coagulagao, plasma humano, e outros) para proporcionar uma terapia de combinapao. As ditas drogas adicionais podem ser partes desta composipao farmaceutica ou, alternativamente, elas poderao ser proporcionadas na forma de composipao separada para a sua administrapao simultanea ou sucessiva (sequencial em tempo) com relapao a administrapao da composipao farmaceutica da invenpao.

[00152] A composipao farmaceutica da invenpao tambem pode ser colocada em um suporte. Consequentemente, em um outro aspecto, a invenpao refere-se a um produto que compreende a composipao farmaceutica da invenpao e um suporte. 0 termo "suporte", tai como usado neste contexto, refere-se a um substrato de material adequado que permite a deposipao de uma composipao farmaceutica da invenpao no mesmo, a sua sustentapao e a sua liberapao no sitio desejado, por exemplo, no sitio onde a composipao farmaceutica da invenpao exerce o seu efeito terapeutico. 0 dito suporte pode ser um suporte solido ou um suporte nao solido, por exemplo, um suporte liquido ou um suporte gasoso. Exemplos ilustrativos, nao limitativos de suportes solidos incluem bandagens, curatives, compressas, emplastros e assemelhados. Exemplos ilustrativos, nao limitativos, de suportes liquidos incluem geis, sprays, colutorios, e assemelhados. Exemplos ilustrativos, nao limitativos de suportes gasosos incluem ar, propelentes e assemelhados.

[00153] Em uma concretizapao particular, a composigao farmaceutica da invenpao compreende microvesiculas de levedura carreadoraas de TF que compreende proteina de TF humana, ou um fragmento desta que tem atividade pro-coagulante, tai como, por exemplo, TF humano completamente formado ou um TF humano truncado (isto e, uma proteina de TF humano em que a totalidade ou parte do dominio responsavel pela ligapao a FVIIa esta ausente ou um mutante de proteina de TF humana que tem atividade pro- coagulante em que o dominio responsavel pela ligapao a FVIIa nao e funcional).

[00154] Este produto que compreende a composipao farmaceutica da invenpao depositada em um suporte pode ser obtida por meio de metodos convencionais, por exemplo, pela mistura de uma composipao farmaceutica da invenpao e do suporte. A interapao entre a composipao farmaceutica da invenpao e o suporte pode ser uma interapao fisica ou quimica, na dependencia da natureza dos componentes da composipao farmaceutica da invenpao e do suporte utilizado.

[00155] De acordo com outro aspecto, a invenpao refere-se ao uso da microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invenpao na fabricapao de um medicamento para o tratamento de hemorragias em um paciente, em particular, para o tratamento topico de hemorragias em um paciente saudavel ou em um paciente com diatese hemorragica.

[00156] O termo "tratamento topico", tai como usado neste contexto, refere-se a aplicagao do tratamento diretamente no sitio onde o mesmo e requerido, por exemplo, em secdes descontinuas da pele (cortes e assemelhados) e tecido vascular (vasos rompidos, e assemelhados) em hemorragia venosa ou arterial devida a ferimentos abertos, cirurgia e assemelhados, e hemorragias muco-cutaneas e micro-vasculares.

[00157] De acordo com esta invengao e tal como ilustrado no Exemplo 4, as microvesiculas derivadas de levedura carreadora de TF da invenpao podem funcionar como um agente pro-coagulante ou anti-hemorragico, e consequentemente, o dito produto pode ser usado para tratar ou corrigir disturbios hemorragicos, com particularidade aqueles disturbios hemorragicos associados com diatese hemorragica.

[00158] O termo "diatese hemorragica" refere-se ao processo que provoca um disturbio hemostatico e que como resultado da origem a ocorrencia da sindrome hemorragica a qual pode ocasionalmente acontecer com sangramento prolongado e excessive. A diatese hemorragica podera ser ocasionada por uma coagulopatia congenita ou adquirida e/ou por um disturbio de plaquetas congenito e adquirido.

[00159] O termo "coagulopatia" refere-se a um disturbio do fator de coagulapao. Este disturbio pode ser devido a uma deficiencia ou deficit de fator de coagulapao especlfico, cuja consequencia sera a ocorrencia da sindrome hemorragica, ou devido a um disturbio de fator de coagulagao. De uma maneira geral a coagulopatia pode ser uma coagulopatia congenita ou uma coagulopatia adquirida.

[00160] Como exemplos ilustrativos, nao limitativos, de coagulopatias congenitas, poderao ser mencionadas as deficiencies de fatores de coagulagao selecionados a partir de Fator V de coagulagao (FV), Fator VII de coagulagao (FVII), Fator VIII de coagulagao (FVIII), o deficit ou deficiencia que provoca hemofilia A, Fator IX de coagulagao (FIX) cujo deficit ou deficiencia provoca hemofilia B, Fator X de coagulagao (FX), Fator XI de coagulagao (FXI) cujo deficit ou deficiencia provoca a hemofilia C, Fator XII de coagulagao (FXII), Fator XIII de coagulagao (FXIII) e as suas combinagoes.

[00161] As coagulopatias adquiridas podem ter origens diferentes. Exemplos ilustrativos incluem as deficiencies de sintese de fator de coagulagao em falha hepatica grave, terapia anticoagulante (tai como heparina, heparinas de baixo peso molecular, warfarin, derivados de cumarina, dicumarinas, e assemelhados). Um mecanismo alternativo e baseado em um consume exagerado de fatores de coagulagao de forma tai que eles nao ficam disponiveis para formarem o coagulo em uma lesao de sangramento. Este mecanismo ocorre na sindrome de coagulagao intravascular disseminada ou coagulopatia devida a consungao que ocorre em enfermidades multiples, tais como em septicemia grave que danifica as plaquetas de ativagao de endotelio de microcirculagao e fatores de coagulagao com a formagao de multiples microtrombos; na invasao de sangue pelo TF tai como soltura placentaria; na retengao de um feto morto; em multiples traumas com o esmagamento de tecidos; em mordidas de cobras venenosas, e assemelhados. Em vasculite, a danificagao parietal e de endotelio libera ativadores de coagulagao. 0 consume de fatores de coagulagao piora pela lise da fibrina de numerosos microtrombos devido a agao de plasmina com liberapao de PDF, que sao antiplaquetas e anticoagulantes.

[00162] O termo "disturbio de plaquetas" refere-se a um disturbio tanto no numero quanto na capacidade funcional das plaquetas, cujo resultado e a ocorrencia da sindrome hemorragica. 0 dito disturbio de plaquetas pode ser congenito ou adquirido.

[00163] Em uma concretizagao particular, o dito disturbio de plaquetas e um disturbio de plaquetas congenito. Exemplos ilustrativos, nao limitativos de distiirbios de plaquetas congenitos incluem a enfermidade de Glanzmann, a doenga de Bernard Soulier, a sindrome de Bolin-Jamieson, a sindrome de Wiskott-Aldrich, a sindrome de Paris-Trousseau-Jacobsen, trombocitopenia de cromossomos X, sindrome de plaquetas de Gray, sindrome de Sebastian e anemia de Fanconi.

[00164] particular, o referido disturbio de plaquetas e um disturbio de plaquetas adquirido. Exemplos ilustrativos, nao limitativos, de disturbios de plaquetas adquiridos incluem disturbios mieloproliferantes, tais como trombocitemia, policitemia, leucemia mielocitica cronica, e outras; ha aqui disturbios de plaquetas funcionais em metaplasia mieloide com tempo de sangramento aumentado, defeitos de retengao de globules de vidro, defeito de agregagao de plaquetas, liberagao anormal, e defeito de fator de plaquetas III. Foram encontrados defeitos de plaquetas funcionais em disproteinemias em escorbuto e em enfermidade cardiaca congenita e cirrose.

[00165] Os termos "coagulopatia adquirida" e "disturbio de plaquetas adquirido" referem-se a origem do disturbio, que pode ser iatrogenico ou secundario a outras enfermidades.

[00166] O termo "paciente" tal como usado neste contexto inclui qualquer elemento de uma especie animal, incluindo a especie humana; a titulo de um exemplo ilustrativo, nao limitative, o dito paciente pode ser um mamifero, tal como um primata, um animal domestico, um roedor, e outros, sendo que o dito paciente e preferentemente um homem ou mulher de qualquer idade e raga. Em uma concretizagao particular, o dito paciente e um ser humano sem historico de disturbios de hemostase, tais como um individuo que nao tern coagulopatias ou disturbio de plaquetas. De acordo com outra concretizapao particular, o dito paciente e um ser humano que tem um historico de disturbios de hemostase, tais como um individuo que tem diatese hemorragica, por exemplo, uma coagulopatia, tai como uma coagulopatia congenita ou adquirida, ou um disturbio de plaquetas, tai como um disturbio de plaquetas congenito ou adquirido.

[00167] Portanto, em uma concretizagao particular, a invenpao refere-se ao uso de microvesiculas derivadas de levedura carreadoraas de TF da invenpao na fabricapao de um medicamento para o tratamento topico de hemorragias em um ser humano sem historico de disturbios de hemostase. De acordo com outra concretizapao particular, a invenpao refere-se ao uso de microvesiculas derivadas de levedura carreadoraas de TF da invenpao na fabricapao de um medicamento para o tratamento topico de hemorragia em um ser humano que tem uma diatese hemorragica.

[00168] Tai como mencionado anteriormente, para administrapao topica ao paciente, as microvesiculas derivadas de levedura carreadoraas de TF da invenpao serao formuladas em uma forma farmaceutica adequada para a sua administrapao topica para tratamento topico (sitio) de hemorragias em um paciente. Exemplos ilustrativos, nao limitativos das ditas formas farmaceuticas incluem aerossois, solupoes, suspensoes, emulsoes, geis, pomadas, cremes, ataduras, emplastros, unguentos, colutorios, e assemelhados. Para tai finalidade, a composigao farmaceutica que compreende microvesiculas derivadas de levedura carreadoraas de TF da invenpao incluira os veiculos, carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitaveis requeridos para a preparapao da forma de administrapao farmaceutica escolhida. Informapao referente a composipao farmaceutica (forma de administrapao farmaceutica, doses, quantidade de componente ativo, e assemelhados) ja foram mencionados em conexao com a composipao farmaceutica da invenpao.

[00169] Tambem foi reportado que o TF induz angiogenese e produpao aumentada de VEGF (Ollivier et al., 2000, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 20:1374-1381; Chen et al., 2000, Thromb.Haemost., 86:334-345 y Watanabe et al., 1999, Thromb.Res., 96:183-189). Desta forma, em um outro aspecto, a invenpao refere-se as microvesiculas derivadas de levedura da invenpao para o tratamento de enfermidades em que e requerida uma angiogenese aumentada ou migrapao de celulas aumentada.

[00170] As enfermidades associadas com uma angiogenese diminuida e que podera beneficiar-se do tratamento das composipoes promotoras de angiogenese da invenpao incluem enfermidade das arterias coronarias, por exemplo, miocardio isquemico, infarto do miocardio, cardiopatia isquemica ou enfermidade arterial periferica, tai como claudicapao de isquemia de limbo cronica (musculo esqueletal) ou dor de inagao/ulceragao isquemica/gangrena. A promogao de angiogenese e requerida bem como em ataque isquemico/neuropatia, tal como tecido do cerebro/nervo, por exemplo, pneumbra isquemico depois de ataque/infarto. Alternativamente, o efeito proangiogenico das composigoes da invengao pode ser usado para promover a cura e/ou endotelializagao de superficies luminares intravasculares, por exemplo, para promover a endotelializagao de placa aterosclerotica instavel/ulcerada, por exemplo, em arterias coronarias/carotidas, ou nas superficies luminares de- endotelializadas, tais como aquelas encontradas em seguida a uma endarterectomia, por exemplo, dentro da arteria da carotida, trombectomia (seja/ou arterial/venosa), angioplastia, tal como balao, laser, ou angioplastia criogenica, uma aterectomia, ou em seguida a trombose, por administragao de uma composigao que inclui um agente de oxido nitrico. As composigoes proangiogenicas da invengao tambem podem ser de utilidade na resolugao de trombose arterial e/ou venosa aguda ou cronica, por exemplo, revascularizagao e/ou neovascularizagao e/ou recanalizagao. De acordo com outra concretizagao, as composigoes da invengao promovem o desenvolvimento de globules neocapilares para aplicagbes de terapia de genes, aplicagoes de regeneragao de orgaos, e para c91ocagao de orgaos hibridos bioartificiais (por exemplo, pancreas, rim, pulmao, figado) bem como promogao e/ou aumento da cura de lesoes e/ou para promogao de tecido de granulagao, por exemplo, para lesoes cronicas, tais como lesoes isquemicas, diabeticas, neuropaticas, baseadas em condigao venosa.

[00171] Reportou-se que o TF promove a migragao de celulas (Ott et al., 2005, Circulation, 111:349-355 e W00105353). Desta forma, em um outro aspecto, a invengao refere-se as composigoes que compreendem o TF da invengao para promover a migragao de celulas em pacientes com necessidade destas. Sera apreciado que diferentes enfermidades podem ser tratadas com as composigoes da invengao da dependencia do tipo de celula cuja migragao e estimulada. Por exemplo, pacientes que padecem de uma lesao em um lumen corporeo, tai como um vaso sanguineo, arteria, arteria coronaria, veia de lumen esofagico, e uretra requerem um estimulo da migragao de celulas endoteliais; pacientes que sofrem de lesoes no sistema nervoso central como um resultado de choque isquemico e hemorragico, e a partir de lesao traumatica necessitara de um estimulo para a migragao de celulas neurais para o sitio da lesao; pacientes que padecem de ulceras que podem ser cronicas e resistentes ao tratamento, por exemplo, em pacientes diabeticos e idosos, por exemplo, ulceras das pernas e escaras de decubito, lesoes corneanas, queimaduras, abrasoes, incisoes cirurgicas, locais de enxerto doador, e lesoes causadas por agentes infecciosos). Outras condigoes medicas que podem ser tratadas sao condigoes cronicas (tais como ulcera venosa cronica, ulcera diabetica, ulcera de compressao, escaras de pressao, e ulceras ou escaras da superficie da mucosa), lesoes de superficie da pele e epitelial causadas por uma condigao inflamatoria ou infecgao persistente, ou por um defeito genetico (tai como formagao de queloide e anormalidades de coagulagao) serao beneficiadas por um estimulo da migragao de celulas epiteliais necessarias para repovoar o tecido danificado.

