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BRPI0708299A2 - composições e métodos para o transporte de moléculas com propriedades melhoradas de liberação através de barreiras biológicas - Google Patents

composições e métodos para o transporte de moléculas com propriedades melhoradas de liberação através de barreiras biológicas Download PDF

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BRPI0708299A2
BRPI0708299A2 BRPI0708299-1A BRPI0708299A BRPI0708299A2 BR PI0708299 A2 BRPI0708299 A2 BR PI0708299A2 BR PI0708299 A BRPI0708299 A BR PI0708299A BR PI0708299 A2 BRPI0708299 A2 BR PI0708299A2
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charge
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BRPI0708299-1A
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Paul A Wender
Elena A Goun
Lisa R Jones
Original Assignee
Univ Leland Stanford Junior
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Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS PARA O TRANSPORTE DE MOLECULAS COM PROPRIEDADES MELHORADAS DE LIBERAçAO ATRAVES DE BARREIRAS BIOLóGICAS São propostos conjugados de uma molécula carga com uma molécula transportadora, em que a molécula carga e a molécula transportadora são ligadas por covalência por um ligante liberável. A carga do conjugado pode ser um agente biologicamente ativo ou uma molécula repórter. A transportadora modula o transporte da carga através de uma barreira biológica (uma membrana celular, por exemplo) em comparação com o transporte da carga não conjugada. Os ligantes liberáveis adequados para uma conjugação rápida e fácil a diversos tipos de carga e transportadores são também propostos, juntamente com métodos para o uso de ligantes na síntese de conjugados.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRANSPORTE DE MOLÉCULAS COMPROPRIEDADES MELHORADAS DE LIBERAÇÃO ATRAVÉS DE BARREIRASBIOLÓGICAS
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS CORRELATOS
Este pedido reivindica o benefício de prioridade aopedido de patente provisório US No 60/777.341, depositadoem 27 de fevereiro de 2006. O conteúdo desse pedido é pelopresente integralmente incorporado ao presente documento atítulo de referência.
DECLARAÇÃO REFERENTE A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO SOBPATROCÍNIO FEDERAL
A presente invenção foi feita com suporte do governosob os Nos. de Concessão CA31841 e CA 31845 do NationalInstitutes of Health, e No. de Concessão 002865-SU doNational Science Foundation Center for Biophotonics Science& Technology. 0 governo detém determinados direitos àinvenção.
CAMPO TÉCNICO
Este pedido se refere a composições de forma CARGA-LIGANTE-TRANSPORTADOR compreendendo conjugados de moléculascarga (tais como moléculas biologicamente ativas oumoléculas repórteres) com agentes transportadores, ligadospor uma fração liberável e que são adequados paratransporte através de uma barreira biológica (tal como umamembrana celular ou tecido). Este pedido também se refere amétodos para a síntese de tais conjugados e para o estudoda sua eficácia em células e animais.
FUNDAMENTOS
Os produtos farmacêuticos e outras moléculasbiologicamente ativas geralmente devem atravessar barreirasbiológicas para serem eficazes. Fármacos e sondas, porexemplo, que são destinadas a interagir com alvosintracelulares, devem atravessar a membrana plasmática dacélula a fim de produzir o efeito desejado. Determinadasfármacos podem precisar atravessar outras barreirasbiológicas, tal como o estrato córneo da pele, para agentesde aplicação tópica. Já que barreiras biológicas, tal comoa membrana plasmática são geralmente compostasprincipalmente de componentes não polares, a moléculabiologicamente ativa deve ser relativamente não polar a fimde ser capaz de atravessar a barreira por difusão passiva.No entanto, a fármaco ou sonda devem também sersuficientemente polares para serem solúveis no plasmasangüíneo ou no fluido extracelular. Estas exigênciasopostas resultam em uma faixa relativamente estreita depolaridade para agentes biológicos e sondas ou moléculasrepórteres que são destinadas a agir no interior da célula,ou que devem atravessar uma membrana biológica ou outrabarreira biológica para exercer um efeito.
Diversas soluções para este problema são descritas naspatentes U.S. Nos. 6.306.993, 6.495.663, 6.593.292,6.669.951, 6.730.293 e 6.759.387, e em Rothbard et al.,Nat. Med. 6: 1253 (2000); Kirschberg et al. , Org. Lett.5:3459 (2003); Samuel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.100:14281 (2003); Chen et al . , Chem. Biol. 8:1123 (2001);Kim et al., J. Immunol. 159:1666 (1997); Robbins et al. ,BioTechniques 33:190, 194 (2002); Siprashvili et al., Hum.Gene Ther. 14:1225 (2003), e os diversos artigos queaparecem em Advanced Drug Delivery Reviews (2005) , volume57, especialmente aqueles das páginas 487 a 665. Estaspublicações descrevem transportadores que melhoram ofornecimento, isto é, moléculas transportadoras queaumentam a capacidade de uma molécula biologicamente ativaatravessar uma barreira biológica, tal como a membranacelular ou o estrato córneo.
É desejável se ter um sistema eficiente para aprodução de conjugados de moléculas carga, tais como asmoléculas biologicamente ativas, com moléculastransportadoras. O conjugado da carga com a moléculatransportadora é produzido, de preferência, por um liganteque é estável em condições de armazenagem e administração,mas que libera a carga no interior da célula ou de outroambiente alvo. É também desejável se ter um sistema rápido,relevante e econômico para se testar moléculastransportadoras para a sua capacidade de transportarmoléculas biologicamente ativas através de uma membranabiológica ou de outra barreira biológica. As modalidades dapresente invenção se voltam a estes objetivos eproporcionam vantagens adicionais, proporcionando tambémdiversas composições e métodos.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Em uma modalidade a invenção abrange um conjugado deforma:(CARGA)-(LIGANTE LIBERÁVEL)-(TRANSPORTADOR) em que acarga do conjugado pode ser um agente biologicamente ativoou uma molécula repórter, e em que a transportadora modulao transporte da carga através de uma barreira biológica aocontrário do que ocorre com o transporte da carga nãoconjugada. Em uma modalidade, a transportadora aumenta aquantidade ou a taxa de transporte da carga através de umabarreira biológica em comparação com o transporte da carganão conjugada. Em outra modalidade, a transportadora reduza quantidade ou a taxa de transporte da carga através deuma barreira biológica em comparação com o transporte dacarga não conjugada. Em uma modalidade, a barreirabiológica é uma membrana biológica. Em outra modalidade, abarreira biológica é uma membrana celular. Em outramodalidade, a barreira biológica é o estrato córneo. Emoutra modalidade, a invenção abrange ligantes liberáveisadequados para uma conjugação simples e barata a diversostipos de carga e transportadora. Em outra modalidade, ainvenção abrange métodos para se usar os ligantes nasíntese de conjugados. Em outra modalidade, a invençãoabrange métodos para se determinar a eficácia de umatransportadora, avaliando a eficácia da transportadora deefetuar o transporte de uma molécula repórter através deuma barreira biológica, de uma membrana biológica tal comouma membrana celular, por exemplo.
Em uma modalidade, a molécula carga e a moléculatransportadora são moléculas diferentes,· isto é, a mesmamolécula não pode servir como molécula carga e moléculatransportadora. Em outra modalidade, a molécula carga e amolécula transportadora são porções diferentes do conjugadode carga-ligante liberável-transportador; isto é, a mesmaporção do conjugado não pode servir tanto como carga comotransportadora. Em uma modalidade, a moléculatransportadora é uma poliamina. Em outra modalidade, amolécula transportadora não é uma poliamina.
Em uma modalidade, a invenção abrange uma composiçãopara o transporte de uma molécula carga através de umabarreira biológica compreendendo uma molécula carga; umamolécula transportadora; e um ligante liberável de forma
que liga covalentemente a molécula carga com amolécula transportadora; sendo Ri é um grupo hidrocarbonetoC1-C8 opcionalmente substituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8 opcionalmente substituído, ou umgrupo de cadeia hetero C1-C8 opcionalmente substituído; W é-(C=O)-,-P(=0)(-OH)-,P( =0) ( -0") , -P (=0)( -O-M+)-, ou -S (=0)2-, em que M+ é um equivalente de um cátion; V é 0,NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S; em que R2 é alquila Ci-C4;e em que br é um número inteiro entre 1 e 4 inclusive eindica o número de "ramificações" no grupo R1; ou qualquersal, solvato ou estereoisômero seu. Em uma modalidade,quando Ri é um grupo -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila Ci-C8, V é0; é preferível que o grupo hidrocarbonila seja selecionadode alquila C2, alquila C3, e alquila C4. A molécula cargapode ser selecionada do grupo que consiste em uma moléculabiologicamente ativa e uma molécula repórter. A variável bré, de preferência, 1 ou 2, sendo mais preferível 1. Quandodois grupos (-W-V-) estão presentes, eles podem ser ligadosa (ramificar-se de) o mesmo átomo no grupo Ri, ou elespodem ser ligados a (ramificar-se de) dois diferentesátomos no grupo Ri. Quando três grupos (-W-V-) se encontrampresentes, todos os três podem estar ligados a (seramificar de) o mesmo átomo no grupo Ri, ou eles podem serligados a (se ramificar de) o mesmo átomo e um pode serligado a (ramificar-se de) um átomo diferente. Quandoquatro grupos (-W-V-) se encontram presentes, eles podemestar ligados a (se ramificar de) dois ou mais átomosiferentes no grupo Ri.
Em uma modalidade, o ligante é de forma:
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Em uma modalidade, o ligante é de forma:
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Em uma modalidade, o ligante é de forma:
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Em uma modalidade, o ligante é de forma:
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Em uma modalidade, o ligante é de forma
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Em uma modalidade, a invenção abrange uma composiçãopara o transporte de uma molécula carga através de umabarreira biológica compreendendo uma molécula carga; umamolécula transportadora; e um ligante liberável de forma
<formula>formula see original document page 7</formula>
que liga covalentemente a molécula carga e a moléculatransportadora; em que Ri é um grupo hidrocarboneto C1-C8opcionalmente substituído, um grupo de forma -CH2-O-(C-O) -hidrocarbonila C1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupode cadeia hetero Ci-C8 opcionalmente substituído; W é -(C=O)-, - P ( =0) ( -0H) - , - - P (=0) ( -0~) , - P (=0) ( -0~M+) - , ou -S(=0)2-/ em que M+ é um equivalente de um cátion; V é O,NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S e R2 é alquila Ci-C4; ouqualquer sal, solvato ou estereoisômero seu. Em umamodalidade, quando Ri é um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila Ci-C8 opcionalmente substituído, V é O; épreferível que o grupo hidrocarbonila C1-C8 sejaselecionado de alquila C2, alquila C3, e alquila C4. Amolécula carga pode ser selecionada do grupo que consisteem uma molécula biologicamente ativa e uma molécularepórter.
Em outra modalidade, quando V é O, HN, NR2 ou S, R1contém um átomo de carbono de forma -C (CH3) 2- (isto é, umcarbono dimetil-substituído, ou carbono gem-dimetila) ,imediatamente adjacente ao átomo de V. Em outra modalidade,quando V é C (R2) 2, os dois grupos R2 são metila (isto é, umcarbono dimetil-substituído, ou carbono gem-dimetila).
Em uma modalidade, o ligante é de forma:
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Em uma modalidade, o ligante é de forma:
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Em uma modalidade, o ligante é de forma:
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Em uma modalidade, o ligante é de forma:<formula>formula see original document page 9</formula>
Em uma modalidade, o ligante é de forma:
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Em uma modalidade, a invenção abrange uma composiçãopara o transporte de uma molécula carga através de umabarreira biológica compreendendo uma molécula carga; umamolécula transportadora; e um ligante liberável de forma
<formula>formula see original document page 9</formula>
que se liga covalentemente à molécula carga e ãmolécula transportadora; em que Ri é um grupohidrocarboneto Ci-C8 opcionalmente substituído, um grupo deforma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8 opcionalmentesubstituído, ou um grupo de cadeia hetero Ci-C8opcionalmente substituído; V é O, NH, N R2, CH2, CHR2,C (R2) 2 ou S; e R2 é alquila C1-C4; ou qualquer sal, solvatoou estereoisômero seu. Em uma modalidade, quando R1 é umgrupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8opcionalmente substituído, V é O; é preferível que o grupohidrocarbonila seja selecionado de alquila C2, alquila C3,e alquila C4. A molécula carga pode ser selecionada dogrupo que consiste em uma molécula biologicamente ativa euma molécula repórter.
Em outra modalidade, a composição que compreende umamolécula carga, uma molécula transportadora, e um liganteliberável ligando por covalência a molécula carga e amolécula transportadora, é de forma<formula>formula see original document page 10</formula>
em que Carg-Nu representa o resíduo de uma moléculacarga "Carg-NuH" e Transp-S representa o resíduo de umamolécula transportadora que porta um grupo tiol de forma"Transp-SH"; em que R1 é um grupo hidrocarboneto Ci-C8, umopcionalmente substituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O) -hidrocarbonila Ci-C8 opcionalmente substituído, ou umagrupo de cadeia hetero Ci-C8 opcionalmente substituído; W é-(C=O)-, -P(=0) (-0H) -, ~P (=0) ( -0") , - -P (=0) ( -0~M+)-, OU-S (=0)2-, V é 0, NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, OU S; R2 éalquila Ci-C4; M+ é um equivalente de cátion; e em que br éum número inteiro de 1 e 4 inclusive e indica o número de"ramificações" no grupo R1, ou qualquer sal, solvato ouestereoisômero seu. Em uma modalidade, quando Ri é um grupode forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila Ci-C8 opcionalmentesubstituído, V é 0; é preferível que o grupo hidrocarbonilaC1-C8 seja selecionado de alquila C2, alquila C3, e alquila
Em outra modalidade, a composição compreendendo umamolécula carga; uma molécula transportadora; e um liganteliberável ligando por covalência a molécula carga e amolécula transportadora é de forma<formula>formula see original document page 10</formula>
em que Carg-Nu representa o resíduo de uma moléculacarga "Carg-NuH"; e Transp-S representa o resíduo de umamolécula transportadora portando um grupo tiol de formagrupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C4."Transp-SH" ; em que Ri é um grupo hidrocarboneto Ci-C8opcionalmente substituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O) -hidrocarbonila Ci-C8 opcionalmente substituído ou um grupode cadeia hetero Ci-C8 opcionalmente substituído; W é -(C=O)-, - P (=0) ( -0H) - , - P (=0) ( -0") - , -P (=0) ( -0~M+) - , ou -S(=0)2-, em que M+ é uma equivalente de um cátion; V é 0,NH, NR2f CH2, CHR2, C(R2)2, OU S; R2 é alquila C1-C4; OUqualquer sal, solvato ou estereoisômero seu. Em umamodalidade, quando R1 é um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8 opcionalmente substituído, V é 0; épreferível que o grupo hidrocarbonila C1-C8 sejaselecionado de alquila C2, alquila C3, e alquila C4.
Em outra modalidade, a composição que compreende umamolécula carga; uma molécula transportadora; e um liganteliberável ligando por covalência a molécula carga e amolécula transportadora é de forma
<formula>formula see original document page 11</formula>
em que Carg-Nu representa o resíduo de uma moléculacarga "Carg-NuH"; e Transp-S representa o resíduo de umamolécula transportadora portando um grupo tiol de forma"Transp-SH" ; em que R1 é um grupo hidrocarboneto C1-C8opcionalmente substituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O) -hidrocarbonila C1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupode cadeia hetero C1-C8 opcionalmente substituído; V é 0,NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S; e R2 é alquila C1-C4; ouqualquer sal, solvato ou estereoisômero seu. Em umamodalidade, V é 0. Em uma modalidade V é NH. Em umamodalidade, V é CH2. Em uma modalidade, V é S. Em umamodalidade, R1 é hidrocarboneto Ci-C8. Em uma modalidade, R1é alquila C1-C8.; em uma modalidade, quando R1 é um grupo deforma de -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8 opcionalmentesubstituído, V é O; é preferível que o grupo hidrocarbonilaC1-C8 seja selecionado de alquila C2, alquila C3, e alquila C4.
Em outra modalidade, V é 0 e R1 é alquila C1-C8, Em umamodalidade, R1 é -CH2CH2- Em uma modalidade R1 é -CH2CH2CH2 -. Em uma modalidade, R1 é -CH2CH2CH2CH2-.
Em uma modalidade, (CARGA)-(LIGANTE LIBERÁVEL)-(TRANSPORTADOR) é de forma:
<formula>formula see original document page 12</formula>
em que V é O, NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S, depreferência O, NH ou CH2; e j é um número inteiroselecionado de 1 a 8 inclusive, de preferência, 1 ou 2.
<formula>formula see original document page 12</formula>
em que k é um número inteiro selecionado de 0 a 8inclusive, de preferência, 1 ou 2.
Em outra modalidade, -Nu- é O, -NH-, -NR2-, ou -S-, emque R2 é alquila C1-C4.
Em outra modalidade, Carg-Nu é o resíduo de umamolécula repórter, tal como luciferina.
Em outra modalidade, Carg-Nu é o resíduo de umamolécula biologicamente ativa. Em uma modalidade, amolécula biologicamente ativa é selecionada do grupo queconsiste em um fármaco, um agente terapêutico, e um agentediagnóstico. A fármaco ou o agente terapêutico pode serpaclitaxel ou uma poliamina. A fármaco ou agenteterapêutico pode ser uma ciclosporina, tal comociclosporina A.
Em outra modalidade, CARGA-LIGANTE LIBERÁVEL-TRANSPORTADOR é selecionado do grupo que consiste em:
<formula>formula see original document page 13</formula>e qualquer estereoisômero, sal ou solvato seu.Em outra modalidade, o resíduo de uma moléculabiologicamente ativa é o resíduo de ciclosporina, ligado ouà hidroxila C2' ou à hidroxila C7.
Em outra modalidade, CARGA-LIGANTE LIBERÁVEL-TRANSPORTADOR é selecionado do grupo que consiste em r8-Cys-S-S-(CH2CH2CH2)-C (=0)-O-CH2-O-C (=0)-OCsA e r8-Cys-S-S-(CH2CH2CH2CH2)-C (=O)-O-CH2-O-C (=0)-OCsA, em que r8-Cys-S-indica o resíduo de acetil-D-Cys-(D-Arg) 8-NH2 e -OCsAindica o resíduo de ciclosporina A, e todos os sais,solvatos e estereoisômeros seus.
Em outra modalidade, a transportadora é uma moléculade lipídio, tal como de um ácido graxo. Em outramodalidade, a molécula de lipídio é de forma(hidrocarbonila C7-C32)-C (=0)-OH e formas acílicas suas. Emoutra modalidade, a transportadora de lipídio é ácidocaprílico (ácido octanóico), ácido cáprico (ácidodecanóico), ácido láurico (ácido dodecanóico), ácidomirístico (ácido tetradecanóico), ácido palmítico (ácidohexadecanóico), ácido esteárico (ácido octadecanóico),ácido araquídico (ácido icosanóico), ácido behênico (ácidodocosanóico), ácido palmitoléico, ácido oléico, ácidolinoléico, ácido linolênico, ácido araquidônico, ácidoicosapentaenóico, ácido docosahexaenóico, ácido erúcico ouformas acílicas suas. Em outra modalidade, a transportadorade lipídio compreendendo a porção "Transp-S" da molécula éde forma (hidrocarbonila C7-C32)-C (=0)-espaçador-S-, em queo espaçador é um grupo alquila Ci-Ci0, alquenila, alquinila,hidrocarbonila, heteroalquila, heteroalquenila ouheteroalquinila opcionalmente substituído, ou qualquercombinação dos grupos acima. Em outra modalidade, atransportadora de lipídio compreendendo a porção "Transp-S"das molécula é de forma
<formula>formula see original document page 15</formula>
isto é, em que o ácido graxo é acilado ao grupo aminode uma cisteína (cisteína D ou L) e a cadeia secundáriasulfidrila da cisteína serve como a porção "S" da porção"Transp-S", e quaisquer estereoisômeros, sais ou solvatosseus.
Em outra modalidade em que a transportadora é umamolécula de lipídio, tal como um ácido graxo, a carga podeser uma ciclosporina, tal como ciclosporina A. Em outramodalidade, o conjugado ciclosporina-ligante-transportadorpode ser selecionado do grupo que consiste em<formula>formula see original document page 15</formula>
em que η = 6, em que η = 10, ou em que η = 14
<formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 16</formula>
e qualquer sal, solvato ou estereoisômero seu.
Em outra modalidade, a invenção abrange um método deprodução de um conjugado de uma molécula de carga "Carg-NuH" e uma molécula transportadora portando um grupo tiolde forma "Transp-SH" compreendendo as etapas de se fazerreagir o composto Carg-NuH, o ânion Carg-Nu(-) ou o salCarg-Nu (-) M+, em que -NuH ou -Nu (-) é uma porçãonucleofllica e M+ é um equivalente de um cátion com umcomposto de forma Y1-W-Y2, em que Yi e Y2 são grupos desaída e podem ser iguais ou diferentes, e em que W é -(C=O)-, - P (=0) ( -0H) - , --P (=0) ( -O") , -P (=0) ( -0~M+) - , -P(=0)(-O-PG)- em que PG é um grupo protetor, ou -S(=0)2-, paraformar um composto de forma Carg-Nu-W-Yi (IlA-gb):
reagindo com um composto de forma (IIIA-gb)<formula>formula see original document page 17</formula>
em que R1 é um grupo hidrocarboneto C1-C8 opcionalmente
substituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonilaC1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupo de cadeiahetero C1-C8 opcionalmente substituído; V é O, NH, NR2, CH2,CHR2, C(R2)2, ou S; e R2 é alquila C1-C4, em que br é umnúmero inteiro entre 1 e 4 inclusive e indica o número de"ramificações" no grupo Ri, e TLGS é um estabilizador degrupo abandonador tiol; com um grupa transportadoraportando um tiol de forma Transp-SH para formar um compostode forma (IVA-gb):
<formula>formula see original document page 17</formula>
e reagir o composto (IIA-gb) com o composto (IVA-gb)para formar o conjugado da fórmula (Igb)
<formula>formula see original document page 17</formula>
Quando W for --P (=0) (-0-PG) -, pode ser conduzida umaetapa adicional de se remover do fosfato o grupo protetor.Em uma modalidade, quando R1 é um grupo opcionalmentesubstituído de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8, V é0; é preferível que o grupo hidrocarbonila C1-C8 sejaselecionado de alquila C2, alquila C3, e alquila C4.
Em uma modalidade, V é 0. Em uma modalidade V é NH. Emuma modalidade V é CH2. Em uma modalidade, V é S. em umamodalidade R1 é hidrocarboneto C1-C8. Em uma modalidade, R1é alquila C1-C8.
Em outra modalidade, V é 0 e R1 é alquila C1-C8. Em umamodalidade, Ri é -CH2CH2-. Em uma modalidade, Ri éCH2CH2CH2-. Em uma modalidade, Ri é -CH2CH2CH2CH2-.
Em outra modalidade, -Nu- é -0,-NH-, -NR2- ou -S-, emque R2 é alquila C1-C4.
Em outra modalidade, M+ é Li+, Na+, K+, Mg+2, ou Ca+2.
Em outra modalidade, TLGS é
<formula>formula see original document page 18</formula>
Em outra modalidade, a invenção abrange um método depreparação de um conjugado de uma molécula carga "Carg-NuH"e uma molécula transportadora portando um grupo tiol deforma "Transp-SH" compreendendo as etapas de se fazerreagir um composto da fórmula (IIgb):
<formula>formula see original document page 18</formula>
em que Ri é um grupo hidrocarboneto Ci-C8 opcionalmentesubstituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonilaC1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupo de cadeiahetero C1-C8 opcionalmente substituído; V é 0, NH, NR2, CH2,CHR2, C(R2)2, ou S; e R2 é alquila C1-C4, em que br é umnúmero inteiro entre 1 e 4 inclusive e indica o número de"ramificações" no grupo R1, e TLGS é um estabilizador degrupo abandonador tiol; com um reagente ativador de formaY1-W-Y2, em que W é -(C=O)-, -P (=0) (-0H) - , --P (=0) (-O") , -P (=0) (-0~M+) -, -P (=0) (-0-PG) - em que PG é um grupoprotetor, ou -S(=0)2-, para formar um composto da fórmula(IIIgb)
<formula>formula see original document page 18</formula><formula>formula see original document page 19</formula>
em que Y1 e Y2 são grupos de saída e podem ser iguaisou diferentes; reagir (IIIg) com um composto nucleofílicode forma Carg-NuH, o ânion Carg-Nu(-) ou o sal Carg-Nu(-)M+, em que -NuH ou -Nu(-) é uma porção nucleofílica e M+ éum equivalente de um cátion, para formar um composto dafórmula (IVgb):
<formula>formula see original document page 19</formula>
e reagir (IVgb) com Transp-SH para formar o conjugadoda fórmula (Igb):
<formula>formula see original document page 19</formula>
Quando W for --P(=0)(-O-PG)-, pode ser conduzida umaetapa adicional de se remover do fosfato o grupo protetor.Em uma modalidade, quando R1 é um grupo opcionalmentesubstituído de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8, V éO; é preferível que o grupo hidrocarbonila C1-C8 sejaselecionado de alquila C2, alquila C3, e alquila C4.
Em uma modalidade, W é -(C=O)-. Em uma modalidade, V éO. Em uma modalidade, V é NH. em uma modalidade, V é CH2.Em uma modalidade, V é S. Em uma modalidade, R1 éhidrocarboneto C1-C8. Em uma modalidade, R1 é alquila C1-C8.
Em outra modalidade, V é 0 e R1 é alquila C1-C8. Em umamodalidade, R1 é -CH2CH2-. Em uma modalidade, R1 é -CH2CH2CH2-. Em uma modalidade R1 é -CH2CH2CH2CH2-.
Em uma modalidade, -Nu- é -0-, -NH-, -NR2-, ou -S-, emque R2 é alquila C1-C4.Em outra modalidade, M+ é Li+, Na+, K+, Mg+2, ou Ca+2.
Em outra modalidade, TLGS é
<formula>formula see original document page 20</formula>
Em outra modalidade, a invenção abrange um método deprodução de um conjugado de uma molécula carga "Carg-NuH" euma molécula transportadora portando um grupo tiol de forma"Transp-SH" compreendendo as etapas de se fazer reagir umcomposto da fórmula (IIg):
<formula>formula see original document page 20</formula>
em que Ri é um grupo hidrocarboneto Ci-C8 opcionalmentesubstituído, um grupo opcionalmente substituído de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila Ci-C8 ou um grupo de cadeiahetero C1-C8 opcionalmente substituído; V é O, NH, NR2, CH2,CHR2, C(R2)2, OU S; e R2 é alquila C1-C4, e TLGS é umestabilizador do grupo tiol abandonador; com um reagenteativador de forma Y1-(C=O)-Y2 para formar um composto dafórmula (IIIg):
<formula>formula see original document page 20</formula>
em que Y1 e Y2 são grupos de saída e podem ser iguaisou diferente; reagir (IIIg) com um composto nucleofílico deforma Carg-NuH, o ânion Car-Nu(-) ou um sal Carg-Nu(-)M+,em que -NuH ou -Nu (-) é uma porção nucleofílica e M+ é umequivalente de um cátion, para formar um composto dafórmula (IVg):<formula>formula see original document page 21</formula>
e reagir (IVg) com Transp-SH para formar o conjugadoda fórmula (!):
<formula>formula see original document page 21</formula>
Em uma modalidade, V é O. Em uma modalidade, V é NH.Em uma modalidade, V é CH2. Em uma modalidade, V é S. Emuma modalidade, Ri é hidrocarboneto C1-C8. Em umamodalidade, Ri é alquila Ci-C8. Em uma modalidade, quando R1é um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8opcionalmente substituído, V é O; É preferível que o grupohidrocarbonila C1-C8 seja selecionado de alquila C2, alquilaC3, e alquila C4.
Em outra modalidade, V é O e R1 é alquila C1-C8. Em umamodalidade, R1 é -CH2CH2-. Em uma modalidade, R1 é -CH2CH2CH2-. Em uma modalidade R1 é -CH2CH2CH2CH2-.
Em outra modalidade -Nu- é -O-, -NH-, -NR2-, ou -S-,em que R2 é alquila C1-C4.
Em outra modalidade, M+ é Li+, Na+, K+, Mg+2, ou Ca+2.
