BRPI0705059B1 - hidrolisados de queratina, processo para sua produção e composições cosméticas contendo os mesmos - Google Patents

Abstract

hidrolisados de queratina, processo para sua produção e composições cosméticas contendo os mesmos. a presente invenção relata um processo para a hidrolise de queratina através de processos microbiológicos e/ou enzimáticos. em especial a queratina é oriunda de penas de animais, como por exemplo o frango e são submetidas a hidrolise por uma cepa de badiius sp.. os hidrolisados apresentam peso molecular menor que 500 da, o que os torna ideais para aplicações cosméticas, em especial para aplicações em composições para tratamentos re-construtivos da fibra capilar.

Description

Relatório Descritivo Hidrolísados de Queratina, Processo para Sua Produção e ComposiçOes Cosméticas Contendo os Mesmos Campo da Invenção A presente invenção relata um processo para a hidrólise de queratina através de processos microbiológicos e/ou enzimáticos. Em especial a queratina é oriunda de penas de animais, como por exemplo, o frango e são submetidas a hidrólise por uma cepa de Bacillus sp..

Os hidrolísados apresentam peso molecular menor que 500 Da, o que os torna ideais para aplicações cosméticas, em especial para aplicações em composições para tratamentos re-construtivos da fibra capilar.

Antecedentes da Invenção É sabido que a queratina possui grande valor na indústria cosmética pro sua ação sobre a fibra capilar. Os hidrolísados de queratina podem ser preparados por hidrólise ácida ou alcalina, ou por digestão enzimática A função da hidrólise química ou enzimática é de dividir as cadeias peptídicas em peptídeos menores com pesos moleculares mais baixos. A queratina de partida usualmente utilizada pode ter várias origens: pode ser derivada de fibras de cabelo humano, lã, pêlos, penas e chifres. O estado da técnica possui diversos documentos relativos a hidrolísados de queratina, e seu uso em cosméticos. A patente US 7,220,405 descreve a formulação de cosméticos a base de peptídeos, como condicionadores e colorações para cabelo hidratantes corporais, corantes cutâneos e corantes para unhas. Peptídeos têm sido descritos como sendo capazes de se ligar com alta afinidade a cabelos, pele e unhas. Dessa forma este trabalho visou o desenvolvimento de produtos de cuidado pessoa! contendo peptídeos, provenientes de colágeno, elastina, soja, caseína, seda entre outros, acoplados ao agente ativo do produto diretamente ou via um espaçador.

Nesta patente se usa também hídrolisados de várias proteínas, mostrando a eficiência destes peptídeos na cosmética, mas não usa queratina de penas hidrolisadas nem usa o método enzímático para hidrólise das proteínas citadas. A patente US 4,186,188 descreve uso de tripsina para hidrolisar proteínas de uma forma geral, gerando polipeptídios de 200 a 2000 Da com carga positiva que podem ser utilizados em formulações cosméticas pra cabelos, unhas e pele. A tripsina é uma peptidase que não tem ação sobre a queratina, logo, ela não pode ser usada para hidrolisar queratina. Em nosso trabalho a hidrólise da queratina é feita por queratinases e peptidases com atividade sobre a queratina, produzidas por B. subtilis AMR durante a fermentação de penas de frango. Por isto nosso método enzimático-microbiológico apresenta uma maior especificidade, pois a queratínase atua diretamente no polímero de queratina.

Os documentos US 2006/134092 e US 5,395,613 descrevem peptidases (trabalho de caracterização enzimática) produzidas por microrganismos do gênero Bacitlus e Micrococcus sedentarius capazes de degradar proteínas altamente resistentes a desnaturação e degradação, entre elas a queratina, prion (primeiro trabalho) e colágeno (segundo trabalho).

As patentes acima citadas objetivam a descrição de uma peptidase de Bacillus ou Micrococcus sedentarius para a degradação de proteínas de difícil degradação como a queratina. Nosso trabalho faz uso de outro microrganismo, o Bacillus subtilis cepa AMR queratinolítico, para a degradação de queratina. O objetivo de nosso trabalho não foi recuperar a enzima e sim utilizar os produtos de hidrólise para a adição em formulações cosméticas. A patente US 6,858,215 apresenta um método para o tratamento de tecidos hiper-queratinizados em mamíferos empregando enzimas proteolíticas desenvolvidas originalmente para a hidrólise de proteínas associadas a alimentos e atualmente é comumente usada para amaciar carne e melhorar o sabor da comida. A composição do produto desenvolvido nesta patente possui essas enzimas amaciantes, que suavizam e esfoliam formações hiper-queratinizadas na pele, como calosidades, grânulos, ressecamento, pele escamosa e queratoses sem prejudicar os tecidos adjacentes pela lise seletiva de tecidos hiper-queratinizados. As enzimas utilizadas (de 1 a 15% na formulação) foram a subtilisina Carlsberg e uma peptidase fúngica de Aspergillus oryzae.

Esta patente também descreve um produto cosmético e farmacêutico atuando sobre um tecido queratinizado. Porém, nesta patente o processo enzimático visa a hidrólise da queratina "in situ", suavizando tecidos hiper-queratinizados como calos Nossa patente utiliza o produto de hidrólise enzimática de queratina de penas através da ação de peptidases e queratinases de B. subíilis AMR em formulação cosmética para cabelos. A patente dos autores acima usa as enzimas diretamente na pele. A patente US 4,591,497 apresenta um removedor de odor e desodorizante que contém como componente efetivo hidrolisado de material constituído de queratina (de 0,1 a 10% com peso de 200-5000 Da), de pêlo aminal, penas, unhas, cascos, chifres e escamas. A hidrólise da queratina foi alcançada por métodos conhecidos, usando ácidos, álcalis ou enzimas. O composto age efetívamente sobre mercaptanas e sulfeto de hidrogênio removendo seu odor O uso de hidrolísados de queratina da patente acima tem um objetivo diferente do apresentando por nosso trabalho. A obtenção deste hidrolisado também emprega uma metodologia diferente. Enquanto o trabalho acima utilizou hidrólise ácida, alcalina ou enzimática, nós utilizamos hidrólise enzimática-microbiológica.

