BRPI0706699A2 - distribuição intraventricular de enzima para doenças de armazenamento lisossÈmico - Google Patents

Abstract

DISTRIBUIçãO INTRAVENTRICULAR DE ENZIMA PARA DOENçAS DE ARMAZENAMENTO LISOSSÈMICO. A presente invenção refere-se as doenças de armazenamento lisossómico que podem ser tratadas com éxito usando a distribuição intra- ventricular da enzima que é etiologicamente deficiente na doença. A administração pode ser efetuada lentamente para atingir o efeito máximo. Surpreendentemente, os efeitos são vistos sobre ambos os lados da barreira hematoencefálica, tornando este um meio de distribuição ideal para as doenças de armazenamento lisossómico que afetam tanto o cérebro quanto os órgáos viscerais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISTRIBUI-ÇÃO INTRAVENTRICULAR DE ENZIMA PARA DOENÇAS DE ARMAZE-NAMENTO LISOSSÔMICO".

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

Esta invenção está relacionada à área de doenças de armaze-namento lisossômico. Em particular, ela refere-se ao tratamento e/ou à pre-venção destas doenças por terapia de reposição de enzimas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um grupo de distúrbios metabólicos, conhecidos como doençasde armazenamento lisossômico (LSDs), inclui mais de quarenta distúrbiosgenéticos, muitos do quais envolvem defeitos genéticos em diversas hidrola-ses lisossômicas. As doenças de armazenamento lisossômico representati-vas e as enzimas defeituosas associadas são listadas na Tabela 1.

TABELA 1

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A característica distintiva das LSDs é o acúmulo anormal de me-tabólitos nos lisossomos, o que resulta na formação de grandes números delisossomos distendidos no pericário. Um desafio maior de tratar as LSDs (emoposição a tratar uma enzimopatia específica de um órgão, por exemplo,uma enzimopatia específica do fígado) é a necessidade de reverter a patolo-gia de armazenamento lisossômico nos múltiplos tecidos separados. Algu-mas LSDs podem ser tratadas efetivamente por infusão intravenosa da en-zima inexistente, conhecida como terapia de reposição de enzima (ERT).Por exemplo, os pacientes com Gaucher tipo 1 têm somente doença viscerale respondem favoravelmente à ERT com glicocerebrosidase recombinante(Cerezyme®, Genzyme Corp.). Entretanto, os pacientes com doença meta-bólica que afeta o SNC (por exemplo, a doença de Gaucher do tipo 2 ou 3)somente respondem parcialmente à ERT intravenosa, porque a enzima dereposição é impedida de entrar no cérebro pela barreira hematoencefálica(BBB). Além disso, as tentativas de introduzir uma enzima de reposição nocérebro pela injeção direta têm sido limitadas em parte devido à citotoxicida-de da enzima em altas concentrações locais e às taxas limitadas de difusãoparenquimatosa no cérebro (Partridge, Peptide Drug Delivery to the Brains,Raven Press, 1991).

Uma LSD ilustrativa é a doença de Niemann-Pick tipo A (NPA).De acordo com o registro UniProtKB/Swiss-Prot P17405, os defeitos no geneSMPD1, localizado sobre o cromossomo 11, (11p15.4-p15.1), são a causada doença de Niemann-Pick tipo A (NPA), também referida como a formainfantil clássica da doença. A doença de Niemann-Pick é um distúrbio reces-sivo clínica e geneticamente heterogêneo. Ela é causada pelo acúmulo deesfingomielina e outros lipídios metabolicamente relacionados nos Iisosso-mos, resultando na neurodegeneração que começa a partir dos primeirosanos de vida. Os pacientes podem mostrar xantomas, pigmentação, hepato-esplenomegalia, Iinfadenopatia e retardo mental. A doença de Niemann-Pickocorre mais freqüentemente entre os indivíduos de descendência de judeusasquenazes do que na população geral. A NPA é caracterizada por iníciomuito cedo na infância e um curso rapidamente progressivo, resultando namorte em três anos. A enzima ácido esfingomielinase (ASM), que é defeituo-sa na NPA, converte a esfingomielina em ceramida. A ASM também tematividades de fosfolipase C em relação à 1,2-diacilglicerolfosfocolina e ao1,2-diacilglicerolfosfoglicerol. A enzima converte

Esfingomielina + H2O N-acilesfingosina + fosfato de colina.De acordo com a presente invenção, as doenças de armazena-mento lisossômico, tais como quaisquer das doenças identificadas na Tabela1 acima, por exemplo, a doença de Niemann-Pick tipo A ou B, são tratadase/ou prevenidas usando distribuição intraventricular, para o cérebro, da en-zima, a qual é etiologicamente deficiente na doença. A administração podeser efetuada lentamente para atingir o efeito máximo. Os efeitos são vistossobre ambos os lados da barreira hematoencefálica, tornando este um meiode distribuição útil para as doenças de armazenamento lisossômico que afe-tam o cérebro e/ou os órgãos viscerais. Em um primeiro aspecto, a invenção,assim, proporciona um método de tratar ou prevenir uma doença de arma-zenamento lisossômico em um paciente, doença esta que é causada poruma deficiência da enzima, o método compreendendo administrar a enzimaao paciente, por meio de distribuição intraventricular para o cérebro. Em umaspecto relacionado, a invenção proporciona o uso de uma enzima para afabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de umadoença de armazenamento lisossômico em um paciente, doença esta que écausada por uma deficiência da enzima no paciente, onde o tratamento ou aprevenção compreende a administração intraventricular da enzima ao cére-bro. A deficiência da enzima pode ser causada, por exemplo, por um defeitona expressão da enzima ou por uma mutação na enzima, o que resulta emum nível reduzido de atividade (por exemplo, a enzima estando inativa) ouem uma taxa aumentada de depuração/decomposição da enzima in vivo. Adeficiência pode resultar em um acúmulo de um substrato da enzima e aadministração da enzima pode resultar em uma redução no nível do substra-to no cérebro. A doença de armazenamento lisossômico pode ser quaisquerdas doenças identificadas na Tabela 1 acima. A enzima pode ser uma hidro-lase lisossômica.

De acordo com uma modalidade da invenção, um paciente coma doença de Niemann-Pick A ou B é tratado. Um ácido esfingomielinase éadministrada ao paciente, por meio de distribuição intraventricular para océrebro, em uma quantidade suficiente para reduzir os níveis de esfingomie-lina no dito cérebro.

Um outro aspecto da invenção é um kit para tratar ou preveniruma doença de armazenamento lisossômico em um paciente, doença estaque é causada por uma deficiência de enzima. O kit compreende a enzimaque é deficiente, e uma sonda e/ou bomba para a distribuição da enzimapara um ou mais ventrículos no cérebro. A sonda e/ou a bomba podem serespecificamente projetadas e/ou adaptadas para a distribuição intraventricu-lar. De acordo com uma modalidade, a invenção proporciona um kit paratratar um paciente com a doença de Niemann-Pick A ou Β. O kit compreendeum ácido esfingomielinase, e uma sonda para a distribuição do dito ácidoesfingomielinase para os ventrículos cerebrais do paciente.

Mais um outro aspecto da invenção é um kit para tratar um paci-ente com a doença de Niemann-Pick A ou Β. O kit compreende um ácidoesfingomielinase e uma bomba para a distribuição do dito ácido esfingomie-linase para os ventrículos cerebrais do paciente.

De acordo com a invenção, um paciente pode ser tratado, o qualtem uma doença de armazenamento lisossômico que é causada por umadeficiência de enzima, o que resulta no acúmulo do substrato da enzima.Tais doenças incluem a doença de Gaucher, as doenças de MPS I e II, adoença de Pompe, e a doença de Batten (CLN2), entre outras. A enzimadefeituosa na doença particular é administrada ao paciente por meio de dis-tribuição intraventricular para o cérebro. Ela pode ser administrada aos ven-trículos laterais e/ou ao quarto ventrículo. A taxa de administração da enzimade acordo com a presente invenção é tal que a administração de uma únicadose pode ser como um bolo ou pode levar cerca de 1-5 minutos, cerca de5-10 minutos, cerca de 10-30 minutos, cerca de 30-60 minutos, cerca de 1-4horas, ou consome mais do que quatro, cinco, seis, sete, ou oito horas. Osníveis de substrato no dito cérebro podem, desse modo, ser reduzidos. Aadministração de uma única dose pode levar mais do que 1 minuto, mais doque 2 minutos, mais do que 5 minutos, mais do que 10 minutos, mais do que20 minutos, mais do que 30 minutos, mais do que 1 hora, mais do que 2 ho-ras, ou mais do que 3 horas.

