BRPI0717511A2

BRPI0717511A2 - Composto puro, composição farmacêutica, métodos para tratar uma infecção por hiv, para prevenir uma infecção por hiv, para inibir a replicação de hiv, e, uso de um composto

Info

Publication number: BRPI0717511A2
Application number: BRPI0717511-6A
Authority: BR
Inventors: Richard Storer; Froncois-Rene Alexandre; Cyril Dousson; Adel M Moussa; Edward Bridges
Original assignee: Idenix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2013-11-19
Also published as: TW200821287A; EA200900358A1; WO2008042240A3; NO20091258L; IL197777A; MX2009003410A; JP2010504978A; EP2078029A2; WO2008042240A2; US8486991B2; EP2078029B1; WO2008042240A9; ES2488922T3; CA2664396A1; EA016267B1; US7960428B2; CR10693A; MA30806B1; KR20090077813A; CO6190525A2

Description

“COMPOSTO PURO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA TRATAR UMA INFECÇÃO POR HIV, PARA PREVENIR UMA INFECÇÃO POR HIV, PARA INIBIR A REPLICAÇÃO DE HIV, E, USO DE UM COMPOSTO”

CAMPO DA INVENÇÃO São providos aqui compostos de fosfoindóis enanciomericamente puros, úteis para inibir replicação viral. Em certas formas de realização, são providos aqui compostos de S-fosfoindol puro, úteis para inibir replicação viral. Em certas formas de realização, são providos aqui compostos de fosfoindol-R úteis para inibir replicação viral. São ainda providos sais, derivativos e análogos dos compostos farmaceuticamente aceitáveis, composições farmacêuticas compreendendo os compostos e métodos de utilizar os compostos, por exemplo, no tratamento ou profilaxia de uma infecção por HIV, e processos para preparação dos compostos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Os indóis, nucleosídeos e seus análogos são conhecidos na arte como tndo utilidade no tratamento de infecções virais em mamíferos, incluindo humanos. Os vírus que infectam os mamíferos e são tratáveis pela administração de composições farmacêuticas compreendendo indóis, nucleosídeos ou seus análogos ou derivativos incluem mas não são limitados a hepacivírus HCV, vírus da imunodeficiência humana (HIV), pestivírus tais como vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus da febre suína clássica (CSFV, também conhecido como virus da cólera do porco) e vírus da doença de Border do carneiro (BDV) e flavivírus como vírus da febre hemorrágica da dengue (DHF ou DENV), vírus da febre amarela (YFV), virus do Nilo Ocidental (WNV), síndrome do choque e vírus da encefalite japonesa (Moennig et al., Adv. Vir. Res. 1992, 41 :53-98; Meyers, G. and Thiel, H-J., Adv. In Viral Res., 1996, 47:53-118; Moennig et al., Adv. Vir. Res. 1992, 41 :53-98; S.B. Halstead, Rev. Infect. Dis., 1984, 6:251-64; S.B. Halstead, Science, 1988, 239:476-81; T.P. Monath, New Engl. J. Med., 1988, 319:641- 3)·

Indóis

Certos análogos do indol e derivativos têm sido usados para

tratar infecção com vírus da imunodeficiência humana (HIV).

Por exemplo, Williams et al. mostra indóis substituídos para o

tratamento de infecção por HIV na Patente U.S. No. 5.527.819 de Merck. Os

compostos descritos na patente ‘819 compreendem uma grande classe

representada genericamente pela seguinte extensa fórmula estrutural (III):

Y-R

(III)

IO em que as variáveis X, Y, Z, R e R6 são amplamente definidas

abranger cerca de uma centena de compostos. Na maioria dos exemplos mostrados, Y é SO2, Z é -C(O)NH2, e R uma fenila opcionalmente substituída.

A Patente U.S. No. 5,124,327 de Greenlee et al. e cedida à Merck & Co. descreve uma classe de compostos de sulfonilfenil indol opcionalmente substituídos. Estes compostos são alegadamente ativos como inibidores de transcriptase inversa e, portanto, úteis no tratamento de infecção por HIV e da AIDS.

A Patente U.S. No. 6.710.068 da Idenix Pharmaceuticals, Ltd., 20 descreve uma classe de fenilindóis que são substituídos por pelo menos dois componentes que não hidrogênio no anel fenila ou no anel benzila da função indol, ou em ambos os anéis. Os substituintes são geralmente contidos nas posições 3” e 5”, se localizados no anel fenila, e nas posições 4’ e 5'; 5' e 6' ou 5' e 7’, se localizados no anel benzila do componente indol. Vide também 25 Publicação PCT No. WO/02/083126. A Publicação PCT No. WO 2004/014364 de Idenix Pharmaceuticals descreve ainda outra classe de fenilindóis que exibem aumentada atividade anti-HIV. Como seus predecessores, estes compostos são substituídos por pelo menos dois componentes que não hidrogênio no anel 5 fenila ou no anel benzo da funcionalidade indol, ou em ambos os anéis. Além disso, estes compostos incorporam numerosos substituintes tendo uma funcionalidade carboxamida na posição-2 do grupo indol do composto, a composição mostrada na Fórmula (III) acima como “Z”.

A Idenix Pharmaceuticals descreve ainda outra classe de compostos de fenilindol, estes sendo fosfo-fenilindóis que são úteis no tratamento do HIV e/ou AIDS (US 2006/0074054 e WO 06/054182).

A Bristol Myers Squibb é o cessionário de numerosas patentes, pedidos de patente publicados e publicações PCT que descrevem vários indóis opcionalmente substituídos, azaindóis, piperazinas e pirrolidinas para o 15 tratamento de HIV e/ou AIDS. Vide Publicação de Patente No. 2004/0006090 de Kadow et al.; Publicação U.S. No. 2004/0063746 de Regueiro-Ren et al.; Publicação U.S. No. 2003/0096825 de Wang et al.; Publicação U.S. No. 2003/0236277 de Kadow et al.; e WO 03/068221 de Kadow et al.

O WO 01/02388 de SmithKline Beecham S.P.A descreve fenilindóis opcionalmente substituídos por um substituinte carbamila, que têm utilidade no tratamento de HIV, AIDS, osteoporose, cânceres e doença de Alzheimer.

Warner-Lambert Company descreve várias indol-tiazepinonas, oxazepinonas, diazepinonas, benzotiofenos, benzofuranos e indol-2- carboxamidas para o tratamento de HIV. (Vide U.S. 5.424.329 de Boschelli et al.; U.S. 5.565.446 de Boschelli et al.; U.S. 5.703.069 de Connor et al.; e WO 96/29077 de Warner-Lambert Company).

Shinogi & Co. descreve derivativos de indol opcionalmente substituídos, que são inibidores da integrase viral, úteis como medicamentos anti-HIV (Publicação U.S. No. 2002/0019434 de Fujishita et al.; a Patente U.S. No. 6,716,605 de Fujishita et al.; e a Patente U.S. No. 6.506.787 de Fujishita et al.)

A Patente U.S. No. 5.945.4409 de Kleinschroth et al. descreve uma classe de indolcarbazol amidas para o tratamento de uma variedade de doenças, incluindo o câncer, doenças virais (incluindo HIV), doenças cardíacas e vasculares, doenças broncopulmonares, distúrbios inflamatórios, doenças degenerativas do sistema nervoso central e outras doenças.

Gunasekera et al. na Patente U.S. No. 4.866.084 mostra certos compostos alcalóides de bisindol, que têm atividade antiviral e antitumor, incluindo HSV (vírus do herpes simples). A Patente U.S. No. 5.935.982 de Dykstra et al. relata uma diferente classe de bisindóis que têm utilidade específica versos infecções retrovirais e especialmente HIV.

Matsunaga et al., na Patente U.S. No. 5.852.011 (22 de dezembro de 1998) descreve uma classe de derivativos de indol substituídos por uma função heteroarila e uma função amida. Os compostos são ditos geralmente possuírem propriedades antitumor, antiviral e antimicrobiana.

Dykstra et al., na Patente U.S. No. 5,935,982, descreve uma classe de bis-indóis e especificamente propões seu uso para tratar infecções retrovirais e especialmente infecção por HIV.

Domagala et al., na Patente U.S. No. 5.929.114 (27 de julho de 1999) descreve uma classe de compostos de ariltio e bitiobisarilamida, incluindo derivativo de indol, que reportadamente tem atividade antibacteriana e antiviral.

Pevear et al., na Patente U.S. No. 5.830.894 (3 de novembro de 1998) descreve uma classe de derivativos de triazinoindol que reportadamente tem atividade anti-pestivírus, mais notavelmente atividade BVDV.

Os indóis têm sido usados no tratamento de doenças que não HIV. A Patente U.S. No. 5.981.525 de Farina et al. descreve um sistema complexo de indóis para uso no tratamento da osteoporose com base em sua capacidade em inibir osteoclasto H+-ATPase e, assim, reduzir a reabsorção óssea. A Patente U.S. No. 6.025.390 também de Farina et al., mostra outro grupo de derivativos de indol, denominados derivativos do ácido pentadienóico heteroaromáticos que também são úteis no tratamento da osteoporose. A Patente U.S. No. 5.489.685 de Houpis et al. descreve uma série de compostos que são ésteres do ácido furo (2,3-b) piridino carboxílico, cuja utilidade é no tratamento do HIV.

À luz do fato de que as infecções HIV alcançaram níveis epidêmicos mundialmente e têm efeitos trágicos no hospedeiro infectado, permanece uma forte necessidade de proverem-se novos e eficazes agentes farmacêuticos para tratar estas infecções virais com baixa toxicidade para o hospedeiro.

E um objetivo da invenção prover compostos, métodos de uso e composições para o tratamento de um hospedeiro infectado com HIV ou para o tratamento de sintomas relacionados com a AIDS.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Portanto, são fornecidos aqui compostos enanciomericamente puros, úteis para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral, por exemplo, uma infecção por HIV em um hospedeiro em necessidade dele. Providos ainda são composições farmacêuticas compreendendo os compostos, métodos de utilizar os compostos para o tratamento ou profilaxia, e métodos de preparar os compostos.

Como demonstrado nos exemplos abaixo, muita da atividade dos compostos de fosfoindol quirais reside em um enanciômero ou estereoisômero. Além disso, certos compostos fornecidos aqui são inibidores potentes e seletivos do HIV resistente ao inibidor da transcriptase inversa e não-nucleosídeo (NNRTI) e tipo selvagem in vitro. Certos compostos providos aqui podem fornecer uma mais elevada barreira genética ao desenvolvimento da resistência do HIV, quando comparados com as atuais terapias, tais como efavirenz.

Em um aspecto, são fornecidos aqui compostos de S- fosfoindol puros e métodos de seu uso para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral, tal como uma infecção por HIV em um hospedeiro em necessidade dele.

Em um aspecto, são fornecidos aqui compostos de R- fosfoindol e métodos de seu uso para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral, tal como uma infecção por HIV em um hospedeiro em necessidade dele.

Em um aspecto, são providos aqui compostos de fosfoindol puros de acordo com a fórmula (A), ou seus sais, solvatos, hidratos, ésteres ou promedicamentos farmaceuticamente aceitáveis:

ou insubstituído e que pode compreender uma estrutura bicíclica, tricíclica ou espiro; C2_6 alquenila, C2-6 alquinila ou alquila;

carbonila, ou um resíduo amino ácido;

R1 é hidrogênio, acila, S(O)n-R, carboxila, carbonila, ou um

hidrogênio, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, arila, heterociclo, halogênio, CN,

15

20

Y é hidrogênio, R, O-R, NH-R, ou NRR;

Z é OR, NHR, NRR, carboxamido, amido, carboxila,

resíduo amino ácido; cada um de R4, R5, R6 e R7’ é independentemente CF3, OR, NHR, NRR, ou NO2; n é 0, I ou 2; e cada R é independentemente hidrogênio, alquila, C2-6 alquenila, C2.6 alquinila, arila, ou heterociclo.

Em certas formas de realização, de acordo com a fórmula (A), X é arila ou heterociclo; C2-6 alquenila, C2.6 alquinila ou alquila; e Y é hidrogênio, R, O-R, NH-R, ou NRR.

Em outro aspecto, são providos aqui compostos de fosfoindol puros de acordo com a fórmula (B), ou seus sais, solvatos, hidratos, ésteres ou promedicamentos farmaceuticamente aceitáveis:

(B)

em que, p. ex. :

X é hidrogênio; arila ou heterociclo, que pode ser substituído

ou insubstituído e que pode compreender uma estrutura bicíclica, tricíclica ou espiro; C2.6 alquenila, C2.6 alquinila ou alquila;

Y é hidrogênio, R, O-R, NH-R, ou NRR;

Z é OR, NHR, NRR, carboxamido, amido, carboxila, carbonila, ou um resíduo amino ácido;

R1 é hidrogênio, acila, S(O)n-R, carboxila, carbonila, ou um resíduo amino ácido;

cada um de R4’, R5’, R6’ e R7 é independentemente hidrogênio, C2.6 alquenila, C2_6 alquinila, arila, heterociclo, halogênio, CN, CF3, OR, NHR, NRR, ou NO2;

n é 0, 1 ou 2; e

cada R é independentemente hidrogênio, alquila, C2.6 alquenila, C2_6 alquinila, arila, ou heterociclo.

Em certas formas de realização, de acordo com a fórmula (B), X é arila ou heterociclo; C2.6 alquenila, C2_6 alquinila ou alquila; e Y é hidrogênio, R, O-R, NH-R, ou NRR.

Em outro aspecto, são providos aqui sais, solvatos, hidratos, ésteres e promedicamentos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos.

Em outro aspecto, são providas composição farmacêutica compreendendo um composto fornecido aqui e um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

Em outro aspecto, são providos aqui métodos de tratar ou evitar uma infecção por HIV em um hospedeiro em necessidade, pela administração de um composto ou composição farmacêutica descrito aqui.

Em outro aspecto, são providos aqui métodos de oralmente administrar um composto de Fórmula (A) ou fórmula (B) para terapia ou para tratamento. Como mostrado nos exemplos abaixo, certos compostos de fórmula (A) são oralmente biodisponíveis com farmacocinéticas favoráveis.

Em outro aspecto, são providos aqui métodos de inibir um citocromo P450. Como mostrado nos exemplos abaixo, certos compostos descritos aqui são eficazes para inibir um ou mais citocromos P450, incluindo citocromo P450 3A4, citocromo P450 2C8 e citocromo P450 2C9. Portanto, são providos aqui métodos de utilizar os compostos providos aqui para inibir um citocromo P450. Os métodos compreendem a etapa de contatar um citocromo P450 com uma quantidade de um composto descrito aqui, tal como um composto de fórmula (A), eficaz para inibir o citocromo P450.

Em outro aspecto, são providos aqui métodos de modular as farmacocinéticas de um medicamento que seja metabolizado por um citocromo P450. Os métodos compreendem a etapa de administrar o medicamento em combinação ou altemação com um composto aqui descrito. O medicamento pode ser qualquer molécula farmaceuticamente aceitável, conhecida daqueles hábeis na arte, a ser metabolizada por um citocromo P450. Em certas formas de realização, o citocromo P450 é citocromo P450 3Α4, citocromo P450 3A4, citocromo P450 2C8 ou citocromo P450 2C9. Os compostos providos aqui podem ser administrados sozinhos ou em combinação ou altemação com um ou mais de outros agentes anti-virais. Os compostos ou suas composições também podem ser usados profilaticamente para evitar ou retardar a progressão de doenças clínicas em indivíduos que carregam um anticorpo anti-HIV,que são positivas do antígeno-HIV ou que foram expostos a um vírus HIV.

Em outro aspecto, são providos composições e métodos para o tratamento de um hospedeiro coinfectado com HIV e hepatite B, compreendendo administrar um composto puro descrito aqui, em combinação com um ou mais agentes eficazes para o tratamento de infecção por hepatite B. Em outro aspecto, são providos composições e métodos para o tratamento de um hospedeiro coinfectado com HIV e hepatite C, compreendendo administrar um composto puro descrito aqui, em combinação com um ou mais agentes eficazes para o tratamento de infecção por hepatite C.

Em outro aspecto, são providos processos para a preparação dos compostos descritos aqui, incluindo compostos de fosfoindol enanciomericamente puros, compostos de fosfoindol-S puros, compostos de fosfoindol-R puros, compostos puros de acordo com a fórmula (A) e compostos puros de acordo com a Fórmula (B).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura IA mostra uma estrutura de cristal de Transcriptase Inversa HIV K103N/Y181C, com o composto de 3-fosfoindol de fórmula 1.

A Figura IB mostra um esquemático da estrutura de cristal da Transcriptase Inversa HIV K103N/Y181C, com o composto de 3-fosfoindol de Fórmula I.

A Figura 2A mostra uma estrutura de cristal de uma molécula do Composto III.

A Figura 2B mostra uma estrutura de cristal de uma molécula do Composto III. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

São providas composições de matéria, métodos de uso e composições farmacêuticas para o tratamento de infecções por vírus, particularmente infecções por HIV, em mamíferos. Em particular, são providos compostos de 3-fosfoindol puros, composições compreendendo estes compostos e métodos de uso dos compostos e composições, para o tratamenteo ou profilaxia de uma infecção incluindo uma infecção por HIV em um hospedeiro. Além disso, são fornecidos aqui processos para a preparação de 3-fosfoindóis puros.

Definições

Como aqui usado, o termo “puro”, quando aplicado a um composto quiral, refere-se a um enanciômero do composto quiral substancialmente livre de seu enanciômero oposto (isto é, em excesso enantiomérico). Por exemplo, a forma “R” pura de um composto é substancialmente livre da forma “S” do composto e está, assim, em excesso enantiomérico da forma “S”. O termo “enanciomericamente puro” ou “enanciômero puro” indica que o composto compreende um excesso de um enanciômero, p. ex., mais do que 75 % em peso, mais do que 80 % em peso, mais do que 85 % em peso, mais do que 90 % em peso, mais do que 91 % em peso, mais do que 92 % em peso, mais do que 93 % em peso, mais do que 94 % em peso, mais do que 95 % em peso, mais do que 96 % em peso, mais do que 97 % em peso, mais do que 98 % em peso, mais do que 98,5 % em peso, mais do que 99 % em peso, mais do que 99,2 % em peso, mais do que 99,5 % em peso, mais do que 99,6 % em peso, mais do que 99,7 % em peso, mais do que 99,8 % em peso ou mais do que 99,9 % em peso, do enanciômero. Em certas formas de realização, os pesos são baseados no peso total do composto, isto é, todos os enanciômeros do composto. Em certas formas de realização, um enanciômero pode ser em excesso de 30-80 %, ou de 30-70 %, 30-60 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % ou 60 %, ou qualquer percentagem intermediária.

Como aqui usado e a menos que de outro modo indicado, a expressão “fosfoindol-(S) enanciomericamente puro” ou “fosfoindol-(S)” 5 refere-se, p. ex., a pelo menos cerca de 80 % em peso de fosfoindol-(S) e no máximo cerca de 20 % em peso de fosfoindol-(R), pelo menos cerca de 90 % em peso de fosfoindol-(S) e no máximo cerca de 10 % em peso de fosfoindol- (R), pelo menos cerca de 95 % em peso de fosfoindol-(S) e no máximo cerca de 5 % em peso de fosfoindol-(R), pelo menos cerca de 99 % em peso de 10 fosfoindol-(S) e no máximo cerca de 1 % em peso de fosfoindol-(R) ou pelo menos cerca de 99,9 % em peso de fosfoindol-(S) e no máximo cerca de 0,1 % em peso de fosfoindol-(R). Em certas formas de realização, os pesos são baseados no peso total do composto, i.e. ambos ou todos os enanciômeros do composto.

Como usado aqui e a menos que de outro modo indicado, a

expressão "fosfoindol-(R) enanciomericamente puro" refere-se, p. ex., a pelo menos cerca de 80 % em peso de fosfoindol-(R) e no máximo cerca de 20 % em peso de fosfoindol-(S), pelo menos cerca de 90 % em peso de fosfoindol- (R) e no máximo cerca de 10 % em peso de fosfoindol-(S), pelo menos cerca 20 de 95 % em peso de fosfoindol-(R) e no máximo cerca de 5 % em peso de fosfoindol-(S), pelo menos cerca de 99 % em peso de fosfoindol-(R) e no máximo cerca de 1 % em peso de fosfoindol-(S), pelo menos cerca de 99,9 % em peso de fosfoindol-(R) ou no máximo cerca de 0,1 % em peso de fosfoindol-(S). Em certas formas de realização, os pesos são baseados no peso 25 total do fosfoindol, isto é, ambos ou todos os enanciômeros do fosfoindol.

Nas composições providas aqui, fosfoindol enanciomericamente puro ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável pode estar presente com outros ingredientes ativos ou inativos. Por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo fosfoindol-(S) enanciomericamente puro pode compreender, por exemplo, cerca de 90 % de excipiente e cerca de 10 % de fosfoindol-(S) enanciomericamente puro. Em certas formas de realização, o fosfoindol-(S) enanciomericamente puro em tais composições pode, por exemplo, 5 compreender, pelo menos cerca de 99,9 % em peso de fosfoindol-(S) e no máximo cerca de 0,1 % em peso de fosfoindol-(R). Em certas formas de realização, o ingrediente ativo pode ser formulado com pouco ou nenhum veículo, excipiente ou diluente.

Sempre que uma faixa é referida aqui, ela inclui independente 10 e separadamente cada membro da faixa. Como um exemplo não limitativo, a expressão “Cmo alquila” é considerada incluir, independentemente, cada membro do grupo, de modo que, por exemplo, Cmo alquila inclui reta ou ramificada e, onde apropriado, funcionalidades C], C2, C3, C4, C5, Ce, C7, Cs, C9 e Cio alquila. Similarmente, como outro exemplo não-limitativo, 1-10 % 15 inclui independentemente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % e 10 %, bem como faixas intermediárias, tais como 1 -2 %, 2-3 %, etc.

O termo “quiral” como aqui usado inclui um composto que tem a propriedade de não ser sobreposto em sua imagem espelho.

O termo “isolado” inclui uma composição que inclui pelo menos 85 ou 90 % em peso, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % em peso do composto.

O termo “alquila” como aqui usado, a menos que de outro modo especificado, inclui um hidrocarboneto saturado, de cadeia reta, ramificada ou cíclica, primário, secundário ou terciário de tipicamente CMO e 25 especificamente inclui mas não é limitado a metila, CF3, CCl3, CFCl2, CF2Cl, etila, CH2CF3, CF2CF3, propila, isopropila, ciclopropila, butila, isobutila, sec- butila, t-butila, pentila, ciclopentila, isopentila, neopentila, hexila, isoexila, cicloexila, cicloexilmetila, 3-metilpentila, 2,2-dimetilbutila, e 2,3- dimetilbutila. O termo inclui grupos alquila tanto substituídos como insubstituídos e, particularmente, inclui grupos alquila halogenados e mesmo mais particularmente, grupos alquila fluorados. Exemplos não limitativos de componentes com que o grupo alquila pode ser substituído são selecionados do grupo consistindo de halogênio (fluoro, cloro, bromo ou iodo), hidroxila, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, desprotegido ou protegido como necessário, como sabido daqueles hábeis na arte, por exemplo, como mostrado por Greene et al., Protected Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 2a. Ed., 1991.

A expressão "alquila inferior" como aqui usado e a menos que de outro modo especificado, refere-se a um grupo Ci.6 alquila saturado, reto, ramificado ou, se apropriado, cíclico (por exemplo, ciclopropila) e componentes insubstituídos.

Os termos "alquilamino” ou "arilamino" referem-se a um grupo amino que tem um ou dois substituintes alquila ou arila, respectivamente. A menos que de outro modo especificamente citado neste pedido, quando alquila for um componente adequado, então é uma alquila inferior, quer substituída ou insubstituída.

Como aqui usado, o termo “nitro” significa -NO2; o termo “sulfidrila” significa -SH; e o termo “sulfonila” significa -SO2.

Os termos “alquenila” e “alquinila” incluem componentes alquila, incluindo formas tanto substituídas como insubstituídas, em que pelo menos uma ligação C-C saturada é substituída por uma dupla ou tripla ligação. Assim, C2.6 alquenila pode ser vinila, allila, 1-propenila, 2-propenila, 1-butenila, 2-butenila, 3-butenila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-pentenila, 4- pentenila, 1-hexenila, 2- hexenila, 3-hexenila, 4-hexenila, ou 5-hexenila. Similarmente, C2.6 alquinila pode ser etinila, 1- propinila, 2-propinila, 1- butinila, 2-butinila, 3-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-pentinila, 4- pentinila, 1-hexinila, 2-hexinila, 3-hexinila, 4-hexinila, ou 5-hexinila. O termo “alquileno” inclui um radical alquila divalente, saturado, de cadeia reta, de fórmula -(CH2)n-, em que "n" pode ser qualquer número inteiro de 1 a 10,

"Alquila", "alcóxi", "alquenila", "alquinila", etc., incluem grupos tanto de cadeia reta como ramificada. Entretanto, referência a um radical individual tal como “propila” abrange somente aquele radical de cadeia reta, enquanto que um isômero de cadeia ramificada, tal como “isopropila”.

O termo “protegido” como aqui usado e a menos que de outro modo definido refere-se a um grupo que é adicionado a um átomo de oxigênio, nitrogênio, enxofre ou fósforo, para evitar sua reação adicional ou para outras finalidades. Uma larga variedade de oxigênio, nitrogênio, enxofre ou grupos de proteção de fósforo é conhecida daqueles hábeis na arte de síntese orgânica.

O termo “arila” como aqui usado e, a menos que de outro modo especificado, refere-se a qualquer anel de carbono estável monocíclico, bicíclico ou tricíclico de até 8 membros em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático como definido pela regra Huckel 4n+2 e especialmente fenila, bifenila ou naftila. O termo inclui componentes tanto substituídos como insubstituídos. O grupo arila pode ser substituído por qualquer componente descrito, incluindo mas não limitado a um ou mais componentes selecionados do grupo consistindo de halogênio (fluór, cloro, bromo ou iodo), hidroxila, amino, azido, alquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, protegido ou não protegido como necessário, como sabido por aqueles hábeis na arte, por exemplo, como ensinado em Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 3a. Ed., 1999.

O termo “alcarila” ou “alquilarila” refere-se a um grupo alquila com um substituinte arila ou um grupo alquila ligado à molécula através de um grupo arila como definido aqui. O termo “aralquila” ou “arilalquila” refere-se a um grupo arila substituído por um substituinte alquila ou ligado à molécula através de um grupo alquila como definido acima.

O termo “cicloalquila” inclui um anel de C3.8, incluindo mas não limitado a ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, cicloeptila e ciclooctila.

O termo "alcóxi" significa um grupo alquila de cadeia reta ou ramificada, tendo um radical oxigênio ligado, o grupo alquila tendo o número de carbonos especificado ou qualquer número dentro desta faixa. Por exemplo, uma "-O-alquila", Cm alcóxi, metóxi, etc.

O termo “halo” como aqui usado refere-se a qualquer membro da família halogênio. Especificamente incluídos estão fluoro, cloro, bromo e iodo.

O termo “acila” ou “éster ligado-O” inclui um grupo de fórmula C(O)R', em que R' é uma alquila, reta, ramificada ou cíclica (incluindo alquila inferior), resíduo carboxilato de um amino ácido, arila incluindo fenila, heteroarila, alcarila, aralquila incluindo benzila, alcoxialquila incluindo metoximetila, ariloxialquila tal como fenoximetila; ou alquila substituída (incluindo alquila inferior), arila incluindo fenila opcionalmente substituída por cloro, bromo, fluoro, iodo, Ci a C4 alquila ou Ci a C4 alcóxi, ésteres de sulfonato tais como alquil ou aralquil sulfonila incluindo metanossulfonila, o mono, di ou trifosfato éster, tritila ou monometóxi-tritila, substituídas benzila, alcarila, aralquila incluindo benzila, alcoxialquila incluindo metoximetila, ariloxialquila tais como fenoximetila. Grupos arila dos éteres otimamente compreendem um grupo fenila. Em formas de realização não limitativas, grupos acila incluem acetila, trifluoroacetila, metilacetila, ciclopropilacetila, ciclopropil-carbóxi, propionila, butirila, isobutirila, hexanoíla, heptanoiloctanoíla, neo-heptanoíla, fenilacetila, 2- acetóxi-2-fenilacetila, difenilacetila, a-metóxi-a-trifluorometil-fenilacetila, bromoacetila, 2-nitro-benzenoacetila, 4-cloro-benzenoacetila, 2-cloro-2,2- difenilacetila, 2-cloro-2- fenilacetila, trimetilacetila, clorodifluoroacetila, perfluoroacetila, fluoroacetila, bromodifluoroacetila, metoxiacetila, 2- tiofenoacetila, clorosulfonilacetila, 3-metoxifenilacetila, fenoxiacetila, terc- butilacetila, tricloroacetila, monocloro-acetila, dicloroacetila, 7H- dodecafluoro-heptanoíla, perfluoro-heptanoíla, 7H-dodeca-fluoroeptanoíla, 7- clorododecafluoro-heptanoíla, 7-cloro-dodecafluoro-heptanoíla, 7H- dodecafluoroeptanoíla, 7H-dodeca-fluoroeptanoíla, nona-fluoro-3,6-dioxa- heptanoíla, nonafluoro-3,6-dioxaeptanoíia, perfluoroeptanoíla,

metoxibenzoila, metil 3-amino-5-feniltiofeno-2-carboxila, 3,6-dicloro-2- metóxi-benzoíla, 4-( 1,1,2,2-tetrafluoro-etóxi)-benzoíla, 2-bromo-propionila, ômega-aminocaprila, decanoíla, n-pentadecanoíla, estearila, 3-ciclopentil- propionila, 1-benzeno-carboxila, O-acetilmandelila, pivaloíla acetila, 1- adamantano-carboxila, cicloexano-carboxila, 2,6-piridinodicarboxila, ciclopropano-carboxila, ciclobutano-carboxila, perfluorocicloexil carboxila, 4-metilbenzoíla, clorometil isoxazolila carbonila, perfluorocicloexila carboxila, crotonila, 1-metil-1H-indazol-3-carbonila, 2-propenila, isovalerila,

1 -pirrolidinocarbonila, 4-fenilbenzoíla.

O termo “arilamino” inclui um grupo tendo uma estrutura de "-N(R')-C(=0)-R' ", em que cada R1 é independentemente como definido acima.

O termo “carbonila” inclui um grupo de estrutura "-C(=0)-X- R' " ou "X-C(=0)-R' ", em que X é O, S, ou uma ligação, e cada R é independentemente como definido acima.

O termo "heteroátomo" inclui um átomo que não carbono ou hidrogênio na estrutura de um composto heterocíclico, exemplos não limitativos dos quais são nitrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo ou boro.

O termo "heterociclo" ou "heterocíclico" como aqui usado, exceto onde citado, inclui um anel heterocíclico, monocíclico de 5 a 7 membros, estável, ou bicíclico de 8 a 11 membros, estável, que é saturado ou insaturado, incluindo heteroarila, e que consiste de átomo(s) de carbono e de um a quatro heteroátomos, incluindo mas não limitado a O, S, N e P; e em que os heteroátomos nitrogênio e enxofre pode opcionalmente ser oxidados e/ou o heteroátomos de nitrogênio quatemizado e incluindo qualquer grupo bicíclico em que qualquer dos anéis heterocíclicos acima identificados é fundido a um anel benzeno. O anel heterocíclico pode ser ligado a qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulte na criação de uma estrutura estável. O anel heteroaromático pode ser parcial ou totalmente hidrogenado, como desejado. Por exemplo, diidropiridina pode ser usada em lugar da piridina. Grupos oxigênio e nitrogênio funcionais em uma heteroarila podem ser protegidos como necessário ou desejado. Grupos de proteção adequados para oxigênio ou nitrogênio incluem trimetilsilila, dimetilexilsilila, t- butildimetilsilila, t-butildifenilsilila, tritila, substituídas tritila, alquila, metanossulfonila, p-toluenosulfonila, ou grupos acila tais como acetila e propionila.

Exemplos não limitativos de grupos heteroarila e heterocíclicos incluem furila, piridila, pirimidila, piridazinila, pirazinila, piperidinila, piperazinila, tienila, pirrolila, pirrolinila, pirrolidinila, imidazolila, tetrazolila, triazolila, triazinila, tiazinila, oxazolila, purinila, carbazolila, quinolinila, pirazolila, morfolinila, benzimidazolila, e similares. Qualquer um dos componentes heteroaromáticos e heterocíclicos pode opcionalmente substituir como descrito acima arila, incluindo substituição(ões) com um ou mais de hidroxila, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, alquila, heterociclila, halo, carbóxi, acila, acilóxi, amido, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, protegido ou não protegido como necessário, como sabido por aqueles hábeis na arte e como ensinado, por exemplo, em Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley e Sons, Terceira Ed., O termo "amino" como aqui usado a menos que de outro modo especificado, inclui um componente representado pela estrutura "-NR2", e inclui aminas primárias, secundárias e terciárias, opcionalmente substituídas por grupos alquila, arila, heterociclila, e/ou sulfonila. Assim R2 pode representar dois átomos de hidrogênio, dois componentes alquila ou um componente hidrogênio e um alquila.

O termo “amino ácido” ou “resíduo amino ácido” inclui α, β, γ, ou δ amino ácidos naturalmente ocorrentes e sintéticos e inclui mas não é limitado a amino ácidos encontrados em proteínas, isto é, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidino. Em uma forma de realização, o amino ácido é na configuração-L, mas pode também ser usado na configuração-D. Alternativamente, o amino ácido pode ser um derivativo de alanila, valinila, leucinila, isoleucinila, prolinila, fenilalaninila, triptofanila, metioninila, glicinila, serinila, treoninila, cisteinila, tirosinila, asparaginila, glutaminila, aspartoíla, glutaroíla, lisinila, argininila, histidinila, β-alanila, β-valinila, β- leucinila, β-isoleucinila, β-prolinila, β-fenilalaninila, β-triptofanila, β- metioninila, β-glicinila, β-serinila, β-treoninila, β-cisteinila, β-tirosinila, β- asparaginila, β-glutaminila, β-aspartoíla, β-glutaroíla, β-lisinila, β-argininila ou β-histidinila. Quando o termo amino ácido é usado, é considerado ser uma descrição específica e independente de cada um dos ésteres de α, β, γ, ou δ glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, pralina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina, e histidino nas configurações-D e L.

O termo "amido" como aqui usado inclui uma carbonila amino-substituída, enquanto o termo “amidino” significa um grupo tendo a estrutura "-C(=NH)-NH2". Certos termos contendo enxofre e fósforo têm os seguintes significados estruturais: "sulfonato" inclui um grupo de estrutura "- S(=0)(=0)-0R’ "sulfato" inclui um grupo de estrutura "0-S(=0)(=0)-0R’ "sulfonamida" inclui um grupo de estrutura "N(R')-S(=0)(=0)-R' "; "sulfamoila" inclui um grupo de estrutura "-S(=0)(=0)-N(R')(R')"; "fosforila" inclui um grupo de estrutura "-P(=0)-0R’ "; e "fosforoamidato" inclui um grupo de estrutura “Q-P(NRiR2)(=0)-0R’ ", em que cada, R' é independentemente como definido acima.

O termo "hospedeiro", como aqui usado, refere-se a um organismo unicelular ou multicelular em que o vírus pode replicar-se, incluindo linhagens de célula e animais e, em certos exemplos, um humano. Alternativamente, o hospedeiro pode conter uma parte do genoma viral HIV, cuja replicação ou fusão pode ser alterada pelos compostos da presente invenção. O termo hospedeiro especificamente refere-se a células infectadas, células transfectadas com todo ou parte do genoma HIV e animais, em particular, primatas (incluindo chimpanzés) e humanos. Na maioria das aplicações animais da presente invenção, o hospedeiro é um paciente humano. Aplicações veterinárias, em certas indicações, entretanto, são claramente abrangidas pelas formas de realização da presente invenção (tais como chimpanzés).

O termo “substituído” inclui múltiplos graus de substituição por um ou mais dos substituintes citados, tais como, por exemplo, halo, hidroxila, tio, alquila, alquenila, alquinila, nitro, ciano, azido, amino, carboxamido, etc. Onde múltiplas possibilidades de substituinte existirem, o composto pode ser substituído por um ou mais dos grupos substituintes descritos ou reivindicados, independentemente entre si e tomados sozinhos ou pluralmente.

Compostos

Em certas formas de realização, desde que aqui estejam compostos puros de acordo com a fórmula (A), ou seus sais, solvatos, hidratos, ésteres ou promedicamentos farmaceuticamente aceitáveis:

(A)

em que, p. ex. :

X é hidrogênio; arila ou heterociclo, que pode ser substituído ou insubstituído e que pode compreender uma estrutura bicíclica, tricíclica ou espiro; C2_6 alquenila, C2-6 alquinila ou alquila;

Y é hidrogênio, R, O-R, NH-R, ou NRR;

R1 é hidrogênio, acila, S(O)n-R, carboxila, carbonila, ou um

resíduo amino ácido;

cada um de R4R5’, R6’ e R7’ é independentemente hidrogênio, C2_6 alquenila, C2.6 alquinila, arila, heterociclo, halogênio, CN, CF3, OR, NHR, NRR, ou NO2;

n é 0, 1 ou 2; e

cada R é independentemente hidrogênio, alquila, C2_6 alquenila, C2_6 alquinila, arila, ou heterociclo.

Em certas formas de realização, de acordo com a fórmula (A), X é arila ou heterociclo; C2_6 alquenila, C2_6 alquinila ou alquila; e Y é hidrogênio, R, O-R, NH-R, ou NRR.

Em certas formas de realização, de acordo com a fórmula (A), R4’ e R5’ são independentemente hidrogênio ou halogênio e X, Y, Z, R1, R6’,

•y

R ’ e R são como definidos acima.

Em certas formas de realização, de acordo com a fórmula (A): cada um de R4’ e R5’ é independentemente hidrogênio ou halogênio;

R6’ e R7' are hidrogênio;

R1 é hidrogênio ou S(O)n-R;

Y é hidrogênio, R, ou O-R;

X é arila opcionalmente substituída;

Z é carboxamido, amido, carboxila, ou carbonila; n é 0, 1 ou 2; e cada R é independentemente hidrogênio ou

alquila

Em certas formas de realização, são providos aqui compostos puros de acordo com a fórmula (C), ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável:

(C)

em que R2”, R3”, R4”, R5” e R6” são independentemente hidrogênio, halogênio, alquila, ou C2.e alquenila;

R4’ e R5’ é independentemente hidrogênio ou halogênio; R6’ e R7' são hidrogênio;

R1 é hidrogênio ou S(O)n-R;

Y é hidrogênio, R, ou O-R;

Z é carboxamido, amido, carboxila, ou carbonila; n é 0, 1 ou 2; e

cada R é independentemente hidrogênio ou alquila.

Em certas formas de realização of formula (C): R3” e R5” são independentemente alquila ou C2-6 alquenila cada uma das quais independentemente pode opcionalmente ser substituído por CN ou halogênio;

R2 , R4 e R6" são hidrogênio;

cada um de R4 ’ e R5 ’ é independentemente hidrogênio ou

halogênio;

R6 e R7 são hidrogênio;

R1 é hidrogênio ou S(O)n-R;

Y é hidrogênio, R, ou O-R;

Z é carboxamido, amido, carboxila, ou carbonila; n é 0, 1 ou 2;

e

cada R é independentemente hidrogênio ou alquila.

Em uma forma de realização, desde que seja um composto puro, ou seus sais, solvatos, hidratos, ésteres ou promedicamentos farmaceuticamente aceitáveis:

(0

em que a configuração absoluta no átomo de fósforo é S. O nome químico do Composto I é metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4- fluoro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico e a fórmula empírica é is C2Ohi6CIFN3OsP com um peso molecular de 431,39.

Em uma forma de realização, desde que seja um composto puro, ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável: (EU) em que a configuração absoluta no átomo de fósforo é S. O nome químico do composto III é metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro- lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico, e a fórmula empírica é C20H17CIN3O3P com um peso molecular de 413,79.

Em uma forma de realização, desde que seja um composto

puro selecionado do grupo consistindo de:

metil éster do ácido (2-carbamoil-5-cloro-lH-indol-3-il)-[3- ((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico; e

metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol-3- il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável.

Em certas formas de realização, são providos aqui compostos puros de acordo com a fórmula (B), ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável:

R4’ Y,,x P=O R5x z R6" Rr R1 (B)

em que, p. ex. :

X é hidrogênio; arila ou heterociclo, que pode ser substituído ou insubstituído e que pode compreender uma estrutura bicíclica, tricíclica ou espiro; C2-6 alquenila, C2-e alquinila ou alquila; Y é hidrogênio, R, O-R, NH-R, ou NRR; Z é OR, NHR, NRR, carboxamido, amido, carboxila, carbonila, ou um resíduo amino ácido;

R1 é hidrogênio, acila, S(O)n-R, carboxila, carbonila, ou um resíduo amino ácido; cada um de R4’, R5’, R6’ e R7 ’ é independentemente hidrogênio, C2-6 alquenila, C2_6 alquinila, arila, heterociclo, halogênio, CN, CF3, OR, NHR, NRR, ou NO2;

n é 0, 1 ou 2; e

cada R é independentemente hidrogênio, alquila, C2.6 alquenila, C2.6 alquinila, arila, ou heterociclo.

Em certas formas de realização, de acordo com a fórmula (B), X é hidrogênio; arila ou heterociclo; C2.6 alquenila, C2.6 alquinila ou alquila; e Y é hidrogênio, R, O-R, NH-R, ou NRR.

Em certas formas de realização, de acordo com a fórmula (B), R4 ’ e R5 ’ são independentemente hidrogênio ou halogênio e X, Y, Z, R1, R6 , R7 e R são como definidos acima.

Em certas formas de realização, de acordo com a fórmula (B),

R4’ e R5’ são, cada um independentemente, hidrogênio ou

halogênio;

6* T

R0 eR' são hidrogênio;

R1 é hidrogênio ou S(O)n-R;

Y é hidrogênio, R, ou O-R;

Z é carboxamido, amido, carboxila, ou carbonila;

n é 0, 1 ou 2; e

cada R é independentemente hidrogênio ou alquila.

Em certas formas de realização, são providos aqui compostos puros de acordo com a fórmula (D), ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável: em que R2’, R3’, R4’, R5’ e R6’ são independentemente hidrogênio, halogênio, alquila, ou C2-6 alquenila;

R4’ e R5’ são independentemente hidrogênio ou halogênio;

R6 e R7 são hidrogênio;

R1 é hidrogênio ou S(O)n-R;

Y é hidrogênio, R, ou O-R;

Z é carboxamido, amido, carboxila, ou carbonila; n é 0, 1 ou 2; e

cada R é independentemente hidrogênio ou alquila.

Em certas formas de realização of formula (D):

3»

R e R são independentemente alquila ou C2-6 alquenila que pode ser opcionalmente substituída por CN ou halogênio;

R2, R4 e R6" são hidrogênio;

cada um de R4 ’ e R5 é independentemente hidrogênio ou

halogênio;

R6’ e R7' são hidrogênio;

R1 é hidrogênio ou S(O)n-R;

Y é hidrogênio, R, ou O-R;

Z é carboxamido, amido, carboxila, ou carbonila; n é 0, 1 ou 2; e

cada R é independentemente hidrogênio ou alquila.

Em certas formas de realização of formula (D):

3 í y

Rj e R são independentemente alquila ou C2-6 alquenila que pode ser opcionalmente substituída por CN ou halogênio; R2”, R4” e R6 são hidrogênio; cada um de

R4 e R5 é independentemente hidrogênio ou halogênio;

R6’ e R7 são hidrogênio;

R1 é hidrogênio;

Y é O-R;

Z é amido, carboxila, ou carbonila; e

cada R é independentemente hidrogênio ou alquila.

Em uma forma de realização, desde que seja um composto puro, ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável:

ÇH3

(Π)

em que a configuração absoluta no átomo de fósforo é R.

ÇH3

(IV)

em que a configuração absoluta no átomo de fósforo é R.

Em uma forma de realização, desde que seja um composto puro selecionado do grupo consistindo de: metil éster do ácido (2-carbamoil-5-cloro-lH-indol-3-il)-[3- ((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(R)-fosfínico; e

metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol-3- il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(R)-fosfmico, ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável.

Em certas formas de realização, o composto de acordo com (A)-(D) ou (I)-(IV) é o composto enanciomericamente puro ou um seu sal, solvato, hidrato, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização, o composto de acordo com (A)-(D) ou (I)-(IV) é o composto enanciomericamente puro ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização, o composto enanciomericamente puro compreende pelo menos cerca de 80 % em peso do enanciômero designado e no máximo cerca de 20 % em peso de do outro enanciômero ou outro estereoisômero(s), pelo menos cerca de 90 % em peso do enanciômero designado e no máximo cerca de 10 % em peso do outro enanciômero ou outro(s) estereoisômero(s), pelo menos cerca de 95 % em peso do enanciômero designado e no máximo cerca de 5 % em peso do outro enanciômero ou outro estereoisômero(s), pelo menos cerca de 96,6 % em peso do enanciômero designado e no máximo cerca de 3,4 % em peso do outro enanciômero ou outro estereoisômero(s), pelo menos cerca de 97 % em peso do enanciômero designado e no máximo cerca de 3 % em peso do outro enanciômero ou outro estereoisômero(s), pelo menos cerca de 99 % em peso do enanciômero designado e no máximo cerca de 1 % em peso do outro enanciômero ou outro estereoisômero(s), ou pelo menos cerca de 99,9 % em peso do enanciômero designado e no máximo cerca de 0,1 % em peso do outro enanciômero ou outro estereoisômero(s). Em certas formas de realização, os pesos são baseados no peso total do composto.

São também providos compostos que podem ser fornecidos como um sal, éster ou promedicamento que, na administração ao receptor, fornecem direta ou indiretamente um composto provido aqui ou que exibe a desejada própria atividade.

Sais, Promedicamentos, Estereoisômeros e Tautômeros Farmaceuticamente Aceitáveis

Um composto provido aqui pode ser administrado como qualquer sal ou promedicamento que, na administração ao receptor, seja capaz de prover direta ou indiretamente o composto precursor ou que exiba sua própria atividade. Exemplos não limitativos são sais farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis. A frase “sal ou promedicamento farmacêutica ou fisiologicamente aceitável” é usada por todo o relatório para descrever qualquer forma farmaceuticamente aceitável (tal como um éster, amida, sal de um éster, sal de uma amida ou grupo relacionado) de um composto que, na administração a um paciente, fornece um composto ativo da invenção. Modificações como estas podem afetar a atividade biológica do composto, em alguns casos aumentando a atividade através do composto precursor.

A expressão “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se ao estado de um composto em que o composto contém um contraíon que é farmaceuticamente aceitável e em que o sal retém a desejada atividade biológica dos compostos aqui identificados, enquanto exibindo mínimos efeitos toxicológicos indesejados. Tais sais são formas não tóxicas terapeuticamente úteis dos compostos da presente invenção. Qualquer sal que retenha a desejada atividade biológica dos compostos contidos aqui e que exiba efeitos toxicológicos mínimos ou não indesejados é pretendido para inclusão aqui. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos e bases orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os ácidos e bases não farmaceuticamente aceitáveis também encontram uso aqui, como por exemplo, na síntese e/ou purificação dos compostos de interesse. Assim, todos os “sais” são projetados para inclusão aqui.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de bases e ácidos inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitáveis e incluem tosilato, metanossulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, alfacetoglutarato, alfa- glicerofosfato, formiato, fumarato, propionato, glicolato, lactato, piruvato, oxalato, maleato, salicilato, sulfato, sulfonato, nitrato, bicarbonato, hidrobromato, hidrobrometo, hidroiodeto, carbonato e sais de ácido fosfórico. Uma forma de realização particular é o sal mono ou dicloridreto. Sais adequados incluem aqueles derivados de metais alcalinos tais como potássio e sódio, metais alcalino terrosos, tais como cálcio e magnésio, entre numerosos outros ácidos bem conhecidos na arte farmacêutica. Promedicamentos farmaceuticamente aceitáveis refere-se a um composto que é metabolizado, por exemplo, hidrolisado ou oxidado, no hospedeiro para formar um composto da presente invenção. Exemplos típicos de promedicamentos incluem compostos que têm grupos de proteção biologicamente instáveis em um componente funcional do composto ativo, incluindo mas não limitado a um componente éster ou acila. Os promedicamentos incluem compostos que podem ser oxidados, reduzidos, aminados, desaminados, hidroxilado, desidroxilado, hidrolisado, desidrolisado, alquilado, desalquilado, acilado, desacilado, fosforilado, desfosforilado para produzir o composto ativo.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser obtidos utilizando-se procedimentos padrão bem conhecidos na arte, por exemplo, reagindo-se um composto suficientemente básico, tal como uma amina, com 25 um ácido adequado propiciando um ânion fisiologicamente aceitável. Sais de metal alcalino (tal como potássio, sódio ou lítio) ou metal alcalino terroso (tal como cálcio) de ácidos carboxílicos podem também ser produzidos.

Exemplos não limitativos de sais adequados incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido bicarbônico, ácido carbônico; e sais formados com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido malônico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido palmoico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido tósico, ácido metanossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido naftalenodissulfônico, ácido α-cetoglutárico, ácido α-glicerofosfórico e ácido poligalacturônico. Sais adequados incluem aqueles derivados de metais alcalinos, tais como lítio, potássio e sódio, de metais alcalino terrosos, tais como cálcio e magnésio, bem como de outras bases bem conhecidas daqueles hábeis na arte farmacêutica. Outros sais adequados incluem aqueles derivados de cátions metálicos tais como zinco, bismuto, bário ou alumínio ou com um cátion formado de uma amina, tal como amônia, Ν,Ν-dibenziletileno-diamina, D-glicosamina, tetraetilamônio ou etilenodiamina. Além disso, os sais adequados incluem aqueles derivados de uma combinação de ácidos e bases, tais como, por exemplo, um sal de tanato de zinco.

Um promedicamento farmaceuticamente aceitável refere-se a um composto que é metabolizado (isto é, hidrolisado ou oxidado, por exemplo) no hospedeiro para formar um composto da presente invenção. Exemplos típicos de promedicamentos incluem compostos que têm grupos de proteção biologicamente instáveis em um componente funcional do composto ativo. Os promedicamentos incluem compostos que podem ser oxidados, reduzidos, aminados, desaminados, hidroxilados, desidroxilados, hidrolisados, desidrolizados, alquilados, desalquilados, acilados, desacilados, fosforilados e/ou desfosforilados para produzir o composto ativo.

Em uma forma de realização, os compostos providos aqui possuem atividade antiviral contra HIV ou são metabolizados em um composto que exibe tal atividade. Métodos de Tratamento

Em uma forma de realização, são providos métodos para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por HIV em um hospedeiro, compreendendo administrar uma quantidade antiviralmente eficaz de um 5 composto aqui descrito, incluindo um composto de Fórmulas A-D o compostos I-IV ou um seu, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável. Os compostos podem ser combinados dom um veículo e diluente farmaceuticamente aceitável.