Os documentos US 5,262,307, CA 1108542 e US 4,390,525 descrevem o pré-tratamento do material contendo queratina (penas, cabelos, etc...) com um agente redutor, ou tratamento ácido, seguido da digestão enzimática da queratina desnaturada obtida na primeira fase do processo. Na primeira patente o pré-tratamento é feito com sulfito em solução aquosa (a 60-100 graus) para a desnaturação da queratina. Na segunda, antes da hidrólise enzimática na presença de uréia a queratina é submetida a condições ácidas a temperatura de 80°C. A terceira patente descreve o desenvolvimento de um hidrolisado de queratina contento pelo menos dois grupos mercapto por molécula e com peso molecular entre 2.000 a 20.000 Da, apropriada para aplicações cosméticas para cabelos, em especial fixadores. O hidrolisado é preparado pela redução da queratina em solução aquosa em condições alcalinas contendo mercaptano e sulfito, seguido por hidrólise enzimática. Os oligopeptídeos alcançados no final dos processos descritos pedem ser utilizados em cosméticos.

Nas patentes citadas é feita hidrólise enzimática da queratina previamente reduzida em condições alcalinas ou na presença de sulfito ou parcialmente hidrolisada em ácido No nosso trabalho, a queratina hidrolisada é obtida da degradação microbiana e enzimática de penas inteiras sem qualquer tratamento químico prévio.

Algumas patentes que tratam da hidrólise da queratina por métodos físicos estão descritas abaixo: A patente US 5,772,968 descreve um sistema, incluindo aparelhos e métodos, para hidrotisar materiais a base de queratina como carcaças não aproveitadas, cabelos, penas entre outros, para a obtenção de produtos protéicos úteis e comercializáveis. Este “sistema de hidrólise1’ faz uso de uma aparelhagem que promove a quebra da queratina através de aquecimento, expansão, agitação, mistura e secagem. A alta temperatura adicionada ao processo de mistura das penas (material queratinolítico selecionado para o trabalho), num tubo condutor com parafuso, leva a hidrólise do substrato. O objetivo da hidrólise da queratina é aumentar a sua digestibilidade e que ela possa ser utilizada como suplemento alimentar animal. A patente US 4,172,073 descreve a hidrólise de queratina obtida de estruturas de animais, utilizando vapor saturado à alta pressão, obtendo por fim uma farinha solúvel em água e excelente para uso em alimentação animal, uma vez que é digestível por pepsina.

Estas patentes descrevem processos físicos (temperatura, ação mecânica, alta pressão) para quebrar a molécula de queratina de forma que ela possa ter sua digestibilidade aumentada, ou seja, objetivando seu uso alimentar. Nosso trabalho propõe a hidrólise microbiana e enzimática de queratina de penas, num processo que não requer gastos com aquecimento, tendo como objetivo aplicar os pequenos fragmentos peptídicos gerados em cosméticos de uso capilar.

Algumas patentes que tratam da hidrólise queratina por métodos químicos estão descritas abaixo. O documento US 2007/0065506 descreve o uso de queratina e seus derivados (50-60.000 Da) como suplemento administrado oralmente para a redução do estresse oxidativo e os benefícios disto como promoção da saúde da pele e promover a resposta antiinflamatória. Os derivados de queratina produzidos foram filamentos intermediários de queratina S-sulfonado, queratina com alto teor de enxofre S-sulfonado e peptídeos de queratina hidrolisada S-sulfonados Os derivados de queratina foram obtidos de cabelo humano, lã, fibra animal, cascos e chifres, por oxidação parcial. A queratina nesta patente foi obtida de mamíferos, enquanto foi utilizada penas de frango em nosso trabalho. O tratamento da queratina na patente acima foi químico, enquanto utilizamos métodos enzimático-microbiológicos. O produto final é também completamente diferente. O documento US 2007/128134 apresenta um derivado de queratina solúvel em água e suas aplicações. O derivado de queratina foi obtido pelo tratamento alcalino de penas seguido pela exposição à irradiação em comprimento de onda de alta energia, levando a obtenção de peptídeos com peso molecular entre 5000 a 50.000 Da. O documento US 2004/0210039 relata um processo para solubilizar queratina de materiais constituídos por queratina como penas de frango. A queratina foi solubilizada utilizando sulfito sob condições alcalinas. Neste processo os resíduos de cisteína são parcialmente modificados pela alquilação e a queratina é parcialmente hidrolisada. Esta queratina parcialmente hidrolisada, com peso molecular entre 1.000 e 10.000 Da, e pode ser utilizada para a produção de filmes. A patente US 5,679,329 descreve o desenvolvimento de uma composição cosmética contendo proteína do leite (0,02% - 15%) e/ou proteínas hidrolisadas do leite e queratina hidrolisada (0,1 - 10%) com peso molecular entre 100 a 200.000 Da. A queratina hidrolisada pode ser obtida pela hidrólise de cabelos, lã, pele, sedas, penas, escamas, cascos e chifres. Neste trabalho a queratina utilizada foi oriunda da hidrólise ácida moderada (fragmentos de aproximadamente 100.000 Da encontrados no KERASOL comercializado pela CRODA) e controlada (fragmentos de aproximadamente 150 Da obtidas no produto CROGUAT WKP também comercializada pela CRODA) de casco bovino O produto final é preferencialmente mousse utilizado para fixar penteados A patente US 5,154,916 descreve a adição de hidrolisado de queratina com peso molecular de 50 000 Da em máscaras para cílios utilizando como base uma cera. melhorando as propriedades de cobertura dos cílios, a estabilidade e comprimento dos cílios. A queratina para hidrólise pode ser obtida de cabelos, lã, cascos, chifres, pêlos, sedas e penas Foi usada preferencialmente queratina de pele hidrolisada por hidrólise alcalina moderada na concentração entre 0,05 a 5%. A patente US 4,839,168 descreve a formulação de cosméticos de uso capilar contendo extrato de planta (preferencialmente de vidoeiro, alecrim e hamadríade), extraído com solvente polar e um composto polipeptídico (com peso entre 100 a 100.000 Da) incluindo queratina, hidrolisado de queratina, seda e hidrolisado de seda. A queratina utilizada é proveniente de cabelo humano, lã e penas e foi extraída por métodos de oxidação e redução, e hidrolisada por hidrólise ácida. O produto objetiva melhorar as características sensoriais dos cabelos. A patente US 4,818,520 descreve o uso de hidrolisados de queratina, obtidos de material queratinizado como penas de aves, que podem ser úteis na formulação de produtos que reduzem linhas de expressão para pele, hidratantes, mascaras de pele, xampu, loção para barbear, fortalecedor de unhas e condicionadores. O hidrolisado é obtido por aquecimento de farinha de penas em solução alcalina, sob refluxo, seguido de resfriamento, filtração e acidificação com ácido clorídrico e nova filtração, aquecimento e evaporação Por fim é feita uma nova etapa com tratamento alcalino seguido de neutralização e assim se obtém queratina hidrolisada líquida.