Estas e outras modalidades que serão aparentes para aquelesde habilidade na técnica com a leitura do relatório descritivo proporcionam àtécnica métodos e kits para o tratamento e/ou a prevenção de doenças dearmazenamento lisossômico, em particular aquelas que envolvem patologiastanto do SNC quanto viscerais.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra o diagrama das secções do cérebro que foramanalisadas quanto à esfingomielina. S1 está na frente do cérebro e S5 estána parte posterior do cérebro.

A Figura 2 mostra que a administração intraventricular de rhASMreduz os níveis de SPM no cérebro de camundongo ASMKO

A Figura 3 mostra que a administração intraventricular de rhASMreduz os níveis de SPM no fígado, baço, e pulmão de ASMKO.

A Figura 4 mostra a coloração de hASM no cérebro após a infu-são intraventricular.

A Figura 5 mostra que a infusão intraventricular de rhASM du-rante um período de 6 h reduz os níveis de SPM no cérebro de camundongoASMKO.

A Figura 6 mostra que a infusão intraventricular de rhASM du-rante um período de 6 h reduz os níveis de SPM no fígado, soro, e pulmãode ASMKO.

A Figura 7 mostra variantes de hASM documentadas e a suarelação com a doença ou a atividade da enzima.

A Figura 8 mostra uma vista em seção transversal do cérebrocom os ventrículos indicados.

As Figuras 9A e 9B mostram as vistas laterais e superiores, res-pectivamente, dos ventrículos.

A Figura 10 mostra a injeção nos ventrículos laterais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A prática da presente invenção empregará, a não ser que deoutro modo indicado, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecu-lar, microbiologia, biologia da célula e DNA recombinante, que estão dentroda habilidade da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis,MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2â edição (1989);CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, e col.eds., (1987)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.):PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R.Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORA-TORY MANUAL, e ANIMAL CELL CULTURE (R.l. Freshney, ed. (1987)).

Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, asformas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências plurais, a nãoser que o contexto claramente dite de outro modo. Por exemplo, o termo "u-ma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo as suas misturas.

Conforme usado neste documento, o termo "compreendendo" épretendido significar que as composições e os métodos incluem os elemen-tos citados, porém não excluindo os outros. "Consistindo essencialmenteem", quando usado para definir as composições e os métodos, significaráexcluindo os outros elementos de qualquer significado essencial para acombinação. Assim, uma composição consistindo essencialmente nos ele-mentos como definidos aqui não excluiria os contaminantes em traço a partirdo método de isolamento e purificação e os veículos farmaceuticamente a-ceitáveis, tais como a solução salina tamponada com fosfato, os conservan-tes, e similares. "Consistindo em" significará excluindo mais do que os ele-mentos em traço dos outros ingredientes e excluindo as etapas substanciaisdos métodos para administrar a composição ou os medicamentos de acordocom esta invenção. As modalidades definidas por cada um destes termos detransição estão dentro do escopo desta invenção.

Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura,tempo, concentração, e peso molecular, incluindo as faixas, são aproxima-ções que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 0,1. É para ser entendi-do, embora nem sempre explicitamente expresso, que todas as designaçõesnuméricas são precedidas pelo termo "cerca de". Também é para ser enten-dido, embora nem sempre explicitamente expresso, que os reagentes descri-tos neste documento são meramente ilustrativos e que os equivalentes detais, que são conhecidos na técnica, podem também ser usados.

Os termos "terapêutica", "quantidade terapeuticamente efetiva",e seus cognatos referem-se àquela quantidade de uma substância, por e-xemplo, a enzima ou a proteína, que resulta na prevenção ou no retardo doinício, ou na melhora, de um ou mais sintomas de uma doença em um paci-ente, ou em uma obtenção de um resultado biológico desejado, tal como acorreção da neuropatologia. O termo "correção terapêutica" refere-se àquelegrau de correção que resulta na prevenção ou no retardo do início, ou namelhora, de um ou mais sintomas em um paciente. A quantidade efetiva po-de ser determinada por métodos empíricos conhecidos.

Uma "composição" ou "medicamento" é pretendido incluir umacombinação de um agente ativo, por exemplo, uma enzima, e um veículo ououtro material, por exemplo, um composto ou composição, que seja inerte(por exemplo, um agente detectável ou marca) ou ativo, tal como um adju-vante, diluente, aglutinante, estabilizante, tampão, sal, solvente lipofílico,conservante, adjuvante ou similar, ou uma mistura de duas ou mais destassubstâncias. Os veículos são, de preferência, farmaceuticamente aceitáveis.Eles podem incluir excipientes e aditivos farmacêuticos, proteínas, peptídeos,aminoácidos, lipídios, e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo osmonossacarídeos, os di-, tri-, tetra-, e oligossacarídeos, os açúcares deriva-dos, tais como os alditóis, os ácidos aldônicos, os açúcares esterificados esimilares; e os polissacarídeos ou polímeros de açúcares), que podem estarpresentes individualmente ou em combinação, compreendendo sozinhos ouem combinação 1 -99,99% em peso ou volume. Os excipientes de proteínasilustrativos incluem a soro albumina, tal como a soro albumina humana(HSA), a albumina humana recombinante (rHA), a gelatina, a caseína, e si-milares. Os componentes de aminoácidos/anticorpos representativos, osquais podem também funcionar em uma capacidade de tamponamento, in-cluem a alanina, a glicina, a arginina, a betaína, a histidina, o ácido glutâmi-co, o ácido aspártico, a cisteína, a lisina, a leucina, a isoleucina, a valina, ametionina, a fenilalanina, o aspartame, e similares. Os excipientes de car-boidratos são também pretendidos dentro do escopo desta invenção, cujosexemplos incluem, porém não estão limitados aos, monossacarídeos, taiscomo a frutose, a maltose, a galactose, a glicose, a D-manose, a sorbose, esimilares; dissacarídeos, tais como a lactose, a sacarose, a trealose, a celo-biose, e similares; polissacarídeos, tais como a rafinose, a melezitose, asmaltodextrinas, as dextranas, os amidos, e similares; e alditóis, tais comomanitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) e mioinositol.

O termo veículo também inclui um tampão ou um agente de a-juste de pH ou uma composição contendo o mesmo; tipicamente, o tampãoé um sal preparado a partir de um ácido ou uma base orgânica. Os tampõesrepresentativos incluem os sais de ácidos orgânicos, tais como os sais deácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glicônico, ácido carbônico, ácido tartári-co, ácido succínico, ácido acético, ou ácido itálico, o Tris, o cloridrato detrometamina, ou os tampões de fosfato. Os veículos adicionais incluem osexcipientes/aditivos poliméricos, tais como as polivinilpirrolidonas, os ficóis(um açúcar polimérico), os dextratos (por exemplo, as ciclodextrinas, taiscomo a 2-hidroxipropil-.quadratura.-ciclodextrina), os polietileno glicóis, osagentes aromatizantes, os agentes antimicrobianos, os adoçantes, os antio-xidantes, os agentes antiestáticos, os tensoativos (por exemplo, os polissor-batos, tais como o "TWEEN 20" e o "TWEEN 80"), os lipídios (por exemplo,os fosfolipídios, os ácidos graxos), os esteróides (por exemplo, o colesterol),e os agentes quelantes (por exemplo, o EDTA).

Conforme usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente acei-tável" inclui quaisquer dos veículos farmacêuticos padrão, tais como umasolução salina tamponada com fosfato, a água, e as emulsões, tais como aemulsão de óleo/água ou de água/óleo, e os diversos tipos de agentes u-mectantes. As composições e os medicamentos que são fabricados e/ouusados de acordo com a presente invenção, e que incluem a enzima particu-lar cuja deficiência é para ser corrigida, podem incluir estabilizantes e con-servantes e quaisquer dos veículos acima observados, com a condição adi-cional que eles sejam aceitáveis para uso in vivo. Quanto aos exemplos deveículos, estabilizantes e adjuvantes, ver Martin REMINGTON'S PHARM.SCI., 15ª Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975) e Williams e Williams, (1995), eno "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 52â ed., Medicai Economics,Montyvale, N.J. (1998).

