BRPI0710216A2 - método para produzir um l-aminoácido - Google Patents

Abstract

<B>MéTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOáCIDO<D>Um L-aminoácido é produzido por cultivo de uma bactéria produzindo L-aminoácido que pertence à família Enterobacteriaceae e que foi modificada de modo que a atividade da acetil-CoA sintetase é aumentada.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO"

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um método de produção de umL-aminoácido usando uma bactéria e, mais particularmente, a um método deprodução de um L-aminoácido como L-lisina, L-treonina, e ácido L-glutâmico. L-lisina e L-treonina são usadas como aditivos em rações paraanimais, alimentos naturais, infusões de aminoácidos, e semelhantes, ácido L-glutâmico é usado como um condimento para alimentos.

Fundamentos da TécnicaL-aminoácidos têm sido industrialmente produzidos porfermentação usando bactérias pertencentes aos gêneros Brevibacterium,Corynebacterium, Escherichia, ou semelhantes. Métodos de produção de L-lisina são descritos em EP 0643135 B, EP 0733712 B, EP 1477565 A, EP0796912 A, EP 0837134 A, WO 01/53459, EP 1170376 A, e WO2005/010175. Nestes métodos, cepas bacterianas são usadas, as quais sãoisoladas de mutantes naturais ou artificiais das mesmas, assim como cepasbacterianas que foram modificadas para aumentar a atividade de uma enzimabiossintética de L-aminoácido por técnicas de DNA recombinantes.

Acetil-CoA sintetase catalisa uma reação para produzir acetil-CoA, pirofosfato e AMP a partir de ácido acético, coenzima A e ATP, e écodificada por um gene acs (J Bacteriol. Maio de 1995; 177(10):2878-86.).No entanto, não se encontra nenhum relato de que a melhora da atividade daacetil-CoA sintetase poderia ser efetiva para a produção de L-aminoácido.

Descrição da invençãoUm objetivo da presente invenção consiste em prover umabactéria que é capaz de produzir efetivamente um L-aminoácido e um métodopara produzir efetivamente um L-aminoácido usando a bactéria.

Os inventores da presente invenção realizaram estudosdiligentes para alcançar o objetivo acima mencionado. Como resultado, elesverificaram que a produção de um L-aminoácido é melhorada poramplificação de gene acs codificando acetil-CoA sintetase em uma bactériaproduzindo L-aminoácido, e deste modo completaram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção é como a seguir.

É um objetivo da presente invenção prover um método deprodução de um L-aminoácido, compreendendo cultivar uma bactéria em ummeio, e coletar o L-aminoácido do meio ou células bacterianas, em quereferida bactéria é uma bactéria produzindo L-aminoácido pertencendo àfamília Enterobacteriaceae que foi modificada para melhorar a atividade daacetil-CoA sintetase.

E outro objetivo da presente invenção prover o método comodescrito abaixo, em que a atividade da acetil-CoA sintetase é melhorada poraumento do número de cópias do gene acs que codifica a acetil-CoA sintetase,ou por modificação de uma seqüência regulatória da expressão do referido gene.

É outro objetivo da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que referido gene acs é selecionado dentre o grupoconsistindo de:

(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo deSEQ ID NO: 3; e

(b) um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeoque é complementar a uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3, oucom uma sonda que é preparada a partir de uma seqüência de nucleotídeo sobcondições estringentes, e em que referido DNA codifica a proteína com umaatividade acetil-CoA sintetase.

E outro objetivo da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que o L-aminoácido é selecionado dentre o grupoconsistindo de L-lisina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-treonina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano, L-cisteína, ácidoL-glutâmico, e combinações dos mesmos.

É outro objetivo da presente invenção prover o método comodescrito acima, em que a referida bactéria pertence ao gênero Escherichia,Pantoea, ou Enterobaeter.

Descrição das formas de realização preferidas

Abaixo, a presente invenção será descrita em detalhes.<1> Bactéria da presente invenção

A bactéria da presente invenção pertence à famíliaEnterobaeteriaeeae, e tem uma capacidade de produzir um L-aminoácido, e émodificada de modo que a atividade da acetil-CoA sintetase (ACS) éaumentada. Aqui, o termo "capacidade de produzir um L-aminoácido" refere-se à capacidade para produzir e acumular um L-aminoácido em um meio emum nível coletável quando a bactéria da presente invenção é cultivada nomeio. A bactéria da presente invenção pode ser capaz de produzir umapluralidade de L-aminoácidos. A capacidade de produzir L-aminoácido podeser natural da bactéria, ou pode ser obtida modificando-se a bactéria paraconferir a capacidade de produzir L-aminoácido por mutação ou uma técnicade DNA recombinante.

O tipo de L-aminoácido não é particularmente limitado, eexemplos do mesmo incluem os L-aminoácidos básicos como L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina e L-citrulina; os L-aminoácidos alifáticoscomo L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina, e L-glicina; os ácidoshidroxi monoaminocarboxílicos como L-treonina e L-serina; os L-aminoácidos cíclicos como L-prolina; os L-aminoácidos aromáticos como L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano; L-aminoácidos contendo enxofrecomo L-cisteína, L-cistina, e L-metionina; e os L-aminoácidos ácidos comoácido L-glutâmico, ácido L-aspártico, L-glutamina, e L-asparagina. A bactériada presente invenção pode ser capaz de produzir dois ou mais tipos deaminoácidos.<1-1> Conferir a capacidade de produzir L-aminoácido

A seguir, métodos para conferir a capacidade de produzir L-aminoácido serão descritos, assim como exemplos das bactérias em que umacapacidade de produzir um L-aminoácido pode ser conferida. No entanto, abactéria não é assim limitada, desde que tenham uma capacidade de produzirum L-aminoácido.

Bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae, incluindoas pertencendo ao gênero Eseheriehia ou Pantoea, podem ser usadas como ascepas parentais das quais derivam as bactérias da presente invenção. Outrosexemplos de bactérias pertencentes à família Enterobaeteriaeeae incluem γ-Proteobaeteria como Enterobaeter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella,e Morganella.

As bactérias Eseheriehia relatadas em Neidhardt et al.((Backmann, B.J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutantderivatives of Eseheriehia coli K-12, p. 2460-2488. Tabela 1. Em F. D.Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/2a. ed., American Society for Microbiology Press, Washington,D.C.), como Eseheriehia coli podem ser utilizadas. Exemplos de uma cepa detipo selvagem de Eseheriehia coli incluem a cepa K-12 ou derivados damesma, cepa MG1655 de Escherichia coli (ATCC No. 47076), e cepa W3110(ATCC No. 27325). Essas cepas são disponíveis no American Type CultureCollection (ATCC) (Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,Estados Unidos da América).

Exemplos de bactérias Enterobacter incluem Enterobacteragglomerans e Enterobacter aerogenes, e um exemplo de bactérias Pantoea éPantoea ananatis. Recentemente, Enterobacter agglomerans foireclassificada em alguns casos como Pantoea agglomerans, Pantoeaananatis, Pantoea stewartii, ou semelhantes, com base em uma análise deuma seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA. Portanto, as bactérias dapresente invenção podem pertencer tanto ao gênero Enterobacter quanto aogênero Pantoea, desde que elas estejam classificadas dentro da famíliaEnterobacteriaceae. Quando Pantoea ananatis é reproduzida usando técnicasde engenharia genética, cepa AJl3355 (FERM BP-6614), cepa AJl3356(FERM BP-6615), cepa AJl3601 (FERM BP-7207) de Pantoea ananatisderivados das mesmas, e semelhantes, podem ser usadas. Estas cepas foramidentificadas e depositadas como Enterobacter agglomerans quando elasforam isoladas, mas, como descrito abaixo, estas cepas foram reclassificadascomo Pantoea ananatis com base na análise de uma seqüência de nucleotídeode 16S rRNA.

A capacidade de produzir L-aminoácido pode ser conferida auma cepa parental, como descrito abaixo, como a seguir.

A fim de conferir a capacidade de produzir um L-aminoácido,métodos podem ser usados, os quais são usados em reproduçõesconvencionais de bactérias Escherichia ou semelhantes, como por aquisiçãode cepas mutantes auxotróficas aos nutrientes, cepas resistentes a análogos, oucepas mutantes de regulação metabólica, ou por criação de cepasrecombinantes tendo aumentada expressão de enzimas biossintéticas de L-aminoácido (Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press, la.ed. publicação: 30 de maio de 1986, p.77 até 100). Na presente invenção,propriedades, como auxotrofia de nutriente, resistência a análogo, e regulaçãometabólica, podem ser conferidas sozinhas ou em combinação para conferir acapacidade de produzir um L-aminoácido. Além disso, expressão de uma oumais enzimas biossintéticas de L-aminoácido podem ser aumentada. Alémdisso, conferir tais propriedades como mutação da auxotrofia de nutrientes,resistência a análogos e regulação metabólica pode ser combinado com amelhora da expressão das enzimas biossintéticas de L-aminoácido.

