BRPI0621800B1 - Anticorpos que se ligam à proteína FZD10, clones de hibridoma, composições farmacêuticas, kit compreendendo os referidos anticorpos, e método para diagnose ou prognose de uma doença que é associada a homólogo FZD10 ou de uma predisposição para desenvolver a doença em um indivíduo - Google Patents

Abstract

anticorpos monoclonais a fzdio que tem como alvo tumores, e usos desses anticorpos. a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento deste que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga encrespada 10 (fzdio), tal como um anticorpo monoclonal de camundongo, um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. também, a presente invenção refere-se a um método para tratar e/ou prevenir doença associada a fzd1o, a um método para diagnose ou prognose de doença associada a fzdio e a um método para formação de imagem in vivo de fzdio em um indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS QUE SE LIGAM À PROTEÍNA FZD10, CLONES DE HIBRIDOMA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, KIT

COMPREENDENDO OS REFERIDOS ANTICORPOS, E MÉTODO PARA DIAGNOSE OU PROGNOSE DE UMA DOENÇA QUE É ASSOCIADA A HOMÓLOGO FZD10 OU DE UMA PREDISPOSIÇÃO PARA DESENVOLVER A DOENÇA EM UM INDIVÍDUO.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO [0001] Este pedido reivindica prioridade sob o Pedido Provisório

Norte-americano N°. 60/815.257, depositado em 21 de junho de 2006. Todo o conteúdo do pedido acima é incorporado aqui em sua totalidade como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento deste que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga Frizzled 10 (FZD10), tal como um anticorpo monoclonal de camundongo, um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. Também, a presente invenção refere-se a um método para tratar e/ou prevenir doença associada a FZD10; a um método para diagnose ou prognose de doença associada a FZD10; e a um método para formar in vivo imagem de FZD10 em um indivíduo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003] Tem-se provado que anticorpos monoclonais contra moléculas específicas de câncer são úteis no tratamento de câncer (Harris, M. (2004). Lancet Oncol, 5, 292-302). Além de exemplos bemsucedidos de aplicação clínica dos anticorpos humanizados ou quiméricos tais como trastuzumab (Baselga, J. (2004). Oncology, 61, Supl. 2 14-21), rituximab (Maloney, D.G. e outros (1997). Blood, 90, 2188-95) e bevacizumab (Ferrara, N. e outros (2004). Nat Rev Drug Discov, 3, 391-400) em câncer de mama, linfoma maligno e câncer do

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2/72 cólon, vários anticorpos monoclonais contra outros alvos moleculares estão em desenvolvimento e sendo avaliadas suas atividades antitumor. Espera-se que esses anticorpos monoclonais proporcionem uma esperança a pacientes que apresentam tumores que não possuem tratamento eficaz. Um dos outros importantes problemas desses anticorpos monoclonais é obtenção de efeitos terapêuticos seletivos em células cancerosas sem toxicidade grave devido à sua reação específica a células que expressam moléculas-alvo (Crist, W.M. e outros (2001). J Clin Oncol, 19, 3091-102.; Wunder, J.S. e outros (1998). J Bone Joint Surg Am, 80, 1020-33.; Ferguson, W.S. e Goorin, A.M.

(2001). Cancer Invest, 19, 292-315).

[0004] Entre sarcomas de tecido mole, osteossarcoma, sarcoma de

Ewing e rabdomiossarcoma são sensíveis à quimioterapia e essas doenças podem ser bem controladas por meio de quimioterapia. Por outro lado, sarcomas de células fusiformes são resistentes à quimioradioterapia, e pacientes com esses sarcomas usualmente exibem prognose insuficiente. Para sarcoma sinovial (SS), tratamento cirúrgico é eficaz para pacientes em estágio inicial, mas nenhum fármaco terapêutico eficaz é disponível para aqueles em estágio avançado. Portanto, espera-se desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para aperfeiçoar prognose melhor dos pacientes.

[0005] Análise ampla de expressão de genes genômicos em tumores proporciona a informação útil para identificar os novos alvos moleculares para desenvolvimento de novos fármacos anticâncer e marcadores de tumores. Em estudo anterior, os presentes inventores analisaram perfil de expressão de genes de diversos sarcomas de tecido mole usando microarranjo amplo de cDNA genômico consistindo de 23.040 genes e demonstraram que homólogo Frizzled 10 (FZD10) (N^os. de Acesso GenBank AB027464 (SEQ ID NO1) e BAA84093 (SEQ ID NO2)) foi induzido específica e frequentemente em SSs (Nagayama,

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S. e outros (2002) Cancer Res, 62, 5859-66; e WO2004/020668). O produto genético FZD10 é um membro da família de Proteínas Frizzled e um receptor de sinal putativo WNT (Koike, J. e outros (1999). Biochem Biophys Res Commun, 262, 39-43). Análise adicional mostrou que FZD10 é expressa especificamente em SS, e sob nenhum nível ou nível dificilmente detectável em outros órgãos normais, exceto a placenta, sugerindo que terapêutica que tem como alvo essa molécula não causaria nenhuma ou pequena reação adversa (Nagayama, S. e outros (2002). Cancer Res, 62, 5859-66). Experimentos de RNAi implicaram que FZD10 era significativamente envolvida no crescimento de tumor de SS (WO2006/013733). Adicionalmente, os presentes inventores geraram o anticorpo policlonal de coelho contra o domínio extracelular de FZD10 (FZD10-ECD) e verificaram que esse anticorpo tinha atividade antitumor em modelo de xenoenxerto de SS em camundongo (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-12; e

WO2005/004912). Ao mesmo tempo, poderia esperar-se que a terapia de anticorpos contra FZD10 melhora o resultado clínico de SS. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] Abaixo, registra-se essa geração dos anticorpos monoclonais murinos contra FZD10 por meio de método de imunização celular para possível aplicação clínica. Atividade de ligação a tumores in vivo desses anticorpos foi avaliada usando sistema de formação de imagem fluorescente in vivo com fluorescência perto do infravermelho, além do método convencional com radionuclídeos. Aqui, revelou-se a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais anti-FZD10 tanto in vitro quanto in vivo, bem como internalização desses anticorpos nas células que expressam FZD10, e verificou-se que em camundongos xenoenxertados que portam SYO-1 tratados com Mab anti-FZD10 marcado com ⁹⁰Y em uma única veia da cauda sob dose de 100 μθΐ observou-se significativo efeito antitumor.

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4/72 [0007] Com base nas verificações acima, os presentes inventores concluíram que os anticorpos monoclonais murinos contra FZD10 apresentam potencial terapêutico no tratamento e diagnose de SS e outros tumores que superexpressam FZD10.

[0008] Portanto, no primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento deste que compreende uma região V (variável) de cadeia H (pesada) que compreende uma região determinadora de complementaridade (CDR), que apresenta as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 15, 17 e 19 ou uma CDR funcionalmente equivalente e uma região V de cadeia L (leve) que compreende uma CDR que apresenta as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 23, 25 e 27 ou uma CDR funcionalmente equivalente, e que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga Frizzled 10 (FZD10) ou um peptídeo parcial desta.

[0009] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento deste é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo de camundongo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um fragmento de anticorpo e anticorpo de cadeia única.

[00010] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo de camundongo. Preferencialmente, o anticorpo de camundongo compreende uma cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 57 e/ou uma cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 59. Por exemplo, o anticorpo de camundongo pode ser produzido pelo clone de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628).

[00011] Em uma modalidade alternativa preferida, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 13, por exemplo, o anticorpo quimérico poderá compreender uma cadeia H que apresenta a

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5/72 sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 46. Preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 21, por exemplo, o anticorpo quimérico poderá compreender uma cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 48.

[00012] Mais preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 13 e uma região V de cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 21. Por exemplo, o anticorpo quimérico compreende uma cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 46 e uma cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 48.

[00013] Em uma modalidade, o anticorpo quimérico compreende adicionalmente uma região C (constante) de anticorpos humanos.

[00014] Em uma modalidade alternativa preferida, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende adicionalmente uma região FR (estrutura) de anticorpos humanos e/ou uma região C de anticorpos humanos.

[00015] No segundo aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento deste que compreende uma região V (variável) de cadeia H (pesada) que compreende uma região determinadora de complementaridade (CDR) que apresenta as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 31,33 e 35 ou uma CDR funcionalmente equivalente e uma região V de cadeia L (leve) que compreende uma CDR que apresenta as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 39, 41 e 43 ou uma CDR funcionalmente equivalente, e que é capaz de ligar-se a uma proteína homóloga Frizzled 10 (FZD10) ou um peptídeo parcial desta.

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6/72 [00016] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento deste é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo de camundongo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um fragmento de anticorpo e anticorpo de cadeia única.

[00017] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo de camundongo. Preferencialmente, o anticorpo de camundongo compreende uma cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 61 e/ou uma cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 63. Por exemplo, o anticorpo de camundongo pode ser produzido pelo clone de hibridoma 93-22 (FERM BP-10620).

[00018] Em uma modalidade alternativa preferida, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 29, por exemplo, o anticorpo quimérico compreende uma cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 50. Preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 37, por exemplo, o anticorpo quimérico compreende uma cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 52.

[00019] Mais preferencialmente, o anticorpo quimérico compreende uma região V de cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 29 e uma região V de cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 37. Por exemplo, o anticorpo quimérico compreende uma cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 50 e uma cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 52.

[00020] Em uma modalidade, o anticorpo quimérico compreende

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7/72 adicionalmente uma região C (constante) de anticorpos humanos. [00021] Em uma modalidade alternativa preferida, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende adicionalmente uma região FR (de moldura) de anticorpos humanos e/ou uma região C de anticorpos humanos.

[00022] Em ainda uma modalidade alternativa, o anticorpo ou fragmento deste pode ser marcado com um marcador de radioisótopo ou um marcador fluorescente. Esse marcador de radioisótopo inclui ⁹⁰ítrio (⁹⁰Y), ¹²⁵iodo (¹²⁵I) e ¹¹¹índio (¹¹¹In).

[00023] No terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um clone de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628) que produz o anticorpo monoclonal de camundongo 92-13.

[00024] No quarto aspecto, a presente invenção proporciona um clone de hibridoma 93-22 (FERM BP-10620) que produz o anticorpo monoclonal de camundongo 93-22.

[00025] No quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir uma doença que é associada a homólogo Frizzled 10 (FZD10) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento acima. Em uma modalidade, a doença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).

[00026] No sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método para diagnose ou prognose de uma doença que é associated a homólogo Frizzled 10 (FZD10) ou de uma predisposição para desenvolver a doença em um indivíduo, compreendendo (a) contatar uma amostra ou um espécime do indivíduo com o anticorpo ou fragmento acima;

(b) detectar a proteína FZD10 na amostra ou espécime; e (c) julgar se o indivíduo sofre ou não de ou está em risco de

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8/72 desenvolver a doença, com base na abundância relativa da proteína FZD10 em comparação com um controle.

[00027] Em uma modalidade, a doença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).

[00028] No sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um método para formação de imagem in vivo de proteína homóloga Frizzled 10 (FZD10) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento acima.

[00029] No oitavo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença associada a homólogo Frizzled 10 (FZD10), compreendendo o anticorpo ou fragmento acima e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00030] Em Nono aspecto, a presente invenção proporciona um kit para diagnose ou prognose de uma doença associada a homólogo Frizzled 10 (FZD10), compreendendo o anticorpo ou fragmento acima.

[00031] No décimo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para formação de imagem in vivo de proteína homóloga Frizzled 10 (FZD10), compreendendo o anticorpo ou fragmento acima.

[00032] No décimo primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uso do anticorpo ou fragmento acima na produção de um kit para diagnose ou prognose de uma doença associada a homólogo Frizzled 10 (FZD10).

[00033] No décimo segundo aspecto, a presente invenção proporciona uso do anticorpo ou fragmento acima na produção de uma composição para prevenção ou tratamento de uma doença associada a homólogo Frizzled 10 (FZD10).

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9/72 [00034] O termo doença que é associada a FZD10 (doença associada a FZD10) refere-se a uma doença que é associada a superexpressão de proteína FZD10. Essas doenças incluem, mas sem se limitar às mesmas, sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).

[00035] O termo fragmento significa qualquer fragmento de anticorpo que pode ser preparado do anticorpo contra proteína FZD10 e contém CDRs definidas. Esse fragmento inclui, mas sem se limitar aos mesmos, fragmento Fab, fragmento F (ab')2 e fragmento Fv.

[00036] O termo anticorpo modificado significa qualquer anticorpo que pode ser derivado do anticorpo contra FZD10 e contém CDRs definidas. Esse anticorpo modificado inclui, mas sem se limitar ao mesmo, um anticorpo modificado com PEG. O fragmento de anticorpo ou fragmento modificado pode ser imediatamente reconhecido por aquele habilitado no estado da técnica e produzido mediante uso de quaisquer métodos conhecidos no estado da técnica.

[00037] O termo indivíduo, aqui, refere-se a um indivíduo que tem sofrido de doença associada a FZD10 e também a indivíduo suspeito de apresentar doença associada a FZD10. O indivíuo na presente invenção poderá ser animais que incluem mamíferos e animais aviários. Por exemplo, mamíferos poderão incluir seres humanos, camundongos, ratos, macacos, coelhos e cães.

DESCRIÇÃO CONCISA DOS DESENHOS [00038] As figuras 1a a 1f mostram caracterização de especificidade de ligação de dois anticorpos monoclonais anti-FZD10.

[00039] A figura 1a mostra análise fluxocitométrica dos quatro anticorpos 39-2 e 39-10 (descritos in WO2005/004912), 92-13 e 93-22, usando cinco linhagens de SS (SYO-1, YaFuSS, HS-SY-2, Fuji e 1973/99) e uma linhagem de células de câncer do cólon (LoVo). Linhas

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10/72 sólidas mostram a intensidade fluorescente detectada por cada mAb; linhas interrompidas representam as intensidades fluorescentes de células incubadas com IgG de camundongo não-imunizado como controle negativo.

[00040] A figura 1b mostra RCP-TA semiquantitativa de FZD10 nas mesmas linhagens de células tumorais conforme usado na figura1a. Expressão de gene para p2-microglobulina (f2MG) serviu como controle interno.

[00041] A figura 1c mostra análise fluxocitométrica de 92-13 (painéis superiores) e 93-22 (painéis inferiores) contra FZD10 exógeno foram indicados. Linhagem de células de câncer de cólon, SNU-C5, foi transfectada com vetor vazio pCAGGS (painéis esquerdos) ou pCAGGS-FZD10-myc/His (painéis direitos) e analisados 48 horas após transfecção. Linhas sólidas mostram a intensidade fluorescente detectada por cada mAb; linhas interrompidas representam as intensidades fluorescentes de células incubadas com IgG de camundongo não-imunizado como controle negativo.

[00042] A figura 1d mostra ligação de 39-10, 39-2, 92-13 e 93-22 marcados com ¹²⁵I com células sanguíneas humanas normais. Mabs radiomarcados foram incubados com cada amostra de sangue humano normal novo de três indivíduos (A, B e C) na ausência (barra aberta) ou presença (barra fechada) de anticorpos idênticos não-marcados.

[00043] A figura 1e mostra atividade de ligação de Mabs marcados com ¹²⁵I. Uma quantidade constante de Mabs radiomarcados foi incubada com células SYO-1 quantidade crescente de anticorpos nãomarcados. A radioatividade percentual ligada a células foi plotada contra a quantidade de anticorpos não-marcados. Cículo fechado, 92-13; Círculo aberto, 93-22.

[00044] A figura 1f mostra análise fluxocitométrica de autoblocos e blocos cruzados. 92-13 marcados com Alexa-488 (painéis superiores) e

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93-22 (painéis inferiores) foram incubados com células SYO-1 em (i) PBS, ou na presença de 100 pg de (ii) 92-13 não-marcado e (iii) 93-22 não-marcado. Histograma sombreado mostra a intensidade fluorescente detectada por cada Mab marcado com Alexa488; linhas interrompidas representam as intensidades fluorescentes de células incubadas com PBS como controle negativo.