Um "paciente", "indivíduo" ou "doente" é usado de modo inter-cambiável neste documento, que refere-se a um vertebrado, preferivelmenteum mamífero, mais preferivelmente um ser humano. Os mamíferos incluem,porém não estão limitados aos, camundongos, ratos, macacos, seres huma-nos, animais da fazenda, animais de esportes, e animais de estimação.

Conforme usado neste documento, o termo "modular" significavariar a quantidade ou a intensidade de um efeito ou resultado, por exemplo,intensificar, aumentar, diminuir ou reduzir.

Conforme usado neste documento, o termo "melhorar" é sinôni-mo de "aliviar" e significa reduzir ou suavizar. Por exemplo, pode-se melho-rar os sintomas de uma doença ou distúrbio tornando-os mais suportáveis.

Quanto à identificação das estruturas no cérebro humano, ver,por exemplo, The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Ana-tomy With MRI, and Blood Supply, 2- ed., eds., Deuteron e col., Springer Ve-la, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai e col., Academic Press; 1997; eCo-Planar Stereotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional ProportionalSystem: An Approach to Cerebral lmaging, eds. Tamarack e col., ThymeMedicai Pub., 1988. Quanto à identificação das estruturas no cérebro docamundongo, ver, por exemplo, The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates,2- ed., Academic Press, 2000.

Os inventores descobriram que a distribuição intraventricular,para o cérebro, das enzimas hidrolases lisossômicas, aos pacientes que es-tejam deficientes nas enzimas, resulta no status metabólico melhorado tantodo cérebro quanto dos órgãos viscerais (que não o SNC) afetados. Isto éparticularmente verdadeiro quando a taxa de distribuição for lenta, em rela-ção a uma distribuição de bolo. As doenças de armazenamento lisossômicocausadas por uma deficiência em uma enzima particular, tais como aquelasdoenças identificadas na Tabela 1 acima, podem, portanto, ser tratadas ouprevenidas pela administração intraventricular da enzima respectiva. Umaenzima particularmente útil para tratar Niemann-Pick A ou B é o ácido esfin-gomielinase (ASM), tal como aquela mostrada na SEQ ID NO: 1.1 Uma en-zima particularmente útil para tratar a doença de Gaucher é a glicocerebro-sidase. Uma enzima particularmente útil para tratar a doença de MPS I é aalfa-L-iduronidase. Uma enzima particularmente útil para tratar a doença deMPS Il é a iduronato-2-sulfatase. Uma enzima particularmente útil para tratara doença de Pompe, ou a doença de armazenamento do glicogênio tipo Il(GSDII), também chamada deficiência de ácido maltase (AMD), é o ácidoalfa-glicosidase. Uma enzima particularmente útil para tratar a doença deBatten infantil tardia clássica (CLN2) é a tripeptidil peptidase. As enzimasque são usadas e/ou administradas de acordo com a presente invenção po-dem ser as formas recombinantes das enzimas, as quais são produzidasusando métodos que são bastante conhecidos na técnica. Em uma modali-dade, a enzima é uma enzima humana recombinante.

A administração de enzimas lisossômicas, e mais particularmen-te das enzimas hidrolases lisossômicas, aos pacientes que estão deficientesnas enzimas pode ser efetuada em qualquer um ou mais dos ventrículos docérebro, os quais estão cheios com líquido cerebroespinhal (CSF). O CSF éum líquido claro que enche os ventrículos, está presente no espaço suba-racnóide, e circunda o cérebro e o cordão espinhal. O CSF é produzido pe-los plexos coróides e por meio de derramamento ou a transmissão de líquidotecidual pelo cérebro para os ventrículos. O plexo coróide é uma estruturaque reveste a base do ventrículo lateral e a raiz do terceiro e do quarto ven-trículos. Certos estudos indicaram que estas estruturas são capazes de pro-duzir 400-600 ccs de líquido por dia, consistentes com uma quantidade paraencher os espaços do sistema nervoso central quatro vezes em um dia. Nosadultos, o volume deste líquido foi calculado ser de 125 a 150 ml (4-5 oz). OCSF está em formação, circulação e absorção contínuas. Certos estudosindicaram que aproximadamente 430 a 450 ml (quase 2 xícaras) de CSFpodem ser produzidos todo dia. Certos cálculos estimam que a produção éigual a aproximadamente 0,35 ml por minuto, em adultos, e 0,15 por minutoem crianças. Os plexos coróides dos ventrículos laterais produzem a maiorparte do CSF. Ele flui através dos forames de Monro para o terceiro ventrícu-lo, onde é agregado por produção a partir do terceiro ventrículo, e continuapara baixo, através do aqueduto de Sylvius, até o quarto ventrículo. O quartoventrículo agrega mais CSF; o líquido então se desloca para o espaço suba-racnóide através dos forames de Magendie e Luschka. Ele então circula portoda a base do cérebro, para baixo em torno do cordão espinhal e para cimasobre os hemisférios cerebrais. O CSF desemboca no sangue por meio dasvilosidades aracnóides e os seios vasculares intracranianos, desse mododistribuindo as enzimas que estão infundidas nos ventrículos não somentepara o cérebro, como também para os órgãos viscerais que sejam sabidosser afetados nas LSDs.

Embora uma seqüência de aminoácidos particular seja mostradaem SEQ ID NO: 1, as variantes desta seqüência que conservam a atividade,por exemplo, as variantes normais na população humana, podem ser usadastambém. Tipicamente, estas variantes normais diferem por somente um oudois resíduos a partir da seqüência mostrada em SEQ ID NO: 1. As varian-tes de SEQ ID NO: 1 que são para serem usadas de acordo com a presenteinvenção, quer sejam de ocorrência natural, quer não sejam, devem ser pelomenos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas à SEQ ID NO: 1. As varian-tes de outras enzimas podem ser usadas de acordo com a presente inven-ção. Entretanto, independente da enzima que for usada, as variantes queestejam associadas com doença ou atividade reduzida não devem ser usa-das. Tipicamente, a forma madura da enzima será distribuída. No caso deSEQ ID NO: 1, a forma madura começará com o resíduo 47, conforme mos-trado na SEQ ID NO: 1. As variantes que estão associadas com doença sãomostradas na Figura 7. Em um modo similar, as variantes normais na popu-lação humana de tais enzimas de LSDs1 como a glicocerebrosidase, a alfa-L-lduronidase, a iduronato-2-sulfatase, o ácido alfa-glicosidase, e a tripeptidilpeptidase, que conservam a atividade enzimática, podem ser usadas também.

Os kits de acordo com a presente invenção são ajuntamentos decomponentes separados. Embora eles possam ser embalados em um únicorecipiente, eles podem ser subembalados separadamente. Mesmo um únicorecipiente pode ser dividido em compartimentos. Tipicamente, uma série deinstruções acompanhará o kit e proporcionará instruções para a distribuiçãodas enzimas, por exemplo, das enzimas hidrolases lisossômicas, de modointraventricular. As instruções podem ser na forma impressa, na forma ele-trônica, como um vídeo instrucional ou DVD, em um disco compacto, em umdisquete, na internet com um endereço proporcionado na embalagem, ouuma combinação destes meios. Outros componentes, tais como os diluentes,os tampões, os solventes, a fita, os parafusos, e as ferramentas de manu-tenção, podem ser proporcionados além da enzima, uma ou mais cânulas ousondas, e/ou uma bomba.

As populações tratadas pelos métodos da invenção incluem, po-rém não estão limitadas aos pacientes que têm, ou que estão correndo orisco de desenvolver, um distúrbio neurometabólico, por exemplo, uma LSD,tal como as doenças listadas na Tabela 1, particularmente se tal doença afe-tar o SNC e os órgãos viscerais. Em uma modalidade ilustrativa, a doença éa doença de Niemann-Pick do tipo A.