Em outra modalidade, TLGS é
<formula>formula see original document page 21</formula>
Em outra modalidade a invenção abrange um método depreparação de um conjugado de uma molécula carga "Carg-NuH"e uma molécula transportadora portando um grupo tiol deforma "Transp-SH" compreendendo as etapas de se fazer
reagir um composto da fórmula (II):
<formula>formula see original document page 22</formula>
em que Ri é um grupo hidrocarboneto Ci-C8 opcionalmentesubstituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonilaC1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupo de cadeiahetero C1-C8 opcionalmente substituído; V é O, NH, NR2, CH2,CHR2, C(R2)2, ou S; e R2 é alquila C1-C4; com um reagente deativação de forma Y1-(C=O)-Y2, para formar um composto dafórmula (III):
<formula>formula see original document page 22</formula>
em que Y1 e Y2 são grupos de saída e podem ser iguaisou diferentes; reagir (III) com uma molécula nucleofílicade forma Carg-NuH, o ânion Car-Nu(-) ou um sal Carg-Nu(-)M+, em que -NuH ou -Nu(-) é uma porção nucleofílica e M+ éum equivalente de um cátion, para formar um composto dafórmula (IV):
<formula>formula see original document page 22</formula>(TV);
e reagir (IV) com Transp-SH para formar o conjugado dafórmula (I):
<formula>formula see original document page 22</formula>Em uma modalidade, V é O. Em uma modalidade, V é NH.Em uma modalidade, V é CH2. Em uma modalidade, V é S. Emuma modalidade, R1 é hidrocarboneto C1-C8. Em umamodalidade, R1 é alquila C1-C8. Em uma modalidade, quando R1é um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8opcionalmente substituído, V é O; é preferível que o grupohidrocarbonila C1-S seja selecionado de alquila C2, alquilaC3, e alquila C4.
Em outra modalidade, V é 0 e R1 é alquila C1-C8. Em umamodalidade, R1 é -CH2CH2-. Em uma modalidade, R1 é -CH2CH2CH2-. Em uma modalidade, R1 é -CH2CH2CH2CH2-.
Em outra modalidade, -Nu- é -O-, -NH-, -NR2-, ou -S-,em que R2 é alquila C1-C4.
Em outra modalidade, M+ é Li+, Na+, K+, Mg+2, ou Ca+2.
Em outra modalidade, a invenção abrange um método dese testar um conjugado de transportador-ligante-carga paraabsorção celular e liberação intracelular, compreendendocolocar-se uma célula ou amostra de tecido em contado comum conjugado de transportador-ligante-carga, em que oligante é de formaque liga covalentemente a molécula carga e a moléculatransportadora; em que R1 é um grupo hidrocarboneto C1-C8opcionalmente substituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O) -hidrocarbonila C1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupode cadeia hetero C1-C8 opcionalmente substituído; W é -(C=O)-, - P (=O) ( -OH) - , - -P (=0) ( -0") , -P (=0) ( -0~M+) - , ou -S(=0)2-, em que M+ é um equivalente de um cátion; V é 0,NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S; em que R1 é alquila C1-C4; eem que br é ura número inteiro entre 1 e 4 inclusive eindica o número de "ramificações" no grupo R1; e em que acarga é uma molécula repórter, durante um período de tempo;e detectar-se a carga que foi transportada para dentro dascélulas ou do tecido; deste modo fica determinada aeficácia da transportadora em efetuar o transporte. Em umamodalidade, br é 1. Em outra modalidade br é 2. Em umamodalidade, quando R1 é um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8 opcionalmente substituído, V é O; épreferível que o grupo hidrocarbonila C1-C8 sejaselecionado de alquila C2, alquila C3, e alquila C4.
Em outra modalidade, a invenção abrange um método dese testar um conjugado transportadora-ligante-carga paraabsorção celular e liberação intracelular, compreendendocolocar-se uma célula ou amostra de tecido em contato comum conjugado transportadora-ligante-carga, em que o liganteé da fórmula:
<formula>formula see original document page 24</formula>
em que R1 é um grupo hidrocarboneto C1-C8 opcionalmentesubstituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonilaC1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupo de cadeiahetero C1-C8 opcionalmente substituído; V é 0, NH, NR2, CH2,CHR2, C(R2)2, ou S; e R2 é alquila C1-C4; e em que a carga éuma molécula repórter, durante um período de tempo; edetectar-se a carga que foi transportada para dentro dascélulas ou do tecido; sendo deste modo determinada aeficácia da transportadora em efetuar o transporte. Em umamodalidade, quando R1 é um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8 opcionalmente substituído, V é 0; épreferível que o grupo hidrocarbonila C1-C8 sejaselecionado de alquila C2, alquila C3, e alquila C4.
Em outra modalidade, a invenção abrange um método dese testar um conjugado transportadora-ligante-carga paraabsorção celular e liberação intracelular, e que compreendecolocar-se uma célula ou amostra de tecido em contato comum conjugado transportadora-ligante-carqa de forma
em que Carg-Nu representa o resíduo de uma moléculacarga "Carg-NuH" e Transp-S representa o resíduo de umamolécula transportadora que porta um grupo tiol de forma"Transp-SH" em que Ri é um grupo hidrocarboneto C1-C8opcionalmente substituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O) -hidrocarbonila Ci-C8 opcionalmente substituído ou um grupode cadeia hetero Ci-C8 opcionalmente substituído; W é -(C=O)-, - P (=0) ( -0H) - , - - P (=0) ( -0") , - P (=0) ( -0"M+) - , ou -S(=0)2-, V é 0, NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S; R2 é alquilaCx-C4; M+ é um equivalente de um cátion; e em que br é umnúmero inteiro entre 1 e 4 inclusive e indica o número de"ramificações" no grupo R1; em que a carga é uma molécularepórter, durante um período de tempo; e detectar-se acarga que foi transportada para dentro das células ou dotecido; deste modo fica determinada a eficácia datransportadora em efetuar o transporte. Em uma modalidade,a carga é luciferina. Em uma modalidade, br é 1. Em outramodalidade br é 2. Em uma modalidade, quando Ri é um grupode forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila Ci-C8 opcionalmentesubstituído, V é 0; é preferível que o grupo hidrocarbonilaC1-C8 seja selecionado de alquila C2, alquila C3, e alquilaC4.Em outra modalidade, a invenção abrange um método dese testar um conjugado transportadora-ligante-carga paraabsorção celular e para liberação intracelular, e quecompreende colocar-se uma célula ou amostra de tecido emcontato com um conjugado transportadora-ligante-carga deforma:
<formula>formula see original document page 26</formula>
em que Ri é um grupo hidrocarboneto C1-C8 opcionalmentesubstituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonilaC1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupo de cadeiahetero C1-C8 opcionalmente substituído; V é O, NH, NR2, CH2,CHR2, C(R2)2, ou S; e R2 é alquila C1-C4, em que a carga éuma molécula repórter, durante um período de tempo; edetectar-se a carga que foi transportada para o interiordas células ou do tecido, determinando-se assim a eficáciada transportadora em efetuar o transporte. Em umamodalidade, a carga é luciferina. Em uma modalidade, quandoRi é um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila C1-C8opcionalmente substituído, V é 0; é preferível que o grupohidrocarbonila C1-C8 seja selecionado de alquila C2, alquilaC3, e alquila C4.
Para qualquer um dos conjugados, composições, emétodos acima em que a transportadora não é de outro modoespecificado a transportadora pode ser selecionado de Ac-D-Cys-(D-Arg)8-CONH2 e qualquer estereoisômero, sal ousolvente seu, em que o grupo tiol da molécula Cyscorresponde ao tiol. do "HS-Transp" a que e refere acima eo restante de Ac-D-Cys-(D-Arg)8-CONH2 corresponde à porção"Transp" de "HS-Transp".Para todos os métodos descritos acima, a ordem dasetapas pode ser alterada, desde que tal rearranjo produza omesmo produto ou resultado.
Para todos os compostos e conjugados descritos acima eno presente documento, a invenção abrange ainda um métodode administração do composto ou conjugado a um paciente emuma quantidade terapeuticamente efetiva. A administraçãopode compreender colocar-se uma célula cancerígena emcontato com um composto ou conjugado da invenção, ou aadministração do composto ou conjugado da invenção de ummodo tal que as células cancerígenas do paciente entrem emcontato com o composto ou conjugado. Em outra modalidade dométodo de administração, um fármaco conjugada a umtransportador por um ligante da invenção pode ser usadapara o tratamento de uma linhagem celular, câncer oupaciente que é normalmente resistente à fármaco livre.
DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS
A Figura IA mostra uma via sintética para a preparaçãode agentes ativados por dissulfeto para a conjugação compolímeros transportadores.
A Figura IB mostra a conjugação do agente ativado pordissulfeto com o polímero transportador.
A Figura IC mostra os produtos de reação que resultamda hidrólise e da descarboxilação dos conjugados e os produtos de reação que resultam da clivagem do dissulfetodos conjugados.
A Figura 2A mostra as curvas padrão de luminescênciaresultando da adição da quantidade conhecida de luciferinaa 100 ng de luciferase de vaga-lume em MgSO4 a 5mM , NaCl a200mM, HEPES a 2 OmM, EDTA a ImM, DTT a ImM, ATP a 2mM, pH7,4. As unidades para a área integrada sob as curvas (AUC)são fótons. Os percentuais representam quantidadesnormalizadas de luz até a dose máxima de luciferina.
A Figura 2B mostra a relação entre a concentração deluciferina e a luminescência relativa para as condições naFigura 2A. Uma relação linear foi observada quando o Iog daconcentração foi lançado em gráfico como uma função do Iogda concentração de luciferina.
A Figura 3A mostra a luminescência resultanteproduzida quando os carbonatos 5b e 5c foram misturados comluciferase; soluções a 1 μΜ de carbonato 5b e 5c forammisturadas com 100 ng de luciferase de vaga-lume em MgSO4 a5mM, NaCl a 2OOmM, HEPES a 2OmM, EDTA a ImM, DTT a ImM, ATPa 2mM, pH 7,4. As unidades para a área integrada sob ascurvas (AUC) são fótons.
A Figura 3B mostra a luminescência resultante quandoos conjugados da Figura 3A foram pré-incubados (reduzidos)com DTT a ImM durante 20 minutos antes da exposição aluciferase de vaga-lume; o perfil de luminescência éanálogo ao observado para luciferina e quantidadesequivalentes de luz foram produzidas para os doisconjugados.
A Figura 4A mostra medição em tempo real debioluminescência de uma linhagem de células de câncer dapróstata estavelmente transfectadas com luciferase (PC3M-Iuc) tratadas com luciferina a 235μΜ (6) ou conjugados deluciferina liberável 5b, ou 5c a 15μΜ ou em HBS ou emK+HBS.
A Figura 4B mostra a luminescência total de umalinhagem de células de câncer de próstata estavelmentetransfectada com luciferase (PC3M-luc) tratada comluciferina (6) a 25 μΜ ou com conjugados 5b ou 5c deluciferina liberável a 15 μΜ ou em HBS ou em K+HBS.
A Figura 5 mostra a seqüência proposta de eventos detransporte e liberação para uma modalidade de conjugado deluciferina-ligante liberável-transportador. A célula foiestavelmente transfectada com um gene para luciferase. Aluciferina livre que é liberada depois da entrada na célulapode reagir com luciferase e gerar um fóton que pode sermedido, permitindo a quantificação no tempo real daabsorção e liberação nas células.
A Figura 6 ilustra a bioluminescência resultantedepois da injeção intradérmica de luciferina em HBS a pH7,4 em camundongos transgênicos (FVB-Iuc+). Aproximadamentedez vezes a quantidade de luz foi observada quando oscamundongos que expressavam luciferase receberam injeçõesde 200 χ 20 nM de luciferina; veja Figura 6A. A área sob acurva para 200 nM era de 3,02 χ 10^10 fótons, ao passo quepara 20 nM era de 3,11 χ 10^9 fótons (10,24%). Quandolançada linearmente no gráfico, a bioluminescênciarapidamente diminui durante os primeiros trinta minutos;veja Figura 6B. O gráfico é a média de três injeções emanimais separados.
A Figura 7 ilustra a bioluminescência resultantedepois da injeção intradérmica de 100 μm de conjugado 5b a200 nM em HBS pH 7,4 em camundongos transgênicos deluciferase (FVB-luc +). O padrão de luminescência émostrado para dois animais diferentes. As áreas sob acurvas têm 2,54 e 2,0 χ 10^10 fótons.
A Figura 8 ilustra a absorção de luciferina livre pelapele. Imediatamente depois do tratamento depilatório, aabsorção é significativa e variável, mas se reduz com otempo até um nível insignificante à medida que o estratocórneo se restabelece. A figura ilustra a luminescênciatotal observada depois da aplicação tópica de 15 pL deluciferina a 5, 5mM em NaOAc a 200 mM, pH 6,0, veículo adiversos pontos no tempo depois do tratamento com Nair™.
A Figura 9 ilustra a bioluminescência resultante deconjugado 5c tamponado e não tamponado; a acidez inerentedo sal trif luoracetato do conjugado 5c na solução nãotamponada resulta em uma redução da bioluminescência. Afigura ilustra a bioluminescência diferencial observadaquando o conjugado é aplicado em veículo tamponado (quadrosólido) ou não tamponado (quadrado aberto). 0 conjugado 5c(2 mM) foi aplicado ou em 25% de água/75% de PEG 400 ou 25%de NaOAc a 200 mM pH 6,0/75% de PEG 4 0 0.
A Figura 10 ilustra a bioluminescência observada decamundongos transgênicos de luciferase como uma função detempo depois da aplicação tópica de 15 pL de conjugados 5b(quadrados sólidos) e 5c (quadrados abertos) a 5 mM em 75%de PEG 400/25% de NaOAc a 200 mM, pH = 6,0.
A Figura 11 ilustra a bioluminescência observada decamundongos transgênicos de luciferase como uma função detempo depois da aplicação tópica de 15 pL de conjugado 5c(quadrados sólidos) e conjugado de lisina 5d (quadradosabertos) a 2mM em 75% de PEG 400/25% de NaOAc a 200 mM, pH= 6,0.
A Figura 12 ilustra um ensaio para GI50 (nM) deLinhagens de Câncer Ovariano 429, pulso de 20 minutos comos compostos indicados. As células foram pulsadas durante20 minutos, lavadas (χ 2) e incubadas durante 72 horas emmeio fresco. Para cada composto, três barras sãoilustradas, para células 429, células 429 T, e células 429TP (da esquerda para a direita) . Os valores de GI50 em nMsão: para o primeiro grupo de barras rotulado "C2 Ester5r8" (composto 62) 12(429), 420 (429T) , 101 (429TP) ; "C2carbonS r8" (composto 55) , 47 (429) , 781 (429T) , 216(429TP) ; "C7 Ester5 r8" (composto 67) , 125 (429) , 225(429T) , 93 (429TP) ; taxol (em DMSO) , 147 (429) , 15802(429T), 8485 (429TP).
A Figura 13 ilustra os resultados do experimento deabsorção celular do Exemplo 10 (1 minuto de pulso,concentração de 10 μΜ) dos transportadores lipidados com umcomprimento diferente de uma cauda de lipídio. Os compostosindicados na Figura 123 são os seguintes: 7a é composto207a do Exemplo 10; 7b é composto 207b do Exemplo 10; 7c écomposto 207c do Exemplo 10; 7d é composto 207d do Exemplo10; 7e é composto 2 07e do Exemplo 10; 8 é composto 2 08 doExemplo 10.
A Figura 14A ilustra a absorção dos transportadoreslipidados tendo comprimentos diferentes da cauda lipídica.A Figura 14B é uma representação em barras da quantidade deluciferina fornecida e liberada pelos conjugados detransportadores lipidados administrados topicamente. Oscompostos são indicados por números como na legenda daFigura 13.
A Figura 15A e a Figura 15B ilustram conjugados deciclosporina A-lipídio usando os ligantes da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Um indivíduo ou um "paciente" se refere a umvertebrado, de preferência um mamífero, sendo maispreferível um ser humano.
"Tratamento" ou "tratar" uma doença usando os métodosda invenção é definido como a administração de um ou maiscompostos, com ou sem agentes terapêuticos adicionais, afim de paliar, melhorar, estabilizar, reverter, reduzir avelocidade, retardar, prevenir, reduzir ou eliminar ou adoença ou os sintomas da doença ou para retardar ouinterromper o progresso da doença ou dos sintomas dadoença. "Uso terapêutico" de um composto é definido como ouso de um ou mais compostos para o tratamento de umadoença, conforme definido acima. Uma "quantidadeterapeuticamente efetiva" é uma quantidade suficiente paratratar uma doença, conforme definida acima. A prevenção ousupressão podem ser parciais ou totais.
Um "agente diagnóstico" é um agente que auxilia nadetecção, diagnóstico, determinação do estágio ou de outromodo qualquer na identificação da presença, extensão ouestágio de uma doença.
"Resíduo" significa a porção de uma molécula quepermanece depois de se ter feito a mesma reagir com umgrupo ligante. Na reação de Boc-NH-CH2-COOH com H2N-CH(CH3)-COOMe (Boc-glicina com éster metílico de alanina) paraformar Boc-NH-CH2-CO-NH-CH(CH3)-COOMe, a porção "Boc-NH-CH2-CO-" é o resíduo de Boc-glicina e a porção "-NH-CH(CH3)-COOMe" é o resíduo do éster metílico de alanina.
Uma "barreira biológica" é definida como uma estruturabiológica que previne a difusão livre de moléculas. Asbarreiras biológicas incluem, sem limitação, a membranacelular, a membrana nuclear, as membranas de organelas, oestrato córneo, o epitélio córneo, e a barreira sangue-cérebro.
A invenção inclui os compostos descritos no presenteou incorporados a título de referência no presente,incluindo todo e qualquer estereoisômero, sal, hidrato esolvato dos compostos descritos no presente ou incorporadosao presente documento a título de referência no presente. Ainvenção também inclui os compostos descritos no presenteou incorporados ao presente documento a título dereferência no presente na sua forma de não sal, nãohidrato/não solvato. Portanto, embora alguns compostosdescritos no presente sejam ilustrados como sais, deveficar subentendido que a descrição abrange todos os outrossais hidratos e solvatos dos compostos dados no presentedocumento, assim como a forma de não sal, não hidrato/nãosolvato do composto. São especialmente preferidos os saisfarmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaceuticamenteaceitáveis são aqueles sais que conservam a atividadebiológica dos compostos livres e que não são indesejáveisdo ponto de vista biológico ou outro. 0 sal desejado de umcomposto básico pode ser preparado por métodos conhecidosdos versados na técnica tratando-se o composto com umácido; tal sal pode ser o produto de uma reação que produzo composto. Exemplos de ácidos inorgânicos incluem, semlimitação, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácidosulfúrico, ácido nítrico e ácido fosfórico. Exemplos deácidos orgânicos incluem, sem limitação, ácido fórmico,ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácidopirúvico, ácido oxálico, ácido maléico, ácido malônico,ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácidocítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico,ácidos sulfônicos e ácido salicílico. Os sais de compostosbásicos com aminoácidos tais como sais aspartato e saisglutamato, podem também ser preparados. 0 sal desejado deum composto ácido pode ser preparado por métodos conhecidosdos versados na técnica tratando-se o composto com umabase; tal sal pode ser o produto de uma reação que produz ocomposto. Exemplos de sais inorgânicos de compostos ácidosincluem, sem limitação, sais de metais alcalinos e demetais alcalino terrosos, tais como sais de sódio, sais depotássio, sais de magnésio e sais de cálcio; sais deamônio; e sais de alumínio. Exemplos de sais orgânicos decompostos ácidos incluem, sem limitação, sais de procaína,ciclohexilamina, dibenzilamina, N-etilpiperidina, N, N' -dibenzil etileno diamina, e trietilamina. Sais de compostosácidos com aminoácidos, tais como sais de lisina, podemtambém ser preparados. Exemplos de solvatos incluem, semlimitação, hidratos, hemiidratos (1/2 H2O), diidratos,triidratos e alcoolatos tais como metanolatos e etanolatos.
A invenção também inclui todas as polimorfas, formascristalinas e formas não cristalinas dos compostosdescritos no presente documento.
A invenção também inclui todos os estereoisômeros doscompostos descritos no presente, incluindodiastereoisômeros e enantiômeros na forma isolada, assimcomo misturas de estereoisômeros em qualquer proporção,incluindo, sem limitação, misturas racêmicas. A não ser quea estereoquímica seja explicitamente em uma estrutura, aestrutura se destina a abranger todos os estereoisômerospossíveis do composto ilustrado. Quando um agentebiologicamente ativo ou molécula repórter é indicado,somente são considerados os estereoisômeros do agente ourepórter que conservam a função biológica oucaracterísticas de repórter/sonda.
O termo "alquila" se refere a grupos alifáticossaturados que incluem grupos de cadeia reta, cadeiaramificada, cíclicos e suas combinações, tendo o número deátomos de carbono especificado, ou se nenhum número forespecificado, tendo até 12 átomos de carbono, incluindo ossubconjuntos preferidos de grupos alquila os grupos alquilaC1-C12, C1-C10, C1-C8, C1-C6 e C1-C4. "Alquila de cadeia reta"ou grupos "alquila linear" se refere a grupos alquila quenão são nem cíclicos nem ramificados, habitualmentedesignados como grupos "n-alquila". Exemplos de gruposalquila incluem, sem limitação, grupos tais como metila,etila, n-propila, isopropila, butila, n-butila, isobutila,sec-butila, t-butila, pentila, n-pentila, hexila, heptila,octila, nonila, decila, undecila, dodecila, neopentila,ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila eadamantila. Os grupos cíclicos podem consistir em um anel,incluindo, sem limitação, grupos tais como ciclo-heptila ouanéis múltiplos fundidos, incluindo, sem limitação, grupostais como adamantila ou norbornila.
"Alquila substituído" se refere a grupos alquilasubstituídos com um ou mais substituintes incluindo, semlimitação, grupos tais como halogênio (flúor cloro, bromo eiodo), alcóxi, acilóxi, amino, hidroxila, mercapto,carbóxi, benzilóxi, fenila, benzila, ciano, nitro,tioalcóxi, carboxaldeído, carboalcóxi e carboxamida ou umafuncionalidade que possa ser adequadamente bloqueada, sefor necessário, para fins da invenção, com um grupoprotetor. Exemplos de grupos alquila substituídos incluem,sem limitação, -CF3, -CF2-CF3, e outros grupos perflúor eperhalo.
"Hidroxialquila" especificamente se refere a gruposalquila que têm o número de átomos de carbono especificadossubstituídos com um grupo -0H. Assim, "hidroxialquilalinear C3" se refere a -CH2CH2CHOH-, -CH2CHOHCH2-, e -CHOHCH2CH2-.
O termo "alquenila" se refere a grupos alifáticosinsaturados que incluem grupos de cadeia reta (lineares) ,de cadeia ramificada, cíclicos e suas combinações, tendo onúmero de átomos de carbono especificado, ou se nenhumnúmero tiver sido especificado tendo até 12 átomos decarbono, que contêm pelo menos uma ligação dupla (-C=C-).Exemplos de grupos alquenila incluem, sem limitação, -CH2-CH=CH-CH3; e -CH2-CH2-ciclohexenila, em que o grupo etilapode estar ligado à porção ciclohexenila em qualquervalência de carbono disponível. 0 termo "alquinila"! serefere a grupos alifáticos insaturados incluindo grupos decadeia reta (lineares), de cadeia ramificada, cíclicos esuas combinações, tendo o número de átomos de carbonoespecificado, ou se nenhum número tiver sido especificado,tendo até 12 átomos de carbono, que cont}em pelo menos umaligação tripla (-C=C-). "Hidrocarboneto", "grupohidrocarboneto", "cadeia de hidrocarboneto" ou"hidrocarbonila" se refere a qualquer grupo alquila,alquenila ou alquinila de cadeia reta, cadeia ramificada oucíclico e qualquer combinação sua. Os grupos hidrocarbonetotêm o número de átomos de carbono especificado, ou, senenhum número tiver sido especificado, têm entre 1 e 12átomos de carbono. "Alquenila substituído", "alquinilasubstituído" e "cadeia hidrocarboneto substituída"("hidrocarbonila substituído", "grupo hidrocarbonetosubstituído", ou "hidrocarboneto substituído") se referemao grupo respectivo substituído com um ou maissubstituintes, incluindo, sem limitação, grupos tais comohalogênio, alcóxi, acilóxi, amino, hidroxila, mercapto,carbóxi, benzilóxi, fenila, benzila, ciano, nitro,tioalcóxi, carboxaldeído, carboalcóxi e carboxamida ou umafuncionalidade que pode ser adequadamente bloqueada, se fornecessário para os fins da invenção, com um grupo protetor.
"Arila" ou "Ar" se refere a um grupo carbocíclicoaromático que tem um único anel (incluindo, sem limitação,grupos tais como fenila) ou anéis múltiplos condensados(incluindo, sem limitação, grupos tais como naftila ouantrila) e inclui tanto grupos arila não substituídos comosubstituídos. "Arilas substituídos" se refere a arilassubstituídos com um ou mais substituintes, incluindo, semlimitação, grupos tais como alquila, alquenila, alquinila,cadeias hidrocarboneto, halogênio, alcóxi, acilóxi, amino,hidroxila, mercapto, carbóxi, benzilóxi, fenila, benzila,ciano, nitro, tioalcóxi, carboxaldeído, carboalcóxi ecarboxamida ou uma funcionalidade que pode seradequadamente bloqueada, se for necessário para fins dainvenção, com um grupo protetor.
"Heteroalquila", "heteroalquenila", e"heteroalquinila" se refere a grupos alquila, alquenila, ealquinila, respectivamente, que contêm o número de átomosde carbono especificado (ou se nenhum número tiver sidoespecificado, tendo até 12 átomos de carbono) e que contêmum ou mais heteroátomos como parte das cadeias principal,ramificada ou cíclica no grupo. Os heteroátomos incluem semlimitação, k N, S, O, e Ρ; N e O são preferido. Os gruposheteroalquila, heteroalquenila e heteroalquinila podemestar ligados ao restante da molécula ou em um heteroátomo(se uma valência estiver disponível) ou em um átomo decarbono. Exemplos de grupo heteroalquila incluem, semlimitação, grupos tais como -O-CH3, -O-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -S-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH(CH3)-S-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-CH2-, l-etil-6-propilpiperidino, 2-etiltiofenila, e morfolino. Exemplos de gruposheteroalquenila incluem, sem limitação, grupos tais como -CH=CH-NH-CH (CH3) -CH2- .
Uma "cadeia hetero" ou "grupo de cadeia hetero" serefere a qualquer um de um grupo heteroalquila,heteroalquenila ou heteroalquinila, ou qualquer combinaçãosua, e tem o número de átomos de carbono especificado (ouse nenhum número tiver sido especificado, tendo até 12átomos de carbono).
"Heteroarila" ou "HetAr" se refere a um grupocarbocíclico aromático tendo um único anel (incluindo, semlimitação, exemplos tais como piridila, tiofeno ou furila)ou múltiplos anéis condensados (incluindo, sem limitação,exemplos tais como imidazolila, indolizinila oubenzotienila) e tendo pelo menos um heteroátomo, incluindo,sem limitação, heteroátomos tais como Ν, O, P ou S, dentrodo anel. A não ser que seja especificado em contrários, osgrupos heteroalquila, heteroalquenila, heteroalquinila eheteroarila têm entre um e cinco heteroátomos e entre um edoze átomos de carbono. Os grupos "heteroalquilasubstituído", "heteroalquenila substituído","heteroalquinila substituído", "cadeia hetero substituído"e "heteroarila substituído" se referem a gruposheteroalquila, heteroalquenila, heteroalquinila, cadeiahetero e heteroarila substituídos com um ou maissubstituintes, incluindo, sem limitação, grupos tais comalquila, alquenila, alquinila, benzila, cadeiashidrocarboneto, halogênio, alcóxi, acilóxi, amino,hidroxila, mercapto, carbóxi, benzilóxi, fenila, benzila,ciano, nitro, tioalcóxi, carboxaldeído, carboalcóxi ecarboxamida ou uma funcionalidade que pode seradequadamente bloqueada, se for necessário para os fins dainvenção, com um grupo protetor. Exemplos de tais grupossubstituídos incluem, sem limitação, piperazina,substituída em um nitrogênio ou carbono por um grupo fenilaou benzila e ligada ao resto da molécula por qualquervalência disponível em um carbono ou nitrogênio, -NH-SO2-fenila, -NH-(C=O)0-alquila, -NH-(C=O)0-alquil-arila e -NH-(C=O)-alquila. Se for quimicamente possível, o(s)heteroátomo(s), assim como os átomos de carbono do grupopode(m) ser substituídos. 0(s) heteroátomo(s) pode(m)também se encontrar na forma oxidada, se for quimicamentepossível.
0 termo "alquilarila" se refere a um grupo alquila quetem o número de átomos de carbono designado, apensos a um,dois ou três grupos arila.
0 termo "alcóxi", conforme empregado no presente, serefere a uma grupo alquila, alquenila, alquinila, ou cadeiahidrocarboneto ligado a um átomo de oxigênio e tendo onúmero de átomos de carbono especificado, ou se nenhumnúmero tiver sido especificado, tendo até 12 átomos decarbono, exemplos de grupos alcóxi incluem, sem limitação,grupos tais como metóxi, etóxi e t-butóxi.
O termo "alcanoato", conforme empregado no presente,se refere a um grupo ácido carboxílico ionizado, tal comoacetato (CH3Ci=O)-Oi"1'), propionato (CH3CH2Ci=O)-Oi"1'), esemelhantes. "Alcanoato de alquila" se refere a um ácidocarboxílico esterifiçado com um grupo alcóxi, tal comoacetato de etila (CH3Ci=O)-O-CH2CH3). "Alcanoato de ω-haloalquila" se refere a um alcanoato de alquila portandoum átomo de halogênio sobre o átomo de carbono de alcanoatoo mais distante do grupo carboxila; assim, ω-bromopropionato de etila se refere a 3-bromo-propionato deetila, ω-cloro-n-butanoato de metila se refere a 4-cloro-n-butanoato de metila etc.
