[go: up one dir, main page]

BRPI0709737A2 - processo para concentraÇço de um polipeptÍdeo - Google Patents

processo para concentraÇço de um polipeptÍdeo Download PDF

Info

Publication number
BRPI0709737A2
BRPI0709737A2 BRPI0709737-9A BRPI0709737A BRPI0709737A2 BR PI0709737 A2 BRPI0709737 A2 BR PI0709737A2 BR PI0709737 A BRPI0709737 A BR PI0709737A BR PI0709737 A2 BRPI0709737 A2 BR PI0709737A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
gly
polypeptide
wing
leu
pro
Prior art date
Application number
BRPI0709737-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Stefan Nilsson
Original Assignee
Zymenex As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymenex As filed Critical Zymenex As
Publication of BRPI0709737A2 publication Critical patent/BRPI0709737A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01061—Hydroxymethylbilane synthase (2.5.1.61)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06001—Arylsulfatase (3.1.6.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01024—Alpha-mannosidase (3.2.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01046—Galactosylceramidase (3.2.1.46)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06008—Cerebroside-sulfatase (3.1.6.8)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

<B>PROCESSO PARA CONCENTRAÇçO DE UM POLIPEPTIDEO<D>A presente invenção refere-se a um método de concentração de uma composição compreendendo um polipeptídeo de interesse e o uso de tal composição concentrada para o tratamento de doenças em mamíferos,em particular através de injeção subcutânea.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOPARA CONCENTRAÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método para concentraçãode um polipeptídeo de interesse, ao uso de uma composição compreenden-do um polipeptídeo de interesse concentrado como um medicamento parainjeção subcutânea e a uma composição compreendendo pelo menos 10mg/ml de polipeptídeo de interesse.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Alguns polipeptídeos são úteis como um medicamento para aprevenção e/ou tratamento de certas doenças. A habilidade em injetar ummedicamento subcutaneamente é uma vantagem uma vez que fica fácil paraos pacientes administrarem a medicação sozinhos.
Como há restrições fisiológicas em quão grande um volume épossível injetar subcutaneamente. Então é uma vantagem para medicamen-tos que devem ser administrados subcutaneamente que eles estejam dispo-níveis em uma alta concentração de modo a assegurar que o paciente rece-ba uma quantidade adequada do medicamento e/ou para evitar injeçõessubcutâneas múltiplas.
O WO 99/37325 descreve métodos de tratamento e prevençãode doença causada por ausência ou deficiência da atividade de enzimas per-tencentes ao curso biossintético do heme. O WO 03/002731 descreve umprocesso para purificação de porfobilinogênio desaminase recombinante emuma escala industrial e ao uso do produto purificado para a preparação deum medicamento. Similarmente, o WO 02/099092 e o WO 2005/094874 pro-vêem alfa-manosidase Iisossomal e seu uso terapêutico. Finalmente, o WO2005/073367 provê um processo para purificação de aril sulfatase A e usoda enzima no tratamento de Ieucodistrofia metacromática.
A presente invenção refere-se a um método para concentraçãode um polipeptídeo de interesse e ao uso de uma composição compreen-dendo um polipeptídeo de interesse concentrado para a fabricação de ummedicamento para injeção subcutânea em mamífero.SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se em um aspecto a um método deconcentração de uma composição compreendendo um polipeptídeo de inte-resse compreendendo:
a) Centrifugação e/ou filtragem de uma composição compreen-dendo um polipeptídeo de interesse
b) Concentração do sobrenadante ou retentato, respectivamen-te, obtido da etapa a).
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma compo-sição compreendendo pelo menos 10 mg/ml de polipeptídeo de interesse.
Em ainda outro aspecto a presente invenção refere-se ao uso deuma composição compreendendo 75-250 mg/ml de polipeptídeo de interes-se para a fabricação de um medicamento para injeção subcutânea em ummamífero.
Em ainda outro aspecto a presente invenção refere-se a um mé-todo de tratamento de um mamífero para Porfiria Intermitente Aguda com-preendendo injetar subcutaneamente uma composição de 500-300 mg/ml dePBGD.
Em ainda outro aspecto a presente invenção refere-se a um mé-todo de tratamento de um mamífero para Ieucodistrofia metacromática com-preendendo injeção subcutânea de uma composição de 50-300 mg/ml de arilsulfatase A.
Em ainda outro aspecto a presente invenção refere-se a um mé-todo de tratamento de um mamífero para o distúrbio de armazenamento Ii-sossomal alfa-manosidose compreendendo injeção subcutânea de umacomposição de 50-300 mg/ml de alfa-manosidase lisossomal.
Em ainda outro aspecto a presente invenção refere-se a um mé-todo de tratamento de um mamífero para doença de Krabbe compreendendoinjeção subcutânea de uma composição de 50-300 mg/ml de galactosilcere-brosidase.
DEFINIÇÕES
Para propósitos da presente invenção, alinhamentos de seqüên-cias e cálculo de contagem de homologia podem ser feitos usando um ali-nhamento Smith-Waterman integral, útil para alinhamentos de ambos proteí-na e DNA. A matriz de substituição BLOSUM50 e a matriz de identidade sãousadas para alinhamentos de proteína e DNA respectivamente. A penalida- de para o primeiro resíduo em uma lacuna é -12 para proteínas e -16 paraDNA, enquanto a penalidade para resíduos adicionais em uma lacuna é -2para proteínas e -4 para DNA.
Alinhamento pode ser feito com a versão de pacote FASTAv20u6 (W.R. Pearson e D.J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448 e W.R. Pearson (1990) "Rapidand Sensitive Sequence Comparison with FAST and FASTA", Methods inEnzymology, 183:63-98).
Alinhamentos múltiplos de seqüências de proteína podem serfeitos usando "ClustalW" (Thompson, J.D., Higgins, D.G. e Gibson, T.J.(1994) "CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple se-quence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penal-ties and weight matrix choice". Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Ali-nhamento múltiplo de seqüências de DNA pode ser feito usando o alinha-mento de proteína como um molde, substituindo os aminoácidos com o có-don correspondente da seqüência de DNA.
No contexto da presente invenção, o termo "E.C" (Classe de En-zima) refere-se ao sistema de classificação de enzima internacionalmentereconhecido, Recommendations of the Nomenclature Committee of the In-ternational Union of Bioehemistry and Molecular Biology, Academic Press,Inc.
O termo "origem" usado no contexto de seqüências de aminoá-cido, por exemplo, proteínas, ou seqüências de ácido nucléico deve sercompreendido como se referindo ao organismo do qual ela deriva. A ditaseqüência pode ser expressa por outro organismo usando métodos de tec-nologia de gene bem-conhecidos de uma pessoa versada na técnica. Istotambém compreende seqüências que foram quimicamente sintetizadas. Ain-da, as ditas seqüências podem compreender pequenas mudanças tal comootimização de códon, isto é, mudanças nas seqüências de ácido nucléicoque não afetam a seqüência de aminoácido.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOPolipeptídeo de interesse
O polipeptídeo da presente invenção pode em particular ser um
hormônio ou variante de hormônio, uma enzima, um receptor ou porção de-la, um anticorpo ou porção dele, um alérgeno ou um repórter. O polipeptídeode interesse pode em particular ser uma enzima selecionada de um a seisgrupos de enzima principais, tal como uma oxidorredutase (E.C. 1), umatransferase (E.C. 2), uma hidrolase (E.C. 3), uma Iiase (E.C. 4), uma isome-rase (E.C. 5) ou uma Iigase (E.C. 6). Em um aspecto mais particular, o poli-peptídeo de interesse pode ser uma aminopeptidase, amilase, carboidrase,carboxipeptidase, catalase, celulase, celobioidrolase, quitinase, cutinase,ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, este-rase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase,beta-glucosidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase,enzima pectinolítica, peroxidase, fosfolipase, fitase, polifenoloxidase, enzimaproteolítica, ribonuclease, transglutaminase, xilanase ou beta-xilosidase.
O polipeptídeo de interesse pode em particular ser um polipeptí-deo que é útil como um medicamento.
Exemplos de um polipeptídeo de interesse adequado incluem,mas não estão limitados a, um selecionado do grupo consistindo em umaforfobilinogênio desaminase, uma aril sulfatase, uma alfa-manosidase e umagalactocerebrosidase.
A princípio um polipeptídeo de interesse derivável de qualquerfonte pode ser tratado de acordo com os métodos da presente invenção.
Em uma modalidade particular o polipeptídeo de interesse podeser de origem humana. Especialmente no contexto de uso de um polipeptí-deo de interesse para a fabricação de um medicamento que deve ser adríii-nistrado a humanos o polipeptídeo pode ser de origem humana uma vez queisso pode minimizar o risco de reações alérgicas indesejadas. Variações na-turais de polipeptídeo humano devido a, por exemplo, polimorfismo estão nocontexto da presente invenção incluídas no termo "origem humana".
O polipeptídeo de interesse pode em particular ser produzidocomo uma proteína recombinante, isto é, uma seqüência de nucleotídeo co-dificando o polipeptídeo de interesse pode ser introduzida em uma célulapara expressão do polipeptídeo de interesse. A expressão recombinante po-de ser homóloga ou heteróloga, isto é, o polipeptídeo de interesse pode serexpresso em célula que é naturalmente expressa por (expressão homóloga)ou ele pode ser expresso por uma célula pela qual ele não é naturalmenteexpresso (expressão heteróloga).
O polipeptídeo recombinante de interesse pode ser expresso porqualquer célula adequada para produção recombinante do polipeptídeo deinteresse particular. Exemplos de células adequadas incluem, mas não estãolimitados a, células procarióticas, tal como uma célula de E. coli ou uma cé-lula de Bacillus. Exemplos de células eucarióticas adequadas incluem, masnão estão limitados a, uma célula de levedura ou uma célula de mamífero talcomo Ovário de Hamster Chinês (CHO). Alternativamente, ela pode ser umacélula humana.
Células hospedeiras adequadas para a expressão de um poli-peptídeo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplosde células de invertebrado incluem células de planta e inseto. No entanto, acélula hospedeiro pode ser também uma célula de vertebrado, e propagaçãode células de vertebrado em cultura (cultura de tecido) se tornou um proce-dimento de rotina.
O termo "polipeptídeo recombinante" ou "polipeptídeo recombi-nante de interesse" significa aqui um polipeptídeo produzido recombinante.
Referência a um polipeptídeo de interesse particular inclui nocontexto da presente invenção também partes ou análogos funcionalmenteequivalentes do polipeptídeo de interesse. Por exemplo, se o polipeptídeo deinteresse for uma enzima uma parte funcionalmente equivalente da enzimapoderia ser um domínio ou subseqüência da enzima que inclui o sítio catalí-tico necessário para permitir o domínio ou seqüência exercer substancial-mente a mesma atividade enzimática que a enzima de comprimento integralou alternativamente um gene codificando o catalisador. O termo "substanci-almente a mesma atividade enzimática" refere-se a uma parte ou análogoequivalente tendo pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, commais preferência pelo menos 70%, com mais preferência pelo menos 75%,com mais preferência pelo menos 80%, com mais preferência pelo menos85%, com mais preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelomenos 95% e com mais preferência pelo menos 97%, pelo menos 98% oupelo menos 99% da atividade da enzima natural. Um exemplo de um análo-go enzimaticamente equivalente da enzima poderia ser uma proteína de fu-são que inclui o sítio catalítico da enzima em uma forma funcional, mas elepode ser também uma variante homóloga da enzima derivada de outra es-pécie. Também, moléculas completamente sintéticas que imitam a atividadeenzimática específica da enzima relevante poderiam também constituir "aná-logos equivalentes enzimáticos".
Em geral, a pessoa versada na técnica será capaz de pronta-mente planejar ensaios apropriados para a determinação da atividade enzi-mática. Para PBGD, no entanto, um ensaio adequado é descrito no WO03/002731, no exemplo 2, bem como nas seções experimentais do presentepedido. Aril sulfatase, em adição a seus substratos naturais, é também ca-paz de catalisar a hidrólise do substrato cromogênico, sintético, para-Nitrocatecol sulfatase (pNCS). O produto, para-Nitrocatecol (pNC), absorveluz a 515 nm. Um ensaio para determinação de atividade de aril sulfatase édescrito em detalhes no WO 2005/073367 e em Fluharty e outros, 1978, Me-th. Enzymol. 50:537-47. Para LAMAN, um ensaio de atividade de proteínaapropriado é descrito no WO 02/099092.
Porfobilinogênio desaminase
Em uma modalidade o polipeptídeo de interesse da invençãopode ser porfobilinogênio desaminase (também conhecida como porfobilino-gênio amônia-liase (polimerização), E.C. 4.3.1.8 (Waldenstrõm 1937, J. Acta.Med. Scand. Supl. 8). Porfobilinogênio desaminase é a terceira enzima nocurso biossintético do heme. E.C. 4.3.1.8 foi transferido para E.C. 2.5.1.61,então porfobilinogênio desaminase (PBGD) está agora posta sob este núme-ro E.C.Porfobilinogênio desaminase catalisa a reação de 4 porfobilino-gênio + H2O = hidroximetilbilano + 4 NH3.PBDG é importante com relação à Porfiria intermitente aguda(AIP), que é um distúrbio dominante autossomal no homem causado por umdefeito (redução de 50% de atividade) de PBDG (vide W001/07065 paradetalhes adicionais em relação a isto).Porfobilinogênio desaminase é resumidamente conhecida comoPBGD e no contexto da presente invenção esses dois termos podem serusados intercomutavelmente um com o outro.Para expressão recombinante de PBGD uma célula hospedeiropode em particular ser uma célula de levedura ou uma célula de E. coli.Para um exemplo detalhado de construção de uma célula de E.coli recombinante referência é feita ao exemplo 1 do W001/07065 e paraconstrução de células HeLa recombinantes e células NIT 3T3 capazes deexpressar PBGD de camundongo referência é feita ao exemplo 6 doWO01/07065.O termo "porfobilinogênio desaminase recombinante (rPBGD)"significa aqui uma PBGD recombinante produzida. A seguir, esta enzima e aforma recombinante humana serão chamadas "PBGD" e "rhPBGD", respec-tivamente. Dentro deste termo está também incluída uma parte ou análogoenzimaticamente equivalente de PBGD. Um exemplo de uma parte enzima-ticamente equivalente da enzima poderia ser um domínio ou subseqüênciada enzima que inclui o sítio catalítico necessário para permitir que o domínioou subseqüência exerça substancialmente a mesma atividade enzimáticaque a enzima de comprimento integral ou alternativamente um gene codifi-cando o catalisador. O termo "substancialmente a mesma atividade enzimá-tica" refere-se a uma parte ou análogos equivalentes da enzima tendo pelomenos 50%, de preferência pelo menos 60%, com mais preferência pelomenos 70%, com mais preferência pelo menos 75%, com mais preferência80%, com mais preferência pelo menos 85%, com mais preferência pelomenos 90%, com mais preferência pelo menos 95% e com mais preferênciapelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade derhPBGD humana natural medida no ensaio de atividade de rhPBGD descritono exemplo 2 do WO 03/002731. Um exemplo de um análogo enzimatica-mente equivalente da enzima poderia ser uma proteína de fusão que inclui osítio catalítico da enzima em uma forma funcional, mas ele pode ser tambémuma variante homóloga da enzima derivada de outra espécie. Também, mo-léculas completamente sintéticas que imitam a atividade enzimática específi-ca da enzima relevante também constituiriam "análogos equivalente enzimá-ticos".
Um exemplo de PBGD que pode ser usado na presente inven-ção inclui qualquer uma daquelas mostradas nas Seqüências 1-10 do pre-sente pedido ou no Genebank N9 X04217, X04808 ou M95623.Aril sulfatase
Em outra modalidade da presente invenção o polipeptídeo de interesse pode ser uma arilsulfatase A.
Arilsulfatase A catalisa a reação de um cerebrosídeo 3-sulfato +H2O = um cerebrosídeo + sulfato.
ASA foi purificada de uma variedade de fontes incluindo fígado,placenta e urina humanos. Ela é uma glicoproteína ácida com um ponto i- soelétrico baixo. Acima de pH 6,5, a enzima existe como um dímero com umpeso molecular de aproximadamente 110 kDa. ASA sofre uma polimerizaçãodependente de pH formando um octâmero em pH 4,5. Em urina humana, aenzima consiste em duas subunidades não-idênticas de 63 e 54 kDa. ASApurificada de fígado, placenta e fibroblastos humanos também consiste em duas subunidades de tamanhos ligeiramente diferentes variando entre 55 e64 kDa. Como no caso de outras enzimas lisossomais, ASA é sintetizada emribossomos ligados à membrana como um precursor glicosilado. Ela entãopassa pelo retículo endoplasmático e Golgi, onde seus oligossacarídeos N-Iigados são processados com a formação e oligossacarídeos fosforilado e sulfatado do tipo complexo (Waheed A. e outros, Biochim. Biophys. Acta.1985, 847, 53-61, Braulke, T. e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun.,1987, 143, 178-185). Em fibroblastos culturados normais, um polipeptídeoprecursor de 62 kDa é produzido, que transloca através de ligação do recep-tor de manose-6-fosfato (Braulke, T. e outros, J. Biol. Chem., 1990, 265,6650-6655) para um endossoma prelisossomal ácido (Kelly, B.M. e outros,Eur. J. CeII. Biol., 1989, 48, 71-78).
A arilsulfatase A pode ser em particular de origem humana. Ocomprimento (18 aminoácidos) do peptídeo sinal de ASA humana é baseadona seqüência de consenso e um sítio de processamento específico parauma seqüência sinal. Então, do cDNA de ASA humana deduzido (númerosde acesso EMBL GenBank J04593 e X521151) a clivagem do peptídeo sinaldeve ser feita em todas as células após o resíduo número 18 (Ala), resultan-do na forma madura da ASA humana. A seguir, arilsulfatase A humana seráabreviada rASA, a forma madura de arilsulfatase A incluindo a forma madurade ASA será chamada "mASA" e a ASA humana recombinante madura seráchamada "mrhASA".
Uma modificação de proteína foi identificada em duas sulfataseseucarióticas (ASA e arilsulfatase B (ASB)) e para uma das algas verdes Vol-vox carteri (Schmidt, B. e outros, CeH 1995, 82, 271-278, Selmer, T. e ou-tros, Eur. J. Biochem. 1996, 238, 341-345). Esta modificação leva à conver-são de um resíduo cisteína, que é conservado dentre as sulfatases conheci-das, em um resíduo de ácido 2-amino-3-oxopropiônico (Schmidt, B. e outros,Cell. 1995, 82, 271-278). O novo derivado de aminoácido é também reco-nhecido como CMormiIgIicina (FGIy). Em ASA e ASB derivadas de célulasMSD, o resíduo Cys-69 é retido. Conseqüentemente, é proposto que a con-versão do Cys-69 em FGIy-69 seja requerida para geração de ASA e ASBcataliticamente ativas, e que deficiência desta modificação de proteína seja acausa de MSD. Cys-69 é referida à ASA precursora que tem um peptídeosinal de 18 resíduos. Na mASA o resíduo cisteína mencionado é Cys-51.Investigação adicional mostrou que uma seqüência linear de 16 resíduoscircundando o Cys-51 na mASA é suficiente para direcionar a conversão eque a modificação de proteína acontece após ou em um estágio final detranslocação de proteína co-translacional em um retículo endoplásmicoquando o polipeptídeo não é ainda dobrado em sua estrutura nativa (Dierks,Τ. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 11963-1196, Wittke, D. e outros,(2004), Acta Neuropathoi (Berl.),-108, 261-271).
Formas múltiplas de ASA foram demonstradas em eletroforese efocalização isoelétrica de preparações de enzima de urina, leucócitos, pla- quetas, fibroblastos culturados e fígado humanos. Tratamento com endogli-cosidase H, sialidase e fosfatase alcalina reduz o tamanho molecular e com-plexidade do padrão eletroforético, o que sugere que muito da heterogenei-dade da carga de ASA seja devido a variações no teor de carboidrato daenzima.
A arilsulfatase A pode em particular ser uma forma de arilsulfa-tase A1 que é capaz de cruzar a barreira sangue cérebro e/ou uma forma derASA, que possui lacunas específicas para entrar em células alvo dentro docérebro. Em particular, ela pode ser uma rASA, que é eficientemente endoci-tosada in vivo através do curso de manose-6-fosfato.
Então a ASA pode em particular ser covalentemente ligada auma chamada expressão, peptídeos ou proteínas como veículos ou toxinascomo veículos que são capazes de aumentar e/ou facilitar transporte de ASAna barreira sangue-cérebro e/ou através de membranas celulares em geral(Schwarze e outros, Trends Cell Biol., 2000; 10(7):290-295; Lindgren e ou-tros, Trends PharmacoL Sei. 2000; 21(3):99-103). Uma molécula de ASAcontendo tais seqüências de peptídeo pode ser produzida através de técni-cas de expressão. O processo de transdução de proteína não é específicode tipo de célula e o mecanismo através do qual ele acontece não é comple-tamente elucidado, no entanto, acredita-se que ele aconteça através de al-gum tipo de processo de perturbação e penetração de membrana que sejaindependente de receptor. Um estado particularmente não-dobrado da molé-cula pode facilitar o processo mas não é essencial.
Um exemplo de uma expressão adequada inclui, mas não estálimitado à, expressão de manose-6-fosfato.
Exemplos de peptídeos ou proteínas como veículo incluem, masnão estão limitados a, os chamados domínios de transdução de proteína.
Exemplos de domínios de transdução de proteína incluem, mas não estãolimitados a, aqueles mencionados no WO 2005/073367, que é incorporadoaqui a título de referência. Então o domínio de transdução de proteína podeser o peptídeo básico de 11 resíduos da proteína TAT de HIV -YGRKKRRQRRR (Schwarze e outros, Trends Cell Bioi 2000; 10(7):290-295), uma versão sintética de TAT -YARAAARQARA que confere mais alfa-helicidade e natureza anfifática à seqüência (Ho e outros, CartcerRes. 2001;61(2):474-477), um peptídeo líder sintético composto de poli -R ou uma mis-tura de resíduos -R e -K básicos em combinação com outros aminoácidos epeptídeos com base em porções de seqüência de sinal hidrofóbicas ou debeta-3 integrina ou FGF de sarcoma de Kaposi (Dunican e outros, Biopoly-mers 2001; 60(1):45-60).
Exemplos de toxinas adequadas como veículos incluem, masnão estão limitados a, aqueles descritos no W02005/073367, que é aquiincorporado a título de referência.
A ASA pode em particular compreender uma seqüência de ácidonucléico que codifica:
(a) a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:2 no WO2005/073367;
(b) uma porção da seqüência em (a), que é enzimaticamenteequivalente à arilsulfatase A humana recombinante;
(c) um análogo de seqüência de aminoácido tendo pelo menos75% de identidade de seqüência para qualquer uma das seqüências em (a)ou (b) e ao mesmo tempo compreendendo uma seqüência de aminoácido,que é enzimaticamente equivalente à arilsulfatase A humana recombinante.
No presente contexto, uma seqüência de aminoácido ou umaporção de uma seqüência de aminoácido que é um polipeptídeo capaz dehidrólise de uma quantidade do substrato de arilsulfatase A pNCS a 37e Cuma taxa correspondendo a uma atividade específica de pelo menos 20U/mg de polipeptídeo (de preferência 50 U/mg de polipeptídeo) quando de-terminada em um ensaio para medir atividade de arilsulfatase A conformedescrito no exemplo 1 do WO 2005/073367, e/ou um polipeptídeo, que écapaz de hidrolisar pelo menos 40% de substrato de arilsulfatase A, fx. 14Cpalmitoil sulfatídeo, carregado em fibroblastos MLD1 quando ensaiado atra-vés de incubação em um nível de dose de 25 um/ml em um ensaio conformedescrito no exemplo 2 do WO 2005/073367.
A ASA pode em outra modalidade em particular compreender: (a) a seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO:1 no WO2005/073367
(b) uma porção da seqüência em (a), que codifica uma seqüên-cia de aminoácido, que é enzimaticamente equivalente à arilsulfatase A hu-mana recombinante
(c) um análogo de seqüência de ácido nucléico tendo pelo me-nos 75% de identidade de seqüência com qualquer uma das seqüências em(a) ou (b) e ao mesmo tempo codificando uma seqüência de aminoácido,que é enzimaticamente equivalente à arilsulfatase A humana recombinante.
Pode ser preferido que o grau de identidade de seqüência entre a seqüência de ácido nucléico acima mencionada e SEQ ID NO: 1 do WO2005/073367 seja pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos99%. Pode ser igualmente preferido que o grau de identidade de seqüênciaentre a seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de ácido nucléi-co acima mencionada e SEQ ID NO:2 do WO 2005/073367 seja pelo menos80%, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelomenos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.
Para o propósito da presente invenção é preferido que a arilsul-fatase A seja uma enzima recombinante, particularmente preferida é arilsul- fatase humana recombinante (rhASA).
É preferido que rASA seja produzida em uma célula ou linhagemde célula de mamífero e que a dita célula ou linhagem de célula de mamíferoproduza uma glicoforma de rASA, que é eficientemente endocitosada in vivoatravés do curso do receptor de manose-6-fosfato. Especificamente, a glico- forma preferida de rASA compreende uma quantidade de manose-6-fosfatoexposta, que permite endocitose eficiente de rASA in vivo através do cursode manose-6-fosfato.Em uma modalidade particular pelo menos uma das glicoformasproduzidas de rASA é similar a uma glicoforma produzida em células CHO.
