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BRPI0708477A2 - composições relacionadas ao lócus 6 de traço quantitativo (qtl6) em milho e métodos de uso - Google Patents

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BRPI0708477A2
BRPI0708477A2 BRPI0708477-3A BRPI0708477A BRPI0708477A2 BR PI0708477 A2 BRPI0708477 A2 BR PI0708477A2 BR PI0708477 A BRPI0708477 A BR PI0708477A BR PI0708477 A2 BRPI0708477 A2 BR PI0708477A2
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William B Allen
Bo Shen
Mitchell C Tarczynski
Mark E Williams
Peizhong Zheng
Gan-Yuan Zhong
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Pioneer Hi Bred Int
Du Pont
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Abstract

COMPOSIçõES RELACIONADAS AO LóCUS 6 DE TRAçO QUANTITATIVO (QTL6) EM MILHO E METODOS DE USO Composições relacionadas ao lócus 6 de traço quantitativo (QTL6) em milho e métodos para seu uso são fornecidos. As composições são loci marcadores moleculares novos que são geneticameflte ligados ao QTL6 e que estão associados ao conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou relação entre ácido oléico/ácido linoleico aumentada de uma planta ou parte de planta. Estes novos marcadores são caracterizados pela presença de pelo menos um polimorfismo relativo ao lócus marcador correspondente da região de QTL6 de plantas de milho com conteúdo de óleo baixo, conteúdo de ácido oléico baixo. Em algumas modalidades, o novo loci marcadorcompreende a seqúência codificadora para um polipeptídeo DGAT 1-2 de milho ou variante biologicamente ativa deste. O loci marcador da invenção, e os fragmentos adequados deste,são úteis nos métodos da invenção para manipular o conteúdo de óleo e/ou ácido oléico e/ou a relação entre ácido oléico e ácido linoleico de uma planta ou parte de planta, para a seleção assistida por marcador de uma planta, por exemplo, uma planta de milho, ou parte da planta, possuindo um conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou uma relação entre ácido oléico e ácido linoleico aumentada, e para a reprodução assistida por marcador do traço de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico.

Description

COMPOSIÇÕES RELACIONADAS AO LÕCUS 6 DE TRAÇO QUANTITATIVO(QTL6) EM MILHO E MÉTODOS DE USOCAMPO DA INVENÇÃO
A invenção relaciona-se ao campo de reprodução deplantas e manipulação genética de plantas, particularmentepara a modulação do conteúdo de óleo e conteúdo oleico emuma planta ou parte desta planta.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Mais de 50% da safra de grão de milho produzida nosEUA é usada para alimentação de animais (Perry (1988) Cornand Corn Improvement, eds., Sprague and Dudley (Madison,WI) , páginas 941-963) . O grão de milho com elevadaconcentração de óleo possui um maior conteúdo calóricocomparado com grão de milho padrão e é vantajoso como umafonte alimentar para animais. A alimentação de suínos eaves domésticas com grão de milho de alto conteúdo de óleoem vez de grão de milho com níveis padrões de concentraçãode óleo resultou em ganho de peso acelerado (Han e outros(1987) J. Poult. Sei. 66:103-111 and Gross e outros (1992)Proc. of the 4 7th Ann. Corn and Sorghum Res. Conference,páginas 82-92) . Assim, o desenvolvimento de germeplasma comalto teor de óleo é um objetivo de alguns programas dereprodução de milho.
A tecnologia de marcador molecular tem permitido aassociação de marcadores de DNA com importantes traçosagornômicos tal como rendimento, altura de planta,resistência à doenças, etc. Métodos e composições quemelhoram o conteúdo de óleo de plantas e também fornecemnovos marcadores moleculares que consideram métodos dereprodução eficientes para identificar as plantas de altoteor de óleo são necessários na técnica.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Composições relacionadas ao lócus 6 de traçoquantitativo (QTL6) em milho e métodos para seu uso sãofornecidos. As composições são Ioci marcadores molecularesnovos que são geneticamente ligados ao QTL6 e que estãoassociados ao conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo deácido oléico aumentado de uma planta ou parte desta planta,e/ou uma relação entre ácido oléico/ácido linoleicoaumentada em uma planta ou parte desta planta. Estes novosmarcadores são caracterizados pela presença de pelo menosum polimorfismo relativo ao lócus marcador correspondenteda região de QTL6 de pé de milho com conteúdo de óleonormal. Em algumas modalidades, os novos Ioci marcadorescompreender codificar seqüência para um polipeptideo, ondepelo menos um polimorfismo dentro do lócus marcador resultana expressão de um polipeptideo variante que está associadoao conteúdo de óleo aumentado, e/ou conteúdo de ácidooléico aumentados, e/ou uma relação entre ácidooleico/ácido linoleico aumentada dentro da planta ou partedesta planta. Em tal modalidade, o lócus marcadorcompreende uma seqüência codificadora para um DGATl-2 demilho ou variante biologicamente ativa deste, part o DGATl-2(ASK) de milho ou variante biologicamente ativa deste. Osloci marcadores da invenção e fragmentos adequados destes,são úteis na seleção assitida por marcador de uma planta,por exemplo, um pé de milho, ou parte da planta, possuindoum conteúdo de óleo aumentado, e/ou conteúdo de ácidooléico aumentado, e/ou uma relação entre o ácido oleico e oácido linoleico, e para reprodução assistida por marcadordo alto traço de óleo e/ou alto traço de ácido oléico,incluindo conteúdo de ácido oleico aumentado e relaçãoaumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico.
Desta forma, a presente invenção fornece métodos paraidentificar um pé de milho ou germeplasma de milho quepossua um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácidooléico aumentado, e/ou uma relação aumentada entre o ácidooléico/ácido linoléico, os métodos compreendendo detectarna planta pi germeplasma pelo menos um polimorfismo em deum lócus marcador da invenção que esteja associado com oconteúdo de óleo aumentado, o conteúdo de ácido oléicoaumentado ou a relação aumentada entre o ácido oléico/ácidolinoléico. Em algumas modalidades, a detecção compreende ouso de um marcador detectável compreendendo todo ou partedo lócus marcador ou de um complemento deste. Plantas ougermeplasmas identificados como possuindo o traço de altoteor de óleo desejável, e/ou o traço de alto teor deácido oléico, e/ou o traço de relação aumentada entre oácido oléico/ácido linoléico podem ser selecionadas parauso em métodos de reprodução tradicionais para introduzit otraço desejado em qualquer planta ou germeplasca adequadosde interesse.
A presente invenção também fornece métodos paraidentificar a presença de um lócus QTL6 que estejaassociado a um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo deácido oléico aumentado e/ou uma relação aumentada entre oácido oléico/ácido linoléico em um pé de milho ougermeplasma de milho. Os métodos compreendem medir aconcentração de ácido oléico da semente do referido pé demilho ou germeplasma de milho, onde uma concentração deácido oléico de pelo menos 35% é indicativa que de o pé demilho ou germeplasma de milho provavelmente compreendemeste lócus QTL6. Plantas ou germeplasmas identificados comopossuindo o lócus QTL6 de alto teor de óleo/alto teor deácido oléico desejável pode ser selecionada para uso emmétodos de procriação tradicionais para introduzir estelócus desejado em qualquer planta ou germeplasma adequadosde interesse.
As composições da invenção também compreendempolinucleotídeos isolados por cinco quadros de leituraabertos em uma região de QTL6 de milho aqui divulgada e ospolipeptideos codificados por estes. Os cinco quadros deleitura abertos codificam um DGAT de milho, designadoZmDGATl-2(ASK); uma permease 1 de aminoácido de milho,degignada ZmAAP 1; uma proteína do sistema de efluxo depotássio de milho, designada ZmPESP, uma proteína S24ribossomal de milho, designada ZmS24, um transportador ABCtipo PDR de milho, designado ZmABCT e variantesbiologicamente ativas destes. É também fornecido o quadro20 de leitura aberto que condifica o ZmDGATl-2 correspondentedas linhas consaguíneas de milho de teor de milho normais eo polipeptídeo codificado por este. Adicionalmente, ainvenção fornece sequencias promotoras isoladas para o geneZmDGATl-2 (ASK) , para um gene DGAT 1-2 de teor de óleonormal correspondente, designado ZmDAGTl-2(Mol7), e para osgenes ZmAAP 1, ZmPESP(Mol7) e ZmPESP(ASK), ZmS24 e ZmABCTda invenção. Estas seqüências promotoras encontram uso nodirecionamento da expressão de polinucleotídeosoperativamente ligados que condificam polipeptideos deinteresse, incluindo os respectivos polinucleotídeosnativos codificando os polipeptídeos ZmDGATl-2(ASK) ,ZmDGATl-2(Mol7), ZmAAP 1, ZmPESP, ZmS24, e ZmABCT deinteresse.
As composições da invenção encontram uso namanipulação de óleo, e/ou conteúdo de ácido oléico e/ourelação entre ácido oléico/ácido linoleico dentro de umaplanta de interesse ou parte da planta. Desta forma, apresente invenção também fornece cassetes de expressãocompreendendo um ou mais polinucleotídeos da invenção, ecélulas de planta transformadas, plantas e sementecompreendendo estes cassetes de expressão. Os cassetes deexpressão encontram uso em métodos da invenção direcionadaspara aumentar o conteúdo de óleo, aumentar o conteúdo deácido oléico e/ou aumentar a relação entre ácidooléico/ácido linoleico em uma planta ou parte desta planta.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra o mapeamento de QTL6 em umapopulação BC2.
A Figura 2 é um desenho esquemático ilustrando omapeamento progressivo de QTL6 de uma região de 47,2 cM emBC2 abaixo de um fragmento de aproximadamente 195 kb emBC4S2, que corresponde a três clones BAC se sobrepondo(bl21c.n3, b33a.k3 e be46c.n5) em um mapa físico de Mol7consanguíneo.
A Figura 3 fornece dados que mostram que o QTL6aumenta as concentrações de óleo no embrião e semente. Emmédia, 10 sementes de cada espiga homozigótica foramanalisadas pata óleo na semente e óleo no embirão por NMR.Para i óleo da semente, sementes secas ao ar foram usadaspara medições de NMR diretas. Para o óleo do embrião, assementes foram imersas em água durante a noite. Osembrições foram dissecados dos endospermas, secos a vácuo esujeitados a análises de NMR. QTL6 aumenta consistentementeas concentrações de óleo no embrião e de óleo na sementeem várias gerações.
A Figura 4 fornece dados que mostram que o QTL6 tambémaumentam a relação entre ácido oléico/ácido linoleico nassementes. Em média, cinco sementes de cada espigahomozigótica foram sujeitadas ao perfil de ácido graxo.
Porque mais de 80% do óleo de semente total é oriunda deembriões, apenas sementes inteiras foram analisadas paraácidos graxos. As sementes foram trituradas e extraídascom hexanos grau HPLC. 0 extrato de hexano/óleo é misturadocom hidróxido de trimetilsulfônio 1/10 volume em um frascode cromatografia gasosa (GC) . A composição de ácido graxofoi determinada por GC capilar em um cromatograf o a gásmodelo 6890 Agilent com detector de ionização de chama. Osésteres metílicos de ácido graxo foram separados em umacoluna capilar ZB-Wax Zebron™. Os dados estão expressadoscomo o percentual normalizados de todos os ésteresmetílicos do ácido graxo identificado.
A Figura 5 fornece dados mostrando que QTL6 de óleo eLeafy Cotyledon 1 (LECl) possuem efeitos aditivos sobre oóleo. Cotilédone Folhoso de Milho 1 (LECl), um ativadortranscricional contendo domínio-B, mostrou aumentar o óleodo embrião. Uma linha ASKC28IBlxEF09B BC2S2 homozigóticapara QTL6 foi cruzada com plantas homozigóticas contendo otransgene LECl de milho. 0 óleo de embrião e de sementedas sementes Fl resultantes foram analisados por NMR. Osdados indicam que QTL6 r LECl possuem efeitos aditivossobre as concentrações de óleo do embrião assim como sobreas concentrações de óleo da semente.
A Figura 6 fornece um mapeamento esquemático da regiãode QTL6, incluindo os cinco quadros de leitura abertos(Open Reading Frames (ORFs)). Conforme descrito na Figura2, um QTL de óleo/ácido oléico importante foi finalmentemapeado para uma pequena região no cromossomo 6 localizadaentre os marcadores SNP BACl 8 e BAC29. Três BACssoprepostos cobrindo a região de QTL6 da linha de milhoconsaguinea Mo 17 foram sequenciados. A inserção genômicatotal nestes três clones é aproximadamente de 280 kb. QTL6pode ser também mapeado para uma região de 195 kb quecontém cinco quadros de leitura abertos (ORFs) dividindosignificante homologia com genes conhecidos. Os cinco ORFse marcadores polimórficos ligados intimamente são marcados.Devido à natureza repetitiva do genoma de milho, algunspequenos espaços e a orientação de alguns fragmentos devemser determinados. Dois dos ORFs (proteína ribossomal 4OS epermease de aminoácido) estão localizados dentro de umespaço de 18 kb. O ORF transportador de ABC está localizadona extremidade da região sequenciada, e apenas metade daextremidade 5' deste ORF grande (mais de 1500 AA) para otransportador de ABC está localizada nestes três BACs.
A Figura 7 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL 6 BAC05 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador BACO5-ASK (Id. de Seq. n° : 1)está alinhado com a seqüência correspondente de BAC05-EF09B(Id. de Seq. n°: 2). 0 alinhamento também fornece oiniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 68) e o inicidorreverso (Id. de Seq. n°: 69) que podem ser usados paraamplificar este marcador.
A Figura 8 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6 BAC05 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador BACl7-ASK (Id. de Seq. n° : 3)está alinhado com a seqüência correspondente de BAC17-EF09B(Id. de Seq. n°: 4). O alinhamento também fornece oiniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 70) e o inicidorreverso (Id. de Seq. n° : 71) que podem ser usados paraamplificar este marcador.
A Figura 9 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL 6 BAC05 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol8 que cobrem aregião de QTL6. O marcador BAC18-ASK (Id. de Seq. n° : 5)está alinhado com a seqüência correspondente de BAC18-EF09B(Id. de Seq. n°: 6). O alinhamento também fornece oiniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 72) e o inicidorreverso (Id. de Seq. n° : 73) que podem ser usados paraamplificar este marcador.
A Figura 10 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL 6 BAC20 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador BAC2O-ASK (Id. de Seq. n° : 7)está alinhado com a seqüência correspondente de BAC17-EF09B(Id. de Seq. n°: 8). O alinhamento também fornece oiniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 74) e o inicidorreverso (Id. de Seq. n° : 75) que podem ser usados paraamplificar este marcador.
A Figura 11 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6 BAC22 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador BAC22 -ASK (Id. de Seq. n° : 9)está alinhado com a seqüência correspondente de BAC22-EF09B(Id. de Seq. n°: 10). O alinhamento também fornece oiniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 76) e o inicidorreverso (Id. de Seq. n° : 77) que podem ser usados paraamplificar este marcador.
A Figura 12 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL 6 BAC24 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador BAC24-ASK (Id. de Seq. n° : 11)está alinhado com a seqüência correspondente de BAC24-EF09B(Id. de Seq. n° : 12) . O alinhamento também fornece oiniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 78) e o inicidorreverso (Id. de Seq. n° : 79) que podem ser usados paraamplificar este marcador.
A Figura 13 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6 BAC29 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador BAC29-ASK (Id. de Seq. n° : 13)está alinhado com a seqüência correspondente de BAC29-EF09B(Id. de Seq. n°: 14). O alinhamento também fornece oiniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 80) e o inicidorreverso (Id. de Seq. n° : 81) que podem ser usados paraamplificar este marcador.
A Figura 14 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6 BAC32 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador BAC32-ASK (Id. de Seq. n° : 15)está alinhado com a seqüência correspondente de BAC32-EF09B(Id. de Seq. n°: 16). O alinhamento também fornece oiniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 82) e o inicidorreverso (Id. de Seq. n° : 83) que podem ser usados paraamplificar este marcador.
A Figura 15 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6SNP7 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6SNP7-ASK (Id. de Seq. n°:17) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6SNP7-EF09B (Id. de Seq. n° : 18). O alinhamento tambémfornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 84) e oinicidor reverso (Id. de Seq. n° : 85) que podem ser usadospara amplificar este marcador.
A Figura 16 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6SNP8 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6SNP8-ASK (Id. de Seq. n°:19) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6SNP8-EF0 9B (Id. de Seq. n° : 20). 0 alinhamento tambémfornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 86) e oinicidor reverso (Id. de Seq. n° : 87) que podem ser usadospara amplificar este marcador.
A Figura 17 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6SNP9 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6SNP9-ASK (Id. de Seq. n° :21) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6SNP9-EF09B (Id. de Seq. n° : 22). O alinhamento tambémfornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 88) e oinicidor reverso (Id. de Seq. n°: 89) que podem ser usadospara amplificar este marcador.
A Figura 18 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6SNP13 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6SNP13-ASK (Id. de Seq. n° :23) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6SNP13-EF09B (Id. de Seq. n° : 24). O alinhamento tambémfornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 90) e oinicidor reverso (Id. de Seq. n° : 91) que podem ser usadospara amplificar este marcador.
A Figura 19 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6SNP14 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6SNP14-ASK (Id. de Seq. n° :25) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6SNP14-EF09B (Id. de Seq. n° : 26). O alinhamento tambémfornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 92) e oinicidor reverso (Id. de Seq. n° : 93) que podem ser usadospara amplificar este marcador.
A Figura 20 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6SNP15 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6SNP15-ASK (Id. de Seq. n° :27) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6SNP15-EF09B (Id. de Seq. n° : 28). O alinhamento tambémfornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 94) e oinicidor reverso (Id. de Seq. n° : 95) que podem ser usadospara amplificar este marcador.
A Figura 21 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6SNP16 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6SNP16-ASK (Id. de Seq. n° :29) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6SNP16-EF09B (Id. de Seq. n° : 30). O alinhamento tambémfornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 96) e oinicidor reverso (Id. de Seq. n° : 97) que podem ser usadospara amplificar este marcador.
A Figura 22 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6SNP17 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6SNP17-ASK (Id. de Seq. n° :31) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6SNP17-EF09B (Id. de Seq. n° : 32). O alinhamento tambémfornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 98) e oinicidor reverso (Id. de Seq. n° : 99) que podem ser usadospara amplificar este marcador.
A Figura 23 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6MZA5002 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6MZA5002-ASK (Id. de Seq. n° :33) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6MZA5002-EFO9B (Id. de Seq. n° : 34). O alinhamentotambém fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 100)e o iniciador reverso (Id. de Seq. n° : 101) que pode serusado para amplificar este marcador.
A Figura 24 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6MZA13321 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6MZA13321-ASK (Id. de Seq.η°: 35) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6MZA13321 -EFO9B (Id. de Seq. n° : 36). O alinhamentotambém fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 102)e o iniciador reverso (Id. de Seq. n° : 103) que pode serusado para amplificar este marcador.
A Figura 25 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6MZA15785 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6MZA15785-ASK (Id. de Seq.n° : 37) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6MZA15785- EF09B (Id. de Seq. n° : 38). O alinhamentotambém fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 104)e o iniciador reverso (Id. de Seq. n° : 105) que pode serusado para amplificar este marcador.
A Figura 26 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6MZA13118 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6MZA13118-ASK (Id. de Seq.n° : 39) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6MZA13118-EFO9B (Id. de Seq. n° : 40). O alinhamentotambém fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 106)e o iniciador reverso (Id. de Seq. n° : 107) que pode serusado para amplificar este marcador.
A Figura 27 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6MZA11771 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6MZA11771-ASK (Id. de Seq.n° : 41) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6MZA11771-EF09B (Id. de Seq. n° : 42). O alinhamentotambém fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 108)e o iniciador reverso (Id. de Seq. n° : 109) que pode serusado para amplificar este marcador.
A Figura 28 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6MZA93 51 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6MZA9351-ASK (Id. de Seq. n° :43) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6MZA9351 -EFO9B (Id. de Seq. n° : 44). O alinhamentotambém fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n° : 110)e o iniciador reverso (Id. de Seq. n° : 111) que pode serusado para amplificar este marcador.
A Figura 29 fornece um alinhamento do marcadormolecular QTL6MZA8135 desenvolvido das seqüências deextremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem aregião de QTL6. O marcador QTL6MZA8135-ASK (Id. de Seq. n° :45) está alinhado com a seqüência correspondente deQTL6MZA8135-EF09B (Id. de Seq. n° : 46). O alinhamentotambém fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 112)e o iniciador reverso (Id. de Seq. n° : 113) que pode serusado para amplificar este marcador.
A Figura 3 0 fornece um alinhamento da proteínaZmDGATl-2 (ASK) (Id. de Seq. n° : 48) com a proteína ZmDGATl-2 das linhas consaguíneas de milho com teor de óleo normal(quando comparado ao amarelo #2) EF09B (Id. de Seq. n° :52), Mol7 (Id. de Seq. n° : 50) e B73 (Id. de Seq. n° : 54).A deleção de glutamina dentro da proteína ZmDGATl-2(ASK)está descrita como ocorrendo na posição correspondente aGln67 da proteína ZmDGATl-2 com teor de óleo normal, emboraa deleção possa ocorrer na posição correspondente a Gln64,Gln65, Gln66 ou Gln67 da proteína ZmDGATl-2 com teor normalde óleo. Também, a inserção de fenilalanina dentro daproteína ZmDGAT 1-2(ASK) está descrita como correspondentea uma inserção de fenilalanina entre Phe469 e Ser470 daproteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo. Entretanto estainserção poderá corresponder a uma inserção de fenilalaninaentre Trp467 e Phe468 da proteína ZmDGATl-2 com teor normalde óleo, ou uma inserção de fenilalanina entre Phe469 eSer470 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo.
A Figura 31 fornece um alinhamento da seqüênciacodificadora para a proteína ZmDGATl-2(ASK) (Id. de Seq.n° : 47) com a seqüência codifcadora para a proteínaZmDGATl-2 das linhas consaguíneas de milho com teor de óleonormal EF09B (Id. de Seq. n° : 51), Mo 17 (Id. de Seq. n° :49) e B73 (Id. de Seq. n° : 53). Note que neste alinhamento,a mudança polimórfica (deleção de um códon CAG dentro daseqüência codificadora para ZmDGAT 1-2(ASK) exposta em Id.de Seq. n° : 47) que resulta em uma deleção de um resíduo deglutamina dentro da proteína ZmDGAT 1-2(ASK) está descritacomo ocorrendo dentro do codon para o resíduo de glutaminacorrespondente à posição 67 da proteína ZmDGATl-2 com teornormal de óleo. Entretanto, dado o estiramento dos quatroresíduos de glutamina repetidos dentro da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo, a mudança polimórfica (deleçãode um códon CAG) poderá ocorrer dentro do códon para oresíduo de glutamina correspondente à posição 64 daproteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (isto é,representado pela deleção de nucleotídeos (nt) 190-192 daseqüência codificadora para a proteína ZmDGATl-2 com teornormal de óleo exposta em Id. de Seq. n° : 51, 49 ou 53),posição 65 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo(isto é, representada pela deleção de nt 193-195 de Id. deSeq. n° : 51, 49 ou 53), posição 66 da proteína ZmDGATl-2com teor normal de óleo (isto é, representada pela deleçãode nt 196-198 de Id. de Seq. n° : 51, 49 ou 53), ou posição67 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (isto é,representada pela deleção de nt 199-201 de Id. de Seq. n° :51, 4 9 ou 53 conforme aqui mostrado).
Também, neste alinhamento, a mudança polimórfica(inserção de um códon TTC dentro da seqüência codificadorapara ZmDGATl-2 (ASK) exposta em Id. de Seq. n° : 47) queresulta em uma inserção do resíduo de fenilalanina dentroda proteína ZmDGATl-2(ASK) está descrita como ocorrendoentre o códon para o resíduo de fenilalanina correspondendoà posição 469 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleoe o códon para o resíduo de serina correspondendo à posição470 da proteína ZmDGATl-2 com teor de óleo normal.Entretanto, dado o estiramento de três resíduos defenilalanina repetidos dentro da proteína ZmDGATl-2(ASK) , amudança polimórfica (inserção de um códon TTC) poderáocorrer entre o último nucleotídeo do códon para o resíduode triptofano correspondente à posição 467 e o primeironucleotídeo do códon para o resíduo de fenilalaninacorrespondente à posição 468 da proteína ZmDGATl-2 com teornormal de óleo (isto é, entre os nucleotídeos (nt) 1401 e1402 da seqüência codificadora para a proteína ZmDGATl-2com teor de óleo normal exposta em Id. de Seq. n° : 51, 49ou 53), entre o último nucleotídeo do códon para o resíduode fenilalanina correspondendo à posição 468 e o primeironucleotídeo do códon para o resíduo de fenilalaninacorrespondendo à posição 469 da proteína ZmDGATl-2 com teorde óleo normal (isto é, entre nt 14 04 e 14 05 de Id. de Seq.n° : 51, 49 ou 53), ou entre o último nucleotídeo do códonpara o resíduo de fenilalanina correspondendo à 469 e oprimeiro nucleotídeo do códon para o resíduo de serinacorrespondendo à posição 470 da proteína ZmDGATl-2 com teornormal de óelo (isto é, entre nt 14 07 e 14 08 de Id. de Seq.n°: 51, 49 ou 53, conforme aqui mostrado).
A Figura 32 mostra os resultados da análisefilogenética de DGATs e seqüências relacionadas. A análisefilogenética foi executada usando-se o programa PHYLIP (J.Felsenstein, University of Washington) e exposta usando-seo programa TreeView (Página (1996) Computer Appl. Biosci.12:357-358). Números de acesso são fornecidos paraseqüência pública. As seqüências proprietárias sãoindicadas por nomes de clone de EST ou por nomes de geneUnicorn (PCOs).
A Figura 33 mostra o alinhamento da seqüência deaminoácido de DGAts e aciltransferases relacionadas. 0programa Vector NTI é usado para alinhamentos múltiplos commétodo CLUSTALW (Higgins e outros (1994) Nucleic Acids Res.22:4673-4680). Caixas maiores (numeradas 1, 2, 3, 4, 5, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17) indicam domínios deseqüência conservados em todos os DGATl da planta. As duascaixas menores (numeradas como 6 e 18) indicam domínios deseqüência únicos para todos os membros do subgrupo DGATl-2.
A Figura 34 fornece um alinhamento da proteína ZmAAPlcom outras proteínas conhecidas.
A Figura 3 5 fornece um alinhamento da proteína ZmPESPcom outras proteínas conhecidas.
A Figura 3 6 fornece um alinhamento da proteína ZmS24com outras proteínas conhecidas.
A Figura 37 fornece um alinhamento da proteína ZmABCTcom outras proteínas conhecidas.
A Figura 38 fornece um alinhamento de seqüência devários elementos da família do ativador transcricionalHAP3. O alinhamento fornece uma seqüência de consenso etambém descreve os domínios A, B e C.
A Figura 3 9 fornece um alinhamento de seqüência devários domínios B tipo LEC-I (levemente sombreado) edomínios B tipo não-LEC-1.
A Figura 40 ilustra o mapeamento final de QTL6. O QTL6com alto teor de óelo/alto teor de ácido oléico foipreviamente mapeado para uma região de aproximadamente 195kb, contendo cinco genes. Para mapear QTL6 também, oitonovos marcadores SNP (QTL6SNP7, 8, 9, 13, 14, 15, 16 e 17)dentro desta região foram desenvolvidos com base nasseqüências BAC Mol7 (nem todos os marcadores sãomostrados). Aproximadamente 4.000 sementes BC5S1 separadaspor QTL6 foram plantas em pequenos potes e foramdesenvolvidas em uma estufa. As mudas foram genotipadaspor marcadores BAC17 e BAC32 para identificação derecombinantes entre DGATl-2 e os genes transportadores ABCtipo PDR. Um total de 90 plantas recombinantes foramindentifiçados e foram depois genotipadas pelos novosmarcadores SNP para identificar a localização precisa dehibridizações. As plantas recombinantes foram transferidaspara potes regulares e foram auto-polinizadas para produzirsementes BC5S2. Os dados de óleo e ácido oléico foramobtidos de 14 arelha recombinantes críticas conformedescrito nos exemplos aqui abaixo.A Figura 41 mostra a concentração de óleo no embrião(A), concentração de óleo na semenete (B), concentração deácido oléico (C) e concentração de ácido linoleico (D) parapés de milho transgênicos para o alelo ASKC28IM ou EF09B deDGATl-2. As sementes Tl separadas foram classificadas comotransgênicas ou cernes nulos usando-se fluorescênciavermellha como um marcador. Métodos para análise de óleo edefinição de perfil de ácido graxo são conforme descritonos exemplos aqui abaixo. O % de mudança refere-se àdiferença entre as sementes positivas para fluorescência esementes negativas para fluorescência em linhastransgênicas ou sementes ASKC2IB1 homozigóticas contrasementes homozigóticas EF09B em BC4S2 NILs. Os dadostransgênicos representam médias de 10 eventos, 10transgênicas e 10 sementes nulas analisadas por evento. Osdados de BC4S2 representam as médias de 5 ASKC28IB1homozigóticas e 5 EF09B NILs homozigóticas, 10 sementes porlinha analisada.
A Figura 4 2 mostra os resultados de um ensaio deatividade de DGAT (A) e acúmulo de TAG em células delevedura (B). ASK, o alelo original de DGATl-2 cDNA isoladode ASKC2 8IB1 pai (ZmDGATl-2 (ASK) de Id. de Seq. n°:47).EFO9B, o alelo original de DGATl-2 cDNA isolado de EFO9Bpai (ZmDGATl-2 (EF09B) de Id. de Seq. n°:51). O ASK-F, oalelo ASKC28IB1 (Id. de Seq. n° : 47) com o códom para oresíduo F469 do polipeptídeo codificado (ZmDGATl-2(ASK) deId. de Seq. n°:48) deletado. EF09B+F, o alelo EF09B (Id. deSeq. n° : 51) com uma insenção de um códon TTC entre o códonpara F4 6 9 e o códon para S4 7 0 de Id. de Seq. n° : 52 para restaurar o resíduo de fenilalanina correspondente àinserção F4 69 em ZmDGAT 1-2 (ASK) de Id. de Seq. n°:48. Osmétodos para ensaio de DGAT e a medição da quantidade deTAG são conforme aqui descrito no exemplo aqui abaixo. Osdados da atividade de DGAT são as médias de quatrorepetoições. Os dados de TAG são as médias de trêsrepetições.
A Figura 4 3 mostra a distribuição de alelos DAGTl-2 emconsanguíneos de milho selecionados. Os conteúdos de óleodo embrião e do ácido oléico para 73 consanguíneosselecionados foram determinados conforme descrito. 0 DNAfoi extraído de discos de folha usando-se mudas deaproximadamente 3 semanas de vida. Os iniciadores DGATl-2(Id. de Seq. noS: 124/125 e 126/127) foram usados paraamplificar por PCR os fragmentos que abrangem as trêsmudanças de aminoácido na região de terminação-N de DGATl-2 (ASK) (isto é, V4 5G; P55S; e as deleções de Q64, Q65, Q66ou Q67) ou a inserção de fenilalanina na posição 467, 468ou 469 na terminação-C de DGATl-2 (ASK) . Os fragmentos dePCR foram sequenciados para determinação dos alelos.
A Figura 44 demonstra que QTL6 (DGAT 1-2) e FAD2 sãoaditivos no aumento do conteúdo de ácido oléico. QTL6+/+,alelo ASKC28IB1 homozigótico; QTL6-/-, alelo EF09Bhomozigótico; FAD2 +/+, alelo favorável homozigótico; FAD2-, alelo não favorável homozigótico. A concentração deácido oléico foi determinada usando-se extração com hexanoe GC conforme descrito nos exemplos aqui abaixo. 0 resíduode semente restante da extração com hexano foi usado paraisolamento de DNA com Qiagen1S DNeasy Plant Mini Kit (Cat.No. 69104) . Os alelos DGAT 1-2 e FAD2 foram determinadospor amplificação por PCR gene específica e análise demarcador CAP.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção será agora descrita maiscompletamente aqui após com referência aos exemplos emanexo, que estão mostrados em algumas mas não em todas asmodalidades da invenção. Realmente, esta invenção pode serincorporada em muitas diferentes formas e não deve serinterpretada como limitada às modalidades expostas aqui, emvez disso, estas modalidades são fornecidas de forma queesta divulgação satisfaça as exigências legaus aplicáveis.Números parecidos referem-se a elementos semelhantes portoda a divulgação.
Muitas modificações e outras modalidades da invençãoexpostas aqui virão à mente daqueles habilitados na técnicaà qual esta invenção pertence possuindo o benefício dosensinamentos apresentados nas descrições supracitadas.Portanto, deve-se compreender que a invenção não estálimitada às modalidades específicas divulgadas e quemodificações e outras modalidades são objetivadas paraestarem inclusas dentro do escopo das reivindicações emanexo. Embora termos específicos sejam aqui empregados,eles são usados em um sentido genérico e descritivo apenase não para propósitos de limitação.
Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para sereferirem a um ou a mais de um (isto é, a pelo menos um) doobjeto gramatical do artigo. Por meio de exemplo, "umelemento" significa um elemento ou a mais de um elemento.
I. Visão Geral
Um nlocus de traço quantitativo" ou "QTL" refere-se auma localização geneticamente definida para uma coleção deum ou mais genes (alelos) que contribuem para umacaracterística observada. A presente invenção desenvolveulinhas isogênicas próximas para QTL6, que é um QTL de óleonotável, e demonstrou que o QTL 6 é um QTL principal nocontrole das concentrações de óleo do embrião econcentrações de ácido oléico, e portanto a relação entreácido oléico e ácido linoleico. Vários métodos ecomposições para a reprodução e manipulação de QTL6 sãofornecidos. As composições compreendem novos Iocimarcadores que se separam do QTL6, e métodos de empregodestes marcadores nos programas de reprodução de milhoassitidos por marcador para identificar os pés de milho eos germeplasmas que possuem conteúdo de óleo aumentado, umconteúdo de ácido oléico aumentado, ou uma relação entreácido oléico e ácido linoleico aumentada são fornecidos. Apresente invenção também mapeia QTL6 a uma região deaproximadamente 195 kb que compreende múltiplos quadros deleitura abertos, que são caracterizados em maiores detalhesabaixo. Os polinucleotídeos e polipeptídeos associados comQTL6 podem ser usados em vários métodos para aumentar oconteúdo de óleo e/ou o conteúdo de ácido oleico em umaplanta de interesse, e/ou para aumentar o conteúdo de ácidooléico em relação ao conteúdo de ácido linoléico, eportanto fornecer uma relação entre ácido oléico e ácidolinoléico maior. De interesse particupar à presenteinvenção são os novos Ioci marcadores que são associadoscom um alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléicoe/ou alta relação de fenótipo entre ácido oléico e ácidolinoléico, e que segregam geneticamente a região de QTL6que é flanqueada por uma primeira seqüência de borda quecompreende os nucleotídeos 1-10 de Id. de Seq. n°:2, aquireferida como "borda de BACO5", e uma segunda seqüência deborda que compreende os nucleotídeos 477-496 de Id. de Seq.n° : 46 aqui referida como "borda de MZA8135". Também deinteresse à presente invenção são os novos Ioci marcadoresmapeados dentro uma região também definida dentro destaregião de QTL6, onde a região também definida compreendeuma primeira seqüência de borda que compreende osnucleotídeos 1-20 de Id. de Seq. n°:6 (referida como "bordaesquerda de QTL6 de BACl8" ; ver Figura 6) e uma segundaseqüência de borda que compreende os nucleotídeos 482-501de Id. de Seq. n° : 14 (referida como "borda direita de QTL6de BAC29"; ver Figura 6). Também de interesse à presenteinvenção é um novo lócus marcador mapeado dentro de umasegunda região também definida dentro desta região de QTL6,onde a segunda região também definida compreende umaprimeira seqüência de borda que compreende nucleotídeos 1-de Id. de Seq. n° : 10 (referida como "borda esquerda deQTL6 de BAC22" ; ver Figura 11) e uma segunda seqüência deborda que compreende os nucleotídeos 488-507 de Id. de Seq.n°: 4 (referida como "borda direita de QTL6 de BACl7).
Consequentemente, a presente invenção fornece novastécnicas de reprodução, plantas e partes de planta, juntocom nocos polinucleotídeos e polipetídeos, cada um dosquais pode ser empregado para aumentar o conteúdo de óleo,aumentar o conteúdo de ácido oléico, e/ou aumentar arelação entre ácido oléico e ácido linoléico em uma palntaou parte de planta. Conforme aqui usado, a expressão"conteúdo de óleo crescente" inclui qualquer aumento nonível de óleo na planta ou parte desta planta, por exemplo,na semente ou cerne e/ou no embrião ou germe, ou qualquercombinação destes. Em modalidades específicas, o aumento emóleo ocorre no germe e/ou no cerne. Por exemplo, o conteúdode óleo aumentado pode compreender um aumento total noconteúdo de óleo na planta ou parte desta planta de cercade 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,80%, 90%, 100%, 120% ou mais quando comparado a uma plantaou parte desta planta de controle. Alternativamente, onível aumentado de óleo pode incluir cerca de 0,5 vez, 1vez, 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes, 32 vezes ou maisde aumento total no nível de óleo na planta ou parte destaplanta quando comparado a um controle de planta ou partedesta planta.
Os níveis dos vários constituintes no óleo podemtambém ser modulados usando-se os vários métodos ecomposições da invenção. Por exemplo, a expressão "conteúdode ácido oléico crescente" inclui qualquer aumento no nívelde ácido oléico ou qualquer alteração na relação entreácido oléico e outros constituintes de óleo em uma plantaou parte desta planta, por exemplo, a semente ou cerne e/ouo embrião ou gerne, ou qualquer combinação destes. Porexemplo, o conteúdo de ácido oléico crescente podecompreender um aumento no nível de ácido oléico total decerca de 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80%, 90%, 100%, 120% ou mais quando comparado a umaplanta ou parte desta planta de controle. Alternativamente,o nível aumentado de ácido oléico pode incluir cerca de 0,5vez, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes, 32 vezesou mais de aumento no nível de ácido oléico na planta ouparte desta planta quando comparado a um controle de plantaou parte desta planta.
A ligação simples delta-12 de ácido oléico (C18:l)pode ser convertida em uma ligação dupla conjugada,produzidno assim ácido linoléico (C18:). Portanto, umconteúdo de ácido oléico crescente pode também modular arelação entre ácido oléico e ácido linoléico em uma plantaou parte desta planta. Desta maneira, os métodos ecomposições da presente invenção podem ser usados paraaumentar a relação entre ácido oléico e ácido linoléico emuma planta ou parte desta planta. Por exemplo, a expressão"relação entre ácido oléico e ácido linoléico crescente"inclui qualquer aumento na relação entre ácido oléico eácido linoléico em uma planta ou parte desta planta, porexemplo, a semente ou cerne e/ou o embrião ou gerne, ouqualquer combinação destes. Assim, por exemplo, relaçãoentre ácido oléico e ácido linoléico em uma planta ou partedesta planta pode ser aumentada em cerca de 0,1%, 0,5%, 1%,5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%ou mais quando comparada a uma planta ou parte desta plantade controle. Alternativamente, relação aumentada entreácido oléico e ácido linoléico pode incluir cerca de 0,5vez, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes, 32 vezesou mais de aumento relação entre ácido oléico e ácidolinoléico na planta ou parte desta planta quando comparadoa um controle de planta ou parte desta planta. Métodos deanálise para os níveis de ácido oléico e o ácido linoléicosão conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a Publicaçãodo Pedido de Patente U. S. de número 20050160494, aquiincorporada por raferência integralmente. Usando-se osmétodos e composições aqui divulgados, a produção total deóleo pode ser aumentada e/ou as características do óleopodem ser modificadas.