Os termos "halo" e "halogênio" , conforme empregado nopresente, se referem a substituintes Cl, Br, F ou I.
Quando "M" é usado para indicar "um equivalente de umcátion", pretende-se representar um equivalente de qualquercátion, independentemente da carga ou natureza químicaformal do cátion. Isto é, M+ pode representar não somenteum cátion com uma única carga tal como Li+, Na+ ou K+, mastambém um cátion com cargas múltiplas tais como Ca+2, Mg+2ou Fe+3, em uma quantidade equivalente apropriada ao ânion.M+ pode representar cátions metálicos ou não metálicos;exemplos de cátions não metálicos incluem, sem limitação,NH3+ ou um cátion de carga múltipla em uma quantidadeequivalente adequada.
"Grupo protetor" se refere a um grupo químico queapresenta as seguintes características: 1) reageseletivamente com a funcionalidade desejada com bomrendimento para produzir um substrato protegido que éestável ás reações projetadas para as quais é desejada aproteção; 2) é removível seletivamente do substratoprotegido para produzir a funcionalidade desejada; e 3) éremovível com bom rendimento por reagentes compatíveis como(s) outro(s) grupo(s) funcional(ais) presente(s) ougerado(s) em tais reações projetadas. Exemplos de gruposprotetores adequados podem ser encontrados em Greene et al.(1991) Protective Groups in Organic Synthesis. 2a. Ed.(John Wiley & Sons, Inc., Nova York). Grupos protetores deamino incluem, sem limitação, mesitileno sulfonila (Mes),benzilóxi-carbonila (CBZ ou Ζ), t-butilóxi-carbonila (Boc),t-butildimetil-silila (TBDIMS ou TBDMS), 9-fluorenil-metilóxi-carbonila (Fmoc), tosila, benzeno-sulfonila, 2-piridil sulfonila, ou grupos protetores adequados foto-instáveis tais como 6-nitroveratrilóxi carbonila (Nvoc),nitropiperonila, pirenil-metóxi-carbonila, nitrobenzila,metildimetóxi-benzila, 5-bromo-7-nitroindoliniloa esemelhante. Os grupos protetores de hidroxila incluem, semlimitação, Fmoc, TBDIMS, grupos protetores foto-instáveis(tais como éter nitroveratril-oximetíIico (NVOM)), Mom(éter metóxi-metílico), e Mem (éter metóxi-etóxi-metílico) ,NPEOC (4-nitrofenetilóxi-carbonila) e NPEOM (4-nitrofenetilóxi-metilóxi-carbonila).
Conjugados da invenção
Em uma modalidade, a invenção abrange conjugados deuma molécula transportadora ligada a uma molécula carga pormeio de um ligante liberável. Cada um destes diversoscomponentes será discutido mais adiante.
Molécula transportadora
As moléculas transportadoras são moléculas quepermitem que outra molécula, denominada molécula carga,atravesse uma barreira biológica (tal como uma membranacelular) ou que modula ou intensifica a capacidade damolécula carga de atravessar uma barreira biológica. Istoé, a molécula carga, em si, ou não atravessaria a barreira,ou atravessaria a barreira em quantidades subótimas ou auma taxa subótima; a conjugação da carga à transportadorapermite ou intensifica a quantidade da carga (em conjugaçãocom a transportadora) que atravessa a barreira, ou modula ataxa à qual a carga (em conjugação com a transportadora)atravessa a barreira. Observe-se que tal modulação pode serum aumento da carga transportada pelo conjugado emcomparação com a carga não conjugada; um aumento na taxa àqual a carga é transportada pelo conjugado em comparaçãocom a carga não conjugada; uma redução na quantidade decarga transportada pelo conjugado em comparação com a carganão conjugada; ou uma redução na taxa à qual a carga étransportada pelo conjugado em comparação com a carga nãoconjugada.
Numerosos exemplos existem de moléculastransportadoras adequadas e as seguintes publicações depatentes descrevem moléculas que podem ser usadas comomoléculas transportadoras na presente invenção. PatentesU.S. Nos. 6.3 06.993 (da coluna 6, linha 63 à coluna 9,linha 47) e U.S. 6.495.663 (da coluna 6, linha 62 à coluna10, linha 59) e publicações de pedidos de patentes U.S.Nos. 2002/0131965, e U.S. 2003/0162719 descrevemcomposições e métodos para aumentar o transporte decompostos selecionados através de uma barreira biológicatal como uma membrana biológica, em que se faz uma membranabiológica entrar em contato com um conjugado que contém umamolécula biologicamente ativa que é ligada covalentemente aum polímero transportador (em que o polímero transportadorestá agindo como a molécula transportadora) . Em umamodalidade, o polímero consiste em de 6 a 25 subunidades,das quais pelo menos 50 % contêm uma porção de cadeiasecundária guanidino ou amidino. U.S. 6.5 93.2 92 descrevemoléculas transportadoras adicionais contendo porçõesamidino e guanidino; veja da coluna 10, linha 4 0 à coluna14, linha 64. U.S. 6.669.951 (da coluna 11, linha 35 àcoluna 18, linha 36), U.S. 6.730.293 (da coluna 10, linha 1à coluna 15, linha 36), e U.S. 6.759.387 (da coluna 10,linha 44 à coluna 16, linha 26) descrevem transportadorescontendo moléculas guanidino ou amidino, tais como osaminoácidos arginina , útil para o transporte de moléculasatravés de tecido epitelial e endotelial. As patentes,publicações de patentes citadas e seções específicas a quese refere acima são pelo presente integralmenteincorporadas ao presente documento a título de referência.
Lipídios podem também ser usados com moléculastransportadoras para diversos compostos. Os lipídiosincluem, sem limitação, ácidos graxos de forma(hidrocarbonil C7-C32)-C (=0)-OH e formas acílicas suas,sendo (alquil C7-C32)-c (=0) -OH e (alquenil C7-C32)-C (=0)-OH esuas formas acílicas os subconjuntos preferidos. 0 ácidocaprílico (ácido octanóico) , ácido cáprico (ácidodecanóico), ácido láurico (ácido dodecanóico), ácidomirístico (ácido tetradecanóico), ácido palmítico (ácidohexadecanóico), ácido esteárico (ácido octadecanóico) ,ácido araquidico (ácido icosanóico), ácido behênico (ácidodocosanóico), ácido palmitoléico, ácido oléico, ácidolinoléico, ácido linolênico, ácido araquidônico, ácidoicosapentaenóico, ácido docosahexaenóico, e ácido erúcicosão exemplos de lipidios que podem ser usados como a porçãotransportadora. O exemplo 10 abaixo indica uma modalidadepara a ligação de lipidios à carga usando os ligantes dapresente invenção.
Além das moléculas transportadoras conhecidas acimaque podem ser usadas com as modalidades de liganteliberável descritas no presente documento, novastransportadoras podem ser avaliadas usando-se asmodalidades de ligantes liberáveis. Uma transportadora éligada ao ligante em conjugação com uma molécula repórter,luciferina, por exemplo, e a eficácia da moléculatransportadora em transportar a molécula repórter atravésde uma barreira biológica pode ser facilmente medida.
Em uma modalidade, o conjugado incorpora uma moléculatransportadora portando um grupo tiol de forma Transp-SH.As transportadoras que não têm um grupo tiol podem serderivadas de modo a incorporar um grupo tiol; os compostostais como tritil-S-CH2CH2COOH e tritil-S-CH2H2NH2, porexemplo, podem ser usados para derivar compostos contendoamino e contendo carboxilato, respectivamente, a fim deincorporar um grupo tiol. Para transportadores peptídicos,pode já estar presente no polipeptídeo um resíduo decisteína que ocorre naturalmente, ou, para os peptídeossintéticos, a incorporação de um resíduo de cisteína ouanálogo (tal como homocisteína) é facilmente obtida durantea síntese de peptídeo. Outros métodos de incorporação degrupos tiol a polipeptídeos se encontram em Wong, Chemistryof Protein Conjugation and Cross-Linkingf CRC Press: BocaRaton, 1991; diversos destes métodos são aplicáveis atransportadores não peptídicas também.
Em uma modalidade, a invenção abrange um método de setestar, ou verificar, diversos agentes transportadores paraeficácia de transporte. Uma molécula repórter pode serconjugada a uma molécula transportadora por meio de umligante liberável. Uma barreira biológica (tal como umamembrana celular) é colocada em contato com o conjugado;veja exemplo 6 abaixo para uma ilustração de tal teste. Aquantidade total de molécula repórter transportada pode serfacilmente quantificada para uma transportadora dada.Ensaios repetidos com diferentes moléculas transportadorasusando a mesma molécula repórter fornecem um método para adeterminação da eficácia do transporte de uma moléculatransportadora dada.
Molécula carga
Uma variedade de moléculas pode ser usada como ocomponente de carga do conjugado. As moléculasbiologicamente ativas constituem um grupo de compostos quepode ser usado como carga. As moléculas biologicamenteativas (que abrangem fármacos, agentes terapêuticos eagentes diagnósticos) incluem, sem limitação, íonsmetálicos (que são tipicamente fornecidos em forma dequelatos metálicos); pequenas moléculas orgânicas tais comomoléculas anticancerígenas (doxorubicina, bleomicina,dactinomicina, daunorubicina, epirubicina, idarubicina,mitoxantrona, mitomicina, epipodofilotoxinas, etoposide,teniposide, agentes antimicrotúbulos, vinblastina,vincristina, vindesina, vinorelbina, outros alcalóides devinca, taxanos, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere),outros taxóides, mostardas de nitrogênio, clorambucil,ciclofosfamida, estramustine, ifosfamide, mecloretamina,melfalan, aziridinas, tiotepa, alquil sulfonatos,bussulfan, nitrosouréias, carmustina, lomustina,streptozocina, complexos de platina, carboplatinacisplatina, alquiladores, altretamina, dacarbazina,procarbazina, temozolamida, análogos de folato,metotrexato, análogos de purina, fludarabina,mercaptopurina, tioguanina; análogos de adenosina,cladribina, pentostatina, análogos de pirimidina,capecitabina, citarabina, floxuridina, fluoruracil, 5-fluoruracil, gemcitabina, uréias substituídas,hidroxiuréia, análogos de camptotecina, irinotecan,topotecan, inibidores de topoisomerase I, inibidores detopoisomerase II, e antibióticos de antraciclina);moléculas de antibiótico e antimicrobiano (penicilina,cefalosporina, isoniazida, trimetoprim, quinolonas,fluorquinolonas, antibióticos macrolídeos tais comoeritromicina e tilosina, por exemplo); e macromoléculastais como polinucleotídeos e análogos de polinucleotídeos,polipeptldeos (peptídeos e proteínas) e análogos depolipeptídeos, e polissacarídeos e análogos depolissacarídeos. Exemplos de macromoléculas incluem, semlimitação, pequenos RNAs interferentes (siRNA ou RNAi), RNAcurto em grampo de cabelo (shRNA), ribozimas (que contêmopcionalmente um ou mais subunidades de 2'-desóxinucleotídeo para aumentar a estabilidade), ácidos nucléicospeptídicos (PNA), antígenos protéicos tais como antígenosde tumores e peptídeos tais como ciclosporinas. Análogos depolinucleotídeos e análogos de polipeptídeos podem terestruturas principais modificadas para conferir uma ou maispropriedades desejáveis, tais como uma maior resistência adegradação ou uma hidrossolubilidade alterada. A moléculabiologicamente ativa tem, de preferência, um peso molecularinferior a aproximadamente 10 kDa, sendo mais preferívelinferior a aproximadamente 1 kDa, sendo ainda maispreferível inferior a aproximadamente 600 Daltons.Moléculas carga são discutidas com mais detalhes nopresente documento.
A. Moléculas orgânicas pequenas
Uma variedade de moléculas orgânicas pequenas podemser ligadas ao conjugado como carga. Basta que a moléculaorgânica pequena tenha somente uma fração nucleofílica paraservir como a porção -Nu da carga. Freqüentemente asmoléculas orgânicas pequenas terão já frações nucleofílicasadequadas, podendo algumas moléculas orgânicas pequenas teruma multiplicidade de frações nucleofílicas (podendo serdesejável, neste caso a proteção de determinadas fraçõesnucleofílicas para limitar a fixação do ligante à moléculaorgânica pequena em um sítio definido) e outras moléculasorgânicas pequenas podem ser facilmente derivadas paraconter uma fração nucleofílica. Doxorubicina, por exemplo,
<formula>formula see original document page 47</formula>pode ser ligada ao ligante por qualquer um dos seusgrupo -OH (tal como o seu grupo 6-hidróxi ou 11-hidróxi, ogrupo 8-hidróxi ou o grupo hidróxi da fração (8-hidróxi-acetila), o grupo hidróxi vicinal ao grupo -NH2 ou opróprio grupo -NH2, podendo cada um deles servir como afração -NuH do grupo Carg-NuH.
Moléculas anticancerígenas de taxano e de taxóidespodem também ser usadas como moléculas carga nosconjugados. Tais conjugados são úteis como agentesanticancerigenos. 0 termo "taxanos" se refere à paclitaxel(também conhecido como TAXOL, uma marca registrada deBristol-Myers Squibb Co., Nova York, NY) (veja Figura 6F deU.S 6.306.993, e a estrutura imediatamente seguinte, em queR'=acetila e R"=benzoíla) e análogos que ocorremnaturalmente, sintéticos ou geneticamente modificados tendoum núcleo de estrutura principal que contém os anéis A, B,C e D de paclitaxel, conforme ilustrado na Figura 6G deU.S. 6.306.993. A Figura 6F de U.S. 6.306.993 também indicaa estrutura de TAX0TERE (uma marca registrada de AventisPharma, França) (R'=H, R"= t-butiloxicarbonila (isto é,Boc) ) , que é um análogo de paclitaxel sintético um poucomais solúvel. "Taxóide" se refere a análogos de paclitaxelque ocorrem naturalmente, sintéticos ou geneticamentemodificados e que contém os anéis básicos A, B e Cpaclitaxel, conforme mostrado na Figura 6H de U.S.6.3 06.993 que os descreve na coluna 16, linhas 9 a 26. Umaampla série de informações sobre taxanos e taxóides,incluindo métodos químicos, sintéticos e biológicos elinhagens de células para se testar a atividadeanticancerígena, é apresentada em Taxol: Science andApplications, Suffness, M., Ed., CRC Press, Nova York NY(1995).
<formula>formula see original document page 49</formula>
Tanto o oxigenio da hidroxila C2' ou o oxigenio dahidroxila C7 de paclitaxel e seus derivados pode servircomo a porção -Nu da molécula carga. Como a conjugação emC2' pode reduzir a atividade anticancerígena, os ligantesliberáveis propostos em uma modalidade da invenção sãoextremamente vantajoso, uma vez que eles são completamenteclivados da carga antes de ocorrer o transporte através deuma barreira biológica. 0 nitrogênio da amida pode tambémser usado com a porção -Nu da molécula carga se fordesejado. Alternativamente, podem ser usados outros métodossintéticos, tais como os descritos em U.S. 6.306.993,Exemplo 9, ou colunas 15-16, Exemplos de conjugados depaclitaxel (TAXOL) que empregam os conjugados da presenteinvenção são descritos no Exemplo 8.
B. íons metálicos.
Os íons metálicos podem ser transportados em forma dequelatos. Os metais podem ser quelados, por exemplo, peloácido dietileno-triamino-pentacético, DTPA, que pode entãoser ainda mais derivado, por acoplamento de Boc-NH-CH2CH2-NH2, por exemplo, a uma carboxila livre usandocarbodiimidas ou reagentes de urônio, tais como HATU, HBTUe TBTU, removendo-se em seguida o grupo Boc; o nitrogêniolivre do complexo me tal-DTPA-NH-CH2CH2-NH2 pode servir comoo grupo -NuH. Alternativamente,os metais podem sercomplexados em derivados de porfirinas ou tetrapirrol taiscomo ftalocianinas ou texafirinas contendo um grupo aminolivre, tal como os grupos ácido carboxílico, por exemplo,de mesoporfirina IX podem ser derivados com Boc-NH-CH2CH2-NH2, conforme descrito acima para DTPA para a conjugaçãosubseqüente ao ligante liberável. Ferro, magnésio, zinco,cobre (Cu67, por exemplo) , níquel, cobalto (Co57, porexemplo) , európio, tecnécio (Tc99m, por exemplo) , európio,lutécio, ítrio (Y90, por exemplo) praseodímio, gadolínio,gálio (Ga67, por exemplo) ou índio (In111, por exemplo) . Emdiversas modalidades, o metal pode ser um íon metálicodivalente tal como Ca+2, Mn+2, Co+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Hg+2,Sm+2 e U02+2, ou um íon metálico trivalente, tal como Mn+3,Co+3 , Ni+3, Y+3, In+3, Pr+3, Nd+3, Sm+3 , Fe+3, Ho+3, Ce+3, Eu+3,Gd+3, Tb+3, Dy+3, Er+3, Tm+3, Yb+3, Lu+3, La+3 e U+3.
C. Macromoléculas
Macromoléculas podem também ser transportadas comocarga nos conjugados. As macromoléculas incluem, semlimitação, proteínas, plasmídeos e oligossacarídeos,incluindo, sem limitação, polinucleotídeos e análogos depolinucleotídeos, polipeptídeos (peptídeos e proteínas) eanálogos de polipeptídeos (tais como peptóides) epolissacarídeos e análogos de polissacarídeos. Exemplos epolinucleotídeos e de análogos de polinucleotídeos incluemDMA, DNAc, DNA polimerizado in vitro, DNA de plasmídeo,fragmentos de DNA de plasmídeo, DNA linear, vetores (PI,PONTO DE ACESSO, BAC, YAC, cromossomos artificiais) , DNArecombinante, DNA cromossômico, DNA anti-sentido, ouderivados destes DNAs; pequenos rnas interferentes (siRNAou RNAi), RNAt (RNA de transferência), snRNA (RNA nuclearpequeno), RNAr (RNA ribossômico), RNAm (RNA mensageiro) ,ribozimas (que contém opcionalmente um ou mais subunidadede nucleotídeos 2'-desóxi para aumentar a estabilidade), eácidos nucléicos peptidicos (PNA). Exemplos depolipeptídeos e de análogos de polipeptídeos incluemhormônios peptidicos, peptóides, anticorpos, anticorposmonoclonais, anticorpos de cadeia única (scAb), fragmentosde anticorpos tais como Fv, Fc, F(ab')2 e Fab, fragmentosde região variável de cadeia única (scFv), enzimas, toxinase antigenos protéicos tais como antígenos de tumores. Osanálogos de polinucleotídeos e análogos de polipeptídeospodem ter estruturas principais modificadas para conferiruma ou mais propriedades desejáveis, tais como uma maiorresistência a degradação ou uma hidrossolubilidadealterada. Os análogos podem incluir análogos de estruturaprincipal com carga, e de preferência, sem carga, tais comofosfonatos (de preferência metil fosfonatos),fosforamidatos, tiofosfatos, polímeros à base de morfolinosem carga, 2'-0-metil polinucleotídeos e ácidos nucléicospeptidicos (PNAs). Os PNAs são análogos de DNA em que aestrutura principal constituída por unidades de N-(2-aminoetil)glicina, é estruturalmente análoga à estruturaprincipal de desóxi-ribofosfato de DNA; as unidades podemconter qualquer uma das bases que ocorrem naturalmente empolinucleotídeos. Os polipeptídeos têm uma variedade denucleófilos que podem servir como a porção -Nu da carga.Alternativamente, a derivação de peptídeos e proteínas paraintroduzir um nucleófilo é simples; veja Wong, Chemistry ofProtein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press: BocaRaton, 1991.
Um tipo de ácido nucléico de interesse é a classe deRNAs pequenos interferentes (ou RNAs interferentes curtos,siRNA) que resultas em interferência de RNA (RNAi). Ainterferência de RNA foi objeto de intensa pesquisa devidoao seu potencial para o silenciamento específico aseqüência de genes de interesse, tais como genes de HIV oude hepatite viral em um paciente infectado. Veja Harmon etal., Nature 431:371 (2004) e Grunweller et al. , Curr. Med.Chem. 12:3143 (2005). MicroRNA (miRNA) é um outro tipo deRNA que pode ser usado na regulação de genes; veja Yeung etal., Cell Res. 15:935 (2005) e Du et al. , Development132:4645 (2005). RNA em grampo de cabelo curto (shRNA) podetambém ser usado para a regulação de genes; veja Pekarik,Brain Res. Buli. 68:115-20 (2005).
siRNA, miRNA, e shRNA, assim como outros ácidosnucléicos podem ser facilmente incorporados a conjugados aum ligante liberável. Ou a hidroxila 5' ou a hidroxila 3'de um ácido nucléico pode servir como a fração -NuH damolécula carga de ácido nucléico. Alternativamente, podemser facilmente introduzidos nucleófilos sobre ácidosnucléicos usando-se métodos já conhecidos na técnica; veja,por exemplo, patentes U.S. Nos. 5.594.118, 5.843.650,6.537.783, e 6.699.978.
As ciclosporinas constituem outro grupo demacromoléculas adequadas para uso como carga. Asciclosporinas são peptídeos cíclicos que apresentam umaatividade imunossupressora. A ciclosporina A (ChemicalAbstracts REGISTRY número 59865-13-3; ciclo [L-alanil-D-alanil-N-metil-L-leucil-N-metil-L-leucil-N-metil-L-valil-(3R,4R,6Ε)-6,7-didesidro-3-hidróxi-Ν,4-dimetil-L-2-aminooctanoil-L-2- aminobutanoil-N-metilglici1-N-metil-L-leucil-L-valil-N-raetil-L-leucil]) é usado clinicamente parasuprimir a rejeição do órgão depois do transplante. 0 grupo3-hidróxi na unidade 2-amino-octanoil proporciona um sítioconveniente para a ligação do grupo ligante da invenção,servindo como a unidade "Nu" da ligação de carga noconjugado. Outras ciclosporinas, tais com a ciclosporina B,ciclosporina C, ciclosporina D, ciclosporina G,ciclosporina H, e ciclosporina M (veja, por exemplo,patente U.S. No. 6.007.840 e 6.004.973) podem também serconjugadas no grupo 3-hidróxi; a proteção adequada dahidroxila de treonina de ciclosporina C é empregada paraimpedir a derivação neste sítio (ou, alternativamente, aproteção adequada do grupo 3-hidróxi da fração 2-amino-octanoil é provida, e o conjugado é formado na hidroxila detreonina da ciclosporina C).
Se um grupo "Nu" diferente é desejado, pode serintroduzido, por exemplo, por criar o éster de cloroacetatodo grupo 3-hidróxi (o éster de cloroacetato de ciclosporinaA tendo o Número de REGISTRO no Chemical Abstracts de141749-42-0; ver US 6.73 0.2 93, Figura 1, e Exemplo 5.A.1para preparação da ciclosporina A alfa-cloroacetil), e pelareação do grupo cloroacetil adicional para introduzir ogrupo desejado. Outras ciclosporinas, tais como,ciclosporina B, ciclosporina C, ciclosporina D,ciclosporina G, e ciclosporina H podem também ser derivadascomo ésteres de cloroacetato para conjugação; proteçãoapropriada da hidroxila de treonina de ciclosporina C éempregada para prevenir a reação de anidrido de cloroacetilnaquele local (ou, alternativamente, proteção apropriada dogrupo 3-hidróxi da porção 2-aminooctanoil é fornecida, e oéster de cloroacetil é formado na hidroxila de treonina deciclosporina C) . O cloro do grupo cloroacetila pode entãoser deslocado com o grupo portador de nucleófilo desejado.
Exemplo 5.A.I. patente U.S. No. 6.730.293 pode sermodificado empregando-se o anidrido simétrico de Boc-glicina, ou um éster ativo de Boc-glicina, em vez doanidrido de cloroacetila. Outros derivados de glicinaprotegidos podem também ser usados. Depois de se acoplar aglicina protegida ao grupo 3-hidróxi da subunidade 2-amino-octanoíla de ciclosporina, a desproteção do grupo amino daglicina resulta em um nucleófilo de nitrogênio adequadopara uso como o grupo "Nu" nos conjugados da presenteinvenção.
Alternativamente, podem ser usados os derivados deciclosporina com grupos introduzidos para a conjugação;veja, por exemplo, patente U.S. No. 6.207.398.
D. Poliaminas
Outro tipo de molécula que pode ser usado como carga éuma poliamina ou análogo de poliamina. As poliaminas sãomoléculas que ocorrem naturalmente e que têm dois ou maisgrupos amino conectados por cadeias alquílicas decomprimento variado. Os análogos de poliamina são moléculasque ocorrem não naturalmente e que têm dois ou mais gruposamino, sendo que uma ou mais das cadeias alquílicas foisubstituída com um componente que ocorre não naturalmente,tal como uma unidade hidrocarbila conformacionalmenterestrita, para produzir uma poliamina conformacionalmenterestrita. "Conformacionalmente restrita" significa que, emum análogo de poliamina, pelo menos dois grupos amino namolécula estão travados ou limitados em configuraçãoespacial uma em relação à outra. Os grupos amino nointerior da molécula podem ser primários, secundários,terciários ou quaternários e são, de preferência, gruposamino primários ou secundário, sendo mais preferível quesejam grupos amino secundários. 0 movimento relativo dedois grupos amino pode ser restringido, por exemplo, porincorporação de uma fração cíclica ou insaturada entre eles(exemplificando, mas sem limitação, um anel, tal como umanel de três carbonos, anel de quatro carbonos, anel decinco carbonos, anel de seis carbonos, ou uma ligação duplaou tripla tal como uma ligação de carbono dupla ou tripla).Grupos que restringem a flexibilidade conformacional pormeio de impedimento estérico, no entanto favorável aosefeitos terapêuticos do composto podem também ser usados.Um análogo de poliamina conformacionalmente restrito podecompreender pelo menos dois grupos amino que sãoconformacionalmente restritos um ao outro; um análogo depoliamina pode também compreender ainda grupos amino quenão são conformacionalmente restritos em relação a outrosgrupos amino. Os análogos de poliamina conformacionalmenterestritos incluem, sem limitação, os compostos descritos nopedido de patente internacional WO 98/17624, na patenteU.S. No. 5.889.061 e na patente U.S. No. 6.392.098; oscompostos descritos em WO 00/66587 e na patente U.S. No.6.794.545; e os compostos descritos nas publicações depedidos de patentes U.S. Nos. 2003/0072715, 2003/0195377, enos pedidos de patentes internacionais WO 02/10142, e WO03/050072. Outras poliaminas que podem ser usadas são asdescritas na publicação de pedido de patente U.S. No.2003/013056, que descreve poliaminas saturadas de cadeialonga (a que se refere naquele documento como"oligoaminas"). Todos os compostos descritos nasreferências acima, incluindo sem limitação, o relatório,reivindicações, tabelas, exemplos, figuras e esquemas dessapatente são expressamente incorporados ao presentedocumento a título de referência.
Os diversos grupos amino nas poliaminas podem servircomo a fração -NuH da molécula carga. Para restringir aconjugação a um único sítio na poliamina, pode ser usadauma proteção diferencial dos grupos amino no compostopoliamina para impedir a reação em sítios indesejáveis.
Exemplos de compostos de poliamina úteis na invençãosão ilustrados na Tabela 1. Embora alguns dos compostossejam ilustrados como sais, tal como sal cloridrato, deveficar subentendido que a descrição na tabela abrange todosos sais, hidratos e solvatos dos compostos ali ilustrados,assim como a forma não sal, não hidrato/não solvato docomposto, conforme é bem compreendido pelos versados natécnica. A Tabela 1 inclui tanto análogos de poliamina nãoconformacionalmente restritos (oligoaminas) como análogosde poliamina conformacionalmente restritos.
Tabela 1
<table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table>
Ε. Moléculas repórteres
Outro tipo de molécula que pode ser usada como carga éuma molécula repórter. Moléculas repórteres são moléculasque podem ser facilmente detectadas para uma análisequantitativa ou qualitativa. Exemplos de moléculasrepórteres incluem, sem limitação, moléculas radioativas,moléculas fluorescentes (tais como rodaminas, cumarinas,cianinas, fluoresceínas, corantes de xanteno, (ácido (4-(2 , 7-diflúor-6-hidróxi-=3-oxo-xanten-9-il)benzeno-1,3-dicarboxílico, conhecido como OREGON GREEN, uma marcaregistrada de Molecular Probes, Inc., Oregon, por exemplo),pirenos, quelatos de lantanídeos, por exemplo), moléculasfosforescentes (metaloporfirinas, eosina, eritrosina, porexemplo), átomos pesados (tipicamente quelados a um veiculoorgânico), moléculas quimioluminescentes, moléculasbioluminescentes (luciferina, por exemplo, que é detectadaem células, tecidos ou animais quando convertidas porluciferase em luz e produto secundário), moléculasbiotiniladas que podem ser reconhecidas por uma avidinarotulada ou estreptavidina rotulada (em que é detectada aavidina rotulada ou a estreptavidina), moléculasantigênicas que podem ser reconhecidas por um anticorporotulado (em que é detectado o anticorpo rotulado) , e íonsmetálicos tais como os descritos acima, que podem serusados como agentes diagnósticos, agentes de imageamento eagentes de detecção.