[00045] A figura 2 mostra análises imuno-histoquímicas em seções de tecido com SS congelado e de tecido humano normal congelado sem anticorpo (a, d, g, j, e m), 92-13 (b, e, h, k, e n) e 93-22 (c, f, i, l, e o). (a-

c), sarcoma sinovial; (d-f), rim; (g-i), fígado; (j-l), coração; (m-o), cérebro. Ampliação original: x100.

[00046] A figura 3 mostra biodistribuição de anticorpos marcados com ¹¹¹In e com ¹²⁵I. 10 kBq de (a), 92-13 marcado com ¹¹¹In, (b), 92-13 marcado com ¹²⁵I, (c), 93-22 marcado com ¹¹¹In e (d), 93-22 marcado com ¹²⁵I, foram injetados intravenosamente em camundongos nus BALB/c portando tumor SYO-1. Os órgãos e o tumor foram dissecados em uma hora (barra aberta), 24 horas (barra hachurada) e 48 horas (barra fechada), e as radioatividades foram medidas. Os dados mostrados são os dados representativos de dois experimentos independentes.

[00047] A figura 4a mostra formação de imagem por fluorescência in vivo de camundongos que portam tumor SYO-1 após injeção de 92-13 ou 93-22 marcado com Alexa 647. Mabs marcados com fluorescência foram administrados sob uma dose de 20 pg por camundongo intraperitonealmente. Todas as imagens de fluorescência foram adquiridas com um tempo de exposição de 60 segundos (f/parada = 2) antes de injeção, imediatamente após injeção (0 hora), 24, 48 e 96 horas. As setas indicam a posição do tumor. Tumor de S.C. localiza-se no dorso para 92-13 (painéis superiores) e no tronco para 93-22 (painéis inferiores). Sinal de fluorescência de Alexa647 foi pseudocolorido de

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12/72 acordo com a barra de cor indicada à direita. Em 93-22 (painel inferior), as pontas das flechas indicam a posição de injeção.

As figuras 4b e 4c mostram imagens representativas de órgãos e tumores dissecados de camundongos mostrados nas figura 4a, 4b, 9213, e 4c, 93-22; i, tumor SYO-1; ii, fígado; iii, baço; iv, rim; v, pâncreas; vi, cólon.

[00048] A figura 5a mostra formação de imagem por fluorescência in vivo de camundongos que portam tumor LoVo após injeção de 92-13 ou 93-22 marcado com Alexa647. Mabs marcados com fluorescência foram administrados como na figura4. Todas as imagens de fluorescência foram adquiridas com um tempo de exposição de 60 segundos (f/parada = 2) imediatamente após injeção (0 hora), 48, 72, 96 e 120 horas (h). As setas indicam a posição do tumor. Tumor de S.C. localiza-se no antebraço direito tanto para 92-13 (painéis superiores) quanto para 9322 (painéis inferiores).

[00049] As figuras 5b e 5c mostram imagens representativas de órgãos e tumores dissecados de camundongos mostrados nas figuras 5a, 5b, 92-13, e 5c, 93-22; i, tumor LoVo; ii, fígado; iii, baço; iv, rim; v, pâncreas; vi, cólon.

[00050] A figura 6 mostra internalização de 92-13 e 93-22 foi avaliado por microscopia confocal. Células foram tratadas com PBS (a, d e g), 50 pg/ml de 92-13 (b, e e h) ou 93-22 (c, f, i) por 3 horas em 37^oC, 5% de CO2. Anticorpos ligados à superfície celular foram separados por ácido com tampão de glicina 0,1 M (pH 2,5). As células foram fixadas, permeabilizadas e, em seguida, bloqueadas com BSA a 3%. Anticorpos intracelulares foram detectados com IgG-Alexa488 de cabra anticamundongo e o núcleo foi corado com DAPI. (a - c), SYO-1; (d - f), YaFuSS; (g - i) Lovo.

[00051] A figura 7 mostra o efeito de 92-13 marcado com ⁹⁰Y sobre o crescimento de tumor. Quando os tumores foram estabelecidos (0,4

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2,7cm³), camundongos receberam em uma única veia da cauda 100 μθΐ de 92-13 marcado com ⁹⁰Y.

[00052] A figura 8 mostra que tanto 92-13 quanto 93-22 quiméricos induziram ADCC (sigla em inglês para citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos) especificamente nas células SYO-1 que superexpressam FZD10. 1 μg/ml de anticorpo quimérico 93-22 (ch93-22) ou anticorpo quimérico 92-13 (ch92-13) sob várias razões Efetuador:Alvo. PBMCs (sigla em inglês para células mononucleares de sangue periférico) de vários doadores foram usados como célula efetuadora; (a), (c) ADCC de 92-13 quimérico contra célula SYO-1 com cinco doadores humanos saudáveis de PBMCs. (b), (d) ADCC de 93-22 quimérico contra célula LoVo com dois doadores humanos saudáveis de PBMCs. Quantificação de citotoxicidade com atividade de LDH é descrita in (Nagayama, S. e outros, Oncogene, 24, 6201-12).

DESCRIÇÃO DETALHADA E MODALIDADES PREFERIDAS DA PRESENTE INVENÇÃO [00053] Homólogo Frizzled 10 (FZD10) é um membro da família Frizzled, que é um receptor de sinalização de Wnt. Como descrito abaixo, estabeleceu-se de forma bem-sucedida que anticorpos monoclonais murinos e anticorpos quiméricos contra proteína FZD10 que poderão ser úteis para uso médico.

[00054] Os anticorpos monoclonais murinos específicos a FZD10 (Mabs 92-13 e 93-22) são estabelecidos mediante imunização de camundongos com células transfectadas com FZD10. Mostrou-se que ambos os Mabs 92-13 e 93-22 apresentam atividade de ligação específica contra FZD10 em linhagem de células de SS, células SYO-1 e células COS7 transfectadas com FZD10 mediante uso de análise de fluxocitometria (FACS). Para validar a atividade de ligação específica desses anticorpos in vivo, os presentes inventores injetaram intraperitoneal ou intravenosamente Mabs marcados com fluorescência

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14/72 nos camundongos que portam xenoenxertos de SS e verificaram que esses Mabs ligaram-se aos tumores que expressam FZD10, mas não a qualquer outro tecido normal de camundongo, por meio de uso do sistema de formação de imagem fluorescente in vivo e radioatividades. Análises imuno-histoquímicas subsequentes com os Mabs confirmaram uma ausência ou nível dificilmente detectável de proteína FZD10 em órgãos humanos normais, exceto a placenta. Adicionalmente, de forma interessante os presentes inventores verificaram que os Mabs foram internalizados nalinhagem de células de SS, SYO-1, mas não em linhagem de células negativas a FZD10, LoVo, usando microscopia confocal de varredura a laser. Surpreendentemente, observou-se que camundongos xenoenxertados que portam SYO-1 tratados em uma única veia da cauda com Mab anti-FZD10 marcado com ⁹⁰Y (92-13) sob dose de 100μ0ΐ apresentam significativo efeito antitumor. Tomados juntamente, concluiu-se que esses Mabs específicos contra FZD10 poderiam ser utilizados como novo marcador de diagnóstico ou tratamento de SS com risco mínimo ou nenhum risco de reações adversas.

[00055] Devido à sua estrutura protéica complicada, é frequentemente muito difícil gerar anticorpos contra sete proteínas de transmembrana. Em estudo anterior, os presentes inventores demonstraram que FZD10 formava homo-oligômero (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-12). Após falha de múltiplas tentativas de gerar anticorpos monoclonais anti-FZD10 que poderiam reconhecer uma forma nativa de FZD10 pelo uso de proteínas FZD10 de comprimento completo ou parcialmente recombinantes, finalmente aplica-se a imunização por meio de injeção de células vivas COS-7 que superexpressam FZD10 na almofada do pé de camundongos Balb/c e obtêm-se com êxito os dois hibridomas que produzem anticorpos antiFZD10 que tinham a capacidade de reconhecer a forma nativa de

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FZD10 em células vivas por análise FACS. Uma vez que esses anticorpos não detectaram proteína FZD10 em Western blotting, os presentes inventores admitem que esses Mabs reconhecem a estrutura terciária de FZD10.

[00056] Para investigar a distribuição in vivo de Mabs 92-13 e 93-22, os presentes inventores aplicaram dois métodos, um baseado nas modalidades de radionuclídeos usando anticorpos marcados com ¹²⁵I e ¹¹¹In, e outro baseado na formação de imagem por fluorescência utilizando anticorpos marcados perto do infravermelho (Alexa647). Substância fluorescente perto do infravermelho, principalmente corante indocianina, é agora amplamente usada na formação de imagem in vivo com fins diagnósticos porque a luz desse comprimento de onda penetra tecido vivo bastante eficientemente (Chen, X. e outros (2004). Cancer Res, 64, 8009-14). Duas abordagens dos resultados obtidos foram muito concordantes e indicaram que 92-13 e 93-22 ligaram-se a células tumorais SYO-1, mas não a outros tecidos normais. Para confirmar se esses anticorpos podem ser aplicados em uso clínico, os presentes inventores examinaram adicionalmente a atividade de ligação de anticorpos contra células sanguíneas normais. A atividade de ligação de 92-13 e 93-22 marcados com ¹²⁵I contra células sanguíneas humanas normais foi indetectável em todos os três doadores individuais (figura1d). Esses resultados foram consistentes com aqueles de análise FACS usando célula mononuclear de sangue periférico humano (dados não mostrados), sugerindo aplicabilidade clínica desses dois anticorpos com pequena possibilidade de efeito adverso em pacientes de SS devido à afinidade de ligação muito específica pela molécula de FZD10. Adicionalmente, experimentos in vitro utilizando microscopia confocal revelaram que a ligação específica de Mabs 92-13 e 93-22 em FZD10 de superfície celular induziu a internalização dos anticorpos (figura6). Como descrito anteriormente (Stein, R. e outros (2001). Criti Rev Oncol

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Hematol, 39, 173-80; Stein, R. e outros (2005). Clin Cancer Res, 11, 2727-34), se Mabs marcados são internalizados após ligação, anticorpo marcado com ¹²⁵I é metabolizado nos lisossomos e difundidos de células tumorais alvo em que anticorpo marcado com ¹¹¹In permanece nos lisossomos. Como observado na figura 3, as radioatividades de anticorpo marcado com ¹¹¹In e anticorpo marcado com ¹²⁵I em tumores foram significativamente diferentes (figura3, a e b, c e d). Essas verificações sugerem que Mabs 92-13 (e 93-22) podem internalizar-se especificamente nas células de SS via proteína FZD10.

[00057] Quando anticorpos são aplicados em terapia de câncer, os seguintes três mecanismos são ensinados para exercer a atividade antitumor: (i) no caso em que a molécula-alvo é involvida em aumento de crescimento, neutralização de anticorpos bloqueiaria a transdução de sinal de crescimento e, em seguida, suprimiria o crescimento de células tumorais; (ii) a segunda possibilidade é as atividades do efetuador induzirem citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC, em inglês); (iii) o terceiro caso são radionuclídeos ou fármaco antitumor que são conjugados com anticorpos e são transportados até as células do tumor alvo de maneira eficaz. Embora os presentes inventores tenham demonstrado anteriormente que a molécula-alvo FZD10 é involvida no crescimento de tumores de SS, nem Mab 92-13 nem Mab 93-22 mostraram o efeito neutralizante in vitro quando adicionados ao meio de cultura celular (dados não mostrados) ou in vivo quando injetados nos camundongos que portam tumor (dados não mostrados).

[00058] Conjugação de radionuclídeo ou fármaco anticâncer com anticorpos tal como Zevalina (anticorpo anti-CD20 conjugado com ⁹⁰ítrio) e Mylotarg (anticorpo anti-CD33 conjugado com caliqueamicina) provou ser altamente eficaz para conferir citotoxicidade aos anticorpos

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17/72 (Wiseman, G.A. e Witzig, T.E. (2005). CancerBiother Radiopharm, 20, 185-8; van der Velden, V.H. e outros (2001). Blood, 97, 3197-204; Carter, P. (2001). Nat Rev Cancer, 1, 118-29). Mylotarg exerce sua atividade antitumor mediante liberação de fármaco antitumor, caliqueamicina, na célula cancerosa após ser internalizado (van der Velden, V.H. e outros (2001). Blood, 97, 3197-204). Nos Exemplos, para experimentos terapêuticos, conjugado ⁹⁰ítrio-DTPA-92-13 foi gerado e sua atividade antitumor investigada. Em modelo de xenoenxerto em camundongo, tumores rapidamente diminuíram após tratamento de ⁹⁰ítrio-DTPA-9213 (figura 7). Notavelmente, os tumores que incluem volume maior (> 1cm³) de tumor não mostraram refração até 34 dias após administração e nenhuma toxicidade intensa foi observada. Uma vez que anticorpos 92-13 e 93-22 anti-FZD10 seriam provavelmente internalizados de maneira eficaz em células positivas a antígenos como mostrado na figura 6, conjugação de fármaco anticâncer com ambos os Mabs 92-13 e 93-22 é também esperada exercer o alto efeito anticâncer em células de SS. Referindo-se à atividade efetuadora, tanto 92-13 quanto 93-22 quiméricos induziram ADCC especificamente nas células de SYO-1 que superexpressam FZD10 (figuras 8, a e c), mas não nas células LoVo negativas a FZD10 (figuras 8, b e d). Particularmente, 92-13 quimérico mostrou maior indução de citotoxicidade em comparação com 93-22 quimérico, entretanto, sua atividade depende de doador de células efetuadoras, possivelmente causada por polimorfismo de receptor de Fc. Em conclusão, os presentes inventores produziram com êxito anticorpos monoclonais que foram capazes de ligar-se especificamente a FZD10 em células tumoarais que superexpressam FZD10 in vitro e in vivo. Ao mesmo tempo, os presentes inventores estão confiantes de que anticorpos monoclonais anti-FZD10 apresentam grande potencial de desenvolvimento de novas terapias com fármacos para tratamento de SS e outros tumores que superexpressam FZD10.

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1. PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO [00059] Anticorpos que podem ser usados na presente invenção especificamente reagem contra uma proteína FZD10 derivada de uma doença associada a FZD10. O termo anticorpo usado aqui significa uma molécula de anticorpo como um todo, ou seus fragmentos tais como fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 e fragmentos Fv, que podem ligar-se à proteína ou seus peptídeos parciais como antígenos. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. Ele pode também ser um anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico, ou um anticorpo de cadeia única Fv (scFv). Os anticorpos (anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais) para uso na presente invenção pode ser preparado, por exemplo, pelo processo seguinte.

(1) Anticorpo monoclonal [00060] Inicialmente, é preparado um antígeno para a produção de um anticorpo útil na presente invenção. Proteína FZD10 ou seu peptídeo parcial pode ser usada como uma proteína imunogênica. Alternativamente, a célula que expressa proteína FZD10 ou peptídeo parcial pode também ser usada como imunógeno. A sequência de aminoácidos de proteína FZD10 usada como imunógeno na presente invenção e a sequência de cDNA que codifica a proteína são publicamente disponíveis em GenBank como Nos. de Acesso BAA84093 (SEQ ID NO 1) e AB027464 (SEQ ID NO 2), respectivamente. A proteína FZD10 ou peptídeo parcial para uso como imunógeno pode ser sinteticamente preparada de acordo com um procedimento conhecido no estado da técnica tal como um processo de síntese de peptídeo em fase sólida, usando a informação disponível sobre sequência de aminoácidos. Os peptídeos parciais de proteína FZD10 incluem, mas sem se limitar aos mesmos, um peptídeo que contém resíduos 1-225 de uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO 1, que corresponde ao domínio extracelular de término N

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19/72 da proteína FZD10 (FZD10-ECD).

[00061] A proteína ou peptídeo parcial, ou a célula que os expressa, podem ser preparados usando a informação de sequência de cDNA que codifica proteína FZD10 ou peptídeo parcial, de acordo com um procedimento conhecido de recombinação genética. A produção da proteína ou peptídeo parcial, bem como a célula que os expressa, de acordo com esse procedimento de recombinação genética, serão ilustrados abaixo.