A modificação pós-traducional do resíduo cisteína na posição 51na arilsulfatase A humana madura é relevante para a atividade da enzima.Deste modo, em uma modalidade preferida da presente invenção, produçãoda arilsulfatase A ou seu equivalente acontece em uma taxa e sob condiçõesque resultam em um produto compreendendo uma isoforma da enzima ondeo aminoácido correspondendo a Cys-69 na SEQ ID NO:2 do WO2005/073367 é convertido em Formilglicina, correspondendo a Fgly-51 naSEQ ID NO:3 do WO 2005/073367. A SEQ ID NO:4 do WO 2005/073367representa arilsulfatase A humana madura após clivagem do peptídeo sinalde 18 aminoácidos mas antes da modificação de C-51.
Então em outra modalidade da presente invenção a ASA ou seuequivalente enzimático pode ser selecionado do grupo consistindo em
(a) a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:3 do WO2005/073367;
(b) uma porção da seqüência em (a), que é enzimaticamenteequivalente à arilsulfatase A humana recombinante
(c) um análogo de seqüência de aminoácido tendo pelo menos75% de identidade de seqüência com qualquer uma das seqüências em (a)ou (b) e ao mesmo tempo sendo enzimaticamente equivalente à arilsulfataseA humana recombinante.
Pode ser preferido que o grau de identidade de seqüência entrea enzima produzida de acordo com a invenção e SEQ ID NO:3 do WO2005/073367 ou SEQ ID NO:4 do WO 2005/073367 seja pelo menos 80%,tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.
Já que a atividade biológica e os efeitos da enzima in vivo exi-gem que sejam ótimos é uma vantagem se uma quantidade adequada daenzima tenha adquirido um padrão de glicosilação conforme acima descritoe tenha sido modificada pós-traducionalmente na posição 51. Então, pelomenos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% da ASA da presente inven-ção podem estar na glicoforma/isoforma acima descrita.
A ASA da presente invenção pode em termos de sua estruturaser diferente da rASA de acordo com a SEQ ID NO: 3 da 2005/073367. Podeser vantajoso que a seqüência de resíduos de aminoácido circundando o Cys-51 seja idêntica ou tenha um grau alto de identidade de seqüência coma seqüência correspondente na SEQ ID NO: 3. Então, pode ser preferidoque uma seqüência linear de 20 aminoácidos, tal como 19, 18, 17, 16, 15,14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ou 4 resíduos de aminoácido circundando oCys-51 na arilsulfatase A seja idêntica ou pelo menos 90% idêntica, tal como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência correspondente na SEQID NO:3 do WO 2005/073367. Como a forma ativa de rASA dentro das Iiso-zimas está um octâmero a ASA da presente invenção pode em particular seruma rASA que é um octâmero ou se reúne como um octâmero sob condi-ções fisiológicas.
A atividade enzimática de ASA, que deve ser compreendida co-mo a atividade catalítica da rASA, pode ser medida em um ensaio enzimáti-co com base na hidrólise mediada por rASA ou de um substrato detectávelou substrato, que leva a um produto final detectável. Em um aspecto preferi-do o ensaio é baseado em hidrólise do substrato cromogênico, sintético, pa- ra-Nitrocatecol sulfato (pNCS) que tem um produto final, para-Nitrocatecol(pNC), que absorve luz a 515 nm.
Alfa-manosidase Iisossomal
Em ainda outra modalidade o polipeptídeo de interesse pode seruma alfa-manosidase Iisossomal (LAMAN). Alfa-manosidase Iisomal perten- ce a EC 3.2.1.24 e é uma exoglicosidase que hidrolisa os resíduos de alfa-D-manose de não-redução, terminais, em alfa-D-manosídeos da extremidadede não-redução durante a degradação ordenada de glicoproteínas N-Iigadas(Aronson e Kuranda FASEB J 3:2615-2622, 1989). No contexto da presenteinvenção o termo alfa-manosidase Iisossomal pode ser usado intercomuta-velmente com o termo abreviado LAMAN.
A LAMAN da presente invenção pode ser em particular de ori-gem humana. A enzima humana é sintetizada como um polipeptídeo simplesde 1011 aminoácidos com um peptídeo sinal putativo de 49 resíduos que éprocessado em três glicopeptídeos principais de 15, 42 e 70 kD (Nilssen eoutros, Hum. Mol. Genet. 6, 717-726. 1997).O gene codificando LAMAN (MANB) está localizado no cromos-somo 19 (19cen-q12), (Kaneda e outros, Chromosoma 95:8-12. 1987).MANB consiste em 24 exons, se estendendo 21,5 kb (números de acessoGenBank U60885-U60899; Riise e outros, Genomics 42:200-107. 1997). Otranscrito LAMAN é » 3.500 nucleotídeos (nts) e contém uma estrutura deleitura aberta codificando 1.011 aminoácidos (GenBank U60266.1).A clonagem e sequenciamento do cDNA humano codificandoLAMAN foram publicados em três trabalhos (Nilssen e outros, Hum. MoLGenet. 6, 717-726. 1997; Liao e outros, J. Bioi Chem. 271, 28348-28358.1996; Nebes e outros, Biochem. Biophys. fíes. Commun. 200, 239-245.1994). Curiosamente, as três seqüências não são idênticas. Quando compa-rado com a seqüência de Nilssen e outros (no. de acesso U60266.1) umamudança TA em AT nas posições 1670 e 1671 resultando em uma substitui-ção de valina por ácido aspártico foi encontrada por Liao e outros e Nebes eoutros.Em uma modalidade mais preferida, a alfa-manosidase Iisosso-mal compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:1 do WO2005/094874.Por razões práticas e econômicas é preferido que a LAMAN dapresente invenção seja produzida recombinante. Através de produção re-combinante pode ser também possível obter uma preparação da enzima on-de uma fração grande contém manose-6-fosfato. Produção recombinantepode ser conseguida após transfecção de uma célula usando uma seqüên-cia de ácido nucléico compreendendo a seqüência da SEQ ID NO:2 do WO2005/094874.A alfa-manosidase é de preferência feita em um sistema de célu-la de mamífero uma vez que isso vai resultar em um perfil de glicosilação,que assegura absorção mediada por receptor eficiente em células de, porexemplo, órgãos viscerais do corpo. Em particular, foi constatado que produ-ção da enzima em células CHO, COS ou BHK assegura modificação pós-traducional adequada da enzima através da adição de resíduos de manose-6-fosfato. Em adição um perfil de sialilação correto é obtido. Sialilação corre-ta é conhecida ser importante a fim de prevenir absorção pelo fígado, porcausa de resíduos de galactose expostos.
Em modalidades ainda mais preferidas, o sistema de célula dèmamífero é então selecionado do grupo compreendendo células CHO, COSou BHK (Stein e outros, J. Bioi Chem. 1989, 264, 1252-1259). Pode ser ain-da preferido que o sistema de célula de mamífero seja uma linhagem de cé-lula de fibroblasto humana.
Em uma modalidade mais preferida, o sistema de célula de ma-mífero é uma linhagem de célula CHO.
Em outra modalidade a alfa-manosidase lisossomal pode seruma preparação de alfa-manosidase lisossomal onde uma fração da ditapreparação consiste em alfa-manosidase lisossomal tendo um ou mais oli-gossacarídeos N-ligados carregando grupos manose-6-fosfato.
É ainda preferido que uma fração de uma preparação da ditaalfa-manosidase lisossomal seja capaz de se ligar a receptores de manose-6-fosfato.
A habilidade da enzima em se ligar a receptores de manose-6-fosfato pode ser determinada em um ensaio in vitro conforme descrito noexemplo 1 do WO 2005/094874. Aqui, ligação da enzima a uma Matriz 300de afinidade MPR prove uma medida de sua habilidade em se ligar a recep-tores de manose-6-fosfato. Em uma modalidade preferida da invenção liga-ção da enzima a receptores de manose-6-fosfato acontece in vitro.
Em modalidades mais preferidas da invenção esta fração cor-responde a de a partir de 1 a 75% da atividade de uma preparação de alfa-manosidase lisossomal, tal como de a partir de 2 a 70%, tal como de a partirde 5 a 60%, tal como de a partir de 10 a 50%, tal como de a partir de 15 a45%, tal como de a partir de 20 a 40%, tal como de a partir de 30 a 35%.
Deste modo, é preferido que a alfa-manosidase lisossomal tenhaum teor de resíduos de manose-6-fosfato permitindo ligação dependente demanose-6-fosfato de a partir de 2 a 100%, 5 a 95%, 10 a 90%, 20 a 80%, 30a 70% ou 40 a 60% da quantidade de enzima a uma matriz Man-6-F-receptor. No momento, o grau de fosforilação foi analisado em várias batela-das de enzima e, tipicamente, de a partir de 30 a 45% da enzima são fosfori-lados e se ligam à matriz de afinidade.
É ainda preferido que uma fração constituindo de a partir de 2-100%, 5-100%, 5-90%, 10-80%, 20-75%, 30-70%, 35-65% ou 40-60% daquantidade da dita alfa-manosidase lisossomal se ligue à Man-6-F-receptorcom alta afinidade. Teoricamente, dois grupos de manose-6-fosfato devemser posicionados próximos um ao outro a fim de que a enzima se ligue àMan-6-F-receptor com alta afinidade. Observações recentes sugerem que adistância entre os resíduos manose fosforilados deva ser 40 Á ou menos afim de se obter ligação de alta afinidade. Na alfa-manosidase Iisossomalhumana de acordo com a SEQ ID NO:1 do W02005/094874 os dois resí-duos de manose-6-fosfato podem ser situados nos resíduos asparaginasenas posições 367 e 766. Deste modo, é preferido que o medicamento deacordo com a presente invenção compreenda alfa-manosidase lisossomal,uma fração da qual carrega grupos manose-6-fosfato em ambos desses re-síduos asparaginase.
De preferência, a alfa-manosidase é feita através de técnicasrecombinantes. Em uma modalidade preferida, a alfa-manosidase é de ori-gem humana (hLAMAN) e ainda com mais preferência uma alfa-manosidasehumana madura (mhLAMAN) ou um fragmento dela. O fragmento pode sermodificado, no entanto, os sítios ativos da enzima devem ser preservados.
Deve ser esperado que, em preparações de alfa-manosidase deacordo com a presente invenção, uma fração da enzima seja representadapela sua forma precursora, enquanto outras frações representam as formasproteoliticamente processadas de aproximadamente 55 e 70 kDa.
Galactocerebrosidase
Em outra modalidade o polipeptídeo de interesse pode ser umagalactocerebrosidase, que pode ser abreviada para GALC. Galactocerebro-sidase pertence a E.C. 3.1.6.46 e são enzimas capazes de catalisação dareação de D-galactosil-N-acilesfingosina + H2O = D-galactose + N-acilesfingosina, então GALC catalisa a degradação de galactolipídeos em,por exemplo, mielina.
A enzima GALC derivada de humanos é uma enzima Iisossomalglicosilada compreendendo 643 aminoácidos e com um peso molecular de72,8 kDa. A GALC da presente invenção pode, em particular, ser de origemhumana. Em uma modalidade adicional a GALC pode ser expressa recom-binante em uma das células hospedeiro previamente mencionadas. A célulahospedeiro para expressão recombinante de GALC pode em particular seruma célula CHO.
No relatório e nas reivindicações referência é feita às seqüênciasde aminoácido e ácido nucléico que seguem:
<table> table see orginal document page 19</column></row><table><formula>formula see original document page 20</formula>
Com referência a essas seqüências o polipeptídeo de interesse,
de acordo com modalidades preferidas da invenção, compreende um ami-noácido selecionado do grupo consistindo em:
i) uma seqüência de aminoácido conforme definido por qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 15, 18, 19, 20, 21 e 24;
ii) uma parte funcionalmente equivalente de uma seqüência deaminoácido conforme definido em i); e
iii) um análogo funcionalmente equivalente de uma seqüência deaminoácido conforme definido em i) ou ii), a seqüência de aminoácido dodito análogo sendo pelo menos 75% idêntica à uma seqüência de aminoáci-do conforme definido em i) ou ii).
Em modalidades particulares o análogo em iii) é pelo menos80% idêntico a uma seqüência conforme definido em i) ou ii), de modo quepelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou tal como pelo menos 99,5% idênticos a uma seqüência con-forme definido em i) ou ii).
Ainda, o polipeptídeo de interesse pode ser obtido através deexpressão recombinante usando uma seqüência de ácido nucléico compre-endendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo em:
i) uma seqüência de ácido nucléico conforme definido por qual-quer uma das SEQ ID NOs: 1 -13, 16, 17, 22 e 23;
ii) uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 75% idên-tica a uma seqüência de ácido nucléico conforme definido em i).
Para produção recombinante do polipeptídeo pode ser aindapreferido que a seqüência de ácido em ii) seja pelo menos 80% idêntica auma seqüência conforme definido em i), tal como pelo menos 85%, pelo me-nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou tal comopelo menos 99,5% idêntica a uma seqüência conforme definido em i).
Composição compreendendo um polipeptídeo de interesse
A descrição que segue de uma composição compreendendo umpolipeptídeo de interesse refere-se ambos a uma composição compreen-dendo um polipeptídeo que é concentrado de acordo com um método dapresente invenção e refere-se também a uma composição da presente in-venção compreendendo pelo menos 10 mg/ml de polipeptídeo de interesse.
A presente invenção refere-se também a uma composição com-preendendo pelo menos 10 mg/ml de polipeptídeo de interesse, onde o poli-peptídeo de interesse pode ser qualquer polipeptídeo de acordo com a pre-sente invenção, tal como em particular rhPBGD, aril sulfatase, alfa-manosidase ou galactocerebrosidase. A dita composição pode em particularcompreender pelo menos 25 mg/ml de polipeptídeo de interesse, tal comopelo menos 50 mg/ml ou pelo menos 75 mg/ml ou pelo menos 100 mg/ml depolipeptídeo de interesse. Então a dita composição pode em particular com-preender entre 10-1000 mg/ml de polipeptídeo de interesse, tal como entre10-500 mg/ml ou entre 10-300 mg/ml ou entre 10-200 mg/ml ou entre 25-500mg/ml ou entre 25-400 mg/ml ou entre 40-400 mg/ml ou entre 40-300 mg/mlou entre 50-400 mg/ml ou entre 50-300 mg/ml ou entre 75-400 mg/ml ou en-tre 75-300 mg/ml ou entre 100-200 mg/ml ou entre 100-150 mg/ml de poli-peptídeo de interesse.
A composição compreendendo um polipeptídeo de interesse po-de em particular ser uma solução aquosa.
Além de compreender uma alta concentração de polipeptídeo deinteresse a dita composição pode em particular compreender ainda quais-quer agregados do polipeptídeo de interesse ou pelo menos apenas alguns agregados. Então a quantidade de polipeptídeo de interesse presente comoagregados pode em particular constituir menos do que 5% p/p da quantidadetotal de polipeptídeo de interesse na composição. Em particular os ditos a-gregados podem constituir menos do que 4% p/p, tal como menos do que3% p/p ou menos do que 2% p/p ou menos do que 1% p/p ou menos do que 0,5% p/p ou menos do que 0,1% p/p da quantidade total de polipeptídeo deinteresse. No presente contexto o termo "agregados" significa qualquer for-ma do polipeptídeo de interesse que não é monomérica. Então o termocompreende qualquer dímero ou multímero do polipeptídeo de interesse.
Ainda, é uma vantagem se a dita composição compreender ape- nas o polipeptídeo de interesse ou pelo menos traços pequenos de outrasproteínas, isto é, proteínas diferentes do polipeptídeo de interesse. Então,em uma modalidade particular, a dita composição compreende menos doque 1% p/p, tal como menos do que 0,5% p/p ou menos do que 0,1% p/p oumenos do que 0,05% p/p ou menos do que 0,01% p/p de outras proteínas que não o polipeptídeo de interesse.
Uma faixa de fatores afeta a estabilidade e atividade de polipep-tídeos e a composição compreendendo um polipeptídeo de interesse podeentão em particular ser otimizada para manter o polipeptídeo de interesse omais estável possível.
O pH geralmente afeta a estabilidade de um polipeptídeo de in-teresse, então o pH de uma composição compreendendo um polipeptídeo deinteresse pode em particular estar na faixa de 7,5-8,5, tal como em particularentre pH 7,7-8,2, mais particularmente entre pH 7,8-8,0 ou entre pH 7,85-7,95, tal como pH 7,8 ou pH 7,9. Isto pode em particular ser o caso se o po-lipeptídeo de interesse for PBGD.
Então a composição compreendendo um polipeptídeo de inte-resse pode em particular compreender um tampão capaz de manter a com-posição dentro da faixa de pH descrita. Exemplos de tais tampões incluem,mas não estão limitados a, TRIS-HCl, Citrato de Na e Na2HPO4. A concen-tração de tal tampão pode depender da escolha do tampão particular e dapresença de outros componentes na composição. Se o tampão for Na2HPO4a concentração de Na2HPO4 pode estar na faixa de 0,5-15 nM, tal como nafaixa de 1-10 mM, ou na faixa de 1,5-7,5 mM, tal como na faixa de 1,83-7,4mM ou na faixa de 1,5-3 mM, tal como na faixa de 1,83-3,7 mM ou na faixade 1,83-2,45 mM ou na faixa de 3,5-7,5 mM, tal como na faixa de 3,6-7,4mM ou na faixa de 5,4-7,4 mM, tal como 1,84 mM ou 2,45 mM ou 3,67 mMou 5,51 mM ou 7,34 mM.
Se o tampão for TRIS-HCI a concentração de TRIS-HCI pode emparticular estar na faixa de 2-50 mM, tal como 2-40 mM ou 2-30 mM ou 2-20mM ou 2-10 mM ou 5-25 mM ou 5-20 mM ou 8-12 mM ou 9-11 mM, por e-xemplo, 10 mM.
Exemplos de outros compostos que a composição compreen-dendo um polipeptídeo de interesse pode compreender incluem, mas nãoestão limitados a, aminoácidos, açúcares, álcoois e detergentes. Exemplosde tais compostos adequados incluem, mas não estão limitados a, glicina,manitol, sacarose, L-serina, Tween-80 ou uma combinação de um ou maisdos ditos compostos. A concentração desses compostos depende do com-posto particular, mas para glicina a concentração pode em particular estar nafaixa de 1-200 mM, tal como na faixa de 5-190 mM ou na faixa de 10-180mM ou na faixa de 10-170 mM ou na faixa de 20-160 mM ou na faixa de 20-150 mM ou na faixa de 25-125 mM ou na faixa de 5-100 mM ou na faixa de5-90 mM ou na faixa de 5-80 mM ou na faixa de 5-70 mM ou na faixa de 5-60 mM ou na faixa de 10-100 mM ou na faixa de 10-90 mM ou na faixa de10-80 mM ou na faixa de 10-70 mM ou na faixa de 10-60 mM ou na faixa de12-60 mM ou na faixa de 12-55 mM ou na faixa de 13,5-54 mM ou na faixade 10-30 mM, tal como na faixa de 13,5-27 mM ou na faixa de 13,5-18 mMou na faixa de 25-55 mM, tal como na faixa de 27-54 mM ou na faixa de 40-55, tal como na faixa de 40,5-54 mM, tal como 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 17,17,5, 18, 18,5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5 ou 53, 53,5,53, 54,5 ou 55 mM.A concentração de manitol pode em particular estar na faixa de50-1000, mM, tal como na faixa de 50-900 mM ou na faixa de 50-800 mM ouna faixa de 50-700 mM ou na faixa de 50-600 mM ou na faixa de 100-900mM ou na faixa de 100-800 mM ou na faixa de 100-700 mM ou na faixa de100-600 mM ou na faixa de 100-500 mM ou na faixa de 120-525 mM ou nafaixa de 125-500 mM ou na faixa de 100-300 mM tal como na faixa de 120-275 mM ou na faixa de 120-170 mM ou na faixa de 200-600 mM, tal como nafaixa de 225-550 mM ou na faixa de 240-510 mM ou na faixa de 370-525mM, tal como 120, 125, 130, 160, 165, 166,7, 170, 175, 200, 221, 225, 250,275,300, 365, 370, 375, 380, 385, 490, 495, 500, 505 ou 510 mM.A concentração de sacarose pode em particular estar na faixa de1-200 mM, tal como na faixa de 5-190 mM ou na faixa de 10-180 mM ou nafaixa de 10-170 mM ou na faixa de 20-160 mM ou na faixa de 20-150 mM ouna faixa de 25-125 mM ou na faixa de 5-100 mM ou na faixa de 5-90 mM ouna faixa de 5-80 mM ou na faixa de 5-70 mM ou na faixa de 5-60 mM ou nafaixa de 10-100 mM ou na faixa de 10-90 mM ou na faixa de 10-80 mM ouna faixa de 10-70 mM ou na faixa de 10-60 mM ou na faixa de 12-60 mM ouna faixa de 12-55 mM ou na faixa de 13,5-54 mM ou na faixa de 10-30 mM,tal como na faixa de 13,5-27 mM ou na faixa de 13,5-18 mM ou na faixa de25-55 mM, tal como na faixa de 27-54 mM ou na faixa de 40-55, tal como nafaixa de 40,5-54 mM, tal como 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 17, 17,5, 18, 18,5,19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5 ou 53, 53,5, 53, 54,5 ou 55mM. Se sacarose for incluída em uma composição que também compreendemanitol a concentração de manitol pode, em particular, ser diminuída corres-pondendo à concentração de sacarose; isto é, a concentração de manitol esacarose juntos pode em particular ser igual à concentração de manitol seeste fosse usado sozinho.A concentração de Tween 80 pode em particular estar na faixade 0,001-1% p/v, tal como na faixa de 0,005-1% p/v ou na faixa de 0,01-1%p/v ou na faixa de 0,001-0,5% p/v ou na faixa de 0,005-0,5% p/v ou na faixade 0,01-0,5% p/v ou na faixa de 0,05-0,4% p/v ou na faixa de 0,05-0,3%p/vou na faixa de 0,05-0,2% p/v ou na faixa de 0,075-0,4% p/v ou na faixa de0,075-0,3% p/v ou na faixa de 0,075-0,2% p/v ou na faixa de 0,09-0,2% p/v,tal como 0,075, 0,08, 0,09, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175 ou 0,2% p/v.
A composição compreendendo um polipeptídeo de interesse,onde o polipeptídeo em particular pode ser um PBGD, uma aril sulfatase,uma alfa-manosidase Iisossomal ou uma galactosidase, pode em particularcompreender uma combinação de um ou mais dos compostos acima men-cionados. Um exemplo adequado de tal composição pode ser um que alémdo polipeptídeo de interesse compreende Na2HPO4, glicina e manitol. O pHda composição e a concentração dos compostos diferentes podem ser con-forme acima descrito. Então a dita composição pode em uma modalidadecompreender Na2HPO4 a 0,5-15 mM, glicina a 1-200 mM, manitol a 50-1000mM e um pH na faixa de 7,5-8,5. Qualquer combinação das concentraçõesacima mencionadas de compostos e pH são compreendidos pela presenteinvenção. Um exemplo específico de uma combinação adequada de outroscompostos e pH na composição compreendendo um polipeptídeo de inte-resse é um que compreende Na2HPO4 a 3,67 mM, glicina a 27 mM, manitola 250 mM e tem um pH na faixa de 7,7 a 7,9.
Outros exemplos de composições adequadas incluem, mas nãoestão limitados a, qualquer um dos que seguem:
l^Na2HPO4 a 1,84 mM, glicina a 13,5 mM, manitol a 125 mM e pHna faixa de 7,7 a 7,9,
• Na2HPO4 a 2,45 mM, glicina a 18 mM, manitol a 167 mM e pHna faixa de 7,7 a 7,9,
Na2HPO4 a 5,51 mM, glicina a 40,5 mM, manitol a 375 mM epH na faixa de 7,7 a 7,9,
• Na2HPO4 a 7,34 mM, glicina a 54 mM, manitol a 500 mM e pHna faixa de 7,7 a 7,9,
• Na2HPO4 a 3,67 mM, glicina a 27 mM, manitol a 220 mM, sa-carose a 30 mM e pH na faixa de 7,7 a 7,9,
• Na2HPO4 a 3,67 mM, manitol a 245 mM, sacarose a 32 mM epH na faixa de 7,7 a 7,9,• Na2HPO4 a 3,67 mM, L-serina a 27 mM, manitol a 250 mM epH na faixa de 7,7 a 7,9,
• TRIS-HCI a10 mM, glicina a 27 mM, manitol a 250 mM e pH nafaixa de 7,7 a 7,9,
• Citrato de Na a 3,67 mM, glicina a 27 mM, manitol a 250 mM epH na faixa de 7,7 a 7,9,
• Na2HPO4 a 3,67 mM, glicina a 27 mM, manitol a 220 mM, sa-carose a 29 mM, 0,1% (p/v) de Tween 80 e pH na faixa de 7,7 a 7,9,
• Na2HPO4 a 3,67 mM, glicina a 27 mM, manitol a 220 mM, sa-carose a 29 mM, 0,1% (p/v) de Tween 80 e pH na faixa de 7,7 a 7,9.
A composição compreendendo um polipeptídeo de interesse po-de em particular ser usada para aplicações terapêuticas em mamíferos. En-tão a composição compreendendo um polipeptídeo de interesse pode emparticular ser isotônica com relação ao tecido de mamíferos, por exemplo,ela pode em particular ter uma osmolalidade na faixa de 200-400 mOsm/kg,tal como na faixa de 250-350 mOsm/kg ou na faixa de 275-325 mOsm/kg ouna faixa de 295-305 mOsm/kg, tal como 295 mOsm/kg ou 300 mOsm/kg ou305 mOsm/kg.