O óleo e/ou os constituintes do óleo, tal como ácidooléico e ácido linoleico, podem ser medidos por qualquermétodo conhecido na técnica. A fim de se fazer umadeterminação da quantidade de óleo nas sementes e/ou aquantidade de ácidos graxos específicos presentes no óleo esuas respectivas concentrações, sementes maduras podem sertrituradas (por exemplo, em uma prensa hidráulica) , e oóleo endógeno pode ser facilmente extraído com hexano oupor quaisquer outras técnicas adequadas de acordo com osprocedimentos conhecidos na técnica. Similarmente, qualquertecido de planta pode ser triturado ou mopido e entãoextraído com hexano para recuperar o óleo.
O hexano pode ser separado do óleo por evaporação, e aquantidade de óleo restante foi determinada. Os ácidosgraxos podem ser determinados seguindo-se a transmetilação.Os ésteres metílicos resultantes dos ácidos graxos podemser separados e suas concentrações determinadas pelo uso decromatografia a gás capilar de açodo com os procedimentosoperacionais padrões conhecidos na técnica. Além disso, aquantificação do conteúdo de óleo das sementes pode serexecutada com métodos convencionais, tais como análise porinfravermelho (MR) , imagem por ressonância magnéticanuclear (NMR), extração com extrator Soxhlet, extraçãoacelerada com solvente (ASE), extração com microondas, eextração com fluido super crítica. A espectroscopia porinfravermelho próximo (NIR) tornou-se um método padrão paraselecionar amostras de semente sempre que a amostra deinteresse for receptiva a esta técnica. As amostrasestudadas incluem trigo, milho, soja, canola, arroz,alfafa, aveia e outros. Métodos de medição do óleo econstituintes de óleo em cernes de milho, germe dissecado eendosperma são divulgados, por exemplo, em WO 2005/003312 eWO 02/062129, aqui incorporados por referênciaintegralmente.
II. Caracterização de QTL6
(A) Lócus marcador para QTL6
Composições compreendendo marcadores para o lócus QTL6são fornecidas. Conforme aqui usado, um "marcador genético"é qualquer diferença fenotípica morfológica, bioquímica oubaseada em ácido que revela um polimorfismo de DNA.Exemplos de marcadores genéticos incluem, mas não estãolimitados a RFLPs (polimorfismos de comprimento defragmento por restrição), RAPDs (DNA polimórficoamplificado aleatoriamente), polimorfismos de nucleotídeoúnico (SNPs), alozimas, SSRs (repetições de seqüênciaúnica) e AFLPs (polimorfismos de comprimento de fragmentopor amplificação). 0 termo nIocus marcador" refere-se a umalocalização geneticamente definida de um polimorfismo deDNA. Tais Ioci marcadores podem ser usados como um ponto dereferência quando se identificam geneticamente os Iocimarcadores.
Um "mapa genético" é uma descrição das relações deligação genética entre os Ioci em um ou mais cromossomos(ou grupos de ligação) dentro de uma dada espécie,geralmente descrita de uma forma diagramática ou em tabela.
O "mapeamento" é o processo de definição das relações deligação dos Ioci através do uso de marcadores genéticos,população que segrega os marcadores, e princípios genéticospadrões de freqüência de recombinação. Uma "localização nomapa" é uma localização determinada em um mapa genéticorelativa aos marcadores genéticos ligados onde um marcadorespecifico pode ser encontrado dentro de uma dada espécie.
Os métodos e composições da invenção requerem detecçãode pelo menos um polimorfismo ou qualquer combinação dospolimorfismos dentro de um lócus marcador favorável aquidivulgado. O termo nIocus marcador favorável" refere-se aum lócus marcador que se segrega geneticamente com a regiãode QTL6 aqui divulgada e que está associada com o traçofenotípico da planta desejável de alto conteúdo de óleoe/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação entre ácidooléico e ácido linoléico aumentada dentro da planta ou umaou mais partes de planta desta. Exemplos não limitantesdas seqüências correspondentes a estes Ioci marcadoresfavoráveis são fornecidos em Id. de Seq. noS:2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menos um polimorfismo contidoneste. Exemplos de polimosfismos específicos dentro de cadalócus marcador favorável da região de QTL6 sãoidentificados na Tabela 2 (Ioci marcadores nãocodificadores) e Tabela 3 (lócus marcador compreendendo aseqüência codificadora) nos Exemplos 2 e 4 aqui abaixo.Exemplos não limitantes de seqüências para Ioci marcadoresfavoráveis da invenção são expostos em Id. de Seq. n°s: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 45 e 47 e o(s) respectivo (s)polimorfismo(s) que ocorre(m) dentro destes loci marcadoresfavoráveis são mostrados nas Tabelas 2 e 3 aqui abaixo.Veja também os alinhamentos mostrados nas Figuras 7-29 e31.
Conforme aqui usados, um "alelo de um lócus marcador"é um de uma pluralidade de seqüências de nucleotídeopolimórficas em um lócus marcador. Para os propósitos dapresente invenção, um "alelo de um lócus marcador favorávelda invenção" compreende pelo menos uma das mudançaspolimórficas encontradas no lócus marcador favorável.Conseqüentemente, um alelo do lócus marcador favorável podeter pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maisnucleotídeos polimórficos encontrados no lócus marcadorfavorável aqui divulgado. Assim, um alelo de um lócusmarcador pode ter pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência ao lócusmarcador favorável aqui divulgado.
No contexto da presente invenção, um lócus marcadorpode estar associado com um outro lócus marcador, com algumoutro lócus genético (por exemplo, um lócus de alto teor deóleo e/ou um lócus de alto teor de ácido oléico, tal comoQTL6) e/ou com um traço (isto é, alto conteúdo de óleo,alto conteúdo de ácido oléico, e/ou alta relação entreácido oléico e ácido linoléico). Por "associado com "pretende-se dizer que o lócus marcador e o segundo lócusmarcador ou o lócus marcador e o lócus genético estão nomesmo grupo de ligação e estão em desequilíbrio de ligaçãoentre si. "Desequilíbrio de ligação" é definido como asegregação não aleatória de alelos em dois ou mais Ioci. 0desequilíbrio de ligação portanto descreve uma situação emque a combinação de alelos ou marcadores genéticos ocorremais freqüentemente em uma população do que seria esperadoa partir de uma formação aleatória de haplótipos de alelosbasaeados em suas freqüências. 0 termo "geneticamenteligado" refere-se aos Ioci genéticos que estão emdesequilíbrio de ligação e foram estatisticamentedeterminados para não serem classificadosindependentemente. Os Ioci geneticamente ligados reúnemmais de 50% do tempo.
Conforme aqui usado, um marcador que é geneticamenteligado a um outro marcador do lócus genético estará nomesmo grupo de ligação e tipicamente dentro de 10centimorgans (cM) entre si. Por exemplo, um lócus marcadorda presente invenção está associado com o traço de altoconteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ourelação aumentada entre ácido oléico e ácido linoleico se omarcador e a seqüência que confere o traço fenotípico dealto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléicoe/ou relação aumentada entre ácido oléico e ácido linoleiconão estão mais de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,7 5 cM, 0,5 cM, 0,2 5 cM afastadas nomesmo grupo de ligação. Isto é, os dois elementos genéticosassociados passam por recombinação durante a meiose entresi a uma freqüência de menos de ou igual a cerca de 10%,9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% oumenos. Espera-se que cada um dos marcadores identificadosesteja em proximidade física ou genética (resultanto naligação física e/ou genética) em relação a um elementogenético (QTL6) que contribui para um conteúdo de óleoaumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ourelação entre ácido oléico e ácido linoléico aumentada.
Conforme aqui usado, o termo "intimamente ligado"significa que a recombinação entre dois lóci ligados ocorrecom uma frequencia de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%,3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos. Em outraspalavras, os Ioci intimamente ligados co-segregam pelomenos 90% do tempo. Assim, os Ioci marcadores intimamenteligados da invenção, são suficientemente próximos ao traçoque confere conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo deácido oléico aumentado e/ou relação aumentada entre o ácidooléico/ácido linoléico de forma que eles podem ser usadoscomo um instrumento de previsão para o próprio traço.
Em uma modalidade, o lócus marcador favorávelgeneticamente ligado ao QTL6 compreende o polinucleotídeoexposto em qualquer uma das Id. de Seq. noS: 1, 3, 5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37,39, 41, 43 e 45. Os Ioci marcadores favoráveis expostos emId. de Seq. noS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45, que estãoassociados com o traço fenotípico de alto conteúdo de óleoe/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentadaentre o ácido oléico e ácido linoléico, estão alinhados nasFiguras 7-29 com a seqüência para o lócus marcadorcorrespondente para a linha consanguínea de milho EF09B(teor normal de óleo). A presente invenção também fornecealelos de lócus marcador geneticamente ligado a QTL6.
Em outras modalidades, o lócus marcador favorável é umácido nucleico expressado que está associado com o traçofenotípico de alto conteúdo de óleo desejável e/ou o altoconteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre oácido oléico/ácido linoléico. Em ainda outras modalidades,o lócus marcador favorável está dentro do polinucleotídeocodificado DGTA, por exemplo, dentro do polinucleotídeocodificando DGATl-2. Por exemplo, o lócus marcadorfavorável pode compreender um polimorfismo nopolinucleotídeo codificando ZmDGATl-2 (por exemplo, aseqüência codificadora exposta em Id. de Seq. n°:51) onde amudança polimórfica à seqüência codificadora de ZmDGATl-2resulta em uma substituição do resíduo de glicina peloresíduo de serina na posição do aminoácido correspondenteao resíduo 45 de Id. de Seq. n°:52; uma substituição doresíduo de serina pelo resíduo de prolina na posição doaminoácido correspondente ao resíduo 55 de Id. de Seq.η°:52; uma deleção do resíduo de glutamina correspondenteàquela posição do aminoácido 64, 65, 66 ou 67 de Id. deSeq. n°:52; e/ou uma inserção de um resíduo de fenilalaninaem uma posição localizada entre um par de resíduos, onde opar de resíduos corresponde a um par de resíduos dentro deId. de Seq. n°:52 selecionado a partir do grupo consistindode: (a) o resíduo de triptofano na posição 467 doaminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de fenilalaninana posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, (b) oresíduo de fenilalanina na posição 4 68 do aminoácido de Id.de Seq. n° : 52 e o resíduo de fenilalanina na posição 469do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, e (c) o resíduo defenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq.n° : 52. Um exemplo não limitante de um lócus marcadorfavorável dentro de um polinucleotídeo codificando DGAT 1-2é uma seqüência compreendendo a seqüência exposta em Id. deSeq. n°:47, que codifica a proteína ZmDGATl-2(ASK) expostaem Id. de Seq. n°:48. As mudanças polimórficas específicaspara a seqüência codificadora para a proteína ZmDGATl-2(ASK) de Id. de Seq. n°:48 são exemplificados na Figura 31(ver também a descrição para esta figura fornecida aquiacima), e descrito na Tabela 3 aqui abaixo. Ver também oalinhamento da proteína ZmDGATl-2(ASK) com a proteínaZmDGATl-2 a partir de três linhas consanguíneas de milhocom teor de óleo normal (Figura 30) e a descrição para estafigura aqui fornecida acima.
Qualquer um habilitado na técnica irá avaliar que osIoci marcadores aqui fornecidos e discutidos são meramenteexemplares e que outros numerosos Ioci marcadores podem seridentificados com base na ligação genética e/ou proximidadefísica de um cromossomo aos Ioci marcadores aquifornecidos. Assim as composições e métodos da presenteinvenção aqui descritos não são objetivados para seremlimitados aos Ioci marcadores favoráveis compreendendo Id.de Seq. noS:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menosum polimorfismo contido neste, ou aos exemplos deseqüências para estes Ioci marcadores favoráveis conformeexposto em Id. de Seq. noS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, e47, mas também incluem marcadores adicionais ligados a ele.Adicionalmente, embora alelos favoráveis dos Iocimarcadores exemplares estejam aqui divulgados, seráfacilmente avaliado por aqueles habilitados na técnica, queos alelos favoráveis dos Ioci adicionais ligados aos Ioeimarcadores aqui descritos podem ser determinados semexperimentação indevida e empregados nas composições emétodos da presente invenção. Conseqüentemente, qualquerlóeus marcador ligado aos Ioei marcadores aqui descritos elocalizados em um segmento de cromossomo identificado pelosloci marcadores da invenção, pode também ser usado paraidentificar este segmento de cromossomo, e para definir ogenótipo de uma planta de interesse, ou para selecionar asformas alélilas favoráveis de um segmento de cromossomocorrelacionado com o traço fenotípico de alto conteúdo deóleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relaçãoaumentada entre o ácido oléico e o ácido linoléico.
Pelo menos um dos polimorf ismos presentes em um oumais loci marcadores favoráveis aqui divulgados pode serusado para identificar uma primeira planta de milho ou umprimeiro germeplasma de milho que possui um álto conteúdode óleo ou um conteúdo de ácido oléico aumentado ou umarelação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico, eportanto compreende o traço fenotípico de alto conteúdo deóleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou uma relaçãoaumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico. Destamaneira, a presente invenção fornece tal método deidentificação, compreendendo detectar no primeiro pé demilho ou no primeiro germeplasma de milho pelo menos umpolimorfismo dentro de um ou mais dos loci marcadoresfavoráveis que estão associados com o traço de conteúdo deóleo aumentado, conteúdo de ácido oléico aumentado e/ourelação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico.Nas modalidades específicas, os polimorfismos do marcadorde um ou mais lócus marcador podem ser empregados. Assim,aspectos da invenção usam uma coleção de diferentes Iocimarcadores. O número de loei marcadores em tal coleção irávariar e será, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15,20, 25 ou maior.
Vários métodos são conhecidos na técnica para detectaro lócus marcador favorável da presente invenção. A detecçãode pelo menos um polimorfismo do lócus marcador favorávelpode incluir, mas não está limitada à detecção de um oumais dos polimorfismo por polimorfismo de comprimento defragmentos de restrição (RFLP), extensão de base única,eletroforese, alinhamento de seqüência, hibridização deoligonucleotídeo alelo específico (ASO), RAPD, detecção deseqüências variáveis amplificadas do genoma de planta,detecção de repetições de seqüência simples (SSRs) , edetecção de polimorfismo de nucleotídeo simples (SNPs) ,etc. Ensaios de marcador incluem extensão de base únicaconforme divulgado na Patente U. S. de número 6.013.431 ediscriminação alélica onde a atividade da endonucleaselibera um corante repórter a partir de um marcador dehibridização conforme divulgado na Patente U. S. de número5.538.848, cujas divulgações estão aqui incorporadas porreferência.
Iniciadores de amplificação para amplificar os Iocimarcadores favoráveis e marcadores adequados para detectaros loci marcadores favoráveis são fornecidos. As Figuras7-29 e Id. de Seq. noS: 68-115 fornecem iniciadoresespecíficos que podem ser usados para amplificar osrespectivos Ioci marcadores da invenção. Qualquer umhabilitado na técnica irá reconhecer que outras seqüênciasem qualquer um dos lados dos dados iniciadores podem serusadas no lugar dos dados iniciadores, contanto que osiniciadores possam amplificar o alelo desejado de um lócusmarcador favorável da invenção. Além disso, marcadores paraestes Ioci favoráveis são também fornecidos. Assim, apresente invenção não é limitada aos iniciadores emarcadores especificamente aqui citados.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece umpolinucleotideo isolado compreendendo pelo menos 12nucleotídeos consecutivos, onde a referida seqüência dosreferidos 12 nucleotídeos consecutivos compreende pelomenos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or100% de identidade de seqüência em relação ao complementode um alelo de um lôcus marcador favorável compreendendouma seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45 ou 47 onde o referido polinucleotideo pode detectarum polimorfismo em um lócus marcador favorável associadocom alto conteúdo de óleo, alto conteúdo de ácido oléicoe/ou alta relação entre o ácido oléico/ácido linoléico. Emalgumas modalidades, o polinucleotideo isolado compreendepelo menos 12 nucleotídeos consecutivos da seqüênciaexposta em Id. de Seq. n° : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 OU47. Em outras modalidades, o polinucleotideo isoladocompreende um marcador detectável. 0 marcador detectávelpode ser, por exemplo, um elemento radioativo ou umcorante. Em algumas modalidades, o iniciador ou marcador dainvenção também compreendem um marcador fluorescente e umatêmpera, por exemplo, para uso nos ensaios de marcador dehibridização dos tipos conhecidos como ensaios Taqman,disponíveis a partir de Applied Biosystems (Foster City,Califórnia).
(B) Reprodução de Planta
Os Ioci marcadores favoráveis da invenção podem serusados na seleção de plantas assistida por marcador quepossuem o fenótipo de alto teor de óleo desejado, e/oufenótipo de alto teor de ácido oléico e/ou fenótipo de altoteor de ácido/baixo teror de ácido linoléico (isto é,relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico) esubsequente reprodução destas plantas selecionadas paraobter linhas genéticas de planta e/ou variedades possuindoo fenótipo de alto teor de óleo desejado e/ou fenótipo dealto teor de ácido oléico e/ou fenótipo de alto teor deácido/baixo teror de ácido linoléico.
O termo "germeplasma" refere-se a um indivíduo, umgrupo de indivíduos, ou um clone representando um genótipo,variedade, espécie ou cultura, ou o material genéticodeste.
Um "genótipo" é a constituição genética de umindivíduo (ou um grupo de indivíduos) em um ou mais Iocigenéticos. Genótipo é definido pelo(s) alelo(s) de um oumais Ioci conhecidos que o indivíduo herdou de seus pais.Um "halótipo" é o genótipo de um indivíduo em umapluralidade de Ioci genéticos. Tipicamente, os Iocigenéticos descritos por um halótipo são fisicamente egenéticamente ligados, isto é, no mesmo segmento docromossomo.
Um indivíduo é "homozigoto" se o indivíduo possuiapenas um tipo de alelo em um dado lócus (por exemplo, umindivíduo diplóide com duas cópias do mesmo alelo em umlócus). Um indivíduo é "heterozigoto" se mais de um tipo dealelo está presente em um dado lócus (por exemplo, umindivíduo diplóide com uma cópia de cada um dos dois alelosdiferentes). O termo "homogeneidade" indica que elementosde um grupo possuem o mesmo genótipo em um ou mais Iociespecíficos. Contrariamente, o termo "heterogeneidade" éusado para indicar que os indivíduos dentro do grupodiferem em genótipo em um ou mais Ioci específicos.
Uma "linha" ou "cepa" é um grupo de indivíduos deascendência idêntica que são geralmente consanguíneos emalgum grau e que são geralmente isogênicos ou quaseisogênicos.
A expressão linhas "quase isogênicas" refere-se alinhas que são geneticamente similares entre si exceto emum ou em um pequeno número de Ioci genéticos (por exemplo,em 1, 2 ou cerca de 5 a cerca de 10 Ioci genéticosespecíficos). Estas podem ser criadas conforme descritopara sublinhas baseadas em marcador ou baseadas emdiferenças para qualquer traço qualitativo que pode servircomo um marcador genético efetivo. 0 percentual desimilaridade entre linhas quase isogênicas é uma função dasimilaridade dos pais da cruza original e a geração em quea auto-polinização é executada. Em média, o parentescoentre os elementos de uma dada linha consanguínea aumenta50% com cada ciclo de procriação consanguínea, devido a umaumento de 50% na homozigosidade em cada ciclo deprocriação consanguínea. A similaridade percentul pode sermais precisamente determinada com marcadores genéticos quese estendem sobre o genoraa. Em alguns casos, linhas quaseisogânicas diferem entre si em um lócus genético definido.
Uma "linha elite" ou "cepa elite" é uma linhaagronomicamente superior que resultou de muitos ciclos dereprodução e seleção para performance agronômica superior.Similarmente, um "germeplasma elite" é um germeplasmaagronomicamente superior, tipicamente derivado de e/oucapaz de dar origem a uma planta com performance agronômicasuperior, tal como uma linha elite de milho existente ourecentemente desenvolvida.
Linhas de milho consanguineas são tipicamentedesenvolvidas para uso na produção de híbridos de milho epara uso como germeplasma em populações de reprodução paraa criação de novas e distintas linhas de milhoconsanguineas. Linhas de milho consanguineas são muitasvezes usadas como alvos para a introgressão de novos traçosatravés de técnicas de reprodução tradicionais e/outécnicas de introgressão molecular. Linhas de milhoconsanguineas necessitam ser altamente homogêneas,homozigóticas e reproduzíveis para serem úteis comoascendentes de híbridos comerciais. Muitos métodosanalíticos estão disponíveis para determinar ahomozigosidade e estabilidade fenotípica de linhasconsanguineas.
A expressão "plantas híbridas" refere-se a plantas queresultam de um crizamento entre indivíduos geneticamentediferentes.
O termo "cruzado" ou "cruzamento" no contexto destainvenção significa a fusão de gametas, por exemplo, atravésde polinização para produzir descendência (isto é, células,sementes ou plantas) no caso de plantas. 0 termo abrangecruzamentos sexuais (a polinização de uma planta por outra)e no caso de plantas, auto-polinização, isto é, quando opólen e, o óvulo são da mesma planta.
0 termo "introgressão" refere-se à transmissão de umalelo desejado de um lócus genético de uma base genética àoutra. Em um método, os alelos desejados podem serintrogredidos através de um cruzamento sexual entre doisascendentes, onde pelo menos um dos ascendentes possui oalelo desejado em seu genoma. 0 alelo desejado pode ser umlócus marcador, um QTL, um transgene ou semelhante. Emalgumas modalidades da invenção, o alelo desejado é umaleno de um lócus marcador favorável aqui divulgado,i. Seleção Assistida por Marcador
A "Seleção Assistida por Marcador" ou "MAS" refere-seã prática de selecionar fenótipos desejados entre elementosde uma população de cruzamento usando-se marcadoresgenéticos. O objetivo principal de qualquer programa dereprodução é combinar tantos alelos favoráveis quantopossível em variedades elite de germeplasma que sãogeneticamente superiores (com relação a um ou mais traçosagronômicos) em relação a seus ancestrais. Os marcadoresaqui fornecidos identificam segmentos cromossômicos, istoé, regiões genômicas, e alelos (formas alélicas) da regiãode QTL6 que estão associados com o traço fenotípico de altoteor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou alto teorde ácido oléico/baixo teor de ácido linoléico.
Conseqüentemente, estes marcadores podem ser usados paraseleção de plantas assistida por marcadores, por exemplo,pés de milho, com o traço fenotípico de alto teor de óleoe/ou alto teor de ácido oléico e/ou alto teor de ácidooléico/baixo teor de ácido linoléico (isto é, relaçãoaumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico) . Porexemplo, em um cruzamento entre ascendentes quecomplementam alelos favoráveis no Ioci alvo, a descendênciapode ser selecionada a qual inclui mais alelos favoráveisque qualquer um dos ascendentes.A seleção assistida por marcador (MAS), empregando osmarcadores da presente invenção, e os segmentoscromossômicos que eles identificam, é útil no contexto deum programa de reprodução de milho para aumentar o conteúdode óleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ou a relação entreo ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou partedesta planta. A seleção fenotípica para um traço deinteresse, tal como alto conteúdo de óleo, alto conteúdo deácido oléico ou relação aumentada entre o ácidooléico/ácido linoléico para grandes números de amostraspode ser cara, assim como consumidora de tempo. Além disso,a seleção fenotípica apenas é muitas vezes não confiáveldevido aos efeitos de epistasia e contribuições nãogenéticas (por exemplo, ambientais) ao fenótipo. MASoferece a vantagem sobre a avaliação de campo porque podeser executada em qualquer momento do ano sem levar emconsideração a estação de crescimento ou estágio dedesenvolvimento. Além disso, MAS facilita a avalaiação deorganismos desenvolvidos em regiões díspares ou sobcondições diferentes.
Um criador de habilidade comum, desejando cultivarplantas com conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo deácido oléico aumentado e/ou relação aumentada entre o ácidooléico e ácido linoléico, pode aplicar os métodos para MASaqui descritos, usando-se, por exemplo, o lócus marcadorfavorável exemplar fornecido aqui ou os Ioci marcadoresligados localizados aos segmentos de cromossomoidentificados pelos Ioci marcadores favoráveis aquifornecidos, para originar linhas de planta com conteúdo deóleo aumentos e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ourelação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico.
Alelos marcadores genéticos, por exemplo, os Ioeimarcadores exemplares expostos em Id. de Seq. noS: 1, 3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 45 e 47 e alelos destes compreendendoum ou mais dos respectivos polimorfismos identificados nasTabelas 2 e 3 aqui abaixo, marcadores ligados, e QTL,identificamndo os segmentos de cromossomo que abrangem oselementos genéticos que são importantes para alto conteúdode óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relaçãoaumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico, sãousados para identificar plantas que contêm um genótipodesejado em um ou mais Ioci, e que se espera que transfiramo genótipo desejado, junto com um fenótipo desejado a suaprole. Os alelos marcadores (ou alelos de QTL) podem seruados para identificar plantas que contêm um genótipodesejado em um lócus, ou em vários Ioci não ligado ouligado (por exemplo, um haplótipo) e que se espera quetransfira o genótipo desejado, junto com um fenótipodesejado a sua prole. Similarmente, identificando-se asplantas que carecem do alelo desejado, as plantas com umfenótipo indesejável, por exemplo, plantas com um teor deóleo não muito alto e/ou fenótipo com teor de ácido oleiconão muito alto, ou fenótipo com teor de óleo normal (quandocomparado ao amarelo #2) , podem ser identificadas, e, porexemplo, eliminadas de cruzamentos subsequentes. Seráavaliado que para os propósitos de MAS, o termo marcadorpode abranger tanto os Ioci marcadores quanto os Ioci deQTL, uma vez que ambos podem ser usados para indentificarplantas com um fenótipo desejado.Por exemplo, MAS pode ser usado para desenvolverlinhas ou cepas de milho e germeplasma de milho com altoconteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ourelação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléicoidentificando-se as formas alélicas favoráveis dossegmentos de cromossomo mostrados como sendo importantes,por exemplo, que incluem um elemento genético, para altoconteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico. Destamaneira, os Ioci marcadores favoráveis aqui divulgadospodem ser empregados como previsores para o traço de altoteor de óleo e/ou o traço de alto teor de ácido oléico, eassim ser previsores para o traço fenotípico de alto teorde ácido oléico/baixo teor de ácido linoléico (isto é,relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico) .
Resumidamente, os pés de milho ou germeplasma podem serselecioandos por um ou mais Ioci marcadores favoráveis oualelos de Ioci marcadores favoráveis que se correlacionampositivamente com o alto teor de óleo e/ou alto conteúdo deácido oléico, e/ou relação aumentada entre o ácido oléico eácido linoléico, sem verdadeiramente dar origem ao milhoatravés de seu ciclo de vida e executar avaliaçõesfenotípicas (isto é, medir o alto teror de óleo e/ou altoconteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre oácido oléico/ácido linoléico). Conforme discutido acima, apresente invenção fornece meios para identificar plantas,particularmente pés de milho, que possuem um conteúdo deóleo aumentado e/ou um conteúdo de ácido oléico aumentadoe/ou uma relação aumentada entre o ácido oléico e ácidolinoléico através da identificação de plantas que possuemum lócus marcador favorável exposto em Id. de Seq. n° : 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 ou 51 com pelo menos umpolimorfismo neste, por exemplo, o lócus marcador favoráveldivulgado em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 OU47 ou um alelo deste compreendendo um ou mais dospolimorfismos aqui identificados (ver, por exemplo, asTabelas 2 e 3 aqui abaixo). Similarmente, em outrasmodalidades, os pés de milho podem ser selecionados contrase eles possuem um ou mais Ioci marcadores que secorrelacionam negativamente com alto teor de óleo e/ou altoconteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre oácido oléico e ácido linoléico. Além disso, estes Iocimarcadores podem ser intregredido em qualquer base genômicadesejada, germeplasma, linha, variedade etc., como parte doprograma de seleção assistido por marcador projetado paraaumentar o conteúdo de óleo e/ou o conteúdo de ácidooléico, ou para aumentar a relação entre ácido oléico eácido linoléico no milho.
Resumidamente, na seleção assitida por marcador, umaamostra de tecido é tomada de um primeiro pé de milho ou deum primiro germeplasma de milhoe é selecionada paradeterminar se o primeiro pé de milho ou o primeirogermeplasma de milho compreende um lócus marcadorapropriado ou alelo deste que está correlacionado com altoconteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oleico e/ourelação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico.Os pés de milho ou germeplasma de milho possuindo o lócusmarcador desejado são selecionados e cruzados com umsegundo pé de milho ou germeplasma.Em ainda outras modalidades, os Ioci marcadoresdesejados ou alelos deste são introgredidos em um segundopé de milho ou um segundo germeplasma de milho pra produzirum pé de milho ou germeplasma de milho introgredido. Emmodalidades especificas, o pé de milho introgredido ougermeplasma apresenta um conteúdo de óleo aumentado, umconteúdo de ácido oléico aumentado ou uma relação aumentadaentre o ácido oléico e ácido linoléico quando comparados aosegundo pé de milho ou germeplasma.
Será avaliado que plantas positivas para um ou maisloci marcadores favoráveis da invenção podem serselecionados e cruzados de acordo com qualquer protocolo dereprodução relevante ao programa de reprodução particular.Conseqüentemente, a prole pode ser gerada de uma plantaselecionada pelo cruzamento da planta selecionada para umaou mais plantas selecionadas na base do mesmo marcador oude um marcador diferente, por exemplo, um marcadordiferente correlacionando-se com alto conteúdo de óleo e/oualto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entreo ácido oléico e ácido linoléico, ou um fenótipo diferentede interesse, por exemplo, resistência a uma doençaparticular. Alternativamente, uma planta selecionada podeser retrocruzada com um ou ambos os progenitores. 0retrocruzamento é freqüentemente feito para o propósito deintrogredir um ou alguns Ioci de um progenitor doador, porexemplo, um progenitor doador compreendendo germeplasmaexótico, em uma outra base genética diferente do prohenitorrecorrente (tipicamente, uma elite).
Quanto mais ciclo de retrocruzamento são executados,maior a contribuição genética do progenitor recorrente àvariedade resultante. Uma planta selecionada pode tambémser retrocruzada, por exemplo, a uma planta ou linha nãopresete em sua genealogia. Tal planta pode ser selecionadaentre uma população de interesse para uma rodada de análiseprévia, ou pode ser introduzida novamente no progroma decruzamento. Uma planta positiva para um marcador desejadopode também ser auto-cruzada para criar uma linha decruzamento verdadeira com o mesmo genótipo.
ii. Uso de conteúdo de ácido oléico para monitorar econfirmar a presença de QTL6
Conforme notato nos exemplos aqui abaixo, aconcentração de ácido oléico mostra um maior aumento que oconteúdo de óleo dentro de pés de milho que portam a regiãode QTL6 de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléicofavorável aqui descrita. Este traço fenotípico pode serusado para monitorar e confirmar a presença de um lôcusmarcador favorável da invenção, e assim prever se um pé demilho ou germeplasma de milho terá o traço desejável dealto conteúdo de óleo e/ou relação aumentada entre o ácidooléico e ácido linoléico.
Em algumas modalidades, o lôcus marcador favorável aser detectado está dentro do polinucleotideo codificandoDGTA, por exemplo, dentro do polinucleotideo codificandoDGATl-2. Desta forma, o lócus marcador favorável a serdetectado pode compreender um polimorfismo nopolinucleotideo codificando ZmDGATl-2 (por exemplo, aseqüência codificadora exposta em Id. de Seq. n°:51) onde amudança polimórfica à seqüência codificadora de ZmDGATl-2resulta em uma substituição do resíduo de glicina peloresíduo de serina na posição do aminoácido correspondenteao resíduo 45 de Id. de Seq. n°:52; uma substituição doresíduo de serina pelo resíduo de prolina na posição doaminoácido correspondente ao resíduo 55 de Id. de Seq.n°:52; uma deleção do resíduo de glutamina correspondenteàquela posição do aminoácido 64, 65, 66 ou 67 de Id. deSeq. n°:52; e/ou uma inserção de um resíduo de fenilalaninaem uma posição localizada entre um par de resíduos, onde opar de resíduos corresponde a um par de resíduos dentro deId. de Seq. n°:52 selecionado a partir do grupo consistindode: (a) o resíduo de triptofano na posição 467 doaminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de fenilalaninana posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, (b) oresíduo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id.de Seq. n° : 52 e o resíduo de fenilalanina na posição 469do aminoácido de Id. de Seq. n° : 52 e (c) o resíduo defenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq.n°:52 e o resíduo de serina na posição 470 do aminoácido deId. de Seq. n° : 52. Um exemplo não limitante de um lócusmarcador favorável dentro de um polinucleotídeocondificanto DGATl-2 é uma seqüência compreendendo aseqüência exposta em Id. de Seq. n°:47, que codifica aproteína ZmDGATl-2(ASK) exposta em Id. de Seq. n°:48.
Assim, a presente invenção fornece um método paradetectar a presença de um ou mais lócus marcador favorávelda invenção, e assim identificar a presença da região deQTL6 aqui descrita, em um pé de milho ou germeplasma demilho, onde o método compreende determinar a concentraçãode ácido oléico da planta ou germeplasma, particularmentedentro da semente ou embrião. Desta maneira, umaconcentração de ácido oléico na semente ou embrião de pelomemos 35% (isto é, 35% ou mais do óleo da semente ouembrião são representados pelo ácido oléico) será preditivade que o pé de milho ou germeplasma de milho provavelmentecompreendem um ou mais Ioci marcadores favoráveis dainvenção, e portanto a região de QTL6 desejada aquidefinida, e portanto será beneficamente continuada noprocesso de reprodução e seleção. Alternativamente, umaconcentração de ácido oléico na semente ou embrião de memosde 35% (isto é, o ácido oléico representa menos de 35% doóleo da semente ou embrião) será preditiva de que o pé demilho ou germeplasma de milho não portam a região de QTL6desejada em seu genoma.
Esta etapa de seleção de ácido oléico pode ser tambémsuplementada com seleções genômicas para a presença de umou mais Ioci marcadores favoráveis da região de QTL6descrita aqui, e portanto a presença da região de QTL6desejada. Em um tal exemplo, a presença da região de QTL6desejada é confirmada pela detecção da presença da inserçãodo códon TTC dentro da seqüência codificadora de ZmDGAT 1-2que resulta na inserção de Phe467, Phe468 ou Phe469 naproteína ZmDGAT 1-2(ASK). Isto pode ser alcançado, porexemplo, pela amplificação de um fragmento de DNA em tornodete códon usando Id. de Seq. n°:126 e 127, conformedescrito nos Exemplos 3 e 13 aqui abaixo.
(C) Polinucleotídeos e/ou Polipeptídeos Associados comQTL6
A presente invenção fornece plantas ou partes deplanta que têm estavelmente incorporado em seu genoma umpolinucleotídeo heterólogo compreendendo pelo menos umaseqüência associada ao alto conteúdo de óleo e/ou pelomenos uma seqüência associada ao alto conteúdo de ácidooléico operativamente ligada a um promotor ativo na plantaou parte desta planta, onde a referida seqüência associadaao alto conteúdo de óleo ou a referida seqüência associadaao alto conteúdo de ácido oléico é derivada de umaseqüência de nucleotideo genômico geneticamente ligada apelo menos um alelo de um ou mais Ioci marcadoresfavoráveis que estão associados com o alto conteúdo de óleoe/ou alto conteúdo de ácido oléico, e/ou relação aumentadaentre o ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ouparte desta planta. Em algumas modalidades, os Iocimarcadores favoráveis são geneticamente ligados com umaregião de QTL6 que é flanqueada por uma primeira seqüênciade borda que compreende os nucleotídeos de 1-20 de Id. deSeq. n°:2, e uma segunda seqüência de borda que compreendeos nucleotídeos 477-496 de Id. de Seq. n°:46. Em outrasmodalidades, os Ioci marcadores favoráveis sãogeneticamente ligados com uma região também definida destaregião de QTL6, onde a região também definida é flanqueadapor uma primeira seqüência de borda que compreende osnucleotídeos de 1-20 de Id. de Seq. n°:6,e uma segundaseqüência de borda que compreende os nucleotídeos de 482-501 de Id. de Seq. n°: 14. Em ainda outras modalidades, osloci marcadores favoráveis são geneticamente ligados comuma segunda também definida regição desta região de QTL6,onde a segunda região também definida é flanqueada por umaprimeira seqüência de borda que compreende os nucleotídeosde 1-20 de Id. de Seq. n° : 10, e uma segunda seqüência deborda que compreende os nucleotídeos de 4 88-507 de Id. deSeq. n°:4. Esta segunda região também definida, que resideem um gene único, DGAT1-2, controla tanto as concentraçõesde óleo quanto de ácido oléico no embrião. É reconhecidoque os loci marcadores favoráveis da invenção podemcompreender seqüências que não são codificadoras, porexemplo, RNA não codificador que funciona sem ser traduzidoem uma proteína, também referido como pequeno RNA (sRNA),incluindo microRNAs (miRNAs) e pode compreende seqüênciacodificadora, por exemplo, um quadro de leitura aberto,conforme notado aqui acima.
Em algumas modalidades, os Ioci marcadores compreendemuma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo dasseqüências expostas em Id. de Seq. n°:2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,44, 46 e 51 com pelo menos um polimorfismo neste queconfere ou está associado com o alto conteúdo de óleo e/oualto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entreo ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou partedesta planta. Exemplos não limitantes destes polimorfismosnestão divulgados na Tabela 2 e 6 aqui abaixo. Em algumasdestas modalidades, os Ioci marcadores favoráveis incluem olócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:4 com pelo menosum polimorfismo ocorrendo em uma posição de nucleotídeo(nt) dentro de Id. de Seq. n°:4 selecioada a partir dogrupo consistindo de nt 28, 204, 256, 302, 305, 341, 429,461, e qualquer combinação destes; o lócus marcador expostoem Id. de Seq. n° : 6 com pelo menos um polimorfismoocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n° : 6selecionado a partir do grupo consistindo de nt 43, 74,208, 224 e qualquer combinação destes; o lócus marcadorexposto em Id. de Seq. n° : 8 com pelo menos um polimorfismoccorrendo a uma posição nt dentro de Id. de Seq. n° : 8selecionada a partir do grupo consistinde de 25, 55, 88,100, 195, 223, 238, 242, 255, 279, 306, 307, 345, 399, equalquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id.de Seq. n° : 10 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo auma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:10 selecionadaselecionada de nt 40, 41, 88, 89, 126, 134, 146, 218 equalquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id.de Seq. n° : 12 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo emuma posição nt dentro de Id. de Seq. n° : 12 selecionada apartir de nt 128, 195, 256, 257, 293, 294, 295, 296, 327,qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id.de Seq. n° : 14 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo emuma posição nt dentro de Id. de Seq. n° : 14 selecionada apartir de nt 262, 311, e qualquer combinação destes; olócus marcador exposto em Id. de Seq. n°: 16 com pelo menosum polimorfismo ocorrendo em uma posição nt 428 de Id. deSeq. n° : 16; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. noS:18 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posiçãont dentro de Id. de Seq. n° : 18 selecionada a partir de nt119, 3 96, 420, e qualquer combinação destes; o lócusmarcador exposto em Id. de Seq. n° : 20 com pelo menos umpolimorfosmo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. deSeq. n°:20 selecionado a partir de nt 194, 258, 259, 260,365, 366, 489, e qualquer combinação destes; o lócusmarcador exposto em Id. de Seq. n°:22 com pelo menos umpolimorfosmo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. deSeq. n°:22 selecionada a partir de nt 48, 50 ,56, 60, 63,101, 133, 166, 170, 179, 181, 206, 207, 211, 231, 237, 255,273, 282, 294, 312, 324, 343, 345, 358, 377, 381, 385, 387,404, e qualquer combinação destes; o lócus marcador expostoem Id. de Seq. n°:24 com pelo menos um polimorfismoocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n° : 24selecionada a partir de nt 358, 359, 371, 421, 422, 423,425, 426, e qualquer combinação destes; o lócus marcadorexposto em Id. de Seq. n°:26 com pelo menos umpolimorfismo ocorrendo em uma posição nt em Id. de Seq.n° : 26 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em umaposição nt em Id. de Seq. n°:26 selecionada a partir de nt28, 31, 35, 43, 50, 111, 117, 143, 192, 197, 219, 266 equalquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id.de Seq. n°:28 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo emuma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:28 selecionada apartir de nt 41, 62, 92, 158, 182, 194, 200, 226, 229, 349e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto emId. de Seq. n°:30 com pelo menos um polimorfismo ocorrendoem uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:30 selecionada apartir de nt 102, 145, 162, 165, 198, 199, 221, 247, 251,253, 306, 331, 352, 451, 461, 464, e qualquer combinaçãodestes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:32 compelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição ntdentro de Id. de Seq. n°:32 selecionada de nt 61, 73, 87,143, 199, 208, 209, 210, 211, 225, 327, 328, 335 e qualquercombinação destes; e o lócus marcador exposto em Id. deSeq. n°:51 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em umaposição nt dentro de Id. de Seq. n°:51 selecionada a partirde nt 134; nt 163; nt 190-192 ou 193-195 ou 196-198 ou 199-201; nt 1401 ou 1404 ou 1407; e qualquer combinação destes.