Cepas mutantes auxotróficas em nutrientes, cepas resistentes aanálogos de L-aminoácidos, e cepas mutantes de regulação metabólica quetêm uma capacidade de produzir um L-aminoácido podem ser obtidas como aseguir. A cepa parental ou uma cepa de tipo selvagem é submetida a umtratamento de mutação típico, como irradiação com raios X ou raiosultravioletas, ou por tratamento com um mutagene, incluindo N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e etilmetanossulfonato (EMS), seguido porseleção de cepas que demonstram uma mutação de auxotrofia de nutrientes,resistência a análogos, ou uma regulação metabólica e tem uma capacidade deproduzir um L-aminoácido.

Técnicas de recombinação de genes incluem a melhora da expressão de um gene codificando uma enzima envolvida em biossíntese deum L-aminoácido alvo e diminuição da expressão de um gene codificandouma enzima envolvida em degradação de um L-aminoácido alvo.

A seguir, será exemplificada uma bactéria em que acapacidade de produzir um L-aminoácido é conferida, mas as bactérias aserem usadas no método da presente invenção não são limitadas a estesexemplos.

Bactérias produzindo L-treonina

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasproduzindo L-treonina da presente invenção incluem, mas não são limitados às cepas pertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996) (Patente US No. 5. 175. 107, Patente US No. 5. 705. 371),E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente US No.5. 631. 157), E. coliNRRL-21593 (Patente US No. 5. 939. 307), E. coli FERM BP-3756 (PatenteUS No. 5. 474. 918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente USNo. 5. 376. 538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (em russo), 14,947-956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A), e semelhantes.

A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, assim como sendoassimilativa de sacarose, e o gene ilvA tem uma mutação dispersa. Esta cepatambém tem uma mutação no gene rhtA, a qual confere resistência emconcentrações elevadas de treonina ou homoserina. A cepa B-3996 contémpVIC40, que foi obtido por inserção de operon thrA*BC que inclui um genethrA mutante dentro de um vetor derivado de RSFlO 10. Este gene thrAmutante codifica aspartoquinase homoserina desidrogenase I que ésubstancialmente dessensibilizada para inibição de retro-alimentação pelatreonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 em All-Union Sicentific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105Moscow, Federação Russa) sob o número de acesso RIA 1867. Esta cepatambém foi depositada na Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscow 1, Dorozhny proezd. 1)em 7 de abril de 1987 sob o número de acesso B-3996.

VKPM B-5318 de E. coli (EP 0593792B) também pode serusado para derivar a bactérias produzindo L-treonina da presente invenção. Acepa B-5318 é prototrófica com relação a isoleucina, e um repressor Cllambda-fago sensível a temperatura e promotor PR substituição a regiãoreguladora do operon de treonina em plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada no Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms (VKPM) em 3 de maio de 1990 sob o número de acesso deVKPM B-5318.

Preferivelmente, a bactéria da presente invenção éadicionalmente modificada para melhorar a expressão de um ou mais dosseguintes genes:

-O gene thrA mutante que codifica para aspartoquinasehomoserina desidrogenase I resistente à inibição de retro-alimentação pelatreonina;

-O gene thrB que codifica para homoserina quinase;

-O gene thrC que codifica para treonina sintase;

-O gene rhtA que codifica para uma proteína transmembranaputativa;-O gene asd que codifica para aspartato-P-semialdeídodesidrogenase; e

-O gene aspC que codifica para aspartato aminotransferase(aspartato transaminase).

A seqüência do gene thrA de Escherichia coli que codificaaspartoquinase homoserina desidrogenase I foi elucidada (posições denucleotídeos 337 a 2799, acesso GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). Ogene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E.coli K-12. A seqüência de nucleotídeo do gene thrB de Escherichia coli quecodifica homoserina quinase foi elucidada (posições de nucleotídeo 2801 a3733, acesso GenBank NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrB estálocalizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12. Aseqüência de nucleotídeo do gene thrC de Escherichia coli que codificatreonina sintase foi elucidada (posição de nucleotídeo 3734 a 5020, acessoGenBank NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre ogene thrB e a matriz de leitura aberta de yaaX no cromossomo de E. coli Κ-12. Todos os três genes funcionam juntos como um único operon de treonina.Para melhorar a expressão do operon de treonina, a região do atenuador queafeta a transcrição pode ser removida do operon (W02005/049808,W02003/097839).

O gene thrA mudado que codifica aspartoquinase homoserinadesidrogenase I resistente a retro-alimentação, assim como os genes thrB ethrCs podem ser obtidos como um operon proveniente de plasmídeo pVIC40bem conhecido. Esse plasmídeo está presente na cepa VKPM B-3996 de E.coli produzindo treonina, e é descrito em detalhes na patente US 5.705.371.

O gene rhtA está a 18 min no cromossomo de E. coli perto dooperon glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte deglutamina. O gene rhtA é idêntico ao ORFl (gene ybiF, posições denucleotídeo 764 a 1651, número de acesso GenBank AAA218541, gi:440181)e está localizado entre os genes pexB e ompX. A seqüência expressando aproteína codificada por ORFl foi designada o gene rhtA (rht: resistência ahomoserina e treonina). Também, a mutação rhtA23 é uma substituição de A-por-G na posição -1 com relação ao códon de partida de ATG (ABSTRACTSof the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology inconjugation com Annual Meeting of the American Society for Biochemistryand Molecular Biology, San Francisco, Califórnia, 24-29 de agosto de 1997,Resumo No. 457, EP 1013765 A).

A seqüência de nucleotídeos do gene asd de E.coli já foielucidada (posições de nucleotídeo 3572511 a 3571408, acesso GenBankNC 000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtida por PCR (reação de cadeiapolimerase; fazer referência a White, T.J. et ai., Trends Genet., 5, 185 (1989))por utilização de iniciadores baseados em uma seqüência de nucleotídeo dogene. Os genes asd de outros microorganismos podem ser obtidos em ummodo similar.

Também, a seqüência de nucleotídeos de gene aspC de E.colijá foi elucidada (posições de nucleotídeo 983742 a 984932, acesso GenBankNC_000913.1, gi:16128895), e pode ser obtida por PCR. Os genes aspC deoutros microorganismos podem ser obtidos em um modo similar.Bactérias produzindo L-Iisina

Exemplos de bactérias produzindo L-Iisina pertencendo aogênero Escherichia incluem mutantes tendo resistência a um análogo de L-lisina. Um análogo de L-Iisina inibe o crescimento das bactérias pertencendoao gênero Escherichia, mas esta inibição é completamente ou parcialmentedessensibilizada quando L-Iisina coexiste em um meio. Exemplos de análogosde L-Iisina incluem, mas não são limitados a oxalisina, hidroxamato de lisina,S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), γ-metil lisina, α-clorocaprolactama e assimem adiante. Mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem serobtidos submetendo-se as bactérias pertencendo ao gênero Escherichia a umtratamento de mutagenese artificial convencional. Exemplos específicos decepas bacterianas usados para produzir L-Iisina incluem Escherichia coliAJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver Patente US No. 4.346.170) eEseheriehia coli VL611. Nestes microorganismos, a inibição de retro-alimentação de aspartoquinase por L-Iisina é dessensibilizada.

A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produzindoL-Iisina de Eseheriehia coli. Essa cepa bacteriana foi reproduzida ao seconferir resistência AEC à cepa W3110, que foi derivada de Eseheriehia coliK-12. A cepa resultante foi designada cepa AJ13069 de Escherichia coli e foidepositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology (atualmente National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology, International PatentOrganism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e recebeu umnúmero de acesso de FERM P-14690. Então, ela foi convertida em umdepósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 desetembro de 1995, e recebeu um número de acesso de FERM BP-5252(Patente US No. 5.827.698).

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-lisina da presente invenção também incluem cepas em que a expressão deum ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-lisina émelhorada. Exemplos de enzimas envolvidas em biossíntese de L-lisinaincluem, mas não são limitadas a diidrodipicolinato sintase (dapA),aspartoquinase (IysC), diidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelatodecarboxilase (IysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente US No.6.040.160), fosfoenolpiravato carboxilase (ppc), aspartato semialdeídodesidrogenase (asd), e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). Além disso, as cepasparentais podem ter aumentada expressão do gene envolvido em eficiência deenergia (cyo) (EP 1170376 A), o gene codificando nicotinamida nucleotídeotransidrogenase (pntAB) (Patente US No. 5.830.716), o gene ybjE(W02005/073390), o gene gdh (Gene23:199-209(1983)), o gene arcA (EP1382686A) ou combinações dos mesmos.

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-Iisina da presente invenção também incluem cepas tendo atividadediminuída ou eliminada de uma enzima que catalisa a reação para gerar umcomposto diferente de L-Iisina por ramificação proveniente de viabiossintética de L-lisina. Exemplos de enzimas que catalisam a reação paragerar um composto diferente de L-lisina por ramificação proveniente de viabiossintética de L-lisina incluem homoserina desidrogenase (WO 95/23864),lisina decarboxilase (Patente US No. 5.827.698), e a enzima málica(W02005/010175).