Composigao que compreende microvesiculas derivadas de levedura carreadora de TF da invengao

[00172] De acordo com outro aspecto, a invengao refere-se a uma composigao, doravante chamada a "composigao da invengao", que compreende microvesiculas derivadas de levedura carreadora de TF da invengao e um veiculo.

[00173] Praticamente, qualquer veiculo que nao afete prejudicialmente as microvesiculas derivadas de levedura carreadora de TF da invengao pode ser usado na dita composigao da invengao.

[00174] De acordo com uma concretizagao, o dito veiculo compreende um meio substancialmente liquido, tai como o meio que circunda as microvesiculas derivadas de levedura carreadora de TF da invengao obtido por operagao do processo da invengao. Consequentemente, em uma concretizagao particular, a composigao da invengao compreende o extrato de levedura clarificado obtido na operagao do processo da invengao.

TF truncado desprovido de todo ou parte do dominio responsavel pela ligapao ao FVIIa

[00175] Tal como mencionado anteriormente, surpreendentemente os inventores descobriram que uma proteina de TF truncado, que e incapaz de ligapao ao FVIIa, tern atividade pro-coagulante. Tal como pode ser observado no Exemplo 4, os inventores mostraram que a dita forma truncada da proteina de TF tern atividade pro-coagulante em um ensaio de coagulapao em plasma.

[00176] Desta forma, em um outro aspecto, a presente invenpao refere-se a um TF truncado desprovido de todo ou parte do dominio responsavel pela ligapao a FVIIa, doravante chamado de "TF truncado desprovido de dominio de ligapao a FVIIa da invenpao", em que todo ou parte do dominio responsavel pela ligapao a FVIIa esta ausente, e, consequentemente, ele e incapaz de ser ligado a FVIIa, mas tern atividade pro-coagulante. Por extensao, o dito "TF truncado desprovido de dominio de ligapao a FVIIa da invenpao" inclui mutantes de proteina de TF que tern atividade pro-coagulante, em que o dominio responsavel por ligapao a FVIIa nao e funcional devido a mutapoes.

[00177] O TF truncado desprovido de dominio de ligapao a FVIIa da invenpao pode ser obtido por meios convencionais, por exemplo, por meio de expressao de gene da sequencia de nucleotidios que codifica a dita proteina em um sistema de expressao adequado (levedura, bacterias, celulas eucarioticas, celulas de insetos, e assemelhados).

[00178] Com a finalidade de se determinar se o TF truncado desprovido de dominio de ligagao a FVIIa da invenpao e capaz de ligagao a FVIIa, podem utilizar-se ensaios de ligagao tais como aquele descrito na publicagao internacional WO00/04148. Adicionalmente, a atividade pro- coagulante do TF truncado desprovido de dominio de vinculagao a FVIIa da invengao pode ser ensaiada tai como foi mencionado anteriormente, por exemplo, por meio de qualquer um dos ensaios de coagulagao mencionados no Exemplo 4, tais como por meio de um ensaio de coagulagao in vitro in plasma, ou por um ensaio de coagulagao in vitro em sangue total nao-anticoagulado, ou por um ensaio in vivo em um modelo de animal de hemorragia grave ou por meio de um ensaio in vivo em um modelo de animal de hemorragia letal, tais como aqueles ensaios mencionados no Exemplo 4.

[00179] Em uma concretizagao particular, o dito TF truncado desprovido de dominio de ligagao a FVIIa da invengao compreende o dominio de interagao para o Fator X, a regiao de transmembrana e a caudacitoplasmatica e ausencias, parcialmente ou totalmente, do dominio responsavel pela ligagao a FVIIa. Alem disso, em uma concretizagao especifica, o referido TF truncado desprovido de dominio de ligagao a FVIIa da invengao e uma forma truncada da proteina de TF humano que contem o dominio de interagao para o Fator X (aa 174-251), a regiao de transmembrana (aa 252-274), e a caudacitoplasmatica (aa 275-295) e um marcador de histidina extra (Exemplo 3). Os inventores descobriram agora, surpreendentemente, que a dita forma truncada da proteina de TF, desprovida do dominio responsavel pela ligapao a FVIIa, e dotada de atividade pro-coagulante (Exemplo 4, Tabela 3).

[00180] De acordo com outra concretizapao particular, o TF e modificado por uma ou mais mutapoes de ponto no dominio de ligapao de FVIIa, de forma que o dito dominio nao e mais capaz de ligapao a FVIIa. Mutapoes de ponto no dominio de TF de ligapao a FVIIa que se sabe abolirem a ligapao ao dito FVIIa sao conhecidas na tecnica (por exemplo, aquelas descritas por Kelley, R.F. et al., 1995, Biochemistry, 34:10383-10392, cujo conteudo e, portanto, incorporado por referenda na sua totalidade) .

[00181] Observou-se, surpreendentemente, que o dito fragmento de TF, desprovido da totalidade ou parte do dominio responsavel pela ligapao a FVIIa, tem atividade pro-coagulante uma vez que, como e amplamente conhecido, no caminho extrinseco de coagulapao do sangue, o TF liga-se aos FVII/FVIIa circulantes para formar o complexo TF::FVIIa e, na presenpa de calcio, funcionar como um substrato de maneira tai que ocorre a ativapao de FX. E aceito que na eventualidade de a hemorragia produzida por uma lesao vascular, a coagulapao e disparada devido a ativapao do caminho extrinseco que envolve a interapao de TF com o seu ligante, FVII/FVIIa.

[00182] O TF truncado desprovido de dominio de ligaQao ao FVIIa da invengao pode ser glicosilado ou nao. Desta forma, em uma concretizapao particular, o TF truncado desprovido de dominio de ligagao ao FVIIa da invengao nao e glicosilado, enquanto de acordo com outra concretizagao particular, o dito TF truncado desprovido de dominio de ligagao ao FVIIa da invengao e glicosilado. Conforme mencionado anteriormente, o termo "glicosilado" inclui qualquer grau de glicosilagao.

MutantesdeTFcarreadoresdeumoumaissitiosde glicosilagao nao-funcionais

[00183] Conforme mencionado anteriormente, os autores da presente invengao tambem observaram que a atividade pro-coagulante de TF, bem como a sua expressao em celulas hospedeiras de levedura e aumentada quando o dito TF realiza mutagoes nos sitios de glicosilagao que impedem a vinculagao de, pelo menos, uma das tres cadeias de glicosil N-encadeadas encontradas no TF do tipo silvestre. Desta forma, em uma concretizagao particular, a microvesicula derivada de levedura carreadora de TF da invengao compreende um fragmento nao-glicosilado da proteina de TF que e dotado de atividade pro-coagulante. Tal como mencionado anteriormente, o termo "glicosilado" inclui qualquer grau de glicosilagao. De acordo com uma concretizagao preferida, a variante de TF e um polipeptidio em que pelo menos um dos sitios de N-glicosilapao de TF foi modificado de maneira a torna-lo nao funcional, isto e, incapaz de servir como sitio de aceitapao para a adipao de cadeias de glicosidio. Os sitios de N-glicosilapao na sequencia de TF que podem ser modificados sao aqueles previamente mencionados, isto e, o sitio Asn1:L-Leu12-Thr13, o sitio Asn124-Val125-Thr126 e/ou o sitio Asn137-Asn138-Thr139. Qualquer modificapao das regioes de consenso de N- glicosilapao e adequada, na medida em que a adipao da cadeia de glicosil N-encadeada seja abolida ou substancialmente inibida. Preferentemente, a modificapao e introduzida no residue Asn correspondente as posipoes 11, 124 e/ou 136 no TF humano completamente formado, uma vez que este e o residuo que serve como aceitante para a vinculapao da cadeia de glicosil. Tais como usados na presente invenpao "sitios correspondentes aos sitios 11, 124 e/ou 136 no TF humano completamente formado" referem-se aos sitios de N-glicosilapao em outros ortologos de TF que possam aparecer em uma posipao diferente na cadeia de polipeptidios, mas que coincidem com os sitios de N- glicosilapao no TF humano completamente formado quando as sequencias humanas e ortologas sao alinhadas com base na similaridade de sequencias. Um algoritmo adequado para alinhamento ou multiplas sequencias de TF e, desta forma, para identificagao de sitios de N-glicosilapao em ortologos de TF correspondentes aos sitios no TF humano completamente formado e o programa PILEUP que faz parte do GCG Software Package(Genetics Computer Grupo, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wis.). 0 PILEUP cria um alinhamento de multiples sequencias a partir de um grupo de sequencias relacionadas utilizando-se alinhamentos progressives por pares para mostrar a relagao e percentual de identidade de sequencias. Ele tambem traga uma arvore ou dendrograma mostrando as relagoes de agrupamento usadas para criar o alinhamento. 0 PILEUP utilize uma simplificagao do metodo de alinhamento progressive de Feng e Doolittle, J.Mol. Evol., 35: 351-360 (1987). Preferentemente, os residues Asn nas posigoes 11, 124 e/ou 136 sao substituidos por Ala. Desta forma, de acordo com uma concretizagao preferida, a variante de TF que forma parte das microvesiculas e selecionada a partir do grupo de N11A, N124A, N137A, N11A e N124A, N11A e N137A, N124A e N137A e N11A, N124A e N137A no TF humano completamente formado. Em qualquer outro ortologo de TF, as mutagdes ocorrerao nos correspondentes residues Asn que formam os sitios de consenso de glicosilagao N-encadeada.

[00184] O TF truncado desprovido de dominio de ligagao ao FVIIa, o TF de mutante carreador de um dominio de ligagao ao FVIIa nao funcional e os mutantes de TF carreadores de um ou mais sitios de N-glicosilagao nao funcionais da invengao podem estar na forma de um elemento da proteina de fusao, a dita proteina de fusao contendo uma primeira regiao que compreende o dito TF truncado desprovido de dominio de ligapao ao FVIIa, o dito TF de mutante carreando um dominio de ligapao ao FVIIa nao funcional e os ditos mutantes de TF carreando um ou mais sitios de N-glicosilapao nao funcionais da invenpao ligados a segunda regiao que compreende outro peptidio ou proteina. A dita segunda regiao pode ser ligada a regiao amino- termino do dito TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa, com o dito TF de mutante carreando um dominio de ligapao de FVIIa nao funcional e os ditos mutantes de TF carreando um ou mais sitios de N- glicosilapao nao funcionais da invenpao, ou, alternativamente, a dita segunda regiao pode ser ligada a regiao carboxila terminal do dito TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa, com o dito TF de mutante carreando um dominio de ligapao de FVIIa nao funcional e os ditos mutantes de TF carreando um ou mais sitios de N- glicosilapao nao funcionais da invenpao. Tanto a primeira como a segunda regioes podem ser ligadas diretamente ou entao ligadas atraves de um polipeptidio vinculador entre a referida primeira e segunda regioes.

[00185] De acordo com uma concretizapao particular, a dita proteina de fusao compreende um TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa, um TF de mutante carreando um dominio de ligapao de FVIIa nao funcional ou um mutante de TF carreando um ou mais sitios de N- glicosilapao nao funcionais e uma marca, usualmente um marcador de peptidio, ligada ao dominio C-terminal ou N- terminal do dito TF truncado desprovido de dominio de ligagao de FVIIa da invenpao. 0 dito marcador e de uma maneira geral a peptidio ou sequencia de aminoacidos que pode ser usada no isolamento ou purificapao da dita proteina de fusao. Exemplos ilustrativos, nao limitativos, das ditas marcas foram mencionados anteriormente. De acordo com uma concretizapao particular, o dito marcador e um marcador His ligada ao dominio C-terminal da dita proteina de TF. De acordo com outra concretizapao, o dito marcador e um marcador His ligada ao dominio N-terminal da dita proteina de TF.

[00186] A dita proteina de fusao podera ser obtida atraves de meios convencionais, por exemplo, por meio de expressao de genes da sequencia de nucleotidios que codifica a dita proteina de fusao em uma celula de levedura adequada. A marcador eventual pode ser usada, se desejado for, para o isolamento ou purificapao da dita proteina de fusao.

[00187] O TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa, o TF de mutante carreador de um dominio de ligapao de FVIIa-binding nao funcional e os mutantes de TF carreadores de um ou mais sitios de N-glicosilapao nao funcionais podem ser usados como um medicamento, por exemplo, na forma de um agente pro-coagulante no tratamento de hemorragias em um paciente.

[00188] Consequentemente, em um outro aspecto, a invengao refere-se ao referido TF truncado desprovido de dominio de ligagao de FVIIa, ao dito TF de mutante carreador de um dominio de ligagao de FVIIa nao funcional e aos ditos mutantes de TF carreadores de um ou mais sitios de N-glicosilagao nao funcionais na forma de um medicamento. Em uma concretizagao particular, a invengao refere-se a dito TF truncado desprovido de dominio de ligagao de FVIIa, ao dito TF de mutante carreador de um dominio de ligagao de FVIIa nao funcional e ditos mutantes de TF carreadores de um ou mais sitios de N-glicosilagao nao funcionais na forma de um medicamento com atividade pro-coagulante adequado para o tratamento de hemorragias em um paciente.

[00189] Alem disso, em um outro aspecto, a invengao refere-se a uma composigao farmaceutica que compreende um TF truncado desprovido de dominio de ligagao de FVIIa, um TF de mutante carreador de um dominio de ligagao de FVIIa nao funcional ou um mutante de TF carreador de um ou mais sitios de N-glicosilagao nao funcionais e um veiculo farmaceuticamente aceitavel. Em uma concretizagao particular, a dita composigao farmaceutica e uma composigao farmaceutica para a administragao topica da um TF truncado desprovido de dominio de ligagao de FVIIa, um TF de mutante carreador de um dominio de ligagao de FVIIa nao funcional ou um mutante de TF carreador de um ou mais sitios de N- glicosilagao nao funcionais e um carreador farmaceuticamente aceitavel adequado para a administragao topica de dito TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa da invengao ou o TF de mutante carreador de um ou mais sitios de N-glicosilagao nao funcionais.

[00190] Em um outro aspecto, a invengao refere-se a um TF truncado desprovido de dominio de ligagao de FVIIa, um TF de mutante carreador de a dominio de ligagao de FVIIa nao funcional e um mutante de TF carreador de um ou mais sitios de N-glicosilagao nao funcional para o tratamento de uma enfermidade que requer promogao de migragao celular e/ou angiogenese em um paciente. Em um outro aspecto, a invengao refere-se a um TF truncado desprovido de dominio de ligagao de FVIIa, um TF de mutante carreador de um dominio de ligagao de FVIIa nao funcional ou um mutante de TF carreador de um ou mais sitios de N-glicosilagao nao funcional para a promogao de angiogenese ou para promover migragao celular em um paciente com necessidade do mesmo.

