BRPI0720054A2 - Uso de iota-carragenano, item de higiene ou sanitário sólido, e, iota-carragenano - Google Patents

Description

“USO DE IOTA-CARRAGENANO, ITEM DE HIGIENE OU SANITÁRIO SÓLIDO, E, IOTA-CARRAGENANO”

A presente invenção está no campo da imunologia e agentes antivirais e diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo carragenano como um ingrediente ativo antiviral e às aplicações desta na prevenção ou tratamento terapêutico de infecções por rinovírus. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Picomavírus representam uma família de vírus muito grande de pequenos vírus contendo ácido ribonucleico responsáveis por doenças humanas e animais muito graves. Os Picomavírus incluem quatro grupos principais: enterovírus, rinovírus, cardiovírus e aptovírus.

Os rinovírus humanos consistem de pelo menos 100 sorotipos e são os principais agentes causadores do resfriado comum. Devido ao grande número de sorotipos, o desenvolvimento de uma vacina é problemático; agentes antivirais podem, portanto, ser a melhor abordagem para o tratamento. Os rinovírus são compostos de um capsídeo circundante, que contém quatro proteínas virais VP1, VP2, VP3 e VP4. As proteínas VP1, VP2 e VP3 são organizadas em 60 unidades icosaédricas protaméricas de repetição. Estas são supostas de serem a causa da diversidade de antígeno associada com estes vírus.

As infecções por rinovírus (HRV) levam ao resfriado comum com sintomas tais como febre, tosse e congestão nasal. A infecção por HRV é o segundo agente mais freqüentemente reconhecida associado com a pneumonia e bronquiolite em lactentes e crianças jovens e comumente causa exacerbações de doença das vias respiratórias pré-existente naqueles com asma, doença pulmonar obstrutiva crônica ou fibrose cística. A infecção por HRV está associada a um terço a um meio das exacerbações de asma dependendo da idade e está ligada às hospitalizações por asma tanto em adultos quanto em crianças. Os métodos de tratamento presentes incluem a aplicação de RNA específico do rinovírus, como divulgado na DE 19825395, que se liga à região da garganta do capsídeo, que é necessária para a ligação do receptor hospedeiro (por exemplo, ICAM-1, molécula-1 de aderência intracelular) e 5 para a infecção de celular.

Outro método compreende a administração de proteínas de ICAM-I solúveis ou derivados de ICAM-I conforme divulgado nas US 6.326.004 e US 6.096.862 (tlCAM-1, truncado ICAM-1) para neutralizar as partículas virais (virions).

Os compostos químicos com atividade antiviral contra os

rinovírus são divulgados na EP 0523803.

Os sintomas de rinovírus são causados por uma reação ou excessiva ou não específica do sistema imune. Portanto, as formas comuns de tratamento de uma infecção por rinovírus incluem a administração de 15 analgésicos como aspirina ou acetaminofeno/ paracetamol, assim como versões localizadas que direcionam a garganta (freqüentemente liberadas na forma de pastilha), descongestionantes nasais, que reduzem a inflamação nas fossas nasais mediante a contração dos vasos sanguíneos locais, supressores da tosse (que operam para suprimir o reflexo de tosse no cérebro ou mediante 20 a diluição do muco nos pulmões), e anti-histamínicos de primeira geração tais como bromfeniramina, clorfeniramine e clemastina (que reduzem a secreção da glândula mucosa e assim combatem o nariz bloqueado/corredio, mas também podem tomar o usuário sonolento).

Os polissacarídeos sulfatados incluindo carragenanos são 25 conhecidos na técnica por sua eficácia antiviral. Em uma análise mais interessante, Gonzalez M.E. et al. (1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31, 1388-1393) relatam uma eficácia antiviral de diferentes polissacarídeos sulfatados incluindo iota-carragenano contra vários vírus de animal. A iota- carragenano mostrou atividade antiviral contra os vírus revestidos HSV-1, HSV-2, vírus Semliki Forest (SFV), vírus vaccínia e vírus da febre suína Africana (ASF) e contra o vírus da encefalomiocardite desnudo (EMC). A iota-carragenano não teve qualquer efeito sobre os vírus revestidos, vírus da estomatite vesicular (VSV) e vírus do sarampo e sobre os vírus desnudos, vírus da poliomielite tipo 1 e adenovírus tipo 5.