Em Escherichia coli, lisina decarboxilases são codificadas porum gene cadA (acesso Genbank No. NP_418555, SEQ ID NO: 5) e gene idcC(acesso Genbank No. NP_414728, SEQ ID NO: 7) (WO 96/17930), entãoestes genes podem ser rompidos para melhorar a capacidade de produzir L-lisina. Moléculas de DNA homólogas para um gene cadA e gene idcC podemser usadas desde que eles possam causar recombinação homóloga com o genecadA e gene idcC no cromossomo de uma bactéria hospedeira. Por exemplo,uma molécula de DNA homóloga ao gene cadA pode hibridizar em umfilamento complementar de SEQ ID NO: 5 sob condições estringentes, e umaDNA molécula homóloga para o gene idcC pode hibridizar em um filamentocomplementar de SEQ ID NO: 7 sob condições estringentes.

Bactérias produzindo L-cisteína

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-cisteína da presente invenção incluem, mas não são limitados a cepaspertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli JM15 que foi transformadocom alelos de cysE diferentes codificando para serina acetiltransferasesresistentes a retro-alimentação (Patente US No. 6.218.168, pedido de patenterussa 2003121601), Ε. coli W3110 que super -expressa genes que codificamproteínas apropriadas para secretar substâncias tóxicas (Patente US No.5.972.663), cepas de E. coli com atividade de cisteína desulfohidrasediminuída (JPl 1155571A2); E. coli W3110 com aumentada atividade de umregulador transcripcional positivo para o regulon de cisteína codificado pelogene cysB (W00127307A1), e semelhantes.

Bactérias produzindo L-Ieucina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-Ieucina da presente invenção incluem, mas não são limitados a cepaspertencendo ao gênero Escherichia, como cepas de E. coli resistentes aleucina (for exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente US No. 6.124.121))ou análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5- trifluoroleucina (JP 62-34397 B e JP 8-70879 A); cepas deE. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito em WO96/06926;E. coli H-9068 (JP 8-70879 A), e semelhantes.

A bactéria da presente invenção pode ser melhorada poraumento da expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-leucina. Exemplos destes genes incluem os do operon de leuABCD, quepreferivelmente incluem um gene IeuA que foi mudado de modo que elecodifica isopropilmalato sintase que é resistente à inibição de retro-alimentação por L-Ieucina (Patente US 6.403.342). Além disso, a bactéria dapresente invenção pode ser melhorada por aumento da expressão de um oumais genes codificando para proteínas que excretam L-aminoácidos de umacélula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683(genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Bactérias produzindo L-histidina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-histidina da presente invenção incluem, mas não são limitados a cepaspertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli cepa 24 (VKPM B-5945,RU2003677); Ε. coli cepa 80 (VKPM B-7270, RU2119536); Ε. coli NRRLB-12116 - B12121 (Patente US No. 4.388.405); E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (Patente US No. 6.344.347); E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087); E. coli AI80/pFM201 (US Patent No.6.258.554) e semelhantes.

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-histidina da presente invenção também incluem cepas em que a expressãode um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-histidina émelhorada. Exemplos destas enzimas biossintéticas L-histidina incluem ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil AMP ciclohidrolase (hisl),fosforibosil-ATP pirofosfohidrolase (hisIE), fosforibosilformimino -5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase(hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB),histidinol desidrogenase (hisD), e assim em adiante.

Sabe-se que os genes codificando a enzima biossintética L-histidina (hisG, hisBHAFI) são inibidos por L-histidina, e assim a capacidadede produzir L-histidina também pode ser eficientemente aumentada porintrodução de uma mutação que induz a resistência à inibição de retro-alimentação em ATP fosforibosiltransferase (hisG) (Patente Russa Nos.2003677 e 2119536).

Exemplos específicos de cepas tendo uma capacidade deproduzir L-histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048 que foramtransformados com um vetor transportando um DNA codificando uma enzimabiossintética L-histidina- (JP 56-005099 A), cepas de E.coli transformadascom rht, um gene para uma exportação de aminoácido (EP1016710A), cepaE. coli 80 conferida com resistência a estreptomicina, sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3-alanina, (VKPM B-7270, Patente Russa No. 2119536), e assimem adiante.Bactérias produzindo ácido L-glutâmico

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoácido L-glutâmico da presente invenção incluem, mas não são limitados acepas pertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli VL334thrC+ (EP1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é auxotrófico para L-isoleucina eL-treonina e é mudado nos genes thrC e ilvA (Patente US No. 4.278.765). Umalelo de tipo selvagem do gene thrC foi transferido por transdução geralusando a bacteriófago Pl cultivado na cepa de tipo selvagem de E. coli Kl2(VKPM B-7). Como um resultado, uma cepa auxotrófica para L-isoleucina VL334thrC+(VKPM B-8961) foi obtida.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasproduzindo ácido L-glutâmico da presente invenção incluem, mas não sãolimitados a cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando umaenzima biossintética ácido L-glutâmico foi melhorada. Exemplos das enzimas envolvidas em biossíntese de ácido L-glutâmico incluem glutamatodesidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase(gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB),citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvatodesidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA),fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeido- 3-fosfato desidrogenase (gapA),triose fosfato isomerase (tpiA), fructose bisfosfato aldolase (fbp),fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), e glucose fosfato isomerase (pgi).

Exemplos de cepas modificadas de modo que a expressão do gene citrato sintetase, o gene fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou o geneglutamato desidrogenase é / são melhorada(s) incluem os descritos emEP1078989A, EP955368A, e EP952221A.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasproduzindo ácido L-glutâmico da presente invenção também incluem as cepasque têm uma atividade diminuída ou eliminada de uma enzima que catalisa asíntese de um composto diferente de ácido L-glutâmico, e se ramifica da viade biossíntese de ácido L-glutâmico. Exemplos destas enzimas incluemisocitrato liase, α-cetoglutarato desidrogenase, fosfotransacetilase, acetatoquinase, aceto hidróxi ácido sintase, acetolactato sintase, formatoacetiltransferase, lactato desidrogenase, e glutamato decarboxilase. Bactériaspertencendo ao gênero Escherichia deficiente na atividade de a-cetoglutaratodesidrogenase ou tendo uma atividade reduzida de a-cetoglutaratodesidrogenase e métodos para obter os mesmos são descritos em Patentes USNos. 5.378.616 e 5.573.945.

Especificamente, estas cepas incluem as seguintes:

E. coli W3110sucA::KmrE. coli AJ12624 (FERM BP-3853)E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

W3110sucA::Kmr de E. coli é obtida por ruptura do gene a-cetoglutarato desidrogenase (a seguir referido como o "gene sucA") de E. coliW3110. Esta cepa é completamente deficiente em a-cetoglutaratodesidrogenase.

Outros exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmicoincluem as que pertencem ao gênero Escherichia e tem resistência a umantimetabólito de ácido aspártico Essas cepas também podem ser deficientesem atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e incluem, for exemplo, E. coliAJ13199 (FERM BP-5807) (Patente US No. 5.908.768), FERM P-12379, queadicionalmente têm uma capacidade baixa de decomposição de ácido L-glutâmico (Patente US No. 5.393.671); AJ13138 (FERM BP-5565) (PatenteUS No. 6.110.714), e semelhantes.

Exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmico incluemas cepas mutantes pertencendo ao gênero Pantoea que são deficientes em umaatividade de α-cetoglutarato desidrogenase ou tem uma atividade diminuídade α-cetoglutarato desidrogenase, e podem ser obtidas como descrito abaixo.Estas cepas incluem Pantoea ananatis AJ13356 (Patente US No. 6.331.419).Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscienceand Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industiy (atualmente, National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology, International Patent OrganismDepositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 29 de fevereiro de 1998 sob um número de acesso de FERMP-16645. Ela foi então convertida em um depósito internacional sob asprovisões do Tratado de Budapeste em 11 de Janeiro de 1999 e recebeu umnúmero de acesso de FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJ13356 é deficienteem atividade de α -cetoglutarato desidrogenase como um resultado da rupturado gene de subunidade aKGDH-El (sucA). A cepa acima foi identificadacomo Enterobacter agglomerans quando ela foi isolada e depositada comoEnterobacter agglomerans AJ13356. No entanto, ela foi recentemente re-classificada como Pantoea ananatis com base no seqüenciamento denucleotídeos de 16S rRNA e assim em adiante. Apesar de AJ13356 serdepositada no depositário acima mencionado como Enterobacter agglomerans, para os fins deste relatório, ela foi descrita como Pantoeaananatis.

Bactérias produzindo L-fenilalanina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-fenilalanina da presente invenção incluem, mas não são limitados a cepaspertencendo ao gênero Escherichia, como E.coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR)(VKPM B-8197); E.coli HWl089 (ATCC 55371) abrigando o gene pheA34(Patente US No. 5.354.672); E.coli MWEClOl-b (KR8903681); E.coli NRRLB-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente USNo. 4.407.952). Também, como uma cepa parental, E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] chamada comoAJ 12604 (FERM BP-3579) pode ser usada (EP 488424 BI). Além disso,5 bactérias produzindo L-fenilalanina pertencendo ao gênero Escherichia quetem uma atividade aumentada da proteína codificada pelo gene yedA ou ogene ddG também podem ser usadas (pedidos de patente US 2003/0148473Al e 2003/0157667 Al).

