BRPI0703025B1

BRPI0703025B1 - microdispositivo multicamada, processo de preparação de microdispositivo multicamada

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Publication number: BRPI0703025B1
Application number: BRPI0703025A
Authority: BR
Inventors: Emanuel CARRILHO; José Alberto Fracassi Da Silva; Wendell Karlos Tomazelli Coltro
Original assignee: Universidade De São Paulo - Usp; Universidade Estadual De Campinas
Priority date: 2007-08-08
Filing date: 2007-08-08
Publication date: 2018-07-17
Also published as: BRPI0703025A2; WO2009018642A1

Abstract

microdispositivo multicamada, processo de preparação de microdispositivo multicamada. a presente invenção trata de microdispositivo multicamada apresentando eletrodos integrados, bem como seu processo de preparação, para utilização em análises químicas, clínicas, biológicas, forenses, ambientais, alimentícias, farmacológicas.

Description

(54) Título: MICRODISPOSITIVO MULTICAMADA, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE MICRODISPOSITIVO MULTICAMADA (51) Int.CI.: B32B 27/36; G01N 27/447; G01N 27/453 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP. UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS (72) Inventor(es): EMANUEL CARRILHO; JOSÉ ALBERTO FRACASSI DA SILVA; WENDELL KARLOS TOMAZELLI COLTRO

1/26 “MICRODISPOSITIVO MULTICAMADA, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE MICRODISPOSITIVO MULTICAMADA” [001] A presente invenção refere-se a um microdispositivo multicamada, bem como seu processo de preparação, para utilização em análises químicas, clínicas, biológicas, forenses, ambientais, alimentícias, farmacológicas, dentre outras.

Estado da Técnica [002] Da mesma forma que os microchips eletrônicos revolucionaram os universos dos computadores e da eletrônica, os microchips analíticos têm revolucionado a química analítica nos últimos anos [Wooley, A.T.; Lao, K.; Glazer,

A.N.; Mathies, R.A. Anal. Chem., v.70, p.684-688, 1998]. Inicialmente, a principal razão para a miniaturização era aumentar a eficiência analítica mais do que reduzir seu tamanho. No entanto, com a mudança da escala macro para a escala micro, outras vantagens foram obtidas como redução do volume de reagentes e amostras (da ordem de pL-nL), baixo custo de fabricação e análise em tempo reduzido. Essa verdadeira revolução teve origem no início da década de 1990, quando Manz e colaboradores propuseram a introdução do conceito de microssistemas para análises totais, ou simplesmente μTAS [Manz, A.; Graber, N.; Widmer, H.M. Sens. Actuators B, v.1, p.244-248, 1990].

[003] Com o desenvolvimento dos μTAS, tornou-se possível integrar várias etapas de processamento analítico convencional como, introdução da amostra, prétratamento da amostra, reações químicas, separação química e detecção em um único dispositivo [Wooley, A.T.; Lao, K.; Glazer, A.N.; Mathies, R.A. Anal. Chem., v.70, p.684-688, 1998; Manz, A.; Graber, N.; Widmer, H.M. Sens. Actuators B, v.1, p.244-248, 1990]. Os μTAS transformam informações químicas em sinais elétricos ou óticos, possibilitando uma fácil automação. Todos estes fatores, aliados à portabilidade, impulsionaram o desenvolvimento explosivo e maciço dos sistemas analíticos em micro-escala nos últimos anos [Reyes, D.R.; Iossifidis, D.; Auroux, P.; Manz, A. Anal. Chem., v.74, p.2623-2636, 2002]. Estes aspectos se tornaram relevantes para o campo clínico e ambiental em que o termo point-of-care vem sendo utilizado [Gulliksen, A.; Solli, L.; Karlsen, F.; Rogne, H.; Hovig, E.; Nordstrom, T. Sirevág, R. Anal. Chem, v.76, p.9-14, 2003; LAB-ON-A-CHIP: The Revolution in portable instrumentation. New York, John Wiley, 2001. p.7-135]. Devido à idéia de inserir várias etapas normalmente desenvolvidas em um laboratório em um chip, os

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2/26 μΤΆβ são também denominados lab-on-a-chip (LOC) [LAB-ON-A-CHIP: The Revolution in portable instrumentation. New York, John Wiley, 2001. p.7-135].

[004] Os vêm sendo intensamente utilizados para solucionar uma ampla diversidade de problemas bioanalíticos. Microdispositivos para cultura de células bacterianas [Martin, K.; Henkel, T.; Baier, V.; Grodian, Ά.; Schon, T.; Roth, M.; Kohler, J.M.; Metze, J. Lab Chip, v.3, p.202-207, 2003; Taylor, Ά.Μ.; Rhee, S.W.; Tu, C.H.; Cribbs, D.H.; Cotman, C.W.; Jeon, N.L. Langmuir, v.19, p.15511556, 2003], diagnósticos clínicos [Li, P.H.;Wang, W.J.; Parameswaran, M. Analyst, v.128, p. 225-231, 2003; Christodoulides, N.; Tran, M.; Floriano, P.N.; Rodriguez, M.; Goodey, Ά.; Ali, M.; Neikirk, D.; Mcdevitt, J.T. Anal. Chem., v.74, p.3030-3036, 2002], interesses ambientais [Ohira, S.I.; Toda, K.; Ikebe, S.I.; Dasgupta, P.K. Anal. Chem., v.74, p. 5890-5896, 2002; Bromberg, Ά.; Mathies, R.A. Anal. Chem., v.75, p.1188-1195, 2003], imunoensaios [Jiang, X.Y.; Ng, J.M.K.; Stroock, ΆΌ.; Dertinger, S.K.W.; Whitesides, G.M. J. Am. Chem. Soc., v.125, p.5294-5295, 2003; Sato, K.; Yamanaka, M.; Takahashi, H.; Tokeshi, M.; Kimura, H.; Kitamori, T. Electrophoresis, v.23, p.734-739, 2002], análise de proteínas [Jin, L.J.; Ferrance, J.; Sanders, J.C.; Landers, J.P. Lab Chip, v.3, p.11-18, 2003; Slentz,

B.E.; Penner, Ν.Ά.; Regnier, F.E. Anal. Chem., v.74, p.4835-4840, 2002], análise e separação de DNΆ [Sanders, J.C.; Breadmore, M.C.; Kwok, Y.C.; Horsman, K.M.; Landers, J.P. Anal. Chem., v.75, p.986-994, 2003.; Tian, H.J.; Landers, J.P. Anal. Biochem., v.309, p.212-223, 2002], reação em cadeia da polimerase (PCR) [Sun, K.; Yamaguchi, Ά.; Ishida, Y.; Matsuo, S.; Misawa, H. Sens. Actuators, B, v.84, p.283-289, 2002] e também para seqüenciamento de DNΆ [Liu, S. Ά. Electrophoresis, v.24, p.3755-3761, 2003; Shi, Y.N.; ^derson, R.C.

Electrophoresis, v.24, p.3371-3377, 2003; Blazej, R.G.; Paegel, B.M.; Mathies, R.A Genome Res., v.13, p.287-293, 2003] são alguns exemplos que demonstram a potencialidade dos microchips químicos. Diversas técnicas analíticas podem ser desenvolvidas em micro-escala, destacando-se a cromatografia em fase gasosa (GC), a cromatografia em fase líquida de alta eficiência (HPLC) e principalmente a eletroforese capilar (CE) ^uroux, P.; Iossifidis, D.; Reyes, D.R.; Manz, Ά. Anal. Chem., v.74, p.2637-2652, 2002];

[005] Ά CE é a principal técnica desenvolvida em micro-escala devido à simplicidade de sua instrumentação e também devido às vantagens com relação ao transporte do fluido, que não requer componentes adicionais além de eletrodos para aplicação de campo elétrico, eliminando assim a necessidade de acoplar

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3/26 micro-bombas e micro-válvulas [Bilitewski, U.; Genrich, M.; Kadow, S.; Mersal, G. Anal. Bioanal. Chem., v.377, p.556-569, 2003]. O controle eletrocinético pode ser usado para transportar a amostra para um determinado ponto em que ela possa ser quimicamente modificada, diluída ou misturada com outra substância, detectada e talvez usada para promover análises pelo acoplamento com outras técnicas analíticas, como a espectrometria de massas [Ermakov, S.Y.; Jacobson, S.C.; Ramsey, J.M. Anal. Chem., v.72, p.3512-3517, 2000].

[006] Os μTAS, LOC's, microchips ou microdispositivos analíticos podem ser fabricados em uma superfície planar através processos litográficos como a litografia por raios-x, a litografia soft, a litografia por feixe de elétrons ou pela litografia com radiação UV [Chen, Y.; Pépin, A. Electrophoresis, v.22, p.187-207, 2002]. Estas tecnologias foram desenvolvidas nas décadas de 1970 e 1980 e são extensivamente utilizadas nas indústrias de microeletrônicos e semicondutores. Apesar dos processos litográficos serem os métodos mais utilizados na preparação dos μTAS, a pesquisa por métodos alternativos, economicamente viáveis, é e sempre será um permanente objetivo da comunidade científica.