[00062] Um vetor recombinante para a produção de proteína pode ser obtido ligando a sequência e cDNA acima a um vetor apropriado. Um transformante pode ser obtido mediante introdução do vetor recombinante para a produção de proteína em um hospedeiro, de modo que a proteína-alvo FZD10 ou peptídeo parcial possam ser expressos. [00063] Como vetor, é usado um fago ou plasmídeo que é capaz de replicar autonomamente em um hospedeiro. Exemplos de um DNA de plasmídeo incluem pCAGGS, pET28, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19 e outros DNAs de plasmídeo derivados de Escherichia coli; pUB110, pTP5, e outros DNAs de plasmídeo derivados de Bacillus subtilis; e YEp13, YEp24, YCp50 e outros DNAs de plasmídeo derivados de lêvedo. Exemplos de um DNA de fago incluem fagos lâmbda tais como Xgt11 e λΖΑΡ. Adicionalmente, vetores de vírus animal tais como vetor de retrovírus e vetor de vírus de vaccínia podem ser usados, e vetores de vírus de inseto tal como vetor de baculovírus podem também ser usados.

[00064] O DNA que codifica a proteína FZD10 ou peptídeo parcial (daqui por diante referido como DNA de FZD10) é inserido no vetor, por exemplo, por meio do método seguinte. Nesse método, DNA purificado é clivado por uma enzima de restrição apropriada e inserido em um sítio de enzima de restrição ou um sítio de clonagem múltipla de um DNA de vetor apropriado para ligar-se ao vetor.

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20/72 [00065] Além de um promotor e do DNA de FZD10, qualquer dentre intensificadores e outros elementos cis, sinais de ligação, sinais de adição de poli A, marcadores seletivos, sítio de ligação de ribossomos (RBS) e outros elementos podem ser ligados ao vetor recombinante para a produção de proteína para uso em células de mamíferos, se desejado.

[00066] Para ligar o fragmento de DNA ao fragmento de vetor, uma DNA ligase conhecida pode ser usada. O fragmento de DNA e o fragmento de vetor são recozidos e ligados, produzindo desse modo um vetor recombinante para a produção de uma proteína.

[00067] O hospedeiro para uso na transformação não é especificamente limitado, contanto que ele permita que a proteína FZD10 ou peptídeo parcial seja expresso nele. Exemplos do hospdedeiro incluem bactérias, por exemplo, E. coli, e Bacillus; lêvedo, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae; células animais, por exemplo, células COS, células do Ovário de Hamster Chinês (CHO, em inglês) e células de inseto.

[00068] Por exemplo, quando uma bactéria é usada como hospedeiro, o vetor recombinante para a produção de proteína deverá preferencialmente ser capaz de replicar-se autonomamente na bactéria hospedeira e compreender um promotor, um sítio de ligação de ribossomos, o DNA de FZD10 e uma sequência de terminação de transcrição. O vetor recombinante poderá compreender adicionalmente um gene para regular o promotor. Um exemplo de Escherichia coli inclui Escherichia coli BRL, e um exemplo de Bacillus é Bacillus subtilis. Qualquer promotor que pode ser expresso no hospedeiro tal como Escherichia coli pode ser usado aqui.

[00069] O vetor recombinante pode ser introduzido na bactéria hospedeira por meio de qualquer procedimento conhecido no estado da técnica. Tais procedimentos incluem, por exemplo, um método que

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21/72 utiliza íons de cálcio e eletroporação. Quando célula de lêvedo, célula animal ou célula de inseto é usada como hospedeiro, um transformante pode ser produzido de acordo com um procedimento conhecido no estado da técnica, e, em seguida, a proteína FZD10 ou peptídeo parcial pode ser produzido no hospedeiro (transformante).

[00070] A proteína FZD10 ou peptídeo parcial para uso como imunógeno na presente invenção pode ser obtida de uma cultura do transformante gerado acima. A cultura refere-se a qualquer dentre sobrenadante de cultura, células cultivadas, microorganismos cultivados e homogenados dos mesmos. O transformante é cultivado em um meio de cultura por meio de um processo convencional de cultura de hospedeiro.

[00071] O meio de cultura para cultivar o transformante obtido mediante uso de Escherichia coli, lêvedo ou outros microorganismos como hospedeiro pode ser um meio natural ou um meio sintético, contanto que ele compreenda uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e outros componentes utilizáveis pelo microorganismo e permita que o transformante cresça eficientemente.

[00072] O transformante é geralmente cultivado agitando vigorosamente a cultura ou cultura com aeração com agitação sob condições aeróbicas a 25°C a 37°C por 3 a 6 horas. Durante cultura, o pH é mantido em um nível próximo de neutralidade mediante ajuste com, por exemplo, um ácido inorgânico ou orgânico e uma solução alcalina. Durante cultura, antibióticos tal como ampicilina ou tetraciclina poderão ser adicionados ao meio de acordo com o marcador seletivo introduzido no vetor de expressão recombinant, se necessário.

[00073] Após cultura, quando a proteína FZD10 ou peptídeo parcial é produzido no microorganismo ou célula, a proteína ou peptídeo parcial é extraído por homogeneização do microorganismo ou célula. Quando a proteína FZD10 ou peptídeo parcial é secretada do microorganismo

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22/72 ou célula, o meio de cultura é usado como tal, ou fragmentos do microorganismo ou célula são removidos do meio de cultura, por exemplo, por centrifugação. Em seguida, a proteína FZD10 ou peptídeo parcial pode ser isolado da cultura e purificada por meio de um método bioquímico convencional para o isolamento e purificação de proteínas, tal como precipitação por sulfato de amônio, cromatografia em gel, cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade, seja individualmente, seja em combinação.

[00074] Se a proteína FZD10 ou peptídeo parcial foi ou não obtido pode ser confirmado, por exemplo, por eletroforese em SDS gel de poliacrilamida.

[00075] Em seguida, a proteína FZD10 ou peptídeo parcial obtido, ou o transformante, é dissolvido em um tampão para preparar um imunógeno. Onde necessário, um adjuvante pode ser adicionado para imunização eficaz. Esses adjuvantes incluem, por exemplo, adjuvante de Freund completo comercialmente disponível e adjuvante de Freund incompleto. Qualquer um desses adjuvantes pode ser usado isoladamente ou em combinação.

[00076] O imunógeno assim preparado é administrado a um mamífero tal como coelho, rato ou camundongo. A imunização é realizada principalmente por injeção intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal. O intervalo de imunização não é especificamente limitado e o mamífero é imunizado uma a três vezes em intervalos que variam de diversos dias a semanas. Células que produzem anticorpos são coletadas 1 a 7 dias após a última imunização. Exemplos das Células que produzem anticorpos incluem células do baço, células do nodo linfático e células de sangue periférico.

[00077] Para obter um hibridoma, são fundidas uma célula que produz anticorpos e uma célula de mieloma. Como célula de mieloma a ser fundida com a célula que produz anticorpos, pode ser usada uma

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23/72 linhagem de células estabelecida geralmente disponível. Preferencialmente, a linhagem de células usada deverá apresentar seletividade a fármaco e propriedades tais que ela não possa sobreviver em um meio seletivo a HAT (contendo hipoxantina, aminopterina e timidina) sob forma não-fundida e possa sobreviver somente quando fundida com uma célula que produz anticorpos. Células de mieloma possíveis incluem, por exemplo, linhagens de células de mieloma de camundongos tais como P3X63-Ag.8.U1 (P3U1) e NS-I.

[00078] Em seguida, a célula de mieloma e a célula que produz anticorpos são fundidas. Para a fusão, essas células são misturadas, preferencialmente à razão de 5:1 da célula que produz anticorpos para a célula de mieloma, em um meio de cultura para células animais que não contêm soro, tais como meios DMEM e RPMI-1640, e fundidas na presença de um agente promotor de fusão de células tal como polietilenoglicol (PEG). A fusão de células poderá também ser realizada utilizando um dispositivo de fusão de células comercialmente disponível, usando eletroporação.

[00079] Em seguida, o hibridoma é extraído das células após o tratamento de fusão acima. Por exemplo, a suspensão de células é apropriadamente diluída com, por exemplo, o meio RPMI-1640 contendo soro bovino fetal e, por conseguinte, plaqueada em uma placa de microtitulação. Um meio seletivo é adicionado em cada cavidade, e as células são cultivadas com substituição apropriada do meio seletivo. Como resultado, as células que crescem cerca de 30 dias após o início de cultura no meio seletivo podem ser obtidas como hibridoma.

[00080] O sobrenadante da cultura do hibridoma em crescimento é então selecionado em relação à presença de um anticorpo que reage com a proteína FZD10 ou peptídeo parcial. A seleção de hibridoma pode ser realizada de acordo com um procedimento convencional, por exemplo, usando ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA),

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24/72 imunoensaio enzimático (EIA) ou rádio-imunoensaio (RIA, em inglês). As células fundidas são clonadas por meio de diluição limitativa para estabelecer um hibridoma, que produz o anticorpo monoclonal de interesse.

[00081] O anticorpo monoclonal pode ser coletado do hibridoma estabelecido, por exemplo, por meio de um método convencional de cultura de células ou mediante produção de ascite. Se necessário, o anticorpo pode ser purificado no método de coleta de anticorpos descrito acima de acordo com um procedimento conhecido tais como precipitação por sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, filtração em gel, cromatografia de afinidade ou uma combination destas. [00082] O tipo de globulina dos anticorpos monoclonais úteis na presente invenção não é especificamente limitado, contanto que eles sejam capazes de ligar-se especificamente à proteína FZD10 e pode ser qualquer dentre IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Dentre estes, IgG e IgM são preferidos.

[00083] Na presente invenção, anticorpos monoclonais murinos 9322 e 92-13 são estabelecidos de forma bem-sucedida e preferencialmente usados. O clone de hibridoma 93-22 que produz anticorpo monoclonal de camundongo 93-22 foi depositado por Shuichi Nakatsuru internacionalmente no Depositário Internacional de Organismos de Patente IPOD do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, 305-8566 Japão) como de 14 de junho de 2006 sob o número de depósito de FERM BP-10620. Também, clone de hibridoma 92-13 que produz anticorpo monoclonal de camundongo 92-13 foi depositado por Shuichi Nakatsuru internacionalmente no Depositário Internacional de Organismos de Patente IPOD do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST) como de 28 de junho de 2006 sob o número de

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25/72 depósito de FERM BP-10628. O anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma poderá ser preferencialmente usado na presente invenção. [00084] Na presente invenção, um anticorpo monoclonal do tipo recombinante poderá também ser usado, que possa ser produzido mediante clonagem de gene para anticorpo do hibridoma, integrando o gene para anticorpo em um vetor adequado, introduzindo o vetor em um hospedeiro e produzindo o anticorpo a partir do hospedeiro de acordo com uma técnica convencional de recombinação genética (ver, por exemplo, Vandamme, A. M. e outros, Eur. J. Biochem. (1990) 192, 76775).

[00085] Mais especificamente, mRNA que codifica região variável (V) do anticorpo monoclonal de camundongo anti-FZD10 é isolado do hibridoma que produz anticorpos (por exemplo, aqueles descritos acima). O isolamento do mRNA é realizado preparando um RNA total por meio de qualquer método conhecido, tal como método de ultracentrifugação de guanídio (Chirgwin, J. M. e outros, Biochemistry (1979) 18, 5294-9) e AGPC método (Chomczynski, P. e outros, Anal. Biochem. (1987) 162, 156-9), e, em seguida, produzindo o mRNA desejado a partir do RNA total utilizando Kit de Purificação de mRNA (Pharmacia) ou similar.

[00086] Alternativamente, o mRNA poderá também ser preparado diretamente usando Kit de Purificação de mRNA QuickPrep (Pharmacia).

[00087] Em seguida, cDNA para a região V de anticorpos é sintetizado do mRNA com uma transcriptase inversa. A síntese do cDNA poderá ser realizada usando, um kit comercialmente disponível, por exemplo, Kit Gene Racer® (Invitrogen). O cDNA poderá também ser sintetizado ou amplificado pelo método 5'-RACE (Frohman, M.A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-32), usando Kit 5'-Ampli

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FINDER RACE (Clontech) em combinação com um método de RCP. [00088] As sequências de aminoácidos de cadeia H e cadeia L de anticorpo monoclonal de camundongo 92-13 são mostradas em SEQ ID NOs: 57 e 59, respectivamente (codificadas pela sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 58 e 60, respectivamente). As sequências de aminoácidos de cadeia H e cadeia L de anticorpo monoclonal de camundongo 93-22 são mostradas em SEQ ID NOs: 61 e 63, respectivamente (codificadas pela sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NOs: 62 e 64, respectivamente). Com base na informação de sequências, iniciadores usados para amplificar a cadeia H ou cadeia L de anticorpo monoclonal de camundongo de interesse podem ser projetados utilizando um método convencional.

[00089] Um fragmento de DNA de interesse é isolado e purificado do produto de RCP resultante e, em seguida, ligado em um DNA de vetor para obter um vetor recombinante. O vetor recombinante é introduzido em um hospedeiro tal como E. coli, e uma colônia contendo um vetor recombinante desejado é selecionado. A sequência de nucleotídeos do DNA de interesse no vetor recombinante é confirmada usando, por exemplo, um sequenciador automatizado.

[00090] Uma vez obtido DNA que codifica a região V de anticorpos anti-FZD10, o DNA é integrado em um vetor de expressão que contém DNA que codifica a região constante (C) de anticorpos.

[00091] Para a produção do anticorpo anti-FZD10 usado na presente invenção, o gene para anticorpo é integrado em um vetor de expressão de modo que o gene para anticorpo possa ser expresso sob o controle de elementos de controle de expressão (por exemplo, intensificador, promotor). Uma célula hospedeira é transformada com o vetor de expressão para expressar o anticorpo.

[00092] Na expressão do gene para anticorpo, DNA que codifica

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27/72 cadeia pesada (H) e DNA que codifica cadeia leve (L) do anticorpo poderão ser integrados em vetores de expressão separados e, em seguida, uma célula hospedeira é co-transformada com os vetores de expressão recombinantes resultantes. Alternativamente, tanto DNA que codifica cadeia H e DNA que codifica cadeia L do anticorpo poderão ser integrados juntamente em um único vetor de expressão, e, em seguida, uma célula hospedeira é transformada com o vetor de expressão recombinante resultante (por exemplo, WO 94/11523).

[00093] O gene para anticorpo pode ser expresso por métodos conhecidos. Para a expressão em uma célula de mamífero, um promotor convencional útil, o gene para anticorpo a ser expresso e um sinal de poli(A) (localizado a jusante na extremidade 3' do gene para anticorpo) poderão ser operavelmente ligados. Por exemplo, como sistema útil promotor/intensificador, poderá ser usado um sistema inicial imediato promotor/intensificador de citomegalovírus humano.

[00094] Outros sistemas promotor/intensificador, por exemplo, aqueles derivados de vírus (por exemplo, retrovírus, vírus de polioma, adenovírus e vírus símios 40 (SV40)) e aqueles derivados de células de mamífero (por exemplo, fator de alongamento humano 1 alfa (HEF1 alfa)), poderão também ser usados para a expressão do anticorpo na presente invenção.

[00095] Quando sistema promotor/intensificador SV40 é usado, a expressão genética poderá ser realizada imediatamente pelo método de Mulligan e outros (Nature (1979) 277, 108-14). Quando sistema promotor/intensificador HEF1 alfa é utilizado, a expressão genética poderá ser realizada imediatamente pelo método de Mizushima e outros (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

[00096] Para a expressão em E. coli, um promotor convencional útil, uma sequência de sinal para secretar o anticorpo de interesse e o gene para anticorpo poderão ser operavelmente ligados. Como promotor,

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28/72 promotor lacZ ou promotor araB poderá ser usado. Quando promotor lacZ é usado, a expressão genética poderá ser realizada pelo método de Ward e outros (Nature (1098) 341,544-6.; FASBE J. (1992) 6, 24227), enquanto quando promotor araB é usado, a expressão genética poderá ser realizada pelo método de Better e outros (Science (1988) 240, 1041-3).

[00097] Com relação à sequência de sinal para secreção do anticorpo, quando se pretende que o anticorpo de interesse seja secretado em um espaço periplasmático da E. coli, sequência de sinal pelB (Lei, S.P. e outros, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-83) poderá ser usada. O anticorpo secretado no espaço periplasmático é isolado e em seguida reenovelado de modo que o anticorpo tome uma configuração apropriada.