Em outra forma de realização principal, é descrito o uso de um 10 composto aqui descrito, incluindo um composto de Fórmula A-D ou Compostos I-IV, ou um seu sal, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável, no tratamento ou profilaxia de uma infecção por HIV em um hospedeiro, opcionalmente em combinação com um veículo e diluente farmaceuticamente aceitável.

E também provido o uso de um composto aqui descrito ou um

seu sal, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável, na manufatura de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por HIV em um hospedeiro, opcionalmente em combinação com um veículo e diluente farmaceuticamente aceitável.

Em uma forma de realização, é provido um método de

tratamento ou profilaxia de uma infecção por HIV em um hospedeiro, compreendendo administrar um composto de 3-fosfoindol substancialmente na forma de um enanciômero, ou um seu sal, éster ou promedicamento farmaceuticamente aceitável, opcionalmente em combinação com um veículo 25 farmaceuticamente aceitável, em um hospedeiro em necessidade. Em uma forma de realização, o 3-fosfoindol é de Fórmula A. Em outra forma de realização, o composto é de Fórmula B. Em uma forma de realização, o 3- fosfoindol é de Fórmula C. Em uma forma de realização, o 3-fosfoindol é de Fórmula D. Em uma forma de realização, o 3-fosfoindol é de Fórmula I, em que a estereoquímica absoluta no fósforo é S. Em outra forma de realização, o 3-fosfoindol é de Fórmula II, com absoluta estereoquímica de R. Em outra forma de realização, o 3-fosfoindol pode ser de Fórmula III, com estereoquímica absoluta de S. Em outra forma de realização, o 3-fosfoindol é representado pela Fórmula IV.

Em outra forma de realização, o hospedeiro pode ter sido diagnosticado por medição de uma titulação anticorpo anti-HIV no sangue. Em outra forma de realização, os compostos são administrados para reduzir ou evitar sintomas de AIDS (síndrome da deficiência imune adquirida) em um hospedeiro. Em ainda outra forma de realização, os compostos aqui descritos são administrados a um hospedeiro sob risco de infecção com HIV.

Em outra forma de realização, o composto ativo exibe atividade contra formas resistentes a medicamento de HIV e, assim, exibe diminuída resistência cruzada contra terapias antivirais atualmente aprovadas. A frase “atividade contra uma forma resistente a uma forma de medicamento de HIV” significa que um composto (ou seu promedicamento ou sal farmaceuticamente aceitável) é ativo contra a cepa mutante com uma EC5O P- ex., menor do que aproximadamente concentração micromolar de 50, 25, 10 ou I. Em uma forma de realização, o inibidor da transcriptase inversa não- nucleosídeo (NNRTI) exibe uma EC50 (em concentração molar) contra uma cepa HIV mutante menor do que aproximadamente 5, 2,5, 1 ou 0,1 micromolar. Em uma forma de realização não limitativa, a cepa mutante de HIV tem uma mutação de transcriptase inversa na lisina 103 —> asparagina e/ou tirosina 181 —> cisteína.

Os compostos providos aqui podem ser avaliados quanto a sua capacidade em inibir a atividade de transcriptase inversa in vitro, de acordo com métodos de triagem padrão. O espectro de atividade exibido por qualquer composto particular é determinado avaliando-se o composto em ensaios descritos nesta especificação ou com outros ensaios confirmatórios conhecidos daqueles hábeis na arte de compostos anti-HIV. Os compostos podem exibir uma EC50 menor do que 10-15 μιη.

Em uma forma de realização, a eficácia dos 3-fosfoindóis é medida pelo ensaio imunoabsorvente ligado por enzima específico de HIV, p24 ELISA. A eficácia do medicamento é expressa como inibição percentual do antígeno HIV p24 neste ensaio rápido e sensível. Em uma forma de realização relacionada, útil para experimentos específicos, a eficácia do composto anti-HIV é determinada por um “ensaio de redução de placa”, que mede a concentração do composto necessária para reduzir o número de placas do vírus in vitro, de acordo com os métodos expostos mais particularmente aqui, em 50 % (isto é, a EC50 do composto). Em algumas formas de realização, o composto exibe uma EC50 menor do que 15 ou menor do que 10 micromolar a quantidades nanomolares in vitro.

Combinação de Terapia Alternativa

Em certas formas de realização, o composto indol é administrado em combinação e/ou altemação com um ou mais de outros agentes anti-HIV. Em outra forma de realização, a administração de dois ou mais agentes anti-HIV resulta em um efeito sinérgico na inibição do HIV. Em outra forma de realização, o efeito da administração de dois ou mais de tais agentes em combinação e/ou altemação produz um efeito aditivo na inibição de replicação por HIV.

Em certas formas de realização, o composto indol é administrado em combinação e/ou altemação com um ou mais agentes anti- HBV ou um ou mais anti-HCV. Por exemplo, Em certas formas de realização, o composto indol pode ser administrado a um hospedeiro coinfectado com HIV e HBV em combinação com um agente eficaz para o tratamento de HBV. O agente eficaz para o tratamento do HBV pode ser qualquer tal agente conhecido daqueles hábeis na arte. Agentes exemplares são descritos aqui. Em certas formas de realização, o composto indol pode ser administrado a um hospedeiro coinfectado com HIV e HCV, em combinação com um agente eficaz para o tratamento de HCV. O agente eficaz para o tratamento de HCV pode ser qualquer tal agente conhecido daqueles hábeis na arte.

Em certas formas de realização, o composto indol é administrado em combinação e/ou altemação com um ou mais agentes que são metabolizados pela monoxigenase do citocromo P450. O agente pode ser qualquer agente sabido por aqueles hábeis na arte ser metabolizado por uma monoxigenase do citocromo P450. Agentes exemplares são descritos aqui. Em certas formas de realização, o citocromo P450 é o citocromo P450 3A4, citocromo P450 2C8 ou citocromo P450 2C9.

Em terapia de combinação, dosagens eficazes de dois ou mais agentes são administradas juntas, enquanto que durante terapia de altemação uma dosagem eficaz de cada agente é administrada serialmente. As dosagens dependerão das taxas de absorção, inativação e excreção dos medicamentos, bem como de outros fatores conhecidos daqueles de habilidade na arte. Os valores de dosagem também variarão com a severidade da condição a ser aliviada. Para qualquer indivíduo particular, regimes e programas de dosagem específicos devem ser ajustados durante o tempo para satisfazer as necessidades do indivíduo e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições.

A resistência a medicamento mais tipicamente ocorre por mutação de um gene que codifica uma enzima usada no ciclo de replicação viral. Foi demonstrado que a eficácia de um medicamento anti-HIV pode ser prolongada, aumentada ou restaurada administrando-se o composto em combinação ou altemação com um segundo e talvez terceiro composto antiviral que induza uma diferente(s) mutação(ões) daquela selecionada pelo medicamento principal. Tais combinações de medicamento simultaneamente reduzem a possibilidade de resistência a qualquer medicamento único e quaisquer efeitos tóxicos associados. Alternativamente, a farmacocinética, biodistribuição ou outros parâmetros do medicamento podem ser alterados por tal terapia de combinação ou altemação. Por exemplo, o uso de uma combinação de medicamento pode permitir que um medicamento individual dentro daquela combinação seja dado em uma dosagem mais baixa do que 5 seria necessária quando o medicamento for administrado como um monoterapêutico. Igualmente, quando medicamentos que objetivo diferentes estágios do ciclo de vida viral são combinados, existe a possibilidade de potenciarem-se seus efeitos. Além disso, o uso de combinações de medicamento poderia diminuir ou eliminar efeitos colaterais indesejáveis de 10 um único medicamento, enquanto ainda produzindo atividade anti-viral. Em geral, a terapia de combinação é tipicamente preferida durante a terapia de altemação porque ela coloca múltiplas e simultâneas pressões no vírus.

Agentes HCV

Interferons (IFNs) para o tratamento da hepatite crônica têm sido tomados disponíveis comercialmente por quase uma década e formam a base das terapias aprovadas atualmente disponíveis para HCV. Os IFNs são glicoproteínas produzidas por células imunes em resposta a infecções virais. Eles inibem a replicação de numerosos vírus, incluindo HCV e, quando usados como o único tratamento para infecção de hepatite C, os IFNs podem às vezes suprimir O RNA-HCV do soro a níveis indetectáveis. Também os IFNs podem normalizar os níveis da amino transferase do soro. Infelizmente, o efeito dos IFNs é temporário e uma resposta sustentada ocorre em somente 8 - 9 % dos pacientes cronicamente infectados com HCV (Gary L. Davis, Gastroenterology, 2000, 118:S 104-S114. A maioria dos pacientes, entretanto, têm dificuldade em tolerar o tratamento com interferon, que causa severos sintomas semelhante à gripe, perda de peso e falta de energia e estamina.

Muitas patentes descrevem Flaviviridae, incluindo HCV, tratamentos que utilizam terapias baseadas em interferon. Por exemplo, a Patente U.S. No. 5.980.884 de Blatt et al. descreve métodos para tratamento de pacientes afligidos com HCV utilizando interferon de consenso. A Patente U.S. No. 5.942.223 de Bazer et al. descreve uma terapia anti-HCV empregando interferon-tau ovino ou bovino. A Patente U.S. No. 5.928.636 de Alber et al. descreve a terapia de combinação de interleuciona-12 e interferon- alfa para o tratamento de doenças infecciosas incluindo HCV. A Patente U.S. No. 5.849.696 de Chretien et al. descreve o uso de timosinas, sozinhas ou em combinação com interferon, para tratar HCV. A Patente U.S. No. 5.830.455 de Valtena et al. ensina uma combinação de terapia HCV que emprega interferon e um purificador de radical livre. A Patente U.S. No. 5.738.845 de Imakawa ensina o uso de proteínas de interferon-tau humanas para tratar HCV. Outros tratamentos baseados em interferon para HCV são dados na Patente U.S. No. 5.676.942 de TEsta et al. e Patente U.S. No. 5.372.808 de Blatt et al. Numerosas patentes também descrevem formas pegiladas de interferons e seu uso, tais como, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.747.646; r.792.834; e 5.834.594, todas de Hoffmann-LaRoche, Inc.; PCT WO 99/32139 e WO 99/32140 de Enzon; WO 95/13090 e Patentes U.S. Nos. 5.738.846 e 5.711.944 de Schering Corporation; e a Patente U.S. No. 5.908.621 de Glue et al.

O interferon alfa-2a e interferon alfa-2b são atualmente aprovados como monoterapia para o tratamento de HCV. ROFERON®-A da Roche é a forma recombinante de interferon alfa-2a. PEGAS YS® da Rocha é a forma pegilada ou modificada por glicol do interferon alfa-2a. INTRON® A da Shcring Corporation é a forma recombinante do interferon alfa-2b e PEG- INTRON® da Schering Corporation é a forma pegilada de interferon alfa-2b.

Outras formas de interferon alfa bem como interferon beta, gama, tau e ômega atualmente estão em desenvolvimento para o tratamento de HCV. Exemplos incluídos aqui são INFERGEN, interferon alfacon-1, pela InterMune; OMNIFERON, um interferon natural, por Viragem; ALBUFERON por Human GEnoma Sciences; REBIF, interferon beta-la, por Ares-Serono; Omega Interferon por BioMedicine; Oral Interferon Alpha por Amarillo Bisosciences; e interferons gama, tau e gama 1 -b por InterMune.

Ribavirin (Ι-β-D-ribofuranosil-l-1,2,4-triazolil-3-carboxamida) é um análogo de nucleosídeo antiviral de largo espectro, induzindo não- interferon, sintético, vendido sob o nome comercial, Virazole (The Merck Index. 11a. Ed., 1989, Editor: Budavari, S., Merck & Co., Inc., Rahway, NJ; p. 1304). Vide Patente U.S. No. 3,798,209 e RE29.835. Estruturalmente a ribavirina é similar a guanosina e tem atividade in vitro contra diversos vírus de DNA e RNA incluindo Flaviviridae (Gary L. Davis, 2000, Gastroenterology, 118: S104-S114).

Ribavirina reduz os níveis da amino transferase do soro para normal em 40 % dos pacientes, porém não diminui os níveis de soro de RNA- HCV (Gary L. Davis, 2000, Gastroenterology, 118:S 104-S114). Assim, a ribavirina sozinha não é eficaz na redução dos níveis do RNA viral. Além disso, a ribavirina tem significativa toxicidade e é sabida induzir anemia. Não é aprovada para monoterapia contra HCV, porém foi aprovada em combinação com interferon alfa-2a ou interferon alfa-2b para o tratamento de HCV.

O atual padrão de cuidados para hepatite C crônica é terapia de combinação com um interferon alfa e ribavirina. Estudos mostraram que mais pacientes com HCV respondem a terapia de combinação com interferon-alfa pegilado/ribavirina do que a terapia de combinação com interferon alfa não- pegilado. Entretanto, como com monoterapia, significantes efeitos colaterais desenvolvem-se durante terapia de combinação, incluindo hemólise, sintomas semelhantes a gripe, anemia e fadiga (Gary L. Davis, 2000, Gastroenterology, 775 :S104-S 114).

A terapia de combinação com cápsulas de PEG-INTRON® (peginterferon alfa-2b) e REBETOL® (Ribivarin, USP) capsules é disponível na Schering Corporation. REBETOL® da Schering Corporation foi também aprovada em combinação com INTRON® A (interferon alfa-2b recombinante da Schering Corporation). PEGASYS® (interferon alfa-2a pegilado) e COPEGUS ® (ribavirina) da Rocha também foram aprovados para o tratamento de Infecção por HCV.

Os PCTs WO 99/59621, WO 00/37110, WO 01/81359, WO 02/32414 e WO 03/024461 todos da Schering Corporation descrevem o uso de terapia de combinação com interferon alfa pegilado e ribavirina, para o tratamento de infecção pro HCV. Os PCTs WO 99/15194, WO 99/64016 e WO 00/24355 todos da Hoffmann-LaRoche, Inc., também descrevem o uso combinado de interferon alfa pegilado e ribavirina para tratamento de infecção por HCV.

O desenvolvimento de novos agentes antivirais para tratar infecções por Flaviviridae, especialmente para infecções por hepacivírus HCV, está em andamento. Inibidores específicos de enzimas derivadas de HCV como protease, helicase e polimerase estão sendo estudados. Medicamentos que inibem as etapas de replicação de HCV também estão sendo investigados e incluem medicamentos que bloqueiam a produção de antígenos HCV de RNA (inibidores IRES), medicamentos que evitam o processamento normal das proteínas HCV (inibidores de glicosilação), medicamento que bloqueiam a entrada do HCV dentro das células, tais como bloqueando seus receptores, e agentes citoprotetores não-específicos, que bloqueiam a lesão celular causada pela infecção viral. Além disso, abordagens moleculares para tratar infecção por vírus da hepatite C estão sendo investigadas. Por exemplo, estudos de ribozimas, enzimas que decompõem as moléculas de RNA virais específicas, e oligonucleotídeos antissentido, que são pequenos segmentos complementares do DNA que se ligam a e inibem o RNA viral, estão sendo estudados. Uma recapitulação de tratamentos de HCV podem ser encontrados em Bymock et al., Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 2000, 11:2, e De Francesco et al., Antiviral Res., 2003, 55:1- 16.

Outras classes de medicamentos estão sendo desenvolvidas para tratar infecções por Flaviviridae e infecção de hepatite C em particular incluem:

1) Inibidores de Protease:

a. Inibidores de protease NS3 baseada em substrato são descritos por Artwood et al. nos WO 98/22496 e DE 19914474; por Attwood et al. em Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 1999, 70:259-273; e por Tung et al. em WO 98/17679, que inclui alfacetoamidas e hidrazinouréias;

IO b. Inibidores de substrato que terminam em um eletrófilo como

ácido borônico ou fosfonato são mostrados por Llinas-Brunet et al. em WO 99/07734;

c. Inibidores de protease NS3 baseados em não-substrato, tais como derivativos de 2,4,6-triidróxi-3-nitro-benzamida, RD3-4082 e RD3-

4078 (o primeiro substituído na amida por uma cadeia de 14-carbonos e o último tendo um grupo para-fenoxifenila) mostrado por Sudo et al. em Biochemical e Biophysical Res. Comm., 1997, 255:643-7, e em Antiviral Chemistry e Chemotherapy, 1998, 9:186;

d. Sch 68631, uma fenantrenoquinona, descrita por por Chu et

al. em Tetrahedron Letters, 1996, 37:7229-32 e Sch 351633, isolada do fungo

Penicillium griseofulvum, descrita por Chu et al. em Bioorganic and Medicinal Chem. Lett., 9:1949-52;

e. Eglin c, uma macromolécula isolada de sanguessuga, que exibe inibição de potência nanomolar contra diversas proteases de serina

como proteases A e B de S. griseus proteases, α-quimiotripsina, quimase e subtilisina, como descrito por Qasim et al., Biochemistry, 1997, 36: 1598- 1607;

f. Inibidores da cisteína protease para inibir endopetptidase 2 de HCV, como descrito na Pat. U.S. No. 6.004.933 de Spruce et al.; g. Inibidores sintéticos do vírus da protease do vírus da hepatite C NS3 ou cofator NS4A, que são subseqüências de substratos utilizados pela protease e/ou cofator, como mostrado na Patente U.S. No. 5.990.276 de Zhang et al.;

h. Enzimas de restrição para tratar HCV como descrito na

Patente U.S. No. 5.538.865 de Reyes et al.;

i. Peptídeos tais como inibidores da serina protease de NS3 do HCV, como mostrado no WO 02/008251 de Corvas International, Inc., e nos WO 02/08187 e WO 02/008256 de Schering Corporation;

j. Inibidores do tripeptídeo HCV, como descrito na Patentes

U.S. Nos. 6.534.523; 6.410.531; e 6.420.380 de Boehringer Ingelheim e WO 02/060926 de Bristol Myers Squibb;

k. Peptídeos de diarila como inibidores da serina protease de HCV como mostrado por Schering Corporation no WO 02/48172;

I. Imidazolidinonas como inibidores da serina protease NS3 do

HCV como descrito no WO 02/08198 de Schering Corporation and WO 02/48157 de Bristol Myers Squibb; e

m. Inibidores da protease de HCV como ensinado por Vertex Farmaceuticals no WO 98/17679 e por Bristol Myers Squibb no WO

02/48116.

2) Derivativos de tiazolidino que apresentam inibição pertinente em um ensaio de HPLC de fase inversa com uma proteína de fusão NS3/4A e substrato NS5A/5B, como demonstrado por Sudo et al., Antiviral Res., 1996, 52:9-18, especialmente compostos RD4 6205, RD4 6193 e RD-I-

6250, que têm um componente de cinamoíla fundido substituído por uma longa cadeia de alquila;

3) Tiazolidinas e benzanilidas como descrito por Kakiuchi et al., J. EBS Letters, 421:217-220 e Takeshita et al., Analitical Biochemistry, 1997, 247:242-46; 4) Inibidores da helicase como descrito por Diana et al. na Pat. U.S. No. 5.633.358 e WO 97/36554;

5) Inibidores da nucleotídeo polimerase e gliotoxina, como mostrado por R. Ferrari et al., J. Virology, 1999, 73:1649-54;

6) Cerulenina, um produto natural mostrado por V. Lohmann

et al., Virology, 1998, 249:108-118;

7) Oligodeoxinucleotídeos de fosforotioato antissentido (S- ODN) complementares aos estiramentos de seqüência de 5’-não-codificante (NCR) do vírus Flaviviridae demonstrado por M. Alt et al., Hepatology,

1995,22:707-717;

8) Nucleotídeos 326-348 compreendendo a terminação 3’ de NCR e nucleotídeos 371-388 localizados na região de codificação de núcleo do RNA HCV, como mostrado por M. Alt et al., Archives of Virology, 1997, 742:589-599; Galderisi et al., J. of Cellular Physiology, 1999, 181:251-257;

9) Inibidores da translação dependente-IRES, como descrito

por Ikeda et al., JP-08268890 e Y. Kai et al., JP-10101591

10) Ribozimas, tais como ribosimas resistentes-nuclease como mostrado por D. D. Maccjak et al., Hepatology, 1999, 50:abstract no. 995; Barber et al. na Pat. U.S. No. 6,043,077; e Draper et al. na U.S. 5.869.253 e

5.610.054;

11) Análogos de nucleosídeo incluindo o uso de nucleosídeos ramificados no tratamento de flavivirus, pestivirus e hepacivirus, como mostrado por Idenix Pharmaceuticals no WO 01/92282, WO 01/90121, U.S.

6.812.219 e U.S. 6.914.054, em que um método é descrito para o tratamento

da hepatite C, infecção por pestivirus e/ou flavivirus em humanos e outros animais hospedeiros que inclui a administração de uma quantidade eficaz de nucleosídeos β-D ou β-L Γ, 2’, 3’ ou 4’-ramificados um seu sal ou derivativo farmaceuticamente aceitável, administrada sozinha ou em combinação com outro agente antiviral, opcionalmente em um veículo farmaceuticamente aceitável. Análogos de nucleosídeo são também encontrados no WO 01/32153 e WO 01/60315 da BioChem Farma, Inc. (agora Shire Biochem, Inc.); WO 02/057425 e WO 02/057287 depositados por Merck & Co., Inc.; WO 02/18404 por Roche; WO 01/79246, WO 02/32920, e WO 02/48165 da 5 Farmasset, Ltd.; e WO 99/43691 da Emory University. Na Oral Session V, Hepatite C Virus, Flaviviridae, 16th International Conference on Antiviral Research, 27 de abril de 2003, Savannah, GA, nucleosídeos modifícados-2' para inibição do HCV, foram descritos por Eldrup et al.; análogos de nucleosídeo como possíveis inibidores da replicação de RNA HCV foram 10 mostrados por Bhar et al. (p. A75), em que o autor relatou que os nucleosídeos modificados-2’ demonstram potente atividade inibitória em ensaios de replicon baseado em célula; o efeito dos nucleosídeos modificados- 2’ sobre a replicação de RNA HCV foi relado por Olsen et al. (p. A76).

Compostos diversos sendo desenvolvidos para tratar infecções por Flaviviridae e infecções por hepatite C em particular incluem: 1-amino- alquilcicloexanos como descrito na Pat. U.S. No. 6.034.134 de to Gold et al.; alquil lipídeos, vitamina E e outros oxidantes na Patente U.S. No. 5.922.757 de Chojkier et al.; squaleno, amantadino, e sais biliares, como mostrado na Patente U.S. No. 5.846.964 de Ozeki et al.; ácido N-(fosfonoacetil)-L- aspártico e piperidinas como encontrado na Patente U.S. No. 5.830.905 de Diana et al.; benzenodicarboxamidas como descritas na Patente U.S. No. 5.633.388 de Diana et al.; derivativos do ácido poliadenílico como descrito na Patente U.S. No. 5.496.546 de Wang et al.; 2',3'-dideoxiinosina como encontrado na Pat. U.S. No. 5.026.687 de Yarchaon et al.; benzimidazóis como demonstrado na Pat. U.S. No. 5.891.874 de Colacino et al.; e extratos de plantas como mostrado na Patente U.S. No. 5.837.257 de Tsai et al. e Patente U.S. No. 5.725.859 de Omer et al.

13) Compostos atualmente em desenvolvimento preclínico ou clínico, para tratamento do vírus da hepatite C, incluindo Interleucina-10 por Schering Plough; IP-501 por Intemeuron; Merimebodib (VX-497) por Vertex; AMANTADINE® (Symmetrel) by Endo Labs Solvay; HEPTAZYME® por RPI; IDN-6556 por Idun Pharmaceuticals; XTL-002 por XTL; HCV/MF59 por Chiron; CIVACIR® (Globulina Imune Hepatite C) por NABI; LEVOVIRIN® por ICN/Ribafarm; VIRAMIDINE® por ICN/Ribafarm (Valeant); ZADAXIN® (timosnalfa-1) por Sci Clone; timosina mais interferon pegilado por Sci Clone; CEPLENE® (dicloridreto de histamina) por Maxim; VX 950/LY 570310 por Vertex/Eli Lilly; ISIS 14803 por Isis Pharmaceutical/Elan; JTK 003 por AKROS Farma; BILN-2061 por Boehringer Ingelheim; CellCept (mofetil micofenolato) por Roche; T67 (inibidor da β-tubulina) por Tularik; uma vacina terapêutica dirigida a E2 por Innogenetics; FK788 por Fujisawa Healthcare, Inc.; IdB 1016 (Siliphos, silibin-fosfatidilcolino fitossoma); um inibidor da replicação do RNA VP50406 ViroPharma/Wyeth; vacinas terapêuticas por Intercell e Epimmune/Genencor; um inibidor da IRES por Anadys; ANA 245 e ANA 246 por Anadys; immunoterapia "Therapore" por Avant; inibidores da protease por Bristol Myers Squibb/Axys e Corvas/Schering; um inibidor da helicase por Vertex; um inibidor da fusão por Trimeris; terapia da célula T por CellExSys; inibidor da polimerase por Biocryst; química do RNA alvejada por PTC Therapeutics; Dication por Immtech, International; inibidores da protease por Agouron and Chiron/Medivir; terapias antissentido AVI BioPharma and Hybridon; um hemopurifícador por Aethlon Medicai; uma vacina terapêutica por Merix; "Chron-VacC", uma vacina terapêutica, por Tripep; UT 23IB por United Therapeutics; inibidores da protease, helicase e polimerase por Genelabs Technologies; inibidors de IRES por Immusol; R803 por Rigel Pharmaceuticals; INFERGEN® (interferon alphacon-1) por InterMune; OMNIFERON® (interferon natural) por Viragen; ALBUFERON® por Human Genome Sciences; REBIF® (interferon beta-la) por Ares-Serono; Omega Interferon por BioMedicine; Interferon Alfa Oral por Amarillo Biosciences; interferons gamma, tau e gama-Ib por InterMune; interferon de consendo por Valeant; Nexavar por Onyx Pharmaceuticals; PI- 88 por Progen Industries; transmedicamento doxorrubicina por BioAlliance Pharma; JBK-122 por Jenken Biosciences; Valopicitabina por Idenix; VGX- 5 4IOC por VGX Pharmaceuticals; Celgosivir por Migenix; Suvus por Bioenvision; Multiferon por Viragen; omega interferon por Intarcia; INNOOlOl (El) por Innogenetics; PF-03491390 por Pfizer; medusa interferon por Flamel Technologies; IC41 por Intercell; SCH 503034 por Schering; G126270 por GlaxoSmithKline; GVlOOl por Pharmexa; R 1626 por Roche;

Maxygen/Roche; R7128 por Pharmasset/Roche; Belerofon por Nautilus Biotech; Alinia por Romark; Bavituximab por Peregrine; Interferon alfa Oral por Amarillo Biosciences; NOV-205 por Novelos; CGI 5005 por Globelmmune; HCV-796 por ViroPharma/Wyeth; HCV/MF59 por Chiron /Norvartis; EMZ702 por Transition Therapeutics; AVI-4065 por Biofarma;

ANA975 por ANADYS; MitoQ por Antipodean Pharmaceuticals, Inc; ACH- 0137171 por Achillion Pharmaceuticals; Rl 626 por Roche; XTL-2125 por XTL; XTL-6865 por XTL; BLX-883 por Biolex Therapeutics / OctoPlus; DEBIO-025 por DEBIO; e UT-231B por United Therapeutics; e

14) Promedicamentos de nucleosídeo como anteriormente

descrito para o tratamento de outras formas de hepatite, incluindo 2'-deóxi-P- L-nucleosídeos e seus 3'-promedicamentos para o tratamento de HBV como descrito nos WO 00/09531 e WO 01/96353 de Idenix Pharmaceuticals; e ésteres terapêuticos de aciclovir como mostrado na Pat. U.S. No. 4.957.924 de Beauchamp.

Outros exemplos de agentes antivirais que podem ser usados

em combinação e/ou altemação com os compostos descritos aqui incluem mas não são limitados a agentes tais como VX-950 e interferon. Interferons que podem ser usados incluem produtos de alfa interferon 2b, Intron® A e PEG- Intron™ da Schering-Plough; e Co-Pegasus e PEGASYS (interferon alfa-2a pegilado) da Hoffman La Roche.

Agentes da Hepatite B

O agente da hepatite B pode ser qualquer agente conhecido daqueles hábeis na arte serem eficazes para o tratamento de infecção por

hepatite B em um hospedeiro em necessidade. Em certas formas de realização, o agente da hepatite B é interferon-alfa (Intron A, Schering- Plough), interferon pegilado (Pegasys, Roche), lamivudina (Epivir-HBV, Zeffix ou Heptodina, Glaxo-Smithkline), adefovir dipivoxila (Hepsera, Gilead), entecavir (Baraclude, Bristol-Myers-Squibb), telbivudino (Tyzeka ou 10 Sebivo, Idenix) ou imunoglobulina HBV (HyperHEP S/D, Talecris; Nabi- HBV, Nabi; Hepa Gam B, Cangene).

Em certas formas de realização, o agente da hepatite B é FTC (Emtricitabina, Gilead), L-FMAU (Clevudino, Pharmasset; Levovir, Bukwang), tenofovir (Viread, Gilead), mono vai LdC (Valtorcitabina, Idenix), 15 DAPD (Amdoxovir, RFS Pharm LLC), Ana 380 (LB80380, Anadys), remofovir (Pradefovir, Schering-Plough), racivir (RCV, Pharmasset), BAM- 205 (NOV-205, Novelos), XTL-OOl (HepeX-B, XTL Biofarm, Cubist), nitoxanida (Alinia, Romark Labs), UT 231-B (United Therapeutics), Bay 41- 4109 (Bayer), EHT899 (Enzo Biochem), timosnalfa-1 (Zadaxin, SciClone), 20 Hi-8 HBV (Oxxon), eiRNA (HepX, Nucleonics), HepaVaxx B (Virexx), Vacina de Antígeno Núcleo HBV (Emergent Europe), ou SpecifEx-HepB (Chromos).

Outros agentes antivirais

Qualquer um dos tratamentos antivirais descritos nos 25 Fundamentos da Invenção aqui em outra parte pode ser usado em combinação ou altemação com os compostos descritos neste relatório. Exemplos não limitativos incluem a) inibidores da protease; b) derivativos da tiazolidina; c) inibidores da helicase; d) benzanilidas; e) fenantrenoquinonas; f) inibidores da polimerase e glitoxina; g) oligodeoxinucleotídeos de fosforotioato antissentido (S-ODN); h) inibidores da translação dependente de IRES; i) ribozimas; j) análogos de nucleosídeo; k) análogos de nucleosídeo dissubstituídos, como descrito por Idenix Pharmaceuticals em WO 01/90121, WO 01/92282, WO 04/00300, WO 04/002999, e WO 04/002422; 1) análogos de 2'-fluoronucleosídeo; m) l-NH2-alquilcicloexanos; n) alquil lipídeos; o) vitamina E e outros antioxidantes; p) squaleno, amantadino e ácidos biliares; q) ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico; r) benzenodicarboxamidas; s) derivativos do ácido poliadenílico; t) benzimidazóis; u) 2',3'-dideoxinosina; v) extratos de plantas; w) piperidinas; e x) outros compostos atualmente em desenvolvimento preclínico ou clínico para tratamento de pestivirus, flavivirus e/ou hepacivírus, incluindo ribavirina e as famílidas de interferons.

O segundo agente antiviral para o tratamento do HIV pode ser, por exemplo, um inibidor da protease, um inibidor da HlV-integrase, um inibidor da quimiocina ou um inibidor da transcriptase inversa ("RTI"), o último dos quais pode ser um inibidor da transcriptase inversa de nucleosídeo sintético ("NRTI") ou um inibidor da transcriptase inversa não-nucleosídeo ("NNRTI"). Em outras formas de realização, um segundo ou terceiro composto pode ser um análogo de pirofosfato ou um inibidor da ligação da fusão. Uma lista compilando dados de resistência coletados in vitro e in vivo para certos compostos antivirais é encontrada em Schinazi et al., Mutations in retroviral genes associated with drug resistance, International Antiviral News, 1997, 5(8).

Em certas formas de realização, o composto de indol é administrado em combinação e/ou altemação com FTC (2',3'-dideóxi-3'-tia-5- fluorocitidina); 141W94 (amprenavir, Glaxo Wellcome, Inc.); Viramune (nevirapina); Rescriptor (delavirdino); DMP-266 (efavirenz); DDI (2',3- dideoxinosina); 3TC (3'-tia-2',3'-dideoxicitidina); DDC (2',3'-dideoxicitidina), abacavir (1592U89), que é succinato de (lS,4R)-4-[(2-amino-6-ciclopropil- amino)-9H-purin-9-il]-2-ciclopenteno-l-metanol, Tenofovir DF (Viread), D4T, ou AZT.

Outros exemplos de agentes antivirais que podem ser usados em combinação e/ou altemação com os compostos descritos aqui incluem mas não são limitados a foscamet; carbovir; aciclovir; interferon; inibidores de 5 fusão tais como enfuvirtida; e nucleosídeos de β-D-dioxolano tais como β-D- dioxolanilguanina (DXG), P-D-dioxolanil-2,6-diaminopurina (DAPD), e β-D- dioxolanil-6-cloropurina (ACP). Interferons que podem ser usados incluem produtos de alfa interferon-2b, Intron® A e PEG-Intron™ da Shering-Plough; e Co-pegasus e PEGASYS (interferon alfa-2a pegilad) da Hoffman La 10 Roche). Combinações com que os fosfoindóis podem ser administrados incluem Epzicom (ABC+3TC), Trizivir (ABC + 3TC + AZT), Truvada (FTC +Viread) e Combivir (AZT+3TC).

Exemplos dos inibidores da protease que podem ser usados em combinação e/ou altemação com os compostos descritos aqui incluem mas não são limitados a indinavir (sulfato de {l(lS,2R),5(S)}-2,3,5-trideóxi-N- (2,3-diidro-2-hidróxi-lH-inden-l-il)-5-[2-[[(l,l-dimetiletil) amino]carbonil]-

4-(3-piridinilmetil)-l-piperazinil]-2-(fenilmetil)-D-eritro-pentoamida; Merck

& Co., Inc.); nelfmavir (Agouron); ritonavir (Abbott Labs), saquinavir (Roche); Amprenavir; Atazanavir; Fosamprenavir; Kaletra; e DMP-450 {[4R- 4(r-a,5-a,6-b,7-6)-hexaídro-5,6-bis(hidróxi)-l,3-bis(3-amino)-fenil]metil-4,7- bis (fenilmetil)-2H-l,3-diazepin-2-ona}-bismesilato (Triangle

Pharmaceuticals, Inc.).

Outros compostos que podem ser administrados em combinação ou altemação com o fosfoindol para aumentar suas propriedades 25 antivirais incluem succinato de (IS, 4R)-4-[2-amino-6-ciclopropil-amino-9H- purin-9-il]-2-ciclopenteno-l-metanol (1592U89, um análogo de carbovir, da GlaxoSmithKline); BILA 1906 (N-{lS-[[[3-[2S-{(l,l-dimetiletil)amino] carbonil}-4R-]3-pirindinilmetil)tio]-l-piperidinil]-2R-hidróxi-lS-fenilmetil) propil]-amino]carbonil]-2-metilpropil}-2-quinolinecarboxamida) (Bio Mega/Boehringer Ingelheim); BILA 2185 (N-(l,l-dimetiletil)-l-[2S-[[[2-2,6- dimetil-fenóxi] -1-oxoetil] amino] -2R-hidróxi-4-fenilbutil] 4R-piridiniltio-2- piperidino-carboxamida) (Bio Mega / Boehringer Ingelheim); BM+51,0836 (derivativo de triazoloiso-indolinona) e BMS 186,318 (inibidor da HIV-I 5 protease do derivativo de aminodiol) (Bristol-Myers Squibb); d4API (9-[2,5- diidro-5-(fosfonometóxi)-2-furanil]-adenina) (Gilead); HBY097 (S-4- isopropoxicarbonil-6-metóxi-3-[metiltio-metil]-3,4-diidroquinoxalin-2(lH)- tiona); HEPT (l-[(2-hidróxi-etóxi)metil]6-[feniltio]-timina); KNI-272 (tripeptídeo contendo ácido (2S,3S)-3-amino-2-hidróxi-4-fenilbutírico); L- 10 697.593 (5-etil-6-metil-3-(2-ftalimido-etil)piridin-2(lH)-ona); L-732,524 (inibidor da protease de HIV-I de hidróxi-aminopentano amida) (Merck & Co.); L-697.661 (3-{ [(-4,7-dicloro-l,3-benzoxazol-2-il)metil]amino}-5-etil- 6-metil-piridin-2(lH)-ona); L-FDDC ((-)-P-L-5-fluoro-2',3'-dideoxicitidino); L-FDOC ((-)-P-L-5-fluoro-dioxolano citosina); PFA (fosfonoformiato; 15 "foscamet"; Astra); PMEA (9-(2-fosfonilmetoxietil)adenina) (Gilead); PMPA ((R)-9-(2-fosfonilmetóxi-propil)-adenina) (Gilead); Ro 31-8959 (inibidor da protease HIV-I do derivativo da hidroxietilamina) (Roche); RPI-3121 (inibidor da peptidil protease, l-[(3S)-3-(n-alfa-benzilóxi-carbonil)-l- asparginil)-amino-2-hidróxi-4-fenilbutiril]-n-terc-butil-l-prolino amida); 2720 20 (6-cloro-3,3-dimetil-4-(isopropeniloxicarbonil)-3,4-diidro-quinoxalin-2(lH) tiona); SC-52151 (inibidor da hidroxietiluréia isostere protease) (G.D. Searle); SC-55389A (inibidor da hidroxietil-ureia isostere protease (G.D. Searle); TIBO R82150 ((+)-(5S)-4,5,6,7-tetraídro-5-metil-6-(3-metil-2- butenil)-imidazo-[4,5,l-jk]-[l,4]-benzodiazepin-2(lH)-tiona) (Janssen

Pharmaceuticals); TIBO 82913 ((+)-(5S)-4,5,6,7-tetraídro-9-cloro-5-metil-6- (3 -metil-2-butenil) imidazo [4,5,1 -jk]-[ 1,4]-benzo-diazepin-2( 1 H)-tiona (Janssen Pharmaceuticals); TSA0-m3T ([2',5'-bis-0-(terc-butildimetilsilil)-3'- espiro-5'-(4'-amino-r,2'-oxatiol-2',2'-dióxido)]-P-D-pentofuranosil-N3-metil- timina); U90152 (l-[3-[(l-metiletil-amino]2-piridinil]-4-[[5- [(metilsulfonil)- amino]-lH-indol-2-il]-carbonil]-piperazina); UC (derivativos de tio- carboxanilida) (Uniroyal); UC-781 (N-[4-cloro-3-(3-metil-2-butenilóxi)fenil]- 2-metil-3-furancarbotioamida); UC-82 (N-[4-cloro-3-(3-metil-2- butenilóxi)fenil]-2-metil-3-tiofenocarbotioamida); VB 11.328 (inibidor da 5 hidroxietil-sulfonamida protease) (Vertex/Glaxo Wellcome); XM 323 (inibidor cíclico da uréia protease) (Dupont Merck); e penciclovir. Em ainda outra forma de realização, o composto indol da invenção é administrado em combinação com o inibidor da protease LG 1350.

Os seguintes medicamentos podem ser usados em combinação e/ou altemação com os compostos da presente invenção.

Nome Medicamento Fabricante 3 TC, lamivudina marca Epivir® GlaxoSmithKline abacavir genérico Ziagen®, ABC, ou 1592U89 GlaxoSmithKline ABC, abacavir marca Ziagen® ou 1592U89 GlaxoSmithKline ΑΒΤ-378/r, ou lopinavir/ritonavir marca Kaletra® Abbott Laboratories AG-1549, S-1153 ou capravirina (CPV) Pfizer AG 1661, Imonógeno HIV-1, ou vacina Salk marca Immune Response Corp. Remune ® Amprenavir (APV), 141 w94 ou VX-478 marca GlaxoSmithKline Agenerase® aldesleukin genérico Proleucin® ou Interleuina-2 (IL-2) Chiron Corporation amdoxovir, ou DAPD Gilead Sciences amprenavir genérico Agenerase®, APV, 141W93 ou GlaxoSmithKline VS-478 Aptivus® Boehringer Ingelheim APV, amprenavir marca Agenerase®, 141W94 ou VX- GlaxoSmithKline 478 atazanavir genérico Reyataz1M ou BMS-232632 Bristol-Myers Squibb Atripla® Bristol-Myers Squibb e Gilead AZT, zidovudina marca Retrovir® (ZDV) GlaxoSmithKline Bis(POC) PMPA, tenofovir DF marca Viread® Gilead Sciences BMS-232632 ou atazanavir marca Reyataz1M Bristol-Myers Squibb BMS-56190 ou DPC-083 Bristol-Myers Squibb Calanolida A Sarawak Medichem capravirina (CPV), AG-1549 ou S-1153 Pfizer zidovudina + lamivudina, ou AZT + 3TC marca Glaxo SmithKline Combivir® CPV (capravirina), AG-1549 ou S-1153 Pfizer Indinavir (IDV) ou MK-639 marca Crixivan® Merck & Co. d4T, estavudina marca Zerit® ou BMY-27857 Bristol-Myers Squibb DAPD ou andoxovir Gilead Sciences ddC, ou zalcitabina marca Hivid® Hoffmann-La Roche ddl, didanosina marca Videx®, ou BMY-40900 Bristol-Myers Squibb delavirdine genérico Rescriptor®, DLV ou U-90152S/T Pfizer didanosina genérico Videx®, ddl, ou BMY-40900 Bristol-Myers Squibb DLV, delavirdina marca Rescriptor®, ou U-90152S/T Pfizer DPC-083 ou BMS-56190 Bristol-Myers Squibb Hidroxiuréia (HU) marca Droxia® Bristol-Myers Squibb efavirez genérico Sustiva®, ou EFV Bristol-Myers Squibb EFV, efavirenz marca Sustiva® Bristol-Myers Squibb entricitabina genérico Emtriva1M ou FTC Gilead Sciences Entricitabina marca Emtriva®, ou FTC Gilead Sciences enfuvirtida genérico Fuzeon1M, ou T-20 Trimeris and Hoffmann- LaRoche Lamivudina marca Epivir®, ou 3TC GlaxoSmithKline epoetin alfa (eritropoietina) genérico Procrit® Ortho Biotech Epizicom® GlaxoSmithKline eritropoietina (epoetina alfa) genérico Procrit® Ortho Biotech Saquinavir marca Fortovase® (Cápsula Gel Mole, ou Hoffmann-La Roche SQV (SGC) fosamprenavir ou GW-433908 ou VX-175 GlaxoSmithKline FTC ou entricitabina marca Emtriva® Gilead Sciences Enfuvirtida marca Fuzeon1M, ou T-20 Trimeris and Hoffmann-La Roche GW-433908, ou fosamprenavir, ou VX-175 GlaxoSmithKline HE2000 ou alfa-epibromida HollisEden Pharmaceuticals HIV-I Immunogen genérico Remune®, vacina Salk, ou Immune Response Corp. AG1661 Zalcitabina marca Hivid®, ou ddC Hoffmann-La Roche HU ou hidroxiuréia marca Droxia® Bristol-Myers Squibb hidroxiuréia genérico Droxia® ou HU Bristol-Myers Squibb IDV, indinavir marca Crixivan®, ou MK-639 Merck & Co. IL-2 (Interleucina-2), ou adesleucina marca Proleukin® Chiron Corporation indinavir genérico Crixivan®, IDV ou MK-639 Merck & Co. Interleucina-2 (IL-2) ou adesleucina marca Proleukin® Chiron Corporation raltegravir marca Isentress Merck saquinavir marca Invirase® (Cápsula Gel Dura), SQV Hoffmann-La Roche (HGC) ou Ro-31-8959 lopinavir/ritonavir marca Kaletra®, ou ΑΒΤ-378/r Abbott Laboratories lamivudina genérico Epivir® ou 3 TC GlaxoSmithKline Lexiva® GlaxoSmithKline lpinavir/ritoavir genéricoKaletra® ou ΑΒΤ-378/r Abbott Laboratories MK-639, indinavir marca Crixivan® Merck & Co. nelfinavir genérico Viracept®, NFV, ou AG-1343 Pfizer nevirapina genérico Viramune®, NVP ou BI-RG-587 Boeringer Ingelheim NFV, nelfinavir marca Viracept®, ou AG-1343 Pfizer ritonavir marca Norvir® (RTV) ou ABT-538 Abbott Laboratories NVP, nevirapina marca Viramune®, ou BI-RG-587 Boeringer Ingelheim PNU-140690 ou tipranavir Boeringer Ingelheim Prezista® Tibotec PRO-542 Progenics Pharmaceuticals epoetina alfa marca Procrit® (eritropoietina) Ortho Biotech aldesleucina marca Proleukin®, ou Interleucina-2 (IL-2) Chiron Corporation Imunógeno HIV-I marca Remune®, ou vacina Salk Immune Response Corp. Delavirdina (DLV) marca Rescriptor®, ou U-90152S/T Pfizer zidobudina (ZDV) marca Retrovir® ou AZT Glaxo SmithKline atazanavir marca ReyatazlM, ou BMS-232632 Bristol-Myers Squibb ritonavir genérico Norvir®, RTV ou ABT-538 Abbott Laboratories RTV, ritonavir marca Norvir®, ou ABT-538 Abbott Laboratories Vacina Salk, Imunógeno HIV-I marca Remune®, ou Immune Response Corp. AGl 661 saquinavir (Cáp. Gel Dura) genérico Invirase®, SQV Hoffmann-La Roche (HGC) ou Ro-31-8959 saquinavir (Cap Gel Mole) genérico Fortovase®, ou Hoffmann-La Roche SQV (SGC) SCH-C Shering-Plough maraviroc marca Selzentry Pfizer somatropina marca Serostim® Serono Laboratories somatropina genérico Serostim® Serono Laboratories SQV (HGC), saquinavir marca Invirase® (Cap. Gel Hoffmann-La Roche Dura) ou Ro-31 -8959 SQV (SGC) ou saquinavir marca Fortovase® (Cap. Gel Hoffmann-La Roche Macia) stavudina genérico Zerit®, d4T ou BMY-27857 Bristol-Myers Squibb efavirenz marca Sustiva® (EFV) Bristol-Myers Squibb T-1249 Timeris and Hoffmann-La Roche T-20 ou enfuvirtida marca Fuzeon1M Trimeris e Hoffmann-La Roche TDF, tenofovir DF genérico Viread1M ou Bis(POC) Gilead Sciences PMPA tenovir DF (TDF) genérico Viread®) Bis(POC) PMPA Gilead Sciences tipranavir, ou PNU-140690 Boeringer Ingelheim TMC-114 Tibotec-Virco Group TMC-125 Tibotec-Virco Group abacavir + zidovudina + lamivudina (ABC + AZT + GlaxoSmithKline 3TC) marca Trizivir® Truvada® Gilead didanosina marca Videx®, ddl ou BMY-40900 Bristol-Myers Squibb Videx® EC marca didanosina (ddl): cápsulas de Bristol-Myers Squibb liberação retardada nelfinavir marca Viracept® (NFV) ou AG-1343 Pfizer nevirapina marca Viramune® (NVP) ou BI-RG-587 Boeringer Ingelheim tenofovir DF marca Viread®, ou Bis(POC) PMPA Gilead Sciences VX-175 ou fosanprenavir ou GW-433908 GlaxoSmithKline zalcitabina genérico Hivid® ou ddC Hoffmann-La Roche ZDV, zidovudina marca Retrovir®, ou AZT GlaxoSmithKline stavudina marca Zerit®, d4T ou BMY-27857 Bristol-Myers Squibb Abacavir marca Ziagen® (ABC) ou 1592U89 GlaxoSmithKline zidovudina genérico Retrovir®, AZT ou ZDV GlaxoSmithKline Medicamentos adicionais que podem ser usados em

combinação e/ou altemação com o 3-fosfoindóis incluem:

GW5634 (GSK) MIV-150 (Medivir/Chiron) Tipranavir (B-I) R0033-4649 (Roche) TMC125 (Tibotec) GW640385 (GSK/Vertex) TMC114 (Tibotec) Elvucitabine (Achillion Ph.) Alovudine (FLT) (B-I) MIV-210 (GSK/Medivir) Racivir (Pharmasset) SPD754 (Shire Pharm.) Reverset (Incyte Corp.) FP21399 (Fuji Pharm.) AMD070 (AnorMed) GW873140 (GSK) BMS-488043 (BMS) Schering C/D (417690) PRO 542 (Progenics Pharm) TAK-220 (Takeda) TNX-355 (Tanox) UK-427.857 (Pfizer) Os seguintes medicamentos podem ser usados em combinação

e/ou altemação com os compostos da presente invenção.

Nome Nome Genérico Uso Nome Fabricante Comercial Abelcet, Anfotericina B, antifungico para aspergilose vários Ambisome ABLC Bactrim, sulfametoxazol e antibiótico antiprotozoário para vários Septra trimetropim Pneumocystis carinii tratamento e prevenção pneumonia Biaxin, claritromicina antibiótico para Mycobacterium Abbott Klacid avium Laboratories prevenção e tratamento Cytovene ganciclovir, antiviral para retinite CMV Roche DHPG DaunoXome daunorrubicina- quimioterapia para sarcoma de Gilead lipossomal Kaposi Diflucan flucanazol antifungico para candidíase, Pfizer meningite criptococal Doxil doxorrubicina quimioterapia para sarcoma de Ortho Biotech cloridreto- Kaposi lipossomal Famvir famciclovir antiviral para herpes Norvatis Foscanet foscavir antiviral para herpes, retinite CMV Astra Parmaceuticals Gamimune N globulina imune, reforço imune para evitar infecções Bayer Biologicals gama globulina, bacterianas em crianças IGIV Intron A interferon alfa- Sarcoma de Karposi, hepatite C Schering 2b Marinol ronabinol tratar perda apetite Roxane Laboratories Megace acetato de tratar apetite, perda peso Bristol-Myers megestrol Squibb Mepron atovaquona antibiótico antiprotozoário para GlaxoSmithKline Pneumocystis carinii tratamento e prevenção pneumonia Mycobutin, rifabutina antibiótico antimicobacteriano para Adria Ansamyein prevenção de Mycobacterium Pharmaceuticals avium NebuPent pentamidina antibiótico antiprotozoário para Fujisawa prevenção de pneumonia Pneumocystis carinii Neutrexin glicuronato de antibiótico antiprotozoário para MedImmune trimetrexato e tratamento de pneumonia por leucovorina Pneumocystis carinii Panretin gel gel alitertinoína sarcoma Karposi relacionado AIDS Ligand 0,1 % Pharmaceuticals Procrit, eritropoetina, tratar anemia relacionada com Amgen Epogen EPO terapia AZT Roferon A interferon alfa- Sarcoma de Karposi e hepatite C Roche 2a Serostim somatropina tratar perda peso Serono rDNA Sporanox itraconazol antifungico para blastomicose, Janssen hostoplamose, aspergilose e Pharmacoceuticals candidíase Taxol paclitaxel Sarcoma Karpose Bristol-Myers Squibb Valcyte valganciclovir antiviral para retinite CMV Roche Vistide cidofovir, antiviral para retinite CMV Gilead HPMPC Vitrasert inserção antiviral para retinite CMV Bausch & Lomb implant ganciclovir Vitravene fomivirsen sódio antiviral para retinite CMV Isis intravitreal injeção Pharmaceuticals injectable Zithromax azitromicina antibiótico para Mycobacterium Pfizer avium Produtos que foram permitidos prosseguir como Novas Drogas

Investigacionais (IND) pela FDA para o tratamento de complicações de infecção por HIV e AIDS podem ser usados. Os seguintes medicamentos podem ser usados em combinação e/ou altemação com os compostos da presente invenção.