[00191] De uma maneira geral, para administragao a um paciente, o TF truncado desprovido de dominio de ligagao de FVIIa, o TF de mutante carreador de um dominio de ligagao de FVIIa nao funcional ou os mutantes de TF carreadores de um ou mais sitios de N-glicosilagao nao funcionais serao formulados em uma forma farmaceutica adequada para a sua administragao topica para tratamento topico (sitio) de hemorragias. Exemplos ilustrativos, nao limitativos, das ditas formas farmaceuticas incluem aerossois, solupoes, suspensdes, emulsoes, geis, pomadas, cremes, bandagens, emplastros, unguentos, desinfetantes orais (colutorios), e assemelhados. Para tai finalidade, a composipao farmaceutica que compreende o TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa da invenpao incluira os carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitaveis requeridos para a preparapao da forma de administrapao farmaceutica escolhida. Portanto, em uma concretizapao particular, esta composipao farmaceutica composipao da invenpao compreende, adicionalmente a proteina de TF truncado da invenpao, um veiculo farmaceuticamente aceitavel tai como pode ser encontrado em tratados de farmacia galenica.

[00192] O TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa da invenpao, o TF de mutante carreador de um dominio de ligapao de FVIIa nao funcional da invenpao e os ditos mutantes de TF carreadores de um ou mais sitios de N-glicosilapao nao funcionais da invenpao estarao presentes nesta composipao farmaceutica em uma quantidade terapeuticamente efetiva. A dita quantidade podera variar dentro de uma ampla faixa, por exemplo, entre cerca de 1,0 pg de proteina ativa/ml e 1,0 mg de proteina ativa/ml, preferentemente entre 0,05 pg de proteina ativa/ml e 10 pg de proteina ativa/ml, e ainda com maior preferencia entre cerca de 0,1 pg de proteina ativa/ml e 2,0 pg de proteina ativa/ml.

[00193] De acordo com outro aspecto, a invenpao refere-se a uma sequencia de polinucleotideos (doravante referida como sendo "o polinucleotideo da invenpao") que codifica o dito TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa, o dito TF de mutante carreador de um dominio de ligapao de FVIIa nao funcional e os ditos mutantes de TF carreadores de um ou mais sitios de N- glicosilapao nao funcionais.

[00194] Em um outro aspecto, a invenpao refere-se a um vetor (doravante chamado de "o vetor da invenpao") que compreende uma sequencia de polinucleotideos da invenpao. Os vetores que sao adequados para o uso na presente invenpao incluem vetores de expressao procariotica, tais como pUC18, pUC19, Bluescript e seus derivados mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl , pCRl , RP4, vetores de fage e vaivem, tais como pSA3 e pAT28, vetores de expressao de levedura, tais como 2 micro plasmidios, plasmidios integrativos, vetores YEP, plasmidios centromericos e assemelhados, vetores de expressao de plantas, tais como vetores de pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE e assemelhados, vetores de expressao de celulas de insetos, tais como vetores de pAC e pVL, vetores de expressao eucariotica sejam baseados em vetores virulentos lentivirus) bem como vetores nao virulentos, tais como pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL e pKSV-10, pBPV-1, pML2d e pTDTl.

[00195] Em um outro aspecto, a invenQao refere-se a uma celula hospedeira (doravante chamada de "a celula hospedeira da invenpao") que compreende um polinucleotideo da invenpao ou o vetor da invenpao. As celulas que podem ser usadas para os propositos da invenpao sao preferentemente celulas eucarioticas, com maior preferencia uma celula de vertebrado ou invertebrado, celulas de insetos ou celulas fungicas, ainda com maior preferencia a celula de vertebrado em uma celula de Xenopus, uma celula isolada a partir de um peixe zebra ou uma celula de mamifero. Preferentemente, a celula de mamifero e uma celula proveniente de uma linha de celulas estabelecidas, tais como CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK 293, 3T3, WI38 e assemelhadas, uma celula tronco embrionaria, uma celula tronco adulta ou uma celula somatica.

[00196] Em um outro aspecto, a invenpao refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a um TF truncado desprovido de dominio de ligapao de FVIIa, a um TF de mutante carreador de um dominio de ligapao de FVIIa nao funcional ou a mutantes de TF carreadores de um ou mais sitios de N-glicosilapao nao funcional da invenpao. Os anticorpos que sao adequados para o uso na presente invengao incluem anticorpos "intactos" que compreendem uma regiao variavel de ligagao de antigeno, bem como um dominio constante de cadeia leve (CL) e dominios constantes de cadeia pesada, CHI, CH2 e CH3, fragmentos "Fab" resultantes da digestao de papaina de um anticorpo intacto e que compreende um unico sitio de ligagao de antigeno e um CL e uma regiao de CHI, fragmentos "F(ab')2" resultantes da digestao de papaina de um anticorpo intacto e que contem dois sitios de ligagao de antigenos, os fragmentos "Fab'" contem o dominio constante da cadeia leve e o primeiro dominio constante (CHI) da cadeia pesada e tem somente um sitio de ligagao de antigeno. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adigao de poucos residues no termino carboxila do dominio CH 1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteinas provenientes da regiao de articulagao de anticorpo, "Fv" e o fragmento de anticorpo minimo que contem um sitio de reconhecimento de antigeno e ligagao de antigeno completo, fragmentos de anticorpo FV ou "scFv" de cadeia unica que compreendem os dominios de anticorpo VL e VH, em que estes dominios estao presentes em uma unica cadeia de polipeptidios, diacorpos" compreende um dominio variavel de cadeia pesada (VH) conectado a um dominio variavel de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptidios (VH-VL) conectada por um vinculador de peptidio que e demasiadamente curta para permitir o emparelhamento entre os dois dominios na mesma cadeia e "anticorpos bi-especificos" (BAbs) sao simples, anticorpos bivalentes (ou imuno-terapeuticamente efetivos ou seus fragmentos) que tem dois sitios de ligagao de antigenos diferentemente especificos.

[00197] Os exemplos seguintes ilustram a invengao e nao deverao ser considerados como uma limitagao desta.

EXEMPLOS

[00198] Os Exemplos 1-3 expoem a produgao em leveduras de um produto pro-coagulante baseado na expressao de (i) proteina de TF humana completamente formada, opcionalmente na forma de uma proteina de fusao fundida a um marcador His (Exemplo 3) , de (ii) uma forma truncada de proteina de TF humana fundida a um marcador His (Exemplo 4) e de (iii) mutantes de N-glicosilagao de proteina de TF humana (exemplo 5) . Os ditos produtos pro-coagulantes, todos em conjunto, estao genericamente nomeados no Exemplo 6, por simplicidade, fator tissular microvesiculado, TF microvesiculado ou mTF. 0 Exemplo 2 ensina a purificagao do TF microvesiculado.

[00199] O Exemplo 6 expoe alguns ensaios in vitro realizados para o proposito de avaliagao da capacidade do dito mTF provocar coagulo de fibrina em pacientes saudaveis e hemofilicos sob diferentes concentragoes, bem como alguns ensaios in vivo realizados com o proposito de avaliar a capacidade do dito mTF de tratar hemorragias em modelos de hemorragia grave e letal.

EXEMPLO 1 Produgao de um produto pro-coagulante baseado na expressao da proteina de TF de comprimento pleno em levedura (CYE-TF) 1.1. Vetor de expressao de levedura

[00200] Para expressao de TF recombinante, gerou-se um vetor epissomatico de levedura (pTT-10301) a partir de plasmidios pGl (ATCC # 37305) e Yep352 (ATCC # 37673) em seguida a estrategia de clonagem ilustrada na Figura 1. 0 plasmidio pTT-10301 contem os seguintes elementos: i) o gene URA3 que permite a selegao de levedura recombinante na ausencia de uracil nos meios de crescimento, ii) o gene de resistencia a ampicilina (Amp) para selegao e propagagao do vetor de plasmidio em E. coll, iii) a regiao de replica de 2 micrometros (2p) de levedura, que permite a replica epissomica do vetor nA levedura, iv) o promotor de gliceraldeido-3-fosfato deidrogenase (GPD) , que controla a transcrigao de genes colocados a j usante, v) o sinal de termino de transcrigao de levedura especlfico da quinase de fosfoglicerato (PGK) , e vi) um sitio de restrigao de BamHI unico que permite a clonagem de genes selecionados sob o controle do promotor de GPD (pGPD) , e seguida pela sequencia de parada de PGK (PGKt).

[00201] A Figura IA mostra o mapa do vetor de plasmidio pTT10301. Na Figura IB encontra-se ilustrada a analise de endonuclease de restrigao para confirmar a organizagao apropriada de todos os elementos dentro do plasmidio.

[00202] Utilizou-se a variedade E. coli DH5cx (Stratagene) para amplificagao de plasmidio. Celulas de bacterias abrigando o plasmidio pTT10301 foram desenvolvidas a 37°C em meio Luria Broth Ampicilin (LBA) (1% triptona, 1% NaCI, 0,5% extrato de levedura, 50 mg de ampicilina por ml) . Cepas de glicerol de culturas bacterianas recombinantes que continham plasmidio pTT-10301 foram mantidas a -80°C.

1.2. Gene recombinante

[00203] O fator tissular (TF) e uma proteina de 295-aminoacido (aa) com uma sequencia lider de 32-aa. A proteina completamente formada pode ser dividida em tres dominios: um dominio extracelular (aa 33-251), uma regiao de transmembrana (aa 252-274), e uma caudacitoplasmatica (aa 275-295). A Figura 2 mostra o tragado de hidropatia da proteina de TF humano (hTF).

[00204] A codificagao de cDNA para a proteina de hTF completamente formada (aa 33-295) foi amplificada como um fragmento 816-bp por reagao de cadeia de polimerase (PCR) . Para esta reagao de PCR utilizou-se como gabarito uma biblioteca de cDNA de placenta humana (Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratories, Inc.), e oligonucleotidios A e B, recozendo respectivamente na extremidade 5zou 3zde gene de TF humano, foram usados como preparadores.

[00205] A Figura 3 mostra a sequencia de recozimento dos preparadores A e B dentro da sequencia de hTF DNA [SEQ ID NO: 5] (acesso ao banco de genes # BC011029). 0 preparador A codifica os primeiros quatro aminoacidos de hTF completamente formado desprovido de peptidio de sinal e contendo um codon de iniciagao ATG no quadro com hTF ORF.

[00206] As condigoes de PCR foram as seguintes: 35 ciclos de PCR (94°C, 30 s; 45°C 30 s; 72°C 1 minuto) e uma etapa extensao final de 7 minutos a 72°C. Depois disso, o produto PCR foi purificado (sistema de purificagao de DNA Qiagen).

1.3. Geragao de vetor de expressao de plasmidio de rTF

[00207] O fragmento de DNA amplificado por PCR obtido conforme mencionado na Segao 1.2 foi digerido com BamHI para remover as extremidades, precipitado em etanol, e clonado no vetor pTT10301 previamente digerido com BamHI. Depois de analise de restrigao de endonuclease de varios clones, selecionou-se um plasmidio que continha o gene de hTF recombinante completamente formado (doravante referido como rTF) na orientagao correta com relagao ao promotor de GDP (pGDP), denominado pTT10302, (Figura 4).

[00208] A sequencia de DNA do rTF contido no plasmidio pTT10302 foi 100% identica a sequencia publicada (Gene Bank #BC011029) . A sequencia de DNA do DNA de codificagao de rTF foi executada em um sequenciador automatico (ABI prism 370, Applied Biosystems) utilizando- se preparadores A e B e reagentes Big Dye Terminator. As celulas DH5a de E. coli carreadoras do plasmidio pTT10302 foram desenvolvidas durante a noite a 37°C em meio LBA e usadas para preparar as cepas de glicerol, as quais foram mantidas a -80°C.

1.4. Expressao de rTF por levedura recombinante

[00209] Para gerar levedura recombinante expressor de fator tissular humano completamente formado recombinante (rTF), utilizou-se o vetor de expressao pTT10302 para transformer celulas de levedura T73 ura3~.

[00210] O T73 ura3_ e um derivative da variedade T73 de S. cerevisiae muito bem caracterizada, que e amplamente usada na produgao de vinho. 0 T73 e uma variedade diploide selecionada na regiao de Alicante, Espanha (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, numero de acesso # CECT1894), e e comercializado no mundo todo para industria alimenticia por Lallemand Inc. (Montreal, Quebec, Canada) . A variedade T73 ura3_ e um derivado de T73 em que as duas copias do gene URA3 foram rompidas (J. Agric. Food Chem. 1998. 46, 1689-1693). 0 T73 ura3_ e uma variedade de levedura URA- e alimenticio seguro fenotipicamente estavel que permite a geragao de levedura T73 recombinante utilizando-se vetores de plasmidio carreadores do gene marcador capaz de ser selecionado URA3.

[00211] Para se gerarem cepas operacionais, desenvolveram-se celulas de T73 ura3_ em uma bandeja Petri e isolou-se e desenvolveu-se uma unica colonia a 30°C em meio de YPD (1% extrato de levedura, 2% peptona bacteriologica, 2% glicose) ate alcangar uma densidade de 107 celulas/ml. Entao, celulas de levedura foram pelotizadas por centrifugagao, resuspensas em 15% glicerol em meio seletivo minimo (base de nitrogenio em extrato de levedura e meio sintetico complete sem uracil; YNB CSM-URA) e congelado em aliquotas a -80°C ate serem usadas. Descongelaram-se tres aliquotas selecionadas aleatoriamente e verificaram-se quanto a ausencia de contaminagao bacteriana. Primeiro, descongelou-se uma aliquota de T73 ura3_ fresco e tornaram-se as celulas suscetiveis de adquirir o vetor de plasmidio de acordo com o protocolo LiAc/SS-DNA/PEG (Metodos in Enzymology 1994. 350:87-96). Seguiu-se uma estrategia assemelhada para gerar levedura recombinante de controle protegendo o plasmidio pTT10301 esgotado.

[00212] Selecionaram-se clones de levedura recombinantes pela sua capacidade de crescerem em meios destituidos de uracil. Isolaram-se oito clones independentes transformados com pTT10302 e cultivaram-se durante a noite em meio sem uracil. Estas culturas de levedura recombinantes, chamadas de yTT10301, foram pelotizadas e homogeneizadas utilizando-se globulos de vidro. Similarmente, clones independentes a partir de levedura transformed© com pTT10301 (chamados de yTT10300) tambem foram submetidos ao mesmo procedimento.