Mudanças polimórficas exemplares dentro destes Iocimarcadores estão expostas nas Tabelas 2 e 3 aqui abaixo. Emalgumas modalidades, o lócus marcador favorável compreendea seqüência divulgada em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45 ou 47, ou um alelo deste compreendendo um ou maisdos polimorfismos identificados nesta (ver, por exemplo,Tabela 2 e Tabela 3, aqui abaixo).
É reconhecido que as plantas transformadas de maneiraestável podem compreender qualquer um ou todos ospolinucleotídeos para os Ioci marcadores favoráveis aquiidentificados. Em tais modalidades, a expressão dopolinucleotídeo heteróligo compreendendo a seqüênciaassociada com alto teor de óleo ou alto teor de ácidooléico aumenta o conteúdo de óleo ou o conteúdo de ácidooléico na planta ou parte desta planta, e pode aumentar deforma favorável a relação entre o ácido oléico e ácidolinoléico na planta ou parte desta planta.
(i) Quadros de Leitura Abertos do lócus QTL6QTL6 foi finamente mapeado a uma região deaproximadamente 195 kb que foi caracterizada e encontradapara conter cinco quadros de leitura abertos. Sem estarpreso pela teoria, uma ou mais proteínas coif içadas porestes quadros de leitura abertos estão associadas com umfenótipo de alto teor de óleo, e/ou um fenótipo de altoteor de ácido oléico, e/ou um fenótipo de alto teor deóleo/baixo teor de ácido linoléico (isto é, relaçãoaumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico). Assim, oconteúdo de óleo e/ou o conteúdo de ácido oléico e/ou arelação entre o ácido oléico e ácido linoléico de umaplanta ou parte desta planta podem ser manipulados porsuperexpressão de uma ou mais destas proteínas na planta ouparte desta planta.
(a) Diacilglicerol o-aciltransferase tipo 1 (DGAT)
A presente invenção fornece uma nova variante de umadiacilglicerol o-aciltransferase tipo 1 (DGAT) que, sobexpressão em uma planta ou parte desta planta, aumenta oconteúdo de óleo, aumenta o conteúdo de ácido oléico, e/ouaumenta a relação entre o ácido oléico e ácido linoléicona planta ou parte desta planta, quando comparada àseqüência de DGAT tipo 1 de uma planta que não exibefenótipo de alto teor de óleo e/ou alto conteúdo de ácidooléico e/ou alto teor de ácido oleico/baixo teor de ácidolinoléico, por exemplo, a seqüência de DGAT 1-2 de milho deteor normal de óleo exposta em Id. de Seq. n°:52 (designadaZmDGATl-2 (EF09B)). Uma seqüência de DGAT variante queaumenta o conteúdo de óleo, aumenta o conteúdo de ácidooléico e/ou aumenta a relação entre o ácido oléico e ácidolinoléico em uma planta ou parte desta planta desta forma éreferida aqui como "uma variante de alto teor de óleo/altoteor de ácido oléico" de DGAT, e a seqüência condificadorapara esta variante representa a seqüência associada a altoteor de óleo e alto teor de ácido oléico da invenção. 0termo "variante" refere-se a uma proteína que compreendeuma seqüência de aminoácido que se difere da seqüência deaminoácido para a proteína de referência pelas deleções deaminoácido, substituições de aminoácido ou ambos.
A variante de alto teor de óleo/alto teor de ácidooléico de DGAT da presente invenção designada ZmDGATl-2(ASK) compreende uma seqüência de aminoácido que se difereda seqüência de DGAT 1-2 de milho com teor normal de óleode referência tendo uma substituição do resíduo de glicinapelo resíduo de valina na posição do aminoácidocorrespondente ao resíduo 45 de Id. de Seq. n°:52; umasubstituição do resíduo de serina pelo resíduo de prolinana posição do aminoácido correspondente ao resíduo 55 deId. de Seq. n° : 52; uma deleção do resíduo de glutaminacorrespondendo àquela posição no aminoácido 64, 65, 66 ou67 de Id. de Seq. n°:52; e/ou uma inserção de um resíduo defenilalanina em uma posição localizada entre um par deresíduos, onde o par de resíduos corresponde a um par deresíduos dentro de Id. de Seq. n°:52 selecinado a partir dogrupo consistindo de: (a) o resíduo de triptofano naposição 467 do aminoácido de Id. de Seq. n° : 52 e o resíduode fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq.n°:52, (b) o resíduo de fenilalanina na posição 468 doaminoácido de Id. de Seq. n° : 52 e o resíduo def enilalaninana posição 469 do aminoácido de Id. de Seq.n°:52, (c) o resíduo de fenilalanina na posição 469 doaminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de serina naposição 470 do aminoácido de Id. de Seq. n° : 52. Veja aseqüência de polipeptídeo ZmDGATl-2(ASK) exposta em Id. deSeq. n°:48. Veja também o alinhamento do polipeptídeoZmDGATl-2(ASK) com a seqüência de polipeptídeo ZmDGATl-2 apartir de três linhas consanguíneas com teor normal deóleo, EF09B, Mo 17 e B73, mostradas na Figura 30. Umalinhamento das respectivas seqüências codificadoras émostrado na Figura 31. A variante de DGAT de alto teor deóleo/alto teor de ácido oléico da invenção pode ter uma oumais destas várias modificações. Conforme aqui usado, aseqüência de aminoácido de referência para DGAT 1-2 demilho a partir de linhas consanguíneas com teor normal deóleo é mostrada em Id. de Seq. n°:52 (seqüência paraZmDGATl-2 (EF09B) ), que é codificada por uma seqüência denucleotídeo tal como aquela exposta em Id. de Seq. n°:51.
Uma ou mais das substituições particulares aquidivulgadas resulta em uma variante de DGAt que retém asatividades desejadas de considerar um aumento nos níveis deóleo e/ou ácido oléico e/ou um aumento na relação entre oácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou partedesta, quando comparada a uma planta ou parte desta plantade controle apropriada, conforme descrito em algum lugaraqui. Tendo-se identificado as posições dentro da seqüênciade DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico(isto é, a seqüência ZmDGATl-2(ASK)) e as substituições,deleções e inserções relevantes, faz parte das habilidadesde qualquer um habilitado na técnica variar outros resíduosdentro da seqüência variante de DGAT para se obtervariantes de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácidooléico aqui divulgada que também retêm a atividadedesejada, isto é, aumentando o conteúdo de óleo e/ouaumentando o conteúdo de ácido oléico, e/ou aumentando arelação entre o ácido oléico e ácido linoléico de umaplanta ou parte desta planta. Tais variantes da variante deDGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléicodivulgadas aqui são também objetivadas para seremabrangidas pela presente invenção, e são também definidasabaixo. A presente invenção também fornece quaisquerseqüências de nucleotídeo codificando as variantes de DGATde alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico da invenção,por exemplo, a seqüência codificadora exposta em Id. deSeq. n°: 4 7, que codifica a variante de DGAT de alto teor deóleo/alto teor de ácido oléico ZmDGATl-2(ASK) (Id. de Seq.n° : 48).
Diacilglicerol aciltransferase (DGAT, EC 2.3.1.20) usaacil-CoA graxo e diacilglicerol como substratos paracatalisar a etapa comprometida na síntese detriacilglicerol. DGATs executam um papel fundamental nometabolismo de glicerolipídeos celulares. Muitos elementosda família de DGAT foram identificados em plantas, váriosdos quais são mostrados em um alinhamento na Figura 33. ADGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico dapresente invenção (ZmDGATl-2(ASK)) está também mostrada naFigura 33. Análise filogênica (ver Figura 32) destespolipeptídeos de DGAT foi executada usando-se o programaPHYLIP (J. Felsenstein, University of Washington) e foiapresentada usando-se o programa TreeView (Página (1996)Computer Appl. Biosci. 12:357-358). A diacilglicerolaciltransferases tipo I e tipo II de planta, glicerol-3-fosfato aciltransferases (GPAT) e lisofosfatidilaciltransferases (LPAT) foram inclusas na análise. Osresultados mostram que a DGAT tipo 1 (DGATl) é distinta daDGAT tipo 2 (DGAT2) , GPAT e LPAT. Dentro da DGTA tipo 1, umsubgrupo DGAT 1-2 composto de várias espécies demonocotilédone pode ser também diferenciado. 0 ORF de DGATlocalizado na região de QTL6 da invenção é um elemento dosubgrupo DGAT 1-2.
São também fornecidos aqui o polipeptídeo ZmDGATl-2com teor normal de óleo conforme identificado nas linhasconsanguíneas de milho com teor normal de óleo EF09B, Mo 17e B73. Para os propósitos da presente invenção, estepolipeptídeo é referido aqui como ZmDGATl-2 or ZmDAGTl-2(EF09B), ZmDGATl-2(Mol7) ou ZmDGATl-2(B73) com "teornormal de óleo", dependendo da linha consanguínea de milhocom teor de óleo normal a partir da qual o polipeptídeoZmDGATl-2 com teor normal de óleo foi derivado. 0polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo está expostoem Id. de Seq. n°:50 (referido aqui referido como ZmDGATl-2 (Mol7), Id. de Seq. n°:52 (referido aqui como ZmDGATl-2 (EF09B) e Id. de Seq. n° : 54 (referido aqui como ZmDGATl-2(B73)). Os polinucleotídeos codificando o polipeptídeoZmDGATl-2 com teor normal de óleo são também abrangidospela presente invenção. Os polinucleotídeos exemplares sãoexpostos em Id. de Seq. n°:49 (aqui referido como seqüênciacodificadora de ZmDGAT 1-2 (Mo 17), Id. de Seq. n°:51 (aquireferido como seqüência codificadora de ZmDGAT 1-2(EF09B) eId. de Seq. n°:53 (aqui referido como seqüênciacodificadora de ZmDGATl-2(B73)). Conforme notado acima,para propósitos de comparação das mudanças polimórficasentre as seqüências codificadoras de ZmDGAT 1-2(ASK) dealto teor de óleo/alto teor de ácido oléico e seqüências depolipeptídeo e as respectivas seqüências codificadoras deZmDGAT 1-2 com teor normal de óleo e as seqüências depolipeptídeo, ZmDGAT 1-2(EF09B) serve como a ZmDGAT 1-2 comteor normal de óleo de referidaArencia (isto é, a seqüênciade aminoácido exposta em Id. de Seq. n° : 52 e a seqüênciacodificadora exemplar exposta em Id. de Seq. n°:51).
Variantes do polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleoe polinucleotídeos codificando estes variantes são tambémabrangidos pela presente invenção.
0 polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo e asseqüências que codificam esta proteína e variantes destesque retêm a atividade da proteína ZmDGATl-2 com teornormal de óleo, e portanto estão envolvidas na biosíntesede óleo, também encontram uso no aumento do conteúdo deóleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ou relação crescenteentre o ácido oléico e ácido linoléico de acordo com osmétodos da presente invenção. Desta forma, a superexpressãodo polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo, ou osfragmentos funcionais e variantes destes conforme definido em algum lugar aqui, podem fornecer conteúdo de óleoaumentado, conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou relaçãoaumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico em umaplanta ou parte desta planta, conforme descrito aquiabaixo. Ver também Exemplo 11 abaixo.
(b) Permease de Aminoácido
A presente invenção também fornece o quadro de leituraaberto para o polipeptídeo permease 1 de aminoácido demilho (AAPl) (Id. de Seq. n°:56, designado ZmAAPl) evariantes biologicamente ativas desta conforme aquidefinido abaixo. Os polinucleotídeos isolados codificando opolipeptídeo ZmAAPl são também abrangidos pela presenteinvenção. Em tal modalidade, o polinucleotídeo isoladocompreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:55 ouvariante desta codificando um polipeptídeo AAPlbiologicamente ativo. A Figura 34 mostra um alinhamento dopolipeptídeo ZmAAPl com outros polipeptídeos AAPrelacionados a partir de outras espécies de planta. Parauma revisão das permeases de aminoácido no transporte deaminoácidos, em geral, veja, por exemplo, Wipf e outros,(2002) Trends Biochem. Sci. 27(3): 139-147. 139-147.(c) Proteína de Sistema de Efluxo de K+ (PESP)
A presente invenção também fornece o quadro de leituraaberto para a proteína de sistema de efluxo de potássio demilho (Id. de Seq. n°:58, designado ZmPESP) e variantesbiologicamente ativas desta conforme aqui definido abaixo.Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptídeoZmPESP são também abrangidos pela presente invenção. Em talmodalidade, o polinucleotídeo isolado compreende aseqüência exposta em Id. de Seq. n°:57 ou variante destacodificando um polipeptídeo PESP biologicamente ativo. AFigura 35 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmPESP comoutros polipeptídeos PESP relacionados a partir de outrasespécies de planta. Para uma revisão dos polipeptídeosPESP, em geral, veja, por exemplo, Ferguson e outros,(1993) Mol. Microbiol. 9(6): 1297-1303.
(d) Proteína S24 Ribossômica 40S
A presente invenção também fornece o quadro de leituraaberto para a proteína S24 ribossômica 4 OS (Id. de Seq.n°:60, designado ZmS24) e variantes biologicamente ativasdesta conforme aqui definido abaixo. Os polinucleotídeosisolados codificando o polipeptídeo ZmS24 são tambémabrangidos pela presente invenção. Em tal modalidade, opolinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta emId. de Seq. n°:59 ou variante desta codificando umaproteína S24 ribossômica 40S biologicamente ativa. A Figura36 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmS24 com outrasproteínas ribossômicas relacionadas a partir de outrasespécies de planta. Para uma revisão dos polipeptídeos S24ribossômicos, em geral, veja, por exemplo, Xu e Roufa(1996) Gene 169:257-262.(e) Transportador ABC
A presente invenção também fornece o quadro de leituraaberto para o polipeptideo do transportador ABC tipp PDR demilho (ABCT) (seqüência compósita mostrada em Id. de Seq.n°:64, designado ZmABCT(compôsito) aqui) e variantesbiologicamente ativas desta conforme aqui definido abaixo.Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptideoZmABCT(compôsito) são também abrangidos pela presenteinvenção. Em tal modalidade, o polinucleotídeo isoladocompreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:63 ouvariante desta codificando um polipeptideo do ABCTbiologicamente ativo.
A seqüência codificadora de comprimento total foiconstruída a partir de uma seqüência de cDNA de ORF parcialde ZmABCT clonada a partir da linha de milho consanguíneaMo 17 sem alto teor de óleo, sem alto teor de ácido oléico(seqüência exposta em Id. de Seq. n°:61), codificado aseqüência de aminoácido de terminal N exposta em Id. deSeq. n° : 62) e EST e a seqüência genômica para linha demilho consanguíneas B73 sem alto teor de óleo, sem altoteor de ácido oléico. A Figura 37 mostra um alinhamento dopolipeptideo ZmABCT(compôsito) com outros polipeptídeosABCT relacionados a partir de outras espécies de planta.Para uma revisão dos polipeptídeos ABCT, em geral, veja,por exemplo, Van den Brule e Smart (2002) Planta 216:95-106 .
(C) Variantes e Fragmentos
A invenção abrange composições de polinucleotídeo oude proteína substancialmente purificados ou isolados. Umpolinucleotídeo ou proteína "isolada" ou "purificada" ouporção biologicamente ativa destes, está substancialmenteou essencialmente livre de componentes que normalmenteacompanham ou interagem com polinucleotideo ou proteínaconforme encontrados em seu ambiente ocorrendonaturalmente. Assim, um polinucleotideo ou proteína isoladaou purificada é substancialmente livre de outro materialcelular, ou meio de cultura quando produzido por técnicasrecombinantes, ou substancialmente livre de precursoresquímicos ou outros produtos químicos quando sintetizadosquimicamente. De forma ideal, um polinucleotideo "isolado"é livre de seqüências (preferivelmente, seqüências quecodificam proteína) que flanqueiam naturalmente opolinucleotideo (isto é, seqüências localizadas nasextremidades 5' e 3' do polinucleotideo) no DNA genômico doorganismo a partir do qual o polinucleotideo é derivado.
Por exemplo, em várias modalidades, o polinucleotideoisolado pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeo queflanqueiam naturalmente o polinucleotideo no DNA genômicoda célula a partir da qual o polinucleotideo é derivado.
Uma proteína que é substancialmente livre de materialcelular inclui preparações de proteína possuindo menos decerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteínacontaminante. Quando a proteína da invenção ou porçãobiologicamente ativa desta é produzida de formarecombinante, preferivelmente o meio de cultura representamenos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco)dos precursores químicos ou produtos químicos não-proteicosde interesse.
Os fragmentos e variantes dos polinucleotídeosdivulgados e quaisquer proteínas codificadas por estes sãotambém abrangidos pela presente invenção. Por "fragmento"pretende-se dizer uma parte do polinucleotídeo, porexemplo, uma parte do polinucleotídeo para o lócus marcador5 compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35,37, 39, 41, 43, 45, ou, no caso de uma proteína dainvenção, uma parte da seqüência de man e por conseguinte aproteína codificada por este.
Onde o polinucleotídeo da invenção compreende umquadro de leitura aberto, por exemplo, um polinucleotídeocodificando os polipeptídeos ZmDGATl-2(ASK) com alto teorde óleo/alto teor de ácido oléico, ZmDGATl-2 com teornormal de óleo, ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 ou ZmABCT(compósito),tal como, por exemplo, o polinucleotídeo exposto em Id. deSeq. n° : 47, 51, 55, 57, 59 ou 63, respectivamente, umfragmento do polinucleotídeo pode codificar os fragmentosde proteína que retêm a atividade biologica do polipeptídeode comprimento total, e por conseguinte aumentar o conteúdode óleo e/ou aumentar o conteúdo de ácido oléico e/ouaumentar a relação entre o ácido oléico e ácido linoléicoem uma planta ou parte desta planta quando comparada a umaplanta de controle apropriada ou parte desta planta.Alternativamente, fragmentos de um polinucleotídeo quecompreendem uma seqüência codificadora e que são úteis comomarcadores de hibridização geralmente não codificamproteínas de fragmentos que retêm a atividade biológica.Assim, os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo podemvariar de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, cerca de 2 0nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100nucleotídeos e até o polinucleotídeo de tamanho completoaqui divulgado, dependendo do uso objetivado dopolinucleotídeo.
Assim, por exemplo, onde o polinucleotídeo representauma seqüência não codif icadora, por exemplo, um lócusmarcador compreendendo uma seqüência exposta em Id. de Seq.n° : 1, 3, 5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25,27, 29,31,33,35, 37, 39, 41, 43 ou 45, um fragmento dopolinucleotídeo pode compreender pelo menos 12, 16, 20, 50,75, 100, 150, 200 ou 250 nucleotídeos contínuos, ou até onúmero de nucleotídeos presenta em uma seqüência denucleotídeo de comprimento total para um lócus marcadorfavorável aqui divulgado (por exemplo, 523, 507, 257, 511,241, 371, 510, 592, 550, 520, 464, 514, 505, 410, 522, 507, 553, 972, 469, 413, 457, 762 ou 499 nucleotídeos para Id.de Seq. n°:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 ou 45, respectivamente).
Fragmentos de um lócus marcador favorável possuindo umaseqüência que não é uma seqüência codificadora irãocompreender pelo menos um dos polimorf ismos aquiidentificados. Assim, por exemplo, um fragmento de um lócusmarcador compreendendo a seqüência exposta em Id. de Seq.n° : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 ou 45 compreende uma parte daseqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos um dospolimorfismos identificados nesta; veja, por exemplo,Tabela 2 abaixo e os alinhamentos fornecidos nas Figuras 7-29 aqui.
Um fragmento de um polinucleotídeo que codifica umaproção biologicamente ativa de uma DGAT de alto teor deóleo/alto teor de ácido oléico (por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) ) , uma DGAT com teor de óleo normal (por exemplo,ZmDGATl-2(EF09B)), uma permease de aminoácido, uma PESP,uma proteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABCda invenção irá codificar pelo menos 15, 25, 30, 50, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 650, 700aminoácidos contínuos, ou até o número total de aminoácidospresentes em uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor deácido oléico de comprimento total, uma DGAT com teor deóleo normal, uma permease de aminoácido, uma PESP, umaproteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABC dainvenção. Os fragmentos de um polinucleotídeo que são úteiscomo marcadores de hibridização ou iniciadores de PCRgeralmente não necessitam codificar uma porçãobiologicamente ativa de uma DGAT de alto teor de óleo/altoteor de ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, umapermease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômicaou uma proteína transportadora ABC.
Assim, um fragmento de um polinucleotídeo da invençãopode codificar uma porção bilogicamente ativa de uma DGATde alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, uma DGATcom teor de óleo normal, uma permease de aminoácido, umaPESP, uma proteína ribossômica ou uma proteínatransportadora ABC, ou ele pode ser um fragmento que podeser usado como um marcador de hibridização ou iniciador dePCR usando-se métodos divulgados abaixo. Uma porçãobiologicamente ativa de uma DGAT de alto teor de óleo/altoteor de ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, umapermease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômicaou uma proteína transportadora ABC pode ser preparadaisolando-se uma parte de um dos respectivospolinucleotídeos codificando estas proteínas, expressando aporção codificada da DGAT de alto teor de óleo/alto teor deácido oléico, DGAT com teor de óleo normal, a permease deaminoácido, a PESP, a proteína ribossômica ou a proteínatransportadora ABC (por exemplo, pela expressãorecombinante in vitro), e analisando-se a atividade daporção codificada da respectiva proteína. Ospolinucleotídeos que são fragmentos de uma seqüência denucleotídeo codificando uma DGAT de alto teor de óleo/altoteor de ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, umapermease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômicaou uma proteína transportadora ABC compreende pelo menos16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400nucleotídeos contínuos, ou até o número de nucleotídeospresentes em uma seqüência de nucleotídeo de comprimentototal codificando uma DGAT de alto teor de óleo/alto teorde ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, umapermease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômicaou uma proteína transportadora ABC aqui divulgadas (porexemplo, 1485, 1485, 1389, 1896, 414 e 4710 nucleotídeospara Id. de Seq. n°:47, 51, 55, 57, 59 e 63respectivamente).
Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica umfragmento do polipeptídeo ZmDGATl-2(ASK) exposto em Id. deSeq. n°:48, onde o fragmento compreende pelo menos um entreo resíduo de glicina na posição 45 do aminoácido de Id. deSeq. n°:48, o resíduo de serina na posição 55 do aminoácidode Id. de Seq. n°:48, e o resíduo de fenilalanina naposição 467, 468 ou 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:48,onde a expressão do fragmento de polipeptídeo codificado emuma planta ou parte desta planta aumenta o conteúdo deóleo, aumenta o conteúdo de ácido oléico, e/ou aumenta arelação entre o ácido oléico e ácido linoléico na planta ouparte desta planta.
Em outras modalidades, o polinucleotídeo codifica umfragmento do polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleoexposto em Id. de Seq. n°:52 com pelo menos uma alteraçãoselecionada a partir do grupo consistindo de: (a) umasubstituição de um resíduo de glicina pelo resíduo devalina na posição 45 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52;(b) um resíduo de serina pelo resíduo de prolina na posição55 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52; (c) uma deleção doresíduo de glutamina correspondente à posição 64, 65, 66 ou67 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52; e (d) uma inserçãode um resíduo de fenilalanina em uma posição localizadaentre um par de resíduos, onde o par de resíduoscorresponde a um par de resíduos dentro de Id. de Seq.n°:52 selecionado a partir do grupo consistindo de: (i) oresíduo de triptofano na posição 467 do aminoácido de Id.de Seq. n°:52 e o resíduo de fenilalanina na posição 468 doaminoácido de Id. de Seq. n°:52, (ii) o resíduo defenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq.n° : 52 e o resíduo de fenilalania na posição 469 doaminoácido de Id. de Seq. n°:52, e (iii) o resíduo defenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq.n° : 52 e o resíduo de serina na posição 470 do aminoácido deId. de Seq. n°:52; onde a expressão do fragmento depolipeptídeo codificado em uma planta ou parte desta plantaaumenta o conteúdo de óleo, aumenta o conteúdo de ácidooléico e/ou aumenta a relação entre o ácido oléico e ácidolinoléico na planta ou parte desta planta.
Em ainda outras modalidades, o fragmento de umpolinucleotideo codifica um fragmento do polipeptideoZmDGATl-2 com teor normal de óleo exposto em Id. de Seq.n° : 52 (expondo ZmDGATl-2(EF09B), que possui a mesmaseqüência dos polipeptideos ZmDGATl-2(Mol7) e ZmDGATl-2(B73), respectivamente, expostos em Id. de Seq. n°:50 e54) , onde a superexpressão do fragmento de polipeptideo codificado em uma planta ou parte desta planta aumenta oconteúdo de ácido oléico e/ou aumenta a relação entre oácido oléico e ácido linoléico na planta ou parte desta planta.
O termo "variantes" objetiva significarsubstancialmente seqüências similares. Para ospolinucleotideos, uma variante compreende uma deleção e/ouadição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítiosinterno dentro do polinucleotideo nativo e/ou umasubstituição de um ou mais nucleotídeos em um ou maissítios no polinucleotideo nativo. Conforme aqui usado, umpolinucleotideo ou polipeptideo "nativo" compreende umaseqüência de nucleotídeo ou uma seqüência de aminoácido queocorrem naturalmente, respectivamente.
Onde o polinucleotideo representa uma seqüência nãocodificadora, por exemplo, um lócus marcador compreendendoa seqüência exposta em Id. de Seq. n° : 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43 ou 45, uma variande do lócus marcador favorável irácompreender uma seqüência de nucleotídeo compreendendo pelomenos um dos polimorfismos identificados na seqüência parao respectivo lôcus marcador (veja, por exemplo, a Tabela 2e os alinhamentos apresentados nas Figuras 7-29 aqui) e iráreter a caracterisitca de estar associada ao traçofenotípico de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo deácido oléico e/ou alto conteúdo de ácido oléico/baixoconteúdo de ácido linoléico (isto é, relação aumentadaentre o ácido oléico e ácido linoléico) . Para ospolinucleotídeos que codificam uma proteína da invenção,variantes conservativas incluem aquelas seqüências que, porcausa da degeneração do código genético, codificam aseqüência de aminoácido da DGAT de alto teor de óleo/altoteor de ácido oléico, DGAT com teor de óleo normal,permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ouproteína transportadora ABC da invenção. Os variantesalélicos que ocorrem naturalmente tais como estes podem seridentificados com o uso de técnicas de biologia molecularbem conhecidas, como, por exemplo, com reação de cadeia depolimerase (PCR) e técnicas de hibridização conformedescrito abaixo. Os polinucleotídeos variantes tambémincluem polinucleotídeos derivados sinteticamente, taiscomo aqueles gerado, por exemplo, pelo uso de mutagênesesítio-dirigida, e, para seqüências codificadoras, aindacodificam a seqüência de aminoácido da DGAT de alto teor deóleo/alto teor de ácido oléico, DGAT com teor de óleonormal, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômicaou proteína transportadora ABC da invenção. Geralmente, asvariantes de um polinucleotídeo particular da invençãopossuirão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99% ou mais de identidade de seqüência em relaçãoàquele polinucleotídeo particular conforme determinadopelos programas de alinhamento de seqüência e parâmetrosdescritos em algum lugar aqui.
As variantes de um polinucleotídeo particular dainvenção (isto é, o polinucleotídeo de referência) quecodifica um polipeptídeo da invenção podem também seravaliadas por comparação do percentual de identidade deseqüência entre o polipeptídeo codificado por umpolinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelopolinucleotídeo de referência. Assim, por exemplo, umpolinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo com umdado percentualde identidade de seqüência em relação aopolipeptídeo de Id. de Seq. n°:48, 52, 56, 58, 60 e 64 sãodivulgados. O percentual de identidade de seqüência entrequalquer um dos dois polipeptídeos pode ser calculadousando-se programas de alinhamento de seqüência e osparâmetros descritos aqui em algum lugar. Onde qualquerdado par de polinucleotídeo da invenção é avaliado porcomparação do percentual de identidade de seqüênciacompartilhado pelos dois polipeptídeos que eles codificam,o percentual de identidade de seqüência entre os doispolipeptídeos codificados é pelo menos de cerca de 40%,45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade deseqüência.
0 termo proteína "variante" é objetivado parasignificar uma proteína derivada da proteína nativa peladeleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou maissítios internos na proteína nativa e/ou substituição de umou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteínanativa. As proteínas variantes abrangidas pela presenteinvenção são biologicamente ativas, isto quer dizer queelas continuam a possuir a atividade biológica desejada daproteína que ocorre naturalmente, isto é, a atividadebiológica desejada da proteína ZmDGATl-2(ASK) , proteínaZmDGATl-2 com teor normal de óleo (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), a proteína ZmAAPl, a proteína ZmPESP, a proteínaZmS24 e a proteína ZmABCT conforme aqui descrito. Taisvariantes podem resultar de, por exemplo, um ou maispolimorfismos genéticos ou de manipulação humana. Asvariantes biologicamente ativas de uma DGAT de alto teor deóleo/alto teor de ácido oléico que ocorre naturalmente dainvenção, tal como ZmDGATl-2 (ASK) , DGAT com teor de óleonormal da invenção, tal como ZmDGATl-2(EF09B), permease deaminoácido da invenção, tal como ZmAAPl, PESP da invenção,tal como ZmPESP, proteína ribossômica da invenção, tal comoZmS24, ou proteína transportadora ABC da invenção, tal comoZmABCT, possuirão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%,60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência emrelação à seqüência de aminoácido para a proteína nativaconforme determinado pelos programas de alinhamento deseqüência e parâmetros descritos em algum lugar aqui. Umavariante biologicamente ativa de uma proteína da invençãopode diferir daquela proteína por apenas 1-15 resíduos deaminoácidos, apenas 1-10, tal como 6-10, apenas 5, apenas4, 3, 2, ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.
As proteínas da invenção podem ser alteradas de váriasmaneiras incluindo substituições de aminoácidos, exclusões,truncações, e inserções. Métodos para tais manipulações sãogerlmente conhecidos na técnica. Por exemplo, variantes deseqüência de aminoácido e fragmentos da proteina ZmDGATl-2 (ASK) , proteina ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (porexemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), a proteina ZmAAPl, a ZmPESP, aproteina ZmS24 e a proteina ZmABCT podem ser preparadaspor mutações no DNA. Métodos para a mutagênese e alteraçõesde polinucleotideo são bem conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, Kunkel (1985) Proe. Natl. Aead. Sei. USA 82:488-492); Kunkel e outros, (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente U.S. de número 4.873.192; Walker e Gaastra,eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillanPublishing Company, New York) e as referências citadasnesta. Orientação para as substituições de aminoácidosapropriadas que não afetam a atividade biológica daproteína de interesse pode ser encontrada no modelo deDayhoff e outros. (1978) Atlas of Protein Sequence andStructure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.),aqui incorporado para referência. Substituiçõesconservativas, tal como a troca de um aminoácido com umoutro possuindo propriedades similares, pode serpreferível.
Assim, os genes e os polinucleotídeox da invençãoincluem tanto as seqüências que ocorrem naturalmente quantoas formas mutantes. De maneira semelhante, as proteínas dainvenção abrangem tanto as proteínas que ocorremnaturalmente quanto as variações e formas modificadasdesta. Tais variantes irão continuar a possuir a atividadedesejada. Assim, por exemplo, variantes da proteínaZmDGATl-2(ASK) continuarão a conceder o fenótipo de altoteor de óleo/alto teor de ácido oléico em uma planta ouparte desta planta. Variantes da proteína ZmDGATl-2 comteor normal de óleo (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B))continuarão a possuir a atividade desejada de estaremenvolvidas na biossíntese de óleo, e portanto quandosuperexpressadas em uma planta ou parte desta palnta,resultarão em um aumento no conteúdo de óleo, conteúdo deácido oléico e/ou relação entre o ácido oléico e ácidolinoléico daquela planta ou parte desta planta. Obviamente,as mutações que serão feitas no DNA que codifica a variantenão devem colocar a seqüência fora do quadro de leitura epreferivelmente não criarão regiões complementares quepoderão produzir estrutura secundária de mRNA. Ver, aPublicação do Pedido de Patente EP de n° 75.444.
Não se espera que as deleções, inserções, esubstituições das seqüências de proteína abrangidas aquiproduzam mudanças radicais nas características da proteína.Entretanto, quando é difícil prever o efeito exato dasubstituição, deleção ou inserção antes que estas sejamfeitas, qualquer um habilitado na técnica irá avaliar que oefeito será avaliado por ensaios de classificaçãorotineiros.
Polinucleotídeos variantes e proteína também abrangemseqüências e proteínas derivadas de um procedimentomutagênico e recombinogênico tal como combinaçõesaleatórias de DNA (DNA shuffling) . Com tal procedimento,uma ou mais seqüências codificadoras diferentes para aproteína ZmDGATl-2(ASK), a proteína ZmDGATl-2 com teor deóleo normal (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), a proteínaZmAAP, a ZmPESP, a proteína ZmS24, ou as seqüências quecodificam a proteína ZmABCT podem ser manipuladas paracriar uma nova proteína DGATl-2, proteína AAPl, PESP,proteína S24 ribossômica 4OS ou proteína ABCT possuindo aspropriedades desejadas. Desta maneira, as bibliotecas depolinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de umapopulação de polinucleotídeos relacionados compreendendoregiões de seqüência que possuem substancial identidade deseqüência e podem ser de forma homóloga recombinadas invitro ou in vivo. Por exemplo, usando-se este método, osmotivos de seqüência que condificam um domínio de interessepodem ser combinados aleatoriamente entre a seqüênciacodificadora para a proteína ZmDGATl-2(ASK), ZmDGATl-2 comteor normal de óleo (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)),ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 ou ZmABCT da invenção e seqüênciascodificadoras para outras proteínas DGATl-2, AAPl, PESP,S24, ABCT respectivas conhecidas para se obter um novo genecodificando para uma proteína com uma propriedade deinteresse melhorada. Estratégias para tal combinaçãoaleatória de DNA são conhecidas na técnica. Ver, porexemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri eoutros (1997) Nature Biotech. 15:436-438, Moore e outros(1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang e outros (1997)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Cramerietal.(1998) Nature 391:288-291; e Patentes U. S. de números5.605.793 e 5.837.458.
As composições da invenção também incluem moléculas deácido nucleico isoladas compreendendo a seqüência denucleotídeo promotora ZmDGATl-2(Mol7) (filamentocomplementar exposto em Id. de Seq. n° : 119); seqüência denucleotídeo promotora ZmDGATl-2(ASK) (filamentocomplementar exposto em Id. de Seq. n°: 130); seqüência denucleotídeo promotora ZmAAPl (exposta em Id. de Seq. n° :120); seqüência de nucleotídeo promotora ZmPESP(Mol7)(exposta em Id. de Seq. n°: 121); seqüência de nucleotídeopromotora ZmPESP(ASK) (exposta em Id. de Seq. n° : 129;seqüência de nucleotídeo promotora ZmS24 (exposta em Id. deSeq. n°: 122); e seqüência de nucleotídeo promotora ZmABCT(exposta em Id. de Seq. n° : 123) . Por "promotor" éobjetivado uma região reguladora de DNA compreendendofreqüentemente uma caixa TATA capaz de direcionar a RNApolimerase II para iniciar a síntese de RNA no sítio deiniciação de transcrição apropriado para uma seqüência decodificação particular. Um promotor pode adicionalmentecompreender outras seqüências de reconhecimento geralmente posicionadas acima ou 5' em relação a caixa TATA, referidocomo elementos promotores superiores, que influenciam ataxa de iniciação de transcrição.
É reconhecido que se tendo identificado as seqüênciasde nucleotídeo para as regiões promotoras aqui divulgadas,elas estão inseridas no estado da técnica para isolar eidentificar elementos reguladores adicionais na região 5'-não traduzida à montante da região promotora particularaqui identificada. Assim, por exemplo, as respectivasregiões promotoras aqui divulgadas podem também compreederelementos reguladores à montante que conferem expressãotecido-preferida das seqüências de nucleotídeo heterólogaoperativamente ligada à seqüência promotora divulgada. Vejaparticularmente, a Patente Australiana de número AU-A-77751/94 e Patentes U. S. de números 5.466.785 e 5.635.618.
Os fragmentos e variantes das seqüências denucleotídeo promotoras ZmDGATl-2(Mol7) , AmDGATl-2(ASK) ,ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 e ZmABCT sãotambém abrangidos pela presente invenção. Por "fragmento"de uma seqüência promotora é objetivado uma porção daseqüência de nucleotídeo promotora. Os fragmentos de umaseqüência de nucleotídeo promotora podem reter atividadebiológica e por conseguinte reter sua atividade reguladoratranscricional. Assim, por exemplo, menos que a seqüênciapromotora inteira aqui divulgada pode ser utilizada paradirecionar a expressão de uma seqüência de nucleotídeooperativamente ligada de interesse, tal como uma seqüênciade nucleotídeo codificando uma proteína heteróloga.Alternativamente, fragmentos de uma seqüência promotora denucleotídeo que são úteis como marcadores de hibridizaçãogeralmente não retêm a atividade biológica. Assim, osfragmentos de uma seqüência promotora de nucleotídeo podemvariar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, e até a seqüênciapromotora de nucleotídeo de tamanho completo da invenção.
Assim, um fragmento de uma seqüência promotora denucleotídeo ZmDGATl-2 (Mol7) , ZmDGATl-2(ASK) , ZmAAPl,ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT pode codificaruma porção biologicamente ativa do respectivo promotor, oupode ser um fragmento que pode ser usado como um marcadorde hibridização ou iniciador de PCR usando os métodosdivulgados abaixo. Uma porção biologicamente ativa dopromotor ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2(ASK), ZmAAPl,ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT pode serpreparada isolando-se uma porção da respectiva seqüênciapromotora de nucleotídeo da invenção, e analisando-se aatividade da porção do respectivo promotor. As moléculas deácido nucleico que são fragmentos de uma seqüênciapromotora de nucleotideo ZmDGATl-2(Mol7) , ZmDGATl-2(ASK) ,ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCTcompreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250,300, 350, 400, 450 nucleotídeos ou até o número denucleotídeos presentes em uma seqüência promotora denucleotideo ZmDGATl-2(Mol7) , ZmDGATl-2(ASK) , ZmAAPl,ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT de comprimentototal aqui divulgada (por exemplo, até 3.000 nucleotídeospara o promotor ZmDGATl-2(Mol7), a seqüência complementarda qual está apresentada em Id. de Seq. n°: 119; até 3.000nucleotídeos para o promotor AmDGATl-2(ASK) , a seqüênciacomplementar da qual está apresentada em Id. de Seq. n° :130; até 728 nucleotídeos para o promotor ZmAAPlapresentado em Id. de Seq. n° : 120; até 3.000 nucleotídeospara o promotor ZmPESP(Mol7) apresentado em Id. de Seq. n° :121); até 3.000 nucleotídeos para o promotor ZmPESP(ASK)apresentado em Id. de Seq. n° : 129); até 3.000 bp para opromotor ZmS24 apresentado em Id. de Seq. n° : 122); até 728nucleotídeos para o promotor ZmABCT apresentado em Id. deSeq. n° : 123) . Ensaios para determinar a atividade de umaseqüência promotora são bem conhecidos na técnica. Porexemplo, um fragmento promotor ZmDGATl-2(Mol7) ou variantepode ser operativamente ligado à seqüência de nucleotideocodificando qualquer proteína repórter, tal como a proteínaβ-glucuronidase (repórter GUS) ou a proteína luciferase. Aconstrução do DNA é inserida no genoma de uma planta ouparte desta planta, e o mRNA ou o nível proteico daseqüência repórter é determinado. Ver, por exemplo, Eulgeme outros, (1999) EMBO Journal 18: 4689-4699.
Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados paraisolar as seqüências correspondentes de outros organismos,particularmente, outras plantas, mais particularmenteoutras plantas tipo monocotiledôneas. Desta maneira,métodos tais como PCR, hibridização, e etc. podem serusados para identificar tais seqüências baseadas em suahomologia de seqüência para as seqüências aqui expostas.Seqüências isoladas com base em sua identidade de seqüênciapara a seqüência inteira de um lócus marcador aquidivulgado, incluindo os cinco quadros de leitura abertospara a região de QTL6 aqui divulgada, para uma DGAT comteor de óleo normal aqui divulgada (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), ou para variantes e fragmentos destes, sãoabrangidas pela presente invenção. Tais seqüências incluemseqüências que são ortólogas das seqüências divulgadas. 0termo "ortólogos" pretende significar genes derivados de umgene ancestral comum e que são encontrados em diferentesespécies como um resultado de evolução. Genes encontrado emespécies diferentes são considerados ortólogos quando suasseqüências de nucleotídeos e/ou suas seqüências de proteínacodificadas compartilham pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%,85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oumais de identidade de seqüência. As funções de ortólogossão freqüentemente conservadas entre as espécies. Assim, ospolinucleotídeos isolados que codificam para uma proteínaDGAT 1-2, uma proteína AAPl, uma PESPf uma proteína S24ribossômica 40S, ou uma proteína ABCT, e que hibridizam-sesob condições severas às respectivas seqüências aquidivulgadas como Id. de Seq. noS:47 ou 51 (ZmDGATl-2 (ASK) eZmDGATl-2(EF09B), respectivamente), 55, 57, 59 e 63, ou àsvariantes ou fragmentos destas, ou qualquer complementodestas, são abrangidas pela presente invenção.
Similarmente, os polinucleotídeos que conferem atividadepromotora, e que hibridizam-se sob condições severas aocomplemente das respectivas seqüências promotoras aquidivulgadas como Id. de Seq. noS:120, 121, 122, 123, 129 e ocomplenento de Id. de Seq. n°: 119 ou o complemento de Id.de Seq. n° : 130, ou às variantes ou fragmentos destas, oua qualquer complemento destas, são abrangidos pela presenteinvenção.
Em um método de PCR, os iniciadores deoligonucleotídeo podem ser designados para uso em reaçõesde PCR para amplificar seqüências de DNA correspondentes apartir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer plantade interesse. Métodos para designar os iniciadores de PCR eclonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica eestão divulgados em Sambrook e outros, (1989) MolecularCloning: A Laboratory Manual (2a ed. , Cold Spring HarborLaboratory Press, Plainview, New York). Ver também Innis eoutros, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods andApplications (Academic Press, New York); Innis e Gelfand,eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); eInnis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (AcademicPress, New York). Os métodos conhecidos de PCR incluem, masnão estão limitados a, métodos que usam iniciadoresemparelhados, iniciadores aninhados, iniciadoresespecíficos únicos, iniciadores degenerados, iniciadoresgene-específicos, iniciadores vetor-específico, iniciadoresparcialmente desemparelhado, e etc.Nas técnicas de hibridização, toda ou parte de umpolinucleotídeo conhecido é usada como um marcador que sehibridiza de forma seletiva a outros polinucleotídeoscorrespondentes presentes em uma população de fragmentos deDNA genômicos clonados ou de fragmentos de cDNA (isto é,bibliotecas genômicas ou de cDNA) de um organismoescolhido. Os marcadores de hibridização podem serfragmentos de DNA genômicos, fragmentos de cDNA, fragmentosde RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadoscom um grupo detectável tal como 32P, ou qualquer outromarcador detectável. Assim, por exemplo, os marcadores parahibridização podem ser feitos mancando-se oligonucleotídeossintéticos com base nos polinucleotídeos para os Iocimarcadores favoráveis da invenção, incluindo Id. de Seq.n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45, assim como os quadros deleitura abertos expostos em Id. de Seq. n°:47, 51, 55, 57,59 e 63. Métodos de preparação dos marcadores parahibridização e para construção de cDNA e bibliotecasgenômicas são geralmente conhecidos na técnica e estãodivulgados em Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Plainview, New York).
Por exemplo, o polinucleotídeo ZmDGATl-2(ASK) inteiroaqui divulgado como Id. de Seq. n°:47, ou uma ou maisporções deste, ou o polinucleotídeo ZmDGATl-2(EF09B)inteiro aqui divulgado como Id. de Seq. n°:51, ou uma oumais porções deste, pode ser usado como um marcador capazde hibridizar-se especificamente aos polinucleotídeosDGATl-2 correspondente e RNAs mensageiros. Para alcançarhibridização específica sob uma variedade de condições,tais marcaodres incluem seqüências que são únicas entre asseqüências de polinucleotídeo DGAT1-2 e possuempreferivelmente pelo menos um tamnaho de cerca de 10nucleotídeo, e ainda mais preferivelmente pelo menos umtamanho de cerca de 20 nucleotídeos. Tais marcadores podemser usados para amplificar os polinucleotídeos DGAT1-2correspondentes, particularmente os polinucleotídeos DGATl-2 que possuem um ou mais dos polimorfismos identificados emId. de Seq. n°:47, ou os polinucleotídeos DGAT-12codificando variantes da proteína DGATl-2 com teor de óleonormal da invenção, a partir de uma planta escolhida porPCR. Esta técnica pode ser usada para isolar seqüênciascodificadoras adicionais a partir de uma planta desejada oucomo um ensaio de diagnóstico para determinar a presença deseqüências codificadoras em uma planta. As técnicas dehibridização incluem seleção por hibridização debibliotecas de DNA palqueadas (ou placas ou colônias; ver,por exemplo, Sambrook e outros, (198 9) Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2a ed. , Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Plainview, New York).
A hibridização de tais seqüências pode ser executadasob condições severas. Por "condições severas" ou"condições de hibridização severas" é objetivado condiçõessob as quais um marcador irá se hibridizar a sua seqüênciaalvo a um grau de forma mais detectável que a outrasseqüências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre a base).As condições severas são dependentes da seqüência e serãodiferentes em diferentes circunstâncias. Controlando-se aseveridade das condições de hibridização e/ou de lavagem,as seqüências alvo que são 100% complementares ao marcadorpodem ser identificadas (marcador homólogo).
Alternativamente, as condições de severidade podem serajustadas para permitir algum desemparelhamento nasseqüências de modo que graus de similaridade menores sejamdetectados (marcador heterólogo). Geralmente, um marcadoré menor que cerca de 1.000 nucleotídeos de tamanho,preferivelmente menor que 500 nucleotídeos de tamanho.
Tipicamente, condições severas serão àquelas nas quaisa concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íonsNa, tipicamente uma concentração de cerca de 0,01 a 1,0 Mde íons Na (ou outros sais) a um pH variando de 7,0 a 8,3 ea temperatura é de pelo menos cerca de 300C para marcadorespequenos (por exemplo, de 10 a 50 nucleotídeos) e pelomenos cerca de 60°C para marcadores longos (por exemplo,mais de 50 nucleotídeos). As condições severas podem tambémser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantestal como formamida. Condições de baixa severidadeexemplares incluem hibridização com uma solução tampão de30 a 35% de formamida, NaCl 1M, SDS (sulfato de dodecilsódico) 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC de IX a 2X (SSC 20X= NaCl 3M/citrato trissódico 0,3M) a uma temperatura entre50 e 55°C. Condições de severidade moderadas exemplaresincluem hibridização em formamida 40 a 45%, NaCl 1M, SDS 1%a 37°C, e uma lavagem em SSC de 0,5X a IX a uma temperaturaentre 55 e 60°C. Condições de severidade altas exemplaresincluem hibridização em formamida 50%, NaCl 1M, SDS 1% a37°C, e uma lavagem em SSC 0,IX a uma temperatura entre 60e 65°C. Opcionalmente, os tampões de lavagem podemcompreender de cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. Aduração da hibridização é geralmente menor que cerca de 24horas, freqüentemente de cerca de 4 a cerca de 12 horas. Aduração do tempo de lavagem será de pelo menos um períodode tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.
A especificidade é tipicamente a função das lavagenspós-hibridização, sendo fatores importantes a força iônicae a temperatura da solução de lavagem final. Para oshíbridos DNA-DNA, o Tm pode ser aproximado a partir daequação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 235:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61(%de form.) - 500/L; onde M é a molaridade dos cátionsmonovalentes, % de GC é o percentual de nucleotídeosguanosina e citosina no DNA, % de form. é o percentual deformamida na solução de hibridização, e L é o comprimentodo híbrido nos pares de base. A Tm é a temperatura (sobforça iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüênciaalvo complementar hibridiza-se a um marcador perfeitamenteemparelhado. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1%de desemparelhamento; assim, Tm, hibridização, e/oucondições de lavagem podem ser ajustados para hibridizar àsseqüências da identidade desejada. Por exemplo, seseqüências com identidade > 90% são procuradas, a Tm podeser diminuída 10°C. Geralmente, condições severas sãoselecionadas para estarem cerca de 5°C abaixo do ponto defusão térmica (Tm) para a seqüência específica e seucomplemento a uma força iônica e pH definidos. Entretanto,condições bastante severas podem utilizar uma hibridizaçãoe/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C abaixo do ponto de fusãotérmica (Tm) ; condições moderadamente severas podemutilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°Cabaixo do ponto de fusão térmica (Tm) ; condições deseveridade baixas podem utilizar uma hibridização e/oulavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C abaixo do ponto defusão térmica (Tm). Usando-se a equação, composições dehibridização ou lavagem, e a Tm desejada, aqueleshabilitados na técnica irão compreender que variações naseveridade das soluções de hibridização e/ou lavagem estãoinerentemente descritas. Se o grau desejado dedesemparelhamento resulta em uma Tm de menos de 45 0C(solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), épreferido aumentar a concentração de SSC de modo que umatemperatura mais alta possa ser usada. Um guia extenso paraa hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I,Capítulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel e outros, eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . VerSambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, New York).
Os seguintes termos são usados para descrever osrelacionamentos de seqüência entre dois ou maispolinucleotídeos ou polipeptídeos: (a) "seqüência dereferência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade deseqüência", e (d) "percentual de identidade de seqüência".
(a) Conforme aqui usado, a expressão "seqüência dereferência" é uma seqüência definida usada como uma basepara uma comparação de seqüência. Uma seqüência dereferência pode ser um subconjunto ou a integridade de umaseqüência especificada, por exemplo, como um segmento de umcDNA de comprimento total ou seqüência do gene, ou o cDNAcompleto ou seqüência do gene.
(b) Conforme aqui usado, a expressão "janela decomparação" faz referência a um segmento continuo eespecificado de uma seqüência de polinucleotideo, onde aseqüência de polinucleotideo na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (isto é, espaços) comparadaà seqüência de referência (que não compreende adições oudeleções) para alinhamento ideal dos dois polinucleotídeos.Geralmente, a janela de comparação possui pelo menos 20nucleotideos contínuos de tamanho, e opcionalmente pode serde 30, 40, 50, 100 ou maior. Aqueles habilitados na técnicacompreendem que para evitar uma alta similaridade a umaseqüência de referência devida à inclusão de espaços naseqüência de polinucleotideo, uma penalidade de intervalo étipicamente introduzida e é subtraída a partir do número deemparelhamentos.
Métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação dopercentual de identidade de seqüência entre quaisquer duasseqüências pode ser executada usando-se um algoritmomatemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmosmatemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith e outros(1981) Adv. Appl. Math. 2:4 82; algoritmo de alinhamentoglobal de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; método de pesquisa por alinhamento local de Pearson eLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; oalgoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.
As implementações de computador destes algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para comparação deseqüências para determinar a identidade de seqüência. Taisimplementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTALno programa PC/Gene (disponível a partir deIntelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programaALIGN (versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA nopacote de software GCG Wisconsin Genetics, Versão 10(disponível a partir de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road,San Diego, Califórnia, USA). Os alinhamentos que usam estesprogramas podem ser executados usando os parâmetrospadrões. 0 programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins eoutros. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins e outros(1989) CABIOS 5:151-153; Corpet e outros (1988) NucleicAeids Res. 16:10881-90, Huang e outros (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson e outros (1994) Meth. Mol. Biol, 24:307-331.0 programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers e Miller(1988) supra. Uma tabela de resíduo de peso PAM120, umapenalidade de comprimento de intervalo de 12 e umapenalidade de intervalo de 4 podem ser usadas com oprograma ALIGN quando se está comparando seqüências deaminoácido. Os programas BLAST de Altschul e outros (1990)J. Mol. Biol. 225:403 são baseados no algoritmo de Karlin eAltschul (1990) supra. As pesquisas de nucleotídeo BLASTpodem ser executadas com o programa BLASTN, pontuação =100, tamanho de palavra = 12, para se obter seqüências denucleotídeo homólogas a uma seqüência de nucleotídeocodificando uma proteína da invenção. As pesquisas deproteína BLAST podem ser executadas com o programa BLASTX,pontuação = 50, tamanho de palavra = 3, para se obterseqüências de aminoácidos homólogas a uma proteína oupolipeptídeo da invenção. Para se obter alinhamentosintervalados para propósitos de comparação, o Gapped BLAST(em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito emAltschul e outros. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389.Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usadopara executar uma pesquisa repetida que detecta relaçõesdistantes entre as moléculas. Ver Altschul e outros (1997)supra. Quando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, osparâmetros dos respsctivos programas (por exemplo, BLASTNpara seqüências de nucleotideo, BLASTX para proteínas)podem ser usados. Veja www.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamentopode também ser executado manualmente por inspeção.
A menos que de outra forma afirmado, os valores deidentidade de seqüência/similaridade aqui se referem aovalor obtido usando GAP versão 10 usando-se os seguintesparâmetros: % de identidade e % de similaridade para umaseqüência de nucleotideo usando-se GAP Weight de 50 eLength Weight de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp;% de indentidade e % de similaridade para uma seqüência deaminoácido usando GAP Weight de 8 e Length Weight de 2, e amatriz de pontuação BLOSUM62. Por "programa equivalente" éobjetivado qualquer programa de comparação de seqüênciaque, para quaisquer duas seqüências em questão, gera umalinhamento possuindo emparelhamentos de nucleotideoidênticos ou de resíduos de aminoácido e um percentual deidentidade de seqüência idêntico quando comparadas aoalinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.GAP usa o algorítimo de Needleman e Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48:443-453, para descobrir o alinhamento de duasseqüências completas que maximiza o número deemparelhamentos e minimiza o número de intervalos. 0 GAPconsidera todos os possíveis alinhamentos e posições dointervalo e cria o alinhamento com o maior número de basesemparelhadas e o menor número de intervalos. Ele leva emconta a provisão de uma penalidade de criação de intervaloe uma penalidade de extensão de intervalo em unidades debases emparelhadas. 0 GAP deve tirar proveito do número depenalidades de criação de intervalo dos emparelhamentos decada intervalo que ele insere. Se uma penalidade deextensão de intervalo maior que zero é escolhida, o GAPdeve, além disso, tirar proveito para cada intervaloinserido do tamanho do intervalo vezes a penalidade deextensão do intervalo. Os valores padrões da penalidade decriação de intervalo e da penalidade de extensão dointervalo na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics SoftwarePackage para seqüências de proteína são 8 e 2,respectivamente. Para as seqüências de nucleotídeo, apenalidade de criação de intervalo padrão é 50 enquanto apenalidade de extensão do intervalo padrão é 3. Aspenalidades de criação de intervalo e de extensão deintervalo podem ser expressas como um inteiro selecionado apartir do grupo de inteiros consistindo de 0 a 200. Assim,por exemplo, penalidades de criação de intervalo e deextensão de intervalo podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oumaiores.
O GAP apresenta um elemento da família de alinhamentosmelhores. Pode haver vários elementos desta família, masnenhum outro elemento possui uma qualidade melhor. 0 GAPmostra quatro figuras de mérito para alinhamentos:Qualidade, Proporção, Identidade e Similaridade. AQualidade é a medida maximizada a fim de alinhar asseqüências. A proporção é a qualidade dividida pelo númerode bases no menor segmento. O percentual de identidade é opercentual dos símbolos que realmente se emparelham. Opercentual de similaridade é o percentual dos símbolos quesão similares. Os símbolos que estão através dos intervalossão ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valorda matriz de pontuação para um par de símbolos é maior ouigual a 0,50, o limite de similaridade. A matriz depontuação usada na Versão 10 do GCG Wisconsin GeneticsSoftware Package é BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).
(c) Conforme aqui usado, "identidade de seqüência" ou"identidade" no contexto das duas seqüências depolinucleotídeo ou polipeptídeo faz referência ao resíduonas duas seqüências que são os mesmos quando alinhadas paracorrespondência máxima sobre uma janela de comparaçãoespecífica. Quando o percentual de identidade de seqüênciaé usado em referência às proteínas, é reconhecido que asposições do resíduo que não sejam idênticos freqüentementediferem por substituições de aminoácido conservativas, ondeos resíduos de aminoácido são substituídos por outrosresíduos de aminoácido com propriedades químicas similares(por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e portanto nãomudam as propriedades funcionais da molécula. Quando asseqüências diferem em substituições conservativas, opercentual de identidade de seqüência pode ser ajustadopara cima para corrigir a natureza conservativa dasubstituição. Seqüências que diferem por tais substituiçõesconservativas são ditas como tendo "similaridade deseqüência" ou "similaridade". Meios para fazer este ajustesão bem conhecidos daqueles habilitados na técnica.
Tipicamente, isto envolve pontuar uma substituiçãoconservativa como um desemparelhamento parcial em vez decompleto, assim aumentando o percentual de identidade deseqüência. Assim, por exemplo, onde a um aminoácidoidêntico é dada uma pontuação de 1 e a uma substituição nãoconservativa é dada uma pontuação de zero, a umasubstituição conservativa é dada uma pontuação entre zero e1. A pontuação das substituições conservativas é calculada,por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).
(d) Conforme aqui usado, "percentual de identidade deseqüência" significa o valor determinado pela comparação deduas seqüências perfeitamente alinhadas sobre uma janela decomparação, onde a porção da seqüência de polinucleotídeona janela de comparação pode compreende adições ou deleções(isto é, intervalos) conforme comparada à seqüência dereferência (que não compreende adições ou deleções) paraalinhamento ideal das duas seqüências. 0 percentual écalculado pela determinação do número de posições nas quaisa base do ácido nucléico ou resíduo de aminoácido idênticosocorre em ambas as seqüências para produzir o número deposições emparelhadas, dividindo-se o número de posiçõesemparelhadas pelo número total de posições na janela decomparação, e multiplicando-se o resultado por 100 paraproduzir o percentual de identidade de seqüência.
(D) Cassete de Expressão
O uso do termo "polinucleotídeo" não é objetivado paralimitar a presente invenção aos polinucleotídeos quecompreendem DNA. Aqueles habilitados na técnica irãoreconhecer que os polinucleotídeos, podem compreenderribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos edesoxiribonucleotideos. Tais desoxirribonucletídeos eribonucleotídeos incluem tanto moléculas que ocorremnaturalmente quanto análogos sintéticos. Ospolinucleotídeos da invenção também abrangem todas asformas de seqüências incluindo, mas não limitadas às formasde filamento único, formas de duplo filamento, grampo decabelo, estruturas "stem-and-loop", e etc.
Quaisquer seqüências de polinucleotídeo associadas aoalto teor de óleo ou alto teor de ácido oléico na região deQTL6 que confira o traço fenotípico de alto teor de óleoe/ou alto teor de ácido oléico e/ou relação aumentada entreo ácido oléico e ácido linoléico, incluindo as seqüênciasde Ioci marcadores expostas em Id. de Seq. noS:l, 3, 5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37,39, 41, 43 e 45, e as seqüências codificadoras expostas emId. de Seq. n°s:47, 55, 57, 59 e 63, assim como asvariantes e fragmentos destas, podem ser incluídas comoparte de um cassete de expressão. Assim, por exemplo, ospolinucleotídeos codificando a DGAT de alto teor deóleo/alto teor de ácido oléico (isto é, ZmDGATl-2(ASK)),permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ou aproteína transportadora ABC da invenção podem serfornecidas em cassetes de expressão para expressão naplanta de interesse. Alternativamente, ou em adição a umaou mais destas seqüências de Ioci marcadores, opolinucleotideo codificando a DGAT com teor de óleo normalda invenção (por exemplo, Id. de Seq. n°:51 codificandoZmDGATl-2 (EF09B) de Id. de Seq. n°:52), assim como asvariantes e fragmentos destas, podem ser incluídas no mesmoou em diferentes cassetes de expressão para fornecersuperexpressão da DGAT com teor de óleo normal. Destaforma,o cassete irá incluir as seqüências reguladoras 5' e 3'operativãmente ligadas a um polinucleotideo codificando aDGAT com alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, DGATcom teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP,proteína ribossômica ou a proteína transportadora ABC dainvenção. "Operativamente ligado" é objetivado parasignificar uma ligação funcional entre dois ou maiselementos. Por exemplo, uma ligação operável entre umpolinucleotideo de interesse e uma seqüência reguladora(isto é, um promotor) é uma ligação funcional que permite aexpressão do polinucleotideo de interesse. Elementosoperativamente ligados podem ser contínuos ou nãocontínuos. Quando usada para se referir à união de duasregiões codificadoras de proteína, a expressão"operativamente ligada" objetiva significar que as regiõescodificadoras estão no mesmo quadro de leitura. 0 cassetepode conter adicionalmente pelo menos um gene adicionalpara ser co-transformado no organismo. Alternativamente,o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser fornecido(s) emcassetes de expressão múltiplos. Tal cassete de expressão éfornecido com uma pluralidade de sítios de restrição e/ousítios de recombinação para inserção do polinucleotideo deinteresse, por exemplo, polinucleotídeos codificando a DGTAde alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, a DGAT comteor normal de óleo, perraease de aminoácido, PESP, proteínaribossômica ou a proteína transportadora ABC da invenção,para estar sob regulação transcricional das regiõesreguladoras. O cassete de expressão pode adicionalmenteconter genes marcadores selecionáveis.
o cassete de expressão incluirá na diração 5'-3' detranscrição, uma região de início transcricional etraducional (isto é, um promotor), um polinucleotídeo dainvenção, por exemplo, um polinucleotídeo codificando aDGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, a DGATcom teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP,proteína ribossômica ou a proteína transportadora ABC dainvenção, e uma região de finalização transcricional etraducional (isto é, uma região de finalização) funcionalem plantas. As regiões reguladoras (isto é, promotores,regiões reguladoras transcricionais e regiões definalização traducional) e/ou o polinucleotídeo da invençãopodem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou entre si.
Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou opolinucleotídeo da invenção podem ser heterólogos à célulahospedeira ou entre si. Conforme aqui usado, "heterólogo"em referência a uma seqüência é uma seqüência que seorigina de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, ésubstancialmente modificada a partir de sua forma nativa emcomposição e/ou lôcus genômico por intervenção humanadeliberada. Por exemplo, um promotor operativamente ligadoa um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferentedaquela espécie a partir da qual o polinucleotídeo foiderivado, ou, se da mesma espécie ou de espécia análoga, umou ambos são substancialmente modificados a partir de suaforma original e/ou lôcus genômico, ou o promotor não é opromotor mativo para o polinucleotídeo operativamenteligado. Conforme aqui usado, um gene quimérico compreendeuma seqüência de codificação operativamente ligada a umaregião de iniciação de transcrição que é heteróloga àseqüência de codificação.
Embora possa ser ideal expressar as seqüências usando-se promotores heterólogos, as seqüências promotoras nativaspodem ser usadas. Tais construções podem mudar os níveis deexpressão da DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácidooléico, a DGAT com teor normal de óleo, permease deaminoácido, PESP, proteína ribossômica ou a proteínatransportadora ABC da invenção na planta ou célula daplanta. Assim, o fenótipo da planta ou célula de plantapode ser alterado.
Desta maneira, a expressão da DGTA de alto teor deóleo/alto teor de ácido oléico, por exemplo, a ZmDGATl-2 (ASK) de Id. de Seq. n°:48, codificada, por exemplo, pelopolinucleotídeo ZmDGATl-2(ASK) exposto em Id. de Seq.n°:4 7, pode ser direcionada por sua seqüência promotoranativa (o filamento complementar ao promotor ZmDGATl-2(ASK)está exposto em Id. de Seq. n° : 130), ou uma seqüênciapromotora para um polipeptídeo DGAT relacionado, porexemplo, a seqüência promotora ZmDGATl-2(Mol7) (o filamentocomplementar ao promotor ZmDGATl-2(Mol7) está exposto emId. de Seq. n° : 119) ou variantes biologicamente ativasdestes.
De maneira semelhante, a expressão da DGTA de teor deóleo normal, por exemplo, a ZmDGATl-2 (Mol7) de Id. de Seq.n°:50, codificada, por exemplo, pelo polinucleotídeoZmDGATl-2 (Mol7) exposto em Id. de Seq. n°:49, pode serdirecionada por sua seqüência promotora nativa (o filamentocomplementar ao promotor ZmDGATl-2(Mol7) está exposto emId. de Seq. n° : 119), ou uma seqüência promotora para umpolipeptídeo DGAT relacionado, por exemplo, a seqüênciapromotora ZmDGATl-2(ASK) (o filamento complementar aopromotor ZmDGATl-2 (ASK) ) está exposto em Id. de Seq. n° :130) ou variantes biologicamente ativas destes.
Similarmente, a expressão da ZmAAPl de Id. de Seq.n° : 56, codificada, por exemplo, pelo polinucleotídeo ZmAAPlexposto em Id. de Seq. n°:55, pode ser direcionada por suaseqüência promotora nativa, exposta como os nucleotídeos6161-6888 de Id. de Seq. n° : 117 (ver também Id. de Seq.N°: 120) ou uma variante biologicamente ativa destes. Aexpressão da ZmPESP de Id. de Seq. n°:58, codificada, porexemplo, pelo polinucleotídeo ZmPESP exposto em Id. de Seq.n°:57, pode ser direcionada por sua seqüência promotoranativa, exposta como os nucleotídeos 153888-156887 de Id.de Seq. n° : 116 (ver também Id. de Seq. N°: 121) umavariante biologicamente ativa destes (ver, por exemplo, aseqüência promotora ZmPESP(ASK) exposta em Id. de Seq. n°:129). A expressão da ZmS24 de Id. de Seq. n°:60,codificada, por exemplo, pelo polinucleotídeo ZmS24 expostoem Id. de Seq. n°:59, pode ser direcionada por suaseqüência promotora nativa, exposta como os nucleotídeos1824-4823 de Id. de Seq. n° : 117 (ver também Id. de Seq.N°: 122) ou uma variante biologicamente ativa destes. Aexpressão da ZmABCT de Id. de Seq. n°:64, codificada, porexemplo, pelo polinucleotídeo ZmABCT exposto em Id. de Seq.n°:63, pode ser direcionada por sua seqüência promotoranativa, exposta como os nucleotídeos 254826-257825 de Id.de Seq. n° : 116 (ver também Id. de Seq. N° : 123) ou umavariante biologicamente ativa destes.
A região de finalização pode ser nativa com a regiãode iniciação transcricional, pode ser nativa com opolinucleotídeo de interesse operativamente ligado, podeser nativa com o hospedeiro da planta, ou pode ser derivadade uma outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga) emrelação ao promotor, polinucleotídeo de interesse,hospedeiro de planta ou qualquer combinação destes. Regiõesde terminação convenientes estão disponíveis a partir deTi-plasmídeo de A. tumefaeiens, tal como as regiões determinação de sintase de octopina e sintase de nopalina.Ver também Guerineau e outros (1991) Mol. Gen. Genet.252:141-144; Proudfoot (1991) Cell 54:671-674; Sanfacon eoutros (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen e outros, (1990)Plant Cell 2:1261-1272; e Munroe e outros (1990) Gene91:151-158; Bailas e outros (1989) Nucleic Acids Res.17:7891-7903, e Joshi e outros (1987) Nucleic Aeids Res.15:9627-9639.
Onde apropriado, os polinucleotídeos podem serotimizados para expressão aumentada na planta transformada.Isto é, os polinucleotídeos podem ser sintetizados usando-se códons de planta preferida para expressão melhorada.Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol.52:1-11 para uma discussão de uso de códom hospedeiropreferido. Métodos estão disponíveis na técnica parasintetizar os genes de planta preferida. Veja, por exemplo,as Patentes U. S. de números 5.380.831 e 5.436.391, eMurray e outros, (1989) Nucleic Acids Res. 27:477-498, aquiincorporada para referência.
Sabe-se que as modificações de seqüência adicionaismelhoram a expressão do gene em uma célula hospedeira.Estas incluem a eliminação de seqüências codificando sinaisde poliadenilação espúria, sinais de sítio de junção exon-intron, repetições semelhante a transposon, e outras taisseqüências bem caracterizadas que podem ser deletérias àexpressão do gene. O conteúdo de G-C da seqüência pode serajustado a níveis médios para um dado hospedeiro celular,conforme calculado com referência aos genes conhecidosexpressos na célula hospedeira. Quando possível, aseqüência é modificada para evitar as previstas estruturasde mRNA secundário de grampo de cabelo.
O cassete de expressão pode adicionalmente conterseqüências líderes 5' . Tais seqüências líderes podem atuarpara melhorar a tradução. Os líderes de tradução sãoconhecidos na técnica e incluem: líderes de picomavírus,por exemplo, líder de EMCV (região não codificadora 5' deencefalomiocardite) (Elroy-Stein e outros (1989) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 86:6126-6130); líder de potivírus, porexemplo, líder TEV (Vírus "Etch" do Fumo) (Gallie e outros(1995) Gene 165 (2) : 233-238) , líder de MDMV (Vírus doMosaico do Milho ("Maize Dwarf Mosaic Vírus")) (Virology154:9-20), e proteína de ligação de cadeia extensa deimunoglobulina humana (BiP) (Macejak e outros (1991) Nature353:90-94); líder não traduzido do mRNA de proteína dacobertura de vírus do mosaico de alfafa (AMV RNA 4)(Jobling e outros (1987) Nature 325:622-625); líder devírus do mosaico de fumo (TMV) (Gallie e outros (198 9) emMolecular Biology of RNA1 ed. Cech (Liss, New York) , pág.237-256); e líder de "Vírus do Mosqueado Clorótico doMilho" (MCMV) (Lommel e outros (1991) Virology 81:382-385).
Ver também Della-Cioppa e outros (1987) Plant Physiol.84:965-968.
Na preparação do cassete de expressão, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a atenderà necessidade de seqüências de DNA na orientação adequadae, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Paraeste fim, adaptadores ou ligantes podem ser empregados paraunir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem serenvolvidas para atender à necessidade por sítios derestrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoçãode sítios de restrição, e etc. Para este propósito, amutagênese in vitro, reparação do iniciador, restrição,fortalecimento, ressubstituições. Por exemplo, transições etransversões, podem estar envolvidas.
Vários promotores podem ser usado na prática dainvenção, incluindo o promotor nativo da seqüência depolinucleotídeo de interesse. Os promotores podem serselecionados com base no resultado desejado. Os ácidosnucleicos podem ser combinados com promotoresconstitutivos, tecido-preferido ou outros promotores paraexpressão em plantas.
Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, opromotor central do promotor Rsyn7 e outros promotoresconstitutivos divulgados em WO 99/43838 e Patente U. S. denúmero 6.072.050; o promotor 35S CaMV central (Odell eoutros, (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz(McElroy e outros, (1990) Plant Cell 2:163-171);ubiquitina (Christensen e outros (1989) Plant Mol. Biol.12·. 619-632 e Christensen e outros (1992) Plant Mol. Biol.18:675-689); pEMU (Last e outros (1991) Theor. Appl. Genet.81:581-588); MAS (Velten e outros (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente U. S. de número 5.659.026) eetc. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo,as Patentes U. S. de números 5.608.149; 5.608.144;5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463;5.608.142 e 6.177.611.
Os promotores regulados quimicamente podem ser usadospara modular a expressão de um gene em uma planta atravésda aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo doobjetivo, o promotor pode ser um promotor indutívelquimicamente, onde a aplicação do produto químico induz aexpressão do gene, ou um promotor reprimível quimicamente,onde a aplicação do produto químico reprime a expressão dogene. Os promotores indutíveis quimicamente são conhecidosna técnica e incluem, mas não estão limitados ao promotorIn2-2 de milho, que é ativado por herbicidas debenzenossulfonamida e safeners, o promotor GST de milho,que é ativador por compostos hidrofóbicos eletrofílicos quesão usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-la de tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outrospromotores regulados quimicamente de interesse incluempromotores responsivos a esteróides (veja, por exemplo, opromotor indutível por glicocorticóide em Schena e outros(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425; McNellise outros (1998) Plant J. 14(2):247-257) e promotoresindutíveis por tetraciclina e reprimíveis por tetraciclina(veja, por exemplo, Gatz e outros (1991) Mol. Gen. Genet.227-.229-221), e Patentes U. S. de números 5.814.618 e5.789.156), aqui incorporadas para referência.
Os promotores de tecido preferido podem ser utilizadospara objetiva a expressão melhorada da seqüência deinteresse, por exemplo, a DGTA de alto teor de óleo/altoteor de ácido oléico, a DGAT com teor normal de óleo,permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica e/ou aproteína transportadora ABC da invenção, dentro de umtecido de planta particular. Os promotores de tecidopreferido incluem Yamamoto e outros, (1997) Plant Cell12:2255; e Kawamata e outros (1997) Plant Cell Physiol.38(7) :792-803; Hansen e outros (1997) Mol. Gen Genet.254 (3) :337-343; Russell e outros (1997) Transgenic Res.6(2): 157-168, Rinehart e outros, (1996) Plant Physiol.112 (3) :1331-1341; Van Camp e outros (1996) Plant Physiol.112 (2) :525-535; Canevascini e outros (1996) Plant Physiol.112 (2) :513-524; Yamamoto e outros (1994) Plant CellPhysiol. 35 (5) : 773-778; Lam (1994) Results Probl. CellDiffer. 20:181-196, Orozco e outros (1993) Plant Mol Biol.23(6): 1129-1138; Matsuoka e outros (1993) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 90 (20) :9586-9590; e Guevara-Garcia e outros(1993) Plant J. 4 (3):495-505. Tais promotores podem sermodificados, se necessário, para expressão mais fraca.
Promotores de "semente preferida" incluem ospromotores "específicos a semente" (aqueles promotoresativos durante o desenvolvimento da semenete tais como ospromotores das proteínas de armazenagem de semente) assimcomo os promotores de "germinação de semente" (aquelespromotores ativos durante a germinação da semente). VerThompson e outros (1989) BioEssays 10:108, aqui incorporadapara referência. Tais promotores de semente preferidaincluem, mas não estão limitados a Ciml (mensagem induzidapor citoquina) ; CZ19B1 (zeína de 19 kDa de milho) ; milps(mio-inositol-l-fosfato sintase) (veja WO 00/11177 ePatente U. S. de número 6.225.52 9; aqui incorporada parareferência). A gama-zeína é um promotor específico aendosperma. Globulina 1 (Glb-I) é um promotor específico aembrião representativo. Para dicotilédones, os promotoresespecíficos a semente incluem, mas não estão limitados a β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, lecitina desoja, cruciferina e etc. Para monocotilédones, ospromotores específicos a semente incluem, mas não estãolimitados a zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa,zeína de 27 kDa, gama-zeína, ceráceos, shrunken 1, shrunken2, Globulina 1, etc. Veja também WO 00/12733, onde ospromotores de semente preferida dos genes endl e end2 sãodivulgados; aqui incorporados por referência.
O cassete de expressão pode também compreender um genemarcador selecionável para a seleção de célulastransformadas. Os genes marcadores selecionáveis sãoutilizados para a seleção de células ou tecidostransformados. Os genes marcadores incluem genes quecodificam resistência a antibiótico, tais como aqueles quecodificam a neomicina fosfotransferase II (NEO) ehigromicina fosfotransferase (HPT) , assim como genes queconferem resistência a compostos herbicidas, tais comoglufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores selecionáveisadicionais incluem marcadores fenotípicos tais como β-galactosidase e proteínas fluorescentes tais como proteínaverde fluorescente (GFP) (Su e outros (2004) BiotechnolBioeng 55:610-9 e Fetter e outros (2004) Plant Cell 76:215-28), proteína ciano fluorescente (CYP) (Bolte e outros(2004) J. Cell Science 117:943-54 e Kato e outros (2002)Plant Physiol 129:913-42), e proteína amarela fluorescente(PhiYFP™ de Evrogen, veja, Bolte e outros (2 004) J. CellScience 117:943-54). Para marcadores selecionávíesadicionais, veja geralmente, Yarranton (1992) Curr. Opin.Biotech. 3:506-511; Christopherson e outros, (1992) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Kuziel e outros (1992)Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley e outros (1980) em The Operon, páginas 177-220; Hu e outros (1987) Cell 48:555-566; Brown e outros(1987) Cell 49:603-612; Figge e outros (1988) Cell 52:713-722; Deuschle e outros (198 9) Proc. Natl. Acad. Aci. USA86:5400-5404; Fuerst e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 86:2549-2553; Deuschle e outros (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg;Reines e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow e outros (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356;Zambretti e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA89:3952-3956; Bairn e outros (1991) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 88:5072-5076; Wyborski e outros (1991) Nucleic AcidsRes. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol.Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb e outros (1991)Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt eoutros (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D.Thesis, University of Heidelberg; Gossen e outros (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551; Oliva e outros(1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka eoutros (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill e outros (1988) Nature334:721-724. Tais divulgações estão aqui incorporadas porreferência.
A lista acima de genes marcadores selecionáveis não éobjetivada para ser limitante. Qualquer gene marcadorselecionável pode ser usado na presente invenção.
(E) Métodos de Introdução do PolinucleotxdeoRecombinante em uma Planta ou Parte desta Planta
Os métodos da invenção envolvem introduzir umpolipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. "Introduzir"é objetivado para significar apresentar à planta opolinucleotídeo ou polipeptídeo de tal forma que aseqüência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta.Os métodos da invenção não dependem de um método particularpara introduzir uma seqüência em uma planta, apenas que opolinucleotídeo ou polipeptídeo ganha acesso ao interior depelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir opolinucleotídeo ou polipeptídeo em plantas são conhecidosna técnica incluindo, mas não limitados a, métodos detransformação estável, métodos de transformaçãotransitória, e métodos mediados por vírus.