Tal como ocorre com outras moléculas carga, asmoléculas repórteres podem ser ligadas ao ligante porutilização de uma fração nucleofilica sobre a molécularepórter. Assim, para a luciferina
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o oxigênio fenólico no anel benzo[d]tiazol pode serdesprotonado (um sal do composto, por exemplo, o salpotássico, por exemplo, pode ser dissolvido em uma baseaquosa) e usado como a fração nucleofílica -Nu(-) docomponente Carg-Nu(-). Outros compostos podem também serligados por meio de grupos nucleofílicos adequados;Rodamina 110 pode ser ligada por meio do seu grupo -NH2aromático.
A detecção da molécula repórter pode ser conduzida pordiversos modos conhecidos na técnica, detecçãoespectroscópica, por exemplo, detecção de radioatividade,detecção eletroquimica ou ensaio enzimático. 0 limiar dedetecção para o sinal produzido pela molécula repórter deveser ajustado a um nível razoável de modo a se distinguir osinal do ruído de fundo, um nível de sinal de uma magnitudede 10 %, 25 %, 50 % ou 100 % acima do desvio padrão doruído de fundo ou um nível de sinal com aproximadamente 66% de probabilidade, sendo mais preferível deaproximadamente 95 % de probabilidade, ainda maispreferível de aproximadamente 99 % de probabilidade, de serdevido ao sinal e não ao ruído.
Ligante liberável
Uma variedade de ligantes liberáveis pode ser usada nainvenção. Um sistema ligante preferido é representado pelaestrutura:
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em que R1 é hidrocarboneto Ci-C8, de preferência -alquila Ci-C8, sendo mais preferível alquila Ci-C4, sendoainda mais preferível -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- ou -CH2CH2CH2CH2-; e V é O, NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S, de preferência-O-; e R2 é alquila C1-C4. Em um ambiente redutor, tal comoo interior de uma célula, a ligação dissulfeto destesistema ligante é reduzida a seus tióis constituintes.
Para fins de ilustração onde as duas moléculas Carg-Nue Transp são ligadas por este ligante:
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o transporte do conjugado para o interior da célularesulta na redução da ligação dissulfeto para produzir osprodutos:
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O tiol livre do produto Carg-Nu-(C=O)-V-Ri-SH podeagora reagir intramolecularmente com diversos componentesdo sistema carbonila a fim de liberar a molécula livreCarg-Nu (em forma de Carg-Nu(-), Carg-Nu(-)M+ em que M+ éum equivalente de um cátion, ou Carg-NuH). Dependendo danatureza do grupo R1 e dos grupos selecionados como V e Nu,o tiol livre pode reagir no carbono de carbonila paraproduzir Carg-Nu e o produto cíclico
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Quando Ri é -CH2CH2- ou -CH2CH2CH2-, resulta um anel decinco ou seis membros, respectivamente, e a ciclizaçãointramolecular é relativamente simples. Outros gruposhidrocarboneto podem ser selecionados para "modular" a taxada reação intramolecular.
Alternativamente, o tiol livre pode reagir no carbonoalfa ao átomo V. Quando um grupo -CH2-, por exemplo, éadjacente ao átomo V e Rir representa o restante do grupo<formula>formula see original document page 65</formula>
o tiol pode atacar o grupo -CH2- adjacente ao átomo Vem uma reação de deslocamento do tipo SN2, resultando nosprodutos
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Quando Rir é -CH2CH2CH2- ou -CH2CH2CH2CH2-, resulta umanel de cinco ou seis membros, respectivamente e aciclização intramolecular por meio do mecanismo SN2 érelativamente simples
0 produto
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se decompõe com relativa rapidez em Carg-Nu(-), Carg-Nu (-) M+ em que M+ é um equivalente de um cátion, ou Carg-NuH. Quando Nu e V são ambos O, por exemplo,
<formula>formula see original document page 65</formula>
o produto se descarboxila rapidamente produzindo Carg-Nu(-), Carg-Nu(-)M+ ou Carg-NuH com um desprendimentoconcomitante de CO2.
A síntese de um conjugado de uma molécula carga, Carg-NuH e de uma molécula transportadora, Transp-SH com esteligante pode ser conduzida usando-se o seguinte esquemageral
<formula>formula see original document page 66</formula>
Faz-se reagir a molécula HV-R1-SH com um compostodissulfeto que é substituído em cada átomo de enxofre comum bom estabilizador de grupo abandonador tiol (TLGS; osdois grupos TLGS podem ser iguais ou diferentes), obtendo-se HV-Ri-S-S-TLGS. 0 estabilizador do grupo abandonadortiol serve para estabilizar o grupo tiol deslocado dodissulfeto. Exemplos de compostos de dissulfeto que sãosubstituídos em cada átomo de enxofre com um bomestabilizador de grupo abandonador tiol são dissulfeto de2,2'-dipiridila (2,2'-ditiodipiridina) e o reagente deEllman (ácido 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzóico), DTNB);outros exemplos de tais reagentes ativadores de dissulfetosão conhecidos na técnica. (Observe-se que quando V é -S-,ele deve ser protegido com um grupo protetor tal comotritila ou p-metóxi-tritila, que pode ser subseqüentementeremovido com ácido fraco sem perturbar o dissulfeto). Emseguida faz-se reagir HV-Ri-S-S-TLGS com um composto deforma Yx-(C-O)-Y2, em que Yi e Y2 são bons grupos de saída epodem ser iguais ou diferentes. Exemplos destes compostosincluem fosgênio (Cl-(C=O)-Cl), bis(p-nitrofenil)carbonatoou carbonil diimidazol. Isto produz uma molécula de formaY1-(C=O)-V-RliS-S-TLGS. Esta molécula é diativada; o grupoY1 pode ser substituído por um nucleófilo ao passo que ogrupo (-S-TLGS) pode ser substituído por uma fraçãocontendo tiol. Assim, a reação com uma molécula carga deforma Carg-Nu (-), Carg-Nu(-)M+ (em que M+ é um equivalentede um cátion) , ou Carg-NuH produz a molécula Carg-Nu-(C=O) -V-R1-S-S-TLGS. A reação deste intermediário com um compostode forma Transp-SH forma o conjugado desejado Carg-Nu-(C=O)-V-R1-S-S-Transp.
Uma via alternativa de síntese é ilustrada abaixo, quemodifica a Carg-NuH do seguinte modo:
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Este produto é então usado na seguinte série dereações:
<formula>formula see original document page 67</formula>
que resulta no conjugado desejado.
Modos de administração
Os compostos úteis nos métodos da invenção podem seradministrados a um paciente ou indivíduo (de preferência,um paciente ou indivíduo humano) por meio de qualquer viaconhecida na técnica, incluindo, sem limitação, aquelasdescritas aqui. Os métodos de administração incluem, semlimitação, sistêmica, transpleural, intravenosa, oral,intra-arterial, intramuscular, tópica, por inalação (emforma de névoa ou pulverização, por exemplo), por mucosanasal, subcutânea (injeção subcutânea ou injeção subdermal,por exemplo), transdermal, intraperitoneal, intra-ocular,bucal e gastrintestinal. Os compostos descritos ouincorporados por referência para uso no presente documentopodem ser administrados na forma de comprimidos, pílulas,misturas de pós, cápsulas, grânulos, injetáveis, cremes,soluções, supositórios, emulsões, dispersões, pré-misturasde alimentos e em outras formas adequadas. Os compostospodem também ser administrados em formulações delipossomos. Os compostos podem também ser administradoscomo pró-fármacos, em que a pró-fármaco sofre umatransformação dentro do indivíduo em uma forma que éterapeuticamente efetiva. Métodos adicionais deadministração são conhecidos na técnica.
Os compostos para uso na invenção são convenientementemisturados com um veículo farmaceuticamente aceitável, talcomo um veículo orgânico farmacêutico não tóxico ou umveículo inorgânico farmacêutico não tóxico. Veículosfarmaceuticamente aceitáveis típicos incluem, por exemplo,manitol, uréia, dextranos, Iactose, amidos de batata emilho, estearato de magnésio, talco, óleos vegetais,polialquileno glicóis, etil celulose,poli(vinilpirrolidona), carbonato de cálcio, oleato deetila, miristato de isopropila, benzoato de benzila,carbonato de sódio, gelatina, carbonato de potássio, ácidosilícico e outros veículos aceitáveis convencionalmenteempregados. A forma de dosagem farmacêutica pode tambémconter substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentesemulsificantes, conservantes ou umectantes e semelhantes.Um veículo adequado é aquele que não causa um efeitosecundário intolerável, mas que permite que o(s)composto(s) conserve a sua atividade farmacológica nocorpo. As formulações para fornecimento parenteral e nãoparenteral de fármacos são conhecidas na técnica e sãoapresentadas em Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 20a. Edição, Lippincott, Williams & Wilkins.Formulações adicionais são descritas em Rowe, Raymond C,Paul J. Sheskey, e Sian C. Owen, eds., Handbook ofPharmaceutical Excipients, 5a. Edição, Nova York: McGraw-Hill/APhA Publications, 2005; e Gibson, Mark,Pharmaceutical Preformulation and Formulation: A PracticalGuide from Candidate Drug Selection to Commercial DosageForm, Boca Raton: CRC, 2001. As composições da presenteinvenção podem ser administradas na forma de saisfarmaceuticamente aceitáveis; veja Heinrich Stahl, P. eCamille G. Wermuth, eds., Pharmaceutical Salts: Properties,Selection, and Use, Hoboken, NJ: Wiley-VCH, 2002. Formassólidas, tais como comprimidos, cápsulas e pós, podem serfabricadas usando-se maquinaria convencional de fabricaçãode comprimidos e de enchimento de cápsulas, que é bemconhecida na técnica. As formas de dosagem sólidasincluindo comprimidos e cápsulas para a administração oralem forma de apresentação de dose unitária podem conterqualquer número de ingredientes não ativos adicionaisconhecidos na técnica, incluindo tais aditivosconvencionais como excipientes; dessecantes; colorantes;agentes de aglutinação, tais como, por exemplo, xarope,acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto e polivinilpirrolidona; cargas, lactose, por exemplo, açúcar, amido demilho, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina;lubrificantes para a formação de comprimidos, tais como,por exemplo, estearato de magnésio, talco, polietilenoglicol ou sílica; desintegrantes, amido de batata, porexemplo; ou agentes umectantes aceitáveis tais como laurilsulfato de sódio. Os comprimidos podem ser revestidos deacordo com métodos bem conhecidos em prática farmacêuticapadrão. As formas líquidas para ingestão podem serformuladas usando-se veículos líquidos conhecidos,incluindo veículos aquosos e não aquosos tais como águaestéril, solução salina estéril, suspensões, emulsões deóleo em água e/ou de água em óleo, e semelhantes. Asformulações líquidas podem também conter qualquer número deingredientes não ativos adicionais, incluindo colorantes,fragrância, aromatizantes, modificadores de viscosidade,conservantes, estabilizantes e semelhantes. Para aadministração parenteral, os compostos para uso na invençãopodem ser administrados em forma de dosagens de uma soluçãoou de uma suspensão do composto em um diluentefisiologicamente aceitável ou um veículo líquido estériltal como água, solução salina ou óleo, com ou semtensoativos ou adjuvantes adicionais. Uma lista ilustrativade óleos veículos incluiria óleos animais e vegetais (óleode amendoim, óleo de soja, por exemplo), óleos derivados depetróleo (óleo mineral, por exemplo) e óleos sintéticos.
Em uma modalidade, os compostos da invenção sãoformulados em uma forma de dosagem farmacêutica unitária. Adosagem unitária contém uma quantidade terapeuticamenteefetiva do composto da invenção.Para doses unitárias injetáveis, os veículos líquidospreferidos são líquidos estéreis como água, solução salina,solução salina tamponada com fosfato, dextrose aquosa, esolução de açúcar correlatas.
A dosagem unitária farmacêutica escolhida pode serfabricada e administrada para fornecer uma concentraçãofinal definida da fármaco ou no sangue ou nos tecidos deinteresse. A concentração efetiva ótima dos compostos dapresente invenção pode ser determinada empiricamente edependerá do tipo e da gravidade da doença, da via deadministração, do progresso da doença e da saúde, massacorporal e área do corpo do paciente. Tais determinaçõesestão dentro das habilidades dos versados na técnica.Exemplos de dosagens que podem ser usadas para aadministração sistêmica (incluindo oral ou parenteral)incluem, sem limitação, uma quantidade efetiva dentro delimites de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 300mg/kg ou dentro de aproximadamente 1,0 pg/kg aaproximadamente 4 0 mg/kg de peso corporal, ou dentro delimites de aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 2 0pg/kg de peso corporal ou dentro de aproximadamente 0,1mÇf/kg a aproximadamente 2 0 mg/kg de peso corporal ou dentrode aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 2 0 mg/kg depeso corporal, ou dentro de aproximadamente 0,1 mg/kg aaproximadamente 10 mg/kg de peso corporal,, ou dentro deaproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de pesocorporal ou dentro de aproximadamente 0,1 pg/kg aaproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Exemplos dedosagens que podem ser usadas para a administraçãosistêmica (incluindo oral e parenteral) quando baseadas emuma área de superfície corporal (expressa em metrosquadrados ou m2) incluem, sem limitação, uma quantidadeefetiva dentro de limites de dosagem de aproximadamente 0,1pg/m2 a aproximadamente 3 00 mg/m2 de área de superfíciecorporal, ou dentro de aproximadamente 10 pg/m2 aaproximadamente 300 mg/m2 de área superficial corporal, oudentro de aproximadamente 100 pg/m2 a aproximadamente 3 00mg/m2 de área superficial corporal, ou dentro deaproximadamente 1 mg/m2 a aproximadamente 300 mg/m2 de áreasuperficial corporal, ou dentro de aproximadamente 10 mg/m2a aproximadamente 300 mg/m2 de área superficial corporal,ou dentro de aproximadamente 10 mg/m2 a aproximadamente 2 00mg/m2 de área superficial corporal, ou dentro deaproximadamente 10 mg/m2 a aproximadamente 120 mg/m2 deárea superficial corporal, ou dentro de aproximadamente 4 0mg/m2 a aproximadamente 12 0 mg/m2 de área superficialcorporal, ou dentro de aproximadamente 60 mg/m2 aaproximadamente 100 mg/m2 de área superficial corporal. Asdosagens podem também ser administradas com menorfreqüência do que diariamente, seis vezes por semana, cincovezes por semana, quatro vezes por semana, três vezes porsemana, duas vezes por semana, aproximadamente uma vez porsemana, aproximadamente uma vez a cada duas semanas,aproximadamente uma vez a cada três semanas,aproximadamente uma vez a cada quatro semanas,aproximadamente uma vez a cada seis semanas,aproximadamente uma vez a cada dois meses, aproximadamenteuma vez a cada três meses, aproximadamente uma vez a cadaquatro meses, ou aproximadamente uma vez a cada seis meses.
Em uma modalidade da invenção, as dosagens podem seradministradas em uma formulação de liberação sustentada ouum implante de liberação sustentada, tal como em umimplante que gradualmente libere o composto para uso nainvenção durante um período de tempo e que permita que afãrmaco seja administrada com menor freqüência, tal comoaproximadamente uma vez ao mês, aproximadamente uma vez acada 2-6 meses, aproximadamente uma vez ao ano ou mesmo umaúnica administração que não precisa ser repetida. Osimplantes, dispositivos ou formulações de liberaçãosustentada (tais como grânulos, microesferas, esemelhantes) podem ser administrados por aplicação tópica,por injeção ou podem ser cirurgicamente implantados emdiversos locais.
Em outra modalidade da invenção, os conjugados ecompostos da invenção podem também ser administrados poradministração tópica. 0 termo "administração tópica" éusado no seu sentido convencional como significando aaplicação de um agente ativo à pele ou mucosa para produzirum efeito local. Os conjugados e compostos para uso nosmétodos da presente invenção estão contidos em umaformulação tópica em uma concentração terapeuticamenteefetiva. A formulação pode conter o composto selecionado emum veículo tópico adequado a qualquer concentração totaladequada, tal como qualquer uma de aproximadamente 1 mM a
aproximadamente 1000 mM, de aproximadamente 10 mM aaproximadamente 500 mM, ou de aproximadamente 10 mM aaproximadamente 100 mM.
As concentrações adequadas dos conjugados ou compostospodem também ser expressas em termos de porcentagem empeso/volume ou peso/peso que podem variar dependendo dadensidade do veículo e de outros componentes na formulação.Um conjugado ou composto pode estar presente na formulaçãoa uma concentração (peso/volume), por exemplo, de pelomenos aproximadamente qualquer uma de 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%,5%, 6%, 7%, 8%, 9%, ou 10%. Em modalidades para uso tópico,a concentração do conjugado ou composto é tal que umadosagem tópica de aproximadamente 0,5 gramas de formulaçãopode ser aplicada sobre uma área da pele de 5 cm χ 5 cm (25cm2). Em veículos tópicos típicos, as composições sãofacilmente formuladas e não deixam nenhum resíduo visívelsignificativo quando aplicadas à pele. As formulações a umaconcentração mais elevada, tal como em pastas saturadas ououtras formas, podem também ser usadas com sucesso,especialmente nos casos em que a aparência visível não éuma consideração limitante (como em aplicaçõesterapêuticas).
As avaliações clínicas de rotina podem ser facilmenteempregadas para se otimizar a concentração do conjugado oucomposto da invenção e para se assegurar se concentraçõesmais altas ou mais baixas são apropriadas para umaformulação dada ou distúrbio dado. Em modalidades para usotópico, por exemplo, a concentração pode ser ajustada paralevar em conta a quantidade de formulação que é tipicamenteaplicada topicamente pelo usuário, que dependerá até umcerto ponto da natureza física do veículo tópico (loção,por exemplo, em comparação com veículos de pulverização delíquido). Do mesmo modo, a quantidade do compostonecessária pode ser reduzida em tais casos em que aformulação contém um ingrediente que intensifica apenetração ou outro agente que aumenta a capacidade doscompostos de permear o estrato córneo.
As formulações da presente invenção são preparadasmisturando-se uma quantidade adequada de um conjugado oucomposto selecionado no veículo de formulação escolhido aum pH adequado. É preferível que o conjugado ou compostoselecionado seja suficientemente solúvel no veículo deformulação para permitir uma formulação consistente quetenha as características de aplicação física desejadas.
Para aplicações tópicas, são bem conhecidos osveículos tópicos para uso com as formulações da invenção natécnica cosmética e farmacêutica, e incluem tais veículos(ou componentes de veículos) como água; solventes orgânicostais como álcoois (especialmente álcoois inferioresfacilmente capazes de se evaporar da pele tais com etanol),glicóis (tais como glicerina), álcoois alifáticos (taiscomo lanolina); misturas de água e solventes orgânicos(tais como água e álcool); misturas de solventes orgânicostais com álcool e glicerina (opcionalmente também comágua); materiais à base de lipídios tais como ácidosgraxos, acil gliceróis (inclusive óleos, tais como óleomineral e gorduras de origem natural ou sintética),fosfoglicerídeos, esfingolipídios e ceras; materiais à basede proteína tais como colágeno e gelatina; materiais à basede silicone (tanto não voláteis como voláteis) tais comociclometicona, medeticonol e dimeticona copoliol (DowCorning); materiais à base de hidrocarbonetos tais comopetrolato e esqualeno; tensoativos aniônicos, catiônicos eanfóteros e sabões; veículos de liberação sustentada taiscomo micro-esponjas e matrizes poliméricas; agentesestabilizantes e de suspensão; e outros veículos ecomponentes de veículos que sejam adequados para aadministração tópica, assim como misturas de componentes deveículos tópicos conforme identificados acima ou de outromodo qualquer conhecidos na técnica. O veículo pode aindaincluir componentes adaptados para melhorar a estabilidadeou a eficácia da formulação aplicada, tais comoconservantes, antioxidantes, intensificadores de penetraçãocutânea, materiais de liberação sustentada e semelhantes,exemplos de tais veículos e de tais componentes de veículossão bem conhecidos na técnica e são descritos naspublicações sobre formulações de fármacos citadas nopresente documento.
Os compostos para uso na invenção podem seradministrados como o único ingrediente ativo ou podem seradministrados em combinação com outro ingrediente ativo.
Kits
A invenção também propõe artigos de fabricação e kitscontendo os compostos da invenção. O artigo de fabricaçãocompreende um recipiente com um rótulo. Recipientesadequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos e tubosde ensaio. Os recipientes podem ser formados de umavariedade de materiais tais como vidro ou plástico. Orecipiente contém uma composição que tem um agente ativoque é efetivo para o tratamento ou a prevenção de umadoença ou indicação. O rótulo no recipiente indica que acomposição é usada para o tratamento ou prevenção de umadoença ou indicação e pode também indicar instruções parauso.
A invenção também propõe kits que compreendem um oumais de um composto da invenção. Em algumas modalidades, okit da invenção compreende o recipiente descrito acima. Emoutras modalidades, o kit da invenção compreende orecipiente descrito acima e um segundo recipiente quecompreende um tampão. Pode ainda incluir outros materiaisdesejáveis do ponto de vista comercial e do usuário,incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas,seringas e inserções de embalagem com instruções para acondução de quaisquer métodos descritos no presentedocumento.
Em outros aspectos, os kits podem ser usados paraqualquer um dos métodos descritos no presente documento,incluindo, por exemplo, para o tratamento de um paciente ouindivíduo com uma doença ou indicação ou para aadministração profilática a um paciente ou indivíduo quecorre o risco de desenvolver uma doença ou indicação. Oskits podem incluir instruções para a colocação em práticade qualquer um dos métodos descritos no presente documento.
Usos de conjugados
Os conjugados podem ser usados em diversas aplicaçõesterapêuticas, incluindo aquelas descritas nas patentes U.S.Nos. 6.306.993, 6.495.663, 6.593.292, 6.669.951, 6.730.293e 6.759.387; as doenças e aplicações terapêuticas descritasnestes pedidos são incorporados ao presente documento atítulo de referência integralmente. Para se descreveralgumas destas aplicações terapêuticas, os conjugados dapresente invenção são úteis para, entre outros, ofornecimento de agentes biologicamente ativos ediagnósticos através da pele. Os conjugados podem penetrarna epiderme viável que é composta do estrato granuloso,estrato lúcido e estrato germinativo que, juntamente com oestrato córneo, constituem a epiderme. 0 fornecimento emalgumas modalidades da invenção se produz através daepiderme e para dentro da derme, incluindo uma das dermespapilar e reticular ou ambas. Esta capacidade de se obter apenetração de uma ou mais camadas da pelo pode aumentar emmuito a eficácia dos compostos tais como antibacterianos,antifúngicos, antivirais, antiproliferativos,imunossupressores, vitaminas, analgésicos, hormônios esemelhantes. Numerosos tais compostos são conhecidos dosversados na técnica (veja, por exemplo, Hardman e Limbird,Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics, McGraw-Hill, Nova York, 1996). Em algumasmodalidades, o agente é fornecido a um vaso sangüíneo queestá presente no tecido epitelial, proporcionando assim ummeio para o fornecimento do agente sistemicamente. 0fornecimento pode ou ser intrafolicular ou interfolicular,ou ambos. O pré-tratamento da pele não é necessário para ofornecimento dos conjugados. Em outras modalidades, osconjugados da invenção são úteis para o fornecimento decosméticos e de agentes que podem tratar condições da pele.As células alvo na pele que são de interesse incluem, porexemplo, fibroblastos, células epiteliais e células imunes.Os transportadores proporcionam a capacidade de se fornecercompostos tais como agentes antiinflamatórios, por exemplo,a células imunes que se encontram na derme.
Os glicocorticóides (esteróides adrenocorticóides) seencontram entre os compostos para os quais o fornecimentoatravés da pele pode ser intensificado pelos conjugados dainvenção. Os glicocorticóides da invenção são úteis para otratamento de doenças inflamatórias da pele, por exemplo.Os glicocorticóides exemplares incluem, por exemplo,hidrocortisona, predrisonlona (deltasona) e prednisolona(hideltasol). Exemplos de condições específicas incluemeczema (incluindo dermatite atópica, dermatite de contato,dermatite alérgica), doença de bolhas, doença vascular decolágeno, sarcoidose, doença de Sweet, pioderma gangrenoso,lepra reativa do Tipo I, hemangiomas capilares, líquenplano, dermatite esfoliante, eritema nodoso, anomaliahormonais (incluindo acne e hirsutismo) , assim comnecrólise epidérmica tóxica, eritema multiforme, linfoma decélula T cutânea, lúpus eritematoso discóide, esemelhantes.
Os retinóides constituem outro exemplo de um agentebiologicamente ativo para o qual se pode usar os conjugadosda invenção para intensificar o fornecimento para dentro deuma ou mais camadas da pele ou de outro tecido epitelial ouendotelial e através deles. Os retinóides que estãoatualmente em uso incluem, por exemplo, retinol,tretinoína, isotretinoína, etretinato, acitretina earotinóide. As condições que são tratáveis usando-se osretinóides conjugados aos conjugados da presente invençãoincluem, sem limitação, acne, distúrbios de queratinização,câncer da pele, condições pré-cancerosas, psoríase,envelhecimento cutâneo, lúpus eritematoso discóide,escleromixedema, nevus epidérmico verrucoso, dermatosepustular subcomeal, síndrome de Reiter, verrugas, líquenplano, acantose nigricans, sarcoidose, doença de Grover,poroqueratose e semelhantes.
As fármacos citotóxicas e imunossupressoras constituemuma classe adicional de fármacos para as quais são úteis osconjugados da invenção. Estes agentes são habitualmenteusados para o tratamento de doenças hiperproliferantes taiscomo psoríase, assim como para doenças imunes tais comodermatoses bolhosas e vasculite leucocitoclástica. Exemplosde tais compostos que se pode conjugar aos conjugados dainvenção incluem, sem limitação, antimetabólitos e agentesalquilantes. Os agentes biológicos úteis incluem, porexemplo, metotrexato, azatioprina, fluoruracil,hidroxiuréia, 6-ti.oguanina, micof enolato, clorambucil,vinicristina, vinblastina, dactinomicina, ciclofosfamida,cloridrato de mecloroetamina, carmustina, taxol,tactolimus, vinblastina, dapsona e sulfassalazina. Asfármacos imunossupressoras tais como ciclosporina eAscomicinas, tais como FK506 (tacrolimus) e rapamicina(patente U.S. No. 5.912.253, por exemplo) e análogos detais compostos são de interesse especial (Mollinson et al. ,Current Pharm. Design 4(5):367-380 (1998); patentes U.S.Nos. 5.612.350; 5.599.927; 5 . 604.294;5.990.131; 5.561.140;5.859.031; 5.925.649; 5.994.299; 6.004.973 e 5.508.397, porexemplo). As ciclosporinas incluem ciclosporina A, B, C, D,GeM. Veja, por exemplo patentes U.S. Nos. 6.007.840; e6.004.973. Tais compostos são úteis, por exemplo, notratamento de psoríase, eczema (inclusive dermatiteatópica, dermatite de contato, dermatite alérgica) ealopecia areata. A administração sistêmica é também objetoda presente invenção.
Os conjugados da presente invenção podem serconjugados a agentes que são úteis para o tratamento decondições tais como lúpus eritematoso (tanto o discóidecomo o sistêmico), dermatomiosite cutânea, porfíria cutâneatarda e erupção polimorfa leve. Agentes úteis para otratamento de tais condições incluem, por exemplo, quinino,cloroquina, hidróxi-cloroquina e quinacrina.
Os conjugados da invenção podem também ser usados parao fornecimento transdérmico de agentes antiinfecciosos.Agentes antibacterianos antifúngicos e antivirais, porexemplo, podem ser conjugados aos conjugados da invenção.Os agentes antibacterianos são úteis para o tratamento decondições tais como acne, infecções cutâneas e semelhantes.Os agentes antifúngicos podem ser usados para o tratamentode tinha do corpo, tinha do pé, onicomicose, candidiase,tinha versicolor e semelhantes. Devido às propriedadesintensificadoras de fornecimento dos conjugados, estesconjugados são úteis para o tratamento tanto de infecçõeslocalizadas como de disseminadas. Os agentes antifúngicossão também úteis para o tratamento de onicomicose. Exemplosde agentes antifúngicos, sem limitação, antifúngicos deazóis, tais como itraconazol, miconazol e fluconazol.Exemplos de agentes antivirais incluem, sem limitação,aciclovir, famciclovir e valaciclovir. Tais agentes sãoúteis para o tratamento de doenças virais, de herpes, porexemplo.