A US 2003/181415 A divulga atividade antiviral de polissacarídeos sulfatados tais como o sulfato de celulose, contra vários vírus revestidos e em particular o vírus da herpes simples (HSV), papiloma vírus e HIV.

A WO 2005/004882 A divulga o tratamento terapêutico de

infecções virais, com exclusão da infecção por rinovírus, com polissacarídeos sulfatados tais como carragenanos.

A US 2005/171053 Al divulga o uso de lambda-carragenano para inibir a disseminação de uma infecção sexualmente transmissível,

incluindo a infecção pelo HIV-1.

Yamada et al. (1997, Carbohydrate Polymers, Appl. Scien. Publishers 32, 51 -55) divulgam uma atividade anti-HIV-1 da lambda-, capa- e iota-carragenano e seus derivados sulfatados.

S. F. Tischer et al. (2006, Carbohydrate Polymers, Appl.

Scien. Publishers 63, 459-465) divulgam uma atividade de carragenano isolada de Meristiella gelidium contra a herpes simples e vírus da dengue.

Carlucci et al. (2004, Antiviral Research, Elsevier Science BV. 64, 137-141) divulgam um efeito protetor da lambda-carragenano sobre a infecção por vírus da herpes simples genital em camundongos.

Pujol et al. (2006, Planta Medica 72, 121 -125) divulgam uma

atividade antiviral de um carragenano isolado de Gigartina skottsbergii contra a infecção por vírus da herpes simples de murino intraperitoneal.

O termo “carragenano” é freqüentemente utilizado como um termo coletivo para polissacarídeos com base em galactose sulfatados lineares extraídos de algas marinhas (rhodophyceae). É principalmente utilizado como um espessante, agente de formação de gel, estabilizante ou emulsificante em produtos farmacêuticos e alimentícios. Existem mais do que 10 diferentes carragenanos dependendo do gênero da alga marinha da qual elas são extraídas. Os três principais tipos são iota-, capa- e lambda-carragenano, que diferem ligeiramente em sua estrutura e grau de sulfatação. A iota- carragenano é um gel macio que forma galactano sulfatado predominantemente extraído de algas marinhas vermelhas Gigartina stellata e Chondrus crispus. A capa-carragenano produz géis fortes rígidos e é predominantemente produzida de Kappaphycus cottonii. A lambda- carragenano, que é a forma mais comum, é freqüentemente usada para espessar lacticínios.

Apesar da longa atividade antiviral conhecida de alguns carragenanos contra vírus tais como, por exemplo, HIV ou HSV, o mecanismo de como os carragenanos apresentam atividade antiviral ainda necessita de esclarecimentos.

A luz do exposto, a presente invenção fornece agora uma composição antiviral com base em carragenano adequada no tratamento profilático ou terapêutico de infecções por rinovírus (rinite).

As experiências que conduziram à presente invenção surpreendentemente têm demonstrado que, apesar de possíveis reservas na técnica, os carragenanos selecionados exercem atividade antiviral contra as infecções por rinovírus (rinite), com a iota-carragenano produzindo os melhores resultados.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Portanto, a presente invenção em sua primeira forma de realização refere-se à utilização de carragenano como um ingrediente ativo antiviral na fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento profilático ou terapêutico de uma infecção por rinovírus. O termo “ingrediente ativo antiviral” aqui utilizado se refere a um composto de carragenano que quando aplicado em uma dose ou quantidade eficaz interfere, direta ou indiretamente ou tanto direta quanto indiretamente, com o ciclo de infecção por rinovírus de uma célula eucariótica, mais especificamente com pelo menos uma parte do ciclo de infecção por rinovírus ciclo selecionada do grupo consistindo de penetração viral de uma célula eucariótica, replicação do vírus em uma célula eucariótica, montagem do vírus, e liberação do vírus da célula eucariótica infectada. Também abrange qualquer efeito na inibição não específica de um aumento de título viral ou na redução não específica de um nível de título viral em um sistema hospedeiro e eucariótico ou mamífero. O termo ainda se refere a um composto que possui eficácia profilática na medida em que protege, pelo menos em certa medida, ou reduz a probabilidade de recaída com uma infecção viral.