• Trimetrexato glicuronato para o tratamento de pneumonia por Pneumocistis carinii em pacientes com AIDS, que não podem tolerar as formas padrão de tratamento.

• Ganciclovir para o tratamento de retinide por citomegalovirus em pacientes com AIDS.

• Pentamidina aerossolizada para a prevenção de pneumonia por Pneumocystis carinii em pacients com AIDS.

• Eritropoietina para o tratamento de anemia relacionada com zidovudino.

• Atovaquona para o tratamento de pacientes com AIDS com pneumonia por Pneumocistis carinii que são intolerantes ou irresponsivos a trimetroprim-sulfametaxol.

• Rifabutina para profilaxia contra bacteremia complexa de Mycobacterium avum em pacientes com AIDS.

• Vistide cidofovir intravenoso para pessoas infectadas com HIV com recaída de retinite por citomegalovirus (CMV) que progrediu apesar do tratamento (Hoffmann-La Roche).

• Serostim, um hormônio do crescimento humano recombinante derivado de mamífero, para o tratamento de emaciamento relacionado com a AIDS (Serono Laboratories).

Em formas de realização particulares, os compostos aqui descritos podem ser administrados em combinação ou altemação com um, dois ou mais de outros agentes anti-HIV. Em uma subforma de realização, o agente adicional é selecionado de:

um inibidor da protease opcionalmente selecionado de amprenavir, tipranavir, indinavir, saquinavir (incluindo mesilato de saquinavir), lopinavir, ritonavir, fosamprenavir, darunavir, atazanavir (incluindo o sal de sulfato), e nelfinavir (incluindo o sal de mesilato);

um inibidor da transcriptase inversa de nucleosídeo ou nucleotídeo, opcionalmente selecionado de lamivudina, ettricitabina, abacavir, zalcitabina, zidovudina, tenofovir (incluindo fumarato de tenofovir disoproxila), didanosina e estavudina;

um inibidor da transcriptase inversa não-nucleosídeo, selecionado de delavirdino, efavirenz e nevirapina;

Atripla, Combivir, Trizivir e Truvada;

um inibidor de entrada (tais como um inibidor de fusão ou antagonista do co-receptor CCR5), opcionalmente selecionado de maraviroc e enfuvirtida; e

elvitegravir (GS-9137).

Onde um agente anti-HIV adicional for usado, ele pode opcionalmente ser em outra forma, tal como uma forma de sal, solvato, hidrato, forma de promedicamento, polimorfo, enanciômero e similares. O agente anti-HIV adicional também pode ser selecionado de:

opcionalmente Etravirina (TMC-125), Rilpivirina (TMC-278) ou Calanolida

5

uma combinação de dose fixa opcionalmente selecionada, de

10

um inibidor da integrase, tal como raltegravir (MK-0518) ou

20

A;

25

um inibidor da integrase que é opcionalmente Elvitegravir,

GSK-364735 ou raltegravir; e

um inibidor da maturação que é opcionalmente Bevirimat

(PA457);

um inibidor celular, tal como hidroxiuréia; um inibidor de entrada, tal como vicriviroc ou TNS-355; e um inibidor baseado imune, tal como Immunitina (alfa- epibromida), proleucina (IL-2), Remune (imunógeno HIV-1), BAY 50-4798 ou IRl03.

Agentes metabolizados pelo citocromo P450 Em certas formas de realização, um composto provido aqui pode ser administrado em combinação ou altemação com um agente farmaceuticamente aceitável, que seja metabolizado pela mono-oxigenase do citocromo P450. Mono-oxigenases de citocromo P450 úteis exemplares incluem citocromo P450 2C8, citocromo P450 2C9 e citocromo P450 3A4. Em certas formas de realização, os compostos puros providos aqui podem inibir a mono-oxigenase do citocromo P450, desse modo melhorando a farmacocinética do agente coadministrado. Em formas de realização particulares, a isozima P450 inibida é CYP3A4. Em formas de realização particulares, o composto de fosfoindol é administrado em combinação com um segundo composto anti-HIV sem a necessidade de um reforço de ritonavir. Em formas de realização particulares, o composto de fosfoindol é administrado em combinação com um ou mais de Atazanavir, Fosamprenavir, Darunavir, Indinavir, Lopinavir, Nelfinavir, Saquinavir, Tipraniavir, ou Enfuvirtida.

Em formas de realização particulares, o composto de fosfoindol é administrado em terapia de combinação com um ou mais inibidores da transcriptase inversa de nucleosídeo e/ou um ou mais inibidores da integrase.

O agente farmaceuticamente aceitável que é metabolizado pela mono-oxigenase do citocromo P450 pode ser qualquer tal agente conhecido ou identificado por aqueles hábeis na arte. Compostos não limitantes exemplares que podem ser metabolizados pela mono-oxigenase do citocromo P450 incluem mas não são limitados a paclitaxel, torsemida, amodiaquina, cerivastatina e repaglinida (citocromo P450 2C8); certos NSAIDs (e.g., diclofenac, ibuprofeno, lomoxicam, meloxicam, S-naproxeno, piroxicam, suprofeno), certos agentes hipoglicêmicos orais (p. ex., tolbutamida, glipizida), certos bloqueadores da angiotensina II (e.g., losartan, irbesartan), certas sulfoniluréias (e.g., gliburida, glibenclamida, glipizida, glimepirida, tolbutamida, amitriptilina), celecoxib, fluoxetina, fluvastatina gliburida, natoglinida, fenitoína, rosiglitazona, tamoxifeno, torsemide, S-warfarina (citocromo P450 2C9); certos antibióticos macrolídeos (e.g., claritromicina, eritromicina, telitromicina), certos anti-arrítmicos (e.g., quinidina), certas benzodiazepinas (e.g., alprazolam, diazepam, midazolam, triazolam) certos modulares imunes (ciclosporina, tacrolimus), certos antivirais HIV (e.g., indinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir), certos procinéticos (e.g., cisaprida), certas histaminas (e.g., astemizol, clorfeniramina, terfenidino), certos bloqueadores do canal de cálcio (e.g., amlodipina, diltiazem, felodipina, lercanidipina, nifedipina, nisoldipina, nitrendipina, verapamil), certos inibidores da HMG CoA redutase (e.g., atorvastatina, cerivastatina, lovastatina, sinvastatina), certos esteróides (estradiol, hidrocortisona, progesterona, testosterona), alfentanila, aprepitant, aripiprazol, buspirona, cafergot, cafeína=>TMU, cilostazol, cocaína, demetilação-codeína-N, dapsona, dexametasona, dextrometorfano, docetaxel, domperidona, eplerenona, fentanila, fmasterida, gleevec, haloperidol, irinotecan, LAAM, lidocaina, metadona, natoglinida, odanestrona, pimozida, propranolol, quetiapina, quinina, risperidona, NOT rosuvastatina, salmeterol, sildenafil, sirolimus, tamoxifeno, taxol, terfenadino, trazodona, vincristina, zaleplon, ziprasidona, Zolpidem (citocromo P450 3A4). Em formas de realização particulares, são providos aqui métodos em combinação ou altemação com antivirais HIV que são metabolisados pelo citocromo P450 (p. ex., indinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir).

Outros compostos exemplares que podem ser metabolizados pela mono-oxigenase do citocromo P450 incluem mas não são limitados a inibidores de CCR5 (p. ex., PRO-140, viciviroc ou SCH-417.690, e maraviroc, ou UK-427,857), inibidors da integrase (e.g. JTK-303/GS-9137, ácido 6-(3-cloro-2-fluorobenzil)-1 -[(2S)-1 -hidróxi-3-metilbutan-2-il]-7- metóxi-4-oxo-l,4-diidroquinolino-3-carboxílico, MK-0518, 5-( 1,1 -dióxido- l,2-tiazinan-2-il)-N-(4-fluorobenzil)-8-hidróxi-l,6-naftiridino-7-carboxamida, e aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.924.282, 6.921.759, 6.919.351, 6.841.558, 6.541.515, 6.403.347, 6.395.743, 6.380.249, 6.306.891, 6.271.402, 6.262.055, 6.245.806, 6.124.327, 6.110.716, 5.939.414, 5.858.738, 5.759.842, 7.176.220, e 7.112.600, cujos conteúdos são por este meio incorporados por referência em sua totalidade), inibidors da protease (e.g., saquinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, atazanavir, fosamprenavir, tipranavir, amprenavir, e darunavir), inibidores de fusão (e.g., enfurvitida), inibidores da maturação (e.g., bevirimat, ou PA-457) e inibidores da transcriptase inversa de nucleosídeo (e.g. zidovudino, didanosina, zalcitabina, estavudino, lamivudino, abacavir, enofovir, entricitabina, combivir, trizivir, truvada, e epzicom).

Outros compostos exemplificativos que podem ser metabolizados por mono-oxigenase do citocromo P450 incluem mas não são limitados a ritonavir, os imunossupressores ciclosporina, FK-506 e rapamicina, os agentes terapêuticos taxol e taxotere, o antibiótico claritromicina e os inibidores da protease HIV A-77003, A-80987, MK-639, saquinavir, VX-478, AG1343, DMP-323, XM-450, BILA 2011 BS, BILA 1096 BS, BILA 2185 BS, BMS 186,318, LB71262, SC-52151, SC-629 (N,N- dimetilglicil-N-(2-hidróxi-3-(((4-metoxifenil)sulfonil)(2-metilpropil)amino)-l- (fenilmetil)propil)-3-metil-L-valinamida), KNI-272, CGP 53437, CGP 57813 e U-103017,

Em certas formas de realização, são providos métodos para melhorar a farmacocinética de um inibidor da protease HIV (ou um seu sal farmaceuticamente aceitável) que seja metabolizado pela mono-oxigenase do citocromo P450. Os métodos compreendem administrar o inibidor da protease HIV em combinação ou altemação com um composto aqui descrito. Tal combinação ou altemação pode ser útil para inibir a protease HIV em humanos e pode também ser útil para inibição, tratamento ou proxilaxia de uma infecção por HIV ou AIDS em humanos. O inibidor da protease HIV pode ser qualquer inibidor da protease HIV conhecido daqueles hábeis na arte. Em certas formas de realização, o inibidor da protease HIV é amprenavir (Agenerase, GlaxoSmithkline), tipranavir (Aptivus, Boehringer Ingelheim), indinavir (Crixivan, Merck), saquinavir (Fortovase, Hoffmann-La Roche), mesilato de saquinavir (Invirase, Hoffmann-La Roche), lopinavir e ritonavir (Kaletra, GlaxoSmithkline), ritonavir (Norvir, Abott), darunavir (Prezista, Tibotec), sulfato de atazanavir (Reyataz), ou mesilato de nelfinavir (Viracept, Agouron), ou a combination deles.

Em subformas de realização particulares, os compostos aqui descritos podem ser administrados em combinação ou altemação com um, dois ou mais de outros agentes anti-HIV inibidores da protease ou inibidor da integrase, que possa potencialmente melhorar o metabolismo do segundo agente. Em uma subforma de realização, o agente adicional é selecionado de: um inibidor da protease opcionalmente selecionado de amprenavir, tipranavir, indinavir, saquinavir (incluindo mesilato de saquinavir), lopinavir, ritonavir, fosamprenavir, darunavir, atazanavir (incluindo o sal de sulfato), nelfinavir (incluindo o sal de mesilato), brecanivir, ou GS-8374; e

um inibidor da integrase tal como raltegravir (MK-0518) ou elvitegravir (GS-9137), ou GSK-364735.

Em geral, durante a terapia de altemação, uma dosagem eficaz de cada agente é administrada serialmente. Durante a terapia de combinação, dosagens eficazes de dois ou mais agentes são administradas juntas. As dosagens administradas dependem de fatores tais como taxas de absorção, biodistribuição, metabolismo e excreção para cada medicamento, bem como outros fatores conhecidos daqueles hábeis na arte. Deve ser citado que as quantidades de dosagem variarão com a severidade da condição a ser aliviada, a idade, peso e condição física geral do indivíduo que recebe o medicamento. Deve ser entendido ainda que para qualquer indivíduo particular, os regimes e programas de dosagem específicos devem ser ajustados durante o tempo, de acordo com a resposta do indivíduo ao medicamento, as necessidades do indivíduo e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições. Exemplos de faixas de dosagem adequadas para os compostos,, incluindo derivativos de nucleosídeo, tais como, por exemplo, D4T, DDI e 3TC, inibidores de nucleosídeos 2 '- ramificados ou da protease como nelfinavir e indinavir, podem ser encontrados na literatura científica e Physicians' Desk Reference. As faixas sugeridas para dosagens eficazes dos compostos da presente invenção são diretrizes somente e não se destinam a limitar o escopo ou uso da invenção.

O regime de combinação e altemação descrito pode ser útil no tratamento e prevenção de infecções retrovirais e outras condições relacionadas, tais como, por exemplo, complexo relacionado com a AIDS (ARC), linfadenopatia generalizada persistente (PGL), condições neurológicas relacionadas com a AIDS, posição anticorpo anti-HIV e condições positivas-HIV, sarcoma de Kaposi, trobocitopenia purpúrica e infecções oportunistas. Além disso, estes compostos ou formulações podem ser usados profilaticamente para evitar ou retardar a progressão de doença clínica em indivíduos que são anticorpo anti-HIV ou antígeno HIV positivas ou que foram expostas ao HIV.

Ensaios

Os compostos providos aqui podem ser ensaiados quanto à atividade contra HIV ou infecção por HIV por qualquer ensaio julgado adequado por uma pessoa hábil na arte. Ensaios exemplares incluem aqueles descritos nesta seção e aqueles providos nos Exemplos abaixo.

Sistemas de Cultura de Célula para Determinar Atividades

Antivirais

Esquemas de detecção de produto amplificado

Detecção heterogênea: Southern blotting, por exemplo, é uma técnica de detecção heterogênea. Na Southern blotting, é usada eletroforese para separar os produtos de amplificação poir tamanho e carga. Os produtos fracionados em tamanho são transferidos para uma membrana ou filtro por difusão, vacuosização ou eletromanchamento. As sondas de detecção rotuladas são hibridizadas nos alvos ligados-membrana, os filtros são lavados para remover qualquer sonda não-hibridizada e a sonda hibridizada da membrana é detectada por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos daqueles hábeis na arte.

Outros tipos de detecção heterogênea são baseados em captura específica dos produtos de amplificação por meio de ensaios imunossorbentes ligados por enzima (ELISAs). Um método usado com a PCR envolve a rotulação de um imprimador com um hapteno ou ligando, tal como biotina e, após amplificação, capturá-lo com uma microplaca revestida de anticorpo ou estreptavidina. O outro imprimador é rotulado com um repórter, tal como fluoresceína, e a detecção é conseguida adicionando-se um anticorpo antifluoresceína, tal como conjugado de peroxidase de rábano silvestre (HRP). Este tipo de método não é tão específico quanto a utilização de sondas de detecção, que hibridizam em produtos de amplificação definidos de interesse.

O sistema de sonda LCx (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) e o teste HIV-I Amplicor (Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA) são sistemas que utilizam métodos de detecção heterogêneos. No sistema LCx, sondas de oligonucleotídeo rotuladas por hapteno termociclam na reação de cadeia de ligase. Um hapteno de captura ou um hapteno de detecção é covalentemente ligado a cada um dos quatro oligonucleotídeos imprimadores. Na amplificação, cada produto amplificado (amplicon) tem um hapteno de captura e um hapteno de detecção. Quando a amplificação está completa, o instrumento do sistema LCx transfere a reação para um novo poço em que as micropartículas revestidas com anticorpo ligam-se aos haptenos de captura. Cada micropartícula é então irreversivelmente ligada a uma matriz de fibra de vidro. Uma etapa de lavagem remove a micropartícula de qualquer sonda que contenha somente o hapteno de detecção. O instrumento LCx adiciona um conjugado de fosfatase alcalina (AP) - anticorpo, que se liga ao hapteno de detecção. Um substrato fluorigênico para AP é 4-metillumbeliferila. A desfosforilação de 4-metilumbeliferila por AP converte-a em 4- metilundebeliferona, que é fluorescente.

O teste HIV-I Amplicor utiliza um formato ELISA. Após amplificação por PCR, o amplicon é desnaturado quimicamente. As sondas de oligonucleotídeo específicas de Amplicon capturam os filamentos desnaturados sobre uma microplaca revestida. O operador retira por lavagem quaisquer imprimadores não incorporados e material não hibridizado em uma etapa de lavagem e então adiciona um conjugado de avidina-HRP em cada poço. O conjugado liga-se ao amplicon rotulado por biotina capturado na placa. O operador em seguida adiciona S^^S^^tetrametilbenzidina (TMB), um substrato HRP cromogênico. Quando peróxido de hidrogênio está presente, HRP oxida TMB. O sinal é determinado colorimetricamente.

Detecção Homogênea: Uma vez que sondas de detecção hibridizadas e não-hibridizadas não sejam fisicamente separadas em sistemas de detecção homogêneos, estes métodos requerem menos etapas do que os método heterogêneos e, assim, são menos tendentes a contaminação. Entre os kits comercialmente disponíveis que utilizam detecção de rótulos fluorescentes e quemiluminescentes estão o sistema TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA), sistema BDProbeTeeET (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), Sistema QPCR 5000 (Perkin-Elmer Corp., Norwalc, CT), e Ensaio de Proteção de Hibridização (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA).

O sistema TaqMan detecta o amplicon em tempo real. A sonda de detecção, que hibridiza em uma região em uma região dentro do amplicon, contém uma fluorossonda doadora tal como fluoresceína em sua extremidade 5’ e um componente extintor como rodamina em sua extremidade 3’. Quando tanto o extintor como o fluoróforo estão no mesmo oligonucleotídeo, a fluorescência doadora é inibida. Durante a amplificação a sonda é ligada ao alvo. A polimerase Taq descloca-se e cliva a sonda de detecção quando ela sintetiza o filamento de substituição. A clivagem da sonda de detecção resulta em separação do fluoróforo do extintor, resultando em um aumento do sinal de fluorescência doador. Durante cada ciclo de amplificação o processo é repetido. O grau do sinal fluorescente aumenta quando o grau de amplicon aumenta.

Sinalizadores moleculares também utilizam extintores e fluoróforos. Os sinalizadores são sondas que são complementares ao amplicon alvo, porém contêm curtos estiramentos (aproximadamente 5 nucleosídeos) de oligonucleotídeos complementares em cada extremidade. As extremidades 20 5’ e 3’ dos sinalizadores são rotuladas com um fluoróforo e um extintor, respectivamente. Uma estrutura em grampo de cabelo é formada quando o sinalizador não é hibridizado em um alvo, trazendo em contato o fluoróforo e o extintor e resultando em extinção fluorescente. A região em laço contém a região complementar ao amplicon. Na hibridização em um alvo, a estrutura 25 em grampo de cabelo abre-se e o extintor e fluoróforo separam-se, permitindo o desenvolvimento de um sinal fluorescente. Um fluorômetro mede o sinal em tempo real.

O sistema BDProbeTecET utiliza um método de detecção em tempo real, que combina aspectos de TaqMan e sinalizadores moleculares. A sonda tem uma estrutura em laço de grampo de cabelo e contém rótulos de fluoresceína e rodamina. No sistema, entretanto, a região complementar à molécula alvo não está dentro do laço, porém na região 3’ do rótulo de rodamina. Em vez de conter a seqüência complementar ao alvo, o laço de filamento único contém um sítio de restrição para a enzima de restrição BsoBI. A seqüência de filamento único não é um substrato para a enzima. Os rótulos de fluoresceína e rodamina estão próximos entre si antes da amplificação, o que extingue a fluorescência de fluoresceína. A amplificação de deslocamento de filamento converte a sonda em uma molécula de filamento duplo. A enzima de restrição bsoBI pode clivar a molécula, resultando em separação dos rótulos e um aumento do sinal fluorescente.

O sistema QPCR 500 emprega eletroquimioluminescência com rótulos de rutênio. Um imprimador biotinilado é usado. Após amplificação, os produtos de biotina são capturados em contas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. As contas são transferidas para dentro de uma pilha de fluxo eletroquímico por aspiração e magneticamente retidas na superfície do elétrodo. Na estimulação eletroquímica, a sonda rotulada com rutênio emite luz.

O Ensaio de Proteção de Hibridização é usado em ensaios PACE não-amplificados da Gen-Probe, bem como em ensaios de M tuberculosis e C. trachomatis amplificados. As sondas de oligonucleotídeo de detecção em HPA são rotuladas com éster de acridínio (AE) quimioluminescentes por meio de um braço ligador. A hibridização ocorre por 15 minutos a 60 0C no mesmo tubo em que a amplificação ocorreu. O reagente de seleção, uma solução tamponada suavemente básica adicionada após hibridização, hidrolisa o AE em qualquer sonda não hibridizada, tomando-a não-quimioluminescente. O AE das sondas hibridizadas multiplica-se dentro do sulco menor da hélice dupla, desse modo protegendo- se da hidrólise pelo reagente de seleção. O AE emite um sinal quimioluminescente na hidrólise por peróxido de hidrogênio, seguido por hidróxido de sódio. Um luminômetro registra o sinal quemioluminescente por 2 segundos (um período denominado um iiIight off”) e reporta os fótons emitidos em termos de unidades relativas de luz (RLU).

O projeto de sonda de detecção é crítico em todas as

metodologias que utilizam sondas para detectar produtos de amplificação. As boas sondas de detecção hibridizam somente em produtos de amplificação específicos e não hibridizam em produtos não-específicos. Outros problemas chave na otimização das metodologias de detecção envolve a rotulação de sondas e a maximização da produtividade de amostra.

Métodos de Rotulação e Moléculas Repórter. As sondas de detecção podem ser rotuladas diversas diferentes maneiras. A incorporação

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enzimática de P ou S dentro das sondas é o método mais comum para rotulação isotópica. Em seguida à hibridização e lavagem, o sinal é detectado em película autorradiográfica.

Para realizar a detecção não-radioativa, as sondas podem ser rotuladas enzimaticamente e então detectadas com fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina, usando-se substratos AP como 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e tetrazólio nitroazul (NBT). Substratos 20 quimioluminescentes tais como Lumi-Phos 350 ou Lumi-Phos Plus (Lumigen, Southfield, MI) também pode ser usados com AP. Além disso, digoxigenin-11 -dUTP pode ser incorporado enzimaticamente dentro do DNA ou RNA e conjugados AP anti-digoxigenina podem ser usados com detecção colorimétrica ou quimioluminescente.

Há numerosos outros tipos de moléculas repórter incluindo

componentes quimioluminescentes como ésteres de acridínio. Muitos componentes fluorescentes são disponíveis também. Compostos eletroquimioluminescentes, tais como tris (2,2’-bipiridino)rutênio (II), podem ser usados também. Outros exames destas e similares técnics podem ser encontrados em Schiff et al, Semin. Liver Dis., 1999, 19:Suppl. 1 : 3-15).

Ensaio de Biodisvonibilidade em Macacos Cvnomolsus Dentro de 1 semana antes do início do estudo, o macaco cynomolgus é cirurgicamente implantado com um cateter venoso crônico e orifício de acesso venoso (VAP) subcutâneo, para facilitar a coleta de sangue e sofre um exame físico incluindo avaliações de químida hematológica e soro e o peso corporal é registrado. Cada macaco (total seis) recebe cada dose de composto ativo em um nível de dose de 10 mg/kg em uma concentração de dose de 0,5 mg/ml, via um bolo intravenoso (3 macacos, IV) ou via gavagem oral (3 macacos, PO). Cada seringa de dosagem é pesada antes da dosagem para determinar gravimetricamente a quantidade de formulação administrada. Amostras de urina são coletadas via captura por panela nos intervalos designados (aproximadamente 18-0 horas predose, 0-4, 4-8 e 8-12 horas posdosagem) e processadas.

Amostras de sangue são coletadas também (predose 0,25, 0,5,

1, 2, 3, 6, 8, 12 e 24 horas posdosagem) via o cateter venoso crônico e VAP ou de um vaso periférico, se o procedimento de cateter venoso crônico caso não seja possível. As amostras de sangue e urina são analisadas por LC/MS quanto ao tempo dec concentração máxima (Cmax) quando a máxima 20 concentração é obtida (Tmax), área sub a curva (AUC), meia vida da concentração da dosagem (Ty2) depuração (CL), volume de estado constante e distribuição (Vss) e biodisponibilidade (F).

Atividade de Toxicidade da Medula Óssea Células de medula óssea humanas são coletadas de voluntários 25 saudáveis normais e a população mononuclear é separada por centrifugação de gradiente Ficoll-Hypaque como descrito anteriormente por Sommadossi J- P, Carlisle R. "Toxicity of 3'-azido-3'-deoxithymidine e 9-(l,3-dlHydróxi-2- propoxymetil)guanine for normal human hematopoietic progenitor cells in vitro", Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1987; 31 :452-454; e Sommadossi J-P, Schinazi RF, Chu CK, Xie M-Y. "Comparison of citotoxicity of the (-)- e (+)-enantiomer of 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine in normal human bone marrow progenitor eells" Biochemieal Pharmacology 1992; 44:1921-1925. Os ensaios de cultura para CFU-GM e BFU-E são 5 realizados usando-se um ágar macio de bicamada ou método de metilcelulose. Os medicamentos são diluídos em meio de cultura de tcido e filtrados. Após

14 a 18 dias a 37 0C em uma atmosfera umidificada de 5 % CO2 em ar, colônias maiores do que 50 células são contadas utilizando-se um microscópio invertido. Os resultados são apresentados como a inibição IO percentual de formação de colônia na presença de medicamento em comparação com culturas de controle de solvente.

Ensaio de Citotoxicidade

As células são semeadas em uma taxa entre 5 x 103x5x IO4/ poço em placas de 96 poços em meio de crescimento durante a noite a 37 0C 15 em uma atmosfera de CO2 (5 %) umidificada. Novo meio de crescimento contendo diluições seriais dos medicamentos é então adicionado. Após incubação por 4 dias, as culturas são fixadas em 50 % TCA e tingidas com sulforrodaminaB. A densidade óptica é lida a 550 nm. A concentração citotóxica é expressa como a concentração requerida para reduzir o número de 20 células em 50 % (CC5o).

Ensaio de Proteção de Célula (CPA)

O ensaio é realiado essencialmente como descrito por Baginski, S. G.; Pevear, D. C; Seipel, M.; Sun, S. C. C; Benetatos, C. A.; Chunduru, S. K.; Rice, C. M. e M. S. Collett "Mechanism of action of a 25 pestivirus antiviral compound" PNAS USA 2000, 97(14), 7981-7986. Células MDBK (ATCC) são semeadas em placas de cultura de 96 poços (4000 células por poço) 24 horas antes do uso. Após infecção com BVDV (cepa NADL, ATCC) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,02 unidade formadora de placa (PFU) por célula, diluições seriais dos compostos de teste são adicionadas em células tanto infectadas como não infectadas em uma concentração final de 0,5 % DMSO em meio de crescimento. Cada diluição é testada em quadriplicata. As densidades das células e inóculos de vírus são ajustados para assegurar contínuo crescimento celular por todo o experimento e para obterem-se mais do que 90 % destruição de células induzida por vírus nos controles não tratados, após quatro dias pos-infecção. Após quatro dias, as placas são fixadas com 50 % TCA e tingidas com sulforrodamina B. A densidade óptica dos poços é lida em uma leitora de microplaca a 550 nm. Os valores concentração 50 % eficaz (EC50) são definidos como a concentração de composto que obtém redução de 50 % de efeito citopático do vírus.

Ensaio de Redução de Placa

Para cada composto a concentração eficaz é determinada em placas de 24 poços em duplicata por ensaios de redução de placa. As monocamadas são infectadas com 100 PFU/poço de vírus. Em seguida, diluições seriais dos compostos de teste em MEM suplementado com 2 % de soro inativado e 0,75 % de metil celulose são adicionadas às monocamadas. As culturas são ainda incubadas a 37 0C por 3 dias, em seguida fixadas com 50 % de etanol e 0,8 % de Crista Violeta, lavadas e secadas ao ar. Em seguida as placas são contadas para determinar a concentração para obter-se 90 % de supressão de vírus.

Atividade Biológica Contra Cepas de HIV Resistentes a

Medicamento

Em uma forma de realização, a eficácia de um composto anti- HIV é medida in vitro por um ensaio rápido, sensível e automatizado, que envolve a redução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio (MTT). Uma linhagem de célula transformada-HIV que é altamente permissiva e seletiva para infecção por HIV, tal como, por exemplo, a linhagem de célula T-4, MT-4, é escolhida como a linhagem de célula alvo (Koyanagi et al., Int. J. Cancer, 1985, 36:445-451). Redução in situ de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT) como avaliado espectrofotometricamente é o padrão pelo qual a viabilidade de tanto células infectadas-simuladas como células infectadas-HIV é medida. A inibição do efeito citopático induzido-HIV serve como o ponto final. Uma 5 concentração citotóxica de 50 % (CC5o em μΜ) é definida como a concentração do composto que reduz a absorvência da amostra de controle infectada-simulada em 50 %. A eficácia percentual de um composto anti-HIV é calculada pela fórmula (expressa como uma %):

(ODcomposto teste Hiv) (ODcontroie)/(ODCgiuias infectadas simuladas)-(ODCOntrole)

Aqui (ODcomposto teste hiv) é a densidade óptica medida pra uma 10 quantidade específica de um composto de tste em células infectadas-HIV; (ODc0ntr0Ie) é a densidade óptica medida para células de controle não-tratadas, infectadas-HIV; e (ODc0IllIas infectadas simulado) é a densidade óptica medida para células de controme infectadas-simulado que não são tratadas. Os valores de densidade óptica tipicamente são avaliados a 540 nm. A dosagem de um 15 composto de teste anti-HIV que fornece 50 % de proteção de acordo com a fórmula precedente é definida como a concentração 50 % inibitória (IC5o em μΜ). O índice de seletividade (SI) é definido como a relação da CC5o para a

IC50-

Em outra forma de realização, o ensaio ELISA p24 é usado para determinar a eficácia de um composto anti-HIV. Este imunoensaio de replicação viral mede a quantidade de antígeno de capsídeo (núcleo) viral p24 presente e é disponível comercialmente de fontes tais como, por exemplo, Coulter Corporation/Immunotech, Inc.® (Westbrook, MI).

Ainda outras formas de realização incluem um ensaio de transcriptase inversa em que a quantidade de replicação viral é medida utilizando-se um sistema imprimador de gabarito de homopolíero poli rA:oligo dT, que quantifica a incorporação dentro de células de monofosfato de timidina tritiado por métodos de contagem de cintilação (Southern Research Institute, University of Alabama, Birmingham, AL); um ensaio de inibição sincicial que emprega CEM-SS, HeLA-CD4 ou células de HeLa- CD4-LTR-b-galactosidase, tendo um ponto final imuno-fluorescente, quimioluminescente ou colorimétrico; e um ensaio de inibição por fixação e fusão, que utiliza linhagens de células indicadoras e quantificação por avaliação quimioluminescente, colorimétrica ou microscópica (Southern Research Institute, University of Alabama, Birmingham, AL).

Em uma forma de realização os compostos indol da presente invenção não exibem resistência cruzada com outros inibidores da transcriptase inversa não-nucleosídeo (NNRTIs), pelo fato de que os compostos da presente invenção exibem uma EC5O (em concentração molar) em uma cepa HIV mutante menor do que aproximadamente concentração de 50, 25, 10 ou 1 μΜ. Em uma forma de realização típica, os NNRTIs exibem uma EC5O em uma cepa de HIV mutante menor do que aproximadamente concentração de 5, 2,5, 1 ou 0,1 μΜ. O grau de resistência à reticulação contra uma cepa resistente a medicamento de HIV é medida avaliando-se a EC50 do composto de oxo-pirimidina desejado no vírus mutado alvo, isto é, resistente a medicamento.

Composições Farmacêuticas

Hospedeiros, incluindo humanos, infectados com um vírus ou qualquer outra condição descrita aqui, podem ser tratados administrando-se ao paciente uma quantidade eficaz do composto ativo ou um seu sal ou promedicamento farmaceuticamente aceitável, opcionalmente na presença de um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Os compostos podem ser administrados a um indivíduo em necessidade deles, opcionalmente em combinação ou altemação com outro agente terapêutico e/ou com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização, um indivíduo infectado com HIV pode ser tratado administrando- se àquele indivíduo uma quantidade eficaz de um composto aqui descrito, ou um seu sal, promedieamento, estereoisômero ou tautômero, na presença de um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Para indivíduos com múltipla resistência a medicamento, o composto de fosfoindol é administrado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Os 5 compostos ativos podem ser administrados por qualquer via apropriada, por exemplo, oral, parenteral, entérica, intravenosa, intradérmica, subcutânea, percutânea, transdérmica, intranasal, topicamente ou por terapia de inalação e pode ser em forma sólida, líquida ou de vapor.

O(s) composto(s) ativo(s) em uma forma de realização são 10 incluídos dentro do veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em uma quantidade suficiente para suprir a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto ativo, a fim de, p. ex., inibir infecção viral, sem causar sérios efeitos tóxicos em um indivíduo tratado. Uma “quantidade inibitória” inclui uma quantidade de ingrediente ativo

suficiente para deter a replicação viral, conforme medido, por exemplo, por um ensaio tal como os referidos aqui.

Uma dose típica do composto pode ser na faixa de cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg, de cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dia, mais geralmente de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal 20 do receptor por dia. Dosagens mais baixas podem ser usadas, por exemplo, doses de cerca de 0,5-100 mg, 0,5-10 mg, ou 0,5-5 mg per quilograma de peso corporal por dia. Doses mesmo mais baixas podem ser usadas e, assim, as faixas podem incluir de cerca de 0,1 - 0,5 mg/kg de peso corporal do receptor por dia. A faixa de dosagem eficaz dos derivativos 25 farmaceuticamente aceitáveis é calculada com base no peso do composto derivativo de indol precursor a ser suprido. Se o próprio composto derivativo exibir atividade, então a dosagem eficaz pode ser estimada como acima usando-se o peso do derivativo ou por outros meios conhecidos daqueles hábeis na arte. Os compostos são convenientemente administrados em unidades de qualquer forma de dosagem adequada, incluindo mas não limitado a conter de cerca de 7 a 3000 mg, de cerca de 70 a 140 mg ou de cerca de 25 a 1000 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária. Por exemplo, uma dosagem oral de cerca de 50 a 1000 mg é usualmente conveniente, incluindo uma ou múltiplas formas de dosagem de 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg. Dosagens mais baixas podem ser preferíveis, por exemplo, de cerca de 10-100 ou 1-50 mg. Também contempladas são doses de 0,1-50 mg, 0,1-20 mg., ou 0,1-10 mg. Além disso, doses mais baixas podem ser utilizadas no caso de administração por uma via não oral, como, por exemplo, por injeção ou inalação.

O ingrediente ativo pode ser administrado uma vez, ou pode ser dividido em um número de doses menores a ser administradas em intervalos de tempo. Entende-se que a dosagem e duração de tratamento precisas é função da doença sendo tratada e podem ser determinadas empiricamente usando-se protocolos de teste conhecidos ou por extrapolação de dados de teste in vivo ou in vivo. Deve ser citado que concentrações e valores de dosagem podem também variar com a severidade da condição a ser aliviada. Deve ser ainda entendido que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados durante o tempo, de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições e que as faixas de concentração expostas aqui são exemplares somente e não são destinadas a limitar o escopo ou prática das composições aqui providas.

Em certas formas de realização, o composto ou composição provida aqui pode ser administrado como uma dose única de uma vez por dia ou, preferivelmente, como doses divididas por todo o dia. Em formas de realização particulares, o composto ou composição é administrado quatro vezes por dia. Em formas de realização particulares, o composto ou composição é administrado três vezes por dia. Em formas de realização particulares, o composto ou composição é administrado duas vezes por dia. Em formas de realização particulares, o composto ou composição é administrado uma vez por dia.

Em uma forma de realização, o ingrediente ativo é administrado para obterem-se concentrações de plasma pico do composto ativo de cerca de 0,02 a 70 μΜ, ou de cerca de 0,5 to 10 μΜ. Por exemplo, isto pode ser conseguido por injeção intravenosa de uma solução de 0,1 a 5 % de ingrediente ativo, opcionalmente em solução salina, ou administrado como um bolo de ingrediente ativo. Deve ser entendido que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados durante o tempo para satisfazer necessidades individuais e variarão dependendo das taxas de absorção, inativação e excreção do medicamento. As concentrações expostas aqui são exemplares somente e não são destinadas a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada. O ingrediente ativo pode ser administrado todo de uma vez ou pode ser dividido em numerosas doses menores a serem administradas em intervalos de tempo variáveis.

Um modo de administração do composto ativo é oral. As composições orais incluem usualmente um diluente inerte ou um veículo comestível. Elas podem ser incluídas em cápsulas de gelatina, comprimidas em tabletes ou supridas em forma líquida. Para administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes ou formulado como dispersões sólidas ou soluções sólidas e usadas na forma de tabletes, trociscos ou cápsulas. Por uma "dispersão sólida" pretendemos significar um estado sólido compreendendo pelo menos dois componentes em que um componente é disperso mais ou menos uniformemente por todo o outro componente. Por "solução sólida" pretendemos significar um estado sólido compreendendo pelo menos dois componentes que são química e fisicamente integrados para produzir um produto homogêneo. Uma solução sólida é típica através de uma dispersão sólida porque forma mais facilmente uma solução líquida no contato com um meio líquido apropriado, desse modo aumentando a biodisponibilidade de um medicamento. Agentes de ligação e/ou materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis também podem ser incluídos como parte desta composição.

Os tabletes, pílulas, cápsulas, trociscos e similares podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose; um agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante tal como bióxido de silício coloidal; um agente adoçante como sacarose ou sacarina; e um agente aromatizante, tal como hortelã pimenta, salicilato de metila ou aromatizante de laranja. Quando a forma unitária de dosagem for uma cápsula, ela pode conter um veículo líquido tal como óleo graxo, além de qualquer material das espécies dadas acima. Além disso, as formas de dosagem unitária podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, tais como, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma-laca ou outros agentes entéricos.

Os compostos podem ser administrados como um componente de um elixir, suspensão, xarope, pastilha, goma de mascar ou similares. Um xarope pode conter sacarose como um agente adoçante, preservativos, corantes, colorantes e aromatizantes, além dos compostos ativos.

Os compostos ativos ou seus sais ou promedicamentos farmaceuticamente aceitáveis podem ser misturados com outros materiais ativos que não prejudiquem a ação desejada ou com materiais que suplementem a ação desejada, tais como antibióticos, antifungicos, anti- inflamatórios, inibidores da protease ou outros agentes antivirais nucleosídeos ou não-nucleosídeos. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea ou tópica podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, parâmetro de programação genética ou outros solvents sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. Uma preparação parenteral normalmente incluirá água estéril e pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de mútiplas doses produzidos de vidro ou plástico.

Se administrados intravenosamente, certos veículos são soluções salinas fisiológicas, solução salina tamponada com fosfato (PBS), uma solução de glicose ou uma solução mista compreendendo glicose e solução salina. Em uma forma de realização, o composto ativo é preparado com um veículo que protegerá o composto contra rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo um implante e/ou sistema de suprimento microencapsulado. Podem ser usados polímeros biocompatíveis biodegradáveis, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Os materiais podem ser obtidos comercialmente na Alza Corporation ou preparados de acordo com métodos conhecidos daqueles hábeis na arte. Se a administração for percutânea, tal como, por exemplo, através do uso de um emplastro ou pomada, o veículo associado pode compreender um agente de intensificação da penetração e/ou um agente umectante adequado que não sejam nocivos à pele. Se inalação ou insuflação for a via de administração desejada, então a composição da presente invenção inclui o composto na forma de uma solução, suspensão ou pó seco que possa ser suprida através dos orifícios oral e/ou nasal. As suspensões lipossomais, que incluem lipossomos alvejados a células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais também são típicas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas são preparadas de acordo com métodos conhecidos daqueles hábeis na arte, por exemplo, como descrito na Patente U.S. No. 4.522.811, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Por exemplo, formulações lipossomais podem ser preparadas dissolvendo-se lipídeo(s) apropriado(s), tais como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina e colesterol, em um solvente orgânico que mais tarde é evaporado, deixando atrás uma película fina de lipídeo seco na superfície do recipiente. Uma solução aquosa do composto ativo ou um seu sal ou promedicamento, é então introduzida dentro do recipiente. O recipiente é redemoinhado para livrar material lipídico de seus lados e para dispersar agregados lipídicos, desse modo formando a suspensão lipossomal. Processos para Preparar os Compostos Ativos

Um esquema geral exemplar para a síntese dos fosfoindóis é provido no Esquema 1

Esquema Geral para Síntese de Fosfoindóis

T »P<S) 9

enantiômero P(R) reciclado

Esquema 1 A síntese envolve o tratamento do Indol 1 N-protegido com uma espécie litiante adequada, por exemplo, n-butil lítio, seguido por um eletrófilo de fósforo apropriado, por exemplo, dietilcolorofosfito, para fornecer um intermediário P(III) que seja parcialmente hidrolisado sob condições ácidas para produzir o fosfinato-H 2. A etapa ii consiste de uma reação de acoplamento catalisada por paládio entre indol fosfinato-H 2 e iodocinamonitrila 11. A transesterificação de etila em metila, seguida por hidrólise de tanto o éster carboxilato como grupos de proteção-N, com, por exemplo, hidróxido de lítio ou t-butóxido de potássio a 5 0C em água- tetraidrofurano, dá acesso ao ácido indol 5. A resolução quiral dos enanciômeros de 5, utilizando-se uma base quiral, seguido por formação de amida, propicia o composto final 7.

Um segundo esquema geral exemplar para a síntese de fosfoindóis é provido no Esquema 2. Esquema Geral 2 para Síntese de Fosfoindóis

enantiômero P(R) reciclado

Esquema 2

Esta síntese envolve tratamento do indol 1 N-protegido com fosfinato de metila sob condições de catálise de paládio suave, para produzir o indol fosfinato-H 2. A etapa ii consiste de uma reação de acoplamento catalisada por paládio entre o indol fosfinato-H 2 e iodocinamonitrila 11. A hidrólise de tanto o éster de carboxilato como grupos de proteção-N, com, por exemplo, hidróxido de lítio ou t-butóxido de potássio a 5 0C em água- tetraidrofiirano, dá acesso ao ácido de indol 5. A resolução quiral dos enanciômeros de 5, empregando-se uma base quiral, seguido por formação de amida, propicia o composto final 7.

Uma via alternativa exemplar para a síntese de fosfoindóis é mostrada no Esquema 3.

Rota alternativa para síntese de Fosfoindóis

enantiômero P(R) reciclado

Esquema 3

Uma síntese alternativa envolve o acoplamento de indol 1 N- protegido com aril H-fosfinato 13, empregando-se catalisador de paládio, ligando, base, em um solvente apropriado em temperatura moderada para fornecer o fosfoindol 4. A formação de aril fosfinato-H 13 é descrita no Esquema 4. A hidrólise de tanto o éster de carboxilato como grupos de proteção-N, com por exemplo hidróxido de lítio ou t-butóxido de potássio a 5 0C em água-tetraidrofurano dá acesso ao ácido de indol 5. A resolução quiral dos enanciômeros de 5, empregando-se uma base quiral, seguido por formação de amida, propicia o composto final 7. 10

As sínteses de iodocinamonitrila e cinamonitrila H-fosfinato são mostradas no Esquema 4.

Síntese de Iodocinamonitrila de dibromotolueno

Br I

9 10 11

Síntese de cinamonitrila H-fosfinato de iodocinamonitrila o ^cn

H-P-OH PhNH2 H iv^

Acoplamento

Esterifi cação

O

H-P-OR3 H vi

Acoplamento

13 R3 = Me

14 R3=Et

Vii

P-transesteirifi cação

O=P-H

i

Iodocinamonitrila 11 pode ser preparada de dibromotolueno 8. A formação de mono-aldeído de 9 é conseguida por mono-litiação, por exemplo, com n-butil lítio e cloreto de n-butil magnésio e subsequente tratamento com Ν,Ν-dimetilformamida. Uma reação Wittig-Horner-Emmons no aldeído 9 usando-se, por exemplo, dietil cianometilfosfonato e hidreto de sódio, prossegue para fornecer principalmente o trans-isômero, que pode ser ainda enriquecido por cristalização para fornecer bromocianamonitrila 10. A iodoinação é então realizada para prover o desejado intermediário 11.

Opcionalmente, a iodocinamonitrila 11 pode ser convertida no aril fosfinato-H 13 por: 1. acoplamento com sal de ácido de hipofósforo de anilínio, seguido por esterificação ou por 2, um acoplamento de paládio direto com fosfinato de alquila. Adicionalmente, o etil aril fosfinato-H 14 pode ser transesterificado para fornecer o fosfinato-H de metila 13.

3-fosfoindóis podem ser preparados de acordo com técnicas conhecidas daqueles hábeis na arte, incluindo técnicas descritas na Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2006/0074054, cujo conteúdo é por este meio incorporado por referência em sua totalidade.

Outra síntese geral para preparar o fosfinato de indol é provida pelo esquema abaixo. A síntese começa do indol 1, que é 3-halogenado e N- protegido (ou N-protegido e 3-halogenado) para fornecer o indol 3 protegido. Os grupos de proteção ("PG") podem ser fenilsulfonila, terc-butilcarbamato (Boc), benzilcarbamato (Cbz), benzoíla, benzila, parametoxibenzila ou outra benzila substituída, terc-butildimetilsilila, terc-butildifenilsilila ou qualquer proteção indol N-1. A última 3 está envolvida em uma troca de halogênio- metal, por exemplo, com n-butil lítio e então reage com um dietil clorofosfito para propiciar, após hidrólise ácida, fosfinato-H 4 ou envolvida em uma reação catalisada por paládio com éster hipofosforoso para propiciar o mesmo produto 4. O Indol fosfmato-4 é então envolvido em outra reação catalisada por paládio com um aril-haleto para fornecer indol 3-fosfinato 5. No caso de diferente R do grupo Metila, uma transesterificação de 4 em amônia em metanol fornece fosfinato-H indolecarboxamida 6. Este composto está também envolvido em uma reação catalisada por paládio com um aril-haleto para propiciar o composto final 7. CO2Et

Halogenação

CO2Et

Proteçâo-N

CO2Et

1) nBuLi

2) CIP(OR)2

3) HCI1M

OU

H2P(O)OR

Catalisador Pd, Ligando, Solvente, aquecimento base

X* I. Br, OTf R= Me, Et, Alk, Ar

CO2Et

ArX

Catalisador Pd1 Ligando, Solvente, aquecimento base

NH3ZMeOH

transesterifi cação (se R não Me)

H

R4-

OMe

ArX

Catalisador Pd1

CO2Et

CONH2 Ligando, Solvente, aquecimento base

10

Esquema 5

Os catalisadores de paládio adequados para a reação de acoplamento cruzado incluem, por exemplo: paládio tetracis(trifenilfosfina), acetato de paládio, propionato de paládio, diacetonitriledicloreto, dipaládio tris(dibenzilidenoacetona) (Pd2dba3), paládio carbeno N-heterocíclico (NHC) ou qualquer outro catalisador de paládio que seja conhecido daqueles hábeis na arte, usados sozinhos ou em associação com ligandos tais como trifenilfosfina, difenilfosfinoferroceno, difenilfosfinopropano ou ligandos de anil fosfina ou difosfina, que são conhecidos daqueles hábeis na arte. Solventes adequados para a reação de acoplamento cruzada catalisada-paládio inclui por exemplo: DMF, acetonitrila, NMP, dioxano, metanol, THF, tolueno. Bases adequadas para a reação de acoplamento cruzada catalisada por paládio incluem, por exemplo: Et3N, di-isopropilamina, K2CO3, Na2CO3, NaHCO3, Cs2CO3, N-metilmorfolina, DABCO, DBU. Em outras formas de realização, 3-fosfoindóis podem ser

preparados reagindo-se um arilfosfinato-H com um 3-iodoindol como representado no esquema abaixo. O 3-iodoindol pode ser preparado por iodação de uma indol usando-se reagentes de iodação conhecidos daqueles hábeis na arte. Opcionalmente, o átomo de nitrogênio do 3-iodoindol pode ser protegido com qualquer grupo de proteção julgado adequado para aqueles hábeis na arte. Reação com um arilfosfinato-H fornece o composto de 3- fosfoindol. No esquema, PG indica o grupo de proteção. O grupo de proteção pode ser removido de acordo com qualquer técnica conhecida daqueles hábeis na arte.

um enanciômero pode ser conseguida por resolução de misturas racêmicas de 3-fosfoindóis preparados por qualquer método adequado ou por síntese quiral de materiais de partida quirais, reagentes ou catalisadores. Os compostos podem ser preparados por uma das técnicas descritas aqui ou por uma combinação das técnicas, onde necessário. Por exemplo, a síntese quiral pode ser combinada com resolução química para preparar um enanciômero de um fosfoindol-3 na pureza química e estereoisomérica desejada. Além disso, os estereoisômeros de fosfoindóis-3 podem ser separados por cromatografia usando-se fase sólida quiral. A separação cromatográfica dos derivados diastereoméricos dos estereoisômeros de fosfoindóis-3 é também considerada. Para resolver uma mistura de compostos quirais, qualquer método julgado adequado para aqueles hábeis na arte pode ser empregado, p.ex., formação de sais iônicos, diastereoméricos (ou complexos de coordenação) com compostos quirais e separação por cristalização fracional ou outros métodos, formação de compostos diastereoméricos com reagentes derivatizantes quirais, separação dos diastereômeros e conversão nos enanciômeros puros, separação dos enanciômeros diretamente sob condições quirais em uma variedade de matrizes incluindo cromatografia supercrítica e hidrólise enzimática. Vide, p. ex., Eliel & Wilen, 1994, Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994); Lochmuller, 1975, J. Chromatogr., 113:(3) 283-302.