[007] Um dos caminhos alternativos é a produção de dispositivos poliméricos utilizando a tecnologia LIGA cuja sigla, do alemão, representa Litografia, Eletroformação e Moldagem (Lithography, Galvo und Abformung) [Manz, A.; Graber, N.; Widmer, H.M. Sens. Actuators B, v.1, p.244-248, 1990]. A tecnologia LIGA foi originalmente concebida com base na litografia por raios-x (LIGA-RX), mas recentemente, graças a avanços na área de materiais, viabilizou-se uma variante tecnológica baseada em litografia com radiação ultra-violeta (LIGAUV). Esta tecnologia possibilita a fabricação de microestruturas com elevada razão de aspecto (por exemplo, uma parede de 200 μm de altura por apenas 2 μm de largura) [Manz, A.; Graber, N.; Widmer, H.M. Sens. Actuators B, v.1, p.244-248, 1990].

[008] Outro método bastante atrativo para a rápida produção de microdispositivos foi proposto recentemente por do Lago e colaboradores [do Lago,

C.L.; Silva, H.D.T.; Neves, C.A.; Brito-Neto, J.G.A.; Fracassi da Silva, J.A. Anal. Chem., v.75, p. 3853-3858, 2003]. Neste processo, os padrões de imagens são impressos em um filme de poliéster usando uma impressora laser para depositar seletivamente uma camada de toner, a qual define as dimensões dos canais microfluídicos. Após impressos, estes padrões são laminados contra uma folha de

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4/26 transparência ou contra uma imagem especular do padrão, formando canais com simples ou dupla camada de toner, respectivamente.

[009] Embora a miniaturização de dispositivos de separação venha se desenvolvendo rapidamente nos últimos anos, o desenvolvimento de sistemas de detecção efetivos encontra-se em um estágio atrasado [Wang, J. Talanta, v.56, p.223-231, 2002; Schwarz, M.A.; Hauser, P.C. Lab Chip, v.1, p.1-6, 2001]. Desde que o conceito de μTAS foi proposto, no início dos anos 90, o método de detecção mais utilizado, principalmente na primeira década, foi a fluorescência induzida a laser (LIF) [Seiler, K.; Harrison, D.J.; Manz, A. Anal. Chem., v.65, p.1481-1488, 1993]. Este modo de detecção é perfeitamente adequado para ser empregado em aplicações bioanalíticas. Outro método de detecção que, recentemente, vem recebendo considerável atenção em conexão (primariamente) com a análise proteômica é a espectrometria de massas (MS) [Ramsey, R.S.; Ramsey, J.M. Anal. Chem., v.69, p.1174-1178, 1997; Bings, N.H.; Wang, Skinner, C.D; Colyer, C.L.; Thibault, P.; Harrison, D.J. Anal. Chem., v.71, p.3292-3296, 1999]. Embora ofereçam alta sensibilidade e um alto grau de informação, LIF e MS requerem um completo controle da instrumentação off-chip e apresentam alto custo instrumental, aspectos que comprometem os benefícios da miniaturização e portabilidade.

[010] Se LIF e MS apresentam instrumentação complexa e de alto custo, técnicas eletroquímicas têm atraído, nos últimos anos, considerável interesse direcionado para os microssistemas [Lacher, N.A.; Garrison, K.E.; Martin, R.S.; Lunte, S.M. Electrophoresis, v.22, p. 2526-2536, 2001; Vandaveer IV, W.R.; Pasas, S.A.; Martin, R.S.; Lunte, S.M. Electrophoresis, v.23, p.3667-3677, 2002]. A eletroquímica oferece grande promessa para os microssistemas, com aspectos que incluem notável sensibilidade,,a própria miniaturização do detector e do controle da instrumentação, independência do comprimento do caminho óptico ou turbidez da amostra, baixo custo, simplicidade e alta compatibilidade com técnicas de microfabricação [Wang, J. Talanta, v.56, p.223-231, 2002]. Uma vez que os processos de deposição metálica já estão bem estabelecidos, a implementação de métodos de detecção utilizando eletrodos integrados na mesma plataforma tornouse bastante atrativa. A integração de eletrodos para detecção amperométrica [Scott Martin, R.; Gawron, A.J., Lunte, S.M.; Henry, C.S. Anal. Chem., v.72, p.3196-3201, 2000; Nacher, N.A.; Lunte, S.M.; Scott Martin, R. Anal. Chem., v.76, p.2482-2886, 2004] e condutométrica [Laugere, F.; Guijt, R.M.; Bastemeijer, J.; Steen, G.V.D.; Berthold, A.; Baltussen, E.; Sarro, P.; van Dedem, G.W.K.; Vellekoop, M. Anal.

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Chem., v.75, p.306-310, 2003; Guijt, R.M.; Baltussen, E.; van der Steen, G.; Frank, H.; Billiet, H.; Schalkhammer, T.; Laugere, F.; Vellekoop, M.; Berthold, A.; Sarro, L.; van Dedem, G.W.K. Electrophoresis, v.22, p.2537-2541, 2001] em microdispositivos de eletroforese foram recentemente propostos. Dentre os modos de detecção eletroquímicos, a detecção amperométrica é que fornece melhor detectabilidade. No entanto, devido sua robustez, sua simplicidade e seu baixo custo, o uso da detecção condutométrica em microssistemas tem aumentado muito nos últimos anos [Vandaveer IV, W.R.; Pasas, S.A.; Martin, R.S.; Lunte, S.M. Electrophoresis, v.23, p.3667-3677, 2002].

[011] A detecção condutométrica é, em princípio, um método eletroquímico de detecção universal. A condutância de uma solução (L) é dependente da área do eletrodo (A), sua distância (/), as concentrações (c) de todas as espécies carregadas e de sua condutividade molar (λ), de acordo com a equação 1:

L = A Σλ, (Eq. 1) [012] A detecção condutométrica pode ser conduzida por dois diferentes modos: (i) modo com contato e; (ii) modo sem contato. No modo convencional (com contato), os eletrodos são posicionados diretamente em contato com a solução, fato que pode gerar alguns problemas na presença de um campo elétrico elevado, como é o caso da eletroforese capilar. Dentre os possíveis problemas, destaca-se a formação de bolhas causadas pela eletrólise e também a degradação do eletrodo. Além disso, a presença de um campo elétrico requer uma proteção adequada do circuito eletrônico do detector para eliminar possíveis interferências elétricas. No modo sem contato, os eletrodos são posicionados do lado externo do microcanal (sem contato com a solução), prevenindo os problemas relacionados ao modo com contato.

[013] Os eletrodos, essencialmente, formam capacitores com o eletrólito, desde que a parede do canal seja um dielétrico. Estes capacitores são caracterizados pela impedância, X_c, também conhecida como reatância capacitiva, a qual é inversamente dependente da capacitância, C, que é calculada pela equação 2:

x_c = G (Eq. 2) ω(.

sendo que C representa a capacitância, e ω é dado por (2π χ freqüência).

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6/26 [014] Ao aplicar um sinal senoidal a um dos eletrodos, uma corrente alternada pode ser capacitivamente acoplada no eletrólito de trabalho e captada no segundo eletrodo de medida. De acordo com a equação 2 quanto maior a freqüência, menor a reatância ou impedância que um capacitor oferece ao fluxo de carga, permitindo que as variações de condutividade da solução no interior do microcanal sejam observadas mesmo com os eletrodos posicionados do lado externo do microcanal.

[015] Para utilizar este modo de detecção em sistemas miniaturizados, é essencial que os eletrodos sejam posicionados tão próximo quanto possível do canal microfluídico, de modo a garantir um bom acoplamento capacitivo. Como mostrado na equação 3, a capacitância, C, é dependente da distância, d, entre as duas placas condutoras (eletrodos) do capacitor paralelo, sendo que d é equivalente à espessura da camada isolante (dielétrico).

C = yJ-A (Eq. 3) d

s_o = permissividade do vácuo (8,854 χ 10¹² F m^-1 ) s_r = constante dielétrica do meio A = área superficial do eletrodo

Substituindo a equação 3 na equação 2:

Xc =-?— (Eq. 4) ωε₀ε_ΓΆ [016] A equação 4 mostra, claramente, que X_c é diretamente dependente da espessura da camada isolante, e que maiores sinais de freqüências devem ser usados para camadas isolantes mais finas (ou menos espessas).