[00098] A origem de replicação derivada de vírus (por exemplo, SV40, vírus de polioma, adenovírus, vírus de papiloma bovino (BPV) ou similar poderá ser usada. A fim de aumentar o número de cópias genéticas no sistema de células hospedeiras, o vetor de expressão poderá adicionalmente conter um gene marcador seletivo, tal como um gene para aminoglicosídeo fosfotransferase (APH, em inglês), um gene para timidina quinase (TK), um gene para xantina-guanina fosforribosiltransferase de E. coli (Ecogpt) e um gene para diidrofolato reductase (dhfr).

[00099] Para a produção do anticorpo útil na presente invenção, qualquer sistema de expressão que inclui sistemas de células eucarióticas e procarióticas poderá ser usado. A célula eucariótica inclui linhagens de células estabelecidas de animais (por exemplo, mamíferos, insetos, bolores e fungos, lêvedo). A célula procariótica inclui células bacterianas tais como células de E. coli. É preferível que o anticorpo usado na presente invenção seja expresso em uma célula de mamífero, tal como célula CHO, COS, de mieloma, BHK, Vero e HeLa.

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29/72 [000100] Em seguida, a célula hospedeira transformada é cultivada in vitro ou in vivo para produzir o anticorpo de interesse. A cultura da célula hospedeira poderá ser realizada por meio de qualquer método conhecido. O meio de cultura que pode ser usado aqui poderá ser meio DMEM, MEM, RPMI 1640 ou IMDM. O meio de cultura poderá conter um suplemento sérico, tal como soro de bezerro fetal (FCS).

[000101] Na produção do anticorpo recombinante, além das células hospedeiras acima mencionadas, um animal transgênico poderá também ser utilizado como hospedeiro. Por exemplo, o gene para anticorpo é inserido em um sítio predeterminado de um gene que codifica uma proteína inerentemente produzida no leite de um animal (por exemplo, beta-caseína) para preparar um gene de fusão. Um fragmento de DNA que contém o gene para anticorpo-gene de fusão introduzido é injetado em um embrião de um animal não-humano, e o embrião é, então, introduzido em um animal fêmeo. O animal fêmeo que apresenta o embrião nele transporta um animal transgênico nãohumano. O anticorpo de interesse é secretado no leite do animal transgênico não-humano ou uma progênie deste. Com a finalidade de aumentar a quantidade do leite que contém anticorpo, um hormônio apropriado poderá ser administrado ao animal transgênico (Ebert, K.M. e outros, Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

[000102] O anticorpo expresso e produzido como descrito acima poderá ser isolado das células ou do corpo do animal hospedeiro e purificado. O isolamento e purificação do anticorpo usado na presente invenção poderão ser realizados em uma coluna de afinidade. Outros métodos convencionalmente usados para o isolamento e purificação de um anticorpo poderão também ser utilizados; assim, o método não é particularmente limitado. Por exemplo, várias cromatografias, filtração, ultrafiltração, separação ácida e diálise poderão ser usadas isoladamente ou em combinação para isolar e purificar o anticorpo de

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30/72 interesse (Anticorpos A Laboratory Manual (Anticorpos: Manual de Laboratório). Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

(2) Anticorpo quimérico e Anticorpo humanizado [000103] Na presente invenção, um anticorpo recombinante artificialmente modificado poderá ser usado, incluindo um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. Esses anticorpos modificados podem ser preparados por meio de qualquer método conhecido. Por exemplo, técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos quiméricos (Morrison e outros, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-

5.; Neuberger e outros, 1984, Nature, 312: 604-8.; Takeda e outros, 1985, Nature, 314: 452-4) podem ser utilizadas. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aquelas que apresentam uma região variável derivada de uma região constante murina mAb e uma região constante humana de imunoglobulina, por exemplo, anticorpos humanizados.

[000104] Um anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção pode ser preparado ligante o DNA que codifica a região V de anticorpos a DNA que codifica uma região C de anticorpos humanos, integrando o produto de ligação em um vetor de expressão e introduzindo o vetor de expressão recombinante resultante em um hospedeiro para produzir o anticorpo quimérico.

[000105] Um anticorpo humanizado é também referido como anticorpo humano reformado, em que as regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) de um anticorpo de um mamífero nãohumano (por exemplo, um camundongo) são enxertadas naquelas de um anticorpo humano. O procedimento geral de recombinação genética para produzir esse anticorpo humanizado é também conhecido (por exemplo, EP 125023; WO 96/02576).

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31/72 [000106] Especificamente, uma sequência de DNA em que CDRs de anticorpos de camundongo se ligam através de regiões de moldura (FRs) é projetada e sintetizada por um método de RCP usando diversos oligonucleotídeos como iniciadores que foram projetados para apresentar regiões que se superpõem às regiões terminais das CDRs e FRs. O DNA resultante liga-se a DNA que codifica a região C de anticorpos humanos, e o produto de ligação é integrado em um vetor de expressão. O vetor de expressão recombinante resultante é introduzido em um hospedeiro, produzindo desse modo o anticorpo humanizado (por exemplo, WO 96/02576).

[000107] As FRs ligadas por meio das CDRs são selecionadas de modo que as CDRs possam formar um sítio funcional de ligação de antígenos. Se necessário, aminoácido(s) nas FRs da região V de anticorpos poderá(ão) ser substituído(s) de modo que as CDRs do anticorpo humano reformado possam formar um sítio apropriado de ligação de antígenos (Sato, K. e outros, Cancer Res. (1993) 53, 851-6). [000108] O anticorpo quimérico é composto de regiões V derivadas de um anticorpo de mamífero não-humano e regiões C derivadas de um anticorpo humano. O anticorpo humanizado é composto de CDRs derivadas de um anticorpo de mamífero não-humano e FRs e regiões C derivadas de um anticorpo humano. O anticorpo humanizado poderá ser útil para uso clínico, porque a antigenicidade do anticorpo contra um corpo humano é reduzida.

[000109] Um exemplo específico de um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado usado na presente invenção é um anticorpo em que as CDRs são derivadas do anticorpo monoclonal de camundongo 92-13 ou um anticorpo em que as CDRs são derivadas do anticorpo monoclonal de camundongo 93-22. O método para produzir esses anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados é descrito abaixo.

[000110] Para clonar DNA que compreende uma sequência de

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32/72 nucleotídeos que codifica região V do anticorpo monoclonal de camundongo anti-FZD10, mRNA pode ser isolado de hibridomas e cada cDNA nas regiões V de cadeias L e H pode ser sintetizado com o uso de transcriptase inversa como descrito acima. Na síntese de cDNA, poderá ser usado iniciador Oligo-dT ou outro iniciador apropriado que hibridiza com região C de cadeia L ou H. Por exemplo, mas sem se limitar aos mesmos, podem ser usados iniciador CH1 (IgG2a) que apresenta a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO 3 para região V de cadeia H e iniciador CL1 (capa) que apresenta a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO 4 para região

V de cadeia L.

[000111] Amplificação de cDNA de ambas as cadeias L e H pode ser realizada por RCP (reação em cadeia de polimerase) usando um kit comercialmente disponível (por exemplo, kit GeneRacei® da Invitrogen) ou utilizando um método conhecido que inclui método 5'-RACE (Frohman, M.A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988.; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res., 17, 2919-32, 1989).

[000112] Os iniciadores específicos para amplificar DNA para regiões

V do anticorpo monoclonal de camundongo 92-13 incluem iniciadores que apresentam as sequências de nucleotídeos mostradas em NOs ID SEQ: 5 e 6 para região V de cadeia H e iniciadores que apresentam as sequências de nucleotídeos mostradas em NOs ID SEQ: 7 e 8 para região V de cadeia L. Usando esses iniciadores, um DNA que codifica região V de cadeia H que apresenta uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO 13 e um DNA que codifica região V de cadeia L que apresenta uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO 21 podem ser amplificados. Os iniciadores específicos para amplificar DNA para regiões V do anticorpo monoclonal de camundongo 93-22 incluem iniciadores que apresentam as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOs: 53 e 54 para região V de

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33/72 cadeia H e iniciadores que apresentam as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOs: 55 e 56 para região V de cadeia L. Usando esses iniciadores, podem ser amplificados um DNA que codifica região

V de cadeia H que apresenta uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO 29 e um DNA que codifica região V de cadeia L que apresenta uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO 37.

[000113] Em seguida, os produtos amplificados são submetidos a eletroforese em gel de agarose de acordo com procedimentos convencionais, e fragmentos de DNA de interesse são excisados, recuperados, purificados e ligados em um DNA de vetor.

[000114] O DNA e DNA de vetor obtidos podem ser ligados usando um kit de ligação conhecido para construir um vetor recombinante. Um DNA de vetor poderá ser preparado segundo um método conhecido: J. Sambrook e outros, Molecular Cloning' (Clonagem Molecular), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. O DNA de vetor é digerido com enzima(s) de restrição e a sequência de nucleotídeos de um DNA desejado pode ser determinada por meio de um método conhecido ou usando um sequenciador automatizado.

[000115] Uma vez clonados fragmentos de DNA que codificam regiões

V de cadeias L e H de anticorpo monoclonal de camundongo (daqui por diante cadeia L ou H de um anticorpo poderá às vezes ser referida como cadeia L ou H de camundongo para anticorpos de camundongo e cadeia humana L ou H para anticorpos humanos), os DNAs que codificam regiões V de camundongo e DNAs que codificam regiões constantes de anticorpos humanos são ligados e expressos para produzir anticorpos quiméricos.

[000116] Um método padrão para preparar anticorpos quiméricos envolve ligar uma sequência de camundongo condutora e sequência de região V presente em um cDNA clonado a uma sequência que codifica

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34/72 uma região C de anticorpos humanos já presente em um vetor de expressão de uma célula de mamífero. Alternativamente, uma sequência de camundongo condutora e sequência de região V presente em um cDNA clonado são ligadas a uma sequência que codifica uma região C de anticorpos humanos seguido de ligação a um vetor de expressão de uma célula de mamífero.

[000117] O polipeptídeo que compreende região C de anticorpos humanos pode ser qualquer um de regiões C de cadeia H ou L de anticorpos humanos, incluindo, por exemplo, C gama 1, C gama 2, C gama 3 ou C gama 4 para cadeias humanas H ou C lâmbda ou C capa para cadeias L.

[000118] Para preparar um anticorpo quimérico, dois vetores de expressão são primeiro construídos, isto é, são construídos um vetor de expressão que contém DNAs que codificam região V de cadeia L de camundongo e região C de cadeia L humana sob o controle de um elemento de controle de expressão tal como um sistema intensificador/promotor, e um vetor de expressão que contém DNAs que codificam região V de cadeia H de camundongo e região C humana de cadeia H sob o controle de um elemento de controle de expressão tal como um sistema intensificador/promotor. Em seguida, células hospedeiras tais como células de mamíferos (por exemplo, células COS) são co-transformadas com esses vetores de expressão e as células transformadas são cultivadas in vitro ou in vivo para produzir um anticorpo quimérico: ver, por exemplo, WO91/16928.

[000119] Alternativamente, a sequência de camundongo condutora presente nos cDNAs e DNAs clonados que codificam região V de cadeia L de camundongo e região C de cadeia L humana, bem como a sequência de camundongo condutora e DNAs que codificam região V de cadeia H de camundongo e região C de cadeia H humana, são introduzidos em um único vetor de expressão (ver, por exemplo,

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WO94/11523), e sse vetor é usado para transformar a célula hospedeira; em seguida, o hospedeiro transformado é cultivado in vivo ou in vitro para produzir um anticorpo quimérico desejado.

[000120] O vetor para a expressão de cadeia H de um anticorpo quimérico pode ser obtido introduzindo cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica região V de cadeia H de camundongo (daqui por diante referido também como cDNA para região V de cadeia H) em um vetor de expressão adequado que contém o DNA genômico que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica região C de cadeia H de anticorpo humano (daqui por diante referido também como DNA genômico para região C de cadeia H) ou cDNA que codifica essa região (daqui por diante referido também como cDNA para região C de cadeia H). A região C de cadeia H inclui, por exemplo, 4 regiões C gama 1, C gama 2, C gama 3 ou C gama.

[000121] Os vetores de expressão que apresentam o DNA genômico que codifica região C de cadeia H, em particular, aqueles que codificam região C gamma 1, incluem, por exemplo, HEF-PMh-g gama 1 (WO92/19759) e E-RVh-PM1-f COM INCREMENTO DHER (WO92/19759). Alternativamente, biblioteca de região constante humana pode ser preparada usando cDNA de PBMCs humanas (células mononucleares de sangue periférico) como descrito anteriormente (Liu, A.Y e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. e outros, Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994).

[000122] Quando cDNA que codifica região V de cadeia H de camundongo é inserida nesses vetores de expressão, uma sequência apropriada de nucleotídeos pode ser introduzida nesse cDNA pelo método de RCP. Por exemplo, RCP poderá ser efetuada usando um iniciador de RCP que é projetado tal que esse cDNA tenha uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição adequada em sua extremidade 5' e sequência de consenso de Kozak

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36/72 imediatamente antes de seu códon de início de modo a aperfeiçoar a eficiência de transcrição, bem como um iniciador de RCP que é projetado tal que esse cDNA tenha uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição adequada em sua extremidade 3' e um sítio doador de ligação para ligar apropriadamente os produtos de transcrição primária do DNA genômico para fornecer um mRNA, para introduzir essas sequências apropriadas de nucleotídeos no vetor de expressão.

[000123] O cDNA que codifica região V de cadeia H de camundongo assim construído é tratado com enzima(s) de restrição adequada(s), em seguida ele é inserido nesse vetor de expressão para construir um vetor de expressão de cadeia H quimérica que contém o DNA genômico que codifica região C de cadeia H (região C gama 1).

[000124] O cDNA que codifica região V de cadeia H de camundongo assim construído é tratado com enzima(s) de restrição adequada(s), ligado a cDNA que codifica essa região C gama 1 de cadeia H e inserido em um vetor de expressão tal como pQCXIH (Clontech) para construir um vetor de expressão que contém o cDNA que codifica uma cadeia H quimérica.

[000125] O vetor para a expressão de cadeia L de um anticorpo quimérico pode ser obtido ligando um cDNA que codifica região V de cadeia L de camundongo e um DNA genômico ou cDNA que codifica região C de cadeia L de um anticorpo humano e introduzindo-os em um vetor de expressão adequado. A região C de cadeia L inclui, por exemplo, cadeia capa e cadeia lâmbda.

[000126] Quando um vetor de expressão que contém cDNA que codifica região V de cadeia L de camundongo é construído, sequências apropriadas de nucleotídeos tal como uma sequência de reconhecimento ou sequência de consenso de Kozak podem ser introduzidas nesse vetor de expressão por meio de método de RCP.

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37/72 [000127] A sequência inteira de nucleotídeos de cDNA que codifica região C de cadeia L lâmbda humana poderá ser sintetizada por um sintetizador de DNA e construída por meio de método de RCP. A região C de cadeia L lâmbda humana é conhecida por apresentar pelo menos 4 isotipos diferentes e cada isotipo pode ser usado para construir um vetor de expressão.

[000128] O cDNA construído que codifica região C de cadeia L lâmbda humana e o cDNA acima construído que codifica região V de cadeia L de camundongo podem ser ligados entre sítios de enzima de restrição adequados e inseridos em um vetor de expressão tal como pQCXIH (Clontech), para construir um vetor de expressão que contém cDNA que codifica uma cadeia L lâmbda de um anticorpo quimérico.

[000129] O DNA que codifica região C de cadeia L capa humana a ser ligado ao DNA que codifica região V de cadeia L de camundongo pode ser construído a partir de, por exemplo, HEF-PM1k-gk que contém o DNA genômico (ver WO92/19759). Alternativamente, biblioteca de região constante humana pode ser preparada usando cDNA de PBMCs humanas (células mononucleares de sangue periférico) conforme descrito anteriormente (Liu, A.Y. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. e outros, Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994).

[000130] Sequências de reconhecimento para enzimas de restrição adequadas podem ser introduzidas, por meio de método de RCP, nas extremidades 5' e 3' de DNA que codifica região C de cadeia L capa, e o DNA que codifica região V de cadeia L de camundongo como construído acima e o DNA que codifica região C de cadeia L capa podem ser ligados um ao outro e inseridos em um vetor de expressão tal como pQCXIH (Clontech) para construir um vetor de expressão que contém cDNA que codifica cadeia L capa de um anticorpo quimérico.