Bactérias produzindo L-triptofano

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasproduzindo L-triptofano da presente invenção incluem, mas não são limitadosa cepas pertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli JP4735/pMU3028(DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficientes em triptofanil-tRNAsintetase codificada por gene trpS mutante (Patente US No. 5.756.345); E.coli SVl64 (pGH5) tendo um alelo serA codificando fosfogliceratodesidrogenase resistente à inibição de retro-alimentação por serina e um alelotrpE codificando antranilato sintase resistente à inibição de retro-alimentaçãopor triptofano (Patente US No. 6.180.373); E. coli AGXl7 (pGX44) (NRRLB-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficientes em enzimatriptofanase (Patente US No. 4.37.614); E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-ppsem que uma capacidade de produzir fosfoenolpiruvato é melhorada(W09708333, Patente US No. 6.319.696), e semelhantes pode ser usada.Além disso, bactérias produzindo L-triptofano pertencendo ao gêneroEscherichia que tem uma atividade melhorada da proteína codificada pelogene yedA ou o gene yddG também podem ser usadas (pedidos de patente US2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Bactérias produzindo L-triptofano

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasproduzindo L-triptofano da presente invenção também incluem cepas em queuma ou mais atividades das enzimas selecionadas de antranilato sintase(trpE), fosfoglicerato desidrogenase (serA), e triptofano sintase (trpAB) sãoaumentadas. A antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase são ambassubmetidas à inibição de retro-alimentação por L-triptofano e L-serina, demodo que uma mutação que resulta em dessensibilização da inibição retro-alimentação pode ser introduzida nestas enzimas. Exemplos específicos decepas tendo tal mutação incluem E. coli SV164 que abriga antranilato sintasedessensibilizada e a cepa obtida por transformação do plasmídeo pGH5 em E.coli SVl64 (WO 94/08031), que contém um gene serA que foi mudado demodo que ele codifica fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada por retro-alimentação.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasproduzindo L-triptofano da presente invenção também incluem cepastransformadas com o operon de triptofano que contém um gene codificandoantranilato sintase dessensibilizada (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, patenteUS No. 4.371.614). Além disso, a capacidade de produzir L-triptofano podeser conferida por melhora da expressão de um gene que codifica triptofanosintase, dentre os operons de triptofano (trpBA). A triptofano sintase consistede subunidades α e β que são codificadas por trpA e trpB, respectivamente.Além disso, capacidade de produzir L-triptofano pode ser melhorada poraumento da expressão do operon isocitrato liase - malato sintase(W02005/103275).

Bactérias produzindo L-prolina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-prolina da presente invenção incluem, mas não são limitados a cepaspertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012)que é deficiente em gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (EP 1172433).

A bactéria da presente invenção pode ser melhorada poraumento da expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-prolina. Exemplos de genes preferidos para bactérias produzindo L-prolinaincluem o gene proB codificando para glutamato quinase que édessensibilizada para inibição de retro-alimentação por L-prolina (DE Patente3127361). Além disso, a bactéria da presente invenção pode ser melhoradapor aumento da expressão de um ou mais genes codificando para proteínasexcretando L-aminoácido de uma célula bacteriana. Estes genes incluem osgenes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP1239041 A2).

Exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia quetem uma atividade para produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E.coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente GB 2075056), VKPM B-8012 (pedido de patente russa 2000124295), mutantes de plasmídeos descritosem Patente DE 3127361, mutantes de plasmídeos descritos por Bloom F.R. etal (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34), e semelhantes.Bactérias produzindo L-arginina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-arginina da presente invenção incluem, mas não são limitados a cepaspertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli cepa 237 (VKPM B-7925)(Pedido de patente US 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas abrigando N-acetilglutamato sintase mutante (pedido de patente russa No. 2001112869), E.coli cepa 382 (VKPM B-7926) (EPl 170358A1), uma cepa produzindoarginina em que o gene argA codificando N-acetilglutamato sintetase éintroduzida (EPl 170361 Al), e semelhantes.

Exemplos de cepas parentais para derivar as bactériasproduzindo L-arginina da presente invenção também incluem as cepas em quea expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-arginina é melhorada. Exemplos das enzimas biossintéticas de L-argininaincluem N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase(argj), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD),ornitina carbamoil transferase (argF), ácido argininossuccínico sintetase(argG), ácido argininossuccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase(carAB).

Bactérias produzindo L-valina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-valina da presente invenção incluem, mas não são limitados a cepas queforam modificadas para superexpressar o operon ilvGMEDA (Patente US No.5,998,178). É desejável remover a região do operon ilvGMEDA que érequerida para atenuação de modo que expressão do operon não é atenuadapela L-valina que é produzida. Além disso, o gene ilvA no operon édesejavelmente rompido de modo que a atividade de treonina deaminase édiminuída. Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindo L-valina da presente invenção também incluem mutantes de amino-acil t-RNAsintetase (Patente US No. 5,658,766). Por exemplo, E. coli VL1970, que temuma mutação no gene ileS codificando isoleucina tRNA sintetase, pode serusado. E. coli VL1970 foi depositada em Russian National Collection ofIndustrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 113545 Moscow, 1 DorozhnyProezd.) em 24 de junho de 1988 sob o número de acesso VKPM B-4411.

Além disso, mutantes requerendo ácido lipóico paracrescimento e/ou faltando H+-ATPase também podem ser usados(W096/06926).

Bactérias produzindo L-isoleucina

Exemplos de cepas parentais para derivar bactérias produzindoL-isoleucina da presente invenção incluem, mas não são limitados a mutantestendo resistência a 6-dimetilaminopurina (JP 5-304969 A), mutantes tendoresistência a análogos de isoleucina como tiaisoleucina e hidroxamato deisoleucina, e mutantes adicionalmente tendo resistência a DL-etionina e/ouhidroxamato de arginina (JP 5-130882 A). Além disso, cepas recombinantestransformadas com genes codificando proteínas envolvidas em biossíntese deL-isoleucina, como treonina deaminase e acetohidroxato sintase, tambémpodem ser usadas (JP 2-458 A, FR 0356739, e Patente US No. 5.998.178).<l-2> Melhora da atividade de ACS

A bactéria da presente invenção pode ser obtida modificando-se uma bactéria tendo uma capacidade de produzir um L-aminoácido comodescrito abaixo de modo que a atividade de ACS é aumentada. No entanto, acapacidade de produzir um L-aminoácido pode ser conferida após a bactériaser modificada de modo que a atividade de ACS é aumentada. Como descritoabaixo, a atividade de ACS pode ser melhorada por aumento da expressão deum gene codificando a proteína tendo atividade de ACS, que pode ser obtidapor aumento da a expressão de um gene endógeno modificando uma regiãoregulatória da expressão como um promotor, ou melhora da expressão de umgene exógeno por introdução de um plasmídeo contendo o gene, ousemelhantes. Além disso, estes métodos podem ser combinados.

Na presente invenção, o termo "atividade de ACS" significauma atividade (EC 6.2.1.1) para catalisar uma reação para produzir acetil-CoA, pirofosfato, e AMP a partir de ácido acético, coenzima A (CoA) e ATP.

coenzima A + ácido acético + ATP = >acetil-CoA +pirofosfato + AMP

Também foi relatado que ACS catalisa a reação para produzirpropionil-CoA a partir de ácido propiônico (Eur J Biochem2002;269(24);6184-94), e também foi relatado que ACS pode funcionar comouma 4-coumarato CoA ligase (Genome Biol 4(9);R54).

coenzima A + ácido propiônico + ATP => propionil-CoA +pirofosfato + AMP

coenzima A + 4-coumarato + ATP => coumaroil-CoA +pirofosfato + AMP

A melhora da atividade de ACS pode ser confirmada pormedida da quantidade de ácido acetohidroxâmico que é obtido por conversãode acetil-CoA que é gerado in vitro pela reação mencionada acima (Meth.Enzymol. 1, 585-591).

A frase "modificar de modo que a atividade de ACS émelhorada" inclui quando o número de moléculas de ACS por célula aumentae quando a atividade de ACS por molécula é melhorada como comparada auma cepa de tipo selvagem ou não modificada. A atividade de ACS émelhorada em não menos do que 150% por célula, preferivelmente em nãomenos do que 200% por célula, mais preferivelmente em não menos do que300% por célula como comparada a uma cepa de tipo selvagem ou uma cepanão modificada. Exemplos de uma cepa de tipo selvagem pertencendo à família Enterobacteriaceae que pode ser usada como um controle incluemEseheriehia coli cepa MG165 5 (ATCC No. 47076), cepa W3110 (ATCC No.27325), e Pantoea ananatis cepa AJ13335 (FERM BP-6615).

A atividade de ACS pode ser melhorada por aumento daexpressão de um gene codificando a proteína tendo atividade de ACS (gene acs). A expressão aumentada como comparada a uma cepa de tipo selvagemou não modificada pode ser confirmada por comparação do nível de mRNAdo gene acs ao de uma cepa de tipo selvagem ou não modificada. Métodospara confirmar a expressão de um gene incluem hibridização Northern e RT-PCR (Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor (USA), 2001)). A expressão pode ser em qualquer nível contanto queela seja aumentada como comparado a uma cepa de tipo selvagem ou nãomodificada, e por exemplo, a expressão é preferivelmente aumentada em nãomenos do que 1,5 vezes, mais preferivelmente em não menos do que 2 vezes,e ainda mais preferivelmente em não menos do que 3 vezes, como comparado a uma cepa de tipo selvagem ou não modificada. Entrementes, a melhora daexpressão do gene acs também pode ser confirmada por um aumento no nívelda proteína correspondente, como comparado a uma cepa de tipo selvagem ounão modificada, e o nível de proteína pode ser detectado, por exemplo, porWestern blotting usando um anticorpo (Molecular Cloning (Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)).