A presente composição farmacêutica pode assim ser administrado antes ou após o aparecimento de uma infecção viral. O termo “profilaxia” ou “tratamento profilático”, como aqui utilizado refere-se à administração da presente composição farmacêutica de modo a proteger, pelo menos em certa medida, ou reduzir o risco de adoecer com uma infecção viral.

O termo “terapia” ou “tratamento terapêutico”, como aqui utilizado refere-se à administração da presente composição farmacêutica em um indivíduo infectado com vírus de modo a aliviar o impacto patológico da infecção, incluindo a redução da gravidade e/ou freqüência de sintomas emergentes, ou a eliminação de tais sintomas, reparação de possíveis lesões causadas ou associadas com tal infecção viral, e incluindo a inibição ou prevenção de vírus, bactérias, fungos secundários ou qualquer outra espécie de infecção microbiana.

O termo coletivo “carragenano” como usado em seguida se refere a uma mistura de pelo menos dois de homo- ou heteropolímeros de iota-, capa- e lambda-carragenano, isto é, uma mistura de homo- ou heteropolímeros de iota- e lambda-carragenano, uma mistura de iota- e capa- carragenano, uma mistura de capa- e lambda-carragenano, ou uma mistura de 5 iota-, capa e lambda-carragenano, a não ser que explicitamente mencionado de outra maneira ou a não ser que um significado diferente seja derivável do espírito da divulgação pertinente.

Um homopolímero de carragenano é um composto de carragenano molecularmente puro de um tipo de iota, capa ou lambda- 10 carragenano. Um heteropolímero de carragenano compreende subunidades de pelo menos duas espécies diferentes de carragenanos, preferivelmente selecionadas do grupo consistindo de subunidades de iota-, capa e lambda- carragenano.

Onde referido a seguir, o termo “mistura” de carragenanos 15 também pode se referir a uma composição de matéria compreendendo como um ingrediente ativo antiviral pelo menos uma espécie de heteropolímero de carragenano, a “mistura” assim principalmente sendo uma mistura de subunidades de carragenano diferentes como parte de dita pelo menos um carragenano heteropolimérico presente na composição.

Em uma outra forma de realização a invenção diz respeito a

uma tal composição anti-rinoviral para uso profilático ou terapêutica, em que dita infecção por rinovírus é uma infecção por rinovírus aguda ou crônica.

A presente composição com base em carragenano é adequada para aplicação tópica para tratar a inflamação da pele ou mucosa. Mas 25 também a aplicação sistêmica, por exemplo, parenteral ou oral, é possível, especialmente quando adaptada para conter frações de carragenano de peso molecular principalmente baixo. O carragenano útil na presente invenção possui um peso molecular médio variando de cerca de 15000 a 5000000 Da. A fração de peso molecular baixo compreende carragenano em um peso molecular média variando de cerca de 15 000 a cerca de 50 000 Da, a fração de peso molecular médio de cerca de 50 000 a cerca de 500 000 Da, e a fração de peso molecular elevado de cerca de 500 000 a cerca de 5 000 000 Da.

Em uma forma de realização preferida a composição farmacêutica é adaptada para uso tópico ou mucosal. As formas galênicas adequadas das preparações prontas para uso são cremes, géis, pomadas, pós (incluindo pós para inalação), aerossóis, espumas, soluções líquidas tais como loções de pele, soluções de gargarejo ou gotas nasais. Outras formas adequadas de preparação galênica serão evidentes para aqueles de habilidade usual na técnica, incluindo, por exemplo, os sistemas de liberação de medicamentos divulgados na US 6.391.452.

À parte dos ingredientes ativos antivirais a presente composição tipicamente compreende pelo menos uma carreador farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente outros aditivos ou ingredientes.