Uma ASM ou outra enzima hidrolase lisossômica pode ser in-corporada em uma composição farmacêutica útil para tratar, por exemplo,inibir, atenuar, prevenir, ou melhorar, uma condição caracterizada por umnível insuficiente de uma atividade de hidrolase lisossômica. A composiçãofarmacêutica será administrada a um paciente sofrendo de uma deficiênciade hidrolase lisossômica ou alguém que esteja correndo o risco de desen-volver a dita deficiência. As composições devem conter uma quantidade te-rapêutica ou profilática da ASM ou outra enzima hidrolase lisossômica, emum veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo farmacêutico pode serqualquer substância não-tóxica, compatível, adequada para distribuir os po-lipeptídeos para o paciente. A água estéril, o álcool, as gorduras, e as ceraspodem ser usados como o veículo. Os adjuvantes, os agentes de tampona-mento, os agentes dispersantes, e similares, farmaceuticamente aceitáveis,podem também ser incorporados nas composições farmacêuticas. O veículopode ser combinado com a ASM ou outra enzima hidrolase lisossômica emqualquer forma adequada para a administração por injeção ou infusão intra-ventricular (forma esta que é também possivelmente adequada para a admi-nistração intravenosa ou intratecal) ou de outro modo. Os veículos adequa-dos incluem, por exemplo, a solução salina fisiológica, a água bacteriostática,o Cremophor EL.TM (BASF, Parsippany, N.J.) ou a solução salina tampona-da com fosfato (PBS), outras soluções salinas, as soluções de dextrose, assoluções de glicerol, a água e as emulsões de óleos, tais como aquelas pre-paradas com óleos de origem de petróleo, animal, vegetal, ou sintética (óleode amendoim, óleo de soja, óleo mineral, ou óleo de gergelim). Um CSF arti-ficial pode ser usado como um veículo. O veículo preferível mente será estérile isento de pirogênios. A concentração da ASM ou de outra enzima hidrola-se lisossômica na composição farmacêutica pode variar amplamente, isto é,de pelo menos cerca de 0,01% em peso, a 0,1% em peso, a cerca de 1%em peso, a tanto quanto 20% em peso ou mais da composição total.

Para a administração intraventricular da ASM ou de outra enzi-ma hidrolase lisossômica, a composição deve ser estéril e deve ser fluida.Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e deveser conservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais comoas bactérias e os fungos. A prevenção da ação de microorganismos podeser obtida por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo,os parabenos, o clorobutanol, o fenol, o ácido ascórbico, o timerosal, e simi-lares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exem-plo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio, nacomposição.

A dosagem da ASM ou de outra enzima hidrolase lisossômicapode variar um pouco de indivíduo para indivíduo, dependendo da enzimaparticular e de sua atividade in vivo específica, da rota de administração, dacondição médica, idade, peso ou sexo do paciente, das sensibilidades dopaciente à ASM ou outra enzima hidrolase lisossômica ou aos componentesdo veículo, e de outros fatores que o médico assistente será capaz de pron-tamente levar em consideração. Embora as dosagens possam variar depen-dendo da doença e do paciente, a enzima é geralmente administrada ao pa-ciente em quantidades de cerca de 0,1 a cerca de 1000 miligramas por 50 kgde paciente, por mês. Em uma modalidade, a enzima é administrada ao pa-ciente em quantidades de cerca de 1 a cerca de 500 miligramas por 50 kg depaciente, por mês. Em outras modalidades, a enzima é administrada ao pa-ciente em quantidades de cerca de 5 a cerca de 300 miligramas por 50 kg depaciente, por mês, ou cerca de 10 a cerca de 200 miligramas por 50 kg depaciente, por mês.

A taxa de administração é tal que a administração de uma únicadose pode ser administrada como um bolo. Uma única dose pode tambémser infundida durante cerca de 1-5 minutos, cerca de 5-10 minutos, cerca de10-30 minutos, cerca de 30-60 minutos, cerca de 1-4 horas, ou consomemais do que quatro, cinco, seis, sete, ou oito horas. Ela pode levar mais doque 1 minuto, mais do que 2 minutos, mais do que 5 minutos, mais do que10 minutos, mais do que 20 minutos, mais do que 30 minutos, mais do que 1hora, mais do que 2 horas, ou mais do que 3 horas. Os Requerentes obser-varam que, embora a administração intraventricular de bolo possa ser efetiva,a infusão lenta é muito efetiva. Embora as requerentes não queiram estarligados por qualquer teoria particular de operação, acredita-se que a infusãolenta seja mais efetiva devido à renovação do líquido cerebroespinhal (CSF).Embora as estimativas e os cálculos na literatura variem, o líquido cerebro-espinhal é acreditado renovar-se dentro de cerca de 4, 5, 6, 7, ou 8 horasnos seres humanos. Em uma modalidade, o tempo de infusão lenta da in-venção deve ser medido de modo que ele seja aproximadamente igual ao,ou maior do que o, tempo de renovação do CSF. O tempo de renovação po-de depender da espécie, do tamanho, e da idade do paciente, porém podeser determinado usando métodos conhecidos na técnica. A infusão podetambém ser contínua durante um período de um ou mais dias. O pacientepode ser tratado uma, duas, ou três ou mais vezes ao mês, por exemplo,semanalmente, por exemplo, de duas em duas semanas. As infusões podemser repetidas durante o curso de vida de um paciente, conforme ditado peloacúmulo novamente de substrato da doença no cérebro ou nos órgãos vis-cerais. O acúmulo novamente pode ser determinado por quaisquer das prá-ticas que são bem conhecidas na técnica para a identificação e a quantiza-ção do substrato relevante, práticas estas que podem ser efetuados sobreuma ou mais amostras retiradas do cérebro e/ou de um ou mais dos órgãosviscerais. Tais práticas incluem os ensaios enzimáticos e/ou os imunoensai-os, por exemplo, os radioimunoensaios ou os ELISAs.O CSF desemboca no sangue por meio das vilosidades aracnói-des e os seios vasculares intracranianos, desse modo distribuindo as enzi-mas infundidas para os órgãos viscerais que sejam sabidos ser afetados nasLSDs. Os órgãos viscerais que são freqüentemente afetados na doença deNiemann-Pick são os pulmões, o baço, o rim, e o fígado. A infusão intraven-tricular lenta proporciona quantidades diminuídas do substrato para uma en-zima administrada pelo menos no cérebro e potencialmente nos órgãos vis-cerais. A redução no substrato acumulado no cérebro, nos pulmões, no baço,no rim, e/ou no fígado pode ser dramática. Podem ser atingidas reduções demais do que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. A reduçãoatingida não é necessariamente uniforme de paciente para paciente oumesmo de órgão para órgão dentro de um único paciente. As reduções po-dem ser determinadas por quaisquer das práticas que são bastante conheci-das na técnica, por exemplo, por ensaios enzimáticos e/ou técnicas de imu-noensaio, conforme discutidas alhures neste documento.

Se desejado, a estrutura do cérebro humano pode ser correla-cionada a estruturas similares no cérebro de um outro mamífero. Por exem-plo, a maioria dos mamíferos, incluindo os seres humanos e os rodentes,mostra uma organização topográfica similar das projeções entorrinal-hipocampo, com os neurônios na parte lateral dos córtices entorrinais tantolaterais quanto mediais se projetando para a parte dorsal ou pólo septal dohipocampo, enquanto que a projeção para o hipocampo ventral origina-seprincipalmente de neurônios nas partes mediais do córtex entorrinal (Princi-pies of Neural Science, A- ed., eds Kandel e col., McGraw-HilI, 1991; TheRat Nervous Ssytem, 2- ed., eds. Paxinos, Academic Press, 1995). Alémdisso, as células da camada Il do córtex entorrinal projetam-se para o girodenteado, e elas terminam nos dois terços externos da camada molecular dogiro denteado. Os axônios das células da camada Ill projetam-se bilateral-mente para as áreas do corno de Ammon CA1 e CA3 do hipocampo, termi-nando na camada molecular com fendas do estrato.

Em uma modalidade ilustrativa, a administração é efetuada porinfusão da enzima da LSD em um ou ambos os ventrículos laterais de umpaciente ou doente. Pela infusão nos ventrículos laterais, a enzima é distri-buída para o local no cérebro no qual a maior quantidade de CSF é produzi-da. A enzima pode também ser infundida em mais do que um ventrículo docérebro. O tratamento pode consistir em uma única infusão por local-alvo, oupode ser repetido. Podem ser usados locais múltiplos de infusão/injeção. Porexemplo, os ventrículos nos quais se administra a enzima podem incluir osventrículos laterais e o quarto ventrículo. Em algumas modalidades, além doprimeiro local de administração, uma composição contendo a enzima deLSD é administrada a um outro local que pode ser contralateral ou ipsilateralao primeiro local de administração. As injeções/infusões podem ser únicasou múltiplas, unilaterais ou bilaterais.