Exemplos do gene acs incluem o gene acs de Escherichia coli.Na presente invenção, exemplos de gene acs de Eseheriehia coli incluem ogene acs de SEQ ID NO: 3 (um filamento complementar de números deacesso de nucleotídeos 4283436.-4285394 GenBank No. NC_000913).

Exemplos de genes acs de outras fontes incluem o gene acs deYersinia pestis (um filamento complementar de números de nucleotídeos577565..579529 Acesso GenBank No. NC_004088), o gene acs deSalmonella typhi (um filamento complementar de números de nucleotídeos120832.. 122790 Acesso GenBank No. AL627282), o gene acs de Vibrioeholerae (um filamento complementar de números de nucleotídeos305121..307121 Acesso GenBank No. NC_002505) e o gene acs deSalmonella typhimuriumi (um filamento complementar de números denucleotídeos 4513714..4515672 Acesso GenBankNo. NC_003197).

Além disso, os homólogos do gene acs podem ser obtidos porclonagem com base em homologias dos genes acima listados, de γ-proteobactéria que pertence ao gênero Eseheriehia, Enterobaeter, Klebsiella,Serratia, Erwinia, Yersinia, ou semelhantes; uma bactéria corineforme comoCorynebaeterium glutamieum, ou Brevibaeterium laetofermentum, umabactéria Pseudomonas como Pseudomonas aeruginosa; uma bactériaMyeobaeterium como Mycobaeterium tubereulosis\ ou semelhantes. Oshomólogos pode ser amplificados por PCR usando, por exemplo,oligonucleotídeos sintéticos mostrados em SEQID NOS: 1 e 2.

As homologias entre as seqüências de aminoácidos eseqüências de nucleotídeos podem ser determinadas usando o algoritmoBLAST desenvolvido por Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90,5873 (1993)) ou o algoritmo FASTA desenvolvido por Pearson (MethodsEnzymol., 183, 63 (1990)). Com base no algoritmo BLAST, programaschamados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

A frase "homólogo do gene acs" inclui um gene derivado deoutras bactérias e um gene mudado naturalmente ou artificialmente, que temuma elevada similaridade estrutural para o gene acs acima mencionado ecodifica uma proteína tendo ACS. Os "homólogos do gene acs" incluemgenes que codificam uma proteína que tem homologia de pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente 95%, particularmentepreferivelmente pelo menos 98% para a seqüência completa de SEQ ID NO:4, e tem atividade de ACS. A atividade de ACS pode ser confirmada porexpressão do gene em uma célula hospedeira e medindo a atividade de ACS.

Entrementes, o gene acs não é limitado a um gene de tiposelvagem e pode ser um gene mutante ou artificialmente modificado quecodifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4,mas que pode incluir substituição, deleção, inserção, ou adição de um ouvários aminoácidos em uma ou uma pluralidade de posições contanto que aatividade de ACS seja mantida. Na presente invenção, apesar de depender dasposições na estrutura ternária e tipos de resíduos de aminoácidos nasproteínas, o termo "um ou vários" especificamente significa 1 a 20,preferivelmente 1 a 10, e mais preferivelmente 1 a 5. A substituição acimamencionada é preferivelmente uma substituição conservativa, e exemplos desubstituição conservativa incluem substituição entre aminoácidos aromáticoscomo a substituição dentre Phe, Trp, e Tyr; substituição entre aminoácidoshidrofóbicos como a substituição dentre Leu, lie, e Vai; substituição entreaminoácidos polares como uma substituição entre Gln e Asn; substituiçãoentre aminoácidos básicos como a substituição dentre Lys, Arg, e His;substituição entre aminoácidos ácidos como uma substituição entre Asp eGlu; substituição entre aminoácidos tendo um grupo hidroxila como umasubstituição entre Ser e Thr. Exemplos específicos de uma substituiçãoconservativa incluem substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gln,=

His, ou Lys por Arg,; substituição de Glu, Gln, Lys5 His, ou Asp por Asn;substituição de Asn, Glu, ou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys;substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg por Gln; substituição de Gly,Asn, Gln, Lys, ou Asp por Glu; substituição de Pro por Gly; substituição deAsn, Lys, Gln, Arg, ou Tyr por His; substituição de Leu, Met, Vai, ou Phe porlie; substituição de lie, Met, Vai, ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu,Gln, His, ou Arg por Lys; substituição de lie, Leu, Vai, ou Phe por Met;substituição de Trp, Tyr, Met, lie, ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Alapor Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr porTrp; substituição de His, Phe, ou Trp por Tyr; e substituição de Met, lie, ouLeu por Vai. Entrementes, substituição, deleção, inserção, adição, ou inversãode aminoácido acima mencionadas pode ser uma mutação de ocorrêncianatural (mutante ou variante) devido a uma diferença individual, umadiferença de tipos, ou semelhantes dentre as bactérias abrigando o gene acs.

Entrementes, o gene acs pode ser um DNA que hibridiza coma seqüência de nucleotídeos complementar a SEQ ID NO: 3, ou uma sondaque pode ser preparada proveniente de seqüência sob condições estringentes,contanto que o gene codifique uma proteína tendo a atividade de ACS. Napresente invenção, o termo "condições estringentes" refere-se a condiçõesonde um híbrido específico, como assim chamado, é formado e híbrido nãoespecífico não é formado. É difícil definir claramente as condições por umvalor numérico e exemplos incluem condições onde DNA tendo altahomologia, por exemplo, DNAs tendo homologia de pelo menos 80%,preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, ouparticularmente preferivelmente pelo menos 98% hibridizam um com cadaoutro e DNAs tendo homologia de menos do que 80% não hibridizam comcada outro, e exemplos específicos dos mesmos incluem a lavagem em umahibridização Southern geral, isto é, lavagem na concentração de sal de 1 χSSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 χ SSC, 0,1% SDS, a 60°C,preferivelmente a 68°C, uma vez, preferivelmente duas ou três vezes.

Expressão do gene acs acima mencionado pode ser aumentadapor, por exemplo, aumento do número de cópias do gene em uma célulausando uma técnica de recombinação de genes. Por exemplo, um fragmento deDNA contendo o gene é ligado a um vetor que funciona na bactériahospedeira, preferivelmente um vetor de cópias múltiplas para assim prepararum DNA recombinante e o DNA recombinante é usado para transformar abactéria hospedeira.

Quando usando gene acs de Escherichia coli, o gene acs podeser obtido por PCR (reação de cadeia polimerase; White, TJ. et al., TrendsGenet. 5, 185 (1989)) usando iniciadores baseados em uma seqüência denucleotídeo de SEQ ID NO: 3, por exemplo, iniciadores de SEQ ID NOS: 1 e2 e um DNA cromossômico de Eseheriehia coli como o gabarito. O gene acsde uma bactéria diferente também pode ser obtido por PCR proveniente dabiblioteca do DNA cromossômico ou do DNA genômico da bactériaescolhida, usando, como iniciadores, oligonucleotídeos preparados com basena seqüência conhecida do gene acs da bactéria escolhida ou do gene acs odeoutro tipo de bactéria, ou a seqüência de aminoácido da proteína ACS. O geneacs também pode ser obtido de uma bactéria diferente por hibridizaçãousando um oligonucleotídeo preparado com base na seqüência como umasonda. Um DNA cromossômico pode ser preparado a partir de uma bactériaque serve como um doador de DNA pelo método de Saito e Miura (Biochem.Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Experiment Manual for Bioteclinology,editado por The Society for Biotechnology, Japan, p97-98, Baifukan Co.,Ltd., 1992) ou semelhantes.

Então, um DNA recombinante é preparado por ligação do geneacs que foi amplificado por PCR em um DNA vetor que é capaz de funcionarna bactéria hospedeira. Exemplos de um vetor capaz de funcionar na bactériahospedeira incluem os vetores que são capazes de replicar autonomamente nabactéria hospedeira.

Exemplos de um vetor que é autonomamente replicável emEscherichia coli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398,ρACYC184, (pHSG e pACYC são disponíveis de Takara Bio Inc.), RSFlOlO(Gene vol. 75(2), p271-288, 1989), pBR322, pMW219, pMW119 (pMW édisponível de Nippon Gene Co., Ltd.), pSTV28, e pSTV29 (Takara Bio Inc.).Um vetor DNA de fago também pode ser usado.

Para ligar o gene ao vetor acima mencionado, o vetor édigerido com uma enzima de restrição correspondendo a um sítio dereconhecimento no término de um fragmento de DNA contendo o gene acs.Ligação é geralmente realizada usando uma ligase como ligase T4 DNA.Métodos de digestão e ligação de DNA, preparação de um DNAcromossômico, preparação de um DNA plasmídeo, transformação, PCR,projeto de oligonucleotídeos a serem usados como iniciadores são bemconhecidos na técnica. Estes métodos são descritos em Sambrook, J., Fritsch,E.F., e Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a. ed.", ColdSpring Harbor Laboratory Press, (1989), e semelhantes.