Método de concentração de um polipeptídeo de interesse
O método da presente invenção compreende as etapas de a)centrifugação e/ou filtragem de uma composição compreendendo um poli-peptídeo de interesse e b) concentração da composição da etapa a). Os in-ventores da presente invenção constataram que através de centrifugaçãoe/ou filtragem de uma composição compreendendo um polipeptídeo de inte-resse antes da concentração da dita composição é possível obter uma com-posição compreendendo um polipeptídeo altamente concentrado de interes-se sem quaisquer ou com pelo menos apenas alguns agregados do polipep-tídeo de interesse. Ainda, é geralmente uma vantagem para aplicações tera-pêuticas de um polipeptídeo que a quantidade de agregados de polipeptídeoseja reduzida, por exemplo, uma vez que eles podem aumentar o risco deelicitação de uma resposta imune com relação ao peptídeo.
Para administração de um polipeptídeo subcutaneamente é umavantagem que a composição de polipeptídeo tenha uma alta atividade emum volume pequeno uma vez que apenas volumes pequenos podem serinjetados subcutaneamente.
Proteínas ou polipeptídeos podem em geral formar agregados quando eles são concentrados. Então é uma vantagem que quando o méto-do da presente invenção for usado para concentrar um polipeptídeo de inte-resse ele não cause uma taxa alta de formação de agregado de polipeptí-deo. Conforme mostrado nos exemplos a quantidade de agregados dePBGD na composição obtida através do método de concentração da presen- te invenção é similar àquele de uma composição PBGD não-concentrada.
Em uma modalidade particular a etapa a) do método é realizadaantes da etapa b).
Etapa a) centrifuqacão e/ou filtragem
Os inventores da presente invenção constataram que antes da concentração de uma composição compreendendo um polipeptídeo de inte-resse é vantajoso pré-tratar a composição através de centrifugação e/ou fil-tragem da composição como através deste pré-tratamento muito ou a maio-ria dos agregados de polipeptídeo é removido.
Quando a concentração da composição na etapa b) é realizada através de um método que se apóia no uso de um filtro ou membrana, talcomo ultrafiltragem, a presença de agregados pode bloquear o filtro oumembrana de modo que moléculas pequenas e líquido não são capazes decruzar o filtro ou membrana. Isto pode diminuir a velocidade através da quala composição é concentrada e/ou bloquear completamente qualquer con- centração adicional.
Então para este tipo de concentração o pré-tratamento de acor-do com a etapa a) é uma vantagem uma vez que remoção dos agregadostorna possível obter composições de um polipeptídeo de interesse que sãomais concentradas do que se a dita composição não tivesse sido pré-tratada.
Quando a concentração da composição na etapa b) é realizadaatravés de um método que é baseado na remoção de água, tal como seca-gem por congelamento ou evaporação, o pré-tratamento na etapa a) tem avantagem que ele reduz a quantidade de agregados presente na composi-ção concentrada.
A etapa a) pode ser realizada através de uma das três alternati-5 vas que seguem:
• Centrifugação,
• Filtragem ou
• Centrifugação e filtragem.
Se a etapa a) compreender ambos centrifugação e filtragem, é uma vantagem realizar a centrifugação antes da filtragem uma vez que osinventores da presente invenção constataram que a centrifugação remove amaioria dos agregados grandes e a filtragem subseqüentemente remove osagregados menores restantes.
Centrifugação
Para ser capaz de remover os agregados a composição com-preendendo um polipeptídeo de interesse pode ser centrifugada em umaforça na faixa de 1500-3000 g, tal como na faixa de 1800-2500 g ou na faixade 2000-2300 g.
Tipicamente a composição pode ser centrifugada por 10-60 mi-nutos, tal como por 15-50 minutos ou por 20-40 minutos.
Como a temperatura pode afetar a estabilidade do polipeptídeode interesse a centrifugação pode ser realizada em uma temperatura na fai-xa de 2-203 C, tal como de a partir de 3-15Q C ou na faixa de 3-10® C ou nafaixa de 3-89 C, tal como a 4Q C ou 5g C ou 6e C.
A centrifugação resulta em que o polipeptídeo de interesse a-grega sedimento, isto é, ele forma um pelete, enquanto o polipeptídeo indivi-dual de moléculas de interesse fica na solução. Então é o sobrenadante dacomposição centrifugada que é subseqüentemente usado no método dapresente invenção.
Filtragem
A composição compreendendo um polipeptídeo de interesse po-de ser filtrada através de um filtro tendo um tamanho de poro na faixa de0,20-5 μm, tal como na faixa de 0,2-2,5 µm.
Além do tamanho de poro do filtro também o material do qual ofiltro é feito pode afetar a filtragem do polipeptídeo de interesse. Exemplosde filtros de membrana adequados incluem, mas não estão limitados a, poli-etersulfona (PES), acetato de celulose, celulose regenerada e fluoreto depolivinilideno (PVDF).
Quando as moléculas tal como proteínas são filtradas geralmen-te as moléculas pequenas é que são removidas então após filtragem o poli-peptídeo de interesse pode geralmente estar presente no retèntato. Então égeralmente o retentato da filtragem que é usado nas etapas subseqüentesda presente invenção.Etapa b) concentração
A princípio qualquer método de concentração do polipeptídeo decomposição de interesse pode ser usado na etapa b) da presente invenção.
Exemplos de tais métodos adequados incluem, mas não estãolimitados a, ultrafiltragem e concentração através de remoção de água.Ultrafiltraqem
Ultrafiltragem é um método de separação onde pressão hidráuli-ca é usada para forçar moléculas e solvente através de uma membranacompreendendo poros de um tamanho particular, também conhecidos comoo tamanho de corte de valor. Apenas moléculas que têm um peso molecularmenor do que o valor de corte da membrana são capazes de cruzar a mem-brana enquanto aqueles com um peso molecular maior não cruzam a mem-brana e formam o chamado retentato. As moléculas presentes no retentatosão então concentradas conforme o solvente flui através da membrana.
Em uma modalidade particular a concentração da solução oucomposição compreendendo o polipeptídeo de interesse pode ser realizadaatravés de Filtragem de fluxo tangencial (TFF). Este método é em particularútil para concentração em grande escala, isto é, para concentração de solu-ções com um volume de a partir de um litro a várias centenas de litros. Entãoeste método é em particular útil para produção de soluções concentradas deum polipeptídeo de interesse em uma escala industrial.A técnica TFF é baseada no uso de um aparelho particular quefaz com que a solução que deve ser filtrada flua através de uma membranasemipermeável; apenas moléculas que são menores do que os poros damembrana vão passar pela membrana, formando o filtrado, deixando maté-ria maior a ser coletada (retentato). Com o método TFF duas pressões dife-rentes são aplicadas; uma para bombear a solução para o sistema e circulá-la no sistema (pressão de entrada) e outra pressão é aplicada sobre a mem-brana (pressão de membrana) para forçar as moléculas pequenas e o sol-vente através da membrana. A pressão de entrada pode tipicamente estarna faixa de 0,1 - 0,3 mPa (1 -3 bar), tal como entre 0,15 - 0,2 mP (1,5-2 bar).
A pressão de membrana pode tipicamente ser maior do que 0,1 mPa (1 bar).
A composição concentrada de um polipeptídeo de interesse po-de ser coletada como o retentato quando TFF é usada para concentrar acomposição.
Membranas úteis para TFF podem tipicamente ser feitas de ce-lulose regenerada ou polietersulfona (PES).
O tamanho de poro da membrana pode tipicamente ter um cortede peso molecular que é menor do que 10.000 Mw, tal como na faixa de 10-10.000 Mw.
Em outra modalidade a concentração da composição compreen-dendo um polipeptídeo de interesse pode ser realizada através do uso deum dispositivo centrífugo. O princípio deste método é que a solução é filtradaem uma membrana através da aplicação de uma força centrífuga sobre amembrana. Tais membranas são freqüentemente caracterizadas por um cor-te de peso molecular (Mw), isto é, este é o tamanho molecular máximo decompostos que são capazes de cruzar a membrana e composto com umtamanho molecular maior do que isto não vai cruzar a membrana. O corte deMw da membrana usada na presente invenção pode em particular ser menordo que 30.000 Mw, tal como entre 10-30.000 Mw.
A membrana pode em particular ser feita de polietersulfona(PES) ou celulose regenerada.
Exemplos de tais dispositivos de filtro comerciais adequados po-dem ser Centricon Plus-80 ou Centricon Plus-15.
A concentração pode tipicamente ser realizada através de centri-fugação a 2000-4500 g, tal como entre 2500-4000 g ou entre 2700-3500 gou entre 3000-3500 g, tal como entre 3000 g ou 3100 g ou 3200 g ou 3300 gou 3440 g ou 3500 g.
Tipicamente a centrifugação pode ser realizada por várias horas,por exemplo, por mais de uma hora, tal como por 1-10 horas.
Para minimizar quaisquer efeitos negativos sobre a estabilidadedo polipeptídeo de interesse a centrifugação pode em particular ser realizadaem uma temperatura na faixa de 2-20°C, tal como na faixa de 3-15°C ou nafaixa de 3-10°C ou na faixa de 3-6°C.
Concentração através de remoção de água
O princípio de concentração através de remoção de água é ge-ralmente que toda, ou a maior parte, da água seja removida para obter umsólido, ou então subseqüentemente diluindo ou dissolvendo este sólido emum volume de água que é menos do que o que era previamente diluído oudissolvido. No entanto, ela pode ser a princípio realizada apenas removendoa quantidade de água necessária para obter a concentração desejada semsubseqüentemente rediluição ou redissolução do composto.
Exemplos de métodos adequados de concentração através deremoção de água incluem secagem com congelamento e evaporação.
Ambos para secagem por congelamento e evaporação os trêsparâmetros mais relevantes são a temperatura, pressão e o tempo.
O método de secagem por congelamento pode compreender astrês ou quatro etapas que seguem; uma fase de congelamento, uma fase desecagem primária e uma fase de secagem secundária e opcionalmente umaetapa de anelamento após a fase de congelamento. Secagem por congela-mento pode em particular ser realizada conforme aqui descrito com relaçãoà secagem com congelamento incluída como uma etapa adicional do méto-do da presente invenção.
Etapas adicionais
O polipeptídeo de interesse pode derivar de uma fonte natural,isto é, de células naturalmente expressando o polipeptídeo de interesse, ouele pode ser em particular expresso recombinante.
Independente de onde o polipeptídeo de interesse deriva elepode ter sido purificado antes de ser submetido a um método da presente invenção.
Tal "purificação" pode em particular incluir, mas não está limita-da à, remoção de restos celulares, remoção de outras proteínas que não opolipeptídeo de interesse e remoção de outros componentes que possamestar presentes na fonte da qual o polipeptídeo de interesse é derivado. En- tão em uma modalidade particular da presente invenção a composição com-preendendo um polipeptídeo de interesse compreende menos do que 5%p/p ou menos do que 1% p/p ou menos do que 0,5 p/v ou menos do que0,1% p/v ou menos do que 0,05% p/v ou menos do que 0,01% p/v de outrasproteínas que não o polipeptídeo de interesse.
Então outras proteínas que são expressas por, por exemplo,uma célula hospedeiro podem ser removidas da composição compreenden-do um polipeptídeo de interesse antes dela ser usada em um método dapresente invenção.
Então em uma modalidade particular o método da presente in- venção pode compreender uma ou mais das etapas que seguem antes daetapa a):
i) expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse
ii) purificação de polipeptídeo de composição de interesse atra-vés de uma ou mais etapas de cromatografia
iii) troca do tampão de formulação.
Expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse podeem particular ser realizada conforme previamente descrito com relação aopolipeptídeo de interesse.
Se o polipeptídeo de interesse for PBGD exemplos de tipos ade-quados de cromatografia incluem, mas não estão limitado a, cromatografiapor afinidade, Cromatografia de Troca de Ion (IEC) e cromatografia em umacoluna de hidroxiapatita. A princípio qualquer combinação desses métodosde cromatografia pode ser usada. Os inventores da presente invenção cons-tataram previamente para PBGD que é uma vantagem realizar pelo menos aetapa de cromatografia por afinidade e se esta for combinada com qualquerum dos outros métodos de cromatografia é uma vantagem realizar a etapade cromatografia por afinidade antes das outras etapas de cromatografia(vide, por exemplo, WO 03/002731).
Para a modalidade onde o polipeptídeo de interesse é PBGDexemplos de colunas de cromatografia de afinidade comercialmente disponí-veis incluem colunas de acoplamento por afinidade, afinidade específica degrupo e afinidade de quelato de metal.
O catálogo de produto 2001 da companhia Amersham Pharma-cia Biotech dá exemplos de colunas de acoplamento por afinidade tal comocolunas compreendendo Iigantes de imobilização contendo -NH2 e colunascompreendendo Iigantes contendo grupos amino primários.
Colunas de afinidade de quelato de metal são especialmentepreferidas para purificação de proteínas através de formação de complexode íon de metal com grupos histidina expostos. O Exemplo 3 doW001/07065 descreve construção de uma Porfobilinogênio desaminasehumana com uma "expressão His" (rhPBGD-His). A fim de purificar rhPBGD-His é preferido usar uma coluna por afinidade de quelato de metal, tal comouma coluna tendo uma resina de afinidade de metal para cobalto.
Exemplos de outros métodos adequados de cromatografia porafinidade incluem, mas não estão limitados a, colunas tendo heparina deporco como Iigante ou colunas tendo ácido 1 -Amino-4-[[4-[[4-cloro-6-[[3- (ou4)-sulfofenil]amino]-1,3,5-triazin-2-il]-amino]-3-sulfofenil]amino]-9,10-diidro-9,10-dioxo-2-antracenossulfônico, também conhecido como Cibracon Blue3G, como Iigante e usando acoplamento de Triazina como o método de aco-plamento de ligante. Um exemplo comercialmente disponível do último éBlue Sepharose 6 Fast Flow (FF) da Amersham Pharmacia Biotech. Destemodo, uma modalidade preferida da invenção refere-se ao processo, con-forme aqui descrito, onde a coluna de cromatografia por afinidade da etapa(i) é uma coluna usando um acoplamento de triazina como método de aco-33
plamento de ligante, e com mais preferência onde o Iigante é Cibacron 3G.
O termo "Cromatografia de Troca de Ion (IEC)" deve ser aquicompreendido de acordo com a técnica como uma coluna separando molé-culas tal como proteínas com base em sua carga líquida em um certo pH5 através de ligação eletrostática a um grupo carregado na coluna. Troca deíon significa a absorção de íons de um tipo em uma coluna em troca de ou-tros que estão perdidos em solução.
Exemplos de colunas IEC adequadas são colunas tal como umacoluna Q Sepharose, uma coluna Q SP Sepharose ou uma coluna CM Se-10 pharose, ela pode ser em particular uma coluna DEAE Sepharose.
Um exemplo de uma coluna de hidroxiapatita adequada é umacoluna de hidroxiapatita de cerâmica. Hidroxiapatita (CasíPO^OH^ é umaforma de fosfato de cálcio que pode ser usada para a separação e purifica-ção de proteínas, enzimas, ácidos nucléicos, vírus e outras macromoléculas.
15 Hidroxiapatita de cerâmica é uma forma macroporosa, esférica, de hidroxia-patita. CHT Tipo I (Bio-Rad) é um exemplo de uma coluna de cromatografiade hidroxiapatita de cerâmica comercialmente disponível adequada.
Em uma modalidade o método da presente invenção pode com-preender as etapas que seguem antes da etapa a):
20 i) expressão recombinante de PBGD
ii) submissão da composição de PBGD da etapa b) à cromato-grafia por afinidade
iii) submissão da composição de PBGD da etapa (ii) a uma cro-matografia de troca de íon.
25 Em uma modalidade adicional o método da presente invenção
pode compreender as etapas que seguem antes da etapa a):
i) expressão recombinante de PBGD
ii) submissão da composição de PBGD da etapa i) à cromatogra-fia por afinidade
30 iii) submissão da composição de PBGD da etapa ii) à cromato-
grafia de troca de íon
iv) submissão da composição de PBGD da etapa iii) a uma colu-na de hidroxiapatita.
Ambos métodos podem opcionalmente incluir uma etapa adicio-nal de diluição de diafiltragem da composição de PBGD obtida da etapa ii).Então a dita etapa deve ser após a etapa ii) e antes da etapa iii), isto é, umaetapa iia). A etapa iia) tem o propósito de redução da concentração de saispara condutividade adequada, por exemplo< 10 mS/cm. Isto pode em parti-cular ser relevante se DEAE Sepharose for usada como resina na etapa decromatografia de troca de íon, isto é, etapa iii), como isto pode facilitar liga-ção da PBGD capturada à resina DEAE Sepharose. Diluição pode ser obtidaatravés da adição de água purificada diretamente ou através de ultrafiltra-gem contra água purificada.
A expressão recombinante de PBGD, etapa i), pode ser realiza-da através de qualquer um dos métodos descritos acima.
Exemplos de colunas de cromatografia de afinidade adequadasna etapa ii) podem ser qualquer um dos acima mencionados.
Exemplos de métodos adequados de realização de cromatogra-fia de troca de íon na etapa iii) podem ser qualquer um dos acima mencio-nados.
Exemplos de colunas de cromatografia de hidroxiapatita ade-quadas na etapa iv) podem ser qualquer um dos acima mencionados.
Em uma modalidade particular a coluna de cromatografia porafinidade pode ser uma coluna usando um acoplamento de triazina comométodo de acoplamento de ligante, e em particular tal método onde o Iiganteé Cibracon Blue 3G. Esta pode ser em particular uma coluna Blue Sepharo-se 6 Fast Flow1 e a coluna de cromatografia de troca de íon pode ser colunaDEAE Sepharose, e na modalidade onde o método também compreendeuma etapa iv) esta coluna pode em particular ser uma coluna de hidroxiapati-ta de cerâmica.
O método da presente invenção pode também compreender e-tapas adicionais após a etapa b) do método. Tais etapas incluem, mas nãoestão limitadas a, um ou mais do que segue:
• secagem por congelamento da composição compreendendoum polipeptídeo concentrado de interesse,
• mudança do tampão da composição compreendendo um poli-peptídeo concentrado de interesse,
• filtragem estéril da composição compreendendo um polipeptí-deo concentrado de interesse.
• evaporação.
Secadores por congelamento, volume de soluções a serem se-cas por congelamento e outros parâmetros diferentes podem ser usados nométodo da presente invenção. Um exemplo de um secador por congelamen-to adequado inclui, mas não está limitado a, um secador por congelamentoLyostar (FTM-Systems) conforme usado nos exemplos da presente inven-ção, onde as soluções compreendendo um polipeptídeo concentrado de inte-resse, isto é, neste caso PBGD, foram cheias em frações de vidro de injeçãode 2 e 6 ml (tipo 1) e tampadas com rolhas de borracha (clorobutila). A se- cagem por congelamento pode ser realizada através das três etapas queseguem:
i) congelamento,
ii) secagem primária, e
iii) secagem secundária.
Etapa i) congelamento pode em particular ser realizado primeirocarregando uma amostra em temperatura ambiente e esfriando-a para O0 Ce mantendo-a a O0 C por 30 minutos, antes de diminuir a temperatura em 1QC por minuto para -40s C e mantê-la a -409 C por 30 minutos.
Etapa ii) secagem primária pode em particular ser realizada ob-tendo a pressão a vácuo 16,78 Pa (126 mTorr), aumentando a temperaturaem 19 C por minuto para O0 C e mantendo a amostra a O0 C por 360 minutos.
Etapa iii) secagem secundária pode em particular ser realizadaobtendo o vácuo integral simultaneamente com aumento da temperatura em0,5S C por minuto para 30°C e mantendo a amostra a 30°C por 360 minutos.
Após a secagem secundária a amostra pode ser ainda fechada avácuo ou fechadas após enchimento com nitrogênio.
Um exemplo de um método de secagem com congelamento a-dequado inclui o descrito nos exemplos da presente invenção.
A secagem por congelamento pode em modalidade adicionalcompreender uma etapa de anelamento antes da fase de secagem primária.Os inventores da presente invenção constataram que inclusão de uma etapade anelamento no método de secagem por congelamento melhora a aparên-cia visual, conforme visualizado por menos quebras, e/ou resulta em umtempo de reconstituição menor do produto seco por congelamento do quequando o mesmo método de secagem por congelamento é usado, mas sema etapa de anelamento. É uma vantagem que o tempo para reconstituiçãode um produto seco por congelamento seja reduzido, especialmente se eletiver que ser usado como um agente farmacêutico que é administrado comouma solução. Uma aparência visual melhorada é geralmente também consi-derada como uma vantagem para a maioria dos produtos.
Então a secagem por congelamento pode compreender as eta-pas que seguem:
i) secagem
ii) anelamento
iii) secagem primária
iv) secagem secundária.
As etapas de congelamento, secagem primária e secagem se-cundária podem em particular ser realizadas conforme acima descrito. A e-tapa de anelamento, isto é, etapa ii), pode em particular ser realizada apósminutos de congelamento, aumentando a temperatura a, por exemplo,uma taxa de 2Q C por minuto para -10e C ou -20e C e mantendo esta tempe-ratura por 120 ou 420 minutos e então diminuindo a temperatura, por exem-plo, uma taxa de 2- C por minuto para -40s C temperatura na qual a amostrapode ser mantida 60-90 minutos antes do início da etapa de secagem primá-ria.
Mudança do tampão da composição compreendendo um poli-peptídeo concentrado de interesse pode em particular ser realizada atravésde a) diluição, por exemplo, 5-15 vezes, da composição compreendendo umpolipeptídeo concentrado de interesse em um tampão ou formulação, b)concentração da composição diluída novamente e realização das etapas a)e b) um número suficiente de vezes de modo que quantidade dos excipien-tes no tampão ou formulação presente na composição antes dessas etapasconstitui menos do que, por exemplo, 5% v/v ou menos do que 1% v/v deexcipientes no tampão ou formulação presente na dita composição após asditas etapas terem sido realizadas.
Em particular a composição compreendendo um polipeptídeo deinteresse obtida da etapa b) da presente invenção pode em particular com-preender ainda uma etapa de filtragem estéril da dita composição e/ou umaetapa de secagem por congelamento da composição.
Filtragem estéril é geralmente realizada através de filtragem dacomposição através de um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm ou0,20 μm. Secagem por congelamento pode em particular ser realizada con-forme acima descrito.
A presente invenção refere-se também a uma composição seca
por congelamento obtida através de um método da presente invenção.Injeção subcutânea
A presente invenção refere-se também ao uso de uma composi-ção compreendendo na faixa de 50-300 mg/ml de polipeptídeo de interessepara a fabricação de um medicamento para injeção subcutânea em um ma-mífero.
O polipeptídeo de interesse pode ser qualquer polipeptídeo deinteresse de acordo com a presente invenção, incluindo, mas não limitado a,PBGD, aril sulfatase A, alfa-manosidase Iisossomal e galactocerebrosidase.
O termo subcutâneo é freqüentemente abreviado s.c. e os doistermos podem ser usados intercomutavelmente no contexto da presente in-venção.
Quando injeção é realizada subcutaneamente não é geralmentepossível injetar mais do que 1,5 mL devido a restrições fisiológicas.
Como o paciente geralmente precisa de uma certa quantidadedo polipeptídeo particular de interesse há uma correlação entre o volume dacomposição compreendendo um polipeptídeo de interesse que precisa seradministrado ao paciente e a concentração de polipeptídeo de interesse nadita composição.
É então uma vantagem da presente invenção que a composiçãocompreendendo um polipeptídeo de interesse compreenda uma alta concen-tração do polipeptídeo de interesse e que esta alta concentração do polipep-tídeo de interesse possa ser obtida sem a formação de grandes quantidadesde agregados de polipeptídeo. O uso de tal polipeptídeo concentrado decomposições de interesse torna possível injetar um volume menor da ditacomposição e ao mesmo tempo assegura que o paciente receba uma quan-tidade adequada do polipeptídeo de interesse; então tornando mais fácil ad-ministrar o polipeptídeo de interesse subcutaneamente.
A composição acima mencionada compreendendo um polipeptí-deo de interesse pode em particular compreender entre 75-250 mg/ml, talcomo entre 75-200mg/ml ou entre 75-150 mg/ml ou entre 100-150 mg/ml ouentre 100-125 mg/ml ou entre 125-150 mg/ml de polipeptídeo de interesse.
Conforme acima descrito o volume de composição compreen-dendo um polipeptídeo de interesse que é necessário injetar no pacientepara assegurar que o paciente receba uma quantidade adequada do poli-peptídeo de interesse se relaciona com a concentração do polipeptídeo deinteresse na dita composição.
Então o volume de tal composição vai geralmente ser ajustadode acordo com a concentração do polipeptídeo de interesse na composição.No entanto, o volume pode geralmente estar na faixa de 0,1-1,5 ml, tal comona faixa de 0,1-1,5 ml ou na faixa de 0,5-1,5 ml ou na faixa de 0,5-1,5 ml ouna faixa de 0,75-1,5 ml ou na faixa de 0,75-1,5 ml ou na faixa de 1 -1,5 ml ouna faixa de 1-1,5 ml.