Para distribuir a solução ou outra composição contendo a enzi-ma especificamente para uma região particular do sistema nervoso central,tal como para um ventrículo particular, por exemplo, para os ventrículos Iate-rais ou para o quarto ventrículo do cérebro, ela pode ser administrada pormicroinjeção estereotática. Por exemplo, no dia da cirurgia, os pacientes te-rão a base da estrutura estereotática fixada no local (aparafusada no crânio).O cérebro com a base da estrutura estereotática (compatível com o MRI,com marcas fiduciárias) será representado por imagens usando MRI de altaresolução. As imagens do MRI então serão transferidas para um computadorque executa um software estereotático. Uma série de imagens coronais, sa-gitais e axiais será usada para determinar o local-alvo de injeção do vetor, ea trajetória. O software diretamente converte a trajetória em coordenadastridimensionais, apropriadas para a estrutura estereotática. Os orifícios dotrépano são perfurados acima do local de entrada e o aparelho estereotáticolocalizado com a agulha implantada na profundidade dada. A solução deenzima em um veículo farmaceuticamente aceitável então será injetada. Po-dem ser usadas rotas adicionais de administração, por exemplo, aplicaçãocortical superficial sob visualização direta, ou outra aplicação não-estereo-tática.

Um modo para distribuir uma infusão lenta é usar uma bomba.Tais bombas estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Alzet (Cu-pertino, CA) ou Medtronic (Minneapolis, MN). A bomba pode ser implantável.Um outro modo conveniente de administrar as enzimas é usar uma cânulaou uma sonda. A cânula ou sonda pode ser usada para administrações múl-tiplas, separadas no tempo. As cânulas e as sondas podem ser implantadasde modo estereotático. Contempla-se que a administração múltipla será u-sada para tratar o paciente típico com uma doença de armazenamento Iisos-sômico. As sondas e as bombas podem ser usadas separadamente ou emcombinação.

A doença de armazenamento lisossômico (LSD) inclui mais déquarenta distúrbios genéticos, muitos dos quais envolvem defeitos genéticosem diversas hidrolases lisossômicas. As doenças de armazenamento lisos-sômico representativas e as enzimas defeituosas associadas estão listadasna Tabela 1.

A doença de Gaucher resulta como uma conseqüência de umadeficiência herdada da hidrolase lisossômica glicocerebrosidase (GC), resul-tando no acúmulo de seu substrato, a glicosilceramida (GL-1), nos Iisosso-mos dos histiócitos. O acúmulo progressivo da GL-1 nos macrófagos tecidu-ais (células de Gaucher) ocorre em diversos tecidos. O grau do acúmulo édependente em parte do genótipo. Clinicamente, três fenótipos de Gaucherdiferentes são reconhecidos, o tipo 1 não neuropático, que é o mais comum,com início variando da primeira infância até a fase adulta, e os tipos 2 e 3neuropáticos, apresentando-se na infância e primeira infância, respectiva-mente. Quaisquer destes fenótipos podem ser tratados de acordo com apresente invenção. As manifestações clínicas primárias comuns para todasas formas da doença de Gaucher são hepatoesplenomegalia, citopenia, fra-turas ósseas patológicas e, ocasionalmente, insuficiência pulmonar. Umadiscussão detalhada da doença de Gaucher pode ser encontrada no OnlineMetabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases, Parte 16, Capítulo 146 e146.1 (2007). Nos pacientes com a doença de Gaucher tipo 2 e tipo 3, emque há um envolvimento significativo do sistema nervoso central, a distribui-ção intraventricular da enzima defeituosa da LSD resulta no status metabóli-co melhorado do cérebro e potencialmente dos órgãos viscerais (que não oSNC) afetados. A distribuição intraventricular da enzima defeituosa da LSDnos pacientes com doença de Gaucher tipo 1 resulta no status metabólicomelhorado dos órgãos viscerais (que não o SNC) afetados. Existem modelosde animais da doença de Gaucher, os quais se derivaram de modelos decamundongos criados por rompimento alvejado do gene de camundongocorrespondente. Por exemplo, existe um modelo de camundongo de Gau-cher abrigando a mutação D409V no lócus da GC do camundongo (Xu, Y-He col. (2003). Am. J. Pathol. 163:2093-2101). O camundongo heterozigoto,gbaD4O9V/null, exibe ~ 5% de atividade da GC normal nos tecidos visceraise desenvolve macrófagos abarrotados de lipídios (células de Gaucher) nofígado, baço, pulmão e medula óssea pelos 4 meses de idade. Este modeloé um sistema adequado para avaliar os benefícios da, e determinar as con-dições para a, distribuição intraventricular da enzima defeituosa da LSD empacientes com a doença de Gaucher.

A doença de Niemann-Pick (NPD) é uma doença de armazena-mento lisossômico e é um distúrbio neurometabólico herdado, caracterizadopor uma deficiência genética na ácido esfingomielinase (ASM; esfingomielinacolinafosfoidrolase, BC 3.1.3.12). A ausência da proteína ASM funcional re-sulta no acúmulo do substrato de esfingomielina dentro dos Iisossomos deneurônios e glia por todo o cérebro. Isto resulta na formação de grandesnúmeros de Iisossomos distendidos no pericário, que são uma característicadistintiva, e no fenótipo celular primário da NPD do tipo A. A presença delisossomos distendidos correlaciona-se com a perda de função celular nor-mal e um curso neurodegenerativo progressivo que resulta na morte do indi-víduo afetado na primeira infância (The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Diseases, eds. Scriver e col., McGraw-HiII, Nova York, 2001, pp.3589-3610). Os fenótipos celulares secundários (por exemplo, anormalida-des metabólicas adicionais) estão também associados com esta doença,notavelmente o acúmulo em alto nível de colesterol no compartimento Iisos-sômico. A esfingomielina tem forte afinidade pelo colesterol, o que resulta noseqüestro de grandes quantidades de colesterol nos Iisossomos de camun-dongos ASMKO e pacientes humanos (Leventhal e col. (2001) J. Biol. Chem.,276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem., 28:277-293; e Viana ecol., (1990) J. Med. Genet., 27:499-504). Uma discussão detalhada da doen-ça NPD pode ser encontrada no Online Metabolic & Molecular Bases of I-nherited Diseases, Parte 16, Capítulo 144 (2007). Existem modelos de ani-mais da NPD. Por exemplo, os camundongos ASMKO são um modelo aceitoda doença de Niemann-Pick dos tipos AeB (Horinouchi e col. (1995) Nat.Genetics, 10:288-293; Jin e col. (2002) J. Clin. Invest., 109:1183-1191; e Ot-terbach (1995) Cell, 81:1053-1061). A distribuição intraventricular da enzimadefeituosa da LSD resulta no status metabólico melhorado do cérebro e dosórgãos viscerais (que não o SNC) afetados.

As mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de distúrbios dearmazenamento lisossômico por deficiências de enzimas que catalisam adegradação dos glicosaminoglicanos (mucopolissacarídeos). Existem 11deficiências de enzimas conhecidas que dão surgimento a 7 MPS distintas,incluindo as MPS I (Síndromes de Hurler, de Scheie, e de Hurler-Scheie) eas MPS Il (Síndrome de Hunter). Quaisquer MPS podem ser tratadas de a-cordo com a presente invenção. Uma discussão detalhada das MPS podeser encontrada no Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases,Parte 16, Capítulo 136 (2007). Existem diversos modelos de animais dasMPS, que se derivaram de mutações de ocorrência natural em cães, gatos,ratos, camundongos, e cabras, bem como modelos de animais criados porrompimento alvejado do gene de camundongo correspondente. As caracte-rísticas bioquímicas e metabólicas destes modelos de animais são geral-mente bem similares àquelas encontradas nos seres humanos; entretanto,as apresentações clínicas podem ser mais brandas. Por exemplo, os mode-los aceitos para as MPS I incluem um modelo de murino [Clark, LA e col.,Hum, Mol. Genet. (1997), 6:503] e um modelo canino [Menon, KP e col., Ge-nomics (1992), 14:763]. Por exemplo, os modelos aceitos para as MPS Ilincluem um modelo de camundongo [Muenzer, J. e col., (2002), Acta Pae-diatr. Suppl.: 91(439):98-9]. Nas MPS que tenham envolvimento do sistemanervoso central, tal como é verificado em pacientes com as MPS I e as MPSII, a distribuição intraventricular da enzima defeituosa da LSD resulta no sta-tus metabólico melhorado do cérebro e potencialmente dos órgãos viscerais(que não o SNC) afetados.