Um carreador adequado pode ser um diluente, por exemplo, água ou soro fisiológico, um excipiente, ou um outro veículo adequado e útil para a administração dos ingredientes ativos. Os aditivos opcionais podem ser selecionados do grupo consistindo de SiO2, TiO2, um aglutinante tal como celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, goma tragacanto, gelatina, amido, lactose, monoidrato de lactose, ácido algínico ou milho; um lubrificante ou tensoativo tal como estearato de magnésio ou de lauril sulfato de sódio; um deslizante, tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina. Outros aditivos na preparação podem ser, mas não são limitados a eles, tampões ou agentes de ajuste do pH, por exemplo, selecionados de ácido cítrico, ácido acético, ácido fumárico, ácido clorídrico, ácido málico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido propiônico, ácido sulfürico, ácido tartárico, ou combinações destes.

Outros ingredientes podem estar presentes, incluindo os medicamentos ou substâncias farmaceuticamente ativas sem carragenano. O carragenano pode ser utilizado na forma de qualquer sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, sais de sódio de carragenano podem ser usados. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, sais de potássio, lítio e amônio de carragenano.

Em outra forma de realização da invenção a composição é para uso tópico e compreende carragenano em uma quantidade entre 0,01 % e %,preferivelmente entre 0,1 % e 10 %, mais preferivelmente entre 0,5 % e

% em peso (p/p) da preparação.

Geralmente, a composição será fornecida como uma preparação estéril não pirogênica. No caso de uma preparação líquida a esterilidade pode ser alcançada, por exemplo, mediante a filtração através de um filtro de membrana adequado. Métodos para a fabricação de composições farmacêuticas estéreis ou assépticas são bem conhecidas na técnica e não fazem parte da presente invenção.

No entanto, a composição farmacêutica da presente invenção também podem ser revestida em superfícies sólidas de itens de higiene e sanitários, por exemplo, higiene facial ou artigos de sanitário que são tipicamente utilizados nas cavidades orais e/ou nasais tais como tecidos ou papéis nasais, e lenços. Mais especificamente, a composição farmacêutica pode ser aplicada, por exemplo, pulverizada - bem como desinfetantes - em luvas, tecidos ou papéis de higiene incluindo tecidos nasais, de modo a exercer um efeito virucida pelo menos em certa medida, contribuindo assim para a redução de uma auto-infecção repetida do indivíduo pelas pontas dos dedos contaminadas e também para reduzir a disseminação viral entre indivíduos diferentes que estão em proximidade, por exemplo, contato corpo a corpo uns com os outros. Dependendo da natureza do item sanitário ou de higiene, o item pode ser coberto, molhado, ou de outra maneira impregnado com a composição farmacêutica.

Tais itens tratado com carragenano também podem incluir, mas não se restringem a eles, mechas de algodão, máscaras de pó ou máscaras faciais. Até batons podem ser formulados para conter uma quantidade eficaz antiviral de carragenano. Estes artigos de higiene ou sanitário podem ser utilizados profilaticamente ou junto do tratamento terapêutico contra uma infecção viral e podem ajudar na prevenção ou redução de um risco de infecção.

Conseqüentemente, em uma forma de realização a invenção diz respeito a um tal uso, em que a composição antiviral é aplicada na superfície sólida de um artigo de higiene ou de sanitário, particularmente de uma luva, tecido ou papel higiênico ou sanitário, especialmente nasal um tecido ou papel nasal, mediante revestimento ou impregnação. Os iota-, capa- e lambda-carragenanos úteis na presente invenção são comercialmente disponíveis, mas também podem ser preparadas mediante a extração de algas marinhas nos termos dos procedimentos de extração conhecidos na técnica.

Em sua forma de realização preferida a invenção diz respeito ao uso de pelo menos um membro selecionado do grupo consistindo dos homo e heteropolímeros de iota-, capa- e lambda-carragenano.

Em uma forma de realização específica a composição farmacêutica antiviral da presente invenção é substancialmente livre de formas de carragenano diferentes de iota-, capa- e lambda-carragenano, - embora vestígios de tais outros carragenanos podem estar presentes. Para várias aplicações, a iota-carragenano pode substancialmente ser a única espécie de carragenano presente na composição.