[00213] Proteinas provenientes de diferentes clones dos dois tipos de leveduras recombinantes leveduras foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose que foi submetida a analise de mancha-oeste. Conforme ilustrado na Figura 5, todos os clones selecionados a partir das culturas de yTT10301 (clones 1 ate 8) expressaram varios polipeptidios que foram reconhecidos pelo anticorpo monoclonal especifico de TF anti-humano (mAb) CD142 (BD Biosciences Pharmingen). Entretanto, nenhum dos clones yTT10300 mostrou polipeptidios imuno-reativos com o TF mAb anti-humano (a faixa C, na Figura 5, corresponde a um destes clones).

[00214] Tai como ilustrado na Figura 5, a dimensao molecular do produto imuno-reativo em yTT10301 (faixas 1 ate 8) foi cerca de 35 kDa (assinalado com um asterisco) . Outros produtos dotados de massas moleculares de 44 e 46 kDa (assinalados por meio de setas), e um grande agregado variando na dimensao de 70 ate 115 kDa (conforme seta) pode ser igualmente observado. Polipeptidios com pesos moleculares mais baixos do que 35 kDa correspondem com toda a probabilidade aos produtos de degradagao de rTF.

[00215] O aparecimento de varios produtos relacionados a TF mostrando diferentes mobilidades eletroforeticas podia ser devido seja a agregagao de proteinas, diferentes graus de glicosilagao ou ambos. Para investigar estas possibilidades, trataram-se extratos provenientes de yTT10301 (clone #7) com as endoglicosilases Endo H e PNGase F. Conforme ilustrado na Figura 6, depois da incubagao seja com Endo H (faixa 2) ou PNGase F (faixa 3) o agregado maior (75 ate 150 kDa) desapareceu enquanto um produto de 75 kDa foi claramente observado (compare-se a faixa 1 com as faixas 2 e 3). Adicionalmente, as bandas de proteina de 44 e 46 kDa tambem desapareceram com os dois tratamentos. Nas amostras tratadas com Endo H (faixa 2) os produtos de 44 e 46 kDa pareceram dar origem a um produto de cerca de 36 kDa. 0 tratamento de PNGase F resultou no aparecimento de duas bandas de 37 e 39 kDa (faixa 3) . Por outro lado, o produto de 35 kDa permaneceu inalterado depois do tratamento com estas glicosilases. Desta forma, parece que o produto de 35 kDa corresponde a proteina de rTF nao glicosilada e o produto de 75 kDa que pode ser reconhecido depois do tratamento de endoglicosilase pode representar um dimero da proteina nao glicosilada. 0 grande agregado observado nas amostras nao tratadas podia corresponder ao mesmo dimero, mas com diferentes graus de glicosilagao. De uma maneira assemelhada, as proteinas de 44 e 46 kDa parecem corresponder a proteina de 35 kDa com padroes de glicosilapao diferentes.

[00216] O peso molecular prognosticado de hTF desprovido do peptidio de sinal determinado de acordo com a sequencia de aminoacidos e de 29,8 kDa. A discrepancia entre a massa molecular prognosticada e observada podia ser devida a migragao anomala da proteina em SDS-PAGE em decorrencia da presenga de uma extensao dos aminoacidos hidrofobos.

[00217] Adicionalmente, a expressao de rTF por yTT10301 foi analisada por microscopia confocal de varredura a laser. Para estes estudos, esferoplastos (isto e, uma levedura desprovido de parede de celula produzido por tratamento enzimatico) provenientes de nao-expressao (yTT10300), e expressao de rTF (yTT10301, clone #7) fixaram-se e incubaram-se leveduras recombinantes com seja o TF mAb anti-humano ou com um mAb contra uma membrana de levedura ATPase. Tai como ilustrado na Figura 7, o anti- ATPase mAb especificamente rotulou somente a superficie dos esferoplastos (Figura 7A, estampas 1 e 3). Entretanto, o TF mAb anti-humano mostrou um sinal distribuido sobre toda a celula, indicando a presenga de rTF nao somente na membrana de plasma, mas tambem dentro da celula, provavelmente associado com compartimentos de celula membranosos internos (Figura 7B, estampas 5 e 7). Por outro lado, conforme ilustrado na Figura 8, nas celulas de levedura que abrigam um plasmidio esgotado (yTT10300) o mAb anti-ATPase tambem deu um sinal especifico na superficie de celula (Figura 8A, estampa 1) , mas, como era de se esperar, a rotulagao com o anticorpo de TF anti-humano nao foi suscetivel de ser detectada (Figura 8B, estampa 3).

[00218] Para se confirmar que o rTF era uma proteina associada com membrana, trataram-se celulas yTT10301 de levedura com tampao de lise que continha o detergente Triton X-114 (para uma concentragao final de 1%) . Depois de 1 hora de incubagao a 4°C, o lisado foi aplicado sobre amortecedor de sacarina a 6%, aquecido a 30°C durante 3 minutos e centrifugado a 300 x g durante 3 minutos para separar a fase aquosa superior em relagao a fase de detergente inferior. A fase aquosa foi coletada e a pilula de detergente foi mantida em gelo. Depois de se coletar uma pequena aliquota para analise subsequente, submeteu-se a fase aquosa a uma segunda rodada de extragao com Triton X-114. Depois de uma nova separagao de fase, coletou-se uma segunda fase aquosa e adicionou-se a nova pilula de detergente a pilula anterior. A mistura das duas pilulas de detergente e as duas fases aquosas foi analisada por coloragao de SDS-PAGE e Coomassie-blue (Figura 9A) , e por mancha-oeste com o TF mAb anti-humano (Figura 9B). Tai como se encontra ilustrado na Figura 9B, os produtos caracteristicos derivados de rTF foram observados exclusivamente na fase de detergente (faixa 4) , e nao em qualquer uma das duas fases aquosas (faixas 2 e 3) . Quanto ao gel colorido de Coomassie observa-se que a maior parte das proteinas provenientes de extratos de levedura permaneceu na fase aquosa (faixas 2 e 3) . Este resultado demonstra claramente que o rTF expresso por yTT10301 encontra-se associado a membrana

1.5. Processo de fermentagao

[00219] Para testar a produgao de extratos de levedura yTT10301 a nivel pre-industrial, os inventores realizaram fermentagoes em um biorreator de 2 litros (Biostat B-2L. BRAUN). As condigoes de operagao e meio de cultura foram:

[00220] Condigoes de operagao: T: 30°C; Velocidade de agitagao: 250-300 rpm; pH: 4,5; Fluxo de ar: 6 1/m.

[00221] Meio de cultura: CSM-URA: 0,78 g/1; YNB: 6,7 g/1; Sacarina: 20 g/1.

[00222] O grafico da Figura 10 mostra a evolugao dos parametros principals durante todo o processo de fermentagao. Uma mudanga na pressao de oxigenio (PO2) , que e o unico parametro nao controlado, reflete as mudangas nos requisites de oxigenio a que foram submetidas as celulas durante o processo. A fermentagao foi sustada quando a PO2 alcangou uma condigao estacionaria (assinaladas com uma seta) (18h).

[00223] O produto resultante da fermentagao foi peletizado por centrifugagao a 3.000 rpm (1.200xg) durante 10 minutos e resuspenso em 200 ml de tampao de lise (25 mM PIPES (pH 7,8), 50 mM NaCI). As leveduras foram homogeneizados por alta pressao (1.000 bar (108 Pa)) (homogeneizador NIRO SOAVIS. Panda 2K) , e o homogenado centrifugado a 13.000 rpm (13.000xg) durante 30 minutos a 4°C, e a pilula (50 ml) e o sobrenadante de extrato de levedura clarificado (CYE) (150 ml) foram coletados separadamente. 0 esquema geral do procedimento esta representado na Figura 11.

[00224] A concentragao de proteina nos dois preparados foi quantificada por meio do ensaio BCA colorimetrico padrao (Pierce) , e a presenga de rTF foi determinada por meio de analise mancha-oeste. Os resultados destes ensaios mostraram que a concentragao de proteina total foi assemelhada para as duas amostras (pilula: 3,8 mg/ml e CYE: 3,9 mg/ml) , e, consequentemente, a quantidade de rTF detectada por meio de mancha-oeste tambem foi equivalente no CYE e na pilula, conforme ilustrado na Figura 12.

[00225] A atividade pro-coagulante, determinada tai como se encontra descrita no EXEMPLO 4, no CYE e na pilula tambem foi assemelhada quando as duas amostras foram analisadas no mesmo dia de preparagao (1.400 ng/ml de rTF ativo), mas a estabilidade do rTF foi muito mais baixa nos extratos de pilula (1.500 vs 199 ng/ml) no 4° dia depois da preparagao, provavelmente devido a presenga de proteases nesta fragao. Desta forma, a fragao de CYE foi selecionada para subsequentes preparagbes de produto de droga.

1.6. Microscopia Eletronica

[00226] Para melhor caracterizar o produto CYE, realizou-se analise de microscopia imunoeletronica. 0 exame das amostras de CYE por microscopia eletronica (EM) mostrou a presenga de grande numero de vesiculas derivadas de levedura de diferentes dimensoes (variando entre 0,1 a 0,01 pm). Cerca de 5-10% destas vesiculas foram rotuladas pelo TF mAb anti-humano conforme observado pela presenga de particulas douradas na sua periferia (assinaladas com setas) (Figura 13). Por outro lado, nas grades de controle que foram incubadas com um mAb nao relacionado observaram- se muito poucas particulas douradas, e elas nao estavam associadas as vesiculas (nao ilustradas).

[00227] Encontra-se perfeitamente estabelecido que a 6tima atividade de coagulagao do sangue requer a associagao de TF aos lipidios (Thromb. Haemost. 2001; 86: 66-74), e uma vez que os extratos de levedura de TF nao expressor provenientes de yTT10300 nao exibem qualquer atividade pro-coagulante, estes resultados indicaram que a atividade pro-coagulante do CYE residira no rTF lipidado resultante da associagao do rTF com as microvesiculas membranosas derivadas de levedura, que sao doravante referidas como CYE-TF (isto e, uma fragao de CYE, que tem atividade pro-coagulante, que contem rTF em associagao com microvesiculas membranosas derivadas de levedura).

EXEMPLO 2 Produgao de um produto pro-coagulante enriquecido em microvesiculas que contem o TF de extensao plena (mTF) 2.1 Processo de purificagao

[00228] Preparou-se um extrato de levedura clarificado contendo rTF (doravante chamado de CYE-TF) obtido a partir de yTT10301, seguindo=se o procedimento previamente descrito (Exemplo 1, Segoes 1.1 ate 1.5). 0 CYE-TF foi submetido a etapas sucessivas de filtragem por fluxo tangencial em um Sistema de Filtragem por Fluxo Transverso [Crossflow Filtration System (Sartorius sartoflow Slice 200 Benchtop)] utilizando-se filtros com uma redugao gradual na dimensao de poros (membranas de 0,45 pm, 0,2 pm e 0,1 pm) (Sartorius, polissulfona). Na Figura 14A encontra-se ilustrado um diagrama do procedimento que foi seguido.

[00229] Para purificar as microvesiculas que continham rTF (mTF) carregaram-se 10 ml de extrato de CYE- TF filtrado, correspondente a microvesiculas de dimensao de 0,1 a 0,2 pM (retentado de 0,1 pM) , em uma coluna de cromatografia de exclusao por tamanho (Sephacryl S500column -HR (60 cm-26 mm, 320ml-General Electric) previamente equilibrada com tampao de fosfato e acoplada a um sistema AKTA-FPLC. Realizou-se eluigao sob uma velocidade de fluxo de Iml/min utilizando-se o mesmo tampao, e coletaram-se 42 fragoes de 4ml cada uma. 0 padrao de eluigao foi monitorado por medig^o da absorvencia das fragoes a 280 nm. Os perfis cromatograficos obtidos nas diferentes tentativas de purificagao foram semelhantes. 0 grafico na Figura 15 mostra um perfil cromatografico representative.

[00230] As aliquotas provenientes de cada uma das fragoes foram analisadas por mancha-oeste, e por ensaio de atividade para identificar aquelas fragoes que continham atividade pro-coagulante. A Figura 16 mostra que as fragoes 5-25 que acumulam mTF quando observadas por mancha-oeste, tambem foram as fragoes onde a atividade foi concentrada (Tabela 1). Tabela 1 Atividade pro-coagulante de mTF nas fragoes 5-42 obtida depois de purificagao por exclusAo de dimensAo

[00231] Finalmente, para concentrar a atividade, as fragoes 5 ate 43 provenientes de cada processo de purificagao foram agrupadas e submetidas novamente ao TFF atraves de um filtro de 0,1pm. Mediante estes meios e possivel obterem-se lotes reproduziveis (14.31, 14.32,15.32, 15.36) de mTF biologicamente ativo, conforme ilustrado na Tabela 2, e todos estes lotes mostram um perfil de proteina similar (Figura 17). Tabela 2: Comparagao do conteudo de proteina total e da atividade pro-coagulante entre lotes

2.2. Caracterizagao bioquimica de microvesiculas que contem rTF purificadas por cromatografia de exclusao por tamanho 2.2.1. Teor de Proteinas

[00232] As microvesiculas onde e inserido rTF contem adicionalmente ao rTF outras proteinas de membranas integrals derivadas das celulas hospedeiras de levedura. 0 teor de proteina de diferentes lotes de mTF purificado foi analisado por SDS-PAGE e coloragao Coomassie blue (Figura 17A) . A comparagao visual do gel colorido indica que o perfil de proteinas de diferentes lotes foi quase identico. Para realizar uma analise comparative mais exata, o gel foi varrido e cada faixa do gel foi submetida a densitometria e obteve-se um tragado mostrando os picos correspondentes as diferentes bandas de proteinas, e a intensidade relative de cada proteina, a partir de cada lote. Os perfis de proteina dos quatro lotes ilustrados na Figura 17 (painel B) foram extremamente similares.