A doença de Pompe, ou doença de armazenamento do glicogê-nio tipo Il (GSDII), também chamada deficiência de ácido maltase (AMD), éum distúrbio herdado do metabolismo do glicogênio que resulta de defeitosna atividade da hidrolase lisossômica ácido alfa-glicosidase em todos os te-cidos dos indivíduos afetados. A deficiência de enzima resulta no acúmulointralissossômico de glicogênio de estrutura normal em diversos tecidos. Oacúmulo é mais no músculo cardíaco e esquelético e nos tecidos hepáticosde crianças com o distúrbio generalizado. Na GSDII de início tardio, o acú-mulo intralissossômico de glicogênio está virtualmente limitado ao músculoesquelético e é de magnitude menor. As anormalidades eletromiográficassugestivas da diagnose incluem as descargas pseudomiotônicas e a irritabi-lidade, porém em pacientes com início na juventude e na fase adulta, as a-normalidades podem variar em diferentes músculos. As varreduras por CATpodem descrever o(s) local(is) dos músculos afetados. A maioria dos pacien-tes tem níveis elevados de creatinina cinase (CK) no plasma sangüíneo, e aselevações nas enzimas hepáticas, particularmente em pacientes com iníciona fase adulta, podem ser verificadas. Existem diversos modelos de animaisde ocorrência natural da doença com início na infância e tardio. Existe ummodelo de camundongo nocaute [Bijvoet AG e col., Hum. Mol. Genet.(1998); 7:53-62]. Os efeitos de melhora da terapia com enzima foram descri-tos em camundongos nocautes [Raben, N e col., Mol. Genet. Metab. (2003);80:159-69] e em um modelo de codorna. A distribuição intraventricular daenzima defeituosa da LSD resulta no status metabólico melhorado do cére-bro e potencialmente dos órgãos viscerais (que não o SNC) afetados.

As lipofuscinoses ceróides neuronais (NCL) são um grupo dedistúrbios neurodegenerativos, distinguidos de outras doenças neurodegene-rativas pelo acúmulo de material autofluorescente ("pigmento de envelheci-mento") no cérebro e em outros tecidos. As características clínicas principaisincluem convulsões, deterioração psicomotora, cegueira, e morte prematura.Foram reconhecidos subgrupos distintos de NCL, que diferem na idade doinício dos sintomas e no surgimento do material de armazenamento, por mi-croscopia eletrônica. Três grupos principais - infantil (INCL), infantil tardiaclássica (LINCL), e juvenil (JNCL, também referida como doença de Batten)- são causados por mutações recessivas autossômicas nos genes CLN1,CLN2, e CLN3, respectivamente. Os produtos protéicos dos genes CLN1(palmitoil tioesterase protéica) e CLN2 (tripeptidil peptidase ou pepinase) sãoenzimas lisossômicas solúveis, enquanto que a proteína CLN3 (battenina) éuma proteína de membrana lisossômica, como é (experimentalmente) a pro-teína CLN5. A identificação de mutações nos genes que codificam as proteí-nas lisossômicas em diversas formas de NCL resultou no reconhecimentodas Iipofuscinoses como distúrbios de armazenamento lisossômico reais.Qualquer subgrupo de NCL pode ser tratado de acordo com a presente in-venção. Uma discussão detalhada da doença de NCL pode ser encontradano Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases, Parte 16, Ca-pítulo 154 (2007). Os distúrbios de NCL de ocorrência natural foram descri-tos nos modelos de ovelhas, cães, e camundongos, que se derivaram porrompimento alvejado de um gene de camundongo correspondente [ver, porexemplo, Katz, ML e col., J. Neurosci. Res. (1999); 57:551-6; Cho, SK e col.,Glycobiology (2005); 15:637-48]. A distribuição intraventricular da enzimadefeituosa da LSD resulta no status metabólico melhorado do cérebro e pos-sivelmente dos órgãos viscerais (que não o SNC) afetados.

Uma discussão detalhada de distúrbios de armazenamento li-sossômico adicionais, descritos na Tabela 1, na qual a distribuição intraven-tricular da enzima defeituosa da LSD na doença, pode ser encontrada noOnline Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases, Parte 16 (2007).

A divulgação acima descreve, de um modo geral, a presente in-venção. Todas as referências descritas neste documento são expressamen-te incorporadas por referência. Um entendimento mais completo pode serobtido por referência aos exemplos específicos que se seguem, os quais sãoproporcionados neste documento para os propósitos de ilustração somente,e não são pretendidos para limitar o escopo da invenção.EXEMPLO 1

Modelo de animal

Os camundongos ASMKO são um modelo aceito da doença deNiemann-Pick dos tipos AeB (Horinouchi e col. (1995) Nat. Genetics,10:288-293; Jin e col. (2002) J. Clin. Invest., 109:1183-1191; e Otterbach(1995) Cell, 81:1053-1061). A doença de Niemann-Pick (NPD) é classificadacomo uma doença de armazenamento lisossômico e é um distúrbio neuro-metabólico herdado, caracterizado por uma deficiência genética na ácidoesfingomielinase (ASM; esfingomielina colinafosfoidrolase, BC 3.1.3.12). Aausência da proteína ASM funcional resulta no acúmulo do substrato de es-fingomielina dentro dos Iisossomos de neurônios e glia por todo o cérebro.Isto resulta na formação de grandes números de Iisossomos distendidos nopericário, que são uma característica distintiva, e no fenótipo celular primárioda NPD do tipo A. A presença de Iisossomos distendidos correlaciona-secom a perda de função celular normal e um curso neurodegenerativo pro-gressivo que resulta na morte do indivíduo afetado na primeira infância (TheMetabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, eds. Scriver e col.,McGraw-HiII, Nova York, 2001, pp. 3589-3610). Os fenótipos celulares se-cundários (por exemplo, anormalidades metabólicas adicionais) estão tam-bém associados com esta doença, notavelmente o acúmulo em alto nível decolesterol no compartimento lisossômico. A esfingomielina tem forte afinida-de pelo colesterol, o que resulta no seqüestro de grandes quantidades decolesterol nos Iisossomos de camundongos ASMKO e pacientes humanos(Leventhal e col. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; Slotte (1997) Sub-cell. Biochem., 28:277-293; e Viana e col., (1990) J. Med. Genet., 27:499-504).

EXEMPLO 2

"Infusão Intraventricular Contínua de rhASM no camundongo ASMKO"

Objetivo: Determinar qual efeito a infusão intraventricular daASM humana recombinante (rhASM) tem sobre a patologia de armazena-mento (isto é, armazenamento de esfingomielina e colesterol) no cérebro docamundongo ASMKO.Métodos: Os camundongos ASMKO foram implantados de modoestereotático com uma cânula de guia de demora, entre 12 e 13 semanas deidade. Na 14â semana de idade, os camundongos foram infundidos com0,250 mg de hASM (n = 5) durante um período de 24 h (-0,01 mg/h), porquatro dias diretos (um total de 1 mg foi administrado), usando uma sondade infusão (que se adapta dentro da cânula de guia), a qual está conectadaa uma bomba. A hASM Iiofilizada foi dissolvida no líquido cerebroespinhalartificial (aCSF) antes da infusão. Os camundongos foram sacrificados 3 diasapós a infusão. No sacrifício, os camundongos foram superdosados comeutanol (>150 mg/kg) e então perfundidos com PBS ou paraformaldeído a4%. O cérebro, o fígado, o pulmão e o baço foram removidos e analisadosquanto aos níveis de esfingomielina (SPM). O tecido cerebral foi dividido em5 secções, antes da análise da SPM (S1 = frente do cérebro, S5 = parte pos-terior do cérebro, ver a Figura 1).