As patentes US 4,465,664 e US 4,460,566 descrevem a composição de produtos para cabelos contendo pelo menos um tipo de derivado de material a base de queratina, como pêlo animal, cabelo humano, lã, unha, penas, cascos, chifres entre outros. Os derivados de queratina foram obtidos por oxidação (que converte as pontes dissulfeto a ácido sulfônico) ou redução (que produz derivados com grupos tiol) da queratina e usados na concentração de 0.01-10% e 01-10%, respectivamente, e tamanho entre 30.000 a 100.000 Da. O produto finai da primeira patente tem efeito hidratante sobre o cabelo. A patente US 3,970,614 relata a solubilização de material a base de queratina como penas de frangos, pêlos, cabelos e cascos, através do tratamento com N, N-metilformamida a alta temperatura para produzir um hidrolizado protéico apropriado para uso como suplemento alimentar animal e humano e como matéria-prima na indústria de alimentos. A principal diferença entre as patentes descritas acima e a metodologia desenvolvida por nosso grupo, é o processo utilizado para a hidrólise de queratina, enquanto as patentes acima descritas utilizam hidrólise química {ácida e/ou alcalina, ou utilizando N, N -dimetilformamida), ou reações de oxidação e redução, a nossa utiliza hidrólise enzimátíca-microbiana, além da fonte de queratina também ser diferente em alguns casos. Enquanto alguns destes trabalhos utilizam queratina proveniente de cascos bovinos e pele, usamos queratina de penas de frango. Nosso produto utiliza apenas queratina hidrolisada com peso molecular inferior a 500 Da, o que facilita a adsorção e penetração dos pequenos fragmentos peptídicos na fibra capilar. O produto final também tem objetivo diferente de algumas das patentes acima. O artigo de Roddick (Roddick-Lanzilotta, A & Kelly R. 2006. Protecting the Hair with Natural Keratín Biopolymers. Cosmetics & Toiletries, 121 (5)) descreve duas estratégias para produção de biopolímeros de queratina intacta e peptídeos de queratina provenientes de lã de ovelha para aplicação em cosméticos de uso capilar. Este polímero se liga a sítios preferenciais na fibra protegendo o cabelo de danos, além de conter propriedades antioxidantes. A produção da queratina envolve etapas de purificação para obtenção de queratina intacta {55 kDa), que tem propriedades para formação de filmes que podem ser aplicados em cosméticos Os peptídeos de baixo peso molecular, capazes de entrar no córtex da fibra capilar, foram obtidos da Croda Chemicals Europe, ou seja, obtidos por hidrólise química. A obtenção da queratina intacta citada no trabalho acima não foi o alvo do nosso trabalho, apesar de queratina intacta de penas (aproximadamente 10 kDa) ter sido encontrada no sobrenadante de cultura do microrganismo utilizado (dado não mostrado). O artigo cita etapas de purificação o que onera a produção da proteína. O hidrolisado utilizado por eles foi obtido por hidrólíse química, enquanto a do nosso trabalho foi por hídrólise microbiana.

Na literatura há uma ampla quantidade de trabalhos relatando a degradação de penas por microrganismos queratinolíticos através de fermentação submersa das penas objetivando utilizar o hidrolisado de queratina obtido como suplemento protéico alimentar na dieta de animal Em contrapartida, nosso trabalho visou aplicar estes hidrolisados provenientes da digestão microbiana em formulações cosméticas para uso capilar, uma finalidade inédita para esses produtos da fermentação das penas. Abaixo estão listadas as patentes, teses e artigos científicos utilizando a hidrólíse microbiológica de penas para obtenção de hidrolisados de queratina para uso em rações. Nenhum dos documentos citados abaixo utiliza o microorganismo Bacillus subtilis cepa AMR

Os principais documentos são US 6,214,576, US 5,887,000, US 5,186,961, US 5,063,161 e US 4,908,220.

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Em uma realização preferida da invenção, o B. subtilis é o B.subtilis cepa AMR

Em uma realização preferida da invenção, o material contendo fibras de queratina é pena de frango.

Em uma realização preferida da presente invenção, o pH é 8,0.

Em uma realização preferida da presente invenção, o meio de cultivo compreende extrato de levedura, peptona, KCI, sacarose ou mistura dos mesmos.

Em uma realização preferida da presente invenção, a mistura é mantida em uma temperatura de 28°C e sob agitação de 300 rpm.

Em uma realização preferida da presente invenção, a separação do sobrenadante é feita por centrifugação, em especial por centrifugação a 4.000 rpm por 20 min.

Em uma realização preferida da presente invenção, a separação dos peptídeos hidrolisados é feita por ultrafiltração É um adicional objeto da presente invenção um processo opcional de preparação do material contendo fibras de queratina compreendendo peto menos uma etapa de lavagem e/ou delipidação.

Em uma realização preferida, as penas de frango são lavadas com detergente e água. secas, delipidadas com uma mistura de clorofórmio metanot e secas. É um adicional objeto da presente invenção um hidrolisado de queratina com peso molecular compreendido na faixa que vai de 500 a 1000 Da. Em especial, o hidrolisado de queratina é obtido pelo processo da presente invenção. É um adicional objeto da presente invenção uma composição cosmética compreendendo um hidrolisado de queratina em uma concentração que varia de 0,0001% p/p a 20% p/v.

Em uma realização preferida da presente invenção, a composição cosmética é aplicada sobre tecidos queratinosos, como cabelo, pele e/ou unhas.

Em uma realização preferida da presente invenção, a composição cosmética é um xampu.

Em uma realização preferida da presente invenção, a composição cosmética é um creme condicionador.