[017] A detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada (C⁴D) foi aplicada às técnicas de eletromigração no início dos anos 1980 para a determinação isotacoforética (ITP) de ânions orgânicos e inorgânicos [Gas, B.; Demjanenko, M.; Vacík, J. J. Chromatogr., v. 192, p. 253-258, 1980; Vacík, J.; Zuska, J.; Muselasová, I. J. Chromatogr., v. 320, p.233-239, 1985]. Em 1998, Zemann e colaboradores [Zemann, A.J.; Schnell, E.; Volgger, D.; Bonn, G.K. Anal.Chem., 1998, v.70, p.563-567] e Fracassi da Silva e do Lago [Fracassi da Silva, J.A.; do Lago, C.L. Anal.Chem., v.70, p. 4339-4343, 1998] propuseram, independentemente, a utilização da C⁴D como método de detecção para eletroforese capilar (CE). A partir deste momento, o número de publicações

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7/26 relacionadas à instrumentação e diferentes aplicações com CE-C⁴D tem aumentado consideravelmente. Maiores detalhes podem ser encontrados em artigos de revisão recentemente publicados [Kubán, P.; Hauser, P.C.; Electroanalysis, v.16, p.20092021, 2004; Kubán, P.; Hauser, P.C.; Electrophoresis, v.25, p. 3387-3397, 2004; Kubán, P.; Hauser, P.C.; Electrophoresis, v.25, p. 3398-3405, 2004; Brito-Neto, J.G.; Fracassi da Silva, J.A.; Blanes, L.; do Lago, C.L. Electroanalysis, v. 17, p.1198-1206, 2005; Brito-Neto, J.G.; Fracassi da Silva, J.A.; Blanes, L.; do Lago, C.L. Electroanalysis, v.17, p.1207-1214, 2005].

[018] O uso da C⁴D em microdispositivos de eletroforese foi primeiramente proposto por Guijt e colaboradores em 2001 [Guijt, R.M.; Baltussen, E.; van der Steen, G.; Frank, H.; Billiet, H.; Schalkhammer, T.; Laugere, F.; Vellekoop, M.; Berthold, A.; Sarro, L.; van Dedem, G.W.K. Electrophoresis, v.22, p.2537-2541, 2001]. Neste primeiro trabalho, eletrodos de alumínio foram incorporados diretamente no canal de separação. Para evitar o contato com a solução, os eletrodos foram revestidos com uma fina camada de SiC. Lichtenberg e colaboradores [Lichtenberg, J.; Rooiji, N.F.; Verpoorte, E. Electrophoresis, v.23, p.3769-3776, 2002] propuseram um protótipo similar, projetando os eletrodos de platina próximo do microcanal de separação, porém, isolados com uma fina parede de vidro (10-15 μm). Os microssistemas propostos por Guijt e Lichtenberg, embora fabricados por tecnologias altamente sofisticadas, não apresentaram bons resultados analíticos quando comparados com sistemas similares. Além disso, as etapas dos processos envolvidos são bastante dispendiosas e também complexas. Um sistema bastante simplificado foi proposto por Pumera e colaboradores [Pumera, M.; Wang, J.; Opekar, F.; Jelínek, I.; Feldman, J.; Lowe, H.; Hardt, S. Anal. Chem., v.74, p.1968-1971, 2002]. Neste sistema dois eletrodos foram preparados a partir de folhas de alumínio e fixados no topo dos microchips de PMMA. A distância entre os eletrodos e o microcanal foi definida pela espessura da placa (tampa) de PMMA (—175 μm). Wang e colaboradores [Wang, J.; Chen, G.; Muck Jr, A. Anal. Chem., v.75, p.4475-4480, 2003; Wang, J.; Chen, G.; Muck Jr, A.; Collins, G.E. Electrophoresis, v.24, p.3728-3732, 2003] usaram um processo similar para fabricar um sistema de C⁴D móvel, permitindo um rápido posicionamento dos eletrodos em diferentes posições sobre o canal de separação. A construção de eletrodos para C⁴D usando fitas adesivas de Cu também foi usado por diferentes grupos [do Lago, C.L.; Silva, H.D.T.; Neves, C.A.; Brito-Neto, J.G.A.; Fracassi da Silva, J.A. Anal. Chem., v.75, p. 3853-3858, 2003; Tanyanyiwa, J.;

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Hauser, P.C. Anal. Chem., v.74, p.6378-6382, 2002; Tanyanyiwa, J.; Abad-Villar, E.M.; Fernández-Abedul, T.F.; Costa-Garcia, A.; Hoffmann, W.; Guber, A.E.; Gerlach, A.; Hauser, P.C. Analyst, v.128, p.1019-1024, 2003]. Embora seja um método prático, a repetibilidade da configuração dos eletrodos é altamente dependente da habilidade técnica do usuário. Logo, o preparo dos eletrodos com as mesmas dimensões (comprimento e largura), a fixação dos mesmos sempre na mesma posição sobre o canal de separação, espaçados ainda pela mesma distância fica completamente comprometida. Isso tem conseqüências na confiabilidade, repetibilidade, reprodutibilidade e conseqüêntemente na fabricação seriada.

[019] Tanyanyiwa e colaboradores [Tanyanyiwa, J.; Hauser, P.C. Anal. Chem., v.74, p.6378-6382, 2002; Tanyanyiwa, J.; Abad-Villar, E.M.; FernándezAbedul, T.F.; Costa-Garcia, A.; Hoffmann, W.; Guber, A.E.; Gerlach, A.; Hauser, P.C. Analyst, v.128, p.1019-1024, 2003] demonstraram que a sensibilidade do C⁴D pode ser melhorada com o uso de um sinal de excitação com elevada amplitude (HV, 100-500 V). O documento US 2005109621 trata do emprego da C⁴D com HV em eletroforese. Este documento se refere ao desenvolvimento da instrumentação analítica do C⁴D com HV para eletroforese convencional e também para o sistema em micro-escala. Para o sistema de eletroforese em micro-escala, os eletrodos foram preparados usando fitas adesivas de Cu. Ressalta-se ainda que os microchips (vidro e PMMA) usados nos trabalhos do grupo de Hauser e col. foram obtidos comercialmente.

[020] Kubán & Hauser mostraram os efeitos da geometria da cela de detecção e os parâmetros operacionais sobre o uso do C⁴D em sistemas miniaturizados foram apresentados [Kubán, P.; Hauser, P.C. Lab Chip, v.5, p.407415, 2005].

Objetivos

Os objetivos da presente invenção foram:

- simplicidade e rapidez na preparação dos dispositivos;

- possibilidade de repetibilidade no preparo dos eletrodos, o que não ocorre nos eletrodos preparados manualmente, possibilitando sua produção em massa ou em escala industrial;

- baixo custo, possibilitando o uso destes microchips integrados como sistemas de análises descartáveis;

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- baixo consumo de reagentes e amostras e, conseqüentemente, baixa produção de lixo ambiental.

Descrição Resumida [021] A presente invenção trata de microdispositivo multicamada que compreende superfície (i) contendo microcanais, superfície (ii) apresentando eletrodos de detecção integrados e reservatórios. A invenção contempla ainda o processo de preparação de microdispositivo multicamada.

Descrição Detalhada [022] A presente invenção trata de microdispositivo multicamada que compreende superfície (i) contendo microcanais, superfície (ii) apresentando eletrodos de detecção integrados e reservatórios.

[023] Segundo a invenção, o material que constitui os microcanais produzidos pelo método de impressão direta pode ser escolhido entre toner, toner em diferentes colorações, toner com materiais nanoparticulados magnetizados, materiais nanoparticulados termoplásticos, compósitos poliméricos e ferromagnéticos; preferencialmente, emprega-se toner, o qual pode ser de impressoras ou fotocopiadoras. Os microcanais podem ser arranjados para criar matriz tridimensional de canais, os quais podem permitir grande variedade de operações analíticas como diluições, reações, concentração, dentre outras.

[024] Já o material que constitui as superfícies (i) e (ii) pode ser escolhido entre vidro, poliéster, PMMA, PC, quartzo, silício, preferencialmente, emprega-se poliéster. Os microcanais obtidos apresentam altura variando de 5 e 15 μm; preferencialmente, 6 e 12 μιη são produzidos por processo contendo simples camada de toner (STL) ou dupla camada de toner (DTL).

[025] Quanto aos eletrodos integrados, estes podem apresentar-se em diferentes geometrias e posicionamentos, podendo ser utilizados para detecção com ou sem contato. Segundo a invenção, cada microdispositivo pode apresentar dois ou mais eletrodos.

[026] Os eletrodos são constituídos de material condutor e, opcionalmente, material que possibilita melhor aderência da camada de material condutor sobre o substrato. O material condutor pode ser escolhido entre alumínio, ouro, platina, paládio, carbono, cobre, titânio, cromo, níquel e prata. O alumínio é preferencialmente empregado devido ao seu baixo custo. No entanto, os materiais que permitem melhor aderência do material condutor sobre o substrato são o titânio e o cromo; preferencialmente, emprega-se titânio.

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10/26 [027] Segundo a invenção, os reservatórios presentes nos microdispositivos são posicionados sobre a superfície (ii) contendo os eletrodos, sendo que o material empregado nos reservatórios podem ser escolhidos entre PVC, polietileno, ou qualquer outro material dúctil, maleável e que seja inerte. O dispositivo básico requer uma quantidade mínima de dois reservatórios para sua operação, sendo utilizados preferencialmente quatro para demonstração de injeção e separação em uma mesma plataforma. O microdispotivo pode acomodar um número variado de reservatórios, os quais, além dos de eletrólitos para análise, podem conter reagentes específicos para separação ou para detecção.

[028] A invenção contempla ainda processo de integração de eletrodos ao microdispositivo multicamada que compreende as seguintes etapas:

(a) preparação de superfície (i) contendo microcanais;

(b) preparação de superfície (ii) contendo eletrodos;

(c) integração das superfícies (i) e (ii);

(d) inserção de reservatórios no microdispositivo obtido nas etapas (a) (c).