Por "transformação estável" é objetivado que aconstrução de nucleotídeo introduzida em uma plantaintegre-se dentro do genoma da planta e seja capaz de serherdado pela prole deste. "Transformação transitória" éobjetivada para significar que um polinucleotídeo éintroduzido na planta e não se integra no genoma da plantaou um polipeptídeo é introduzido em uma planta.Os protocolos de transformação assim como osprotocolos para a introdução de seqüências de polipeptídeose polinucleotídeos em plantas podem variar dependendo dotipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotilédoneou dicotilédone, objetivado para transformação. Métodosadequados de introdução de polipeptídeos e polinucleotídeosem células de planta incluem microinjeção (Crossway eoutros (1986) BioTechniques 4:320-334), eletroporação(Riggs e outros (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (Patente U.S.de número 5.563.055 e Patente U.S. de número 5.981.840),transferência de gene direta (Paszkowski e outros (1984)EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração balística de partícula(veja, por exemplo, Patente U. S. de número 4.945.050;Patente U. S. de número 5.879.918; Patentes U. S. denúmeros 5.886.244 e 5.932.782; Tomes e outros (1995) emPlant Cellr Tissue, e Organ Culture: Fundamental Methods,ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe eoutros (1988) Bioteehnology 6:923-926); e transformação deLecl (WO 00/28058). Veja também Weissinger e outros (1988)Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford e outros (1987)Partieulate Science and Technology 5:27-37 (cebola)Christou e outros (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja)McCabe e outros (1988) BioTechnology 6:923-926 (soja)Finer e McMullen (1991) In Vitro CellDev. Biol. 27P:175-182(soja); Singh e outros (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta e outros (1990) Biotechnology 8:736-740(arroz); Klein e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA85:4305-4309 (milho); Klein e outros (1988) Biotechnology6:559-563 (milho); Patentes U. S. de números 5.240.855;5.322.783 e, 5.324.646; Klein e outros (1988) PlantPhysiol. 91:440-444 (milho); Fromm e outros (1990)Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren eoutros (1984) Nature (London) 311:763-764; Patente U. S. denúmero 5.736.369 (cereais); Bytebier e outros (1987) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet eoutros (1985) em The Experimental Manipulation of OvuleTissues, ed. Chapman e outros (Longman, New York), páginas197-209 (pólen); Kaeppler e outros (1990) Plant CellReports 9:415-418 e Kaeppler e outros (1992) Theor. Appl.Genet. 84:560-566 (transformação mediada por pêlos);DiHalluin e outros (1992) Plant Cell 4:1495-1505(eletroporação); Li e outros (1993) Plant Cell Reports12:250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany75:407-413 (arroz); Osjoda e outros (1996) NatureBiotechnology 14:745-750 (milho através de Agrobacteriumtumefaciens); todos os quais estão aqui incorporados porreferência. Em modalidades específicas, um ou mais dospolinucleotideos da invenção, por exemplo, as seqüênciasdos Ioei marcadores expostas em Id. de Seq. noS: 1, 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35,37, 39, 41, 43 e 45, e as seqüências condificadorasexpostas em Id. de Seq. noS: 47, 51, 55, 57, 59 e 63, assimcomo variantes e fragmentos destes, podem ser fornecidos auma planta usando-se uma variedade de métodos detransformação transitórios. Tais métodos de transformaçãotransitórios incluem, mas não estão limitados à introduçãoda DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, aDGAT com teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP,proteína ribossômica e/ou a proteína transportadora ABC dainvenção ou variantes e fragmentos destas diretamente naplanta ou a introdução na planta de um polinucleotídeocodificando estas respectivas proteínas. Tais métodosincluem por exemplo, microinjeção ou bombardeamento departículas. Veja, por exemplo, Crossway e outros (1986) MolGen. Genet. 202:179-185; Nomura e outros (1986) Plant Sei.44:53-58; Hepler e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91:2176-2180 e Hush e outros (1994) The Journal of CellScience 107:775-784, todas as quais estão aqui incorporadaspor referência. Alternativamente, o polinucleotídeo deinteresse, incluindo as seqüências dos Ioci marcadoresexpostas em Id. de Seq. noS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19,21,23,25,27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45, e asseqüências codificadoras expostas em Id. de Seq. noS:47,51, 55, 57, 59 e 63, assim como variantes e fragmentosdestes, podem ser transformados de forma transitória naplanta usando-se métodos conhecidos na técnica. Taistécnicas incluem sistema de vetor viral e a precipitação dopolinucleotídeo de uma maneira que se evite a liberaçãosubsequente do DNA. Assim, a transcrição do DNA ligado apartícula pode ocorrer, mas a freqüência com a qual ele éliberado para se tornar integrado no genola é reduzidaenormemente. Tais métodos incluem o uso de partículasrevestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143).
Em outras modalidades, o polinucleotídeo da invençãopodem ser introduzido em plantas através do contato dasplantas com um vírus ou ácidos nucléicos virais.Geralmente, tais métodos envolvem incorporar uma construçãode nucleotídeo da invenção dentro de uma molécula de DNA ouRNA viral. É reconhecido que um polipeptídeo da invenção,por exemplo, a DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácidooléico, a DGAT com teor normal de óleo, permease deaminoácido, PESP, proteína ribossômica e/ou a proteínatransportadora ABC da invenção pode ser iniciamentesinstetizado como parte de uma poliproteína viral, que podeser processada depois por proteólise in vivo ou in vitropara produzir a proteína recombinante desejada. Também, éreconhecido que os promotores da invenção também abrange,promotores utilizados para transcrição por polimerases deRNA viral. Métodos para introduzir polinucleotídeos emplantas e expressar uma proteína codificada nesta,envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos natécnica. Ver, por exemplo, Patente U. S. de número5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931, ePorta e outros (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221;aqui incorporados por referência.
Os métodos são conhecidos na técnica para a inserçãoobjetivada de um polinucleotídeo em uma localizaçãoespecífica no genoma da planta. Em uma modalidade, ainserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado éalcançada usando-se um sistema de recombinação sítio-específica. Veja, por exemplo, W099/25821, W099/25854,W099/25840, W099/25855 e W099/25853, todos os quais estãoaqui incorporados por referência. Resumidamente, opolinucleotídeo da invenção pode estar contido no cassetede transferência flanqueado por dois sítios de recombinaçãonão recombinogênicos. O cassete de transferência éintroduzido em uma planta possuindo estavelmenteincorporado em seu genoma um sítio alvo que é flanqueadopor dois sítis de recombinação não recombinogênicos quecorrespondem aos sítios do cassete de transferência. Umarecombinase apropriada é fornecida e o cassete detransferência é integrado no sítio alvo. O polinucleotídeode interesse é portanto integrado em uma posiçãocromossomial específica no genoma da planta.
As células que foram transformadas podem serdesenvolvidas em plantas de acordo com formasconvencionais. Ver, por exemplo, McCormick e outros, (1986)Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então serdesenvolvidas, e ou polinizadas com a mesma cepatransformada ou com cepas diferentes, e a prole resultantepossuindo expressão constitutiva da característicafenotípica desejada identificada. Duas ou mais geraçõespodem ser desenvolvidas para assegurar que a expressão dacaracterística fenotípica desejada seja mantida de formaestável e herdada e então as sementes colhidas paraassegurar que a expressão da característica fenotípicadesejada foi alcançada. Desta maneira, a presente invençãofornece a semente transformada (também referida como"semente transgência") possuindo um polinucleotídeo dainvenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção,estavelmente incorporado em seu genoma.
(F) Plantas e Partes destas Plantas
As composições da invenção também incluem plantas,partesd e planta e células de planta possuindo um ou maisdos polinucleotídeos recombinantes da invenção. Nasmodalidades específicas, o(s) polinucleotídeo(s)recombinante(s) está(ão) estavelmente integrado(s) nogenoma da planta, parte da planta ou célula da planta.
Conforme aqui usado, o termo planta inclui células deplanta, protoplastos de planta, culturas de tecido decélula de planta a partir das quais as plantas podem serregeneradas, calos de planta, molhos de planta e células deplanta que estão intactos nas plantas ou partes da plantatais como embriões, (germe) pólen, óvulos, sementes,folhas, flores, ramos, frutos, cernes, espigas, sabugos,cascas, talos, raízes, pontas de raízes, anteras e etc.Grão é objetivado para significa a semente madura produzidapor produtores comerciais para propósitos outros que não odesenvolvimento ou reprodução da espécie. A prole,variantes, e mutantes das plantas regeneradas estão tambémincluídos dentro do escopo da invenção, desde que estaspartes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.
A presente invenção pode também ser udada paratransformação de qualquer espécie de planta, incluindo, masnão limitada a monocotilédones e edicotilédones. Exemplosde espécies de planta de interesse incluem, mas não estãolimitados a milho (Zea mays), Brassica sp. B. napus, B.rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies deBrassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa(Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeio (Secalecereale) , sorgo (Sorghum vulgare) , milho miúdo ou painço(por exemplo, milho miúdo perolado (Pennisetum glaucum) ,milho miúdo comum/proso (Panicum miliaceum) , milho painçoda Itália (Setaria italica), milho miúdo palito (Eleusinecoracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamustinctorius) , trigo (Triticum aestivum) , soja (Glycine max) ,tabaco (Nieotiana tabaeum), batata (Solanum tuberosum) ,amendoim (Araehis hypogaea), algodão (Gossypium barhadense,Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus) ,mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco(Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus) , árvorescitricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá(Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Perseaamericana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava) ,manga (Mangifera indica) , oliva (Olea europaea) , mamão(Carica papaya), caju (Anacardium occidentale) , macadâmia(Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus) ,beterraba (Beta vulgaris) , cana-de-açúcar (Saeeharum spp.),aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais, e coníferas.
Os vegetais incluem tomates (Lyeopersieon eseulentum),alface (por exemplo, Laetuea sativa) , feijão verde(Phaseolus vulgaris), feijão de lima (Phaseolus limensis) ,ervilhas (Lathyrus spp.), e emelemtos do gênero Cueumis talcomo pepino (C. sativus), cantaloupe (C. eantalupensis), emelão almiscarado (C. melo). As plantas ornamentais incluemazaléia (Rhododendron spp.), hortênsia (Maerophyllahydrangea) , hibiscus (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosaspp.), tulipas (Tulipa spp.), narciso (Nareissus spp.),petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus earyophyllus),bico-de-papagaio (Euphorbia puleherrima), e crisântemo.
As coníferas que podem ser empregadas na prática dapresente invenção incluem, por exemplo, pinheiros tais comopinheiro de incenso (Pinus taeda), pitespaine (Pinuselliotii), Pinho Ponderosa (Pinus ponderosa) , Pinuscontorta (Pinus eontorta) e pinho de Monterey (Pinusradiata); douglásia (Pseudotsuga menziesii); pinheiro doCanadá (Tsuga eanadensis); epicea-de-Sitka (Pieea glauca);pinho vermelho (Sequoia sempervirens) ; abetos verdadeirostal como abeto concolor (Abies amabilis) e abeto balsâmico(Abies balsamea); e cedros tal como cedro do incenso (Thujaplicata) e cedro amarelo do Alaska (Chamaecyparisnootkatensis). Em modalidades específicas, as plantas dapresente invenção são plantas de cultura (por exemplo,milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo,amendoim, sorgo, trigo, milho miúdo, tabaco, e etc) . Emoutras modalides, os pés de milho e soja são ideais, eainda em outras modalidades os pés de milho são ideais.
Outras plantas de interesse incluem plantas em grãoque fornecem sementes de interesse, plantas de sementeoleaginosa, e plantas leguminosas. Sementes de interesseincluem sementes de cereais, tais como milho, trigo,cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. As plantas de sementeoleaginosa incluem algodão, soja, cártamo, brássica, milho,palma, coco, etc. As plantas leguminosas incluem feijões eervilhas. Os feijões incluem guar, semente de alfarroba ,feno-grego, soja, fejoeiro-de-trepar, grão-de-bico, feijãomungo, feijão-de-lima, fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.
Em algumas modalidades, as plantas da invençãocompreendem um polinucleotídeo heterólogo que égeneticamente ligado à região de QTL6 aqui identificada eque confere o traço fenotípico de proporção de alto teor deóleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou teor de ácidooléico/ácido linoléico aumentado a uma planta ou parte deplanta. Desta maneira, as plantas de invenção podemcompreender, incorporadas de maneira estável em seu genoma,um polinucleotídeo heterólogo compreendendo pelo menos umaseqüência associada a alto teor de óleo ou pelo menos umaseqüência associada a alto teor ácido oléico, ligada deforma operável a um promotor ativo na planta ou parte deplanta, onde a seqüência associada a alta oleosidade ouseqüência de alto ácido oléico é derivada de uma seqüênciade nucleotídeo genômico geneticamente ligada a pelo menosum lócus marcador favorável que esteja associado a conteúdode alto teor de óleo ou alto teor de ácido oléico, onde olócus marcador seja selecionado a partir do grupoconsistindo da Id. de Seq. n° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46,e 51 com pelo menos um polimorfismo na mesma. A expressãodo polinucleotídeo heterólogo compreendendo a seqüênciaassociada a alto teor de óleo ou a seqüência associada aalto teor de ácido oléico aumenta o conteúdo de óleo ouconteúdo de ácido oléico na planta ou parte de planta. Emalgumas modalidades, o polinucleotídeo heterólogocompreende pelo menos uma seqüência selecionada a partir dogrupo consistindo das seqüências expostas nas Id. de Seq.n° : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, e 47, ou uma variante oufragmento destas compreendendo pelo menos um dospolimorfismos identificados nestas respectivas seqüências,onde a expressão do polinucleotídeo heterólogo de interesseaumenta o conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico naplanta ou parte de planta.
Em outras modalidades, as plantas compreendem umaconstrução de expressão compreendendo um polinucleotídeocodificando o polipeptídeo de DGAT de óleo normal dainvenção (por exemplo, ZmDGAT12-2(EF09B) , ou uma variantebiologicamente ativa ou fragmento da mesma, ligada de formaoperável a um promotor que é funcional em uma célula deplanta. Esta construção de expressão oferece umasuperexpressão do polipeptídeo DGAT de teor de óleo normal,ou um fragmento ativo ou variante deste. Como o DGAT deteor de óleo normal está envolvido na biossíntese de óleo,a superexpressão desta proteína ou superexpressão de umvariante biologicamente ativa ou fragmento deste em umaplanta ou parte de planta pode levar a um aumento noconteúdo de óleo, conteúdo de ácido oléico e/ou proporçãoácido oléico/ácido linoléico na planta ou parte de planta.Ver, por exemplo, os métodos descritos no Exemplo 11 abaixo.
Em certas modalidades, os polinucleotídeos da presenteinvenção podem ser empilhados em qualquer combinação dasseqüências de polinucleotídeo de interesse a fim de criarplantas com um traço desejado. Um traço, conforme aquiutilizado, refere-se ao fenótipo derivado de uma seqüênciaem particular ou grupos de seqüências. Por exemplo, um oumais nucleotídeos da presente invenção que conferem ofenótipo de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácidooléico, podem ser empilhados com quaisquer outrospolinucleotídeos codificando polipeptídeos possuindoatividade pesticida e/ou inseticida, como outras proteínastóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas nas PatentesU. S. de número 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756;5.593.881; e Geiser e outros (1986) Gene 48:109), lecitinas(Van Damme e outros (1994) Plant Mol. Biol. 24:825),pentina (descrita na Patente U. S. de número 5.981.722) esimilares. As combinações geradas podem também incluirmúltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeo deinteresse. Os polinucleotídeos da presente invenção podemser também empilhados com qualquer outro gene ou combinaçãode genes para produzir plantas com uma variedade decombinações de traços desejados incluindo, mas nãolimitados a, traços desejáveis para farinha para animais,como genes de alto teor de óleo (por exemplo, Patente U. S.de número 6.232.529) ou genes que estejam envolvidos nabiossíntese de óleo, incluindo o DGAT de óleo normal aquidescrito (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B); aminoácidosbalanceados (por exemplo, hordotioninas (Patentes U. S. denúmero 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e 5.703.409); altoteor de lisina em cevada (Williamson e outros (1987) Eur.J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122) e proteínas de altoteor de metionina (Pedersen e outros (1986) J. Biol. Chem.261:6279; Kirihara e outros (1988) Gene 71:359; e Musumurae outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestinilidadeaumentada (por exemplo, proteínas de armazenamentomodificadas (Pedido de Patente U.S. de número de série10/053.410, depositado em 7 de novembro de 2001); etioredoxinas (Pedido de Patente U.S. de número de série10/005.429, depositado em 3 de dezembro de 2001); asdivulgações dos quais estão aqui incorporados porreferência.
Os polinucleotídeos da presente invenção podem sertambém empilhados com traços desejáveis para resistência adoenças e a herbicidas (por exemplo, genes dedesintoxicação de fumonisina (Patente U. S. de número5.792.931); genes de resistência a virulência e doenças(Jones e outros (1994) Science, 266:789; Martin e outros(1993) Science, 262:1432; Martin e outros (1984) Cell78:1089); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que levama resistência a herbicidas como mutações do S4 e/ou Hra;inibidores de glutamina sintase como fosfinotricina oubasta (por exemplo, gene bar); e resistência a glifosato(gene EPSPS)); e traços desejáveis para o processamento ouprocesso de produtos como alto teor de óleo (por exemplo,Patente U. S. de número 6.232.529); óleos modificados (porexemplo, genes de ácido graxo dessaturado (Patente U. S.de número 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (porexemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase), amido sintase(SS), enzimas ramificantes de amido (SBE) e enzimasdesramificantes de amido (SDBE)); e polímeros oubioplásticos (por exemplo, Patente U. S. de número5.602.321; beta-cetotiolase, polihidroxibutirato sintase eacetoacetil-CoA sintase (Schubert e outros (1988) J.Bacteriol. 170:5837-5847) facilitar a expressão depolihidroxialcanoatos (PHAs)); a divulgação das quais estáaqui incorporada por referência. Pode-se ainda combinar ospolinucleotideos da presente invenção com ospolinucleotídeos fornecendo traços agronômicos comoesterilidade de machos (por exemplo, ver Patente U. S. denúmero 5.583.210), resistência de caule, tempo de floração,ou traços de tecnologia de transformação como regulação deciclo celular ou recombinação genética (por exemplo, WO99/61619, WO 00/17364 e WO 99/25821); a divulgação dasquais está aqui incorporada por referência.
Estas combinações empilhadas podem ser criadas porqualquer método, incluindo, mas não limitado a, plantashidribizadas por qualquer metodologia convencional ouTopCross, ou transformação genética. Se as seqüências estãoempilhadas por transformação genética das plantas, asseqüências de polinucleotídeo de interesse podem sercombinadas a qualquer momento e em qualquer ordem. Porexemplo, uma planta transgênica compreendendo um ou maistraços desejado pode ser utilizadas como alvo paraintrodução de traços adicionais por transformaçãosubseqüente. Os traços podem ser introduzidossimultaneamente em um protocolo de co-transformação com ospolinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquercombinação de cassete de transformação. Por exemplo, seduas seqüências serão introduzidas, as duas seqüênciaspodem estar contidas em cassetes de transformação separados(trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação(eis). A expressão destas seqüências pode ser induzida pelomesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certoscasos, pode ser desejável introduzir um cassete detransformação que irá suprimir a expressão de outropolinucleotídeo de interesse. Isto pode ser combinado comqualquer combinação de outros cassetes de supressão oucassetes de superexpressão para gerar a combinação desejadade traços na planta. É adicionalmente reconhecido queseqüências de polinucleotídeo podem ser empilhadas em umalocalização genômica desejada utilizando-se um sistema derecombinação de sítio específico. Ver, por exemplo, WO99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855, e WO99/25853, a totalidades das quais está incorporada por referência.
Em tal modalidade, um ou mais polinucleotídeosassociados a alto teor de óleo e/ou alto teor de ácidooléico da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) da Id. deSeq. n°:47), ou um polinucleotídeo DGAT de teor de óleonormal da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B) da Id. deSeq. n°:51), ou qualquer combinação da mesma, sãoempilhados com um polinucleotídeo heterólogo codificando umativador do tipo transcricional Cotilédone folhoso 1 (LECl)de domínio B ou uma variante biologicamente ativa oufragmento desta, que fornece a modulação adicional do nívelde óleo em uma planta. O ativador transcricional Cotilédonefolhoso 1 (LECl) é um membro da família do ativador detranscrição HAP (proteína ativada por heme) 3, cujosmembros são caracterizados como possuindo três regiões: Osdomínios A, C e C. 0 domínio B central é conservado entreos membros da família e compreende motivo de ligação decaixa CCAAT de ligação de DNA conservado. A Figura 33fornece um alinhamento de seqüência de vários membros dafamília do ativador transcricional HAP3 e marca as posiçõesde domínio A, BeCe ainda mostra a caixa CCAATconservada. Com base na identidade de seqüência e função,os membros da família HAP3 foram divididos em duas classes:membros possuindo o tipo LECl de domínio B e membrospossuindo um tipo não LECl de domínio Β. A superexpressãode um polipeptídeo compreendendo um tipo LECl de domínio Bem uma planta ou parte de planta do mesmo aumenta de formabenéfica a produção de óleo em uma planta ou parte deplanta deste. Ver, por exemplo, a Publicação de Pedido dePatente U.S. de número 20050160494, aqui incorporada porreferência.
Os domínios B de vários membros da família de ativadortranscricional HAP3 estão alinhados na Figura 34. 0 domínioB para o LECl Arabidopsis, do resíduo de aminoácido 28 aoresíduo 117, compartilham entre 55% e 63% de identidade(75% a 85% de similaridade) com outros membros da famíliaHAP3, incluindo milho (HAP3), frango, lampreia, Xenopus,humano, camundongo, Emericella nidulens,Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyees eerevisiae andKluuyveromyces laetis (Lotan e outros (1998) Cell 93: 1193-1205). As seqüências superiores, levemente sombreadas sãomembros representativos do tipo LECl de domínio B, enquantoas seqüências inferiores, fortemente sombreadas, sãorepresentativas dos membros do domínio de tipo não LECl.
Geralmente, o tipo LECl de domínio B compreende 16resíduos conservados que diferem dos resíduos conservadosem posições equivalentes nos domínios B do tipo não LECl(Lee e outros (2003) Proe. Natl. Aead. Sei. USA 100:2152-2156, aqui incorporado por referência em sua totalidade).Estes resíduos residem em um motivo do domínio B do tipoLECl que é representado pela seqüência de consenso expostana Id. de Seq. n° 49. É reconhecido, entretanto, que os 16resíduos conservados expostos na seqüência de consenso paraeste motivo de um domínio B de tipo LECl podem seralterados o polipeptídeo LECl ainda mantém atividade LECl.Ver, por exemplo, Lee e outros, (2003) Proe. Natl. Aead.Sei. USA 100:2152-2156, aqui incorporado por referência emsua totalidade, o qual demonstra alterações específicas emalguns dos resíduos conservados continuam a permitir que opolipeptídeo mantenha a atividade LECl. Descobriu-se que oaminoácido D28 da Id. de Seq. n° 49 desempenha umimportante papel na preservação da atividade LECl. Em umamodalidade, o domínio B de tipo LECl compreende o domínio Bde tipo LECl exposto nos resíduos 36 a 126 da Id. de Seq.n° 51, que expõe o polipeptídeo LECl de milho. 0 domínio Bdo tipo LECl do polipeptídeo LECl do milho é codificadopelos nucleotídeos 106 a 378 da Id. de Seq. n° 50, queexpõe a seqüência de codificação para o polipeptídeo LECldo milho. Vários polinucleotídeo e polipeptídeo possuindodomínio B do tipo LECl são expostos nas Publicações dosPedidos de Patente U. S. de número 20030126638 e20030204870, as quais estão aqui incorporadas porreferência em sua totalidade.
Conforme descrito em detalhes em outro local deste,variantes biologicamente ativas e fragmentos do domínio Bde tipo LECl podem ser também empregados nos métodos dainvenção direcionados ao empilhamento de um ou mais dospolinucleotídeos associados ao alto teor de óleo/alto teorde ácido oléico da presente invenção, um polinucleotídeoDGAT de teor de óleo normal da invenção, ou qualquercombinação destes, com um polinucleotídeo heterólogocodificando um domínio B do tipo LECl, assim conferindo umfenótipo de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácidooléico e/ou proporção aumentada de ácido oléico/ácidolinoléico em uma planta ou parte de planta deste. Taisvariantes e fragmentos são conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, a Figura 34 e também Lee e outros, (2003) PNAS2152-2156 e Publicação de Pedido de Patente U. S. de número20050034193.
Fragmentos biologicamente ativos e variantes de umdomínio B do tipo LECl continuarão a sustentar atividadeLECl quando o domínio for colocado no contexto de umdomínio funcional A e/ou funcional C de um ativadortranscricional HAP3. Conforme aqui utilizado, "atividadeLEC1" é definida como a capacidade de um polipeptídeo emmelhorar a síntese de lipídios como refletido em produçãode óleo aumentada.
Em uma modalidade, o polinucleotídeo ou polipeptídeoLECl empregado na invenção compreende o polinucleotídeo epolipeptídeo exposto na Id. de Seq. n° 50 e Id. de Seq. n°51, respectivamente. Conforme descrito em detalhes emoutro local deste, variantes biologicamente ativas efragmentos do polinucleotídeo e polipeptídeos LECl podemtambém ser empregadas nos métodos da invenção. Taisvariantes e fragmentos são conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, as Figuras 33 e 34 e também Lee e outros, (2003)PNAS 2152-2156; Kwong e outros, (2003) The Plant Cell 15:5-18; Publicação de Pedido de Patente U. S. de número20030126638; WO 02/57439, Patente U. S. de número6.825.3 97; Patente U. S. de número 6.781.035; Publicação dePedido de Patente U. S. de número 20050034193; e WO98/37184.
Conforme aqui utilizado, um "ativador transcricionalHAP3" compreende um membro da família HAP3. Esta família deativadores transcricionais é estruturalmente bemcaracterizada. Ver Li e outros, (1992) Nucleic AcidResearch 20:1087-1091; Xing e outros, (1993) EMBO J.12:4647-4655; Kim e outros (1996) Mol Cell Biol. 16:4003-4013; Sinha e outros (1996) Mol Cell Biol 16:328-331; e,Lotan e outros (1998) Cell 93:1195-1205, cada um dos quaisestá aqui incorporado por referência. Nos métodos ecomposições da invenção, o ativador transcricional HAP3compreende um domínio B do tipo LECl. Conseqüentemente, umativador transcricional HAP3 empregado na presente invençãopode compreender um polipeptídeo quimérico possuindo umdomínio funcional A e/ou funcional B do ativadortranscricional HAP3 o que, em sua forma nativa, pode ou nãopossuir um domínio B do tipo LECl. Ver, por exemplo, Lee eoutros, (2003) PNAS 2152-2156.
EM uma modalidade, um polinucleotídeo heterólogocodificando uma variante de alto teor de óleo/alto teor deácido oléico de DGAT, por exemplo, o polipeptídeo ZmDAGTl-2(ASK) ou variante ou fragmento biologicamente ativo domesmo conferindo o fenótipo de alto teor de óleo/alto teorde ácido oléico é empilhado com um polinucleotídeoheterólogo codificando um polipeptídeo compreendendo umdomínio B do tipo LECl possuindo uma seqüência deaminoácido exposta na Id. de Seq. n° 65 ou uma variantebiologicamente ativa ou fragmento da Id. de Seq. n° 65,onde a variante biologicamente ativa compreende pelo menos80% de identidade de seqüência com Id. de Seq. n° 65, ondeo polipeptídeo ou a variante biologicamente ativa oufragmento do mesmo possui atividade LECl. Em algumasmodalidades, o polinucleotídeo heterólogo codificando avariante de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico deDGAT compreende a seqüência de polinucleotídeo exposta naId. de Seq. n° 4 7 ou variante ou fragmento desta e opolinucleotídeo codificando o domínio B do tipo LEClcompreende a seqüência de polinucleotídeo exposta na Id. deSeq. n° 66 ou uma variante ou fragmento desta.
Em ainda outra modalidade, um polinucleotídeoheterólogo codificando um DGAT de teor de óleo normal, porexemplo, o polipeptídeo ZmDAGTl-2(EF09B) ou variante oufragmento biologicamente ativo do mesmo capaz de aumentar oconteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico quandosuperexpresso em uma planta ou parte de planta deste, éempilhado com um polinucleotídeo heterólogo codificando umpolipeptídeo compreendendo um domínio B do tipo LEClpossuindo uma seqüência de aminoácido exposta na Id. deSeq. n° 65 ou uma variante biologicamente ativa oufragmento da Id. de Seq. n° 65, onde a variantebiologicamente ativa compreende pelo menos 8 0% deidentidade de seqüência com Id. de Seq. n° 65, onde opolipeptídeo ou a variante biologicamente ativa oufragmento do mesmo possui atividade LECl. Em algumasmodalidades, o polinucleotídeo heterólogo codificando oDGAT de teor de óleo normal compreende compreende aseqüência de polinucleotídeo exposta na Id. de Seq. n° 51ou variante ou fragmento desta e o polinucleotídeocodificando o domínio B do tipo LECl compreende a seqüênciade polinucleotídeo exposta na Id. de Seq. n° 66 ou umavariante ou fragmento desta.
É reconhecido que onde um ou mais polinucleotídeos dainvenção são empilhados com um polinucleotídeo heterólogocodificando um polipeptídeo compreendendo um domínio B dotipo LECl, estas seqüências podem ser também empilhadas comum ou mais polinucleotídeos que proporcionem a inibição deexpressão ou função de um produto de gene que estáenvolvido em biossíntese de amido, desta forma melhorandoadicionalmente a produção de óleo e alterações na qualidadedo óleo. Desta maneira, uma redução na síntese de amidopode ser atingida através de expressão reduzida de genesque codificam proteínas que normalmente servem comoproteínas de nucleação de amido, catalisadores enzimáticosou assimilam transportadores envolvidos na biossíntese deamido. Qualquer um dos mecanismos conhecidos na técnicapara efetuar a inibição de expressão genética pode serutilizado para interferir de maneira ideal com os genes debiossíntese de amido incluindo, mas não limitado a, genescodificando sacarose sintase, hexocinase(s),fosfoglucomutase, fosfoglucoisomerase, ADP-glucosepirofosforilase (AGP), amilogenina (um iniciador deproteína da biogênese de amido), amido sintase solúvel eligada e enzimas de ramificação de amido, enzimas dedesramificação de amido, enzimas de isoamilase, amidofosforilases e a proteína de transporte Brittle-I. Ver,por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente U.S. denúmero 20050160494, intitulada "Alteration of Oil Traits inPlants", aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Em outras modalidades, um ou mais nucleotídeosassociados a alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico dainvenção, ou um polinucleotídeo DGAT de teor de óleo normalda invenção (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B) da Id. de Seq.n° 51) , ou qualquer combinação destes, são empilhados comum polinucleotídeo heterólogo que possibilita a alteraçãoda qualidade do teor de óleo aumentado produzido na plantaalterando a expressão ou funcionamento das proteínas ouenzimas que estão envolvidas em modificação lipídica.Exemplos de proteínas e enzimas que modificam ascaracterísticas do óleo no interior das plantas incluem,mas não estão limitados a, qualquer um dos dessaturados deácido graxo, por exemplo, proteína transportadora deestearoil-acil dessaturase (Fadl; ver Patente U. S. denúmero 6.117.677), delta-15 dessaturase (omage-3) (Fad3;ver Shah e outros, (1997) Plant Physiol. 114:1533-1539),delta-4 (trans) dessaturase (Fad4; Xiao e outros, (2001) J.Biol. Chem. 276:31561-31566), delta-7 dessaturase (Fad5;ver Patente U. S. de número 6.635.451), ácido graxo omega-6dessaturase (Fad6; ver Patente U. S. de número 6.635.451),ácido graxo Omega-3 dessaturase (Fad7; Iba e outros, (1993)Biol. Chem. 268:24099-24105), delta-5 dessaturase (verPatente U. S. de número 6.589.767), delta-9 dessaturase(ver Patente U. S. de número 5.723.595), acil-CoAgraxo:álcool graxo aciltransferase (cera sintase; verPatente U. S. de número 6.492.509), beta-cetoacetil-ACPsintase em uma orientação de senso ou antisenso (verPatente U. S. de número 6.483.008), e ácido graxo delta-12dessaturase (FAD2), uma enzima que converte ácido oléico emácido linoléico introduzindo uma ligação dupla na posiçãodelta-12 (Okuley e outros, (1994) Plant Cell 6:147-58).
Exemplos de FAD 2 e seqüências de codificaçãocorrespondentes são bem conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, Acessão GenBank de número NM_11204 7; AcessãoGenBank de número AF243045; Patente Européia de número EPEP0668919 BI; Patente U. S. de número 6.291.742; Patente U.S. de número 6.310.194; Patente U. S. de número 6.323.392;Patente U. S. de número 6.372.965; Publicação de Pedido dePatente U. S. de número 20030033633; e Publicação de Pedidode Patente U. S. de número 20030140372; todas as quaisestão aqui incorporadas em sua totalidade por referência.
Foram identificadas proteínas FAD 2 em milho. Uma destasproteínas FAD2 é denominada ZmFAD2-l (seqüência denucleotídeo exposta em Id. de Seq. n° 131, seqüência deaminoácido exposta na Id. de Seq. n° 132) e a outra édenominada ZmFAD2-2 (Kinney e outros, (2001) Biochem. Soe.Trans. 30:1099-1103; e Mikkilineni e outros, (2003) Theor.Appl. Genet. 106:1326-1332). A supressão ou remoção deambos os genes aumenta a concentração de ácido oléicorelativa em 75%.
Assim, ao interferir com a atividade de ácido graxodessaturase, por exemplo, inibindo a expressão oufuncionamento de FAD2, a conversão de ácido oléico em ácidolinoléico pode ser evitada e, assim, o ácido oléico seacumula na planta ou parte de planta deste como sementes,incluindo embriões de semente.
Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeosassociados a alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico dainvenção, ou um polinucleotídeo DGAT de teor de óleo normalda invenção (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B) da Id. de Seq.n° 51) , ou qualquer combinação destes, são empilhados em umfundo de germeplasma de planta que possui um alelofavorável para FAD2 que normalmente confere um fenótipo dealto teor de [ácido oléico àquela planta. Por "fenótipo dealto teor de ácido oléico" no contexto de um alelofavorável para FAD2, se intenciona que a planta ou parte deplanta desta, por exemplo, a semente ou embrião, possua umaconcentração de ácido oléico de cerca de 3 0% ou superior.Assim, por exemplo, em milho, linhas convencionais que nãopossuem um alelo FAD2 favorável possuem uma concentração deácido oléico em semente ou embrião de cerca de 25% oumenos. Ver, por exemplo, a concentração de ácido oléico emembrião da linha consangüínea de milho de teor de óleonormal, EFO9B, na Figura 4. Tal empilhamento pode serconseguido introduzindo-se os polinucleotídeos associados aalto teor de óleo / alto teor de ácido oléico da invenção(por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47) , ou opolinucleotídeo- DGAT de teor de óleo normal da invenção(por exemplo, ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51) ouqualquer combinação destes, neste fundo de germeplasmafavorável, ou através de métodos de transformação ouatravés de métodos de reprodução conhecidos na técnica edescritos aqui em outro local. Ver, por exemplo, os métodosdescritos no Exemplo 14 aqui abaixo.
Em outras modalidades, um ou mais polinucleotídeosassociados a alto teor de óleo e/ou alto teor de ácidooléico da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) da Id. deSeq. n° : 47) , ou um polinucleotídeo DGAT de teor de óleonormal da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B) da Id. deSeq. n°:51), ou qualquer combinação da mesma, sãoempilhados com um polinucleotídeo heterólogo que compreendeuma seqüência inibidora de FAD2 projetada para silenciar aexpressão de um FAD2. Métodos para silenciar a expressão deFAD2 são descritos na Publicação do Pedido de Patente U. S.de número 20050160494 e WO 2005/063988, aqui incorporadaspor referência em sua totalidade. Suprimindo-se a expressãoou função de um FAD2, aumentos adicionais do conteúdo deácido oléico e/ou da proporção de ácido oléico / ácidolinoléico podem ser alcançados além daqueles conferidospela expressão dos polinucleotídeos associados a alto teorde óleo / alto teor de ácido oléico da invenção, ousuperexpressão do polinucleotídeo DGAT de teor de óleonormal da invenção.
Uma "seqüência inibidora de FAD2" refere-se a umaseqüência inibidora que é capaz de inibir a expressão de umFAD 2 (por exemplo, uma seqüência inibidora de FAD2objetivando ZmFAD2-l), no nível de transcrição e/outradução, ou que seja capaz de inibir a função de um FAD2.
Quando a frase "capaz de inibir" é utilizada no contexto deuma seqüência inibidora de polinucleotideo, pretende-sesignificar que a seqüência inibidora em si exerce o efeitoinibidor; ou, onde a seqüência inibidora codifica umamolécula de nucleotídeo inibidora (por exemplo, um RNA"grampo de cabelo", miRNA, ou polinucleotideos de RNA defilamento duplo), ou codifica um polipeptídeo inibidor(isto é, um polipeptídeo que inibe a expressão ou função doproduto de gene alvo), após sua transcrição (por exemplo,no cado de uma seqüência inibidora codificando um RNA"grampo de cabelo", miRNA u polinucleotideo de RNA defilamento duplo) ou sua transcrição e tradução (no caso deuma seqüência inibidora codificando um polipeptídeoinibidor), o produto transcrito ou traduzido,respectivamente, exerce o efeito inibidor no produto degene alvo (isto é, inibe a expressão ou função do produtode gene alvo).
Qualquer seqüência de nucleotídeo codificando um FAD2conhecido na técnica pode ser utilizado nos métodos dainvenção que utilize uma abordagem transgênica paraempilhar os polinucleotideos associados ao alto teor deóleo e/ou alto teor de ácido oléico da invenção, ou oDGATl-2 de teor normal de óleo da invenção, ou qualquercombinação destes, com um polinucleotideo heterólogo queseja projetado para inibir a expressão ou função de umFAD2. Em algumas modalidades, o polinucleotideo heterólogocompreende uma seqüência de nucleotídeo FAD2, como ZmFAD2-l(Id. de Seq. n° 131) , uma seqüência de nucleotídeocodificando ZmFAD2-l da Id. de Seq. n° 132, uma seqüênciade nucleotídeo ZmFAD2-2, combinações de ambas, ousimilares. Ver, por exemplo, as seqüências divulgadas emMikkilineni e outros, (2003) Theor. Appl. Genet. 106:1326-1332. Em algumas modalidades, a seqüência de FAD2 éselecionada entre, mas não limitada a, aquelas divulgadasna Acessão GenBank de número NM_112047, Acessão GenBank denúmero AF243 04 5, Patente U. S. de número 6.323.392, PatenteU. S. de número 6.372.965, Publicação do Pedido de PatenteU. S. de número 20030033633, e Publicação do Pedido dePatente U. S. de número 20030140372, todas as quais estãoaqui incorporadas em sua totalidade por referência. Emoutras modalidades, o polinucleotídeo heterólogo compreenderegiões truncadas da seqüência do nucleotídeo ZmFAD2, porexemplo, ZmFAD2-l da Id. de Seq. n° 131, na orientaçãosenso e orientação antisenso; ver, por exemplo, Id. de Seq.n° 133.
Por exemplo, em algumas modalidades, o polinucleotídeoheterólogo compreende uma seqüência inibidora de FAD2 que éexpressa na orientação senso. Em algumas modalidades, astranscrições em orientação senso provocam co-supressão. Emoutras modalidades, a expressão de orientação senso detranscrições de FAD2 trincadas provocam proteínas nãofuncionais a serem expressas e desta forma inibem aatividade FAD2. Alternativamente, a seqüência ou seqüênciasinibidora(s) de FAD2 podem ser expressas na orientaçãoantisenso e desta forma inibir a expressão ou atividade deFAD2 endógeno por mecanismos antisenso.
Ainda em outras modalidades, a seqüência ou seqüênciasinibidora(s) no polinucleotídeo heterólogo são expressascomo RNA "grampo de cabelo", que possui tanto componente deseqüência senso quanto antisenso. Em modalidadescompreendendo uma estrutura de "grampo de cabelo", aestrutura de laço pode compreender qualquer seqüência denucleotídeo adequada, incluindo, por exemplo, regiões não traduzidas 5' do gene a ser suprimido, como o 5' UTR deFAD2, seqüências de nucleotídeo de íntron de álcooldesidrogenase (adhl), nucleotídeos aleatórios, espaçadoresde polinucleotídeo e similares (ver também Baileu-Serres eDawe (1996) Plant Physiol. 112:685). Em algumas modalidades, a seqüência ou seqüências inibidora(s) de FAD2ou expressas como um "grampo de cabelo" são codificadas poruma região invertida de seqüências de nucleotídeocodificando FAD2, como a seqüência de nucleotídeo ZmFAD2-l(Id. de Seq. n° 131), a seqüência de nucleotídeo ZmFAD2-2,ou uma combinação destas. Ainda em outras modalidades, asseqüências inibidoras são expressas como RNA de duplofilamento, onde uma seqüência de FAD2 inibidora é expressana orientação senso e outra seqüência complementar éexpressa na orientação antisenso. Ver, por exemplo, aseqüência de polinucleotídeo inibidora de FAD2 exposta naId. de Seq. n° 133. RNA de duplo filamento, estruturas de"grampo de cabelo" e combinações destas compreendendoseqüências FAD2 podem operar por interferência de RNA, co-supressão, mecanismo de antisenso e combinação destes, oupor meio de outro mecanismo que provoque a inibição daexpressão ou função de FAD2.