Descricão das Figuras A Figura 1 mostra o MALDI-TOF do sobrenadante de cultura do B. subtilis, AMR em meio de penas após 120h de cultivo, mostrando os peptídeos derivados da queratina da pena. A Figura 2 mostra o MALDI TOF dos hidrolisados de queratina da CRODA obtidos de cascos de porcos A Figura 3 mostra a zimografia com gelatina e queratina do sobrenadante de Bacillus subtilis em penas demonstrando a presença de enzimas proteolíticas e queratinolíticas. A Figura 4 mostra o HPTLC dos hidrotisados de queratína de penas por degradação microbiana. 1- controle de glicina; 2-peptídeos recolhidos pela membrana de 1000 Da; 3- peptídeos recolhidos pela membrana de 500 Da; 4-hidrolisado comercial Queratan. A Figura 5 mostra o SDS-PAGE do material retido e filtrado pela membrana de 1000 Da pelo processo de ultrafiltração em AMICON. Coloração: nitrato de prata A Figura 6 mostra o zimograma do material retido e filtrado pela membrana de 1000 Da pelo processo de ultrafiltração em AMICON. Coloração: coomassie blue. A Figura 7 mostra o fluxograma da metodologia empregada, exemplificando o tratamento ao qual as mechas foram submetidas. A Figura 8 mostra a avaliação do teor de hidratação para as mechas secas sem calor (temperatura ambiente). Grupo de mechas: 1 - cabelo virgem; 2 - cabelo tingido; 3 - cabelo tingido com luzes, 4 - cabelo tingido com alisamento; e 5 - cabelo totalmente descolorado. A Figura 9 mostra a avaliação do teor de hidratação para as mechas secas com calor e placa térmica. Grupo de mechas: 1 - cabelo virgem; 2 -cabelo tingido; 3 - cabelo tingido com luzes, 4 - cabelo tingido com alisamento; e 5 - cabelo totalmente descolorado. A Figura 10 mostra a representação gráfica dos resultados da análise sensorial para o grupo de mechas secas sem calor. A Figura 11 mostra a representação gráfica dos resultados da análise sensorial para o grupo de mechas secas com calor.

Descrição Detalhada da Invenção Os exemplos aqui descritos não tem o intuito de limitar o escopo da invenção, e sim somente de exemplificar uma forma preferida de realizar a invenção. Qualquer outra forma de realização semelhante e/ou equivalente deve ser interpretada como dentro do escopo da invenção.

Material contendo fibras de queratina Um material contendo fibras de queratina adequado de acordo com a presente invenção pode ser escolhido do grupo que compreende fontes naturais de fibras de queratina como por exemplo cabelo, penas, cascos, unhas, chifres e similares. As penas são um material de partida preferenciai, especialmente penas de frango, galinha, patos, gansos ou outras aves, como por exemplo subprodutos da indústria avícola. A fibra de queratina é preferencialmente submetida a um pré-tratamento tais como limpeza, lavagem, delipidação, corte, moagem, secagem ou combinações dos mesmos. Esse pré-tratamento tem a finalidade de facilitar o manuseio da fibra de queratina e pode melhorar a eficiência geral do processo e pode também influir na qualidade do produto final. B. subtil is A bactéria útil na presente invenção é a espécie Bacillus subtilis. Em especial, a espécie útil na presente invenção pode ser escolhida dentre diversas variantes. A mais adequada é a variante B. subtilis cepa AMR.

Composição Cosmética Um técnico no assunto pode escolher a forma apropriada, e também o método de preparo, baseado no conhecimento da área, levando em conta a natureza dos ingredientes utilisados, em especial sua solubilidade, e também o uso pretendido pela composição.

As composições de acordo com a presente invenção podem estar na forma de soluções aquosa, misturas alcool-água, ou oleosas, emulsões óleo-em-água, água-em-óleo ou emulsões múltiplas, géis aquosos ou oleosos, produtos anidros, ou dispersões de uma fase oleosa em uma fase aquosa compreendendo nanopartículas, como nanoesferas e nanocápsulas, ou vesículas lipídicas iônicas (lipossomos) e/ou não-iônicas.

Quando a composição de acordo com a invenção é uma emulsão, a proporção da fase oleosa pode variar, por exemplo de 5% a 80% por peso, preferencialmente de 5% a 50% por peso total da composição. Os óleos, emulsificantes e co-emulsificantes usados na composição são escolhidos dentre aqueles usados convencionalmente no campo técnico correspondente. O emulsificante e o co-emulsificante podem estar presente na composição em uma proporção variando de 0,3% a 30% por peso. preferencialmente de 0,5% a 20% por peso relativo ao peso total da composição.

Para aplicações no cabelo, a composição pode preferencialmente estar na forma de cremes, loções, géis, emulsões ou mousses, ou na forma de aerossóis, compreendendo um propelente pressurizado. Ela pode estar na forma de uma loção para cuidados capilares, um xampu ou condicionador, um sabonete líquido e/ou sólido, um produto para modelar o cabelo (gel modelador, mousse, laquê), um xampu coloridor, uma composição para alisamento, um creme espumante. Também pode estar na forma de uma tintura, para ser aplicada com pincel ou pente.

Para aplicações nas unhas, a composição pode, preferencialmente ser um produto como um esmalte colorido, um esmalte base, ou outro produto para ser aplicado sob ou sobre outro produto, um removedor de esmalte, ou um produto para proteger, fortalecer e/ou reparar as unhas.

Para aplicações na pele, a composição pode preferencial mente ser mais ou menos viscosa, e pode ter a aparência de, por exemplo, um creme branco ou colorido, uma pomada, uma loção, uma pasta.

As composições podem ser aplicadas por qualquer meio adequado, como pincéis, sprays, ou com os dedos, por exemplo.

As composições também estão associadas a processos para cuidado, tratamento, fortalecimento e/ou reparação de substratos queratínicos, onde a composição definida na presente invenção é aplicada sobre a pele, cabelos (incluindo cílios) e/ou unhas, opcionalmente seguida de rinsagem.

Para efeitos dessa invenção a expressão “cuidado de substratos queratínicos’- significa uma composição direcionada a melhorar a aparência e/ou a superfície de substratos queratínicos. O cuidado de tais substratos pode consistir em tornar o cabelo mais suave e menos quebradiço.