A quantidade de polipeptídeo de interesse que é relevante admi-nistrar a um paciente geralmente depende do peso do indivíduo e do poli-peptídeo particular de interesse.
Em uma modalidade a presente invenção refere-se a um métodode tratamento de um mamífero para Porfiria Intermitente Aguda compreen-dendo injeção subcutânea de uma composição de 50-300 mg/ml de PBGD.Administração de PBGD pode em particular ser útil para o trata-mento de Porfiria Intermitente Aguda. No entanto, é compreendido que ad-ministração de PBGD também pode ser útil para o tratamento de outras por-firias, tal como Coproporfiria hereditária ou Porfiria variegata. Porfiria é umtermo usado para coletivamente descrever várias doenças causadas pordeficiências diferentes no curso biossintético do heme. Então é compreendi-do que administração de PBGD1 por exemplo, em combinação com outrosterapêuticos, a um paciente sofrendo de qualquer tipo de porfiria possa aju-dar a aumentar o turnover geral dos intermediários diferentes no curso. Porexemplo, Meissner, P.N. e outros, 1986, European Journal of Clinicai Inves-tigation, vol. 16, 257-261; Hift, R.J. e outros, 1997, S. Afr. Med. J., vol. 87,718-27 e Meissner, P. e outros, 1993, J. Clin. Invest., vol. 91, 1426-44 des-crevem acúmulo de ALA e PBG em Coproforia hereditária e Porfiria variega-ta. Nessas doenças o acúmulo de ALA e PBG resulta de defeitos enzimáti-cos que estão localizados quatro e cinco etapas a jusante da conversão deALA em PBG, respectivamente. Nos dois trabalhos mais recentes é descritocomo o porfirinogênio que acumula em pacientes com Porfiria variegata écapaz de inibir PBG-desaminase.
Em uma modalidade adicional a presente invenção refere-se aum método de tratamento de um mamífero para Ieucodistrofia metacromáti-ca compreendendo injeção subcutânea de uma composição de 50-300mg/ml de aril sulfatase A.
Leucodistrofia metacromática (MLD) é causada por um defeitogenético recessivo autossomal na enzima Iisossomal Arilsulfatase A (ASA),resultando em uma quebra progressiva de membranas da bainha da mielina(desmielinação) e acúmulo de galactosil sulfatídeo (cerebrosídeo sulfato) emmatéria branca de ambos sistema nervoso central (CNS) e sistema nervosoperiférico. Em preparações histolóticas, galactosil sulfatídeo forma massasgranulares esféricas que tingem metacromaticamente. Galactosil sulfatídeotambém acumula dentro do rim, vesícula biliar e certos outros órgãos visce-rais e é excretado em quantidades excessivas na urina.
Galactosil sulfatídeo é normalmente metabolizado pela hidrólisede ligação 3-O-sulfato para formar galactocerebrosídeo através da açãocombinada da enzima Iisossomal arilsulfatase A (E.C. 3.1.6.8) (Austin e ou-tros, Biochem. J. 1964, 93, 15C-17C) e uma proteína ativadora de esfingoli-pídeo chamada saposina B. Uma deficiência profunda em arilsulfatase Aacontece em todos os tecidos de pacientes com as formas infantil tardia,juvenil e adulta de MLD (vide abaixo). A seguir, a proteína arilsulfatase Aserá chamada "ASA". Uma deficiência profunda de ASA acontece em todosos tecidos de pacientes com MLD.
Em ainda outra modalidade a presente invenção refere-se a ummétodo de tratamento de um mamífero para distúrbio de armazenamentoIisossomal alfa-manosidose compreendendo injeção subcutânea de umacomposição de 50-300 mg/ml de alfa-manosidase lisossomal.
Alfa-manosidose é uma doença autossomal, recessiva, que a-contece em todo o mundo com uma freqüência entre 1/1.000.000 e1/500.000. Manosidose é encontrada em todos os grupos étnicos na Europa,América, África e também Ásia. Ela é detectada em todos os países com umbom serviço de diagnóstico para distúrbios de armazenamento lisossomal,em uma freqüência similar. Eles nascem aparentemente saudáveis; no en-tanto, os sintomas das doenças são progressivos. Alfa-manosidose mostraheterogeneidade clínica, variando de muito séria a formas muito leves. Sin-tomas clínicos são: retardo metal, mudanças esqueletais, sistema imune pre-judicado resultando em infecções recorrentes, prejuízo à audição e freqüen-temente a doença está associada com uma característica facial típica talcomo uma face áspera, uma testa proeminente, uma ponte nasal achatada,um nariz pequeno e uma boca grande. Nos casos mais severos (manosido-se tipo I) as crianças sofrem de hetaposplenomegalia, e eles morrem duran-te os primeiros anos de vida. Possivelmente esta morte precoce é causadapor infecções severas devido à imunodeficiência causada pela doença. Emcasos mais leves (manosidose tipo 2) os pacientes geralmente atingem aidade adulta. A fragilidade esqueletal dos pacientes resulta em necessidadesde cadeiras de rodas na idade de 20 a 40. A doença causa uma disfunçãodifusa do cérebro freqüentemente resultando em desempenhos mentais fra-cos que excluem tudo menos as habilidades mais básicas de leitura e escritasimples. Esses problemas associados com incapacidades de ouvir e outrasmanifestações clínicas precludem o paciente de uma vida independente, aconseqüência sendo que o cuidado por toda a vida é necessário.
Em ainda outra modalidade a presente invenção refere-se a ummétodo de tratamento de um mamífero para doença de Krabbe compreen-dendo injeção subcutânea de uma composição de 50-300 mg/ml de galacto-cerebrosidase.
Em humanos uma deficiência em enzima GALC resulta em umadoença de Armazenamento Lisossomal genética herdada autossomal co-nhecida como doença de Krabbe ou Leucodistrofia de Célula Globóide. Aenzima é geralmente expressa nos testículos, rins, placenta, fígado e cére-bro de seres humanos e uma deficiência na enzima GALC geralmente resul-ta em um distúrbio no metabolismo de mielina e nos sistemas nervosos cen-tral e periférico (o SNC e SNP, respectivamente).
A doença de Krabbe foi observada em seres humanos de qual-quer idade, nacionalidade e sexo.
Deve ser notado que modalidades e características descritas nocontexto de um dos aspectos da presente invenção também se aplicam aosoutros aspectos da invenção. Em particular, todas as modalidades descritaspara a composição compreendendo um polipeptídeo de interesse, tal como apresença de compostos adicionais, tampões e pH, também se aplicam àcomposição compreendendo um potipeptídeo de interesse usada no presen-te pedido.
Quando um objeto de acordo com a presente invenção ou um deseus traços ou características é referido no singular isso também refere-seao objeto ou seus traços e características no plural. Como um exemplo,quando se referindo a "um polipeptídeo" deve ser também compreendidocomo se referindo a um ou mais polipeptídeos.
Durante todo o presente relatório a palavra "compreendem", ouvariações tal como "compreende" ou "compreendendo, será compreendidaimplicar a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou etapa, ou grupo deelementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro ele-mento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.
Todas as referências de patente e não-patente citadas no pre-sente pedido são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.
A invenção será agora descrita em detalhes adicionais nas Se-ções experimentais não-limitantes que seguem.
EXPERIMENTAL
Materiais
rhPBGD
A rhPBGD usada nos experimentos que seguem foi obtida deacordo com o processo 2 no exemplo 1 do WO 03/002731, onde o processo2 é o processo que inclui a etapa IV, isto é, a etapa de cromatografia de hi-droxiapatita cerâmica.
Tampão de formulação
A rhPBGD recombinante e purificada estava presente no tampãode formulação aquosa que segue:
Na2HPO4 a 3,67 mM
Glicina a 27 mM
Manitol a 250 mMe um pH de 7,9.
O tampão de formulação foi então filtrado estéril através de umfiltro de 0,22 µm.
Métodos
Secagem por congelamento
A secagem por congelamento das soluções de rhPBGD foi reali-zada em um secador por congelamento Lyostar (FTM-systems) de acordocom o programa que segue:<table>table see original document page 44</column></row><table>
Observação visual (Clareza e cor)
O líquido foi visualmente estudado com relação à cor, clareza eprecipitados de acordo com o esquema abaixo.
Cor: 1: Nenhuma cor; 2: Ligeiramente amarelo; 3: Amarelo
Clareza: 1: Claro; 2: Ligeiramente turvo; 3: Turvo
Outras observações: Outras observações do operador foram emalguns casos incluídas aqui (por exemplo, precipitados, material não-dissolvido, etc).
Medição do pH
O medidor de pH (Medidor de pH Metrohm 691) e eletrodo (ele-trodo de pH LL combinado) foram calibrados com 3 soluções de referência-padrão (Merck) na faixa de 4,00 a 9,00. O líquido foi finalmente analisado.
Concentração de proteína
A concentração de proteína em extrato, amostras em processo,substância de fármaco-padrão e produto final foi determinada através de ummétodo que utiliza princípios da redução de Cu2+ em Cu+ pela proteína emum meio alcalino (a reação Biuret). Os íons de Cu+ foram então reagidoscom um reagente contendo ácido bicinconínico resultando em uma detecçãocolorimétrica altamente sensível e seletiva.
Pureza
Porfobilinogênio desaminase humana recombinante (rhPBGD) evariantes de rhPBGD foram separadas de acordo com sua habilidade emabsorver e dessorver para meios estacionários baseados em sílica depen-dendo da porcentagem de modificador orgânico (acetonitrila) na fase móvel.Atividade de rhPBGD
Porfobilinogênio desaminase (PBGD) catalisa a adição de 4 mo-léculas de porfobilinogênio (PBG) para formar um tetrâmero linear, preuro-porfirinogênio, que é liberado da enzima e in vivo circularizado para uroporfi-rinogênio III pela ação de Uroporfirinogêηio III sintase. Preuroporfirinogêniopode ser quimicamente oxidado com benzoquinona para formar uroporfirina,que absorve luz a 405 nm.
As análises foram realizadas em um frasco único em cada oca-sião de teste. Para a determinação da atividade de rhPBGD e concentraçãode proteína os testes foram realizados em duplicata e triplicada respectiva-mente, para cada frasco.Osmolalidade
Um frasco de rhPBGD seca por congelamento foi ressuspensoem 1,00 I de MilliQ-Water. O frasco de solução aquosa congelada derhPBGD foi descongelado. O osmômetro (osmômetro Vapro) foi calibradocom 3 soluções-padrão na faixa de 100-1000 mOsm/kg (100, 290, 1000mOsm/kg). O líquido foi então analisado.
Exemplo 1
Concentração com dispositivos de filtro centrífugo
Solução-padrão de PBGD congelada (7 mg/mL de rhPBGD,Na2HPO4 a 3,67 mM, glicina a 27 mM, Manitol a 250 mM, pH 7,9) foi des-congelada em um banho de água a 209 C, centrifugada a 3200 g por 10 mi-nutos e em seguida filtrada estéril por filtros PES de 0,20 μm (filtros de Polie-tersulfona Nalgene). A solução-padrão de PBGD foi concentrada para 100mg/ml ativando a Centifugal Filter Devices Centricon Plus-80 (corte de Mw30000) e Centricon Plus-15 (corte de Mw 30000) a 3200 g por várias horas.A solução concentrada, isto é, o retentato, foi filtrada estéril por filtros de0,22 μm (Millex GV) e finalmente uma parte desta solução foi diluída comtampão de formulação estéril para dar 50 mg/ml. A solução-5 mg/ml foi pre-parada através de diluição direta da hPGGD recombinante e purificada comtampão de formulação estéril.
Os 5 mg/mL, 50 mg/mL e 100 mg/mL de rhPBGD foram entãosecos por congelamento conforme acima descrito. Vários frascos de cadauma das soluções de rhPBGD secas por congelamento mencionadas acimacom 5, 50 e 100 mg/mL de rhPBGD e da solução de rhPBGD de 5 mg/mLforam armazenados a 40-C ± 2-C, 75% ± 5% de umidade relativa (RH). Osfrascos foram armazenados protegidos da luz em uma embalagem secundá-ria bem vedada (caixa de papel).
Nos pontos de tempo indicados (isto é, tempo de armazenamen-to) um frasco de cada amostra seca por congelamento foi ressuspenso em1,00 mL de água Millipore.
Cada um dos frascos ressuspensos e o frasco aquoso derhPBGD foram então visualmente observados com relação à cor, clareza eprecipitados, e o pH, concentração de proteína, pureza e atividade derhPBGD foram medidos conforme acima descrito.
Os resultados são dados nas Tabelas 1-4 que seguem:
Tabela 1: Produto seco por congelamento, 5 mg/mL
<table>table see original document page 46</column></row><table>
Tabela 2: Produto seco por congelamento, 50 mg/mL
<table>table see original document page 46</column></row><table>Tabela 3: Produto seco por congelamento. 100 ma/mL
<table>table see original document page 47</column></row><table>
Tabela 4: Produto aguoso, 5 mg/mL
<table>table see original document page 47</column></row><table>
Exemplo 2
Concentração de uma composição de rhPBGD através de dispositivos de filtro centrífugo
Solução-padrão de PBGD congelada (7 mg/mL de rhPBGD,Na2HPO4 a 3,67 mM, glicina a 27 mM, Manitol a 250 mM, pH 7,9) foi des-congelada em um banho de água a 20e C, centrifugada a 3200 g por 10 mi-nutos e em seguida filtrada estéril por filtros PES de 0,20 μιτι (filtros de Polie- tersulfona Nalgene). A solução-padrão de PBGD foi concentrada para 100mg/ml acionando o Centrifugai Filter Devices Centricon Plus-80 (corte de Mw30000) e Centricon Plus-15 (corte de Mw 30000) a 3200 g por várias horas.A solução concentrada, isto é, o retentato, foi filtrada estéril por filtros de0,22 μηι (Millex GV) e diluída com tampão de formulação filtrado estéril (vide acima) para dar soluções de concentrações menores. Uma fração em volu-me de cada concentração foi seca com congelamento conforme acima des-crito.
As concentrações diferentes de rhPBGD seca por congelamentoe solução aquosa de rhPBGD foram armazenadas a 5°C ± 3°C ou a -20°C± 5°C (umidade relativa ambiente (RH)). Todos os frascos foram armazena-dos protegidos da luz em uma embalagem secundária bem vedada (caixa depapel).
Nos pontos de tempo indicados (isto é, tempo de armazenamen-to) um frasco de cada amostra seca por congelamento foi ressuspenso em1,00 mL de água Millipore e então testado junto com a solução aquosa derhPBGD através de observação visual da cor, clareza e precipitados, e me-dindo o pH, concentração de proteína, pureza, osmolalidade e atividade derhPBGD.
Os resultados são dados nas Tabelas 5-19 que seguem:<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 0</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>Tabela 8: Produto aquoso, 17 mg/ml; Temp. de armazenamento: 5+°C
<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>Continuacao
<table>table see original document page 63</column></row><table><table> table see orginal document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table>Continuacao
<table>table see original document page 69</column></row><table>Tabela 19: Produto seco por
<table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table>Exemplo 3
Concentração de uma composição de rhPBGD através de filtragem de fluxotanqencial (TFF)
A solução-padrão de rhPBGD foi então descongelada por ummínimo de três dias a 5S C e no escuro.
A solução descongelada foi então centrifugada com 200 mL detubos centrífugos cônicos por aproximadamente 10 minutos a 2200 g.
A solução foi então filtrada através de uma série de filtros comos tamanhos de poro que seguem: 5,0 μιτι; 0,65 μιτι; 0,45 μηι e 0,20 pm an-tes dela ser concentrada através de filtragem de fluxo tangencial (TFF).
A concentração por TFF foi realizada com um Millipore LabscaleTFF System e Millipore Pellicon® XL Filter com uma pressão de entrada debomba de aproximadamente 137,9-172,37 kPa (20-25 psi) e uma pressão noPellicon® XL Filter de aproximadamente 27,58-41,37 kPa (4-6 psi). ArhPBGD foi protegida da luz durante o procedimento cobrindo o recipiente daamostra do TFF System por folhas de alumínio.
A solução de rhPBGD concentrada obtida do procedimento deTFF foi então trocada com tampão contra um tampão de formulação conten-do Na2HPO4 a 3,67 mM χ 2 H2O, glicina a 27 mM e Manitol a 220 mM prepa-rado em água estéril. Isto foi realizado adicionando continuamente o ditotampão ao sistema TFF e pressionando-o através da membrana até o ditotampão ter substituído o tampão anterior.
A solução de rhPBGD concentrada e com tampão trocado foientão filtrada estéril passando-a através de um filtro com um tamanho deporo de 0,22 μιτι. Esta filtragem estéril foi realizada duas vezes com um filtronovo a cada vez.
A solução de rhPBGD concentrada estéril foi então posta emfrascos antes dela ser seca por congelamento conforme descrito na seçãode método.
Exemplo 4
O efeito de modos de secagem por congelamento diferentes e/ou da quanti-dade de excipientes sobre o tempo de reconstituicãoPBGD foi concentrada conforme descrito no exemplo 3 e após atroca do tampão a concentração de PBGD determinada.
A solução de PBGD concentrada foi então seca por congela-mento em um secador por congelamento Lyostar (FTM-systems). As solu-ções foram enchidas em frascos de vidro de injeção de 2 e 6 ml (tipo 1) etampadas com rolhas de borracha (clorobutila).
Ciclo de secagem por congelamento original:
As amostras foram carregadas em temperatura ambiente e asprateleiras foram esfriadas para O ° C por 30 minutos. A temperatura foi dimi-nuída para -40e C (19 C por minuto) e mantida ali por 30 minutos e então apressão a vácuo foi obtida a 16,78 Pa (126 mTorr) e a secagem primáriacomeçou aumentando a temperatura para O ° C (18 C por minuto). Após 360minutos de secagem primária a temperatura foi aumentada para +30s C (0,5SC por minuto) e vácuo integral foi obtido simultaneamente (início da segundasecagem). A temperatura foi mantida a +30® C por 360 minutos e os frascosforam então tampados sob vácuo.
Secagem por congelamento com inclusão de uma etapa de anelamento:
<formula>formula see original document page 74</formula>
Após 30 minutos a-40s C a temperatura foi aumentada com umataxa de 2- C por minuto para -10Q C ou -20s C temperatura na qual elas fo-ram mantidas por 120 ou 420 minutos antes da temperatura ser diminuídanovamente com 2- C por minuto para -40s C onde as amostras foram manti-das por 60-90 minutos antes do início da secagem primária.
Os resultados são mostrados na Tabela 20 onde os termos a-breviados usados com relação aos excipientes e ciclo de secagem por con-gelamento significam o que segue:
1x quantidade de excipientes refere-se a que a solução dePBGD compreende Na2HPO4 a 3,67 mM χ 2H20, glicina a 27 mM e Manitola 220 mM preparado em água estéril.
1,5x quantidade de excipientes refere-se a que a solução dePBGD compreendendo Na2HPO4 a 5,51 mM χ 2 H2O, glicina a 40,5 mM eManitol a 375 mM preparado em água estéril, isto é, 1,5x de cada um doscomponentes presentes no tampão 1x.2x excipientes refere-se a que a solução de PBGD compreendeNa2HPO4 a 7,34 mM χ 2H20, glicina a 54 mM e Manitol a 500 mM preparadoem água estéril, isto é, 2x de cada um dos componentes presentes no tam-pão 1x.
O ciclo de secagem por congelamento original é conforme acimadescrito.
O ciclo de secagem por congelamento com anelamento é descri-to acima onde a etapa de anelamento compreende aumento da temperaturapara -10-C mantendo a amostra nesta temperatura por 120 minutos antesde diminui-la para -40-C novamente.
O ciclo de secagem por congelamento com anelamento estendi-do é conforme acima descrito onde a etapa de anelamento compreende au-mento da temperatura para -20-C mantendo a amostra nesta temperaturapor 420 minutos antes de diminui-la para -40-C novamente.
Tabela 20:
<table>table see original document page 75</column></row><table>Exemplo 5
O efeito de modos diferentes de secagem por congelamento e ou a quanti-dade de excipientes sobre a aparência do produto seco por congelamento
Soluções concentradas e secas por congelamento de PBGD fo-ram preparadas conforme descrito no exemplo 4 e referências à quantidadede excipientes e tipo de ciclo de secagem por congelamento têm o mesmosignificado que no exemplo 4.
Os resultados que seguem foram obtidos através de inspeçãovisual dos produtos secos por congelamento: A: Comparação de três produtos preparados de soluções com-
preendendo respectivamente 4,6 mg ml, 66,6 mg ml e 109,4 mg ml derhPBGD mostrou que o número de quebras no produto seco por congela-mento aumentou conforme a concentração de rhPBGD aumentou.
B: Comparação de dois produtos, preparados a partir de uma solução compreendendo 150 mg/ml de rhPBGD e compreendendo 1x e 1,5xquantidade de excipientes, mostrou que o número de quebras no produtoseco por congelamento era menor para o produto que compreendia 1,5quantidade de excipientes do que o produto compreendendo 1x quantidadede excipientes.
C: Comparação de dois produtos secos por congelamento pre-parados a partir de uma solução a 150 mg/ml de rhPBGD, compreendendo1x e 2x quantidade de excipientes, mostrou que o número de quebras noproduto seco por congelamento com 2x quantidade de excipientes era me-nor do que o produto compreendendo a quantidade 1x de excipientes. D: Comparação de três produtos secos por congelamento prepa-rados a partir de uma solução a 150 mg/ml de rhPBGD usando o ciclo desecagem por congelamento original, de anelamento e o de anelamento es-tendido mostrou que o número de quebras no produto seco por congelamen-to era menor no produto que foi preparado de acordo com o ciclo de seca- gem por congelamento com anelamento do que no produto preparado deacordo com o ciclo de secagem por congelamento original. Ainda, o númerode quebras no produto preparado de acordo com o ciclo de secagem porcongelamento com anelamento estendido foi menor do que no produto pre-parado de acordo com o ciclo de secagem por congelamento com anelamento.
E: Três produtos secos por congelamento foram preparados apartir de uma solução a 150, 175 e 200 mg/ml de rhPBGD, respectivamente.
Os produtos secos por congelamento compreendiam cada um 1x5 quantida-de de excipientes e eles foram secos por congelamento com o ciclo de ane-lamento. Nenhum dos produtos secos por congelamento compreendiaquaisquer quebras.
F: Dois produtos de rhPBGD secos por congelamento forampreparados a partir de uma solução de rhPBGD. Um deles compreendia 1xquantidade de excipientes e foi preparado de acordo com o ciclo de seca-gem por congelamento original, enquanto outro compreendia 1,5x quantida-de de excipientes e foi preparado de acordo com o ciclo de secagem porcongelamento come anelamento. O produto compreendendo 1,5x quantida-de de excipientes e preparado de acordo com o ciclo de secagem por conge-lamento com anelamento estendido compreendia menos quebras do que oproduto compreendendo 1x quantidade de excipientes e preparado de acor-do com o ciclo de secagem por congelamento original.
G: Dois produtos de rhPBGD secos por congelamento forampreparados de uma solução a 150 mg/ml de rhPBGD. Um deles compreen-dia 1x quantidade de excipientes e foi preparado de acordo com o ciclo desecagem por congelamento original, enquanto o outro compreendia Tween a0,1% em combinação com a 1 χ quantidade de excipientes e foi preparado deacordo com o ciclo de secagem por congelamento com anelamento estendi-do. O produto compreendendo Tween 80 a 0,1% em combinação com a 1xquantidade de excipientes e que foi preparado de acordo com o ciclo de se-cagem por congelamento com anelamento estendido compreendia menosquebras do que o produto que compreendia 1x quantidade de excipientes eque foi preparado de acordo com o ciclo de secagem por congelamento original.
Exemplo 6O efeito de volume de recuperação, da quantidade de excipientes e do modode secagem por congelamento sobre a estabilidade de rhPBGD seca porcongelamento
Amostras secas por congelamento de soluções de rhPBGD con-centradas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 4.
A "solução padrão" é uma solução concentrada de PBGD antesda secagem por congelamento.
A Tabela 21 mostra os resultados de soluções de rhPBGD tendoas características que seguem com relação à concentração de rhPBGD,quantidade de excipientes (onde as mesmas definições que no exemplo 4são usadas), o modo de secagem por congelamento (onde as mesmas defi-nições que no exemplo 4 são usadas) e a razão do volume de enchimento(Vol. de enchimento que é o volume da composição antes dela ser seca porcongelamento) versus o volume de recuperação (Vol. de recuperação que éo volume onde o produto seco por congelamento é ressuspenso):Solução 1:
• Aproximadamente 5 mg/ml de rhPBGD
• 1 χ quantidade de excipiente
• Ciclo de secagem por congelamento original
• Vol. de enchimento = Vol. de rec.
Solução 2:
Solução 3:
Solução 4:
• Aproximadamente 70 mg/ml de rhPBGD
• 1 χ quantidade de excipiente
• Ciclo de secagem por congelamento original
• Vol. de enchimento = 2x Vol. de rec.
• Aproximadamente 110 mg/ml de rhPBGD
• 1x quantidade de excipiente
• Ciclo de secagem por congelamento original
• Vol. de enchimento = Vol. de rec.