[000131] A fim de tornar humanizado um anticorpo em que CDR de

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38/72 um anticorpo monoclonal de camundongo é enxertada em um anticorpo humano, é desejável que exista uma alta homologia entre FR do anticorpo monoclonal de camundongo e FR do anticorpo humano. Consequentemente, é feita uma comparação entre regiões V de cadeias H e L anticorpo monoclonal anti-FZD10 de camundongo e as regiões V de todos os anticorpos conhecidos cujas estruturas foram elucidadas com o uso de Banco de Dados de Proteínas. Adicionalmente, elas são simultaneamente comparadas com os subgrupos de anticorpos humanos (HSG: Subgrupo humano) classificados por Kabat e outros com base no comprimento da FR do anticorpo, na homologia de aminoácidos e similares: Kabat, E.A. et al, US Dep. Health e Human Services, US Government Printing Offices (Departamento NorteAmericano de Serviços de Saúde e Sociais, Imprensa Oficial do Governo dos Estados Unidos), 1991.

[000132] A primeira etapa para projetar DNA que codifica uma região V de anticorpos humanizados é selecionar uma região V de anticorpos humanos como base para o projeto. Por exemplo, FR de uma região V de anticorpos humanos que apresenta uma homologia superior a 80% com FR de uma região V de anticorpos de camundongo pode ser usada na produção de um anticorpo humanizado.

[000133] No anticorpo humanizado, a região C e as regiões de moldura (FR) da região V desse anticorpo são originadas de ser humano e as regiões determinadoras de complementaridade (CDR) da região V são originadas de camundongo. Um polipeptídeo que compreende a região V do anticorpo humanizado pode ser produzido da maneira chamada enxerto de CDR pelo método de RCP, contanto que um fragmento de DNA de um anticorpo humano se tornasse disponível como padrão. O enxerto de CDR refere-se a um método em que um fragmento de DNA que codifica uma CDR derivada de camundongo é produzida e substituída pela CDR de um anticorpo humano como

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39/72 padrão.

[000134] Se um fragmento de DNA de um anticorpo humano a ser usado como padrão não é disponível, a sequência de nucleotídeos registrada em um banco de dados poderá ser sintetizada em um sintetizador de DNA e um DNA para uma região V de um anticorpo humanizado pode ser produzido pelo método de RCP. Adicionalmente, quando somente uma sequência de aminoácidos é registrada no banco de dados, toda a sequência de nucleotídeos poderá ser deduzida da sequência de aminoácidos com base em conhecimento no uso de códon em anticorpos como relatado por Kabat, E.A. e outros in US Dep.Health e Human Services, US Government Printing Offices, 1991. Essa sequência de nucleotídeos é sintetizada em um sintetizador de DNA e um DNA de uma região V de anticorpos humanizados pode ser preparado por método de RCP e introduzido em um hospedeiro adequado seguido de sua expressão para produzir o polipeptídeo desejado.

[000135] Procedimentos gerais de enxerto de CDR pelo método de RCP são descritos abaixo quando um fragmento de DNA de um anticorpo humano como padrão é disponível.

[000136] Primeiro, são sintetizados fragmentos de DNA derivados de camundongo correspondentes a respectivas CDRs. CDRs 1 a 3 são sintetizadas com base nas sequências de nucleotídeos das regiões V de cadeias H e L de camundongo anteriormente clonadas. Por exemplo, quando um anticorpo humanizado é produzido com base no anticorpo monoclonal de camundongo 92-13, sequências de CDR de região V de cadeia H podem ser as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 15 (VH CDR1), 17 (VH CDR2) e 19 (VH CDR3); e sequências de CDR de região V de cadeia L podem ser as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 23 (VL CDR1), 25 (VL CDR2) e 27 (VL CDR3). Quando um anticorpo humanizado é produzido com

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40/72 base no anticorpo monoclonal de camundongo 93-22, sequências de CDR de região V de cadeia H podem ser as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 31 (VH CDR1), 33 (VH CDR2) e 35 (VH CDR3); e sequências de CDR de região V de cadeia L podem ser as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 39 (VL CDR1), 41 (VL CDR2) e 43 (VL CDR3).

[000137] O DNA para região V de cadeia H de um anticorpo humanizado poderá ser ligado a DNA de qualquer região C de cadeia H de anticorpos humanos, por exemplo, região C gama 1 de cadeia H humana. Como mencionado acima, o DNA de região V de cadeia H poderá ser tratado com uma enzima de restrição adequada e ligado a DNA que codifica a região C de cadeia H humana sob um elemento de controle de expressão tal como um sistema intensificador/promotor para produzir um vetor de expressão que contém DNAs para uma região V de cadeia H humanizada e uma região C de cadeia H humana.

[000138] O DNA para região V de cadeia L de um anticorpo humanizado poderá ser ligado a DNA de qualquer região C de cadeia L de anticorpos humanos, por exemplo, região C lâmbda de cadeia L humana. O DNA para região V de cadeia L poderá ser tratado com uma enzima de restrição adequada e ligado a um DNA que codifica a região C de cadeia L lâmbda humana sob um elemento de controle de expressão tal como um sistema intensificador/promotor para produzir um vetor de expressão que contém DNAs que codificam uma região V de cadeia L humanizada e uma região C de cadeia L lâmbda humana.

[000139] O DNA que codifica região V de cadeia H de um anticorpo humanizado e uma região C de cadeia H humana e o DNA que codifica uma região V de cadeia L humanizada e região C de cadeia L humana poderão também ser introduzidos em um único vetor de expressão tal como aquele descrito no WO94/11523, esse vetor poderá ser usado para transformar a célula hospedeira e o hospedeiro transformado

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41/72 poderá ser cultivado in vivo ou in vitro para produzir um anticorpo humanizado desejado.

[000140] Para produzir um anticorpo quimérico ou humanizado, deverão ser preparados dois vetores de expressão como mencionado acima. Assim, com relação a um anticorpo quimérico, são construídos um vetor de expressão que compreende um DNA que codifica uma região V de cadeia H de camundongo e uma região C de cadeia H humana, sob o controle de um elemento de controle de expressão tal como um intensificador/promotor, e um vetor de expressão que compreende um DNA que codifica a região V de cadeia L de camundongo e a região C de cadeia L humana sob o controle de um elemento de controle de expressão. Com relação a um anticorpo humanizado, são construídos um vetor de expressão que compreende um DNA que codifica uma região V de cadeia H humanizada e uma região C de cadeia H humana sob o controle de um elemento de controle de expressão, e um vetor de expressão que compreende um DNA que codifica uma região V de cadeia L humanizada e uma região C de cadeia L humana sob o controle de um elemento de controle de expressão.

[000141] Em seguida, uma célula hospedeira tal como uma célula de mamífero (por exemplo, célula COS) poderá ser co-transformada com esses vetores de expressão e a célula transformada resultante poderá ser cultivada in vitro ou in vivo para produzir o anticorpo quimérico ou humanizado (ver, por exemplo, WO91/16928).

[000142] Alternativamente, um DNA que codifica regiões V e C de cadeia H e um DNA que codifica regiões V e C de cadeia L poderão ser ligados a um único vetor e transformados em uma célula hospedeira adequada para produzir um anticorpo. Assim, na expressão de um anticorpo quimérico, um DNA que codifica uma sequência de camundongo condutora presente no cDNA clonado, uma região V de

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42/72 cadeia H de camundongo e uma região C de cadeia H humana, bem como um DNA que codifica uma sequência de camundongo condutora, uma região V de cadeia L de camundongo e uma região C de cadeia L humana, podem ser introduzidos em um único vetor de expressão tal como aquele descrito in, por exemplo, WO94/11523. Na expressão de um anticorpo humanizado, um DNA que codifica uma região V de cadeia H humanizada e uma região C de cadeia H humana e um DNA que codifica um região V de cadeia L humanizada e uma região C de cadeia L humana poderão ser introduzidos em um único vetor de expressão tal como aquele descrito in, por exemplo, WO94/11523. Esse vetor é usado para transformar uma célula hospedeira e o hospedeiro transformado é cultivado in vivo ou in vitro para produzir um anticorpo quimérico ou humanizado de interesse.

[000143] Qualquer sistema de expressão poderá ser usado para produzir o anticorpo quimérico ou humanizado contra proteína FZD10 de acordo com a presente invenção. Por exemplo, células eucarióticas incluem células animais tais como linhagens de células de mamífero estabelecidas, células fúngicas e células de lêvedo; células procarióticas incluem células bacterianas tal como Escherichia coli. Preferencialmente, o anticorpo quimérico ou humanizado da presente invenção é expresso em uma célula de mamífero tal como célula COS ou CHO.

[000144] Quaisquer promotores convencionais úteis para a expressão em célula de mamíferos poderão ser usados. Por exemplo, promotor inicial imediato de citomegalovírus humano (CMVH) é preferencialmente usado. Adicionalmente, promotores para expressão genética em células de mamíferos poderão incluir promotores viróticos, tais como aqueles de retrovírus, vírus de polioma, adenovírus e vírus simiesco (SV) 40, e promotores derivados de células de mamíferos, tais como aqueles de fator-1 alfa de alongamento de cadeia de polipeptídeo

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43/72 humano (HEF-1 alfa). Por exemplo, promotor SV40 poderá ser prontamente usado de acordo com método de Mulligan e outros (Nature, 277, 108-14, 1979); método de Mizushima, S. e outros (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990) poderá ser facilmente utilizado com promotor HEF-1 alfa.

[000145] Origem de replicação inclui aquelas derivadas de SV40, vírus de polioma, adenovírus ou vírus de papiloma bovino (BPV). Adicionalmente, o vetor de expressão poderá compreender um gene para fosfotransferase APH(3') II ou I (neo), timidina quinase (TK), xantina-guanina fosforribosiltransferase de E. coli (Ecogpt) ou diidrofolato reductase (DHFR) como marcador seletivo para aumentar o número de cópias genéticas em um sistema de células hospedeiras.

[000146] O anticorpo quimérico ou humanizado de interesse que é assim produzido mediante cultura do transformante transformado com um DNA que codifica o anticorpo quimérico ou humanizado poderá ser isolado da célula e em seguida purificado.

[000147] O isolamento e purificação do anticorpo quimérico ou humanizado de interesse poderão ser realizados usando uma coluna de agarose com proteína A, mas poderão também ser realizados por meio de quaisquer métodos utilizados no isolamento e purificação de uma proteína, e, desse modo, não são limitados. Por exemplo, cromatografia, ultrafiltração, separação ácida e diálise poderão opcionalmente ser selecionadas ou combinadas para isolar e purificar o anticorpo quimérico ou humanizado.

[000148] Após isolar o anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado, a concentração do anticorpo purificado resultante pode ser determinada por ELISA.

[000149] A determinação da atividade de ligação a antígeno ou outras atividades, incluindo atividade de ligação a uma célula normal do anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado poderá ser realizada por

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44/72 meio de quaisquer métodos conhecidos (Antibodies A Laboratory Manual (Anticorpos: Manual de Laboratório), Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

[000150] Como método para a determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo, técnicas tais como ELISA (ensaio imunossorvente ligado à enzima), EIA (imunoensaio enzimático), RIA (rádio-imunoensaio) ou ensaio fluorescente poderão ser empregados.

(3) Fragmento de anticorpo e Anticorpo modificado [000151] O anticorpo usado na presente invenção poderá ser qualquer fragmento do mesmo ou um anticorpo modificado, contanto que ele possa ligar-se a proteína FZD10 e inibir sua atividade. Por exemplo, o fragmento do anticorpo inclui Fab, F(ab')2, Fv ou uma única cadeia Fv (scFv) composta de um fragmento Fv de cadeia H ou um fragmento Fv de cadeia L ligados por meio de um ligante adequado. Especificamente, tais fragmentos de anticorpo podem ser produzidos clivando o anticorpo com uma enzima (por exemplo, papaína, pepsina) em fragmentos de anticorpo, ou construindo um gene que codifica o fragmento de anticorpo e inserindo o gene em um vetor de expressão e introduzindo o vetor de expressão recombinante resultante em uma célula hospedeira adequada, expressando desse modo o fragmento de anticorpo (ver, por exemplo, Co, M. S. e outros, J. Immunol. (1994), 152, 2968-76; Better, M. & Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989), 178, 476-96, Academic Press, Inc.; Pluckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-63; Rousseaux, J. e outros, Methods in Enzymology (1989) 121,663-9; e Bird, R.E. e outros, Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-7). Alternativamente, bibliotecas de expressão de Fab poderão ser construídas (Huse e outros, 1989, Science, 246: 1275-81) para permitir rápida e fácil identificação de fragmentos monoclonais de Fab com a especificidade desejada.

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45/72 [000152] Um scFv pode ser produzido ligando a região V de cadeia H à região V de cadeia L por meio de um ligante, preferencialmente um ligante peptídico (Huston, J. S. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-83). A região V de cadeia H e a região V de cadeia L no scFv poderão ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritos aqui. O ligante peptídico que liga as regiões V poderá ser qualquer peptídeo de cadeia única, por exemplo, de 12-19 resíduos de aminoácidos.

[000153] Como anticorpo modificado, por exemplo, anticorpo antiFZD10 ou fragmento do mesmo conjugado com qualquer molécula (por exemplo, polietilenoglicol) poderá também ser usado. Esses anticorpos modificados são também incluídos no anticorpo da presente invenção. Os anticorpos modificados podem ser preparados por meio de modificações químicas dos anticorpos. As técnicas de modificação química adequadas para este fim já foram estabelecidas no estado da técnica.

2. USOS TERAPÊUTICOS [000154] São descritos abaixo métodos e composições farmacêuticas para tratar e/ou prevenir doença associada a FZD10 usando o anticorpo da presente invenção. O resultado de um tratamento é pelo menos produzir em um indivíduo tratado um benefício saudável, que, no caso de tumores, inclui, mas sem se limitar aos mesmos, remissão dos tumores, mitigação dos sintomas dos tumores e control de disseminação metastática dos tumores.

[000155] Especificamente, o método para tratar e/ou prevenir doença associada a FZD10 em um indivíduo de acordo com a presente invenção compreende administrar a um indivíduo com necessidade desse tratamento e/ou prevenção o anticorpo ou o fragmento descrito acima.

[000156] O termo indivíduo aqui refere-se a um indivíduo que sofre

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46/72 de doença associada a FZD10 e também a um indivíduo suspeito de apresentar doença associada a FZD10. O indivíduo na presente invenção poderá ser animais que incluem mamíferos e animais aviários. Por exemplo, mamíferos poderão incluir seres humanos, camundongos, ratos, macacos, coelhos e cães.

[000157] O termo doença associada a FZD10 aqui refere-se a uma doença associada à superexpressão de proteína FZD10. Especificamente, doenças associadas a FZD10 incluem, mas sem se limitar às mesmas, sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).

[000158] O anticorpo ou fragmento deste descrito aqui pode especificamente ligar-se à proteína FZD10, de modo que, quando o anticorpo ou fragmento deste é administrado a um indivíduo, ele se liga à proteína FZD10 no indivíduo e a atividade de proteína FZD10 poderá ser inibida. Alternativamente, quando o anticorpo ou fragmento deste poderá ser conjugado com uma porção terapêutica e administrado a um indivíduo, ele é derivado em uma região que expressa proteína FZD10 (isto é, região afetada) em um indivíduo e a porção terapêutica pode ser seletivamente transportada à região afetada e atuar nela. Essa porção terapêutica poderá ser qualquer substância terapêutica que é conhecida ou que será desenvolvida para apresentar uma eficácia terapêutica sobre doença associada a FZD10 e inclui, mas sem se limitar aos mesmos, um marcador de radioisótopo e agente quimioterapêutico. Um marcador de radioisótopo que pode ser usado como substância terapêutica pode ser selecionado dependendo de uma variedade de elementos que incluem energia de raios β e sua eficiência de emissão, a presença ou ausência de raios γ emitidos, sua energia e eficiência de emissão, meia-vida física e procedimento de marcação. Geralmente, o marcador de radioisótopo baseado em ítrio (tal como ⁹⁰Y) e iodo (tais

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47/72 como ¹²⁵I e ¹³¹I) poderá ser usado. Um agente quimioterapêutico poderá ser qualquer agente que é conhecido ou que será desenvolvido para tratar doença associada a FZD10 e inclui, mas sem se limitar aos mesmos, metotrexato, taxol, mercaptopurina, tioguanina, cisplatina, carboplatina, mitomicina, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel e docetaxel. O anticorpo ou fragmento deste descrito aqui pode seletivamente ligar-se à proteína FZD10 e não ligar-se a uma célula normal, de modo que efeito colateral que é causado pelo anticorpo ou fragmento deste, ou radioisótopo ou agente quimioterapêutico, possa ser eficazmente evitado e, portanto, a potência terapêutica possa ser alta.