Para efeitos dessa invenção a expressão “fortalecer e/ou reparar substratos queratínicos” significa uma composição direcionada a conservar e/ou restaurar as propriedades físicas e/ou mecânicas de tais substratos, que podem se manifestar como por exemplo: rigidez dos substratos queratínicos, que confere maior consistência, e também um toque mais agradável, resultando em um aumento do volume das fibras queratínicas e também facilidade na modelagem e manutenção do penteado; melhor elasticidade e/ou resistência a forças mecânicas aplicadas, como por exemplo durante o pentear. O hidrolisado de queratina obtido não causa interferência na cor do produto onde ele á aplicado (xampu e creme rinse) uma vez que possui uma coloração dara, diferente de muitos hidrolisados disponíveis no mercado que possuem tonalidade forte e podem influenciar a cor final do produto O hidrolisado da presente invenção pode estar presente na formulação cosmética em uma proporção de 0,0001% p/p a 20% p/p.

Principais Vantagens As principais vantagens do hidrolisado apresentado nesta invenção em relação ao estado da técnica são: - Obtenção de peptídeos da massa molecular menor; O uso de peptídeos de 500 Daltons de massa molecular permite uma melhor penetração dos peptídeos na cutícula do cabelo. As preparações existentes no mercado apresentam peptídeos na faixa de 980-1300 Daltons. - Uso de tecnologia limpa Os processos biocatalisados por enzimas são menos poluentes. As características destes processos industriais e a biodegradabilidade apresentada pelos seus efluentes atendem às exigências das normas ISO 9000 e ISO 14001, que estabelecem padrões para a qualidade de produtos e norteiam as características dos processos de produção, dando ênfase ao menor consumo energético, ao baixo impacto ambiental e à maior qualidade dos produtos. Neste contexto é importante ressaltar que o processamento enzimático de matérias primas resulta em produtos de maior valor agregado. - O uso de microrganismo como produtores diretos do biocatalizador (enzima) no sistema de produção dos hidrolisados de queratina. O uso de mícrorganismos nos sistemas de produção dos hidrolisados de queratina é vantajoso por que, pode-se facilmente obter grandes populações de mícrorganismos e consequentemente mais enzima, reduzindo o tempo de degradação das penas, além de se ter um controle da produção em todas as fases. Outras vantagens são que os mícrorganismos podem ser geneticamente melhorados, aumentando a quantidade e/ou qualidade do biocatalizador produzido, permitindo também sempre selecionar cepas de alta atividade - O meio de crescimento é barato O meio de crescimento é barato devido a abundância de matéria prima no Brasil (resíduos agro-industriais da indústria avícola) Portanto é um método que ainda tem a vantagem de potencialmente poder aproveitar um dos principais resíduos gerados pelas atividades industriais brasileiras. - Favorece a reciclagem de materiais podendo gerar acordos produtivos entre empresas A indústria cosmética pode fazer um importante link com a indústria avícola para aproveitamento destes resíduos, evitando que os mesmos sejam incorporados em rações animais ou poluindo o ambiente. O sistema de compostagem que a indústria usa das penas e da cama de frango é inviável para absorver toda a produção nacional.

Exemplo 1. Preparo das Penas de frango As penas utilizadas no meio de cultura foram penas de frango brancas lavadas com detergente em água corrente, secas a 60°C e delipidadas com clorofórmio: metanol (1:1 v/v) por 1h sob agitação de 300 rpm a temperatura ambiente. A delipidação foi feita em Becker de 4 litros com 1/3 do volume do mesmo em penas com 1L da solução de clorofórmio: metanol 1;1 (v/v). Em seguida as penas foram removidas e secas overnight a 60°C. A penas foram adicionadas inteiras no meio de cultura como principal fonte de carbono e nitrogênio.

Exemplo 2. Microraanismo e condições de cultura Para obtenção dos hidrolisados de queratina utilizou-se o Bacillus subtilis cepa AMR, isolado pelo nosso laboratório de resíduos agro-industriais da indústria avícola RICA e atualmente depositado na coleção de cultura da Fundação Oswaldo Cruz com o numero de registro 1266. Este microrganismo foi escolhido devido a sua intensa atividade queratinolítica para penas de frango. O bacilo foi cultivado em meio extrato de levedura (extrato de levedura 0,5%, peptona 0,5%, KCI 2,0% e sacarose 2,0%;) por 2 dias a 28°C sob agitação constante (300 rpm) para obter massa celular e lavados com salina (2x 3000rpm/20min) para remoção dos componentes do meio antes de serem inoculados nos meio contendo penas a 1%.Em seguida as células foram transferidas para meio PBS pH 8,0 (NaH2P04 0,06M e K2HP04 0.04M) com 1% de penas de frango (preparadas segundo o procedimento descrito no item anterior) e suplementado com 0,01% de extrato de levedura. A amostra foi cultivada neste meio durante 5 dias a 2Q°C sob agitação de 300 rpm. Ao término da fermentação do bacilo no meio contendo penas como principal fonte de carbono e nitrogênio, o sobrenadante foi recolhido por centrifugação a 4.000 rpm por 20 minutos (MAZOTTO, A. M. 2005 Queratinases de Bacillus licheniformis AMR isolado da indústria avícola. 2005. Trabalho monográfico (Bacharel em Microbiologia e Imunologia) - Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes/UFRJ, Rio de Janeiro, 2005).

Exemplo 3. Análise dos peptídeos presentes no meio de cultura por MALDI-TOF

Foram feitas análises em MALDI-TOF (Matrix assisted laser desorption/ionisation - Time of flight) para detecção de peptídeos no sobrenadante de cultura (obtido segundo o item anterior) gerados pela hidrólise de penas pelas peptidases do B.subtilis AMR. O sobrenadante contendo 4,99 mg/m! de proteínas dosadas pelo método de Lowry (LOWRY, O. H.; ROSEMBROUGH, N. J ; FARR, A L AND RANDALL.RJ.1951 Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1): 267 - 275), foi parcialmente purificadas em ZipTip Ci8 O ZipTip C-iSfoi equilibrado com uma solução de acetonitrila (ACN) 100% seguida pela lavagem com ácido trifloroacético (TFA) 0,1% Após este processo, os peptídeos foram fixados na resina do ZipTip Ci8, lavados com TFA 0,1% para remoção de sais, fosfatos e/ou DMSO que causam ruído na leitura. A eluição foi feita com 0,1% de TFA em ACN 50%. As amostras purificadas foram incorporadas as matrizes de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico (5pg/mL em TFA 0,1% em ACN 50%) 1:1. A mistura foi então aplicada na placa para análise por MALDI-TOF. Analise em MALDI-TOF revelou fragmentos com massa molecular de 800-1100 Dalton no sobrenadante bruto das culturas (Figura 1) (Mazotto, 2005) O mesmo procedimento de preparação realizado para o sobrenadante de cultura foi também feito para a preparação comercia! da CRODA diluída 100x. O perfil de pequenos fragmentos peptídicos observado no sobrenadante de cultura do bacilo foi também observado na preparação comercial da CRODA (Figura 2) (Mazotto, 2005).