2.2.2. Teor de lipidios

[00233] O teor de lipidios do mTF purificado foi analisado por cromatografia de camada fina seguindo-se o procedimento descrito por Hara e Radin (Anal. Biochem. 1978, 90: 420-426) com algumas modificagoes (Rodriguez- Sureda y Peinado-Onsurbe, 2005, Anal.Biochem. 343: 277- 282). Basicamente, dissolveram-se 120 mg de produto liofilizado em um tubo de vidro em 1 ml da mistura de hexano e isopropanol (3:2, v:v). 0 frasco, protegido da luz para evitar oxidagao dos lipidios, foi mantido em um agitador orbital durante 24h. Neste periodo adicionaram-se 0,3 ml de sulfato de sodio (0,47 M) . Para facilitar a separagao de fases, a amostra foi centrifugada. A fase superior (hexano) contem lipidios apolares enquanto os polares tais como fosfolipidios sao encontrados junto a interfase. A fase superior foi transferida para um frasco diferente e foi evaporada utilizando-se gas de nitrogenio para evitar oxidagao de lipidios. 0 extrato seco que continha os lipidios foi dissolvido em cloroformio (0,2 ml) . 0 TLC foi realizado em uma placa de gel de silica utilizando-se como uma fase movel Cloroformio:metanol e agua (C:M:W, 345:133:21, v:v:v). Em paralelo as amostras, analisaram-se padroes de lipidios sob as mesmas condigoes. Uma vez que as amostras foram passadas nas placas, os lipidios foram visualizados pela adipao de vapores de iodo. A identificagao dos diferentes componentes de lipidios nas amostras foi realizada por comparagao da sua mobilidade com aquela dos padrdes.

[00234] Por meio desta tecnica foi possivel determinar que o CYE-TF (lote 91) sob diferentes concentragoes 5, 10 e 20 pg/ml) bem como o produto purificado continham (lote 14.31 a 5, 10 e 20 pg/ml) um teor de lipidios complexo, incluindo triacilgliceridas, ergosterol, fosfatiletanoamina, cardiolipina, acido fosfatidico, fosfatidilcolina, fosfatidilserina/fosfatidilinositol (Figura 18). 0 perfil de lipidio das microvesiculas que contem rTF difere do perfil derivado do rTF relipidizado obtido por incorporagao do rTF em lipossomos sinteticos seguindo-se os procedimentos descritos por, entre outros, Waters, E.K. e Morrisey, J.H. (Biochemistry, 2006, 45:3769-3774), Brucato, C. et al (Protein Expression and Purification, 1998,26:386-393), WO9848283, e Guha, A. et al (Proc.Natl.Acad.Sic.USA, 1986, 83:299-302). Embora os lipossomos sinteticos descritos em todos estes documentos compreendam essencialmente uma combinapao de fosfatidilcolina e fosfatidilserina, ou fosfatidilcolina, fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina, as microvesiculas derivadas de levedura purificadas de acordo com a presente invenpao compreendem componentes adicionais, tais como ergosterol e cardiolipina que nao sao encontrados nos lipossomos que contem rTF.

EXEMPLO 3 Produgao de um produto pro-coagulante baseado na expressao da proteina modificada de marca-His de TF de extensao plena em levedura (6HT-TF) 3.1. Produgao de rTF que contem uma marca-6xhis no termino de carboxila

[00235] A purificapao por cromatografia de afinidade de proteinas que contem um marcador de histidina (marca-his) , seja no termino C ou N, e um metodo perfeitamente padronizado que foi extensamente usado para se obterem preparados altamente purificados de um grande numero de proteinas. Desta forma que qualquer metodo cromatografico, o procedimento pode ser facilmente aumentado. Por esta razao produziu-se um rTF que contem uma marca-6xhis no termino carboxila.

3.2. Geragao de vetor de expressao de plasmidio de marca-his-rTF

[00236] A codificagao de cDNA para a proteina de hTF completamente formada (aa 33-295) com 18 nucleotidios extras (codificagao para seis histidinas) na extremidade 3', foi amplificada como um fragmento 842-bp por PCR. Para esta reagao, seguiu-se uma estrategia similar aquela descrita no Exemplo 1 (Sepoes 1.2 e 1.3) . Desta forma, usou-se como gabarito uma biblioteca de cDNA de placenta humana (Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratories, Inc.), e usaram-se oligonucleotidios A e E como preparadores. No oligonucleotidio E (SEQ ID NO: 3) o codon de terminapao (TAA) da sequencia de hTF DNA foi substituido por uma codificagao de sequencia de nucleotidios para 6 residuos de histidinas seguida por um novo codon de terminapao (MARCA). A Figura 19 mostra o sitio dos preparadores A e E na sequencia de DNA de hTF (acesso # BC011029 no Gene Bank).

[00237] Depois de 35 ciclos de PCR (94°C, 30s, 45°C 30s, 72°C 1 min) e uma etapa de extensao final de 7 minutes a 72 °C, purificou-se um produto de DNA com a dimensao esperada (sistema de purificapao de DNA Qiagen).

[00238] O fragmento de DNA amplificado por PCR foi digerido com BamHI para remover as extremidades, precipitado em etanol, e clonado no vetor pTT10301 previamente digerido com BamHI. Depois de analise de restrigao de endonuclease de diversos clones, foi selecionado o plasmidio pTT10303, contendo o gene hTF-his- marcador recombinante na orientagao direita com relaQao ao promotor de GDP (pGDP) (Figura 20).

[00239] Os inventores confirmaram ainda que a sequencia de DNA do hTF-his-marcador recombinante clonado no pTT10301 foi 100% identica a sequencia de hTF DNA anteriormente publicada (Gene Bank #BC011029) e que ela continha os 18 nucleotidios extra esperados na extremidade 3' . A analise da sequencia de DNA da hTF-his-marcador recombinante foi realizada em um sequenciador automatico (ABI prism 370, Applied Biosystems) utilizando-se preparadores A e E e reagentes Big Dye Terminator. Desenvolveram-se celulas DH5a carreadoras do plasmidio pTT10303 durante a noite a 37 °C em meio de LBA e utilizaram-se para preparar cepas de glicerol.

3.3. Expressao de rTF-his-marca

[00240] Para gerar hTF-his-marcador completamente formado recombinante de expressao de levedura (rTF-his- marca) , utilizou-se o vetor de expressao pTT10303 para transformar celulas de levedura T73 ura3_ tai como descritas no Exemplo 1 (Sepao 1.4). Selecionaram-se clones de levedura recombinantes (denominados yTT10302) por sua habilidade de se desenvolverem em meios desprovidos de uracil. Isolaram-se cinco clones independentes de yTT10302 e cultivaram-se durante a noite em meios sem uracil. A analise de mancha-oeste mostrou que todos os clones selecionados expressaram polipeptidios reconhecidos pelo TF mAb anti-humano (Figura 21). A Figura 22 mostra o padrao de expressao de rTF-his-marcador do clone selecionado (yTT10302 clone #5) em comparapao com extratos provenientes de leveduras recombinantes yTT10300 e yTT10301. Tal como e ilustrado, as dimensoes moleculares dos produtos anti-TF imuno-reativos expresses por yTT10302 foram de cerca de 36, 38, 45, 47 e 49 kDa (assinalados com setas) , enquanto outros agregados de grande peso molecular (cerca de 100 ate 115 kDa) tambem puderam ser observados (seta). Como no caso dos extratos de levedura yTT10301, estas diferenpas na mobilidade corresponderam a diferentes graus de glicosilapao de rTF tal como se encontra ilustrado na Figura 20.

3.4. Purificagao de rTF-his-marcador por cromatografia 3.4.1. Processo de purificapao

[00241] Para a purificapao de rTF-his-marca, os inventores partiram de extratos clarificados que continham rTF-his-marcador (doravante chamados de CYE-6HT-TF) obtidos a partir de yTT10302 seguindo-se o procedimento anteriormente descrito (Exemplo 1, Sepao 1.5). 0 dito CYE- 6HT-TF foi filtrado atraves de um filtro de tamanho de poro de 0,2 pm por filtragem de fluxo tangencial antes de ser carregado sobre uma coluna de afinidade HiTrap® de 5 ml (Pharmacia Biotech), que foi previamente lavada com agua e equilibrada com tampao de partida (20 mM de tampao de fosfato, 500 mM de NaCl, pH 7,4) . Depois de aplicapao da amostra, o fluxo passante foi recuperado (material nao ligado), e a coluna foi submetida a tres lavagens: a primeira com 40 ml de tampao de partida (20 mM de tampao de fosfato, 500 mM de NaCI, pH 7,4); a segunda lavagem foi com 40 ml de tampao de partida que continha 10 mM de imidazol; e a terceira com 40 ml de tampao de partida suplementado com 100 mM de imidazol. Depois da ultima lavagem, a proteina rTF-his-marcador microvesiculada chamada de 6HT- TF, foi eluida mediante adigao a coluna de 25 ml de tampao de partida que continha 1 M de imidazol, e coletaram-se as fragoes de eluigao (fragoes #1, #2, #3, e #4) de 2,5 ml. Na Figura 23 encontra-se ilustrado um esquema geral do processo.

[00242] Esta fragoes foram submetidas a dialise em tampao de dialise (20 mM de tampao de fosfato, 50 mM de NaCI, pH 7,4), e o extrato de partida, material nao ligado, ultima lavagem antes da eluigao e as quatro fragoes de eluigao dialisadas foram analisadas por SDS-PAGE e cloragao de prata ou por mancha-oeste. Conforme ilustrado na mancha- oeste na Figura 24A, depois da ligagao a coluna 6HT-TF, o produto pode ser recuperado com exito principalmente nas primeiras tres fragoes de eluigao (faixas 4-6) . Digno de nota, quando proteinas provenientes destas amostras foram visualizadas ao colorir-se o gel com prata (Figura 24B), as bandas de proteina puderam ser observadas somente nas faixas correspondentes ao extrato de levedura de partida (faixa 1) e ao material nao ligado (faixa 2) , mas nao nas fragoes eluidas (faixas 4-7) . Adicionalmente, a quantidade de proteina total nestas amostras ficou sob o limite de detecgao do reagente BCA padrao (20 gg/ml).

[00243] Estes resultados, em conjunto com o resultado da mancha-oeste, demonstraram claramente que produto 6HT-TF altamente purificado pode ser obtido por este procedimento de cromatografia de afinidade. Mais importante, as fragoes de eluigao dialisadas #1-3 mantiveram a atividade pro-coagulante, determinada conforme descrito no EXEMPLO 4, e surpreendentemente a fragao #1 mostrou essencialmente a mesma atividade pro-coagulante que o extrato de partida CYE-6HT-TF. Tai como era esperado, a fragao que continha menos quantidade de proteina rTF imuno- reativa (fragao #4, faixa 7) nao mostrou qualquer atividade pro-coagulante.

[00244] As diferengas entre a concentragao de proteina total versus atividade nestas duas amostras podem ser sumariadas da seguinte forma:

ND*: nao detectado por ensaio colorimetrico padrao (BCA) (limite de detecgao 20 p.g/ml)

3.4.2. Metodos Analiticos

[00245] Tal como ilustrado na mancha-oeste da Figura 19 o produto 6HT-TF nas frapoes eluidas consistiu, desta forma que no extrato de levedura total, de diversas bandas de proteina variaveis na dimensao que foram similarmente originadas por glicosilagao diferencial da rTF-his-marca. Para estudar esta possibilidade, a frapao #1 eluida foi submetida a tratamento de endoglicosilase. Sucintamente, os extratos provenientes de levedura expressor de rTF (yTT10301) tratado com 500 unidades (U) de endoglicosidase H (Endo H) ou N-glicosidase F (PNGase F) durante 1 h a 37°C foram, alem disso, analisados por mancha-oeste com o TF mAb anti-humano. A Figura 25 mostra que depois do tratamento com seja PNGase F (faixa 2) ou Endo H (faixa 3) as bandas de proteina 45, 47 e 49 kDa disapareceram com os dois tratamentos. Depois da incubapao de PNGase F observaram-se somente dois polipeptidios, o 36 e o 38 kDa que foi aumentado mais provavelmente devido a deglicosilapao dos produtos de 45, 47 e de 49 kDa (comparem-se as faixas 1 e 2). 0 tratamento com Endo H deu origem a um unico produto imuno-reativo de 36 kDa (faixa 3) , que devia corresponder a proteina rTF-his-marcador nao glicosilada.

[00246] Adicionalmente, analisou-se 6HT-TF purificado por EM depois de ser submetido a imunocolorapao com TF mAb anti-humano tal como descrito no Exemplo 1 (Se?ao 1.6). Conforme ilustrado na Figura 26, pode ser observado na mesma um grande numero de particulas de ouro, a maior parte das quais estavam associadas a pequenas vesiculas de tamanho regular. Em uma amostra assemelhada proveniente dA levedura expressor de non-rTF, analisada em paralelo, o numero de particulas de ouro foi extremamente reduzido (nao ilustrado). Este resultado indica que o procedimento de cromatografia de afinidade usado para purificar o produto 6HT-TF permite a recuperagao de 6HT-TF biologicamente ativo que esta associado as microvesiculas de membrana derivadas de levedura.

EXEMPLO 4 Produgao de um produto pro-coagulante baseado na expressao de uma forma truncada da proteina de hTF em leveduras (CYE- TTF) 4.1. Geragao do vetor de expressao de plasmidio de TF- his-marcador (TTF-his-marca) truncado

[00247] A codificagao de cDNA para uma forma truncada da proteina de hTF (TTF), contendo o dominio de interapao para o Fator X (aa 174-251), a regiao de transmembrana (aa 252-274), e a caudacitoplasmatica (aa 275-295) com 18 nucleotidios extras (codificagao para seis histidinas) na extremidade 3', foi amplificada por PCR como um fragmento de 398 bp. Seguiu-se uma estrategia similar aquela descrita no Exemplo 1 (Segoes 1.2 e 1.3) . Desta forma, utilizou-se uma biblioteca de cDNA de placenta humana (Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratories, Inc.) como gabarito, e usaram-se oligonucleotidios F e E como preparadores. In oligonucleotidio E, o codon de termino (TAA) da sequencia de DNA hTF foi substituido por uma codificagao de sequencia de nucleotidios para 6 residues de histidinas seguido por um novo codon de termino (MARCA). A Figura 28 mostra a sitioizagao dos preparadores F e E na sequencia de DNA hTF (Gene Bank accession # BC011029).

[00248] Depois de 35 ciclos de PCR (94°C, 30s, 45°C 30s, 72°C 1 min) e uma etapa de extensao final de 7 min a 72 °C, purificou-se um produto de DNA com a dimensao esperada (sistema de purificagao de DNA Qiagen).

[00249] O fragmento de DNA amplificado por PCR foi digerido com BamHI, para remover as extremidades, precipitado por etanol, e clonado no vetor pTT10301 previamente digerido com BamHI. Depois de analise de restrigao de endonuclease dos diversos clones, selecionou- se o plasmidio pTT10304 que continha o gene de TTF-his- marcador recombinante na orientagao direita com relagao ao promotor de GDP (pGDP) (Figura 29).