Por exemplo, sais diastereoméricos podem ser formados pela reação de bases quirais enanciomericamente puras, tais como, por exemplo, cinchonidina, brucina, quinina, efedrina, estricnina, a-metil-P-feniletilamina (anfetamina) e similares com compostos providos aqui. Em certas formas de realização, um sal diastereomérico é formado por reação com um alcalóide, tal como ciconidina. Os sais diastereoméricos podem ser induzidos para separar, por exemplo, por cristalização fracional ou cromatografia iônica. Alternativamente, uma mistura de compostos quirais a ser resolvida pode ser reagida com um enanciômero de um composto quiral para formar um par diastereomérico. Por exemplo, compostos diastereoméricos podem ser formados reagindo-se os compostos da presente invenção com reagentes derivatizantes quirais enanciomericamente puros, tais como, por exemplo, derivativos de mentila, seguido por separação dos diastereômeros e hidrólise para produzir composto livre, enanciomericamente enriquecido. Alternativamente, uma mistura de compostos quirais pode ser separada por cromatografia usando-se uma fase estacionária quiral, vide, p. ex., Chiral Liquid Chromatography, W. J. Lough, Ed. Chapman and Hall, New York, (1989); Okamoto, 1990, J. Chromatogr. 513:375-378. Em certas formas de realização, são providos aqui métodos de produzir um composto da presente invenção por reação de uma mistura racêmica com um reagente quiral, seguido pela recuperação do produto resultante e conversão ao composto da presente invenção. Em certas formas de realização, são providos métodos de preparar um composto de qualquer uma das Fórmulas A-D, compreendendo as etapas de reagir uma forma racêmica do composto com um reagente quiral, tal como cinchonidina, recuperação do produto de reação e conversão no composto de qualquer uma das Fórmulas A-D. Em formas de realização particulares, são providos aqui métodos de produzir o composto I, compreendendo a etapa de contatar a forma racêmica do derivativo de 2-carboxila do composto I com (-)- cinchonidina, recuperação do produto de reação e conversão no composto I com, p. ex., ácido seguido por formação de amida. Em formas de realização particulares, são providos aqui métodos de produzir o composto II, compreendendo a etapa de contatar a forma racêmica do derivativo de 2- carboxila do composto II com (+)-cinchonina, recuperação do produto de reação e conversão no composto II com, p. ex., ácido, seguido por formação de amida. Em formas de realização particulares, são providos aqui métodos de produzir o composto III, compreendendo a etapa de contatar a forma racêmica do derivativo de 2-carboxila do composto III com (-)-cinchonidina, recuperação do produto de reação e conversão no composto III com, p.ex., ácido, seguido por formação de amida. Em formas de realização particulares, são providos aqui métodos de produzir o composto IV, compreendendo a etapa de contatar a forma racêmica do derivativo de 2-carboxila de um composto IV com (+)-cinchonina, recuperação do produto de reação e conversão no composto IV com, p. ex., ácido, seguido por formação de amida. Em outras formas de realização, são providos aqui métodos alternativos com outros reagentes quirais, tais como efedrina e hemi-hidrato de efedrina. Em certas formas de realização, são providos aqui métodos de produzir um composto por reciclagem de seu enanciômero oposto. Em tais formas de realização, uma mistura racêmica é resolvida de acordo com uma técnica descrita aqui. Além de obter-se o desejado enanciômero, o enanciômero oposto pode ser reciclado para aumentara produção do enanciômero desejado. Por exemplo, um composto de Fórmula B pode ser reciclado para produzir um composto de Fórmula C e vice-versa. Em uma reação de reciclagem, um composto é contatado com um reagente capaz de racemizar o composto. Por exemplo, em certas formas de realização, um composto de fosfoindol provido aqui é contatado com um reagente de racemização capaz de reagir com um grupo fosfo. Em certas formas de realização, o reagente de racemização é, por exemplo, um ácido, um base ou um reagente de halogenação. Em certas formas de realização, o reagente de racemização é, por exemplo, cloreto de oxalila. Após contato com o reagente de racemização, os enanciômeros podem ser resolvidos por qualquer técnica descrita aqui. Em formas de realização particulares, o composto II pode ser reciclado para produzir o composto III. Métodos exemplificativos são providos abaixo.

Os métodos abaixo descrevem a síntese de 3-fosfoindóis enanciomericamente puros de Fórmulas A-D ou Compostos I-IV como exemplos não limitativos destas técnicas.

1. Resolução Cinética Dinâmica (DKR)

Em uma resolução cinética, começando-se de uma mistura racêmica S (SR e Ss), um enanciômero reagirá preferencialmente para fornecer o produto Pr com uma produção máxima teórica de 50 %. Se a racemização puder ocorrer concomitantemente com a resolução cinética, então teoricamente 100 % da mistura racêmica podem ser convertidos em um enanciômero (Esquema 7). Este processo é conhecido como resolução cinética dinâmica (DKR). Sr

Ss .....Ps

kr»ks produção máx. Pr = 50% Separação de Pr e Ss requerida Resolução cinética padrão

krac^kr^ks

produção máx. Teórica 100% em Pr Resolução cinética dinâmica

Esquema 7: (S = substrato, P = produto) Produção teórica máx 100 % em Pr - Resolução cinética

dinâmica -.

Os problemas associados com a resolução cinética padrão são

que somente uma produção teórica máxima de 50 % é possível e a separação do produto desejado de uma quantidade substancial do substrato não convertido é necessária. Par uma eficiente DKR, há algumas exigências específicas (Strauss, U. T.; Felfer, U.; Faber, K. Tetrahedron: Asymmetry 1999,70,107):

1. A resolução cinética deve ser irreversível a fim de assegurar elevada enantiosseletividade.

2. A relação enantiomérica (E = kR / Ks) deve ser pelo menos maior do que ~20.

3. Para evitar depleção de Sr, a taxa de racemização (krac) deve ser pelo menos igual a ou maior do que a taxa de reação do enanciômero rápido (kR).

4. No caso em que as seletividades sejam somente moderadas, a krac deve ser maior do que kR por um fator de -10.

5. Qualquer reação espontânea envolvendo os enanciômeros do substrato bem como racemização do produto deve estar ausente. 10

O Η RV V-ORs

Rp

rápido

RÍ"

Catalisador paládio Fosfinas Quirais Base/CH3CN

lento

Esquema 8

Em uma forma de realização, a síntese dos 3-fosfoindóis enanciomericamente puros, a discriminação quiral entre os enanciômeros a fim de reagir com o haleto de arila é realizada com uma fosfina quiral, que é um componente do catalisador de paládio e produzirá preferencialmente composto 4' (Esquema 8). Esta reação de acoplamento de paládio é uma variação das reações de acoplamento de paládio descrita nos esquemas acima para a preparação de misturas racêmicas de 3-fosfoindóis. Os ligandos de fosfirna quiral podem ser qualquer ligando que produza a requerida seletividade e taxa de reação na transformação de 3-fosfoindóis 3' em 3- fosfoindóis substituídos 4'. Os ligandos de fosfina quiral podem ser ligandos monodentados ou bidentados. Exemplos não limitativos de ligandos de fosfina quiral incluem ferrocenil fosfinas P-quirais, (R)-(+)-BINAP, (S)-(-)- BINAP, (R,R)-CHIRAPHOS, e (S,S)-CHIRAPHOS. 10 R.

. O H

^L· JL ÍTV; R6^ I \ R7' pG 3'

rápido

"^y^yRj" "RexY^R2"

Catalisador paládio

Fosfinas

base/CH3CN

lento

R Yi η [y-z R5V Rg1 R7' PG 4"

Onde a quiralidade é induzida por grupos quirais: R3, Z ou PG

£squema 9

Em outra forma de realização, a discriminação quiral pode ser introduzida juntando-se um grupo quiral à mistura racêmica de 3-fosfoindóis, produzindo-se uma mistura de diastereômeros que reagirá em diferentes taxas com o sistema catalisador de paládio não-quiral (Esquema 9). O segundo centro quiral pode ser adicionado como um componente do substituinte R3, o grupo Z ou o grupo de proteção PG. O grupo quiral não é limitado e qualquer grupo que induza a desejada seletividade na reação em uma taxa razoável pode ser usado. Um exemplo não limitativo de um grupo quiral que possa ser utilizado como R3 nesta reação inclui um álcool quiral, por exemplo, (+) ou (- )-mentol. Outros exemplos não limitativos de grupos que podem ser usados como grupo Z ou PG no Esquema 9 inclui um éster quiral ou uma sulfona quiral.

Quando R3 for quiral (R*), para a transformação no 3- fosfoindol alvo, o componente quiral R* pode ser removido usando-se as condições descritas em JOC 1975, 1523-1525 usando-se um sal de trialquiloxônio, seguido por clivagem ácida, com inversão da configuração (Esquema 10):

1) Me3O+BF^

2) TFA

? 05F-OMe vT5VA /?

^il-N NH2 H

Esquema 10

O mesmo processo de DKR pode também ser utilizado com um aril fosfinato-H e um bromoindol em uma reação de acoplamento cruzada (Esquema 11):

V-R3

rápida

Q Il

R4- O^.

l$p

R4' X Ti ^nf "y. K^· R7' PG

R4-

«rj 1 O ··

"O -^V^D -

Ke y K2 0=P "H D

à np

OR3

I

i4"

-Re-jY^R2-

0=p-«H

ÕR3 Sp

Onde a quiralidade for induzida por grupos quirais: R3, Z, PG ou utilizando-se uma fosfina quiral

Esquema 11

Esquema DKR Específico

No seguinte exemplo não-limitativo de um processo DKR

Catalisador paládio

Fosfinas

Et3N/CH3CN

lenta

R5V Γ / c Pfv I ι R/ PG 4" representado no Esquema 12, o catalisador Pd é acetato de paládio, a fosfina quiral é (R)-l-[(S)-2-Di-2-furilfosfino)-ferrocenil]etildi-(2-metilfenil)fosfina, a base é diisopropil etilamina e o solvente é acetonitrila. Após aquecer a 100 0C, o composto principal é obtido com um excesso enantiomérico de 40 %.

realizada por resolução química usando-se uma base quiral. Uma base quiral exibirá seletividade para o ácido livre de um dos dois enanciômeros dos 3- fosfoindóis, desse modo provendo o meio de resolver os enanciômeros. Como descrito no Exemplo abaixo, a resolução química do derivativo 2-carboxila dos 3-fosfoindóis de Fórmula I/II pode ser realizada em l usando-se (-)- Cinchonidina 2 (Esquema 13, para obter-se o enanciômero requerido, primeiro eluindo-se o isômero por análise de HPLC quiral) e (+)-Cinchonina 3, que pode ser usada para remover o indesejado enanciômero do filtrado, segundo eluindo-se o isômero por análise de HPLC quiral). O enanciômero indesejado pode ser racemizado para obter-se mais material.

X=FiH

5

Esquema 12 2. Resolução Química de 3-fosfoindóis

A resolução dos ácidos livres de 3-fosfoindóis pode ser

Uma estratégia poderia também ser aplicada usando-se benzilamina substituída por alfa-metil quiral, como representado no esquema abaixo. O indol 1 é halogenado na posição 3, em seguida a função éster é hidrolisada para fornecer o indol 3. Uma benzilamina quiral (onde a quiralidade é definida S ou R) alfa-metil substituída (ou insubstituída) é então introduzida na função carboxílica do indol 3 via uma reação de acoplamento "tipo peptídeo". Alternativamente, 4 poderia ser preparado via formação de cloreto ácido tratando-se o ácido 3 com reagente clorado, em seguida adição da benzilamina quiral alfa-metil substituída (ou insubstituída). O intermediário 4 é então envolvido em uma reação catalisada por paládio para propiciar uma mistura de diastereoisômeros 5a e 5b. A mistura de 5a e 5b poderia ser separada por gel de sílica ou recristalização. 5a (quiralidade Sp em fósforo) é então envolvida em uma reação de clivagem para remover o componente quiral na posição 2 e propiciar o enanciômero-(Sp) 6 puro. 5b poderia ser reciclado por transformação em um ácido fosfínico por clivagem (p. ex., com TMSBr), em seguida re-esterificado para propiciar uma mistura de 5a e 5b, em seguida os diatereoisômeros poderiam ser resseparados. Rs-L

R*

Γ T Vco2Et Halogenaçf°

"Ν H

Acoplamento ex: EDCI/HOBt

Ri'. Rr

R4*

Oip ■ i

OR

Rr

R4' Osp' Rr «4 OR

Catalisador Pd, ligando

Solvente, base Aquecimento

R4' Oapf Rr ■ OR_

Sb

clivagem

Separação de diastereoisômeros

«vT

,0

Exemplo 1

composto I.

Esquema 13 Exemplos

O presente exemplo descreve a preparação do composto III e Cl

#9

Composto III ι

Cl

\

-CO,Et

#7

KOH/DMSO

\

CO2Et

#8

O=P-H

Et3NZPdjdba3 DMF 70"C

1) TFA/DCM 2} LiOH H2OZTHF

CO2H

#5A

10

#12

Reações 7 a 8:

Em um frasco foi adicionado sob indol argônio 7 (1 eq) iodo (1,98 eq.), hidróxido de potássio sólido (1 eq.) e DMF anidro (4,5 ml/mmol). A mistura de reação foi agitada 3 horas, em seguida água foi adicionada e a lama filtrada através de filtro de papel, o sólido foi secado sob pressão reduzida e triturado/filtrado em água diversas vezes para produzir, após secado sob pressão reduzida, o 3-iodoindol 8. 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) δ 1,45 (t, 3H), 4,50 (q, 2H), 7,20-7,40 (m, 2H), 7,55 (s, 1H), 9,40 (br s, 1H).

Reações 8 a 9:

Em uma solução agitada de indol 8 (1 eq) em diclorometano (3,5 ml/mmol) sob nitrogênio foi adicionado di-terc-butildicarbonato (1,8 eq) e 4-dimetilaminopiridina (2 eq.). A mistura de reação foi agitada 18 horas, em seguida tampão de fosfato (pH = 7) foi adicionado e extraído com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram secadas (Na2SC^) e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc: 1/1) para propiciar indol protegido por N-Boc 9. Sólido ligeiramente amarelo. 1H- RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,34 (t, J= 8,0 Hz, 3H), 1,56 (s, 9H), 4,35 (q, J= 8,0 Hz, 2H), 7,46 (d, J= 4,0 Hz, 1H), 7,55 (dd, J= 12,0 e 4,0 Hz, 1H), 8,0 (d, J= 12,0 Hz, 1H), MS (ES") m/z =448 (M-H).

Reações 9 a 10:

Uma solução agitada de DMF desgaseificado com N2, N-Boc 3-iodoindol 9 (1 eq.) H-arilfosfinato 11 (1,1 eq.), trietilamina (2 eq.) e P2dba3 (0,2 eq.) foi aquecida a 70 0C ou 90 0C até a reação ser terminada de acordo com análise TLC ou HPLC. A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e o solvente foi evaporado. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc : 8/2) para propiciar fosfinato de indol 10 (com também algum indol desprotegido). Sólido branco. 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,26 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 1,58 (s, 9H), 2,35 (s, 3H), 3,70 (d, J= 11,5 Hz, 3H), 4,29 (m, 2H), 6,53 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,53 (dd, J= 9,0 e 2,2 Hz, 1H), 7,65 (d, J= 13,3 Hz, 1H), 7,70 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,84 (d, J= 13,3 Hz, 1H), 7,92 (d, J= 2,2 Hz, 1H), 8,06 (d, J= 9,0 Hz, 1H), MS (ES+) m/z = 543 (MH+).

Reações 12 a 13:

Iodoarila 12 (1 eq.), dimetilformamida (1 ml/mmol), trietilamina (3 eq.) e o sal hipofosforoso de anilínio* (1,25 eq) foram colocado em um tubo de pressão e desgaseificados com N2 por 15 min. Em seguida tetracis paládio foi adicionado e esta mistura foi agitada a 85 0C durante a noite.

O solvente foi evaporado e água foi adicionada (pH = 5 - 6). A mistura foi basificada com NaHCO3 até pH = 8 e extraída com dietil éter. A camada aquosa foi acidificada com HCl IN até pH = 1 e extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas combinadas foram secadas, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para fornecer o composto #13.

Sal de anilínio foi sintetizado de acordo com o procedimento de Montchamp et al. (J. Am. Chem. Soe. 2001, 123, 510 - 511).

Sólido não totalmente branco. IH RMN (dé-DMSO, 400 MHz) δ 6,54 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,46 (d, J= 549,8 Hz, 1H), 7,57 (d, J= 13,6 Hz, 1H), 7,71 (m, 3H), 31P RMN (d6-DMSO, 121,49 MHz) δ 15,56, MS (ES") m/z =208.

Reações 13 a 11

Piridina (1 eq.) foi cuidadosamente adicionada a uma solução vigorosamente agitada de cloroformiato de alquila (1 eq.) e ácido arilfosfínico 12(1 eq.) em diclorometano (2 ml/mmol) em temperatura ambiente. Uma vez a efervescência tinha parado, a solução foi refluxada por 15 minutos e então permitida esfriar à temperatura ambiente. A solução foi vertida dentro de ácido clorídrico 0,1 M (1 ml/mmol) e a camada orgânica foi separada. Após lavagem com água e secagen sobre Na2SO4, o solvente foi removido in vácuo para fornecer o composto #11. Sólido branco. IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 2,40 (s, 3H), 3,71 (d, J= 12,2 Hz, 3H), 6,58 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,52 (d, J= 576,0 Hz, 1H), 7,63 (d, J= 14,0 Hz, 1H), 7,71 (d, J= 16,8Hz, 1H), 7,80 (m, 2H), MS (ES") m/z = 222. 10

15

cu

F

Cl

N H

CO2Et

Composto I F I

CO2Et

KOH/DMSO

N

H

Boc2O

Cl

DCM/DMAP

#7

#8

yyVCN

V «1 VV^-CN

O=P-H OMe

#9

Cl

F O^rT

OMe

Et3N/ Pd2dba3 DMF 70°C

1) TFA/DCM Cl

N

-CO2Et 2) LiOH H2OZTHF

~M #9 O

YyA,,

F Oip'

^OMe

CO2H

CO2Et

CN

#10 o

>=0

N H

#5A

^XN

I

#12

Reações 7 a 8:

Em uma solução agitada de indol 7 (1,0 eq.) em dimetilformamida (4,4 ml/mmol) sob argônio foi adicionado iodo (1,98 eq.) e hidróxido de potássio (1,0 eq.). A mistura de reação foi agitada por 3 horas. A mistura de reação foi extinta pela adição de água (8 ml/mmol) e o produto precipitado, que foi filtrado e secado. O sólido foi ressubmetido a condições de reação (dimetilformamida (4,4 ml/mmol) sob argônio, iodo (4,4 eq.) e hidróxido de potássio (0,2 eq.) e agitado por 1 h) para converter o material de partida remanescente. A mistura de reação foi extinta pela adição de água (8,8 ml/mmol) e o produto precipitado, que foi filtrado e secado para propiciar 3- iodoindol 8. Sólido bege. 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,39 (t, J= 7,2 Hz, 3H), 4,40 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 7,35-7,42 (m, 2H), 12,66 (s, 1H), 19F RMN (d6-DMSO, 376 MHz) δ -126,87, MS (ESI-) m/z = 366,13 (M-H)- 100 %, 368,15 (M-H)" 35 %.

Reações 8 a 9: Em uma solução agitada de indol 8 (1 eq.) em diclorometano (3,5 ml/mmol) sob nitrogênio foi adicionado di-terc-butil dicarbonato (1,8 eq.) e 4-dimetilaminopiridina (2 eq.). A mistura de reação foi agitada 18 horas em seguida tampão de fosfato (pH = 7) foi adicionado e extraída com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram secadas (Na2SO4) e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc : 1/1) para propiciar indol 9 N-Boc protegido. Sólido branco. 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,35 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 1,57 (s, 9H), 4,39 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 7,64 (dd, J = 7,3 e 9,1 Hz, 1 H), 7,90 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 19F RMN (de- DMSO, 377 MHz) δ-126,9, MS (ESI, El+) m/z = 490 (M+Na+).

Reação 9 a 10:

Uma solução agitada de DMF degaseificado com N2, N-Boc 3- iodoindol 9 (1 eq.), H-arilfosfinato 11 (1,1 eq.), trietilamina (2 eq.) e Pd2dba3 (0,2 eq.) foi aquecida a 70 0C ou 90 0C até a reação ser terminada de acordo com análise TLC ou HPLC. A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e o solvente foi evaporado. O resíduo bruto foi purificado pro cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc : 8/2) para propiciar indol fosfinato 10 (com também algum indol desprotegido). Sólido branco. 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,34 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,62 (s, 9H), 2,35 (s, 3H), 3,66 (d, J= 11,6 Hz, 3H), 4,37 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 6,51 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 7,58-7,65 (m, 2H), 7,69-7,77 (m, 3H), 7,94 (d, J= 9,5 Hz, 1H), 19F RMN (d6-DMSO, 377 MHz) δ -116,0 (s,.lF), 31P RMN (d6- DMSO, 162 MHz) δ 23,42 (s, IP), MS (ESI, El+) m/z = 561 (M+H*). Reação 12 a 13:

A iodoarila 12 (1 eq.), dimetilformamida (1 ml/mmol), trietilamina (3 eq.) e o sal hipofosforoso de anilínio* (1,25 eq.) foram colocados em um tubo pressurizado e desgaseificados com N2 por 15 min. Em seguida tetracis paládio foi adicionado e esta mistura foi agitada a 85 0C durante a noite.

O solvente foi evaporado e água foi adicionada (pH = 5 - 6). A mistura foi basificada com NaHCO3 até pH = 8 e extraída com dietil éter. A camada aquosa foi acidificada com HCl IN até pH =Ie extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas combinadas foram secadas, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para fornecer o composto #13.

Sal de anilínio foi sintetizado de acordo com o procedimento de Montchamp et al. (.JAm. Chem. Soc., 2001, 123, 510-511).

Sólido não totalmente branco. 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 6,54 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,46 (d, J= 549,8 Hz, 1H), 7,57 (d, J= 13,6 Hz, 1H), 7,71 (m, 3H), 31P RMN (d6-DMSO, 121,49 MHz) δ 15,56, MS (ES ) m/z =208,

Reação 13 a 11

Piridina (1 eq.) foi cuidadosamente adicionada a uma solução vigorosamente agitada de cloroformiato de alquila (1 eq.) e ácido arilfosfínico 13(1 eq.) em diclorometano (2 ml/mmol) em temperatura ambiente. Uma vez a efervescência tinha parado, a solução foi refluxada por 15 minutos e então permitida esfriar à temperatura ambiente. A solução foi vertida em ácido clorídrico 0,1 M (1 ml/mmol) e a camada orgânica foi separada. Após lavar com água e secar sobre Na2SO4, o solvente foi removido in vácuo para fornecer o composto #11. Sólido branco. IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 2,40 (s, 3H), 3,71 (d, J= 12,2 Hz, 3H), 6,58 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,52 (d, J= 576,0 Hz, 1H), 7,63 (d, J= 14,0 Hz, 1H), 7,71 (d, J= 16,8Hz, 1H), 7,80 (m, 2H), MS (ES ) m/z =222.

Certos compostos do presente exemplo foram preparados pelo esquema e métodos abaixo. 10

Método Al oS 62 -- R·

R=Me, Et

Esquema 14: H-arilfosfinato acoplando com 3-iodoindol

CO2El

Método L Método AD

CO2Et

proteção

Método AE, AF, AG ou AH

CO2Et

Método AJ

H

RV O^p.

CO2Et

Método AL

MÉTODO AD

Em um frasco foi adicionado sob argônio indol 10 (1 eq.) iodo (1,98 eq.), hidróxido de potássio sólido (1 eq.) e DMF anidro (4,5 ml/mmol). A mistura de reação foi agitada 3 horas então água foi adicionada e a lama filtrada através de filtro de papel, o sólido foi secado sob pressão reduzida e triturado/filtrado em água diversas vezes para produzir, após secado, sob pressão reduzida, o 3-iodoindol 61.

MÉTODO AE

Em uma solução agitada de indol 10 (1 eq.) em diclorometano (3,5 ml/mmol) sob nitrogênio foi adicionado di-terc-butil dicarbonato (1,8 eq.) e 4-dimetilaminopiridina (2 eq.). A mistura de reação foi agitada 18 horas, em seguida tampão de fosfato (pH = 7) foi adicionado e extraído com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram secadas (Na2SO4) e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc : 1/1) para propiciar indol N-Boc protegido 62a.

MÉTODO AF

Em uma solução agitada de indol 10 (1 eq.) em DMF (3,5 ml/mmol) sob nitrogênio e esfriada a 0 0C (banho de gelo) foi adicionado hidreto de sódio (1,2 eq.) em porções. A mistura de reação foi agitada 15 minutos até que o desprendimento de gás cessasse e 4-metoxibenzil cloreto foi adicionado em gotas. A mistura de reação foi agitada 18 horas em seguida pouca quantidade de água foi adicionada a 0 0C. O meio de reação foi diluído com água/tampão de fosfato (pH = 7). A camada aquosa foi extraída com acetato de etila e as camadas orgânicas foram lavadas com água, secadas (Na2SO4) e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc : 98/2 a 1/1) para propiciar indol protegido por N-p-metoxibenzila 62b.

MÉTODO AG

Em uma solução agitada e esfriada (a cerca de 0 0C) de etil indol-2-carboxilato 10 (1 eq.) em DMF (2 ml/mmol) sob N2 foi adicionado NaH (60 % em óleo, 1,2 eq.) em porções. Quando o desprendimento de gás parou, cloreto de benzenossulfonila (1,2 eq.) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por cerca de 1 hora (monitoramento TLC, eluente diclorometano); uma pequena quantidade de água então foi adicionada cuidadosamente e o DMF foi evaporado. O resíduo bruto foi dissolvido em acetato de etila e lavado com água e salmoura. Após secagem e evaporação dos solventes, o composto foi purificado por cromatografia sobre gel de sílica (eluente: C6H12/EtOAc 9/1 a 7/3) para fornecer o N-fenilsulfonilindol 62c.

MÉTODO AH

Em uma solução agitada de indol 10 (1 eq.) em THF (3,5 ml/mmol) sob nitrogênio foi adicionado terc-butóxido de potássio (1,5 eq.). A mistura de reação foi agitada 15 minutos, em seguida cloreto de benzoíla (1,2 eq.) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada 18 horas, em seguida água foi adicionada. THF foi evaporado sob pressão reduzida e a camada aquosa foi extraída três vezes com acetato de etila. As camadas orgânicas combinadas foram secadas (Na2SO,*) e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc: 3/1) para propiciar indol protegido por N-Bz 62d.

MÉTODO AI

Uma solução agitada de DMF desgaseificado com N2, 3- iodoindol N-protegido 62 (1 eq.), H-arilfosfinato 23 (R = Me ou Et) (1,1 eq.), trietilamina (2 eq.) e Pd2dba3 (0,2 eq.) foi aquecida a 70 0C ou 90 0C até a reação ser terminada de acordo com análise TLC ou HPLC. A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e o solvente foi evaporado. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: tipicamente éter de petróleo/EtOAc : 8/2) para propiciar fosfinato de indol 63 (observe-se que, quando PG = Boc, uma mistura de composto protegido por Boc e composto indol desprotegido é obtida).

MÉTODO AJ

Em uma solução esfriada a -90 0C (banho de acetona/nitrogênio líquido) de bromoindol 11 (1 eq.) em THF (5 ml/mmol) sob nitrogênio foi adicionado n-butil-lítio (2,5 M em hexanos, 1,1 eq.) em gotas enquanto mantendo-se a temperatura em torno de -90 0C. Após o término da adição, o meio de reação foi agitado por 5 min na mesma temperatura e clorodietilfosfito (1 eq.) foi adicionado em gotas. A reação foi permitida aquecer até -20 0C e então lavada rapidamente com um pequeno volume de salmoura. A camada orgânica foi então imediatamente adicionada a uma solução agitada de HCl 0,5M e a mistura agitada por 1 hora. Após decantação, a camada aquosa foi extraída com EtOAc diversas vezes. As camadas orgânicas combinadas foram secadas (Na2SO4), em seguida concentradas sob pressão reduzida e o resíduo oleoso foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: DCM/EtOAc : 95/5) para propiciar 3-H-fosfinato de indol 64.

MÉTODO AL

Em uma solução de 3-H-fosfinato de indol 64 ou 65 sob N2 em acetonitrila desgaseificada foi adicionado 3-iodo-5-metil-cinamonitrila (1,1 eq.), Et3N (1 eq.) e tetracis(trifenilfosfino) de paládio (0,2 eq.). A reação foi aquecida a 100 0C até o término da reação (monitorada por HPLC). A reação foi esfriada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi então purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica para propiciar 3-H-fosfinato 63 ou 64.

MÉTODO AM

Em um tubo pressurizado, 3-H-fosfinato de indol 64 (1 eq.) foi dissolvido em metanol, a solução foi esfriada até 0 0C, em seguida saturada com amônia. A reação foi então aquecida a 50 0C sob pressão por 18 horas. Após esfriar os solventes foram evaporados. Água foi adicionada e extração com EtOAc foi realizada. As camadas orgânicas foram secadas (Na2SO4) e evaporadas in vácuo. O resíduo foi triturado em acetonitrila e forneceu após filtragem 3-H-fosfinato indol carboxamida 65.

Intermediário 62b: l-(4-metoxibenzil)-5-cloro-3-iodo-lH-indol-2-carboxilato de

etila

I

O intermediário 62b foi sintetizado de acordo com o método AF. Sólido branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,33 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 3,67 (s, 3H), 4,35 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 5,73 (s, 2H), 6,82 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 6,97 (d,), 7,40 (J= 8,9 e 2,1 Hz, 1H), 7,45 (d, J= 2,1 Hz, 1H), 7,72 (d, J= 8,9 Hz, 1H).

Intermediário 62c: l-fenilsulfonil-5-cloro-3-iodo-lH-indol-2-carboxilato de etila

AG. 1H-RMN Cd6-DMSO, 400 MHz) δ 1,40 (t, 3H), 4,50 (br q, 2H), 7,45 (s, 1H), 7,52-7,80 (m, 4H), 8,00 (m, 3H). MS (ESI, El") m/z = 488 (M-H+).

Intermediário 62d: l-benzoil-5-cloro-3-iodo-lH-indol-2-carboxilato de etila. O intermediário 62d foi sintetizado de acordo com o método AH. Sólido ligeiramente amarelo, 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,03 (t, J= 9,4 Hz, 3H), 3,88 (q, J- 9,4 Hz, 2H), 7,52-7,71 (m, 8H). MS (ESI, El+) m/z = 476 (M+Na+), MS (ES") m/z = 452, Intermediário 62e

l-fenilsulfonil-5-cloro-4-fluoro-3-iodo-lH-indol-2-carboxilato

de metila

AG. Sólido bege. 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,41 (t, J- 7,2 Hz, 3H), 4,51 (q, J- 7,2 Hz, 2H), 7,63-7,71 (m, 3H), 7,78-7,82 (m, 1H), 7,89-7,91 (d, 1H), 8,00-8,03 (m, 2H), 19F RMN (d6-DMSO, 376 MHz) δ-125,60 (d, 1F). MS (ESI-) m/z = 506,12 (M-H)" 30 %, 380,21 (M-I)" 100 %, 382,21 (M-I)" 35 %.

Intermediário 62h

l-(4-metoxibenzil)-4-fluoro-5-cloro-3-iodo-1 H-indol-2-

carboxilato de metila.

MeO

O intermediário 62h foi sintetizado de acordo com o método AF. Sólido branco, 1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,31 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 3,67 (s, 3H), 4,34 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 5,68 (s, 2H), 6,82 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 6,96 (d, J- 8,6 Hz, 2H), 7,45 (dd, J= 7,0 e 9,2 Hz, 1H), 7,59 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 19F RMN (d6-DMSO, 377 MHz) δ - 126,1 (s, 1F). MS (ESI, El+) m/z = 487.

Composto 63b

Etil éster do ácidol-Benzenesulfonil-5-cloro-3-[metil 3-((E)-2- cianovinil)-5-metilfenil] fosfinoil-lH-indol-2-carboxílico.

Sólido branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,33 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 2,65 (s, 3H), 3,69 (d, J= 11,7 Hz, 3H), 4,41 (m, 2H), 6,52 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 7,53 (dd, J= 9,0 e 2,2 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 7,60-7,71 (m, 3H), 7,76- 7,81 (m, 3H), 7,85 (d, J= 2,2 Hz, 1H), 8,04-8,09 (m, 3H). MS (ES+) m/z = 583 (MH+)

Composto 63c

Metil éster do ácido l-(4-metoxibenzil)-5-cloro-3-[metil 3- ((E)-2-cianovinil)-5-metilfenil] fosfinoil-lH-indol-2-carboxílico.

O composto 63c foi sintetizado de acordo com o método AI. Sólido branco, IH RMN (d6-Acetona, 400 MHz) δ 1,18 (t, J= 7,1 Hz, 3H),

O composto 63b foi sintetizado de acordo com o método AI. 2,39 (s, 3Η), 3,74 (s, 3Η), 3,76 (d, J= 11,4 Hz, 3Η), 4,26 (m, 2H), 5,63 (s, 2H), 6,35 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 6,86 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 7,14 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 7,35 (dd, J = 9,0 e 2,2 Hz, 1H), 7,61 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,67 (dd, J= 8,9 e 1,9 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 7,75 (d, J= 13,2 Hz, 1H), 7,91 (d, J= 13,2 Hz, 1H), 8,24 (d, J= 2,2 Hz, 1H). MS (ES+) m/z = 563 (MH+).

Composto 63 f

Etil éster do ácido l-(terc-butilcarbanato)-5-cloro-4-fluoro-3- [metil 3-((E)-2-cianovinila-5-metilfenil] fosfinoíl)-lH-indol-2-carboxílico

O composto 63f foi sintetizado de acordo com o método AI.

Sólido branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,34 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 1,62 (s, 9H), 2,35 (s, 3H), 3,66 (d, J= 11,6 Hz, 3H), 4,37 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 6,51 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 7,58-7,65 (m, 2H), 7,69-7,77 (m, 3H), 7,94 (d, J= 9,5 Hz, 1H), 19F RMN (d6-DMSO, 377 MHz) δ-116,0 (s,.lF), 31P RMN (d6-DMSO, 162 MHz) δ 23,42 (s, IP). MS (ESI, El+) m/z = 561 (M+tf).

Composto 63g:

Etil Éster do ácido 5-cloro-4-fluoro-3-[metil 3-((E)-2-

O composto 63g foi sintetizado de acordo com o método AI. Sólido branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 2,35 (s, 3Η), 3,58 (d, J= 11,6 Hz, 3Η), 4,24 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 6,49 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 7,38-7,82 (m, 6H), 13,19 (bs, 1H), 19F RMN (d6-DMSO, 376 MHz) δ- 115,0 (s, 1F), 31P RMN (d6-DMSO, 162 MHz) δ 25,24 (s, IP). MS (ESI, El+) m/z = 461 (M+H^.

Etil éster do ácido l-(4-metoxibenzil)-5-cloro-4-fluoro-3- [metil 3-((E)-2-cianovinil-5-metilfenil] fosfinoil)- lH-indol-2-carboxílico.

Sólido branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,20 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 2,35 (s, 3H), 3,61 (d, J= 11,6 Hz, 3H), 3,70 (s, 3H), 4,28 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 5,43 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 5,48 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 6,48 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 6,88 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 7,12 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 7,46 (dd, J = 6,8 e 8,8 Hz, 1H), 7,55-7,79 (m, 5H), 19F RMN (d6-DMSO, 377 MHz) δ-116,7 (s, 1F), 31P RMN (d6-DMSO, 162 MHz) δ 24,55 (s, IP). MS (ESI, El+) m/z = 581 (M+FT). Intermediário 64a

Etil éter do ácido l-Benzenesulfonil-5-cloro-3-etóxi- hidrogenfosfinil-1 H-indol-2-carboxílico.

5

Compoto 63h

MeO

O composto 63h foi sintetizado de acordo com o método AI. O intermediário 64a foi sintetizado de acordo com o método

r

AJ. Oleo espesso ligeiramente amarelo, IH RMN (d6-DMSO, 300 MHz) δ 1,25 (t, J= 7,2 Hz, 3H), 1,37 (t, J= 7,2 Hz, 3H), 4,1 (m, 2H), 4,46 (q, J= 7,2 Hz, 3H), 7,58 (dd, J= 9,0 e 2,1 Hz, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,80 (d, J = 609,6 Hz, 1H), 7,83 (m, 1H), 7,97 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 8,11 (m, 3H), 31P RMN (d6- DMSO, 162 MHz) δ 13,43, MS (ES+) m/z = 456 (MH+).

Intermediário 64b Metil éster do ácido l-Benzenesulfonil-5-cloro-4-fluoro-3- etóxi-hidrogen-fosflnil-1 H-indol-2-carboxílico.

AJ. Sólido branco, IH RMN (d6DMSO, 300 MHz) δ 1,20 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 3,99 (s, 3H), 4,03 (m, 2H), 4,10 (m, 2H), 7,70 (m, 4H), 7,71 (m, 2H), 7,79 (dd, J= 616,8 e 4,8 Hz, 1H), 7,84 (m, 1H), 7,96 (m, 1H), 31P RMN (d6DMSO, 121,49 MHz) δ 12,42 (JP.F = 12,6 Hz). MS (ES+) m/z = 460 (MH+).

Composto 63 f

Etil éster do ácido 5-cloro-3-[Etil 3-((E)-2-cianovinil)-5- metilfenil] fosfmoil-1 H-indol-2-carboxílico.

O composto 63f foi sintetizado de acordo com o método AL. Sólido branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,09 (t, J= 7,1 Hz, 3H), 1,26

O intermediário 64b foi sintetizado de acordo com o método (t, J= 7,0 Hz, 3Η), 2,34 (s, 3Η), 3,99 (m, 2Η), 4,16 (m, 2Η), 6,48 (d, J= 16,5 Hz, 1Η), 7,39 (dd, J= 8,8 e 2,2 Hz, 1H), 7,59 (m, 2H), 7,71 (m, 3H), 8,39 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 12,93 (brs, 1H). MS (ES+) m/z = 597 (MH").

Intermediário 65a 5-cloro-S-metoxi-hidrogenfosfinila-lH-indol-2-carboxamida.

AM. Sólido branco, IH RMN (d6DMSO, 300 MHz) δ 3,71 (d, J= 12,6 Hz, 3H), 7,35 (dd, J= 8,7 e 2,1 Hz 1H), 7,60 (dd, J= 8,7 e 1,8 Hz 1H), 7,85 (d, J= 2,1 Hz 1H), 7,99 (dd, J= 616,8 e 5,4 Hz 1H), 8,00 (brs, 1H), 9,28 (brs, 1H), 12,71 (brs, 1H), 31P RMN (d6-DMSO, 121,49 MHz) δ 22,38, MS (ES") m/z = 271 (M-H).

Intermediário 65b 5-cloro-4-fluoro-3-metóxi-hidrogenfosfinil-lH-indol-2-

carboxamida.

AM. Sólido branco, IH RMN (d6DMSO, 300 MHz) δ 3,72 (d, J= 13,2 Hz, 3H), 7,45 (m, 2H), 7,99 (dd, J= 616,8 e 5,4 Hz 1H), 8,08 (brs, 1H), 9,96 (brs, 1H), 13,0 (brs, 1H), 31P RMN (d6-DMSO, 121,49 MHz) δ 22,79 (dd, J= 28,8 e 4,6 Hz). MS (ES ) m/z = 289 (M-H).

Composto 66a

5-cloro-3-[metil 3-((E)-2-cianovinil)-5-metilfenil]fosfmoil-1H- indol-2-carboxamida. i 10 CI

CN

O composto 66a foi sintetizado de acordo com o método AL.

Sólido branco, IH RMN (CDCl3, 300 MHz) δ 2,40 (s, 3H), 3,88 (d, J= 11,7 Hz, 3H), 5,89 (d, J= 16,5 Hz, 1H), 5,97 (brs, 1H), 7,33-7,67 (m, 7H), 10,46 (s, 1H), 10,89 (brs, 1H), 3IP RMN (CDCl3, 121,49 MHz) δ 31,54, MS (ES+) m/z =414 (MH+).

Sólido branco, IH RMN (CDCl3, 300 MHz) δ 2,42 (s, 3H), 3,88 (d, J= 12,0 Hz, 3H), 6,38 (d, J= 16,5 Hz, 1H), 7,20 (brs, 1H), 7,42 (dd, J = 8,8 e 6,7 Hz, 1H), 7,61-7,66 (m, 2H), 7,74 (m, 2H), 7,89 (m, 1H), 11,24 (s, 1H), 12,07 (brs, 1H), 31P RMN (CDCl3, 121,49 MHz) δ 30,29, 19F RMN ((I6-DMSO, 282,4 MHz) δ-115,0, MS (ES+) m/z = 432 (MH+). Intermediários 4a e 4b

Composto 66b

5-cloro-4-fluoro-3-[metil 3-((E)-2-cianovinil)-5-metilfenil] fosfmoil-1 H-indol-2-carboxamida.

O composto 66b foi sintetizado de acordo com o método AL.

OMe

4a 4b

Em uma solução de ácido 3-iodo-5-cloroindol 2-carboxílico (1 eq.) em DMF (7ml/mmol) sob nitrogênio, foi adicionado HOBt (1 eq.), (R) ou (S)-alfa-metil-p-metoxibenzilamina (1 eq.) e finalmente EDCI (1 eq.). O meio de reação foi agitado por 18 horas então água foi adicionada. O precipitado sólido foi filtrado, enxaguado com água, solubilizado com EtOAc, secado com Na2SO4 e evaporado sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc : 95/5 a 8/2) para propiciar indol 4a ou 4b.

4a: 5-cloro-3-iodo-N-((S)-l-(4-metoxifenil)etil)-lH-indol-2- carboxamida. Sólido não totalmente branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,48 (d, J= 7,0 Hz, 3H), 3,73 (s, 3H), 5,10 (m, 1H), 6,90 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,27 (dd, J= 8,7 e 2,0 Hz, 1H), 7,35-7,38 (m, 3H), 7,45 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 8,37 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 12,15 (brs, 1H), MS (ES+) m/z =455 (ΜΗΓ).

4b: 5-cloro-3 -iodo-N-((R)-l-(4-metoxifenil)etil)-1 H-indol-2- carboxamida: Sólido branco, IH RMN ((I6DMSO, 400 MHz) δ 1,48 (d, J= 7,0 Hz, 3H), 3,73 (s, 3H), 5,10 (m, 1H), 6,90 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,27 (dd, J= 8,7 e 2,1 Hz, 1H), 7,35-7,38 (m, 3H), 7,45 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 8,37 (d, J= 7,7 Hz, 1H), 12,20 (brs, 1H), MS (ES+) m/z =455 (MH+).

Intermediários 5 c e 5 d

Oaa Osò

Γ OMe f "OMe

OcH/ XxM,

H

OMe OMe

Sc Sd

Uma solução agitada de DMF desgaseificado com N2, 3- iodoindol 4b (1 eq.), H-arilfosfinato #11 (1,1 eq.), trietilamina (2 eq.) e Pd2dba3 (0,2 eq.) foi aquecida a 70 0C até a reação ser terminada de acordo com análise TLC ou HPLC. A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e o solvente foi evaporado. Os diastereoisômeros obtido são separados pro cromatografía flash sobre gel de sílica (eluente: éter de petróleo/EtOAc : 9/1 a 1/1), para propiciar sucessivamente fosfinato 5c e 5d.

5c: 3-((E)-2-cianovinil)-5-metilfenil(2-((R)-l-(4-

metoxifenil)etilcarbamoil) -5-cloro-lH-indol-3-il)-3-fosfinato de (Sp)-metila: Sólido branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,48 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 2,24 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,75 (d, J = 11,8 Hz, 3H), 5,14 (m, 1H), 6,52 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 6,91 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 7,30 (dd, J= 8,5 e 2,1 Hz, 1H), 7,36 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 7,56 (dd, J= 8,8 e 1,5 Hz, 1H), 7,61 (m, 2H), 7,48 (dd, J= 2,2 e 8,9 Hz, 1H), 7,70 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,80 (d, J= 13,0 Hz, 1H), 11,12 (d, J= 6,8 Hz, 1H), 12,76 (brs, 1H), MS (ES+) m/z =548 (M+H*).

5d: 3-((E)-2-cianovinil)-5-metilfenil(2-((R)-l-(4-

metoxifenil)etilcarbamoil)-5-cloro-lH-indol-3-il)-3-fosfínato de (/?p)-metila: Sólido branco, IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 1,48 (d, J= 7,1 Hz, 3H), 2,24 (s, 3H), 3,72 (s, 3H), 3,79 (d, J= 11,5 Hz, 3H), 5,14 (m, 1H), 6,42 (d, J= 16,5 Hz, 1H), 6,85 (d, J= 8,5 Hz, 2H)„ 7,31 (dd, J= 2,1 e 8,8 Hz, 1H), 7,34 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 7,44 (d, J= 13,2 Hz, 1H), 7,58 (m, 2H), 7,70 (m, 3H), 11,11 (brs, 1H), 12,77 (brs, 1H), MS (ES+) m/z =548 (M+H^).

Composto (Sp)-66a Uma solução de (Sp)-5c (1 eq.) em acetonitrila sob nitrogênio foi esfriada até -150 0C (NaCl/banho de gelo), em seguida nitrato de amônio cérico (7,5 eq.) em água foi adicionado em gotas. A reação foi agitada por 30 minutos nesta temperatura. O meio de reação foi diluído com EtOAc e água. A camada orgânica foi lavada com água, em seguida salmoura, secada (Na2SO4) e evaporada sob pressão reduzida. HPLC quiral da amostra bruta mostrou a presença de somente um enanciômero do composto 66a: 3-((E)-2- cianovinil)-5-metilfenil(2-carbamoil-5-cloro-lH-indol-3-il)-3-fosfinato de (S)-metila. Dados analíticos reportados acima.

Alternativamente, o indol 4 pôde ser N-protegido antes do paládio acoplado com um H-arilfosfinato como descrito acima. Após 10

15

separação dos diastereoisômeros N-protegidos, o carboxamida opticamente puro 6 pode ser obtido por remoção seqüencial do grupo protegido por N de indol e do componente quiral. Exemplo 2

Resolução química do derivativo de 2-carboxila de 3- fosfoindóis de Fórmula I/II foi realizada em 280,82 g de 1 usando-se (-)- Cinchonidina 2 (Esquema 15, para obter-se o enanciômero requerido, primeiro eluindo-se o isômero por análise de HPLC quiral) e (+)-Cinchonina 3 (que pode ser usada para remover o enanciômero indesejado do filtrado, segundo eluindo-se o isômero por análise HPLC quiral).

Resolução inicial da escama de 280,82 g do ácido racêmico

^p-om

Cl

f}cínchonkÉna 2

CO1H

290,83 g em 4.21 de acetons

Prirogga Resolução Relação de carga: 1:15

CBvagem com 1N HCI 198,5g de solidi (2 h rt) e acetato de etila

irei ação 96:4}

Formação d» ácido

107,34 gdeaeíc > {Relação ÍS:Si

► 306,4g de filtrado

(rttefio 20:89

(-Jcinchonidma 2

(♦{cinchonidina 3

Reci^eração do enantiòmero aniples= 83%

Recuperação do enantiòmero simples = 76% {com base nos esperado* 140,42 g de ácido)

(com fceae nos esperados 239,5êg de ácido)

SegumteReaotueio

Relação de carga: 1:1(

Portanto, CSlOSg do enantiõmero ácii o requerido isolado (70 % recuperaçã< com base em 140,2 g de ácido}

(4-CÉftGhonfdina 2

107,34 g em 1,071 de aeetona

322,25 g de cal dos filtrado· combirt dos

IH1OBgde {relação »8.6:1

Qivagem com 1N HCI

(2h emrOe acetato de etila (09,07 g de som relação 88,6:1, J

Formação de ácido

a serem m ais tratado· para ικιφιπ enantiõmero ácido mais requerido

Recuperação do enantiòmero sãnpies = 70 % (com base rios 140,42 g esperados de ácido}

+13,83 g de SRrado

(Relação 55:45} Recuperação do enantiomero simples - 83 %

(com base nos esperados 239,58 g de aaB

Esquema 15

1. Resolução Inicial da escama de 282 g de ácido racêmico

Primeira resolução - empregando (-)-Cinchonidina 2

O ácido livre de indol 1 (280,83 g, 675,61 mol, Esquema 15) foi suspenso em acetona (4,2 1) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado, (-)-cinchonidina 2 (198,89 g, 675,61 mmol) foi adicionada em uma porção e, após 1 h, uma solução transparente foi observada. Após mais 1 h, foi observada precipitação de um sólido branco e a suspensão foi agitada em temperatura ambiente por mais 2 h (total 4H). Após este tempo, o sólido precipitado foi isolado por filtragem e lavado com acetona (200 ml). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido precipitado como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 198,5 g de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 96:4) e 308,4 g de filtrado (pureza por análise HPLC quiral, relação = 20:80).

r

Clivagem Acida do sal

O sal parcialmente resolvido de indol 1 (198,5 g, pureza por análise HPLC quiral 96:4) foi suspenso em uma mistura de acetato de etila (3 1) e IN HCl (3 1) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente por 2 h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (2 1) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir

0 ácido parcialmente resolvido como um sólido não totalmente branco (107,34 g, pureza por análise HPLC quiral, relação = 95:5.

Segunda resolução - empregando-se (-)-Cinchonidina 2

O indol de ácido parcialmente resolvido 1 (107,34 g, 258,78 mmol, pureza por análise HPLC quiral, relação = 95:5) foi suspenso em acetona (1,07 1) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado. (-)- Cinchonidina 2 (76,18 g, 258,78 mmol) foi adicionada em uma porção e, após

1 h, uma solução transparente foi observada. Após mais 1 h, a precipitação de um sólido branco foi observada e a suspensão foi agitada em temperatura ambiente por mais 2 h (total 4h). Após este tempo, o sólido precipitado foi isolado por filtragem e lavado com acetona (200 ml). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido precipitado como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 199,07 g de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 98,6:1,4) e 13,83 g de filtrado (pureza por análise HPLC quiral, relação = 55:45).

r

Clivagem Acida do Sal

O sal resolvido (199,07 g, pureza por análise HPLC quiral, relação = 98,6:1,4) foi suspenso na mistura de acetato de etila (3 1) e IN HCl (31) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente por 2 h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (2 1) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido resolvido como um sólido não totalmente branco (98,08 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 98,6 : 1,4).

IH RMN ((I6-DMSO, 400 MHz): δ 2,33 (3H, s, Ar-CH3), 3,70 (3H, d, J 11,72 Hz, P-OCH3), 6,50 (1H, d, J 16,84 Hz, CH=CHCN), 7,34 (1H, dd, J 1,95Hz, J 8,79 Hz), 7,57 (1H, d, J 8,56 Hz), 7,62-7,79 (3H, m), 7,82- 7,85 (1H, m ou d com J 13,43Hz), 7,98 (1H, m), 13,02 (1H, s, CO2H), 14,36 (1H, br-s, NH); 31P RMN (d6-DMSO, 161,8 MHz): 533,42; m/z (ES+) 415 (M+H)+.

Recuperação

Portanto, 98,08 g do enanciômero ácido requerido foram isolados (recuperação 70 % com base em 140,42 g de enanciômero ácido disponível de 280,83 g de ácido racêmico). Mais 322,25 g de sal dos filtrados combinados das duas resoluções 4 (308,4 g + 13,85 g) foram ainda tratados para recuperar mais enanciômero requerido.

2. Recuperação do filtrado

Clivagem ácida do sal

O sal parcialmente resolvido combinado 4 (322,25 g) foi suspenso em uma mistura de acetato de etila (4,8 1) e IN HCl (4,8 1) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente por 2 h (Esquema 16). Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (4 1) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido parcialmente resolvido como um sólido não totalmente branco (169,75 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 22:78).