Tabela 2

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Resumo dos resultados: A infusão intraventricular de hASM a0,250 mg/24 h, por 4 dias contínuos (total de 1 mg), resultou na coloração dahASM e na depuração da filipina (isto é, armazenamento de colesterol) portodo o cérebro do ASMKO. A análise bioquímica mostrou que a infusão in-traventricular de hASM também resultou em uma redução global nos níveisde SPM por todo o cérebro. Os níveis de SPM foram reduzidos até aqueledos níveis do tipo selvagem (WT). Uma redução significativa na SPM foitambém observada no fígado e no baço (uma tendência decrescente foi vistano pulmão).

EXEMPLO 3

"Distribuição intraventricular de hASM nos Camundongos ASMKO II"

Objetivo: determinar a dose eficaz mais baixa durante um perío-do de infusão de 6 h.Métodos: os camundongos ASMKO foram implantados de modoestereotático com uma cânula de guia de demora, entre 12 e 13 semanas deidade. Na 14â semana de idade, os camundongos foram infundidos duranteum período de 6 horas em uma das seguintes doses de hASM: 10 mg/kg(0,250 mg; η = 12), 3 mg/kg (0,075 mg; η = 7), 1 mg/kg (0,025 mg; η = 7), 0,3mg/kg (0,0075 mg; η = 7), ou aCSF (líquido cerebroespinhal artificial; η = 7).Dois camundongos de cada nível de dose foram perfundidos com parafor-maldeído a 4%, imediatamente após a infusão de 6 h, para avaliar a distribu-ição da enzima no cérebro (o sangue foi também coletado destes para de-terminar os níveis de hASM no soro). Os camundongos restantes de cadagrupo foram sacrificados 1 semana após a infusão. O tecido do cérebro, fí-gado, e pulmão destes camundongos foi analisado quanto aos níveis deSPM como no estudo 05-0208.

Tabela 3

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Resumo dos resultados: A hASM intraventricular durante um pe-ríodo de 6 h resultou em uma redução significativa nos níveis de SPM portodo o cérebro, independente da dose. Os níveis de SPM no cérebro noscamundongos tratados com doses > 0,025 mg foram reduzidos até os níveisde WT. Os níveis de SPM nos órgãos viscerais foram também significativa-mente reduzidos (porém não até os níveis de WT) em um modo dependenteda dose. Em suporte desta verificação, a proteína hASM foi também detec-tada no soro dos camundongos ASMKO infundidos com a proteína hASM. Aanálise histológica mostrou que a proteína hASM estava amplamente distri-buída por todo o cérebro (de S1 até S5) após a administração intraventricu-lar da hASM.EXEMPLO 4

"Infusão intraventricular de rhASM nos camundongos ASMKO III"

Objetivo: Determinar (1) o tempo que leva para a SPM acumular-se novamente dentro do cérebro (e do cordão espinhal), após uma infusãode 6 h de hASM (dose = 0,025 mg); (2) se existem diferenças entre os sexosna resposta à administração intraventricular de hASM (os experimentos an-teriores demonstram que existem diferenças entre os sexos no acúmulo desubstrato no fígado, não se sabe se isto ocorre ou não no cérebro).

Métodos: os camundongos ASMKO foram implantados de modoestereotático com uma cânula de guia de demora, entre 12 e 13 semanas deidade. Na 14â semana de idade, os camundongos foram infundidos duranteum período de 6 h com 0,025 mg de hASM. Após a distribuição intraventricu-lar da hASM, os camundongos foram sacrificados em 1 semana após a infu-são (n = 7 machos, 7 fêmeas), ou em 2 semanas após a infusão (n = 7 ma-chos, 7 fêmeas), ou em 3 semanas após a infusão (n = 7 machos, 7 fêmeas).No sacrifício, o cérebro, o cordão espinhal, o fígado e o pulmão foram remo-vidos para a análise de SPM.

Tabela 4

<table>table see original document page 27</column></row><table>

As amostras de tecidos são preparadas para a análise da SPM.EXEMPLO 5

"Efeito da infusão intraventricular de rhASM sobre a função cognitiva emcamundonaos ASMKO"

Objetivo: determinar se a infusão intraventricular de rhASM aliviaos déficits cognitivos induzidos doentes em camundongos ASMKO

Métodos: os camundongos ASMKO foram implantados de modoestereotático com uma cânula de guia de demora, entre 9 e 10 semanas deidade. Na 13â semana de idade, os camundongos foram infundidos duranteum período de 6 h com 0,025 mg de hASM. Nas 14â e 16â semanas de ida-de, os camundongos sofreram o teste cognitivo usando o Labirinto de Bar-nes.

EXEMPLO 6

"Distribuição da proteína hASM dentro do SNC de ASMKO após infusão in-traventricular"

Objetivo: determinar a distribuição da proteína hASM (como fun-ção do tempo) dentro do cérebro e do cordão espinhal de camundongosASMKO, após infusão intraventricular.

Métodos: os camundongos ASMKO foram implantados de modoestereotático com uma cânula de guia de demora, entre 12 e 13 semanas deidade. Na 14â semana de idade, os camundongos foram infundidos duranteum período de 6 h com 0,025 mg de hASM. Após o procedimento de infusão,os camundongos foram sacrificados imediatamente ou 1 semana ou 2 se-manas ou 3 semanas posteriormente.<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>Referências

A divulgação de cada referência citada é expressamente incor-porada aqui.

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<130> 003482.00036

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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 629

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1 Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly1 5 10 15 Arg Glu Gln Gly 20 Gln Asp Gly Thr Ala 25 Gly Ala Pro Gly Leu 30 Leu TrpMet Gly Leu 35 Val Leu Ala Leu Ala 40 Leu Ala Leu Ala Leu 45 Ala Leu SerAsp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro 50 55 60 Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp65 70 75 80Val Phe Gly Trp Gly 85 Asn Leu Thr Cys Pro 90 Ile Cys Lys Gly Leu 95 PheThr Ala Ile Asn 100 Leu Gly Leu Lys Lys 105 Glu Pro Asn Val Ala 110 Arg ValGly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro 115 120 125 Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu 130 135 140 Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu145 150 155 160Leu Gly Ser Thr Cys 165 Gly His Trp Asp Ile 170 Phe Ser Ser Trp Asn 175 IleSer Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His 195 200 205 Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro 210 215 220 Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225 230 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr 245 250 255 Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 260 265 270Val Tyr Trp Thr 275 Arg Gln Asp Gln 290 Lys Phe Leu Gly 305 Ser Thr Pro ValSer Ser Arg Trp 340Leu Pro Ala Glu 355 Leu Ser Pro Tyr 370 Cys Ser Arg Glu385 Gly Gln Leu GlnGly Asp Lys Val 420Lys Ser Trp Ser 435 Thr Leu Ala Ala 450 Val Phe Tyr Asp465 Leu Ala Pro SerVal Tyr Gln Ile 500Asp His Glu Thr 515 Ala Ile Pro His 530 Leu Pro Asn Thr545 Arg Gly Asp MetGly His Pro Pro 580Leu Cys Ala Gln 595 His Leu Met Pro 610 Arg Pro Leu Phe625

Gly Asp Ile Pro 280Leu Arg Ala Leu 295 Pro Val Pro Val 310 Asn Ser Phe Ero325 Leu Tyr Glu AlaAla Leu Arg Thr 360Pro Gly Leu Arg 375 Asn Phe Trp Leu 390 Trp Leu Val Gly405 His Ile Ile GlyTrp Asn Tyr Tyr 440Gln Phe Phe Gly 455 Glu Glu Thr Leu 470 Ala Thr Thr Tyr485 Asp Gly Asn TyrTyr Ile Leu Asn 520Trp Gln Leu Leu 535 Leu Pro Thr Ala 550 Gln Leu Phe Gln565 Ser Glu Pro CysLeu Ser Ala Arg 600Asp Gly Ser Leu 615 Cys

Ala His Asp ValThr Thr Val Thr 300Iyr Pro Ala Val 315 Pro Pro Phe Ile 330 Met Ala Lys Ala345 Leu Arg Ile GlyLeu Ile Ser Leu 380Leu Ile Asn Ser 395 Glu Leu Gln Ala 410 His Ile Pro Pro425 Arg Ile Val AlaHis Thr His Val 460Ser Arg Pro Leu 475 Ile Gly Leu Asn 4 90 Ser Arg Ser Ser505 Leu Thr Gln AlaTyr Arg Ala Arg 540Trp His Asn Leu 555 Thr Phe Trp Phe 570 Gly Thr Pro Cys585 Ala Asp Ser ProPro Glu Ala Gln 620