[00250] Os inventores confirmaram ainda que a sequencia de DNA do rTF-his-marcador clonado no pTT10301 foi 100% identica a sequencia anteriormente publicada (Gene Bank #BC011029) e que ela contem os 18 nucleotidios extra esperados na extremidade 3' (Figura 25) . As celulas DH5a carreadoras do plasmidio pTT10304 foram desenvolvidas durante a noite a 37 °C em meio de LBA e usadas para preparar cepas de glicerol.

4.2. Expressao de rTTF-his-marcador por levedura recombinante

[00251] Para se regenerarem leveduras recombinantes expressores de TF-his-marcador (rTTF-his-marca) truncado humano recombinante, utilizou-se o vetor de expressao pTT10304 para transformarem celulas de levedura T73 ura3_ conforme descritas no Exemplo 1 (Segao 1.4). Selecionaram- se clones de levedura recombinantes (chamados de yTT10304) pela sua capacidade de crescerem em meios desprovidos de uracil.

[00252] Para a expressao de rTTF-his-marca, prepararam-se e analisaram-se quanto a atividade extratos de levedura clarificados (CYE) obtidos a partir de yTT10304 seguindo-se o procedimento anteriormente descrito no Exemplo 1 (Segao 1.5), que tern atividade pro-coagulante, denominada CYE-TTF (isto e, extrato de levedura clarificado (CYE) que contem fator tissular truncado microvesiculado (TTF)), tais como descritos no EXEMPLO 1.

EXEMPLO 5 Geragao do vetor de expressao de plasmidio de TF mutante de N-glicosilagao

[00253] O TF mostra tres residues diferentes onde ocorre a N-glicosilagao, a saber, Nil, N124, e N137. Mutantes simples acomodando estes residuos (N11A, N124A e N137A) e todas as suas combinagoes possiveis foram construidos utilizando-se procedimentos padrao (Figura 30). Mutagenese Dirigida a Oligonucleotidio

[00254] Utilizou-se uma reagao de PCR padrao usando-se os oligonucleotidios listados na tabela 3 para gerar os diferentes mutantes (Protocolos Correntes em Biologia Molecular, 15° capitulo). Utilizou-se o plasmidio pTT10302 como um modelo de DNA, e utilizou-se Pfu como polimerase uma vez que ele mostra uma fidelidade muito alta e baixa taxa de erro.Tabela 3. Sequencia dos oligonucleotidios usados para gerar mutantes de glicosilagao em TF. Ala significa Alanina, e Asn significa Asparagina.

Resultados Mutagdes de pontos em sitios de glicosilagao que afetam o TF

[00255] A Figura 31 mostra uma mancha-oeste antiTF comparando o perfil dos diferentes mutantes em sitios de glicosilagao locais com o tipo silvestre. Conforme ilustrado, o perfil e diferente em todos eles, e quando tratados com glicosilases, todas as bandas tornam-se uma, o que significa que o perfil observado e devido a a condipao de glicosilagao diferente.

[00256] Determinou-se a atividade de coagulagao destes mutantes, e os dados encontram-se sumariados na Tabela 4. Todos os dados foram normalizados para o tipo silvestre, cuja atividade e expressao foi considerada como sendo 100. As duas mutagoes simples em 11 (PM1) e 124 (PM2) mostraram um aumento na atividade, muito embora, surpreendentemente, o efeito mais digno de nota fosse observado quando o residuo 124 foi mudado, uma vez que a sua atividade e expressao foram significativamente aumentadas (6 e 2 vezes respectivamente). A atividade daqueles mutantes duplos e mutantes triples em que se encontra envolvido PM2 tambem foi aumentada. Tabela 4 Atividade relativa e expressao dos diferentes mutantes em sitios de glicosilagao quando comparados ao 6HT-TF do tipo silvestre.

PM = Mutagao de ponto

EXEMPLO 6 Avaliagao da atividade pro-coagulante de fator de tecido microvesiculado (mTF)

[00257] Por simplicidade, neste Exemplo, "fator tissular microvesiculado", "TF microvesiculado" ou "mTF" refere-se, de uma maneira geral, ao fator tissular, fator tissular modificado (por substituigao, eliminagao, adigao ou troca de um ou mais aminoacidos) , proteina de fusao que compreende fator tissular, ou fator tissular truncado desprovido de parte ou todo o dominio de uniao para FVIIa, sendo todos eles total ou parcialmente glicosilados e associados a microvesicula derivada de leveduras (isto e, sendo integrados na camada de lipidios das microvesiculas) a nao ser que de outro modo estabelecido.

[00258] Para o proposito de avaliagao da atividade de pro-coagulante de fator tissular microvesiculado proporcionado pela presente invengao, realizou-se uma serie de ensaios in vitro e in vivo, especificamente: 1. Ensaios in vitro demons trando que TF microvesiculado causa formagao de coagulos de fibrina e coagulagao do sangue em condigoes saudaveis e de paciente 1.1 Ensaios de coagulagao em plasma proveniente de pessoas saudaveis. 1.2 Comparagao do efeito pro-coagulante de vesiculas purificadas por filtragem de gel e TF relipidado. 1.3 Ensaios de coagulagao em plasmas deficientes em FVIII, em FIX ou em FXI. 1.4 Ensaios de coagulagao em plasmas Trombocitopenicos. 1.5 Ensaios de coagulagao em plasma proveniente de plasma deficiente em FVIII, FIX e FXI na presenga de um anticorpo anti-FVII. 1.6 Ensaios de coagulagao em sangue total nao anticoagulado proveniente de pessoas saudaveis. 1.7 Ensaios de coagulagao em sangue total nao- anticoagulado proveniente de pacientes hemofilicos (ensaios de coagulagao em sangue total nao-anticoagulado). 2. Ensaios In vivo demonstrando que TF microvesiculado e um agente de utilidade para tratamento topico anti- hemorragico em modelos de hemorragia grave (por aplicagao deste diretamente ao vaso sanguineo previamente seccionado) 2.1 Ensaio em um modelo de animal de hemorragia grave por sepao proxima de caudas de rates. 2.2 Ensaio em um modelo de animal de hemorragia grave previamente tratado com heparina. 3. Ensaios in vivo demonstrando que o TF microvesiculado e um agente de utilidade para o tratamento anti-hemorragico topico em modelos de hemorragia letal (por aplicagao diretamente no vaso sanguineo previamente seccionado) 3.1 Ensaio em um modelo de animal de hemorragia letal por segao proxima de caudas de camundongos deficientes em FVIII.

1. MATERIAIS e METODOS Materials

[00259] Como fonte de fator tissular microvesiculado (mTF) utilizaram-se tres compostos diferentes: (i) Extratos de levedura clarificados contendo TF microvesiculado (CYE-TF), obtidos de acordo com o Exemplo 1; (ii) proteina de fusao de marcador de histidina de TF-hexa microvesiculada purificada (6HT-TF) obtida de acordo com o Exemplo 2; e (iii) Extrato de levedura clarificado que contem fator tissular truncado microvesiculado (CYE- TTF) obtido de acordo com o Exemplo 3.

[00260] Plasmas deficientes em Fator de Coagulapao FVIII-, FIX- e FXI- comerciais foram adquiridos a partir da Dade Behring Marburg GmbH.

[00261] Anticorpo FVII anti-humano monoclonal comercial (clone HVII-1) foi adquirido a partir da Sigma Aldrich.

[00262] Camundongos hemofilicos comerciais (Allele: F8tmlKaz; nome comum MFVIII-16; submetido a mutagao por Haig H Kazazian; Referenda: Bi L; Lawler AM; Antonarakis SE; High KA; Gearhart JD; Kazazian HH Jr. 1995. 0 rompimento visado do gene VIII de fator de camundongo produz um modelo de hemofilia A, Nat. Genet. 10:119-21) foram adquiridos da Jackson Laboratory.

[00263] rTF Comercial foi adquirido a partir da American Diagnostica.

[00264] Amostras de plasma provenientes de cinco doadores saudaveis foram obtidas a partir do Blood Bank de Vail d'Hebron Hospital, Department "Banc de Sang i Teixits"(Pg,Vail d'Hebron, 119-129, 08035 Barcelona). As amostras de plasma foram checadas quanto a virus de hepatite B (HBV) , virus de hepatite C (HCV) , HIV e TPHA e foram todos negatives. As cinco amostras de plasma foram agrupadas e congeladas a -20C em frascos de 1,5 ml ate serem usadas.

Metodos Relipidagao de rTF

[00265] Submeteu-se a relipidagao rTF comercial (American Diagnostica) seguindo-se o procedimento padrao descrito por Morrissey (http://www.tf7.org/relipidation2. pdf) em que rTF e incorporado em lipossomos de fosfolipidio lipossomos. A quantidade de rTF presente nas amostras foi quantificada pelo "IMUBIND Tissue Factor ELISA Kit", proveniente da American Diagnostica Inc. (No. 845) e seguindo-se especificagoes do fornecedor.

Ensaios in vitro

[00266] A firn de se determinar se um fator tissular truncado microvesiculado e desprovido de parte ou da totalidade do dominio de uniao (ligagao) a FVII, e de saber se ele ainda se encontra ativo, primeiramente, realiza-se um ensaio de ligagao do fator tissular truncado microvesiculado ao FVIIa com a finalidade de se determinar se a ligagao de fator tissular truncado microvesiculado a FVIIa pode ser detectado ou nao, e, em segundo lugar, o ensaio de coagulagao em plasma pode ser usado para determinar se o fator tissular truncado ainda se encontra ativo como um pro-coagulante.

Ensaio de ligagao do fator tissular truncadomicrovesiculado ao FVIIa

[00267] Para se determinar a interagao entre seja proteina de fusao marcada de histidina TF-hexa microvesiculado purificado (6HT-TF), extratos de levedura clarificados contendo TF microvesiculado (CYE-TF) ou estratos de levedura clarificados contendo TF truncado microvesiculado (CYE-TTF) e o Fator de Coagulagao Vila (FVIIa) os autores da invengao seguiram uma versao modificada do metodo descrito na publicagao internacional WO 00/04148. Por estes meios, ensaiou-se a ligagao de 6H- TF, CYE-TF ou CYE-TTF a FVIIa bioestanhado como um teste ELISA. Para isto, preparou-se FVIIa bioestanhado (BEGR-7a) tal como descrito anteriormente (Kelley et al., 1995 Biochem. 34:10383-10392). Entao, revestiram-se placas de micro titulagao de 96 cavidades com BEGR-7a utilizando-se estreptavidina como um agente de capture. As cavidades foram lavadas duas vezes com Tween 20 a 0,05% em agua destilada e bloquearam-se com PBS contendo 1% leite seco nao gorduroso (solugao de bloqueio) durante 2h. Depois disso, adicionaram-se as cavidades diluigoes decuplas de 6HT-TF, CYE-TF ou CYE-TTF, partindo-se sob uma concentragao de 10 pg/ml, preparada em tampao de TNC (20 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM CaC12) , e contendo uma quantidade fixa de seja estreptavidina conjugada com BEGR-7a ou estreptavidina isoladamente. Depois da 2h de incubagao sob R/T, as cavidades foram lavadas novamente com Tween 20 a 0,05% para eliminar material nao ligado. Para detectar o complexo TF-FVIIa nas diferentes solugoes que continham TF utilizou-se um anti-soro policlonal de coelho anti-TF especifico. Para isto, uma diluigao a 1:500 da diluigao de soros anti-TF foi adicionada as cavidades e incubada 2h a 37 °C. As placas foram lavadas cinco vezes antes da ser adicionado o anticorpo de detecgao. Diluiu-se anticorpo de imunoglobulina anti-coelho caprina conjugado a peroxidase G (IgG) (Southern Biotechnology Associated) 1:1000 em solugao de bloqueio e incubou-se durante lh a 37°C. As placas foram lavadas novamente cinco vezes e utilizaram-se peroxido de hidrogenio e ortofenilenodiamina (OPD) a 0,05% para desenvolver a reagao. Depois de 10 a 15 minutos de incubagao sob temperatura ambiente, a reagao foi sustada pela adigao de H2SO4 (2N) e a absorvencia foi medida a 492 nm em uma leitora de placas Multiskan Plus (sistema laboratorial).

Ensaios de coagulagao em plasma

[00268] Mediu-se a atividade pro-coagulante espontanea (nao estimulada) em plasma por meio de um ensaio de coagulagao de duas etapas em um coagulometro de 4 canais (Start 4, Diagnostica Smarcao). Sucintamente, adicionaram- se 50 pl de plasma pobre em plaquetas as depressoes ja temperadas e 50 pl da amostra (mTF, ou agua destilada como controle). Deixou-se esta mistura incubar durante 60 segundos a 37 °C e adicionaram-se imediatamente 50 pl de cloreto de calcio 25 e o tempo de coagulagao foi determinado em segundos no coagulometro, verificado pela formagao do coagulo. Obtiveram-se plasmas deficientes em plaquetas por meio de centrifugagao e o numero de plaquetas foi determinado por Coulter.

[00269] O efeito pro-coagulante de mTF nos plasmas deficientes em fatores de coagulagao (FVIII, FIX ou FXI) correspondeu a hemofilia A, B ou C, respectivamente, foi investigado pelo uso de plasmas comerciais (Dade Behring Marburg GmbH) exaurido por meio de tecnicas de imunoafinidade. Em cada caso, o teor final dos ditos fatores de coagulagao foi menor do que 1%.

[00270] O efeito pro-coagulante em uma condigao semelhante a trombocitopenica foi investigada em plasma exaurido de plaquetas com um processo de centrifugagao sequencial.

Ensaios de coagulagao em sangue total

[00271] A atividade pro-coagulante em sangue total nao-anticoagulado foi determinada por meio de um metodo de coagulagao. Os diferentes agentes (mTF) a serem estudados foram adicionados em volume final de 0,2 ml a 0,8 ml de sangue total nao-anticoagulado e mediu-se o tempo de coagulagao com um cronometro desde o inicio da extragao ate que apareceu um coagulo de sangue estavel e consolidado. 0 efeito dos diferentes agentes foi avaliado por meio da diminuigao ou alongamento dos tempos de coagulagao do sangue.

[00272] Obtiveram-se amostras de sangue a partir de pacientes ou voluntaries saudaveis.

Ensaios in vivo Modelo de hemorragia grave por sepao proxima em cauda de rato

[00273] Ratos machos Sprage-Dawley pesando 300-600 gramas foram distribuidos aleatoriamente em 2 grupos de tratamento: um grupo de controle, constituido de pelo menos 3 animais que receberam tratamento topico com solupao salina fisiologica, e um segundo grupo, tambem constituido de pelo menos 3 animais, que recebeu tratamento topico com mTF.