Outro exemplo de agente biologicamente ativo para oqual é desejável uma intensificação de fornecimento porconjugação aos conjugados da presente invenção são as anti-histaminas. Estes agentes são úteis para o tratamento decondições tais como prurido devido a urticária, dermatiteatópica, dermatite de contato, psoríase e muitos outras.Exemplos de tais reagentes incluem, por exemplo,terfenadina, astemizol, lorotadina, cetirizina,acrivastina, temelastina, ciraetidina, ranitidina,famotidina, nizatidina e semelhantes. Os antidepressivostricíclicos podem também ser fornecidos usando-se osconjugados da presente invenção.
As fármacos contra a psoriase tópicas são também deinteresse. Os agentes tais como corticosteróides,calcipotrieno e antralina podem ser conjugadas aosconjugados da invenção e aplicados à pele.
Os conjugados da invenção são também úteis paraintensificar o fornecimento de agentesfotoquimioterapêuticos para dentro de uma ou mais camadasda pele e de outros tecidos epiteliais e através deles.Tais compostos incluem, por exemplo, os psoralenos, esemelhantes. Os componentes de filtro solar são também deinteresse; estes incluem ésteres do ácido p-aminobenzóico,cinamatos e salicilatos, assim como benzofenonas,antranilatos e avobenzona.
Agentes de alivio de dor e anestésicos locaisconstituem outra classe de compostos para os quais aconjugação aos conjugados da invenção pode melhorar otratamento. Lidocaína, bupibacaína, novocaína, procaína,tetracaína, benzocaína, cocaína e os opiatos estão entre oscompostos que se pode conjugar aos conjugados da invenção.
Outros agentes biológicos de interesse incluem, porexemplo, minoxidil, agentes queratolíticos, agentesdestrutivos tais como podofilina, hidroquinona, capsaicina,masoprocol, colquicina e ouro.
Os conjugados da invenção são também úteis para ofornecimento de fármacos conjugadas por administraçãogastrintestinal. A administração gastrintestinal pode serusada tanto para fármacos sistemicamente ativas como parafármacos que agem no epitélio gastrintestinal. Dentre ascondições gastrintestinais que são tratáveis usando-sereagentes adequados conjugados aos conjugados da invenção são a doença de Crohn (ciclosporina e FK506, por exemplo)colite ulcerosa, úlceras gastrintestinais, doença de úlcerapéptica, desequilíbrio de absorção de sal e água (podelevar a constipação, diarréia, ou desnutrição), doençasproliferativas anormais e semelhantes. Os tratamentos deúlcera incluem, por exemplo, fármacos que reduzem asecreção do ácido gástrico tais como inibidores dehistamina H2 (cimetidina e ranitidina, por exemplo) einibidores do próton-potássio ATPase (lansoprazol eomeprazol, por exemplo) e antibióticos direcionados aHelicobacter pylori.
Os antibióticos se encontram entre os agentesbiologicamente ativos que são úteis quando conjugados aosconjugados da invenção, especialmente aqueles que agemsobre as bactérias invasivas, tais como Shigella.,Salmonella e Yersinia. Tais compostos incluem, por exemplo,norfloxacina, ciprofloxacina, trimetoprim,sulfametiloxazol, e semelhantes.
Agentes antineoplásticos podem também ser conjugadosaos conjugados da invenção e administrados por viagastrintestinal. Estes incluem, por exemplo, cisplatina,metotrexato, taxol, fluoruracil, mercaptopurina,donorubicina, bleomicina e semelhantes. Os conjugados dainvenção podem ser usados para tratar câncer incluindocâncer da mama, câncer ovariano, câncer da próstata, câncerda pele, cânceres gastrintestinais, malignidades do sanguee cânceres oftálmicos. Podem também ser usados para tratara proliferação celular descontrolada, tumorações benignasna pele, por exemplo.
Os conjugados da invenção podem também ser usados paraintensificar a administração de fármacos através do tratorespiratório. O trato respiratório que inclui a mucosanasal, hipofaringe e as estruturas aéreas grandes epequenas, proporcionam uma grande superfície mucosal paraabsorção de fármacos. A penetração melhorada dos agentesconjugados para dentro de uma ou mais camadas do tecidoepitelial ou através delas que é provida pelos conjugadosda invenção resulta na amplificação das vantagens que ofornecimento pelo trato respiratório tem sobre outrosmétodos de fornecimento. Doses mais baixas de um agente,por exemplo, são freqüentemente suficientes para se obterum efeito desejado, um efeito terapêutico local podeocorrer com maior rapidez e níveis sangüíneos terapêuticossistêmicos do agente são obtidos rapidamente. Um rápidoefeito da atividade farmacológica pode resultar daadministração ao trato respiratório. Além disso, aadministração ao trato respiratório geralmente temrelativamente poucos efeitos secundários.
Os transportadores da invenção podem ser usados parafornecer agentes biológicos que são úteis para o tratamentode condições pulmonares. Exemplos de condições tratáveispor administração nasal incluem, por exemplo, asma; Estescompostos incluem agentes antiinflamatórios, tais comcorticosteróides, cromolina e nedocromil,bronquiodilatadores tais como fármacos adronérgicasseletivas para beta 2 e teofilina e fármacosimunossupressoras (ciclosporina e FK506, por exemplo).
Outras condições incluem, rinite alérgica, por exemplo (quepode ser tratada com glicocorticóides) e doença pulmonarobstrutiva crônica (enfisema). Outras fármacos que agemsobre os tecidos pulmonares e podem ser fornecidas usando-se os transportadores da invenção incluem beta-agonistas,estabilizadores de mastócitos, antibióticos, agentesantifúngicos e antivirais, tensoativos, fármacosvasoativas, sedativos e hormônios.
A administração ao trato respiratório é útil nãosomente para o tratamento de condições pulmonares, mastambém para o fornecimento de fármacos a órgãos alvodistantes por meio do sistema circulatório. Uma amplavariedade de tais fármacos e agentes diagnósticos pode seradministrada ao trato respiratório depois da conjugação aosconjugados da invenção.
Os conjugados da invenção são também úteis para ofornecimento de agentes biologicamente ativos ediagnósticos através da barreira sangue-cérebro. Os agentessão úteis para o tratamento de isquemia (usando-se umfármaco anti-apoptótica, por exemplo), assim como para ofornecimento de rieurotrasnmissores e de outros agentes parao tratamento de diversas condições tais como esquizofrenia,doença de Parkinson, dor (morfina, por exemplo, osopiatos). O antagonista de receptor de 5-hidroxitriptaminaé útil para o tratamento de condições tais como doenças daenxaqueca e ansiedade.
Os conjugados da invenção são também úteis para ofornecimento de agentes de imageamento e contrastediagnósticos para dentro de uma ou mais camadas de umtecido epitelial e/ou endotelial ou através delas. Exemplosde agentes diagnósticos incluem substâncias que sãorotuladas com radioatividade tais como glicoheptonato de99mTc ou substâncias usadas em procedimentos de imageamentode ressonância magnética (IMR) tais como agentes quelantesdopados com gadolínio (Gd-DTPA, por exemplo). Outrosexemplos de agentes diagnósticos incluem genes marcadoresque codificam proteínas que são facilmente detectáveisquando expressas em uma célula (incluindo, sem limitação,beta-galactosidase, proteína fluorescente verde, luciferasee semelhantes). Uma ampla variedade de rótulos podem serempregada tais como radionuclídeos, flúores, enzimas,substratos para enzimas, cofatores de enzimas, inibidoresde enzimas, ligantes (especialmente haptenos) etc.
Os exemplos abaixo são dados para ilustrar diversasmodalidades da invenção, e não se destinam a limitar denenhum modo a invenção.
EXEMPLOS
A não ser que seja determinado em contrário, todos osreagentes e solventes foram obtidos de fontes comerciais eforam usados sem purificação. TLC analítica foi conduzidacom placas 60F de gel de sílica de 0,25 mm com indicadorfluorescente (254 nm). As placas foram visualizadas por luzultravioleta e tratamento ou com tingimento com molibdatode amônio (preparado por combinação de 90 g de molibdato deamônio, 6 g de sulfato de cério e 1800 mL de H2SO4 a 10%) oucom tingimento de permanganato de potássio (preparado porcombinação de 8 g de KMnO4, 60 g de K2CO3, 16 mL de NaOH a5%, e 900 mL de H2O) . A cromatografia líquida de altodesempenho de fase reversa (RP-HPLC) foi conduzida com umVarian ProStar 210/215 HPLC usando-se uma colunapreparatória (Alltec Alltima C18, de 250 χ 22 mm) ou em umaAgilent 1100 HPLC analítica com uma coluna analítica (VydakC18, de 150 χ 4,6 mm). O produto foi eluído utilizando-seum gradiente de solventes (solvente A = TFA a 0,1%/H20;solvente B = TFA a 0,1%/CH3CN). Os espectros de RMN forammedidos em um espectrômetro de ressonância magnética VarianINOVA 500 (RMN-1H a 500 MHz; RMN-13C a 125 MHz) ou em umVarian INOVA 400 (RMN-1H a 400 MHz; RMN-13C a 100 MHz) . Osdados para espectros de RMN-1H são relatados da seguintemaneira: desvio químico, multiplicidade (s = singleto, d =dupleto, dd = dupleto de dupleto, t = tripleto, q =quarteto, em= multipleto), integração, e constante deacoplamento (Hz). Os dados para os espectros de RMN-13C sãorelatados em termo de desvio químico em relação ao pico desolvente residual (CDCl3 = 77,3 ppm e CD3OD = 49,1 ppm) . Osespectros no infravermelho foram registrados em um Perkin-Elmer 1600 Series FTIR. Os espectros de massa de altaresolução (HRMS) foram registrados nas instalações deespectrometria de massa regional NIH na Universidade deCalifórnia, São Francisco. Os espectros de massa deionização de eletropulverização (ES-EM) foram registradosno laboratório de espectrometria de massa na universidadede Stanford em um espectrômetro de massa de aprisionamentode íons quadripolar Finnigan LCQ. Os espectros de Desorçãode Laser Assistido por Matriz (MALDI) foram registrados emum espectrômetro de massa Voayager DE de AppliedBiosystems.
Exemplo 1 - Síntese da Série dos Compostos 2
<formula>formula see original document page 87</formula>A síntese de Composto 2a, ilustrada na Figura IA, foiconduzida assim. A um frasco de três gargalos secado emforno sob nitrogênio à temperatura ambiente, equipado comuma barra de agitação acrescentou-se 2'-aldritiol (4,71 g,21,4 mmol) em 20 mL de metanol com os gases extraídos. Aesta mistura acrescentou-se gota a gota 2-mercaptoetanol(500 pL, 7,10 mmol). A solução ficou amarela e deixou-seagitar durante duas horas. Removeu-se então o solvente avácuo e conduziu-se a cromatografia flash usando-se acetatode etila a 20% e cloreto de metileno. O produto era um óleoamarelo (1,320 g, 7,06 mmol, rendimento de 97%) e homogêneo(uma mancha) por TLC Rf = 0,47 (EtOAc a 5%, DCM) . RMN-1H(500 MHz, CD3OD): δ 8,15-8,14 (m, 1H) , 7,59-7,53 (m, 2H) ,7,00-6,97 (m, 1H), 3,51 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 2,68 (t, 2H, J= 6,5 Hz). RMN-13C (400 MHz, CDCl3): δ 159,3, 150,0, 137,1,122,0, 121,7, 58,5, 42,8, IV (película delgada): 3349,2920, 2865, 1574, 1559, 1446, 1285, 1116, 1063, cm"1, HRMS(m/z): [M+] calculado para C7H9NOS2: 187,0126; encontrado:187,0123.
O composto 2b, ilustrado na Figura IA, foi sintetizadoconforme descrito acima para 2a a partir de 3-mercapto-propanol com um rendimento de 91%. RMN-1H (5 00 MHz, CD3OD) :δ = 8,35 (m, 1H), 7,84 (m, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,19 (m, 1H),3,60 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 2,87 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 1,87(m, 2H). RMN-13C (500 MHz, CD3OD) δ 161,0, 149,5, 139,5,122,2, 121,2, 60,7, 36,1, 32,5, IV (película, cm"1) 3359,2934, 1784, 1688, 1574, 1446, EI-EM (m/z): [M+] calculadopara C8H11NOS2 201,0282; encontrado 201,0275.<formula>formula see original document page 89</formula>O composto 2c, ilustrado na Figura IA, foi sintetizadoconforme descrito acima para 2a a partir de 3-mercapto-butanol com um rendimento de 82%. RMN-1H (500 MHz, CD3OD);δ 8,45-8,43 (m, 1H), 7,91-7-86 (m, 2H), 7,25-7,18 (m, 1H),3,59 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 2,87 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 1,92-1,85 (m, 4H) . RMN-13C (400 MHz, CDCl3): δ 160,6, 149,7,137,3, 120,9, 112,9, 62,3, 38,9, 31,6, 25,5, IV (películadelgada): 3365, 2933, 2863, 1575, 1560, 1446, 1440, 1118,1062, 1044 cm"1. HRMS (m/z) : [M+] calculado para C9H13NOS2215,0439; encontrado 215,0433.
0 composto 4a, ilustrado na Figura IA, foi sintetizadodo seguinte modo. A um frasco secado em forno equipado comuma barra de agitação e uma tampa de Teflon sob argônioacrescentou-se 2a (44,0 mg, 0,235 mmol), trifosgênio (25,0mg, 0,0842 mmol), e piridina (18,0 pL, 0,222 mmol) emcloreto de metileno (3 mL ) à temperatura ambiente. Asolução continuou transparente. Deixou-se que esta seagitasse durante 3 0 minutos, fazendo-se então evaporar osolvente a vácuo para se obter um sólido brancoborbulhante. A este acrescentou-se luciferina (30,0 mg,94,3 μπιοί) e NaOH (547 pL a 0,5 M, 0,273 mmol) em água (3mL ) que tinha sido resfriada em salmoura e gelo. A soluçãoficou branca turva, violeta e em seguida amarela turva.Agitou-se a reação durante 4 horas a 4o C, extinguiu-se com
Exemplo 2
Síntese da Série de Compostos 4<formula>formula see original document page 89</formula>TFA a 1% e água (15 mL) e extraiu-se três vezes com cloretode metileno. Fez-se o solvente evaporar a vácuo, purificou-se o composto usando-se cromatografia flash com acetato deetila a 20%, ácido acético a 1%, e cloreto de metileno.
Isolaram-se as frações apropriadas, purificando-se emseguida mais por RP-HPLC. Liofilizaram-se frações adequadaspara se obter um sólido amarelo (27 mg, 54,5 μτηοΐ, 58%),que era homogêneo (uma mancha) por TLC Rf = 0,4 (2 0% EtOAc,ácido acético a 1%, DCM) . RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,59-10 8,58 (m, 1H) , 8,15 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,85-7,77 (m, 3H) ,7,36 (dd, 1H, J = 9 Hz), 7,23-7,23 (m, 1H), 5,46 (t, 1H, J- 8,4 Hz), 4,55 (t, 2H, J = 8,4 Hz), 3,84-3,81 (m, 2H) ,3,18 (t, 2H, J = 8,4 Hz). RMN-13C (500 MHz, CDCl3): δ 172,9,167,5, 161,0, 159,2, 153,3, 151,3, 150,0, 148,8, 139,0,15 137,9, 130,6, 125,6, 122,0, 121,2, 114,5, 78,2, 66,5, 37,3,35,4, IV (película delgada): 3350, 2952, 2360, 1761, 1587,1448, 1418, 1201, 1196, 1043 cm'1. EI-EM (m/z): [M+l]calculado para Ci9Hi6N3O5S4 4 93,9; (H+) encontrado 493,9,
<formula>formula see original document page 90</formula>
O composto 4b, ilustrado na Figura IA, foi sintetizadoconforme descrito acima para 4a a partir de 2b com umrendimento de 47% e grau de pureza >99% por HPLC analítica.RMN-1H (500 MHz, CD3OD) δ 8,43 (m, 1H) , 8,11 (d, 1H, J = 9Hz), 7,97 (d, 1H, J = 2 Hz), 7,86 (m, 1H) , 7,81 (m, 1H) ,7,44 (dd, 1H, J = 9 Hz), 7,27 (m, 1H) , 5,46 (t, 1H, J = 9Hz), 4,41 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 3,81 (dd, 2H, J = 9 Hz),2,95 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 2,16 (m, 2H) . RMN-13C (500 MHz,CD3OD) δ 168,1, 162,9, 161,2, 154,7, 152,2, 151,5, 150,4,139.1, 137,9, 130,4, 125,8, 122,4, 121,3, 121,2, 115,8,79,7, 68,3, 43,8, 35,9, 29,1, IV (película, cm"1) 3045,2958, 1761, 1574, 1417, 1236, EI-EM (m/z): [M+l] calculadopara C20Hi8N3O5S4 508,00; encontrado 508,06.
<formula>formula see original document page 91</formula>
O composto 4c foi sintetizado conforme descrito acimapara 4a a partir de 2c com um rendimento de 67%. 0 produtoera homogêneo (um ponto) por TLC Rf = 0,56 (EtOAc a 2 0%,ácido acético a 1%, DCM) . RMN-1H (400 MHz, CD3OD); δ 8,42-8,41 (m, 1H) , 8,10 (d, 1H, J = 8,8), 7,93-7,83 (m, 3H) ,7,41 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 7,27-7,24 (m, 1H), 5,42 (t, 1H,J = 8,8 Hz), 4,27 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 3,79 (dd, 2 H, J =8,8), 2,89 (t, 2 H, J = 6,8), 1,86-1,83 (m, 4H) . RMN-13C(500 MHz, CDCl3); δ 171,9, 167,45, 160,7, 159,2, 153,3,151.2, 149,9, 148,5, 138,8, 136,7, 130,5, 125,3, 121,6,121,1, 114,3, 75,5, 66,4 38,9, 37,1, 35,3, 30,3, IV(película delgada): 2937, 1760, 1586, 1496, 1447, 1417,1231, 1197, 1043, 874 cm"1' EI-EM (m/z): [M+l] calculadopara C2IH20N3O5S4 522,02; encontrado 522,0.
As reações acima prosseguiram através dosintermediários de cloroformiato 2-piridinil dissulfeto de(1-cloroformilóxi)etila (3a, η = 1), dissulfeto de (1-cloroformilóxi)propil 2-piridinila (3b, η = 2), e 2-piridinil dissulfeto de (1-cloroformilóxi)butila (3c, η =3), com referência à estrutura abaixo.
<formula>formula see original document page 91</formula>
Exemplo 3Síntese da Série de Compostos 5
O conjugado 5a, conforme ilustrado na Figura IB, foisintetizado da seguinte maneira. A um tubo de ensaio secadoem forno sob nitrogênio equipado com uma barra de agitaçãoacrescentou-se Ac-D-Cys- (D-Arg) 8-CONH2*8TFA (20 mg, 8,61μmol) em acetonitrila com os gases extraídos e água a 1:1(2 mL ). Acrescentou-se 4a (7,10 mg 14,4 pmol) em 0,5 mL deacetonitrila e DMSO. Deixou-se a reação se agitar durante16 horas, purificando-se então por RP-HPLC. Liofilizaram-sefrações apropriadas para se obter um sólido branco (15 mg,5,54 μmol, rendimento de 64%) que tinha um grau de pureza>99% por HPLC analítica. RMN-1H (400 MHz, D2O) δ 8,00 (d,1H, J = 8,8 Hz), 7,87 (d, J = 2, 1H), 7,38 (dd, 1H, J = 8,8Hz), 5,23 (t, 1H, J = 8,8 Hz), 4,41-4,38 (m, 2H), 4,15-4,02(m, 9H) , 3,78-3,58 (m, 2H) , 3,05-2,87 (m, 20H) , 1,88 (s,3H) , 1,66-1,45 (m, 32H) . EM (m/z): [M+3] calculado paraC67Hn9N36Oi5S4 1795,8; encontrado (MALDI) 1795,8,
O conjugado 5b, conforme ilustrado na Figura IB, foisintetizado conforme descrito acima para 5a a partir docomposto 4b e Ac-D-CyS-(D- ArgJ8-CONH2, com um rendimentode 66% e pureza >99% por HPLC analítica. RMN-1H (500 MHz,CD3OD) 8,16 (d, 1H, J - 9 Hz), 7,99 (d, 1H, J = 2 Hz), 7,46(dd, IH, J = 9 Hz), 5,46 (t, 1H, J = 9 Hz), 4,42 (t, 2H, J= 6,5 Hz), 4,27-4,35 (m, 9H) , 3,81 (dd, 2H, J = 9 Hz),3,15-3,23 (m, 18H), 2,91 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 2,17 (m, 2H),2,05 (s, 3H), 1,60-1,95 (m, 32H). EM (m/z): [M+l] calculadopara C68 H119N36Oi5S4 1807,85; encontrado (MALDI) 1807,84.
O conjugado 5c, conforme ilustrado na Figura IB, foisintetizado conforme descrito acima para 5a a partir decomposto 4c e de Ac-D-Cys-(D-Arg)8-CONH2 com um rendimentode 24% e pureza >99% por HPLC analítica. RMN-1H (400 MHz,D2O) δ 7,97 (d, 1H, J = 8,8 Hz) 7,82 (d, 1H, J = 2), 7,34(dd, 1H, J = 8,8 Hz), 5,17 (t, 1H, J = 8,8 Hz), 4,22-4,04(m, 1 1H), 3,75-3,55 (m, 2H), 3,02-2,83 (m, 18H), 2,68-2,59(m, 2H) , 1,83 (s, 3H) , 1,64-1,45 (m, 36H) . EM (m/z): [M+2]calculado para C69Hi22N36Oi5S4 1822,86; encontrado (MALDI)1822,05 (M+l).
Exemplo 4
Ensaio medindo a liberação de luciferina dos conjugados 5a,5b e 5c e a decomposição dos mesmos
As estabilidades dos conjugados foram testadasmedindo-se sua decomposição quando incubados em soluçãosalina tamponada com HEPES (HBS, pH 7,4) a 37°C usando-seHPLC analítica. Cada um dos conjugados 5a, 5b, e 5c (0,2mg) foi dissolvido em 250 pL de HBS a pH 7,4 em tubosmicrofugos de 1,5 mL e incubado a 3 7 0C contendo 10 pL deuma solução de 10 mg de 1-naf talenometanol em 24 mL demetanol, que serviu como um padrão interno. Nos pontosadequados no tempo, removeram-se 2 0 pL das soluções eanalisaram-se por HPLC de fase reversa. A porcentagem dedecomposição foi calculada a partir de áreas de picointegradas do conjugado, do padrão interno e de diversosprodutos de decomposição.
As meias-vidas dos conjugados diferiamsignificativamente, variando de 3 horas para o carbonato 5aa 11 horas para o carbonato 5b a 33 horas para o carbonato5c. Os produtos de decomposição eram luciferina, álcool 7 eCO2, conforme era de se esperar da hidrólise lenta docarbonato (Figura 1C). O padrão de uma estabilidadecrescente está correlacionado com o aumento da distânciaentre o grupo carbonila e o átomo próximo de enxofre,sugerindo um papel para este último na etapa de hidrólise.
Exemplo 5
Ensaio isento de células para a determinação da liberaçãodo agente do conjugado
As taxas de liberção relativa de luciferina dosconjugados 5b e 5c em um ambiente redutor foram medidasincubando-se concentrações variáveis dos conjugados comluciferase de vaga-lume (Promega, Madison7 WI) e medindo-sea luminescência resultante como uma função do tempo usando-se um luminômetro (Berthold Detection Systems, modelo:Sinus). As curvas padrão medindo a quantidade de luz geradapor luciferina forma produzidas acrescentando-seconcentrações variáveis (de 20-2000 nM) do sal potássico deluciferina (Xenogen Corp. , Alameda, CA) em 5 0 pL de MgSO4a 5 mM, NaCl a 200 mM, HEPES a 20 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,4até 100 ng de luciferase de vaga-lume em 50 pL do mesmotampão contendo 1 mM de DTT, 2mM de ATP . Foi constatadoque a luz produzida era linear dentro dos limites deconcentração usados neste estudo (veja Figura 2B).
Para se determinar as taxas relativas de liberação deluciferina dos conjugados em um ambiente redutor, 50 pL deuma solução a 50 μΜ de carbonatos 5b e 5c em 5 mM de MgSO4,200 mM de NaCl, 20 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, pH 7,4acrescentaram-se 100 ng de luciferase de vaga-lume em 50 pLdo mesmo tampão contendo 1 mM de DTT, 2 mM de ATP e mediu-se a luz resultante. Houve uma diferença significativa naluz produzida, com o carbonato 5c gerando somenteaproximadamente 12% da luz gerada pelo carbonato 5b (Figura3A). Quantidades de equivalentes molares de luciferinaforam liberadas de cada conjugado conforme estabelecido porpré-incubação com ImM de DTT durante 20 minutos antes daadição da enzima. Nestas condições, o perfil deluminescência era similar ao observado com luciferinapurificada (Figura 2A) e quantidades equivalentes de luzforam observadas para os dois conjugados. (Figura 3B) . umapossível explicação para as diferenças é que a vida dointermediário de 5c é muito mais longa do que a do 5b,permitindo que ele competisse com a luciferina liberadapelo sítio de ligação de luciferase. Esta hipótese ésustentada pelo fato de que o éter 6-0 metilico deluciferina, alquilado de modo análogo no fenol, é uminibidor conhecido de luciferase (Denburg et al. , Arch.Biochem. Biophys. 134:381 (1969)).
Exemplo 6
Ensaios celulares para a liberação de luciferina deconjugados
Para se estudar a absorção e liberação em cultura decélulas, incubaram-se concentrações variáveis deluciferina, 5b e 5 c separadamente com uma linhagem decélulas de câncer de próstata estavelmente transfectadascom um gene que codifica luciferase, PC3M-luc. A linhagemde células de tumor de próstata PC3M-luc (Jenkins et al. ,Clin. Exp. Metastasis 20:733 (2003)), foi disposta emplacas a 60.000 células por poço em placas de fundo chatode 96 poços, doze horas antes do ensaio. As células foramincubadas com concentrações variáveis ou de sal potássicode luciferina (Xenogen Corp., Alameda, CA) ou de carbonatos5b ou 5c, em triplicata, durante 1 minuto, ou em soluçãosalina tamponada com HEPES (HBS) pH 7,4 ou em K+HBS(solução salina tamponada com HEPES em que todos os sais desódio foram substituídos com quantidades equimolares do salpotássico). As células foram lavadas para se removerluciferina extracelular ou conjugado, ressuspensas com otampão adequado, e a luminescência resultante foi medidausando-se uma câmera de dispositivo acoplado com carga esoftware Living Image (IVIS200, Xenogen Corp., Alameda, CA)(veja Cao et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A. 101:221(2004)) .
O sinal luminescente de células pulsadas com 5b, que éuma medida da liberação intracelular de luciferina livre ea sua utilização pela luciferase intracelular, aumentouligeiramente nas primeiras poucos segundos e gradualmentese decompôs, atingindo o fundo depois de aproximadamente1000 segundos (Figura 4A) . As células tratadas com 5cgeraram uma curva diferente com menos luz inicial, umavelocidade de decomposição mis lenta e somente dois terçosdo total de fótons produzidos quando comparada com oobservado para 5b (Figura 4A, Figura 4B) . Para demonstrarque a luminescência foi devida à liberação intracelular deluciferina e a sua reação com luciferase e não a hidróliseextracelular do conjugado e absorção de luciferina, oexperimento foi repetido em solução salina tamponada comHEPES em que todos os sais sódicos foram substituídos comquantidades equimolares do sal potássico (K + HBS), umacondição que se sabe que elimina o potencial da membrana econseqüentemente a absorção de transportadores ricas emarginina, mas não a absorção de luciferina livre (Rothbardet al., J. Am. Chem. Soe. 126:9506 (2004)). Nestascondições, a luminescência proveniente do conjugado (e,portanto, a absorção e a liberação) foi reduzida de >> 90%(Figura 4A, Figura 4B) ao passo que a luminescênciaproveniente de luciferina propriamente dita aumentouligeiramente (Figura 4B) . Conseqüentemente, a grandemaioria da luz se origina da absorção do conjugado pelascélulas e da subseqüente liberação de luciferina.
Exemplo 7
Ensaios com camundongos para a liberação de luciferina deconjugados
Um animal transgênico expressando luciferase de vaga-lume (FVB-luc+) foi criado usando métodos padrão de injeçãopronuclear (Cao YA et al. Transplant 80:134-139 (2005)) eusado aqui para se avaliar o fornecimento de conjugados deluciferina liberável através da pele. O transgeneconstituído por um promotor de CMV híbrido-galinha-β-actina, uma seqüência de codificação modificada baseada nogene de luciferase de vaga-lume (presente no vetor pGL3 dePromega Corp. Madison, WI), um sítio de sobreposiçãoribossômica de FMDV2A e gene GFP. Os animais primeirodescritos por Cao YA et al. , Proc Natl Acad Sci USA101:221-226 (2004) mostraram que expressam luciferase namaioria de tipos de células (não expressa em célulaseritróides) e que apresentam a expressão de GFP na pele masnão em muitos outros tecidos. Veja Cao YA et al. Transplant80:134-139 (2005). Todos os procedimentos foram aprovadospelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da universidade deStanford.