Exemplo 4 Separação dos hidrolisados de queratina de penas de frango e análise dos ammoácidos e peptídeos gerados por HPTLC O sobrenadante de cultura além de conter os peptídeos oriundos da hidrólise das penas, apresentava também as queratinases e peptidases secretadas pelo Bacillus subtilis AMR A figura 3 mostra dois zimogramas com gelatina e queratina do sobrenadande de cultura bruto concentrado 20X em membrana de diálise overnight contra polietilenoglicol. As zimografias foram preparadas segundo metodologia descrita por Heussen & Dowdle (HEUSSEN, C. & DOWDLE, E. B 1980. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulphate and copolymerized substrates. Anal. Biochem, 102:196-202.), porém utilizando gelatina (Merck) e queratina extraída de penas de frango com DMSO como substratos incorporados a malha de poliacrilaminda a 12,5%.

Para ter uma preparação contendo apenas os peptídeos, o sobrenadante foi submetido a ultrafiltração, usando o sistema AMICON, com o objetivo de separar os peptídeos de até 500 e 1000 Dalton através de membranas de celulose regenerada Millipore de 500 e 1000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit), respectivamente. A figura 4 mostra estes peptídeos e aminoácidos e os compara com uma preparação comercial de queratina de penas hidrolisada da POLYTECHNO denominado Queratan,, através de HPTLC (high performance thin layer chromatography) e revelado com nínhidrina, mostrando que a queratina de penas hidrolisadas pelo B. subtilis AMR tem um padrão de aminoácidos e peptídeos semelhante ao da preparação comercial usada. Observa-se também que o Queratan possui, em adição, peptídeos com massa molecular maior (Fig.6, linha 5). Comparativamente nosso procedimento é melhor por ter apenas peptídeos de baixa massa molecular que tem um poder de penetração melhor na fibra capilar. Como controle foi utilizado uma solução de glicina (1 mg/ml), um aminoácido presente em alta concentração nas penas, 76,6 g/kg (DALEV, P. 2000. Utilization of biodegradable keratin and collagen- containing wastes through enzymatic treatment. Wolfsburg. Orbiti Association).

No HPTLC foram aplicadas 10 pL de peptídeos separados do sobrenadante com membrana de 500 e 1000 Da.

Durante a ultrafiltração ficaram retidas nas membranas basicamente proteínas com massa molecular acima do seu limite de exclusão, incluídos as enzimas e moléculas de queratina solubilizadas, porém não hidrolisadas (com peso molecular de aproximadamente 10 kDa). O retido pela membrana e os peptídeos menores que seu limite de exclusão (filtrado) foram examinados por SDS-PAGE (LAEMMLI, V. K 1970 Cleavage of structural during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.) e corado pelo método de coloração por nitrato de prata (figura 5) e zimografia (HEUSSEN. C. & DOWDLE, E. B. 1980. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulphate and copolymerized substrates Anal. Biochem, 102:196-202 ), como mostrado na figura 6. O SDS-PAGE mostrou a presença de proteínas apenas no retido pela membrana (foram aplicadas 30 μΙ_ de amostra), um resultado esperado, uma vez que peptídeos e aminoácidos (foram aplicados 60 pl de amostra) estão fora do limite de detecção da técnica, o mesmo é válido para a zimografia. Esta mostrou que houve perda de atividade do sobrenadante de cultura durante o processo de ultrafiltração, quando comparado com a zimografia do sobrenadante antes da ultrafiltração (figura 3 e figura 6). O SDS-PAGE e a zimografia mostraram a completa ausência de proteínas na fração peptídica confirmando que não houve contaminação do hidrolisado com proteínas e enzimas proteolíticas respectivamente.

Exemplo 5. Aplicação cosmética dos peptídeos de hidrolisado de pena de frango Os peptídeos de peso molecular menores que 500 Dalton obtidos através da ultrafiltração em AMICON (membrana 500 NMWL), foram incorporados em duas bases cosméticas: um xampu suave e um creme rinse com enxágüe, ambos contendo 10% do material filtrado através de membrana de AMICON de 500 NMWL

Xampu suave com 10% de hidrolisado microbiano de penas de frango contendo peptídeos menores que 500 Da Lauril éter sulfato sódio............................. 30% Decil poliglicosídeo....................................5% Lauril poliglicosídeo...................................5% Surfax ácido.............. .....................3% Dietanolamida de ácido graxo de côco............ 4% Phenoc-hen ou Phenova........ .................. 0,5% Germai 115................... ..................0,2% Hidroiisado de queratina........................10% Unistab 569 .................................... 0,2% Essência de erva-doce........................... 0,5% Água destilada q.s.p............................ 100 ml O Germai requer aquecimento (80°C) para a sua dissolução em água destilada. Após a dissolução do Germai, os demais componentes foram adicionados a solução. O poliglicosídeos devem ser aquecidos para incorporação a solução anterior. A homogeneização deve ser feita lentamente para evitar formação de espuma. Finalizar adicionando o hidroiisado microbiano de penas, o Unistab 569 e a essência, completar o volume final, homogeinizando Creme rinse com enxágüe com 10% de hidroiisado microbiano de penas de frango contendo peptídeos menores que 500 Da FASE OLEOSA Álcool cetoestearílico.............. 5% Phenova.............................0,5% Cloreto de cetiltrimetilamonio......0,5% FASE AQUOSA

Germai 115..........................0,2% Essência erva-doce..................0,5% Corante.............................0,2% Hidroiisado de queratina............10% Água destilada q.s.p................100ml Todos os componentes da fase oleosa foram aquecidos (75°C) juntos e homogeneizados até completa dissolução. Em outro recipiente o germai foi dissolvido sob aquecimento a 80°C. Após atingir as temperaturas, a fase oleosa foi acrescida a fase aquosa, sob agitação, até emulsificar. A solução obtida foi colocada em banho frio, homogeneizada e acrescida das demais substâncias da fase aquosa.