[00274] Todos os compostos entraram em contacto topico com a sepao proxima da cauda do animal para agirem hemostaticamente em um volume de 1 ml/min distribuido diretamente na superficie ferida com o rato em uma posipao voltada para cima. A formapao do coagulo estavel e consolidado foi evidenciada por meio de confirmapao de nenhum outro sangramento.

Modelo de hemorragia grave por sepao proxima da cauda do rato em animais tratados com drogas anticoagulantes a) Animais tratados com 6HT-TF

[00275]Ratos machos Sprage-Dawley, pesando 300-600 gramas foram distribuidos aleatoriamente em 2 grupos de tratamento: um grupo de controle, constituido de 14 animais que receberam tratamento topico com solugao salina fisioldgica, e um segundo grupo constituido de 5 animais que receberam 200 U/kg de heparina intravenosamente (i.v.) 15 minutos antes de comegar o procedimento de transecgao da cauda. Este grupo foi tratado depois de 15 minutos com mTF (6HT-TF) 1494 ng/ml. 0 mTF entrou em contacto topico com a segao proxima da cauda do animal para agir hemostaticamente distribuido gota a gota por uma pipeta plastica eppendorf.

[00276]A formagao do coagulo estavel e consolidado foi evidenciada por meio de confirmagao de mais nenhum sangramento.

b) Animais tratados por CYE-TF

[00277]Distribuiram-se aleatoriamente 27 ratos machos Sprage-Dawley pesando 300-600 gramas em 5 grupos de tratamento: - um grupo de controle, constituido de 14 animais que receberam tratamento topico com solugao salina fisiologica; - dois grupos receberam 200 U/kg de heparina i.v. 15 minutos antes de iniciar-se o procedimento de transecgao da cauda (para serem tratados com CYE-TF (n=3), e para serem tratados com solugao salina fisiologica (n=5)), e - outros dois grupos receberam oralmente 0,1 mg/kg/dia de warfarin durante tres dias antes de se iniciar o procedimento de transecgao de cauda (para serem tratados com CYE-TF (n=3) e para serem tratados com solugao salina fisiologica (n=2)).

[00278] Portanto, houve um grupo de controle tratado para cada tratamento de anticoagulagao. 0 CYE-TF entrou em contacto topico com a segao proxima da cauda do animal para atuar hemostaticamente aplicado por meio de uma pipeta eppendorf de plastico. A formagao do coagulo estavel e consolidado foi evidenciada por meio da confirmagao de nenhum sangramento mais.

Modelodehemorragialetalporsegaoproximadecaudade camundongos, utilizando-se camundongos deficientes em Fator VIII

[00279] O proposito deste ensaio foi avaliar os efeitos de administrapao topica de mTF em um modelo de hemorragia letal (transecgao da veia da cauda) utilizando- se camundongos deficientes em Fator VIII (Hemofilia A) obtidos por mutagao visada de gene.

[00280] Os camundongos que eram homoziguos para o alele mutante vinculado a cromossomo X, eram viaveis e ferteis. As femeas homoziguas e machos carreadores tinham menos do que 1% de atividade de Fator VIII normal e exibiam tempos de coagulagao prolongados. Estes camundongos recapitularam fatores chave de Haemofilia A e proporcionaram um modelo excelente para o uso na exploragao de estrategias de terapia alternativas.

[00281] Proporcionaram-se 5 grupos de tratamento, com de 3 a 5 camundongos por grupo, como se segue:

[00282]A concentragao de proteina da cepa mTF foi 1,494 ng/ml de material biologicamente ativo. Somente uma dose foi usada diretamente a partir do recipiente de cepa e nao se realizou qualquer diluigao. As doses de artigo de teste foram calculadas com base na concentragao de proteina biologicamente ativa, utilizando-se um ensaio de coagulagao de duas etapas. 0 mTF e o veiculo foram administrados topicamente no sitio da hemorragia da cauda gota a gota em uma proporgao de 0,25 ml/minuto durante um maximo de 20 minutos (5 ml).

II. RESULTADOS 1. Ensaios in vitro demonstrando que o TF microvesiculado causa coagulagao do sangue em condigoes saudaveis e doentes

[00283] Realizaram-se diversos ensaios in vitro com o proposito de se avaliar a capacidade do mTF causar coagulapao de fibrina em pacientes saudaveis e hemofilicos sob diferentes concentraqoes. Tal como mencionado anteriormente, "tempo de coagulapao" refere-se ao tempo que o coagulo demora em consolidar-se em uma amostra de sangue nao-anticoagulado.

1.1 TF Microvesiculado e capaz de coagular plasma proveniente de pacientes saudaveis (ensaios de coagulapao em plasma)

[00284] O ensaio direto para atividade pro- coagulante de mTF em plasma saudavel sob diferentes concentrapoes demonstrou que o mTF e capaz de diminuir de forma muito significativa o tempo de coagulapao em condipoes de plasma saudavel, de uma forma de resposta a dose absoluta. Mesmo sob concentrapoes de mTF muito baixas (2 ng/ml) o tempo de coagulapao de plasma saudavel e reduzido em quase tres vezes. Sob concentrapoes mais altas (100 ng/ml) ele e reduzido em mais de 5 vezes. A Tabela 5 mostra os resultados em tres experiencias independentes para proteina de fusao marcador de TF-hexa histidina microvesiculada purificada (6HT-TF), a Tabela 6 para extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE-TF), e a Tabela 7 para extrato de levedura clarificado que contem TF truncado microvesiculado (CYE-TTF). Tabela 5 A proteina de fusao de marcador de histidina TF-hexa microvesiculada (6HT-TF) purificada diminui o tempo de coagulagao em plasma saudavel na forma de uma resposta a dose

Tabela 6 Extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE-TF) diminui o tempo de coagulagao em plasma saudavel na forma de uma resposta a dose

Tabela 7 Extratos de levedura clarificado que contem TF truncado microvesiculado (CYE-TTF) diminui o tempo de coagulagao em plasma saudavel

1.2 0 TF microvesiculado e capaz de coagular plasma com eficiencia aperfeigoada quando comparado a rTF relipidado seguindo-se procedimentos padrao. 1.2.1. Atividade pro-coagulante do mTF comparada com rTF comercial relipidado seguindo-se os procedimentos padrao.

[00285] Submeteu-se a relipidaqao rTF comercial (American Diagnostica) seguindo-se o procedimento padrao descrito por Morrissey (http://ww.tf7.org/relipidation2. pdf) , em que o rTF e incorporado em lipossomos de fosfolipidio. Obtiveram-se amostras de plasma a partir de cinco doadores saudaveis provenientes do Blood Bank de Vail d'Hebron Hospital, Department "Banc de Sang i Teixits"(Pg,Vail d'Hebron, 119-129, 08035 Barcelona). As amostras de plasma foram checadas quanto a virus de hepatite B (HBV) , virus de hepatite C (HCV) , HIV e TPHA e todas elas foram negatives. As cinco amostras de plasma foram agrupadas e congeladas a -20C em frascos de 1,5 ate serem utilizadas. A quantidade de rTF presente nas amostras foi quantificada pelo IMUBIND Tissue Factor ELISA Kit, proveniente do American Diagnostica Inc. (No. 845) e seguindo-se as especificagdes do fornecedor.

[00286] Primeiro, analisaram-se as possiveis diferengas na atividade entre o rTF incorporado nas microvesiculas de levedura ou quando ele e inserido em lipossomos sinteticos. Para estas experiencias testaram-se quatro lotes diferentes de mTF (Lotes P4, P7, P8 e P) e um lote de rTF relipidado in vitro, todos eles com concentragoes de rTF conhecidas conforme determinado por ELISA, quanto a atividade coagulante. Desta maneira, testaram-se diluigoes em serie, seja de mTF (a partir dos quatro lotes diferentes), ou de rTF comercial relipidado, quanto a atividade em um teste de coagulagao padrao. 0 resultado mostrou que sobre toda a gama de concentragoes testadas, e independentemente do grupo testado, a atividade pro-coagulante nas amostras de mTF foi sempre mais alta (entre uma ou duas ordens de grandeza) do que aquela das diluigoes correspondentes de rTF relipidado (Figura 32).

1.2.2. Atividade pro-coagulante do rTF inserido nas microvesiculas derivadas de levedura (mTF) comparado ao mesmo rTF inserido nos lipossomos sinteticos.

[00287] Esforgos realizados para relipidar o rTF extraido a partir de microvesiculas de mTF mostraram que a atividade de rTF e enormemente reduzida quando comparada as microvesiculas de levedura originais que contem rTF (Figura 33) . Parece haver um requisito de conformagao para a atividade 6tima de fator tissular.

1.2.3. Atividade pro-coagulante de mTF em plasma heparinizado

[00288] Adicionalmente, a atividade presente nos preparados reconstituidos foi insignificante em determinados modelos in vivo (animais heparinizados) de hemorragia (Figura 34).

[00289] Tornados em conjunto, os resultados mostrados em 1.2 indicam que a combinagao unica de fator tissular e membrana de leveduras presentes nas microvesiculas no mTF ou 6H-TF de acordo com a a invengao exibem uma pleiade de atividades hemostaticas as quais nao podem ser conseguidas pela insergao in vitro convencional do rTF em lipossomos sinteticos.

1.3 . 0 TF microvesiculado e capaz de coagular plasma a partir de pacientes deficientes em FVIII, FIX e FXI (ensaios de coagulagao em plasma)

[00290] O ensaio direto quanto a atividade pro- coagulante de mTF em plasmas deficientes em fatores de coagulagao FVIII (Hemofilia A) , FIX (Hemofilia B) , e FXI (Hemofilia C) obtidos por imunodeplegao sob diferentes concentragoes, demonstrou que o mTF e capaz de diminuir de forma muito significativa o tempo de coagulagao em condigoes hemofilicas, em uma maneira de resposta de dose evidente. Mesmo sob concentragoes de mTF muito baixas (2 ng/ml) ele conseguiu provocar a coagulagao de plasmas exauridos de FVIII, FIX ou FXI. Sob concentragoes mais altas (100 ng/ml) , o mTF reduz o tempo de coagulagao em plasmas exauridos sob o mesmo nivel que nos plasmas saudaveis. A Tabela 8 mostra os resultados em 3 experiencias independentes para proteina de fusao de marcador de histidina de TF-hexa microvesiculado purificado (6HT-TF), e a Tabela 9 mostra os resultados para extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE-TF). Tabela 8 A proteina de fusao marcador de histidina de TF-hexa microvesiculado purificado (6HT-TF) diminui o tempo de coagulagao em plasmas deficientes em fator de coagulagao FVIII (Hemofilia A), FIX (Hemofilia B), e FXI (Hemofilia C) em uma maneira de resposta de dose

Tabela 9 Extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado diminuem o tempo de coagulagao em plasmas deficientes em fator de coagulagao FVIII (Hemofilia A), FIX (Hemofilia B), e FXI (Hemofilia C) de uma maneira de resposta de dose

1.4 . 0 TF microvesiculado e capaz de coagular plasma a partir de deficiencia de plaquetas adquirida (ensaios de coagulagao em plasma Trombocitopenico)

[00291] O ensaio direto para atividade pro- coagulante de mTF em plasma a partir de deficiencia de plaquetas adquirida demonstrou que o mTF e capaz de diminuir de forma muito significativa o tempo de coagulagao em plasmas trombocitopenicos com diferentes contagens de plaquetas. Mesmo sob contagens de plaquetas muito baixas (<1,000/|il) o tempo de coagulagao e drasticamente reduzido pelos extratos de levedura clarificado que contem o TF microvesiculado TF (CYE-TF), conforme ilustrado na Tabela 10. Tabela 10 Os extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE-TF) diminuem o tempo de coagulagao em plasmas trombocito penicos

1.5 . 0 TF microvesiculado e capaz de coagular plasma proveniente de plasma deficiente em FVIII, FIX e FXI na presenga de um anticorpo anti-FVII (ensaios de coagulagao em plasma)

[00292] O efeito de TF microvesiculado na coagulagao de plasma foi investigado por meio de ensaios de coagulagao utilizando-se plasmas deficientes em FVIII, FIX e FXI (FVIII DP, FIX DP e FXI DP) provenientes de voluntaries saudaveis na presenga de um anticorpo monoclonal contra FVII. Os resultados mostram de forma evidente que os extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE-TF) sao capazes de produzir coagulapao de plasma, mesmo reduzindo extraordinariamente o tempo de coagulagao mesmo na ausencia de FVIII, FIX ou FXI e na presenga do anticorpo monoclonal contra FVII, conforme ilustrado na Tabela 11. A coagulagao com a ausencia de FX, e com a presenga de anticorpos FVII significa que, surpreendentemente, o mTF nao esta atuando atraves de caminhos de coagulagao intrinsecos nem extrinsecos. Tabela 11 Extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE-TF) coagulam os plasmas deficientes em FVIII, FIX e FXI na presenga de anticorpos anti-FVII

1.6 0 TF microvesiculado e capaz coagular sangue proveniente de pessoas saudaveis (ensaios de coagulagao em sangue total nao-anticoagulado)

[00293] O ensaio direto quanto a atividade pro- coagulante de mTF em sangue total proveniente de pessoas saudaveis sob diferentes concentragoes demonstrou que o mTF e capaz de diminuir de forma muito significativa o tempo de coagulagao de uma forma no sentido de dose evidente. Mesmo sob concentragoes de mTF muito baixas (1 ng/ml) ele conseguiu reduzir o tempo de coagulagao do sangue total proveniente de pessoas saudaveis. Sob concentragoes mais altas (100 ng/ml) , o mTF reduz o tempo de coagulagao em plasmas exauridos em mais do que 8 vezes. Q Tabela 12 mostra os resultados obtidos em tres experimentos independentos quanto a proteina de fusao marcador de histidina de TF-hexa microvesiculado purificado (6HT-TF), e a Tabela 13 mostra os resultados quanto a extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE- TF) .  Tabela 12 A proteina de fusao de marcador de histidina de TF-hexa microvesiculado purificado diminui o tempo de coagulagao no sangue total proveniente de pacientes saudaveis segundo uma resposta dosada

Tabela 13 Os estratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE-TF) diminuem o tempo de coagulagao no sangue total proveniente de pacientes saudaveis segundo uma resposta dosada

1.7 0TFmicrovesiculadoecapazdecoagularsangue proveniente de pacientes hemofilicos (ensaios de coagulagao em sangue total nao-anticoagulado)

[00294] O ensaio direto quanto a atividade pro- coagulante de mTF em sangue total proveniente de pacientes hemofilicos sob concentrapoes diferentes demonstrou que o mTF e capaz de diminuir de forma muito significativa o tempo de coagulagao em uma maneira de resposta a uso evidente. Mesmo sob baixas concentrapoes de mTF (2-5 ng/ml) ele conseguiu normalizar o tempo de coagulagao de sangue total proveniente de pacientes hemofilicos. Sob concentrapoes mais elevadas (20 ng/ml), o mTF reduz o tempo de coagulagao no sangue total hemofilico para menos de um minuto. A Tabela 14 mostra os resultados em tres experiencias independentes para proteina de fusao marcador de histidina de TF-hexa microvesiculado purificado (6HT- TF) , e a Tabela 15 mostra os resultados para extratos de levedura clarificado que contem TF microvesiculado (CYE- TF)

2. Ensaios in vivo demonstrando que o TF microvesiculado e um agente de utilidade para tratamento anti-hemorragico topico em modelos de hemorragia grave (por aplicagao diretamente no vaso sanguineo previamente seccionado)

[00295] Realizaram-se diversos ensaios in vivo com o proposito de avaliar a capacidade do mTF causar coagulagao de fibrina em pacientes saudaveis e hemofilicos sob diferentes concentragoes.