Para os ensaios de imageamento para se avaliar otransporte pela pele, removeu-se o pelo dos animais portosa com um grande tosador de pelos no flanço direito.Subseqüentemente aplicou-se Nair (NAIR e uma marcaregistrada de Church & Dwight Co., Inc., Princeton NewJersey, USA para um creme depilatório) durante 90 segundos,retirou-se o mesmo, e lavaram-se bem os animais com toalhasde papel úmidas e secados. Deixou-se que o estrato córneose recuperasse durante cinco dias antes de se usar oscamundongos para imageamento.
Para a injeção intradérmica de luciferina, preparou-seuma solução a 2M de luciferina dissolvendo-se 0,62 mg em 1mL de água, pH 5,5. Esta solução foi diluída em série comHBS (pH 7,4) (a: 10) para produzir 1 mL de soluções a 200,20, 2, 0,2 e 0,002 μΜ. As soluções de luciferina (100 pL),a 0,02 e 0,2 μΜ foram injetadas intradermicamente em doiscamundongos diferentes. A luminescência foi observada e foimostrado que a dose maior era suficientemente intensa paraser útil para o experimento. Subseqüentemente, três outroscamundongos receberam injeções e foram feitas imagens omais rapidamente possível.
Para a injeção intradérmica de conjugado, preparou-seuma solução a 1 mM do conjugado 5b dissolvendo-se 2,1 mg em770 μΙϋ de água a pH 5,5. Esta solução foi diluída em sériecom HBS (pH 6,9) (1:10) para produzir 1 mL de soluções a200, 20, 2, 0,2 e 0,02 μΜ. As soluções do conjugado 5b (100μL), a 0,2 μΜ, foram injetadas intradermicamente em doiscamundongos diferentes. A luminescência foi observada e foimostrado que a dose era suficientemente intensa para serútil para o experimento.
Prepararam-se formulações para a aplicação tópica deconjugados do seguinte modo. Em um tubo eppendorf foramcombinados 2 5 μL de NaOH a 200 mM pH 6,0, 55 pL de PEG 400com 1 mg cada do conjugado 5b e conjugado 5c para produzirconcentrações finais de 5b 8TFA de 4,93 mM, de 5c 8TFA de4,93 mM e acetato de sódio de 63M. Aplicaram-se soluções(15 μL·) de 5b e 5c a 5 mM topicamente em dois locais emcada um dos quatro camundongos usando-s uma ponta de pipetapadrão (tamanho de 1-20 pL) . A luminescência foi observadadurante aproximadamente 60 minutos.
O imageamento de bioluminescência in vivo foiconduzido da seguinte maneira. Os animais foram feitasimagens em uma câmara escura usando-se uma câmera CCDesfriada (IVIS100 Xenongen Corp.) conforme já descrito 45 eos dados foram analisados usando-se o software LivingImage(Xenogen Corp.). Os dados são expressos em forma defótons/ster radian/segundos para cada região de interesse,de modo tal que os dados não são dependentes do ajuste dacâmera, da geometria da câmara ou do tempo de integração.
A calibração deste modelo murino para o fornecimentointradérmico foi conduzida usando-se luciferina livre. Parase estabelecer a quantidade de luciferina livre necessáriapara a detecção do sinal da pele de camundongos FVB-Iuc+ ese ela é dependente da dosagem, injetou-se uma quantidadeconhecida de luciferina livre (10 0 pL ou de uma solução a20 nM ou de uma solução a 200 nM de luciferina em HBS(solução salina tamponada com HEPES) foi injetadaintradermicamente nos flancos dos camundongos e o sinal debioluminescência resultante (fótons/unidade de tempo) foimedido. 0 número total de fótons emitido foi calculado,integrando-se a área sob a curva; veja Figura 6. 0 padrãode luminescência como uma função do tempo foi reproduzivele similar par as duas doses, com uma redução constante apósa injeção em emissão de luz durante a medição. A área sob acurva para a dose dez vezes mais alta foi de praticamenteexatamente 10 vezes a da dose inferior indicando a estasconcentrações uma resposta linear a dose. Com base naquantidade conhecida de luciferina injetada e naluminescência observada, um fóton de luz é detectado pelacâmera para cada 4Ò0 moléculas de luciferina injetada.
Para se determinar o número de fótons produzidos deuma quantidade conhecida do conjugado independentemente daentrada na pele mediada por transportadora, o conjugado 5bde luciferina foi injetado intradermicamente conformedescrito acima para luciferina livre. A injeçãointradérmica do conjugado 5b gerou um padrão temporaldistintamente diferente de bioluminescência em relação aoobservado para luciferina livre conforme mostrado na Figuray. Um sinal significativo é aparente imediatamente depoisda injeção, e ele aumenta durante os seguinte 2 0 minutos,decompondo-se lentamente durante os seguintes 50 minutos. 0perfil é consistente com a geração e eliminação deluciferina dependentes de tempo depois da absorção celulare clivagem do ligante. Aproximadamente 80% da quantidadeteórica de luciferina na amostra injetada do conjugado 5bfoi considerada quando o número total de fótons emitidos em60 minutos foi multiplicado pelo número calculadoanteriormente de 400 moléculas de luciferina por fótondetectado.
Aplicação Tópica de Conjugados de Luciferina: Paraaplicações tópicas, o pelo dos camundongos FVB-Iuc+interfere no contato entre a amostra do conjugado e a pele,criando problemas com a reprodutibilidade durante aadministração. Não havia nenhum camundongo transgênico sempelos disponível e raspando-se somente com navalha nãoremoveu uniformemente o pelo. Além disso, uma degradaçãoextremamente variável do estrato córneo, uma barreira degrande importância para aplicações tópicas foi observada,criando mais problemas com a reprodutibilidade na mediçãoda absorção. O uso alternativo de um depilatório (Naire)removeu o pelo com mais uniformidade, mas também causou umaerosão variável do estrato córneo, comprometendo acapacidade de se estudar de modo reproduzível a absorção napele intacta. A observação de que luciferina entrafacilmente na pele de camundongos cujo estrato córneo tenhasido erodido e produz um sinal de bioluminescência forneceua base para uma solução deste problema com areprodutibilidade. Mais especificamente, com a aplicação deluciferina somente à pele dos camundongos transgênicospode-se determinar a integridade do estrato córneo e, o queé importante, a sua recuperação com o tempo. Conformemostrado na Figura 8, no primeiro ponto no tempo depois detratamento com Naxr®, um sinal grande e extremamentevariável foi observado. Com o decorrer do tempo, noentanto, não somente o sinal diminui, indicando uma reduçãona penetração de luciferina com a recuperação do estratocórneo, mas há uma maior reprodutibilidade no sinal. Desteestudo no decorrer do tempo, foi determinado que o tempoótimo para se obter um sinal reproduzível era de cinco diasdepois do tratamento com depilatório.
A seguinte etapa consistia em se determinar o melhorveículo para a aplicação tópica dos conjugados. As soluçõesde conjugados de luciferina octa-D-arginina em saistrifluoracetato a 5 mM têm um pH próximo a 2,0. Aimportância de se incluir um tampão foi testada poraplicação tópica de 15 pL de uma solução a 5 mM de 5c ou em25% de água ou tamponada com 25% de NaOH a 200 mM pH 6,0 ecombinação com 75% de PEG 4 00 (Figura 9). Havia umadiferença dramática da quantidade de luz produzida, com umaquantidade constantemente crescente de luminescênciaobservada somente quando o conjugado foi aplicado noveículo tamponado. A falta de luz na ausência do tampãopoderia se originar da acidificação da pele pelo conjugado,o que faria reduzir tanto a atividade de luciferase como ataxa de liberação de luciferina. Estes resultadosestabeleceram a necessidade de se incluir um tampãoadequado no veículo.
Com a identificação de um veículo apropriado para aaplicação um procedimento para se obter de modoreproduzível um estrato córneo intacto isento de peso ecalibrações baseadas sobre injeções intradérmicas deluciferina de um conjugado de luciferina, formainvestigados a absorção e a liberação de luciferina apartir de dois conjugados de luciferina e octa-D-argininaligados por dissulfeto administrados topicamente. 0 métodomais reproduzível para se avaliar o desempenho relativo dostransportadores e dos ligantes foi o de aplicar uma únicagota de uma solução de cada conjugado ao flanço decamundongos FVB-Iuc+ anestesiados. Deixou-se a gotapermanecer em contato coma pele durante o decorrer doensaio durante o qual foi monitorada a luminescênciaproveniente do animal. Em experimentos selecionados, aamostra de lavagem contendo o conteúdo residual da gotaadministrada foi examinada por HPLC analítica e foiconstado que o conjugado estava totalmente intacto. Osexperimentos de administração foram projetados parareprodutibilidade para a quantificação comparativa dediferentes conjugados e sistemas de liberação e paraconservar tempo de câmera e não para se obter níveisterapêuticos ótimos. No entanto, como seria de se esperar,uma absorção maior pode ser obtida aumentando-se a dose, otempo de exposição ou a área de aplicação ou por aplicaçãoes repetidas. Conforme mostrado na Figura 10, os doisconjugados geraram um sinal de luminescência forte ereproduzível. a diferença ente o sinal observado e aquantidade do conjugado que penetrou na pele representa osdestino não produtivo do conjugado (absorção incompleta,clivagem incompleta, eliminação da pele, metabolismo, porexemplo). Com base na calibração intradérmica, a quantidadetotal de luciferina liberada em uma hora pode serdeterminada multiplicando-se a área sob a curva por 4 00moléculas/fóton detectado. Dividindo-se pelo número deAvogadro, indica-se que a quantidade de luciferina liberadaé de 3,62 χ IO'12 mol para o carbonato 5b e de 2,0 χ IO"11mol para o carbonato 5c. A partir da área de aplicação e daespessura da pele do camundongo (0,69 mm), as concentraçõesintradérmicas cumulativas que resultam da exposição da peledurante uma hora são de 47 nM e 62 nM, respectivamente. Aquantidade de luz gerada é linearmente proporcional àquantidade do conjugado aplicado dentro dos limites de 0,5e 4,5 mM (dados não mostrados), que permitem concentraçõesintradérmicas da ordem de 2 99 nM.
Para se determinar se a liberação de luciferinapoderia ocorrer durante a administração e contato com asuperfície da pele, foi necessário se mostrar que a luzobservada era somente devida ao transporte e liberaçãointracelular contra a decomposição e liberação deluciferina extracelular. Para tal fim, depois de cadaperíodo de exposição, o material restante sobre a pele foiremovido do camundongo por lavagem e analisado por HPLCanalítico para se detectar qualquer luciferina livre nalavagem. Em cada ensaio mostrado não foi observada nenhumaluciferina livre. Outro controle consistia em se testar umconjugado que é composto de uma transportadora ineficientecom um ligante liberável exatamente igual e exatamenteigual carga de luciferina. Os tetrâmeros de lisina sãoconhecidos como sendo transportadores precários parapenetração na pele. Portanto um conjugado de um tetrâmerode lisina 5d foi sintetizado e usado como comparação.
0 conjugado 5d foi preparado assim:
<formula>formula see original document page 104</formula>
A um tubo de ensaio secado em forno sob nitrogênioequipado com uma barra de agitação acrescentou-se Ac-DCys (L Lys) 4CONH2*4TFA (9,7 mg, 8,61 μπιοί) em DMF anidro (1mL) . Acrescentou-se 4c (4,5 mg, 8,61 pmol) em 0,5 mL deDMF. Deixou-se a reação se agitar durante 12 horas,purificando-se então por RP-HPLC. LIofilizaram-se fraçõesapropriadas para se obter um sólido branco (8,1 mg, 5,25pmol, rendimento de 61%) que tinha um grau de pureza >99%por HPLC analítica. RMN-1H (500 MHz, CD3OD): δ 8,16 (d, 1H,J = 9,0 Hz), 7,99 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,46 (dd, 1H, Jl =9,OHz, J2 = 2,OHz) , 5,46 (t, 1H, J = 9,0 Hz), 4,58 (m, 1H) ,4,31-4,36 (m, 6H), 3,81 (dd, 2H, J = 9,0 Hz), 3,18 (m, 2H),2,95-2,97 (m, 10H) , 2,83 (m, 2H) , 2,05 (s, 3H) , 1,85-1,89(m, 8H) , 1,67-1,75 (m, 12H) , 1,47-1,52 (m, 8H) ppm. EM(m/z): [M+2 ] calculado para [C45H74Ni2OhS4] 1086,5;encontrado (MALDI) 1086,5, Ac-D Cys (L Lys) 4CONH2*4TFA foisintetizado usando-se o procedimento geral para a sínteseautomatizada de peptídeo. O peptídeo foi montado em umaresina amídica de Fmoc-Rink em uma escala de 0,1 mmol comtodos os aminoácidos usados em um excesso de 10 vezes (1mmol). A identidade do peptídeo foi estabelecidautilizando-se uma análise espectrométrica de massa MatrixAssisted Laser Desorption IOnization Time of Flight (MALDI-TOF) . EM (m/z): [M+2] calculado para [C29H60NioO6S] 676,4;encontrado (MALDI) 676,5.
Quando este conjugado transportador menos efetivo 5d écomparado com o conjugado 5b correspondente (Arg)8 noensaio de camundongo, conforme mostrado na Figura 11, hámuito menos luz, estabelecendo assim que a luminescênciaresulta principalmente da liberação intracelular, não dahidrólise externa da pró-fármaco.
Exemplo 8
Conjugados de taxol-Iigante-transportador
Este exemplo demonstra que o índice terapêutico invitro de taxol em diversos modelos de câncer ovarianodiferentes (OVC A429/429T/429TP, OVCA433/433T/433TP, UCI-101), assim como a sua solubilidade em água, podem sermelhorados pela conjugação de um transportador deoctaarginina usando-se o ligante da presente invenção nasposições C2' e C7 do taxol. Estes conjugados tambémmostraram ter uma atividade antitumoral significativa invifcro em células resistentes a taxol (OVCA4 29T/429TP, eOVCA433T/433TP), sugerindo que estes conjugados são capazesde contornar o fenótipo de resistência a multifármacos(MDR). A linhagem de células OVCA 429 é sensível a taxol,ao passo que OVCA 429T é resistente a Taxol, devido àsobre-expressão de p-glicoproteína (PGP) e OVCA 429 TP éresistente a Taxol devido a um mecanismo desconhecido.
Os conjugados foram sintetizados assim:
<formula>formula see original document page 106</formula><formula>formula see original document page 107</formula>
A nao ser que seja determinado em contrario, todos osreagentes e solventes foram obtidos de fontes comerciais eusados sem purificação. Todos os reagentes para a síntesede peptideos incluindo NMP, DIEA, DMF, HOBT, HBTU, epiperidina foram adquiridos de Aldrich, NovaBiochem (CA) ,BaChem (CA) , ou de Applied Biosystems (CA) . Aminoácidosprotegidos com Fmoc e resina foram adquiridos de NovaBachemou BaChem na sua forma apropriadamente protegida. Todas assínteses automatizadas de peptideos foram conduzidas em umsintetizador automatizado de peptídeos PE Biosystems Model4 3 3A usando-se a estratégia de acoplamento padrão FastMoc.Acromatografia de líquido de alto desempenho de fase reversa(RP-HPLC) foi conduzida com um Varian ProStar 210/215 HPLCusando-se uma coluna preparatória (Alltec Alltima C18, 250χ 22 mm) ou em um Agilent 1100 HPLC analítica com umacoluna analítica (Vydak C18, 150 χ 4,6 mm). Os produtosforam eluídos usando-se um gradiente de solventes (solventeA = TFA a 0;1%/H20; solvente B = TFA a 0,1%/CH3CN). Osespectros de RMN forma medidos em um espectrômetro deressonância magnética Varian INOVA 500 (RMN-1H a 500 MHz;RMN-13C a 125 MHz). Os dados para os espectros de RMN-1H sãorelatados assim: desvio químico, multiplicidade (ssingleto, d = dupleto, dd = dupleto de dupleto, ttripleto, q = quarteto, em= multipleto), integração, econstante de acoplamento (Hz) . Os dados para os espectrosde RMN-1H são relatados em termos de desvio químico emrelação ao pico do solvente residual (CD3OD: 4,97 ppm paraos espectros de RMN-1H) . Os espectros de massa por MatrixAssisted Laser Desorption (MALDI) foram registrados em umespectrômetro de massa Voyager DE de Applied Biosystems.
Carbonato de p-nitrofenila 53. Fez-se reagir ocloroformiato de p-nitrofenila com álcool 52 (veja Jones,L. R. et al., J. Am. Chem. Soe. 2006, 128, 6526-6527) deacordo com o procedimento descrito por Anderson, G. W. eMcGregor, A. C, J. Am. Chem. Soe. 1957, 79, 6180-6183, parase obter o carbonato 53 com um rendimento de 82. RMN-1H(500 MHz, CD3OD): C = 8,47 (m, 1H) , 8,24 (dd, Jl = 7,0Hz,J2 = 2,OHz 2H), 7,74- 7,66 (m, 2H), 7,36 (dd, Jl = 7,0Hz,J2 = 2,OHz 2H), 7,14 (m, 1H), 4,54 (t, J = 6,0Hz, 2H), 3,15(t, J = 6, OHz, 2Η) ppm. RMN-13C (125 MHz, CD3Cl3): δ =159,3, 155,6, 152,5, 149,8, 145,6, 137,8, 125,6, 122,1,
121.6, 120,6, 66,9, 37,0 ppm. EI-EM (m/z): [Μ+1] calculadopara [Ci4Hi3N2O5S2] 353,02 encontrado 353,0.
Carbonato de Taxol C2'54. A síntese de um carbonatoligante C2' foi baseado no trabalho de Groot, F. Μ. H. etal., J. Med. Chem. 2000, 43, 3093-3102 em que se faz reagiro carbonato de p-nitrof enila 53 com uma posição C2' deTaxol para se obter carbonato C2' 54 com um rendimentoquase quantitativo (99%). RMN-1H (500 MHz, CD3OD): δ = 8,39(m, 1H), 8,14 (d, J = 7,6Hz, 2H), 7,85-7,47 (m, 1 1H), 7,31(m, 1H), 7,20 (m, 1H), 6,47 (s, 1H) , 6,11 (t, J = 8,5Hz,1H), 5,88 (d, J = 6,OHz, 1H), 5,48 (d, J = 6,5Hz, 1H), 4,43(m, 2H) , 4,37 (m, 1H), 4,20 (m, 1H) , 3,83 (d, 7,5Hz, 1H),3,12 (t, J = 6,OHz, 2H), 2,51 (m, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,44-2,20 (m, 4H), 1,91 (s, 3H), 1,83 (m, 2H), 1,68 (s, 3H),1,17 (s, 3H), 1,16 (s, 3H) ppm. RMN-13C (100 MHz, CDCl3): S= 203,5, 170,9, 169,5, 167,4, 166,7, 158,8, 153,5, 149,5,142,3, 136,8, 136,3, 133,4, 133,1, 132,5, 132,1, 131,7,130,5, 129,9, 128,8, 128,5, 128,4, 128,2, 126,8, 126,3,
120.7, 119,6, 84,1, 80,7, 78,8, 75,2, 74,7, 71,8, 67,8,66,1, 58,2, 52,4, 45,2, 42,8, 38,3, 36,2, 35,2, 30,0, 28,6,26,5, 23,4, 22,6, 22,4, 21,8, 20,5, 14,5, 13,7, 10,6, 9,3ppm. EM (m/z): [M+l] calculado para [C55H59N2Oi6S2] 1067,3;encontrado (MALDI) 1067,5.
Conjugado de Taxol C2' octaarginina 55. Acoplou-seainda o carbonato 54 com Ac-NH-DCys(DArg)8CONH2(Kirschberg, T. A. et al, Org. Lett. 2003, 5, 3459-3462)usando-se o procedimento de Jones et al. (Jones, L. R. etal., J. Am. Chem. Soe. 2006, 128, 6526-6527) para se obtero conjugado final com um rendimento de 61%. RMN-1H (500MHz, D2O): S = 7,99 (d, J = 7,3Hz, 2H) , 7,75-7,50 (m, 6H) ,7,44-7,39 (m, 6H), 7,15 (m, 1H), 6,33 (s, 1H), 5,91 (t, J =8,5Hz, 1H), 5,59 (d, J = 7,9Hz, 1H), 5,47 (m, 2H), 5,05 (d,J= 8,7Hz, 1H), 4,42 (t, J = 7,0Hz, 1H), 4,26-4,14 (m, 11H) , 3,79 (t, J = 6,OHz, 2H) , 3,63 (d, J = 7,0Hz, 1H) , 3,08(m, 18H) , 2,98-2,84 (m, 2H) , 2,88 (t, J = 6,0Hz, 2H) , 2,43(m, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 1,87 (s, 3H), 1,80 (s,3H) , 1,79- 1,52 (m, 38H) , 1,05 (s, 3H) , 1,00 (s, 3H) . EM(m/z): [M+2] calculado para [Ci03Hi6IN35O26S2] 2368,2;encontrado (MALDI) 23 68,1.
Conjugado de Taxol C2' tetraarginina. Este compostofoi acoplado com Ac-NH-DCys(DArg)4CONH2 usando-se oprocedimento de Jones et al. (Jones, L. R. et al. , J. Am.Chem. Soe. 2006, 128, 6526-6527) com um rendimento de 55%.RMN-1H (500 MHz, D2O): δ = 8,05 (d, J = 7,3Hz, 2H) , 7,72-747 (m, 6H), 7,40-7,37 (m, 6H), 7,14 (m, 1H), 6,33 (s, 1H),5,92 (t, J = 8,5Hz, 1H), 5,60 (d, J = 7,9Hz, 1H), 5,47 (m,2H) , 5,03 (d, J = 8, 7Hz, 1H) , 4,42 (t, J = 7,0Hz, 1H) ,4,22-4,15 (m, 7H) , 3,79 (t, J = 6, OHz, 2H) , 3,65 (d, J =7,OHz, 1H), 3,08 (m, 10H), 2,98-2,84 (m, 2H), 2,88 (t, J =6,OHz, 2H) , 2,45 (m, 1H) , 2,29 (s, 3H) , 2,13 (s, 3H) , 1,87(s, 3H) , 1,81 (s, 3H) , 1,81-1,51 (m, 21H) , 1,08 (s, 3H) ,1,03 (s, 3H) . EM (m/z): [M+l] calculado para C79HnNi9O22S21742,8, encontrado (MALDI) 1742,9.
Ácido 4 -(piridin-2-ildisulfanil)-butírico (60). Oácido 60 foi sintetizado a partir de tiol livre 59 (vejaBlount, K. F. e Uhlenbeck, O. C, Biochemistry, 2002, 41,6834-6841) conforme descrito por Jones, L. R. et al. , J.Am. Chem. Soe. 2006, 128, 6526- 6527, RMN-1H (500 MHz,CDCl3): δ 8,50 (d, 1Η, J = 4,5Hz), 7,74 (d, 1H, J = 8,0Hz),7,68 (t, 1H, J - 8,OHz), 7,13 (t, 1H, J = 7,0 Hz), 2,87 (t,2H, J = 7,OHz), 2,52 (t, 2H, J = 7,0Hz), 2,06 (m, 2H), ppm.RMN-13C (125 MHz, CDCl3): δ = 178,1, 159,9, 149,4, 137,3,120,8, 1 19,9, 37,7, 32,3, 23,7, EI-EM (m/z): [M+l]calculado para [C9Hi2NO2S2] 23 0,02; encontrado 23 0,0.
Ester de Taxol C2' 61. 0 procedimento publicado porRodrigues e colaboradores (Rodrigues, M. L. et al. , ChemBiol. 1995, 2, 223-227) foi usado para o acoplamento doácido 6 0 com Taxol para resultar no composto 61 com umrendimento de 71%. RMN-1H (500 MHz, CDCl3) : δ = 8,46 (m,1H) , 8,16 (d, J = 7, 6Hz, 2H) , 7,78 (d, J = 7,6Hz, 2H) ,7,69-7,35 (m, 13H) , 7,11 (m, 1H) 6,99 (d, J = 9,0Hz, 1H) ,6,32 (s, 1H) , 6,28 (t, J = 9,0Hz, 1H) , 5,99 (dd, Jl = 9,1Hz, J2 = 3,2 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 5,54 (d, J= 2,2 Hz, 1H) , 4,99 (d, J = 9,0 Hz, 1H) , 4,48 (dd, Jl =11,0 Hz, J2 = 6,8 Hz, IH)), 4,33 (d, J = 8,5 Hz, 1H) , 4,21(d, J = 8,5 Hz, 1H) , 3,84 (d, J = 7,0 Hz, 1H) , 2,84-2,77(m, 2H) , 2,66-2,55 (m, 2H) , 2,47 (s, 3H) , 2,38 (m, 1H) , 2,25 (s, 3H) , 2,20 (m, 1H) , 2,05 (m, 3H) , 1,91 (m, 4H) , 1,78(m, 1H) , 1,71 (s, 3H) , 1,25 (s, 3H) , 1,16 (s, 3H) ppm. RMN-13C (12 5 MHz, CDCl3): δ = 204,1, 172,1, 171,5, 170,1, 168,3,167,5, 167,3, 149,1, 145,0, 143,0, 138,3, 137,1, 134,0,133,7, 133,0, 132,4, 130,6, 130,5, 129,8, 129,4, 129,0,128,8, 128,3, 128,2, 128,1, 127,4, 126,8, 121,4, 120,8,84,7, 81,3, 79,4, 75,9, 75,3, 74,3, 72,4, 72,1, 58,8, 53,0,45,9, 43,4, 37,5, 35,8, 32,2, 27,1, 24,0, 23,0, 22,4, 21,1,15,1, 9,9 ppm. EM (m/z): [M+2] calculado para [C56H62N2O15S2]1066,3; encontrado (MALDI) 1066,7.
Conjugado de Taxol C2' octaarginina 62. Este compostofoi acoplado com Ac-NH-DCys(DArg)8CONH2 (Kirschberg, T. A.et al., Org. Lett. 2003, 5, 3459-3462) usando-se oprocedimento de Jones et al. (Jones, L. R. et al. , J. Am.Chem. Soe. 2006, 128, 6526-6527) com um rendimento de 58%.
RMN-1H (500 MHz, CD3OD): δ = 8, 14 (d, J = 7,5Hz, 2H) , 7,85(d, J = 7, 5Hz, 2H) , 7,72 (m, 1H) , 7,59 (m, 3H) , 7,48 (m,6H) , 7,28 (m, 1H) , 6,46 (s, 1H) , 6,03 (t, J = 8,5 Hz, 1H) ,5,80 (d, J = 7,OHz, 1H) , 5,65 (d, J = 7,0Hz, 1H) , 5,49 (m,1H) , 5,03 (d, J = 9,5 Hz, 1H) , 4,88 (s, 1H) , 4,54 (m, 1H) ,4,35-4,26 (m, 10H), 4,20 (m, 2H), 3,81 (d, J = 7,OHz, 1H),3,22 (m, 17H) , 3,14 (m, 1H) , 2,98 (m, 1H) , 2,77 (t, J =7,OHz, 2H) , 2,61 (m, 2H) , 2,49 (m, 1H) , 2,40 (s, 3H) , 2,20(s, 3H) , 2,14- 2,03 (m, 6H) , 1,94-1,87 (m, 43H) , 1,17 (s,3H) , 1,14 (s, 3H) ppm. EM (m/z): [M+l] calculado para[C104Hi62N35O25S2] 2365,2; encontrado (MALDI) 2365,8.
Conjugado de Taxol C2' tetraarginina. Este compostofoi acoplado com Ac-NH-DCys(DArg)4CONH2 usando-se oprocedimento de Jones et al. (Jones, L. R. et al. , J. Am.Chem. Soe. 2006, J 28, 6526-6527) com um rendimento de 58%.RMN-1H (500 MHz, CD3OD): δ = 8, 14 (d, J = 7,5Hz, 2H) , 7,86(d, J = 7, 5Hz, 2H) , 7,72 (m, 1H) , 7,61 (m, 3H) , 7,49 (m,6H) , 7,30 (m, 1H) , 6,46 (s, 1H) , 6,01 (t, J = 8,5 Hz, 1H) ,5,82 (d, J = 7,OHz, 1H), 5,67 (d, J = 7,0Hz, 1H), 5,49 (m,1H) , 5,04 (d, J = 9,5 Hz, 1H) , 4,88 (s, 1H) , 4,53 (m, 1H) ,4,36-4,27 (m, 6H) , 4,20 (m, 2H) , 3,81 (d, J = 7,0Hz, 1H) ,3,22 (m, 9H) , 3,14 (m, 1H) , 2,98 (m, 1H) , 2,77 (t, J =7,OHz, 2H)3 2,61 (m, 2H) , 2,49 (m, 1H) , 2,40 (s, 3H) , 2,21(s, 3H) , 2,11-2,03 (m, 6H) , 1,95-1,86 (m, 27H) , 1,17 (s,3H) , 1,14 (s, 3H) ppm. EM (m/z): [M+l] calculado para[C90H114N19O21S2] 1740,8; encontrado (MALDI) 1741,5.Ester TBS de Taxol C2' 64. A síntese de Taxol C2'protegido por TBS 64 foi descrita por Magri, N. F. et al. ,J. Nat. Prod. 1988, 51, 298-306, e o seu procedimento foiseguido com precisão para se obter o éster TBS C2' 64 comum rendimento de 95%. Todos os espectros estavam de acordocom os dados publicados por Magri et al.