Recuperação do enanciômero requerido do filtrado

Ί»-οκ·

CKagMi com 1N HCl {2ti «m · acetato de «Na

{+)-c Hc Pion Idina 3

322,25 gdesa! Formação de ácido

H-HRc RonraBsai 2]»

168.75 ga»àei4 isajsgem 4,21 da acmona parcialmente resolvido

ρ*"-:'"» *"·ν°)

Primara Hsgofteato relação de carga 1:25

324.2 g dfr Idltfo WJt I AIHtIKlO (Mqlt UMfi

Saisde 4dofiltradoeoraDmad<í,cπ,n,0'22*"Cllflc* Τ·» β eoácidoroquertdo puderam aer

(clJvagem com 1H HCf (2n«mn)o acetato a» ei

Cllvsgem com INHCt (2tterirt)e acetato de mm

122,14 g de enaratómero

122 M J ito Uildo 4&59<*tdda O ' <n>H«o J.SM.8 cltvagem ácida

{-)-cincnontdina2

46,87gem470ml dsaceto! gn íou» I

<p»lrçao7T,í:2S9 I

M total de 28.07 g do enantlórr»ro áctct > requerido foram recuperados dos fllwad « combinados (68 % reciperaçâo Baseada em 37,35 g de ácido dtspowwl em mlsti ra com feiacao de partida 22:78)_

ISiITgik ácido <;ι»ί^ο«MA'

segyraa resolução

4.13.7 g de fitrado da carga 1:«

(relação 39:61)

Esquema 16

Primeira resolução - empregando-se (+)-Cinchonina 3 O indol ácido parcialmente resolvido (169,75 g, 409,25 mol, pureza por análise por HPLC quiral, relação = 22:78) foi suspenso em acetona (3,06 1) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado. (+)- Cinchonina 3 (120,48 g, 409,25 mol) foi adicionada em uma porção e, após 1 h, uma solução transparente foi observada. Após mais 5 min, precipitação rápida de um sólido branco foi observada e a suspensão espessa requereu mais acetona (1,14 1 - volume total de acetona usada = 4,2 1) para permitir agitação da mistura de reação em temperatura ambiente por mais 3 h (total 4h). Após este tempo, o sólido precipitado foi isolado por filtragem e lavado com acetona (150 ml). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido precipitado como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 324,2 g de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação - 4,5:45,5) e 80,72 g do filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 77:23).

Clivagem ácida do sal para obter-se o enanciômero indesejado

O sal parcialmente resolvido (324,2 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 4,5 : 95,5) foi suspenso em uma mistura de acetato de etila (4,8 1) e IN HCl (4,8 1) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente por 2 h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (3 1) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sótio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido resolvido como um sólido não totalmente branco (122,14 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 3,5 : 9,6,5).

1H-RMN (d6-DMSO, 400 MHz) δ 2,33 (3H, s, Ar-CH3), 3,70 (3H, d, J 11,72 Hz, P-OCH3), 6,50 (1H, d, J 16,84 Hz, CH=CHCN), 7,34 (1H, dd, J 1,95Hz, J 8,79 Hz), 7,57 (1H, d, J 8,56 Hz), 7,62-7,79 (3H, m), 7,82- 7,85 (1H, m ou d com J 13,43Hz), 7,98 (1H, m), 13,02 (1H, s, CO2H), 14,36 (1H, br-s, NH); 31P RMN (d6-DMSO, 161,8 MHz): δ 33,42 m/z (ES+) 415 (M+H)+.

Clivagem ácida do sal para obter-se o enanciômero requerido

do filtrado

O sal parcialmente resolvido (80,71 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 77:23) foi suspenso na mistura de acetato de etila (1,21 1) e IN HCl (1,21 1) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, por 2h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (1 1) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido parcialmente resolvido como um sólido não totalmente branco (46,97 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 77:23)

Segunda Resolução - usando-se (-)-Cinchonidina 2 O indol ácido parcialmente resolvido (46,97 g, 113,24 mmol, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 77:23) foi suspenso em acetona (470 mL) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado. (-)- Cinchonidina 2 (33,34 g, 113,24 mmol) foi adicionado em uma porção e, após 1 h, uma solução transparente foi observada. Após mais 1 h, precipitação de um sólido branco foi observada e a suspensão foi agitada em temperatura ambiente por mais 2h (total 4h). O sólido precipitado foi isolado por filtragem e lavado com acetona (100 mL). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 48,5 g de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 97,5:2,5) e 33,7g de filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 39:61).

Clivagem ácida de sal para obter-se o enanciômero requerido

do filtrado

O sal parcialmente resolvido (48,5g, pureza por análise de

HPLC quiral, relação = 97,5:2,5) foi suspenso na mistura de acetato de etila (728 mL) e IN HCl (728 mL) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, for 3h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (700 mL) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido resolvido como um sólido não totalmente branco (25,87 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 97,4:2,6)

IH RMN (de-DMSO, 400 MHz): δ 2,33 (3H, s, Ar-CH3), 3,70 (3H, d, J 11,72 Hz, P-OCH3), 6,50 (1H, d, J 16,84 Hz, CH=CHCN), 7,34 (1H, dd, J 1,95Hz, J 8,79 Hz), 7,57 (1H, d, J 8,56 Hz), 7,62-7,79 (3H, m), 7,82- 7,85 (1H, m ou d com J 13,43Hz), 7,98 (1H, m), 13,02 (1H, s, CO2H), 14,36 (1H, br-s, NH); 31P RMN (d6-DMSO, 161,8 MHz): δ 33,42; m/z (ES+) 415 (M+H)+. Recuperação

Portanto, 25,87g de enanciômero requerido recuperado do

filtrado.

Recuperação total do enanciômero ácido: 98,08 g + 25,87 g = 123,95 g (de possíveis 140,42 g de 280,83

g ácido racêmico) = produção 88 %. Exemplo 3

Resolução Química de 3-Fosfoindóis de Fórmula III/IV A resolução do indol de ácido livre de Fórmula III/IV foi assim realizada em 432,6 g de 5 usando-se (-)-Cinchonidina 2, Este processo é representado no esquema 17 abaixo.

Resolução inicial em 432,6 g de escama de ácido racêmico

CN (4-clnc!iontdlna 2 Cl.

f 0^p-Ow* 432,6 g em 7,791 Cte acetona

____ Cnvagemcwn-ENHCI

343,1 gde»úfld< (2 ft an)e acetato da etlla

(relação 88:2)

FormaçSo de ácido

343,1 g de ácldc reação «8,4:1,6

Vco1H Primeira Rosnlueilo + '"f300 Recuperação do erantSómero simples = 68 %

N l (Relação 9:91) { base nos esperados 216,3 g de ácido)

η relação de carga 1:1 B 1 ^

Recuperação de enantlomwo íripies = 94 % (com base nos esperados 363,58 g de sal)

Portama 145,45 g de enanttõmero ácido requerido isolado (es % recuperação com base em 216,3 güe ácido)

-420,52 g de sal dos filtrados combinados para serem ainda tratados para recuperar mais

o na Wtftrmm árum ramjarlrtn

Esquema 17 Procedimento Experimental 1. Resolução Inicial em 432,6 g escama de ácido racêmico Resolução - usando-se (-)-Cinchonidina 2

O indol de ácido livre 5 (432,6 g, 1,0 mol) foi suspenso em acetona (7,79 L) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado. (-)- Cinchonidina 2 (294,39 g, 1,0 mol) foi adicionada em uma porção e a suspensão foi agitada em temperatura ambiente por 4h. Após este tempo o sólido (nenhum precipitado observado, uma suspensão estava sempre presente nesta escama) foi isolado por filtragem e lavado com acetona (300 mL). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 343,2 g de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 98:2) e 420,52 g de filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 9:91).

Clivagem ácida de sal

O sal parcialmente resolvido de indol 5 (343,2 g, pureza por análise de HPLC quiral 98:2) foi suspenso na mistura de acetato de etila (5,2L) e IN HCl (5,2 L) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, por 2h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (2,7L) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido resolvido como um sólido não totalmente branco (145,44 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 98,4:1,6).

IH RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 2,35 (3H, s, Ar-CH3), 3,78 (3H, d, POCH3), 6,52 (1H, d, CH=CHCN), 7,46 (2H, d, Ar-H), 7,66 (1H, d, CH==CHCN), 7,69, 7,81 (2H, 2 χ d, H-6, H-7), 7,77 (1H, s, Ar-H), 13,63 (1H, s, N-H), 15,70 (1H, br-s, COOH); 31P RMN δΡ (162 MHz, d6-DMSO): 36,44 (IP, s); 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO):-l 14,27 (1F, s); m/z (ESI+): 433,0 (MH+, 100 %), 435,0 (MH+, 35 %).

Recuperação

Portanto, 145,44 g do enanciômero ácido requerido foram isolados (68 % recuperação com base em 216,3 g de enanciômero de ácido disponível de 432,6 g de ácido racêmico). Mais 420,52 g do sal do filtrado foram ainda tratados para recuperar mais enanciômero requerido.

2. Recuperação do filtrado

Clivagem ácida de sal

O sal combinado parcialmente resolvido 4 (420,52 g) foi suspenso na mistura de acetato de etila (6,31L) e IN HCl (6,31 L) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, por 2h (Esquema 18). Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (3L) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido parcialmente resolvido como um sólido não totalmente branco (222,7 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 9:91)

Recuperação do enanciômero requerido do filtrado

Ί Ρ~0·Λ·

C'YtHl_t (2h em rt) e acetato de euu^j g de ãcldi 22^t g era 4,881 de acetona S^n 420,52 α de sal ^^ΜύΓ

ciivagem com 1N hci

H-Chchonina 2

1

[(-Kmchonidlna 2]+ sais ε do filtrado

420,52 g de sal Formulação do ácido

Primeira HBaotucfto Relação ao carga 1122

SU (CbKIdD (HtfcQfto 3:07)

SE OdtlHOwlO (refeito U-13

Portanto, β % significa que ao g do ácido requerido poderiam ser

ItnlarfAt

ClKragem com DCM β 1N HCl (2 h em rt»

210,0 g de enantiõmero Indeae lado (relação 2:08)

Um total de 13,02 g do enantiõmero ácido

requerido foram recuperados dos IHtrados

gamttlnaflog (« y. recuperação cem

Clkragem com DCM e IN HCI (2hem rt)

O-CinchonidHa 2 36,65 g em 367 ml de acetwsr

+36,GS g de filtrado (Relação 49,51)

Segunda Resolucio Ftelaçao de carga 1:10

SfctEg d* McMo

írekçaoat:12

ciivagem com DCM e 1N HC| <2hem rt)

g dUcMo (mnfooaii)

Esquema 18

Primeira resolução - usando-se (+)-Cinchocina 3 O indol ácido parcialmente resolvido (222,7 g, 409,25 mol, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 9:91) foi suspenso em acetona (4,38L) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado. (+)- Cinchonina 3 (120,48 g, 409,25 mmol) foi adicionada em uma porção e, após 1 h, uma solução transparente foi observada. Após mais 5 min, rápida precipitação de um sólido branco foi observada e a suspensão espessa requereu acetona adicional (0,5 L - volume total de acetona usada = 4,88 L)para permitir agitação da mistura de reação em temperatura ambiente por mais 3h (total 4h). Após este tempo o sólido precipitado foi isolado por filtragem e lavado com acetona (400 mL). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido precipitado como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 360,6 g de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 3:97) e 58,32 g de filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 84:12).

Clivagem ácida de sal para obter-se enanciômero indesejado

O sal parcialmente resolvido (360,6 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 3:97) foi suspenso na mistura de diclorometano (5,4 L) e IN HCl (5 L) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, por 2h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com diclorometano (2L) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido resolvido como um sólido não totalmente branco (210,0 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 2:98).

IH RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 2,35 (3H, s, Ar-CH3), 3,78 (3H, d, POCH3), 6,52 (1H, d, CH=CHCN), 7,46 (2H, d, Ar-H), 7,66 (1H, d, CH=CHCN), 7,69, 7,81 (2H, 2 χ d, H-6, H-T), 7,77 (1H, s, Ar-H), 13,63 (1H, s, N-H), 15,70 (1H, br-s, COOH); 31P RMN δΡ (162 MHz, (I6-DMSO): 36,44 (IP, s); 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO):-l 14,27 (1F, s); m/z (ESI+): 433,0 (MH+, 100 %), 435,0 (MH+, 35 %).

Clivagem ácida de sal para obter-se o enanciômero requerido

do filtrado

O sal parcialmente resolvido (58,32 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 84:12) foi suspenso na mistura de diclorometano (875 mL) e IN HCl (875 mL) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, por 2h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com diclorometano (400 mL) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido parcialmente resolvido como um sólido não totalmente branco (36,65g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 88:12).

Segunda resolução - usando-se (-)-Cinchonidina 2

O indol ácido parcialmente resolvido (36,65 g, 85,0 mmol, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 88:12) foi suspenso em acetona (367 mL) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado. (-)- Cinchonidina 2 (25,02 g, 85,0 mmol) foi adicionado em uma porção e, após 1 h, uma solução transparente foi observada. Após mais 1 h, precipitação de um sólido branco foi observada e a suspensão foi agitada em temperatura ambiente por mais 2h (total 4h). O sólido precipitado foi isolado por filtragem e lavado com acetona (100 mL). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 24,92 g de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 99:1) e 36,65 g de filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 49:51).

Clivagem ácida de sal para obter-se o enanciômero requerido

do filtrado

O sal parcialmente resolvido (24,92g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 99: 1) foi suspenso na mistura de diclorometano (374mL) e IN HCl (374 mL) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, por 2h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com diclorometano (200 mL) e os extratos orgânicos contendo o produto foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido resolvido como um sólido não totalmente branco (13,02 g, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 99:1).

IH RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 2,35 (3 H, s, Ar-CH3), 3,78 (3H, d, POCH3), 6,52 (1H, d, CH=CHCN), 7,46 (2H, d, Ar-H), 7,66 (1H, d, CH=CHCN), 7,69, 7,81 (2H, 2 χ d, H-6, H-7), 7,77 (1H, s, Ar-H), 13,63 (1H, s, N-H), 15,70 (1H, br-s, COOH); 31P RMN δΡ (162 MHz, d6-DMSO): 36,44 (IP, s); 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO):-l 14,27 (1F, s); m/z (ESI+): 433,0 (MH+, 100 %), 435,0 (MH+, 35 %). Recuperação

Portanto, 13,02 g de enanciômero requerido recuperado do

filtrado.

Recuperação total do enanciômero ácido requerido: 145,44 g + 13,02 g = 158,46 g (dos 216,3g possíveis de 432,6 g ácido racêmico) = 73 % produção.

A resolução do ácido livre de 3-fosfoindol 6 foi realizada em 1,02 g do composto usando-se (1R,2S)-Efedrina 7 e hemi-hidrato de (1S,2R)- Efedrina 8 IN 95 % EtOH (Esquema 19). O princípio desta resolução é o mesmo que aquele descrito acima utilizando-se as bases de Cinchonidina. 10

Η, NMVle

H OH (1R,23M->-Sedrina 7

Primeira Purificação Ph.

-m

ÁcidoS

1.2 g em 12 ml 05% EtOH

reiaçao de carga 1:10

H OH

HemMifcJmo de (1&2RM*>-Efedrina 8

Primeira purificação

558 mg de sòBdo («706mgde IihfMlo)

Segunda purificação (558 mgem 12 m! de 95 % EtOH) Relação de carga 1:20

236 mg de sólido {4-107 mg de filtrado)

Ciivagem com 1N HCi (3h a ii e acetato de etila

106 mg de ácido resolvido

Sinal HPLC a $38 min (99 % puro) [a]o " - 59.1°

δίβ mg de «óido (»840 mg de filtrado)

Segunda purificação (618 mgem 12 mi de 95% EtOH) Relação de carga 1:19

(φ 127 mg de filtrado}

Ciiv agem com INHCI (3h a rO e acento de etiia

183 mg de ácido resolvido Sinal HPLC a 13,11 min (99 % puro) l«Io ■ ♦ ββ.2®

Produção total > 18 % (com base em possíveis 0,6 g de 1,2 g de ácido racérnico)

Produção total = 18 % {com base em possíveis 0,6 g de 1,2 g de ácido raoêmico)

Esquema 19

Exemplo 4

1. Primeira resolução - usando-se (lR,2S)-(-)-Efedrina 7 O ácido livre 3-fosfoindol 6 (1,2 g, 3,17 mmol) foi suspenso em 95 % de etanol (12 ml) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado. (lR,2S)-(-)-Efedrina 7 (0,52 g, 3,17 mmol) foi adicionada em uma porção e, após 5 min, uma solução transparente foi observada. Após mais 5 min, rápida precipitação de um sólido branco foi observada e a agitação foi continuada em temperatura ambiente por 3h. Após este tempo o sólido precipitado foi isolado por filtragem e lavado com 95 % etanol (2 mL). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido precipitado como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 558 mg de sólido precipitado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 14:86) e 706 mg de filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 74:26).

Segunda resolução

O sal parcialmente resolvido de 6 (558 mg, pureza por análise de HPLC quiral 14:86) foi suspenso em 95 % etanol (12 mL) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado for 3h. Após este tempo o sólido foi isolado por filtragem e lavado com 95 % etanol (2 mL). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 236 mg de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 1 :99) e 197 mg de filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 25:75).

Clivagem ácida do sal

O sal resolvido de 6 (236 mg, pureza por análise de HPLC quiral 1 : 99) foi suspenso na mistura de acetato de etila (7 mL) e IN HCl (7 mL) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, por 3h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil (acetato de etila adicional (3 mL) e IN HCl (3 mL) foram requeridos para transferir material do frasco) e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (2x6 mL) e os extratos orgânicos foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido resolvido como um Sólido branco (106 mg, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 1 : 99, [<x]D = -59,1°).

IH RMN (d6-DMSO, 400 MHz): δ 2,27 (6H, s, 2 χ Ar-CH3), 3,71 (3Η, d, J 11,72 Hz, P-OCH3), 7,2-7,30 (1H, m), 7,35-7,45 (m, 3H), 7,57- 7,6 (m, 1H), 7,78-7,79 (m, 1H), 12,99 (1H, s, CO2H), 14,73 (1H, br-s, NH); 31P RMN (dô-DMSO, 161,8 MHz): 535,41; m/z (ES+) 378 (M+H)+.

2. Primeira resolução - Usando-se (lS,2R)-(+)-Efedrina 8

O indol de ácido livre 6 (1,2 g, 3,17 mmol) foi suspenso em 95 % etanol (12 mL) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado. (lS,2R)-(+)-Efedrina 8 (0,55 g, 3,17 mmol) foi adicionada em uma porção e, após 5 min, uma solução transparente foi observada. Após mais 5 min, rápida precipitação de um sólido branco foi observada e a agitação foi continuada em temperatura ambiente por 3h. Após este tempo o sólido precipitado foi isolado por filtragem e lavado com 95 % etanol (0,5 mL). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido precipitado como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 618 mg de sólido precipitado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 94:6) e 840 mg de filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 25:75).

Segunda Resolução

O sal parcialmente resolvido (618 mg, pureza por análise de HPLC quiral 94:6) foi suspenso em 95 % etanol (12 mL) e agitado em temperatura ambiente em um frasco selado for 3h. Após este tempo o sólido foi isolado por filtragem e lavado com 95 % etanol (0,5 mL). O filtrado foi concentrado in vácuo e tanto o sólido precipitado como o resíduo do filtrado foram secados durante a noite sob vácuo para produzir 250 mg de sólido (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 100:0) e 127 mg de filtrado (pureza por análise de HPLC quiral, relação = 85:15).

Clivagem ácida de sal

O sal rsolvido de 6 (250 mg, pureza por análise de HPLC quiral 100:0) foi suspenso na mistura de acetato de etila (7 mL) e IN HCl (7 mL) e vigorosamente agitado em temperatura ambiente, por 3h. Após este tempo, a mistura de reação foi transferida para um funil (acetato de etila adicional (3 mL) e IN HCl (3 mL) foram requeridos para transferir material do frasco) e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (2x6 mL) e os extratos orgânicos foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados in vácuo para produzir o ácido resolvido como um sólido branco (108 mg, pureza por análise de HPLC quiral, relação = 100:0, [a]D = +59,2°) 10

15

20

IH RMN (de-DMSO, 400 MHz): δ 2,27 (6H, s, 2 χ Ar-CH3), 3,71 (3Η, d, J 11,72 Hz, P-OCH3), 7,2-7,30 (1H, m), 7,35-7,45 (m, 3H), 7,57- 7,6 (m, 1H), 7,78-7,79 (m, 1H), 12,99 (1H, s, CO2H), 14,73 (1H, br-s, NH); 31P RMN (dé-DMSO, 161,8 MHz): 535,41; m/z (ES+) 378 (M+H)+.

Recuperação

A recuperação total é 18 % de ácido racêmico 6 usando-se (1 R,2S)-Efedrina 7 ou hemi-hidrato de (1S,2R)-Efedrina 8 porém sem qualquer otimização do processo. Exemplo 5

Síntese Quiral de 3-fosfoindóis

Síntese com intermediários opticamente puros, onde o centro quiral é completamente preservado ou completamente invertido. Neste caso a base usada para o acoplamento cruzado (p. ex., Et3N) não é bastante forte para permitir que a racemização do H-P fosfmato de partida ocorra (ao contrário ao processo DKR). A reação de acoplamento cruzado prossegue com retenção da configuração. A clivagem do fosfmato de mentila usando-se sal de trialquiloxônio, seguida por tratamento ácido, prossegue com inversão da configuração (J. Org. Chem 1975, 1523-1525). Este processo é representado no esquema 20,

Y

Ts-sA^j" Catalisador paládio

Il j Fosfinas

"RXjN^R2" EIIWCH1CN RS'

O-P-H retenção de configuração

Ri"

"R, R<' 0»

Os

Mentila

N

R,· PG Ri

'0.MenU|a 1)Me,0'BF/

V-Z 2) TFA

Inversão da configuração

"Rj

"R,

Catalisador paládio Fosfinas

Et3WCHjCN R}·.

V-R,·

J retenção de configuração

O=P-H R6'

OMentifa

°T"*0· Mertlila 1) Mfl)0*BF,· R5'. \-Z 2) tFA

N Inversão da configuração

Esquema 20

A preparação do composto de fosfmato de mentila é realizada em duas etapas de haletos ou triflatos de arila (Esquema 21). A primeira etapa é a preparação do ácido H-fosfínico de acordo com os métodos descritos, tais como o trabalho de Montchamp et al, J. Am. Chem. Soe. 2001, 123:510-511 e Montchamp et al., J. Organomet. Chem. 2002, 643 - 644:154 - 163. A segunda etapa é uma reação Hewitt, tal como descrito em Tetrahedron Lett.

2003,781-783.

começa também de um haleto de arila para produzir diclorofosfito com método disponível na literatura (Esquema 22). Em seguida ataque de (-) ou (-)-mentol fornece mentilfosfinato como uma mistura distereomérica, como

cristalização usando-se ou adaptando-se as condições descritas em J. Am. Chem. Soe. 1970, 92, 5809-.5810, Heteroatom Chemistry 1995, 6, 365-70, Russ. J. Gen. Chem. 2005, 75, 656-657 (Esquema 23).

Esquema 21

Uma segundo caminho para sintetizar fosfinato de mentila

descrito em J. Am. Chem. Soe. 1967, 90, 3459-3465.

X=I1BrlCl1OTf 10

R4" R4" R4" 'R5 TTR3" separação "R5 γΟν "R5 YV- diastereomérica JL .JL + "R6 ■^V^^o - R6' "R6' ^y^ R2- T «2 O=P-H p. ex., por baixa T O=P-H O=P-H cristalização em ^"Mentila " Mentila hexano OMentiIa

racemica

Esquema 23

Os Esquemas 24 e 25 representam a síntese quiral de 3- fosfoindóis de Fórmula I e III usando-se este caminho:

CN

f Vvv»

Cl

? Br

O

O-M'

CONHj

"Pd*

EljN/CHjCN

* OafS*'

α

?

CN

'°-Ment DMeiO-BFt- a ^Xjs; V-CONHj 2) TFA XJLV

OMa CONHj

Esquema 24

CN

CI

x Br

I J VcO2Et +

N

SO2Ph

"Pd"

Et3WCH3CN

retenção da configuração

CO2Et

X O»

CN

Vvvc

NH3ZMeOH

V-CO2Et ou 1JU0H 2)CDI 3)NH3

1) Me3OtBF4-

2) TFA "

inversão da configuração

Esquema 25

Para a separação analítica de enanciômeros, as condições para análise de HPLC quiral são:

Coluna: DAICEL CHIRALP AK® AD-H 5um, 250x4,6 mm LD. Fase Móvel A: Metanol Fase Móvel Β: ΙΡΑ+0,05 % ρ TFA Isocratic: A/B (25/75) Taxa de Fluxo: 0,4 ml/min Detection: Plotagem PDA max 210 - 400nm Enanciômero 1 RT= 13,4 min; Enanciômero 2 RT= 19,6 min.

Método preparativo:

Injeção de 2 g mistura racêmica (IM403): Coluna: DAICEL CHIRALP AK® AD 20um, 260x50 mm I.D.

Fase Móvel: 50 etanol/50 metanol/ 0,1 dietilamina (v/v/v)

Taxa de Fluxo: 120 ml/min

Detecção: UV 320nm

Enanciômero 1 RT = 7,0 min; Enanciômero 2 RT = 25,3 min.

Outro caminho para a síntese de 3-fosfoindóis enanciomericamente puros é representado nos esquema 49 e 50.

A determinação da eficiência do estereocontrole para cada

Λ 1

etapa deve ser realizada por P RMN e HPLC, a fim de confirmar se a retenção ou inversão predita está completa ou se a mistura de diastereômeros é observada. A etapa mais sensível poderia ser a desproteção de borano que requereu calor. A partir deste estágio, a medição do excesso enantiomérico requer o uso de uma coluna HPLC analítica quiral.

Se a configuração do fósforo for 100 % controlada em cada etapa, o precursor único 4 pode resultar nos dois diferentes enanciômeros 8 ou 12, dependendo do trajeto químico selecionado. Exemplo 6

Resolução dos Intermediários Diastereoméricos

Um outro método para a preparação dos 3-fosfoindóis enanciomericamente puros baseia-se na preparação dos diastereômeros pela funcionalização dos indóis com reagentes quirais. O uso dos amino ácidos quirais para preparar 3-fosfoindóis diastereoméricos é representado no Esquema 26. A quiralidade no carbono de alfa-amino-ácido é imutada. A síntese é realizada como segue: ο

V—ΟΜ« ΗΛ—\

MeOH.NH3 70-C H1N

82%

Vnhj —/

r\

ácido indol

HOBT/EDCI

DMF

78%

Cl

Quiral

V»

(· N-S(S)

Μ, )

Os

Cl

Quiral

?Λο' VN // W

Esquema 26

Os 2 diastereômeros são separados usando-se uma coluna de

sílica padrão.

Esta estratégia pode ser aplicada para preparar outras amidas diastereoméricas com benzilaminas enanciomericamente puras, por exemplo, ou para preparar ésteres diastereoméricos em vez de amidas que poderiam ser clivadas após separação diastereomérica, para liberar o enanciômero separado. Este caminho é mostrado no Esquema 17 abaixo.

Rt

R1

O. O

-OMe MeOH .NH3 NH,

70-C R0-1 O.

y~c

RO—(

o

82%

Ácido de indol

CDI

j· o~((S) *

»JCK ) XN

Cl-

N

N O

separação diastereomérica

MeOH.NH3 MeOH.NHS

V"

HTs

Rl

R1

Exemplo 7

Oa

Cl

A0'

Esquema 27

Preparação do Composto I

NH,

Cl

enantiõmeros separados

Λο

C 10

15

α

Cf·

NH2

-Λ

. -τ-

Os

Il

NH2

-CO2H

Dr

Cl

CO2M*

CO2Me

O=S"0

i. Boc3O 3,0eq, u-htjjtano, SO0C, 4h

ii n-BuLi 3,lcq, Ij 3,5 eq -80»C < T < -75°C

iii 1 C.HC1 6,0eq , 55 0C; 2. 2M NaOH, 15 °C iv. DAB CO, ácido pirúvico, Pd(OAc)1

ν. 1. CDI1DMF, 1 MeOH ou EtOH

VL 1. NaH. DMF; 2. PhSCb Cl

sii Br3. DCM

viii- D BD MH, THF

ix 1 NaH, DMF; 2. PhSCbQ

OsT

vil

Br

bt O

CO2Me — Il

O^r0

CO2Me

Alternativamente éster de etila

Parte A: Síntese de intermediário de 3-bromo-indol Composto 102

F

4-Cloro-3-fluoroanilina (250,3 g, 1,719 mol) foi adicionada em um frasco de fundo redondo de 5 gargalos de 5 1, equipado com agitador aéreo, condensador de refluxo, camisa de aquecimento, controlador de temperatura, uma sonda de temperatura interna e uma entrada de argônio. n- Heptano (2000 ml) e di-t-butil-dicarbonato (450,3 g, 2,064 mol) foram carregados no frasco. A mistura foi agitada sob argônio em temperatura ambiente por 15 min, permitindo a dissolução da maior parte dos sólidos. A mistura foi aquecida ao refluxo por 4 h sob argônio (cuidado: geração de CO2 g). Análise da mistura de reação pelo Teste do método HPLC 20 (THF : MeCN 1:1) indicou completa conversão do material de partida (Rt 4,57 min) em um produto (Rt 6,17 min).

A reação foi permitida esfriar a50-55 °Ce transferida em duas porções para um RBF de um gargalo 3 1. Um total de 1500 ml de destilado foi removido por concentração in vácuo a 45 0C para fornecer uma solução colorida de pêssego com cristais brancos. A lama foi permitida esfriar a temperatura ambiente, enquanto agitando, por 1,5 h. O frasco foi estocado a 4 0C por 15 h, após cujo tempo os cristais foram filtrados sob vácuo e lavados com n-heptano frio (400 ml).

Após secar a 35 0C sob vácuo por 7 h, cristais brancos muito finos do Composto 102 (393,1 g, 93 % produção) foram obtidos. Composto 102: C11H13ClFNO2 245,68 gmol"1. Análise HPLC (Teste 20, MeCN): Rt 6,16 min; 99 % pureza @ 254 nm. p.f.: 103-104 0C. IH RMN δΗ (400 MHz, CDCl3): 1,51 (9H, s, 3 χ CH3), 6,56 (1H, br-s, N-H), 6,94, 7,25, 7,35 (3 χ 1H, 3 χ m, 3 χ Ar-H).

Composto 103

O composto 102 (80,2 g, 0,326 mol) foi adicionado a um frasco de fundo redondo de quatro gargalos 3 1, equipado com agitador aéreo, uma sonda de temperatura interna, funil adição de 500 ml e uma entrada de argônio. Tetraidrofiirano anidro (640 ml) foi carregado no frasco e esfriado usando-se um banho de gelo seco, mais nitrogênio líquido, assegurando uma temperatura interna de -80 0C < T < - 75 0C durante todo o tempo durante a reação. n-Butil lítio (405 ml, 1,011 mol) foi transferido via cânula para o funil enchido com argônio e adicionado em gotas à solução com mínimo salpico durante 2 h. Após envelhecer por 40min, uma solução de iodo (289,9 g, 1,142 mol) em tetraidrofurano anidro (430 ml + 100 ml enxágue) foi adicionada em gotas à mistura de reação fria, assegurando uma temperatura interna de -80 0C < T > -75 0C durante 3 h.

A mistura de reação foi permitida aquecer lentamente a -30 0C durante 14 h após cujo tempo análise pelo Teste 20 do método HPLC (amostra extinta com NaHSO3 aq., diluída com MeCn, em seguida camada 10

15

20

MeCN diluída com MeOH) indicou conversão quase completa do material de partida (Rt 6,17 min, 1,6 % @ 254 nm) em um produto (Rt 6,73 min).

Uma solução de NH4Cl (41,6 g em 160 ml de água) foi adicionada gradualmente, seguido poruma solução de NaHSO3 (184,8 g em 560ml de água) assegurando T < -10 0C. A mistura de extinção foi permitida aquecer a 10 0C, enquanto agitando por 1,5 h.

Após transferir a mistura para um frasco de 1 gargalo, 1370 ml de destilado THF foram removidos e água (500 ml) foi adicionada. A mistura foi agitada vigorosamente a 4 0C por 15 h e filtrada. Após lavar com água (400 ml) um sólido bege foi obtido com um filtrado incolor, que não continha nenhum produto por HPLC.

O sólido foi dissolvido em etanol quente (65 0C) (700 ml) e filtrado enquanto quente para remover material insolúvel (3,5 g, nenhum produto por HPLC). O filtrado obtido foi concentrado a 45 0C sob vácuo a 150 ml em cujo ponto sólidos começaram a precipitar-se. Água (32 ml) foi adicionada em gotas à mistura, que foi então esfriada lentamente a 4 0C durante 1,5 h. Filtragem sob vácuo, lavagem com etanol:água 2:1 4 0C (250 ml) e secagem sob vácuo a 40 0C forneceram o Composto 103 como um sólido amarelo pálido (114,1 g, 94 % produção). Composto 103:

Ci1H12CIFINO2 371,57gmol"1. Análise HPLC (Teste 20, MeOH): Rt 6,73min; 99 % pureza @ 272 nm. p'.f.: 66-67 0C. IH RMN δΗ (400 MHz, CDCl3): 1,45 (9H, s, 3 χ CH3), 7,27 (1H, dd, Ar-H), 7,55 (1H, t, Ar-H), 8,70 (1H, s, CON- H). 13C RMN 6C (100 MHz, CDCl3): 28,04 (C(CH3)3), 79,73 (C(CH3)3), 86,23, 86,49 (C-I), 115,11, 115,32 (C-Cl), 122,35, 122,38 (C-N), 129,89 (C-H), 140,99, 141,02 (C-H), 152,94 (C=O), 155,47, 157,87 (C-F).

Composto 104 F

O composto 103 (110,0 g, 0,296 mol) foi adicionado em um frasco de fundo redondo de quatro gargalos 3 1, equipado com agitador aéreo, condensador de refluxo, banho de água, funil de adição de 250 ml, uma sonda de temperatura interna e uma entrada de argônio. Etanol (900ml) foi carregado no frasco e esfriado a 50 0C. Ácido clorídrico (37 %, 145,9 ml) foi adicionado em gotas, mantendo-se a temperatura interna abaixo de 150 0C.

A mistura foi aquecida a50-550 °C por 2 h, após cujo tempo análise pelo Teste 20 do método HPLC (MeOH) indicou conversão completa do material de partida (Rt 6,73 min) em um produto (Rt 5,44 min). A reação foi esfriada a 50 0C e a solução de NaOH (80,0 g em 1000 ml de água preparada, 865 ml adicionados) foi adicionada gradualmente, mantendo-se a temperatura abaixo de 15 0C, monitorando-se o pH até neutro. A mistura foi transferida para um frasco de um gargalo e armazenada a 4 0C por 15 h.

Um total de 970 ml de destilado foi removido por concentração in vácuo a 35 0C, para fornecer uma solução incolor com sólidos precipitados. A lama foi permitida esfriar a 4 0C por 1 h, após cujo tempo o sólido foi filtrado sob vácuo e lavado com 4 0C de etanohágua 1:4 (200 ml). Após secagem a 35 0C sob vácuo por 72 h, O Composto 104 impuro (80 g, produção 99 %, pureza 95 % a 254 nm) foi obtido.

O sólido foi dissolvido em etanol quente (60 0C) (450 ml) e filtrado enquanto quente para remover o material insolúvel fino. O filtrado foi concentrado a 35 0C sob vácuo a 175 ml, em cujo ponto água (70 ml) foi adicionada em gotas à mistura durante 3-4 h, sendo então esfriado lentamente a 4 0C e agitado por mais 0,5 h. Filtragem sob vácuo, lavagem com etanohágua 4 0C 3:2 (100 ml) e secagem sob vácuo a 35 0C forneceram o Composto 104 como agulhas laranjas (70,5 g, produção 88 %, pureza 98 % @ 272 nm). Uma segunda cultura de material foi obtida do licor mãe como um sólido amarelo pálido (4,6 g, 5 %, 98 % pureza a 272 nm). Produção combinada = 93 %. Composto 104: C6H4ClFlN 271,45 gmol"1. Análise HPLC (Teste 20, MeCN): Rt 5,44 min; 98 % pureza @ 272 nm. p.fi: 80,5-81 0C. ESI +ve: m/z 271,9 [M+H]+ 65 %; 312,9 [M+MeCN+H]+ 100 %. IH RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 5,69 (2H, s, 2 χ N-H), 6,55 (1H, d, Ar-H), 7,18 (1H, t, Ar-H). 13C RMN 6C (100 MHz, Ci6-DMSO): 70,97, 71,24 (C-I), 104,03, 104,25 (C-Cl), 110,14, 110,17 (C-H), 129,90 (C-H), 150,09, 150,14 (C-N), 155,45, 157,82 (C-F). 19F RMN 6F (376 MHz, d6-DMSO): -91,60 (1F, d)

Composto 105 F

H

O composto 104 (74,5 g, 0,275 mol) foi adicionado em um frasco de fundo redondo de quatro gargalos, equipado com agitador aéreo, condensador de refluxo, camisa de aquecimento, controlador de temperatura, funil de adição de 250 ml, uma sonda de temperatura interna e uma entrada de argônio. N,N-Dimetilformamida (575 ml) foi carregada no frasco em temperatura ambiente. DABCO (95,5 g, 0,85 1 mol) foi adicionado em uma porção e a temperatura interna caiu para 150 0C. A mistura foi agitada durante min para realizar a dissolução e a solução foi desgaseificada borbulhando- se argônio através dela vigorosamente por 10 min. Ácido pirúvico (57,33 ml, 0,824 mol) foi adicionado à solução marrom durante 10 min e a temperatura interna elevou-se para 360 0C. A solução foi novament desgaseificada com argônio por 10 min e acetato de paládio (678 mg, 0,0030 mol) foi adicionado em uma porção.

A mistura foi aquecida a 1000 0C por 3 h, após cujo tempo análise pelo Teste de método HPC 20 (MeCN, filtrado) indicou completa conversão do material de partida (R6 5,44 min) em um produto (Rt 3,64 min). A reação foi esfriada à temperatura ambiente por 15 h e subseqüentemente a 50 0C. Uma solução de ácido clorídrico (1,15 N, 575 ml então 0,115 N, 280 ml) foi adicionada gradualmente, mantendo-se a temperatura abaixo de 100 0C, monitorando-se o "pH" até pH = 3,5. Um sólido bronze precipitou-se da solução e a mistura foi agitada por mais 0,5 h a 5 0C. O sólido foi filtrado sob vácuo e lavado com água 10 0C (3 χ 200 ml). Após secar a 40 0C sob vácuo por 36 h, o Composto 105 (55,9 g, produção 95 %) foi obtido. Composto 105: C9H5ClFNO2 213,59 gmol-1 análise HPLC (Teste 20, MeCN): Rt 3,63min; 99 % pureza @ 272 nm ESI -ve: m/z 212,1 [M-H]- 10 %; 168,1 [M-COOH]- 100 % IH RMN δΗ (400 MHz, (I6-DMSO): 7,10, 7,11 (1H, d, Ar-H), 7,25-7,32 (2H, m, 2 χ Ar-H), 12,30, 13,33 (2 χ 1H, 2 χ s, N-H, COO-H) 13C RMN ôc (100 MHz, d6-DMSO): 102,45 (C-3), 108,76, 108,92 (C-9), 110,20, 110,24 (C-6), 116,88, 117,09 (C-5), 125,46 (C-7), 130,34 (C-2), 137,90, 138,00 (C- 8), 149,76, 152,25 (C-4), 162,12 (C=O) 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO):- 121,35 (1F, d).

frasco de fundo redondo de quatro gargalos de 5 1, equipado com um agitador aéreo, funil de adição, uma sonda de temperatura interna e uma entrada de argônio. N,N-Dimetilformamida (695 ml) foi carregada no frasco em temperatura ambiente sob argônio, agitando por 20 min para obter-se uma solução marrom. Carbonildiimidazol (51,0 g, 0,314 mol) foi adicionado em uma porção fornecendo uma suspensão marrom. A mistura foi agitada por 1 h sob argônio em temperatura ambiente, após cujo tempo análise pelo Teste 20 do método HPLC (MeOH para fornecer Me éster, filtrado) indicou incompleta conversão do material de partida (Rt 3,64 min, 0,5 %) no produto principal (Rt 5,48 min) mais intermediário (Rt 4,77 min). Carbonildiimidazol adicional (0,43 g, 0,0026 mol) e N,N-dimetilformamida (45 ml) foram adicionados e a reação foi agitada por mais 2 h, após cujo tempo análise pelo Teste 20 do método HPLC (MeOH para fornecer Me éster, filtrado) indicou completa conversão do material de partida (Rt 3,64 min) no produto (Rt 5,48

Composto 106 F

H

O Composto 105

O composto 105 (55,9 g, 0,262 mol) foi adicionado em um min). Metanol (297 ml, 7,34 mol) foi adicionado à mistura de reação agitada sob argônio a 24 0C, para fornecer uma suspensão marrom nebulosa. Após 3 h, análise pelo Teste 20 do método HPLC (MeCN, filtrado) indicou um produto (Rt 5,48 min). A mistura de reação foi esfriada usando-se um banho de gelo. e água (2000 ml) foi adicionada durante 0,5 h, mantendo-se a temperatura interna a 15 - 20 0C para precipitar um sólido bronze. O sólido foi filtrado sob vácuo e lavado com água 5 0C (2 χ 400 ml). Após secagem no ar, o sólido foi absorvido em diclorometano (800 ml) e acetato de etila (1600 ml) e secado com sulfato de sódio anidro (400 mg). Filtragem através de Celite e eluição com diclorometano (1000 ml) produziram uma solução laranja transparente. A solução foi concentrada sob vácuo a 30 0C, deixando uma lama de cristais no acetato de etila remanescente (160 ml). A lama foi esfriada a 5 0C com um banho de gelo por 15 min. Filtragem sob vácuo, lavagem com 4 0C acetato de etila:n-heptano 1:1 (2 χ 100 ml) então 1:3 (100 ml) e secagem sob vácuo a 35 0C forneceram o Composto 6 como longas agulhas brancas (37,3 g, produção 63 %, pureza 99 % @ 272 nm). Uma segunda cultura de material foi obtida do licor mãe como menos agulhas brancas (5,3 g, 9 %, 98 % pureza a 272 nm). Produção combinada = 72 %. Composto 106: CioH7CIFNO2 227,62 gmol"1 análise HPLC (Teste 20, MeCN): Rt 5,48min; 99 % pureza @ 272nm p.f.: 216,5-218 0C IH RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 3,88 (3H, s, CH3), 7,16 (1H, s, Ar-H), 7,27-7,35 (2H, m, 2 χ Ar-H), 12,48 (1H, s, N-H) 13C RMN ôc (100 MHz, d6-DMSO): 52,15 (CO2CH3), 102,90 (C-3), 108,97, 109,12 (C-9), 110,27, 110,31 (C-6), 116,77, 116,98 (C-5), 125,84 (C-7), 128,82 (C-2), 138,00, 138,09 (C-S), 149,77, 152,26 (C-4), 161,05 (C-O) 19F RMN δΡ (376 MHz, Cl6-DMSO): -121,11 (1F, d)

Composto 107 O composto 106 (46,5g, 0,204mol) foi adicionado em um frasco de fundo redondo de quatro gargalos de 2 1, equipado com agitador aéreo, banho de gelo, uma sonda de temperatura interna e uma entrada de argônio. Ν,Ν-dimetilformamida andira (450ml) foi carregada no frasco em temperatura ambiente sob argônio, agitando-se para obter-se uma solução laranja. Hidreto de sódio (95 %, 7,30 g, 0,290 mol) foi adicionado em porções durante 45min, mantendo-se a temperatura interna abaixo de 50 0C. Não foi observado mais desprendimento de gás. Cloreto de fenilsulfonila (35,8 ml, 0,280 mol) foi adicionado em gotas durante 15 min, mantendo-se a temperatura interna abaixo de 10 0C. A reação foi agitada por 1 h, após cujo tempo análise pelo Tete 20 do método HPLC (MeCN) indicou incompleta conversão do material de partida (Rt 5,48min, 3 % a 272 nm) no produto (Rt 6,43min). A reação foi trabalhada pela lenta adição de água (770 ml) durante min, assegurando-se que a temperatura interna permanecesse abaixo de 200 0C, permitindo que um sólido amarelo se precipitasse. O sólido foi filtrado sob vácuo, lavado com água 5 0C (770 ml) e secado a 37 0C por 15 h. O sólido foi absorvido em etanol (700 ml) e aquecido a 55 0C com agitação por 1 h. A suspensão quente foi concentrada sob vácuo a 40 0C, removendo-se 350 ml de destilado, em seguida permitindo-se esfriar a 5 0C por 0,5 h. Filtragem sob vácuo, lavagem com 4 0C etanol (150 ml) e secagem sob vácuo a 40 0C forneceu o Composto 107 como um sólido amarelo pálido (68,5 g, 91 % produção). Composto 107: C16H11ClFNO4S 367,78 gmol"1 análise HPLC (Test 20, MeCN): Rt 6,43min; 98 % pureza @ 272nm p.f.: 163 0C expandido, 166-167 0C derretido

IH RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 3,88 (3H, s, CH3), 7,51 (1Η, s, ΑΤ-Η), 7,62-7,68 (3Η, m, 3 χ Ar-H), 7,77 (1Η, t, ΑΤ-Η), 7,92 (1Η, d, Ar-H), 8,04 (2Η, d, Ar-H) 13C RMN Sc (100 MHz, d6-DMSO): 53,21 (CO2CH3), 110,60 (C-3), 112,30, 112,34 (C-6), 114,02, 114,17 (C-9), 117,93, 118,14 (C-5), 127,14 (2 χ Ar-C), 128,78 (C-T), 129,85 (2 χ Ar-C), 132,29 (C- 2), 135,24 (C-para), 136,82 (C-ipso), 136,88, 136,96 (C-8), 149,37, 151,89 (C-4), 160,51 (C=O) 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO): -119,42 (1F, d)

Composto 108

O composto 107 (68,4 g, 0,186 mol) foi adicionado em um frasco de fundo redondo de quatro gargalos de 2 1,equipado com agitador aéreo, funil de adição, banho de gelo, uma sonda de temperatura interna e entrada de argônio. Diclorometano anidro (685 ml) foi carregado no frasco em temperatura ambiente sob argônio, agitando-se para obter suspensão parcial. Bromo (11,5 ml, 0,223 mol) foi adicionado em gotas durante 20 min, mantendo-se a temperatura interna abaixo de 10 0C, fornecendo uma mistura vermelho carregado. A mistura de reação foi permitida aquecer à temperatura ambiente por 1 h, após cujo tempo análise pelo Teste 20 do método HPLC (amostra extinta com NaHSO3 aq, diluído com MeOH, em seguida MeOH, filtrada e diluída com MeCN) indicou conversão incompleta do material de partida (Rt 6,43 min, 78 % @ 272 nm) a um produto menor (Rt 6,76 min). Bromo adicional (12,4 ml) foi adicionado em porções durante o curso das próximas 6h e a reação foi deixada agitar em temperatura ambiente por 14 h, em cujo ponto análise pelo Teste 20 do método HPLC (amostra extinta com NaHSO3 aq., diluído com MeOH, em seguida MeOH filtrado e diluído com MeCN) indicou incompleta conversão do material de partida (Rt 6,43 min) a um produto maior (Rt 6,76 min). A reação foi extinta pela adição de uma solução de NaHSO3 (132 g em 400 ml água), assegurando T < 15 0C em gotas durante 30 min. As camadas foram separadas e a camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio aquoso saturado (400 ml χ 2). As camadas aquosas foram extraídas com diclorometano (400 ml) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (1000 ml) e secadas com sulfato de sódio anidro (500 g). Filtragem e concentração sob vácuo a 28 0C forneceram um sólido amarelo bruto (78 g). O sólido foi triturado em etanol quente (650 ml) a 50 0C por 1 h. A suspensão quente foi concentrada sob vácuo a 40 0C, remo vendo-se 450 ml de destilado, então permitida esfriar a 5 0C por 0,2 h. Filtragem sob vácuo, lavagem com etanol 4 0C (150 ml) e secagem sob vácuo a 25 0C fornecera o Composto 108 como um pó amarelo pálido (72,6 g, produção 88 %, 93 % pureza a 272 nm). Este sólido foi dissolvido em acetato de etila quente (500 ml) a 50 0C por 1 h. Etanol (200 ml) foi adicionado lentamente a 50 0C e agitado por 15 min. Precipitação começou e a suspensão quente foi concentrada sob vácuo a 40 0C, removendo-se 475 ml de destilado, em seguida permitida esfriar a 5 0C por 0,5 h. Filtragem sob vácuo, lavagem com etanol 4 0C (150 ml) e secagem sob vácuo a 25 0C forneceu o Composto 108, metil 3-bromo-5-cloro-4-fluoro-l-benzenosulfonil-indol-2-carboxilato, como um pó amarelo pálido (57,4g, 69 % produção, 97 % pureza a 272nm). Uma segunda cultura de material foi obtida do licor mãe como um sólido amarelo (9,6 g, 12 %). Produção combinada = 81 %. Metil 3-bromo-5-cloro- 4-fluoro-l-benzenosulfonil-indol-2-carboxilato Composto 108:

C16H10BrClFNO4S 446,68 gmol"1 Análise HPLC (Teste 20, MeCN): Rt 6,76 min; 97 % pureza @ 272 nm ESI +ve: m/z 447,8 [M+H]+ 90 %; 464,8 [M+NH4]+ 100 % ESI-ve: m/z 445,9 [M-H]"1 100 % IH RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 3,99 (3H, s, CH3), 7,66 (3H, t, 3 χ Ar-H), 7,78 (1H, t, Ar-H), 7,90 (1H, d, Ar-H), 7,98 (2H, d, 2 χ Ar-H) 13C RMN ôc (100 MHz, d6-DMSO): 53,88 (CO2CH3), 96,66 (C-3), 111,87, 111,90 (C-6), 115,36, 115,51 (C-9), 117,29, 117,45 (C-5), 127,16 (2 χ Ar-C), 129,40 (C-7), 130,15 (2 χ Ar-C), 10

130,45 (C-2), 134,63, 134,69 (C-8), 135,46 (C-para), 135,81 (C-ipso), 149,31, 151,85 (C-A), 160,30 (C=O) 19F RMN δΡ (376 MHz, Cl6-DMSO): -124,00 (1F, d)

Parte B: Síntese do composto I

Br

Ct

1. BuU.THF.-90C

SuaMgUi. MePhl -50C Q

2. CIP(OEt)2

3. 0.05NHCI.20C

F cV0et

,OEt

SO2Ph

201

C17H13BrCIFNO4S P mol.: 460,70

N> "o

SO2Ph

202

C1lH1sClFNOePS P mol.: 473,84

Pd(PPh3)4TEA. Tolueno, 80C

203

CmHmCIFNjOsPS P mol.: eis,01

1. TMSBr, OCM, 40C

2. OxaJiIC I. DC M. SC

3. MeOH1 SC

LiOH-H2O. THF, SC

OU

KOfBii, THF1 H2O, SC

205A C20H1tCIFN2O4P P mol.:432,77

1. (-)cinchonidina, Acetona

2. 1N HC!, EtOAe

S

CmHJJCIFN,OePS P mol.: 600,98

MeQs

CN

1. CDI, 1.2-DME

2. NH,(9)

206

C2OH15CIFN2O4P P mol.: 432,77

Composto 1 C2cH18CiFNjOsP P mol.:431,78

Composto 202

Um reator adequado foi carregado Composto 201 (51 g, 0,12 mol) e tetraidrofurano (570 ml). A solução resultante foi esfriada a -90 0Ca- 100 0C sob nitrogênio, usando-se um banho de lama mole LN2 / IPA, em seguida foi tratada com n-butil lítio (2,5M em Hexanos, 52 ml, 0,13 mol) adicionado durante 10 minutos. A isto foi adicionado clorofosfito de dietila (20,5 g, 0,13 mol) durante 10 minutos. HPLC (Método 001, RT = 17,7 min) não mostrou nenhum material de partida e ca. de 70 % de produto. A reação foi então diluída com acetato de etila (570 ml) e foi permitida aquecer a -40 0C. A mistura foi então tratada com ácido clorídrico (0,5 M, 400 ml) e foi permitida aquecer à temperatura ambiente e agitar por 30 minutos. As camadas resultantes fora separadas e o extrato aquoso com acetato de etila (500 ml). Os orgânicos foram combinados e lavados com salmoura (500 ml), secados sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados em um óleo. 78 % HPLC AUC (Método 20, RT = 5,6 min) > produção 100 % devido a impurezas e solvente. Usado como é na etapa seguinte. Dados para C-2-Metil Éster: #2x: C18H16ClFNO6PS 459,81 gmol-1 m/z (ESI+): 460,0 (MH+, 100 %), 462,0 (MH+, 35 %).