2.1 0 TF microvesiculado e de utilidade como um agente hemostatico topico em um modelo de animal de hemorragia grave por segao proxima de caudas de ratos

[00296] Estudos in vivo utilizando-se um modelo de hemorragia grave em rato por transecgao de cauda total mostrou uma redugao significativa no tempo de sangramento: de 18,16±1,61 ate 8,36±0,82 minutos quando se trataram animais com 6HT-TF a 1494 ng/ml ate 1,7 |ig de concentragao de proteina total; de 18,16±5,98 ate 9,33±l,05 minutos quando se trataram animais com CYE-TF a 200 ng/ml/min.

2.2 0 TF microvesiculado e de utilidade como um agente hemostaticotopicoemummodelodeanimaldehemorragia grave previamente tratado com heparina

[00297] Estudos realizados in vivo utilizando-se um modelo de hemorragia grave em rato pre-tratado com anticoagulante (isto e, heparina 200 IU) por segao da cauda total mostrou um efeito anti-sangramento muito significativo. Os ratos nao tratados com 6HT-TF sangraram ate morrer depois de 90 minutos, onde ratos tratados com 6HT-TF a 1494 ng/ml pararam de sangrar em 15,46±l,20 minutos e mostraram uma capacidade de sobrevivencia de 100%. Por outro lado, o uso de CYE-TF tambem mostrou efeito anti-sangramento assemelhado. Os ratos previamente tratados com heparina sangraram ate morrer depois de 90 minutes, enquanto que os ratos tratados com CYE-TF pararam de sangrar em 14,21 2,4 (n=5) minutos e tambem mostraram uma capacidade de sobrevivencia de 100%. Os ratos previamente tratados com warfarin reduziram o seu tempo de coagulapao de 41,6116,45 para 5.8±0.64 (n=3) minutos quando tratados com CYE-TF (200 ng/ml).

3. Ensaios in vivo demonstrando que o TF microvesiculado e um agente de utilidade para tratamento anti-hemorragico topico em modelos de hemorragia letal (por aplicagao diretamente no vaso sanguineo previamente seccionado) 3.1 0 TF microvesiculado e de utilidade como um agente hemostaticotopicoemummodelodeanimaldehemorragia letal por segao proxima de caudas de camundongos deficientes em FVIII

[00298] Em um modelo de hemorragia letal em camundongos hemofilicos (camundongos deficientes em FVIII), a administragao topica de 6HT-TF resultou em uma redugao dramatica do tempo de sangramento (de 31,4±4,74 para 5,14±0,69 minutos em ratos machos hemofilicos e de 43,33113,48 a 5,012,0 minutos em camundongos femeas) comparaveis ao tempo de sangramento obtido em camundongos normals, nao hemofilicos (5,010,65 minutos). Esta redugao no tempo de sangramento esteve associada com nenhuma mortalidade no grupo tratado com 6HT-TF enquanto todos os camundongos hemofilicos tratados com veiculos sangraram ate morrer. A Tabela 16 mostra os resultados em cinco/tres experiencias independentes para proteina de fusao de marcador de histidina de TF-hexa microvesiculado purificado (6HT-TF). Tabela 16 A proteina de fusao de marcador de histidina de TF-hexa microvesiculado purificado (6HT-TF) diminui o tempo de sangramento em modelo de hemorragia letal por segao proxima de caudas de camundongos deficientes em FVIII

[00299] Os resultados globais mostram o potencial hemostatico poderoso do mTF em pacientes saudaveis e mesmo em pacientes hemofilicos, sendo isto demonstrado tanto in vitro (plasma e sangue total proveniente de pacientes hemofilicos) quanto de modelos in vivo utilizando-se o modelo de camundongo deficiente de gene A com hemofilia. Adicionalmente, o mTF e capaz de coagular plasmas com caminhos intrinsecos e extrinsecos bloqueados.

Claims (27)

1 - Microvesicula derivada de levedura carreadora de fator tissular (TF) com atividade pro- coagulante caracterizadapor compreender (i) uma membrana de levedura, e (ii) uma proteina de fator tissular (TF) ou uma variante desta com atividade pro- coagulante, em que uma porgao da dita proteina de fator tissular (TF) ou um fragmento desta com atividade pro- coagulante e integrada na dita membrana, em que a dita membrana e obtida por um processo que compreende: a) submeter uma cultura de celulas de levedura recombinantes que expressam proteina TF ou um fragmento desta com atividade pro-coagulante a fermentagao sob condigoes que permitem a expressao da dita proteina TF ou fragmento desta com atividade pro-coagulante; b) peletizar o produto resultante da fermentagao da etapa a) para obter um produto de fermentagao; c) submeter o dito produto de fermentagao proveniente da etapa b) a homogeneizagao para obter um homogeneizado de fermentagao; e d) submeter o dito homogeneizado de fermentagao da etapa c) a separagao para obter um pellet e um extrato de levedura clarificado (CYE) contendo a dita microvesicula derivada de levedura carreadora de TF com atividade pro-coagulante; clarificado (CYE) contendo a dita microvesicula derivada de levedura carreadora de TF com atividade pro-coagulante; e f) isolar ou purificar as ditas microvesiculas derivada de levedura carreadora de TF com atividade pro-coagulante.

2 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicagao 1, caracterizadapelo fato de que a dita proteina de fator TF ou uma variante desta com atividade pro-coagulante e glicosilada.

3 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicagao 1 ou 2, caracterizadapelo fato de que a dita proteina de fator TF ou uma variante desta com atividade pro-coagulante e um elemento de uma proteina de fusao, a dita proteina de fusao contendo uma primeira regiao que compreende a proteina TF ou um fragmento desta com atividade pro-coagulante ligada a uma segunda regiao que compreende outro peptideo ou proteina.

4 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicagao 3, caracterizadapelo fato de que a dita proteina de fusao compreende uma proteina TF ou uma variante desta com atividade pro-coagulante e um marcador.

5 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicagao 4, caracterizadapelo fato de que o dito marcador e um marcador de histidina (His- tag) .

6 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicagoes 1 a 5, caracterizadapor compreender uma proteina TF madura, preferivelmente, uma proteina TF madura humana.

7 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicagoes 1 a 6, caracterizadapor compreender uma proteina TF truncada com atividade pro-coagulante, em que todo ou parte do dominio responsavel pela ligagao a FVIIa (aa 32 a 174) esta ausente.

8 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicagao 7, caracterizadapelo fato de que a dita proteina TF truncada compreende o dominio de interagao para o Fator X, a regiao transmembrana e a cauda citoplasmatica e carece, parcialmente ou totalmente, do dominio responsavel pela ligagao a FVIIa.

9 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicagao 8, caracterizadapelo fato de que a dita proteina truncada TF compreende o dominio de interagao para o Fator X (aa 174-251) , a regiao transmembrana (aa 252-274) e a cauda citoplasmatica (aa 275-295) do TF humano e um marcador de histidina extra.

10 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicagoes 1 a 6, caracterizadapelo fato de que o TF contem pelo menos um sitio de N-glicosilagao nao funcional.

11- Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicapao 10, caracterizadapelo fato de que o dito sitio ou sitios de N-glicosilapao nao funcional(is) sao aqueles correspondentes aos sitios de N-glicosilapao NLT nas posipoes 11-13, NVT nas posipoes 124-126 ou NNT nas posipoes 137-139 na rTF humana madura.

12 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicapao 11, caracterizadapelo fato de que o TF transporta uma ou mais mutapoes Asn-a-Ala nos residuos Asn em posipoes correspondentes as posipoes 11, 124 ou 137 no TF humano maduro.

13 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicapoes 1 a 12, caracterizadapelo fato de que o dominio N-terminal da dita proteina TF ou uma variante desta com atividade pro-coagulante fica voltado para o lado exoplasmatico da dita membrana.

14 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicapoes 1 a 12, caracterizadapelo fato de que o dominio N-terminal da dita proteina TF ou variante desta com atividade pro- coagulante fica voltado para o lado endoplasmatico da dita membrana.

15 - Microvesicula derivada de levedura, de acordo com a reivindicapao 1, caracterizadapelo fato de que a dita purificapao e realizada atraves de purificapao por marcadores ou cromatografia por imunoafinidade.

16 - Composicao caracterizadapor compreender uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, conforme definida em qualquer uma das reivindicaQoes 1 a 15.

17 - Microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, de acordo com qualquer uma das reivindicaQoes 1 a 15, caracterizadapor ser para uso como um medicamento.

18 - Composipao farmaceutica caracterizadapor compreender uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, conforme definida em qualquer uma das reivindicaQoes 1 a 15, e um veiculo farmaceuticamente aceitavel.

19 - Microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, de acordo com qualquer uma das reivindicaQoes 1 a 15, caracterizadapor ser para uso no tratamento de hemorragias em um paciente.

20 - Microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, de acordo com a reivindicagao 19, caracterizadapor ser para uso no tratamento topico de hemorragias em um paciente.

21 - Microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, de acordo com qualquer uma das reivindicaQoes 1 a 15, caracterizadapor ser para uso no tratamento de uma doenga que requer promover migragao celular e/ou angiogenese em um paciente, em que a dita doenga e selecionada a partir de isquemia miocardica, infarto do miocardio, cardiomiopatia isquemica, claudicagao isquemica cronica de membros, dor em repouso/ulcera isquemica/gangrena, acidente vascular cerebral isquemico/neuropatia, penumbra isquemica ao redor de acidente vascular cerebral/infarto, placa aterosclerotica instavel/ulcerada em arterias coronarias/carotidas, trombose arterial e/ou venosa aguda ou cronica, cicatrizagao de feridas, acidente vascular cerebral isquemico e hemorragico, lesao traumatica e ulceras.

22 - Microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, de acordo com a reivindicagao 21, caracterizadapelo fato de que a lesao e selecionada a partir de lesoes na cornea; danos; abrasoes; incisoes cirurgicas; local doador de enxerto; lesao em um lumen corporal como um vaso sanguineo, arteria, arteria coronaria, veia, lumen esofagico e uretra; lesoes causadas por agentes infecciosos; lesoes de pele e superficie epitelial causadas por uma condigao inflamatoria persistente ou infecgao; lesoes de pele e da superficie epitelial causadas por um defeito genetico, como formagao de queloides e anormalidades na coagulagao.

23 - Microvesicula derivada de levedura carreadora de TF, de acordo com a reivindicagao 21, caracterizadapelo fato de que a ulcera e selecionada dentre ulceras nas pernas, escaras, ulcera venosa cronica, ulcera diabetica, ulcera por compressao, ulceras por pressao e ulceras ou feridas na superficie de mucosas.

24 - Processo para a fabricagao de uma microvesicula derivada de levedura carreadora de TF com atividade pro-coagulante que compreende (i) uma membrana de levedura, e (ii) uma proteina de fator tissular (TF) ou uma variante desta com atividade pro- coagulante, em que uma porgao da dita proteina de fator tissular (TF) ou um fragmento desta com atividade pro- coagulante e integrada na dita membrana, caracterizado pelo fato de que compreende: a) submeter uma cultura de celulas de levedura recombinantes que expressam proteina TF ou um fragmento desta com atividade pro-coagulante a fermentagao sob condigoes que permitem a expressao da dita proteina TF ou fragmento desta com atividade pro-coagulante; b) peletizar o produto resultante da fermentagao da etapa a) para fornecer um produto de fermentagao; c) submeter o dito produto de fermentagao proveniente da etapa b) a homogeneizagao para obter-se um homogeneizado de fermentagao; e d) submeter o dito homogeneizado de fermentagao proveniente da etapa c) a separagao para obter-se um pellet e um extrato de levedura clarificado (CYE) que contem a dita microvesicula derivada de levedura carreadora de TF com atividade pro-coagulante; e) coletar o dito extrato de levedura clarificado (CYE) que contem a dita microvesicula derivada de levedura carreadora de TF com atividade pro-coagulante; e, f) isolar ou purificar as ditas microvesiculas derivadas de levedura carreadora de TF com atividade pro-coagulante.

25 - Processo, de acordo com a reivindicapao 24, caracterizadopelo fato de que a dita purificagao e realizada atraves de purificapao por marcador ou cromatografia por imunoafinidade.

26 - Processo para a preparapao de microvesiculas que compreendem uma proteina de membrana de interesse, em que a proteina de interesse e rTF, um fragmento desta ou um mutante da N-glicosilapao desta, a partir de uma celula de levedura caracterizadopelo fato de que compreende as etapas de: a) cultivar uma cultura da dita celula de levedura sob condigoes que permitem a expressao da dita proteina de membrana de interesse; b) submeter a frapao de celula da cultura de a) a homogeneizapao; c) submeter o homogeneizado obtido a partir da etapa b) a separagao para obter-se um pellet e um extrato de celula clarificado que contem as ditas microvesiculas derivadas de celulas que contem a proteina de membrana de interesse; d) purificar as ditas microvesiculas derivadas de celulas por partipao de tamanho usando filtrapao de fluxo tangencial e/ou usando filtros de membrana que retem microvesiculas com um diametro de 0,11 a 0,2 pm.

27 - Processo, de acordo com a reivindicapao 26, caracterizadopor compreender uma etapa adicional de concentragao por cromatografia de exclusao de tamanho ou uma etapa de purificagao adicional por cromatografia de afinidade utilizando-se um ligante que apresenta afinidade pela proteina de membrana de interesse.

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