Éster de Taxol C7 65. A formação de éster 65 naposição C7 foi efetuada de acordo com o procedimentodescrito por Damen e colaboradores (Damen, E. W. P. et al. ,Bioorg. Med. Chem. 2000, 8, 427-432) obtendo-se o ésterdesejado 65 com um rendimento de 62%. RMN-1H (500 MHz,CDCl3): 8,44 (m, 1H) , 8,12 (d, J = 10,5Hz, 2H) , 7,73 (m,3H) , 7,61 (m, 2H) , 7,49 (m, 3H) , 7,42-7,31 (m, 6H) , 7,07(m, 2H) , 6,25 (m, 2H) , 5,73-5,68 (m, 2H) , 5,59 (m, 1H) ,4,95 (d, J = 11,5 Hz, 2H) , 4,66 (s, 1H) , 4,33 (d, J =10,5Hz, 1H) , 4,19 (d, J = 10,5Hz, 1H) , 4,11 (m, 2H) , 3,95(d, J = 8,5Hz, 1H) , 2,83 (t, J = 8,0Hz, 2H) , 2,56 (s, 3H) ,2.78 (m, 4H) , 2,14 (s, 3H) , 2,03 (s, 3H) , 1,97 (s, 3H) ,1.79 (m, 6H) , 1,26-1,15 (m, 10H) , 0,79 (s, 9H) , -0,03 (s,3H) , -0,31 (s, 3H) . RMN-13C (125 MHz, CDCl3) δ 202,2, 172,2,171,7, 170,1, 169,2, 167,2, 160,7, 149,9, 141,2, 138,5,137,3, 134,3, 134,0, 132,9, 132,1, 130,5, 129,3, 129,1,129,0, 128,2, 127,3, 126,6, 120,8, 119,8, 84,2, 81,2, 78,9,76,7, 75,4,75,3, 74,7, 71,6, 56,3, 55,9, 47,1, 43,6, 38,3,35,8, 33,6, 32,7, 29,9, 26,6, 25,8, 23,8, 23,3, 21,7, 21,0,18,4, 14,9, 11,2, 1,3, -4,9, -5,6, EM (m/z): [M+2]calculado para [C62H76N2O15S2Si] 1180,4; encontrado (MALDI)1180,1.
Éster de Taxol C7 66. A desproteção de TBS do ésterC2' para se obter 66 com um rendimento de 7 0% foi conduzidausando-se o procedimento de Kirschberg, T. A. et al., Org.Lett. 2003, 5, 3459-3462, RMN-1H (500 MHz, CDCl3): 8,44 (m,1H) , 8,12 (d, J = 10,5Hz, 2H) , 7,73 (m, 3H) , 7,61 (m, 2H),7,49 (m, 3H) , 7,42-7,31 (m, 6H) , 7,20 (d, J = 9,0Hz, 1H) ,7,08 (m, 1H) 6,21 (m, 2H) , 5,81 (d, J = 9,0Hz, 1H) , 5,68(d, J = 7,0Hz, 1H) , 5,55 (m, 1H) , 4,95 (d, J = 11,5 Hz,2H) , 4,81 (s, 1H) , 4,33 (d, J = 10,5Hz, 1H) , 4,19 (d, J =10, 5Hz, 1H) , 4,11 (m, 2H) , 3,95 (m, 2H) , 2,84 (t, J =8,OHz, 2H), 2,54-2,43 (m, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,34 (m, 2H),2,17 (s, 3H) , 2,05- 1,95 (m, 4H) , 1,82 (s, 3H), 1,80 (s,3H), 1,78 (m, 1H) , 1,97 (s, 3H) , 1,27 (m, 1H), 1,21 (s,3H), 1,17 (s, 3H) ppm. RMN-13C (125 MHz, CDCl3): δ = 202,2,172,7, 172,2, 170,6, 169,2, 167,3, 167,1, 160,6, 149,8,140,7, 138,3, 137,3, 134,1, 133,9, 133,2, 130,4, 129,3,129,2, 129,0, 128,9, 128,5, 127,3, 120,8, 199,9, 84,1,81,2, 78,7, 76,7, 75,5, 74,5, 73,5, 72,3, 71,7, 56,4, 55,2,47,2, 43,5, 38,2, 35,8, 33,7, 32,7, 26,8, 23,8, 22,8, 21,1,21,0, 14,9, 11,1 ppm. EM (m/z): [M+Na] calculado para[C56H60N2Oi5S2Na] 1087,3 encontrado (MALDI) 1087,4.
Conjugado de Taxol C7 octaarginina 67. Acoplou-se oéster de Taxol C7 16 com Ac-NH-DCys(DArg)8CONH2(Kirschberg, T. A. et al , Org. Lett. 2003, 5, 3459- 3462)usando-se o procedimento de Jones et al. (Jones, L. R. etal., J. Am. Chem. Soe. 2006, 128, 6526-6527) para se obtero produto desejado com um rendimento de 63%. RMN-1H (500MHz, CD3OD): ü = 8,14 (d, J = 7,5Hz, 2H), 7,88 (d, J =7,5Hz, 2H), 7,71 (m, 1H), 7,59 (m, 3H), 7,48 (m, 6H), 7,32(m, 1H), 6,27 (s, 1H) , 6,17 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 5,67 (m,2H), 5,61 (m, 1H) , 5,04 ((d, J = 9,5 Hz, 1H) , 4,89 (s, 1H),4,78 (d, J = 5, 5Hz, 1H) , 4,52 ((t, J = 7, 0Hz, 1H), 4,35-4,21 (m, 10Η) , 3,93 (d, J = 7,0Hz, 1Η) , 3,23 (m, 17Η) , 3,05(m, 1Η) , 2,76 (t, J = 7, OHz, 2Η) , 2,55 (m, 1Η) , 2,41 (m,5Η) , 2,28 (m, 1Η) , 2,18 (s, 3H) , 2,08 (s, 3H) , 2,03-1,65(m, 45H) , 1,18 (s, 3H) , 1,14 (s, 3H) ppra. EM (m/z) : [M+Na]calculado para [Ci04Hi6IN35O25S2Na] 2387,2; encontrado (MALDI)2387,4.
Conjugado de Taxol C7 tetraarginina. Acoplou-se oéster de Taxol C7 16 com DCys(DArg)4CONH2 usando-se oprocedimento de Jones et al. (Jones, L. R. et al. , J. Am.Chem. Soe. 2006, 128, 6526-6527) obtendo-se o produtodesejado com um rendimento de 51%. RMN-1H (500 MHz, CD3OD):õ = 8,15 (d, J = 7,5Hz, 2H) , 7,88 (d, J = 7,5Hz, 2H) , 7,72(m, 1H), 7,59 (m, 3H), 7,48 (m, 6H), 7,32 (m, 1H), 6,26 (s,1H) , 6,15 (t, J = 8,5 Hz, 1H) , 5,64 (m, 2H) , 5,61 (m, 1H) ,5,05 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,89 (s, 1H), 4,78 (d, J = 5,5Hz,1H), 4,50 (t, J = 7,OHz, 1H), 4,33-4,18 (m, 6H), 3,93 (d, J= 7, OHz, 1H) , 3,30 (m, 9H) , 3,03 (m, 1H) , 2,77 (t, J =7,OHz, 2H) , 2,55 (m, 1H) , 2,41 (m, 5H) , 2,28 (m, 1H) , 2,18(s, 3H) , 2,08 (s, 3H) , 2,15-1,76 (m, 29H) , 1,19 (s, 3H) ,1,15 (s, 3H) ppm. EM (m/z): [M+Na] calculado para[C8oHii3Ni902iS2Na] 1762,8; encontrado (MALDI) 1763,3.
Os resultados do ensaio de inibição do crescimentocelular (GI50) em linhagens de células do câncer ovarianohumano OVCA429/429T/429TP são mostrados na Figura 12. Ascélulas foram pulsadas com conjugados administrados em PBS(pH = 7,4) e Taxol (administrado em DMSO) durante 20minutos. Em seguida removeu-se a solução, lavaram-se ascélulas duas vezes e incubaram-se em meio fresco durante 72horas. A presença de células vivas foi medida com base noensaio MTS padrão. Conforme se pode ver, os conjugadosinibiram o crescimento de células cancerosas mesmo emlinhagens de células resistentes a Taxol, ao passo que otaxol apresentou uma atividade menor por ordens de grandezaem linhagens de células resistentes 429T e 429TP.
Exemplo 9
Conjugados de ciclosporina-ligante-transportador
<formula>formula see original document page 116</formula>
Metil carbonato de cloro-CsA (124) . A um frasco defundo redondo de 25 mL secado na chama purgado com N2acrescentou-se Ciclosporina A (500,0 mg, 0,416 mmol). Osólido branco foi então dissolvido em CH2Cl2 anidro (4 mL).O frasco foi então resfriado até 0°C em um banho degelo/água antes de se acrescentar cloroformiato declorometila (296 pL, 3,33 mmol) por micro-seringa.Acrescentou-se então piridina (168 pL, 2,08 mmol) e deixou-se a reação se aquecer até a temperatura ambiente. Asolução mudou de cor de amarelo pálido depois da adição depiridina para um rosa pálido para um tom ligeiramente corde laranja. Deixou-se agitar durante 21,5 horas (a coragora era marrom claro) , diluindo-se em seguida com CH2Cl2(20 mL) e solução aquosa saturada de NaHCO3 (25 mL) . A faseorgânica foi lavada sucessivamente com solução aquosasaturada de NaHCO3 (25 mL χ 2) e solução aquosa saturada deNaCl (40 mL χ 1) , secada sobre MgSO4, filtrada, econcentrada a vácuo. 0 produto bruto foi purificado porcromatografia sobre gel de sílica (pentano-acetato de etilagradiente de 1:1 a 1:3), obtendo-se 404,0 mg (75%) de 24puro: RMN-1H (500 MHz, CDCl3): δ 8,56 (1H, d, J = 10 Hz),8,00 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,50 (1H, d, J = 9 Hz), 7,46 (1H,d, J = 7,5 Hz), 5,66 (1H dd, J = 11,5, 4,3 Hz), 5,58 (1H,d, J = 3,5 Hz), 5,37 (1H, dd, J = 12, 3,8 Hz), 5,26 (2H, m,J = nd) , 5,14 (2H, m, J = nd) , 4,94 (1H, q, J = 8 Hz), 4,83(1H, t, J = 8Hz), 4,82 (1H, d, J = 11 Hz), 4,74 (IH1 t, J =10 Hz), 4,64 (1H, d, J = 14,5 Hz), 4,40 (1H, quinteto, J -7 Hz), 4,18 (1H, d, J = 14,5 Hz), 3,94 (1H, d, J = 14,5Hz), 3,45 (3H, s) , 3,24 (3H, s) , 3,23 (3H, s), 3,19 (3H,s) , 3,14 (1H, d, J = 11 Hz), 2,65 (3H, s), 2,63 (3H, s),2,42 (1H, m, J = nd), 2,15 (4H, m, J = nd), 1,93 (4H, m, J= nd), 1,67 (6H, m, J = nd), 1,58 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,42(2H, m, J = nd) , 1,32 (1H, m, J = nd) , 1,29 (3H, d, J = 7Hz), 1,25 (3H, d, J = 7 Hz), 1,16 (1H, dq, J = 15, 10,5, 4Hz), 1,05 (3H, d, J = 7 Hz), 1,04 (3H, d, J = 7 Hz), 1,01(3 H, d, J = 7 Hz), 0,98 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,94 (3H, d,J = I Hz), 0,93 (3H, d, J = 7 Hz), 0,89 (3H, d, J = 7,5Hz), 0,88 (3H, d, J = 7,5 Hz), 0,86 (3H, d, J = 7,5 Hz),0,84 (9H, m, J = nd), 0,79 (3H, d, J = 8 Hz), 0,76 (3H, d,J = 7 Hz).Metil carbonato de iodo-CsA (125). A ura frasco defundo redondo secado no forno e purgado com N2 acrescentou-se uma solução de 124 (239,5 mg, 0,185 mmol) em CH2Cl2anidro (800 pL). O solvente foi ventilado sob uma correntede N2 e ainda mais concentrado a vácuo. O resíduo seco foiabsorvido em CH3CN anidro (1,8 mL), obtendo-se uma soluçãoligeiramente turva. Em seguida acrescentou-se NaI sólido(166,3 mg, 1,11 mmol) à temperatura ambiente. A soluçãotransparente amarela resultante foi aquecida até 40°C emum banho de óleo e deixou-se que se agitasse durante 20horas. A solução marrom foi concentrada a vácuo, absorvidaem acetato de etila (20 mL), lavada sucessivamente comsolução aquosa a 10% de Na2S2O5 (20 mL χ 2) e solução aquosasaturada de NaCl (20 mL χ 1), secada sobre MgSO4, filtrada,e concentrada a vácuo. O produto não foi mais purificado oucaracterizado. Ele foi levado diretamente para a reaçãoseguinte.
Ácido 4-tritiltio-butírico (130) . A um tubo de ensaiosecado em forno e purgado com N2 acrescentou-se tritilmercaptano (1,203 g, 4,35 mmol). O sólido foi dissolvido emtolueno anidro (3 mL) e agitado com uma barra de agitaçãomagnética antes da adição de uma solução de metóxido desódio a 25% em metanol (2,17 mL, 9,58 mmol) por seringa.Resfriou-e a solução até 0°C em um banho de gelo/água,acrescentando-se então uma solução de ácido 4-bromobutírico(800,0 mg, 4,79 mmol) em MeOH (1 mL). A solução mudou decor para marrom claro e deixou-se que se aquecesse até atemperatura ambiente e agitou-se durante 6 horas. Ela foientão aquecida até 40 0C em um banho de óleo. A cor sealterou de um tom amarelo para laranja profundo depois de24 horas de tempo de reação. Depois de 24 horas,acrescentou-se um equivalente adicional de ácido 4-bromobutírico. Depois de outra hora de agitação,acrescentou-se mais metóxido de sódio em solução de metanol(500 pL). Deixou-se que a reação se agitasse um total de 30horas, quando ele foi concentrada a vácuo, absorvida emH2O destilada (30 mL) e H2SO4 a IM (10 mL), extraída comacetato de etila (40 mL χ 3), secada sobre MgSO4, filtrada,e concentrada a vácuo. 0 óleo amarelo resultante foipurificado por cromatografia sobre gel de sílica (pentano-acetato de etila-ácido acético, gradiente e 84:15:1 a64:35:1), obtendo-se 873,6 mg (50,3%) de 130 puro: RMN-1H(400 MHz, CDCl3): 5 7,47 (6H, d, J = 8,5 Hz), 7,32 (6H, t,J = 7,2 Hz), 7,24 (3H, 7,2 Hz), 2,36 (2H, t, J = 7,2 Hz),2,28 (2H, t, J = 7,2 Hz), 1,72 (2H, quinteto, J = 7,2 Hz).
Ácido 4-piridilditio-butírico (131). A um frasco defundo redondo de 10 mL secado na chama purgado com N2acrescentou-se uma solução de 130 (436,8 mg, 1,205 mmol) emCH2Cl2 anidro (10 mL). A esta solução acrescentou-se 4-aldritiol (796,4 mg, 3,615 mmol) por meio de papel de pesare em seguida acrescentou-se triisopropilsilano (272,3 pL,1,325 mmol) por micro-seringa. Acrescentou-se ácidotrifluoracético (-2,5 mL) gota a gota com agitação àtemperatura ambiente até persistir uma cor amarela viva.
Deixou-se a reação se agitar durante 1 hora, quando seconcentrou a vácuo e purificou-se por cromatografia sobregel de sílica (pentano-acetato de etila-ácido acético,gradiente de 69:30:1 a 54:45:1), obtendo-se 251,6 mg (91%)de 131 puro: RMN-1H (500 MHz, CDCl3): 5 8,52 (1 Η, d, J =4,8 Hz), 7,79 (1H, d, J = 8 Hz), 7,74 (1H, t, J = 7,5 Hz),7,18 (IH, t, J = 6,5 Hz), 2,84 (2Η, t, J = 7,5 Hz), 2,47(2Η, t, J = 7,5 Hz), 2,01 (2Η, quinteto, J = 7,5 Hz).
Ácido 5-tritiltio-valérico (133). A um frasco de fundoredondo secado na chama e purgado com N2 acrescentou-setritil mercaptano (347 mg, 1,26 mmol). Dissolveu-se osólido em tolueno anidro (5,5 mL) e agitou-se com uma barrade agitação magnética antes de se adicionar uma solução a25% de metóxido de sódio em metanol (860 pL, 3,7 7 mmol) pormeio de seringa. Resfriou-se a solução até O0C em um banhode gelo/água, acrescentando-se então uma solução de ácido5-bromovalérico (250,0 mg, 1,38 mmol) em MeOH (3 mL) . Asolução mudou para uma cor marrom claro e deixou-se que seaquecesse até a temperatura ambiente e agitou-se durante 8horas, quando ela foi concentrada a vácuo, vertida em H2Odestilada (30 mL) e solução aquosa a IM de H2SO4 (10 mL) ,extraída com acetato de etila (40 mL χ 3) , secada sobreMgSO4, filtrada, e concentrada a vácuo. 0 sólido amareloresultante foi purificado por cromatografia sobre gel desílica (pentano-acetato de etila-ácido acético, gradientede 69:30:1 a 64:35:1), obtendo-se 419,8 mg (88,5%) de 133puro: RMN-1H (500 MHz, CDCl3): S 7,48 (6H, d, J = 8,5 Hz),7,33 (6H, t, J = 8 Hz), 7,26 (3H, 8 Hz), 2,26 (2H, t, J =7,5 Hz), 2,23 (2H, t, J = 7,5 Hz), 1,64 (2H, quinteto, J =7,5 Hz), 1,48 (2H, quinteto, J = 7,5 Hz).
Ácido 5-piridilditio-valérico (134) . A um frasco defundo redondo de 10 mL secado na chama e purgado com N2acrescentou-se uma solução de 133 (248,5 mg, 0,66 mmol) emCH2Cl2 anidro (6 mL) . A esta se acrescentou 4-aldritiol(436,3 mg, 1,98 mmol) por meio de papel de pesar e emseguida triisopropilsilano (149,2 pL, 0,726 mmol) por meiode micro-seringa. Acrescentou-se ácido trifluoracético (~1mL) gota a gota com agitação à temperatura ambiente atépersistir uma cor amarela viva. Deixou-se a reação seagitar durante 1 hora, quando se concentrou a mesma a vácuoe purificou-se por cromatografia sobre gel de sílica(pentano-acetato de etila-ácido acético, gradiente de64:35:1 a 44:55:1), obtendo-se 142,1 mg (88,5%) de 134puro: RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ 8,48 (1H, d, J = 4,8 Hz),7,75 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,68 (1H, t, J = 7,6 Hz), 7,11(1H, t, J = 6 Hz), 2,78 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,33 (2H, t, J= 6,8 Hz), 1,72 (4H, m, J = nd).
CsA-carbonato-acetal-éster-S-aldritiol (135). A umfrasco cônico de fundo redondo de 10 mL secado na chamaacrescentou-se uma solução de 131 (50,0 mg, 0,218 mmol) emacetato de etila. Fez-se o solvente evaporar a vácuo. Aoresíduo seco à temperatura ambiente acrescentou-se DMFanidro (750 pL) e diisopropil-etilamina (45,7 pL, 0,263mmol). A solução resultante foi acrescentada a um frasco defundo redondo contendo 125 (242,6 mg, 0,175 mmol). Agitou-se a reação à temperatura ambiente durante 3 horas, quandose diluiu a mesma com MeOH (1,5 mL) e purificou-se por HPLCprep (CH3CN, gradiente de 65-100% durante 30 minutos,coluna aquecida até 50°C), obtendo-se 123,1 mg (47,3%) de135 puro.
CsA-carbonato-acetal-éster-5-D-Arg8-NH2 (136). A umfrasco cônico de 600 pL secado em forno e purgado com N2,acrescentou-se 135 (16,13 mg, 0,0108 mmol) em CH2Cl2 anidro.Fez-se evaporar o solvente sob uma corrente de N2 econcentrou-se ainda mais a vácuo. Acrescentou-se ao frascouma solução de Ac-D-Cys-D-Arg8-NH2 (22,91 mg, 0,00986 mmol)em DMF anidro (150 pL). A cor da solução ficouimediatamente amarela. Deixou-se que se agitasse àtemperatura ambiente durante 24 horas, quando se diluiu comMeOH e purificou-se por HPLC prep (gradiente de 30-90% deCH3CN durante 30 minutos, coluna aquecida até 50°C),obtendo-se 10,4 mg (28,5%) de 136 puro.
CsA-carbonato-acetal-éster-6-aldritiol (137). A umfrasco secado no forno, acrescentou-se uma solução de 134(21,37 mg, 0,088 mmol) em CH3CN anidro(550 pL) . Em seguidaacrescentou-se diisopropil-etilamina (17,13 pL, 0,098 mmol)por micro-seringa. Um sólido se precipitou, acrescentando-se então DMF anidro (80 pL) para se solubilizar o mesmo.
Acrescentou-se a solução resultante a um frasco de fundoredondo seco contendo 125 (97,4 mg, 0,070 mmol). Agitou-sea reação à temperatura ambiente durante 24 horas, quando seconcentrou a mesma a vácuo. O resíduo amarelo foi absorvidoem acetato de etila (40 mL) , lavado sucessivamente com umasolução aquosa a 10% de Na2S2O5 (40 mL χ 2) e solução aquosasaturada de NaCl (40 mL χ 1), secado sobre MgSO4, filtrado,e concentrado a vácuo. O produto bruto foi purificado porcromatografia sobre gel de sílica (acetato de etila-pentano, gradiente de 91:9 a 95:5), obtendo-se 73,1 mg(69,4%) de 13 7 puro.
CsA-carbonato-acetal-éster-6-D-Arg8-NH2 (138). A umfrasco cônico de 600 pL secado no forno e purgado com N2acrescentou-se 137 (14,62 mg, 0,0097 mmol) em CH2Cl2 anidro.Fez-se evaporar o solvente sob uma corrente de N2 econcentrou-se ainda mais a vácuo. Acrescentou-se ao frascouma solução de Ac-D-Cys-D-Arg8-NH2 (20,56 mg, 0,00885 mmol)em DMF anidro (100 pL). A solução ficou imediatamente°Camarela. Deixou-se que se agitasse à temperatura ambientedurante 25 horas, quando ele foi diluída com MeOH epurificada por HPLC prep (CH3CN, gradiente de 30-90%durante 20 minutos, coluna aquecida até 50°C), obtendo-se°C2,7 mg (8,2%) de 138 puro.Composto 136.
<formula>formula see original document page 123</formula>
foi testado do seguinte modo. Células BL4.IL-2 foramincubadas com concentrações variáveis ou de CsA ou doconjugado 13 6 de um dia para o outro a 370C para permitir a°Cabsorção e a liberação da forma ativa de CsA. No diaseguinte, as células T foram estimuladas para produzir IL-2com a adição de 10 ng/mL de forbol 12-miristato 13 acetatoe ionomicina a 1 μΜ. Incubaram-se as culturas de um diapara o outro a 37°C, e no dia seguinte coletaram-se os°Csobrenadante e mediu-se IL-2 usando-se imunoensaio ligado aenzima fluorescente (kit ELISA). Cada teste foi conduzidoem triplicata. 0 IC50 de 13 6 foi determinado como sendo de1900 nM.
A Figura 15A e a Figura 15B ilustram ciclosporina A°Cconjugada a lipídios por meio de ligantes da invenção, emque se fez reagir as moléculas de lipídio-cisteína-SH 205do Exemplo 10 com compostos de ciclosporina 135 e 137 desteexemplo, para criar conjugados de ciclosporina-lipidio. Ascélulas BL4.IL-2 foram incubadas com concentraçõesvariáveis ou de CsA ou com conjugados de um dia para ooutro a 3 7 0C para permitir a absorção e a liberação daforma ativa de CsA. NO dia seguinte, as células T foramestimuladas para produzir IL-2 com a adição de 10 ng/mL deforbol 12-miristato 13 acetato e 1 μΜ de ionomicina. Asculturas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C, eno dia seguinte coletaram-se os sobrenadantes e mediu-se aIL-2 usando-se imunoensaio ligado a enzima fluorescente(kit ELISA). cada teste foi conduzido em triplicata. Osvalores de IC50 determinados estão relacionados na Figura15A e na Figura 15B.
Exemplo 10
Transportadores lipidicas
<formula>formula see original document page 124</formula>
Uma modalidade das moléculas lipidicas detransportadores-ligante-carga usando-se os ligantes dainvenção pode ser convenientemente sintetizada pelo métododescrito no presente. A não ser que seja determinado emcontrário, todos os reagentes e solventes foram obtidos defontes comerciais e usados sem purificação. Conduziu-se aTLC analítica com placas 60F de gel de sílica de 0,25 mmcom indicador fluorescente (254 nm) . A cromatografialíquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) foiconduzida com um Varian ProStar 210/215 HPLC usando-se umacoluna preparatória (Alltec Alltima C18, 250 χ 22 mm) ou emAgilent 1100 HPLC analítico com uma coluna analítica (VydakC18, 150 χ 4,6 mm). Os produtos foram eluídos usando-se umgradiente de solventes (solvente A = TFA a 0,1%/H20;solvente B = de TFA a 0,1%/CH3CN). Os espectros de RMNforam medidas em um espectrômetro de ressonância magnéticaVarian INOVA 500 (RMN-1H a 500 MHz; RMN-13C a 12 5 MHz). Osdados para RMN-1H sãq relatados conforme segue: desvioquímico, multiplicidade (s = singleto, d = dupleto, dd =dupleto de dupleto, t = tripleto, q = quarteto, em=multipleto), integração, e constante de acoplamento (Hz).Os dados para os espectros de RMN-13C são relatados emtermos de desvio químico em relação ao pico do solventeresidual (CDCl3 = 77,3 ppm e CD3OD = 49,1 ppm). Osespectros de massa de ionização por eletropulverização (ES-EM) foram registrados no laboratório de espectrometria naUniversidade de Stanford em um espectrômetro de massa deaprisionamento de íons quadripolar Finnigan LCQ. Espectrosde massa de Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI) foramregistrados em um espectrômetro de massa Voyager DE deApplied Biosystems.
Síntese e caracterização de conjugados de luciferinaocta L-arginina 203-207a-e.
Éster etílico de 5-tritil-L-cisteina (203). Agitaram-se cloridrato de éster etílico de L-cisteína (5,0 g, 27,03mmol, 1 eq.) e cloreto de tritila (11,3 g, 40,55 mmol, 1,5eq) em 20 mL de DMF durante 2 dias à temperatura ambiente.A reação foi purificada por injeção direta em RP-HPLCusando-se gradiente de 50-100% de água/acetonirila (nenhumTFA acrescentado) durante 20 minutos. Depois de secar avácuo, obtiveram-se 9,3 g (88%) de 203 em forma de um póbranco. RMN-1H (500 MHz, CD3OD): δ = 7,23-7,41 (ra, 15H) ,4,18 (q, 2H, J = 7,5 Hz), 3,17 (m, 1H) , 2,58 (dd, 1H, J =8,5 Hz, 12 Hz), 2,48 (dd, 1H, J = 5 Hz, 12 Hz), 1,35 (t,3H, J = 7,5 Hz). RMN-13C (125 MHz, CD3OD) δ 171,9, 145,9,130,7, 129,0, 127,9, 68,1, 62,5, 53,3, 30,8, 14,3! EI-EM(m/z): [M+l] calculado para C24H27NO2S 392,2; encontrado393,2.
Composto 204a. A uma solução de éster etílico de 5-tritil-L-cisteína (203) (67 mg, 0,176 mmol), ácidopalmítico (50 mg, 0,194 mmol), DCC (36 mg, 0,176 mmol), eHOBt (27 mg, 0,176 mmol) em 3 mL de DMF anidro acrescentou-se trietilamina (54 pL, 0,352 mmol) e deixou-se a reação seagitando de um dia para o outro à temperatura ambiente sobuma atmosfera de nitrogênio. A reação foi extinta com umasolução aquosa a 1% de HCl e foi lavada com acetato deetila. A fase orgânica foi secada sobre MgSO4, concentradaa vácuo e purificada por cromatografia de coluna (EtOAc -pentano a 1:5, em seguida a 1:1), obtendo-se 202a puro(85,3 mg, 77%) em forma de um óleo. RMN-1H (500 MHz,CD3OD): δ = 7,41-7,23 (m, 15H) , 4,20 (q, 1H, J = 5 Hz),4,08 (q, 2H, J = 7,5 Hz), 2,62 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, 12 Hz),2,56 (dd, 1H, J - 5 Hz, 12 Hz), 2,28 (t, 3H, J = 7,5 Hz),1,63-1,60 (m, 2H), 1,34-1,28 (m, 24H), 1,20 (t, 3H, J = 7,5Hz), 0,91 (t, 3H, J = 7 Hz). RMN-13C (125 MHz, CD3OD) δ176,1, 171,8, 145,9, 130,7, 129,0, 127,9, 68,1, 62,5, 53,3,36,7, 34,5, 33,1, 30,8, 30,7, 30,5, 30,4, 30,2, 27,0, 23,7,14,5, 14,4, EI-EM (m/z): [M+l] calculado para C40H56NO3S63 0,4; encontrado 630,4.