[000159] O anticorpo ou fragmento deste descrito aqui pode ser administrado a um indivíduo sob doses eficazes para tratar ou prevenir a doença associada a FZD10. Uma dose eficaz refere-se àquela quantidade de um anticorpo ou um fragmento deste suficiente para resultar em um benefício saudável no indivíduo tratado. Formulações e métodos de administração que podem ser empregados quando a composição farmacêutica contém um anticorpo da presente invenção são descritos abaixo.

[000160] Composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[000161] Os anticorpos ou fragmentos destes podem ser formulados para administração parenteral (isto é, intravenosa ou intramuscular) por meio de injeção, via, por exemplo, injeção de bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção pode ser apresentada em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidoses, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais

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48/72 como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formulatórios tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o anticorpo pode ser em forma de pó liofilizado para constituição com um veiculo adequado, por exemplo, água estéril sem pirogênio, antes de uso. [000162] Toxicidade e eficácia terapêutica do anticorpo ou fragmento, ou da porção terapêutica conjugada com ele, pode ser determinada por meio de procedimentos farmacêuticos padrão em cultura de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal em 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de doses entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD/ED.

[000163] Anticorpos ou porções terapêuticas que exibem grandes índices terapêuticos são preferidos. Embora anticorpos ou porções que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usados, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de transporte que tenha como alvo esses anticorpos ou porções no sítio de tecido afetado a fim de minimizar dano potencial a células não-infectadas e, desse modo, reduzir efeitos colaterais.

[000164] Os dados obtidos dos ensaios de cultura com células e estudos animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para uso em seres humanos. A dosagem de tais anticorpos situa-se preferencialmente em uma faixa de concentrações plasmáticas circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar nessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada, da via de administração utilizada e tipos e quantidades da porção terapêutica conjugada. Para qualquer anticorpo usado no método da invenção, a dose eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de culturas celulares. Uma dose pode ser formulada

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49/72 em modelos animais para obter uma faixa de concentrações plasmáticas circulanttes que inclui a IC50 (isto é, a concentração do anticorpo de teste que atinge uma inibição de sintomas metade da máxima) como determinado em cultura de células. Essa informação pode ser usada para determinar mais precisamente doses úteis em seres humanos. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficácia.

[000165] Embora dependendo das condições e idade do indivíduo e/ou via de administração, aquele habilitado no estado da técnica pode selecionar uma dose apropriada da composição farmacêutica da presente invenção. Por exemplo, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada em uma quantidade tal que o anticorpo de acordo com a presente invenção seja administrado ao indivíduo em um dia em uma quantidade de cerca de 3 a cerca de 15 pg por kg de peso corporal do indivídio, e, preferencialmente, de cerca de 10 a cerca de 15 pg por kg de peso corporal do indivídio. O intervalo e tempos de administração podem ser selecionados em consideração da condição e idade do indivíduo, via de administração e resposta à composição farmacêutica. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser administrada ao indivíduo uma a cinco vezes, preferencialmente 1 vez ao dia por 5 a 10 dias.

[000166] A composição farmacêutica pode ser administrada sistêmica ou localmente. Ela é preferencialmente administrada sob uma maneira de transporte direcionada a alvo, de modo a transferir o componente ativo a um sítio afetado.

[000167] Em modalidades particulares, os métodos e composições da presente invenção são usados para o tratamento ou prevenção de doença associada a FZD10 juntamente com um ou uma combinação de agentes quimioterápicos que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, metotrexato, taxol, mercaptopurina, tioguanina, cisplatina, carboplatina,

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50/72 mitomicina, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel e docetaxel.

[000168] Com respeito à terapia com radiação, qualquer protocolo de terapia com radiação pode ser usado dependendo do tipo de doença associada a FZD10 a ser tratada. Por exemplo, mas não à guisa de limitação, radiação de raios X pode ser administrada. Radioisótopos que emitem raios gama, tais como isótopos radioativos de rádio, cobalto e outros elementos poderão também ser administrados a tecidos expostos.

[000169] Em outra modalidade, quimioterapia ou terapia com radiação é administrada, preferencialmente pelo menos uma hora, cinco horas, 12 horas, um dia, uma semana, um mês e mais preferencialmente diversos meses (por exemplo, até três meses) subsequentes ao uso dos métodos e composições que contêm o anticorpo da presente invenção. A quimioterapia ou terapia com radiação administrada antes, concorrentemente ou subsequentemente ao tratamento com uso dos métodos e composições de acordo com a presente invenção pode ser realizada por meio de qualquer método conhecido no estado da técnica.

3. USOS DIAGNÓSTICOS e PROGNÓSTICOS [000170] Anticorpos direcionados contra proteína FZD10 ou fragmentos desta poderão também ser usados como diagnósticos e prognósticos, conforme descrito aqui. Esses métodos de diagnósticos poderão ser usados para detectar a presença ou ausência de doença associada a FZD10 e o risco de apresentar a doença. O método para diagnose e/ou prognose de uma doença associada a FZD10 da presente invenção compreende detectar ou determinar imunologicamente a proteína FZD10 derivada da doença em uma amostra usando um anticorpo ou um fragmento deste de acordo com a presente invenção. Especificamente, um método para diagnose ou

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51/72 prognose de doença associada a FZD10 ou de uma predisposição para desenvolver a doença em um indivíduo de acordo com a presente invenção compreende:

(a) contatar uma amostra do indivíduo com um anticorpo contra proteína FZD10 ou um fragmento deste;

(b) detectar a proteína FZD10 na amostra; e (c) julgar se o indivíduo sofre ou não de ou está em risco de desenvolver a doença com base na abundância relativa da proteína FZD10 em comparação com um controle.

[000171] O método para diagnose ou prognose da presente invenção pode ser realizado com base em quaisquer procedimentos, contanto que seja um ensaio que utilize um anticorpo, isto é, um ensaio imunológico. Desse modo, pode-se detectar a proteína FZD10 usando o anticorpo ou um fragmento deste da presente invenção como anticorpo usado no ensaio. Por exemplo, a proteína FZD10 pode ser detectada utilizando uma coloração imuno-histoquímica, imunoensaio tais como imunoensaios enzimáticos (ELISA e EIA), ensaio imunofluorescente, rádio-imunoensaio (RIA) ou Western blotting.

[000172] Uma amostra a ser testada no método de diagnose e/ou prognose de doença associada a FZD10 da presente invenção não é especificamente limitada, contanto que ela seja uma amostra biológica que possa conter a proteína FZD10 derivada da doença associada a FZD10. Exemplos da amostra incluem extrato de uma célula ou órgão, e seções de tecido, bem como sangue, soros, plasma, sobrenadante cultivado de linfócitos, urina, fluido espinhal, saliva, suor e ascite. A abundância da proteína FZD10 como determinado em amostras tais como tecido de tumor, biópsia de tumor e tecido de metástase usando o anticorpo ou um fragmento deste da presente invenção é especificamente útil como índice de uma doença associada a FZD10.

[000173] Por exemplo, anticorpos e fragmentos destes descritos aqui

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52/72 poderão ser usados para detectar quantitativa ou qualitativamente a proteína FZD10. Os anticorpos (ou fragmentos destes) da presente invenção poderão, adicionalmente, ser empregados histologicamente, como microscopia de imunofluorescência ou imunoeletrônica, para detecção in situ de proteína FZD10. Detecção in situ poderá ser realizada removendo uma amostra histológica de um indivíduo, tais como seções de tecido embutidas em parafina (tais como espécimes cirúrgicos), e aplicando-lhes um anticorpo marcado da presente invenção. O anticorpo (ou fragmento deste) é preferencialmente applicado sobrepondo uma amostra com o anticorpo (ou fragmento deste) marcado. Usando a presente invenção, aqueles habilitados no estado da técnica perceberão imediatamente que qualquer de uma variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) pode ser modificada a fim de obter essa detecção in situ.

[000174] Imunoensaio para proteína FZD10 compreenderá tipicamente incubar uma amostra de um indivíduo a ser examinado, tais como um fluido biológico, um extrato de tecido, células colhidas recentemente ou lisatos de células que foram incubadas em cultura de células, na presença de um anticorpo detectavelmente marcado da presente invenção, e detectar o anticorpo ligado por meio de qualquer de várias técnicas bem conhecidas no estado da técnica.

[000175] A amostra poderá ser levada a contato com e imobilizada em um suporte ou veículo em fase sólida tal como nitrocelulose, ou outro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas celulares ou proteínas solúveis. O suporte poderá, então, ser lavado com tampões adequados seguido de tratamento com o anticorpo detectavelmente marcado contra FZD10. O suporte em fase sólida poderá, por conseguinte, ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover anticorpo não-ligado. A quantidade de marcador ligado no suporte sólido poderá, então, ser detectada por meios convencionais.

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53/72 [000176] O termo suporte ou veículo em fase sólida significa qualquer suporte capaz de ligar-se a um antígeno ou um anticorpo. Aqueles habilitados no estado da técnica conhecerão muitos veículos adequados para ligar-se a anticorpos ou antígenos, ou serão capazes de avaliar os mesmos mediante uso de experimentação de rotina. [000177] A atividade de ligação de um dado lote de anticorpos antiFZD10 poderá ser determinada de acordo com métodos bemconhecidos. Aqueles habilitados no estado da técnica serão capazes de determinar condições operativas e ótimas de ensaio para cada determinação empregando experimentação de rotina.

[000178] Para detectar facilmente uma reação entre o anticorpo (ou seu fragmento) da presente invenção e a proteína FZD10 derivada de um sítio afetado por doença associada a FZD10 em uma amostra, a reação pode ser diretamente detectada marcando o anticorpo da presente invenção ou indiretamente detectada usando um anticorpo secundário marcado. Esse último procedimento de detecção indireta, tal como um ensaio intercalado ou ensaio competitivo de ELISA, é preferencialmente usado no método da presente invenção para melhor sensibilidade.

[000179] Exemplos de marcadores para uso aqui são como seguem. Peroxidases (PODs), fosfatases alcalinas, β-galactosidase, urease, catalase, glicose oxidase, lactato desidrogenase, amilases e complexos biotina-avidina podem ser usados em um imunoensaio enzimático. Isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), isotiocianato de rodamina substituído, isotiocianato de diclorotriazina e Alexa488 podem ser usados em um ensaio imunofluorescente. Trítio, iodo (tal como ¹²⁵I e ¹³¹I) e índio (tal como ¹¹¹In) podem ser usados em um rádio-imunoensaio. Ensaio de NADH-FMNH2luciferase, sistema luminol-peróxido de hidrogênio-POD, ésteres de acridínio e compostos de dioxetano podem ser usados em um ensaio

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54/72 imunoluminescente.

[000180] O marcador pode ser ligado ao anticorpo de acordo com um procedimento convencional. Por exemplo, o marcador pode ser ligado ao anticorpo por meio de um método de glutaraldeído, método de maleimida, método de dissulfeto de piridila ou método de periodato no imunoensaio enzimático, e por um método de cloramina T ou método de Bolton-Hunter no rádio-imunoensaio.

[000181] O ensaio pode ser realizado de acordo com um procedimento conhecido (Ausubel, F.M. e outros Eds., Short Protocols in Molecular Biology (Protocolos Breves em Biologia Molecular), Capítulo 11, Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 1995).

[000182] Por exemplo, quando o anticorpo da presente invenção é diretamente marcado com o marcador descrito acima, a amostra é levada a contato com o anticorpo marcado para formar desse modo um complexo entre a proteína FZD10 e o anticorpo. Em seguida, anticorpo marcado não-ligado é separado e o nível da proteína FZD10 na amostra pode ser determinado com base na quantidade de anticorpo marcado ligado ou na quantidade de anticorpo marcado não-ligado.

[000183] Quando um anticorpo secundário marcado é utilizado, o anticorpo da presente invenção é deixado reagir com a amostra em uma reação primária, e o complexo resultante é deixado reagir com o anticorpo secundário marcado em uma reação secundária. A reação primária e a reação secundária podem ser realizadas em ordem inversa, concorrentemente, com algum intervalo de tempo entre elas. As reações primária e secundária produzem um complexo [proteína FZD10]-[o anticorpo da invenção]-[o anticorpo secundário marcado] ou um complexo [o anticorpo da invenção]-[proteína FZD10]-[o anticorpo secundário marcado]. Anticorpo secundário marcado não-ligado é, então, separado e nível da proteína FZD10 na amostra pode ser determinado com base na abundância de anticorpo secundário marcado

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55/72 ligado ou abundância de anticorpo secundário marcado não-ligado. [000184] De acordo com outra modalidade, o anticorpo da presente invenção é marcado com um radioisótopo ou um marcador fluorescente, e o anticorpo marcado é parenteralmente administrado a um indivíduo. Assim, a localização de um tumor primário e o tumor com metástase correlato de doença associada a FZD10 pode ser rapidamente verificado de uma maneira não-invasiva. Esse método de diagnose é conhecido como formação de imagem de tumor in vivo, e aquele habilitado no estado da técnica pode facilmente entender seus procedimentos. O anticorpo marcado pode ser administrado ao indivíduo sistêmica ou localmente, preferencialmente por meio de uma via parenteral tais como injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal ou injeção subcutânea.

[000185] Os anticorpos de acordo com a presente invenção reagem especificamente com uma proteína FZD10 como mencionado acima e podem desse modo ser usados em kits para diagnose e/ou prognose de uma ddoença associada a FZD10.

[000186] O kit para diagnose e/ou prognose da presente invenção compreende um anticorpo ou um fragmento deste descrito aqui. Detectando a proteína FZD10 em uma amostra de um indivíduo que é suspeito de sofrer de uma doença associada a FZD10 com o uso do kit para diagnose e/ou prognose da presente invenção, pode-se rápida e facilmente avaliar se o indivíduo sofre ou não da doença associada a FZD10. Kits para diagnose e/ou prognose de doenças usando tais reações imunológicas são amplamente conhecidos, e aquele habilitado no estado da técnica pode facilmente selecionar componentes apropriados diferentes de anticorpo. Os kits para diagnose e/ou prognose da presente invenção podem ser usados em qualquer dispositivo, contanto que este seja um dispositivo para imunoensaio. EXEMPLOS:

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56/72 [000187] A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelos exemplos seguintes não-limitativos.

[000188] Linhagens de células e espécimes de tecidos usados nos exemplos seguintes foram preparados conforme descrito abaixo. Especificamente, linhagens de células derivadas de sarcomas sinoviais (HS-SY-2, YaFuSS, 1973/99, Fuji e SYO-1), cânceres do cólon (LoVo, SNU-C4 e SNU-C5), HEK293 e células COS7 foram desenvolvidas em monocamadas em meios apropriados suplementados com soro bovino fetal a 10% e 1% solução a 1% antibiótico/antimicótico e mantidas a 37^oC em ar contendo 5% de CO2. Amostras de sarcoma sinovial (SS) primário foram obtidas após permissão informada e congeladas bruscamente em nitrogênio líquido imediatamente após ressecção e armazenadas a -80^oC.