Composto 203

Um reator adequado foi carregado com o Composto 202 (56 g, 0,10 mol estimados), iodocinamonitrila (27 g, 0,10 mol), trietilamina (17 ml, 0,12 mol) e tolueno (475 ml). A mistura resultante foi desgaseificada espargindo com uma corrente nitrogênio por 10 minutos em temperatura ambiente, após cujo tempo tetracis(trifenilfosfina) paládio(O) (6,0 g, 0,005 mol) foi adicionado. A mistura foi espargida por mais 5 minutos, em seguida foi aquecida a 80 0C por 2 horas. HPLC (Método 20, RT = 6,2 min) mostrou uma reação completa. A mistura foi esfriada à ambiente e foi filtrada através de celite e lavada com acetato de etila (1000 ml). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (2 χ 500 ml), em seguida secados sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados a um volume de 170 ml. O concentrado foi esfriado a 0 0C e foi agitado por 1 hora, durante cujo tempo o produto cristalizou-se. Os sólidos foram filtrados e lavados com hexano:tolueno (2:1, 150 ml) e secados para deixar 54 g, HPLC AUC 85 % (Método 20).

O sólido bruto foi então purificado por cromatografia de coluna eluído w/ 25 % acetato de etila em cloreto de metileno. As frações puras foram coletadas e combinadas para fornecer os Compostos 203, 41 g, produção 67 %, 96 % HPLC AUC (método Test 20, RT = 6,2 min).

Dados para C-2-Etil Éster: #3: C29H25ClFN2O6PS 615,01 gmol" 1 1H RMN δΗ (400 MHz, CDCl3): 1,35 (3Η, t, PO2CH2CH3), 1,52 (3Η, t, CO2CH2CH3), 2,40 (3Η, s, Ar-CH3), 4,08-4,20 (2Η, m, PO2CH2CH3), 4,61 (2Η, q, CO2CH2CH3), 5,90 (1Η, d, CH-CHCN), 7,33-7,37 (3Η, m, 2 χ Ar-H, CH=CHCN), 7,55 (2H, a-t, 2 χ Ar-H), 7,67 (1H, a-t, Ar-H), 7,74-7,79 (3H, m, 3 χ Ar-H), 8,13 (2H, d, 2 χ Ar-H)

Dados para C-2-Metil Éster: #3x: C28H23ClFN2O6PS 600,98 gmol"1 m/z (ESI+): 601,1 (MH+, 100 %), 603,0 (MH+, 35 %) 1H RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 1,18 (3H, t, CH3CH2OP), 2,34 (3 H, s, Ar-CH3), 4,02 (5H, m, CH3CH2OP, CO2CH3), 6,47 (1H, d, CH=CHCN), 7,54 (1H, d, Ar-H), 7,62 (1H, t, Ar-H), 7,72 (1H, d, CH=CHCN), 7,70-7,76 (4H, m, 4 χ Ar-H), 7,82 (1H, t, Ar-H), 7,91 (1H, d, Ar-H), 8,13 (2H, d, 2 χ Ar-H). Valores ôc múltiplos indicam divisão do sinal de carbono devido a F e/ou P. ljC RMN ôc (100 MHz, d6-DMSO): 15,97, 16,03 (CH3CH2OP), 20,79 (Ar-CH3), 53,88 (CO2CH3), 61,73, 61,79 (CH3CH2OP), 98,39 (CH=CHCN), 107,50, 107,54 (C), 108,95, 108,99 (C), 111,37, 111,42 (C), 115,47, 115,63 (C), 116,82, 116,91, 117,01, 117,10 (C), 118,43 (CN), 127,44 (SO2Ph, 2 χ Corto), 127,91, 128,02 (C-H), 128,67 (C-H), 130,27 (SO2Ph, 2 χ Cmeta), 131,21, 131,41 (C- H), 132,68 (C), 133,29, 133,40 (C-H), 134,12, 134,27 (C), 134,55, 134,63, 134,72 (C), 135,49 (SO2Ph, Cipso), 136,09 (SO2Ph, Cpara), 139,10, 139,25 (C), 149,06, 151,60 (C-4), 149,51 (CH=CHCN), 161,10 (C=O). 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO):-l 12,36 (1F, d). 31P RMN δΡ (162 MHz, d6-DMSO): 23,49 (IP, s)

Composto 204

Um reator adequado foi carregado com o Composto 203 (41 g, 0,067 mol) e cloreto de metileno (175 ml). A solução resultante foi esfriada a O0C e foi tratada com bromotrimetilsilano (46 g, 0,30 mol) adicionado durante minutos. A reação foi então aquecida a 40 0C for 1,5 horas. HPLC (Método 20, RT = 4,3 min) indicou uma reação completa. O TMSbr em excesso foi extraído sob vácuo (40-45°C) e o sólido resultante pegajoso foi ressuspenso em DCM (200 ml) e e esfriado a 0 0C. Cloreto de oxalila (12 ml, 0,13 mol) foi adicionado durante 15 minutos, seguido por N5N- dimetilformamida (1,0 ml) ambos adicionados a 0 0C. Desprendimento de gás foi observado durante a adição de DMF. Após 1 hora em temperatura ambiente, HPLC (Método 20, RT = 6,0 min, amostra extinta com metanol antes da injeção) mostrou uma completa reação. Os solventes foram extraídos novamente para remover cloreto de oxalila residual e a mistura ressuspendeu cloreto de metileno (100 ml). A solução foi esfriada a 0o - 50 0C, e então foi tratada com metanol (300ml) e foi permitida aquecer à temperatura ambiente. Após duas horas, HPLC indicou uma reação completa (HPLC Método 20, RT = 6,0 min.) Os solventes foram extraídos e o sólido bruto foi usado como é na etapa seguinte. Composto 204 48 g, HPLC AUC 91 %, >100 % produção devido a solventes e impurezas.

Dados para C-2-Étil Éster: 204: C28H23ClFN2O6PS 600,98 gmol"1 1H RMN δΗ (400 MHz, CDCl3): 1,53 (3H, t, CO2CH2CH3), 2,40 (3H, s, Ar-CH3), 3,79 (3H, d, POCH3), 4,61 (2H, q, CO2CH2CH3), 5,90 (1H, d, CH=CHCN), 7,33-7,37 (3H, m, 2 χ Ar-H, CH=CHCN), 7,55 (2H, a-t, 2 χ Ar- H), 7,67 (1H, a-t, Ar-H), 7,73-7,79 (3H, m, 3 χ Ar-H), 8,13 (2H, d, 2 χ Ar-H) Dados para C-2-Metil Éster: 204x: C27H2IClFN2O6PS 586,96 gmol"1 m/z (ESI+): 587,1 (MH+, 100 %), 589,0 (MHf, 35 %) 1H RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 2,33 (3H, s, Ar-CH3), 3,66 (3H, d, POCH3), 4,02 (3H, s, CO2CH3), 6,47 (1H, d, CH=CHCN), 7,53 (1H, d, Ar-H), 7,61 (1H, dd, Ar-H), 7,70 (1H, d, CH=CHCN), 7,68-7,76 (4H, m, 4 χ Ar-H), 7,82 (1H, t, Ar-H), 7,90 (1H, d, Ar-H), 8,13 (2H, d, 2 χ Ar-H). Múltiplos valores ôc indicam divisão do sinal de carbono devido a F e/ou P. 13C RMN Ôc (100 MHz, d6- DMSO): 20,81 (Ar-CH3), 52,07, 52,13 (CH3OP), 53,99 (CO2CH3), 98,46 (CH=CHCN), 106,99 (C), 108,41 (C), 111,45 (C-H), 115,51, 115,67 (C), 116,77, 116,86, 117,07 (C), 118,48 (CN), 127,51 (SO2Ph, 2 χ Corto), 127,92, 128,04 (C-H), 128,71 (C-H), 130,32 (SO2Ph, 2 χ Cmeta), 131,56 (C-H), 132,20 (C), 133,35, 133,46 (C-H), 134,19, 134,34 (C), 134,55, 134,63, 134,72 (C), 135,47 (SO2Ph, Cipso), 136,16 (SO2Ph, Cpara), 139,20, 139,35, 139,39, 139,54 (C), 149,09, 151,63 (C-4), 149,51 (CH=CHCN), 161,15 (C=O). 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO): -113,93 (1F, d). 31P RMN δΡ (162 MHz, d6-DMSO): 25,42 (IP, s)

Composto 205

Um reator adequado foi carregado com o Composto 204 (48 g, ca. 0,072 mol) e tetraídrofurano (800 ml.) A solução resultante foi então esfriada a 50 0C e foi tratda com monoidrato de hidróxido de lítio (12 g, 0,28 mol) e água (180 ml) adicionada durante 15 minutos. A reação foi permitida aquecer à temperatura ambiente, durante cujo tempo a cor clareou. Após agitação durante a noite, HPLC indicou uma reação completa (Método Test 20, produto RT = 4,5, impureza principal RT = 3,7). A reação foi esfriada a 50 0C e foi acidificada com ácido clorídrico (5N, 300 ml). O THF em excesso foi removido por evaporação sob pressão reduzida e os sólidos pegajosos resultantes foram empastados em acetona (200 ml). A mistura foi aquecida a 40 0C por 30 minutos e então deixada esfriar à temperatura ambiente. Os sólidos foram permitidos granularem-se por 2 horas, em seguida foram filtrados e lavados com acetona / água (2:1, 20). Usados como são na etapa seguinte.

Composto 206 (resolução quiral)

Um reator adequado foi carregado com o Composto 205 (432,6 g, 1,0 mol) e acetona (7,79 L). (-)-Cinchonidina (294,39 g, 1,0 mol) foi adicionada em uma porção e a suspensão resultante foi agitada por quatro horas. Os sólidos foram isolados por filtragem e lavados com acetona (300 ml) para deixar 343,2 g do sal após secar sob vácuo. Relação de análise HPLC quiral = 98:2.

O sal foi suspenso em uma mistura de acetato de etila (5,2 1) e IN HCl (5,2 1) e foi vigorosamente agitado em temperatura ambiente por 2 horas. Após este tempo, as camadas foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraída com acetato de etila (2,7 1) e os extratos orgânicos foram combinados, secados com sulfato de sódio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida para produzir o Composto 206 resolvido como um sólido branco. 145,4 g, 68 % produção total, relação, análise HPLC quiral = 98,4 : 1,6. Usado como é na etapa seguinte. #6: C2OH15ClFN2O4P 432,77 gmol"1 m/z (ESI+): 433,0 (MH+, 100 %), 435,0 (MH+, 35 %)

1H RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 2,35 (3H, s, Ar-CH3), 3,78 (3H, d, POCH3), 6,52 (1H, d, CH=CHCN), 7,46 (2H, d, Ar-H), 7,66 (1H, d, CH=CHCN), 7,69, 7,81 (2H, 2 χ d, H-6, H-I), 1,11 (1H, s, Ar-H), 13,63 (1H, s, N-H), 15,70 (1H, br-s, COOH). 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO): - 114,27 (1F, s). 31P RMN δΡ (162 MHz, d6-DMSO): 36,44 (IP, s).

Composto I

Um reator adequado foi carregado com o Composto 206 (0,63 g, 0,0014 mol) e 1,2-dimetoxietano (10 ml). A mistura foi tratada com 1,1- carbonildiimidazol (0,47 g, 0,0028 mol) adicionado em uma porção e a mistura foi permitida agitar em temperatura ambiente até o desprendimento de gás cessasse (ca. 1,5 horas). A solução foi então esfriada a 5 0C e foi espargida com gás amônia por 5 minutos. HPLC (Método 20, produto RT = 5,0 min) mostrou uma completa reação após uma hora em temperatura ambiente. A reação foi extinta pela adição de 10 g de gelo moído e foi concentrada sob pressão reduzida para remover DME. A lama resultante foi agitada por uma hora a 5 0C para granular o produto. Os sólidos foram filtrados e secados para deixar o Composto I puro ((metil éster do ácido 2- Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-

fenil]-(S)-fosfínico). 0,56g, 89 % produção. HPLC (Método 20) pureza química 98,5 %. Pureza quiral 97 %.

Um reator adequado foi carregado com o Composto 206 (10 g, 0,024 mol) e 1,2-dimetoxietano (150 ml). A mistura foi tratada com 1,1- carbonildiimidazol (7,8 g, 0,048 mol) adicionado em uma porção e a mistura foi permitida agitar em temperatura ambiente até o desprendimento de gás cessar. A solução foi então esfriada a 5 0C e foi espargida com gás amônia por minutos. HPLC (Método 20, produto RT = 5,0 min) mostrou uma completa reação após uma hora. A reação foi extinta pela adição de 100 g de gelo moído e foi concentrada sob pressão reduzida para remover o DME. O sólido oleoso resultante (em água) foi diluído com metanol (20 ml) e agitado por uma hora a 5 0C para granular o produto. Os sólidos foram filtrados e secados para deixar o Composto I puro ((metil éster do ácido 2-Carbamoil-5-cloro-4- fluoro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfinico). 9,8 g, 98 % produção. HPLC (Método 20) pureza química 99,5 %. pureza quiral 94,3 %. Sólido branco,

O composto I: C20Hi6ClFN3O3P 431,78 gmol"1 m/z (ESI+): 432,1 (MH+, 100 %), 434,0 (MH+, 35 %) vmax (KBr disco) (cm'1) 1619,0 (amida I), 1672,5 (amida II), 2218,4 (CN), 3063,0, 3286,0 (N-H) [a]D20 : +33,42 (c, 10,04 mgmf1 e, CHCl3) p.f.: 177 0C brilha, 181 0C amolece, 183- 185 0C derrete. Análise elementar: C20H17ClN3O3P calculado C 55,63 %, H

3.73 %, N 9,73 %, Cl 8,21 %, F 4,40 %, P 7,17 %. Encontrado C 55,56 %, H

3.74 %, N 9,72 %, Cl 8,24 %, F 4,21 %, P 7,11 % 1H RMN δΗ (400 MHz, d6- DMSO): 2,32 (3 H, s, Ar-CH3), 3,70 (3H, d, CH3OP), 6,49 (1H, d,

CH=CHCN), 7,37 (1H, dd, H-6), 7,43 (1H, dd, H-7), 7,54 (1H, d, H-6'), 7,66 (1H, d, CH=CHCN), 7,69 (1H, d, H-2'), 7,73 (1H, s, H-4'), 8,05, 10,63 (2 χ 1H, 2 χ s, NH2), 13,02 (1H, s, N-H) Múltiplos valores ôc indicam divisão do sinal de carbono devido a F e/ou P. 13C RMN 6C (100 MHz, d6-DMSO): 20,77 (Ar-CH3), 51,70, 51,76 (CH3OP), 96,03, 96,07, 97,52, 97,56 (C-3), 98,29 (CH=CHCN), 110,70 (C-7), 111,66, 111,83 (C-5), 118,04, 118,13, 118,22, 118,32 (C-9), 118,56 (CN), 125,84 (C-6), 127,11, 127,22 (C-2'), 131,05 (C- 4'), 132,57, 132,67 (C-6'), 132,96, 134,50 (C-I'), 134,03, 134,18 (C-3'), 136,40, 136,51, 136,61 (C-8), 138,95, 139,10 (C-51), 141,71, 141,91 (C-2), 149,19, 151,70 (C-4), 149,65 (CH=CHCN), 160,46 (C=O). 19F RMN δΡ (376 MHz, d6-DMSO): -113,11 (1F, d). 31P RMN δΡ (162 MHz, (I6-DMSO): 33,39 (IP, s) Exemplo 8

H

Preparação do Composto III

SO2Pft

1uBuU.THF.-90C ^y0et

^kU OEt Bu3M8UMeph-SOC ΩΡ1 —:-- Yy>*

^0pS. 20C XX>Y ^kOo

^^ N o Tolueno, BOC SO2Ph

301

SO2Ph 303

302

CN

1. TMSBr1 DCM, 40C Cl

MeQs _.

2. OxaliICl. DCM. 5C D 1__/ \ LiOH-H2O. THF1 5C

3. M.OH. SC ^S^ti \

ψ} KOiSu. THF1 H2O SC

305

1. (-)cincíionidina, Acetona

2. 1NHCI. ElOAc —η T^ OH

CN

MeQs 1, CDI, 1.2-DME

CK ^ O 2. NH3(B)

H O

306

Composto 302

Um reator adequado foi carregado Composto 301 (100 g, 0,23 mol) e tetraidrofurano (1 1). A solução resultante foi esfriada entre -90 0C a - 100 0C sob nitrogênio, usando-se um banho de lama mole LN2 / IPA, em seguida foi tratada com n-butil lítio (2,5 M em Hexanos, 99 ml, 0,25 mol) adicionado durante 10 minutos. A isto foi adicionado dietil clorofosfito (37,1 g, 0,25 mol) durante 10 minutos. HPLC (Método 001, RT = 18,9 min) não mostrou nenhum material de partida e ca. de 8 % de produto. A reação foi então diluída com acetato de etila (1 L) e foi permitida aquecer a -40 0C. A mistura foi então tratada com ácido clorídrico (0,5 M, 590 ml) e foi permitida aquecer à temperatura ambiente e agitação por 30 minutos. As camadas resultantes foram separadas e a água extraída com acetato de etila (500 ml). Os orgânicos forem combinados e lavados com salmoura (500 ml), secados sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados em um óleo. 88 % HPLC AUC (Método 20, RT = 5,8 min) 115 g > 100 % produção devido a impurezas e solvente. Usados como são na etapa seguinte.

Composto 303

Um reator adequado foi carregado com o Composto 302 (111

g, estimado 0,18 mol), iodocinamonitrila (47,1 g, 0,175 mol), trietilamina (29,3 ml, 0,21 mol) e tolueno (800 ml). A mistura resultante foi desgaseificada espargindo-se com uma corrente de nitrogênio por 10 minutos em temperatura ambiente, após cujo tempo tetracis(trifenilfosfino) paládio (0) (10,1 g, 0,0088 mol) foi adicionado. A mistura foi espargida por mais 5 minutos, em seguida foi aquecida a 80 0C por 2 horas. HPLC (Método 20, RT = 6,5 min) mostrou uma completa reação. A mistura foi esfriada à temperatura ambiente e foi filtrada através de celite e lavada com acetato de etila (400 ml). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (2 χ 500 ml), em seguida secados sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados a um volume de 350 ml. O concentrado foi esfriado a 0 0C e foi agitado por 1 hora, durante cujo tempo o produto cristalizou-se. Os sólidos foram filtrados e lavados com hexano:tolueno (2:1, 150 ml). Secados para deixar 95 g, 90 % produção, HPLC AUC 98 % (Método 20). Usados como são na seguinte reação.

303: C29H26ClN2O6PS 597,02 gmol"1 m/z (ESI+): 597,0 (MH+, 100 %), 599,0 (MH+, 35 %) 1H RMN δΗ (400 MHz, CDCl3): 1,38, 1,48 (2 χ 3Η, 2 χ t, COOCH2CH3, POOCH2CH3), 2,41 (3H, s, Ar-CH3), 4,09-4,16 (2H, m, POOCH2CH3), 4,52 (2H, q, COOCH2CH3), 5,93 (1H, d, CH=CHCN), 7,33-7,38 (3H, m, CH=CHCN, 2 χ Ar-H), 7,52 (2H, t, 2 χ Ar-H), 7,64 (1H, t, Ar-H), 7,74, 7,77 (2 χ 1H, 2 χ d, 2 χ Ar-H), 7,85 (1H, d, Ar-H), 7,94 (1H, dd, Ar-H), 8,08 (2H, d, 2 χ Ar-H) 1H RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 1,26, 1,33 (2 χ 3H, 2 χ t, COOCH2CH3, POOCH2CH3), 2,34 (3H, s, Ar-CH3), 3,95-4,10 (2H, m, POOCH2CH3), 4,40 (2H, q, COOCH2CH3), 6,52(1 H, d, CH=CHCN), 7,52 (1H, dd, Ar-H), 7,60-7,84 (8H, m, CH=CHCN, 7 χ Ar-H), 8,07 (3 χ 1H, m, 3 χ Ar-H)

Composto 304

Um reator adequado foi carregado com o Composto 303 (537 g, 0,90 mol) e cloreto de metileno (2,0 L). A solução resultante foi esfriada a 0 0C, e foi tratada com bromotrimetilsilano (450 g, 2,9 mol) adicionado durante 15 minutos. A reação foi então aquecida a 400 0C por 1,5 horas. HPLC (Método 20, RT = 4,4 min) indicou uma reação completa. O TMSbr em excesso foi extraído sob vácuo (40-45°C) e o sólido resultante pegajoso foi ressuspenso em DCM (2,5L) e esfriado a 0 0C. Cloreto de oxalila (156 ml, 1,8 mol) foi adicionado durante 15 minutes, seguido por N,N- dimetilformamida (13,7 ml, 0,18 mol) ambos adicionados a 0 0C. Desprendimento de gás foi observado durante a adição de DMF. Após 1 hora, HPLC (Método 20, RT = 6,2 min, amostra extinta com metanol anidro antes da injeção) mostrou uma completa reação. Os solventes foram extraídos novamente para remover cloreto de oxalila residual e a mistura ressuspensa em metanol esfriado (3 ,OL) a 0 - 5 0C e então foi permitida aquecer à temperatura ambiente. Após duas horas, HPLC indicou uma reação completa (HPLC Método 20, RT = 6,2 min). A solução foi concentrada a um volume de 1,5L e a lama fina resultante foi esfriada a 0 0C e foi diluída com uma solução aquosa de bicarbonato de sódio (126 g, água 3L). Após 2 horas a 5 0C, o produto foi filtrado e lavado com água fria / metanol (2:1, 1,5L) em seguida secado para deixar 500 g Composto 304. Pureza HPLC (Método 20) 92 % usado como é.

Composto 305

Um reator adequado foi carregado com o Composto 304 (ca. 280 g, 0,48 mol) e tetraidrofurano (2,8 L). A solução resultante foi então esfriada a 50C e foi tratada com monoidrato de hidróxido de lítio (45 g, 1,07 mol) adicionado em uma porção. A reação foi permitida aquecer à temperatura ambiente, durante cujo tempo a cor clareou e um precipitado branco formou-se. Após agitação durante a noite, HPLC indicou uma reação incompleta (Método 20, produto RT = 4,3, parcialmente desprotegido RT = 5,1, impureza principal RT = 3,8). 10 % adicionais LiOH-H2O foram adicionados, porém, após 10 horas, o intermediário parcialmente desprotegido permaneceu a 5 % e o pico de impureza a 3,8 minutos tinha aumentado para cerca de 25 %. A reação foi esfriada a 5 0C e foi acidificada com ácido clorídrico (5N, 280 ml), em seguida foi diluída com acetato de etila (2L). As camadas foram separadas e a água extraída com acetato de etila (500 ml). Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura (IL) e secados com sulfato de sódio, em seguida concentrados para deixar um sólido oleoso bruto, Composto 305. Ca. 300 g, HPLC AUC 57 %.

O produto bruto foi absorvido em acetonitrila (1,2 L) a 40 0C e o produto triturado com água (1,2 L). A lama resultante foi esfriada a 5 0C e foi permitida granular por 30 minutos, após cujo tempo o produto foi filtrado e lavado com ACNiH2O (1 : 1, 100 ml). Ca. 103g, 88 % por HPLC. O produto foi então recristalizado de 360 ml ACN a 40 0C e 360 ml de água como antes. Filtrado, lavado e secado para deixar 75 g Composto 305. HPLC AUC 97 %. Usado como é na etapa seguinte. Composto 306 (resolução quiral)

Um reator adequado foi carregado com o Composto 305 (280 g, 0,66 mol) e acetona (4,2 L). A lama resultante foi então tratada com (-)- Cinchonidina (199 g, 0,66 mol) adicionada em uma porção. Após uma hora, uma solução tinha-se formado e, após mais 1 hora, um sólido branco precipitou-se e a mistura foi deixada agitar por mais duas horas (quatro horas no total), após cujo tempo os sólidos foram filtrados, lavados com acetona (200 ml) e secados para deixar 199 g do Composto Bruto 306 sal de cinchonidina. HPLC mostrou uma relação de isômero de 96:4.

O sal bruto foi então empastado em acetato de etila (3 L) e ácido clorídrico (IN, 3 L). A solução de duas fases foi vigorosamente agitada por 2 horas em temperatura ambiente. As camadas foram separadas e a água extraída com acetato de etila (3 L). Os orgânicos foram combinados, secados com sulfato de sódio e concentrados para deixar o Composto 306 de base livre, 107 g, 95:5 por HPLC quiral.

O Composto 306 bruto foi então suspenso em acetona (1,07 L) e tratado com (-)-cinchonidina (76 g, 0,26 mol). Após 4 horas de tempo de agitação total (como acima), os sólidos foram filtrados, lavados com acetona (200 ml) e secados para deixar 199 g do sal. HPLC 98,6:1,4.

O sal foi rompido dissolvendo em acetato de etila (3 L) e ácido clorídrico (IN, 3 L). A solução de duas fases foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. As camadas foram separadas, secadas com sulfato de sódio e concentradas para deixar o Composto 306 de base livre, 98 g, 98,6:1,4 por HPLC quiral. 70 % de recuperação do isômero desejado, 35 % produção do Composto 306 racêmico. #6: C20H16ClN2O4P 414,78 gmol"1 m/z (ESI+): 415,1 (MH+, 100 %), 417,0 (MH+, 35 %) [a]D25: -47,51 (c, 10,66 mgml"1 em EtOAc)

1

[Enanciômero oposto [a]D : +47,26 (c, 9,60 mgml"1 em EtOAc)] 1H RMN δΗ (400 MHz, d6-DMSO): 2,33 (3 H, s, Ar-CH3), 3,71 (3H, d, CH3OP), 6,50 (1H, d, CH=CHCN), 7,36 (1H, dd, H-6), 7,57 (1H, d, H-I), 7,66-7,71 (2H, m, H-4, Ar-Horto), 7,67 (1H, d, CH=CHCN), 7,84 (1H, d, Ar- Horto), 7,98 (1H, s, Ar-Hpara), 12,97 (1H, s, N-H), 14,38 (1H, br-s, COOH) Múltiplos valores ôc indicam divisão do sinal de carbono devido a P. 13C RMN ôc (100 MHz, d6-DMSO): 20,68 (Ar-CH3), 51,70 (CH3OP), 98,15 (CH=CHCN), 102,33, 103,85, 114,98, 120,91 (3 χ C), 118,47 (CN), 125,39 (C), 126,78 (C), 127,74, 127,86 (C-Horto), 129,78, 129,88 (C), 131,25 (C), 132,06 (C), 133,44, 133,55 (C), 133,89, 134,05 (C), 134,62, 134,75 (C), 135,47, 135,66 (C), 138,78, 138,91 (C), 149,62 (CH=CHCN), 160,40 (C=O) 31P RMN δΡ (162 MHz, d6-DMSO): 33,50 (IP, s)

Composto III

Um reator adequado foi carregado com o Composto 306 (0,63 g, 0,0014 mol) e 1,2-dimetoxietano (10 ml.). A mistura foi tratada com 1,1- carbonildiimidazol (0,47 g, 0,0028 mol) adicionado em uma porção, e a mistura foi permitida agitar em temperatura ambiente até que o desprendimento de gás cessasse (ca. 15, horas). A solução foi então esfriada a 0C e foi espargida com gás amônia por 5 minutos. HPLC (Método 20, produto RT = 5,0 min) mostrou uma completa reação após uma hora em temperatura ambiente. A reação foi extinta pela adição de 10 g de gelo moído e foi concentrada sob pressão reduzida para remover o DME. A lama resultante foi agitada por uma hora a 5 0C para granular o produto. Os sólidos foram filtrados e secados para deixar o Composto III puro ((metil éster do ácido 2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5- metil-fenil]-(S)-fosfínico) como um sólido branco 0,56 g, 89 % produção. HPLC (Método 20) pureza química 98,5 %. pureza quiral 97 %.

Um reator adequado foi carregado com o Composto 306 (10 g, 0,024 mol) e 1,2-dimetoxietano (150 ml). A mistura foi tratada com 1,1- carbonildiimidazol (7,8 g, 0,048 mol) adicionado em uma porção, e a mistura foi permitida agitar à temperatura ambiente até que o desprendimento de gás cessasse. A solução foi então esfriada a 5 0C e foi aspargida com gás amônia por 5 minutos. HPLC (Método 20, produto RT = 5,0 min) mostrou uma reação completa após uma hora. A reação foi extinta pela adição de 100 g de gelo moído e foi concentrada sob pressão reduzida para remover DME. O sólido oleoso resultante (em água) foi diluído com metanol (20 ml) e e agitado por uma hora a 50 0C para granular o produto. Os sólidos foram filtrados e secados para deixar o Composto III puro ((metil éster do ácido 2- Carbamoil-5 -cloro-4-fluoro-1 H-indol-3 -il)- [3 -((E)-2-ciano-vinil)-5-metil- fenil]-(S)-fosfínico). 9,8 g, 98 % produção. HPLC (Método 20) pureza química 99,5 %. pureza quiral 94,3 %. Composto III: C20H17ClN3O3P 413,79 gmol"1 m/z (ESI+): 414,1 (MHf, 100 %), 416,1 (MHf, 35 %) vmax (KBr disco) (cm"1) 1620,0 (amida I), 1670,6 (amida II), 2218,7 (CN), 3125,5, 3291,9 (N- H) [a]D20 : -75,08 (c, 9,04 mgml"1 em CHCl3) p.f.: 144-148 0C transição para semi-sólido opaco, 209-210 0C derrete Análise elementar: C2OHi7ClN3O3P calculado C 58,05 %, H 4,14 %, N 10,15 %, Cl 8,57 %, P 7,49 %. Encontrado C 58,13 %, H 4,08 %, N 10,16 %, Cl 8,69 %, P 7,44 % 1H RMN δΗ (400 MHz, dé-DMSO): 2,32 (3H, s, Ar-CH3), 3,74 (3H, d, CH3OP), 6,52 (1H, d, CH=CHCN), 7,30 (1H, dd, H-6), 7,53-7,58 (3H, m, H-4, H-7, H-6'), 7,68 (1H, d, CH=CHCN), 7,73 (1H, s, H-4'), 7,75 (1H, d, H-2'), 8,02, 10,15 (2 χ 1H, 2 χ s, NH2), 12,80 (1H, s, N-H) Múltiplos valores δ indicam divisão do sinal de carbono devido a P. 13C RMN ôc (100 MHz, d6-DMSO): 20,77 (Ar- CH3), 51,75, 51,81 (CH3OP), 98,39, 98,91 (C-3), 98,44 (CH=CHCN), 115,05 (C-7), 118,53 (CN), 119,96 (C-4), 124,73 (C-6), 126,68 (C-5), 127,15, 127,26 (C-2'), 129,25, 129,35 (C-9), 131,37 (C-4'), 132,45, 134,04 (C-I'), 132,69, 132,80 (C-6'), 133,92 (C-8), 134,30, 134,44 (C-3'), 139,33, 139,46 (C-5'), 139,96, 140,17 (C-2), 149,55 (CH=CHCN), 160,65 (C=O) 31P RMN δΡ (162 MHz, d6-DMSO): 33,72 (IP, s) Exemplo 9

Reciclagem do enanciômero R do Compoto Ι-2-ácido carboxílico 2(PR):

F F \jÒk^CN F

r. I l OMí 1) Oxalilcloreto _ ι pOMe α X / OMe

Vr\ Cal. DMF uy"V\ 1) Cinchonidina1 TrV

k>-N C02H PCM. Q-SaC , UJLn^CO2H Acetona k^L ,/-CO2H

I t 2) INNaOH aq. H .

3) INHCUAeetona 2(Ps),2(PR) ' 2(P.)

Em uma solução fria (0-5 0C) do enanciômero de partida 2(Pr) (50,0 g, 120,8 mmol) em DCM anidro (300 ml) foi adicionado oxalilcloreto (15,2 ml, 174,2 mmol, 1,5 eq) em gotas durante um período de 5 minutos. DMF anidro (1,43 ml, 18,5 mmol) foi adicionado usando-se uma seringa durante um período de 2 minutos. Desprendimento de gás foi observado. A solução amarela resultante foi mantida agitando sob atmosfera de argônio a 0 - 5 0C. Após 60 minutos, o resultado de HPLC da alíquota de reação extinta por metanol indicou somente 10% de ácido de partida não reagido. Após agitar por mais 10 minutos, a mistura de reação foi diluída com (0 — 5 0C) DCM (300 ml). A mistura diluída foi rapidamente transferida para um funil de adição e foi adicionada a uma solução de NaOH aquosa agitando (IN, 695 ml) durante um período de 7 minutos. A temperatura da mistura extinguindo-se elevou-se a 33 0C (de 26,5 0C, temperatura de partida de NaOH aquosa), quando a adição foi completada. Após agitação contínua por mais 3 minutos, o líquido da camada superior foi decantado. A camada inferior (contendo sal precipitado) foi concentrada sob pressão reduzida para remover DCM. O resíduo foi colocado em acetona (300 ml) e foi acidificado usando-se IN HCl (total 275 ml foi adicionado) a pH 4. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 30 minutos. O produto sólido coletado por filtragem, lavado com 1 : 1 acetona/água DI (100 ml). O sólido obtido foi secado em um forno de vácuo a 45 0C durante 18 h. O peso líquido deste lo. material de cultura = 31,4 g. = 98,4 % por HPLC (AUC). O resultado da HPLC quiral indicou uma mistura de 2(PS) (51,7 %) e 2(PR) (47,5 %). O espectro de 1H-RMN indicou produto limpo com traços de DCM.

Recuperação do 2o. produto de cultura do licor mãe do lo. produto de cultura: duas camadas estavam presentes no licor mãe. As camadas foram separadas. A camada superior foi extraída com DCM (400 ml). A camada inferior do licor mãe da la. cultura (óleo marrom, principalmente por HPLC) foi colocado em tolueno (30 ml) e foi lavado com uma mistura de IN HCl (5 ml) e salmoura (15 ml). Combinada a camada de tolueno com o extrato DCM, lavada com água DI (400 ml), secada sobre sulfato de sódio anidro. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida. O material da 2a. cultura foi secado sob elevado vácuo por 16 horas. O peso líquido = 15,1 g. Pureza química = 90% por HPLC (AUC). Resultado de HPLC quiral indicou uma mistura de 2(PS) (91,4 %) e 2(PR) (8,6 %). Espectro 1H-RMN indicou principalmente produto com resíduo de Tolueno (5,3 % p) e traço de impurezas menores. Recuperação total do ácido livre (mistura de 2 enanciômeros) = 92%.

Reciclagem do enanciômero R do Composto ΙΙΙ-2-ácido carboxílico I(Pr):

VAzs^cn VAsAvvn VAjA^cn

a ^ 1 U Oxalilcloreto JvOMe CN cl _ l·OMe

rW CatDMF T^Yv 1) Cinchonidina,

U9i^lL./"COitH DCM.0.5"C K IsJLn-kCO3H Acetona kJL^OiH

" 2) IN NaOH aq. " ~

3) INHCI 2) HCI. DCM 1(P.)

1(PR) I(PS)II(Pr)

Em uma solução turva fria (0- 5 0C) do enanciômero de partida I(Pr) (50,0 g, 120,8 mmol) em DCM anidro (300 ml) foi adicionado oxalilcloreto (15,7 ml, 180 mmol), 1,5 eq.) em gotas durante um período de 5 minutos. DMF anidro (1,45 ml, 18,8 mmol) foi adicionado usando-se uma seringa durante um período de 2 minutos. Desprendimento de gás foi observado. A solução amarela resultante foi mantida agitando sob atmosfera de argônio a 0 - 5 0C por 30 minutos. A mistura de reação foi então diluída com DCM (300 ml) e foi rapidamente transferida para um funil de adição. A mistura de reação diluída foi adicionada a uma solução NaOH aquosa agitando (IN, 725 ml) durante um período de 6 minutos. A temperatura da mistura extinguindo-se foi a 33 0C (de 24,5 0C5 temperatura de partida de NaOH aquoso), quando a adição foi completada. Após agitação contínua por mais 5 minutos, a mistura extinta foi colocada em um banho de gelo. IN HCl (365 ml) foi adicionado através de um funil de adição durante 2 minutos. A mistura acidificada resultante (pH = 2) foi agitada por 5 minutos. As camadas foram separadas usando-se um funil de separação. A água foi ainda extraída com DCM (200 ml χ 2). Combinados a camada orgânica e extratos DCM). Lavados com água DI (200 ml), secados sobre sulfato de sódio anidro. DCM foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi secado em um forno de vácuo por 42 horas. Peso líquido = 52,4 g. Pureza química > 97% por HPLC (AUC). O resultado da HPLC quiral indicou uma mistura de I(Ps) (64,1%) e I(Pr) (35,9%). O espectro de 1H-RMN indicou produto limpo com resíduo DCM (4,3 % p) e traço de DMF. Recuperação do ácido livre (mistura de 2 enanciômeros) = 100%. Exemplo 10

Preparação de Iodo Cinamonitrila

Ι?8'

Br

2 3 4 1

3-Bromo-5-metil-benzaldeído (3)

Tolueno anidro (365 ml) foi adicionado em um frasco de fundo redondo de quatro gargalos 3 1 equipado com agitador aéreo, um funil de adição de 250 ml e um de 1 L, uma sonda de temperatura interna e uma entrada de argônio. O frasco foi imerso em um banho de gelo/metanol a fim de manter a temperatura interna na região de -15 0C, n-butil lítio (2,5 M em hexano, 232 ml, 0,581 mol) foi adicionado ao frasco via seringa, sob argônio em uma taxa de agitação moderada. Cloreto de n-butil magnésio (2,0 M em THF, 145 ml, 0,290 mol, solução marrom clara) foi introduzida dentro do funil de adição de 250 ml via seringa, sob argônio. A adição desta solução foi realizada em gotas durante 22 minutos durante cujo tempo a temperatura interna elevou-se de -16 0C a - 13 0C e a mistura tornou-se de transparente para amarelo opaco claro. A solução foi agitada por mais 0,5 h a -13 0C.

Uma solução de 3,5-dibromotolueno (196 g, 0,784 mol; Aldrich) em toleuno anidro (1458 ml) foi preparada em um frasco de fundo redondo de um gargalo de 2 L. Esta solução amarelo pálido foi transferida em duas porções para o funil de adição de 1 L. A adição desta solução foi realizada em gotas durante 50 minutos durante cujo tempo a temperatura interna foi mantida entre -13 0C e -17 0C e a mistura tornou-se de uma cor marrom-laranja, opaca, mais escura. A suspensão foi agitada por mais 2,75 h entre -13 0C e -17 0C sob argônio. Uma amostra HPLC foi tirada após 2 h e preparada por adição de 2 gotas de metanol, seguido por remoção de solvente sob pressão reduzida. O Teste 20 do método HPLC indicou que nenhum material de partida permanecia (Rt 6,64 min) e uma mistura de intermediários (Rt 4,94 min, 6,15 min, 7,40 min). Esta suspensão foi rotulada 'Mistura A'.

Durante a adição de 3,5-dibromotolueno, N5N- dimetilformamida anidra (78,7 ml, 1,016 mol) foi adicionada via seringa em um frasco de fundo redondo de quatro gargalos de 5 L, equipado com agitador aéreo, um funil de adição de 1 1, uma sonda de temperatura interna e uma entrada de argônio. O frasco foi imerso em um banho de gelo/metanol, a fim de manter a temperatura interna na região de -15 0C. Tolueno anidro (91 ml) foi adicionado ao frasco via seringa, sob argônio em uma taxa de agitação moderada. Esta solução foi rotulada 'Mistura B'.

A Mistura A foi transferida em duas porções (2 χ 950 ml) para o funil de adição de 1 L do frasco de 5 L contendo a Mistura Β. O funil de adição foi envolvido com folha de alumínio, para evitar influxo de calor excessivo. A adição da Mistura A foi realizada em gotas durante 38 minutos, durante cujo tempo a temperatura de reação interna foi mantida entre -16 0C e —12 0C e a reação torno-se uma solução laranja. A solução foi agitada por mais 1 h entre -13 0C e -16 0C sob argônio, após cujo tempo uma amostra HPLC foi preparada removendo-se tolueno sob pressão reduzida, dissolvendo-se em MeOH e filtrando-se qualquer material insolúvel. O Teste do método HPLC indicou um produto principal (Rt 5,42 min).

A reação foi julgada estar completa e pronta para ser extinta.

Uma solução preparada de ácido cítrico (341,54 g) em água (650 ml) em um frasco cônico de 1 L foi adicionada lentamente durante 20 minutos na mistura de reação em porções de 50 ml, mantendo-se a temperatura interna abaixo de 0 0C. Esta solução amarela foi agitada a 0 0C por mais 20 minutos.

Após este tempo, a mistura de reação extinta foi transferida para um funil de separação de 4 L e as duas fases foram separadas. A camada orgânica foi lavada com água (650 ml) e salmoura saturada (550 ml) antes de ser secada pela adição de sulfato de sódio anidro (500 g). O agente de secagem foi removido por filtragem a vácuo. A camada orgânica secada foi transferida em duas porções para um frasco de fundo redondo de 3 L e os solventes foram removidos sob elevado vácuo a 35 0C. Um óleo laranja avermelhado de baixa viscosidade 3-bromo-5-metil-benzaldeído (159,1 g, 102 % produção) foi obtido. C8H7BrO 199,04 gmol"1; HPLC: Rt 5,42 min; 96 % pureza @ 272 nm; 1H RMN δΗ (400 MHz, CDC13): 2,41 (3H, s, CH3), 7,58, 7,60, 7,81 (3 χ 1H, 3 χ s, 3 χ Ar-H), 9,92 (1H, s, CHO); 13C RMN ôc (100 MHz, CDCl3): 21,17 (CH3), 123,27 (C-3), 129,15, 129,93 (C-2, C-6), 138,06 (C-l), 138,11 (C-4), 141,33 (C-5), 191,20 (CHO).

3-Bromo-5-metil-cinamonitrila (4)

Hidreto de sódio (60% dispersão em óleo mineral, 39,2 g, 0,980 mol) foi adicionado a um frasco de fundo redondo de quatro gargalos de 5 L, equipado com agitador aéreo, funil de adição de 250 ml, uma sonda de temperatura interna e uma entrada de argônio. Tetraidrofurano anidro (2,6 L) foi adicionado ao frasco sob argônio e a agitação começou em uma taxa moderada para fornecer uma suspensão opaca branca. Dietil cianometilfosfonato (152,1 ml, 0,941 mol, líquido amarelo pálido ligeiramente viscoso) foi introduzido em um funil de adição de 250 ml, sob argônio. A adição do fosfonato foi realizada em gotyas durante 56 minutos durante cujo tempo a temperatura interna elevou-se de 21 0C para 29 0C e a mistura tornou-se uma suspensão amarelo muito pálido, menos opaca. A solução foi agitada por mais 1 h, durante cujo tempo a temperatura interna caiu de 29 0C para 22 0C e a mistura tornou-se uma solução transparente, amarelo pálido.

3-Bromo-5-metil-benzaldeído (159 g, 0,784 mol, presumida quantitativa, óleo vermelho) foi transferido de seu frasco de fundo redondo de 3 L para o funil de adição de 250 ml por verteção. O frasco foi enxaguado com tetraidrofurano anidro (3x5 ml). Os três enxágues foram também vertidos no funil de adição, que foi então jateado com argônio. A adição do aldeído foi realizada em gotas sob argônio, durante 71 minutos, durante cujo tempo a temperatura interna elevou-se de 20 0C para 33 0C e a mistura tornou- se uma solução laranja escuro.

A solução foi agitada por mais 2 h, durante cujo tempo a temperatura interna caiu de 32 0C para 19 0C. Uma amostra HPLC da solução marrom escuro foi preparada a 1 h diluindo-se com THF. O Teste 20 do método HPLC indicou completa conversão do material de partida (Rt 5,42 min) em um produto principal com uma mistura de 10:1 de isômeros E:Z (272 nm, Rt 5,76 min Z; Rt 5,83 min E). Ácido clorídrico (6N, 21,66 ml) e água (2578,33 ml) foram

misturados em um frasco cônico de 4L para fornecer uma solução aquosa de 0,05 M HCl (2,6 L).

A mistura de reação foi diluída com terc-butil metil éter (0,5 L) e extinta com 0,05 M HCl aquoso (0,5 L), após o que a temperatura interna elevou-se para 22 0C. A mistura de reação parcialmente extinta foi transferida para um funil de separação de 22 L. O resíduo do vaso de reação foi transferido para o funil de separação por enxágue consecutivo com terc-butil metil éter (1,5 L), 0,05M HCl aquoso (1,0 L), terc-butil metil éter (2,0 L), 0,05 M HCl aquoso (1,1 L), terc-butil metil éter (1,2 L). As camadas foram agitadas por 30 segundos, permitindo que os gases escapassem periodicamente e a camada aquosa foi separada dentro de um frasco de 22 L. A camada orgânica foi lavada com água (2,0 L) e as camadas aquosas foram combinadas. A camada orgânica foi secada com sulfato de sódio anidro (500 g) por 10 minutos e o agente de secagem foi então filtrado sob vácuo. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida para fornece um sólido amarelo pálido, que foi secado durante a noite sob vácuo a 30 0C. O material bruto resultante (200,2 g) era um sólido amarelo, pulverulento, porém ligeiramente pegajoso. O sólido amarelo bruto (200 g), em um frasco de fundo

redondo de três gargalos de 2 L, equipado com sonda de temperatura interna, funil de adição de 500 ml e agitador aéreo, foi dissolvido em metanol (700 ml) por imersão em um banho de água a 50 0C. Na dissolução, o sólido amarelo tornou-se uma solução laranja-avermelhada. O banho de água foi removido e água (250 ml) foi introduzida dentro do funil de adição de 500 ml. A adição da água foi realizada em gotas com uma taxa de agitação moderada, durante 3 h, durante cujo tempo a temperatura interna caiu de 50 0C para 25 0C. Um sólido amarelo começou a precipitar-se fora da solução laranja- avermelhada após cinco minutos e a adição de 50 ml de água. O licor mãe foi verificado periodicamente por HPLC para determinar a relação de isômeros E:Z ainda na solução. Após adicionar 250 mld e água, a relação E:Z era de 1:1,2 e determinada ser favorável. A suspensão foi esfriada em um banho de gelo por 10 minutos, permitindo que a terminal de importação caísse par 17 0C, antes de ser filtrada através de um funil de vidro sinterizado de 3 L sob pressão reduzida. O sólido resultante foi lavado com uma solução fria de metanolrágua (1:1, 2 χ 50 ml, 5-10 0C). O sólido foi secado a peso constante em um forno de vácuo a 35 0C. Um sólido amarelo pálido, 3-bromo-5-metil- cinamonitrila (144,1 g, produção 53%) foi obtido. Este material foi, entretanto, contaminado com o óleo mineral não removido, como observado nos espectros RMN de próton e carbono. 3-Bromo-5-metil-cinamonitrila: C10H8BrN 222,08 gmol"1; HPLC: isômero-E Rt 5,83 min; 97 % pureza @ 272 nm. isômero-Z Rt 5,76 min; -1,7 % @ 272 nm; 1H RMN δΗ (400 MHz, CDCl3): 2,36 (3H, s, CH3), 5,86 (1H, d, JH, H 16,7, CH=CHCN), 7,17 (1H, s, Ar-H), 7,28 (1H, d, JH, H 16,7, CH=CHCN), 7,39 (2 χ 1H, s, 2 χ Ar-H); 13C RMN δ0 (100 MHz, CDCl3): 21,23 (CH3), 97,86 (CH=CHCN), 117,89 (CN), 123,19 (C-3), 127,03, 127,38 (C-4, C-6), 134,85 (C-2), 135,38 (C-l), 141,16 (C-5), 149,31 (CH=CHCN).

3-Iodo-5-metiI-cinamonitrila (1)

Três frascos pressurizados, seláveis, de topo de tarraxa de 500 ml (rotulados A, B e C) foram individualmente equipados com um agitador magnético e dispostos através de banhos de óleo aquecidos a 115 0C. Separada e seqüencialmente adicionado a cada frasco foram: 3-bromo-5- metil-cinamonitrila (3 χ 47,5 g, 3 χ 0,214 mol); m-xileno (3 χ 171 ml), fornecendo uma solução laranja; dietileno glicol dimetil éter (3 χ 43 ml); iodeto de sódio (3 χ 64,12 g, 3 χ 0,428 mol); iodeto de cobre (I) (3 χ 4,08 g, 3 χ 0,0214 mol); e finalmente Ν,Ν'-dimetiletilenodiamina (3 χ 4,60 ml, 3 χ 0,0427 mol) em cujo ponto a cor tornou-se preto-esverdeado escuro. O topo rosqueado de cada frasco foi enxaguado com m-xileno (3x1 ml). O iodeto de sódio sólido insolúvel, endurecido, foi mobilizado com uma espátula, enquanto a solução era desgaseificada: correntes constantes de argônio foram borbulhadas através das soluções de cada frasco por 10 minutos.

Os três frascos foram selados sob uma atmosfera de argônio e abaixados dentro de seus respectivos banhos de óleo a 115 0C, assegurando uma taxa de agitação moderada em cada. As reações foram deixadas agitar a 115 0C, atrás de uma proteção de jato de ar por 14 h durante a noite.

Após este tempo, o frasco C foi constatado ter parado a agitação. Os frascos foram permitidos esfriar no ar por 5 minutos antes da abertura. Amostras HPLC das três reações foram preparadas para remover o m-xileno sob pressão reduzida e dissolução em MeCN. Análise foi realizada usando-se o Teste 20 do método HPLC;

Frasco A: Produto principal (Rt 5,97min), 2,5 % material de partida (Rt 5,83min).