Em uma outra forma de realização a invenção diz respeito ao uso de carragenano na fabricação de uma composição antiviral, em que a composição compreende iota-, capa ou lambda-carragenano, ou uma mistura de pelo menos dois de ditos carragenanos, em uma quantidade de 80 % ou mais, 90 % ou mais, 95 % ou mais, ou mesmo 99 % ou mais de todos os carragenanos presentes na composição. As porcentagens são dadas em por cento em peso (% p/p) em relação ao peso seco dos carragenanos referidos. Em outra forma de realização a invenção se refere a um tal uso, em que a composição compreende não menos do que 50 %, não menos do que 70 %, não menos do que 80 % e, preferivelmente não menos do que 95 % (p/p) em peso seco de iota-carragenano, em relação ao peso seco total de todos os carragenanos presentes na composição.

Os valores de concentração de carragenano acima da mesma maneira se aplicam às carragenanos homo e heteropoliméricas.

O carragenano foi observado ser não tóxico após administração oral ou dérmica, ou após a inalação, mesmo quando aplicada em doses extremamente elevadas, portanto, foi classificada como “geralmente reconhecida como segura” (GRAS) pelo Food and Drug Administration (FDA).

Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito ao uso de carragenanos na fabricação de uma composição antiviral, que ainda compreende pelo menos um composto antiviral farmaceuticamente ativo adicional, preferivelmente sulfato de celulose.

Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se ao uso de carragenano, preferivelmente iota-carragenano, na fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento profilático ou terapêutico de uma condição corporal selecionada do grupo consistindo de infecção microbiana, doença inflamatória, alergia e sistema imune prejudicado ou suprimido, em que o carragenano está presente em combinação com pelo menos um outro composto ou medicamento farmaceuticamente ativo. Em uma tal composição o carragenano pode exercer função adjuvante anti-rinoviral. Dito pelo menos um outro composto ou medicamento farmaceuticamente ativo pode ser selecionado do grupo consistindo de um esteróide, por exemplo, cortisona, e uma antiistamina.

Em uma outra forma de realização da preparação farmacêutica antiviral é para o tratamento ou profilaxia de um indivíduo que é especialmente sensível ou está em um risco aumentado de uma infecção por rinovírus tal como um paciente de alto risco selecionado do grupo consistindo de um paciente asmático, uma pessoa com alergias, e uma pessoa tendo uma doença inflamatória. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 mostra os resultados de um ensaio da inibição de morte celular induzida por HRV (ensaio XTT).

Coordenadas = OD medido em 492 nm; abscissa = amostras de teste diferentes; 1 = células não infectadas, 2 = células infectadas não tratadas; 3 = células infectadas tratadas com iota-carragenano; 4 = células infectadas tratadas com capa-carragenano; 5 = células infectadas tratadas com lambda-carragenano; Fig. IA = células infectadas com HRV-2; Fig.l B = células infectadas com HRV-14.

A Fig. 2 mostra a determinação dos títulos máximos de sobrenadantes de células por ensaios TCID50.

Coordenadas = título TCID50; abscissa = concentração de iota- carragenano em μg/ml; U = células não tratadas; T (tratamento) = células foram infectadas durante um hora e a concentração indicada de iota- carragenano foi adicionada uma hora após o tratamento; P (profilaxia) = a suspensão de vírus foi pré-incubada com a concentração indicada de iota- carragenano durante uma hora antes da infecção. Outro processamento foi idêntico a T: as células foram infectadas em uma multiplicidade de infecção de 0,01. Os títulos máximos foram observados no dia 3 com relação ao HRV-

2 (Fig 2A) e no dia 4 com relação ao HRC-14 (Fig 2B).

A Fig. 3 mostra a eficácia da iota-carragenano na inibição da replicação de rinovírus nas células epiteliais nasais humanas determinada pelos ensaios TCID50.

Coordenadas = título TCID50 em logs; abscissa = concentração de iota-carragenano em μg/ml; MOCK = células de controle não tratadas; Fig. 3A = células infectadas com HRV-IA; Fig. 3B = células infectadas com HRV-2; Fig. 3C = células infectadas com HRV-8; Fig. 3D = células infectadas com HRV-16; Fig. 3E = células infectadas com HRV-39; Fig. 3F = células infectadas com HRV-83.

A Fig. 4 mostra a eficácia de iota-carragenano contra o rinovírus após tratamento repetido determinado pelo ensaio de redução de CPE.