[029] Os microcanais preparados na etapa (a) podem ser obtidos por processo de corrosão, moldagem, prensagem, impressão ou litografia ou processos derivados destes. O material utilizado na formação dos microcanais pode ser escolhido toner, toner em diferentes colorações, toner com materiais nanoparticulados magnetizados, materiais nanoparticulados termoplásticos, compósitos poliméricos e ferromagnéticos, preferencialmente, toner. Os microcanais podem ser arranjados para criar matriz tridimensional de canais, os quais podem permitir grande variedade de operações analíticas como diluições, reações, concentração, dentre outras. O material que constitui as superfícies (i) e (ii) pode ser escolhido entre vidro, poliéster, PMMA, PC, quartzo, silício; preferencialmente, poliéster.

[030] Já os eletrodos podem ser obtidos por processo de litografia, impressão, corrosão, eletroformação, evaporação química ou deposição térmica. Os eletrodos também podem ser fabricados usando máscaras de toner. O processo de litografia compreende as seguintes etapas:

i. recobrimento do substrato com material fotossensível;

ii. fotogravação da imagem desejada;

iii. revelação;

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11/26 iv. deposição de camada contendo material condutor para formação dos eletrodos;

v. remoção do material fotossensível.

[031] Segundo a invenção, o processo de litografia compreende, opcionalmente, etapa anterior à etapa (i) de limpeza do substrato; além de apresentar, opcionalmente, etapas intermediárias para redução de stress térmico do material fotossensível.

[032] Os eletrodos integrados podem apresentar diferentes geometrias e são constituídos de material condutor e, opcionalmente, material que possibilita melhor aderência da camada de material condutor sobre o substrato. O material condutor pode ser escolhido entre alumínio, ouro, platina, paládio, carbono, cobre, prata, cromo, níquel ou titânio; preferencialmente, emprega-se alumínio. Já o material que permite melhor aderência do material condutor sobre o substrato pode ser escolhido entre cromo e titânio, preferencialmente, emprega-se titânio.

[033] A etapa (c) do processo de integração de eletrodos ao microdispositivo multicamada pode ocorrer por processo de laminação térmica, usando uma plastificadora de documentos ou prensa térmica, sendo que a superfície contendo os eletrodos pode ser posicionada de acordo com o tipo de detecção desejada, com ou sem contato com os microcanais.

[034] A invenção contempla ainda microdispositivo multicamada obtido pelo processo anteriormente descrito.

[035] Segue exemplos para melhor elucidação da invenção, não devendo, contudo serem tomados para efeitos limitativos da invenção.

Exemplo 1: Fabricação dos Microcanais [036] Os microcanais fluídicos foram fabricados conforme o processo de impressão direta, conforme o documento PI 0105260-8. Além das vantagens referentes ao custo e ao tempo de fabricação, a potencialidade deste processo para a fabricação de microdispositivos para separações eletroforéticas com detecção amperométrica [Coltro, W.K.T., Fracassi da Silva, J.A.; Silva, H.D.T.; Richter, E.M.; Furlan, R.; Angnes, L.; do Lago, C.L.; Mazo, L.H.; Carrilho, E. Electrophoresis, v.25, p.3832-3839, 2004; He, F.Y.; Liu, A.L.; Yuan, J.H.; Coltro, W.K.T.; Carrilho, E.; Xia, X.H.; Anal. Bioanal. Chem., v.382, p.192-197, 2005; Liu, A.L.; He, F.Y.; Hu, Y.L.; Xia, X.H. Talanta, v.68, p.1303-1308, 2006] ou microdispositivos para mistura de soluções [Liu, A.L.; He, F.Y.; Wang, K.; Zhou, T.; Lu, Y.; Xia, X.H. Lab Chip, v.5, p.974-978, 2005] foi recentemente abordada na literatura. O esquema do processo

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12/26 de impressão direta está apresentado na Figura 1, que apresenta a preparação das estruturas com uma simples camada de toner (SCT), porém, também é possível projetar estruturas com uma dupla camada de toner (DCT). As etapas do processo de microfabricação para estruturas com SCT baseado na impressão direta são: (I) filme de poliéster; (II) filme de poliéster com uma camada de toner (a) depositada;

(III) alinhamento entre o esquema do dispositivo impresso no filme de poliéster com filme de poliéster sem toner perfurado (para acesso aos reservatórios); (IV) etapa de laminação e; (V) microdispositivo finalizado com reservatórios (b) colados (tubos de PVC ou a base de ponteiras de pipetadores de 100 μL).

[037] A primeira etapa do processo de fabricação, não apresentada na Figura, está relacionada com o preparo do desenho do dispositivo. A configuração do dispositivo foi desenhada, na escala de 1:1. O padrão foi impresso em um filme de poliéster (I) (modelo CG 3300, 3M, Sumaré-SP) usando uma impressora Laser (modelo LaserJet 2200d, Hewlett Packard). É importante salientar, neste ponto, que o uso de filmes de poliéster devidamente fabricados para uso em impressoras laser é de extrema importância para o sucesso na fabricação e conseqüentemente operação instrumental deste microdispositivo.

[038] A impressão foi realizada no modo otimizado, com resolução de 600 dpi operando no modo vetorial. Durante a impressão, uma camada de toner (II) (modelo Q4096A, Hewlett Packard) foi depositada pela impressora de modo a formar os microcanais. A espessura da camada de toner (~ 6 μm), representada pela coloração preta, define a altura dos microcanais obtidos e as regiões brancas representam os reservatórios e microcanais formados.

[039] A etapa de selagem dos microcanais fabricados pelo processo de impressão direta será apresentada adiante, como maiores detalhes, no qual será abordada a etapa de integração com os eletrodos microfabricados. Adicionalmente, para efeitos ilustrativos e para uma melhor compreensão do usuário, esta etapa está também inserida (genericamente) na Figura 1. Como o objetivo é a construção de estruturas com uma SCT, a selagem foi realizada contra um filme de poliéster padrão (limpo ou sem toner). No entanto, para ter acesso aos microcanais, orifícios foram feitos diretamente sobre o filme de poliéster (sem toner) com auxílio de um perfurador de papel adaptado (III). O uso de guias (ou marcas) facilita a etapa de perfuração dos locais apropriados para acesso aos microcanais. O padrão de imagem impresso e o filme de poliéster perfurado foram alinhados (III) e laminados (IV) juntos.

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13/26 [040] Após a laminação, tubos de PVC com 5 mm de comprimento e diâmetro externo de 7 mm foram colados (V) nos microdispositivos, com resina epóxi, de modo a formar reservatórios para as soluções, finalizando assim o processo de microfabricação. Além dos tubos de PVC, tubos de poli-etileno ou a base de ponteiras de pipetadores de 100 μL podem ser usados para o mesmo propósito. A etapa de colagem dos reservatórios deve ser feita com cuidado de modo a evitar o entupimento da extremidade dos microcanais com a resina utilizada.

[041] A Figura 2 apresenta duas imagens do microdispositivo projetado. Na Figura 2a está apresentado o esquema dos microcanais de injeção e de separação. O microcanal de separação é delimitado pelos pontos 1 e 4. Por sua vez, o microcanal de injeção é delimitado pelos pontos 2 e 3. A geometria do microcanal de injeção é de extrema importância para qualquer análise quantitativa, como será discutido adiante. A geometria utilizada para este sistema (de detecção) foi constituída de um duplo-T, como está destacado na Figura 2a. Na Figura 2b está apresentado o esquema dos microcanais com o posicionamento dos eletrodos (e1 e e2 - em detalhe) sobre o microcanal de separação (isolados do contato com o microcanal através da espessura do filme de poliéster).

Exemplo 2: Fabricação dos Eletrodos por litografia [042] Os microeletrodos foram fabricados combinando uma etapa fotolitográfica e uma etapa de deposição metálica, usando filmes de poliéster como substratos.

[043] O processo de microfabricação dos eletrodos está apresentado na Figura 3, onde: a barra em branco representa o filme de poliéster; em cinza, a camada de fotorresiste; e em preto, o material metálico depositado.

[044] O filme de poliéster, devido a sua flexibilidade, foi fixado em uma placa de vidro para dar maior rigidez facilitando a preparação dos eletrodos. O processo fotolitográfico se resume às etapas de escolha e limpeza do substrato, recobrimento com um material fotossensível (fotorresiste), fotogravação da imagem desejada através da incidência à radiação UV, revelação do padrão fotogravado e corrosão do material. Como a utilização deste processo se fez apenas para a fabricação de microeletrodos planares, a etapa de corrosão não foi necessária nesta etapa.