O DNA recombinante assim preparado é introduzido em umabactéria por um método de transformação convencional, como eletroporação(Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997)). Também é possívelaumentar a permeabilidade de DNA por tratamento das células recipientescom cloreto de cálcio, o que foi relatado para Escherichia coli K-12 (Mandei,M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970), e introduzir um DNA em umacélula competente no estágio de proliferação, o que foi relatado com Bacillussubtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A e Young, F.E, Gene, 1, 153 (1977)).

O número de cópias do gene acs também pode ser aumentadopor introdução de cópias múltiplas do gene no DNA cromossômico dabactéria hospedeira. A introdução de cópias múltiplas do gene no DNAcromossômico da bactéria hospedeira pode ser atingida por recombinaçãohomóloga usando uma seqüência de marcação presente no DNAcromossômico em cópias múltiplas. Isto pode ser um DNA repetitivo ou umarepetição invertida presente na extremidade de um elemento de transposon.Alternativamente, como descrito em JP 2-109985 A, cópias múltiplas do geneacs podem ser introduzidas no DNA cromossômico por inserção do gene emum transposon, e transferindo o mesmo de modo que as copias múltiplas dogene são integradas no DNA cromossômico. A integração do gene nocromossomo pode ser confirmada por hibridização Southern usando umaporção do gene como uma sonda.

Além disso, expressão do gene acs pode ser aumentada por,como descrito em WO 00/18935, W098/04715, substituição de umaseqüência regulatória da expressão como o promotor nativo com um promotormais forte, quer o gene esteja presente no cromossomo ou no plasmídeo,amplificando um elemento regulatório que é capaz de aumentar a expressãodo gene, ou deletando ou atenuando um elemento regulatório que diminui aexpressão do gene acs. Exemplos de promotores fortes conhecidos incluem opromotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR fagolambda, promotor PL, e promotor tet.

Métodos para avaliar a resistência de um promotor e exemplosde promotores fortes são descritos em Goldstein et al. (Prokaryotic promotersin biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) ou semelhantes.Além disso, sabe-se que uma seqüência de espaçador entre o sítio de ligaçãodo ribossoma (RBS) e o códon de iniciação de tradução, especialmente, váriosnucleotídeos logo a montante do códon de iniciação tem uma grandeinfluência na eficiência da tradução. Portanto, esta seqüência pode sermodificada.

Além disso, para aumentar a atividade de uma proteínacodificada pelo gene acsA, uma mutação que aumenta a atividade de ACSpode ser introduzida em um gene. Exemplos desta mutação incluem amutação na seqüência do promotor para aumentar o nível de transcrição degene acs, e a mutação na região de codificação para aumentar as atividadesespecíficas da proteína ACS.

<2> Método para produzir L-aminoácido

O método para produzir um L-aminoácido da presenteinvenção compreende cultivar uma bactéria da presente invenção em um meiopara produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou células bacterianas, ecoletar o L-aminoácido proveniente de meio ou das células bacterianas.

Meios de cultura convencionais que são tipicamente usados naprodução fermentativa bacteriana de um L-aminoácido podem ser usados. Istoé, um meio geral contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio,íon inorgânico, e se necessário, outros componentes orgânicos podem serusados. Na presente invenção, exemplos da fonte de carbono incluemaçúcares como glucose, sacarose, lactose, galactose, fructose e um hidrolisadode amido; álcoois como glicerol e sorbitol; e ácidos orgânicos como ácidofumárico, ácido cítrico e ácido succínico. Exemplos da fonte de nitrogênioincluem sais de amônio inorgânico como sulfato de amônio, cloreto deamônio e fosfato de Amônio; um nitrogênio orgânico como hidrolisado desoja; gás amônia; e amônia aquosa. Como nutrientes de traço orgânicos,substâncias auxotróficas como vitamina Bl e L-homoserina, extrato delevedura, e outros, estão preferivelmente contidos no meio em quantidadesapropriadas. Além destas substâncias, se necessário, fosfato de potássio,sulfato de magnésio, íon ferro, íon manganês, ou outros, podem seradicionados em quantidades pequenas. O meio a ser usado na presenteinvenção pode ser um meio natural ou um meio sintético desde que elecontenha uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, íon inorgânico, e senecessário, outros nutrientes de traço orgânicos.

A cultura é preferivelmente realizada sob condições aeróbicasdurante 1 a 7 dias a uma temperatura de 24°C a 37°C e um pH de 5 a 9. O pHpode ser ajustado com uma substância alcalina ou ácida, inorgânica, ouorgânica, gás amônia ou semelhante. O L-aminoácido pode ser coletado dolíquido de fermentação por um método convencional, como resina de trocaiônica, precipitação, e outros métodos bem conhecidos. Quando o L-aminoácido se acumula nas células bacterianas, o L-aminoácido pode sercoletado, por exemplo, por ruptura das células bacterianas por ultra-sonicaçãoou outro, para liberar o L-aminoácido na fração de sobrenadante, e então ascélulas bacterianas são removidas por centrifugação, seguido submetendo-se afração de sobrenadante resultante a uma resina de troca iônica ou semelhante.

Quando produzindo um L-aminoácido básico, fermentaçãopode ser realizada enquanto controlando o pH do meio durante a cultura a 6,5-9,0 e controlando o pH do meio após completar a cultura a 7,2-9,0, assimcomo controlando a pressão no tanque de fermentação durante a fermentaçãode modo que ela seja positiva. Alternativamente, dióxido de carbono ou umgás misto contendo dióxido de carbono, pode ser adicionado ao mesmo demodo que o íon bicarbonato e/ou íon carbonato estejam presentes em umaquantidade de pelo menos 2 g/L no meio durante o período de cultura. Estesíons funcionam como contra'-íons contra o cátion dos L-aminoácidos básicos,e o L-aminoácido básico alvo pode ser coletado (EP1182261,W02006/03 8695).

EXEMPLOS

A seguir, a presente invenção será descrita em maioresdetalhes por referência aos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

<1> Construção de um plasmídeo para amplificar o gene acs

Para avaliar o efeito de amplificação do gene acs sobre aprodução de L-lisina, um vetor plasmídeo para amplificar o gene acs foiconstruído. A seqüência cromossômica completa de nucleotídeo deEscherichia eoli (Eseherichia eoli cepa K-12) já foi descrita (Science, 277,1453-1474 (1997)). Com base na seqüência de nucleotídeo do gene acs, que édescrito neste documento, o oligonucleotídeo de SEQ ID NO: 2 que contémum sítio SaII fixado à seqüência complementar de nucleotídeos 4285765 a4285784 de GenBank ACCESSO No. NC_000913 foi usado como o iniciador5', e o oligonucleotídeo de SEQ ID NO: 1 que contém um sítio BamHI fixadoà seqüência de 4283415 a 4283435 de No. NC_000913 foi usado comoiniciador 3'. Estes iniciadores foram usados para realizar PCR usando o DNAcromossômico de Escherichia coli cepa MGl655 como um gabarito.

O gene acs amplificado foi purificado e digerido com SalI eBamHI, e então ligado ao vetor digerido com SalI e BamHI, pMW119(Takara Bio), para obter um plasmídeo para amplificação do gene acs(pMWacs).

Exemplo 2:

Construção de uma cepa com genes codificando lisinadecarboxilase rompida (cadA e IdcC)

Uma cepa que não produz lisina decarboxilase foi construída.As lisina decarboxilases são codificadas pelo gene cadA (acesso Genbank No.NP_418555, SEQ ID NO: 5) e o gene idcC (acesso Genbank No. NP_414728,SEQ ID NO: 7) (WO 96/17930). Escheriehia coli WC196 (FERM BP-5252)foi usada como uma cepa parental (WO96/17930).

O gene cadA e o gene idcC foram rompidos pelo métododesenvolvido por Datsenko e Wanner, que é chamado"Red-drivenintegration" (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645),e por um sistema de excisão derivado de fago λ (J. Bacteriol. 2002 Sep;184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phagelambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.)."Red-driven integration" torna possível construir uma cepa com generompido em uma etapa por emprego de um produto PCR obtido por uso comoiniciadores de oligonucleotídeos sintéticos projetados para ter uma parte dogene marcado nas extremidades 5' e uma parte do gene de resistência aantibiótico nas extremidades 3'. A combinação do sistema de excisão derivadodo fago λ permite a remoção do gene de resistência a antibiótico que foiincorporado na cepa de gene rompido. (W02005/010175).

(2-1) Ruptura do gene cadA

O plasmídeo pMWl 18-attL-Cm-attR (W02005/010175) foiusado como um gabarito para PCR. pMWl 18-attL-Cm-attR foi obtido porinserção dos genes attL e attR, que são sítios de fixação para o fago λ, e ogene cat, que é um gene de resistência a antibiótico, em pMWl 18 (Takara BioInc.) Os genes são dispostos na seguinte ordem: attL-cat-attR.