Exemplo 1

Geração de anticorpos monoclonais anti-FZD10 (1) Geração de anticorpos monoclonais com imunização celular [000189] Anticorpos monoclonais anti-FZD10 de camundongo (Mabs) foram gerados mediante imunização de camundongos Balb/c de quatro semanas de idade em suas almofadas dos pés com 2 x 10⁷ células COS-7 transfectadas com 2 x 10⁷ de pCAGGS/neo-FZD10-myc/His (Medical and Biological Laboratories, Nagóia, Japão). A construção de pCAGGS/neo-FZD10-myc/His foi relatada anteriormente (Nagayama,

S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-12) e esta expressa toda a sequência de codificação de cDNA de FZD10 e pontas de epítopos Myc e His em seu término C. Os camundongos foram imunizadas com adjuvante de Freund completo (Mitsubishi Kagaku latron, Inc., Tóquio, Japão) um dia antes da imunização celulas. Células do baço dos camundongos imunizadas foram colhidas e fundidas com a linhagem de células de mieloma. Os hibridomas foram subclonados e ensaiados por ELISA celular em relação à capacidade de secretar imunoglobulina que

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57/72 se liga ao domínio extracelular de FZD10 (resíduos de aminoácidos 1225 de FZD10). Para ELISA celular, células COS-7 que expressam FZD10-myc/His (toda a sequência de codificação de cDNA de FZD10 e pontas de epítopos Myc e His em seu término C) foram semeadas em placas de 96 cavidades. Subsequentemente, 50 μΙ dos sobrenadantes de cultura obtidos de hibridomas foram adicionados à placa e incubados por 30 minutos a temperatura ambiente. Após lavagem das células, IgGPOD de cabra anticamundongo (Medical and Biological Laboratories, Nagóia, Japão) foi adicionado sob diluição de 1:10.000, incubado por 30 minutos a temperatura ambiente. Anticorpos ligados foram detectados a DO450-620 nm. Clones positivos foram adicionalmente analisados em relação a atividade de ligação específica. Esses clones incluem: clones 39-2 e 39-10 (descritos in WO2005/004912, referidos como 5F2), bem como 92-13 e 93-22. Todos os Mabs eram do isotipo IgG2a como determinado por meio do kit de isotipificação de anticorpos monoclonais de camundongo IsoStrip (Roche). Os Mabs foram purificados por afinidade em proteína G-sefarose para caracterização adicional.

[000190] O clone de hibridoma 93-22 que produz anticorpo monoclonal de camundongo 93-22 foi depositado por Shuichi Nakatsuru internacionalmente no Depositário Internacional de Organismos de Patente IPOD do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, 305-8566 Japão) como de 14 de junho de 2006 sob o número de depósito de FERM BP-10620. Também, clone de hibridoma 92-13 que produz anticorpo monoclonal de camundongo 92-13 foi depositado por Shuichi Nakatsuru internacionalmente no Depositário Internacional de Organismos de Patente IPOD do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (AIST) como de 28 de junho de 2006 sob o número de depósito de FERM BP-10628.

(2) Marcação de anticorpos com radionuclídeos

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58/72 [000191] Mabs marcados com ¹²⁵I foram preparados pelo método de cloramina T (Arano, Y e outros (1999). Cancer Res, 59, 128-34). 740 kBq/2 pl de Na¹²⁵I foram adicionados a 10 pg de Mab em 100 μΙ de tampão de fosfato de sódio 0,3 M. Um pg de cloramina T em 3 μΙ de tampão de fosfato de sódio 0,3 M foi adicionalmente acrescentado, incubado por 5 min à temperatura ambiente. Anticorpo marcado foi purificado usando coluna 6 de Biospina (Bio-Rad).

[000192] Para marcar Mabs com ¹¹¹In, 1 mg de Mab em 100 pl de tampão de borato 50 mM (pH 8,5) foi conjugado com isotiocianato ácido benzil dietilenotriaminopentacético (SCN-BZ-DTPA; Macrocyclics) em dimetilformamida sob razão molar de 1:3. Após incubação a 37^oC por 20 horas, conjugados de Mabs foram purificados usando coluna 6 de Biospina. 40 pl de ¹¹¹In foram incubados em 60 pl de tampão de ácido acético 0,25 M (pH 5,5) e incorporados em 10 pg/pl de conjugados MabDTPA por uma hora à temperatura ambiente. Anticorpo marcado foi purificado utilizando coluna 6 de Biospina.

[000193] Para gerar 92-13 conjugado com ⁹⁰Y, 92-13 foi conjugado com DTPA em resíduos de lisina. DTPA-92-13 foi marcado com ítrio até uma atividade específica de 100 pCi/mg, e a imunorreatividade de ⁹⁰YDTPA-92-13 foi de aproximadamente 70%.

(3) Síntese de Mabs marcados com Alexa647 [000194] Marcação de Mabs com Alexa-Flúor647 foi realizada de acordo com instrução do fabricante usando Kit de Marcação de Anticorpo Monoclonal com Alexa647 (Molecular Probes, Eugene, Oregon). O corante reativo Alexa647 apresenta uma porção éster succinimidílico que reage com aminas primárias de proteínas, e conjugados Mabs-corante resultantes foram purificados por meio de coluna de exclusão por tamanho.

Exemplo 2

Atividades de ligação de anticorpos monoclonais anti-FZD10

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59/72 [000195] Os presentes inventores aplicaram dois métodos para avaliação da afinidade de ligação de anticorpos monoclonais de camundongo: análise fluxocitométrica com corantes fluorescentes e medição radioativa usando ¹²⁵I.

(1) Análise de fluxocitometria (FACS) [000196] Para investigar as afinidades de ligação com célula dos quatro anticorpos, 39-2 e 39-10 (descritos no WO2005/004912), 92-13 e 93-22, realizaram-se experimentos de fluxocitometria (FACS). Para análise fluxocitométrica com fluorescência indireta, suspensões de 5 x 10⁶ células foram incubadas com 10 pg/ml de Mabs ou IgG de camundongos não-imunizados (Beckman Coulter) por 30 min a 4^oC. Após lavagem com PBS, 2 pg de IgG fluorescente de cabra anticamundongo (Alexa Flúor 488, Molecular Probes, Eugene, Oregon) foram adicionados e a suspensão de células incubada por 30 min a 4^oC para análise por FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Para ensaios de imunofluorescência direta, células foram incubadas com 2 pg de Alexa488-Mabs na presença ou ausência de quantidade em excesso (100 pg) de Mabs não-marcados por 30 min a 4^oC e submetidos a análise por FACScan.

[000197] A fim de confirmar a expressão de FZD10 em linhagens de células, realizou-se RCP-TA. Para experimentos de RCP-TA, RNAs totais foram extraídos de linhagens de células usando reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e alíquotas de 3 pg de cada RNA total foram inversamente transcritas. Amplificação por RCP foi realizada usando os cDNAs como padrões com os seguintes iniciadores: 5'TATCGGGCTCTTCTCTGTGC-3' (SEQ ID NO 9) e 5'GACTGGGCAGGGATCTCATA-3' (SEQ ID NO 10) para FZD10, e 5'TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3' (SEQ ID NO 11) e 5'TCACATGGTTCACACGGCAG-3' (SEQ ID NO 12) para β2microglobulina (p2MG), o controle interno.

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60/72 [000198] Como mostrado na figura 1a, todos os quatro Mabs, 39-2, 39-10, 92-13 e 93-22 ligaram-se a quatro linhagens de células de SS que expressam FZD10, SYO-1, YafuSS, HS-SY-2 e Fuji de maneira dependente de dose de FZD10, mas não se ligaram a duas linhagens de células, 1973/99 e LoVo, em que nenhum transcrito de FZD10 foi detectado. A Tabela 1 abaixo indica correlação entre Intensidades Médias Fluorescentes relativas (MFI) desses Mabs e os níveis de expressão de FZD10 mostrados na figura 1b. Adicionalmente, de forma particular, demonstramos que Mabs 92-13 e 93-22 também se ligaram à SNU-C5 transfectada com constructo FZD10-myc/His, enquanto nenhuma ligação foi detectada com células SNU-C5 transfectadas com vetor vazio (figura1c), sugerindo ligação específica desses Mabs 92-13 e 93-22 contra proteína FZD10.

Tabela 1. Ligação de mAbs anti-FZD10 a linhagens de células de SS humano SYO-1, YaFuSS, HS-SY-II, Fuji, 1973/99 e linhagem de células de câncer do cólon humano, LoVo.

	SYO-1	YaFuss	HS-SY-II	Fuji	1973/99	LoVo
39-2	17,6	11,6	9,4	7,1	5,5	1,1
39-10	18,4	11,8	9,9	6,9	4,9	1,0
92-13	4,7	3,0	3,0	1,3	0,9	1,0
93-22	3,3	2,7	2,4	1,1	1,0	1,1

[000199] O MFI de FZD10 é medido por fluxocitometria como descrito acima.

(2) Atividade de ligação contra células normais do sangue [000200] Para confirmar se esses anticorpos podem ser aplicados em uso clínico, os presentes inventores examinaram adicionalmente a atividade de ligação de anticorpos contra células normais do sangue. Para avaliar a atividade de ligação não-específica de Mabs contra células normais do sangue, Mabs marcados com ¹²⁵I foram incubados

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61/72 com 100 μΙ de sangue saudável novo. Após incubação por uma hora a temperatura ambiente, as radioatividades de péletes de células foram medidas conforme descrito acima.

[000201] A atividade de ligação de Mabs 92-13 e 93-22 marcados com ¹²⁵I contra células sanguíneas humanas normais não foi detectável em todos os três doadores individuais, considerando que a atividade de ligação de Mabs 39-2 e 39-10 foi detectada em todos os três doadores individuais (figura1d). Esses resultados foram consistentes com aqueles de análise FACS usando células mononucleares de sangue periférico humano (dados não mostrados), sugerindo aplicabilidade clínica de somente anticorpos 92-13 e 93-22 com pequena possibilidade de efeito adverso em pacientes de SS devido à afinidade de ligação muito específica pela molécula de FZD10. Portanto, nos centralizamos apenas nos anticorpos 92-13 e 93-22 para análise adicional.

(3) Análises adicionais [000202] Adicionalmente, foi realizado ensaio de ligação usando Mabs marcados com ¹²⁵I (ver Exemplo 1 (2)) para avaliar a afinidade de ligação contra moléculas de FZD10 na superfície celular. Para análise de radioatividade, 0,5 kBq (0,001 μg de anticorpos) de Mabs marcados com ¹²⁵I preparados no Exemplo 1 (2) foi adicionado a 100 μl de suspensão de células com várias quantidades de Mabs idênticos nãomarcados. Após incubação por uma hora à temperatura ambiente, a suspensão de células foi centrifugada a 800 x g. Sobrenadante foi removido e a radioatividade de péletes de células foi medida.

[000203] Os resultados mostraram maior afinidade de ligação de anticorpos 92-13 do que anticorpos 93-22; aproximadamente 33% de 92-13 ligados às células e aproximadamente 9% de anticorpos 93-22 ligados às células sob a mesma condição (figura1e). A quantidade de anticorpos ligados diminuiu à medida que anticorpos não-marcados foram adicionados de uma maneira dependente de dose.

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62/72 [000204] Subsequentemente, realizou-se análise de competição de ligação de Mabs 92-13 com Mabs 93-22 utilizando fluxocitometria. Ligação entre si de células de ambos os anticorpos marcados com Alexa488 foi completamente bloqueada por meio de alta quantidade de anticorpos não-marcados (figura1f, ii e iii), sugerindo que Mabs 92-13 e 93-22 provavelmente reconhecem epítopos muito similares ou iguais de FZD10. Essas verificações sugerem que esses Mabs são capazes de reconhecer especificamente FZD10 expressa na superfície de células de SS.

Exemplo 3

Imuno-histoquímica [000205] Para avaliar a especificidade de ligação de 92-13 e 93-22 a tecidos humanos, realizou-se análise imuno-histoquímica usando seções congeladas de tecidos. Seções de tecidos de órgãos humanos adultos normais congelados (BioChain, Hayward, Califórnia) foram fixadas com paraformaldeído a 4% e a 4^oC por 15 min, e incubadas com 5 pg/ml de Mabs por uma hora a temperatura ambiente. Subsequentemente, Reagente Polimérico ENVISION de camundongo (DAKO) foi adicionado e visualizado com substrato de peroxidase (Tetracloridreto de 3, 3’-Diaminobenzidina).

[000206] Os resultados são mostrados na figura 2. A figura2 mostra análises imuno-histoquímicas em seções de tecidos humanos congelados normais e de SS sem anticorpos (a, d, g, j e m), 92-13 (b, e, h, k e n) e 93-22 (c, f, i, l e o); (a-c), sarcoma sinovial; (d-f), rim; (g-i), fígado; (j-l), coração; (m-o), cérebro. De modo esperado, observou-se forte imunorreatividade a FZD10 em espécimes de SS (figuras 2, a, b e

c) e placenta (dados não mostrados), mas não detectada em rim, coração, cérebro e fígado (figuras 2, d-o), de maneira concordante com os resultados de northern-blot e experimentos de RCP-TA (Nagayama,

S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-6212).

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Exemplo 4

Biodistribuição de Mabs anti-FZD10 em modelo de xenoenxerto em camundongos Balb/c [000207] Distribuição de 92-13 e 93-22 em modelo in vivo foi examinada em camundongos BALB/c por meio de dois métodos independentes, formação de imagem por radionuclídeos e formação de imagem por fluorescência.

(1) Formação de imagem por radionuclídeos in vivo [000208] Experimentos in vivo foram realizados em instalação para animal de acordo com diretrizes institucionais. Camundongos Jcl-nu BALB/cA (7 semanas de idade) foram injetados subcutaneamente (s.c.) com células de tumor SYO-1 (5 x 10⁶ de células), em 0,1 ml de PBS, nos flancos. Para estudos de biodistribuição, camundongos com tumores plenamente estabelecidos receberam 10 kBq (0,5-1 pg) de Mabs marcados com ¹²⁵I e 10 kBq (0,5-1 pg) de Mabs marcados com ¹¹¹In via veia da cauda. Nas 1,24 e 48 horas, animais foram submetidos à eutanásia e o peso e radioatividade dos tecidos, medidos. A distribuição foi expressa como % de dose injetada/g de tecido para todas as amostras. Para formação de imagem óptica de biodistribuição, foram usados camundongos que portam tumores LoVo além de camundongos com tumores SYO-1. Células de tumor LoVo (1 x 10⁷ de células) foram injetadas s.c. em camundongos Jcl-nu BALB/cA como descrito acima. Quando tumores foram completamente estabelecidos, os camundongos foram submetidos ao estudo segundo formação de imagem.

[000209] Os resultados na figura3a demonstram que a radioatividade de ^wIn-92-13 associada ao sangue diminuiu de 35% de doses injetadas por grama (% de DI/g) em uma hora pós-injeção para 12% após 48 horas. Radioatividades de ^wIn-92-13 associadas a fígado, rim, intestino, baço, pâncreas, pulmão, coração, estômago e músculo

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64/72 permaneceram razoavelmente constantes ou decresceram ao longo da observação (figura 3a). Radioatividade de ¹¹¹In-92-13 associada a tumor acumulou-se durante o experimento, de 2% de DI/g em uma hora pósinjeção para 11% de DI/g após 48 horas. Por outro lado, a figura 3b demonstra que radioatividade de 92-13 marcado com ¹²⁵I associada a tumor não aumentou significativamente, embora radioatividade associada ao sangue tenha caído de 25% em uma hora para 7% após 48 horas e radioatividades associadas a outros órgãos normais permaneceram constantes. Os anticorpos marcados com ¹²⁵I foram possivelmente degradados na célula após internalização. 93-22 marcado com ¹¹¹In acumulou-se também em tumor SYO-1 em 48 horas pós-injeção (figura 3c) e 93-22 marcado com ¹²⁵I mostrou acumulação pobre (figura 3d), sugertindo sua internalização, bem como 92-13.

(2) Formação de imagem por fluorescência in vivo [000210] Formação de imagem por fluorescência in vivo foi realizada com Sistema de Formação de Imagem IVIS® série 100 (Xenogen, Alameda, CA). Um filtro otimizado Cy5.5 foi usado para adquirir fluorescência de Alexa647-Mabs in vivo. Camundongos SYO-1 que portam tumor foram injetados com 20 pg Mabs marcados com Alexa647 intraperitonealmente e submetidos à formação de imagem fluorescente em vários pontos de tempo. Os camundongos foram alimentados com alimento que não contém alfalfa por quatro dias antes de injetar Mabs a fim de reduzir a fluorescência de fundo. Quando da aquisição de imagens, camundongos foram anestesiados com 2% de isoflurano (Abbott Laboratories) e colocados no sistema IVIS. Os camundongos foram submetidos à eutanásia em quatro dias após a injeção de Mabs, o tumor e a maior parte dos órgãos foram dissecados e imagem por fluorescência foi obtida.