Em outras modalidades, um ou mais polinucleotídeosassociados a alto teor de óleo e/ou alto teor de ácidooléico da invenção são empilhados com um polinucleotídeoheterólogo codificando um polipeptídeo envolvido naalteração de traços de óleo em plantas, onde o polipeptídeoé aquele divulgado na Publicação de Pedido de Patente U. S.de número 20030204870, intitulado nAlteration of Oil Traitsin Plants", aqui incorporada por referência em suatotalidade. Em tal modalidade, o polinucleotideo codificaum aintegumenta tipo 2 CKC (Id. de Seq. n° 320 daPublicação de Pedido de Patente U. S. de número20030204870, codificando a seqüência da Id. de Seq. n° 319desta publicação de pedido de patente), que fornece a modulação adicional do nível de óleo em uma planta.
Em outras modalidades da invenção, um ou maispolinucleotídeos associados ao alto teor de óleo e/ou altoteor de ácido oléico da invenção são empilhados com umabase genética "TUSC2 7". As plantas compreendendo a base genética TUSC27 compreendem um alelo de inserção TUSC Muhereditário no gene gama-zein 2 7 kD que contribui paramelhorar a qualidade do grão, particularmente capacidade dedigestão melhorada do grão. Ver, por exemplo, a Publicaçãodo Pedido de Patente U.S. de número 20050204418, intituladanGrain Quality through Altered Expression of SeedProteins", aqui incorporada por referência em suatotalidade.
III. Métodos:
(A) Modulação do nível de uma Seqüência da Invenção
A introdução e expressão de um ou mais dospolinucleotídeos associados a alto teor de óleo e/ou altoteor de ácido oléico da invenção, ou um polinucleotideoDGAT de teor de óleo normal da invenção, em uma plantapermite um aumento no nível da seqüência de polinucleotideorespectiva de interesse, e onde a seqüência compreendeseqüência de codificação, permite um aumento no nível dopolipeptídeo codificado, por exemplo, uma variante de DGATcom alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGATde teor normal de óleo, um AAPl, um PESP, uma proteína S24ribossômica 4OS, e/ou uma proteína de transporte ABC. Um"nível modulado" ou "nível de modulação" de umpolinucleotídeo ou um polipeptídeo no contexto dos métodosda presente invenção refere-se a qualquer aumento naexpressão, concentração e/ou atividade de um produto degene (isto é, polipeptídeo ou polinucleotídeo), incluindoqualquer incremento relativo na expressão, concentraçãoe/ou atividade. O termo "expressão" conforme aqui utilizadono contexto de um produto de gene, refere-se À biossíntesedaquele produto incluindo a transcrição e tradução doproduto de gene. Em geral, o nível do polipeptídeo oupolinucleotídeo é aumentado em pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%,30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 120%, ou mais em relaçãoà planta, parte de planta ou célula de controle nativa. Amodulação na presente invenção pode ocorrer durante e/ousubseqüente ao desenvolvimento da planta ao estágiodesejado de desenvolvimento. Em modalidades específicas, ospolinucleotídeos ou os polipeptídeos da presente invençãosão modulados em monocotilédones, particularmente milho.
O nível de expressão de uma variante de DGAT de altoteor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGAT de teornormal de óleo, um AAPl, um PESP, uma proteína S24ribossômica 4 OS e/ou uma proteína transportadora ABC dopolipeptídeo da invenção pode ser medido diretamente, porexemplo, realizando-se um ensaio para o nível dopolipeptídeo respectivo na planta, ou indiretamente, porexemplo, medindo-se a atividade do respectivo polipeptídeona planta. Métodos para determinar se a expressão de umavariante de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácidooléico, um AAPl, um PESP, uma proteína S24 ribossômica 4OS,e/ou uma proteína de transporte ABC ou variantebiologicamente ativa ou fragmento desta, confere aofenótipo de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácidooléico e/ou ácido oléico/ácido linoléico aumentados em umaplanta ou parte de planta deste são conhecidos na técnica esão descritos em outro local deste. De forma similar,métodos para determinar se a superexpressão de um DGAT deteor normal de óleo da invenção, ou variante biologicamenteativa ou fragmento desta, são bem conhecidos na técnica esão descritos em outro local deste.
Em modalidades específicas, o polipeptídeo ou opolinucleotídeo da invenção é introduzido na célulavegetal. Subseqüentemente, uma célula vegetal possuindo aseqüência da invenção introduzida é selecionada utilizando-se métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica como,mas não limitado a, análise de Southern blot,sequenciamento de DNA, análise de PCR ou análisefenotípica. Uma planta ou parte de planta alterada oumodificada pelas modalidades precedentes é desenvolvida sobcondições formação de planta por um período suficiente para modular a concentração e/ou a composição de polipeptídeosda presente invenção na planta. As condições de formação deplanta são bem conhecidas na técnica e discutidas de formabreve em outro local deste.
É também reconhecido que o nível e/ou atividade dopolipeptídeo pode ser modulado empregado-se umpolinucleotídeo que não seja capaz de direcionar, em umaplanta transformada, a expressão de uma proteína ou um RNA.Por exemplo, os polinucleotídeos da invenção podem serutilizados para projetar construções de polinucleotídeo quepossam ser empregadas em métodos para alterar ou causarmutação em uma seqüência de nucleotídeo genômico em umorganismo. Algumas construções de polinucleotídeos incluem,mas não estão limitadas a, vetores RNA:DNA, vetoresmutacionais RNA:DNA, vetores de reparo RNA:DNA,oligonucleotídeos duplos misturados, oligonucleotídeos deRNA:DNA autocomplementar, e oligonucleobasesrecombinogênicas. Tais construções de nucleotídeo emétodos para utilização são conhecidos na técnica. Ver,Patentes U. S. de número 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325;5.760.012; 5.795.972; e 5.871.984; todas as quais estãoaqui incorporadas por referência. Ver também, WO 98/49350,WO 99/07865, WO 99/25821 e Beetham e outros (1999) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 96:8774-8778, aqui incorporadas parareferência.
É desta forma reconhecido que os métodos da presenteinvenção não dependem da incorporação do polinucleotídeocompleto dentro do genoma, apenas que a planta ou céluladesta seja alterada como um resultado da introdução dopolinucleotídeo em uma célula. Em uma modalidade dainvenção, o genoma pode ser alterado seguindo a introduçãodo polinucleotídeo em uma célula. Por exemplo, opolinucleotídeo, ou qualquer parte deste, pode incorporar-se ao genoma da planta. Alterações ao genoma da presenteinvenção incluem, mas não estão limitadas a adições,exclusões, e substituições de nucleotídeos no genoma.Embora os métodos da presente invenção não dependam deadições, exclusões e de substituições de qualquer númeroparticular de nucleotídeos, é reconhecido que tais adições,exclusões, ou substituições compreendem pelo menos umnucleotideo.
Em uma modalidade, a atividade e/ou nível de umavariante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácidooléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAPl, um PESP,uma proteína S24 ribossômica 4OS e/ou uma proteínatransportadora ABC da invenção é aumentada(o). Um aumentono nível e/ou atividade do respectivo polipeptídeo dainvenção pode ser alcançado fornecendo-se à planta umavariante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácidooléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAPl, um PESP,uma proteína S24 ribossômica 4 OS e/ou uma proteínatransportadora ABC. Conforme discutido aqui em outro local,muitos métodos são conhecidos na técnica para fornecer umpolipeptídeo a uma planta incluindo, mas não limitado aintrodução direta do polipeptídeo na planta, e introduçãona planta (de modo provisório ou de forma estável) de umaconstrução de polinucleotídeo codificando o respectivopolipeptídeo. É também reconhecido que os métodos dainvenção podem empregar um polinucleotídeo que não é capazde controlar, na planta transformada, a expressão de umaproteína ou um RNA. Assim, o nível e/ou atividade de umavariante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácidooléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAPl, um PESP,uma proteína S24 ribossômica 4OS e/ou uma proteínatransportadora ABC pode ser aumentado alterando-se acodificação genética do respectivo polipeptídeo ou seupromotor. Ver, por exemplo, Kmiec, Patente U. S. de número5.565.350; Zarling e outros, PCT/US93/03868.
Conseqüentemente, plantas mutagenizadas que carreguemmutações no gene codificando uma variante de DGAT de altoteor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGAT de teornormal de óleo, um AAPl, um PESP, uma proteína S24ribossômica 4OS e/ou uma proteína transportadora ABC, ondeas mutações que aumentam a expressão do respectivo gene ouaumentam a atividade da variante de DGAT de alto teor deóleo / alto teor de ácido oléico codificada, DGAT de teornormal de óleo, AAPl, PESP, proteína S24 ribossômica 40Se/ou uma proteína transportadora ABC são fornecidas.
Uma "planta ou célula vegetal de interesse" é aquelana qual uma alteração genética, como transformação, foiefetuada enquanto um gene de interesse, ou é uma planta oucélula vegetal que é descendente de uma planta ou céluladesta forma alterada e que compreende a alteração. Um"controle" ou "planta de controle" ou "célula vegetal decontrole" fornece um ponto de referência para mediralterações no fenótipo da planta ou célula de planta deinteresse.
Uma planta ou célula vegetal de controle podecompreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula do tiposelvagem, isto é, do mesmo genótipo que o material inicialpara a alteração genética que resultou na planta ou célulade interesse; (b) uma planta ou célula vegetal do mesmogenótipo que o material inicial mas que foi transformadacom uma construção nula (isto é, com uma construção que nãopossui efeito conhecido no traço de interesse, como umaconstrução compreendendo um gene marcador); (c) uma plantaou célula vegetal que é um segregante não transformado emmeio à progenia de uma planta ou célula vegetal deinteresse; (d) uma planta ou célula vegetal geneticamenteidêntica à planta ou célula vegetal de interesse mas quenão está exposta às condições ou estímulos que induziriam aexpressão do gene de interesse; ou (e) a planta ou célulavegetal em si, sob condições nas quais o gene de interessenão é expressado.
0 nível de expressão de um polipeptídeo e/ou um RNApode ser medido diretamente, por exemplo, realizando-se umensaio quanto ao nível do polipeptídeo ou do RNA na planta,ou indiretamente, por exemplo, medindo-se a atividade dopolipeptídeo ou do RNA na planta.
Em modalidades específicas, o polinucleotídeorecombinante da invenção é introduzido na célula vegetal.
Subseqüentemente, uma célula vegetal possuindo a seqüênciada invenção introduzida é selecionada utilizando-se métodosconhecidos àqueles habilitados na técnica como, mas nãolimitado a, análise de Southern blot, sequenciamento deDNA, análise de PCR ou análise fenotípica. Uma planta ouparte de planta alterada ou modificada pelas modalidadesprecedentes é desenvolvida sob condições de formação deplanta por um período suficiente para modular aconcentração e/ou a composição de polipeptídeos da presenteinvenção na planta. As condições de formação de planta sãobem conhecidas na técnica e discutidas de forma breve emoutro local deste.
(B) Modulando Conteúdo de Óleo e/ou Conteúdo de ÁcidoOléico de uma Planta ou Parte de Planta
Os métodos da invenção também fornecem modulação do137/204
conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ouproporção de ácido oléico/acido linoléico de uma planta ouparte da mesma planta. Desta maneira, uma ou maisseqüências associadas a alto teor de óleo e/ou alto teor deácido oléico geneticamente ligadas a uma região QTL6 que éflanqueada por uma primeira seqüência de borda quecompreende nucleotídeos 1 a 20 da Id. de Seq. n° 2 desta euma segunda seqüência de borda que compreende osnucleotídeos 477 a 496 da Id. de Seq. n° 46 desta, ou umaregião QTL6 que seja flanqueada por uma primeira seq deborda que compreende nucleotídeos 1 a 2 0 da Id. de Seq. n°6 desta e uma segunda seqüência de borda que compreendenucleotídeos 482 a 501 da Id. de Seq. n° 14 desta, ou umaregião QTL6 que esteja flanqueada por uma primeiraseqüência de borda que compreenda nucleotídeos de 1 a 20 daId. de Seq. n° 10 desta e uma segunda seqüência de bordaque compreenda nucleotídeos 488 a 507 da Id. de Seq. n° 4desta podem ser introduzidas em uma planta ou parte destaplanta para conferir o fenótipo de alto teor de óleo e/oualto teor de ácido oléico e/ou proporção entre ácidooléico/ácido linoléico aumentada na planta ou parte destaplanta. Assim, em algumas modalidades, um ou mais dos Iocimarcadores favoráveis identificados aqui são introduzidosna planta ou parte desta planta por métodos bem conhecidosna técnica, incluindo os métodos de transformação ereprodução discutidos aqui acima. Em algumas modalidades,Ioci marcadores favorável compreende as seqüências expostasnas Id. de Seq. n° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, e 51 compelo menos um polimorfismo contido nestas. Exemplos depolimorfismos específicos em cada locus marcador favorávelna região QTL6 são identificados na Tabela 2 (locimarcadores não codificante) e Tabela 3 (loci marcadorescompreendendo seqüência de codificação) no Exemplo 2 e 4abaixo. Exemplos não limitantes de seqüências de Iocimarcadores favoráveis da invenção são expostos nas Id. deSeq. n° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, e 47, e os respectivospolimorfismos ocorrendo nestes Ioci marcadores favoráveissão mostrados nas Tabelas 2 e 3 abaixo. Ver também osalinhamentos mostrados nas Figuras 7 a 29 e 31. Aintrodução de um ou mais destas seqüências associadas aalto teor de óleo e/ou associadas a alto teor de ácidooléico em uma planta ou parte desta planta podem conferir ofenótipo desejado de alto conteúdo de óleo e/ou altoconteúdo de ácido oléico e/ou proporção aumentada de ácidooléico/ácido linoléico.
Em outras modalidades, os métodos da invenção fornecemmodulação do conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléicoe/ou proporção de ácido oléico/acido linoléico em umaplanta ou parte da mesma planta por superexpressão de umDGAT de teor normal de óleo da presente invenção. Destamaneira, um cassete de expressão compreendendo umpolinucleotídeo codificando um polipeptídeo DGAT de teornormal de óleo da invenção, por exemplo, o polinucleotídeoZmDGATl - 2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51, codificando oZmDGATl - 2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 52, para fornecersuperexpressão deste polipeptídeo, assim aumentando oconteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ouproporção de ácido oléico/acido linoléico em uma planta ouparte da mesma planta. Assim, em algumas modalidades, umcassete de expressão compreendendo a Id. de Seq. n° 51 ouum polinucleotídeo codificando a Id. de Seq. n° 52 ou umavariante ou fragmento biologicamente ativo destepolipeptídeo é introduzido na planta ou parte desta plantapor métodos bem conhecidos na técnica, incluindo os métodosde transformação e reprodução discutidos acima.
Em modalidades específicas, as plantas e partes destasplantas da invenção possuindo o conteúdo de óleo aumentadoencontram uso na indústria de moagem em úmido. No processode moagem em úmido, o propósito é fracionar o cerne eisolar os constituintes químicos de valor econômico em suaspartes componentes. 0 processo permite o fracionamento deamido em forma altamente purificada, assim como oisolamento em formas cruas de outros materiais incluindo,por exemplo, óleo não refinado, ou como uma ampla misturade materiais que comumente recebem pouco ou nenhumprocessamento adicional além da secagem. Portanto, noprocesso de moagem em úmido o grão é amaciado porimpregnação e quebrado por trituração para liberar o germedos cernes. 0 germe é separado da mistura de densidade maispesada de amido, cascas e fibra por "flutuação" dossegmentos de germe livres das outras substâncias em umprocesso de centrifugação. Isto permite uma separação limpada fração do grão que contém o óleo dos fragmentos detecido que contêm a maioria do amido. Uma vez que não éeconômico extrair o óleo em uma escala pequena, muitasinstalações de moagem em úmido enviam seu germe ainstalações de produção de óleo centralizadas grandes. 0óleo é expelido ou extraído com solventes dos germes secose a farinha de germe restante é normalmente misturada afarinha de glúten de milho (CGF), um co-produto da moagemem úmido. Desta forma, o amido contido no germe não érecuperado como tal no processo de moagem em úmido e écanalizado para CGF. Ver, por exemplo, Anderson e outros,(1982) "The Corn Milling Indus try"; CRC Handbook ofProcessing and Utilization in Agriculture, A. Wolff, BocaRaton, FL, CRC Press., Inc., Vol. 11, Parte 1, PlantProducts: 31-61 e Eckhoff (24-26 de junho de 1992)Proceedings of the 4th Corn Utilization Conference, St.Louis, MO, impresso pela National Corn Growers Association,CIBA-GEIGY Seed Division e USDA, ambas as quais estão aquiincorporadas por referência.
(C) Métodos para Melhorar a Qualidade da Alimentação
São fornecidos métodos para melhorar a qualidade dotecido de um animal alimentando-se um animal com uma dietacompreendendo uma planta ou parte de uma planta da presenteinvenção que possua um conteúdo de óleo aumentado e/ouconteúdo de ácido oléico aumentado. Tais métodoscompreendem alimentar o animal com uma dieta compreendendoquantidade suficiente de um grão ou óleo da invenção quecompreende o conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo deácido oléico aumentado.
O alimento empregado na dieta pode compreender cercade 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%do grão da invenção (isto é, um grão compreendendo umavariante de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléicode DGAT, o grão compreendendo um cassete de expressão quepossibilita a superexpressão de um DGAT de teor normal deóleo aqui divulgado, combinações destes e similares). Emoutras modalidades, o alimento empregado na dieta podecompreender cerca de 1% a cerca de 15%, cerca de 10% acerca de 25%, cerca 20% a cerca de 35%, cerca de 30% acerca de 45%, cerca de 40% a cerca de 55%, cerca de 50% acerca de 65%, cerca de 60% a cerca de 75%, cerca de 70% acerca de 85%, cerca de 80% a cerca de 95% ou cerca de 90% a100% do grão de invenção.
A qualidade do tecido de qualquer animal pode sermelhorada. Animais de interesse incluem, mas não estãolimitados a animais ruminantes, incluindo, mas nãolimitados a gado bovino, búfalos ou carneiros, assim comoanimais não ruminantes incluindo, mas não limitados asuínos, aves (isto é, galinhas, galinhas poedeiras, peru,avestruzes e emas) ou peixes.
Na modalidade específica, a planta, parte de planta,semente, grão ou óleo é um constituinte de alimentaçãoanimal ou um produto alimentício. Plantas ou partes destasda presente invenção podem ser utilizadas em métodos, porexemplo, sem limitação, para se obter uma semente, farinha,matéria-prima ou óleo. Plantas utilizadas em tais métodospodem ser processadas. Assim sendo, a presente invençãofornece uma semente, grão, alimento e/ou óleo que sãoproduzidos a partir de uma planta ou parte de plantapossuindo um conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo deácido oléico aumentado e/ou proporção entre ácidooléico/ácido linoléico aumentada conforme aqui descrito.Métodos para produção de preparações de alimento, farinha,proteína e óleo a partir de várias partes de plantas sãobem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patentes U. S.de número 4.957.748, 5.100.679, 5.219.596, 5.936.069,6.005.076, 6.146.669 e 6.156.227. É fornecida ainda umacarne produzida a partir de animais sendo alimentados com aplanta, parte de planta, grão e/ou óleo possuindo umconteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléicoaumentado e/ou proporção entre ácido oléico/ácido linoléicoaumentada conforme aqui descrito em outro local.
(D) Métodos para utilização de seqüências promotorasde ZmDGATl-2, ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 e ZmABCT
A seqüência de nucleotídeo para o promotor de ZmDGATl-2(Mol7), ZmDGAT 1-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP(Mol7),ZmPESP(ASK), ZmS24, ou ZmABCT divulgada na presenteinvenção, assim como os variantes e fragmentos desta, éútil na manipulação genética de qualquer planta quandomontada com uma construção de DNA de forma que a seqüênciapromotora esteja operativamente ligada com uma seqüência denucleotídeo heteróloga codificando uma proteína deinteresse. Desta maneira, a seqüência de nucleotídeopromotor de ZmDGATl-2(Mol7), ZmDGAT 1-2(ASK), ZmAAPl,ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT da invenção éfornecido em cassetes de expressão juntamente comseqüências de nucleotídeo heterólogas para expressão naplanta de interesse.
Regiões de promotores híbridos sintéticos sãoconhecidos na técnica. Tais regiões compreendem elementosde promotor à montante de uma seqüência de nucleotídeoligada de forma operativa ao elemento promotor de outraseqüência de nucleotídeo. Em uma modalidade da invenção, aexpressão de gene heterólogo é controlada por um promotorhíbrido sintético compreendendo a seqüência promotoraZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPli ZmPESP (Mol7),ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT da invenção ou uma variante oufragmento desta, ligada de forma operativa a elemento(s)promotor(es) à montante de um promotor heterólogo.Elementos promotores à montante têm sido identificados epodem ser utilizados para gerar um promotor sintético. Ver,por exemplo, Rushton e outros (1998) Curr. Opin. PlantBiol. 7:311-315. Alternativamente, uma seqüência depromotor ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT sintético podecompreender duplicações dos elementos promotores à montanteencontrados na seqüência de promotor ZmDGATl-2 (Mol7) ,ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24ou ZmABCT. É reconhecido que uma seqüência de promotorZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7),ZmPESP (ASK) , ZmS24 ou ZmABCT da invenção pode serutilizada com sua seqüência de codificação de ZmDGATl-2(Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 ou ZmABCTnativa. Uma construção de DNA compreendendo promotorZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPli ZmPESP (Mol7),ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT ligado de forma operativacom sua seqüência de codificação de ZmDGATl-2 (Mol7),ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 ou ZmABCT nativapode ser utilizada para transformar qualquer planta deinteresse para produzir uma mudança de fenótipo desejada.
Onde o promotor e seu gene nativo ocorrem naturalmente naplanta, isto é, no milho, a transformação de planta comestas seqüências ligadas de forma operativa também resultaou em uma mudança de fenótipo, como um conteúdo de óleoaumentado, conteúdo de ácido oléico aumentado e/ouproporção entre ácido oléico/ácido linoléico aumentada, ouna inserção de seqüências ligadas de forma operativa em umaregião diferente do cromossomo alterando assim o genoma daplanta.
Em outra modalidade da invenção, cassetes de expressãocompreenderão uma região de iniciação transcricionalcompreendendo a seqüência de nucleotideo promotor deZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2(ASK) , ZmAAPli ZmPESP (Mol7),ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT aqui divulgadas, ouvariantes ou fragmentos destas, ligadas de forma operativaà seqüência de nucleotideo heterólogo de cuja expressãodeve ser controlada pelo promotor de ZmDGATl-2 (Mol7),ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24ou ZmABCT da invenção.
A seqüência de nucleotideo promotor e métodosdivulgados aqui são úteis na regulação da expressão dequalquer seqüência de nucleotideo heteróloga em uma plantahospedeira a fim de variar o fenótipo de uma planta. Váriasmudanças em fenótipo são de interesse, incluindo amodificação da composição de ácido graxo em uma planta, aalteração do conteúdo de aminoácido de uma planta, aalteração de um mecanismo de defesa contra patógenos de umaplanta e similares. Estes resultados podem ser alcançadosfornecendo-se a expressão de produtos heterólogos ou aexpressão aumentada de produtos endógenos em plantas.
Alternativamente, os resultados podem ser alcançadosatendendo-se à necessidade por uma redução de expressão deum ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ouco-fatores na planta. Estas mudanças resultam em umamudança no fenótipo da planta transformada.
Os seguintes exemplos são oferecidos por meio deilustração e não por meio de limitação.
EXPERIMENTAL
Exemplo 1: Mapeamento de QTL6 de Óleo/Ácido Oléico eInformação de Seqüência
ASKC28IB1, uma linha consangüínea derivada do ciclo 28da população sintética de cerne único Alexho (ASK) foiutilizada como doador de alto teor de óleo e EF09B como umpai recorrente em uma série de populações deretrocruzamento continuas. Para o mapeamento de QTL de óleoinicial, 300 cernes BCl foram plantados, discos de folhaforam coletados de cada muda e o DNA foi extraído.
Genotipia de todo o genoma foi executada com todas as mudasindividuais utilizando-se marcadores SSR igualmentedistribuídos em 10 cromossomos de milho. Todas as 300plantas BCl foram retrocruzadas com EF09B para produzirsementes BC2. Dez a 20 cernes de cada espiga de BC2 maduraforam analisados por NMR para determinar a quantidade deóleo assim como a concentração de óleo em bases por cerneou por embrião. Para o óleo de semente, cernes secos ao arforam utilizados para orientar as medições NMR. Para óleode embrião, os cernes foram encharcados em água durante anoite. Os embriões foram dissecados de seus endospermas,secos a vácuo e submetidos a análise por NMR.
0 mapeamento foi executado utilizando-se dados demarcador das mudas BCl e dados do óleo das espigas BC2. Omapeamento por intervalo composto de traços de óleo foiexecutado utilizando-se o programa Windows QTL Cartographer(Wang e outros, North Carolina State University). 0 nívelde significância de QTL para cada traço foi determinado por300 permutações a ρ < 0,05.Um QTL de teor de óleo de embrião e teor de óleo decerne significativo foi detectado no cromossomo seis(QTL6). Os resultados do mapeamento derivados daconcentração de óleo no embrião são mostrados na Figura 1.
O QTL6 está localizado entre os marcadores PHI077 (51,2 cM,IBM2 + , mapa de meiose simples) e EST723482 (98,4 cM) e comum valor de pico em torno de UMC1918 (Figura 1) . Estesresultados são consistentes com aqueles de Zhong e Williams(2003, dados não mostrados) obtidos de um estudo demapeamento em uma população F2 derivada de um cruzamentoentre ASKC28IB1 e FBl consangüíneos.
o mapeamento fino de QTL6 foi atingido utilizando-sesobreposição de linhas quase isogênicas desenvolvidas ao emtorno da região QTL6 (Figura 2) . Eventos recombinantesentre PHI077 e EST723482 foram identificados a partir devários estágios e autopolinizados por duas ou mais geraçõespara produzir linhas quase isogênicas (NILs). Séries desobreposições próximas a NILs foram desenvolvidas em BC3S2,BC3S3 E BC4S2. Nas gerações de retrocruzamento eautopolinização subseqüentes, aplicou-se seleção assistidapor marcador (MAS) de todo o genoma a cada geração paraacelerar a seleção de indivíduos que apenas contêm o genomaASKC28IB1 na região QTL6. Foi estimado que muitosindivíduos selecionados para desenvolvimento de NILcontinham mais de 97,5% e 99% de seus genomas de pai EF09Bpara BC3 e BC4 respectivamente.
A fim de mapear QTL6 em uma resolução muito mais alta,marcadores SSR e SNP adicionais em torno da região QTL6foram também desenvolvidos utilizando-se informação deseqüência proprietária ou informação de seqüência deextremidade BAC pública. Os marcadores utilizados nesteprojeto e alguns marcadores em torno dessa regiãoutilizados e publicados por vários autores, são mostradosna Tabela 1 abaixo.
Tabela 1. Marcadores utilizados para mapeamento finode teor de óleo /ácido oléico em QTL6. Marcadores em pretosão marcadores Pioneer SSR ou SNP utilizados no mapeamentode QTL6. Eles são desenvolvidos a partir de seqüênciasproprietárias Pioneer (S) ou a partir de seqüênciaspúblicas (N). Se conhecido, as posições no mapa sãofornecidas em três diferentes mapas, meiose simples IBM2+(V 1.5); Visinhos IBM2+ (V 1.6) e Diversidade Pioneer (V1.4). Marcadores em várias cores são citados a partir dereferências dadas abaixo: 1. Mangolin e outros, 2004,Mapping QTLs for kernel oil content in a tropical maizepopulation, Euphytica, 137:251-259. 2. Song e outros, 2004,QTL mapping of kernel oil concentration with high-oil maizeby SSR markers, Maydica, 49:41-48. 3. Alrefai e outros,1995, Quantitative trait locus analysis of fatty acidconcentration in maize, Genoma, 38:894-901. 4. Johnson eRocheford, 2003, Evaluation of Near-Isogenic Lines for QTLfor kernel concentration in maize, Illinois Corn Breeder1SSchool, páginas 126-149.
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Dados relacionados a óleo foram obtidos dos NILssobrepostos e classificados de acordo com diferentesclasses de marcadores. Para cada par NIL, dados de óleo eperfis de ácido graxo foram obtidos a partir de cincoespigas homozigotas para alelo ASK (QTL6+/+) e cincoespigas homozigotas para alelo EF09B (QTL6-/-). Dados daclasse QTL6+/+ e classe QTL6-/- foram comparados e umadiferença significativa em ρ < 0,01 entre a classe ASKhomozigota (QTL6+/+) e a classe de EF09B homozigota (QTL6-/-) sugeriu a presença de QTL6. Em BC3S2, a QTL6 foimapeada a uma região de 10,8 cM (entre os marcadoresEST4 50983 e MZA5002) . Em BC3S3 e BC4S2, a QTL6 foi mapeadaadicionalmente a uma pequena região entre os marcadoresBAC18 e BAC2 9 (Figura 2) . Esta região corresponde a trêsclones BAC sobrepostos (bl21c.n3, b33a.k3 e be46c.n5) nomapa físico de Mol7 consangüíneo. Seqüências destes trêsBACs foram determinadas e a inserção genômica total nostrês clones é de aproximadamente 280 kb. As inserçõesgenômicas nos 3 clones BAC Mol7 seqüenciados sãoapresentadas em três fragmentos genômicos separados, Id. deSeq. n° 116, Id. de Seq. n° 117 e Id. de Seq. n° 118,devido a alguns espaços não resolvidos.
O fragmento maior, Id. de Seq. n° 116, é 263762-bp emcomprimento e contém ORFs para Proteína do Sistema deEfluxo K+ (ZmPESP; proteína mostrada na Id. de Seq. n° 56) ,proteína ZmDGATl-2 (Mol7) mostrada na Id. de Seq. n° 50,codificando a seqüência (cDNA) mostrada na Id. de Seq. n°49), e transportador ABC semelhante a PDR (ZmABCT; proteínamostrada na Id. de Seq. n° 64, seqüência de codificação(cDNA) mostrada na Id. de Seq. n° 63) . Assim, osnucleotídeos (nt) 153888-156887 da Id. de Seq. n° 116representa o promotor ZmPESP (Mol7) (exposto na Id. de Seq.n° 121); nt 156888-165958 da Id. de Seq. n° 116 representaa seqüência de codificação (seqüências íntron mais exon)para ZmPESP; nt 165959-166382 da Id. de Seq. n° 116representa a seqüência ZmPESP 31-UTR; o filamentocomplementar a nt 173344-176343 da Id. de Seq. n° 116representa o promotor ZmDGATl-2 (Mol7) (filamentocmplementar a este promotor é exposto na Id. de Seq. n°119) ; o filamento complementar a nt 167385-173343 da Id. deSeq. n° 116 representa a seqüência de codificação(seqüência exon mais íntron) para ZmDGATl-2 (Mol7); ofilamento complementar a nt 167035-167384 da Id. de Seq. n°116 representa a seqüência ZmDGATl-2 (Mol7) 3'-UTR; nt254826-257825 da Id. de Seq. n° 116 representa o promotorZmABCT (expoto na Id. de Seq. n° 124); nt 257826-263762 daId. de Seq. n° 116 representa a seqüência de codificaçãoparcial (seqüências exon mais íntron) para ZmABCT; e nt167035-167384 da Id. de Seq. n° 116 representa a seqüênciaZmABCT 3'-UTR.
O segundo fragmento (Id. de Seq. n° 117) é 1191 bp econtém ORFs para 4 0 proteínas ribossômicas (ZmS24; proteínamostrada na Id. de Seq. n° 60, seqüência de codificação(cDNA) mostrado na Id. de Seq. n° 59) e aminoácido permease(ZmAAPl; proteína mostrada na Id. de Seq. n° 56, seqüênciade codificação (cDNA) mostrada na Id. de Seq. n° 55) .
Assim, nt 1824-4823 da Id. de Seq. n° 117 representa opromotor ZmS24 (exposto na Id. de Seq. n° 123) ; nt 4 824-5994 da Id. de Seq. n° 117 representa a seqüência decodificação de ZmS24 (seqüências íntron mais exon); nt5995-6160 da Id. de Seq. n° 117 representa a seqüênciaZmS 2 4 3 1 -UTR; nt 6161-6888 da Id. de Seq. n° 117representa o promotor de ZmAAPl (exposto na Id. de Seq. n°120) ; nt 6889-8556 da Id. de Seq. n° 117 representa aseqüência de codificação de ZmAAPl (seqüências exon maisíntron) ; nt 8557-8822 da Id. de Seq. n° 117 representa aseqüência ZmAAPl 3'-UTR.
O terceiro fragmento (Id. de Seq. n° 118) possui 6268bp e não contém ORFs.
A seqüência genômica ASK28IB1 para a região QTL6 foitambém obtida. Uma biblioteca BAC foi construídautilizando-se DNA isolado de folhas de ASKC28IB1 eselecionada utilizando-se seqüência BAC 17 (Id. de Seq. n°3) como um marcador. Um dos clones BAC positivos (cloneASKBAC F4) foi seqüenciado e anotado. A inserção nesteclone é de 82725 pares de base (Id. de Seq. n° 128) econtém dois genes, PESP e DGAT1-2. Os outros três genes(Proteína S24 ribossômica 40S, AAP e ABCT) encontrados nosBACs Mol7 estavam fora da região coberta pelo clone F4. Asposições de nucleotídeo para promotor, codificação e 3' UTRpara ambos os genes PESP e DGATl-2 no clone BAC ASKC28IB1são descritas abaixo.
A seqüência genômica ASKC28IB1 (ASK) de 82725 bp (Id.de Seq. n° 128) contém o ORF para a proteína ZmPESP (ZmS24;mostrada na Id. de Seq. n° . 57 (seqüência de codificação(cDNA) mostrado na Id. de Seq. n° 56) e a proteína ZmDGATl-2 (ASK) mostrada na Id. de Seq. n° 4 8 (seqüência decodificação (cDNA) mostrada na Id. de Seq. n° 47) . Assim,os nucleotídeos (nt) 9306-12305 da Id. de Seq. n° 128representa o promotor de ZmPESP (ASK) (exposto na Id. deSeq. n° 129) ; nt 12306-21370 da Id. de Seq. n° 128representa a seqüência de codificação (seqüências exon maisíntron) para ZmPESP; nt 21371-21794 da Id. de Seq. n° 128representa a seqüência ZmPESP 3'-UTR; o filamentocomplementar a nt 29472-32471 da Id. de Seq. n° 128
representa o promotor ZmDGATl-2 (ASK) (filamentocmplementar a este promotor é exposto na Id. de Seq. n°130) ; o filamento complementar para nt 22774-29471 da Id.de Seq. n° 12 8 representa a seqüência de codificação(seqüências exon mais íntron) para ZmDGATl-2 (ASK); e ofilamento complementar a nt 22365-22773 da Id. de Seq. n°128 representa a seqüência ZmDGATl-2 (ASK) 3'-UTR.
QTL6 pode ser adicionalmente definida a um fragmentode aproximadamente 195 kb, entre BACl8 e BAC2 9 (Figura 2).
Os dados de óleo destes NILs mostram que a QTL6consistentemente aumenta as concentrações de óleo noembrião e na semente em múltiplas gerações. Os dados deóleo de BC3S2 e BC4S2 são resumidos na Figura 3. A QTL6aumenta a concentração de óleo no embrião de 31,6% a 35,8%(um aumento de 13%) em BC3S2 e de 28,7% a 33,3% (um aumentode 16%) em BC4S2. Ela também aumenta a concentração de 4,4%a 5,1% (um aumento de 17%) em BC3S2 e de 3,7% a 4,4% (umaumento de 19%) em BC4S2. Acredita-se geralmente que essemilho de alto teor de óleo também contém um nível aumentadode ácido oléico (18:1). Adicionalmente, uma QTL maiorcontrolando a proporção de adido oléico (18:1) e linoléico(18:2) foi mapeada no cromossomo 6 por diferentes grupos(Alrefai e outros, (1995) Genome 38:894-901; Poneleit eoutros, (1976) Agron. Abs. 8:59).
O presente estudo investiga se os NILs desenvolvidospara QTL6 também continham níveis aumentados de ácidooléico. Perfis de ácidos graxos para classes ASK e EF09Bhomozigotas em sementes BC3S2, BC3S2, e BC4S2 foramobtidos. Os dados para BC3S2 e BC4S2 são resumidos naFigura 4. Certamente a QTL6 também aumenta consistentementea concentração de ácido oléico em sementes em múltiplasgerações. Em BC3S2, a QTL6 aumentou a concentração de ácidooléico de 24,6% a 36,2% (um aumento de 47%) e reduz aconcentração de ácido linoléico de 58,5% a 46,4% (umaredução de 21%). Em BC4S2, a QTL6 aumenta a concentração deácido oléico de 23,6% a 37,9% (um aumento de 61%) e reduz aconcentração de ácido linoléico de 59,8% a 45,4% (umaredução de 24%). Embora as concentrações de ácidos graxosnos embriões não fossem diretamente medidas, é razoávelassumir que a maioria das mudanças observadas devem-se amudanças nos embriões uma vez que o teor de óleo dosembriões representam aproximadamente 90% do óleo de sementetotal. Na resolução de mapeamento de 195 kb, os fenótiposde teor de óleo aumentado e de teor de ácido oléicoaumentado não segregam, sugerindo que os genes responsáveispor ambos os fenótipos estão localizados na região de 195 kb.
Em teoria, o milho com maior conteúdo de óleo além daQTL 6 pode ser produzido por empilhamento molecular ougenético da QTL6 com outro QTL de teor de óleo ou outrosgenes conhecidos por aumentarem o teor de óleo. 0cotilédone folhoso 1 (LECl) de milho é um fator detranscrição de domínio B (ver Figuras 38 e 39)anteriormente mostrado aumentando o teor de óleo do embrião(ver Figura 5). Para determinar se LECl pode aumentar aindamais o teor de óleo, uma linha homozigótica BC2S2 para QTL6derivada da população ASKC28IB1 χ EF09B foi cruzada complantas homozigóticas contendo o transgene ÇEC1 de milho. 0teor de óleo do embrião e semente das plantas Flresultantes foram analizados e os dados foram comparadosàqueles obtidos de plantas carregando QTL6 e LECl apenas.
Os resultados indicam que QTL6 e LECl possuem efeitosaditivos na concentração de óleo no embrião assim como dasemente e empilhar geneticamente LECl e QTL6 pod eelevar aconcentração de óleo no embrião a cerca de 4 0% econcetração de óleo da semente a cerca de 6% em plantasheterozigóticas (Figura 5).
Para identificar os genes responsáveis pelo aumento deóleo e ácido oléico em QTL6, os três clones de BAC Mol7(bl21c.n3, b33a.k3 e be46c.n5) foram sequenciados eanotados. O programa FGENESH (Softberry, Inc. 116 RadioCircle, Suite 400 Mount Kisco, NY 10549) foi utilizado paraprever os genes localizados nos três clones de BAC. Naregião entre BAC18 e BAC29 (aproximadamente 195 kb), cincoquadros de leitura aberta (ORFs) compartilhandosignificativa homologia com os genes conhecidos foramidentificados. Eles codificam uma proteína de sistema deefluxo K+ (PESP), uma diaglicerol O-aciltransferase do tipo1 (DGAT1-2), uma proteína S24 ribossômica 40S, umaaminoácido permease (AAP) e um transportador ABC semelhantea PDR (ABCT) . Os cinco ORFs e alguns marcadoresproximamente ligados são mostrados na Figura 6.