Estes produtos foram aplicados em mechas de cabelos virgem e quimicamente tratados, previamente lavados e desengordurados e durante 5 semanas, submetidos ao tratamento com o xampu suave e creme rinse, contendo o hidrolisado microbiano de queratina, e a secagem com calor seguida de placa térmica de 180°C e a temperatura ambiente, com a finalidade de avaliar o grau de hidratação das fibras capilares.

As mechas foram separadas em 5 grupos diferentes. Estes são compostos por mechas de cabelos virgens, tingidos, tingidos com alisamento, tingido com luzes (descoloração) e totalmente descoiorados Cada grupo contém quatro mechas, sendo duas com os hidrolisados de queratina a 10% e duas mechas controles. Antes da realização dos ensaios todas as mechas foram devidamente lavadas com xampu de lauril sulfato de sódio 2%. e enxaguadas com água destilada . Esse procedimento visou eliminar quaisquer materiais adsorvidos ao fio, evitando-se interferência no ensaio. Abaixo está ilustrado o fluxograma da metodologia utilizada para o processo de tratamento e medição da hidratação (figura 7).

Os ensaios de medição de hidratação foram realizados em aparelho CORNEOMETHER marca CM 825. Foram realizados em paralelo, no mesmo grupo de mechas, ensaios controle com as bases cosméticas sem os peptídeos de hidrolisado de pena de frango. As formulações foram manipuladas no Laboratório de Farmacotécnica da UNESA - Campus Rebouças. Foi aplicado teste sensorial para avaliação do brilho e emoliência do cabelo.

Exemplo 6. Medida da Hidratação O processo de medição de hidratação das mechas foi realizado a cada sete dias num período de cinco semanas no Laboratório de Desenvolvimento Galênico (LADEG) da Farmácia Universitária da UFRJ. Para isso, foi utilizado o aparelho CORNEOMETHER marca CM 825. A função deste aparelho é avaliar a quantidade de água evaporada através da fibra capilar por variação de campo. O método está baseado na grande variabilidade do vapor da constante dielétrica da água a qual é registrada automaticamente no aparelho. O valor medido é dado em Unidade Arbitrária de Hidratação (UA), sendo utilizado para a medição das mechas do cabelo A temperatura e a umidade do ambiente foram sempre monitoradas e as mesmas estavam em torno de 25°C e 42% de umidade, respectívamente.

Para cada grupo, foram feitas 5 medições de hidratação e utilizou-se a média de cada avaliação para apresentar e discutir os resuitados. A Análise de Variância ANOVA foi utilizada para avaliar estatisticamente o teor final de hidratação na estrutura capilar com peptídeos hidrolisados de queratina de pena de frango, em relação à formulação sem o hidrolisado ou seja, grupo controle.

Após os tratamentos de hidratação entre os diferentes tipos de mechas observaram-se os graus de hidratação a seguir: (tabela 1) Tabela 1: Teor de hidratação obtido por cada tipo de cabelo. A - mecha ponto zero (lavada somente com lauril sulfato de sódio) e seca sem calor (naturalmente); B - mecha lavada com xampu e condicionador de peptídeos hidrolisados de proteínas 10% e seca com calor e chapinha; C - mecha lavada com xampu e condicionador de peptídeos hidrolisados de proteínas 10%, e seca sem caíor (naturalmente); D - mecha controle (lavada com xampu e condicionador controle) seca com calor e chapinha; E - mecha controle (lavada com xampu e condicionador controle) seca sem calor (naturalmente). Esses resultados das médias foram obtidos no final das cinco semanas.

As figuras 10 e 11 representam à média dos resultados da avaliação de hidratação do grupo de mechas secas sem calor (figura 8) e com calor e placa térmica (figura 9). Para ambas as situações foram feitas comparações entre o teor de hidratação das mechas controle, ponto zero e com peptídeo hidrolisado de proteína 10%.

Observou-se que o grupo de mechas tratadas com preparação controle não apresentou hidratação significativa como às tratadas com peptídeo hidrolisado de proteínas de pena de frango a 10%. A média de hidratação obtida pelo grupo de mechas tratadas com a formulação controle durante as duas avaliações (secando com calor e sem calor) foi inferior à do grupo tratado com o peptídeo hidrolisado a 10%. Inclusive as mechas que foram submetidas ao calor obtiveram menor grau de hidratação do que as que secaram naturalmente em temperatura ambiente. Esse dado confirma que a base utilizada na formulação não interferiu na hidratação Desta forma, torna-se claro a importância dos componentes peptídicos (queratina hidrolisada) na estrutura capilar, proporcionando um grau maior de hidratação. Isso se dá devido à função que esses componentes têm em proteger, enriquecer ou reparar as fibras do cabelo tornado-as mais hidratadas, pois os fragmentos de aminoácidos e de polipeptídios das proteínas hidrolisadas que são compostos de um agrupamento de aminoácido e apresenta peso molecular baixo, parecem se ligar a queratina do cabelo, restaurando a estrutura protéica danificada (PAOLA, M.V.R.V. Cabelos Étnicos. COSMETICS & TOILETRIES, São Paulo, Brasil, v. 11, p. 36-44, Mai/jun 1999 ).

Para a análise estatística dos resultados, foi empregado o método de análise de variância ANOVA, a partir do qual foi possível observar que as comparações entre mechas do ponto zero com as mechas controle com calor e placa térmica e sem calor, secas naturalmente (temperatura ambiente) não apresentaram resultados significativos ao nível de 5%, também não apresentou resultado significativo, as mechas com o hidrolisado de peptídeos sem calor, secas naturalmente. Porém as mechas que utilizaram o peptideo hidrolisado de proteína 10% tiveram um teor de hidratação significativo ao nível de 5%. Isto confirma de forma mais consistente os resultados obtidos anteriormente através do método das médias.

Através dos resultados foi observado que o cabelo virgem por estar com sua cutícula intacta obteve um grau maior de hidratação, uma vez que permite que o produto permaneça em sua estrutura. Já em relação aos cabelos tratados quimicamente foi observado que o teor de absorção é maior quanto menor for o grau de agressão em sua estrutura capilar (EXPÓSITO, F. Tricologia. Espanha, Madri, ed. Eldesa, 5Q-58p, 1995).