Frasco B: Produto principal (Rt 5,97min), 1,0 % material de partida (Rt 5,83min).

Frasco C: Produto principal (Rt 5,97min), 20 % material de partida (Rt 5,83min).

Todos os três frascos foram desgaseificados borbulhando-se correntes constantes de argônio através das respectivas misturas de reação por minutos. Os três frascos foram selados sob uma atmosfera de argônio e abaixado dentro de seus respectivos banhos de óleo a 120 0C, assegurando uma taxa de agitação moderada em cada. As reações foram deixadas agitar a 120 0C, atrás de uma proteção contra rajadas de vento por 2 h.

Após este tempo, os frascos foram permitidos esfriar no ar por minutos antes de abrir. As amostras HPLC das três reações foram preparadas removendo-se o m-xileno sob pressão reduzida e dissolvendo-se em MeCn. A análise foi realizada usando-se o Teste 20 do método HPLC;

Frasco A: Produto principal (Rt 5,97min), 1,9 % material de partida (Rt 5,83min).

Frasco B: Produto principal (Rt 5,97min), 0,9 % material de partida (Rt 5,83min).

Frasco C: Produto principal (Rt 5,97min), 7,5 % material de partida (Rt 5,83min). As reações AeB foram julgadas estarem completas e deixadas esfriar à temperatura ambiente. O frasco C foi novamente desgaseificado por borbulhação de uma corrente constante de argônio através da mistura de reação por 10 minutos. O frasco foi selado sob uma atmosfera de argônio e abaixado dentro do banho de óleo a 125 0C, assegurando uma taxa de agitação moderada. A reação foi deixada agitar a 125 0C, atrás de uma proteção contra rajadas de vento, por mais 4 h.

Após este tempo, o frasco C foi permitido esfriar no ar por 5 minutos antes da abertura. Uma amostra HPLC da reação foi preparada removendo-se o m-xileno sob pressão reduzida e dissolvendo-se em MeCN. A análise foi realizada usando-se o Teste 20 do método HPLC.

Frasco C: Produto principal (Rt 5,97min), 2,0 % material de partida (Rt 5,83min).

A reação C foi julgada estar completa e deixada esfriar à temperatura ambiente.

O frasco A foi diluído com terc-butil metil éter (2 χ 150 ml) e a mistura foi filtrada sob vácuo para remover os materiais insolúveis, através de um funil de vidro sinterizado de 3 L,contendo Celite (1,5 L), prelavado com terc-butil metil éter.

Os frascos BeC foram similarmente diluídos e filtrados através do mesmo funil sinterizado Celite, combinando-se os três filtrados A, BeC em um frasco cônico de 12 L. Os frascos foram enxaguados e Celite foi eluído com terc-butil metil éter (3 L).

Os filtrados combinados foram refiltrados sob vácuo através de um funil de vidro sinterizado de 3 L limpo, contendo Celite fresco (1,5 L), prelavados com terc-butil metil éter, para remover os particulados turvos remanescentes. Eluição foi realizada com terc-butil metil éter (4 L). O filtrado cor marrom-avermelhado, transparente resultante era estável, sendo armazenado a 4 0C por 48 h. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida a 40 0C e os solventes de elevadamente ebulindo foram então removidos sob elevado vácuo a 45 0C. Coevaporação com metanol (2 χ 50 ml) produziu um sólido marrom bruto (203 g).

O sólido marrom bruto (200 g), em um frasco de fundo

redondo de três gargalos de 2 L, equipado com sonda de temperatura interna, funil de adição de 500 ml e agitador aéreo,foi dissolvido em metanol (700 ml) por imersão em um banho de água a 53 0C. Na dissolução, o sólido marrom tornou-se uma solução marrom-avermelhada. O banho de água foi removido e água (300 ml) foi introduzida dentro do funil de adição de 500 ml. A adição da água foi realizada em gotas com uma moderada taxa de agitação, durante 3 h, durante cujo tempo a temperatura interna caiu de 50 0C para 24 0C. Um sólido marrom-amarelado começou a precipitar-se da solução marrom- avermelhada após dez minutos e a adição de 80 ml de água. O licor mãe foi verificado periodicamente por HPLC para determinar a relação de isômeros E:Z ainda em solução. Após adicionar 300 ml de água, a relação E:Z era de 1:1,1 e foi determinada ser favorável. A suspensão foi esfriada por 14 h, permitindo que a temperatura interna caísse para 4 0C, antes de ser filtrada através de um funil de vidro sinterizado de 3 L sob pressão reduzida. O sólido resultante foi lavado com uma solução fria de metanol:água (1:4, 100 ml, em seguida 200 ml, 5 0C). O sólido foi secado a temperatura constante em um forno de vácuo a 35 0C. Um sólido marrom pálido, 3-iodo-5-metil- cinamonitrila (149,4g, 86 % produção) foi obtido. Este material foi, entretando, contaminado com o óleo mineral não removido, como observado nos espectros RMN de próton e carbono.

O sólido marrom, ligeiramente pegajoso (148,8 g), em um frasco cônico de 2 L, foi dissolvido em acetonitrila (1,5 L) para fornecer uma solução marrom-alaranjada escura com glóbulos insolúveis de óleo mineral. Esta mistura foi filtrada sob gravidade através de papel filtro (Whatman, 541), remo vendo-se a maior parte do óleo mineral (10,6 g). O filtrado foi transferido para um funil de separação de 4 L e lavdo com heptano (0,5 L). A camada de heptano foi extraída com acetonitrila (250 ml) e concentrada sob pressão reduzida para fornecer mais óleo mineral (3,2 g). As camadas de acetonitrila foram combinadas, concentradas sob pressão reduzida e secadas em um forno de vácuo a 35 0C, produzindo 3-iodo-5-metil-cinamonitrila (132,5g, 77 % produção) como um sólido marrom claro. Este material foi observado ser livre de todo o óleo mineral por espectros RMN de próton e carbono. 3-Iodo-5-metil-cinamonitrila: Ci0H8IN 269,08 gmol"1; P.F.: 980 0C amolece, 99-100 0C derrete; HPLC (Acetonitrila): isômero-E Rt 5,97min; 97 % pureza @ 272 nm (3-Bromo-5-metil-cinamonitrila, isômero-E Rt 5,83 min; -1,4 % @ 272 nm.); 1H RMN δΗ (400 MHz, CDCl3): 2,33 (3H, s, CH3), 5,85 (1H, d, JH, H 16,7, CH=CHCN), 7,20 (1H, s, Ar-H), 7,25 (1H, d, JH, H 16,7, CH=CHCN), 7,59, 7,60 (2 χ 1H, 2 χ s, 2 χ Ar-H); 13C RMN ôc (100 MHz, CDCl3): 21,09 (CH3), 94,93 (C-3), 97,70 (CH=CHCN), 117,91 (CN), 127,61 (C-6), 133,37 (C-2), 135,44 (C-l), 140,81 (C-4), 141,15 (C-5), 149,18 (CH=CHCN). Exemplo 11

Configuração Absoluta do Composto III (metil éster do ácido 2-Carbamoil-5-cloro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)- fosfínico

mg do Composto III foram suspensos em 50 ml de anisol. Cristais adequados para análise de raio-X de monocristal formaram-se após 2 dias. os cristais eram monoclínicos com um grupo espacial de P21 e dimensões unitárias de célula de a = 13,0983 Â, b = 10,9625 Â, c = 16,4266 Â, α = 90°, β = 103,6063° e γ = 90°. No cristal, a unidade assimétrica continha duas moléculas independentes do composto III (molécula A e molécula B) e uma única molécula, parcialmente ocupada (ca. 86%) de anisol como solvente. O parâmetro do frasco foi determinado como -0,04(7) para molécula A e 1,04(7) para molécula B. Com base na determinação anterior, a estereoquímica absoluta foi atribuída e os centros quirais em PlA e PlB são ambos na configuração S. A Fig. 2A fornece uma vista da molécula A incluindo estereoquímica em PIA, e a Fig. 2B fornece uma vista da molécula B, incluindo estereoquímica em PIB. Exemplo 12

Farmacologia do Composto I Metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2- ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfinico acid metila ester)

e

Composto III

Metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-

vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico) As seguintes tabelas mostram a atividade anti-HIV in vitro de 3-fosfoindóis enanciomericamente puros dos compostos I e III nos ensaios, incluindo análise da resistência aos medicamentos testados. A Tabela 1 mostra a atividade dos compostos contra um painel de enzimas de Transcriptase Inversa HIV-I mutantes. A atividade antiviral dos compostos de 3-fosfoindol do composto I e composto III écomparada com a atividade do composto de controle EFV (efavirenz, 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4- trifluorometil-l,4-diidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona) com vários vírus.

Como mostrado na Tabela 1, o Composto I inibiu a enzima de transcriptase inversa (RT) HIV-I (subtipo B, cepa BH10) com valores de concentração inibitória média de 50% (IC50) variando de 0,366 ± 0,251 μΜ (RT tipo selvagem) a 1,411 ± 0,873 μΜ (K103N/Y181C). Similarmente, as IC50S do Composto III variou de 0,343 ± 0,083 μΜ (RT tipo selvagem) a 1,614 ± 0,279 μΜ (K103N/Y181C). O Composto I e Composto III não eram inibitórios para polimerases humanas alfa (IC50S > 145 μΜ), beta (IC50S > 422 μΜ) ou gama (IC50S > 60 mM) como visto na Tabela 5, demonstrando a seletividade dos compostos de teste. Estudo cristalográficos com o Composto Ieo mutante duplo HIV RT K103N/Y18IC revelou que o Composto I liga-se à bolsa NNRTI hidrofóbica conhecida da enzima.

Nos ensaios de cultura de célula HIV-1, empregando-se células MT-4 e um HIV-I subtipo B (cepa BH-10), O Composto I e Composto III inibiram a produção de HIV com valores de médios concentração eficaz de 50% (EC5o) de 1 nM e 1,2 nM, respectivamente (vide Tabela 6). Em ensaios realizados em PBMC humana, o Composto I e Composto III inibiram a produção de HIV-1 com uma EC5O média de 0,4 nM (cepa BH-10) ou 1,5 nM (cepa NL4-3). Contra 3 diferentes cepas virais HIV- 1 em 5 diferentes linhagens de células humanas hospedeiras, a faixa EC50 determinada para o Composto I foi de 0,5 - 2,0 nM e para o Composto III foi de 0,5 - 1,7 nM. O Composto Ieo Composto III foram ativos contra um painel de 9 diferentes subtipos de HIV-I com respectivas faixas de potência de 0,25 a 3,2 nM e 0,2 a 2,14 nM. As atividades do Composto I e Composto III foram reduzidas 24,8 e 19,5 vezes, respectivamente, na presença de glicoproteína de ácido ácido alfa-1 e 45% de soro humano.

No dia 4 o teste de citotoxicidade em 6 linhagens de células hospedeiras HIV-I humanas o Composto I e Composto III motraram valores médios de concentração de citotoxicidade de 50% (CC50) de 16,6 a 32,9 μΜ e 14,8 a 50,0 μΜ, respectivamente. Em PBMC, os valores CC50 de 52,6 (Composto I) e 66,9 μΜ (Composto III) foram determinados. No teste de 9- 12 dias em linhagens de célula HeLa, HuH7 e HepG2, os valores CC50 do Composto I e Composto II foram na faixa de 23,5 a 31,5 μΜ. Com base nas relações CC50/EC50 determinadas nas células MT-4, os valores do índice de Seletividade (SI) de > 22000 e > 18000 foram calculados para o Composto III e Composto I, respectivamente.

No teste de resistência cruzada usando-se uma variedade de linhagens de célula e cepas HIV-1, o Composto 1 e Composto III retiveram boa potência contra vírus resistentes a NNRTI contendo mutações K103N, Yl8IC ou KlOSNArISlC (valores respectivo EC5O permaneceram abaixo de

4,5 e 14,5 nM), enquanto EFV mostrou considerável resistência contra o mutante duplo em particular (valores EC50 36 a 116 nM).

O perfil de resistência do Composto I e Composto III foi examinado em maior profundidade usando-se 3 diferentes painéis de vírus no teste realizado por Monogram BioSciences (anteriormente ViroLogic): um painel de avaliação de vírus de baixa a moderada resistência a EFV; um painel de 8 vírus altamente resistentes a EFV e um painel de largo espectro de 64 vírus, incluindo 40 vírus resistentes NNRTI com mutantes de resistência simples, dupla e tripla a NNRTI. O Composto I e Composto III eram altamente ativos contra um subpainel de mutantes contendo mutações NRTI e PI. O Composto I e Composto III eram superiores a EFV contra essencialmente todos os vírus resistentes a EFV, incluindo vírus com mutantes duplos e triplos. O Composto I era 2-3 mais potente do que o Composto III contra vírus resistentes a EFV, com duplos e triplos mutantes.

Em uma série de estudos de interação in vitro, não houve interação negativa observada entre o Composto I e Composto III e 7 NRTIs ou 6 PIs aprovados para a terapia de HIV-I na clínica.

F ARMACODINÀMIC A PRIMÁRIA Lista de abreviações

HIB Comumente usada em cepa de laboratório HIV-I A98 Alanina na posição 98 ou RT AAG Glicoproteína do ácido alfa-1 AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida AZT Zidovudina BHlO Cepa adaptada em laboratório do vírus tipo 1 da imunodeficiência humana CC50 Concentração 50% citotóxica CPE Efeito citopático

DNA Ácido deoxirribonucleico

DSA Ensaio de susceptibilidade a medicamento

E138k Mudança de glutamato para lisina na posição 138 de

RT

EC5O, EC50S 50% concentração eficaz

EFV Efavirenz

ELISA Ensaio imunossorvente ligado por enzima

F227F/L Fenilalanina/leucina na posição 227 de RT

FBS Sorobovinofetal

G190A Mudança de glicina para alanina na posição 190 de RT

G190A/G Mudança de glicina/alanina na posição 190 de RT

G190S Mudança de glicina para serina na posição 190 de RT

GLP Boas práticas de laboratório

H9 Linhagem de célula T humana derivada de um paciente

com linfoma de célula T

HepG2 Linhagem de célula de hepatoma humano

HeLa Linhagem de célula humana isolada de um paciente com adenocarcinoma

HIV, HIV-I Vírus da imunodeficiência humana tipo 1

HIV-2 Vírus da imunodeficiência humana tipo 2

HS Soro humano

HuH7 Linhagem de célula de hepatoma humano

IC5o, IC50S 50% concentração inibitória

IND Aplicação de Medicamento Novo Investigacional

KlOlE Mudança de lisina para glutamato na posição 101 de RT

K103N Mudança de lisina para asparagina no resítuo 103 de

RT 10

15

20

25

K103R Mudança de lisina para arginina no resítuo 103 de RT

K103 S Mudança de lisina para serina na posição 103 de RT

LlOOl Mudança de leucina par isoleucina na posição 100 de

RT

Mudança de metionina para valina na posição 184 de RT

Miligrama

Células T humanas isoladas de um paciente com leucemia

Linhagem de célula T humana isolada de um paciente com leucemia de célula T adulta

Linhagem de célula T humana isolada de um paciente com leucemia de célula T adulta Sal interno de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazólio

Mutação associada com nucleosídeo Cepa de laboratório HIV-I comumente usada Nanomolar

NNRTI, NNRTIs Inibidor(es) da transcriptase inversa não-nucleosídeo NRTI Inibidor da transcriptase inversa

Nucleosídeo/Nucleotídeo P225H Mudança de prolina para histidina no resíduo 225 ou

RT

P227L Mudança de prolina para leucina da posição 227 ou RT

P236L Mudança de prolina para leucina na posição 236 ou RT

p24 Proteína de núcleo p24 HIV

p28 Proteína de núcleo p28 SIV

M184 V

mg

MOLT-4

MT-2

MT-4

MTS

MTT

NAM

NL4-3, 4595 nM PI Inibidor da protease

PBMC Células mononucleares sanguíneas periféricas

RC Capacidade de replicação

ROD Cepa de laboratório HIV-2 comumente usada

RT Transcriptase inversa

SD Desvio padrão

SI índice de seletividade

SIV Vírus da imunodeficiência simiana

U937 Linhagem de célula monócita humana isolada de um

IO paciente com linfoma

Mudança de valina para alanina na posição 106 de RT Mudança de valina para metionina na posição 106 de RT

Mudança de valina para isoleucina na posição 108 de 15 RT

Mudança de valina para ácido aspártico no resíduo 179 de RT

Tipo selvagem

Mudança de tirosina para cisteína no resíduo 181 de RT

Mudança de tirosina para valina na posição 181 de RT Mudança de tirosina para leucina na posição 188 de RT Micrograma Micromolar

25 Atividade antiviral in vitro contra a enzima RT HIV

Os perfis de atividade do Composto I, Composto III e EFV contra RT HIV foram determinados usando-se um painel de ensaios de transcriptase inversa (RT) de HIV como mostrado na Tabela I. Estes estudos empregaram enzima RT HIV tipo selvagem derivada de HIV subtipo B (cepa

20

V106 A V106 A

V108I

V179D

WT, W.T., wt Y181C

Y181V

Y188L

Vg

μΜ BH-10), juntamente com um painel padrão de enzimas mutantes, dirigidas ao sítio, resistentes a NNRTI com substituições K103N e Y18C apenas ou em combinação.

Quando testado in vitro, o Composto I inibiu a transcrição 5 inversa de HIV com valores IC50 variando de 0,366 ± 0,251 μΜ (RT tipo selvagem) a 1,411 ± 0,873 μΜ (K103N/Y181C). Similarmente, IC50S derivadas do Composto III variaram de 0,343 ± 0,083 μΜ (RT tipo selvagem) a 1,614 ± 0,279 μΜ (K103N/Y181C). EFV produziu o esperado perfil de inibição in vitro, exibindo atividade tipo selvagem contra a enzima Y181C, 10 porém fortemente prejudicou a atividade contra as enzimas mutantes K103N e

K103N/Y181C.

Tabela 1

Atividade Contra RT HIV-I em Ensaio de Enzima

Composto N Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão W.T.3 Y181C b K103N b Y181C/K103N b 4 0,366 ±0,251 0,526 ± 0,285 0,782 ±0,801 1,411 ±0,873 III 5 0,343 ± 0,083 0,361 ± 0,086 2,203 ± 1,259 1,614 ±0,279 EFV 4 C50 = concentração de inibidor que reduz a atividade enzimática em 50% N = número de experimentos réplicas realizados a enzima RT HIV-I tipo selvagem na estrutura BHlO

A atividade relativa dos agentes de teste e comparador contra os diferentes vírus pode ser vista pelos dados de resistência-múltipla apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

Composto Mudança múltipla W.T. Y181C K103N Y181C/ K103N I 1 1,6 ±0,7 3,2 ±3,5 5,0 ±3,4 III 1 3,2 ±1,1 1,2 ±0,4 12,7 ±4,3 EFV 1 2,3 ± 1,5 34,3 ± 17,5 36,8 ± 20,5 Mudança-múltipla = EC50 para o mutante HIV dividido pela EC50 para o vírus HIV tipo selvagem

A mudança-múltipla média foi calculada como a média das mudanças-múltiplas individuais testadas em paralelo. As concentrações de medicamento calculadas requeridas para bloquear 50% da enzima (IC5o) e os dados mostrados nas Tabelas 1 —4 foram medidos na presença de detergente (que aumenta o valor IC5o), entretanto, valores mais baixos foram geralmente obtidos na ausência de detergente.

Atividade antiviral in vitro contra enzimas RT HIV mutantes

adicionais

Os Compostos I e III foram testados contra um painel mais largo de enzimas RT contendo mutações de resistência-NNRTI comuns. Os dados da eficácia são mostrados na Tabela 3 e as correspondentes mudanças- múltiplas são resumidas na Tabela 4. Os estudos são resumidos no texto que segue.

Tabela 3

Atividade in vitro antiviral contra enzimas RT HIV-I mutante

direcionadas ao sítio

Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão Mutação RT N Comp. I Comp.III EFV W.T.b 10 0,23 ± 0,05 0,21 ± 0,02 0,04 ± 0,006 LlOOlc 3 0,16 ±0,03 0,13 ±0,06 0,26 ± 0,09 V106MC 3 0,23 ± 0,06 0,20 ± 0,06 0,37 ± 0,07 V1081c 3 1,20 ±0,71 0,83 ± 0,35 0,30 ± 0,05 E1381c 3 4,67 ±0,91 2,99 ±0,18 0,6 ±0,16 Ml 84 Vd 4 0,29 ± 0,08 0,17 ±0,08 0,02 ± 0,00 Y188L6 3 1,25 ±0,38 1,15 ±0,36 1,73 ±0,22 L1001/K103Ne 4 0,43 ± 0,33 0,40 ± 0,26 >2 Faixa Atividade 0,16-4,67 0,13-2,99 0,02 - >2 Média (μΜ) C50 = concentração inibitória que reduz a atividade da enzima em 50% a: Número de experimentos réplicas realizados por enzima, exceto onde indicado de outro modo

b: enzima RT HIV-I tipo selvagem em estrutura BHlO

c: enzimas RT derivadas BHlO com mutações de resistência a medicamento NNRTI dirigidas ao sítio

d: enzima RT derivada BHlO com mutações de resistência a medicamento NRTI dirigidas ao sítio.

e: 2 conjuntos de dados usados para cálculos IC50 Como pode ser visto pelos dados, o Composto III e Composto

I retiveram substancial eficácia in vitro contra enzimas RT HIV com substituições nos códons 100, 106, 184 e 134. A única perda significativa de eficácia foi vista para os mutantes nos códons 108, 138 e 188.

Tabela 4 Resistência-múltipla Contra um Painel de RT HIV-I Mutante

Direcionada ao Sídio

Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão Mutação RT N Comp. I Comp.III EFV W.T.b 10 1 . 1 1 LlOOlc 3 0,5 ± 0,2 0,6 ± 0,6 3,3 ± 4,0 V106MC 3 1,2 ±0,5 1,0 ±0,3 13,4 ± 8,2 V1081c 3 4,0 ± 5,3 3,8 ±3,8 3,7 ±2,3 El 381*“ 3 15,5 ±6,8 13,7 ± 1,9 7,6 ± 7,5 M184Vd 4 1,7 ±0,5 0,8 ± 0,3 0,8 ± 0,4 Y188Le 3 6,0 ± 1,7 7,0 ± 5,9 59,6 ±25,8 L1001/K103Ne 4 2,4 ± 1,2 1,8 ±0,8 >101 ±43,2 Faixa Atividade 0,5 - 15,5 0,6-13,7 0,8- 101 Média (μΜ) Resistência-múltipla = IC50 para a RT HIV-I de mutante dividida pela IC50 para a enzima tipo selvagem no correspondente ensaio.

A mudança múltipla média foi calculada como a média das mudanças múltiplas individuais testadas em paralelo.

N = Número de conjuntos replicativos de experimentos realizados, exceto onde indicado por nota ao pé da página.

a: Dois conjuntos de dados usados para cálculo da resistência-múltipla média

No total, os Compostos I e III forneceram mudanças múltiplas variando de 0,5 ± 0,2 a 15,50 ± 6,8.

Efeito nas polimerases alfa, beta e gama de DNA humano A RT HIV, como outras polimerases virais, compartilha homologia estrutural limitada com as polimerases de DNA celular, responsáveis pela síntese e reparo do DNA nuclear e mitocondrial normal. Isto eleva a possibilidade formal de que os inibidores de RT HIV poderiam inibir as polimerases celulares, resultando em toxicidade celular. Em particular, a inibição da polimerase gama tem o potencial para resultar em toxicidade mitocondrial. A capacidade do Composto I e Composto III de inibirem as polimerase do DNA celular foi avaliada usando-se ensaios in vitro padrão (Tabela 5).

Quando testados in vitro, o Composto III, Composto I e EFV não alcançaram uma IC50 com polimerase alfa ou beta de DNA celular humano variando de 100 - > 450 μΜ. Similarmente, dados preliminares (n = 1) mostraram que as IC505S do Composto I e EFV eram >100 μΜ contra atividade da polimerase gama de DNA humano in vitro, enquanto o Composto III tinha uma IC50 de 60,1 μΜ contra esta enzima.

Tabela 5

Atividade invitro contra polimerases alfa, beta e gama dependentes de

DNA celular humano

Composto N Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão DNA Pol Alfaa DNA Pol Betab DNA Pol Gamac I 4/4/1 145,7 ±44,5 >422,2 ± 149,6 118,5 III 4/4/1 159,3 ±84,3 >479,0 ±41,9 60,1 EFV 4/4/1 108,6 ±40,9 314,2 ± 177,2 116,3 Act,D 4/4/1 16,1 ± 11,2 23,0 ± 10,4 16,9 IC50 = concentração eficaz que inibe a atividade enzimática em 50% in vivo

N = número de experimentos replicativos realizados para cada polimerase Act. D = actinomicina D usada como um controle de ensaio positivo a: polimerase alfa de DNA humano b: polimerase beta de DNA humano

c: polimerase gama de DNA humano; dados preliminares de um único experimento Demonstração direta da ligação em RT HIV A determinação estrutural da RT HIV mutante dupla K103N/Y181C (a mesma enzima de cepa BH-IO usada nos ensaios de atividade), co-cristalizada com os Compostos I e III, foi realizada.

NNRTIs são usualmente pequenas e têm uma forte afinidade para uma bolsa hidrofóbica localizada próximo do sítio catalítico de RT. A ligação do inibidor restringe a flexibilidade da envima e interfere com a própria síntese de DNA (Clavel e Hance, HIV drug resistance. N Engl J Med; 350:1023-35 (2004)).

A cristalização da proteína mutante Kl03NArISlC na presença do Composto I foi realizada. A proteína RT K103N/Y181C HIV-I recombinante foi concentrada na presença de um Composto I, em seguida usada em sucessivos experimentos de micro-semeação de cristal, para 20 produzir cristais de proteína de tamanho suficiente para permitir coleta de dados de raio-X. Um monocristal foi usado para difração e modelagem de raio-X. A 3 Â, o esquemático mostra o Composto I ligado à bolsa NNRTI de RT HIV-1.

A estrutura de cristal por raio-X do Composto I, em um co- complexo com enzima mutante dupla HIV-I K103N/Y181C ativa é mostrada na Figura IAe um esquemático é mostrado na Figura 1B. A estrutura mostra

0 Composto I ligando-se à bolsa NNRTI de RT HIV de uma maneira similar ao medicamento aprovado efavirenz (Bacheler, et al., J Virol; 75:4999-5008 (2001)). O anel indol do Composto I pode ser visto em estreita proximidade dos códons 101 e 103 de RT HIV-1.

Atividade celular

Esta seção resume os perfis de atividade antiviral do Composto

1 e Composto III contra HIV-I e HIV-I em sistemas de cultura de célula. Estas atividades foram medidas com uma larga variedade de ensaios e pontos finais, empregando-se múltiplas cepas HIV e tipos de células humanas que

suporta a replicação HIV.

Exemplo 13

Atividade contra cepa BHlO HIV-I

O ensaio baseado em célula HIV padrão empregado é um ensaio de 4 dias em células MT-4 com uma leitora RLISA p24. A atividade 20 anti-HIV-1 in vitro (valor EC50) de IDX12899 foi determinado em um ensaio de susceptibilidade de medicamento (DSA) baseado em célula padrão, essencialmente como descrito em Devine D, Mathews N, Kinchington D (2000), Antiviral Meth e Prot. Human Press Inc., Totowa, NJ. 185-199, O vírus de teste HIV-I é de origem de cepa BHl0, subtipo B. O painel de teste 25 padrão incluiu o vírus tipo selvagem, bem como derivativos mutantes direcionados ao sítio Y181C, K103N e K103N/Y181C. Os dados deste ensaio são resumidos na Tabela 6 abaixo. Contra o vírus BHlO tipo selvagem, as atividades inibitórias do Composto I e Composto III e EFV eram todas rigorosamente similares com EC50S em tomo de I nM. Os valores de controle estavam em boa concordância com os resultados anteriormente publicados (Young et al., 1995, Antimicrob Agents Chemother: 39(12):2602-5; Andries et al., 2004, Antimicrob Agents Chemother; 48(12):4680-6; Janssen et al., 2004, J Med Chem; 48(6): 1901-9; Boone 2006, Curr. Opin Investig Drugs; 7(2): 128-35) e aqueles obtidos utilizando-se o ensaio PhenoScreen™.

Tabela 6

Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão Composto N DNA Pol Alfa a DNA Pol Beta DNA Pol Garna I 4 145,7 ±44,5 422,2 ± 149,6 118,5 II 4 159,3 ±84,3 >479,0 ±41,9 >95,2 ± 9,5 EFV 4 108,5 ±40,9 314,2 ± 177,2 >100 Act, D 4 16,1 ± 11,2 23,0 ± 10,4 11,8 ± 1,9 ddCTP 4 N/A N/A 1,5 ±0,6 IC50 = concentração eficaz que inibe a atividade enzimática em 50% in vitro.

N = Número de experimentos replicativos realizados para cada polimerase.

Act. D = actinomicina D usada como um inibidor de controle de ensaio positivo

ddCTP = trifosfato de dideoxicitidina usado como um inibidor de controle positivo em

ensaio de pol gama DNA

N/A = não aplicável

a: polimerase alfa DNA humano

b: polimerase beta DNA humano

c: polimerase gama DNA humano

d: precipitados visíveis observados

Contra os vírus mutantes, EFV exibiu o esperado perfil antiviral; inibiu eficientemente o crescimento do vírus Yl8IC (EC50 - 2,5 nM), porém foi significativamente menos ativo contra os vírus mutantes K103N ou Y181C/K103N (valores EC50 médios de 41 a 42 nM).

As atividades de diferentes artigos de teste contra os vírus mutantes são evidentes pelos correspondentes valores de resistência- múltipla resumidos na Tabela 7. Todos os 5 compostos apresentaram similarmente atividade diminuída contra o mutante Yl8IC (as mudanças 15 múltiplas média variou de 2,3 a 3,7). Enquanto que EFV mostrou uma mudança múltipla média de 34,3 contra o vírus K103N, os compostos restantes mostraram essencialmente atividade não mutada (0,8 -

1,2 vezes). Tabela 7

Resistência múltipla dos Compostos Contra Vírus BHlO HIV-I

Composto Mudança múltipla W.T. Y181C K103N K103N/Y181C Comp. I 1 3,4± 1,7 0,9 ± 0,4 4,5 ± 2,5 Comp. III 1 3,2± 1,1 1,2 ±0,4 12,7 ±4,3 EFV 1 2,3 ± 1,5 34,3 ± 17,5 36,8 ± 20,5 Mudança-múltipla = EC50 para o mutante HIV dividido pela EC50 para o vírus HIV tipo selvagem

Tabela 8 Atividade contra Vírus BHlO HIV-I em ensaio de célula MT-4 por CPE

Composto Na Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão W.T. Y181CD K103N υ KlOSNArISlCD Comp. I 5 0,0003 ± 0,0001 0,0018 ±0,0003 0,0003 ±0,0001 0,0035 ±0,0015 Comp.III 5 0,0002± 0,0001 0,0015 ±0,0006 0,0001 ±0,0001 0,0066 ±0,0010 EFV 5 0,0006 ±0,0001 0,0016 ±0,0001 0,0410 ±0,0130 0,0530 ±0,0120 EC50 = concentração eficaz que reduz a produção de vírus em 50% em cultura de célula. a = número de experimentos replicativos realizados.

b Vírus BHlO mutantes tipo selvagem e direcionados ao sítio adaptados para laboratório.

Tabela 9 Resistência múltipla

Composto Muc ança múltipla W.T. Y181C K103N K103N/Y181C Comp. I 1 6,5 ± 0,9 1,0 ±0,3 12,7 ±5,0 Comp.III 1 11,9 ±4,7 1,1 ±0,3 55,6 ±21,8 EFV 1 2,7 ± 0,7 66,8 ± 14,8 88,0 ± 20,5 Mudança múltipla = EC50 para o HIV mutante dividida pela EC50 para o vírus HIV tipo selvagem.

Mudança múltipla média foi calculada como a mediadas mudanças-múltiplas individuais testadas em paralelo.

No ensaio CPE, a replicação do vírus BHlO WT foi

potencialmente inibida pelo Composto I, Composto III e EFV como mostrado pelos valores de EC50 médios subnanomolares (faixa 0,1 a 0,7 nM).

Os vírus do painel BHlO Y181C, K103N e KlOSNArISlC foram inibidos eficazmente pelo Composto I, Composto III, com valores EC50 10 médios variando de 0,1 a um máximo de 6,6 nM. Como esperado, EFV inibiu eficientemente o crescimento do vírus Y181C, porém foi muito menos ativo contra os outros vírus mutantes (valores EC50 41 a 53 nM). Os valores de controle estavam em boa concordância com os resultados anteriormente descritos (Young et al., 1995, Antimicrob Agents Chemother: 39(12):2602-5; Andries et al., 2004, Antimicrob Agents Chemother; 48(12):4680-6; Janssen et al, 2004, J Med Chem; 48(6): 1901-9; Boone 2006, Curr. Opin Investig Drugs; 7(2): 128-35).

Em termos de mudanças múltiplas, em comparação dom a 5 cepa WT BH 10, o Composto I, Composto III e EFV mostraram uma faixa múltipla de 2,7 a 11,9 de aumento em relação ao mutante Y181C, enquanto Composto I e Composto III não apresentaram nenhuma mudança (<1,8 vezes) em relação ao mutante K103N. O mutante K103N/Y181C forneceu maior variabilidade e mudanças múltiplas de 12,7 (Composto I) e 55,6 (Composto 10 III). EFV mostrou mudanças múltiplas médias respectivas de 66,8 e 88,0 em relação aos mutantes K103N e K103N/Y181C, respectivamente.

Atividade contra cepa NL4-3 HIV-I

As atividades do Composto I e Composto III foram também determinadas em um ensaio baseado em célula empregando os vírus HIV-I 15 subtipo B com uma estrutura NL4-3. O painel padrão de vírus NL4-3 (w.t., Y181C, KNl 03N e K103N/Y181C) foi ensaiado com os compostos de teste como descrito para o painel de vírus BH-IO acima, usando-se a leitora ELISA. Os resultados destes ensaios são resumidos na Tabela 10.

Os resultados deste estudo são geralmente comparáveis àqueles vistos com os vírus BHl0. Na informação de NL4-3, os compostos são potentes contra o vírus w.t. NL4-3 (EC50S variou de 0,7 a 2,3 nM) e o vírus Yl8IC (EC50S variou de 0,7 a 2,3 nM).

Tabela 10 Atividade contra vírus NL4-3 HIV-I em ensaio de célula MT4

Composto N Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio 3adrão W.T. b Y181C b K103Nb K 03N/Y181Cb Comp. I 5 0,0020 ± 0,0039 ± 0,0014 ± 0,0028 ± 0,0001 0,0016 0,0004 0,0008 Comp. III 5 0,0017 ± 0,0036 ± 0,0015 ± 0,0065 ± EFV 5 0,0003 0,0020 0,0003 0,0023 0,0023 ± 0,0057 ± 0,0612 ± 0,0619 ± 0,0002 0,0019 0,0338 0,0183 EC50 = concentração eficaz que reduz a produção de vírus em 50% em cultura de célula. a = número de experimentos replicativos realizados.

b Vírus BHlO mutantes tipo selvagem e direcionados ao sítio adaptados para laboratório. Tabela 11 Resistência múltipla

Composto Muc ança múltipla W.T. Y181C K103N K103N/Y181C Comp. I 1 6,5 ± 0,9 1,0 ±0,3 12,7 ±5,0 Comp.III 1 11,9 ±4,7 1,1 ±0,3 55,6 ±21,8 EFV 1 2,7 ± 0,7 66,8 ± 14,8 88,0 ± 20,5 Composto Mudança múltipla W.T. Y181C K103N K103N/Y181C Comp. I 1 2,0 ± 0,8 0,7 ± 0,2 1,4 ±0,4 Comp. III 1 2,1 ±1,1 0,9 ± 0,2 3,9 ± 1,7 EFV 1 2,5 ± 0,7 34,6 ± 7,8 27,4 ± 8,6 Mudança múltipla = EC50 para 0 HIV mutante dividida pela 50 para 0 vírus HIV tipo selvagem.

Atividade contra isolados clínicos HIV-I em células MT-2 A eficácia antiviral do Composto I e Composto III foi em seguida medida em relação a dois isolados clínicos HIV-I adaptados- 5 linhagem de célula MT2 em comparação com os medicamentos comparadores. O painel de tese de vírus consistiu de mutantes de isolados clínicos expressando Yl8IC (#3350) e K103N/Y181C (#5054) comparados com um vírus WT sensível. Os dados são resumidos na Tabela 12 abaixo.

Tabela 12 Atividade contra isolados clínicos HIV-I em ensaio de célula MT-2

Composto N Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão W.T. (BH10)a Y181C b K103N/Y181C c Comp. I 5 0,0009 ± 0,0006 0,0014 ±0,0006 0,0020 ± 0,0003 Comp. III 5 0,0011 ±0,0004 0,0015 ±0,0005 0,0057 ± 0,0035 EFV 5 0,0008 ± 0,0002 0,0018 ±0,0003 0,0724 ±0,0217 EC50 = concentração eficaz que reduz a produção de vírus em 50% na cultura de célula. a: Cepa tipo selvagem adaptada em laboratório.

b: Isolado clínico 3350 é resistente a Nevirapina. Este mutante também possui uma mutação Ml 84 V.

Isolado clínico 5054.

Tabela 13 Resistência múltipla

Composto Mudança múltip a W.T. Y181C K103N/Y181C Comp. I 1 2,2 ± 1,3 3,2 ±2,1 Comp. III 1 1,7 ±0,9 6,2 ± 4,3 EFV 1 2,2 ± 0,6 93,1 ±31,4 Mudança-múltipla = EC50 para o mutante HIV dividida pela EC50 para o HIV tipo selvagem. Observe-se que a mudança-múltipla não foi determinada pelos valores EC50 médios da Tabela 12, mas foi primeiro calculado para experimentos individuais. Em seguida a mudança-múltipla média ± SD foi tirada de todos os experimentos.

Atividade contra cepas HIV-I em PBMC humana A atividade antiviral do Composto I e Composto III e compradores foi em seguida medida em relação a um painel de HIV-I em células mononucleocíticas de sangue periférico (PBMC). O painel de vírus 5 total consistiu de 3 mutantes isolados clínicos expressando vírus K103N (#4937 e # 5002) e K103N/Y181C (#5004), juntamente com dois vírus WT sensíveis-NNRTI (BH10 e NL4-3). Os resultados de cinco conjuntos de dados independentes são resumidos na Tabela 14.

Tabela 14 Atividade contra vírus HIV-I em ensaio de célula PBMC

Composto Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão W.T. (BHlO)3 W.T. (NL4-3)a K103N b K103N/Y181C c Comp. I 0,0004 ±0,0001 0,0015 ±0,0007 0,0007 ± 0,0003 0,0027 ±0,0016 Comp. III 0,0004 ±0,0001 0,0015 ±0,0005 0,0009 ± 0,0004 0,0088 ± 0,0044 EFV 0,0009 ± 0,0003 0,0021 ± 0,0007 0,0414 ±0,0369 0,0687 ± 0,0487 EC50 = concentração eficaz que reduz a produção de vírus em 50% na cultura de célula.

Os números representam valores médios ± desvio padrão derivados de 5 experimentos independentes.

a: Cepa de vírus tipo selvagem adaptada em laboratório. b: Resultados usaram isolados clínicos 4937 (n=3) e 5002 (n=2). c: Isolado clínico 5004.

Todos os 5 compostos eram extremamente potentes contra o

vírus BHlO de PBMC, com valores EC50 de 0,4 a 0,9 nM. Os agentes foram tipicamente 2 a 4 vezes menos eficazes contra o vírus NL4-3 das mesmas células. O Composto 1 e Composto III inibiu a replicação dos vírus K103N eficazmente, com somente uma perda de atividade de 1 a 2 vezes (versus o

vírus BH 10), porém foram 2 a 22 vezes menos inibitório para o isolado K103N/Y181C. Ao contrário, EFV exibiu aproximadamente 40 a 70 vezes menos atividade contra os isolados de mutante simples e duplo, respectivamente. Os valores do controle e artigo de teste estavam em boa concordância com os resultados anteriormente publicados (Young et al, 1995,

Antimicrob Agents Chemother: 39(12):2602-5; Andries et al, 2004, Antimicrob Agents Chemother; 48(12):4680-6; Janssen et al, 2004, J Med Chem; 48(6): 1901-9) e com outros valores informados nesta seção. Atividade contra vírus IIIB HIV-I em células MT-4 por ensaio

CPE

Os artigos de teste foram em seguida perfilados em relação a um painel de mutantes cultivados em laboratório IIIB HIV-1, como resumido 5 no texto abaixo. A eficácia antiviral foi determinada via um ensaio CPE com uma leitora MTS para viabilidade celular. Os vírus testados neste ensaio incluíram w.t. IIIB padrão, bem como vírus Y181C e Y181C/K103N selecionados-cultura, porém ο K103N usual foi substituído por um vírus mutante triplo K103R/V179D/P225H, que é descrito mais abaixo. Os dados 10 de eficácia médios são mostrados na Tabela 15.

Tabela 15 Atividade Contra vírus IIIB HIV-I em células MT-4 por CPE

Composto Na Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão W.T.b Y181C b K103RN179D/P225H b K103NN181C b Comp. I 5 0,0010 ±0,0004 0,0028 ± 0,0003 0,0100 ±0,0015 0,0047 ± 0,0009 Comp. III 5 0,0005 ±0,0001 0,0021 ±0,0003 0,0250 ± 0,0060 0,0091 ±0,0019 EFV 5 0,0015 ±0,0006 0,0069 ± 0,0020 >1,0 0,1120 ± 0,0330 a = número de experimentos replicativos realizados

b = Vírus BHlO mutantes tipo selvagem e direcionados ao sítio adaptados em laboratório.

Tabela 16 Resistência-múltipla

Composto Mudança múltipla W.T. Y181C K103R/V179D/P225H K103N/Y181C Comp. I 1 2,9 ± 0,8 11,1 ± 4,1 4,8 ± 1,6 Comp. III 1 4,5 ± 1,0 53,5 ± 12,8 19,5 ±4,3 EFV 1 4,6 ± 0,5 >711,7 ±255,3 74,2± 17,2 Mudança-múltipla = EC50 para o HIV mutante dividida pela EC50 para o vírus HIV tipo selvagem.

A mudança-múltipla média foi calculada como a média das mudanças-múltiplas individuais testadas em paralelo.

O vírus IIIB W.T. foi inibido eficazmente por todos 5 medicamento com valores médios EC5O (em μΜ) variando de 0,0004 ± 0,0002 a 0,0017 ±0,0004.

A replicação do vírus Y181C IIIB selecionado-cultura foi também inibida eficazmente por cada medicamento com valores EC5O médios (em μΜ) variando de 0,0021 ± 0,0003 a 0,0120 ± 0,0026. Estes valores concordam bem com outros resultados apresentados por toda esta seção.

O vírus K103N/Y181C IIIB foi geralmente inibido eficazmente pelo Composto I e Composto III, como implicado pelos valores médios EC50 (em μΜ) variando de 0,0026 ± 0,0004 a 0,0099 ± 0,0016. EFV, entretanto, foi muito menos eficaz como visto pelo valor EC50 médio (em μΜ) de 0,112010,0330.

O vírus IIIB mutante triplo K103R/V179D/P225H mostrou resultados mais variáveis e muito maior resistência a EFV, embora permanecesse relativamente sensível ao Composto I e Composto III. Os valores EC5O médios (em μΜ) foram: 0,0100 ± 0,0015 (Composto I), 0,0250 ± 0,0060 (Composto III) e > 1,0 (EFV). Observe-se que uma enzima RT mutante K103R não é resistente a NNRTI (dados não mostrados).

Em termos de mudanças de multiplicação da susceptibilidade do medicamento para o painel de mutante IIIB, os valores de resistência- multiplicada médios para o Composto I, Composto III e EFV foram geralmente pouco mudados (2,9 ± 0,8 a 7,7 ± 2,8 vezes) em relação ao vírus Yl 81 C. A resistência-multiplicada contra o mutante K103N/Y181C foi mais variável, porém dentro da faixa de mudanças vista nesta seção global: as mudanças multiplicadas foram 4,8 ±1,6 (Composto I) e 19,5 ± 4,3 (Composto III). Os valores de resistência-multiplicada vistos para o mutante K103R/V179D/P225H foram: 11,1 ± 4,1 (Composto I), 53,5 ± 12,8 (Composto III) e > 711,7 ± 255,3 (EFV).

Em resumo, estes testes do ensaio CPE vírus IIIB geralmente confirmam os achados apresentados em outra parte desta seção, com exceção dos vírus mutante triplo Kl 03RrV 179D/P225H. O Composto I era mais ativo contra este mutante (EC50 = 10 nM), seguido pelo Composto ΙΠ com razoável atividade (EC5o = 21 a 25 nM), enquanto EFV era essencialmente inativo (EC5o > 1000 nM). Embora o padrão genotípico mutante K103R/V179D/P225H não seja comumente reconhecido em amostras clínicas, a combinação de K103R/V179D é sabida conferir grandes reduções de susceptibilidade a todos três NNRTIs aprovados (Harrigan et al., 2005, AIDS; 19:549-54; Parkin et al., 2006, Antimicrob Agents Chemother; 50(l):351-4). Atividade contra várias cepas HIV-I em diferentes linhagens de célula humana

A dependência do vírus e célula hospedeira do Composto I, Composto III e medicamentos de controle foi ainda examinada em ensaios de susceptibilidade de medicamento realizados através de 3 diferentes cepas HIV-I tipo selvagem subtipo B e 5 diferentes linhagens de célula. As cepas HIV-I usadas foram BH 10, NL4-3 e IIIB: as linhagens de célula foram células U-937 (monócitos humanos derivados de um linfoma hitiocítico); células MOLT-4 (uma linhagem de célula de leucemia linfoblástica T humana); células H-9 (células T linfoblásticas humanas); e céluls T de leucemia humana MT-2 e MT-4.

Os valores EC50 médios e os desvios padrão dos três experimentos independentes são resumidos na Tabela 17. Sob as condições experimentais deste estudo, o Composto I, Composto ΙΠ e EFV retiveram largamente potências não mutadas através de cada vírus tipo selvagem e combinação de célula hospedeira testados. As atividades vistas variaram de 0,4 a 3,2 nM.

Tabela 17 Atividade Contra Cepas W.T. HIV-I em Hospedeiro Humano

Estabelecido em Linhagens de Célula

Valores médios IC50 (μίν ) ± Desvio Padrão Hospedeiro Virus Comp. I Comp. III EFV U937 IIIB 0,0005 ± 0,0005 ± 0,0015 ± 0,0001 0,0001 0,0008 MOLT- IIIB 0,0007 ± 0,0006 ± 0,0009 ± 4 0,0001 0,0001 0,0002 H9 IIIB 0,0006 ± 0,0005 ± 0,0015 ± 0,0001 0,0002 0,0006 U937 BHlO 0,0006 ± 0,0013 ± 0,0019 ± 0,0002 0,0006 0,0008 MT-2 BHlO 0,0009 ± 0,0011 ± 0,0008 ± 0,0006 0,0004 0,0002 MT-4 BHlO 0,0010 ± 0,0012 ± 0,0012 ± 0,0004 0,0006 0,0008 MT-4 NL4-3 0,0020 ± 0,0017 ± 0,0023 ± 0,0001 0,0003 0,0002 Faixa de Atividade 0,0005 ± 0,0005 ± 0,0008 ± Média (uM) 0,0020 0,0017 0,0023 EC50 = concentração eficaz que reduz a produção de vírus em 50% em cultura de célula. Os números representam valores médios ± desvio padrão derivado de 3 experimentos independentes.

As faixas de atividade média vistas para cada um dos medicamentos através das cepas de vírus e tpos de células são resumidas na última fileira da tabela. O Composto I e Composto III exibiram potente atividade antiviral in vitro (faixa 0,5 a 2 nM) através de três cepas HIV-I e linhagens de células T e monocítica humanas morfologicamente distintas. Todos 5 compostos apresentaram atividade razoavelmente comparáveis.

Atividade contra um painel de diferentes subtipos HIV-I

As atividades dos compostos de teste e controle foram em seguida testadas contra um painel de subtipo que cobre todos os subtipos HIV-I principais ou grupos de organismos (A, B, C, D, Fl, G, H, AE e AG). Este painel era parte de um painel de 64 vírus selecionados da grande biblioteca de isolados clínicos Monogram BioSciences (anteriormente ViroLogics). Cada um dos subtipos do painel foi representado por 2 distintos vírus, que compartilham muitas similaridades de seqüência, porém também algumas diferenças chave e, portanto, poderiam responder diferentemente a um ou mais dos medicamentos incluídos no estudo.

Pelo teste PhenoSense™ dos artigos de teste Composto I, Composto III e do EFV de medicamento de controle, a atividade do Composto I, composto III e EFV em relação a um painel de subtipos (18 vírus) compreendendo 9 diferentes subtipos HIV-I (A, B, C, D, Fl, G, Η, AE, Ag) estava toda dentro de 2-vezes aos valores de atividade do tipo selvagem (dados não mostrados).

Entre os diferentes subtipos, as faixas de potência total foram: Composto I, 0,25 a 3,20 nM; Composto III = 0,2 a 2,14 nM; EFV = 0,40 a 3,10 nM. Não surpreendentemente, a faixa de potência foi um tanto maior através dos subtipos (10 a 11 vezes) do que dentro dos subtipos, porém esta variabilidade foi principalmente a apenas dois isolados de vírus: O isolado HIV-I do segundo subtipo C era, através do quadro, o menos susceptível a todos os medicamentos (valores EC50 0,17 a 0,55 nM). Entretanto, estes vírus também tinham capacidade de replicação reduzida de 42% e 10%, respectivamente, que poderia contribuir para sua evidente hipersensibilidade. Os vírus dos subtipos restantes geralmente mostraram uma divergência < 2,5 5 vezes de potência da cepa de referência CNDO.

Atividade contra ROD HIV-2 nas células H9 A susceptibilidade de ROD HIV tip 2 em células H9 para o Composto I e Composto III foi determinada em relação a zidovudina (AZT) como controle. Os dados médios foram derivados de dois experimentos independentes de atividade antiviral e mostrados na Tabela 18.

O Composto I e Composto III deixaram de suprimir a replicação ROD HIV-2 na mais elevada concentração ensaiada (1,25 μΜ), enquanto o controle AZT exibiu atividade (0,1619 ± 0,0767 μΜ) comparável aos valores publicados (Witvrouw, et al 2004, Antiviral Therapy 9:57-65).

Tabela 18 Atividade contra WT ROD HIV-2 em ensaio de célula H9

Composto Valores EC50 (uM) Composto I >1,25 Composto III >1,25 AZT 0,1619 ±0,0767 EC só = concentração eficaz que reduz a produção de vírus em 50% em cultura de célula.

Os números representam valores médios ± desvio padrão de 2 experimentos independentes.