• Aproximadamente 70 mg/ml de rhPBGD1x quantidade de excipienteCiclo de secagem por congelamento com anelamentoVol. de enchimento = Vol. de rec.Solução 5:Aproximadamente 90 mg/ml de rhPBGD2/3x de quantidade de excipienteCiclo de secagem por congelamento originalVol. de enchimento = 1x5 Vol. de rec.Solução 6:Aproximadamente 60 mg/ml de rhPBGD1/2x quantidade de excipienteCiclo de secagem por congelamento originalVol. de echimento = 2x Vol. de rec.Solução 7:Aproximadamente 110 mg/ml de rhPBGD1x quantidade de excipienteCiclo de secagem por congelamento com anelamentoVol. de enchimento = Vol. rec.Solução 8:Aproximadamente 60 mg/ml de rhPBGD1x quantidade de excipienteCiclo de secagem por congelamento com anelamentoVol. de enchimento = 2x Vol. de rec.Solução 9:Aproximadamente 150 mg/ml de rhPBGD1x quantidade de excipienteCiclo de secagem por congelamento com anelamentoVol. de enchimento = Vol. de rec.Solução 10:Aproximadamente 150 mg/ml de rhPBGD1x quantidade de excipienteCiclo de secagem por congelamento original• Vol. de enchimento = Vol. de rec.
Embora não mostrado na Tabela 21 a pureza foi também testa-da para cada ponto de tempo como foi verificada para 100% em todos oscasos.
Para solução 2 no ponto de tempo de 4 e 9 semanas e para so-lução 4 no ponto de tempo de semana 9 um volume de recuperação erradofoi usado.Tabela 21:
<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>Exemplo 7
Efeito de excipientes diferentes sobre a estabilidade de rhPBGD
rhPBGD foi concentrada conforme descrito no exemplo 4 e en-tão o tampão foi mudado para um dos quatro tampões descritos abaixo. Osprodutos foram então secos por congelamento conforme descrito no exem-plo 4 com uma etapa de anelamento original incluída e estabilidade das a-mostras foi testada conforme descrito no exemplo 6.
O efeito das quatro formulações que seguem sobre estabilidadede rhPBGD foi testado:
Formulação A (corresponde à solução 9 no exemplo 6): Manitola 250 mM, glicina a 27 mM e Na2HPO4 a 3,67 mM.
Formulação B: manitol a 250 mM, glicina a 27 mM e TRIS-HCI a10 mM.
Formulação C: manitol a 250 mM, glicina a 27 mM, Na2HPO4 a3,67 mM e Tween 80 a 0,1%.
Formulação D: manitol a 221 mM, sacarose a 29 mM, glicina a27 mM, Na2HPO4 a 3,67 mM e Tween 80 a 0,1%.
Os resultados são mostrados na Tabela 22.<table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Zymenex A/S
Stefan Nilsson
<120> Processo para concentração de polipeptídeos
<130> 39840pc01
<150> PA 2006 00488
<151> 2006-04-04
<150> PA 2006 00922
<151> 2006-07-05
<160> 24
<170> FastSEQ for Windows Versão 4.0
<210> 1
<211> 1035
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 1
atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480gacgagcagc aggagttcag tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540tggcacaacc gggttgggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960ctggccaact tgttgctgag caaaggagccaacgatgccc attaa
<210> 2
<211> 1035
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 2
atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaaggtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccctaccacagggg acaagattct tgatactgcaaccaaggagc ttgaacatgc cctggagaagaaggacctgc ccactgtgct tcctcctggcaaccctcatg atgctgttgt ctttcacccaccagagaaga gtgtggtggg aaccagctccttcccgcatc tggagttcag gagtattcgggacgagcagc aggagttcag tgccatcatctggcacaacc gggtggggca gatcctgcacggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaagctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgcgaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtgctgactggag gagtctggag tctagacggcaccatccatg tccctgccca gcatgaagatatcactgctc gtaacattcc acgagggcccctggccaact tgttgctgag caaaggagccaacgatgccc attaa
<210> 3
<211> 1035
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 3
atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaaggtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct
aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020
1035
agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720catacagc.ta tgaaggatgg gcaactgtac 780tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020
1035
agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480gacgagcagc aggagttcag tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540tggcacaacc gggtggggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960ctggccaact tgttgctgag caaaggagcc aaaaacátcc tggatgttgc acggcaattg 1020aacgatgccc attaa 1035
<210> 4
<211> 1034
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 4
atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300aaccctcatg atgctgttgt cttcacccaa aatttgttgg gaagacccta gaaaccctgc 360cagagaagag tgtggtggga accagctccc tgcgaagagc agcccagctg cagagaaagt 420tcccgcatct ggagttcagg agtattcggg gaaacctcaa cacccggctt cggaagctgg 480acgagcagca ggagttcagt gccatcatcc tggcaacagc tggcctgcag cgcatgggct 540ggcacaaccg ggtggggcag atcctgcacc ctgaggaatg catgtatgct gtgggccagg 600gggccttggg cgtggaagtg cgagccaagg accaggacat cttggatctg gtgggtgtgc 660tgcacgatcç cgagactctg cttcgctgca tcgctgaaag ggccttcctg aggcacctgg 720aaggaggctg cagtgtgcca gtagccgtgc atacagctat gaaggatggg caactgtacc 780tgactggagg agtctggagt ctagacggct cagatagcat acaagagacc atgcaggcta 840ccatccatgt ccctgcccag catgaagatg gccctgagga tgacccacag ttggtaggca 900tcactgctcg taacattcca cgagggcccc agttggctgc ccagaacttg ggcatcagcc 960tggccaactt gttgctgagc aaaggagcca aaaacatcct ggatgttgca cggcaattga 1020acgatgccca ttaa 1034
<210> 5
<211> 1035
<212> DNA
<213> Hoo Sapiens
<400> 5
atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacgggcagt 60gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaagg 420ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480gacgagcagc aggagttcag tgtcatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540tggcacaacc gggttgggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960ctggccaact tgttgctgag caagggagcc aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020aacgatgccc attaa 1035
<210> 6<211> 1035<212>
DNA
<213>
Homo Sapiens
<400>
6
atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480gacgagcagc aggagttcag tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540tggcacaacc gggtggggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720gaaggaggtt gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960ctggccaact tgttgctgag caaaggagcc aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020aacgatgccc attaa 1035
<210> 7
<211> 1034
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 7
atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctccttcccgcatc tggagttcag gagtattcgggacgagcagc aggagttcag tgccatcatctggcacaacc gggtggggca gatcctgcacggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaagctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgcgaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtgctgactggag gagtctggag tctagacggcaccatccatg tccctgccca gcatgaagatatcactgctc gtaacattcc acgagggcccctggccaact tgttgctgag caaaggagccacgatgccca ttaa<210> 8<211> 1035
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 8
atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaaggtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccctaccacagggg acaagattct tgatactgcaaccaaggagc ttgaacatgc cctggagaagaaggacctgc ccactgtgct tcctcctggcaaccctcatg atgctgttgt ctttcacccaccagagaaga gtgtggtggg aaccagctccttcccgcatc tggagttcag gagtattcgggacgagcagc aggagttcag tgccatcatctggcacaacc gggtggggca gatcctgcacggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaagctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgcgaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtgctgactggag gagtctggag tctagacggcaccatccatg tccctaccca gcatgaagat
ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960aaaaacatcc tggatgttgc acggcaatta 1020
1034
agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780tcagatagca tacaagagac catgcaggcc 840ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900atcactgctc gtaacattcc acgagggcccctggccaact tgttgctgag caaaggagccaacgatgccc attaa
<210> 9
<211> 1260
<212> - DNA<213> Homo Sapiens<400> 9
cacaggaaac agctatgacc atgattacgcacaaaagctg gagctccacc gcggtggcgggcaggaattc atgagagtga ttcgcgtggggacggacagt gtggtggcaa cattgaaagctgctatgtcc accacagggg acaagattctaagcctgttt accaaggagc ttgaacatgctcactccttg aaggacctgc ccactgtgctcaagcgggaa aaccctcatg atgctgttgtagaaaccctg ccagagaaga gtgtggtggggcagagaaag ttcccgcatc tggagttcagtcggaagctg gacgagcagc aggagttcaggcgcatgggc tggcacaacc gggttgggcatgtgggccag ggggccttgg gcgtggaagtggtgggtgtg ctgcacgatc ccgagactctgaggcacctg gaaggaggct gcagtgtgccgcaactgtac ctgactggag gagtctggagcatgcaggct accatccatg tccctgcccagttggtaggc atcactgctc gtaacattccgggcatcagc ctggccaact tgttgctgagacggcaattg aacgatgccc attaataagcccggtaccca attcgcccta tagtgagtcg
<210> 10<211> 1113
<212> DNft
cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020
1035
caagctcgaa attaaccctc actaaaggga 60ccgctctaga actagtggat cccccgggct 120tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca 180ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat 240tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa 300cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt 360tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg 420ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct 480aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct 540gagtattcgg ggaaacctca acacccggct 600tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca 660gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc 720gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct 780gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct 840agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg 900tctagacggc tcagatagca tacaagagac 960gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca 1020acgagggccc cagttggctg cccagaactt 1080caaaggagcc aaaaacatcc tggatgttgc 1140ttatcgatac cgtcgacctc gagggggggc 1200tattacaatt cactggccgt cgttttacaa 1260<213> Homo Sapiens
<400> 10
cacacagcct actttccaag cggagccatggaagaaaaca gcccaaagat gagagtgattcgcatacaga cggacagtgt ggtggcaacagaaatcattg ctatgtccac cacaggggacggagagaaaa gcctgtttac caaggagcttctggttgttc actccttgaa ggacctgcccgccatctgca agcgggaaaa ccctcatgataagaccctag aaaccctgcc agagaagagtgcccagctgc agagaaagtt cccgcatctgacccggcttc ggaagctgga cgagcagcagggcctgcagc gcatgggctg gcacaaccggatgtatgctg tgggccaggg ggccttgggcttggatctgg tgggtgtgct gcacgatcccgccttcctga ggcacctgga aggaggctgcaaggatgggc aactgtacct gactggaggacaagagacca tgcaggctac catccatgtcgacccacagt tggtaggcat cactgctcgtcagaacttgg gcatcagcct ggccaacttggatgttgcac ggcaattgaa cgatgcccat
<210> 11
<211> 1380
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 11
agcaggtcct actatcgcct ccctctagtcaaggaagaaa acagcccaaa gatgagagtggctcgcatac agacggacag tgtggtggcatttgaaatca ttgctatgtc caccacagggattggagaga aaagcctgtt taccaaggaggacctggttg ttcactcctt gaaggacctg
tctggtaacg gcaatgcggc tgcaacggcg 60cgcgtgggta cccgcaagag ccagcttgct 120ttgaaagcct cgtaccctgg cctgcagttt 180aagattcttg atactgcact ctctaagatt 240gaacatgccc tggagaagaa tgaagtggac 300actgtgcttc ctcctggctt caccatcgga 360gctgttgtct ttcacccaaa atttgttggg 420gtggtgggaa ccagctccct gcgaagagca 480gagttcagga gtattcgggg aaacctcaac 540gagttcagtg ccatcatcct ggcaacagct 600gttgggcaga tcctgcaccc tgaggaatgc 660gtggaagtgc gagccaagga ccaggacatc 720gagactctgc ttcgctgcat cgctgaaagg 780agtgtgccag tagccgtgca tacagctatg 840gtctggagtc tagacggctc agatagcata 900cctgcccagc atgaagatgg ccctgaggat 960aacattccac gagggcccca gttggctgcc 1020ttgctgagca aaggagccaa aaacatcctg 1080taa 1113
tctgcttctt tggatccctg aggagggcag 60attcgcgtgg gtacccgcaa gagccagctt 120acattgaaag cctcgtaocc tggcctgcag 180gacaagattc ttgatactgc actctctaag 240cttgaacatg ccctggagaa gaatgaagtg 300cccactgtgc ttcctcctgg cttcaccatc 360ggagccatct gcaagcggga aaaccctcat gatgctgttg tctttcaccc aaaatttgtt 420gggaagaccc tagaaaccct gccagagaag agtgtggtgg gaaccagctc cctgcgaaga 480gcagcccagc tgcagagaaa gttcccgcat ctggagttca ggagtattcg gggaaacctc 540aacacccggc ttcggaagct ggacgagcag caggagttca gtgccatcat cctagcaaca 600gctggcctgc agcgcatggg ctggcacaac cgggttgggc agatcctgca ccctgaggaa 660tgcatgtatg ctgtgggcca gggggccttg ggcgtggaag tgcgagccaa ggaccaggac 720atcttggatc tggtgggtgt gctgcacgat cccgagactc tgcttcgctg catcgctgaa 780agggccttcc tgaggcacct ggaaggaggc tgcagtgtgc cagtagccgt gcatacagct 840atgaaggatg ggcaactgta cctgactgga ggagtctgga gtctagacgg ctcagatagc 900atacaagaga ccatgcaggc taccatccat gtccctgccc agcatgaaga tggccctgag 960gatgacccac agttggtagg catcactgct cgtaacattc cacgagggcc ccagttggct 1020gcccagaact tgggcatcag cctggccaac ttgttgctga gcaaaggagc caaaaccatc 1080ctggatgttg cacggcagct taacgatgcc cattaactgg tttgtggggc acagatgcct 1140gggttgctgc tgtccagtgc ctacatcccg ggcctcagtg ccccattctc actgctatct 1200ggggagtgat taccccggga gactgaactg cagggttcaa gccttccagg gatttgcctc 1260accttggggc cttgatgact gccttgcctc ctcagtatgt gggggcttca tctctttaga 1320gaagtccaag caacagcctt tgaatgtaac caatcctact aataaaccag ttctgaaggt 1380<210> 12<211> 1377
<212> DNA
<213> Homo Saplens
<400> 12
cacacagcct actttccaag cggagccatg tctggtaacg gcaatgcggc tgcaacggcg 60gaagaaaaca gcccaaagat gagagtgatt cgcgtgggta cccgcaagag ccagcttgct 120cgcatacaga cggacagtgt ggtggcaaca ttgaaagcct cgtaccctgg cctgcagttt 180gaaatcattg ctatgtccac cacaggggac aagattcttg atactgcact ctctaagatt 240ggagagaaaa gcctgtttac caaggagctt gaacatgccc tggagaagaa tgaagtggac 300ctggttgttc actccttgaa ggacctgccc actgtgcttc ctcctggctt caccatcgga 360gccatctgca agcgggaaaa ccctcatgat gctgttgtct ttcacccaaa atttgttggg 420aagaccctag aaaccctgcc agagaagagt gtggtgggaa ccagctccct gcgaagagca 480gcccagctgc agagaaagtt cccgcatctg gagttcagga gtattcgggg aaacctcaac 540acccggcttc ggaagctgga cgagcagcag gagttcagtg ccatcatcct agcaacagct 600ggcctgcagc gcatgggctg gcacaaccggatgtatgctg tgggccaggg ggccttgggcttggatctgg tgggtgtgct gcacgatcccgccttcctga ggcacctgga aggaggctgcaaggatgggc aactgtacct gactggaggacaagagacca tgcaggctac catccatgtcgacccacagt tggtaggcat cactgctcgtcagaacttgg gcatcagcct ggccaacttggatgttgcac ggcagcttaa cgatgcccatttgctgctgt ccagtgccta catcccgggcgagtgattac cccgggagac tgaactgcagttggggcctt gatgactgcc ttgcctcctcgtccaagcaa cagcctttga atgtaaccaa<210> 13
<211> 10024
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 13
aatcatgatt gttaattatg ttcatgattagcactttggg aggccgaggt gggcgaatcactaacatgga gaaacctcat ctctaccaaatgcctgtaat cccagctact cggggggctgggaggttgca gtgagctgag atcgtgccatctccgtctca aaaaaaaaaa aaaattatgtttttctcact acatgtaggt ttgtgctcccttaatctctc tgaaccagtt tcctcattttcacgcctgta atcccagcac tttgggaggcttcgagacta gcctgggcaa catagtgaggtagaaattag tcccacgtgg tgatgtgcgctggggggatc gctgaagccg ggaggtcaagctctagtctg gggacacagt gagaccccgtgttgtagcaa agctaagttt gaacagagca
gtggggcaga tcctgcaccc tgagaaatgc 660gtggaagtgc gagccaagga ccaggacatc 720gagactctgc ttcgctgcat cgctgaaagg 780agtgtgccag tagccgtgca tacagctatg 840gtctggagtc tagacggctc agatagcata 900cctgcccagc atgaagatgg ccctgaggat 960aacattccac gagggcccca gttggctgcc 1020ttgctgagca aaggagccaa aaacatcctg 1080taactggttt gtggggcaca gatgcctggg 1140ctcagtgccc cattctcact gctatctggg 1200ggttcaagcc ttccagggat ttgcctcacc 1260agtatgtggg ggcttcatct Ctttagagaa 1320tcctactaat aaaccagttc tgaaggt 1377
caggcgcggt ggctcacgcc tgtactccca 60cctgaggtca ggagttcaag acctgcctga 120aatacaaaat tagccgggtg tggtggtgcg 180aggcaggaga attgcttgaa cccgggaggc 240tgcattccag cctgggcaac aagagcgaaa 300tcatgggaaa gcacttttcc taacaagccc 360acttcagtta cttgtcttta ggcatgacct 420aagaattgaa atgctggctg ggccagtcgt 480caaggcgaga tgactgcttg agtccaggag 540ccacctcccc gctgtctcta taaaaaaatc 600ctgtagtccc agctgcttgg gaggctgagg 660gctgcagtga cccgtggtca tgccgctgca 720atcaaaaaga aaaatgctgc ctatttcaag 780aaggaagcgc catagaagct gcactacttg 840ctcatgtcac agctggggaa tggggaggtcaattcccgcc cagagggagg gacctcccctctctgcggag accaggagtc agactgtaggtcgccggccg gagcctccgg cttcccggggcctactttcc aagcggagcc atgtctggtactgagccggt gaccagcaca ctttgggcttgttgccatcc tcagtcgtct attggtcagatttttggtcc gagtagcttt taaagggccagaaatcagag agcggtgata ctgggttaaggtccctgcgg gcatctgggt gggattcccagtgacccaga ccaagaacgt tcgtctacacgaggcggatg cagatacggc ccctttgggagagtatcagc caagcctccg aactgcacacgttatagtgg tctcccagcc acagccaacggaattactac cgtgggtggg aggccgccgtgccctgggct tgtgcacaga caaactgcagaagaaagaga tggggagctg ctaatctcccctttgctctt gcagtcattc cagagccctgcccaactctc tttcggttat tagctctgtgccacccgttg cttctgtaac atggtcccaatttgagacga caacaatatg caaaagcaatttttttaatg aaacggtttg acttggatatgtttgaacct agtagttctg ggaccttagatttttggtgg ccacgtttaa tatcaagcctaatttattgg agtgatcaca tggagtagaccttcggcaat agaggcccca gatgtctgggcatggtgaaa ccccgtctct actaaaaatacctgtaatcc tagcactttg ggaggccgagagaccagcct agggaacaca gtgaaaccccacgtggtggc atgcgcctgc agtcccagctgaacctggga ggtggaggtt gcactgagccgacagagcgc aactccccct caaaaaaaga
gaatggggag gtccactgtc gcaatgttcc 900
tcgagggagg gcgccggaag tgacgcgagg 960
acgacctcgg gtcccacgtg tccccggtac 1020
ccgggggacc ttagcggcac ccacacacag 1080
acggcaatgc ggctgcaacg gcggtgagtg 1140
ctggacgagc cgtgcagcga ttggccccag 1200
acggctatct tttttttttt tttttttttt 1260
gtagctcggt tgccctccgg aaggaatggg 1320
agtggaagga ttgtttggaa cggaactccg 1380
tcaggcctgg gatgcacggc tctagattta 1440
agacggggtc ctttcattcg aggctgggct 1500
agacacgttc cacttttgat tcataggaga 1560
aaacgtctta gaagtgcgcc ttctttttgt 1620
ctccaagtcc ccagctgtga cacacctact 1680
gggcctttcc attacgagcc tgcttgccga 1740
agctggtgga ggccactgcc aggccgagat 1800
cctgtccagc ctgttggtga gggctgggat 1860
gactaggagt aggaagatct gaattgtggc 1920
accctaggca agtcacctca tcccttgatg 1980
aggtgcctgt cttgtccacc tgataggatt 2040
agcttcaaca tagaagtgct cagtgtttta 2100
gctgtgcaca ttcaatgaac ttaaggaatt 2160
gtcctttctg tgggctccct gtggcccaga 2220
agcctaattt gcaaagggtc tcccagggtt 2280
cagagtctga gggcagaaag ctgtcacctg 2340
tgcaaaagaa ctccatagca ccccgaccaa 2400
taaaaattag gccgagcaca gtggctcatg 2460
gcaggtggat tgcctgagct caggagttcg 2520
gtttctacta aaaatacaaa aaattagccg 2580
acttgggagg ctaagacagg agaatcgctt 2640
gagaccgcgc cattgcactc cagcctgggt 2700aaaaaatata tatatatata tatatatata 2760tacacacata ttttagctgg gcatggtggtaggctgagtc aggagaatcg cttgaacctgtgccactgca ctccagcctg ggcaacagagaggaactaca taggatgaac atcccagatctctacagtgg ctactgtctg atgtagaaagcgcctgtaat cccagctctt tgggaggctgctggccaaca cagtgaaacc ccgtctctacgaacatgctg tagttccagc ttgaacccagccactgcact ccagcctgag caaaacagtgagagaaatgg gacctccgtc ttagactgaaacttttgtcc aaggtactct ggcaggaggaggctctggcc tgttaatatt tccatgttggaactttaggc agcgcagcct cctagtcttaccaacctttt cattttatag atgaacaaacacccagccaa gaggctgagc aggactgtacatgcagtcca gccagattaa gggacccttatcatcctctt gacttctttt gtagccagaccttgctgctc ttagactcta gtctactccacaagtgcctt gtctgttgta gataatgaatcagtgtggtc ctggctgccc tgcccctgccgctgatgggc cttatctctt tacccacctgcttggtcaag gtgggcttca gggctcagtggtcctactat cgcctccctc tagtctctgcactgaggaag gttaaaggga ccagccttggcacaggccag gttctgaatt tcctttcttctgttgaggaa cactagaaac agaggggactaacagcccaa agatgagagt gattcgcgtggccggggtgg aggaggtttg tcagaacagtactcagaggg ttagttccta gtatgaaggagaaatggcag attacattct atggcaagatcagagggctc ccaagcccct tctcatgccccctaacctgt gacagtctaa agagtctgag
gtgcgtctgt agtagtccca gctacttggg 2820gaaggcagtg gttgtagtta gctgagaaca 2880ggagactctg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa 2940agggaatgtt gactgtcgac agtatcagta 3000aaatgggatc aggctaggcg tggtggctca 3060gggcaggagg atcacaagtt cgagaccagc 3120taaaaatgtg aaaattagct gggcatggtg 3180gggtggaggt tgtagtgagc ctagatcacg 3240agactctgtc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300gaattcagtt ctacgtgctt agcagtgaat 3360agaggcgtgt cctcttgagt tcttgacttg 3420tgaaaccaga ggcagcactc taggtgaacg 3480tggaacatct gaggcagaag aaacctgagt 3540agatcctgat gggacagtgt acccaaggtc 3600gtcagatccg tttacctcag tccttaatgc 3660atactgtcag ctttccccac tgtgggatct 3720atctgggcct cttgctggag aaggtggcag 3780tgtggcatct ggatggcact gaaattttct 3840ctatcctcca gtgactcagc acaggttccc 3900agctgcaggc cccacccttc ctgtggccag 3960gctgtgcaca gcactcccac tgacaactgc 4020tcctggttac tgcagcggca gcaacagcag 4080ttctctggat ccctgaggag ggcagaaggt 4140agtatttccc cactctgaga ctcagctggc 4200caagccagtg attctggttc ttggacaagg 4260gtgacctggg gactttttct gcaggaagaa 4320ggtacccgca agagccaggt gggtgcagga 4380tatgatgctc acagcatcac aaattggggg 4440gatggggtgg ctgggcgtta agttccccgg 4500catccctagg ctgggaaaat tgttggagtg 4560agatggaaat tccagtccct tcaggatctg 4620ccgtggctgg gaagggcagg actaatccaa 4680atctctaccc gcagcttgct cgcatacagacgtaccctgg cctgcagttt gaaatcagtggaagcccagt accccgagag gagagaacacccgtcccgct gccccgagat tccttctggggaatacctcc agctctgact acctggattactttttatga gtgtttctgg tcttcctgctgggattatgt gcctctgtcc ccatcatgaatgatcaataa tgagcacctg attgattgacggacaagatt cttgatactg cactctctaaccccactctt ctttccttcc ctgaagggatgagagaaaag cctgtttacc aaggagcttgagataggaga gtgtggtgcc ctcccagtcttgctgggacc cggggtgtca gataggctgcagctcatagg tgggtttttt caggcttcagggctgcctgg actgcaagaa tggctgggggagtgagagga gagcagtttt catgctcctgccctaggctc caccactgaa gtagaggcaggctcataccc tttctctttg cccccctctcctccttgaag gacctgccca ctgtgcttccgtaagagtct tgcaagtaag gggcttgggctccctttggg gcctgaccct ctgcttcaggtggtggcaga aaactcaaga aataccagtgctgaacttaa atctcttccc tcattctgtgctcatgatgc tgttgtcttt cacccaaaatagaagaggta agtggggcct ggataggcagatgggaggag gaggaaagga acagtgactgtctgggcagt gtggtgggaa ccagctccctcccgcatctg gagttcagga gtattgtatcgagtgacgga gacagcagcc aaggaaaaaggagtggaagg ggcttccagc aagcagcccgcactcatccg tccactcatt tacagtctaagtgcaaggca ttggggataa tggtgagcaa