Coordenada = redução de CPE em %; abscissa = concentração de iota-carragenano em μg/ml; Cepa HRV2P0 = cepa do rinovírus original (sem rodada de replicação); Cepa HRV2P10 = cepa de rinovírus HRV2P0 após 10 rodadas de replicação seletivas sobre as células HeLa.

De modo que a invenção aqui descrita possa ser mais completamente compreendida, os seguintes exemplos são apresentados. Os exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitativos desta invenção sob qualquer aspecto. Fica ainda entendido que a presente invenção também compreenderá variações das formas de realização expressamente divulgadas até um ponto como seria contemplado por uma pessoa de habilidade usual na técnica.

Exemplo 1: Efeito de diferentes tipos de carragenanos contra o rinovírus humano tipo 2 (HRV-2) e tipo 14 (HRV-14)

Células HeLa subconfluentes foram incubadas com uma suspensão de vírus que foi pré-incubada durante 5 minutos com 125 μg/ml dos polímeros como conforme indicado na Figura 1. 48 horas depois a viabilidade das células foi determinada com o ensaio TOX2 XTT (Sigma).

Como mostrado na figura 1, verificou-se que o polímero mais eficaz foi iota-carragenano (coluna 3), que foi eficaz contra ambos os tipos de rinovírus enquanto, a lambda-carragenano (coluna 5) e capa-carragenano (coluna 4) mostraram eficácia contra HRV-2, mas não contra o HRV-14. As barras de erro indicam o desvio padrão entre seis reservatórios independentes. Exemplo 2 Os polímeros indicados na Tabela 1 foram testados em um ensaio de inibição da morte celular induzida por HRV-2 e HRV-14 (ensaio XTT) em uma concentração de 100 μ^ηιΐ.

Como mostrado na Tabela 1, a iota-carragenano produziu proteção contra amos os tipos de rinovírus (um "+" indica pelo menos 95 % de proteção em comparação com as células de controle não infectadas). A capa- carragenano e lambda-carragenano foram ativas contra HRV-2, mas não contra o HRV-14. Os polímeros quitosana, carboximetil celulose e carboximetil quitosana não apresentaram um efeito inibidor sob qualquer condição.

Tabela 1: Atividade antiviral de vários polímeros testados

Polímero HRV-2 HRV-14 Iota-carragenano + + Capa-carragenano + - Lambda-carragenano + - Quitosana - - Carboximetilcelulose - - Carboximetilquitosana - -

Exemplo 3

Iota-carragenano foi eficaz contra o HRV-2 e o HRV-14 em

um tratamento e um modelo de replicação viral de profilaxia. Uma redução significativa de título viral máximo foi observada em concentrações iguais e superiores a 6,25 μg/ml. No entanto, a iota-carragenano foi mais eficaz no modelo de profilaxia contra o HRV-2 em que uma redução de mais do que 99,9 % no título viral máximo foi observada.

Exemplo 4: Efeito da iota-carragenano contra uma seleção de subtipos de rinovírus humano

Células HeLa subconfluente em placas de 96 reservatórios foram incubadas com uma suspensão de vírus em uma MOI (multiplicidade de infecção) de 0,5.

min após a infecção com a suspensão de vírus, meio nutritivo contendo polímero em diluições de 3 vezes foi adicionado. 48 a 72 horas mais tarde a viabilidade das células foi determinada com ensaio TOX2 XTT (Sigma). Os valores de EC5O foram calculados com o software Excel-Fit. Tabela 2

Vírus HRV-I HRV-2 HRV-8 HRV-14 HRV-16 HRV-39 EC50 0,7 μ^πιΐ 21 μ^ηιΐ < 0,5 μ£/πι1 400 μ^πιΐ 381 μ^πύ Ul \ig!m\

Iota-carragenano foi ativa contra todos os rinovírus humanos testados nas células HeLa previamente infectadas. As concentrações de carragenano necessárias para inibir 50 % do efeito citopático variam dentro de uma ampla faixa de < 0,5 μg/ml para o HRV-8 e 400 μg/ml para o HRV-14. Este resultado indica que a iota-carragenano inibe a replicação de um amplo espectro de subtipos de rinovírus em células HeLa infectadas. Exemplo 5: Inibição da replicação de rinovírus nas células epiteliais nasais humanas por iota-carragenano