Atividade contra HIV-I na presença de soro humano e glicoproteína de ácido alfa-1

Os estudos anteriores tipicamente mediram a EC5O de cada 20 medicamento em relação a HIV-I cultivado em cultura de célula, na presença de 10%) de soro bovino fetal (FBS). Para estimar uma EC50 ajustada-soro para os artigos de teste, experimentos adicionais foram realiados na presença de soro 45% humano ou 1 mg/ml de glicoproteína de ácido alfa-1, ou ambos. Os resultados médios dos experimentos de atividade antiviral 3 a 7 são mostrados 25 na Tabela 19. Tabela 19 Atividade W.T. BHlO anti-HIV-1 na preseça de HS ou AAG

Composto N Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão 10% Soro Bovino 10% Soro Bovino 45% Soro Humano 6 45% Soro Humano + Fetal Fetal + AAG a AAG Comp. I 5 0,0011 ±0,0004 0,0029 ± 0,0012 0,0146 ±0,0063 0,0190 ±0,0017 Comp.III 5 0,0012 ± 0,0004 0,0028 ± 0,0004 0,0219 ±0,0117 0,0326 ± 0,0073 EFV 7 0,0016 ±0,0005 0,0050 ± 0,0023 0,0115 ±0,0039 0,0116 ±0,0074 EC50 = concentração eficaz que reduz a produção de vírus e 50% na cultura de célula. a glicoproteína ácida a-1 a 1 mg/ml.

b Soro Humano - AB+ não tem anticorpos contra os antígenos tipo sanguínero AeB.

Tabela 20 Múltipla Resistência

Composto N Valores médios IC5o (μΜ) ± Desvio Padrão 10% Soro Bovino 10% Soro Bovino 45% Soro Humano 45% Soro Humano Fetal Fetal + AAG a b + AAG Comp. I 5 1 2,7 ± 0,7 15,9 ± 11,1 19,5 ±7,6 Comp.III 5 1 2,1 ±0,5 17,0 ±6,3 24,8 ± 3,8 EFV 7 1 2,4 ± 0,8 8,4 ± 3,2 5,4 ± 3,2 Mudança múltipla = EC5O obtida com soro bovino fetal + AAG ou soro humano ± AAG dividido por EC50 obtida com somente soro bovino fetal. Note-se que a mudança-múltipla não foi determinada pelos valores EC50 médios da Tabela 19, mas foi primeiro calculado para experimentos individuais. Em seguida a mudança múltipla média ± desvio padrão foi retirada de vários experimentos. a glicoproteína de ácido a-1 a 1 mg/ml.

Os 5 medicamentos inibiram a replicação do vírus WT na presença de 10% FBS com as potências antecipadas, com valores EC50 5 variando de 1,0 a 1,6 nM. A adição de 1 mg/ml de AAG geralmente diminuía a potência do medicamento em 2 a 3 vezes para cada medicamento, mudando os valores EC5O médios para a faixa de 2 a 5 nM.

As potências dos 5 medicamentos foram reduzidas a uma extensão maior em 45% do soro humano (HS), resultando em valores EC50 10 médios de 11,5 a 21,9 nM e mudanças múltiplas de 8,4 a 17,0 vezes. A presença de 45% HS + AAG nos experimentos de cultura forneceram resultados mais variáveis e valores EC5O médios (em nM) de 19,0 (Composto I), 32,6 (Composto III e 11,6 (EFV). Os valores vistos para os controles estavam em boa concordância com os resultados publicados (Young et al., 15 1995, Antimicrob. Agents Chemother: 39(12):2602-5; Andries et al., 2004, Antimicrob. Agents Chemother; 48(12):4680-6; Janssen et al, 2004, J. Med. Chem.; 48(6): 1901-9; Boone 2006, Curr. Opin. Investig Drugs; 7(2): 128- 35). As múltiplas mudanças médias correspondentes foram 19,5 (Composto I),24,8 (Composto III) e 5,4 (EFV). Em resumo, nenhuma interação significativa de ligação de proteína foi observada com apenas AAG (mudança < 3 vezes) para o Composto I e Composto III. Uma elevação moderada de EC5O (mudança de 26 a 25 vezes) foi estimada em HS ou HS + AAG. No total, os dados sugerem que a ligação da proteína é um pouco mais elevada para o Composto I e Composto III do que para EFV.

Exemplo 14

Citotoxicidade in vitro

Ensaios convencionais baseados em célula, empregando células proliferantes, foram usados para avaliar a citotoxicidade do Composto

I e Composto III. Estes estudos de citotoxicidade de 3 a 12 dias focalizaram- se nas linhagens de células humanas, que são (i) susceptíveis de infecção com vírus HIV-I in vitro (p. ex., monócitos de sangue primários; células T de leucemia MT-2 e MT-4) ou (ii) comumente usadas para avaliar a citotoxicidade in vitro induzida por medicamento (p. ex., HepG2, HuH7 ou HeLa) (Divi RL, Haverkos KJ, Humsi JA et al. (2006) Morphological and molecular course of mitochondrial pathology in cultured human cells exposed long-term to zidovudina. Environ Mol Mutagen; 47). A viabilidade da célula foi medida por tingimento MTT ou MTS padrão.

Efeito citotóxico em células PBMC

A citotoxicidade in vitro dos artigos de teste foi avaliada em 4 experimentos independentes em células mononucleares sanguíneas primárias (PBMC) humana estimuladas. As PBMC foram expostas ao Composto I e Composto IIIjuntamente com EFV de medicamento de controle por 3 dias em concentrações variando de 0,005 μΜ a 100 μΜ. A viabilidade celular foi determinada via tingimento MTT. Os resultados são apresentados como as concentrações de medicamento eficazes médias que reduziram a viabilidade das células em 50% (CC5o). Os valores CC50 médios (em μΜ) determinados para os artigos de teste em PBMC foram:

Composto 1 = 52,6 ± 15,2 e Composto III = 66,9 ± 19,6. Para

0 valor CC50 médio do artigo de controle (em μΜ) foi determinado: EFV = 70,9 ± 7,6.

Citotoxicidade celular em células hospedeiras humana HIV-I Os efeitos citopáticos in vitro dos artigos de teste o Composto

1 e Composto III e EFV de medicamento de controle foram em seguida testados nas seguintes seis linhagens de célula hospedeira humana

susceptíveis a HIV-I: células U-937 (monócitos humanos derivados de um linfoma histiocítico); células MOLT-4 (uma linhagem de célula da leucemia linfoblástica T humana); células H9 (células T linfoblásticas humanas); células IM9 (uma linhagem de célula linfoblástica B humana); e células T da leucemia humana MT-2 e MT-4.

Em seguida à exposição do medicamento por 4 dias, a

viabilidade da célula foi medida por tingimento MTS e os valores CC50 foram determinados. As concentrações de medicamento variaram de 0,005 μΜ a 100 μΜ. Os resultados de 3 experimentos independentes (a menos que de outro modo indicado) são resumidos na Tabela 21.

Tabela 21

Citotoxicidade celular em Linhagens de Células Hospedeiras Humanas HIV-I

Composto Valores médios IC50 ( μΜ) ± Desvio Padrão Faixa CC50 U937 d MOLT-4 e H9‘ 1M9 8 MT-2 h MT-4 h I 26,5 ± 0,5 16,6 ±0,4 20,0 ± 1,6 32,9 ± 2,6 23,5 ± 1,0 18,6 ±3,1 16,6-32,9 III 24,6 ± 1,9 14,8 ± 1,0 31,3 ±5,2 50,0 ± 17,4 25,9 ±2,1 27,3 ± 12,9 14,8 - 50,0 EFV 23,2 ± 1,0 41,7 ±3,4 50,0 ± 9,0 51,0± 1,3 24,6 ± 4,5 44,1 ± 18,2 23,2-51,0 a CC50 = concentração eficaz que reduz a viabilidade celular em 50% b Os números representam os valores médios ± desvio padrão derivados de 3 experimentos independentes, a menos que de outro modo citado. c Os valores foram derivados de 2 experimentos independentes

d Linfoma histiocítico de monócito humano; revestido em placa a 5 x IO3 células por poço. e Leucemia linfoblástica T humana; revestido a 2x IO4 células por poço f Linfoma de célula T linfoblástica humana; revestido em placa a 4x IO4 células por poço s Linhagem de célula linfoblástóide B humana; revestido em placa 2x104 células por poço h Leucemia de célula T humana; revestido em placa a 1,25x104 (MT-2) e 2,5x104 (MT-4) células por poço Os artigos de teste Composto I e Composto III e os compostos de controle exibiram cototoxicidade in vitro mensurável nas 6 linhagens de células hospedeiras susceptíveis HIV-I humanas. Dependendo do tipo de célula, os valores CC5o médios para o Composto I variou de 16,6 a 32,9 μΜ versus 14,8 a 50,0 μΜ para o Composto III (Tabela 21), similar às faixas CC50 médias determinadas para EFV (23,2 a 51,0 μΜ).

Entre as 6 linhagens de célula, a linhagem de célula MOLT-4 foi a mais sensível à citotoxicidade para o Composto I e Composto III. EFV mostrou a maior citotoxicidade em células U937 e MT-2.

Exemplo 15

índice de Seletividade do Composto I e Composto III contra HTV-I

Os dados precedentes permite-nos calcular os valores do índice de seletividade (SI) baseados na relação de CC50 para EC5O em células MT-4 (o ensaio padrão usado neste trabalho).

A CC5o do Composto I das células T MT-4 foi de 27 μΜ versos uma EC5O de 1,2 nM, fornecendo um SI > 22.000. A CC50 do Composto III foi de 18,6 μΜ versus uma EC5O de 1,0 nM, para um SI de > 18.000. Similarmente, o índice de seletividade do medicamento de controle foi estimado ser: EFV = 37000. Estes valores estão em boa concordância com os valores SI anteriormente relatados (Young et al, 1995, Antimicrob Agents Chemother: 39(12):2602-5; Andries et al., 2004, Antimicrob Agents Chemother; 48(12):4680-6; Janssen et al., 2004, J Med Chem; 48(6): 1901-9; Boone 2006, Curr. Opin Investig Drugs; 7(2): 128-35).

Empregando-se dados de citotoxicidade e atividade derivados em PBMC, os valores SI de >100.000 puderam ser computados para o Composto I e Composto III.

Citotoxicidade celular de mais longo termo e outros tipos de

célula humana

Finalmente, a citotoxicidade in vitro dos artigos de teste foi determinada em outras linhagens de célula humana com relevância toxicológica; células de fígado HuH7 e HepG2 (Knowles et al, 1980, Science; 209(25):497-9) e células epiteliais HeLa (Gey et al, 1952, Cancer Research; 12:264-5) via tingimento de viabilidade MTS. As células foram repetidamente tratadas com uma faixa de 5 concentrações de medicamento (0,005 a 100 μΜ) por 9 (HeLa) ou 12 dias (HuH7, HepG2). Os valores CC50 médios e os desvios padrão derivados de 3 a 5 experimentos independentes são resumidos na Tabela 22.

Tabela 22

Citotoxicidade celular em Linhagens de Célula Humana Selecionadas

Composto Valores médios IC50 (μΜ) ± Desvio Padrão HeLa % α HuH7 b e HepG2 c e I 27,88 ± 1,14 23,49 ± 1,61 25,69 ±3,26 III 29,86 ± 2,09 31,46 ±3,37 23,50 ± 1,51 EFV 48,57 ±2,50 75,72 ±12,43 80,56 ± 12,12 CC50 = concentração eficaz que reduz a viabilidade celular derivada de 3 a 5 experimentos indepententes, como indicado:a = 3-4; b = 4-5;c = 3-5.

d Células Hela foram revestidas em placa a 1 x IO3 células/poço e incubadas na presença de medicamento por 9 dias. O medicamento e meios foram substituídos a cada 3 dias. e Células HuH7 e HepG2 foram revestidas em placa a 1 x 10 e 7 x 10 células/poço respectivamente e incubadas por 12 dias na presença de medicamento. Medicamento e meios foram substituídos a cada 3 dias.

As tendências observadas neste teste de citotoxicidade de mais

longo termo espelham aquelas vistas nos estudos precedentes. Em geral, o Composto I e Composto III forneceram valores CC50 similares nas 3 linhagens de célula, variando de 23 a 32 μΜ. EFV foi novamente o menos citotóxico dos compostos (faixa de CC50 48 - 81 μΜ).

Exemplo 16

Dados Comparativos In Vitro

Os Compostos I e III, os correspondentes enanciômeros (isto é, compostos II e IV) e os correspondentes racematos foram avaliados nos ensaios baseados em célula HIV BHlO padrão descritos

acima. O painel de teste padrão incluiu vírus tipo selvagem, bem como Y181C, K103N e derivativos mutantes direcionados ao sítio K103N/Y181C. A tabela abaixo fomece dados para o composto I, composto II e seu correspondente racemato. Contra o vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Y181C, K103N e K103N/Y181C o racemato tinha EC50S de 2,4 a

6,2 nM. Contra o vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Y181C, K103N e K103N/Y181C o composto I tinha EC5os de 0,2 6 3,5 nM. Contra o vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Yl8IC e K103N o composto II tinha EC50S de 129 a 920 nM.

Atividade contra vírus BHlO HIV-I em ensaio de célula

BHlO K103N Y181C Y181C/K103N Comp. n n n n 1 0,001 ±0,0005 8 0,0006 ± 0,0002 3 0,0026 ±0,0011 3 0,0035 ±0,0014 3 1 0,0007 ± 0 1 0,0009 ± 0 1 0,0024 ± 0 1 0,003 ± 0 1 II 0,1917 ± 0 1 0,9201 ±0 1 0,3637 ±0 1 rac 0,0025 ± 0,0004 3 0,0024 ± 0,0007 3 0,0032 ± 0,0006 3 0,0062 ± 0,0036 3 EC50 = concentração eficaz que reduz a produção de vírus em 50% em cultura de célula. aN = número de experimentos replicativos realizados.

b Vírus BHlO mutantes tipo selvagem e direcionados ao sítio adaptados em Laboratório.

A tabela abaixo fomece dados para o composto III, composto

IV e seu correspondente racemato. Contra vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Y181C, K103n E K103N/Y181C, o racemato tinha EC50S de 1,6 a 24,4 nM. Contra o vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Y181C, K103N e K103N/Y181C o composto III tinha EC50S de 0,6 a 23,1 nM. Contra o vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Y181C, K103N e 15 K103N/Y181C, o composto IV tinha EC50S de 89,2 a 824 nM.

Atividade contra vírus BHlO HIV-I em ensaio de célula

BHlO K103N Y181C Y181C/K103N Comp. n n n n III 0,001 ±0,0005 10 0,0013 ±0,0005 5 0,0028 ± 0,0005 5 0,0114 ±0,0023 5 III 0,0018 ±0,0003 3 0,0016 ±0,0005 3 0,0040 ± 0,0005 3 0,0231 ±0,0121 3 III 0,0006 ± 0 1 0,0006 ± 0 1 0,0029 ± 0 1 0,0045 ± 0 1 IV 0,1902 ±0,0038 2 0,3776 ±0,2047 2 0,8241 ±0,3636 2 0 IV 0,0892 ±0,1068 2 0,1053 ±0,0579 2 0,2286 ± 0,0605 2 0,5167 ±0 1 IV 0,0976 ± 0 1 0,3123 ±0 1 0,331 ±0 1 0 rac 0,031 ± 0,0002 2 0,0031 ±0,0005 2 0,0049 ±0,0011 2 0,0167 ±0,0088 2 rac 0,0017 ±0 1 0,0017 ±0 1 0,0016 ±0 1 0,0042 ± 0 1 rac 0,0025 ± 0,0007 3 0,0025 ±0,0013 3 0,005 ± 0,0037 3 0,0244 ±0,0188 3 EC 50 = concentração eficaz que reduz a produção de vírus em 50% em cultura de célula. a N = número de experimentos replicativos realizados.

Como mostrado nas tabelas acima, nestes ensaios a maior parte se não toda a atividade da mistura racêmica situa-se nos enanciômeros S, compostos I e III.

Ensaio de Proteção de Célula

Os compostos I e III, os correspondentes enanciômeros (isto é, compostos II e IV) e os correspondentes racematos foram avaliados em um ensaio de proteção de célula. O painel de teste padrão incluiu vírus tipo selvagem, bem como derivativos de mutantes direcionados ao sítio Y181C, K103N e K103N/Y181C.

Os compostos de teste foram dissolvidos em DMSO a 15 mM e então diluídos em meio de cultura RPMI 1640 + 2 g/L NaHCO3 + 1% solução de canamicina IOOx (10000 μg/mL) + 10% FCS ± 1,2% DMSO.

Células MT-4 (Fonte: NIH Catálogo # 120) foram semeadas em placas de cultura de célula de 96 poços (1 x IO4 células por poço em 50 μΐ).

Diluições seriais de 2 vezes dos compostos de teste em 50 μΐ (0,29 μΜ a 75 μΜ) foram adicionadas às células em meio de crescimento completo (RPMI, 10% Soro de Bovino Fetal, Penicilina, Estreptomicina) e as células foram infectadas com uma alíquota de 20 μΐ de uma suspensão HIV (vírus tipo selvagem e resistentes BHlO cepa HIV-I Y181C, K103N e Y181C/K103N) em uma diluição que fomece 90% de efeito citopático. A concentração de DMSO final no ensaio foi de 0,5% em 120 μΐ. As culturas de célula foram então incubadas a 37 °C/5% CO2 por 4 dias. Em seguida, Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) foi usado para medir a viabilidade celular, o One Solution Reagent foi adicionado diretamente em poços de cultura (20 μΐ/poço), incubado por 5 horas e a absorvência foi registrada a 492 nm usando-se o Sunrise Tecan Spectrophotometer.

Os valores EC50 foram determinados pela inibição percentual versus dados de concentração, usando-se uma análise de regressão não-linear sigmoidal baseada em quatro parâmetros com software Tecan Magellan.

A tabela abaixo fomece dados para o composto I, composto I e seu correspondente racemato. Contra o vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Y181C, K103N e K103N/Y181C, o racemato tinha EC50S de 1,5 a 5 7,0 nM. Contra vírus BHl0 tipo selvagem e os vírus mutantes Yl 81C, Kl03N e K103N/Y181C, o composto I tinha EC50S de 0,26 a 3,5 nM. Contra o vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Y181C e K103N, o composto III tinha EC50S de 62 a acima de de 1000 nM.

Atividade contra círus BHlO HIV-I em Ensaio de Proteção Celular

BHlO K103N Y181C Y181C/K103N

Comp.

I 0,00028 ± 0,000072 0,00026 ±0,000057 0,0018 ± 0,00029 0,0035 ± 0,0015

II 0,062 ±0,019 0,277 ±0,099 0,424 ±0,21 >1

rac 0,0015 ±0,0007 0,001 ±0 0,0045 ± 0,0007 0,007 ±0,0028 EC50 = concentração de composto que obteve 50% de redução do efeito citopático do vírus.

A tabela abaixo fomece dados para o composto II e seu

correspondente racemato. Contra o vírus BHlO tipo selvagem e os vírus mutantes Y181C, K103N e K103N/Y181C, o racemato tinha EC50S de 0,2 a 9,0 nM. Contra o vírus tipo selvagem BHlO e os vírus mutantes Y181C, K103N e K103N/Y181C, o composto III tinha EC50S de 0,14 a 6,6 nM.

Atividade contra vírus BHlO HIV-I em Ensaio de Proteção Celular

BHlO K103N Y181C Y181C/K103N

Comp.

III 0,00015 ±0,00011 0,00014 ±0,000052 0,0015 ± 0,0006 0,0066 ± 0,00097

IVrac 0,0002 ±0,0001_0,0003 ± 0_0,0023 ± 0,0005 0,009 ± 0,0048

EC50 = concentração de composto que obteve 50% de redução de efeito citopático do vírus.

Ligação, Inibição e Indução do Citocromo P450 Os compostos I e III, os correspondentes enanciômeros (isto é, compostos II e IV) e os correspondentes racematos foram avaliados em ensaios para ligação de citocromo P450.

Estudos de inibição foram conduzidos para avaliar o potencial

dos compostos I e III para inibir a atividade catalítica das isoenzimas CYP450 de proteínas microssomais de fígado humano. A taxa de formação de metabólito dos substratos de sonda específicos de CYP450 por microssomas de fígado humano foi determinada na presença e ausência do Composto I ou III. A inibição direta bem como inibição dependente do tempo, também referida como inibição baseada em mecanismo ou MBI, foi também avaliada.

Estudos iniciais determinaram valores IC5o com subsequente determinação de kj ou Icinact e kj para MBI, quando inibição significativa (IC5o <10 μΜ) foi observada. Além disso, o tipo de inibição foi também avaliado.

Os compostos foram ensaiados usando-se proteínas microssomais humanas recombinantes com substratos fluorométricos. O sinal foi medido com uma leitora de placa de Fusão, utilizando-se apropriado

comprimento de onda de excitação e emissão ajustado para detectar 0 metabólito específico: Enzimas Substrato Excitação Emissão (largura de faixa) (largura de faixa) CYP1A2 CEC 400 nm (20 nm) 535 nm (25 nm) CYP2B6 EFC 400 nm (20 nm) 535 nm (25 nm) CYP2D6 AMMC 400 nm (20 nm) 460 nm (35 nm) CYP3A4 BFC 400 nm (20 nm) 535 nm (25 nm) A inibição de CYP2C9 foi realizada incubando-se um

substrato CYP450 lumnogênico Luciferin-H com CYP2C9 e um sistema de regeneração NADPH. A luminescência medida usando-se uma leitora de placa Fusion.

Inibição de isozima de citocroma P450 recombinante in vitro

CYP450 Mais elevada IC50 (gM) IC50 IC50 IC50 (μΜ) IC50 IC50 isoenzima concentração rac (I+II) (μΜ) ((μΜ)) rac (μΜ) (μΜ) testada (IM) I II (III+IV) III IV CYP1A2 20 NA 17,5% NA NA 17,6 ± NA 2,06 CYP2B6 20 NA 21,6% NA NA 22,9% NA CYP2C9 10 NA 8,40 ± NA 5,99 6,85 ± 3,38 0,67 0,48 CYP2D6 10 NA 11,2% NA 16-23% 15,2% 29,1% CYP3A4 10 1,608 1,46 ± 3,21 2,269 2,86 ± 2,962 0,39 0,78 Estudos de inibição IC50 = 50% concentração inibitória (μΜ) ou percentagem de inibição na mais elevada concentração testada

Valores representam a média ± SD dos três experimentos independentes NA não disponível Estudos cinéticos de enzimátieos de inibição de isozima de eitoeromo P450 foram conduzidos usando-se microssomos de fígado humano. A taxa de formação de metabólito dos substratos de sonda específicos de CYP450 por microssomos de fígado humano reunidos foi determinada na presença e ausência de inibidores padrão ou composto I ou III (0, 0,1, 0,1, 1, e 50 μΜ). A inibição dependente do tempo foi também investigada avaliando-se o efeito do composto I ou III pré-incubação (30 minutos) na inibição das enzimas CYP450 (em concentrações como citadas acima) com microssomos. Os valores IC50 para inibição tanto direta como dependente do tempo foram determinados quando a inibição alcançou níveis maiores do que 50%. Além disso, a inibição direta de CYP2C8 e CYP2C9 pelo composto I ou

III (em concentrações de 0, 1, 3, 6, 9 e 12 μΜ) foi examinada determinando- se o valor Ki e o tipo de inibição.

Além dos valores Ki para inibição direta de CYP2C8 e CYP2C9, valores Kinact e K1 para inibição dependente do tempo de CYP3A4 (testosterona e midazolam) pelo Composto I ou Composto III foram determinados. O composto I e composto III a 0, 0,0125, 0,125, 1,25, 12,5 e

62,5 μΜ para C1P3A4 (midazolam e testosterona) foram preincubados com microssomos de fígado humano e NADPH por 0, 1, 5, 10, 20, e 30 minutos a 37 0C. Incubações de controle incluíram artigo de tste em uma única concentração preincubado sem NADPH e um inibidor de controle positivo. A formação do metabólito foi monitorada por métodos LC-MS/MS validados e a atividade percentual remanescente, além dos valores kinac e ki, foi determinada.

O composto I exibiu inibição limitada (IC50 > 20 μΜ) de CYP1A2, CYP2B6, CYP2D6 e CYP2C19 (IC50 = 10,2 μΜ) e inibição significativa (IC5o < 10 μΜ) de CYP2C8, CYP2C9 e CYP3A4. O composto I exibiu inibição competitiva de CYP2C8 e CYP2C9 com valores kj de 1,1 e 1,4 μΜ, respectivamente. Em razão de CYP3A4 ter múltiplos sítios de ligação, a inibição é tipicamente avaliada com dois substratos de sonda estruturalmente não relacionados, testosterona e midazolam. O composto I exibiu significativa inibição baseada em mecanismo de CYP3A4-testosterona e CYP3A4-midazolam com valores Ici de 0,14 e 0,18 μΜ, respectivamente.

5 Inibição de isozima P450 de eitoeromo microssomal humano in vitro com o

Composto I

CYP450 isoenzima Ki (μΜ) Kínact (min ) Tipo de inibição CYP1A2 (Fenacetina)3 NDb CYP2B6 (Bupropiona) ND CYP2C8 (Paclitaxel) 1,1 Competitivo CYP2C9 (Diclofenaco) 1,4 Competitivo CYP2C19 (S-mefenitoína) ND CYP2D6 (Dextrometorfano) ND CYP3A4 (Midazolam) 0,36 0,072 Inibição Baseada em mecanismo CYP3A4 (Testosterona) 0,14 0,033 Inibição Baseada em mecanismo a = substrato de sonda específico de CYP450

b = não determinado. Valores kj determinados para valores IC50 <10 μΜ c = constante de taxa máxima para inativação. Relevante somente para inibição dependente do tempo.

O Composto III exibiu inibição ilimitada (IC50 >10 μΜ) de CYP1A2, CYP2B6, CYP2D6, inibição marginal de CYP2C19 (IC50 = 10,2 μηι) e inibição significativa (IC50 < 10 μΜΟ de CYP2C8, CYP2C9 e 10 CYP3A4. O Composto III exibiu inibição competitiva de CYP2C8 e CYP2C9 com valores Ici de 0,66 e 0,93 μΜ, respectivamente. Em razão de CYP3A4 ter múltiplos sítios de ligação, a inibição é tipicamente avaliada com dois substratos de sonda estruturalmente não relacionados, testosterona e midazolam. O Composto III exibiu significativa inibição baseada em 15 mecanismo de CYP3A4-testosterona e CYP3A4-midazolam com valores k, de 0,21 e 0,06 μΜ, respectivamente. Inibição de isozima do eitoeromo P450 microssomal humano in vitro com

Composto III

CYP450 isoenzima K1 (μΜ) Kinact (min ) Tipo de inibição CYP1A2 (Fenacetina)3 NDb CYP2B6 (Bupropiona) ND CYP2C8 (Paclitaxel) 0,66 Competitivo CYP2C9 (Diclofenaco) 0,93 Competitivo CYP2C19 (S-mefenitoína) ND CYP2D6 (Dextrometorfano) ND CYP3A4 (Midazolam) 0,06 0,06 Inibição Baseada em mecanismo CYP3A4 (Testosterona) 0,21 0,05 Inibição Baseada em mecanismo a = Substrato de sonda específico CYP450

b = não determinado. Valores IC50 foram >10 μΜ. Valores kj somente determinados para valores IC50 < 10 μΜ

c = máxima constante de taxa para inativação. Relevante somente para inibição dependente do tempo

O potencial para indução in vitro de CYP3A4 foi avaliada em células DPX2. A linhagem de célula DPX2 é um derivativo de uma linhagem 5 de célula humana de carcinoma hepatocelular (HepG2) transformada com o pregnane x receptor humano (PXR) e um vetor de gene repórter contendo a região intensificadora de CYP3A4. O potencial para indução in vitro de CYP1A2 foi avaliado em células CYP1A2-DRE. A linhagem de célula CYP1A2-DRE é uma célula HepG2 estavelmente tmsformada com elementos 10 de resposta de dioxina (DRE) e gene repórter contendo elementos promotores de CYP1A2. A extensão da indução de CYP3A4 foi determinada comparando-se a ativação de PXR obtida com o artigo de teste com aquela obtida com rifampicina (indutor potente), mifepristona (indutor moderado) e adrostanol (indutor fraco). A extensão da indução de 15 CYP1A2 foi determinada comparando-se a ativação do receptor aril hidrocarcon (AhR) obtido com o artigo de teste com aquela obtida com TCDD (indutor potente), omeprazol (indutor moderado) e 2- acetilaminofluoreno (indutor fraco). Composto DPX2 (CYP3A4) Indução CYP1A2-DRE (CYP1A2) rac (1 + 11) NA NA I Moderado (n"2) Não indutor (n=l) II NA NA rac (III + IV) Moderado (n=l) NA III Moderado (n~2) Não indutor (n=l) IV Moderado (n=l) NA NA = não disponível

Como mostrado na tabela acima, os compostos I e III são indutores moderados de CYP3A4 e CYP1A2.

Ligação de Proteína de Plasma In vitro

A ligação de proteína de plasma in vitro do composto I e 5 composto III em plasma de rato, cão, macaco e humano foi determinada por diálise de equilíbrio. A ligação de proteína foi avaliada por diálise de equilíbrio utilizando-se plasma de rato, cão, macaco e humano. As amostras foram ensaiadas por HPLC com detecção de LC-MS/MS. A ligação de proteína de plasma era elevada (> 99%) para todas as espécies e para ambos 10 os compostos.

Ligação de proteína do Composto I e Composto III

Ligação Proteína Plasma Percentual Espécie Composto I Composto ΠΙ Ratos 99,1 99,4 Cães 99.0 99.4 Macacos 99,9 99,9 Humanos 99,8 99,9 EXEMPLO 17 INIBIÇÃO DE CITOCROMO P450 IN VIVO Effeitos do Composto I e Composto III em combinação com

outros agentes

Estudos de interação de medicamento-medicamento in vitro envolvendo o Composto I e Composto III e compostos das classes NRTI e PI ativos contra HIV foram realizados.

O efeito in vitro de cada medicamento antirretroviral sobre a atividade antiviral do artigo de teste foi testado em triplicata em infecção de

15

20 vírus HIV-I tipo selvagem de células T humanas MT-4, empregando-se um ensaio de susceptibilidade de medicamento padrão (DSA), realizao em soro 45% humano (HS), para prover uma melhor estimativa das interações que ocorreriam sob condições de ligação de proteína encontradas in vivo. O Composto I ou Composto III foram titulados sozinhos ou em combinação com cada NRTI ou PI.

O impacto de cada NRTI ou PI sobre a eficácia do Composto I ou Composto III foi testado em duas diferentes concentrações de medicamento, uma concentração “baixa” (Ix) e uma “elevada” (5x); a concentração elevda usada para cada composto foi determinada de experimentos piloto conduzidos para assegurar que valores de inibição mensuráveis pudessem ainda ser obtidos na presença de 45% HS.

Estes estudos de interação de medicamento-medicamento invitro foram potenciados principalmente para determinar o potencial das interações negativas entre as diferentes classes de medicamento HIV, em vez de examinar o potencial de sinergia entre os diferentes agentes.

Em resumo, nenhum dos sete medicamentos NRTI HIV ou dos seis medicamentos PI HIV testados exibiram uma interação negativa ou antagonística mensurável com o Composto I ou Composto III contra HIV nestes experimentos in vitro.

Exemplo 18

Metabolismo

O metabolismo dos compostos I e III foi avaliado em células de rato, cão, macaco e humanas e a inibição do eitoeromo P450 foi avaliado em microssomos de fígado humano.

Métodos

Hepatócitos frescos foram revestidos em placas revestidas com colágeno e expostos aos compostos de teste a 1 μΜ por até 2 horas. O meio de cultura de tecido foi avaliado quanto à depleção do composto por detecção LC/MS. Os valores da Tabela 23 representam experimentos independentes de 5 a 7 doadores.

A inibição da atividade CYP450 foi determinada monitorando- se mudanças no metabolismo dos substratos específicos de CYP450 por 5 microssomos de fígado humano com variáveis concentrações do composto I ou III. O substrato de sonda para 2C8 foi paclitaxel, o substrato de sonda par 2C9 foi diclofenaco e para substratos de sonda 3A4 foram midazolam e testosterona. Dois substratos são usados para avaliar a interações 3A4 devido a múltiplos sítios de ligação na enzima.

Resultados

Tabela 23 Inibição da Isozima CYP450 Espécies Composto I Composto III Rato 33 ±26 17 ±15 Cão 28 ±14 21 ±10 Macaco 63 ±40 52 ± 24 _Humano_215 ± 48_125 ± 55_

Como mostrado na tabela acima, tanto o composto I e composto III exibiram limitado metabolismo in vitro em hepatócitos humanos.

Inibição da Isozima CYP450

Composto I Composto III 2C8 1,10 0,66 2C9 1,45 0,93 3A4 _0,36_0,06

Como mostrado na tabela acima, tanto composto I como

composto III mostraram inibição competitiva de CYP2C8 e CYP2C9. Além disso, tanto o composto I como o composto III apresentaram inibição baseada em mecanismo de CYP3A4. A inibição baseada em mecanismo é caracterizada por perda dependente do tempo de ativividade enzimática, 20 associada com ligação covalente entre a enzima e o intermediário metabólico reativo. A inibição baseada em mecanismo é também associada com indução de CYP450 visto que nova enzima é requerida para restaurar a atividade enzimática. A inibição de CYP 2D6, 1A2, 2B6 e 2C19 não foi observada. Metabolismo do Composto I e III versus Raeematos Correspondentes

O metabolismo in vitro foi avaliado usando-se microssomos de fígado para todas as espécies. Os compostos foram incubados a 1 μΜ com 5 microssomos de fígado por até uma hora. As meias-vidas relatadas maiores do que o tempo de incubação total são valores extrapolados. Os extratos foram ensaiados quanto a desaparecimento de composto precursor por detecção de LC-MS/MS.

Os dados representam um experimento independente

conduzido.

Meia-vida in vitro de Compostos I & III e Racematos de Microssomos de

Fígado

Espécies_1_rac (1 + II)_Ul_rac (III + IV)

_Meia-Vida (min)_

Rato 100 146 88,8 105 Cão 19,3 287 13,2 257 Macaco 15,4 18,4 12,6 16,3 Humano_120,6_Π5_154_91,2

Como mostrado na tabela acima, os compostos enantioméricos puros I e III tiveram meias-vidas significativamente mais curtas em microssomos de fígado, quando comparadas com seus correspondentes enanciômeros.

Exemplo 19

Farmacocinética In Vivo

A farmacocinética dos compostos I e III foi avaliada em ratos (composto III somente), cães e macacos.

Métodos

Todos os animais receberam uma única dose ora ou intravenosa do composto em polietileno glicol 400 (PEG400) ou uma mistura de 10% etanol (EtOH), 10% de dimetilacetamina (DMA) e 80% de PEG400 no nível de dose indicado. Os dados de concentração de plasma foram adquiridos usando-se métodos LC-MS/MS sensíveis e específicos. Os dados farmacocinéticos do estudo de toxicidade incluíram aspectos de diferenças de sexo, variabilidade e exposição.

As amostras de sangue (1,5 - 2,5 ml) foram coletadas em tubos heparinizados a 0 (predose), 5 (IV somente), 10, 20, 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 12 (somente PO) e 24 h após dosagem. O plasma foi separado e armazenado a -70 0C até análise.

Estudos PK de concentrações de composto I e composto III não rotulados dentro das amostras de plasma e excreções de rato, cão e macaco foram identificados através de métodos de cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC), que incorporaram detecção espectrométrica de massa em tandem (LC-MS/MS).

A biodisponibilidde oral absoluta foi determinada em farmacocinética por comparação dos valores AUC de composto precursor, em seguida a doses únicas intravenosas e orais de ratos (somente composto III), cães e macacos.

A biodisponibilidade oral de ambos os compostos (5 mg/kg) dos estudos PK exploratórios foi de 38% em ratos (composto III somente), 4 - 9% em cães e 42 - 58% em macacos. Embora a biodisponibilidade do composto III em ratos fosse mais elevada do que em cães e comparáveis a de macacos, os ratos tiveram muito menos exposição AUC de plasma, em comparação com cães e macacos.

A biodisponibilidade absoluta foi também estimada para ambos os compostos dos estudos de macacos a 5 mg/kg. A biodisponibilidade absoluta do composto III foi de 42% em machos e 76% em fêmeas, sugerindo uma potencial diferença de sexo em exposição sistêmica. A biodisponibilidade do composto I, calculada usando-se valores AUCt médios, foi de 54% em machos e 61% em fêmeas. Entretanto, o valor para machos pode ter sido subestimado, visto que a absorção em um animal foi lenta e as concentrações de plasma pareceram ser ainda crescentes a 8 horas pós-dose. Com base nos valores AUC, e excluindo-se esta animal para o qual AUC não poderia ser calculado, a biodisponibilidade em machos foi de 75%.

Em seguida a uma dose oral de 5 mg/kg, as concentrações de plasma a 24 horas pós-dose foram de 12 ng/ml para o composto III e 17,9 5 ng/ml para o composto III e 17,9 ng/ml para o composto I. Uma dose oral de 5 mg/kg no macaco é equivalente (com base na área de superfície corporal) a uma dose humana de aproximadamente 100 mg (vide Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinicai Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health e 10 Human Services, Food e Drug Administrelação, Center for Drug Evaluation e Research, julho de 2005). Este nível de composto a 24 horas pós-dose é confirmador da dosagem de uma vez por dia.

Biodisponibilidade Oral dos Compostos I e III

Espécie Dose Via de No, animais / Tmax BA (mg/kg)a administração Gênero (hr) (%) Cão 5 PO-Fed Composto I 0,3 b 9 2M, IF Macaco 5 PO-Fed 3M 2,7 b 58 Macaco 5 PO-Fed 3M 4,0 c 54 Macaco 5 PO-Fed 3F 4,0 c 61 Rato 10 PO-Fasted Composto III 0,4 b 38 3M Cão 5 PO-Fed 1M, IF 1,5 b 4 Cão 20 PO-Fed 1M, IF 2,2 b 23 Macaco 5 PO-Fed 2M 3,0 b 42 Macaco 5 PO-Fed 3M 2,0 c 42 Macaco 5 PO-Fed 3F 2,0 c 76 Macaco 20 PO-Fed 2M 2,5 b 61 = biodisponibilidade oral absoluta a = Ratos, cães e macacos receberam uma única dose oral do Composto 1 ou Composto III. Adicionalmente, os ratos receberam uma dose IV de 2 mg/kg e os macacos receberam uma dose IV de mg/kg. b = Média c = valor médio

Exemplo 20

Toxicologia

As toxicidades potenciais dos compostos I e II foram avaliadas

in vivo em ratos e macacos. Métodos Ratos Sprague-Dawley e macacos cinomolgus fora dosados uma vez por dia durante 14 dias via gavagem oral com o composto I ou composto III ou veículo dose (68% Capmul PG-8, 20% PEG 400, 2% Tween e 10% Labrasol), de acordo com GLP. Houve 10 ratos machos e 10 fêmeas e houve 3 macacos machos e 3 fêmeas. Os ratos e macacos foram dosados com 0, 50, 150 ou 500 mg/kg/dia do composto I ou com 0, 50, 150, 450 mg/kg/dia do composto III.

A toxicidade foi avaliada usando-se observações clínicas, pesos corporais, consumo de alimento e patologia clínica (hematologia, coagulação e química do soro).

Uma necrópsia compreensiva e exame patológico vulgar foram realizados em animais e órgãos e tecidos selecionados foram coletados para avaliação histológica.

Determinações de hematócrito, hemoglobina, concentração, contagem de eritrócitos, contagem de leucócitos totais e contagem de plaquetas foram conduzidos em todas as amostras. Avaliações diferenciais e morfológicas dos leucócitos foram realizadas.

Determinações bioquímicas clínicas incluíram atividades da alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), gama- glutamiltranspeptidase (GGT) e fosfatase alcalina e concentrações de nitrogênio na uréia sanguínea (BUN), creatinina, proteína total, albumina, globulina, glicose, colesterol, triglicerídeos, bilirrubina total e níveis de eletrólitos (Na, K, P, Cl, Ca).

Amostras da urina (somente macacos) foram avaliadas macroscopicamente e microscopicamente e testadas quanto ao pH, bilirrubina, glicose, proteína, cetonas, sangue, uroblinogênio, nitritos, leucócitos e peso específico.

Resultados Nenhum efeito no consumo de comida ou peso corporal ou diferenças de peso corporal foi associado com a dosagem do composto I ou composto III. Nenhum achado clínico relacionado com o tratamento foi observado e nenhuma mudança toxicologicamente significativa em parâmetros hematológicos ou de química do soro ou achados de urinálise foram observados.

Nenhum efeito toxicologicamente significativo sobre os pesos dos órgãos (absoluto ou relativo), com exceção de pesos de fígado aumentados em ratos tratados com o composto III (somente fêmeas) e macacos nas doses intermediárias e elevadas. Entretanto, estes fígados não foram microscopicamente extraordinários.

Nos ratos tratados com o composto I e composto III, foi observada mínima a suave hipertrofia/hiperplasia de célula folicular, em todos os grupos de dose, exceto em fêmeas tratadas com o composto III em baixa dose. O impacto sobre a função da tiróide não pôde ser avaliado, uma vez que os níveis de hormônio da tiróide circulante e de TSH não foram examinados.

Não foram observados outras lesões macroscópicas, achados microscópicos ou achados de histopatologia em ratos ou macacos.

Todas as publicações e pedidos de patente citados neste relatório são aqui incorporados por referência como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência. Esta invenção foi descrita com referência a certas formas de realização. Embora a invenção precedente tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será facilmente evidente para aqueles hábeis na arte, à luz dos ensinamentos desta invenção, que certas mudanças e modificações podem ser feitas nela sem desvio do espírito ou escopo das reivindicações anexas. Variações e modificações da invenção serão óbvias para aqueles hábeis na arte pela precedente descrição detalhada da invenção.

Claims

1. Composto puro, caracterizado pela fórmula (A) ou um seu sal, solvato, hidrato ou éster farmaceuticamente aceitável; <formula>formula see original document page 211</formula> carbonila, ou um resíduo amino ácido; R1 é hidrogênio, acila, -S(O)n-R, carboxila, carbonila, ou um C2-6 alquenila, C2.6 alquinila, arila, heterociclo, halogênio, -CN, -CF3, -OR, - NHR, -NRR, ou -NO2; n é O, 1, ou 2; e cada R é independentemente hidrogênio, alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, arila, ou heterociclo.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de X ser arila ou heterociclo; C2-6 alquenila, C2-6 alquinila ou alquila; e alquinila ou alquila; Y é hidrogênio, -Rj-O-R, -NH-R, ou -NRR; Z é -OR, -NHR, -NRR, carboxamido, amido, carboxila, resíduo amino ácido; cada R4, R5, R6 e R7’ é independentemente hidrogênio, Y ser -R, -O-R, -NH-R, ou -NRR.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de cada R4 e R5 ser independentemente hidrogênio ou halogênio; R6 e R7 serem hidrogênio; R1 ser hidrogênio Ou-S(O)n-R; Y ser hidrogênio, -R5 ou -O-R; Z ser carboxamido, amido, carboxila, ou carbonila; n ser 1 ou 2; e cada R ser independentemente hidrogênio ou alquila.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pela fórmula (C): em que cada R2, R3, R4, R5 e R6 ser independentemente hidrogênio, halogênio, alquila substituída ou insubstituída, ou C2-6 alquenila substituída ou insubstituída.

5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de cada R3 e R5 ser independentemente alquila ou C2-6 alquenila que pode ser opcionalmente substituída por CN ou halogênio; e R2, R4 e R6 serem hidrogênio.

6. Composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de R1 ser hidrogênio; Y ser -O-R; e Z ser amido, carboxila, ou carbonila.

7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser metil éster do ácido (2-carbamoil-5-cloro-lH-indol-3-il)-[3- ((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfmico.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser metil éster do ácido (2-carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico.

9. Composto puro, caracterizado pelo fato de ser da fórmula (B) ou um seu sal, solvato, hidrato ou éster farmaceuticamente aceitável: em que: X é hidrogênio; arila ou heterocíclico; C2.e alquenila, C2-6 alquinila ou alquila; Y é hidrogênio, -R, -O-R, -NH-R, ou -NRR; Z é -OR, -NHR, -NRR, carboxamido, amido, carboxila, carbonila, ou um resíduo amino ácido; R1 é hidrogênio, acila, -S(O)n-R, carboxila, carbonila, ou um resíduo amino ácido; cada R4, R5, R6 e R7 é independentemente hidrogênio, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, arila, heterociclo, halogênio, -CN, -CF3, -OR, -NHR, -NRR, ou -NO2; n é 1 ou 2; e cada R é independentemente hidrogênio, alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, arila, ou heterociclo.

10. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de X ser arila ou heterociclo; C2-6 alquenila, C2-6 alquinila ou alquila; e Y ser -R, -O-R, -NH-R, ou -NRR.

11. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de cada R4 e R5 ser independentemente hidrogênio ou halogênio; R e R ’ serem hidrogênio; R1 ser hidrogênio OU-S(O)n-R; Y ser hidrogênio, -R, ou-O-R; Z ser carboxamido, amido, carboxila, ou carbonila; n é 1 ou 2; e cada R é independentemente hidrogênio ou alquila.

12.Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações9—11, caracterizado pelo fato de ser da fórmula (D) <formula>formula see original document page 214</formula> em que cada R2, R3, R4, R5 e R6 é independentemente hidrogênio, halogênio, alquila substituída ou C2.6 alquenila substituída ou insubstituída.

13. Composto de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de cada R3” e R5” ser independentemente alquila ou C2_6 alquenila, que pode opcionalmente ser substituída por CN ou halogênio; e R2’, R4 e R6 são hidrogênio.

14. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de R1 ser hidrogênio; Y ser -O-R; e Z ser amido, carboxila, ou carbonila.

15. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser metil éster do ácido (2-carbamoil-5-cloro-lH-indol-3-il)-[3- ((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(R)-fosfínico.

16. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol- .3 -il)- [3 -((E)-2-ciano-vinil)-5 -metil-fenil]-(R)-fosfínico.

17. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo fato de ser enanciomericamente puro.

18. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo fato de ser substancialmente livre de seu enanciômero oposto.

19. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos 80%, 90%, 95 % ou 99% em peso do enanciômero designado.

20. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo fato de ser um sal, éster ou forma neutra farmaceuticamente aceitável.

21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1- 20 e um veículo, excipiente ou diluente farmacêutico.

22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato do composto ser metil éster do ácido (2-carbamoil- 5-cloro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico; ou metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-7H-indol-3-il)-[3-((E)-2- ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico.

23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de ser em uma forma de dosagem oral farmaceuticamente aceitável, que é opcionalmente uma cápsula ou tablete.

24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de o composto ser enanciomericamente puro.

25. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 - 20 e um segundo agente anti-HIV.

26. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 20, que é opcionalmente metil éster do ácido (2-carbamoil-5-cloro-lH- indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico ou metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5- metil-fenil]-(S)-fosfínico, em combinação com um segundo agente anti-HIV que é um inibidor da protease, opcionalmente selecionado de amprenavir, tipranavir, indinavir, saquinavir, lopinavir, ritronavir, fosamprenavir, darunavir, atazanavir, nelfmavir, brecanivir ou GS-8374; ou um inibidor da integrase opcionalmente selecionado de Elvitegravir, GSK-364735 ou raltegravir.

27. Método para tratar uma infecção por HIV, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo em necessidade dele uma quantidade eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 20.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de o composto ser metil éster do ácido (2-carbamoil-5-cloro-lH- indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico; ou metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-lH-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfínico.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de o composto estar em uma forma de dosagem oral farmaceuticamente aceitável, que é opcionalmente uma cápsula ou tablete.

30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de o composto ser enanciomericamente puro.

31. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de o método compreender ainda administrar o composto a um indivíduo, em combinação ou altemação com pelo menos um segundo agente anti-HIV.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de o segundo agente anti-HIV ser selecionado de: um inibidor da protease opcionalmente selecionado de amprenavir, tipranavir, indinavir, saquinavir, lopinavir, ritronavir, fosamprenavir, darunavir, atazanavir, e nelfmavir; um inibidor da transcriptase inversa de nucleosídeo ou nucleotídeo, opcionalmente selecionado de lamivudino, entricitabina, abacavir, zalcitabina, zidovudino, tenofovir, didanosina, e estavudina; um inibidor da transcriptase inversa não-nucleosídeo, opcionalmente selecionado de delavirdina, efavirenz e nevirapina. uma combinação de dose fixa opcionalmente selecionado de Atripla, Combivir, Trizivir e Truvada; e um inibidor de entrada opcionalmente selecionado de um inibidor de fusão ou antagonista correceptor CCR5, opcionalmente selecionado de maraviroc e efuvirtida.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de o segundo agente anti-HIV ser selecionado de: um inibidore da transcriptase inversa de nucleosídeo, opcionalmente selecionado de andoxovir, apricitabina e elvucitabina; um inibidor da protease, que é opcionalmente brecanivir ou GS-8374; um antagonista do receptor CCR5, opcionalmente selecionado de Aplaviroc, PR02000 e Vicriviroc; um inibidor da transcriptase inversa não-nucleosídeo, que é opcionalmente Etravirina, Rilpivirina ou Calanolida A; um inibidor da maturação, que é opcionalmente Bevirimat; e um inibidor da integrase, que é opcionalmente Elvitegravir, GSK-364735 ou raltegravir.

34. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de o composto ser administrado em combinação ou altemação com um agente anti-HBV, que é opcionalmente selecionado de entecavir; lamivudina; um interferon incluindo interferon alfa-2b ou peginterferon alfa-2a; adefovir dipivoxil; ou telbivudina.

35. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de o composto ser administrado em combinação ou altemação com um agente anti-HBV, que é opcionalmente selecionado de entricitibina, clevudina, tenofovir, valtorcitabina, andoxovir, LB80380, remofovir e racivir.

36. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de o segundo agente anti-HIV ser um inibidor da protease, opcionalmente selecionado de amprenavir, tipranavir, indinavir, saquinavir, lopinavir, ritronavir, fosamprenavir, darunavir, atazanavir, nelfmavir, brecanivir ou GS-8374; ou um inibidor da integrase opcionalmente selecionado de Elvitegravir, GSK-364735 ou raltegravir.

37. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de o composto modular a atividade do eitoeromo P450.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de o composto inibir o metabolismo de P450 do segundo agente anti-HIV.

39. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de o composto ser administrado oralmente, opcionalmente uma vez por dia.

40. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de o composto ser administrado em combinação com um segundo composto eficaz para o tratamento ou prevenção da infecção por HCV no indivíduo.

41. Método para prevenir uma infecção por HIV, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 20.

42. Método para inibir a replicação de HIV, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de contatar uma célula infectada com HIV com um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 20.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de o composto ser metil éster do ácido (2-carbamoil-5-cloro-lH- indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfmico; ou metil éster do ácido (2-Carbamoil-5-cloro-4-fluoro-1 H-indol-3-il)-[3-((E)-2-ciano-vinil)-5-metil-fenil]-(S)-fosfinico.

44. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 - 20, caracterizado pelo fato de ser em terapia.

45. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 - 20, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para tratar, evitar, melhorar ou controlar os sintomas associados com uma infecção por HIV.