cggacagtgt ggtggcaaca ttgaaagcct 4740agttttctgg aaaggagtgg aagctaatgg 4800aacatttctg gctttgccta tagctaaagc 4860ctgctcccag ttctgaaggt gctttcctct 4920gcctggcatt taacatcttg agctttgggt 4980cgattgtata tactcagagg gcaggaacca 5040tcgtagcaca gtgctaggct cagtaaatgc 5100tctctcctca gttgctatgt ccaccacagg 5160ggtaacaaca tcttcctccc cagttcttgt 5220tcactcaggc tctttctgtc cggcagattg 5280aacatgccct ggagaagaat gagtaagtaa 5340cttgctggga ccctagtatg ctaggtctct 5400tgggcttaaa ccctcagaga ggctgaaggc 5460aaaaggagag tgtctggttc tgagccatct 5520agggagggta ggagggagag taggagggag 5580agatcttgag aaggtgtgct tcctgaactg 5640gggtgggtgg agaaggggtg aaggctggct 5700ccatctctat agagtggacc tggttgttca 5760tcctggcttc accatcggag ccatctgcaa 5820aggggtaggc atcatgtgaa cctttgcctt 5880gttatctcct ctgccctgag gagtgttgac 5940agttggcaat cgagagagaa tagaggtgat 6000cccttccctc ctcccccagg cgggaaaacc 6060ttgttgggaa gaccctagaa accctgccag 6120cttggtggga tgtgcccaga agatgcaggg 6180cctagtgtta aaatctcatt gtaacttctc 6240gcgaagagca gcccagctgc agagaaagtt 6300cttttagaag agtgacggat ccttttggaa 6360acaaggtcta gagggctctg ggagtccgga 6420tggggtcagt ggcctgtctg tctttccatg 6480tgttttctta gccccagaca agtgttcaga 6540gataaacatt cccctgcata tgtagagttt 6600acgtcttact tagggataat gcagttatactagggagtac ttcctttttt ttttttttttaggttggagt gcagtggcgc aatctaggctaatcttcctg cctcagcctc ctaagtagtttttttgtatt tttagtagag actgggtttctgacctcagg tgatccacca gcctcggcctccgcacccgg tcagtacttc catttttataaatatgtagt acatttcata aaactaaattagtgaagttg ggaattttct ggaaacttctgtgtcaggga aggtttctca gaggtcttgttcattttcct tatctgtaaa gtggggataaaagatgaaat gagctgacat atggaaagtatatgatgtaa ctgttagctg ttaacattaaccagctagag agggaaagac agactcaggccgacactgtg gtccttagca actctccacagatggacgag cagcaggagt tcagtgccatgggctggcac aaccgggttg ggcaggtagggcatctcctt tctgccttac agtcatcccctgaaagcgat atacgttcag tagaaactgttactttcagt acagtattca ttacatgagatcagatgatt ttgtccaact ataataggctaggctaggtg tattaaatgc attttcagctatgtaaccct attgtaagtc aaggaccatcacaccgtagg ctgggaagat tgtgaatcagtttacaaaaa aaaaaaaaag aggccagactgatagggaac tcccatctca ctgccaggtgactccctgtt ccgcctccac agatcctgcaggtacacttg accagggaag ccacatggtgaagcttgtct cacaaccttc tgcatctgctgaccttggga tgctaccggt ccaaaaggcgtgctttgcgc cattggttgg ggaaagatcagggggccttg ggcgtggaag tgcgagccaa
tgaactgaat agtgactact tctggaggga 6660tttctgagac ggagtctcgc tctgttgccc 6720cactgcaact tctgcctcct gagttcaagc 6780gggattacag gtgccaccac acctggctaa 6840accatgttag tcaggctggt ctcaaactcc 6900cccaaagggc tgggattaca ggcttgagcc 6960tgctactata ttgtcttgac ttttacaatg 7020taaaaatagt atgtgctaag tgctccaata 7080agttggaaca tctaaacaca gaagtctggg 7140aaccttggca agttatttag cctccctatg 7200taatactacc ttcctcacag ggttgttgtg 7260cttttagagc agtgtctggc atgtagtaag 7320gctgagagct ggaagatgac tgaaagtcag 7380agagggaacc gcacgaggcc ccagattgcc 7440gcggggaaac ctcaacaccc ggcttcggaa 7500catcctggca acagctggcc tgcagcgcat 7560gcctgcccct atcctctccc cagctcatct 7620aatttaggat ttttagactt tatgattgtg 7680acttagtacc catacagcca ttctgttttt 7740tattcacttt attgtaaaac aggcttggtg 7800aatcttaagt gttctgagca catgtaaggt 7860tgttttcaac ttaacaatgg gtttatcagg 7920tgtcttcact tcttgaccac cccacctcta 7980aggccagact ctaggctttc atggagaaaa 8040cacacttagg cctacccagg ctttctagat 8100cttttagaca cccccgtgtc cacccttttg 8160ccctgaggaa tgcatgtatg ctgtgggcca 8220acatatgcct tccctttgtt ctcaaccaag 8280tccccagaat agcattctca gggaggggca 8340ctggggagca agtagataga ggtggtccca 8400ggcctgatgt cctaggatgt ttttccatca 8460ggaccaggac atcttggatc tggtgggtgt 8520gctgcacgat cccgagactc tgcttcgctg catcgctgaa agggccttcc tgaggcacct 8580ggtagggcct gtgctccacc tgtggagggc tggggacttg gagagctggg aaaggtggca 8640gggaagattt cttacatgaa tgctctgtat acagtgctaa ctcattcttg ttgaatgttg 8700tgtatggata ggaccaggtc tgggcccaca gttgcctttt cagtgatgtc ctca.ggtctg 8760tggtcacagg gtggtgttaa gagcccttgc agctcacaag aacttcttgt tacaggaagg 8820aggctgcagt gtgccagtag ccgtgcatac agctatgaag gatgggcaag taagtggggg 8880gaaatgggcg ggaagccagg gaaaggagga ctgtggcatt tcttcctgtg catcccaggt 8940ttctaggtag tcccctctca gactgtgctg aggcaactgt tttcttcccc agctgtacct 9000gactggagga gtctggagtc tagacggctc agatagcata caagagacca tgcaggctac 9060catccatgtc cctgcccagg taccaaagct ggagggcgag ggggtaataa acaagagtgc 9120atataatctc ttgttctcac caaatcccac ctccttccct catacagcat gaagatggcc 9180ctgaggatga cccacagttg gtaggcatca ctgctcgtaa cattccacga gggccccagt 9240tggctgccca gaacttgggc atcagcctgg ccaacttgtt gctgagcaaa ggagccaaaa 9300acatcctgga tgttgcacgg cagcttaacg atgcccatta actggtttgt ggggcacaga 9360tgcctgggtt gctgctgtcc agtgcctaca tcccgggcct cagtgcccca ttctcactgc 9420tatctgggga gtgattaccc cgggagactg aactgcaggg ttcaagcctt ccagggattt 9480gcctcacctt ggggccttga tgactgcctt gcctcctcag tatgtggggg cttcatctct 9540ttagagaagt ccaagcaaca gcctttgaat gtaaccaatc ctactaataa accagttctg 9600aaggtgttgt gtgtgcgcgt gtggagttgg cgggaagata ggaacaaaca caaagccctt 9660tcatccttac ctcagaggct gggacttttg cccagagttc tcctggtacg tcctttctgc 9720ttctgcctca atagttttca tttcacacag aataaattgt ctcccaggaa caccaagaaa 9780cagagccaca atcttaaatt cctatggttt gccccttcag ttaacagtag agcctgttta 9840tattgcatgg cccctcccac ccctattatc aggaaagtat agaaagtcac taattctaca 9900actctcttgc aaaatgaaaa caaatgctcc atttaaaaaa aaaacaatcc tttaataaaa 9960ttagtccatc taaaactccc caatgcctaa ggttctagtc gtggaagggt tagctgcaga 10020
attc 10024
<210> 14
<211> 361
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 14
Met Ser Gly Asn Gly Asn Ala Ala Ala Thr Ala Glu Glu Asn Ser Pro1 5 10 15
Lys Met Arg Val Ile Arg Val Gly Thr Arg Lys Ser Gln Leu Ala Arg
20 25 30
Ile Gln Thr Asp Ser Val Val Ala Thr Leu Lys Ala Ser Tyr Pro Gly
35 40 45
Leu Gln Phe Glu Ile Ile Ala Met Ser Thr Thr Gly Asp Lys Ile Leu
50 55 60
Asp Thr Ala Leu Ser Lys Ile Gly Glu Lys Ser Leu Phe Thr Lys Glu65 70 75 80
Leu Glu His Ala Leu Glu Lys Asn Glu Val Asp Leu Val Val His Ser
85 90 95
Leu Lys Asp Leu Pro Thr Val Leu Pro Pro Gly Phe Thr Ile Gly Ala
100 105 110
Ile Cys Lys Arg Glu Asn Pro His Asp Ala Val Val Phe His Pro Lys
115 120 125
Phe Val Gly Lys Thr Leu Glu Thr Leu Pro Glu Lys Ser Val Val Gly
130 135 140
Thr Ser Ser Leu Arg Arg Ala Ala Gln Leu Gln Arg Lys Phe Pro His145 150 155 160
Leu Glu Phe Arg Ser Ile Arg Gly Asn Leu Asn Thr Arg Leu Arg Lys
165 170 175
Met Asp Glu Gln Gln Glu Phe Ser Ala Ile Ile Leu Ala Thr Ala Gly
180 185 190
Leu Gln Arg Met Gly Trp His Asn Arg Val Gly Gln Ile Leu His Pro
195 200 205
Glu Glu Cys Met Tyr Ala Val Gly Gln Gly Ala Leu Gly Val Glu Val
210 215 220
Arg Ala Lys Asp Gln Asp Ile Leu Asp Leu Val Gly Val Leu His Asp225 230 235 240
Pro Glu Thr Leu Leu Arg Cys Ile Ala Glu Arg Ala Phe Leu Arg His
245 250 255
Leu Glu Gly Gly Cys Ser Val Pro Val Ala Val His Thr Ala Met Lys260 265 270
Asp Gly Gln Leu Tyr Leu Thr Gly Gly Val Trp Ser Leu Asp Gly Ser
275 280 285
Asp Ser Ile Gln Glu Thr Met Gln Ala Thr Ile His Val Pro Ala Gln
290 295 300
His Glu Asp Gly Pro Glu Asp Asp Pro Gln Leu Val Gly Ile Thr Ala305 310 315 320
Arg Asn Ile Pro Arg Gly Pro Gln Leu Ala Ala Gln Asn Leu Gly Ile
325 330 335
Ser Leu Ala Asn Leu Leu Leu Ser Lys Gly Ala Lys Asn Ile Leu Asp
340 345 350
Val Ala Arg Gln Leu Asn Asp Ala His
355 360
<210> 15
<211> 344
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 15
Met Arg Val Ile Arg Val Gly Thr Arg Lys Ser Gln Leu Ala Arg Ile
1 5 10 15
Gln Thr Asp Ser Val Val Ala Thr Leu Lys Ala Ser Tyr Pro Gly Leu
20 25 30
Gln Phe Glu Ile Ile Ala Met Ser Thr Thr Gly Asp Lys Ile Leu Asp
35 40 45
Thr Ala Leu Ser Lys Ile Gly Glu Lys Ser Leu Phe Thr Lys Glu Leu
50 55 60
Glu His Ala Leu Glu Lys Asn Glu Val Asp Leu Val Val His Ser Leu65 70 75 80
Lys Asp Leu Pro Thr Val Leu Pro Pro Gly Phe Thr Ile Gly Ala Ile
85 90 95
Cys Lys Arg Glu Asn Pro His Asp Ala Val Val Phe His Pro Lys Phe100 105 110Val Gly Lys Thr Leu Glu Thr Leu Pro Glu Lys Ser Val Val Gly Thr
115 120 125
Ser Ser Leu Arg Arg Ala Ala Gln Leu Gln Arg Lys Phe Pro His Leu
130 135 140
Glu Phe Arg Ser Ile Arg Gly Asn Leu Asn Thr Arg Leu Arg Lys Met145 150 155 160
Asp Glu Gln Gln Glu Phe Ser Ala Ile Ile Leu Ala Thr Ala Gly Leu
165 170 175
Gln Arg Met Gly Trp His Asn Arg Val Gly Gln Ile Leu His Pro Glu
180 185 190
Glu Cys Met Tyr Ala Val Gly Gln Gly Ala Leu Gly Val Glu Val Arg
195 200 205
Ala Lys Asp Gln Asp Ile Leu Asp Leu Val Gly Val Leu His Asp Pro
210 215 220
Glu Thr Leu Leu Arg Cys Ile Ala Glu Arg Ala Phe Leu Arg His Leu225 230 235 240
Glu Gly Gly Cys Ser Val Pro Val Ala Val His Thr Ala Met Lys Asp
245 250 255
Gly Gln Leu Tyr Leu Thr Gly Gly Val Trp Ser Leu Asp Gly Ser Asp
260 265 270
Ser Ile Gln Glu Thr Met Gln Ala Thr Ile His Val Pro Ala Gln His
275 280 285
Glu Asp Gly Pro Glu Asp Asp Pro Gln Leu Val Gly Ile Thr Ala Arg
290 295 300
Asn Ile Pro Arg Gly Pro Gln Leu Ala Ala Gln Asn Leu Gly Ile Ser305 310 315 320
Leu Ala Asn Leu Leu Leu Ser Lys Gly Ala Lys Asn Ile Leu Asp Val
325 330 335
Ala Arg Gln Leu Asn Asp Ala His340
<210> 16<211> 2022<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 16
ccggtaccgg ctcctcctgg gctccctctaagcgccaagt gacttacgcc cccgaccctgtctccgctcg agaatctgaa ggtgccctggtctcccggta ctgctcgccc cggccctctggagtatttgg gtccggggtc tcagggaagggcctgctgga gccaagtagc cctccctctcgggggcaccg cggtccctcc tcctggccctcaacatcgtg ctgatctttg ccgacgacctccccagctct accactccca acctggaccacttctacgtg cctgtgtctc tgtgcacacccccggttcgg atgggcatgt accctggcgtcctggaggag gtgaccgtgg ccgaagtcctcggcaagtgg caccttgggg tggggcctgaccatcgattt ctaggcatcc cgtactcccacttcccgccg gccactcctt gcgacggtgggttggccaac ctgtccgtgg aggcgcagcccatggctttc gcccatgacc tcatggccgagtactatgcc tctcaccaca cccactacccttcaggccgc gggccatttg gggactccctgatgacagcc ataggggacc tggggctgctcaatggacct gagaccatgc gtatgtcccgaaagggaacg acctacgagg gcggtgtccgtatcgctccc ggcgtgaccc acgagctggcagccctggct ggggccccac tgcccaatgtgctgctgggc acaggcaaga gccctcggcacgaggtccgt ggggtttttg ctgtgcggacgggctctgcc cacagtgata ccactgcagatgctcatgag cccccgctgc tctatgacctgctggggggt gtggccgggg ccaccccaga
gcgccttccc cccggcccga ctgcctggtc 60agcccggacc gctaggcgag gaggatcaga 120tcctggagga gttccgtccc agccctgcgg 180gagcttcagg aggcggccgt cagggtcggg 240gcggcgcctg ggtctgcggt atcggaaaga 300ttgggacaga cccctcggtc ccatgtccat 360ggctgctggc ctggccgttg cccgtccgcc 420cggctatggg gacctgggct gctatgggca 480gctggcggcg ggagggctgc ggttcacaga 540ctctagggcc gccctcctga ccggccggct 600cctggtgccc agctcccggg ggggcctgcc 660ggctgcccga ggctacctca caggaatggc 720gggggccttc ctgccccccc atcagggctt 780cgaccagggc ccctgccaga açctgacctg 840ctgtgaccag ggcctggtcc ccatcccact 900cccctggctg cccggactag aggcccgcta 960cgcccagcgc caggatcgcc ccttcttcct 1020tcagttcagt gggcagagct ttgcagagcg 1080gatggagctg gatgcagctg tggggaccct 1140tgaagagacg ctggtcatct tcactgcaga 1200aggcggctgc tccggtctct tgcggtgtgg 1260agagcctgcc ttggccttct ggccaggtca 1320cagctccctg gacctgctgc ctaccctggc 1380caccttggat ggctttgacc tcagccccct 1440gtctctcttc ttctacccgt cctacccaga 1500tggaaagtac aaggctcact tcttcaccca 1560ccctgcctgc cacgcctcca gctctctgac 1620gtccaaggac cctggtgaga actacaacct 1680ggtgctgcaa gccctgaaac agcttcagct 1740gctcaaggcc cagttagacg cagctgtgacggaccccgcc ctgcagatct gctgtcatccttgcccagat ccccatgcct gagggcccctctgggagcct gtgggggagg ctcaggtgtcacaccagtgg agacttgcac atctgaaaaa
<210> 17
<211> 1524
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 17
atgggggcac cgcggtccct cctcctggcccccaacatcg tgctgatctt tgccgacgaccaccccagct ctaccactcc caacctggacgacttctacg tgcctgtgtc tctgtgcacactcccggttc ggatgggcat gtaccctggccccctggagg aggtgaccgt ggccgaagtcgccggcaagt ggcaccttgg ggtggggcctttccatcgat ttctaggcat cccgtactcctgcttcccgc cggccactcc ttgcgacggtctgttggcca acctgtccgt ggaggcgcagtacatggctt tcgcccatga cctcatggccctgtactatg cctctcacca cacccactaccgttcaggcc gcgggccatt tggggactccctgatgacag ccatagggga cctggggctggacaatggac ctgagaccat gcgtatgtccggaaagggaa cgacctacga gggcggtgtccatatcgctc ccggcgtgac ccacgagctggcagccctgg ctggggcccc actgcccaatctgctgctgg gcacaggcaa gagccctcgggacgaggtcc gtggggtttt tgctgtgcggcagggctctg cccacagtga taccactgcaactgctcatg agcccccgct gctctatgac
cttcggcccc agccaggtgg cccggggcga 1800tggctgcacc ccccgcccag cttgctgcca 1860cggctggcct gggcatgtga tggctcctca 1920tggagggggt ttgtgcctga taacgtaata 1980aaaaaaaaaa aa 2022
ctggctgctg gcctggccgt tgcacgtccg 60ctcggctatg gggacctggg ctgctatggg 120cagctggcgg cgggagggct gcggttcaca 180ccctctaggg ccgccctcct gaccggccgg 240gtcctggtgc ccagctcccg ggggggcctg 300ctggctgccc gaggctacct cacaggaatg 360gagggggcct tcctgccccc ccatcagggc 420cacgaccagg gcccctgcca gaacctgacc 480ggctgtgacc agggcctggt ccccatccca 540cccccctggc tgcccggact agaggcccgc 600gacgcccagc gccaggatcg ccccttcttc 660cctcagttca gtgggcagag ctttgcagag 720ctgatggagc tggatgcagc tgtggggacc 780cttgaagaga cgctggtcat cttcactgca 840cgaggcggct gctccggtct cttgcggtgt 900cgagagcctg ccttggcctt ctggccaggt 960gccagctccc tggacctgct gcctaccctg 1020gtcaccttgg atggctttga cctcagcccc 1080cagtctctct tcttctaccc gtcctaccca 1140actggaaagt acaaggctca cttcttcacc 1200gaccctgcct gccacgcctc cagctctctg 1260ctgtccaagg accctggtga gaactacaac 1320ctgctggggg gtgtggccgg ggccacccca gaggtgctgc aagccctgaa acagcttcag 1380
ctgctcaagg cccagttaga cgcagctgtg accttcggcc ccagccaggt ggcccggggc 1440
gaggaccccg ccctgcagat ctgctgtcat cctggctgca ccccccgccc agcttgctgc 1500
cattgcccag atccccatgc ctga 1524
<210> 18
<211> 507
<212> PRT
<213> homo Sapiens
<400> 18
Met Gly Ala Pro Arg Ser Leu Leu Leu Ala Leu Ala Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15
Val Ala Arg Pro Pro Asn Ile Val Leu Ile Phe Ala Asp Asp Leu Gly
20 25 30
Tyr Gly Asp Leu Gly Cys Tyr Gly His Pro Ser Ser Thr Thr Pro Asn
35 40 45
Leu Asp Gln Leu Ala Ala Gly Gly Leu Arg Phe Thr Asp Phe Tyr Val
50 55 60
Pro Val Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg65 70 75 80
Leu Pro Val Arg Met Gly Met Tyr Pro Gly Val Leu Val Pro Ser Ser
85 90 95
Arg Gly Gly Leu Pro Leu Glu Glu Val Thr Val Ala Glu Val Leu Ala
100 105 110
Ala Arg Gly Tyr Leu Thr Gly Met Ala Gly Lys Trp His Leu Gly Val
115 120 125
Gly Pro Glu Gly Ala Phe Leu Pro Pro His Gln Gly Phe His Arg Phe
130 135 140
Leu Gly Ile Pro Tyr Ser His Asp Gln Gly Pro Cys Gln Asn Leu Thr145 150 155 160
Cys Phe Pro Pro Ala Thr Pro Cys Asp Gly Gly Cys Asp Gln Gly Leu
165 170 175
Val Pro Ile Pro Leu Leu Ala Asn Leu Ser Val Glu Ala Gln Pro Pro180 185 190
Trp Leu Pro Gly Leu Glu Ala Arg Tyr Met Ala Phe Ala His Asp Leu
195 200 205
Met Ala Asp Ala Gln Arg Gln Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr Tyr Ala
210 215 220
Ser His His Thr His Tyr Pro Gln Phe Ser Gly Gln Ser Phe Ala Glu225 230 235 240
Arg Ser Gly Arg Gly Pro Phe Gly Asp Ser Leu Met Glu Leu Asp Ala
245 250 255
Ala Val Gly Thr Leu Met Thr Ala Ile Gly Asp Leu Gly Leu Leu Glu
260 265 270
Glu Thr Leu Val Ile Phe Thr Ala Asp Asn Gly Pro Glu Thr Met Arg
275 280 285
Met Ser Arg Gly Gly Cys Ser Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Gly Thr
290 295 300
Thr Tyr Glu Gly Gly Val Arg Glu Pro Ala Leu Ala Phe Trp Pro Gly305 310 315 320
His Ile Ala Pro Gly Val Thr His Glu Leu Ala Ser Ser Leu Asp Leu
325 330 335
Leu Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ala Pro Leu Pro Asn Val Thr
340 345 350
Leu Asp Gly Phe Asp Leu Ser Pro Leu Leu Leu Gly Thr Gly Lys Ser
355 360 365
Pro Arg Gln Ser Leu Phe Phe Tyr Pro Ser Tyr Pro Asp Glu Val Arg
370 375 380
Gly Val Phe Ala Val Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Ala His Phe Phe Thr385 390 395 400
Gln Gly Ser Ala His Ser Asp Thr Thr Ala Asp Pro Ala Cys His Ala
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Thr Ala His Glu Pro Pro Leu Leu Tyr Asp Leu Ser
420 425 430
Lys Asp Pro Gly Glu Asn Tyr Asn Leu Leu Gly Gly Val Ala Gly Ala435 440 445
Thr Pro Glu Val Leu Gln Ala Leu Lys Gln Leu Gln Leu Leu Lys Ala
450 455 460
Gln Leu Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Pro Ser Gln Val Ala Arg Gly465 470 475 480
Glu Asp Pro Ala Leu Gln Ile Cys Cys His Pro Gly Cys Thr Pro Arg
485 490 495
Pro Ala Cys Cys His Cys Pro Asp Pro His Ala
500 505
<210> 19
<211> 489
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> F0RMILAÇÃ0
<222> 51
<223> C-alfa Formilglicina
<400> 19
Arg Pro Pro Asn Ile Val Leu Ile Phe Ala Asp Asp Leu Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Asp Leu Gly Cys Tyr Gly His Pro Ser Ser Thr Thr Pro Asn Leu Asp
20 25 30
Gln Leu Ala Ala Gly Gly Leu Arg Phe Thr Asp Phe Tyr Val Pro Val
35 40 45
Ser Leu Xaa Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg Leu Pro
50 55 60
Val Arg Met Gly Met Tyr Pro Gly Val Leu Val Pro Ser Ser Arg Gly65 70 75 80
Gly Leu Pro Leu Glu Glu Val Thr Val Ala Glu Val Leu Ala Ala Arg
85 90 95
Gly Tyr Leu Thr Gly Met Ala Gly Lys Trp His Leu Gly Val Gly Pro100 105 110Glu Gly Ala Phe Leu Pro Pro His Gln Gly Phe His Arg Phe Leu Gly
115 120 125
Ile Pro Tyr Ser His Asp Gln Gly Pro Cys Gln Asn Leu Thr Cys Phe
130 135 140
Pro Pro Ala Thr Pro Cys Asp Gly Gly Cys Asp Gln Gly Leu Val Pro145 150 155 160
Ile Pro Leu Leu Ala Asn Leu Ser Val Glu Ala Gln Pro Pro Trp Leu
165 170 175
Pro Gly Leu Glu Ala Arg Tyr Met Ala Phe Ala His Asp Leu Met Ala
180 185 190
Asp Ala Gln Arg Gln Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr Tyr Ala Ser His
195 200 205
His Thr His Tyr Pro Gln Phe Ser Gly Gln Ser Phe Ala Glu Arg Ser
210 215 220
Gly Arg Gly Pro Phe Gly Asp Ser Leu Met Glu Leu Asp Ala Ala Val225 230 235 240
Gly Thr Leu Met Thr Ala Ile Gly Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Thr
245 250 255
Leu Val Ile Phe Thr Ala Asp Asn Gly Pro Glu Thr Met Arg Met Ser
260 265 270
Arg Gly Gly Cys Ser Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Gly Thr Thr Tyr
275 280 285
Glu Gly Gly Val Arg Glu Pro Ala Leu Ala Phe Trp Pro Gly His Ile
290 295 300
Ala Pro Gly Val Thr His Glu Leu Ala Ser Ser Leu Asp Leu Leu Pro305 310 315 320
Thr Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ala Pro Leu Pro Asn Val Thr Leu Asp
325 330 335
Gly Phe Asp Leu Ser Pro Leu Leu Leu Gly Thr Gly Lys Ser Pro Arg
340 345 350
Gln Ser Leu Phe Phe Tyr Pro Ser Tyr Pro Asp Glu Val Arg Gly Val355 360 365Phe Ala Val Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Ala His Phe Phe Thr Gln Gly
370 375 380
Ser Ala His Ser Asp Thr Thr Ala Asp Pro Ala Cys His Ala Ser Ser385 390 395 400
Ser Leu Thr Ala His Glu Pro Pro Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Lys Asp
405 410 415
Pro Gly Glu Asn Tyr Asn Leu Leu Gly Gly Val Ala Gly Ala Thr Pro
420 425 430
Glu Val Leu Gln Ala Leu Lys Gln Leu Gln Leu Leu Lys Ala Gln Leu
435 440 445
Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Pro Ser Gln Val Ala Arg Gly Glu Asp
450 455 460
Pro Ala Leu Gln Ile Cys Cys His Pro Gly Cys Thr Pro Arg Pro Ala465 470 475 480
Cys Cys His Cys Pro Asp Pro His Ala485
<210> 20
<211> 489
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 20
Arg Pro Pro Asn Ile Val Leu Ile Phe Ala Asp Asp Leu Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Asp Leu Gly Cys Tyr Gly His Pro Ser Ser Thr Thr Pro Asn Leu Asp
20 25 30
Gln Leu Ala Ala Gly Gly Leu Arg Phe Thr Asp Phe Tyr Val Pro Val
35 40 45
Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg Leu Pro
50 55 60
Val Arg Met Gly Met Tyr Pro Gly Val Leu Val Pro Ser Ser Arg Gly65 70 75 80
Gly Leu Pro Leu Glu Glu Val Thr Val Ala Glu Val Leu Ala Ala Arg85 90 95
Gly Tyr Leu Thr Gly Met Ala Gly Lys Trp His Leu Gly Val Gly Pro
100 105 110
Glu Gly Ala Phe Leu Pro Pro His Gln Gly Phe His Arg Phe Leu Gly
115 120 125
Ile Pro Tyr Ser His Asp Gln Gly Pro Cys Gln Asn Leu Thr Cys Phe
130 135 140
Pro Pro Ala Thr Pro Cys Asp Gly Gly Cys Asp Gln Gly Leu Val Pro145 150 155 160
Ile Pro Leu Leu Ala Asn Leu Ser Val Glu Ala Gln Pro Pro Trp Leu
165 170 175
Pro Gly Leu Glu Ala Arg Tyr Met Ala Phe Ala His Asp Leu Met Ala
180 185 190
Asp Ala Gln Arg Gln Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr Tyr Ala Ser His
195 200 205
His Thr His Tyr Pro Gln Phe Ser Gly Gln Ser Phe Ala Glu Arg Ser
210 215 220
Gly Arg Gly Pro Phe Gly Asp Ser Leu Met Glu Leu Asp Ala Ala Val225 230 235 240
Gly Thr Leu Met Thr Ala Ile Gly Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Thr
245 250 255
Leu Val Ile Phe Thr Ala Asp Asn Gly Pro Glu Thr Met Arg Met Ser
260 265 270
Arg Gly Gly Cys Ser Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Gly Thr Thr Tyr
275 280 285
Glu Gly Gly Val Arg Glu Pro Ala Leu Ala Phe Trp Pro Gly His Ile
290 295 300
Ala Pro Gly Val Thr His Glu Leu Ala Ser Ser Leu Asp Leu Leu Pro305 310 315 320
Thr Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ala Pro Leu Pro Asn Val Thr Leu Asp
325 330 335
Gly Phe Asp Leu Ser Pro Leu Leu Leu Gly Thr Gly Lys Ser Pro Arg340 345 350