Descolorir ou tratar os cabelos com produtos para permanente faz diminuir a quantidade de cistina da fibra capilar. Descolorações drásticas levam também a perda de tirosina e metionina (SCANAVEZ, C. 2001. Alteração na ultra estrutura do cabelo induzidas por cuidados diários e seus efeitos nas propriedades da cor. Tese de Doutorado sob orientação da porfa. Inês Joekes Instituto de Química - UNICAMP.) O uso de produtos com hidrolisados de queratina pode minimizar essa perda e melhorar as características do cabelo O método de medição utilizado tem como função verificar o grau de hidratação da superfície cutânea e como a avaliação foi feita para verificar o grau de hidratação da haste capilar, pode ter ocorrido alguma interferência nos resultados, uma vez que, a estrutura capilar apresenta algumas diferenças em relação à pele como, por exemplo, um menor grau hídrico (PEYREFITTE, G.; MARTINI, M.; CHIVOT, M. Biologia da Pele. Estética-Cosmética; Cosmetologia; Biologia Gerai, São Paulo: Organização Andrei Ltda, 373-379p, 1998. BOTELHO, A, J. Avaliação da hidratação capilar em cabelos alisados utilizando preparação cosmética com extrato de algas marinhas. 2006. 61 f. Trabalho monográfico (Graduação em Farmácia)- Universidade Estácio de Sá, Rio de Janeiro, 2006). Para confirmação dos resultados obtidos, seria necessária posteriormente, a realização da análise da estrutura capilar através da microscopia eletrônica.

Exemplo 7, Analise sensorial Foi feito também um teste para avaliação sensorial das mechas para verificar o grau de brilho e emoliência.

As avaliadoras (total de 20 pessoas) analisaram as mechas (ponto zero) com as de controle e as testes, para verificar qual delas tinha maior brilho e emoliência. A avaliação foi cega, pois as avaliadoras não sabiam qual formulação estava sendo usada. Antes de ser feito o teste as avaliadoras passaram por um processo de higienização das mãos, para retirada de qualquer produto engordurante que pudesse interferir na análise, sendo respondido qual grupo apresentava maior ou menor grau de brilho e emoliência.

Diante da avaliação sensorial realizada para verificar qual das mechas (com hidrolisado a 10% e controle) apresentava maior brilho e emoliência, foram obtidos resultados distintos de acordo com o tipo de secagem realizada. Para o grupo de mechas secas sem calor (a temperatura ambiente) foi observado que o maior percentual de preferência das avaliadoras (65%) foi pelas mechas que haviam sido tratadas com os peptídeos hidrolisados de proteína a 10% e um menor (35%) não foi capaz de optar por qual dos grupos apresentava maior brilho e emoliência (Figura 10). Em contrapartida, para o grupo de mechas secas com calor e placa térmica foi observado que o maior percentual de preferência das avaliadoras (90%) foi pelas mechas que haviam sido tratadas com o hidrolisado de peptídeo a 10% e um menor (10%) não foi capaz de optar por qual dos grupos apresentava maior brilho e emoliência (Figura 11). Estes resultados foram fundamentais para avaliar o quanto o uso do peptídeo hidrolisado de proteína interferiu na estrutura capilar tornando-a mais sedosa e brilhosa.

As figuras 14, 15 e 16 mostram dois grupos de cabelo (quimicamente tratado) controle e tratado com calor.

Na visão do consumidor o brilho está diretamente relacionado com um cabelo saudável, pois quanto maior for o brilho mais saudável será o cabelo (SCHUELLER, R.; ROMANOWSKI. P. Avaliação do Brilho do Cabelo. Cosmetics & Toiletries, Melrose Park IL, Estados Unidos, v.14, p. 52 - 56, set/out. 2002).

Ao utilizar produtos cosméticos hidratantes nos cabelos, os mesmos são responsáveis por aumentar a quantidade de água no fio ou formar uma barreira que dificulte a perda de água, pois o teor de umidade dos cabelos influencia nas propriedades físicas como: carga estática, rigidez, brilho e volume (POZEBON, D. Análise do cabelo: uma revisão dos procedimentos para a determinação de elemento traços e aplicações. Química Nova, Florianópolis, v. 22, n. 6, p. 830-840, 1999. BOTELHO, A, J. Avaliação da hidratação capilar em cabelos alisados utilizando preparação cosmética com extrato de algas marinhas. 2006. 61 f. Trabalhe monográfico (Graduação em Farmácia)-Universidade Estácio de Sá, Rio de Janeiro, 2006).

REINVIDICAÇÕES

Claims (17)

1 . Processo de hidrólise de queratina caracterizada por compreender as etapas de: a) misturar: a.l) de 106 a 5xl07 células/mL de pelo menos uma bactéria da espécie B.subtilis cepa AMR; a.2) de 0,1% a 5% p/p de um material contendo fibras de queratina; a.3) de 0,005% a 10% p/p de meio de cultivo; onde o pH do meio está compreendido na faixa que vai de 7,5 a 8,5; b) manter a mistura em a) em uma temperatura que varia de 20°C a 35°C e sob agitação; c) separar o sobrenadante obtido em b); d) separar os peptídeos hidrolisados do sobrenadante da etapa c);

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela concentração da bactéria do item a.l) ser 107 células/mL.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo material contendo fibras de queratina ser escolhido do grupo que compreende cabelo, penas, cascos, unhas, chifres e mistura dos mesmos.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelas penas serem escolhidas do grupo que compreende penas de frango, galinha, patos, gansos e mistura dos mesmos.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo material contendo fibras de queratina estar na concentração de 1% p/p.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo meio de cultivo compreender extrato de levedura, peptona, KC1, sacarose ou mistura dos mesmos.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo meio de cultura estar na concentração de 5% .

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo pH ser 8,0.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela temperatura ser 28°C.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela agitação ser 300 rpm.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela separação mencionada em c) ser realizada por meio de centrifugação.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela separação mencionada em d) ser realizada por meio de ultrafiltração.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma etapa adicional de preparação do material contendo fibras de queratina antes do mesmo ser utilizado na etapa a).

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela etapa adicional compreender um ou mais passos escolhidos do grupo que compreende: a) lavagem; b) secagem; c) delipidação; e d) misturas de a), b) e/ou c).

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela etapa de lavagem ser realizada com um detergente adequado.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela etapa de delipidação compreender o uso de uma mistura clorofórmio:metanol numa razão que vai de 0,5:1 a 3:1.

17 . Hidrolisado de queratina, com peso molecular de 500Da a lOOODa, caracterizado por ser obtido pelo processo descrito nas reivindicações 1 a 16.