Composto 204b. Composto 204b foi sintetizado conformedescrito acima para 204a usando-se ácido láurico em vez deácido palmítico com um rendimento de 71%. RMN-1H (500 MHz,CD3OD): δ = 7,41-7,21 (m, 15H) , 4,22 (q, 1H, J = 5 Hz),4,08 (q, 2H, J = 7,5 Hz), 2,64 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, 12 Hz),2,56 (dd, 1H, J = 5 Hz, 12 Hz), 2,22 (t, 2H, J = 7 Hz),1,64-1,61 (m, 2H), 1,35-1,28 (m, 16H), 1,18 (t, 3H, J = 7,5Hz), 0,91 (t, 3H, J = 7 Hz). RMN-13C (125 MHz, CD3OD) δ176,1, 171,8, 145,9, 130,7, 129,0, 127,9, 68,1, 62,5, 53,3,36,7, 34,5, 33,1, 30,8, 30,7, 30,5, 30,4, 30,2, 27,0, 23,7,14,5, 14,4, EI-EM (m/z): [M+l] calculado para C3sH48NO3S574,3; encontrado 574,3.
Composto 204c. Composto 204c foi sintetizado conformedescrito acima para 204a usando-se ácido octanóico em vezdo ácido palmítico com um rendimento de 85%. RMN-1H (125MHz, CD3OD): δ = 7,41-7,23 (m, 15H) , 4,91 (q, 1H, J = 5Hz), 4,11 (q, 2H, J = 7,5 Hz), 2,64 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, 12Hz), 2,56 (dd, 1H, J = 5 Hz, 12 Hz), 2,23 (t, 2H, J = 7,5Hz), 1,64-1,61 (m, 2H), 1,37-1,31 (m, 8H), 1,21 (t, 3H, J =7,5 Hz), 0,91 (t, 3H, J = 7 Hz). RMN-13C (125 MHz, CD3OD) δ176,1, 171,8, 145,9, 130,7, 129,0, 127,9, 68,1, 62,5, 53,3,36,7, 34,5, 33,1, 30,5, 30,4, 30,2, 23,7, 14,5, 14,4, EI-EM(m/z): [M+l] calculado para C32H40NO3S 518,3; encontrado518,3 .
Composto 204d. Composto 204d foi sintetizado conformedescrito acima para 204a usando-se ácido butírico em vez doácido palmítico com um rendimento de 80%. RMN-1H (500 MHz,CD3OD): δ = 7,41-7,23 (m, 15H) , 4,60 (q, 1H, J = 5 Hz),4,21 (q, 2H, J = 7,5 Hz), 2,64 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, 12 Hz),2,56 (dd, 1H, J = 5 Hz, 12 Hz), 2,27 (t, 2H, J = 7Hz),1,70-1,64 (m, 2H), 1,30 (t, 3H, J = 7,5 Hz), 0,99 (t, 3H, J=7 Hz). RMN-13C (125 MHz, CD3OD) δ 175,0, 171,8, 145,9,130,7, 129,0, 127,9, 68,1, 62,5, 53,3, 37,3, 30,2, 22,5,14.4, 14,3, EI-EM (m/z): [M+l] calculado para C28H32NO3S62,2; encontrado 462,2.
Composto 204e. A uma solução de éster etílico de 5-Tritil-L-Cisteina (17 mg, 0,043 mmol) em 3 mL de NaOHgelado (IN) gota a gota acrescentaram-se 100 pL de anidridoacético com agitação vigorosa e resfriamento contínuo em umbanho de gelo. Acrescentou-se mais NaOH gelado (IN), e emseguida 100 pL de anidrido acético. Depois da mistura tersido agitada durante 3 0 min a solução foi levada a um pH 3com a adição de H2SO4 concentrado e lavada com acetato deetila. A fase orgânica foi secada sobre MgSO4, concentradaa vácuo e purificada por RP-HPLC usando-se um gradiente de20-80% água/acetonirila (nenhum TFA acrescentado) durante20 minutos, obtendo-se 204e puro (mg, 88%) em forma de umpó branco. RMN-1H (500 MHz, CD3OD): ü = 7,41-7,23 (m, 15H) ,4,29 (q, 1H, J = 5 Hz), 4,10 (q, 2H, J = 7,5 Hz), 2,62 (dd,1H, J = 8,5 Hz, 12 Hz), 2,56 (dd, 1H, J = 5 Hz, 12 Hz),1,98 (s, 3H) , 1,20 (t, 3H, J = 7,5 Hz). RMN-13C (125 MHz,CD3OD) δ 174,8, 171,8, 145,9, 130,7, 129,0, 127,9, 68,1,62.5, 53,4, 30,2, 18,5, 14,3, EI-EM (m/z): [M+l] calculadopara C26H28NO3S 434,2; encontrado 434,2.
Composto 2 07a. Em uma atmosfera inerte, o composto204a (28,5 mg, 0,045 mmol) foi dissolvido em 1,5 mL deCH2Cl2. Em seguida, acrescentaram-se subseqüentementetrietilsilano (28 pL, 0,18 mmol), e ácido trifluoracético(1,5 mL) . Depois de 2 horas, removeu-se o solvente a vácuoe colocou-se o resíduo resultante em bombas de alto vácuodurante 1 hora. O resíduo foi ressuspenso em 1,5 mL de DMFanidro e acrescentou-se o composto 206 (22,8 mg, 0,045mmol). Depois de se ter agitado de um dia para o outro àtemperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio,extinguiu-se a reação com uma solução aquosa a 1% de HCl elavou-se com acetato de etila. Secou-se a fase orgânicasobre Na2SO4, concentrou-se a vácuo e purificou-se porcromatografia de coluna (EtOAc-pentano a 1:5, em seguida a2:1) para se obter 207a puro (22,2 mg, 63%) em forma de umóleo amarelo. RMN-1H (500 MHz, CD3OD): δ = 8,13 (d, 1H, J =9 Hz), 7,98 (d, 1H, J = 2 Hz), 7,44 (dd, 1H, J = 9 Hz),5,46 (t, 1H, J = 9 Hz), 4,76 (q, 1H, J = 5 Hz), 4,41 (t,2H, J = 6,5 Hz), 4,21 (q, 2H, J = 7,5 Hz), 3,81 (dd, 2H, J= 9 Hz), 3,24 (dd, 1H, J = 5 Hz, 12 Hz), 2,99 (dd, 1H, J =8,5 Hz, 12 Hz), 2,89 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 2,28 (t, 3H, J =7 Hz), 2,16 (m, 2H), 1,63-1,60 (m, 2H), 1,34-1,27 (m, 27H),0,91 (t, 3H, J = 7 Hz). RMN-13C (125 MHz, CDCl3): 6 = 173,4,172,2, 170,7, 168,0, 160,9, 153,6, 151,4, 149,5, 137,0,125,6, 121,7, 114,5, 78,2, 68,4, 62,3, 51,9, 41,1, 38,9,36,7, 34,7, 30,6, 30,0, 29,9, 29,8, 29,6, 29,5, 29,1, 25,8,24,0, 23,3, 23,0, 14,4, 14,3, 11,2 ppm. EM (m/z): [M+l]calculado para C36H54N3O8S4 784,3 ; encontrado (MALDI) 784,3.
Composto 207b. O composto 207b foi sintetizadoconforme descrito acima para 207a usando-se 204b como umprecursor com um rendimento de 67%. RMN-1H (5 00 MHz,CD3OD): δ = 8,11 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,98 (d, 1H, J = 2 Hz),7,44 (dd, 1H, J = 9 Hz), 5,46 (t, 1H, J = 9 Hz), 4,76 (q,1H, J = 5 Hz), 4,41 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 4,21 (q, 2H, J =7,5 Hz), 3,81 (dd, 2H, J - 9 Hz), 3,24 (dd, 1H, J = 5 Hz,12 Hz), 2,99 (dd, 1 H, J = 8,5 Hz, 12 Hz), 2,89 (t, 2H, J =6,5 Hz), 2,27 (t, 3H, J = 7 Hz), 2,15 (m, 2H), 1,63-1,60(m, 2H) , 1,34-1,27 (m, 19H) , 0,91 (t, 3H, J = 7 Hz). EM(m/z): [M+l] calculado para C32H4eN3O8S4 728,2; encontrado(MALDI) 728,2.
Composto 207c. 0 composto 207c foi sintetizadoconforme descrito acima para 207a usando-se 204c como umprecursor com um rendimento de 72%. RMN-1H (500 MHz,CD3OD): δ = 8,13 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,98 (d, 1H, J = 2 Hz),7,44 (dd, IHi J = 9 Hz), 5,41 (t, 1H, J = 9 Hz), 4,76 (q,IHi J = 5 Hz), 4,41 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 4,21 (q, 2H, J =7,5 Hz), 3,81 (dd, 2H, J = 9 Hz), 3,24 (dd, 1H, J = 5 Hz,12 Hz), 2,99 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, 12 Hz), 2,89 (t, 2H, J =6,5 Hz), 2,28 (t, 3H, J = 7 Hz), 2,16 (m, 2H) , 1,63-1,60(m, 2H) , 1,34-1,27 (m, 1 1H) , 0,91 (t, 3H, J = 7 Hz). EM(m/z) : [M+l] calculado para C2SH3SN3OgS4 672,1; encontrado(MALDI) 672,2.
Composto 207d. 0 composto 207d foi sintetizadoconforme descrito acima para 207a usando-se 204d como umprecursor com um rendimento de 65%. RMN-1H (5 00 MHz,CD3OD): δ = 8,12 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,97 (d, 1H, J = 2 Hz),7,44 (dd, 1H, J = 9 Hz), 5,44 (t, 1H, J = 9 Hz), 4,76 (q,1H, J = 5 Hz), 4,41 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 4,21 (q, 2H, J =7,5 Hz), 3,81 (dd, 2H, J = 9 Hz), 3,24 (dd, 1H, J = 5 Hz,12 Hz), 2,99 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, 12 Hz), 2,89 (t, 2H, J =6,5 Hz), 2,27 (t, 3H, J = 7 Hz), 2,16 (m, 2H) , 1,69-1,65(m, 2H), 1,30 (t, 3H, J = 7,5 Hz), 0,99 (t, 3H, J = 7 Hz).RMN-13C (100 MHz, CDCl3): δ = 173,7, 172,3, 170,7, 167,5,160,9, 153,5, 151,3, 149,5, 137,0, 125,6, 121,6, 114,5,78,2, 66,7, 62,4, 52,0, 41,1, 38,6, 37,1, 36,9, 35,2, 19,2,14,4, 13,9 ppm. EM (m/z): [M+l] calculado para C24H30N3O8S4616,1; encontrado (MALDI) 616,1.
Composto 207e. O composto 207e foi sintetizadoconforme descrito acima para 207a usando-se 204e como umprecursor com um rendimento de 68%. RMN-1H (500 MHz,CD3OD): δ = 8,11 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,98 (d, 1H, J = 2 Hz),7,44 (dd, 1H, J = 9 Hz), 5,41 (t, 1H, J = 9 Hz), 4,76 (q,1H, J = 5 Hz), 4,41 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 4,21 (q, 2H, J =7,5 Hz), 3,81 (dd, 2H, J = 9 Hz), 3,23 (dd, 1H, J = 5 Hz,12 Hz), 2,99 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, 12 Hz), 2,90 (t, 2H, J =6,5 Hz), 2,21 (s, 3H), 2,16 (m, 2H), 1,30 (t, 3H, J = 7,5Hz) ppm. RMN-13C (100 MHz, CDCl3): δ - 173,8, 171,1, 170,4,166,9, 160,8, 153,5, 151,3, 150,2, 137,1, 125,7, 121,3,114,5, 78,1, 67,4, 62,5, 52,1, 40,6, 34,8, 28,1, 23,4, 13,9ppm. EM (m/z): [M+l] calculado para C22H2SN3O8S4 588,1;encontrado (MALDI) 588,1.
Compostos 206 e 208. A síntese e caracterização doscompostos 206 e 208 já foram descritas (Jones et al. , J.Am. Chem. Soe. 128:6526-6527 (2006). Composto 206, (RMN-13C(125 MHz, CD3OD): δ = 172,4, 167,7, 160,9, 160,4, 159,3,153,5, 151,3, 150,1, 147,2, 140,5, 137,0, 125,6, 122,2,121,3, 114,5, 78,1, 67,2, 35,3, 28,1 ppm.
Ensaios celulares para liberação de luciferina dosconjugados 207a-e. Para se estudar a absorção e liberaçãona cultura celular, concentrações variáveis de luciferina(201) e conjugados (207a-e, 208) forma incubadasseparadamente com as células. Depois de um tempo deincubação de 1 minuto, selecionado para facilitar a mediçãoe não para maximizar a absorção, as células foram lavadaspara se remover qualquer luciferina extracelular ouconjugado extracelular, e o número de fótons produzidoscomo uma função do tempo foi analisado usando-se uma câmerade dispositivo acoplado a carga (IVIS100, Xenogen Corp.,Alameda, CA). A quantidade de sinal luminescente, que é umamedida da liberação intracelular de luciferina livre e oseu consumo por luciferase intracelular, foi proporcional àconcentração (dados não mostrados) com curvas típicas deabsorção mostradas na Figura 13. 0 sinal luminescenteproveniente das células pulsadas com 207a-c gradualmente sedecompôs atingindo o fundo depois de aproximadamente 15minutos (Figura 13). As células tratadas com 207d-e geraramuma curva diferente, sendo aquele formato similar ao daluciferina, com menos luz inicial, uma taxa mais lenta dedecomposição e somente uma fração do total de fótonsproduzidos quando comparado com o observado para 2 07a-c(Figura 13). O procedimento descrito anteriormente foiseguido com pequenas variações no veículo em que oscompostos foram aplicados (Jones et al., J. Am. Chem. Soe.128:6526- 6527 (2006)). Uma linhagem de células de tumor dapróstata, estavelmente transfectada com luciferase, PC3M-Iuc, foi disposta em placas de fundo chato de 96 poços, com60.000 células por poço doze horas antes do ensaio. Ascélulas foram incubadas com concentrações variáveis ou dosal potássico de luciferina (Xenogen Corp., Alameda, CA) oucom carbonatos lipidados 271-e, em triplicata, durante 1minuto, em solução salina tamponada com HEPES (HBS) pH 7,4.
Os compostos foram administrados em DMSO uma vez que elesnão são solúveis em tampões aquosos, obtendo-se umaconcentração final de 10 μΜ do composto testado em cadapoço. A concentração total de DMSO foi mantida abaixo de 2% em um poço no total, depois da incubação as células foramlavadas, ressuspensas com o tampão adequado e aluminescência resultante foi medida usando-se uma câmera dedispositivo acoplado com carga e software Living Image((IVIS200, Xenogen, Corp., Alameda, CA). A Figura 13ilustra os resultados do experimento de absorção celular(pulso de 1 minuto, concentração de 10 μΜ) dastransportadores lipidadas com um comprimento diferente deuma cauda de lipxdio. Os compostos indicados na Figura 13são os seguintes: 7a é o composto 207a; 7b é o composto207b; 7c é o composto 207 c; 7d é o composto 207d; 7e é ocomposto 207e; 8 é o composto 208.
Experimentos com animais: O resultado do experimentoda absorção pela pele dos transportadores lipidadas émostrado na figura 14A e na Figura 14B. Para se assegurar areprodutibil idade no procedimento de aplicação 15 μL desolução a 5 mmol de cada conjugado em 100 % de PEG (400)foram administrados de uma ponta de pipeta padrão (tamanhode 1-20 μL) à superfície preparada da pele, queproporcionou um controle reproduzível da área de aplicação(veja Exemplo 7. Nenhuma outra manipulação da amostra foifeita, impedindo-se assim uma perda variável de amostrapara uma luva ou haste de vidro que se originaria de umafricção no procedimento. Este procedimento permitiu odesempenho comparativo dos conjugados estudados em umconjunto padrão de condições de administração. O desempenhoda absorção usando-se este procedimento é reproduzível, masmínimo. Para aplicações terapêuticas, a administraçãocobrindo uma área maior usando um procedimento de fricçãoresultaria em uma absorção maior. Todos os experimentosforam conduzidos depois do dia 5 e antes dos dia 12 apartir da remoção do pêlo, o que mostrou apresentar umareprodutibilidade excelente devido à completa recuperaçãodo estrato córneo (veja exemplo 7). 0 conjugado depoliarginina com luciferina 208 em um tampão de 75 % de PEG400 e 25 % de NaOAc a 1 mmol (pH = 6,0) foi usado como umcontrole positivo (Exemplo 7). Camundongos transgênicostratados com o conjugado de ácido láurico (2 07b) geraramuma curva diferente com mais luz inicial, uma taxa deaumento similar do sinal dr os primeiros 30 minutos e umataxa mais rápida de decomposição (Figura 14A) . 0 sinalproveniente do conjugado de ácido octanóico (207c) foianálogo ao de um controle de poliarginina 208, demonstrandouma taxa ligeiramente mais lenta de aumento de sinal nosprimeiros 2 5 minutos, seguido por uma produção estável desinal durante os seguintes 35 minutos (Figura 14A) .Consistentes com os dados sobre as células, os conjugados207d-e produziram somente uma fração do total de fótonsquando comparados com o observado para 207a-c. 0 número defótons produzido de uma quantidade conhecida de luciferinaindependente da penetração na pele mediada portransportadora foi determinado anteriormente a partir dosexperimentos de injeção intradérmica e calibração (vejaExemplo 7) . Estes dados foram usados para se determinar aquantidade de luciferina fornecida e liberada porconjugados de luciferina com transportadora lipidadaadministrados topicamente e que tinham comprimentos deácidos graxos diferentes (207a-e) e para comparar os mesmosa uma transportadora de poliarginina (208), que no mesmoensaio demonstrou anteriormente fornecer 2 99 nM deluciferina em um período de uma hora, o que é bem acima doque é necessário para a atividade terapêutica para muitasfármacos. Em comparação com 208, os conjugados comtransportadores de ácido palmítico (207a) e láurico (207b)foram capazes de fornecer 1,7 e 1,5 vezes respectivamentemais luciferina no mesmo período de uma hora (veja Figura14B). Para aplicações terapêuticas, deve se observar que aárea da leitura do sinal resultante da luciferina liberadaera maior do que a área de aplicação do conjugado eaumentou com o tempo indicando que o conjugado se deslocoupara dentro e lateralmente depois de ter atravessado oestrato córneo. 0 procedimento anteriormente descrito acimano Exemplo 7 foi usado para experimentos com animais.Concentrações equimolares de cada composto foram preparadoscom base na absorção de UV e sua pureza foi determinadaantes do experimento. Os animais forma tratados com Naire5-10 dias antes dos experimento.Alíquotas de 15 pL de umasolução a 5 mmol de cada composto foram aplicadas a cadaanimal 92 manchas por animal) usando-se 100 % de veículoPEG (peso molecular - 400) .NO fim de cada experimento, asamostras foram removidas dos animais e a sua pureza foideterminada. Nenhuma presença de luciferina livre foiobservada em qualquer uma das amostras.
Os conteúdos de todas as publicações, patentes,pedidos de patentes e pedidos de patentes publicadas a quese refere no presente documento por uma citação deidentificação são incorporados integralmente ao presentedocumento a título de referência.
Embora a invenção acima tenha sido descrita com certosdetalhes a título de ilustração e exemplo com a finalidadede clareza de compreensão, é evidente aos versados natécnica que determinadas alterações e modificações menoresserão colocadas em prática. Portanto, a descrição eexemplos não devem ser considerados como limitando o âmbitoda invenção.

Claims (50)

1. Composição para o transporte de uma molécula cargaatravés de uma barreira biológica caracterizada pelo fatode que compreende:uma molécula carga;uma molécula transportadora; eum ligante liberável de forma<formula>formula see original document page 137</formula>que liga covalentemente a molécula carga com amolécula transportadora;sendo Ri um grupo hidrocarboneto Ci-C8 opcionalmentesubstituído, um grupo opcionalmente substituído de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonila Ci-C8 , ou um grupo de cadeiahetero Ci-C8 opcionalmente substituído;W é -(C=O)-, -P(=0) (-0H)-, --P(=0)(-0), -P(=0) (-0~M+) -, ou -S (=0) 2-, em que M+ é um equivalente de um cátion;V é 0, NH, NR2, CH2, CHR2, C (R2) 2, ou S; em que R2 éalquila Ci-C4; eem que br é um número inteiro entre 1 e 4 inclusive eindica o número de "ramificações" no grupo Ri;ou qualquer sal, solvato ou estereoisômero dos mesmos.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que br é 1.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que o ligante liberável é deforma <formula>formula see original document page 137</formula>
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a molécula carga éselecionada do grupo que consiste em uma moléculabiologicamente ativa e uma molécula repórter.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que é da fórmula (I):<formula>formula see original document page 138</formula>em que Carg-Nu representa o resíduo de uma moléculacarga "Carg-NuH"; e Transp-S representa o resíduo de umamolécula transportadora "Transp-SH" ; ou qualquer sal,solvato ou estereoisômero seu.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que V é O.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que V é NH.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que V é CH2.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que V é S.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que Ri é alquila Ci-C8.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que V é O.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que Ri é -CH2CH2- .
13. Composição, de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que R1 é -CH2CH2CH2-.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que Ri é -CH2CH2CH2CH2-.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que -Nu- é -O-, -NH-, -NR2,-, ou -S-.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que Carg-Nu é o resíduo de umamolécula repórter.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que o resíduo de uma molécularepórter é o resíduo de luciferina.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que Carg-Nu é o resíduo de umamolécula biologicamente ativa.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que a molécula biologicamenteativa é selecionada do grupo que consiste em um fármaco, umagente terapêutico e um agente diagnóstico.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que o resíduo de uma moléculabiologicamente ativa é um resíduo de paclitaxel.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo queconsiste em: <formula>formula see original document page 139</formula><formula>formula see original document page 140</formula>e qualquer estereòisômero, sal ou solvato seu.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que o resíduo de uma moléculabiologicamente ativa é o resíduo de ciclosporina, ligada ouna hidroxila C2' ou a hidroxila C7.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo queconsiste em r8-Cys-S-S-(CH2CH2CH2)-C (=0) -O-CH2-O-C (=0) -OCsAe r8-Cys-S-S- (CH2CH2CH2CH2) -C(-0) -O-CH2-O-C (=0) -OCsA em quer8-Cys-S- indica o resíduo de acetil-D-Cys-(D-Arg) 8-NH2 e -OCsA indica o resíduo de ciclosporina A, e todos os sais,solvatos e estereoisômeros seus.
24. Método de se preparar um conjugado de uma moléculacarga "Carg-NuH" e uma molécula transportadora portando umgrupo tiol de forma "Transp-SH", caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:reagir o composto Carg-NuH, o ânion Carg-Nu(-), ou osal Carg-Nu (-) M+, em que -NuH ou -Nu (-) é uma fraçãonucleófila e M+ é um equivalente de um cátion, com umcomposto de forma Yi -W-Y2, em que Yi e Y2 são grupos desaída que podem ser iguais ou diferentes e em que W é -(C=O)-, - P (=0) ( -0H) , - P (=0) ( -0) , - -P (=0) ( -0~M+) - , -P(=0)(-O-PG)- em que PG é um grupo protetor, ou -S(=0)2-, paraformar um composto de forma:Carg-Nu-W-Y1 (IIA-gb);reagir um composto de forma (IIIA-gb)<formula>formula see original document page 141</formula>(IIIA-gb)em que Rx é um grupo hidrocarboneto C1-C8 opcionalmentesubstituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O) - hidrocarbonilaC1-C8 opcionalmente substituído, ou um grupo de cadeiahetero C1-C8 opcionalmente substituído ;V é 0, NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S; e R2 é alquilaC1-C4, em que br é um número inteiro entre 1 e 4 inclusivee indica o número de "ramificações" no grupo Ri,e TLGS é um estabilizador de grupo abandonador tiol;em que um grupo transportador porta um tiol de formaTransp-SH para formar um composto de forma (IVA-gb):<formula>formula see original document page 141</formula>(IVAgb) ;ereagir o composto (IIA-gb) com o composto (IVA-gb)para formar o conjugado da fórmula (Igb):<formula>formula see original document page 141</formula>(Igb) ;em que W é --P (=0) (-O-PG)-, é conduzida uma etapaadicional de se remover do fosfato o grupo protetor.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que br é 1.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas dereagir o composto da fórmula (IIg):<formula>formula see original document page 142</formula>em que Ri é grupo hidrocarboneto Ci-C8 opcionalmentesubstituído, um grupo de forma -CH2-O-(C=O)-hidrocarbonilaCi-C8 opcionalmente substituído, ou um grupo de cadeiahetero Ci-C8 opcionalmente substituído;V é 0, NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, OU S;TLGS é um estabilizador de grupo abandonador tiol; eR2 é alquila Ci-C4 ;com um reagente ativador de forma Y1-(C=O)-Y2 paraformar um composto da fórmula (IIIg):<formula>formula see original document page 142</formula>em que Yi e Y2 são grupos de saída e podem ser iguaisou diferentes;reagir (IIIg) com uma molécula nucleofílica de formaCarg-NuH, o ânion Carg-Nu(-), ou o sal Carg-Nu(-)M+, em que-NuH ou -Nu(-) é uma porção nucleofílica e M+ é umequivalente de um cátion, para formar um composto dafórmula (IVg): <formula>formula see original document page 142</formula>e reagir (IVg) com Transp-SH para formar o conjugadoda fórmula (I): <formula>formula see original document page 143</formula>
27. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que V é 0.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que V é NH.
29. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que V é CH2.
30. Método, de acordo com a reivindicação 26 ,caracterizado pelo fato de que V é S.
31. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que Ri é alquila Ci-C8.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que V é 0.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que Ri é -CH2 CH2- .
34. Método, de acordo com a reivindicação 32 ,caracterizado pelo fato de que Ri é -CH2 CH2CH2-.
35. Método, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que Ri é -CH2CH2CH2CH2-.
36. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que -NuH é -0H, -NH2, -NHR2, OU -SH.
37. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que -Nu ( - ) é -0(-), -NH(-) l ~NR2(-) , ou -S (-) .
38. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que M+ é Li + , Na+, K+, Mg , ou Ca+2.
39. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que TLGS é selecionado do grupoque compreende <formula>formula see original document page 144</formula>
40. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a molécula carga éselecionada do grupo que consiste em siRNA, miRNA, e shRNA.
41. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que a molécula carga éselecionada do grupo que consiste em siRNA, miRNA, e shRNA.
42. Método de se testar um conjugado transportador-ligante-carga para absorção celular e liberaçãointracelular, caracterizado pelo fato de que compreende:colocar uma célula ou amostra de tecido em contato comum conjugado de transportador-ligante-carga, sendo oligante o ligante da reivindicação 1 e sendo a carga umamolécula repórter, durante um período de tempo; edetectar a carga que foi transportada para dentro dascélulas ou do tecido cargo; sendo assim determinada aeficácia do transportador em efetuar o transporte.
43. Método de se testar um conjugado transportador-ligante-carga para absorção celular e liberaçãointracelular, caracterizado pelo fato de que compreende:colocar uma célula ou amostra de tecido em contato comum conjugado de transportador-ligante-carga, em que oconjugado é o composto de acordo com a reivindicação 5 e emque a carga é uma molécula repórter, durante um período detempo; edetectar a carga que foi transportada para dentro dascélulas ou do tecido, determinando deste modo a eficácia dotransportador de efetuar o transporte.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que a carga é luciferina.
45. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a porção "Transp-S" doconjugado compreende um lipídio.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 45,caracterizada pelo fato de que o lipídio é selecionado dogrupo que compreende ácidos graxos.
47. Composição, de acordo com a reivindicação 46,caracterizada pelo fato de que o transportador de lipídio éde forma<formula>formula see original document page 145</formula>
48. Composto, de acordo com a reivindicação 46,caracterizado pelo fato de que, a carga é ciclosporina A.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 48,caracterizada pelo fato de que é selecionado do grupo queconsiste em<formula>formula see original document page 145</formula>em que η = 6, em que η = 10, ou em que η = 14,<formula>formula see original document page 146</formula>e qualquer sal, solvato ou estereoisômero seu.
50. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que é de forma:<formula>formula see original document page 146</formula>em que V é 0, NH, NR2, CH2, CHR2, C(R2)2, ou S; e j éum número inteiro selecionado de 1 a 8 inclusive; ou<formula>formula see original document page 146</formula>em que k é um número inteiro selecionado de 0 a 8 inclusive.
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