PCR foi realizado usando, como iniciadores, osoligonucleotídeos sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 9 e 10, que temseqüências correspondendo a attL e attR nas extremidades 3'- e a seqüênciacorrespondendo a uma parte do gene marcado cadA nas extremidades 5

O produto PCR amplificado foi purificado em um gel deagarose e introduzido na cepa WC196 de Escherichia coli por eletroporação.Essa cepa abriga pKD46 que tem replicabilidade sensível a temperatura.pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)contém um fragmento de DNA de 2.154 nucleotídeos derivados de fago λ quecontém os genes codificando Red recombinase (genes γ, β, e exo) o sistemade recombinação homólogo λ Red, que é controlado por um promotor ParaBindutível por arabinose (GenBank/EMBL Acesso No. J02459, números denucleotídeo 31088 a 33241). pKD46 é necessário para integrar o produto PCRno cromossomo da cepa WCl 96.

As células competentes para eletroporação foram preparadascomo a seguir. Isto é, células da cepa WC196 de Eseherichia coli com pKD46foram cultivadas durante a noite a 3 0°C em meio LB contendo 100 mg/Lampicilina, e então diluídas 100 vezes com 5 mL de meio SOB (MolecularCloning: Laboratory manual, 2a. ed., Sambrook, J. et al., Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)) contendo ampicilina (20 mg/L) e L-arabinose (1mM). As células diluídas foram cultivadas com aeração a 30°C até o ODóOOalcançar cerca de 0,6, e então concentradas 100 vezes e lavadas três vezescom 10% glicerol de modo que as células estavam disponíveis paraeletroporação. A eletroporação foi realizada com 70 JiL das célulascompetentes e cerca de 100 ng do produto PCR. Após a eletroporação, 1 mLde meio SOC (Molecular Cloning: Laboratory manual, 2a. ed., Sambrook, J.et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) foi adicionado às células,e as células foram cultivadas a 37°C durante 2,5 horas, e então submetidas auma cultura de placas em meio L-agar contendo Cm (cloranfenicol) (25mg/L), para assim selecionar as cepas recombinantes resistentes a Cm.Subseqüentemente, para remover o plasmídeo pKD36, as células foramsubcultivadas duas vezes a 42 0C em meio L-agar contendo Cm, e aresistência a ampicilina das colônias resultantes foi examinada para dar,assim, cepas sensíveis a ampicilina em que o pKD46 foi curado.

Deleção do gene cadA na cepa mutante, que foi identificadapelo gene de resistência a cloranfenicol, foi confirmada por PCR. A ceparompida em cadA foi chamada WC196AcadA: :att-cat.

Subseqüentemente o plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts(W02005/010175) foi usado para remover o gene att-cat que tinha sidointroduzido no gene cadA. O plasmídeo pMW-intxis-ts transporta um genecodificando a integrase (Int) de fago λ, e o gene codificando excisionase(Xis), e apresenta replicabilidade sensível a temperatura.

Células competentes da cepa WC196AcadA: :att-cat cepaforam preparadas por um método convencional, e foram então transformadascom o plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts, e então submetidas a uma culturaem placas a 3O0C sobre meio L-agar contendo 50 mg/L ampicilina, para assimselecionar as cepas resistentes a ampicilina.

Subseqüentemente, para remover o plasmídeo pMW-intxis-ts,as células foram subcultivadas duas vezes a 42°C em meio L-agar, eresistência a ampicilina e resistência a cloranfenicol das colônias resultantesforam examinadas, para assim dar uma cepa sensível a cloranfenicol e aampicilina, em que o gene cadA foi rompido, e att-cat e o pMW-intxis-tsforam removidos. A cepa foi chamada WC196AcadA.(2-2) Ruptura do gene idcC na cepa WC196AcadA

O gene idcC na cepa WC196AcadA foi rompido por uso deoligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 11 e 12 como iniciadores do mesmomodo como descrito abaixo. Deste modo, a cepa rompida em cadA e IdcCchamada WC196∆cadA∆ldcC foi obtida.

<3>Efeito de amplificação do gene acs em uma cepa produzindo L-Iisina debactéria Escherichia

Introdução de um plasmídeo para a produção de lisina na cepaWC196∆cadA∆ldcC

Cepa WC196∆cadA∆ldcC foi transformada com umplasmídeo para a produção de lisina chamada pCABD2 (WO 01/53459), quetransporta o gene dapA, gene dapB, gene IysC e gene ddh, para assim dar acepa WC196∆cadA∆ldcC/pCABD2.

A cepa WC196∆cadA∆ldc/pCABD2 foi transformada com oplasmídeo para amplificar o gene acs (pMWacs) que foi construído noExemplo 1 e um plasmídeo de controle (pMW119) (Takara Bio Inc), e cepasresistentes a estreptomicina e ampicilina foram selecionadas. A introduçãodos plasmídeos foi confirmada e a cepa introduzida em pMWacs e cepaintroduzida em pMW119 foram chamadas cepaWC196∆cadA∆ldc/pCABD2-acs e cepa WC196∆cadA∆ldc/pCABD2-119,respectivamente.

As cepas WC196∆cadA∆ldc/pCABD2-acs eWC196∆cadA∆ldc/pCABD2-119 foram cultivadas a 37°C em meio -Lcontendo 50 mg/L de ampicilina e 20 mg/L de estreptomicina até o OD600final alcançar cerca de 0,6, e então um volume igual de solução de glicerol a40% foi adicionado à cultura, seguido por agitação. Então, a suspensãoresultante foi distribuída em quantidades apropriadas e armazenada a -80°C,que foi usada como uma carga de glicerol.

As cargas de glicerol das cepas foram descongeladas e 100 uLde cada cepa foi uniformemente aplicado em uma placa L contendo 50 mg/Lampicilina e 20 mg/L estreptomicina, e cultivadas a 37°C durante 24 horas.Cerca de um oitavo das células de cada cepa na placa foram inoculadas em 20mL do meio de fermentação (meio de produção de L-Iisina para bactériasEscherichia) contendo 50 mg/L ampicilina e 20 mg/L estreptomicina em umfrasco de 500 mL-Sakaguchi e cultivadas a 37°C usando um agitadoralternante durante 29 horas. A quantidade de L-Iisina que acumulou no meiofoi determinada usando um dispositivo Biotech Analyzer AS210 (SakuraSeiki Co,. Ltd.).

[Meio de produção de L-Iisina para bactéria Eseheriehia]

Glucose 40 g/L

Sulfato de amônio 24 g/L

Di-hidrogeno fosfato de potássio 1,0 g/L

Sulfato de magnésio heptaidratado 1,0 g/L

Sulfato de ferro heptaidratado 0,01 g/L

Sulfato de manganês heptaidratado 0,01 g/L

Extrato de levedura 2,0 g/L

Carbonato de cálcio (tipo oficial) 30 g/L (esterilizado separado)

O meio foi ajustado a pH 7,0 com hidróxido de potássio eesterilizado por valor a 115°C durante 10 minutos.

Glucose e Sulfato de magnésio heptaidratado foramesterilizados separados.

Carbonato de cálcio (tipo oficial) foi esterilizado separado poraquecimento a 180°C durante 2 horas.Tabela 1 mostra as quantidades de L-Iisina presentes após 29horas. No caso da cepa WC196AcadAAldc/pCABD2-acs, a quantidade de L-lisina foi maior como comparado com a cepa WC196AcadAAldc/pCABD2-119, que não contém o gene acs. Estes dados mostram que a capacidade deproduzir L-Iisina foi melhorada por aumento da expressão do gene acs.

Tabela 1

<table>table see original document page 37</column></row><table>

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

A bactéria da presente invenção permite uma produçãofermentativa eficiente de L-aminoácidos básicos como L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina e L-citrulina; L-aminoácidos alifáticos como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-Ieucina e L-glicina; ácidos hidróximonoaminocarboxílico como L-treonina e L-serina; L-aminoácido cíclicocomo L-prolina; L-aminoácidos aromáticos como L-fenilalanina, L-tirosina eL-triptofano; L-aminoácidos contendo enxofre como L-cisteína, L-cistina e L-metionina; e L-aminoácidos ácidos como ácido L-glutâmico, ácido L-aspártico, L-glutamina e L-asparagina.LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> Ajinomoto CO., Inc.

<120> "METODO DE PRODUZIR UM L-AMINOACIDO"

<130> C755-C7003

<150> JP2006-0947S4<151> 2006-03-30

<160> 12

<170> PatentIn Versão 3.3

<210> 1<211> 28<2l2> DnA<213> Seqüência Artificial

<220><223> 5' Iniciador para asC

<400> 1cgggatcctc gcategggca attgtggg

<210> 2<211> SO<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220><223> 3' Iniciador para asc

<400> 2

acgcgtcgaç gggcttcatc egaattgcgc

<210> 3<211> 1959<212> DNA<2l3> Escherichia coli<220>

<221> CDS<222> (I).. (1956}

<400> 3

stg age csâ cac aaa cac scc att cct gcc sac ate gea gac Ggt 48

Met Sev Gln Ile His Lys His Thr Ile Pro Ala Asn De Ala Asp Arg1 S 10 15

tgc ctg ata sac cct cag cag tsc gag geg atg tat caa caa tçt att 96

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20 25 30

sac gta cct gst acc ttc tgg ggc gaa cag ggs asa att ctt gac tgg 144Asn Val Pro Asp Thr Phe Trp Gly GJu Gln G2y Lvs Ile Leu Asp Trp

35 40 4B

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50 SS 60

gtg tcc att aaa tgg tac gag gac ggc acg ctg aat ctg gcg gea aac 240Val Ser Ile Lys Tr^ Tyr Glu Asp Gly Thr Leu Asn Leu AIa Ala Asn55 70 80

tgc ctt gac cgc cat ctg caa gáô aac ggc gat egt acc geç ate ate 288Çys Leu Asp Arg Hjs Lea Gln Glu Asn Gly Asp Arg Thr Ala Iie Ile

85 90 95 .