[045] Inicialmente, o substrato (filme de poliéster) foi submetido à uma etapa de limpeza (I). O substrato foi, então, revestido (II) com uma camada de

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14/26 fotorresiste positivo (Shipley S1811 - Shipley, Marlborough, MA, EUA). A configuração dos eletrodos, contida em uma máscara, foi transferida com exposição à radiação UV para o fotorresiste positivo (III) e, após a etapa de revelação (IV) uma camada metálica (Ti/Al) foi depositada via sputtering (V). A técnica de sputtering pode ser opcionalmente substituída por deposição de vapor químico. A camada de titânio (20 nm) foi depositada de modo a garantir uma melhor aderência da camada de alumínio (150 nm) com o substrato. Para evitar problemas de aderência do metal, antes da metalização os substratos foram submetidos a um plasma de oxigênio por 4 minutos com o objetivo de eliminar qualquer material orgânico. Ao remover o fotorresiste com acetona, os eletrodos foram facilmente obtidos (VI), desde que tenham aderido perfeitamente na superfície do substrato. A remoção da camada de fotorresiste e conseqüente obtenção dos eletrodos é denominada de lift-off. O alumínio (material usado na construção dos eletrodos) foi escolhido devido seu baixo custo comparado a outros materiais. No entanto, materiais como o ouro (Au), platina (Pt), paládio (Pd), carbono (C), cobre (Cu), prata (Ag), níquel (Ni) ou mesmo cromo (Cr) podem ser depositados através do mesmo procedimento. A fabricação de eletrodos de Au, Pt, C, Ni, Ag e Cr sobre filmes de poliéster é atrativa não só para aplicações em microchips de separação, mas também como biosensores descartáveis. Esta tecnologia poderia reduzir significativamente o custo dos protótipos utilizados para controle da taxa de glicose no sangue e outros diagnósticos clínicos, por exemplo,

Limpeza dos substratos

A etapa de limpeza dos substratos consistiu, inicialmente, no desengraxamento orgânico (acetona, metanol e 2-propanol) seguida pela lavagem com uma solução piranha H₂SO₄/H₂O₂ (2:1) durante 30 minutos. Esta etapa foi realizada de modo a remover os resíduos orgânicos e promover uma melhor aderência do fotorresiste com o substrato. Após cada uma das etapas utilizando solução ácida, as amostras foram lavadas, em abundância, com água deionizada e secas com nitrogênio ultra-puro.

Spinning

O recobrimento dos substratos com material fotossensível foi efetuado através do uso de um spinner. O spinner é um dispositivo mecânico utilizado para espalhar soluções viscosas de uma maneira uniforme resultando em um filme ultraPetição 870170085429, de 06/11/2017, pág. 24/47

15/26 fino. Este dispositivo opera a uma alta rotação, está acoplado a um sistema de vácuo e a espessura dos filmes é determinada de acordo com uma curva de calibração do material. O tempo de spinning depende da característica do material sensível à radiação e também da espessura desejada. Nos experimentos realizados foi utilizado o fotorresiste positivo S1811, o qual possui uma transparência ótica baixa que faz dele idealmente apropriado para filmes finos. A etapa de spinning foi realizada a 4000 rpm durante 30 s, obtendo uma espessura de aproximadamente 1 μm.

Fotogravação

Após o espalhamento do fotorresiste foi realizada a etapa de pré-bake antes da etapa de fotogravação. A amostra foi colocada sobre uma chapa aquecedora a 65 °C durante 5 min e em seguida em outra chapa aquecedora a 95 °C durante 15 min. A amostra foi colocada novamente na chapa aquecedora a 65 °C durante outros 5 min. Este procedimento ajuda a reduzir o stress térmico. O tempo de pré-bake está diretamente relacionado com a eliminação do solvente contido no fotorresiste. Uma vez retiradas da chapa aquecedora, as amostras ficaram em repouso por 10 min antes de serem exposta à radiação UV. O tempo de exposição está diretamente relacionado com a espessura e o tempo de pré-bake, ao qual o fotorresiste foi exposto. Nos experimentos realizados utilizou-se a Alinhadora Karl Suss MJB 3 UV300. Para uma potência de 10 mW/cm² foi utilizado um tempo de exposição de 9 s.

Revelação

Como o S1811 é uma resina termo-ativada, após o processo de exposição, a amostra foi submetida a um tratamento térmico em uma chapa aquecedora a 95 °C, durante 15 min. A amostras ficaram em repouso por 10 min antes de iniciar a etapa de revelação. A etapa de revelação é necessária para remover o fotorresiste que recebeu radiação, pois sendo um fotorresiste positivo, as regiões irradiadas com radiação UV tornam-se solúveis em solvente orgânico e podem ser removidas facilmente. As áreas não irradiadas permanecem intactas (polimerizadas).

[046] Foi utilizado o revelador AZ 351, o qual foi colocado em um béquer sob agitação magnética a temperatura ambiente. A amostra foi fixada em um portaPetição 870170085429, de 06/11/2017, pág. 25/47

16/26 amostra giratório para melhorar a uniformidade do processo. O tempo de revelação utilizado foi igual a 20 s. Após a revelação, o substrato contendo a configuração dos eletrodos foi então lavado com água deionizada e seco com N₂.

[047] Com a finalidade de reduzir o stress intrínseco do S1811 ao final do processo de fotogravação foi realizada outra etapa de pós-bake (95 °C por 15 min). Após esta etapa, o processo de fotogravação da configuração dos eletrodos estava finalizado.

[048] O uso deste processo para a construção de eletrodos planares possibilita a projeção e a avaliação de diferentes geometrias, ou mesmo a projeção de um arranjo de eletrodos. Estes fatores representam vantagens adicionais frente ao uso de eletrodos preparados com fitas adesivas de Cu. A Figura 4 apresenta exemplos de diferentes geometrias.

Exemplo 3: Fabricação dos Eletrodos por impressão direta [049] O processo litográfico para a fabricação dos eletrodos pode ser opcionalmente substituído pelo processo de impressão direta, similarmente ao processo de fabricação dos microcanais. Neste caso, o esquema impresso define a área dos eletrodos que são formados com deposição via sputtering. Após a deposição metálica, o toner é facilmente removido com uso de acetona ou acetonitrila. Esta alternativa permite a fabricação de máscaras para a fabricação de eletrodos em questão de minutos sem a necessidade de toda a infra-estrutura para as etapas fotolitográficas. Em termos comparativos, a produção das máscaras através do processo convencional (fotolitografia) requer entre 2 e 3 horas, enquanto o processo de impressão direta requer apenas 5-10 minutos.

Exemplo 4: Integração dos eletrodos/microcanais [050] Como já mencionado, a selagem dos microcanais fabricados em poliéster-toner foi feita através de uma etapa de laminação térmica, usando uma plastificadora de documentos da marca Gazela modelo AC91 230. Em geral, os processos de selagem de microchips de vidro, por exemplo, envolvem altas temperaturas (500-700 ^oC), são lentos, dispendiosos e requerem ambiente completamente limpo (cleanroom) dependendo do tipo de material que é utilizado. Adicionalmente, o uso de

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17/26 elevadas temperaturas pode danificar o material condutor durante sua integração, inutilizando o dispositivo.

[051] Na selagem via laminação térmica o substrato contendo os microcanais impressos e o substrato contendo os eletrodos microfabricados foram alinhados e laminados juntos a 120 °C e a 40 cm min^-1, conforme visualizado na Figura 1. Nesta temperatura, ocorre a fusão entre a camada de toner e o filme de poliéster, promovendo uma efetiva vedação dos microcanais, sem danificação dos eletrodos.

[052] Durante a etapa de laminação, a face do filme de poliéster contendo os eletrodos foi cuidadosamente colocada de modo a ficar sem contato com o microcanal, ou seja, os eletrodos ficaram isolados do microcanal pela própria espessura do filme de poliéster (~ 100 pm). A laminação não provoca nenhum tipo de dano aos eletrodos aderidos. Uma das grandes vantagens do uso da laminação térmica para integrar os microeletrodos aos microcanais fabricados em poliéster-toner é que há a possibilidade de utilização destes eletrodos para outros modos de detecção eletroquímicos. Eletrodos para detecção amperométrica e suas derivações, condutométrica com contato, voltamétrica ou potenciométrica podem ser perfeitamente fabricados sobre o filme de poliéster e integrados com os microcanais. Como neste caso os modos de detecção citados requerem contato com a solução, basta posicionar a face dos eletrodos em contato com o microcanal, antes da laminação.

[053] A idealização destes microchips com eletrodos integrados torna possível a produção em massa destes protótipos, sem perder a precisão no posicionamento dos eletrodos. Além disso, a projeção de diferentes geometrias bem como a fabricação de arranjo de eletrodos em série enriquece, conforme visualizado na Figura 4, a consolidação deste processo. O custo destes microchips integrados foi calculado com base nos valores de mercado dos filmes de poliéster, cartuchos de toner e alvos de alumínio. A estimativa é de que cada protótipo custe, no máximo, R$ 0,20 (vinte centavos de real). Para efeitos comparativos, microchips integrados, fabricados em vidro, custam em torno de € 500 (quinhentos euros) cada

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18/26 unidade (segundo cotação realizada recentemente junto a Micronit Microcfluidics).

[054] Além da simplicidade, rapidez e o baixo custo dos protótipos fabricados, outra grande vantagem é que muitos dispositivos podem ser fabricados em paralelo em todas as etapas envolvidas. Na projeção dos microcanais, desde que uma folha tamanho carta ou A4 seja usada, dezenas de microestruturas podem ser impressas em uma única folha. De maneira análoga, dezenas de substratos podem ser submetidos em paralelo para deposição metálica (via sputtering), dependendo do tamanho da câmara de deposição. Na etapa de laminação, última etapa envolvida na fabricação destes protótipos, dependendo do tamanho da plastificadora, vários microchips podem ser laminados também em paralelo.