É bem conhecido na técnica que DGAT está envolvido naúltima etapa de biossíntese de triaciglicerol (TAG). Asseqüências cDNA para o gene DGAT (DGAT 1-2) localizadas naregião QTL6 de diversos consangüíneos diferentes foramobtidas, incluindo ASKC28IB1, EF09B, Mol7, e B73. Aseqüência do alelo B37 foi derivada dos clones EST Pionnerexistentes. A seqüência do alelo Mol7 foi deduzida a partirdas seqüências do clone BAC descritas abaixo. As seqüênciasde alelo ASKC28IB1 e EF09B foram clonadas de embriõesimaturos por RT-PCR. De forma breve, o RNA total foiextraído de homozigotos dos pares NIL de BC4S2 para ASK(QTL6+/+) OU EFO9Β (QTL6-/-). O primeiro filamento de cDNAfoi sintetizado utilizando-se iniciadores de poli(dT). 0comprimento total de cDNA foi amplificado por PCR a partirdo primeiro filamento de cDNA utilizando os seguintesiniciadores: iniciador de avanço, 5'-ctggaaccttcctcgcatggccccg (94784) (Id. de Seq. n° 114) ;iniciador reverso 5'-ctatctacttgcctgggcctgcctgttc (94785)(Id. de Seq. n° 115) . 0 alinhamento da seqüência de DNAdestes quatro alelos é mostrado na Figura 31. Em nível denucleotídeo, ASK e alelos normais possuem modificações emnove locais e as mudanças em quatro destes locais levam amudanças em aminoácidos (Figura 30) . Análises maisdetalhadas destas modificações estão presentes no Exemplo 4abaixo.
Exemplo 2: Informação de Marcador e Iniciador
Marcadores polimórficos de nucleotídeo simples (SNP)foram desenvolvidos a partir de seqüências de extremidadeBAC das três seqüências BAC de Mol7 cobrindo a região QTL6.Exemplos não limitantes de marcadores polimórficos entrealelos ASKC28IB1 (ASK; uma linha de alto teor de óleo /alto teor de ácido oléico) e EF09B (linha de teor de óleonormal)são expostos nas Figuras 11 a 25. A Tabela 2 abaixomostra os polimorfismo únicos aos marcadores QTL6 de ASKque não são encontrados nos locais de marcadorcorrespondentes na região QTL6 das linhas de teor normal deóleo (Id. de Seq. n° para EF09B é utilizada como aseqüência de referência).
Tabela 2. Locais dos polimorfismos nos Ioci marcadoresda região QTL6 de milho. Os identificadores de seqüênciareferem-se ao locus marcador específico para EF09B (linhaconsangüínea de milho de teor normal de óleo) . NT, aposição de nucleotideo no identificador de seqüência paraEF09B onde um polimorfismo foi identificado no locusmarcador correspondente para ASK (linha consangüínea demilho de alto teor de óleo, alto teor de ácido oléico) ;"mudança polimórfica" refere-se à substituição, inserção oudeleção específica ocorrendo no locus marcadorcorrespondente para ASK.
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Iniciadores adequados para detecção da presença destesloci marcadores em uma planta ou tecido de planta sãoexpostos nas Figura 7 a 29 e Id. de Seq. n° 68 a 115 e 124a 127 .
Exemplo 3: Reprodução Assistida por Marcador para QTL6
Este exemplo expõe o uso dos polimorfismos nos váriosmarcadores moleculares de QTL6 para acelerar a incorporaçãodo traço de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácidooléico em outro germeplasma de milho com o resultado deaumentar o teor de óleo e/ou teor de ácido oléico noembrião e no cerne.
A presente invenção fornece um pé de milho comconteúdo de óleo e/ou ácido oléico no embrião e/ou cerneaumentado(s) selecionado com o uso de reprodução assistidapor marcador onde uma população de plantas são selecionadaspara a presença de pelo menos uma das seqüênciaspolimórficas exportas no Exemplo 2. A seleção de plantaspossuindo pelo menos uma das seqüências polimórficasassociadas ao traço de alto teor de óleo e/ou alto teor deácido oléico compreende marcar o DNA genômico da plantaresultante, através do processo de seleção, para a presençado polimorfismo. As plantas contendo o locus marcadordesejado continuam na reprodução e no processo de seleção.
Além disso, uma vez que a concentração de ácido oléicomostra um aumento maior que o conteúdo de óleo em plantastransportando o locus marcador de QTL6 de alto teor deóleo/alto teor de ácido oléico e podem ser medidas comprecisão, isto pode ser utilizado para monitorar econfirmar a presença de QTL6 durante o processo dereprodução assistida por marcador. Assim, por exemplo,qualquer pé de milho dado ou a progenia resultante doscruzamentos ou retrocruzamentos entre pés de milho pode ser selecionado pela presença do locus marcador de QTL6examinando-se seu conteúdo de ácido oléico, particularmenteem todo o cerne ou embrião. Desta maneira, a concentraçãode ácido oléico de uma semente ou embrião de pelo menos 35%(isto é, 3 5% ou mais do óleo da semente ou embrião érepresentado por ácido oléico) seria preditivo de que aplanta provavelmente compreende o locus marcador de QTL6desejado e assim poderia prosseguir de forma benéfica noprocesso de reprodução e seleção. Alternativamente, aconcentração de ácido oléico em uma semente ou embrião demenos de 3 5% (isto é, o ácido oléico representa menos de35% do óleo da semente ou embrião) seria preditivo de que afonte da planta não transporta o locus QTL6 desejado em seugenoma.
Esta etapa de seleção de ácido oléico poderia seradicionalmente suplementada com seleções genômicas para apresença do locus QTL6. Em tal exemplo, a presença do locusQTL6 desejado é confirmada detectando-se a presença dainserção do códon TTC na seqüência de codificação deZmDGATl-2 que resulta na inserção de Phe467, Phe4 68/ or Phe469na proteína ZmDGATl-2 (ASK) . Isto pode ser alcançado, porexemplo, amplificando-se o fragmento de DNA ao redor destecódon utilizando-se a Id. de Seq. n° 126 e 127, conformedescrito no Exemplo 13 abaixo.
Exemplo 4. Caracterização de Seqüência de Quadro de
Leitura Aberta em QTL6.Α. DGAT
A Figura 31 mostra o alinhamento da seqüência de ácidonucléico da variante de ZmDGATl-2 de alto teor de óleo /alto teor de ácido oléico (derivada da linha consangüíneaASK; Id. de Seq. n° 48, codificada por Id. de Seq. n° 47)comparada à seqüência ZmDGATl-2 obtida das linhasconsangüíneas de milho de teor de óleo normal Mol7 (Id. deSeq. n° 50, codificada por Id. de Seq. n° 49), EF09B (Id.de Seq. n° 52, codificada por Id. de Seq. n° 51) e b73 (Id.de Seq. n° 54, codificada por Id. de Seq. n° 53). 0alinhamento das respectivas seqüências de aminoácidos paraestas proteínas é mostrado na Figura 30. O alinhamento deseqüência de ácido nucléico mostra que existem os seguintespolimorfismos únicos ao alelo de alto teor de óleo/altoteor de ácido oléico de ZmDGATl-2 que não são encontradosna seqüência correspondente das linhas consangüíneas demilho de teor de óleo normal. A Tabela 3 abaixo resume ospolimorfismos identificados na variante de ZmDGATl-2 dealto teor de óleo/alto teor de ácido oléico (isto é,ZmDGATl-2 (ASK)) que levam às mudanças de resíduo emZmDGATl-2(ASK).
Conforme pode ser observado a partir do alinhamento daproteína ZmDGAT 1-2(ASK) com o da proteína DGATl-2 daslinhas consangüíneas de milho de teor de óleo normal (istoé, EF09B, Mol7 e B73), a proteína ZmDGAT 1-2(ASK) possuiuma deleção de glutamina e inserção de fenilalanina emrelação à proteína DGATl-2 de teor de óleo normal. Observeque uma vez que a deleção de glutamina e a inserção dafenilalanina mostradas na Figura 3 0 ocorre em regiões daproteína DGATl-2 que compreende resíduos de glutamina emrepetição e de fenilalanina em repetição, respectivamente,a deleção e inserção poderia ocorrer em qualquer um dosresíduos de repetição respectivos. Assim, a deleção daglutamina mostrada na Figura 3 0 aparece na posiçãocorrespondente a Gln67 da proteína DGATl-2 de teor normalde óleo, na realidade, a deleção da glutamina poderiarepresentar uma deleção do resíduo correspondente a toGln64/ Gln65, Gln66, ou Gln67 da DGATl-2 de teor normal deóleo (por exemplo, EF09B de Id. de Seq. n° 52) . De formasimilar, embora a inserção de fenilalanina em DGAT1-2 (ASK)mostrada na Figura 3 0 seja representada por Phe469 destaproteína, na realidade, a inserção de fenilalanina emrelação à DGATl-2 poderia ser representada pelafenilalanina na posição 467, 468 ou 469 da DGATl-2 (ASK)(ver Id. de Seq. n° 48).
Tabela 3. Locais dos polimorfismos nos ORF de ZmDGATl-2 da região QTL6 de milho. 0 identificador de seqüênciarefere-se ao ORF de ZmDGATl-2 para EFO9B (linhaconsangüínea de milho de teor normal de óleo; Id. de Seq.n° 51) . NT, a posição de nucleotídeo no identificador deseqüência para EF09B onde um polimorfismo foi identificadono ORF de ZmDGATl-2 correspondente para ASK (linhaconsangüínea de milho de alto teor de óleo, alto teor deácido oléico); "mudança polimórfica" refere-se àsubstituição, inserção ou deleção específica ocorrendo noORF de ZmDGATl-2 correspondente para ASK (Id. de Seq. n°47); "mudança de resíduo" refere-se à substituição, deleçãoou inserção de aminoácido na proteína ZmDGATl-2correspondente para ASK (Id. de Seq. n° 48) conformecomparado à seqüência de referência EFO9B (Id. de Seq. n°52) como um resultado da mudança polimórfica no ORF deZmGDATl-2 para ASK (Id. de Seq. n° 47).
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* Proteína ZmDGATl-2 para ASK (Id. de Seq. n° 48) estásem o resíduo de glutamina correspondente na posição 64,65, 66 ou 67 da proteína ZmDGATl-2 para EFO9B (Id. de Seq.n° 52), dependendo se a deleção dos três nucleotídeos CAGna seqüência de codificação correspondente para a proteínaZmDGATl-2 para EF09B (Id. de Seq. n° 51) ocorre nosnucleotídeos 190 a 192, 193 a 195, 196 a 198 ou 199 a 201.
** O resíduo de fenilalanina na posição 467, 468 ou469 da proteína ZmDGATl-2 para ASK (Id. de Seq. n° 48)representa uma inserção nesta proteína com relação ao localcorrespondente na proteína ZmDGATl-2 para EFO9B (Id. deSeq. n° 52). Assim, Phe467 na seqüência ASK corresponderia auma inserção deste resíduo entre Trp467 e Phe468 da proteínaZmDGATl-2 para EF09B (Id. de Seq. n° 52). A Phe468 daseqüência ASK corresponderia a uma inserção deste resíduoentre Phe468 e Phe469 da proteína ZmDGATl-2 para EF09B. APhe469 da seqüência ASK corresponderia a uma inserção desteresíduo entre Phe469 e Phe470 da proteína ZmDGATl-2 paraEFO9B. O local da inserção do resíduo de fenilalanina naseqüência ASK dependeria se a mudança polimórfica observadana seqüência de codificação ASK (isto é, na inserção TTC)ocorre na posição correspondente ao nucleotídeo 1401, 1404ou 1407 da seqüência de codificação para a proteínaZmDGATl-2 EFO9B de teor normal de óleo (isto é, Id. de Seq.n° 51).
Estes polimorfismos no ORF de ZmDGATl-2 para ASK podemser caracterizados pela mudança de resíduo ocorrendo naproteína ZmDGATl-2 codificada para ARK (Id. de Seq. n° 48)com relação ao resíduo correspondente para a proteínaZmDGATl-2 para EF09B (Id. de Seq. n° 52) como segue:
1. Polimorfismos de Nucleotídeo Simples
a. valina na posição 45 da Id. de Seq. n° 52 ésubstituída com uma glicina na posição 45 de Id. de Seq. n°48
b. prolina na posição 55 da Id. de Seq. n° 52 ésubstituída com uma serina na posição 55 de Id. de Seq. n°48
2. Deleções
O resíduo de glutamina correspondente ao resíduo deglutamina na posição 64, 65, 66 ou 67 do aminoácido de Id.de Seq. n° 52 é deletado em Id. de Seq. n° 48.3. Inserções
A proteína ZmDGATl-2 (ASK) possui uma inserção de umresíduo de fenilalanina em uma posição localizada entre um par de resíduos correspondentes a um par de resíduos em Id.de Seq. n° 52 selecionados entre:
a. o resíduo de triptofano em uma posição 467 doaminoácido de Id. de Seq. n° 52 e o resíduo de fenilalaninaa uma posição de aminoácido 468 de Id. de Seq. n° 52; ou
b. o resíduo de fenilalanina na posição de aminoácido468 de Id. de Seq. n° 52 e o resíduo de fenilalanina naposição de aminoácido 469 de Id. de Seq. n° 52; ou
c. o resíduo de fenilalanina em uma posição deaminoácido 469 de Id. de Seq. n° 52 e o resíduo de serinaa uma posição de aminoácido 470 de Id. de Seq. n° 52.
A proteína ZmDGATl-2 (ASK) (Id. de Seq. n° 48)compreende todas estas quatro mudanças de resíduo. Ospolimorfismos únicos ao ORF de ZmDGATl-2 (Id. de Seq. n°47, codificando o polipeptídeo de ZmDGATl-2 (ASK) na Id. deSeq. n° 48) da linha consangüínea de alto teor de óleo,alto teor de ácido oléico ASK podem ser também utilizadosna seleção e reprodução assistida por marcador conformedescrito no Exemplo 5 abaixo.
B. Aminoácido Permease 1 (AAPl)
A presente invenção também fornece o quadro de leituraaberta para o polipeptídeo de aminoácido permease 1 (AAPl)de milho (Id. de Seq. n° 56; denominado ZmAAPl) e variantesbiologicamente ativas deste conforme definido abaixo. Ospolinucleotídeos isolados codificando o polipeptídeo ZmAAPlsão também englobados pela presente invenção. Em umamodalidade, o polinucleotídeo isolado compreende aseqüência exposta em Id. de Seq. n° 55 ou variante destecodificando um polipeptídeo AAPl biologicamente ativo. AFigura 34 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmAAPl comoutros polipeptídeos AAP relacionados de outras espécies deplantas.
C. Proteína de Sistema de Eflxixo de K+ (PESP)
A presente invenção também fornece o quadro de leituraaberta para a proteína de sistema de efluxo de potássio demilho (Id. de Seq. n° 58; denominada ZmPESP) e variantesbiologicamente ativas desta conforme definido abaixo. Ospolinucleotídeos isolados codificando o polipeptídeo ZmPESPsão também englobados pela presente invenção. Em umamodalidade, o polinucleotídeo isolado compreende aseqüência exposta em Id. de Seq. n° 57 ou variante destecodificando um polipeptídeo PESP biologicamente ativo. AFigura 35 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmPESP comoutros polipeptídeos PESP relacionados de outras espéciesde plantas.
D. Proteína S24 Ribossômica 40S
A presente invenção também fornece o quadro de leituraaberta para a proteína S24 ribossômica 4OS de milho (Id. deSeq. n° 60; denominada ZmS24) e variantes biologicamenteativas desta conforme definido abaixo. Os polinucleotídeosisolados codificando o polipeptídeo ZmS24 são tambémenglobados pela presente invenção. Em uma modalidade, opolinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta emId. de Seq. n° 59 ou variante deste codificando umaproteína S24 ribossômica 4OS biologicamente ativa. AFigura 36 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmS24 comoutras proteínas ribossômicas relacionadas de outrasespécies de plantas.
E. Transportador ABC
A presente invenção também fornece o quadro de leituraaberta para o polipeptídeo de transportador ABC tipo PDR(ABCT) de milho (Id. de Seq. n° 64; denominado ZmABCT(compósito)) e variantes biologicamente ativas desteconforme definido abaixo. Os polinucleotídeos isoladoscodificando o polipeptídeo ZmABCT (compósito) são tambémenglobados pela presente invenção. Em uma modalidade, opolinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta emId. de Seq. n° 63 ou variante deste codificando umpolipeptídeo AAPl biologicamente ativo.
o comprimento total da seqüência de codificação foiconstruído a partir da seqüência de cDNA de ORF parcial deZmABCT clonada a linha de milho consangüínea Mol7 de teornormal de óleo (seqüência exposta na Id. de Seq. n° 61,codificando a seqüência de aminoácido N-terminal expostana Id. de Seq. n° 62) e as seqüências EST e genômica para alinha de milho consangüínea B73 de teor normal de óleo. AFigura 37 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmABCT(compósito) com outros polipeptídeos de ABCT relacionadosde outras espécies de plantas.
Exemplo 5. Reprodução Assistida por Marcador para QTL6Este exemplo expõe o uso dos polimorfismos na variantede DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico,por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47, à medidaque os marcadores moleculares aceleram a incorporação dotraço de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico emoutro germeplasma com o resultado de aumento de teor deóleo e/ou teor de ácido oléico no cerne, e/ou aumento naproporção de ácido oléico / ácido linoléico no cerne.
A presente invenção fornece um pé de milho comconteúdo de óleo e/ou ácido oléico aumentado no cerneselecionado pelo uso de reprodução assistida por marcador,onde uma população de plantas é selecionada pela presençade pelo menos uma das seqüências polimórficas únicas àvariante de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléicode DGAT. O Exemplo 4, Tabela 3, acima, lista ospolimorfismos únicos ao DGAT de alto teor de óleo / altoteor de ácido oléico.
A seleção de plantas possuindo pelo menos uma dasseqüências polimórficas da variante de alto teor de óleo /alto teor de ácido oléico de DGAT, que está associada com otraço de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico,compreende marcar o DNA genômico da planta resultante,através do processo de seleção, para a presença dopolimorfismo. Iniciadores adequados para detecção dapresença da variante de alto teor de óleo / alto teor deácido oléico são expostos na Id. de Seq. n° 114, 115 e 124a 127. Por exemplo, o par iniciador exposto como Id. deSeq. n° 124 e 125 amplificará um fragmento que englobe asprimeiras três mudanças no N-terminal da proteína DGATl-2ASK (nt 134, 163, 199 a 201 na Tabela 3 acima). 0 pariniciador exposto como Id. de Seq. n° 126 e 127amplificará um fragmento que inclua a mudança no C-terminalde DGATl-2 ASK (nt 1408 a 1410 na Tabela 3 acima). Asplantas contendo o DGAT de alto teor de óleo / alto teor deácido oléico continuam no processo de reprodução e deseleção.Exemplo 6. Transformação e Regeneração de Pés de MilhoTransgênicos
Embriões de milho imaturos de plantas doadoras deestufa são bombardeados com plasmideos contendo a seqüênciade ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47, ou a seqüênciaZmDGATl - 2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51, ligada de formaoperativa a um promotor de interesse e o gene marcadorselecionável PAT (Wohlleben e outros, (1988) Gene 70:25-37), que confere resistência ao herbicida Bialafos.
Alternativamente, o gene do marcador selecionável éfornecido em um plasmídeo separado. A transformação éexecutada como segue. Receitas do meio seguem abaixo.
Preparação de Tecido Alvo
As espigas são descascadas e a superfície esterilizadaem 30% de água sanitária Clorox mais 0,5% de detergenteMicro por 20 minutos e rinsadas duas vezes com águaestéril. Os embriões não maduros são extirpados e o eixo doembrião voltado para baixo (escutelo voltado para cima), 25embriões por placa, em meio 56 OY por 4 horas e entãoalinhados dentro dos 2,5 cm da zona alvo em preparação porbombardeamento.
É produzido um vetor de plasmídeo compreendendo aseqüência ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47, ou aseqüência ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51, ligada deforma operativa a um promotor de interesse. Este DNAplasmídeo mais DNA plasmídeo contendo um marcadorselecionável PAT é precipitado sobre pelotas de tungstêniode 1,1 micrômetro (diâmetro médio) usando um procedimentode precipitação de CaCl2 como segue: 100 μL de preparado departículas de tungstênio em água; 10 μL (1 μg) de DNA emtampão Tris-EDTA (1 μ9 total de DNA) ; 100 μΐ, de CaCl2 2,5Μ; e, 10 μ!· de espermidina 0,1 M.
Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensãode partículas de tungstênio enquanto a agitação é mantidano centrifugador de vários tubos. A mistura final ébrevemente sonificada e deixada a incubar sob agitaçãoconstante por 10 minutos. Após o período de precipitação,os tubos são centrifugados brevemente, o líquido éremovido, lavados com 500 mL de etanol 100% e centrifugadopor 30 segundos. Novamente o líquido é removido, e 105 μΐϋde etanol a 100% são adicionados à pelota da partícula detungstênio final. Para bombardeamento por pistola departículas, as partículas de tungstênio/DNA são brevemente"sonicadas" e são coradas com 10 μΐι sobre o centro de cadamacrotransportador e deixadas a secar por cerca de 2minutos antes do bombardeamento.
As placas de amostra são bombardeadas no nível #4 emuma pistola de partículas. Todas as amostras recebem umúnico disparo a 4,48 MPa, com um total de dez alíquotastiradas de cada tubo de partículas preparadas/DNA.
Seguindo o bombardeamento, os embriões são mantidos emmeio 560Y por 2 dias, e então transferidos a meio deseleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialafos esubcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10semanas de seleção, os clones de calos resistentes àseleção são transferidos a meio 288J para iniciar umaregeneração de planta. Seguindo a maturação do embriãosomático (2 a 4 semanas), embriões somáticos bemdesenvolvidos são transferidos ao meio para germinação etransferidos ao ambiente de cultura iluminado.Aproximadamente 7 a 10 dias após, plântulas emdesenvolvimento são transferidas a meio livre de hormônio272V em tubos por 7 a 10 dias até que as plântulas estejambem estabelecidas. As plantas são então transferidas parainserção em superfícies (equivalentes a recipiente de 6,35cm) contendo terra e foram crescidas por 1 semana em umacâmara de desenvolvimento, um crescimento subseqüenteadicional por 1 a 2 semanas na estufa, e então transferidasa 600 recipientes clássicos (6,07 litros) e deixadas a crescer até maturidade. As plantas são monitoradas eregistradas quanto ao seu conteúdo de óleo e conteúdo deácido oléico.
O meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/L desais basais N6 (SIGMA C-1416) , 1,0 mL/L de Mistura reacional de vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511) , 0,5mg/L de HCl tiamina, 120,0 g/L sucrose, 1,0 mg/L de 2,4-D e2,88 g/L de L-prolina (levado ao volume com D-I H2Oseguindo ajuste ao pH 5,8 com KOH) ; 2,0 g/L de Gelrite(adicionado após avolumação com D-I H2O); e 8,5 mg/Lnitrato de prata (adicionado após esterilizar o meio eresfriar à temperatura ambiente). 0 meio de seleção (560R)compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0mL/L de Mistura reacional de vitamina de Eriksson (1000XSIGMA-1511), 0,5 mg/L de HCl tiamina, 30,0 g/L sucrose e2,0 mg/L de 2,4-D e 2,88 g/L de L-prolina (levado ao volumecom D-I H2O seguindo ajuste ao pH 5,8 com KOH); 3,0 g/L deGelrite (adicionado após avolumação com D-I H2O); e 0,85mg/L nitrato de prata e 3,0 mg/L de bialafos (ambosadicionados após esterilizar o meio e resfriar àtemperatura ambiente).O meio de regeneração de planta (288J) compreende 4,3g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução comumde vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L HCltiamina, 0,10 g/L de HCl piridoxina e 0,40 g/L de glicinaavolumados com D-I H2O polido) (Murashige and Skoog (1962)Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0,5 mg/Lzeatina, 60 g/L de sucrose, e 1,0 mL/L de ácido abscíssico0,1 mM (avolumado com D-I H2O polido após ajuste ao pH5,6); 3.0 g/L de Gelrite (adicionado após avolumação com D-I H2O); e 1.0 mg/L ácido indoleacético e 3,0 mg/L debialafos (adicionado após esterilizar o meio e resfriamentoa 60 ° C). O meio livre de hormônio (272V) compreende 4,3 g/Lde sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução comum devitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L HCltiamina, 0,10 g/L de HCl piridoxina e 0,40 g/L de glicinaavolumados com D-I H2O polido), 0,1 g/L de mio-inositol, e40,0 g/L de sucrose (avolumados com D-I H2O polido apósajuste ao pH 5,6); e 6.0 g/L de bacto-agar (adicionado apósavolumação com D-I H2O), esterilizado e resfriado a 60°C.
Exemplo 7. Transformação de Milho mediada porAgrobacterium
Para a transformação de milho mediada porAgrobacterium com uma seqüência ZmDGATl-2 (ASK) de Id. deSeq. n° 47 ou uma seqüência ZmDGATl-2 (EF09B) de Id. deSeq. n° 51, o método de Zhao é empregado (Patente U.S. denúmero 5.981.840, e publicação de patente PCT W098/32326;os conteúdos das quais estão aqui incorporados porreferência). De forma breve, embriões imaturos são isoladosdo milho e os embriões contatados com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias são capazes de transferira seqüência ZmDGATl - 2 (ASK) de Id. de Seq. n° 47, ouZmDGATl-2 (EF09B) de Id. de Seq. n° 51, ligada de formaoperativa a um promotor de interesse a pelo menos umacélula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1:etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos sãoimersos em uma suspensão de Agrobacterium para a iniciaçãode inoculação. Os embriões são co-cultivados por um tempocom o Agrobacterium (etapa 2: etapa de co-cultivação) . Osembriões imaturos são cultivados em meio sólido após aetapa de infecção. Após este período de co-cultivação umaetapa de "descanso" opcional é considerada. Nesta etapa dedescanso, os embriões são incubados na presença de pelo umantibiótico conhecido para inibir o desenvolvimento deAgrobacterium sem a adição de um agente seletivo paratransformantes de planta (etapa 3: etapa de descanso) . Osembriões imaturos são cultivados em meio sólido comantibiótico, mas sem um agente de seleção, para eliminaçãode Agrobacterium e para uma fase de descanso para ascélulas infectadas. A seguir, os embriões inoculados sãocultivados em meio contendo um agente seletivo e calostransformados em desenvolvimento são recuperados (etapa 4:etapa de seleção). Os embriões imaturos são cultivados emmeio sólido com um agente seletivo resultando nodesenvolvimento seletivo de células transformadas. 0 calo éentão regenerado em plantas (etapa 5: etapa deregeneração), e preferivelmente, os calos desenvolvidos emmeio seletivo são cultivados em meio sólido para regenerarplantas.
Exemplo 8. Transformação do Embrião de SojaA. Condições de Cultivo
Culturas de suspensão embriogênicas de soja (cv.Jack) são mantidas em 3 5 mL de meio líquido SB 196 (verreceitas abaixo) em um agitador rotativo, 150 RPM, 260C comluzes fluorescentes brancas frias em fotoperíodo de 16:8 hdia/noite a intensidade de luz de 60 a 85 μΕ/ιη2/3. Oscultivos são sub-cultivados a cada 7 dias a duas semanasinoculando-se aproximadamente 35 mg de tecido em 35 mL deSB196 líquido fresco (o intervalo de sub-cultivo preferidoé a cada 7 dias).
Os cultivos de suspensão embriogênica de soja sãotransformados com os plasmídeos e fragmentos de DNAdescritos nos seguintes exemplos pelo método de bombardeiopor pistola de partículas (Klein e outros, (1987) Nature327 : 70) .
B. Iniciação de Cultivo de Suspensão Embriogênica deSoja
Os cultivos de soja são iniciados duas vezes a cadamês com 5 a 7 dias entre cada iniciação.
Vagens com sementes imaturas de pés de sojadisponíveis após 45 a 55 dias de plantio foram escolhidas,removidas de suas cascas e colocadas em uma caixa magentaesterilizada. As sementes de soja são esterilizadasagitando-as por 15 minutos em solução de Clorox a 5% com 1gota de sabão marfim (95 mL de água destilada autoclavadamais 5 mL de Clorox e 1 gota de sabão) . Misturar bem. Assementes são rinsadas utilizando-se 2 garrafas de 1 litrode água destilada esterilizada e destas menos de 4 mm sãocolocadas em lâminas de microscópio individuais. A pequenaextremidade das sementes é cortada e os cotilédonespressionados para fora do revestimento da semente. Oscotilédones são transferidos a placas contendo meio SBl (25a 30 cotilédones por placa). As placas são embrulhadas comfita de fibra e armazenadas por 8 semanas. Após esteperíodo embriões secundários são cortados e colocados emmeios líquidos SB 196 por 7 dias.
C. Preparação de DNA por Bombardeamento
Um plasmídeo intacto ou um fragmento de plasmídeo deDNA contendo os genes de interesse o gene marcadorselecionável são utilizados para bombardeamento. 0 DNA deplasmídeo para bombardeamento é rotineiramente preparado epurificado utilizando-se métodos descritos nos Protocolos eGuia de Aplicações Promega™, Segunda Edição (página 106).Fragmentos dos plasmídeos transportando a seqüênciaZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47, ou a seqüênciaZmDGATl - 2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51, ligada de formaoperativa a um promotor de interesse são obtidos porisolamento com gel de plasmídeos duplamente digeridos. Emcada caso, 100 μg de DNA de plasmídeos são digeridos em 0,5mL da mistura de enzima específica que é apropriada para oplasmídeo de interesse. Os fragmentos de DNA resultantessão separados por eletroforese em gel em agarose GTGSeaPlaque a 1% (BioWhitaker Molecular Applications) e osfragmentos de DNA contendo a sequencia ZmDGATl-2 (ASK) deId. de Seq. n° 47, ou a sequencia ZmDGATl-2 (EF09B) de Id.de Seq. n° 51, ligada de forma operativa a um promotor deinteresse são cortados do gel de agarose. 0 DNA épurificado da agarose utilizando-se a enzima digestivaGELase seguindo-se o protocolo do fabricante.
Uma alíquota de 50 μ]^ de água destilada estérilcontendo 3 mg de partículas de ouro (3 mg de ouro) éadicionada a 5 μL de uma solução de DNA de 1 μg/μL (sejaplasmídeo intacto ou fragmento de DNA preparado comodescrito acima), 50 μL de CaCl2 2,5 M e 20 μL deespermidina a 0,1 Μ. A mistura é agitada por 3 minutos nonível 3 de um agitador de vórtice e girada pro 10 segundosem uma centrífuga de mesa. Após uma lavagem com 400 μL deetanol a 100% a pelota é suspensa por sonicação em 40 μL deetanol a 100%. Cinco μL de suspensão de DNA são dispensadosem cada disco voador do instrumento Biolistic PDS1000/HE.Cada alíquota de 5 μL contém aproximadamente 0,375 mg deouro por bombardeio (ou seja, por disco).
D. Preparação de Tecido e Bombardeio com DNA
Aproximadamente 150 a 200 mg de cultivos de suspensãoembriônica com 7 dias são colocados em uma placa de Petride 60 χ 15 mm estéril vazia e a placa é coberta com umamalha de plástico. O tecido é bombardeado com 1 a 2disparos por placa com pressão de ruptura de membranaajustada a 7,58 MPa e a câmara evacuada a um vácuo de 91,43KPa a 94,82 KPa. O tecido é colocado a aproximadamente 8,9cm da tela de retenção.
E. Seleção de Embriões Transformados
Os embriões transformados são selecionados ouutilizando-se higromicina (quando o gene da higromicinafosfotransferase, HPT, é utilizado como um marcadorselecionável) ou clorsulfurona (quando o gene daacetolactato sintase, ALS, é utilizado como o marcadorselecionável).
F. Seleção por Higromicina (HPT)
Após o bombardeio, o tecido é colocado em meio SB 196fresco e cultivado conforme descrito acima. Seis dias apóso bombardeio, o SB 196 é trocado por SB 196 fresco contendoum agente de seleção de higromicina a 3 0 mg/L. Este meio deseleção é renovado semanalmente. Quatro a seis semanas pós-bombardeamento, um tecido transformado verde pode serobservado desenvolvendo-se a partir de grupos embriogênicosnecróticos não transformados. O tecido verde isolado éremovido e inoculado em placas de multicavidades para gerarnovas culturas em suspensão embriogênicas transformadas,propagadas de forma clonal.
G. Seleção por Clorsulfurona (ALS)
Após o bombardeio, o tecido é dividido entre 2 frascoscom meio SB 196 fresco e cultivado conforme descrito acima.Seis a sete dias após o bombardeio, o SB 196 é trocado porSB 196 fresco contendo um agente de seleção declorsulfurona a 100 ng/mL. Este meio de seleção é renovadosemanalmente. Quatro a seis semanas pós-bombardeamento, umtecido transformado verde pode ser observado desenvolvendo-se a partir de grupos embriogênicos necróticos nãotransformados. 0 tecido verde isolado é removido einoculado em placas de multicavidades contendo SB 196 paragerar novas culturas em suspensão embriogênicastransformadas, propagadas de forma clonal.
H. Regeneração de Embriões Somáticos de Soja emPlantas
A fim de se obter plantas completas a partir decultivos de suspensão embriogênica, o tecido deve serregenerado.
I. Maturação do Embrião
Os embriões são cultivados por 4 a 6 semanas a 260C emSB 196 sob lâmpadas (40 watts) fluorescentes brancas frias(Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW) e Agro(Phillips F40 Agro) em um fotoperiodo de 16:8 h comintensidade de luz de 90 a 120 μΕ/ιη2/3. Após este períodoos grupos de embriões são removidos para um meio de agarsólido, SB 166, por 1 a 2 semanas. Os grupos são entãosubcultivados a um meio SB 103 por 3 semanas. Durante esseperíodo, embriões individuais podem ser removidos dosgrupos e selecionados pelo fenótipo de alto teor de óleo /alto teor de ácido oléico associado com a presença deZmDGATl-2 (ASK), ou conteúdo de óleo aumentado e/ouconteúdo de ácido oléico aumentado e/ou proporção de ácidooléico/ácido linoléico aumentada devido a superexpressão deZmDGATl-2 (EF09B) de teor normal de óleo. Deve serobservado que qualquer fenótipo detectável, resultando daexpressão dos genes de interesse poderia ser selecionadoneste estágio.
J. Dessecação e Germinação de Embrião
Os embriões individuais amadurecidos são dessecadoscolocando-os em uma pequena placa de petri (35x10 mm) poraproximadamente 4 a 7 dias. As placas são seladas com fitade fibra (criando uma pequena cÂmara de umidade). Osembriões dessecados são plantados em meio SB71-4 onde elessão deixados para germinar sob as mesmas condições decultura descritas acima. As plântulas germinadas sãoremovidas do meio de germinação e rinsadas completamentecom água e então plantadas em Redi-Earth em bandeja de 24células, cobertas com domos de plástico transparente. Após2 semanas o domo é removido e as plantas enrijecem por umasemana adicional. Se as plântulas aparentarem estar forteselas são transplantadas a vasos de 25,4 cm com Redi-Earthcom até 3 plântulas por vaso. Após 10 a 16 semanas, assementes maduras são colhidas, cortadas e analisadas quantoa proteínas.
K. Receitas de Meios
1. SB 196 - Meio de proliferação líquido FN Lite (porlitro)
MS FeEDTA - IOOx estoque 1 10 mlSulfato MS - 100x estoque 2 10 mlFN Lite Halides - IOOx estoque 3 10 mlFN Lite P,B,Mo - 100x estoque 4 10 mlVitaminas B5 (1 mL/L) 1,0 ml2,4-D (10 mg/L concentração final) 1,0 mlKNO3 2,83 gm(NH4)2 SO 4 0,463 gmAsparagina 1,0 gmSucrose (1%) 10 gmpH 5, 8
Soluções Estoque FN Lite
Estoque # MS Fe EDTA IOOx Estoque 1000 mL 500 mLNa2 EDTA* 3,724 g 1,862 gFeSO4 - 7H20 2,784 g 1,392 g
* Adicionar primeiro, dissolver em garrafa escura durante agitação2 MS Sulfato IOOx estoque
MgSOi -7H20 37,0 g 18,5 gMnSO4 -H2O 1,69 g 0,845 gZnSO4 -7H20 0,86 g 0,43 gCuSO4 -5H20 0,0025 g 0,00125 g
Haletos FN Lite 100x EstoqueCaCl2 -2Η20 30,0 g 15,0 g
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Meio sólido SBl (por litro) compreende: 1 Pct. deSais MS (Gibco / BRL - N0 de Cat. 11117-066); 1 mL devitaminas B5 l.OOOx estoque; 31,5 g sucrose; 2 mL 2,4-D (20mg/L de concentração final); pH 5,7 e 8 g de TC agar.
Meio sólido SB 166 (por litro) compreende: 1 Pct. deSais MS (Gibco / BRL - N0 de Cat. 11117-066); 1 mL devitaminas B5 l.OOOx estoque; 60 g maltose; 750 mg dehexahidrato de MgCl2; 5 g de carvão ativado; pH 5,7 e 2 gde Gelrite.
Meio sólido SB 103 (por litro) compreende: 1 Pct. deSais MS (Gibco / BRL - N0 de Cat. 11117-066); 1 mL devitaminas B5 l.OOOx estoque; 60 g maltose; 750 mg dehexahidrato de MgCl2; pH 5,7 e 2 g de Gelrite.
Meio sólido SB 71-4 (por litro) compreende: 1 garrafade sais B5 Gamborg com sucrose (Gibco / BRL - N° de Cat.21153-036); pH 5,7; e 5 g de TC agar.
2,4-D de estoque é obtido pré-pronto de Phytotech, n°de cat. D 295 - concentração é de 1 mg/mL.
Vitaminas B5 de estoque (por 100 mL) que é armazenadaem alíquotas a -20°C compreende: 10 g de mioinositol; 100mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCl; e 1 g detiamina. Se a solução não dissolver rápido o suficiente,aplicar um nível baixo de calor através da placa deagitação a quente. A clorsulfurona de estoque compreende 1mg/mL em hidróxido de amônio 0,01 N.
Exemplo 9. Identificadores de Sequencia
A Tabela 4 fornece um resumo dos identificadores deseqüência para os Ioci marcadores e seqüências associadasaqui mencionadas.
Tabela 4
Resumo de Identificadores de Seqüência
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Exemplo 10: Mapeamento Final de QTL6 a um Único Gene(DGAT1-2)
Para mapear a QTL6 até um único gene, novos marcadoresSNP foram desenvolvidos a partir de 3 seqüências de clonede BAC e utilizados para genotipar aproximadamente 4.000mudas de BC5S1 segregando QTL6. Os dados de óleo e ácidooléico foram obtidos a partir de 14 recombinantes críticos.OS dados mostram que a QTL6 está localizada entre BAC 17 eBAC 22, uma região de aproximadamente 5,0 kb, contendo aseqüência de codificação para a metade de C-terminal deDGATl-2 (4050 bp; codificando aminoácidos 196 a 495), o 3'UTR (409 bp), e possivelmente a região terminal (542 bp) deDGATl-2 (Figura 40). Desta forma, a QTL6 foi mapeada a umaregião em um único gene, DGATl-2. Os dados também mostramque esta região controle tanto as concentrações de óleoquanto de ácido oléico do embrião uma vez que nenhumasegregação entre fenótipos de alto teor de óleo e alto teorde ácido oléico foi observada neste intervalo.