Trp His Gln Thr285 Ala Leu Val ArgGly Asn His Glu 320Glu Gly Asn His 335 Trp Glu Pro Trp 350 Gly Phe Tyr Ala365 Asn Met Asn PheThr Asp Pro Ala 400Ala Glu Asp Arg 415 Gly His Cys Leu 430 Arg Tyr Glu Asn445 Asp Glu Phe GluAla Val Ala Phe 480Pro Gly Tyx Arg 4 95 His Val Val Leu 510 Asn Ile Pro Gly525 Glu Thr Tyr GlyVal Tyr Arg Met 560Leu Tyr His Lys 575 Arg Leu Ala Thr 590 Ala Leu Cys Arg605 Ser Leu Trp Pro

Claims (61)

1. Método de tratar um paciente com doença de Niemann-Pick Aou B, compreendendo:administrar um ácido esfingomielinase ao paciente por meio dedistribuição intraventricular para o cérebro, em uma quantidade suficientepara reduzir os níveis de esfingomielina no dito cérebro.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantida-de administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina no fíga-do do paciente.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantida-de administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina nospulmões do paciente.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantida-de administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina no baçodo paciente.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantida-de administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina no rimdo paciente.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,em que a quantidade administrada é suficiente para reduzir os níveis de es-fingomielina no cérebro pelo menos 10% no paciente.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a quantida-de administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina no cé-rebro pelo menos 20% no paciente.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a quantida-de administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina no cé-rebro pelo menos 30% no paciente.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a quantida-de administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina no cé-rebro pelo menos 40% no paciente.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a quanti-dade administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina nocérebro pelo menos 50% no paciente.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a quanti-dade administrada é suficiente para reduzir os níveis de esfingomielina nocérebro pelo menos 60% no paciente.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em que a etapa de administrar emprega uma bomba.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, em que o ácido esfingomielinase é administrada por meio de uma sondade demora.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, em que os níveis de esfingomielina são monitorados no paciente e ácidoesfingomielinase adicional é administrado em resposta aos níveis de esfin-gomielina determinados.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 14, em que o ácido esfingomielinase é um ácido esfingomielinase humana.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, em que o ácido esfingomielinase compartilha pelo menos 95% de identi-dade da seqüência de aminoácidos com um ácido esfingomielinase confor-me mostrada em SEQ ID NO: 1.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 96% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 97% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 98% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 99% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o ácidoesfingomielinase tem uma seqüência conforme mostrada em SEQ ID NO: 1.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, em que a etapa de administrar compreende uma pluralidade de infusões.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, em que a etapa de administrar uma única dose é efetuada em uma taxatal que a administração de uma única dose consuma mais do que quatrohoras.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a etapade administrar uma única dose é efetuada em uma taxa tal que a administra-ção de uma única dose consuma mais do que cinco horas.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a etapade administrar uma única dose é efetuada em uma taxa tal que a administra-ção de uma única dose consuma mais do que seis horas.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a etapade administrar uma única dose é efetuada em uma taxa tal que a administra-ção de uma única dose consuma mais do que sete horas.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a etapade administrar uma única dose é efetuada em uma taxa tal que a administra-ção de uma única dose consuma mais do que oito horas.

28. Kit para tratar um paciente com doença de Niemann-Pick Aou B, compreendendo:uma ácido esfingomielinase; euma sonda para a distribuição do dito ácido esfingomielinasepara os ventrículos cerebrais do paciente.

29. Kit para tratar um paciente com doença de Niemann-Pick Aou B, compreendendo:uma ácido esfingomielinase; euma bomba para a distribuição do dito ácido esfingomielinasepara os ventrículos cerebrais do paciente.

30. Kit de acordo com a reivindicação 28, adicionalmente com-preendendo uma bomba para a distribuição do dito ácido esfingomielinasepara os ventrículos cerebrais do paciente.

31. Kit de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que o ácidoesfingomielinase é um ácido esfingomielinase humana.

32. Kit de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 95% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

33. Kit de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 96% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

34. Kit de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 97% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

35. Kit de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 98% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

36. Kit de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que o ácidoesfingomielinase compartilha pelo menos 99% de identidade da seqüênciade aminoácidos com um ácido esfingomielinase conforme mostrada em SEQID NO: 1.

37. Kit de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que o ácidoesfingomielinase tem uma seqüência conforme mostrada em SEQ ID NO: 1.

38. Método de tratar um paciente com uma doença de armaze-namento lisossômico que é causada por uma deficiência de enzima, o méto-do compreendendo:administrar a enzima ao paciente por meio de distribuição intra-ventricular para o cérebro.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que a defici-ência de enzima resulta em um acúmulo do substrato da enzima e a admi-nistração é tal que os níveis de substrato no dito cérebro são reduzidos.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, em que a doença de armazenamento lisossômico é de Niemann-Pick A ea enzima é a esfingomielinase.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, em que a doença de armazenamento lisossômico é de Niemann-Pick B ea enzima é a esfingomielinase.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, em que a doença de armazenamento lisossômico é a síndrome de Mu-copolissacaridose I e a enzima é a alfa-L-iduronidase.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, em que a doença de armazenamento lisossômico é a síndrome de Mu-copolissacaridose Il e a enzima é a iduronato-2-sulfatase.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, em que a doença de armazenamento lisossômico é a doença de Gau-cher e a enzima é a glicocerebrosidase.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, em que a doença de armazenamento lisossômico é a doença de Pompee a enzima é a alfa-glicosidase.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, em que a doença de armazenamento lisossômico é a doença de Batteninfantil tardia clássica (CLN2) e a enzima é a tripeptidil peptidase.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-46, em que a enzima é administrada em uma taxa tal que a administração deuma única dose consome mais do que quatro horas.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que a taxa étal que a administração de uma única dose consome mais do que cinco ho-ras.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que a taxa étal que a administração de uma única dose consome mais do que seis horas.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que a taxa étal que a administração de uma única dose consome mais do que sete horas.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que a taxa étal que a administração de uma única dose consome mais do que oito horas.

52. Uso de uma enzima para a fabricação de um medicamentopara a prevenção ou o tratamento de uma doença de armazenamento Iisos-sômico em um paciente, doença esta que é causada por uma deficiência daenzima dentro do paciente, em que o dito tratamento ou prevenção compre-ende a administração intraventricular da enzima ao cérebro.

53. Uso de acordo com a reivindicação 52, em que a deficiênciaresulta em um acúmulo do substrato da enzima e a administração da enzimaresulta em uma redução no nível do substrato no cérebro.

54. Uso de acordo com a reivindicação 52 ou 53, em que a defi-ciência resulta em um acúmulo do substrato da enzima e a administração daenzima resulta em uma redução no nível do substrato no cérebro e em umou mais dos órgãos viscerais.

55. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 52-54,em que a enzima é uma hidrolase lisossômica.

56. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 52-55,em que a doença de armazenamento lisossômico é uma das doenças quesão identificadas na Tabela 1.

57. Uso de acordo com a reivindicação 56, em que a doença éselecionada a partir do grupo consistindo em: Niemann-Pick A, Niemann-Pick B, síndrome de Mucopolissacaridose I, síndrome de Mucopolissacari-dose II, doença de Gaucher, doença de Pompe e doença de Batten infantiltardia clássica (CLN2).

58. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 52-57,em que uma única dose da enzima é para ser administrada em uma taxa talque a administração consuma mais do que quatro horas, preferivelmentemais do que cinco horas, mais preferivelmente mais do que seis horas, maispreferivelmente ainda mais do que sete horas, e o mais preferivelmente maisdo que oito horas.

59. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 52-58,em que o dito tratamento ou prevenção compreende a administração da en-zima aos ventrículos laterais e/ou ao quarto ventrículo do cérebro.

60. Kit para o tratamento ou a prevenção de uma doença de ar-mazenamento lisossômico que é causada por uma deficiência em uma en-zima lisossômica, o dito kit compreendendo a enzima e uma sonda e/oubomba que é especificamente adaptada para a administração intraventricularda enzima ao cérebro.

61. Kit como definido na reivindicação 5, em que a enzima éuma hidrolase lisossômica.