[055] Estas vantagens estimulam a produção em massa, reduzem o custo unitário e também o tempo de fabricação. Além disso, a invenção passa a ser industrializável e sua construção não fica dependente da habilidade técnica do usuário para o posicionamento dos eletrodos de forma manual, ou artesanal.

[056] A Figura 5 representa um esquema simplificado do processo de microfabricação utilizado na presente invenção, onde (A) fabricação dos microcanais através do processo de impressão direta; (B) preparação dos eletrodos sobre o filme de poliéster (face superior); (C) alinhamento do filme de poliéster perfurado (contendo os eletrodos) e o filme de poliéster com os microcanais impressos antes da etapa de laminação; 1: filmes de poliéster; 2: microcanais impressos sobre o filme de poliéster; 3: eletrodos microfabricados sobre o filme de poliéster; e (a) filme de poliéster; (b) microcanais impressos; (c) filme de poliéster; (d) eletrodos microfabricados; (e) filme de poliéster perfurado; (f) microcanais impressos.

[057] As Figuras 6A e 6B apresentam um esquema do microdispositivo fabricado em poliéster-toner, onde: I, microcanal para introdução da amostra; II, microcanal de separação analítica. 1, 2, 3 e 4 representam os reservatórios para amostra, tampão, descarte da amostra e destarte do tampão, respectivamente. Os eletrodos para conexão com o

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19/26 gerador de sinais e com o circuito do detector estão representados por 5 e 6, respectivamente.

Exemplo 5: Detecção Condutométrica sem Contato [058] O esquema [Fracassi da Silva, J.A.; Guzman, N.; do Lago, C.L. J. Chromatogr. A, v.942, p.249-255, 2002] de funcionamento do detector condutométrico sem contato está ilustrado no diagrama de blocos da Figura 7. A um dos microeletrodos planares é aplicado um sinal alternado de alta freqüência usando um gerador de sinal. Ao aplicar esse sinal é gerada uma corrente, a qual é transmitida pelo conversor corrente/tensão (i/e) refletindo todos os possíveis caminhos percorridos pelo sinal. Uma vez que os parâmetros geométricos da cela de detecção sejam mantidos constantes, a variação de corrente obtida reflete diretamente às variações de composição da solução no interior do microcanal. Deste modo, quanto menor a resistência da solução, ou seja, maior a condutância, maior será a corrente registrada.

[059] Após a transformação do sinal de corrente em tensão, pelo conversor i/e, segue-se a retificação do sinal em meia-onda. O sinal resultante é filtrado em um filtro RC (passa-baixas) e finalmente passa por uma etapa de amplificação e compensação da linha de base (Vos). O sinal DC resultante (Vs) é aplicado diretamente à entrada da interface serial, usada para a aquisição de dados em sistema operacional, preferencialmente Linux (distribuição Slacker).

[060] A corrente medida pelo circuito eletrônico reflete a impedância total do sistema. A impedância, por sua vez, é a combinação das reatâncias capacitivas da parece do capilar (X_w), intereletrodos (X_o) e a resistência da solução (R_s), e é melhor expressa em termos do inverso da impedância complexa: a admitância complexa (Y):

Y = G + jB =

R_, Λ² + Xw (Xo + Xw) + J

R_s + Xw

Xo (Rs² + Xw²) (Eq. 5) [061] A parte real da admitância é chamada de condutância (G), e não deve ser confundida com a condutância da solução no interior do canal. À parte imaginária, dá-se o nome de susceptância (B). O módulo da admitância, que é proporcional à corrente medida, é dado por:

\R ² X_o ² + R² + Xw (Xo + Xw )f

Xo (Rs² + Xw²) (Eq. 6)

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20/26 [062] Ao trabalhar com valores fixos de freqüência de operação, mantendo a geometria da cela oscilométrica e ignorando as variações de capacitância (ou mais corretamente de constante dielétrica) influenciadas pela temperatura, as variações na admitância Y serão devidas às variações na condutividade na solução. Gerador de sinal [063] O sinal de excitação para o circuito do C⁴D foi gerado a partir de um gerador de funções MFG 4202 (Minipa, São Paulo, SP). O gerador digital é capaz de gerar formas de onda senoidal, quadrada e triangular na faixa de freqüência de 0,2 Hz a 2 MHz, com ajuste de amplitude (tensão máxima de 20 V_pp) e simetria da onda, visores digitais com 5 dígitos para freqüência e 3 dígitos para amplitude e impedância de saída de 50 Ω.

Circuito eletrônico [064] O circuito do detector, mostrado nas Figuras 8 e 9, foi montado em dois módulos, conforme visualizado na Figura 7. No primeiro módulo (Figura 8) , a cela de detecção, o estágio de conversão corrente/tensão (i/e), o retificador e o filtro RC foram colocados em uma única placa utilizando-se a tecnologia de montagem em superfície (SMD, surface mounted devices). Uma blindagem (caixa de alumínio e PDMS) foi colocada em torno desta para minimizar a captação de ruído. No segundo módulo (Figura 9), foram colocados os estágios finais de amplificação e compensação da linha base, bem como a fonte de alimentação do circuito.

Exemplo 6: Sistema de aquisição de dados [065] O sistema de aquisição de dados foi desenvolvido usando uma porta serial RS232 como interface. Todo o desenvolvimento foi feito no sistema operacional Linux e o software foi programado através do Borland Kylix 3 utilizandose as linguagens C e C++. O software desenvolvido foi nomeado de MICSENS. Todo o sistema é controlado através de um microcomputador Pentium 233 MHz, 32 Mb de memória RAM e HD de 4,0 Gb. O sistema desenvolvido para aquisição de dados do C⁴D foi também foi programado, com auxílio de uma microcontroladora, para controlar os potenciais elétricos aplicados pela fonte de alta tensão. Com isso, os potenciais para introdução e separação da amostra dentro dos microcanais foram aplicados de maneira automatizada.

Exemplo 7: Aplicabilidade [066] A aplicabilidade destes microdispositivos com eletrodos integrados, e completamente descartáveis, foi avaliada com separações eletroforéticas de uma mistura de cátions inorgânicos (K+, Na+ e Li+). Embora diferentes geometrias

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21/26 tenham sido projetadas, apenas os resultados de uma delas serão apresentados. O microssistema utilizado consistiu de dois eletrodos (largura de 750 μm) para detecção, configurados na direção anti-paralela, espaçados por 750 μm e posicionados a 5 mm do reservatório de descarte do tampão.

[067] Inicialmente, os canais foram preenchidos com solução (MES/His 20 mmol L'¹, pH 6,0) através do fenômeno de capilaridade. Após o preenchimento, um potencial de 1,0 kV foi aplicado momentaneamente ao microcanal de separação até estabilização da linha de base. Em seguida, otimizaram-se as condições de detecção (sinal de saída em função da freqüência e amplitude da onda senoidal aplicada) antes de iniciar os experimentos eletroforéticos. A Figura 10 apresenta algumas curvas do sinal dc em função da freqüência e da amplitude da onda senoidal, parâmetros que podem ser otimizados em cada sistema.

[068] O valor absoluto da linha de base (V_dc) foi monitorado, por aproximadamente 60 s, com o canal preenchido com o eletrólito de corrida. Os experimentos foram realizados numa faixa de freqüência de 100 a 900 kHz e com uma faixa de amplitude de 1-10 V_pp. A Figura 10a mostra o sinal da linha de base como função da freqüência de operação para diferentes amplitudes. O sinal da linha de base em função da amplitude da onda senoidal, para diferentes freqüências, está apresentado na Figura 10b.

[069] Como se pode observar na Figura 10a, para cada valor de amplitude há uma resposta máxima indicando sua melhor freqüência de operação. Este ponto é deslocado para menores freqüências quando a amplitude da onda senoidal é aumentada. Quando observado o sinal de resposta em função da amplitude (Figura 10b) observa-se uma dependência linear para baixas amplitudes. Para a curva construída na freqüência de 400 kHz, a linearidade é observada até aproximadamente 8 Vpp. Esta dependência linear é reduzida para freqüências maiores. Em resumo, ambas as figuras mostram que para uma onda de amplitude igual a 10 Vpp a freqüência de 400 kHz é a melhor escolha. Logo, para os demais experimentos estas condições foram escolhidas como condições padrão. Nestas condições iniciaram-se os experimentos eletroforéticos.

[070] Para os experimentos eletroforéticos, há a necessidade de um controle eletrocinético nos microcanais. A Figura 11 apresenta um esquema do sistema operacional. Na Figura 11A está representada a configuração dos microdispositivos. A configuração é constituída, basicamente, de dois microcanais para introdução da amostra (I) e separação analítica (II). No microcanal de injeção,

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22/26 configurado na forma de um duplo-T, os pontos 1 e 3 indicam os reservatórios da amostra e de descarte da amostra, respectivamente. Por outro lado, os pontos 2 e 4, no canal de separação indicam os reservatórios para o tampão de corrida e o de descarte do tampão, respectivamente. O ponto (III), em destaque, representa a região onde os eletrodos de detecção são posicionados.