Conforme mostrado na Tabela 3 acima, há apenas 4mudanças de aminoácido em DGAT1-2 do alelo de alto teor deóleo, alto teor de ácido oléico ASK (isto é, ZmDGATl-2(ASK) mostrado na Id. de Seq. n° 48) quando comparado aoDGATl-2 do alelo de teor de óleo normal (isto é, ZmDGATl-2(EF09B) mostrado em Id. de Seq. n° 52). Estas mudançasincluem a substituição Val45 h> Gly45; a substituição Pro55 -»Ser55; deleção do resíduo de glutamina correspondendo aGln64 ou Gln65 ou Gln66 ou Gln67 de DGATl-2 do alelo EF09B; ea inserção de Phe467 ou Phe468 ou Phe469 em DGATl-2 do alelode alto teor de óleo ASK. Na posição de mapeamento final deQTL6 (entre Bac 17 e Bac 22) , a inserção Phe467 ou Phe468 ouPhe469em DGATl-2 do alelo ASK é a única mudança de aminácidoentre os dois parentes de mapeamento (ilustrados comoinserção Phe469 (/469F) na Figura 40) . Isto sugere que opolimorfismo no alelo de alto teor de óleo, alto teor deácido oléico ASK que resulta na inserção de Phe467 ou Phe468ou Phe469 em DGATl-2 do alelo ASK desempenha um papelcrucial em aumentar o conteúdo de óleo e ácido oléico.
Exemplo 11: Conformação de QTL6 em Milho Transgênico
O resultado do mapeamento fino descrito no Exemplo 10acima foi conformado no milho transgênico. As construçõescontendo promotor de oleosina 16-kD de embrião preferidoguiando a expressão do alelo ASKC28IB1 (chamado de ASK; Id.de Seq. n° 47) ou EF09B (Id. de Seq. n° 51) do cDNA DGATl-2foram transformadas em milho por infecção de Agrobacterium.
As construções também continham um DS-RED direcionado porum promotor de proteína 2 de transferência de lipidioespecífico de aleurona (LTP2) para facilitar a segregaçãode cernes transgênicos e nulos para análise fenotípica. Osdados de óleo e perfis de ácidos graxos foram obtidos decernes Tl segregados.
Em média, a superexpressão do alelo ASK leva a umaumento de 27%, 26% e 80% na concentração de óleo doembrião, na concentração de óleo da semente e concentraçãode ácido oléico, e um decréscimo de 28% nas concentraçõesde ácido linoléico, cerca de 2 a 3 vezes os efeitoscausados pelo alelo EF09B (Figura 41). Os aumentos causadospela superexpressão do alelo ASK foram também maissignificantes que aqueles causados pelo alelo ASKC28IB1nativo observado em BC4S2 NILs (Figure 41). Os cernestransgênicos superexpressando o alelo EFO9B de DGATl-2também apresentaram mudanças em todos os quatro traços.DGAT catalisa a etapa final em biossíntese de óleo e temsido implicada como a taxa que limita a etapa. Sem estarpreso por qualquer teoria ou mecanismo de ação, asuperexpressão do alelo EF09B de DGAT1-2 provavelmentesupera esta etapa limitante de taxa levando a mudançasnestes quatro traços de óleo.
Juntos, estes dados indicam que DGATl-2 é o genelcausador para QTL6 e é responsável pelos conteúdosaumentados de óleo e ácido oléico no milho.
Exemplo 12: DGAT 1-2 e inserção de resíduo defenilalanina crítico confirmado com Gene QTL6 em levedura
Conforme notado acima, o resíduo extra de fenilalaninalocalizado na posição 469 da proteína DGAT1-2 para o aleloASKC28IB1 (isto é, Phe46S de Id. de Seq. n°:48, tambémreferido como F469) quando alinhado com a proteína DGAT 1-2com teor normal de óleo para o alelo EF09B (ver Figura 30B)pode representar o resultado de uma inserção deste resíduoentre os pares seguintes de resíduos na proteína DGAT 1-2com teor normal de óleo correspondente (Id. de Seq. n°:52)para o alelo EF09B entre Trp467 e Phe468 de Id. de Seq.n°:52, entre Phe468 e Phe469 de Id. de Seq. n°:2 ou entrePhe469 e Ser470 de Id. de Seq. n° :2. Para determinar se ainserção representada pelo resíduo na posição 467, 468, or469 da proteína DGATl-2 para o alelo ASKC28IB1 éresponsável pelos fenótipos de alto teor de óleo/alto teorde ácido oléico, as atividade enzimáticas de DGAT 1-2 apartir de diferentes alelos de DGAT 1-2 foi medida emlevedura.
Uma cepa de deleção Saccharomyces cerevisiae DGAl(DGAT) (Id. de clone 12501) foi adquirida a partir deInvitrogen e usada para criar um mutante duplo (AyDGAT,AyPDAT) deficiente na biossíntese de TAG pela remoção dogene LROl (fosfolipídeo:diacilglicerol aciltransferase, ouPDAT) usando-se recombinação homóloga. 0 alelo ASKC28IB1 ouORF de EF09B (ZmDGAT 1-2 (ASK) de Id. de Seq. n°:47 e ORF deZmDGAT 1-2(EF09B) de Id. de Seq. n°:51, respectivamente) ousuas formas mutantes (ORF de ZmDGAT 1-2 (ASK) com o códonTTC nas posições nt 1405-1407 deletadas, codificando oZmDGAT 1-2(ASK) mutante possuindo a seqüência exposta emId. de Seq. n°:48 com o resíduo Phe469 deletado; e OFR deZmDGAT 1-2(EF09B) com um códon de TTC inseridoimediatamente depois de nt 1407 Id. de Seq. n°:51, encodingo ZmDGAT 1-2(EF09B) mutante possuindo a seqüência expostaem Id. de Seq. n° : 52 com uma inserção do resíduo defenilalanina entre Phe469 e Ser470 de Id. de Seq. n°:52)foram clonado em PTS416 (Stratagene) contendo um promotorde 1.0 kb e um finalizador de 0,5 kb a partir de S.cerevisiae 3-fosfoglicerato quinase (PGKl). Os plasmídeosresultantes e vetor apenas foram usados para transformar omutante duplo de levedura.
A quantidade de Tag nas células transformadas foideterminada. Resumidamente, 20 mL de meio de crescimento decultura de levedura para 54 horas foram colhidos. Lipasesforma inativadas pelo aquecimento a 80°C por 10 minutos napresença de 1 mL de isopropanol. As células foram lisadaspor vórtice na presença de o,5 mL de contas de vicro e 0,5mL de ácido acético 0,15 M. Como um controle interno, 50 μgde TAG (C17:0) foram adicionados a cada amostra. Oslipídeos totais foram extraídos com 3 mL de tampão deextração (clorofórmio:metanol=2:1), lavado com 1,5 mL declorofórmio. A fase orgânica foi combiada e seca sobcorrente de nitrogênio, então dissolvida em 100 μL declorofórmio. Métade das amostras (50 μL) formam carregadossobre plantas de TLC, desenvolvidos com hexano/éter/ácidoacético (70:30:1) e seguido por um breve tingimento comvapor de iodo. As faixas correspondentes forma raspadaspara análise com GC similar aquela descrita acima. Osconteúdos totais de TAG foram calculados com base na somade valores experimentais para C16:0, C16:lf C18:0, e C18:l.
O método de Milcamps e outros (2005) J. Biol. Chem.280:5370-5377 foi seguido com menores mudanças parapreparação de proteína microsoma. Culturas de leveduraforma desenvolvidas para começar a fase estacionária emmeio de SC menos uracila. Seguindo-se a colheira, aspelotas de levedura foram ressuspensas em 4 mL de 20 mMTris-HCl, pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mMDTT, e 0,3 M (NH4)2SO4. 2 mL de contas de vidro foramadicionados, e células foram lisadas por vórtice por 5minutos. O lisato foi centrifugado por 15 min a 1500 g a6°C. O sobrenadante foi então centrifugado a 100.000 g por1,5 h a 6°C. O pelete microssomal foi ressupenso em 500 μLde fosfato de potássio 100 mM, pH 7,2 contendo 10% deglicerol e foi congelado em nitrogênio líquido antes daarmazenagem a -80°C. As concentrações de proteína formadeterminadas pelo método de Bradford, usando-se o reagenteCoomassie Plus (Pierce), com albumina bovina sérica como umpadrão.
Os ensaios de DGAT foram feitos por 1 min a 25°C, comfosfato de potássio 50 mM pH 7,2, oleoil-coenzima A marcadacom I-14C 10 μΜ (50 mCi/mmol, Perkin Elmer), e 20 μg deproteína microsomal em um volume total de reação de de 10 0μL de volume. A reação foi iniciada adicionando-se proteínamicrosoma. O ensaio foi interrompido e os lipídeos foramextraído com 2 mL of hexano: isopropanol (3:2) (Hara e Radin(1978) Anal. Biochem. 90:420-426) contendo 4 μL detriacilglicerol não marcado (trioleína, Sigma). Seguindo-seo vórtice por 10 segundos, as fases foram separadas com 1mL de sulfato de sódio 500 mM e o vórtice foi novamentefeito por 10 segundos. Após 10 minutos, a fase superior foitransferida a um outro tubo e seca com nitrogÊnio gasoso. Olipideo foi ressolubilizado em um pequeno volume de hexano(aproximadamente 100 a 150 μΐι) e aplicado a placas de TLCcom K6 sílica, que foram desenvolvidas em 80:20:1 (v/v)hexano:dietileéer:ácido acético. Triacilglicerol foivisualizado e marcado corando-se com vapor de iodo. Após amancha ter descorado, o triacilglicerol foi raspado, eradioactividade foi determinada por contagem de cintilaçãolíquida.
Células de levedura contendo o ORF de (ZmDGATl-2(ASK)do alelo ASKC28IB1 DGATl-2 expostos em Id. de Seq. n°:47)possuíam atividade de enzima DGAT 2 a 3 vezes maior queaqueles contento o ORF (ZmDGAT 1-2(EF09B) do alelo EF09BDGAT 1-2 mostrado em Id. de Seq. n°:51. De forma maisimportante, quando Phe469 foi deletado de DGATl-2 do aleloASKC28IB1 (usando-se o ORF de ZmDGAT 1-2(ASK) mutante ondent 1405-1407 (códon TTC) de Id. de Seq. n°:47 foramdeletados), a atividade da enzima DGAT dentro destascélulas de levedura foi reduzida a um nível similar àqueleobsercado para células de leveduras contendo o alelo EFO9BDGAT 1-2. Inserindo-se um resíduo de fenilalanina entrePhe 469 β Ser470 do DGAT 1-2 com teor normal de óleo (usando-se o ORF de ZmDGAT 1-2(EF09B) mutante com um códon TTCinserido imediatamente depois de nt 1407 de Id. de Seq.n°:51), que resulta em um ZmDGAT 1-2(EF09B) mutante com oresíduo de fenilalanina correspondendo a Phe469 da proteínaZmDGAT 1-2(ASK), restaurou a atividade da enzima ao nívelobsercado para células de levedura compreendendo o aleloASKC28IBl (isto é, OFR de ZmDGAT 1-2 (ASK) de Id. de Seq.η° : 47) . Ver Figura 42A. A quantidade de TAG acumuladanestas células correlacionam-se muito bem com o nível deatividades de DGAT (Figura 42B) . Estes resultados indicamnovamente que DGAT 1-2 é o gene responsável por QTL6 e queum resíduo de aminoácido único, Phe469 dentro da proteínaZmDGAT 1-2(ASK) é responsável pela atividade aumentada daenzima DGAT e acúmulo de Tag na levedura.
Exemplo 13: Alelo ASKC28IB1 de DGATl-2 está associadocom o germeplasma de alto teor de óleo/alto cteor de ácidooléico
Conforme mostrado na Figura 33, o resíduo Phe469 (F469)parece estar presente em todos os DGATs tipo I de plantas eestá apenas ausente a partir de certos consanguíneos demilho com conteúdos normais de óleo. Para determinar quealelo é ancestral no milho, um fragmento de DNA circundandoa localização do códon para F469 foi amplificado a partir de5 0 acessos das linhas de Teosinte usando-se Id. de Seq.noS: 126 e 127 como iniciadores, e os produtos de PCRresultantes foram sequenciados. Os resutados dosequenciamento mostram que todas as 50 linhas de Teosintecontêm F469, possuindo o mesmo alelo do consanguíneoASKC2 8IB1 de milho, sugerindo que o alelo ASKC28IB1 com F469é ancestral e que o alelo EF09B é uma mutação por deleção.
0 mesmo fragmento de DNA de 73 consanguíneos de milhoproprietário e público com vários níveis de concentraçõesde óleo e ácido oléico no embrião foi amplificado esequenciado. Os resultados mostram que o alelo ASKC28IB1com F4 69 é encontrado exclusivamente em consanguíneos demilho com alto teor de óleo e alto conteúdo de ácido oléico(Figura 43A).Como uma comparação, um fragmento de DNA daextremidade 5' do gene DGATl-2 abrangendo a região quecompreende todas as três mudanças de aminoácido descritasmais cedo (a substituição de Val45 —> Gly45 (também referidacomo V4 5G) ); a substituição Pro55 —> Ser55 (também referidacomo P55S) e a deleção do resíduo de glutaminacorrespondente a Gln64 ou Gln65 ou Gln66 ou Gln67 de DGATl-do alelo EF09B (também referida como Q64 ou Q65 ou Q66 ouQSl) foi amplificado e sequenciado (usando-se Id. de Seq.n°s: 124 e 125). Contrariamente a F469, os alelos ASKC28IB1para estes três aminoácidos não estão exclusivamenteassociados com consanguíneos de milho de alto teor de óleoe alto teor de ácido oléico. Por exemplo, Gly45 (tambémreferido como G45) encontrado em ASKC28IB1 é tambémencontrado em consanguíneos de milho com níveis de normal abaixo de óleo e ácido oléico, não exclusivamente no grupoácido de alto teor de óleo e alto teor de ácido oléico(Figura 43B). Estes dados são consistentes com o mapeamentofino de QTL6 e resultados da expressão de levedura.
Exemplo 14: QTL 6 (DGAT1-2) e FAD 2 possuem efeitosaditivos na concentração de ácido oléico crescente
0 gene FAD2 de milho codifica uma desnaturase de ácidograxo delta-12 que catalisa a desnaturação de ácido oleicoà forma de ácido linileico. A variação alélica no gene FAD2é um principal contribuidor para os níveis de ácido oleicoem germeplasma de milho. GR1B5 consanguíneo proprietáriocontém um alelo favorável para o conteúdo de ácido oléico epossui um nível de ácido oléico de cerca de 40%. Paradeterminar se QTL 6 e o FAD 2 em GR1B5 são aditivos, umacruza foi feita entre GR1B5 e uma linha BC3S2 de QTL6 (nabase de EF09B) contendo alelos homozigóticos ASKC28IB1 parao gene DGAT1-2, e sementes F2 foram subsquentementeproduzidas. Os genótipos de DGAT1-2 e FAD2 foramdeterminados em 200 sementes F2 segregadas de uma espiga. Aconcentração de ácido oléico para cada semente foi tambémdeterminada. Os níveis de ácido oléico nos diferentesgrupos de genótipo foram comparados. Os dados mostram queos genes QTL6 (DGAT1-2) e FAD2 possuem efeitos aditivos noaumento da concentração de ácido oléico (Figura 44) .
Sementes F2 contendo alelos ASKC28IB1 homozigóticos deDGATl-2 e alelos não favoráveis homozigóticos de FAD2possuem um nível de ácido oléico de aproximadamente 38%,enquanto que as sementes que contém alelos favoráveishomozigóticos de FAD2 apenas possuem um conteúdo de ácidooléico de 40%. Por outro lado, os níveis de ácido oléicoda semente são maiores que 50% quando alelos favoráveishomozigóticos para DGATl-2 e FAD2 estão presentes.
O efeito aditivo para aumentar a concentração de ácidooléico empilhando-se o alelo DGATl-2(ASK) de alto teor deóleo e alto teor de ácido oléico com alelos de FAD 2favoráveis pode também ser alcançado por métodostransgênicos. Por exemplo, linhas transgênicas de milhodesejáveis para a seqüência de ORF de ZmDGATl-2 (ASK) e umaseqüência inibitória que tem como alvo a expressão de FAD2são produzidas. Qualquer seqüência inibitória que reduza ouelimine a expressão de FAD2 pode ser usada para diminuir aatividade/expressão de FAD2 de forma que a conversão deácido oléico a ácido linoleico seja inibida, favorecendoassim o acúmulo de ácido oléico. Exemplos de seqüências depolinucleotídeo inibitórias de FAD2 e construçõesinibitórias incluem, mas não estão limitadas àquelasdescritas na Publicação do Pedido de Patente U. S. denúmero 2005-0160494 e WO 2005/063988, aqui incorporados porreferência integralmente.
Desta forma, as plantas transgênicas compreendendo oORF de ZmDGATl-2(ASK) de Id. de Seq. n°:47 e um cassete deexpressão compreendendo a seqüência inibitória de FAD2exposta em Id. de Seq. n° : 133 são produzidas a fim deconferirem efeito aditivo de concentração de ácido oléicoaumentada em sementes destas plantas transgênicas alémdaquele associado à presença do ORF de ZmDGATl-2(ASK).Estas plantas transgênicas são obtidas empilhando-se aseqüência de ORF de ZmDGATl-2(ASK) com esta seqüênciainibitória de FAD2, por exemplo, por cruzamento tradicionalde uma linha de planta transgênica compreendendo um cassetede expressão que compreende a seqüência inibitória de FAD2com uma linha de planta compreendendo o lócus marcador deZmDGAT 1-2 favorável definido por ZmDGATl-2(ASK) de Id. deSeq. n°:47. Com este método de empilhamento, a linha queplanta que porta o lócus marcador de ZmDGAT 1-2 favorável éobtida através de métodos de cruzamento tradicionais, ou éobtida através de um método transgênico, por exemplo,através de transformação com o cassete de expressãocompreendendo este lócus marcador favorável.
Alternativamente, o empilhamento é alcançado pormétodos transgênicos, onde uma linha de planta étransformada com o ORF de ZmDGAT 1-2(ASK) operativãmenteligado a um promotor que é funcional em uma célula deplanta, e um cassete de expressão compreendendo a seqüênciainibitória de FAD2. 0 ORF de ZmDGAT 1-2 (ASK) e o promotoroperativamente ligado são introduzidos na planta em umcassete de expressão separado, em um mesmo vetor ou em umvetor diferente, ou no mesmo cassete de expressão quecompreende a seqüência inibidora de FAD2 .
Todas as publicações e pedidos de patente mencionadosna especificação são indicativos do nível daqueleshabilitados na técnica à qual esta invenção pertence. Todasas publicações e pedidos de patente estão aqui incorporadospor referência na mesma medida como se cada publicação oupedido de patente individual fosse especificamente eindividualmente indicada para ser incorporada porreferência.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita emalguns detalhes por meio de ilustração e exemplos parapropósitos de clareza de compreensão, certas mudanças emodificações podem ser praticadas dentro do escopo dasreivindicações em anexo.

Claims (60)

1. Método para identificar uma primeira planta demilho ou um primeiro germeplasma de milho que possui umfenótipo selecionado a partir do grupo consistindo de umconteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácido oléicoaumentado, uma relação entre ácido oléico e ácido linoléicoaumentada, e quaisquer combinações destes, caracterizadopor compreender detectar na primeira planta de milho ou noprimeiro germeplasma de milho pelo menos um polimorfismodentro de um lócus marcador que está associado ao referidofenótipo da referida primeira planta de milho ou o referidoprimeiro germeplasma de milho, onde o referido lócusmarcador está geneticamente ligado com uma primeira regiãode QTL6 que é flanqueada por uma primeira seqüência deborda que compreende os nucleotídeos 1-20 de Id. de Seq.n°:2 e uma segunda seqüência de borda que compreende osnucleotídeos 477-495 de Id. de Seq. n°:46.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o lócus marcador estágeneticamente ligado com uma segunda região de QTL6 mapeadadentro da referida primeira região de QTL6, onde a referidasegunda região de QTL6 é flanqueada por uma primeiraseqüência de borda que compreende os nucleotídeos 1-20 deId. de Seq. n° : 6 e uma segunda seqüência de borda quecompreende os nucleotídeos 573-592 de Id. de Seq. n° : 14.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcadorestá geneticamente ligado com uma terceira região de QTL6mapeada dentro da referida primeira região de QTL6, onde areferida terceira região de QTL6 é flanqueada por umaprimeira seqüência de borda que compreende os nucleotídeos-1-20 de Id. de Seq. n°:10 e uma segunda seqüência de bordaque compreende os nucleotídeos 488-507 de Id. de Seq. n°:4.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o lócus marcador éselecionado a partir do grupo consistindo de Id. de Seq.n°s: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,-32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menos umpolimorfismo neste.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o referido polimorfismoocorre em, ou imediatamente depois, de uma ou mais posiçõesde nucleotídeo (nt) dentro do referido lócus marcador ou emum códon dentro do referido lócus marcador, onde asreferidas uma ou mais posições de nt ou do referido códonsão selecionadas a partir do grupo consistindo de:a) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:4selecionada a partir do grupo consistindo do nt 28, 204,-256, 302, 305, 341, 429, 461 e qualquer combinação destes;b) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n° : 6selecionada a partir do grupo consistindo do nt 43, 74,-208, 224 e qualquer combinação destes;c) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n° : 8selecionada a partir do grupo consistindo do nt 25, 55, 88,-100, 195, 223, 238, 242, 255, 279, 306, 307, 345, 399 equalquer combinação destes;d) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n° : 10selecionada a partir de nt 40, 41, 88, 89, 126, 134, 146,-218 e qualquer combinação destes;e) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:12selecionada a partir de nt 128, 195, 256, 257, 293, 294,- 295, 296, 327 e qualquer combinação destes;f) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n° : 14selecionada a partir de nt 262, 311 e qualquer combinaçãodestes;g) nt 428 de Id. de Seq. n° : 16;h) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n° : 18selecionada a partir de nt 119, 396, 420 e qualquercombinação destes;i) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:20selecionada a partir de nt 194, 258, 259, 260, 365, 366,- 489 e qualquer combinação destes;j) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:22selecionada a partir de nt 48, 50, 56, 60, 63, 101, 133,- 166, 170, 179, 181, 206, 207, 211, 231, 237, 255, 273, 282,- 294, 312, 324, 343, 345, 358, 377, 381, 385, 387, 404 equalquer combinação destes;k) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:24selecionada a partir de nt 358, 359, 371, 421, 422, 423,- 425, 426 e qualquer combinação destes;l) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:26selecionada a partir de nt 28, 31, 35, 43, 50, 111, 117,- 143, 192, 197, 219, 266 e qualquer combinação destes;m) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:28selecionada a partir de nt 41, 62, 92, 158, 182, 194, 200,- 226, 229, 349 e qualquer combinação destes;n) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:30selecionada a partir de nt 102, 145, 162, 165, 198, 199,- 221, 247, 251, 253, 306, 331, 352, 451, 461, 464 e qualquercombinação destes;o) uma posição de nt dentro de Id. de Seq. n°:32selecionada a partir de nt 61, 73, 87, 143, 199, 208, 209,-210, 211, 225, 327, 328, 335 e qualquer combinação destes;p) pelo menos uma posição de nt dentro de Id. de Seq.n°:51 selecionada a partir de nt 134 e 163;q) um códon dentro de Id. de Seq. n°:51 correspondenteao nt 190-192 ou nt 193-195 ou nt 196-198 ou 199-201; er) nt 1401 ou nt 1404 ou nt 1407 de Id. de Seq. n°:51.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o referido polimorfismoresulta em uma mudança polimórfica dentro do referido lócusmarcador, onde a referida mudança polimórfica é selecionadaa partir do grupo consistindo das mudanças polimórficaslistadas na Tabela 2 aqui ou Tabela 3 aqui para o referidolócus marcador.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcadorcompreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5,-7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,29, 31, 33, 35,-37, 39, 41, 43, 45 ou 47, ou uma variante desta possuindopelo menos 90% de identidade de seqüência à seqüência parao referido lócus marcador, onde a referida variantecompreende pelo menos um dos referidos polimorfismos dentrodo referido lócus marcador.
8. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelofato de que o referido aumento no conteúdo de óleocompreende um aumento no óleo de semente, um aumento noóleo de germe ou ambos, um aumento no óleo de semente e umaumento do óleo de germe.
9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelofato de que o referido aumento no conteúdo de ácido oléicocompreende um aumento na concentração do ácido oléico dasemente, um aumento na concentração de ácido oléico dogerme, ou ambos, um aumento na concentração do ácido oléicoda semente e concentração de ácido oléico do germe.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o referido aumento nareferida relação entre ácido oléico e ácido linoleicocompreende um aumento na referida relação em semente, umaumento na referida relação no referido germe, ou ambos, umaumento na referida relação em semente e em germe.
11. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10,caracterizado pelo fato de que o referido primeirogermeplasma é uma linha de milho ou uma variedade de milho.
12. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11,caracterizado pelo fato de que o método também compreendeselecionar uma primeira planta de milho ou uma prole destesou o primeiro germeplasma de milho ou uma prole deste.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de também compreender cruzar aprimeira planta de milho selecionada ou germeplasma com umasegunda planta de milho ou germeplasma.
14. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11,caracterizado pelo fato de o método também compreenderintrogredir um lôcus QTL6 compreendendo pelo menos um dosreferidos polimorfisraos em uma segunda planta de milho ouum segundo germeplasma de milho para produzir uma planta demilho introgredida ou germeplasma de milho de milhointrogredido.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a planta de milhointrogredida ou germeplasma de milho introgredidoapresentam um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo deácido oléico aumentado, uma relação entre ácido oléico eácido linoleico aumentada, e quaisquer combinações destes,quando comparados à segunda planta de milho ou segundogermeplasma de milho.
16. Planta introgredida caracterizada pelo fato de serproduzida pelo método da reivindicação 15.
17. Polinucleotideo isolado caracterizado porcompreender pelo menos 12 nucleotideos consecutivos e ummarcador detectável, onde a referida seqüência dosreferidos 12 nucleotideos consecutivos compreende pelomenos 90% de identidade de seqüência ao complemento de umlõcus marcador exposto em Id. de Seq. n° : 1, 3, 5, 7, 9,-11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,-41, 43, 4 5 ou 47, onde o referido polinucleotideo podedetectar um polimorfismo em um lócus marcador associado comalto conteúdo de óleo, alto conteúdo de ácido oléico ouambos, alto conteúdo de óleo e alto conteúdo de ácidooléico.
18. Polinucleotideo isolado, de acordo com areivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referidopolinucleotideo compreende pelo menos 12 nucleotideosconsecutivos de Id. de Seq. n° : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,- 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45OU 47.
19. Planta ou parte de planta caracterizada porpossuir estavelmente incorporado em seu genoma umpolinucleotídeo heterólogo compreendendo pelo menos umaseqüência associada ao alto conteúdo de óleo ou pelo menosuma seqüência associada ao alto conteúdo de ácido oléicooperativãmente ligada a um promotor ativo na planta ouparte de planta, onde a referida seqüência associada aoalto conteúdo de óleo ou a referida seqüência associada aoalto conteúdo de ácido oléico é derivada de uma seqüênciade nucleotídeo genômico geneticamente ligada a pelo menosum lócus marcador favorável que está associado com o altoconteúdo de óleo ou de ácido oléico, onde o lócus marcadoré selecionado a partir do grupo consistindo de Id. de Seq.n° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,- 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menos umpolimorfismo neste, através do qual a expressão dopolinucleotídeo heterólogo compreendendo a seqüênciaassociada ao alto conteúdo de óleo ou a seqüência associadaao alto conteúdo de ácido oléico aumenta o conteúdo deóleo, aumenta o conteúdo de ácido oléico, aumenta a relaçãoentre o ácido oléico e o ácido linoleico, ou qualquercombinação destes, na planta ou parte da planta.
20. Planta ou parte de planta, de acordo com areivindicação 19, caracterizada pelo fato de que aseqüência associada ao alto conteúdo de óleo aumenta oconteúdo de óleo de germe da planta, o conteúdo de óleo desemente da planta, ou ambos, o conteúdo de óleo de germe eo conteúdo de óleo de semente da planta.
21. Planta ou parte de planta, de acordo com qualqueruma das reivindicações 19 ou 20, caracterizada pelo fato deque a seqüência associada ao alto conteúdo de ácido oléicoaumenta o conteúdo de ácido oléico de germe da planta, oconteúdo de ácido oléico de semente da planta, ou ambos, oconteúdo de ácido oléico de germe e o conteúdo de ácidooléico de semente da planta.
22. Planta ou parte de planta, de acordo com areivindicação 21, caracterizada pelo fato de que aseqüência associada ao alto conteúdo de ácido oléicoaumenta a relação entre ácido oléico e ácido linoleico nogerme da planta, na semente da planta ou em ambos, no germee na semente da planta.
23. Planta ou parte de planta, de acordo com qualqueruma das reivindicações 19, 20, 21 ou 22, caracterizada pelofato de que o referido polinucleotídeo compreendendo aseqüência associada ao alto conteúdo de óleo ou a seqüênciaassociada ao alto conteúdo de ácido oléico compreende umquadro de leitura aberto, um sRNA ou um miRNA.
24. Planta ou parte de planta, de acordo com qualqueruma das reivindicações 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizadapelo fato de que o polinucleotídeo compreendendo aseqüência associada ao alto conteúdo de óleo ou a seqüênciaassociada ao alto conteúdo de ácido oléico é isolado pelaclonagem posicionai e é identificado pela ligação a pelomenos um lócus marcador favorável.
25. Planta ou parte de planta, de acordo com qualqueruma das reivindicações 19, 20, 21, 22, 23 ou 24,caracterizada pelo fato de que a referida planta ou partede planta também possui estavelmente incorporada em seugenoma um polinucleotídeo heterólogo codificando um domínioLECl-tipo B possuindo uma seqüência de aminoácido expostaem Id. de Seq. n°:65 ou uma variante biologicamente ativaou um fragmento de Id. de Seq. n°:65, onde a referidavariante biologicamente ativa compreende pelo menos 80% deidentidade de seqüência à Id. de Seq. n°:65, o referidopolipeptídeo ou a variante biologicamente ativa oufragmento desta possuindo atividade de LECl.
26. Planta ou parte de planta, de acordo com areivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o referidopolinucleotídeo heterólogo codificando o domínio LECl-tipoB compreende a seqüência de polinucleotídeo exposta em Id.de Seq. n°:66 ou uma variante ou fragmento destacodificando uma variante de polipeptídeo ou fragmento depolipeptídeo possuindo atividade de LECl.
27. Planta ou parte de planta, de acordo com qualqueruma das reivindicações 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26,caracterizada pelo fato de que a referida planta ou partede planta também compreende um polinucleotídeo heterólogocompreendendo uma seqüência inibidora de FAD2 que é capazde inibir a expressão ou função de FAD 2 possuindo umaseqüência de aminoácido exposta em Id. de Seq. n° : 132 ouvariante biologicamente ativa ou um fragmento de Id. deSeq. n° : 132, onde a referida variante biologicamente ativacompreende pelo menos 8 0% de identidade de seqüência à Id.de Seq. n° : 132, o referido polipeptídeo ou a variantebiologicamente ativa ou fragmento desta possuindo atividadede FAD2.
28. Planta ou parte de planta, de acordo com areivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a referidaseqüência inibidora de FAD2 compreende a seqüência expostaem Id. de Seq. n°: 133.
29. Planta ou parte de planta, de acordo com qualqueruma das reivindicações 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27ou 28, caracterizada pelo fato de que a referida planta ouparte de planta compreende um alelo favorável para FAD2,onde o referido alelo favorável está associado com umfenótipo de alto conteúdo de ácido oléico na referidaplanta ou parte de planta.
30. Planta ou parte de planta, de acordo com qualqueruma das reivindicações 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,-28 ou 29, caracterizada pelo fato de que a referida plantaou parte de planta também compreende pelo menos um QTL comalto conteúdo de óleo adicional.
31. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29ou 30, caracterizada pelo fato de que a referida planta éuma monocotiledônea.
32. Planta, de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho, trigo, arroz, cevada, sorgo ou centeio.
33. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29ou 30, caracterizada pelo fato de que a referida planta éuma dicotiledônea.
34. Planta, de acordo com a reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que a dicotiledônea é soja,Brassica, girassol, algodão ou alfafa.
35. Semente transgênica caracterizada por serproduzida a partir da planta de qualquer uma dasreivindicações 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,- 30, 31, 32, 33 ou 34.
36. Grão transgênico caracterizada por ser produzidopela planta de qualquer uma das reivindicações 19, 20, 21,- 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34.
37. Método para produzir uma planta ou parte de plantapossuindo um fenótipo selecionado a partir do grupoconsistindo de conteúdo de óleo aumentado, conteúdo deácido oléico aumentado, relação entre ácido oléico e ácidolinoleico aumentada, e qualquer combinação destes, oreferido método caracterizado por compreender introduzir naplanta ou parte da planta um polinucleotídeo heterólogocompreendendo pelo menos uma seqüência associada ao altoconteúdo de óleo ou pelo menos uma seqüência associada aoalto conteúdo de ácido oléico operativamente ligada a umpromotor ativo na planta ou parte da planta, onde areferida seqüência associada ao altò conteúdo de óleo ou areferida seqüência associada ao alto conteúdo de ácidooléico é derivada de uma seqüência de nucleotídeo genômicogeneticamente liga.da a pelo menos um lócus marcadorfavorável que está associado ao alto conteúdo de óleo ou aoalto conteúdo de ácido oléico, onde o marcador éselecionado a partir do grupo consistindo de Id. de Seq.n° : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,- 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menos umpolimorfismo neste, através do qual a expressão dopolinucleotídeo compreendendo a seqüência associada ao altoconteúdo de óleo ou a seqüência associada ao alto conteúdode ácido oléico aumenta o conteúdo de óleo da planta ouparte da planta, aumenta o conteúdo de ácido oléico daplanta ou parte da planta, aumenta a relação entre o ácidooléico e o ácido linoleico da planta ou parte da planta, ouqualquer combinação destes.
38. Método, de acordo còm a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que a seqüência associada aoalto conteúdo de óleo aumenta o conteúdo de óleo de germeda planta, o conteúdo de óleo de semente da planta, ouambos, o conteúdo de óleo de germe e o conteúdo de óleo desemente da planta.
39. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que aseqüência associada ao alto conteúdo de ácido oléicoaumenta o conteúdo de ácido oléico de germe da planta, oconteúdo de ácido oléico de semente da planta, ou ambos, oconteúdo de ácido oléico de germe e o conteúdo de ácidooléico de semente da planta.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato de que a seqüência associada aoalto conteúdo de ácido oléico aumenta a relação entre ácidooléico e ácido linoleico no germe da planta, na semente daplanta ou em ambos, no germe e na semente da planta.
41. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37, 38, 39 ou 40, caracterizado pelo fato deque o referido polinucleotídeo compreendendo a seqüênciaassociada ao alto conteúdo de óleo ou a seqüência associadaao alto conteúdo de ácido oléico compreende um quadro deleitura aberto, um sRNA ou um miRNA.
42. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37, 38, 39, 40 ou 41, caracterizado pelofato de que o polinucleotídeo compreendendo a seqüênciaassociada ao alto conteúdo de óleo ou a seqüência associadaao alto conteúdo de ácido oléico é isolado pela clonagemposicionai e é identificado pela ligação a pelo menos umlócus marcador favorável.
43 . Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37, 38, 39, 40, 41 ou 42, caracterizado pelofato de que a referida planta ou parte de planta possuiestavelmente incorporado em seu genoma um polinucleotideoheterólogo operativamente ligado a um promotor ativo naplanta ou parte da planta, onde o referido polinucleotideoheterólogo codifica um polipeptideo possuindo um domínioLECl-tipo B possuindo uma seqüência de aminoácido expostaem Id. de Seq. n°:65 ou uma variante biologicamente ativaou um fragmento de Id. de Seq. n°:65, onde a referidavariante biologicamente ativa compreende pelo menos 8 0% deidentidade de seqüência à Id. de Seq. n°:65, o referidopolipeptideo ou a variante biologicamente ativa oufragmento desta possuindo atividade de LECl.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotideoheterólogo codificando o domínio LECl-tipo B compreende aseqüência de polinucleotideo exposta em Id. de Seq. n°:66ou uma variante ou fragmento desta codificando uma variantede polipeptideo ou fragmento de polipeptideo possuindoatividade de LECl.
45. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ou 44,caracterizado pelo fato de que a referida planta ou partede planta também compreende um polinucleotideo heterólogocompreendendo uma seqüência inibidora de FAD2 que é capazde inibir a expressão ou função de FAD 2 possuindo umaseqüência de aminoácido exposta em Id. de Seq. n° : 132 ouvariante biologicamente ativa ou um fragmento de Id. deSeq. n° : 132, onde a referida variante biologicamente ativacompreende pelo menos 80% de identidade de seqüência à Id.de Seq. n° : 132, o referido polipeptídeo ou a variantebiologicamente ativa ou fragmento desta possuindo atividadede FAD2.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45,caracterizado pelo fato de que a referida seqüênciainibidora de FAD2 compreende a seqüência exposta em Id. deSeq. n° : 133.
47. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 ou 46,caracterizado pelo fato de que a planta ou parte de plantacompreende um alelo favorável para FAD2, onde o referidoalelo favorável está associado com um fenótipo de altoconteúdo de ácido oléico na referida planta ou parte deplanta.
48. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou- 47, caracterizado pelo fato de que a referida planta ouparte de planta também compreende pelo menos um QTL comalto conteúdo de óleo adicional.
49. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47ou 48, caracterizado pelo fato de que a referida planta éuma monocotiledônea.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49,caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho, trigo, arroz, cevada, sorgo ou centeio.
51. Método, de acordo cora qualquer uma dasreivindicações 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47ou 48, caracterizado pelo fato de que a referida planta éuma dicotiledônea.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51,caracterizado pelo fato de que a dicotiledônea é soja,Brassica, girassol, algodão ou alfafa.
53. Método para identificar a presença de um lócusmarcador que está associado com um conteúdo de óleoaumentado, um conteúdo de ácido oléico aumentado, e/ou umarelação entre ácido oléico e ácido linoleico aumentada emuma planta de milho ou germeplasma de milho, onde oreferido lócus marcador está geneticamente ligado com umaprimeira região de QTL6 que é flanqueada por uma primeiraseqüência de borda que compreende os nucleotídeos 1-20 deId. de Seq. n° : 6 e uma segunda seqüência de borda quecompreende os nucleotídeos 573-592 de Id. de Seq. n°: 14, oreferido método caracterizado pelo fato de que compreende0 determinar a concentração de ácido oléico na semente dareferida planta de milho ou germeplasma de milho, onde umaconcentração de ácido oléico de pelo menos 35% é preditivada presença do referido lócus marcador dentro da referidaplanta de milho ou germeplasma de milho.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53,caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcadorestá geneticamente ligado com uma segunda região de QTL6mapeada dentro da referida primeira região de QTL6, onde areferida segunda região de QTL 6 é flanqueada por umaprimeira seqüência de borda que compreende os nucleotídeos- 1-20 de Id. de Seq. n° : 10 e a segunda seqüência de bordaque compreende os nucleotídeos 488-507 de Id. de Seq. n°:4.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54,caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcadorcompreende um polinucleotídeo codificando DGAT 1-2.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55,caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcadorcompreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:51 compelo menos um polimorfismo neste.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56,caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcadorcompreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:47.
58. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 53, 54, 55, 56 ou 57, caracterizado pelofato de que uma concentração de ácido oléico de menos decerca de 35% é preditiva de que a referida planta de milhoou germeplasma de milho não compreende o referido lócusmarcador dentro de seu genoma.
59. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 53, 54, 55, 56 ou 57, caracterizado pelofato de também compreender detectar a presença de umpolimorfismo em um lócus marcador compreendendo opolinucleotídeo exposto em Id. de Seq. n°:, onde o referidopolimorfismo resulta em uma mudança polimórfica selecionadaa partir do grupo consistindo de:a) uma substituição de aT —» G em nt 134 de Id. deSeq. n°:51;b) uma substituição de aC —> T na posição 163 de Id.de Seq. n°: 51;c) uma exclusão do códon CAG nas posições nt 190-192,-193-195, 196-198 ou 199-201 de Id. de Seq. n°:51; ed) uma inserção de códon TTC imediatamente depois dent 1401, 1404 ou 1407.
60. Planta de milho ou germeplasma de milhocaracterizada pelo fato de ser identificado como possuindoo referido lócus marcador de qualquer uma dasreivindicações 53, 54, 55, 56, 57, 58 ou 59.
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