Células epiteliais nasais humanas primárias (Promocell) foram semeadas em placas de 24 reservatórios (2,9 * IO4 células por reservatório) e cultivadas durante três dias a 37 0C, 5 % CO2 e 95 % de umidade. As células foram infectadas em uma confluência de quase 60% com cepas rinovírus HRV-IA, HRV-2, HRV-8, HRV-14, HRV-16, HRV-39, HRV-83 e HRV-84. Os rinovírus HRV-IA, HRV-2, HRV-8, HRV-16, HRV-39 e HRV-83 executaram uma replicação lítica sobre as células epiteliais nasais humanas. O HRV-14 e o HRV-84 não submeteram a Iise as células e foram, portanto, não submetidos a outro teste. Os vírus foram pré-incubados com iota-carragenano em concentrações de 4, 40 e 400 μg/ml e um controle MOCK. O MOI foi 0,34. Os sobrenadantes foram colhidos entre 48 e 72 horas após a infecção e utilizados para a determinação de título TCID50. Como mostrado na Figura 3, o tratamento com iota-carragenano reduziu o título viral de todos os vírus nos sobrenadantes em pelo menos duas etapas Iog em uma concentração de 40 μg/ml (> 99 %) quando comparado com as células de controle tratadas com MOCK (o eixo Y mostra o título de vírus em logs). Estes dados demonstram claramente que a iota-carragenano inibe a replicação de vírus em células epiteliais humanas primárias. Visto que parece que neste momento não existe nenhum modelo animal para o teste de rinovírus humano in vivo disponível, as células epiteliais nasais humanas aqui utilizadas representam o modelo in vitro mais importante correntemente disponível. As barras de erro indicam o desvio padrão entre três amostras testadas independentes.

Exemplo 6: Determinação da eficácia da iota-carragenano contra a infecção por rinovírus após tratamento repetido (verificação de possível desenvolvimento de resistência viral)

O vírus HRV2P0 original e o vírus HRV2P10, obtidos após 10 rodadas de replicação seletiva sobre as células HeLa, foram testados em um ensaio de redução do CPE (efeito citopático). As células HeLa (8 * IO4 células por reservatório) foram semeadas em seis placas de reservatório. As células foram infectadas com um meio nutritivo adequado suplementado com polímero de carragenano em concentrações finais de carragenano de 1,6, 5,3, 17, 50, 150 e 450 μg/ml, e ainda contendo vírus em um MOI de 0,1. Como controles, um reservatório foi infectado por MOCK com

meio nutritivo suplementado por carragenano livre de vírus, e um outro reservatório foi infectado com uma suspensão viral tratada com MOCK, isto é, uma suspensão viral contendo meio nutritivo, mas sem carragenano. Após um tempo de incubação de 20 minutos após infecção, as placas foram lavadas duas vezes e o meio de controle (livre de vírus, suplementado com carragenano nas concentrações selecionadas) foi adicionado em todos os reservatórios com exceção ao controle negativo tratado com simulação (isto é, infecção não inibida pura). As amostras foram colhidas em cada reservatório experimental assim que um efeito citopático claro foi visível no reservatório de controle negativo desprotegido. Para a subseqüente rodada de seleção, o sobrenadante contendo vírus foi experimentado daqueles reservatórios tratados com carragenano que apresentam um CPE claramente detectável em relação ao controle não infectado foi usado para a infecção das células HeLa. Tipicamente, as respostas de CPE foram detectáveis apenas nas amostras experimentais nas duas concentrações de carragenano mais baixas, isto é, em 1,6 e 5,3 μg de carragenano por 1 ml.

O procedimento foi repetido 10 vezes e as amostras virais resultantes foram comparadas em um teste de inibição de CPE com o estoque de vírus original. Resumidamente, 48 horas após a infecção um reagente TOX2 (Sigma) foi adicionado, valores de OD450nm foram determinados e a redução de CPE em % do controle não infectado foi determinada.