[071] As separações eletroforéticas foram realizadas após a estabilização da linha de base. A amostra, adicionada no reservatório 1 (ver Figura 11B), foi introduzida eletrocineticamente sob a aplicação de uma diferença de potencial de 1,0 kV/10 s entre os reservatórios 1 e 3. Após este tempo (10 s) todo o microcanal de injeção é preenchido com amostra (ver Figura 11C). O plug da amostra, definido pela geometria em forma de duplo-T, foi deslocado na direção do detector ao aplicar a diferença de potencial entre os reservatórios 2 e 4 (ver Figura 11D). Dessa maneira, os analitos são separados de acordo com sua mobilidade eletroforética e detectados com o C⁴D. O volume correspondente ao plug de injeção, definido geometricamente pelo duplo-T, é igual a 270 pL nesta geometria). Na Figura 11D, os pontos indicados por e1 e e2 indicam os eletrodos que são conectados ao gerador de sinais e ao circuito eletrônico, respectivamente.

[072] Para uma melhor visualização do controle eletrocinético nos microcanais, a Figura 12 mostra uma seqüência de imagens capturadas, em tempo real, de modo a apresentar o fenômeno eletrocinético nas etapas de preenchimento do canal de injeção e introdução do plug da amostra no microcanal de separação. Estas imagens foram capturadas com auxílio de um microscópio óptico equipado com uma câmera CCD (charge coupled device). Para estes experimentos, uma solução 20 mmol L^-1 de fosfato de potássio, pH 7,0, foi utilizada como solução eletrolítica. Para a visualização das imagens, 20 mg do corante azul de metileno foram dissolvidos em 1 mL da solução eletrolítica. As imagens A, B e C foram capturadas após 1, 5 e 10 s, respectivamente, sob aplicação de um potencial elétrico no canal de injeção. As imagens D, E e F foram capturadas após 1, 3 e 5 s, respectivamente sob aplicação de potencial elétrico no canal de separação. O controle eletrocinético foi realizado conforme apresentado na Figura 11. O potencial aplicado, em ambas as etapas, foi igual a 1,0 kV.

[073] Com estes parâmetros pré-determinados, realizou-se a separação eletroforética da mistura dos cátions inorgânicos (K⁺, Na⁺ e Li⁺) como eletrólito, sob aplicação de um campo elétrico igual a 250 V cm^-1, usando o tampão MES/His 20 mmol L^-1, pH 6,0, injeção de 1,0 kV/10 s, campo elétrico de 250 V cm^-1,

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23/26 freqüência de operação de 400 kHz, 10 V_pp, e um dos eletroferogramas resultantes está apresentado na Figura 13. Apesar de apresentar um baixo custo de produção por unidade mais de 50 eletroferogramas foram registrados usando um único protótipo. No eletroferograma apresentado, a mistura equimolar dos cátions foi preparada numa concentração igual a 25 μmol L^-1. Pode-se observar que os três analitos foram eficientemente separados em, aproximadamente, 75 s. Para o eletroferograma apresentado a resolução entre os picos do K+ e Na+ foi igual a 1,7 e entre os picos do Na+ e Li+ foi igual a 1,4.

[074] Embora em eletroforese convencional a introdução da amostra seja realizada por ações eletrocinéticas e/ou hidrodinâmicas, em sistemas miniaturizados esta etapa se faz principalmente por processos eletrocinéticos [Chen, G.; Wang, J. Analyst, v. 129, p.507-511, 2004; Fang, Q. Anal. Bioanal. Chem., v.378, p.49-51, 2004], embora já existam alguns trabalhos com injeção hidrodinâmica [Backofen, U.; Matysik, F-M.; Lunte, C.E. Anal. Chem., v.74, p.40544059, 2002; Solignac, D.; Gijs, M.A.M. Anal. Chem., v.75, p.1652-1657, 2003]. O sistema de introdução da amostra é uma das etapas mais importantes do processamento analítico desenvolvido em dispositivos microfluídicos. Tal importância se deve ao fato de que as características do plug de amostra, formado pela intersecção dos canais, determinarão a qualidade da separação analítica. Além disso, para um estudo quantitativo há a necessidade de uma boa repetibilidade das injeções. Este é um ponto crítico e problemas relacionados à repetibilidade da injeção eletrocinética têm sido observados [de Jesus, D.P.; BritoNeto, J.G., do Lago, C.L.; In: 13° Encontro Anual de Química Analítica. Livro de Resumos. Niterói, 2005. ref.H-057].

[075] Diferentes alternativas foram estudadas de modo a avaliar qual era a melhor metodologia para realizar a etapa de injeção eletrocinética nos microchips. A alternativa que forneceu resultados satisfatórios consistiu de uma etapa de limpeza (clean-up) com o próprio tampão de corrida (MES/His 20 mmol L'¹, pH 6,0) entre as subseqüentes injeções. Em outras palavras, após cada separação eletroforética realizada o canal de injeção era limpo com solução tampão. A etapa de limpeza foi monitorada com o sinal do C⁴D e também pela corrente eletroforética nos microcanais. Com esse procedimento, uma série de 10 injeções foi realizada com a etapa de limpeza e outra série de 10 injeções foi realizada sem a etapa de limpeza para comparação dos resultados. O analito utilizado, em ambas as séries, foi o K+ na concentração de 75 μmol L^-1, o qual apresenta alta mobilidade

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24/26 eletroforética e é facilmente detectado com o C⁴D. O plug de injeção, definido pela geometria dos microcanais, foi de apenas 270 pL (V = 150 χ 300 χ 6 μm³).

[076] Os resultados de ambas as séries estão apresentados na Figura 14. Como pode ser visualizada na Figura 14A, a série de injeções sem a etapa de limpeza apresenta um decréscimo na altura do pico para as primeiras injeções. O desvio padrão relativo (RSD) para a seqüência apresentada foi de aproximadamente 30%. Este decréscimo está relacionado com a formação de um sample stacking no canal de injeção resultando em regiões com diferentes concentrações do analito, e enquanto o plug não ser mobilizado completamente pelo canal o sinal decresce até seu patamar basal.

[077] A partir dos dados referentes às simulações ficou claro que se as injeções fossem realizadas sob as mesmas condições, os resultados seriam diferentes. Com a adição da etapa de limpeza, entre as subseqüentes injeções, não foi observado o mesmo decréscimo na altura dos picos (Figura 14B). O clean-up não elimina a presença do fenômeno, apenas permite que o plug de amostra seja introduzido nos microcanais sempre sob as mesmas condições. O RSD para esta nova seqüência foi inferior a 5%.

[078] O sucesso obtido na repetibilidade da injeção eletrocinética nos microcanais possibilitou realizar um primeiro ensaio quantitativo nos microchips caseiros completamente descartáveis. A Figura 13 apresenta um eletroferograma típico para uma mistura de K+, Na+ e Li+ na concentração de 25 μmol L^-1 cada e a Figura 15 apresenta uma seqüência de eletroferogramas obtidos em diferentes concentrações (Fig. 15A, onde: (a) 25, (b) 50, (c) 75 e (d) 100 μmol L^-1) e também as curvas analíticas para os cátions analisados (Fig. 15B). Os coeficientes de correlação para o K+, Na+ e Li+ foram 0,9985, 0,9976 e 0,9926, respectivamente. A sensibilidade obtida foi de 9,55 (K+), 8,51 (Na+) e (Li+) mV/pmol L^-1. A estimativa dos limites de detecção (LD), considerando a razão sinal/ruído igual a 3, foi igual a 3, 4 e 7 μmol L^-1 para o K+, Na+ e Li+, respectivamente.

[079] Os LD's obtidos para os três cátions em nosso sistema são maiores que os obtidos no sistema de C⁴D com HV [Tanyanyiwa, J.; Hauser, P.C. Anal.Chem., v.74, p.6378-6382, 2002; Tanyanyiwa, J.; Abad-Villar, E.M.; Fernández-Abedul, T.F.; Costa-Garcia, A.; Hoffmann, W.; Guber, A.E.; Gerlach, A.; Hauser, P.C. Analyst, v.128, p.1019-1024, 2003], e são também maiores do que aqueles apresentados por Pumera e colaboradores [Pumera, M.; Wang, J.; Opekar, F.; Jelínek, I.; Feldman, J.; Lowe, H.; Hardt, S. Anal. Chem., v.74, p.1968-1971,

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2002]. No entanto, os LD's de nosso sistema são comparáveis com os LD's encontrados para um sistema com a geometria dos eletrodos otimizada [Kubán, P.; Hauser, P.C. Lab Chip, v.5, p.407-415, 2005] e ainda menores do aqueles encontrados com eletrodos microfabricados [Laugere, F.; Guijt, R.M.; Bastemeijer, J.; Steen, G.V.D.; Berthold, A.; Baltussen, E.; Sarro, P.; van Dedem, G.W.K.; Vellekoop, M. Anal. Chem., v.75, p.306-310, 2003; Guijt, R.M.; Baltussen, E.; van der Steen, G.; Frank, H.; Billiet, H.; Schalkhammer, T.; Laugere, F.; Vellekoop, M.; Berthold, A.; Sarro, L.; van Dedem, G.W.K. Electrophoresis, v.22, p.2537-2541, 200; Lichtenberg, J.; Rooiji, N.F.; Verpoorte, E. Electrophoresis, v.23, p.37693776, 2002]. Esse estudo analítico é de extrema importância de modo a estabelecer um método confiável para realizar análises validadas e certificadas.