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100 105 110

ctg cm cgc gac gtc tgc egc ttc gce aat sec ctg ctç gag ctg ggc 384Leu His Arg Asp Val Cys Arg Phe Ala Asti Hir Leu Leu GIn Lea Gly

Ϊ15 120 125

Stt asa asa ggt gat gtg gtg gcg att tat atg ceg atg gtg ceg gad 432Ile Lyg Lys Gly Asp VaI Val Als Ile Tyr Het Pro JJet Tal Pro Ciu

130 135 140

gcc gcg gtt gcg atg ctg gcc tgc gcc cgc att ggc- gçg gtg cat tcg 460Ala Ala Vel AIa Üet Lêü Aia Cys Ala Arg ILe Cly Ala Vsl His Ser145 ISO 355 160

gtg att ttc ggc ggc ttc tcg ccg gaa gcc gtt gcc ggg cge att att 528Val IIe Pbe GIy Gly Phe Ser Pro Glu Ala Val Alá Gly Arg Ile Ile

165 170 175

gat tcc aao tea cga ctg gtg ate a et tcc pse gaa ggt gtg cgt gcc 576Asp Ser Asn Ser Arg Lew Vsl Iie Thr Sar Asp Glu Gly Val Arg Ala

180 185 190

ggg cgc agi att ecg ctg aag asa aac gtt gat gec geg ctg aaa aac 624Gly Arg Ser Ile Pro Ley Lys Lys Asn VaI Asp Asp Ala Leu Lys Asb195 200 205

ccg aac gtc acc age gta gag; cat gtg gtg gta ctg aag cgt act ggc 672Pro Asn V-el Thx Ser VaI GLu His VaI Val Val Uu Lys Arg Thx Gly

210 215 220

ggt aaa att gac tgg cag gaã ggg cgc gac ctg tgg tgg cac gac otg 720Gly Lys Ile Asp Txp Gln GJu Gly Arg Asp Leu Txp ?3*p His Asp Leu225 230 235 240

gtt gag caa gcg age gst cag cac cag gcg gaa gag aíg aac gcc gea 76SVaJ Glu Gln AIa Ser Asp Gln Ris Glfi Ala Glu Glu Met Asn Ala Glu

245 250 255

gat ccg ctg ttt att ctc tac acc tcc ggt trt acc ggt aag cca àsa 816Asp Pio Leu Pbe Ile Lsu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys

260 265 270

ggt gtg ctg cat act acc ggc ggt tst ctg gtg tac gcg gçg ctg acc 864Gly Val Leu His' Ttar Thr Gly Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Ala Leu Thr

27$ 280 285

ttt aaa tst gtc ttt gat tet cat ccg ggt gat ate tac tgg tgc aoc 912Phe Lys Tyr Val Phe Asp Tyr Mis Pro Gly Asp Ue Tyr Txp Cys Tbr

290 295 300

gcc gat gtg ggc z$g gtg acc gga cac egt. tac ttg ctg tsc ggc ccg S60Ala Asp Val Gly Trp VaI Tbr Gly His Ser Tyr Leu Leu Tyr Gly Pro305 310 315 . 320

ctg gcc tgc ggt gcg acc a cg ctg atg ttt gaa ggc gta ccc aac tgg 1008Leu Al» Cys Gly Ala Thr Thr Leu Met Phe Glu GIy Val Pro Asn Trp

325 330 335

ccg acg cot gcc cft atg gcg cag gtg gtg gac mg cat cag gtc aat 1056Pro TTsr Pro AU Arg Met Ala Gla Yal Val Asp Lys His Gln Val Asn

340 34S 350

att etc tat acc gea ccc «cg gcg ate egc gcg ctg atg gçg gaa gge 1104Ile Uu Tyx Thr Alii Pro Thr Ala Ile Arg Ala Uw Met Ala Gly Gly

355 360 365

gat eaa gcg ate gaa ggc acc gac egt tcg tcg ctg cgc att ctc ggt 1152Asp Lts Ala Ile Gla Gly Thr Asp Arg Ser Ser leu Arg Ile Uy Gly

370 375 380

tcc gtg ggc gag cca 3tt aac ccg gaa gcg: tgg gag tgg tac tgg asa 1200Ser Val Gly GXu Pro IJe Asn Pxo Glw Ala Trp Glu Trp Tyr Trp Lys385 390 395 400

aaa ate ggc aac gag aaa tgt ccg gtg gtc gat acc tgg tgg cag acc 1248Lys Ile Gly Asn Glu Lys Cys Pro Val Val fcsp Thr Trp Trp GIr Thr

405 410 415

gaa acc ggc ggt ttc gtg ate acc ccg ctg cct gge get acc gag ctg 1296Glu Thr Gly Gly Pbe Met Ile Thr Pro Leu Pro Gly Ala Thr GIu Leu

420 425 430

aaa gcc ggt tcg gea aca cgt ccg ttc ttc ggc gtg caa ccg gcg ctg 1344Lys AJa Gly Ser Ale Thar Arg Pro Phe Phe Gly Val Gln Pro Ãla Leu

m 440 445

gtc gat aao gaa ggt aac ccg ctg gag ggg gcc acc gaa ggt age ctg 3392Val Asp Asn Glu Gly Asn Pro Leu Glu Gly Ala TTir Gla Gly Ser Leu

450 455 460

gta âte scc gae tçc tgg ccg ggt cag gcg cgt acg ctg: ttt ggc gat 1440Vsl Ile Thr Asp Ser Trp Pro Gly Gln Als Axg Thr Uu Phe Gly Asp465 470 475 480

cac gae cgt ttt gaa cag abe tãe tte tcc acc tte aaa aat Stg tat 14SSHis Glu Arg Phe Glu Gln Thr Tyr Mis Ser Thr Phe Lys Asn Utt Tyr

485 ' 4S0 495

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acc ggg cgt gtg gac gac gtg ctg aac gtc tcc ggt câc cgt ctg ggg 1584Thr Gly Arg Val Asp Asp Val Leu Asn Vsl Ser Gly His Arg leu Gly

515 520 525

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530 535 540

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gcc tac gtc acg ctt aat cac ggg gag gaa ccg tca cca gaa ctg tac 172-8Ala Tyr Val Thr LeU Asr His Gly Glu Glu Pro Ser Pro Glu Leu Tyr

565 570 575

gea gaa gtc cgc aac tgg gtg cgt aaa gag att ggc ccg ctg gcg acg I?7fiAla Glu Val Arg Asn Trp Val Arg Ly§ Glu Ile Gly Pro Uu Ala Thr

580 . 585 590

cca gac gtg ctg cac tgg acc gac tcc ctg çct aaa acc cge tcc ggc 1824Pro Asp Val Leu His Trp Thr Asp Scr Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly

$95 600 6«

aaa att atg cgc cgt att ctg cgc a as att gcg gcg ggc çot acc sgc 1.872Lys Oe Jdet Arg Arg Ils leü Arg Lys 11« Ala Ala Cly Asp Thr Sar

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ã8S ctg ggc gat acc tcg acg ctt gcc gat cct ggc gta £tc gag aag 1920Asn Leu Gly Asp Thr Ser TJir Leu Ala Asp Pro Gly Vel Val Glu Iys625 630 635 640

ctg ctt gaa gag aag cag gct ate gcg atg cca tcg tsa 1959

Leu Leu Glu Glu Lys Glri Ala Ile Ale Met Pro Ser645 650

<210> 4<211> 652<212> PRT

<213> EstJherichia coli

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Claims (5)

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelofato de compreender cultivar uma bactéria em um meio, e coletar o L-aminoácido proveniente de meio ou da bactéria mencionada, em que abactéria mencionada é uma bactéria produzindo L-aminoácido pertencendo àfamília Enterobacteriaceae, que foi modificada para aumentar a atividade daacetil-CoA sintetase.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a atividade da acetil-CoA sintetase é aumentada por um métodoselecionado dentre o grupo consistindo de:a) aumentar o número de cópias do gene acs que codifica aacetil-CoA sintetase, eb) modificar uma seqüência regulatória da expressão do genemencionado.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o gene acs mencionado é selecionado dentre o grupo consistindode:(a) um DNA compreendendo a seqüência de nucleotídeo deSEQ ID NO: 3, e(b) um DNA que hibridiza com a seqüência de nucleotídeo queé complementar a uma seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3, ou com asonda que é preparada a partir de uma seqüência de nucleotídeo sob condiçõesestringentes, e em que DNA mencionado codifica a proteína com a atividadeda acetil-CoA sintetase.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é selecionado a partir dogrupo consistindo de L-lisina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina,L-leucina, L-treonina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano, L-cisteína,ácido L-glutâmico, e combinações dos mesmos.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que a bactéria mencionada pertence ao gêneroEscherichia, Pantoea, ou Enterobacter.