Gln Ser Leu Phe Phe Tyr Pro Ser Tyr Pro Asp Glu Val Arg Gly Val
355 360 365
Phe Ala Val Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Ala His Phe Phe Thr Gln Gly
370 375 380
Ser Ala His Ser Asp Thr Thr Ala Asp Pro Ala Cys His Ala Ser Ser385 390 395 400
Ser Leu Thr Ala His Glu Pro Pro Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Lys Asp
405 410 415
Pro Gly Glu Asn Tyr Asn Leu Leu Gly Gly Val Ala Gly Ala Thr Pro
420 425 430
Glu Val Leu Gln Ala Leu Lys Gln Leu Gln Leu Leu Lys Ala Gln Leu
435 440 445
Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Pro Ser Gln Val Ala Arg Gly Glu Asp
450 455 460
Pro Ala Leu Gln Ile Cys Cys His Pro Gly Cys Thr Pro Arg Pro Ala465 470 475 480
Cys Cys His Cys Pro Asp Pro His Ala485
<210> 21<211> 1011<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 21
Met Gly Ala Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Val Cys Ala Arg Gly Cys Leu
1 5 10 15
Asp Ser Ala Gly Pro Trp Thr Met Ser Arg Ala Leu Arg Pro Pro Leu
20 25 30
Pro Pro Leu Cys Phe Phe Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Gly Ala Arg
35 40 45
Ala Gly Gly Tyr Glu Thr Cys Pro Thr Val Gln Pro Asn Met Leu Asn50 55 60Val His Leu Leu Pro His Thr His Asp Asp Val Gly Trp Leu Lys Thr65 70 75 80
Val Asp Gln Tyr Phe Tyr Gly Ile Lys Asn Asp Ile Gln His Ala Gly
85 90 95
Val Gln Tyr Ile Leu Asp Ser Val Ile Ser Ala Leu Leu Ala Asp Pro
100 105 110
Thr Arg Arg Phe Ile Tyr Val Glu Ile Ala Phe Phe Ser Arg Trp Trp
115 120 125
His Gln Gln Thr Asn Ala Thr Gln Glu Val Val Arg Asp Leu Val Arg
130 135 140
Gln Gly Arg Leu Glu Phe Ala Asn Gly Gly Trp Val Met Asn Asp Glu145 150 155 160
Ala Ala Thr His Tyr Gly Ala Ile Val Asp Gln Met Thr Leu Gly Leu
165 170 175
Arg Phe Leu Glu Asp Thr Phe Gly Asn Asp Gly Arg Pro Arg Val Ala
180 185 190
Trp His Ile Asp Pro Phe Gly His Ser Arg Glu Gln Ala Ser Leu Phe
195 200 205
Ala Gln Met Gly Phe Asp Gly Phe Phe Phe Gly Arg Leu Asp Tyr Gln
210 215 220
Asp Lys Trp Val Arg Met Gln Lys Leu Glu Met Glu Gln Val Trp Arg225 230 235 240
Ala Ser Thr Ser Leu Lys Pro Pro Thr Ala Asp Leu Phe Thr Gly Val
245 250 255
Leu Pro Asn Gly Tyr Asn Pro Pro Arg Asn Leu Cys Trp Asp Val Leu
260 265 270
Cys Val Asp Gln Pro Leu Val Glu Asp Pro Arg Ser Pro Glu Tyr Asn
275 280 285
Ala Lys Glu Leu Val Asp Tyr Phe Leu Asn Val Ala Thr Ala Gln Gly
290 295 300
Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn His Thr Val Met Thr Met Gly Ser Asp Phe305 310 315 320Gln Tyr Glu Asn Ala Asn Met Trp Phe Lys Asn Leu Asp Lys Leu Ile
325 330 335
Arg Leu Val Asn Ala Gln Gln Ala Lys Gly Ser Ser Val His Val Leu
340 345 350
Tyr Ser Thr Pro Ala Cys Tyr Leu Trp Glu Leu Asn Lys Ala Asn Leu
355 360 365
Thr Trp Ser Val Lys His Asp Asp Phe Phe Pro Tyr Ala Asp Gly Pro
370 375 380
His Gln Phe Trp Thr Gly Tyr Phe Ser Ser Arg Pro Ala Leu Lys Arg385 390 395 400
Tyr Glu Arg Leu Ser Tyr Asn Phe Leu Gln Val Cys Asn Gln Leu Glu
405 410 415
Ala Leu Val Gly Leu Ala Ala Asn Val Gly Pro Tyr Gly Ser Gly Asp
420 425 430
Ser Ala Pro Leu Asn Glu Ala Met Ala Val Leu Gln His His Asp Ala
435 440 445
Val Ser Gly Thr Ser Arg Gln His Val Ala Asn Asp Tyr Ala Arg Gln
450 455 460
Leu Ala Ala Gly Trp Gly Pro Cys Glu Val Leu Leu Ser Asn Ala Leu465 470 475 480
Ala Arg Leu Arg Gly Phe Lys Asp His Phe Thr Phe Cys Gln Gln Leu
485 490 495
Asn Ile Ser Ile Cys Pro Leu Ser Gln Thr Ala Ala Arg Phe Gln Val
500 505 510
Ile Val Tyr Asn Pro Leu Gly Arg Lys Val Asn Trp Met Val Arg Leu
515 520 525
Pro Val Ser Glu Gly Val Phe Val Val Lys Asp Pro Asn Gly Arg Thr
530 535 540
Val Pro Ser Asp Val Val Ile Phe Pro Ser Ser Asp Ser Gln Ala His545 550 555 560
Pro Pro Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ser Leu Pro Ala Leu Gly Phe Ser565 570 575Thr Tyr Ser Val Ala Gln Val Pro Arg Trp Lys Pro Gln Ala Arg Ala
580 585 590
Pro Gln Pro Ile Pro Arg Arg Ser Trp Ser Pro Ala Leu Thr Ile Glu
595 600 605
Asn Glu His Ile Arg Ala Thr Phe Asp Pro Asp Thr Gly Leu Leu Met
610 615 620
Glu Ile Met Asn Met Asn Gln Gln Leu Leu Leu Pro Val Arg Gln Thr625 630 635 640
Phe Phe Trp Tyr Asn Ala Ser Ile Gly Asp Asn Glu Ser Asp Gln Ala
645 650 655
Ser Gly Ala Tyr Ile Phe Arg Pro Asn Gln Gln Lys Pro Leu Pro Val
660 665 670
Ser Arg Trp Ala Gln Ile His Leu Val Lys Thr Pro Leu Val Gln Glu
675 680 685
Val His Gln Asn Phe Ser Ala Trp Cys Ser Gln Val Val Arg Leu Tyr
690 695 700
Pro Gly Gln Arg His Leu Glu Leu Glu Trp Ser Val Gly Pro Ile Pro705 710 715 720
Val Gly Asp Thr Trp Gly Lys Glu Val Ile Ser Arg Phe Asp Thr Pro
725 730 735
Leu Glu Thr Lys Gly Arg Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Gly Arg Glu Ile
740 745 750
Leu Glu Arg Arg Arg Asp Tyr Arg Pro Thr Trp Lys Leu Asn Gln Thr
755 760 765
Glu Pro Val Ala Gly Asn Tyr Tyr Pro Val Asn Thr Arg Ile Tyr Ile
770 775 780
Thr Asp Gly Asn Met Gln Leu Thr Val Leu Thr Asp Arg Ser Gln Gly785 790 795 800
Gly Ser Ser Leu Arg Asp Gly Ser Leu Glu Leu Met Val His Arg Arg
805 810 815
Leu Leu Lys Asp Asp Gly Arg Gly Val Ser Glu Pro Leu Met Glu Asn820 825 830Gly Ser Gly Ala Trp Val Arg Gly Arg His Leu Val Leu Leu Asp Thr
835 840 845
Ala Gln Ala Ala Ala Ala Gly His Arg Leu Leu Ala Glu Gln Glu Val
850 855 860
Leu Ala Pro Gln Val Val Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ala Ala Tyr Asn865 870 875 880
Leu Gly Ala Pro Pro Arg Thr Gln Phe Ser Gly Leu Arg Arg Asp Leu
885 890 895
Pro Pro Ser Val His Leu Leu Thr Leu Ala Ser Trp Gly Pro Glu Met
900 905 910
Val Leu Leu Arg Leu Glu His Gln Phe Ala Val Gly Glu Asp Ser Gly
915 920 925
Arg Asn Leu Ser Ala Pro Val Thr Leu Asn Leu Arg Asp Leu Phe Ser
930 935 940
Thr Phe Thr Ile Thr Arg Leu Gln Glu Thr Thr Leu Val Ala Asn Gln945 950 955 960
Leu Arg Glu Ala Ala Ser Arg Leu Lys Trp Thr Thr Asn Thr Gly Pro
965 970 975
Thr Pro His Gln Thr Pro Tyr Gln Leu Asp Pro Ala Asn Ile Thr Leu
980 985 990
Glu Pro Met Glu Ile Arg Thr Phe Leu Ala Ser Val Gln Trp Lys Glu
995 1000 1005
Val Asp Gly1010<210> 22<211> 8079
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Plasmideo de expressão pLamanExpl
<400> 22
agatcttcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat 60tggctattgg ccattgcata cgttgtatctatgtccaata tgaccgccat gttggcattgtacggggtca ttagttcata gcccatatattggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccctcccatagta acgccaatag ggactttccaaactgcccac ttggcagtac atcaagtgtacaatgacggt aaatggcccg cctggcattatacttggcag tacatctacg tattagtcatgtacaccaat gggcgtggat agcggtttgatgacgtcaat gggagtttgt tttggcaccacaactgcgat cgcccgcccc gttgacgcaatatataagca gagctcgttt agtgaaccgttatcacagtt aaattgctaa cgcagtcagttgcagtgact ctcttaaggt agccttgcagtatcaaggtt acaagacagg tttaaggagaaagactcttg cgtttctgat aggcacctatctccacaggt gtccactccc agttcaattactcactatag gctagcctcg agaattcgccgtctgcgctc gaggctgcct ggactcagcaccaccgctcc cgcctctctg ctttttccttgggggatacg agacatgccc cacagtgcagcacacacatg atgacgtggg ctggctcaaaaatgacatcc agcacgccgg tgtgcagtacgcagatccca cccgtcgctt catttacgtgcagcagacaa atgccacaca ggaagtcgtgttcgccaatg gtggctgggt gatgaacgatgaccagatga cacttgggct gcgctttctgcgtgtggcct ggcacattga ccccttcggccagatgggct tcgacggctt cttctttgggatgcagaagc tggagatgga gcaggtgtgggcggacctct tcactggtgt gcttcccaatgatgtgctgt gtgtcgatca gccgctggtg
atatcataat atgtacattt atattggctc 120attattgact agttattaat agtaatcaat 180ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt 420tgcccagtac atgaccttac gggactttcc 480cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 540ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 600aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 720cagatcacta gaagctttat tgcggtagtt 780gcttctgaca caacagtctc gaacttaagc 840aagttggtcg tgaggcactg ggcaggtaag 900ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag 960tggtcttact gacatccact ttgcctttct 1020cagctcttaa ggctagagta cttaatacga 1080gccatgggcg cctacgcgcg ggcttcgggg 1140ggcccctgga ccatgtcccg cgccctgcgg 1200ttgttgctgg cggctgccgg tgctcgggcc 1260ccgaacatgc tgaacgtgca cctgctgcct 1320accgtggacc agtactttta tggaatcaag 1380atcctggact cggtcatctc tgccttgctg 1440gagattgcct tcttctcccg ttggtggcac 1500cgagaccttg tgcgccaggg gcgcctggag 1560gaggcagcca cccactacgg tgccatcgtg 1620gaggacacat ttggcaatga tgggcgaccc 1680cactctcggg agcaggcctc gctgtttgcg 1740cgccttgatt atcaagataa gtgggtacgg 1800cgggccagca ccagcctgaa gcccccgacc 1860ggttacaacc cgccaaggaa tctgtgctgg 1920gaggaccctc gcagccccga gtacaacgcc 1980aaggagctgg tcgattactt cctaaatgtgaaccacactg tgatgaccat gggctcggacaagaaccttg acaagctcat ccggctggtacatgttctct actccacccc cgcttgttactggtcagtga aacatgacga cttcttccctggttactttt ccagtcggcc ggccctcaaacaggtgtgca accagctgga ggcgctggtgtccggagaca gtgcacccct caatgaggcgagcggcacct cccgccagca cgtggccaacgggccttgcg aggttcttct gagcaacgcgttcacctttt gccaacagct aaacatcagcttccaggtca tcgtttataa tcccctgggggtcagcgaag gcgttttcgt tgtgaaggacgtaatatttc ccagctcaga cagccaggcgctgcccgccc tgggcttcag cacctattcagcccgcgcac cacagcccat ccccagaagagagcacatcc gggcaacgtt tgatcctgacaatcagcaac tcctgctgcc tgttcgccaggacaacgaaa gtgaccaggc ctcaggtgccctgcctgtga gccgctgggc tcagatccaccaccagaact tctcagcttg gtgttcccagctggagctag agtggtcggt ggggccgataatcagccgtt ttgacacacc gctggagacacgggagatcc tggagaggag gcgggattatcccgtggcag gaaactacta tccagtcaaccagctgactg tgctgactga ccgctcccaggagctcatgg tgcaccgaag gctgctgaagatggagaacg ggtcgggggc gtgggtgcgacaggctgcag ccgccggaca ccggctcctggtgctggccc cgggtggcgg cgccgcctactcagggctgc gcagggacct gccgccctcgcccgaaatgg tgctgctgcg cttggagcac
gccactgccc agggccggta ttaccgcacc 2040ttccaatatg agaatgccaa catgtggttc 2100aatgcgcagc aggcaaaagg aagcagtgtc 2160ctctgggagc tgaacaaggc caacctcacc 2220tacgcggatg gcccccacca gttctggacc 2280cgctacgagc gcctcagcta caacttcctg 2340ggcctggcgg ccaacgtggg accctatggc 2400atggctgtgc tccagcatca cgacgccgtc 2460gactacgcgc gccagcttgc ggcaggctgg 2520ctggcgcggc tcagaggctt caaagatcac 2580atctgcccgc tcagccagac ggcggcgcgc 2640cggaaggtga attggatggt acggctgccg 2700cccaatggca ggacagtgcc cagcgatgtg 2760caccctccgg agctgctgtt ctcagcctca 2820gtagcccagg tgcctcgctg gaagccccag 2880tcctggtccc ctgctttaac catcgaaaat 2940acagggctgt tgatggagat tatgaacatg 3000accttcttct ggtacaacgc cagtataggt 3060tacatcttca gacccaacca acagaaaccg 3120ctggtgaaga cacccttggt gcaggaggtg 3180gtggttcgcc tgtacccagg acagcggcac 3240cctgtgggcg acacctgggg gaaggaggtc 3300aagggacgct tctacacaga cagcaatggc 3360cgacccacct ggaaactgaa ccagacggag 3420acccggattt acatcacgga tggaaacatg 3480gggggcagca gcctgagaga tggctcgctg 3540gacgatggac gcggagtatc ggagccacta 3600gggcgccacc tggtgctgct ggacacagcc 3660gcggagcagg aggtcctggc ccctcaggtg 3720aatctcgggg ctcctccgcg cacgcagttc 3780gtgcacctgc tcacgctggc cagctggggc 3840cagtttgccg taggagagga ttccggacgt 3900aacctgagcg cccccgttac cttgaacttgcgcctgcagg agaccacgct ggtggccaactggacaacaa acacaggccc cacaccccacatcacgctgg aacccatgga aatccgcactgatggttagg tctgctggga tgggccctctgtgagggtta atgcttcgag cagacatgataactagaatg cagtgaaaaa aatgctttattgtaaccatt ataagctgca ataaacaagttcaggttcag ggggagatgt gggaggtttttaaaatccga taaggatcga tccgggctggccttcccaac agttgcgcag cctgaatggcgcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcgccgctccttt cgctttcttc ccttcctttcctctaaatcg ggggctccct ttagggttccaaaaacttga tttgggtgat ggttcacgtagccctttgac gttggagtcc acgttctttacactcaaccc tatctcggtc tattcttttgattggttaaa aaatgagctg atttaacaaagtgtcagtta gggtgtggaa agtccccaggtgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtggtatgcaaag catgcatctc aattagtcagtcccgcccct aactccgccc agttccgcccttatttatgc agaggccgag gccgcctctggcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaacatcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggatgctcaggaac gagttcaagt acttccaaagacagaatctg gtgattatgg gtaggaaaactttaaaggac agaattaata tagttctcagtcattttctt gccaaaagtt tggatgatgcaagtaaagta gacatggttt ggatagtcggtcaaccaggc caccttagac tctttgtgacgtttttccca gaaattgatt tggggaaata
agggacctgt tctccacctt caccatcacc 3960cagctccgcg aggcagcctc caggctcaag 4020caaactccgt accagctgga cccggccaac 4080ttcctggcct cagttcaatg gaaggaggtg 4140agagtcgacc cgggcggccg cttcccttta 4200aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 4260ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 4320taacaacaac aattgcattc attttatgtt 4380ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 4440cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 4500gaatggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 4560tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 4620tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 4680gatttagagc tttacggcac ctcgaccgca 4740gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 4800atagtggact cttgttccaa actggaacaa 4860atttataagg gattttgggg atttcggcct 4920aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt 4980ctccccaggc aggcagaagt atgcaaagca 5040gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 5100caaccatagt cccgccccta actccgccca 5160attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 5220cctctgagct attccagaag tagtgaggag 5280agctcccggg atggttcgac cattgaactg 5340tggcaagaac ggagacctac cctggcctcc 5400aatgaccaca acctcttcag tggaaggtaa 5460ctggttctcc attcctgaga agaatcgacc 5520tagagaactc aaagaaccac cacgaggagc 5580cttaagactt attgaacaac cggaattggc 5640aggcagttct gtttaccagg aagccatgaa 5700aaggatcatg caggaatttg aaagtgacac 5760taaacttctc ccagaatacc caggcgtcct 5820ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaactaattcgaa atgaccgacc aagcgacgcctatctttatt ttcattacat ctgtgtgttgtccgcgtatg gtgcactctc agtacaatctgacacccgcc aacacccgct gacgcgccctacagacaagc tgtgaccgtc tccgggagctcgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtgataataatggt ttcttagacg tcaggtggcatttgtttatt tttctaaata cattcaaataaaatgcttca ataatattga aaaaggaagattattccctt ttttgcggca ttttgccttcaagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtgacagcggtaa gatccttgag agttttcgccttaaagttct gctatgtggc gcggtattatgtcgccgcat acactattct cagaatgactatcttacgga tggcatgaca gtaagagaatacactgcggc caacttactt ctgacaacgatgcacaacat gggggatcat gtaactcgccccataccaaa cgacgagcgt gacaccacgaaactattaac tggcgaacta cttactctagaggcggataa agttgcagga ccacttctgcctgataaatc tggagccggt gagcgtgggtatggtaagcc ctcccgtatc gtagttatctaacgaaatag acagatcgct gagataggtgaccaagttta ctcatatata ctttagattgtctaggtgaa gatccttttt gataatctcatccactgagc gtcagacccc gtagaaaagatgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaacggatcaaga gctaccaact ctttttccgacaaatactgt ccttctagtg tagccgtagtcgcctacata cctcgctctg ctaatcctgtcgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat
gtataagttt gaagtctacg agaagaaaga 5880caacctgcca tcacgatggc cgcaataaaa 5940gttttttgtg tgaatcgata gcgataagga 6000gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 6060gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 6120gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 6180tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 6240cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 6300tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 6360gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 6420ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 6480cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 6540ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 6600cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 6660tggttgágta ctcaccagtc acagaaaagc 6720tatgcagtgc tgccatãacc atgagtgata 6780tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 6840ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 6900tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 6960cttcccggca acaattaata gactggatgg 7020gctcggccct tccggctggc tggtttattg 7080ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 7140acacgacggg gagtcaggca actatggatg 7200cctcactgat taagcattgg taactgtcag 7260atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 7320tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 7380tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 7440aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 7500aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 7560taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 7620taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 7680agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 7740gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagctacctacagcg tgagctatga gaaagcgccaatccggtaag cggcagggtc ggaacaggagcctggtatct ttatagtcct gtcgggtttcgatgctcgtc aggggggcgg agcctatggatcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca
<210> 23
<211> 3761
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 23
ggctactctc ggcttcctgg caacgccgagcgggccgcgc cgcggtgccc ttgctgctgttgctcgacga ctccgacggg ctgggccggggcggggcaac ctcccgactt ctagtaaattattatctctt taagccgaat tttggtgcctgtgatgggca gacaacagac ggcactgagcattatttccg aggatacgag tggtggttgattacactcat tgggttgcca tggtcattcccttatgtcaa tcttcagctg actgcctattgttaccatga tttggacatt gattatattgattatattaa gatattaaga aaaatgctgatagcaagtga taatctctgg gagtccatcttcaaggtggt tgatgttata ggggctcattagttgactgg gaagaagctt tggtcttctggtgcaggctg ctggggtcgc attttaaatccaatcgcatg gaatttagtg gctagttacttgatgacggc ccaagâgcca tggagtgggccagctcatac cactcagttt actcaacctgtagagaaagg aggaagctac gtagctctgattgaaaccat gagtcataaa cattctaagttgtcacaaca atttgccacc tttgttctta
tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 7800cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 7860agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 7920gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 7980aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 8040tggctcgac 8079
cgaaagctat gactgcggcc gcgggttcgg 60gtgcgctgct ggcgcccggc ggcgcgtacg 120agttcgacgg catcggcgcg gtcagcggcg 180acccagagcc ctatcgttct cagatattgg 240ctttgcatat tttaaaagtg gaaataggtg 300cctcccacat gcattatgca ctagatgaga 360tgaaagaagc taagaagagg aatcccaata 420ctggatggct gggaaaaggt ttcgactggc 480atgtcgtgac ctggattgtg ggcgccaagc 540gaatttggaa tgagaggtca tataatgcca 600attatcaagg tctccagcga gtgaaaatca 660ctgcatccat gctccttgat gccgaactct 720atcctggaac ccattcagca aaagatgcaa 780aagactttag cactttaaat agtgacatgg 840agaattatat caatggctat atgacttcca 900atgaacagtt gccttatggg agatgcgggt 960actacgtggt agaatctcct gtctgggtat 1020gctggtatta cctgaagaca gttggccatt 1080ctgatggctt agggaacctc accatcatca 1140gcatacggcc atttcttcct tatttcaatg 1200agggatcttt tagtgaaata ccagagctac 1260aggtatggta taccaaactt ggaaaaacatctctatggct ccttgacagc gatggcagtttcacactcac cactctcacc actggtcgcaagcccttccc aagtacctat aaggatgattctccaaactt tgctgatcaa actggtgtatgcgagcatca cttcacgcta cgccaagttcatgcatccaa cacaatcagt attataggaggtgatgttta catagagacc cctgacacagaaggtggtat tttgattaga agtgccagagcttacagggt tacaggtgat ttagctggatttacagcaaa aaaatggtat acactcacgttgctgaatga caagtctctg tggacagacactgcaattgg aactcactcc tttgaatttgcacgctaata cttaacaggg catcatagaatttggttcag agccaattct tgtttcattgataatgaaga gtaaaagggg agagaaattttagaattaat tccaagggga aaactggtgacattcaaact gtgcattggc catacccttaccttgctgct aacactgagg tagctctcttcagtaacttg atcatcactg agatgtatttagtgtcttca tcacaagatg atgctgccattttttgaaaa ccacttcaac ctgttatgctctttttaaga tgatactttt gaaatgcaggctctttaata aactacctct aacactatttggttatttgc attatttaat ttttttgattctctgtgaac gtttttccag gtggctggaagttgtagtcg tttcctcagc ctcatctcacggtaacagac tcacacagct gatgaatgctcacttagaca tttgctaact cccagaattgaagtccaaat atgtttatat ttaaatatactactaagcat taatgtggct ctatgtagcatagaattatt tataagaatt actcattgaa
ccgaaagatt tctttttaag cagctggatt 1320tcacactgag cctgcatgaa gatgagctgt 1380aaggcagcta cccgcttcct ccaaaatccc 1440tcaatgttga ttacccattt tttagtgaag 1500ttgaatattt tacaaatatt gaagaccctg 1560tcaaccagag acccattacg tgggctgccg 1620actacaactg gaccaatctg actataaagt 1680gaggtgtgtt cattgcagga agagtaaata 1740gaattttctt ctggattttt gcaaatggat 1800ggattatata tgctttagga cgtgttgaag 1860taactattaa gggtcatttc gcctctggca 1920tccctgtgaa ttttccaaag aatggctggg 1980cacagtttga caactttctt gtggaagcca 2040tactctggat tttcttccct tctttttggt 2100gaacagtata tgaggctttt gagactaaaa 2160atttttaatt taccctgtgg aagattttat 2220atctttaaca ttacctggtg tgttccctaa 2280ggagtggttt gagtagtaca gacctcgaag 2340catcttattt gcaagcggtc ctgtagatgg 2400atgcatgctg accgtgtgtc caagtgagcc 2460aatagaaagc tgaagaacac tagaagtagc 2520ttatgctcta aaaagtattt ttttattttc 2580atatgatgag tgggatgatt ttaaaaacgc 2640ctgcggtaat agatattagc agattaattg 2700ccaagttttg gtcttgtaac cactataact 2760gaaggaagaa aacctgatat agccaatgct 2820tgtgctgtgg tctgtcctca catgtgcact 2880tttctctcct tatgtgtgga aggaggggag 2940gatcatctcc taagatgtac ttacttttta 3000gtgagcatgt tcatcatgtt gtatgattta 3060aatcagttat tcatgtaggt aaagtaaatc 3120ctaattctac tatttaggaa tttataagag 3180tctaacatag gcttagctac agtgaagttt tgcattgctt ttgaagacaa gaaaagtgct 3240agaataaata agattacaga gaaaattttt tgttaaaacc aagtgatttc cagctgatgt 3300atctaatatt ttttaaaaca aacattatag aggtgtaatt tatttacaat aaaatgttcc 3360tactttaaat atacaattca gtgagttttg ataaattgat atacccatgt aaccaacact 3420ccagtcaagc ttcagaatat ttccatcacc ccagaaggtt ctcttgtata cctgctcagt 3480cagttccttt cactcccaat tgttggcagc cattgatagg aattctatca ctataggtta 3540gttttctttg ttccagaaca tcatgaaagc ggcgtcatgt actgtgtatt cttatgaatg 3600gtttctttcc atcagcataa tgatttgaga ttggtccatg ttgtgtgatt cagtggtttg 3660ttccttctta tttctgaaga gttttccatt gtatgaatat accacaattt gtttcctccc 3720caccagtttc tgatactaca attaaaactg tctacattta c 3761