[000211] Como mostrado na figura 4a, quantidade significativa de fluorescência foi detectada no local do tumor 24 horas após a injeção.

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Fluorescência ligada a tumor foi observada em ambos os Mabs, 92-13 e 93-22; os signais atingiram nível máximo cerca de 48 horas após a injeção, e podiam ser detectáveis 96 horas após a injeção. Os presentes inventores sacrificaram esses camundongos 120 horas pós-injeção e mediram sua intensidade de fluorescência no tumor e também em órgãos normais importantes (fígado, baço, rim, pâncreas, cólon) (Figuras 4b e 4c). Sinal de fluorescência muito intenso foi observado no tumor dissecado, considerando que nenhum sinal de fluorescência foi detectado em órgãos normais. Para validar a especificidade de ligação, os presentes inventores geraram xenoenxertos usando linhagem de células negativas a antígenos, LoVo, em camundongos nus, e injetaram Mabs marcados com Alexa647, realizando análise de formação de imagem fluorescente. Em camundongos que portam LoVo, fluorescência não foi detectada nem no local do tumor (figura 5a), nem no tumor dissecado ou outros órgãos (figuras 5b e 5c). Esses resultados demonstraram que esses Mabs são também capazes de ligar-se especificamente a células de tumor que expressam FZD10 in vivo. Exemplo 5

Internalização de Mabs anti-FZD10 em células positivas a antígenos [000212] Para investigar comportamento molecular desses Mabs após ligação com as superfícies celulares, sua localização foi traçada usando sistema de formação de imagem in vitro.

[000213] Células foram plaqueadas em lâminas de câmara de 8 cavidades (Nalge Nunc International, Naperville, IL) sob densidade de 5 x 10⁴ células por cavidade. Células foram incubadas com Mabs por três horas a 37^oC em câmara de ar contendo 5% de CO2. Mabs ligados à superfície cellular foram removidos por meio de tampão de separação ácido (glicina 0,1 M, 500mM NaCl, pH 2,5) a 4^oC por 10 min e neutralizados com Tris 500mM (pH 7,5). Células foram então fixadas com formaldeído a 3,7% por 15 min à temperatura ambiente e

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66/72 permeabilizadas por exposição a TritonX-100 0,2% por 10 min, seguido de bloqueio com soroalbumina bovina a 3% por uma hora à temperatura ambiente. Para detectar os Mabs internalizados na célula, amostras foram incubadas com IgG de cabra anticamundongo marcado com Alexa488 (1:700 de diluição) por uma hora à temperatura ambiente. As lâminas foram montadas com DAPI (Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA) e analisadas óptica confocal Leica TCS SP1.

[000214] Como mostrado na figura 6, ambos os Mabs 92-13 e 93-22 foram eficientemente incorporados no citossol de células SYO-1 e de células YaFuSS 3 horas após a incubação de Mab com células mediante formação de imagem com microscópio confocal detectada usando IgG de cabra anticamundongo marcado com Alexa488 (figura6, a-f). Por outro lado, os sinais de fluorescência desses Mabs foram dificilmente detectáveis em células LoVo sem expressão de FZD10 (figura6, g-i), demonstrando que a ligação específica de Mabs em FZD10 de superfície celular induziu a internalização dos anticorpos.

Exemplo 6

Citotoxicidade específica de Mabs [000215] 92-13 e 93-22 não tiveram nenhum efeito sobre o crescimento de células tumorais quando adicionados diretamente nas células cultivadas (dados não mostrados). Para estudos de terapia, tumores SYO-1 foram desenvolvidos em camundongos Jcl-nu BALB/cA da mesma maneira que no Exemplo 4. Os diâmetros dos tumores foram medidos por meio de paquímetro e o volume dos tumores foram determinados usando a seguinte fórmula: 0,5 x (diâmetro maior) x (diâmetro menor)² como descrito anteriormente (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 6201-12). Quando o volume dos tumores atingiu mais de 0,4-2,8 cm³, camundongos Balb/c nu que portam tumor subcutâneo SYO-1 foram designados aleatoriamente a grupos de tratamento e receberam injeções intravenosas de 100 pCi de Mabs

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67/72 marcados com ⁹⁰Y ou Mabs de controle via veia da cauda. Os camundongos foram pesados e o diâmetro dos tumores registrados.

[000216] A figura 7 mostrou que os volumes tumorais reduziram-se notavelmente de forma imediata após tratamento, quase até traços dentro de uma semana em todos os camundongos. Quando 50 pCi de ⁹⁰Y-DTPA-92-13 foram dados aos camundongos, tumores > 1 cm³ de volume refrataram-se duas semanas após tratamento, embora mostrassem notável redução no tamanho dos tumores imediatamente após tratamento. Os camundongos mostraram diminuição temporária do peso (10~15%), contudo, recuperaram-se em uma semana e nenhum sinal tóxico visível foi observado (dados não mostrados). Exemplo 7

Geração de Anticorpos quiméricos [000217] Anticorpos quiméricos correspondendo aos anticorpos 92-13 e 93-22 de camundongo, ch92-13 e ch93-22, foram gerados mediante substituição da sequência de região variável de cada anticorpos de camundongo na região constante humana IgG1 sob o controle do promotor CMV. Os RNAs totais foram extraídos de clones de hibridoma 92-13 e 93-22. cDNA foi sintetizado do RNA total utilizando Kit GeneRacei® (Invitrogen). As sequências de regiões variáveis de anticorpos monoclonais foram amplificadas usando iniciador anterior (Iniciador 5' GeneRacei®) e iniciador inverso; CH1 (IgG2a); 5'AATTTTCTTGTCCACCTTGGTG-3' (SEQ ID NO 3) para cadeia pesada e CL1 (capa); 5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3' (SEQ ID NO 4) para cadeia leve. Produtos de RCP foram sequenciados e as sequências que codificam as regiões variáveis m92-13 e m93-22 determinadas.

[000218] Como resultado, as sequências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia H e regiões variáveis de cadeia L de Ig de camundongo foram determinadas como segue:

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92-13, região variável de cadeia H: MKCSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGF NINDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADT SSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGARGSRFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO 13) codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 14, e

92- 13, região variável de cadeia L: MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASEN IYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYVATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKI NSLQSEDFGSYYCQHWGTPYTFGGGTKL (SEQ ID NO 21) codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 22; e

93- 22, região variável de cadeia H: MGWSRIFLFLLSITAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAF SSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADK SSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARGGNYGWFAYWGQGTLVTVSAGS (SEQ ID NO 29) codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 30, e

93-22, região variável de cadeia L: METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKS VSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTD FTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELYTFGGGTKLGS (SEQ ID NO 37) codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 38. Sublinhas indicam as sequências de sinal.

[000219] As sequências de CDR (região determinadora de complementaridade) dos anticorpos foram determinadas como segue: 92-13, INDTYMH (SEQ ID NO 15) como VH CDR1, RIDPANGNTKYD (SEQ ID NO 17) como VH CDR2, e GSRFAY (SEQ ID NO 19) como VH CDR3, RASENIYSNLA (SEQ ID NO 23) como VL CDR1, VATNLAD (SEQ ID NO 25) como VL CDR2, e QHFWGTPY (SEQ ID NO 27) como VL CDR3; e

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93-22, SSWMN (SEQ ID NO 31) como VH CDR1, RIYPGDGDTNYN (SEQ ID NO 33) como VH CDR2, e GGNYGWFAY (SEQ ID NO 35) como VH CDR3, RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO 39) como VL CDR1, LASNLES (SEQ ID NO 41) como VL CDR2, e QHSRELY (SEQ ID NO 43) como VL CDR3.

[000220] Adicionalmente, as sequências de aminoácidos das cadeias H e cadeias L de anticorpos monoclonais de camundongo 92-13, 93-22 e 39-10 são determinadas como segue:

92-13, cadeia H: SEQ ID NO 58 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 57);

92- 13, cadeia L: SEQ ID NO 60 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 59);

93- 22, cadeia H: SEQ ID NO 62 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 61);

93-22, cadeia L: SEQ ID NO 64 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 63);

39-10, cadeia H: SEQ ID NO 66 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 65);

39-10, cadeia L: SEQ ID NO 68 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 67).

[000221] De acordo com a sequência determinada, iniciadores específicos foram projetados para a região variável m92-13: 5'-AATAGCGGCCGCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTT-3' (SEQ

ID NO 5) e 5'-AATAGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC-3' (SEQ ID NO 6) para cadeia pesada e 5'AATAGCGGCCGCACCATGAGT GTGCCCACTCAGG-3' (SEQ ID NO 7) e 5'-TTCCAGCTTGGTCCCCCC-3' (SEQ ID NO 8) para cadeia leve. Também, iniciadores específicos foram projetados para a região variável m93-22:

5’- ATAGCGGCCGCACCATGGGATGGAGCCGGATCTTT-3’ (SEQ ID

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NO 53) e 5’-AATAGGATCCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC CTT3' (SEQ ID NO 54) para cadeia pesada e 5’AATAGCGGCCGCACCATGGAGACAGACACACTCCT-3’ (SEQ ID NO 55) e 5’-AATAGGATCCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGT-3’ (SEQ ID NO 56) para cadeia leve. Para construir o vetor de expressão para anticorpos quiméricos, dois vetores cassette foram preparados. O fragmento de DNA que codifica IgG1 humana (CH1-CH3) foi inserido em pQCXIH (Clontech) (pQCXCHIH) e o fragmento de DNA que codifica IgK humana (CL1) foi inserido em pQCXIP (pQCXCLIP). Para obter fagmentos de DNA que codificam IgG1 humana ou IgK humana, biblioteca de região constante humana foi preparada usando cDNA de PBMCs humanas (células mononucleares de sangue periférico) pelo método relatado (Liu, A.Y. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. e outros, Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994). Os DNAs que codificam região variável de cadeia pesada e cadeia leva de m92-13 e m93-22 foram amplificados por RCP, sequenciados e subclonados em pQCXCHIH e pQCXCLIP, respectivamente, usando sítios NotI e BamHI. Esses vetores foram co-transfectados em células CHO. Células transfectadas foram cultivadas em meio F-12 que contém 500 pg/ml de higromicina e 10 pg/ml de puromicina. Quando células se desenvolveram subconfluentemente, o meio foi trocado por meio sem soro (CHO-S-SFM II; GIBCO) e anticorpo quimérico foi purificado do sobrenadante de células cultivadas usando coluna de afinidade de proteína A (GE Amersham) e sequenciado. A sequência de cadeia pesada de anticorpo quimérico ch92-13 compreende SEQ ID NO 46 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 45; e a sequência de cadeia leve de anticorpo quimérico ch92-13 compreende SEQ ID NO 48 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 47. A sequência de cadeia pesada de anticorpo quimérico ch93-22 compreende SEQ ID NO 49 codificada pela sequência de nucleotídeos

Petição 870190095293, de 24/09/2019, pág. 75/86 /72 de SEQ ID NO 50; e a sequência de cadeia leve de anticorpo quimérico ch93-22 compreende SEQ ID NO 52 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 51.

Exemplo 8

Atividade de ligação de Anticorpos quiméricos [000222] Atividades de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) induzidas por anticorpos quiméricos 92-13 e 93-22 foram determinadas usando atividade de LDH conforme descrito anteriormente (Nagayama, S. e outros (2005). Oncogene, 24, 62016212). Células efetuadoras novas foram isoladas de sangue periférico heparinizado de um doador saudável por meio de Ficoll-Plaque (Amersham Bioscience). Células efetuadoras (E) e células-alvo (T) (em cada caso, 5 x 10³/cavidade) foram co-incubadas por 6 h a 37^oC em quadruplicata sob várias razões E:T, juntamente com anticorpos quiméricos 92-13, anticorpos quiméricos 93-22 ou IgG humana nãoimunizada, em 0,1 ml de RPMI 1640 sem vermelho de fenol suplementado com FBS a 5% em uma placa de 96 cavidades. LDH liberado nos sobrenadantes de cultura foi determinado por absorbância a 490 nm. A porcentagem de citotoxicidade específica foi calculada de acordo com as instruções do fabricante.

[000223] Referindo-se à atividade efetuadora, ambos os anticorpos quiméricos 92-13 e 93-22 induziram ADCC especificamente nas células SYO-1 que superexpressam FZD10 (figuras 8, a e c), mas não nas células LoVo negativas a FZD10 (figuras 8, b e d). Particularmente, 9213 quimérico mostrou maior indução de citotoxicidade em comparação com 93-22 quimérico; contudo, sua atividade depende de doador de células efetuadoras, possivelmente causada por polimorfismo do receptor Fc.

[000224] Cada um dos pedidos e patentes mencionados neste documento, e cada documento citado ou referido em cada um dos

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72/72 pedidos e patentes acima são incorporados aqui como referência. Além disso, todos os documentos citados neste texto, e todos os documentos citados ou referidos em documentos citados neste texto, e quaisquer instruções do fabricante ou catálogos para quaisquer produtos citados ou mencionados neste texto, são incorporados aqui como referência. [000225] Várias modificações e variações dos métodos descritos e sistema da invenção serão evidentes àqueles habilitados no estado da técnica, sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em relação a modalidades específicas preferidas, deve-se entender que a invenção como reivindicada não deverá ser indevidamente limitada a essas modalidades específicas e que muitas modificações e adições poderão ser feitas dentro do escopo da invenção. Na verdade, pretende-se que várias modificações das modalidades descritas para realizar a invenção que são óbvias àqueles habilitados em biologia molecular ou campos afins estejam dentro do escopo das reivindicações. Adicionalmente, várias combinações das características das reivindicações seguintes dependentes podem ser produzidas com as características das reivindicações independentes, sem se afastar do escopo da presente invenção.

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo humanizado ou quimérico ou fragmento deste, caracterizado pelo fato de que se liga à proteína FZD10 e no qual as regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) são as CDRs do anticorpo monoclonal de camundongo 92-13 (FERM BP-10628).
2. 2. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico que compreende:

   (i) uma região V de cadeia H tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13 e uma região V de cadeia L tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 21; ou (ii) uma cadeia H tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 46 e uma cadeia L tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48.
3. 3. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico que compreende ainda uma região C (constante) de anticorpo humano ou que é um anticorpo humanizado que compreende ainda uma região FR (estrutura) de anticorpo humano e/ou uma região C de anticorpo humano.
4. 4. Anticorpo monoclonal de camundongo ou fragmento deste, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia H que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 58 e uma cadeia L que apresenta a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60.
5. 5. Anticorpo monoclonal de camundongo ou fragmento deste de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de camundongo é produzido pelo clone de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628).
6. 6. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com qualquer

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   2/3 uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é marcado com um marcador de radioisótopo ou um marcador fluorescente.
7. 7. Anticorpo ou fragmento deste de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o marcador de radioisótopo é selecionado de ⁹⁰ítrio (⁹⁰Y), ¹²⁵iodo (¹²⁵I) e ¹¹¹índio (¹¹¹In).
8. 8. Clone de hibridoma 92-13 (FERM BP-10628), caracterizado pelo fato de que produz o anticorpo monoclonal de camundongo 92-13.
9. 9. Método para diagnose ou prognose de uma doença que é associada a homólogo Frizzled 10 (FZD10) ou de uma predisposição para desenvolver a doença em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) contatar uma amostra do indivíduo com o referido anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7;

   (b) detectar a proteína FZD10 na amostra; e (c) julgar se o indivíduo sofre ou não de ou está em risco de desenvolver a doença com base na abundância relativa da proteína FZD10 em comparação com um controle, em que a doença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).
10. 10. Composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença associada a homólogo Frizzled 10 (FZD10), caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado de anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, com um rádionucleotídeo ou fármaco anti-câncer e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a doença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide

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    3/3 aguda (AML).
11. 11. Composição farmacêutica para formação de imagem in vivo de proteína homóloga Frizzled 10 (FZD10), caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
12. 12. Kit para diagnose ou prognose de uma doença associada a homólogo Frizzled 10 (FZD10), caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a doença que é associada a FZD10 é selecionada de sarcoma sinovial (SS), câncer colorretal, câncer gástrico, leucemia mielóide crônica (CML) e leucemia mielóide aguda (AML).