De modo a verificar o possível desenvolvimento de resistência do vírus com respeito ao tratamento de carragenano, o vírus utilizado para a primeira inoculação (vírus 2_001 na Fig. 4) e um vírus obtido após 10 rodadas de replicação seletivas (20_001 vírus na Fig. 4) foram testados em um ensaio de redução de CPE usando células HeLa, seguindo um protocolo experimental que era ligeiramente diferente daquele descrito acima. Resumidamente, as células HeLa foram infectadas com o respectivo vírus em um MOI de 0,1, e 20 minutos após a infecção do inóculo ter sido removida e meio nutritivo contendo polímero de carragenano em concentrações finais de 1,6, 5.3, 17, 50, 150 e 450 μg/ml foi adicionado (ver abscissa da Fig. 4). 48 horas após a infecção um reagente TOX2 (Sigma) foi adicionado, valores OD450nm foram determinados e a redução de CPE em % de controle não infectado foi determinada (Fig. 4, ordenada). As barras de erro indicam o desvio padrão entre 6 reservatórios independentes.

Como graficamente representado na Figura 4, nenhuma diferença significativa na suscetibilidade do vírus com respeito ao tratamento de carragenano foi detectada nas amostras obtidas do sobrenadante do primeiro e do décimo ciclo de infecção. Isto indica que nenhuma fuga de mutantes surgiu durante o procedimento de seleção. Estes dados desta maneira sugerem que uma fuga de rinovírus durante a terapia in vivo com iota-carragenano pode ser pouco provável, mesmo nos casos de terapia contínua ou repetida durante um período de tempo prolongado.

Claims (15)

1. Uso de iota-carragenano em uma quantidade antiviral eficaz, caracterizado pelo fato de ser como um ingrediente ativo antiviral na fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento profilático ou terapêutico de uma infecção por rinovírus.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita infecção por rinovírus é uma infecção por rinovírus aguda ou crônica.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição é adaptada para uso tópico ou mucoso, preferivelmente para uso como um pulverizador de nariz, um pó, incluindo um pó para inalação, um gel, um ungüento, uma espuma, ou uma solução líquida, particularmente uma loção, uma solução de gargarejo, ou gotas.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição ainda compreende pelo menos um carreador ou aditivo farmaceuticamente aceitável.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a4, caracterizado pelo fato de que a composição é adaptada para uso tópico e compreende carragenano em uma quantidade entre 0,01 % e 20 %, preferivelmente entre 0,1 % e 10 %, mais preferivelmente entre 0,5 % e 5 % (p/v) da preparação.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a composição adicionalmente compreende pelo menos um outro carragenano, opcionalmente selecionado de capa- carragenano e lambda-carragenano.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a6, caracterizado pelo fato de que a composição compreende não menos do que50 %, opcionalmente não menos do que 80 %, e preferivelmente não menos do que 95 % (p/p), com base no peso de iota-carragenano em relação ao total de todos os carragenanos presentes na composição.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição ainda compreende pelo menos um outro componente antiviral farmaceuticamente ativo.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição é revestida em uma superfície sólida de um artigo de higiene ou sanitário, particularmente de uma luva, tecido ou papel de higiene ou sanitário, especialmente um tecido ou papel nasal.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a composição ainda compreende pelo menos um outro composto farmaceuticamente ativo, preferivelmente um esteróide ou uma antiistamina.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que dita infecção por rinovírus está em um indivíduo que é um paciente de alto risco selecionado do grupo consistindo de um paciente asmático, uma pessoa que sofre de alergia, e uma pessoa que sofre de uma doença inflamatória.

12. Item de higiene ou sanitário sólido, caracterizado pelo fato de ser revestido ou impregnado com a composição antiviral referida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8.

13. Item de higiene ou sanitário sólido de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo de luvas, tecidos de higiene, papéis higiênicos, artigos de higiene facial e artigos de sanitário facial usados nas cavidades orais e/ou nasais, particularmente tecidos ou papéis nasais, e lenços.

14. Iota-carragenano, caracterizado pelo fato de ser para uso em uma quantidade antiviral eficaz como um ingrediente ativo antiviral na uma composição farmacêutica para o tratamento profilático ou terapêutico de uma infecção por rinovírus.

15. Iota-carragenano de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a composição é adaptada para uso tópico e compreende iota-carragenano em uma quantidade entre 0,01% e 20%, preferivelmente entre 0,1% e 10%, mais preferivelmente entre 0,5% e 5% (p/v) da preparação.