[080] Para um total de 10 injeções realizadas seqüencialmente, o tempo de migração médio para os cátions K+, Na+ e Li+ foi igual a 37 ± 1, 56 ± 1 e 72 ± 2 s, respectivamente. A eficiência da separação obtida foi calculada em número de pratos. Os valores obtidos para o Li+, Na+ e K+ foram de aproximadamente 18800, 7800 e 11250 pratos/m, respectivamente. Esses valores foram calculados de acordo com a equação 7, considerando t_m, o tempo de migração do analito até o detector e w, a largura da base do pico:

N = 1óf 3^} (Eq. 7) [081] O valor teórico para a eficiência, ou a eficiência esperada para a separação, é igual a 2,30*10⁵ pratos/m. O valor teórico foi calculado conforme a equação 8, sendo que L_ef e L_pUg representam, respectivamente, o comprimento efetivo do canal de separação (3,4 cm) e o comprimento do plug de amostra definido na geometria de duplo-T (300 μm):

N_T = 16 ef < ^Lplug J (Eq. 8) [082] Dividindo os valores referentes à eficiência experimental obtida e o valor teórico, os valores encontrados foram 8,2, 3,4 e 4,9 %. Esses valores são bem superiores aos valores obtidos para a separação amperométrica nos microdispositivos de poliéster-toner [Coltro, W.K.T.; Fracassi da Silva, J.A.; Silva, H.D.T.; Richter, E.M.; Furlan, R.; Angnes, L.; do Lago, C.L.; Mazo, L.H., Carrilho, E. Electrophoresis, v.25, p.3832-3838, 2004]. A diferença (superior a 10 %) deve-se ao fato da detecção oscilométrica ser realizada no canal de separação, ou seja,

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26/26 sobre o canal (on channel). Especialmente no caso da detecção amperométrica, o eletrodo de trabalho foi posicionado na saída do canal de separação (end-channel). No modo de detecção on-channel não há alargamento de banda referente à dispersão na saída do canal, como observado na DA.

[083] Uma comparação direta entre os resultados obtidos com nossos microchips e aqueles publicados pelos grupos de Wang e Hauser torna-se difícil devido uma série de fatores. Ambos os grupos utilizam microchips comerciais fabricados em vidro ou em PMMA, os quais possuem excelente definição e resolução dos canais. Por outro lado, nossos microchips são fabricados sem “ambiente limpo” e a definição dos canais é completamente dependente da resolução da impressora laser utilizada. Por este fator, a largura e a altura dos microcanais representam as limitações deste processo. A largura considerada “limite” é igual a 150 μm. Com relação à altura, é possível construir microcanais com 6 ou 12 μm. No processo apresentado neste pedido de patente, a fabricação de microcanais com 6 μm de altura foi adotada, na qual uma simples camada de toner foi depositada sobre o filme de poliéster. A fabricação de microcanais com 12 μm de altura podem ser fabricados usando uma dupla camada de toner. Além das desvantagens relacionadas à definição e à resolução dos microcanais, nós acreditamos que os microchips fabricados em poliéster-toner possuem um alto potencial como microchips de análises portáteis e descartáveis para o monitoramento do meio ambiente, diagnósticos clínicos, análises químicas, forenses, de defesa nacional, alimentícias, combustíveis, dentre outras.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Microdispositivo multicamada que compreende superfície contendo microcanais de toner, eletrodos para detecção, caracterizado pelo fato de apresentar microcanais com altura preferencial entre 6 e 12 μm arranjados sobre a superfície (i) de modo a criarem uma matriz tridimensional de canais e permitir uma variedade de operações analíticas, pelo menos dois eletrodos fabricados por litografia ou máscara de toner e integrados à superfície (ii) e pelo menos 2 reservatórios para detecção com diferentes geometrias e posicionamentos, os quais são constituídos de material condutor, preferencialmente alumínio, de forma a possibilitar sua aderência sobre o substrato, escolhido entre titânio ou cromo, preferencialmente, titânio.
2. Microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de o material que constitui os microcanais poder ser escolhido entre toner, toner em diferentes colorações, toner com materiais nanoparticulados magnetizados, materiais nanoparticulados termoplásticos, compósitos poliméricos e ferromagnéticos.
3. Microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo fato de o toner poder ser de impressoras ou fotocopiadoras.
4. Microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de o material que constitui as superfícies (i) e (ii) poder ser escolhido entre vidro, poliéster, PMMA, PC, quartzo, silício.
5. Microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 4 caracterizado pelo fato de o material que constitui as superfícies (i) e (ii) ser poliéster.
6. Microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de o material condutor preferencial ser escolhido entre alumínio, ouro, platina, paládio, carbono cobre, titânio, cromo, níquel ou prata.
7. Microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de os eletrodos integrados poderem ser utilizados para detecção com ou sem contato com os microcanais.
8. Microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de apresentarem preferencialmente, quatro reservatórios.
9. Microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de o material que constitui os reservatórios poder ser escolhido entre PVC, polietileno ou qualquer outro material dúctil, maleável e inerte.
10. Processo de preparação de microdispositivo multicamada, conforme definido nas reivindicações 1 a 9, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

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2/3 (a) preparação da superfície (i) contendo microcanais, preferencialmente, por impressão direta;

(b) preparação da superfície (ii) contendo eletrodos integrados, fabricados por litografia ou máscara de toner;

(c) integração das superfícies (i) e (ii);

(d) inserção de reservatórios no microdispositivo obtidos nas etapas (a) - (c).
11. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de os microcanais preparados na etapa (a) poderem ser obtidos por processo de corrosão, moldagem, prensagem, impressão ou litografia ou processos derivados destes.
12. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de o material utilizado na formação dos microcanais poder ser escolhido entre toner, toner em diferentes colorações, toner com materiais nanoparticulados magnetizados, materiais nanoparticulados termoplásticos, compósitos poliméricos e ferromagnéticos, preferencialmente, toner.
13. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de os microcanais poderem ser arranjados para criar matriz tridimensional de canais, os quais podem permitir grande variedade de operações analíticas como diluições, reações, concentração, dentre outras.
14. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de o material que constitui as superfícies (i) e (ii) poder ser escolhido entre vidro, poliéster, PMMA, PC, quartzo, silício; preferencialmente, poliéster.
15. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de os eletrodos poderem ser fabricados usando máscaras de toner.
16. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de o processo de litografia compreender as seguintes etapas:

i. recobrimento do substrato com material fotossensível;

ii. fotogravação da imagem desejada;

iii. revelação;

iv. deposição de camada contendo material condutor para formação dos eletrodos;

v. remoção do material fotossensível.

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17. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 16 caracterizado pelo fato de o processo de litografia compreender, opcionalmente, etapa anterior à etapa (i) de limpeza do substrato.
18. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 16 caracterizado pelo fato de o processo de litografia compreender, opcionalmente, etapas intermediárias para redução de stress térmico do material fotossensível.
19. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de os eletrodos poderem apresentar diferentes geometrias e posicionamentos.
20. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de os eletrodos serem constituídos de material condutor escolhido entre alumínio, ouro, platina, paládio, carbono, cobre, titânio, prata, níquel ou cromo.
21. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 20 caracterizado pelo fato de o material condutor ser alumínio.
22. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de os eletrodos serem constituídos, opcionalmente, de material que possibilita melhor aderência da camada de material condutor sobre o substrato.
23. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 22 caracterizado pelo fato de o material que possibilita melhor aderência da camada de material condutor sobre o substrato poder ser escolhido entre titânio ou cromo; preferencialmente, emprega-se titânio.
24. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de a etapa (c) poder ocorrer por processo de laminação térmica.
25. Processo de preparação de microdispositivo multicamada de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de a superfície (ii) poder ser posicionada com ou sem contato com os microcanais.

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Canais ,

X X *

FIGURA 2

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2/13

ΙΗ ι Η ι ΙΗ

FIGURA 3

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3/13

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4/13

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5/13

FIGURA 6

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6/13

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7/13

FIGURA 8

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100 nF

PT1 Y ♦—ο Λ

D/A ‘/2 OPA2604AP

300 kO

10 kO

PTAO ΐ

100 nF

10 kO l·

10 kn

Interface serial ‘/2 OPA2604AP

28 kO +12 V

TI

PI 1 kíl

BZX79C4V7

8/13

220 kíl 10 kíl

FIGURA 9

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9/13

Freqüência (kHz) 2,0 V ▲ 4,0 V • 10 V

V (V) pp ' '

FIGURA 10

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10/13

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11/13

FIGURA 12

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Altura do Pico (V)

Injeções Seqüenciais Injeções Seqüenciais

FIGURA 14

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FIGURA 15

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