<210> 24
<211> 669
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 24
Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly Ile Gly Ala Val Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser
50 55 60
Gln Ile Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His65 70 75 80
Ile Leu Lys Val Glu Ile Gly Gly Asp Gly Gln Thr Thr Asp Gly Thr
85 90 95
Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly
100 105 110
Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn Ile
115 120 125
Thr Leu Ile Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly130 135 140
Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gln Leu Thr Ala Tyr Tyr Val Val145 150 155 160
Thr Trp Ile Val Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp Ile Asp Tyr
165 170 175
Ile Gly Ile Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Ile
180 185 190
Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gln Gly Leu Gln Arg Val Lys Ile Ile
195 200 205
Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp
210 215 220
Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly225 230 235 240
Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser
245 250 255
Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp
260 265 270
Gly Arg Ile Leu Asn Gln Asn Tyr Ile Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr
275 280 285
Ile Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gln Leu Pro Tyr Gly
290 295 300
Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gln Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val305 310 315 320
Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gln Phe Thr Gln
325 330 335
Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly
340 345 350
Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr Ile Ile Ile
355 360 365
Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys Ile Arg Pro Phe Leu Pro
370 375 380
Tyr Phe Asn Val Ser Gln Gln Phe Ala Thr Phe Val Leu Lys Gly Ser385 390 395 400
Phe Ser Glu Ile Pro Glu Leu Gln Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys
405 410 415
Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gln Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu
420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe
435 440 445
Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro
450 455 460
Pro Lys Ser Gln Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val465 470 475 480
Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gln Thr Gly
485 490 495
Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn Ile Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe
500 505 510
Thr Leu Arg Gln Val Leu Asn Gln Arg Pro Ile Thr Trp Ala Ala Asp
515 520 525
Ala Ser Asn Thr Ile Ser Ile Ile Gly Asp Tyr Asn Trp Thr Asn Leu
530 535 540
Thr Ile Lys Cys Asp Val Tyr Ile Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Val545 550 555 560
Phe Ile Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly Ile Leu Ile Arg Ser Ala
565 570 575
Arg Gly Ile Phe Phe Trp Ile Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Val Thr
580 585 590
Gly Asp Leu Ala Gly Trp Ile Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Val Glu Val
595 600 605
Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Ile Lys Gly His Phe
610 615 620
Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu Trp Thr Asp Ile Pro Val625 630 635 640
Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala Ile Gly Thr His Ser Phe Glu645 650 655
Phe Ala Gln Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu Ala Thr Arg660 665
<210> 25
<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> peptídeo básico de 11 resíduos de proteína TAT de HIV
<400> 25
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 26<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> peptídeo de TAT sintético
<400> 26
Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala1 5 10

Claims (28)

1. Método de concentração de uma composição compreendendoum polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em: Alfa Manosidase, ga-lactosilcerebrosidase, Porfobilinogênio desaminase e partes e análogos fun-cionalmente equivalentes dos mesmos, o dito método compreendendo:a) centrifugação e/ou filtragem de uma composição compreen-dendo o dito polipeptídeo;b) concentração do sobrenadante ou retentato, respectivamente,obtido da etapa a).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito poli-peptídeo compreende um aminoácido selecionado do grupo consistindo em:i) uma seqüência de aminoácido conforme definido por qualqueruma das SEQ ID Nos: 21, 24, 14 e 15;ii) uma parte funcionalmente equivalente de uma seqüência deaminoácido conforme definido em i); eiii) um análogo funcionalmente equivalente de uma seqüência deaminoácido conforme definido em i) ou ii), a seqüência de aminoácido dodito análogo sendo pelo menos 75% idêntica a uma seqüência de aminoáci-do conforme definido em i) ou ii).
3, Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a etapab) é realizada através de secagem por congelamento ou evaporação.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações ante-riores, em que a etapa b) é realizada através de ultrafiltragem.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a etapa b) érealizada através de filtragem de fluxo tangencial.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a etapa b) érealizada com um dispositivo centrífugo.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações ante-riores, em que a composição compreendendo um polipeptídeo de interessecompreende ainda um ou mais dos componentes selecionados do grupoconsistindo em: glicina, L-serina, sacarose e manitol.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações ante-riores, em que a composição compreendendo um polipeptídeo de interessecompreende ainda um ou mais tampões selecionados do grupo consistindoem: TrIS-HCI1 citrato de Na e Na2HPO4.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações ante-riores, em que o dito método compreende ainda uma etapa de esterilizaçãoda composição concentrada compreendendo um polipeptídeo de interesseobtido da etapa b).
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, em que o dito método compreende ainda uma etapa de secagempor congelamento da composição concentrada compreendendo um polipep-tídeo de interesse obtido da etapa b).
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, em que a centrifugação na etapa a) é realizada a 1800-2500 g.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, em que o filtro usado para a filtragem na etapa a) tem um tamanhode poro na faixa de 0,20 a 5,0 micrometros.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, em que o dito método compreende ainda uma ou mais das etapasque seguem antes da etapa a):i) expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse emuma célula procariótica ou em células de vertebrado em cultura;ii) purificação de um polipeptídeo de interesse através de umaou mais etapas de cromatografia; eiii) troca do tampão da formulação.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a croma-tografia na etapa ii) é selecionada do grupo consistindo em: cromatografiapor afinidade, cromatografia de troca de íon e cromatografia de hidroxiapatita.
15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o dito mé-todo compreende as etapas que seguem antes da etapa a):i) expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse;ii) submissão da composição compreendendo um polipeptídeode interesse da etapa i) à cromatografia por afinidade; eiii) submissão da composição compreendendo um polipeptídeode interesse da etapa ii) à cromatografia de troca de íon.
16. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o dito mé-todo compreende as etapas que seguem antes da etapa a):i) expressão recombinante de um polipeptídeo de interesseii) submissão da composição compreendendo um polipeptídeode interesse da etapa i) à cromatografia por afinidade;iii) submissão da composição compreendendo um polipeptídeode interesse da etapa ii) à cromatografia de troca de íon; eiv) submissão da composição compreendendo um polipeptídeode interesse da etapa iii) a uma coluna de hidroxiapatita.
17. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o dito mé-todo compreende expressão recombinante usando uma seqüência de ácidonucléico compreendendo uma seqüência selecionada do grupo consistindoem:i) uma seqüência de ácido nucléico conforme definido por qual-quer uma das SEQ ID Nos: 22, 23 e 1 -13;ii) uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 75% idên-tica a uma seqüência de ácido nucléico conforme definido em i).
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15ou 16, em que o dito método compreende ainda uma etapa de diluição oudiafiltragem da composição compreendendo um polipeptídeo de interesseobtido da etapa ii).
19. Composição compreendendo pelo menos 10 mg/ml de umpolipeptídeo selecionado do grupo consistindo em Alfa Manosidase, galacto-silcerebrosidase, Porfobilinogênio desaminase e partes e análogos funcio-nalmente equivalentes dos mesmos, onde menos do que 5% da quantidadetotal do polipeptídeo na dita composição estão presentes na forma de agre-gados.
20. Composição de acordo com a reivindicação 19, em que opolipeptídeo compreende um aminoácido selecionado do grupo consistindoem:i) uma seqüência de aminoácido conforme definido por qualqueruma das SEQ ID NOs: 21, 24, 14 e 15;ii) uma parte funcionalmente equivalente de uma seqüência deaminoácido conforme definido em i); eiii) um análogo funcionalmente equivalente de uma seqüência deaminoácido conforme definido em i) ou ii), a seqüência de aminoácido dodito análogo sendo pelo menos 75% idêntica a uma seqüência de aminoáci-do conforme definido em i) ou ii).
21. Uso de uma composição compreendendo 75-250 mg/ml depolipeptídeo selecionado do grupo consistindo em alfa manosidase, galacto-silcerebrosidase, Porfobilinogênio desaminase e partes e análogos funcio-nalmente equivalentes dos mesmos para a fabricação de um medicamentopara injeção subcutânea em um mamífero.
22. Uso de acordo com a reivindicação 21, em que o polipeptí-deo compreende um aminoácido selecionado do grupo consistindo em:i) uma seqüência de aminoácido conforme definido por qualqueruma das SEQ ID NOs: 21, 24, 14 e 15;ii) uma parte funcionalmente equivalente de uma seqüência deaminoácido conforme definido em i); eiii) um análogo funcionalmente equivalente de uma seqüência deaminoácido conforme definido em i) ou ii), a seqüência de aminoácido dodito análogo sendo pelo menos 75% idêntica a uma seqüência de aminoáci-do conforme definido em i) ou ii).
23. Uso de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que o ditopolipeptídeo é alfa manosidase e em que o medicamento é para o tratamen-to de alfa manosidose.
24. Uso de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que o ditopolipeptídeo é galactosilcerebrosidase e em que o medicamento é para otratamento de doença de Krabbe.
25. Uso de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que o ditopolipeptídeo é porfobilinogênio desaminase e em que o medicamento é parao tratamento de porfiria intermitente aguda.
26. Método de tratamento de um mamífero para alfa manosidosecompreendendo injeção subcutânea de uma composição de 50-300 mg/mlde alfa manosidase.
27. Método de tratamento de um mamífero para doença deKrabbe compreendendo injeção subcutânea de uma composição de 50-300mg/ml de galactosilcerebrosidase.
28. Método de tratamento de um mamífero para porfiria intermi-tente aguda compreendendo injeção subcutânea de uma composição de 50-300 mg/ml de porfobilinogênio desaminase.
BRPI0709737-9A 2006-04-04 2007-04-04 processo para concentraÇço de um polipeptÍdeo BRPI0709737A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200600488 2006-04-04
DKPA200600488 2006-04-04
DKPA200600922 2006-07-05
DKPA200600922 2006-07-05
PCT/DK2007/000177 WO2007112757A2 (en) 2006-04-04 2007-04-04 A process for concentration of a polypeptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0709737A2 true BRPI0709737A2 (pt) 2011-07-26

Family

ID=38472949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0709737-9A BRPI0709737A2 (pt) 2006-04-04 2007-04-04 processo para concentraÇço de um polipeptÍdeo

Country Status (20)

Country Link
US (6) US20090246187A1 (pt)
EP (4) EP2631242B1 (pt)
JP (6) JP2009532394A (pt)
KR (3) KR20140057678A (pt)
CN (1) CN105233276A (pt)
AU (2) AU2007234195B2 (pt)
BR (1) BRPI0709737A2 (pt)
CA (3) CA2632528C (pt)
DK (1) DK2628746T3 (pt)
ES (3) ES2713488T3 (pt)
HU (1) HUE042402T2 (pt)
IL (4) IL194267A (pt)
MX (1) MX2008012748A (pt)
NO (3) NO347673B1 (pt)
NZ (7) NZ607595A (pt)
PL (3) PL2100898T3 (pt)
PT (1) PT2628746T (pt)
SI (1) SI2628746T1 (pt)
WO (1) WO2007112757A2 (pt)
ZA (2) ZA200805346B (pt)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ576986A (en) 2004-01-30 2010-12-24 Shire Pharmaceuticals Ireland Ltd Production and purification of recombinant arylsulfatase A
EP2631242B1 (en) * 2006-04-04 2022-08-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited A process for concentration of a polypeptide
LT2538968T (lt) * 2010-02-24 2018-01-10 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Rekombinantinės lizosominės alfa manozidazės gamybos ir gryninimo būdas
KR20140005842A (ko) 2010-06-25 2014-01-15 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 헤파란 n-설파타제의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
SI3626258T1 (sl) 2010-06-25 2021-11-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Postopki in sestavki za dovajanje idunorat-2-sulfataze v cžs
KR102537084B1 (ko) 2010-06-25 2023-05-26 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 아릴설파타제 a의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
UA115648C2 (uk) 2010-06-25 2017-12-11 Шае Хюмен Дженетік Терапіс, Інк. Доставка терапевтичних агентів до цнс
EP2729566B1 (en) 2011-07-08 2017-03-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of arylsulfatase a
EP2793922B1 (en) 2011-12-23 2019-10-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a
KR101783466B1 (ko) * 2012-11-13 2017-10-10 치에시 파마슈티시 에스.피.아. 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타-갈락토시다아제(rhGALC)의 정제
AU2013357812B2 (en) * 2012-12-11 2019-10-10 Centogene Gmbh Method for the diagnosis of metachromatic leukodystrophy
CA2896979C (en) 2013-01-09 2023-05-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of arylsulfatase a
SG10201913874TA (en) 2013-03-15 2020-03-30 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
EA038573B1 (ru) 2014-03-24 2021-09-16 Биовератив Терапьютикс Инк. Лиофилизированный состав, содержащий фактор ix, для предупреждения приступов кровотечения
KR102286260B1 (ko) * 2017-08-31 2021-08-05 주식회사 녹십자 설파타아제 단백질을 정제하는 방법
KR102290596B1 (ko) * 2020-09-10 2021-08-19 주식회사 파이안바이오테크놀로지 분리된 미토콘드리아를 포함하는 주사용 조성물 및 이의 용도

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2041280A1 (en) 1990-05-10 1991-11-11 Yosuke Sawada Arylsulfatase
NO960163D0 (no) * 1996-01-15 1996-01-15 Thomas Berg Mutasjonsdeteksjon av bovin
JP2002501032A (ja) 1998-01-27 2002-01-15 ヘム−バイオテック エイ／エス 急性間欠性ポルフィリン症（ａｉｐ）及び他のポルフィリン症の治療方法
AU753468B2 (en) * 1998-06-09 2002-10-17 Csl Behring Ag Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products
JP4685238B2 (ja) * 1998-06-09 2011-05-18 ツエー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシヤフト 静脈投与用免疫グロブリン及び他の免疫グロブリン生成物の製造法
US6537777B1 (en) 1998-07-27 2003-03-25 Hemebiotech A/S Human porphobilinogen deaminase sequences
AUPQ026799A0 (en) * 1999-05-10 1999-06-03 Csl Limited Method of increasing protein stability by removing immunoglobulin aggregates
JP2003505057A (ja) * 1999-07-27 2003-02-12 ヘム−バイオテック エイ／エス ｒｈＰＢＧＤの製造及び急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）及び他のポルフィリン症の患者を処置するための新規な治療方法
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
EP1409695A2 (en) 2000-11-15 2004-04-21 Genzyme Corporation Expression system for recombinant proteins
WO2002099092A2 (en) * 2001-06-07 2002-12-12 Hemebiotech A/S Production of recombinant human lysosomal alpha-mannosidase
WO2002098455A2 (en) * 2001-06-07 2002-12-12 Hemebiotech A/S Production of recombinant human arylsulfatase a
EP1402014A1 (en) * 2001-06-29 2004-03-31 Hemebiotech A/S A process for purification of recombinant porphobilinogen deaminase
US7232670B2 (en) * 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
CA2472937C (en) 2002-01-11 2014-06-17 Biomarin Pharmaceutical, Inc. Use of p97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes
US7118675B2 (en) * 2002-02-04 2006-10-10 Millipore Corporation Process for removing protein aggregates and virus from a protein solution
CH694697A5 (de) 2004-01-29 2005-06-15 Koelbl Engineering Und Consult Gummimehl-enthaltende Elastomerlegierungen.
NZ576986A (en) * 2004-01-30 2010-12-24 Shire Pharmaceuticals Ireland Ltd Production and purification of recombinant arylsulfatase A
EP1740204B1 (en) * 2004-04-01 2018-03-14 Chiesi Farmaceutici S.p.A. Medicinal use of alpha-mannosidase
US20060051347A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Winter Charles M Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof
EP2631242B1 (en) * 2006-04-04 2022-08-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited A process for concentration of a polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200805346B (en) 2018-11-28
EP2100898A1 (en) 2009-09-16
KR101504969B1 (ko) 2015-03-24
ES2744499T3 (es) 2020-02-25
US8809055B2 (en) 2014-08-19
CA2882501C (en) 2021-09-07
EP2100898B1 (en) 2019-06-19
CA2882501A1 (en) 2007-10-11
KR20150103339A (ko) 2015-09-09
NZ568728A (en) 2011-09-30
NO20084776L (no) 2008-10-31
US20120076767A1 (en) 2012-03-29
EP2628746A3 (en) 2014-03-19
NZ571610A (en) 2011-07-29
WO2007112757A3 (en) 2008-02-28
US20170202927A1 (en) 2017-07-20
EP2631242B1 (en) 2022-08-03
EP2631242A3 (en) 2013-10-02
US20140314735A1 (en) 2014-10-23
NO347673B1 (no) 2024-02-19
CA2644642A1 (en) 2007-10-11
PT2628746T (pt) 2019-04-23
EP2628746B1 (en) 2019-01-09
NO346368B1 (no) 2022-06-27
AU2008229659A1 (en) 2008-10-23
NZ597548A (en) 2013-08-30
CA2644642C (en) 2016-01-26
US20090246187A1 (en) 2009-10-01
PL2628746T3 (pl) 2019-07-31
US20160193304A1 (en) 2016-07-07
HUE042402T2 (hu) 2019-06-28
EP2004672A2 (en) 2008-12-24
EP2628746A2 (en) 2013-08-21
JP5878152B2 (ja) 2016-03-08
KR20090018894A (ko) 2009-02-24
AU2007234195B2 (en) 2013-02-07
ZA200809540B (en) 2019-09-25
IL194267A (en) 2015-10-29
NO20211305A1 (no) 2008-10-31
MX2008012748A (es) 2009-01-07
IL235982A0 (en) 2015-01-29
IL194267A0 (en) 2011-08-01
EP2631242A2 (en) 2013-08-28
US20180289777A1 (en) 2018-10-11
US9713634B2 (en) 2017-07-25
JP2013236633A (ja) 2013-11-28
ES2713488T3 (es) 2019-05-22
DK2628746T3 (en) 2019-04-01
KR20140057678A (ko) 2014-05-13
NZ588903A (en) 2012-08-31
CA2632528C (en) 2022-07-12
WO2007112757A2 (en) 2007-10-11
PL2100898T3 (pl) 2019-11-29
JP2009273469A (ja) 2009-11-26
JP2014051503A (ja) 2014-03-20
AU2008229659B2 (en) 2013-01-31
IL211905A0 (en) 2011-05-31
IL241654B (en) 2019-02-28
NZ607595A (en) 2014-10-31
CN105233276A (zh) 2016-01-13
CA2632528A1 (en) 2007-10-11
EP2004672B1 (en) 2015-08-19
PL2631242T3 (pl) 2023-03-20
JP2016104000A (ja) 2016-06-09
SI2628746T1 (sl) 2019-04-30
JP2014058521A (ja) 2014-04-03
JP5384232B2 (ja) 2014-01-08
IL241654A0 (en) 2015-11-30
NZ582045A (en) 2011-07-29
NZ623123A (en) 2015-04-24
JP2009532394A (ja) 2009-09-10
AU2007234195A1 (en) 2007-10-11
NO20082510L (no) 2008-10-31
ES2928096T3 (es) 2022-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0709737A2 (pt) processo para concentraÇço de um polipeptÍdeo
KR101535791B1 (ko) 개량형 이듀로네이트-2-설파타제 및 이의 용도
DK2538968T3 (en) PROCEDURE FOR THE PREPARATION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT LYSOSOMAL ALFA MANNOSIDASE
CN101410408A (zh) 用于浓缩多肽的方法
DK1740204T3 (en) MEDICAL USE OF ALFA MANNOSIDASE
AU2013202950B2 (en) A process for concentration of a polypeptide
US20030199073A1 (en) Production of recombinant human lysosomal alpha-mannosidase
PT1740204T (pt) Utilização médica de alfa-manosidase
HK1189007B (en) A process for concentration of a polypeptide
HK1188604B (en) A process for the concentration of a polypeptide
HK1188604A (en) A process for the concentration of a polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: CHIESI FARMACEUTICI S.P.A. (IT)

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]

Free format text: MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL