BRPI0610026A2

BRPI0610026A2 - composição de imunolipossoma para direcionamento a um receptor celular her2

Info

Publication number: BRPI0610026A2
Application number: BRPI0610026-0A
Authority: BR
Inventors: Kristen Hjortsvang; Luke Guo; Francis M P Wong; Azar Najafi; Anthony Huang; Robert Abra; Laura Kelley
Original assignee: Alza Corp
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2006-04-20
Publication date: 2010-05-18
Also published as: TW200719917A; WO2006116107A3; IL186700A0; JP2008536944A; EP1871424A2; CA2605560A1; WO2006116107A2; US20060269542A1; AU2006239973A1; MX2007013200A; KR20080002995A

Abstract

COMPOSIçãO DE IMUNOLIPOSSOMA PARA DIRECIONAMENTO A UM RECEPTOR CELULAR HER2. A presente invenção refere-se a uma composição de imunolipossoma compreendida de lipossomas carregando um ligante para direcionamento a células expressando um receptor de fator de crescimento, tal como HER2, é descrita. Ligação do imunolipossoma a células expressando HER2 resulta em internalização do imunolipossoma para aplicação citoplásmica de um fármaco capturado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO DE IMUNOLIPOSSOMA PARA DIRECIONAMENTO A UM RECEPTOR CELULAR HER2".

Campo da Técnica

A presente invenção refere-se a uma composição de lipossoma.Em particular, a matéria objeto refere-se a lipossomas direcionados a umreceptor celular específico para aplicação de um fármaco aprisionado emlipossoma à célula.

Antecedentes

Lipossomas são vesículas esféricas compreendidas de bicama-das de lipídeo concentricamente ordenadas que encapsulam uma fase a-quosa. Lipossomas servem como um veículo de aplicação para agentes te-rapêuticos contidos na fase aquosa ou em bicamadas de lipídeo. Aplicaçãode fármacos em forma aprisionada em lipossoma pode prover uma varieda-de de vantagens, dependendo do fármaco, incluindo, por exemplo, uma toxi-dade de fármaco diminuída, farmacocinética alterada ou solubilidade de fár-maco aperfeiçoado. Lipossomas quando formulados para incluir um revesti-mento de superfície de cadeias de polímero hidrofílico, os chamados Steal-th® ou lipossomas de circulação longa, oferecem a vantagem adicional deum tempo de a/ida na circulação sangüínea longo, devido em parte à remo-ção reduzida dos lipossomas pelo sistema de fagócito mononuclear. Fre-qüentemente um tempo de vida prolongado é necessário a fim de que oslipossomas atinjam sua região ou célula alvo desejada a partir do local deinjeção.

Lipossomas direcionados têm ligantes de direcionamento ouporções de afinidade ligados à superfície dos lipossomas. Os ligantes dedirecionamento pode ser anticorpos ou seus fragmentos, caso onde os li-possomas são referidos como imunolipossomas. Quando administrados sis-temicamente os lipossomas direcionados aplicam o agente terapêutico apri-sionado a um tecido, região ou célula alvo. Devido ao fato dos lipossomasserem direcionados a uma região ou célula específica, tecido saudável não éexposto ao agente terapêutico. Tais ligantes de direcionamento podem serligados diretamente às superfícies do lipossoma através de acoplamentocovalente do ligante de direcionamento aos resíduos de grupo principal polarde componentes lipídeo lipossomais (vide, por exemplo, Patente U.S. No.5.013.556). Esta abordagem, no entanto, é adequada principalmente paralipossomas que não têm cadeias de polímero ligadas à superfície, como ascadeias de polímero interferem com a interação entre o ligante de direcio-namento e seu alvo pretendido (Klibanov, A.L. e outros, Biochim. Biophys.Acta., 1062:142-148 (1991); Hansen, C.B. e outros, Biochim. Biophys. Acta,1239:133-144(1995)).

Alternativamente, os ligantes de direcionamento podem ser liga-dos às extremidades livres das cadeias de polímero formando o revestimen-to de superfície sobre os lipossomas (Allen, T.M. e outros, Biochim. Biophys.Acta., 1237:99-108 (1995); Blume, G. e outros, Biochim. Biophys. Acta,1149:180-184 (1993)). Nesta abordagem, o ligante de direcionamento é ex-posto e prontamente disponível para interação com o alvo pretendido.

O protononcogene HER2 (c-erbB2, neu) e p185HER2, o receptorde fator de crescimento-tirosina cinase que ele codifica, parecem desempe-nhar um papel na patogênese de muitos cânceres humanos. Superexpres-são de p185HER2 acontece em 20-30% dos cânceres de mama, e prevê umprognóstico pobre para esses pacientes (Park, J.W. e outros, Proc. Natl. A-cad. Sei. USA, 92:1327 (1995)).

O receptor p185HER2 é um alvo atraente para uma terapia basea-da em anticorpo, uma vez que quando presente, superexpressão dep185HER2 geralmente acontece homogeneamente dentro de tumores de ma-ma primários, ainda é expresso apenas em níveis baixos em certas célulasepiteliais normais. Um anticorpo monoclonal anti-p185HER2 de murino, mu-Ab4D5, e uma versão humanizada deste anticorpo, trastuzumab, foram de-senvolvidos (Carter, P. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992);

Patente U.S. No. 5.677.171). Vários anticorpos que se ligam a p185HER2fo-ram também descritos (WO 99/55367).

Lipossomas carregando um anticorpo específico para o receptorHER2 foram descritos (Park, J.W. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA,92:1327 (1995)); Park, J.W. e outros, J. Controlled Release, 74:95 (2001);Nielsen, U.B. e outros, Biochim. Biophys. Acta, 1591:109 (2002); PatenteU.S. No. 6.214.388). Uma relação aparente entre o número de anticorpospor lipossoma, isto é, densidade do anticorpo, sobre grau de ligação e ab-sorção celular é descrita (Nielsen, U.B. e outros, Biochim. Biophys. Acta,1591:109 (2002)). Os resultados deste estudo indicam que a variação nadensidade de anticorpos na superfície do lipossoma de a partir de 0 a 30corresponde a um aumento em absorção celular, que atinge um máximo de30 anticorpos por lipossoma. Aumento no número de anticorpos anti-HER2de 30 para 100 por lipossoma não aumentou a absorção celular dos lipos-somas.

A eficácia de um tratamento de câncer está diretamente relacio-nada com a habilidade do tratamento em se direcionar e matar as células docâncer enquanto afetando o mínimo possível de células saudáveis. Emborao conceito de direcionamento de um fármaco especificamente a uma célulade tumor tenha sido amplamente discutido, permanece uma necessidadequanto a uma formulação que seja altamente seletiva para certas células decâncer e que seja feita para ligação in vivo ótima a tais certas células decâncer.

Os exemplos acima da técnica relacionada e limitações relacio-nadas com eles pretendem ser ilustrativos e não exclusivos. Outras limita-ções da técnica relacionada se tornarão aparentes àqueles versados na téc-nica quando da leitura do relatório e um estudo dos desenhos.

Breve Sumário

Em um aspecto, uma composição é descrita, a composiçãocompreendendo lipossomas compreendidos de (i) lipídeos de formação devesícula; (ii) um lipopolímero; (iii) um conjugado de anticorpo de receptoranti-HER2 compreendido de uma porção hidrofóbica de um polímero hidrofí-lico e (iv) um fármaco aprisionado é descrita. A quantidade de conjugadoestá presente em uma quantidade eficaz para prover mais do que cerca de 2anticorpos por lipossoma, em média, e menos do que cerca de 25 anticorpospor lipossoma, em média.Em uma modalidade, o anticorpo tem um peso molecular entre5.000-50.000 Dáltons, com mais preferência entre 10.000-50.000 e commais preferência ainda entre 10.000-30.000. Em uma outra modalidade, oanticorpo tem um peso molecular de menos do que 100.000 Dáltons, commais preferência de menos do que cerca de 35.000 Dáltons, e com mais pre-ferência ainda de menos do que 30.000 Dáltons.

Em uma outra modalidade, o anticorpo tem uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos cerca de 80%, de preferência pelo menoscerca de 85%, com mais preferência pelo menos cerca de 90%, de identida-de de seqüência com SEQ ID NO: 2.

Em uma outra modalidade, o polímero hidrofílico é polietilenoglicol tendo um peso molecular entre 750-5000 Dáltons.

Em uma outra modalidade, o fármaco aprisionado é um fármacocitotóxico. Em ainda uma outra modalidade, o fármaco aprisionado é um a-gente antitumor. Um fármaco aprisionado exemplar é antraciclina, tal comodoxorrubicina.

Em uma outra modalidade, a quantidade de conjugado provemenos do que cerca de 20 anticorpos por lipossoma, em média, 48 horasapós administração in vivo.

Em um outro aspecto, uma formulação de imunolipossoma éprovida, a formulação compreendendo lipossomas compreendidos de (1)pelo menos um lipídeo de formação de vesícula rígido; (ii) um lipopolímerocompreendido de uma porção hidrofóbica e polietileno glicol; (iii) um conju-gado compreendido de uma porção hidrofóbica, polietileno glicol e um anti-corpo de cadeia simples de receptor anti-HER-2 tendo pelo menos 80% deidentidade com a SEQ ID NO: 2; e (iv) um fármaco aprisionado tendo ativi-dade antitumor. Os lipossomas são caracterizados por uma quantidade deconjugado eficaz para prover mais do que cerca de 2 e menos do que cercade 15 anticorpos por lipossoma 96 horas após administração in vivo.

Em uma modalidade, o lipídeo de formação de vesícula rígido éfosfatidilcolina de soja hidrogenada.

Em uma outra modalidade, os lipossomas compreendem aindacolesterol.

Em ainda um outro aspecto, uma formulação de imunolipossomaé descrita, a formulação compreendendo lipossomas compreendidos de (i)pelo menos um lipídeo de formação de vesícula rígido; (ii) um lipopolímerocompreendido de uma porção hidrofóbica e polietileno glicol; (iii) um conju-gado compreendido de uma porção hidrofóbica, polietileno glicol e um anti-corpo de cadeia simples de receptor anti-HER-2 tendo a identidade de SEQID NO:2; e (iv) um fármaco aprisionado tendo atividade antitumor. A formula-ção de imunolipossoma quando administrada in vivo prove uma área sob acurva que é maior do que ou não mais do que 25% menor do que a área soba curva de lipossomas compreendidos de componentes similares mas sem oanticorpo.

Em uma modalidade, a quantidade de conjugado prove menosdo que cerca de 20 anticorpos por lipossoma, em média, 48 horas após ad-ministração in vivo. Em uma outra modalidade, a quantidade de conjugadoprove menos do que cerca de 15 anticorpos por lipossoma, em média, 96horas após administração in vivo.

Em ainda uma outra modalidade, a quantidade de conjugadoprove mais do que dois anticorpos por lipossoma, em média, 48 horas apósadministração*;/^ vivo e menos do que cerca de 20 anticorpos por lipossoma,em média, 48 horas após administração in vivo.

Em ainda um outro aspecto, uma formulação de imunolipossomaé descrita, onde a formulação compreende lipossomas compreendidos de (i)pelo menos um lipídeo de formação de vesícula rígido; (ii) opcionalmente,um lipopolímero compreendido de uma porção hidrofóbica e polietileno gli-col; (iii) um conjugado compreendido de uma porção hidrofóbica, polietilenoglicol e um anticorpo de cadeia simples de receptor anti-HER-2 tendo pelomenos 80% de identidade com SEQ ID NO:2; e (iv) um fármaco aprisionadotendo atividade antitumor. A composição é caracterizada pela característicade que 96 horas após administração dos imunolipossomas, entre 30-60% deanticorpos dissociam de cada lipossoma para prover uma composição, 96horas após administração in vivo que tem menos do que cerca de 25 anti-corpos por lipossoma.

Em ainda um outro aspecto, uma composição de lipossoma pre-parada de acordo com um certo processo é descrita, o processo sendocompreendido de (i) provisão de lipossomas, opcionalmente tendo um reves-timento externo de cadeias de polímero hidrofílico e/ou um fármaco aprisio-nado; (b) incubação dos lipossomas com uma quantidade de conjugadocompreendido de uma porção hidrofóbica, polietileno glicol e um anticorpode cadeia simples de receptor anti-Her-2 tendo pelo menos 80% de identi-dade com SEQ ID NO:2; e a quantidade de conjugado sendo selecionadapara prover (i) mais do que dois anticorpos por lipossoma em média 96 ho-ras após administração in vivo; (ii) menos do que 150 anticorpos por lipos-soma em média; e/ou (iii) menos do que cerca de 15 anticorpos por liposso-ma em média 96 horas após administração in vivo.

Em uma modalidade, a quantidade de conjugado prove 12 oumenos, alternativamente 10 ou menos, alternativamente 8 ou menos, anti-corpos por lipossoma em média.

Em um outro aspecto, uma composição é descrita, a composi-ção compreendendo lipossomas conforme acima descrito, mas onde os li-possomas antes da administração in vivo têm menos do que 25 anticorpospor lipossoma e após administração in vivo, os lipossomas perdem entrecerca de 20-50% dos anticorpos ainda retendo ligação ao receptor Her-2suficiente para citotoxidade.

Em ainda um outro aspecto, um método de preparação de umacomposição de imunolipossoma é provido. O método compreende provisãode imunolipossomas compreendidos de (i) lipídeos de formação de vesícula;(ii) opcionalmente um lipopolímero; (iii) um conjugado compreendido de umaporção hidrofóbica, um polímero hidrofílico e um anticorpo tendo afinidadede ligação para um alvo, tal como um domínio extracelular de um receptorHer-2; e (iv) um fármaco aprisionado. O conjugado é incluído na composiçãoem uma primeira quantidade suficiente para prover um primeiro número se-lecionado de anticorpos por lipossoma. Os lipossomas são trazidos em con-tato com sangue, in vitro ou in vivo, e o número de anticorpos por lipossomaem um ou mais pontos de tempo quando do contato dos lipossomas comsangue é determinado, por exemplo, através de uma técnica analítica ade-quada tal como cromatografia. Com base na determinação do número deanticorpos em um primeiro ponto de tempo selecionado após contato comsangue, uma segunda quantidade de conjugado suficiente para prover umsegundo número, maior, de anticorpos por lipossoma a fim de prover pelomenos dois anticorpos por lipossoma após contato com sangue em tal pontode tempo é selecionada.

Em uma modalidade, o método inclui seleção de uma segundaquantidade de conjugado eficaz para prover menos do que 50 anticorpos porlipossoma. Em uma outra modalidade, uma segunda quantidade de conju-gado eficaz para prover 30 ou menos anticorpos por lipossoma é selecionada.

Em uma outra modalidade, o método inclui provisão de liposso-mas tendo uma primeira quantidade de conjugado que prove menos do que150 anticorpos por lipossoma, com mais preferência 100 ou menos anticor-pos por lipossoma e com mais preferência ainda 75 ou menos anticorpos porlipossoma.

Em adição aos aspectos exemplares e modalidades descritosacima, aspectos e modalidades adicionais se tornarão aparentes através dereferência aos desenhos e através do estudo das descrições que seguem.

Breve Descrição dos Desenhos

As figuras 1A-1B mostram um esquema de reação sintética parapreparação de um conjugado de lipídeo-polímero-anticorpo onde uma ma-leimida de um DSPE carbamato de polietileno glicol (PEG) bis (amina) éformada;

A figura 2A mostra a viabilidade celular, expressa como umaporcentagem de células de controle não-tratado, como uma função de con-centração de doxorrubicina, em ug/mL, após 10 minutos de exposição à do-xorrubicina administrada como fármaco livre, aprisionado em lipossomas(círculos), ou aprisionada em imunolipossomas contendo 2 (círculos), 5(quadrados), 7,5 (diamantes) ou 15 (triângulos) anticorpos por lipossoma;A figura 2B mostra a viabilidade celular, expressa como umaporcentagem de células de controle não-tratado, como uma função de con-centração de doxorrubicina, em ug/ml, após quatro horas de exposição àdoxorrubicina administrada como fármaco livre (diamantes), aprisionada emlipossomas (triângulos) ou aprisionada em imunolipossomas contendo 7,5(símbolos X), 15 (símbolos *), 30 (círculos) ou 45 (quadrados) anticorpos porlipossoma;

As figuras 3A-3H mostram o perfil de eluição de scFv radiomar-cado (125l) de imunolipossomas tendo 15 anticorpos scFV marcados por li-possoma de alíquotas removidas durante incubaçao dos imunolipossomasem plasma humano, as alíquotas removidas em tempos de 0 hora (figura3A), 1 hora (figura 3B), 4 horas (figura 3C), 8 horas (figura 3D), 24 horas (fi-gura 3E), 48 horas (figura 3F), 72 horas (figura 3G) e 96 horas (figura 3E);

A figura 4A mostra a dissociação de anticorpo scFv marcadocom 125l de formulações imunolipossoma tendo razões de anticor-po/lipossoma de 7,5:1 (diamantes), 15:1 (quadrados), 30:1 (círculos), 45:1(triângulos) e 90:1 (*) como uma função de tempo de incubaçao, em horas,em plasma humano in vitro.

A figura 4B mostra a porcentagem de marcador 125l restante nosimunolipossomas tendo razões de anticorpo/lipossoma de 7,5:1 (diamantes),15:1 (quadrados), 30:1 (círculos), 45:1 (triângulos) e 90:1 (*) como uma fun-ção de tempo de incubaçao, em horas, em plasma humano in vitro;

A figura 5A mostra a porcentagem de anticorpo radiomarcadodissociado da formulação de imunolipossoma tendo 15 anticorpos por lipos-soma em dois estudos diferentes (diamantes, quadrados) como uma funçãode tempo de incubaçao, em horas, em plasma humano in vitro;

A figura 5B mostra a porcentagem de anticorpo radiomarcadoque permanece nos imunolipossomas (diamantes) e dissociado dos imunoli-possomas (quadrados) da formulação de imunolipossoma tendo 15 anticor-pos por lipossoma como uma função de tempo de incubaçao, em horas, emplasma humano;

A figura 6A mostra a porcentagem de anticorpo scFv marcadocom 125l recuperado na fração lipossomal de amostras de plasma como umafunção de tempo, em horas, após administração de uma formulação de imu-nolipossoma 15:1 a ratos;

A figura 6B mostra a concentração de anticorpo scFv marcadocom 125l, em ng/mL, recuperado na fração lipossoma de plasma de rato apósseparação da coluna Sepharose CL-4B como uma função de tempo, em ho-ras, após administração de uma formulação de imunolipossoma 15:1 a ratos;

A figura 6C mostra a concentração de anticorpo scFv marcadocom 125l, em ng/mL, recuperado na fração livre ou de plasma de plasma derato após separação em uma coluna Sepharose CL-4B como uma função detempo, em horas, após administração de uma formulação de imunoliposso-ma 15:1 a ratos;

A figura 7A mostra a porcentagem de scFv marcado com 125lrestante no plasma (diamantes), no sangue (quadrados fechados) e a por-centagem de doxorrubicina no plasma (triângulos) como uma função detempo, em horas, após administração de uma formulação de imunoliposso-ma 15:1 a ratos. Também mostrada é a porcentagem de anticorpo scFvmarcado com 125l no plasma (círculos abertos) e no sangue (quadrados a-bertos) como uma função de tempo, em horas, após administração como umconjugado livre a ratos em uma dose de doxorrubicina de 2 mg/kg;

A figura 7B mostra a concentração no plasma de doxorrubicina,em ug/mL, como uma função de tempo, em horas, após administração deuma formulação de imunolipossoma 15:1 a ratos em uma dose de 2 mg/kg;

A figura 8 é um gráfico da razão de anticorpo scFv marcado com125l para doxorrubicina no sangue, em ng/ug, como uma função de tempo,em horas, após administração de uma formulação de imunolipossoma 15:1 aratos;

A figura 9 é um gráfico de concentração de doxorrubicina noplasma, em ug/mL, como uma função de tempo, em horas, após administra-ção in vivo de lipossomas PEGuilados contendo doxorrubicina (diamantes)ou de imunolipossomas contendo 15 (quadrados), 75 (triângulos), 150 (x) ou300 (*) anticorpos scFv por lipossoma;As figuras 10A-10B mostram o volume de tumor, em porcenta-gem relativo ao tamanho de tumor inicial, (figura 10A) e a mudança percen-tual no peso do corpo (figura 10B) em camundongos carregando um xeno-enxerto de tumor de mama e tratados com solução salina (círculos abertos),lipossomas PEGuilados contendo doxorrubicina (quadrados abertos) ou i-munolipossomas contendo 7,5 (diamantes), 15 (triângulos), 30 (quadradosfechados) ou 45 (círculos fechados) anticorpos scFv por lipossoma;

A figura 11 é um gráfico de volume de tumor relativo, tomadocomo uma porcentagem de volume de tumor inicial, como uma função detempo, em dias, em camundongos carregando um xenoenxerto de tumor demama e tratados com solução salina (círculos abertos), lipossomas PEGui-lados contendo doxorrubicina em dosagens de 2 mg/kg (quadrados abertos)e 3 mg/kg (diamantes abertos) ou com uma formulação dê imunolipossoma15:1 em dosagens de 2 mg/kg (quadrados fechados), 3 mg/kg (diamantesfechados) ou 4 mg/kg (triângulos fechados);

A figura 12 é um gráfico de concentração de doxorrubicina noplasma, em ng/mL, como uma função de tempo, em horas, após administra-ção intravenosa a macacos de doxorrubicina (10 mg/mL) aprisionada emimunolipossomas carregando 15 anticorpos scFv por lipossoma, em média,(círculos) ou aprisionada em lipossomas PEGuilados (quadrados);

A figura 13A é um gráfico da concentração de doxorrubicina noplasma, em ng/mL, como uma função de tempo, em horas, após administra-ção intravenosa a macacos de doxorrubicina aprisionada em imunoliposso-mas carregando 15 anticorpos scFv por lipossoma, em média, a doxorrubici-na administrada em dosagens de 1 mg/kg (círculo), 5 mg/kg (quadrados) e10 mg/kg (triângulos);

A figura 13B é um gráfico da concentração de anticorpo noplasma, em ng/mL, como uma função de tempo, em horas, após administra-ção intravenosa a macacos de doxorrubicina aprisionada em imunoliposso-mas carregando 15 anticorpos scFv por lipossoma, em média, os imunoli-possomas administrados em dosagens de doxorrubicina de 1 mg/kg (círcu-los), 5 mg/kg (quadrados) e 10 mg/kg (triângulos);A figura 14A é um gráfico da razão de concentração de anticorposcFv/doxorrubicina em plasma, em ng/ug, como uma função de tempo, emhoras, após administração a macacos de doxorrubicina aprisionada em imu-nolipossomas carregando 15 anticorpos scFv por lipossoma, em média, osimunolipossomas administrados em dosagens de doxorrubicina de 1 mg/kg(diamantes), 5 mg/kg (quadrados) e 10 mg/kg (triângulos);

A figura 14B é um gráfico da razão de concentração de anticorposcFv/doxorrubicina em plasma normalizado para a razão de anticor-po/doxorrubicina inicial, como uma função de tempo, em horas, após admi-nistração a macacos de doxorrubicina aprisionada em imunolipossomas car-regando 15 anticorpos scFv por lipossoma, em média, os imunolipossomasadministrados em dosagens de doxorrubicina de 1 mg/kg (diamantes), 5mg/kg (quadrados) e 10 mg/kg (triângulos); e

A figura 15A é um gráfico de concentração de doxorrubicina, emng/m, como uma função de tempo, em horas, após administração a macacosde doxorrubicina aprisionada em imunolipossomas carregando 15 anticorposscFv por lipossoma, em média, os imunolipossomas administrados em do-sagens de doxorrubicina de 0,5 mg/kg (quadrados), 2 mg/kg (triângulos) e 4mg/kg (triângulos invertidos);

A figura 15B é um gráfico de concentração de doxorrubicina, emng/mL, como uma função de tempo, em horas, após administração a maca-cos de doxorrubicina aprisionada em imunolipossomas carregando 15 anti-corpos scFv por lipossoma, em média, os imunolipossomas administradosem uma dosagem de doxorrubicina de 4 mg/kg seis vezes durante um perí-odo de seis meses, os dados correspondendo às primeira (triângulos inverti-dos) e sexta (quadrados) doses;

A figura 15C é um gráfico de concentração de doxorrubicina, emng/mL, como uma função de tempo, em horas, após administração a maca-cos de 4 mg/kg de doxorrubicina em forma livre (triângulos), aprisionada emlipossomas PEGuilados (DOXIL®; quadrados) ou aprisionada em imunoli-possomas carregando 15 anticorpos scFv por lipossoma, em média (triângu-los invertidos).Breve Descrição das Seqüências

A SEQ ID NO:1 é a seqüência de nucleotídeo de um anticorpotendo afinidade de ligação para o domínio extracelular de receptor c-erb-B2,também referido aqui como receptor HER2 e o receptor p185HER2.

A SEQ ID NO:2 é a seqüência de aminoácido de um anticorpode cadeia simples (scFv) chamado F5, tendo a habilidade em especifica-mente se ligar ao domínio extracelular de receptor HER2.

Descrição Detalhada

I. Definições

A menos que de outro modo mencionado, o termo "lipídeo deformação de vesícula" refere-se a qualquer lipídeo capaz de formar parte deuma composição de micela ou lipossoma estável e tipicamente incluindouma ou duas cadeias de hidrocarbono, hidrofóbicas, ou um grupo esteróidee pode conter um grupo quimicamente reativo, tal como uma amina, um és-ter ácido, aldeído ou álcool, como seu grupo principal polar.

Conforme aqui usado, um "anticorpo" inclui anticorpos integraise qualquer fragmento de ligação de antígeno ou sua cadeia simples. Destemodo, o anticorpo inclui qualquer molécula contendo proteína ou peptídeoque compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobuli-na, tal como, mas não limitado a, pelo menos uma região de determinaçãode complementariedade-(CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma por-ção de ligação de ligante dela, uma região variável de cadeia pesada ou ca-deia leve, uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma regi-ão de estrutura (FR), ou qualquer porção dela, ou pelo menos uma porçãode uma proteína de ligação.

O termo "anticorpo" pretende ainda compreender fragmentos dedigestão de anticorpo, suas porções especificadas e variantes, incluindo mi-méticos de anticorpo ou compreendendo domínios de anticorpos que imitama estrutura e/ou função de um anticorpo ou seu fragmento ou porção especi-ficada, incluindo anticorpos de cadeia simples e seus fragmentos. Fragmen-tos funcionais incluem fragmentos de ligação de antígeno que se ligam auma proteína HER2 de mamífero que é um receptor de fator de crescimento.Exemplos de fragmentos de ligação compreendidos no termo "porção deligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, umfragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) umfragmento F(ab')2) um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentosFab ligados por uma ponte dissulfeto na região de união; (iii) um fragmentoFd consistindo nos domínios VH e CH; (iv) um fragmento Fv consistindo nosdomínios VL e VH de um braço simples de anticorpo, (v) e um fragmentodAb (Ward e outros, Nature, 341:544-546 (1989)), que consiste em um do-mínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade isolada(CDR). Ainda, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejamcodificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodosrecombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam feitoscomo uma cadeia de proteína única onde as regiões VL e VH emparelhampara formar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia única Fv(scFv); vide, por exemplo, Bird e outros, Science, 242:423-426 (1988), Hus-ton e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5879-5883 (1988)). Tais anticor-pos de cadeia simples são também pretendidos ser compreendidos dentrodo termo anticorpo. Esses anticorpos são obtidos usando técnicas conven-cionais conhecidas daqueles versados na técnica, e os fragmentos são ava-liados quanto^à utilidade da mesma maneira que o são os anticorpos intactos.

Tais fragmentos podem ser produzidos através de clivagem en-zimática, técnicas sintéticas ou recombinantes, como conhecido na técnicae/ou conforme descrito aqui. Anticorpos podem ser também produzidos emuma variedade de formas truncadas usando genes de anticorpo onde um oumais códons de parada foram introduzidos a montante do sítio de paradanatural. Por exemplo, um gene de combinação codificando uma porção decadeia pesada F(ab')2 pode ser feito para incluir seqüências de DNA codifi-cando o domínio CH1 e/ou região de união da cadeia pesada. As várias por-ções de anticorpos podem ser unidas quimicamente através de técnicasconvencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua u-sando técnicas de engenharia genética.Por "receptor HER2" e "p185HER2" se quer dizer a proteína co-dificada pelo gene HER2 ou ERRB2 (v-erb-2, homólogo 2 do oncogene viralde leucemia eritroblástica) e também chamado o homólogo do oncogenederivado de neuro/glioblastoma; homólogo 2 do oncogene viral (v-erb-2) deleucemia eritroblástica de ave; homólogo 2 do oncogene viral da leucemiaeritroblástica de ave v-erb-b2 (homólogo de oncogene derivado de neu-ro/glioblastoma). O gene HER2/ERRB2 codifica um membro da família dereceptor de fator de crescimento epidermal (EGF) de receptor tirosina cina-se. A seqüência de codificação para HER2 é dada pela seqüência de refe-rência NM_004448 cujo produto de tradução é dado por NP_004439. O re-ceptor HER2 não tem nenhum domínio de ligação de ligante próprio e entãonão pode ligar fatores de crescimento. No entanto, ele realmente se liga for-temente a outros membros da família de receptor EGF ligado a ligante paraformar um heterodímero, estabilizando a ligação de ligante e aumentando aativação mediada por cinase de cursos de sinalização a jusante, tal comoaqueles envolvendo proteína cinase e fosfatidilinositol-3 cinase ativadas pormitógeno. Variações alélicas em posições de aminoácido 654 e 655 de iso-forma (posições 624 e 625 de isoforma b) foram descritas, com o alelo maiscomum, Ile654/lle655. União alternativa resulta em várias variantes de trans-crito adicionais, algumas codificando isoformas diferentes. Todas as varian-tes alélicas e de união estão incluídas no significado de "receptor HER2".

Um "anticorpo de internalização" é um anticorpo que, quando daligação a um receptor ou outro ligante sobre a superfície de uma célula, étransportado para a célula, por exemplo, para uma lisozima ou outra organe-la ou para o citoplasma.

O termo "isolado" refere-se a material que é substancialmenteou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanhamconforme encontrado em seu estado nativo.

O termo "idêntico" ou "identidade" percentual ou "homologia"percentual no contexto de duas ou mais seqüências de ácido nucleico oupolipeptídeo refere-se a duas ou mais seqüências ou subseqüências quesão iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoáci-do ou nucleotídeo que é igual, quando comparadas com e alinhadas paracorrespondência máxima, conforme medido através de inspeção visual ouusando um algoritmo de computador.

Conforme aqui usado, o termo "afinidade" de um anticorpo refe-re-se à constante de dissociação, KD, do anticorpo para um antígeno prede-terminado. Anticorpos de alta afinidade têm uma KD de 10'8 M ou menos,com mais preferência 10"9 M ou menos e com mais preferência ainda 10"10 Mou menos, para um antígeno predeterminado. O termos "Kdis" ou "KD" ou"Kd", conforme aqui usado, pretendem se referir à taxa de dissociação deuma interação de anticorpo-antígeno particular. A "KD" é a razão da taxa dedissociação (k2), também chamada de "off-rate (koff)", para a taxa de taxa deassociação (k^ ou a "on-rate (kon)"- Deste modo, KD é igual a k2/k1 ou IWkone é expressa como uma concentração molar (M). Portanto quanto menor aKD, mais forte a ligação. Então uma KD de 10"6 M (ou 1 uM) indica uma liga-ção fraca comparado com 10'9 M (ou 1 nM).

As expressões "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "umanticorpo específico para um antígeno" são usadas intercomutavelmenteaqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".Conforme aqui usado, "ligação específica" e "se liga especificamente" sereferem à ligação de anticorpo a um antígeno predeterminado com maiorafinidade do que para outros antígenos ou proteínas. Tipicamente, o anticor-po se liga com uma constante de dissociação (KD) de 10"6 M ou menos, e seliga ao antígeno predeterminado com uma KD que é pelo menos duas vezesmenos do que sua Kd para ligação a um antígeno não-específico (por exem-plo, BSA, caseína ou qualquer outro polipeptídeo especificado) outro quenão o antígeno predeterminado. As expressões "um anticorpo reconhecendoum antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas in-tercomutavelmente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especifica-mente a um antígeno".

Conforme revelado e reivindicado aqui, a seqüência mostrada naSEQ ID NO:2 inclui "modificações de seqüência conservativas", isto é, modi-ficações de seqüência de nucleotídeos e aminoacidos que não afetam oualteram significantemente as características de ligação do anticorpo codifi-cado pela seqüência de nucleotídeo ou contendo a seqüência de aminoáci-do. Tais modificações de seqüência conservativas incluem substituições,adições ou deleções de nucleotídeo e aminoácido. Modificações podem serintroduzidas na SEQ ID NO:2 através de técnicas padrão conhecidas nocampo, tal como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediadapor PCR. Substituições de aminoácido conservativas incluem uma onde oresíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendouma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadei-as laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem ami-noácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidi-na), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico),cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina,glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias lateraisnão-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenila-lanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina,valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, feni-lalanina, triptofano, histidina).

II. Composição de Lipossoma

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição de li-possoma compreendida de lipossomas que incluem como um ligante de di-recionamento um anticorpo tendo especificidade de ligação para um receptorde fator de crescimento HER2. O ligante de direcionamento a HER2 é incor-porado aos lipossomas na forma de um conjugado de lipídeo-polímero-anticorpo, também referido aqui como um conjugado de lipídeo-polímero-ligante. Como será descrito abaixo, o anticorpo tem afinidade específica parao domínio externo do receptor HER2 e direciona os lipossomas para célulasque expressam receptor HER2. As seções que seguem descrevem os com-ponentes do lipossoma, incluindo os lipídeos e agentes terapêuticos do li-possoma, preparação de lipossomas carregando um ligante de direciona-mento a HER2 e métodos de uso da composição lipossomal para tratamentode distúrbios.A. Componentes Lipideo de Lipossoma

Lipossomas adequados para uso na composição da presenteinvenção incluem aqueles compostos principalmente de lipideos de forma-ção de vesícula. Tal lipideo de formação de vesícula é um que pode se for-mar espontaneamente em vesículas bicamada em água, conforme exempli-ficado por fosfolipídeos, com sua porção hidrofóbica em contato com a regi-ão hidrofóbica, interior, da membrana bicamada, e sua porção de grupo prin-cipal orientada em direção à superfície polar, exterior, da membrana. Lipi-deos capazes de incorporação estável a bicamadas de lipideo, tal como co-lesterol e seus vários análogos, podem ser também usados nos lipossomas.

Os lipideos de formação de vesícula são de preferência lipideostendo duas cadeias hidrocarbono, tipicamente cadeias acila, e um grupoprincipal, ou polar ou não-polar. Existe uma variedade de lipideos de forma-ção de vesícula sintéticos e lipideos de formação de vesícula de ocorrêncianatural, incluindo os fosfolipídeos, tal como fosfatidilcolina, fosfatidiletanola-mina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol e esfingomielina, onde as duas ca-deias hidrocarbono são tipicamente entre cerca de 14-22 átomos de carbonode comprimento, e têm graus variáveis de insaturação. Os lipideos e fosfoli-pídeos descritos acima cujas cadeias carbono têm graus variáveis de satu-ração podem ser obtidos comercialmente ou preparados de acordo com mé-todos publicados. Outros lipideos adequados incluem glicolipídeos, cerebro-sídeos e esteróis, tal como colesterol.

Lipideos catiônicos são também adequados para uso nos lipos-somas da invenção, onde o lipideo catiônico pode ser incluído como umcomponente em quantidade menor da composição de lipideo ou como umcomponente principal ou único. Tais lipideos catiônicos tipicamente têm umaporção lipofílica, tal como um esterol, uma cadeia acila ou diacila, e onde olipideo tem uma carga positiva líquida geral. De preferência, o grupo princi-pal do lipideo carrega a carga positiva. Lipideos catiônicos exemplares in-cluem 1,2-dioleilóxi-3-(trimetilamino) propano (DOTAP); brometo de N-[1-(2,3-ditetradecilóxi)propil]-N,N-dimeitl-N-hidroximetilamônio (DMRIE); brome-to de N-[1-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidróxi etilamônio (DORIE);cloreto de N-[1-(2,3-dioleilóxi)propil]-N)N-trimetilamônio (DOTMA); 3-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol); e dimetildioctadeci-lamônio (DDAB). O lipídeo de formação de vesícula catiônico pode ser tam-bém um lipídeo neutro, tal como dioleilfosfatidil etanolamina (DOPE) ou umlipídeo anfifático, tal como um fosfolipídeo, derivatizado comum lipídeo cati-ônico, tal como polilisina ou outros lipídeos de poliamina. Por exemplo, olipídeo neutro (DOPE) pode ser derivatizado com polilisina para formar umlipídeo catiônico.

O lipídeo de formação de vesícula pode ser selecionado paraatingir um grau especificado de fluidez ou rigidez, para controlar a estabili-dade do lipossoma no soro, para controlar as condições eficazes para inser-ção do conjugado de direcionamento, como será descrito, e/ou para contro-lar a taxa de liberação do agente aprisionado no lipossoma. Lipossomastendo uma bicamada de lipídeo mais rígida, ou uma bicamada cristalina lí-quida, são obtidos através da incorporação de um lipídeo relativamente rígi-do, por exemplo, um lipídeo tendo uma temperatura de transição de faserelativamente alta, por exemplo, até 60° C. Lipídeos rígidos, isto é, satura-dos, contribuem para rigidez de membrana maior na bicamada de lipídeo.Outros componentes de lipídeo, tal como colesterol, são também conhecidoscontribuir para a rigidez da membrana em estruturas em bicamada de lipí-_deo.

Por outro lado, fluidez de lipídeo é conseguida através da incor-poração de um lipídeo relativamente fluido, tipicamente um tendo uma fasede lipídeo com uma temperatura de transição de fase cristalina-líquido paralíquido relativamente baixa, por exemplo, na ou abaixo da temperatura am-biente.

Os lipossomas também incluem um lipídeo de formação de vesí-cula covalentemente ligado a um polímero hidrofílico, também referido aquicomo um "lipopolímero". Como foi descrito, por exemplo, na Patente U.S.No. 5.013.556, inclusão de tal lipídeo derivatizado de polímero na composi-ção de lipossoma forma um revestimento de superfície de cadeias de polí-mero hidrofílico em torno do lipossoma. O revestimento de superfície de ca-deias de polímero hidrofílico é eficaz para aumentar o tempo de vida da cir-culação sangüínea in vivo dos lipossomas quando comparado com liposso-mas sem tal revestimento.

Lipídeos de formação de vesícula adequados para derivatizaçãocom um polímero hidrofílico incluem qualquer um desses lipídeos listadosacima, e, em particular, fosfolipídeos, tal como diestearoil fosfatidiletanola-mina (DSPE).

Polímeros hidrofílicos adequados para derivatização com umlipídeo de formação de vesícula incluem polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter,polimetiloxazolina, polietiloxazolina, poliidroxipropiloxazolina, poliidroxipro-pilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilmetacrilamida, poliidroxipro-pilmetacrilato, poliidroxietilacrilato, hidroximetilcelulose, hidroxietilcelulose,polietilenoglicol, poliaspartamida e seqüências de peptídeo hidrofílico. Ospolímeros podem ser empregados como homopolímeros ou como copolíme-ros em bloco ou aleatórios.

Uma cadeia de polímero hidrofílico preferida é polietilenoglicol(PEG), de preferência como uma cadeia de PEG tendo um peso molecularentre 500-1.000 Dáltons, com mais preferência entre 750-10.000 Dáltons,com mais preferência ainda entre 750-5000 Dáltons. Análogos capeadoscom metóxi ou etóxi de PEG são também polímeros hidrofílicos preferidos,comercialmente disponíveis em uma variedade de tamanhos de polímero,por exemplo, 120-20.000 Dáltons.

Preparação de lipídeos de formação de vesícula derivatizadoscom polímeros hidrofílicos foi descrita, por exemplo, na Patente U.S. No.5.395.619. Preparação de lipossomas incluindo tais lipídeos derivatizados foitambém descrita, onde tipicamente entre 1 -20 por cento em mol de tal lipí-deo derivatizado estão incluídos na formulação de lipossoma (vide, por e-xemplo, Patente U.S. No. 5.013.556).

B. Anticorpo de Direcionamento

A composição de lipossoma também inclui um anticorpo que di-reciona as partículas de lipídeo a uma célula. Em uma modalidade, o anti-corpo se liga especificamente a receptor HER2 sobre a superfície de umacélula derivada de tumor. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreen-de pelo menos um domínio de ligação que especificamente se liga ao recep-tor HER2 sobre a superfície de uma célula derivada de tumor. Em uma mo-dalidade alternativa, o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples compre-endendo pelo menos um domínio de ligação que especificamente se liga areceptor HER2 sobre a superfície de uma célula derivada de tumor.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo para uso na compo-sição de lipossoma descrita aqui é um anticorpo de cadeia simples compre-endendo pelo menos um domínio de ligação que especificamente se liga areceptor HER2 sobre a superfície de uma célula derivada de tumor e temuma seqüência identificada aqui como SEQ ID NO:2. A preparação desteanticorpo é descrita no WO 99/55367 e o anticorpo é chamado F5. O anti-corpo é um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) que especifica-mente se liga ao domínio extracelular do produto de proteína c-erb-B2 dooncogene HER2/neu, e é também referido aqui como o anticorpo anti-HER2,ou um anticorpo tendo afinidade de ligação para o receptor HER2. O anti-corpo F5 é compreendido de domínios variáveis de anticorpo humano co-nectados por uma molécula ligante e contém 252 aminoácidos com uma cis-teína terminal (peso molecular 27,6 Kd) e tem afinidade de ligação comHER2 moderada (Kd=150-300 nM ou 1,5-3 x 10'7 M). O anticorpo anti-HER2da invenção é rapidamente internalizado em células que expressam o recep-tor HER2 sobre sua superfície de membrana.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-HER2 tem uma seqüênciaque representa substituição conservativa de SEQ ID NO:2.

C. Preparação de Conjugado de Lipídeo-Polímero-Anticorpo

Conforme acima descrito, o anticorpo anti-HER2 é covalente-mente ligado à extremidade distai livre de uma cadeia de polímero hidrofíli-co, que é ligado em sua extremidade proximal a um lipideo de formação devesícula. Há uma ampla variedade de técnicas para ligação de um polímerohidrofílico selecionado a um lipideo selecionado e ativação da extremidadenão-ligada, livre, do polímero para reação com um ligante selecionado e, emparticular, o polímero hidrofílico de polietilenoglicol (PEG) tem sido ampla-mente estudado (Allen, T.M. e outros, Biochemicia et Biophysica Acta,1237:108 (1995); Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4(4):296-299 (1993);Zalipsky, S. e outros, FEBS Lett., 353:71-74 (1994); Zalipsky, S. e outros,Bioconjugate Chemistry, 6(6):705-708 (1995); Zalipsky, S. em STEALTH Ll-POSOMES (D. Lasic e F. Martin, Eds.) Capítulo 9, CRC Press, Boca Raton, Fia. (1995)).

Em geral, as cadeias de PEG são funcionalizadas para contergrupos reativos adequados para acoplamento com, por exemplo, sulfidrilas,grupos amino e aldeídos ou cetonas (tipicamente derivados de oxidação su-ave de porções carboidrato de um anticorpo) presentes em uma ampla vari-edade de ligantes. Exemplos de tais grupos reativos PEG-terminais incluemmaleimida (para reação com grupos sulfidrila), N-hidroxissuccinimida (NHS)ou éster de carbonato de NHS (para reação com aminas primárias), hidrazi-da ou hidrazina (para reação com aldeídos ou cetonas), iodoacetila (de pre-ferência reativo com grupos sulfidrila) e ditiopiridina (tiol-reativa). Esquemasde reação sintética para ativação de PEG com tais grupos são mostradosnas Patentes U.S. Nos. 5.631.018, 5.527.528, 5.395.619 e as seções rele-vantes descrevendo procedimentos de reação sintética são expressamenteaqui incorporadas a título de referência.

Esquema de reação sintética exemplar é mostrado nas figuras1A-1B. Detalhes da reação são dados na Patente U.S. No. 6.326.353. Re-sumidamente, polietileno glicol (PEG) bis (amina) (Composto I) é reagidacom cloreto de 2-nitrobenzeno sulfonila para gerar o produto monoprotegido(Composto II). O Composto II é reagido com carbonil diimidazol em trietila-mina (TEA) para formar o imidazol carbamato da mono 2-nitrobenzenossulfonamida (Composto III). O composto III é reagido comDSPE em TEA para formar o lipídeo PE derivatizado protegido em uma ex-tremidade com cloreto de 2-nitrogenzil sulfonila. O grupo de proteção é re-movido através de tratamento com ácido para dar o produto DSPE-PEG(Composto IX) tendo uma amina terminal na cadeia PEG. Reação com ani-drido de ácido maléico dá o produto maleamico correspondente (CompostoV), que em reação com anidrido acético dá o produto de PE-PEG-maleimida(Composto VI). O composto é reativo com grupos sulfidrila, para acoplamen-to dos anticorpos antiintegrina descritos aqui através de uma ligação tioéter(Composto VII).

Será compreendido que qualquer um dos polímeros hidrofílicosmencionados acima em combinação com qualquer um dos lipídeos de for-mação de vesícula acima mencionados pode ser empregado como agentesde modificação para preparar o conjugado de direcionamento lipídeo-polímero-ligante e seqüências de reação adequadas para qualquer polímeroselecionado podem ser determinadas por aqueles versados na técnica.

D. Preparação de Lipossoma

Várias abordagens foram descritas para preparação de liposso-mas tendo um ligante de direcionamento ligado à extremidade distai de ca-deias de polímero ligadas a lipossoma. Uma abordagem envolve preparaçãode vesículas de lipídeo que incluem um derivado de lipídeo-polímero funcio-nalizado na extremidade; isto é, um conjugado de lipídeo-polímero onde aextremidade de polímero livre é reativa ou "ativada" (vide, por exemplo, Pa-tentes U.S. Nos. 6.326.353 e 6.132.763). Tal conjugado ativado é incluído nacomposição de lipossoma e as extremidades do polímero ativadas são rea-gidas com um ligante de direcionamento após formação de lipossoma. Emuma outra abordagem, o conjugado de lipídeo-polímero-ligante é incluído nacomposição_.de lipídeo no momento da formação de lipossoma (vide, porexemplo, Patentes U.S. Nos. 6.224.903, 5.620.689). Em ainda uma outraabordagem, uma solução micelar do conjugado de lipídeo-polímero-ligante éincubada com uma suspensão de lipossomas e o conjugado de lipídeo-polímero-ligante é inserido nos lipossomas pré-formados (vide, por exemplo,Patentes U.S. Nos. 6.056.973, 6.316.024).

Lipossomas carregando um agente aprisionado e carregandoligantes de direcionamento ligados à superfície, isto é, lipossomas terapêuti-cos, direcionados, são preparados através de qualquer uma dessas aborda-gens. Um método preferido de preparação é o método de inserção, ondelipossomas pré-formados são incubados com o conjugado de direcionamen-to para se obter inserção do conjugado de direcionamento nas bicamadaslipossomais. Nesta abordagem, lipossomas são preparados através de umavariedade de técnicas, tal como aquelas detalhadas em Szoka, F., Jr. e ou-tros, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980), e exemplos específicos delipossomas preparados em apoio da presente invenção serão descritos a-baixo. Tipicamente, os lipossomas são vesículas multilamelares (MLVs), quepodem ser formadas através de técnicas de hidratação de película de lipídeosimples. Neste procedimento, uma mistura de lipídeos de formação de lipos-soma do tipo detalhado acima dissolvida em um solvente orgânico adequadoé evaporada em um recipiente para formar uma película fina, que é entãocoberta por um meio aquoso. A película de lipídeo hidrata para formar MLVs,tipicamente com tamanhos entre cerca de 0,1 a 10 mícrons.

Os lipossomas podem incluir um lipídeo de formação de vesículaderivatizado com um polímero hidrofílico para formar um revestimento desuperfície de cadeias de polímero hidrofílico sobre a superfície dos liposso-mas. Adição de um conjugado de lipídeo-polímero é opcional, uma vez queapós a etapa de inserção, descrita abaixo, os lipossomas vão incluir ligantede direcionamento de lipídeo-polímero. Cadeias de polímero adicionais adi-cionadas à mistura de lipídeo no momento da formação de lipossoma e naforma de um conjugado de lipídeo-polímero resulta em cadeias de polímerose estendendo de ambas superfície interna e externa das bicamadas de lipí-deo lipossomais. Adição de um conjugado de lipídeo-polímero no momento-da formação de lipossoma é tipicamente conseguida incluindo entre 1-20 porcento em mol do lipídeo derivatizado de polímero com os componentes deformação de lipossoma restantes, por exemplo, lipídeos de formação de ve-sícula. Métodos exemplares de preparação de lipídeos derivatizados de po-límero e de formação de lipossomas revestidos por polímero foram descritosnas Patentes U.S. Nos. 5.013.556, 5.631.018 e 5.395.619, que são aqui in-corporadas a título de referência. Será compreendido que o polímero hidrofí-lico pode ser estavelmente acoplado ao lipídeo, ou acoplado através de umaligação instável, que permite que os lipossomas revestidos soltem o revesti-mento de cadeias de polímero conforme eles circulam na corrente sangüí-nea ou em resposta a estímulos.Os lipossomas também incluem um agente terapêutico ou dediagnóstico, e agentes exemplares são providos abaixo. O agente selecio-nado é incorporado a lipossomas através de métodos padrão, incluindo (i)aprisionamento passivo de composto solúvel em água através da hidrataçãode uma película de lipídeo com uma solução aquosa do agente, (ii) aprisio-namento passivo de um composto lipofílico através da hidratação de umapelícula de lipídeo contendo o agente e (iii) carregamento de um fármacoionizável contra um gradiente de pH de lipossoma interno/externo. Outrosmétodos, tal como evaporação de fase reversa, são também adequados.

Após formação do lipossoma, os lipossomas podem ser dimen-sionados para se obter uma população de lipossomas tendo uma faixa detamanho substancialmente homogênea, tipicamente entre cerca de 0,01 a0,5 mícron, com mais preferência entre 0,03-0,40 mícron. Um método dedimensionamento eficaz para REVs e MLVs envolve extrusão de uma sus-pensão aquosa dos lipossomas através de uma série de membranas de po-licarbonato tendo um tamanho de poro uniforme selecionado na faixa de0,03 a 0,2 mícron, tipicamente 0,05, 0,08, 0,1 ou 0,2 mícron. O tamanho doporo da membrana corresponde mais ou menos aos tamanhos maiores delipossomas produzidos por extrusão através desta membrana, particular-mente onde a preparação for extrudada duas ou mais vezes através damesma menbrana. Métodos de homogeneização são também úteis para li-possomas de dimensionamento baixo para tamanhos de 100 nm ou menos(Martin, F.J., em SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS - MANUFAC-TURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, P. TYLE, Ed., Mareei Dekker,Nova York, pp. 267-316 (1990)).

Após formação dos lipossomas, um ligante alvo é incorporadopara se obter um lipossoma terapêutico, direcionado à célula. O ligante dedirecionamento é incorporado através de incubação dos lipossomas pré-formados com o conjugado de lipídeo-polímero-ligante, preparado conformedescrito acima. Os lipossomas pré-formados e os conjugados são incubadossob condições eficazes para associação com o conjugado e os lipossomas,que podem incluir interação do conjugado com bicamada de lipossoma ex-terna ou inserção do conjugado na bicamada de lipossoma. Mais especifi-camente, os dois componentes são incubados juntos sob condições que ob-têm associação do conjugado com os lipossomas de uma tal maneira que oligante de direcionamento é orientado exteriormente da superfície do lipos-soma, e então disponível para interação com seu receptor cognato. Serácompreendido que as condições eficazes para se obter tal associação ouinserção são determinadas com base em várias variáveis, incluindo a taxadesejada de inserção, onde uma temperatura de incubação maior pode obteruma taxa mais rápida de inserção, a temperatura para a qual o ligante podeser seguramente aquecido sem afetar sua atividade, e a um ponto menor atemperatura de transição de fase dos lipídeos e da composição de lipídeo.Será também compreendido que a inserção pode ser variada pela presençade solventes, tal como solventes anfifáticos, incluindo polietilenoglicol e eta-nol, ou detergentes.

O conjugado de direcionamento, na forma de um conjugado delipídeo-polímero-ligante, vai tipicamente formar uma solução de micelasquando o conjugado é misturado com um solvente aquoso. A solução mice-lar dos conjugados é misturada com uma suspensão de lipossomas pré-formados para incubação e associação do conjugado com os lipossomas ouinserção do conjugado nas bicamadas de lipídeo lipossomal. A incubação éeficaz para se obter associação ou inserção do conjugado de lipídeo-polímero-anticorpo com um folheto da bicamada externa dos lipossomas,para formar um imunolipossoma.

Após preparação, os imunolipossomas têm de preferência umtamanho de menos do que cerca de 150 nm, de preferência entre cerca de85-120 nm, e com mais preferência entre 90-110 nm, conforme medido, porexemplo, através de difração de luz dinâmica a 30° ou 90B

E. Imunolipossomas Exemplares

Em estudos realizados em apoio à invenção, imunolipossomastendo um anticorpo scFv antiHER2 foram preparados conforme descrito noExemplo 1. Resumindo, os lipossomas foram preparados a partir de lipídeosHSPC, colesterol e mPEG-DSPE. O agente terapêutico, doxorrubicina, foicarregado nos lipossomas através de carregamento remoto contra um gradi-ente de íon de amônio (Doxil®). Um conjugado de direcionamento de lipídeo-polímero-anticorpo, preparado conforme descrito no Exemplo 1 com um an-ticorpo anti-HER2 tendo a seqüência identificada aqui como SEQ ID NO: 2,foi inserido nos lipossomas pré-formados através de incubação de uma solu-ção micelar contendo uma pluralidade dos conjugados com os lipossomaspré-formados. Imunolipossomas tendo uma média de 2, 5, 7,5, 15, 30, 45,75, 100, 150 e 300 anticorpos por lipossomas, também referidos aqui comoformulações 2:1, 5:1, 7,5:1, 15:1, 30:1, 45:1, 75:1, 100:1, 150:1 e 300:1, fo-ram preparados através de ajuste das concentrações do reagente, conformedetalhado no Exemplo 1.

A absorção in vitro em células expressando HER2 (SK-BR03) eem células expressando não-HER2 (MCF-7) dos imunolipossomas carre-gando 7,5, 15, 30 e 45 anticorpos foi determinada, conforme descrito no E-xemplo 2. Os resultados são sumarizados na Tabela 1.

Tabela 1: Sumário de Ligação/Absorção Celular de Imunolipossomas Anti-HER2 em Células SK-BR-3 e MCF-7

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*NS = não-significante; abaixo do limite de detecção

Os dados na Tabela 1 mostram ligação/absorção de célula posi'tiva dos imunolipossomas anti-HER2 nas células SK-BR3 positivas paraHER-2, com níveis de doxorrubicina de 2,58 pg por célula e 1,75 pg por célu-la para as formulações 15:1 e 30:1, respectivamente. A ligação/absorção deimunolipossomas anti-HER2 nas células MCF-7, que têm níveis de expres-são de HER2 baixos, não foi significante. A ligação/absorção dos lipossomasnão carregando anticorpos anti-HER2 em ambas linhagens celulares tam-bém não foi significante.

Em um outro estudo, descrito no Exemplo 3, a citotoxidade deimunolipossomas anti-HER2 carregando 2, 5, 7,5 e 15 anticorpos por lipos-soma em células de carcinoma de mama humano SK-BR-3 foi avaliada. Li-possomas carregados com doxorrubicina livre e PEGuilada, doxorrubicinaserviram com controles positivo e negativo, respectivamente. As células SK-BR-3 foram expostas a imunolipossomas anti-HER2 por 10 minutos e entãoa viabilidade celular foi avaliada. Os resultados são mostrados na figura 2A.

A figura 2A mostra a viabilidade celular, expressa como umaporcentagem de células de controle não-tratado, como uma função de con-centração de doxorrubicina, em ug/mL, quando administrada como fármacolivre (triângulos), aprisionado em lipossomas (círculos) ou aprisionado emimunolipossomas contendo 2 (círculos), 5 (quadrados), 7,5 (diamantes) ou15 (triângulos) anticorpos por lipossoma. Diferenças na citotoxidade dascomposições de lipossoma se tornam aparentes em concentrações de do-xorrubicina de cerca de 0,5 ug/mL, onde imunolipossomas decorados com 5(quadrados) ou 7,5 (diamantes) anticorpos por lipossoma proveram citotoxi-dade in vitro mais ou menos a mesma que o fármaco livre (triângulos). Noentanto, imunolipossomas com 15 anticorpos por lipossoma (triângulos) e-ram mais citotoxicos do que a mesma concentração do fármaco livre, comuma viabilidade celular de 50% em cerca de 4 ug/mL de doxorrubicina. Imu-nolipossomas com 2 anticorpos por lipossoma eram menos citotoxicos doque a doxorrubicina lipossomal PEGuilada não-direcionada.

O efeito de morte celular de imunolipossomas direcionados aHer2 está relacionado com a densidade de anticorpos por lipossoma. Valo-res IC50 para formulações de imunolipossoma anti-Her2 com razões descFv/lipossoma de 5, 7,5 e 15 após uma exposição de 10 minutos eram a-proximadamente 30, 16 e 3,9 ug/mL, respectivamente. Citotoxidade paraformulações de imunolipossoma anti-Her2 tendo a razão de scFv/lipossomade 2 tinha pouca ou nenhuma citotoxidade após uma exposição ao fármacode 10 minutos. O IC5o para doxorrubicina livre era aproximadamente 9,5ug/mL. Pouca ou nenhuma toxidade foi notada para doxorrubicina aprisiona-da em lipossomas revestidos com PEG. Imunolipossomas anti-Her2 comuma razão de scFv/lipossoma de 15 tinham maior citotoxidade do que doxor-rubicina livre, indicando a vantagem de uma formulação direcionada comligação rápida seguido por internalização.

Deste modo, em uma modalidade, uma formulação de imunoli-possoma que inclui uma quantidade de conjugado de lipídeo-polímero-anticorpo que prove mais do que 2 anticorpos por lipossoma e, em particular,que prove em média mais do que 2 anticorpos por lipossoma após circula-ção dos imunolipossomas no sangue in vivo por mais do que 24, 48 ou 96horas é compreendida, como será discutido mais abaixo.

Um método alternativo de medição de citotoxidade in vitro foirealizado, onde as formulações de lipossoma e imunolipossoma foram incu-badas com as células por quatro horas. As células foram então lavadas eincubadas a 37° C por três dias. O número de célula no final dos três dias foiestimado através de tingimento com violeta cristal. Os resultados são mos-trados na figura 2B. A figura 2B mostra a viabilidade celular, expressa comouma porcentagem de células de controle não-tratado, como uma função deconcentração de doxorrubicina, em ug/mL. Quatro horas de exposição a vá-rias concentrações de doxorrubicina a partir dos vários imunolipossomasilustra a citotoxidade in vitro diferente das formulações. Imunolipossomascarregando 7,5 e 45 anticorpos por lipossoma eram ligeiramente menos cito-tóxicos ou tão citotóxicos quanto a doxorrubicina livre (diamantes). Imunoli-possomas com 15 e 30 anticorpos eram mais citotóxicos do que doxorrubici-na livre. A figura 2B também mostra que os imunolipossomas com 15 e 30anticorpos eram mais potentes em citotoxidade celular do que doxorrubicinalivre.Em um outro estudo, descrito no Exemplo 4, a estabilidade doslipossomas direcionados a Her2 no sangue foi avaliada. Imunolipossomascarregando um anticorpo scFv marcado com 125l foram preparados em ra-zões de anticorpo scFv/imunolipossoma de 7,5, 15, 30, 45 e 90. Os imunoli-possomas foram incubados em plasma humano, e alíquotas removidas emtempos selecionados para análise. Alíquotas em duplicata de material lipos-somal em plasma humano foram removidas da incubação e aplicadas emcolunas Sepharose CL-4B para cada ponto de tempo.

As figuras 3A-3H mostram os perfis de eluição de conjugados delipídeo-PEG-scFv marcados com 125l de imunolipossomas tendo 15 anticor-pos scFv por lipossoma de alíquotas removidas durante incubação dos imu-nolipossomas em plasma humano, as alíquotas removidas em tempos de 0hora (figura 3A), 1 hora (figura 3B), 4 horas (figura 3C), 8 horas (figura 3D),24 horas (figura 3E), 48 horas (figura 3F), 72 horas (figura 3G) e 96 horas(figura 3E). A radioatividade na fração lipossomal foi recuperada dentro deuma faixa muito estreita de frações dentro de 2-3 frações e tipicamente den-tro de 6-9 mL de eluente total coletado. Frações de plasma, devido à faixade tamanho ampla de proteínas de plasma, eluíram da coluna de SepharoseCL-4B em pelo menos 12 frações. Em todos os pontos de tempo, as fraçõeslipossomal e de plasma eram distinguíveis uma da outra. A fim de calcular aporcentagem de conjugado de lipídeo-PEG-scFv marcado com 125l dissocia-do (e associado correspondente), as radioatividades das frações lipossomale de plasma foram combinadas para prover uma quantidade total de marca-dor 125l. Esse total foi avaliado como uma razão de radioatividade total naamostra aplicada à coluna Sepharose CL-4B.

A figura 4A mostra a dissociação de anticorpos scFv marcadoscom 125l de formulações de imunolipossoma tendo razões de anticorposcFv/lipossoma de 7,5:1 (diamantes), 15:1 (quadrados), 30:1 (círculos), 45:1(triângulos) e 90:1 (*) como uma função de tempo de incubação, em horas,em plasma humano. A figura 4B mostra em gráfico os dados como porcen-tagem de marcador 125l restante nos imunolipossomas para as mesmas for-mulações. A taxa e grau de dissociação do anticorpo (com relação à quanti-dade de doxorrubicina) a partir das formulações são essencialmente iguaissem importar a densidade inicial de anticorpos por lipossoma.

Em um outro estudo, uma formulação de imunolipossoma tendo15 anticorpos por lipossoma foi preparada e a dissociação de radiomarcadora partir da formulação durante incubação in vitro em plasma humano foi me-dida. Os resultados são mostrados nas figuras 5A-5B.

A figura 5A mostra a porcentagem de anticorpo radiomarcadodissociado da formulação de imunolipossoma para os dois estudos (diaman-tes, quadrados) como uma função de tempo de incubação, em horas. Osresultados entre os dois estudos estão consistentes e indicam que 24 horasde incubação resultam em cerca de 30% de dissociação do anticorpo a partirdo imunolipossoma. Após 96 horas de incubação em plasma humano, 50%dos anticorpos não estão mais associados com os imunolipossomas.

A figura 5B mostra em gráfico os dados de um dos estudos u-sando a formulação de imunolipossoma 15:1 como a porcentagem de anti-corpo radiomarcado restante nos imunolipossomas (diamantes) e como aporcentagem de anticorpo radiomarcado dissociado dos imunolipossomas(quadrados), como uma função de tempo de incubação em plasma humano,onde dissociação induzida por plasma é descrita como radioatividade recu-perada na fração de plasma. A figura 5B mostra a diminuição de scFv ra-diomarcado na fração lipossomaLcom o aumento correspondente na fraçãode plasma expresso como a porcentagem de material de scFv total. Umadiminuição inicial na quantidade de anticorpo scFv liberado foi observadaatingindo um estado estacionário em aproximadamente 48 horas. No pontode tempo zero, 85% da radioatividade foram recuperados na fração liposso-mal com o restante na fração de plasma. A diminuição na radioatividade as-sociada lipossomal foi mais pronunciada dentro de 24 horas com >30% doanticorpo scFv dissociados e recuperados da fração de plasma. Como o an-ticorpo scFv inicial diminui na fração lipossomal, a quantidade de radioativi-dade na fração de plasma mostra um aumento correspondente (com diminu-ição correspondente na fração lipossoma) durante o tempo de incubação de96 horas para aproximadamente 50% de dissociação.Deste modo, em uma modalidade, uma composição de imunoli-possoma é provida, a qual tem 24 horas após administração in vivo, commais preferência 48 horas após administração e com mais preferência ainda96 horas após administração, mais do que dois anticorpos por lipossoma,em média, e menos do que 150 anticorpos por lipossoma, em média. Emuma outra modalidade, a composição de imunolipossoma tem uma quanti-dade inicial de anticorpos por lipossoma em média, e entre 30-60% dos anti-corpos dissociam da dose de imunolipossoma administrada in vivo, paraprover uma composição, 48 ou 96 horas após administração in vivo que temmenos do que cerca de 50 anticorpos por imunolipossoma em média, commais preferência menos do que cerca de 30 anticorpos por imunolipossomaem média e com mais preferência ainda menos do que cerca de 15 anticor-pos por imunolipossoma em média. Em uma modalidade preferida, os imu-nolipossomas em média incluem entre 2 e 15, inclusive, anticorpos por imu-nolipossoma. Será compreendido que o número de anticorpos por lipossomain vivo pode ser aproximado usando um ensaio in vitro onde o imunolipos-soma é incubado em plasma humano a 37° C por um tempo selecionado, talcomo 24, 48 ou 96 horas e análise usando uma técnica analítica adequadaquanto à dissociação do anticorpo (ou do construto de lipídeo-polímero-anticorpo) a partir do lipossoma.

Um estudo in vivo foi realizado para avaliar a estabilidade doanticorpo nos imunolipossomas seguindo uma administração intravenosaúnica a ratos. Conforme descrito no Exemplo 5, os ratos foram tratados in-travenosamente ou com imunolipossomas marcados com 125l (formulação15:1) ou com conjugado de anticorpo scFv-PEG-DSPE marcado com 125l.Amostras de sangue foram coletadas em 5 minutos e em 1, 3, 8, 24 e 48horas pós-dosagem. Amostras de sangue integral e plasma foram contadasquanto a 125l e expressas em porcentagem (%) de dose injetada. As amos-tras de plasma do grupo tratado com os imunolipossomas foram tambémensaiadas quanto à concentração de doxorrubicina. Em adição, uma porçãoda amostra de plasma em cada ponto de tempo foi passada por uma colunade exclusão de tamanho para separar conjugado livre de conjugado ligado alipossoma para determinar se radioatividade estava associada com fraçãode lipossoma.

A figura 6A mostra a porcentagem de conjugado de anticorposcFv radiomarcado -PEG-DSPE recuperado na fração lipossomal das amos-tras de plasma. Em todos os pontos de tempo, >85% da radioatividade fo-ram encontrados apenas na fração lipossomal. Isto indica que qualquer anti-corpo livre ou conjugado livre (isto é, não-associado a lipossoma) é rapida-mente removido da circulação.

A figura 6B mostra a concentração de anticorpo scFv radiomar-cado livre na fração lipossomal do plasma após separação na coluna Sepha-rose CL-4B. A quantidade de anticorpo scFv livre nesta fração é desprezíveluma vez que apenas quantidades pequenas (100 ng/mL) foram recupera-das. Em toda a duração do estudo, a recuperação de anticorpo scFv livre foimenos do que 15% do total recuperado.

A concentração de anticorpo scFv radiomarcado não-associadocom a fração lipossomal, isto é, "anticorpo livre" ou "conjugado livre" apósadministração da formulação de imunolipossoma 15:1 a ratos é mostrada nafigura 6C. No primeiro ponto de tempo (5 min), a concentração de anticorposcFv radiomarcado inicial tinha diminuído em 20% da dose injetada espera-da. A taxa inicial de eliminação de anticorpo scFv radiomarcado foi rápidadurante as primeiras 10 horas ou então após dosagem. Durante as primeiras48 horas pós-dosagem, a concentração de anticorpo scFv radiomarcado di-minuiu em 90% da concentração de anticorpo scFv radiomarcado no primei-ro ponto de tempo. Em comparação 40% da doxorrubicina permanecem emcirculação (figura 7A).

Também conforme descrito no Exemplo 5, os parâmetros farma-cocinéticos dos imunolipossomas e da doxorrubicina foram determinados. ATabela 2 sumariza os parâmetros farmacocinéticos e as figuras 7A-7B mos-tram as concentrações como uma função de tempo.Tabela 2: Parâmetros Farmacocinéticos de Formulação de Imunolipossoma15:1 e de Conjugado de Anticorpo scFv-PEG-DSPE

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aCalculado usando o método trapezoidal para o último ponto de tempo (96horas pós-dose)

bVolume de distribuição em estado estacionário.cLiberação de doxorrubicina do plasma.

A figura 7A mostra a porcentagem de anticorpo scFv marcadocom 125l restante no plasma (diamantes) e no sangue (quadrados fechados);a porcentagem de doxorrubicina no plasma (triângulos), como" uma funçãode tempo, em horas, após administração de uma formulação de imunolipos-soma 15:1 a ratos. Também mostrada é a porcentagem de um anticorposcFv marcado com 125l no plasma (círculos abertos) e no sangue (quadradosabertos) como uma função de tempo, em horas, após administração comoum conjugado livre. A radioatividade no sangue e plasma atingiu o pico 5minutos pós-dosagem ambos em animais dosados com imunolipossomas eem animais dosados com conjugado de anticorpo scFv-PEG-DSPE marcadocom 125l. Em animais tratados com imunolipossomas, o nível de 125l no san-gue e plasma era 78,4±4,1 e 77,2±3,7% em 5 minutos e 4,4 ± 0,9 e 4,1 ±0,8% em 96 horas, respectivamente. O teor de doxorrubicina em plasma era127 ± 19,7% ou 69,4 ± 10,8 ug/mL em 5 minutos e 11,8 ± 3,9% ou 6,4 ± 2,2ug/mL em 96 horas. O perfil de 125l eluído a partir da coluna de exclusão detamanho mostrou um pico único, que correspondia à fração de lipossoma doefluente da coluna. Com base na porcentagem de dose injetada de 125l nosangue e plasma, a meia-vida de eliminação dos imunolipossomas era 25,6h e 25,0 h, respectivamente. Com base na concentração de doxorrubicina noplasma, a meia-vida de eliminação dos imunolipossomas era 31,6 h.

Em animais tratados com conjugado de anticorpo scFv-125l-PEG-DSPE, o nível de 125l no sangue e plasma era 41,8 ± 6,0 e 40,8 + 3,1% em 5minutos e 2,9 ± 0,6 e 2,7 ± 1,1% em 8h, respectivamente. Nenhuma radioa-tividade foi detectada nos pontos de tempo de 24 ou 48 horas. A meia-vidade eliminação de conjugado no sangue e plasma era 2,1 e 2,0 h, respecti-vamente.

A figura 7B mostra a concentração de doxorrubicina no plasma,em ug/mL, como uma função de tempo, em horas, após administração deuma formulação de imunolipossoma 15:1 a ratos. Conforme visto, a doxorru-bicina permanece no sangue 96 horas após dosagem.

A figura 8 é um gráfico da razão de anticorpo scFv marcado com125l para doxorrubicina no sangue, em ng/ug, como uma função de tempo,em horas, após administração de uma formulação de imunolipossoma 15:1 aratos. A razão de componentes diminuiu durante as primeiras 24 horas pós-dosagem, e então atingiu um platô em cerca de 50 horas pós-dosagem. Arazão de diminuição mostra que o anticorpo scFv é perdido do lipossoma emuma taxa mais rápida do que ou liberação do lipossoma a partir da circula-ção ou perda de doxorrubicina a partir do lipossoma.

Sumarizando, os estudos in vivo mostraram que os imunolipos-somas permaneciam na circulação por mais de 96 horas seguindo a admi-nistração intravenosa única em ratos. O conjugado de anticorpo-PEG-DSPEestava intimamente associado com os lipossomas conforme demonstradoatravés de cromatografia de exclusão de tamanho. A meia-vida de 125l emsangue/plasma seguindo administração de imunolipossomas marcados com125l era aproximadamente 25 horas, e a meia-vida da doxorrubicina no plas-ma era 31,6 horas. Quando administrado em forma livre, o conjugado deanticorpo-PEG-DSPE permaneceu na circulação por aproximadamente 8horas seguindo uma administração intravenosa única. A meia-vida de circu-lação de conjugado livre era aproximadamente 2 horas. Os dados in vivoexaminando a estabilidade dos imunolipossomas no soro mostraram que emtodos os pontos de tempo >85% da radioatividade permaneciam na fraçãolipossomal indicando que anticorpo dissociado ou anticorpo livre-conjugadoé rapidamente removido da fração de soro. O imunolipossoma tinha umameia-vida medida em ambos soro e sangue de aproximadamente 25 horasenquanto a meia-vida do anticorpo livre ou anticorpo-conjugado era aproxi-madamente 2 horas em ambos sangue e plasma (Tabela 2).

O Exemplo 6 descreve um outro estudo in vivo conduzido paraavaliar a farmacocinética de formulações de imunolipossoma tendo 15, 75,150 e 300 anticorpos scFv por lipossoma. Resumindo, foram tratados comum bolo intravenoso único de uma das formulações de imunolipossoma.Camundongos de controle foram administrados com doxorrubicina liposso-mal PEGuilada. Plasma foi coletado em aproximadamente 5 minutos e 4, 8,24, 48, 72 e 96 horas pós-dosagem e foi ensaiado quanto à doxorrubicinatotal. Os resultados são mostrados na figura 9.

Perfis de concentração versus tempo de doxorrubicina similaresforam observados nos animais tratados com a formulação de controle (dia-mantes) e com as formulações de imunolipossoma 15:1 (quadrados fecha-dos) e 75:1 (triângulos). Valores consideravelmente menores para Cmax,AUC e meia-vida foram observados, acompanhados por uma liberação maisrápida e um volume de distribuição maior, para animais tratados com os i-munolipossomas tendo 150 (símbolos X) e 300 (símbolos *) anticorpos porlipossoma.

Os parâmetros farmacocinéticos determinados a partir dos da-dos na figura 9 são mostrados na Tabela 3.Tabela 3

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AUCúltimo = a área sob a curva calculada para o último ponto de tempo medido

As concentrações de doxorrubicina no plasma atingiram o picono primeiro ponto de tempo de amostragem, isto é, aproximadamente 5 mi-nutos após injeção. Os valores Cmax em camundongos administrados com aformulação de controle lipossomal PEGuilada, formulação de imunoliposso-ma 15:1 e a formulação de imunolipossoma de 75:1 eram 39,0 ± 0,27, 39,9 ±5,49 e 43,3 ± 1,30 ug/mL, respectivamente. Os níveis de fármaco corres-pondentes diminuíram para 10,1 ± 1,82, 9,05 ± 0,69 e 13,6 ±5,0 ug/mL, res-pectivamente, em 24 h, e 0,32 ±0,19, 0,56 ± 0,41 e 0,28 ± 0,12 ug/mL, res-pectivamente, em 96 horas pós-administração. Perfis farmacocinéticos muitosimilares foram observados nesses três grupos de tratamento. Os valores deCmax em camundongos administrados com formulação de lipossoma 150:1 ea formulação de lipossoma 300:1 eram notavelmente menores do que aque-les tratados com as formulações de imunolipossoma 75:1 ou menores, istoé, 20,6 ± 3,88 e 10,5 ± 6,13 ug/mL, respectivamente. Os níveis de fármacocorrespondentes diminuíram para 4,56 ± 0,52 e 0,58 ± 0,19 ug/mL, respecti-vamente em 24 horas. No final de 96 horas, metade dos animais nos gruposde tratamento de formulação de imunolipossoma de 150:1 e 300:1 não ti-nham nenhum nível de fármaco detectável em plasma.

Os valores de AUCúitima em camundongos administrados comformulação de controle lipossomal PEGuilada, formulação de imunoliposso-ma 15:1 e a formulação de imunolipossoma 75:1 eram 751,5, 763,1 e 898,3ug/mL, respectivamente. Os valores de AUCúitima em camundongos adminis-trados com formulações de imunolipossoma de 150:1 e 300:1 eram 287,7 e81,5 ug h/mL, respectivamente.

A meia-vida do plasma em camundongos administrados comformulação de controle lipossoma PEGuilada, formulação de imunoliposso-ma de 15:1 e a formulação de imunolipossoma de 75:1 foi 14,8, 17,0 e 12,8horas, respectivamente. A meia-vida em camundongos administrados com aformulação de imunolipossoma de 150:1 e 300:1 foi 3,30 e 3,91 horas, res-pectivamente.

A liberação de doxorrubicina do plasma em camundongos admi-nistrados com formulação de controle lipossomal PEGuilada, formulação deimunolipossoma de 15:1 e a formulação de imunolipossoma de 75:1 era0,070, 0,068 e 0,059 mL/h, respectivamente. A liberação de doxorrubicina doplasma em camundongos administrados com formulações de imunoliposso-ma de 150:1 e 300:1 foi 0,183 e 0,645 mL/h, respectivamente.

O volume de distribuição em camundongos administrados comformulação de controle lipossomal, formulação lipossomal de 15:1 e a formu-lação lipossoma de 75:1 foi 1,49, 1,50 e 12,3 mL, respectivamente. O volu-me de distribuição em camundongos administrados com formulação imunoli-possoma de 150:1 e 300:1 foi 3,57 e 12,0 mL, respectivamente.

As constatações do Exemplo 6 mostram que perfis farmacociné-ticos similares foram observados em camundongos após uma administraçãode bolo única de imunolipossomas contendo uma razão de scFv/lipossomade 0, 15 ou 75. Valores menores para Cmax, AUC e meia-vida foram obser-vados, acompanhado por uma liberação mais rápida e um volume maior dedistribuição, para animais tratados com imunolipossomas contendo uma ra-zão de scFv/lipossoma de 150 ou 300, onde os parâmetros eram inversa-mente proporcionais à densidade do ligante. Deste modo, em uma modali-dade, uma formulação de imunolipossoma é provida a qual tem uma AUC,Cmax e/ou meia-vida que é (i) maior do que ou (ii) não maior do que 30%, depreferência não mais do que 25%, com mais preferência ainda não mais doque 20%, menor do que a AUC, Cmax e/ou meia-vida para uma formulaçãolipossomal similar sem o anticorpo de direcionamento. Por exemplo, a AUCda formulação de lipossoma PEGuilada de controle sem o anticorpo era 751ugh/mL. As AUCs das formulações de imunolipossoma de 15:1 e 75:1 foram763 ug-h/mL e 898 ugh/mL, respectivamente. A formulação de imunolipos-soma de 15:1 tinha um valor de AUC que era 1,6% menor (isto é, não maisdo que 25% menor) do que a AUC da formulação lipossomal corresponden-te, idêntica em composição exceto pela ausência dos anticorpos. A formula-ção de imunolipossoma de 75:1 tinha um valor de AUC que era maior do quea AUC da formulação lipossomal correspondente. Em contraste, os valoresde AUC para as formulações de imunolipossoma de 150:1 e 300:1 eramconsideravelmente mais do que 30% menores do que a AUC da formulaçãolipossomal. Similarmente, os parâmetros farmâcocinéticos de Cmax e meia-vida para as formulações de imunolipossoma de 75:1 e 15:1 eram mais doque 25% menores do que o parâmetro correspondente da formulação lipos-somal direcionada de não-anticorpo, lipossomal.

Deste modo, os dados na figura 9 quando considerados com osdados na figura 2A e na figura 5B indicam que uma formulação de imunoli-possoma, e em uma modalidade um lipossoma carregando um anticorpotendo um peso molecular entre cerca de 20.000-50.000 Dáltons, com maispreferência 25.000-35.000 Dáltons, de preferência tem_antes da administra-ção in vivo entre cerca de 4-30 (inclusive dos pontos finais) anticorpos, emmédia, por lipossoma, e com mais preferência entre cerca de 5-25 (inclusivedos pontos finais) anticorpos por lipossoma, e com mais preferência aindaentre cerca de 6-20 (inclusive dos pontos finais) anticorpos por lipossoma.Outras faixas preferidas para o número de anticorpos por lipossoma antesda administração in vivo estão entre cerca de 5-30, entre cerca de 6-25 eentre cerca de 4-15 e entre cerca de 7-15.

Em uma outra modalidade, a formulação de imunolipossomatem, em média, mais do que cerca de 2 anticorpos por lipossoma e menosdo que cerca de 16 anticorpos cerca de 96 horas após administração in vivo,com mais preferência tendo mais do que cerca de 2 anticorpos por liposso-ma e menos do que cerca de 12 anticorpos cerca de 96 horas após adminis-tração in vivo, e com mais preferência ainda tendo mais do que cerca de 2anticorpos por lipossoma e menos do que cerca de 10 anticorpos cerca de96 horas após administração in vivo, e com mais preferência ainda tendomais do que cerca de 2 anticorpos por lipossoma e menos do que cerca de 8anticorpos cerca de 96 horas após administração in vivo. Alternativamente, acomposição de imunolipossoma tem mais do que dois anticorpos por lipos-soma, em média, após cerca de 48 horas após circulação in vivo no sanguee menos do que cerca de 20 anticorpos por lipossoma, em média, cerca de48 horas após administração intravenosa in vivo.

Em uma outra modalidade, a invenção prove uma formulação deimunolipossoma tendo uma AUC que está dentro de 30%, de preferência25%, com mais preferência dentro de 20%, da AUC de formulação de lipos-soma similar sem os anticorpos de direcionamento. Em uma outra modalida-de, a invenção prove uma formulação de imunolipossoma tendo uma AUCnormalizada pela dose que está dentro de 30%, de preferência 25%, commais preferência dentro de 20%, da AUC normalizada pela dose de umaformulação lipossoma similar sem os anticorpos de direcionamento.

Um outro estudo foi conduzido para avaliar a eficácia antitumorda composição de imunolipossoma. Conforme descrito no Exemplo 7, ca-mundongos carregando xenoenxertos de carcinoma de mama humano BT-474, que é conhecido mostrar receptor HER2 sobre a superfície das células,foram tratados com formulações de imunolipossoma não tendo quaisqueranticorpos de direcionamento (controle) ou tendo 7,5, 15, 30 ou 45 anticor-pos por lipossoma. Os resultados são mostrados nas figuras 10A-10B.

A figura 10A mostra o volume de tumor relativo, em porcenta-gem, nos camundongos após dosagem com solução salina (círculos aber-tos), doxorrubicina contendo lipossomas PEGuilados (quadrados abertos) ouimunolipossomas contendo 7,5 (diamantes), 15 (triângulos), 30 (quadradosfechados) ou 45 (círculos fechados) anticorpos scFv por lipossoma. Tumoresno grupo de controle de solução salina (círculos abertos) quadruplicaram detamanho em uma média de 23,9 ± 7,5 dias. Os animais tratados com as for-mulações de imunolipossoma tendo razões de anticorpo:lipossoma de 45:1,30:1, 15:1 e 7,5:1 tinham tempos de quadruplicação de volume de tumor demais do que 35,1 ± 2,9, 32,9 ± 4,4, 36,1 ± 1,9 e 38,0 ± 0 dia, respectivamen-te. Os tumores nos animais tratados com formulação lipossomal de controle(Doxil®, quadrados abertos) tinham tumores que quadruplicaram de tamanhoem mais de 29,2 ± 6,0 dias. No final do estudo no dia 38, um animal em ca-da um dos grupos de tratamento dosado com imunolipossomas tendo razõesde anticorpo:lipossoma de 45:1, 15:1 e 7,5:1 ou não tinham nenhum tumorpresente ou tamanho de nódulo < 10 mm3.

Houve um retardo de crescimento de tumor aparente em todosos animais tratados com doxorrubicina lipossomal ou imunolipossomalquando comparado com controles de solução salina. Os animais tratadoscom formulações de imunolipossoma direcionando a HER2 tinham retardosligeiramente maiores em crescimento de tumor do que os animais tratadoscom doxorrubicina lipossomal não-direcionada (Doxil®).

A figura 10B mostra a mudança percentual no peso do corpo dosanimais de teste durante o período de tratamento.

Resumindo, o estudo mostra que neste modelo de xenoenxertode câncer de mama humano BT-474, tratamento com doxorrubicina aprisio-nada em lipossoma ou com doxorrubicina aprisionada em imunolipossomaresultou em um aumento em atividade antitumor quando comparado comaquela de animais de controle. Não havia nenhuma diferença em eficáciaantitumor através da variação das razões de anticorpo:lipossoma na formu-lação de imunolipossoma de 7,5-45.

A formulação de imunolipossoma de 15:1 foi selecionada paraavaliação em um estudo de faixa de dose in vivo em camundongos carre-gando tumor. Conforme descrito no Exemplo 8, os camundongos foram tra-tados com várias dosagens (2, 3, 4 mg/kg) de doxorrubicina aprisionada emlipossomas PEGuilados ou aprisionada em imunolipossomas. Todos os ca-mundongos receberam uma dose intravenosa semanal da formulação apro-priada por três semanas. O tamanho do tumor foi medido duas vezes porsemana para calcular o volume do tumor, e os resultados são mostrados nafigura 11.

A figura 11 é um gráfico de volume de tumor relativo, tomadocomo uma porcentagem de volume de tumor inicial, como uma função detempo, em dias, em camundongos carregando um xenoenxerto de tumor demama e tratados com solução salina (círculos abertos), lipossomas PEGui-lados contendo doxorrubicina em dosagens de 2 mg/kg (quadrados abertos)e 3 mg/kg (diamantes abertos) ou com uma formulação de imunolipossomade 15:1 em dosagens de 2 mg/kg (quadrados fechados), 3 mg/kg (diamantesfechados) ou 4 mg/kg (triângulos fechados). Tumores em animais de contro-le não-tratados (círculos abertos) tinham um tempo de triplicação de volumede tumor (TVTT) em média de 11,1 ±1,9 dias. Os animais tratados com do-xorrubicina lipossomal em 2, 3 e 4mg/kg (quadrados abertos, diamantes,triângulos, respectivamente) tinham um tempo de triplicação de volume detumor (TVTT) de 16,7 ± 4,8 dias, 26,0 ± 3,9 e >34,2 ± 9,0 dias, respectiva-mente. Os animais tratados com a formulação de imunolipossoma de 15:1com TVTTs de mais do que 34,2 ± 6,6, 29,5 ± 8,6 e 49,0 para níveis de dosede 2, 3 e 4 mg/kg, respectivamente.

O retardo de crescimento de tumor foi observado para todos osgrupos de tratamento de fármaco quando comparado com grupo de controlenão-tratado. Havia uma relação de dose resposta aparente para grupos detratamento lipossomal PEGuilado mas não para os grupos de tratamento deimunolipossoma. No entanto, tratamento com imunolipossoma a 15:1 em 4mg/kg resultou em retardo maior em crescimento de tumor do que todos osoutros grupos de tratamento mas uma relação não era evidente para os gru-pos de tratamento de imunolipossoma. Tratamento com imunolipossomas de15:1 a 2 e 4 mg/kg proveu TVTTs médios que eram maiores do que o TVTTmédio para os grupos de camundongos tratados com lipossomal PEGuiladoem 4 mg/kg. Ainda, em cada dose, o TVTT médio para imunolipossomas de15:1 era maior do que para o grupo de camundongos tratado com lipossomalPEGuilado.

Em um outro estudo, descrito no Exemplo 9, uma formulação deimunolipossoma contendo doxorrubicina aprisionada e carregando 15 anti-corpos scFv, em média, por imunolipossoma, foi administrada em três dosa-gens a animais através de uma injeção intravenosa única. A farmacocinéticadas imunolipossomas, da doxorrubicina e do anticorpo foi determinada e osresultados são mostrados nas figuras 12-14.

A figura 12 mostra a concentração de doxorrubicina no plasma,em ng/mL, como uma função de tempo, em horas, após administração intra-venosa a macacos da formulação de imunolipossoma 15:1 (círculos) e lipos-somas PEGuilados (quadrados) em uma dosagem de doxorrubicina de 10mg/mL O tempo de vida de circulação no sangue dos imunolipossomas eraessencialmente equivalente aos lipossomas PEGuilados sem o anticorposcFv.

As figuras 13A-13B mostram a concentração de doxorrubicinano plasma (figura 13A) e a concentração de anticorpo no plasma (figura 13B)como uma função do tempo após administração intravenosa dos imunolipos-somas 15:1 nas dosagens de doxorrubicina de 1 mg/kg (círculos), 5 mg/kg(quadrados) e 10 mg/kg (triângulos). A concentração de doxorrubicina total(livre e aprisionada) no plasma diminui como uma função de tempo pós-administração (figura 13A). A concentração de anticorpo total (livre e associ-ado a imunolipossoma) exibe uma diminuição inicial maior nas quatro horasapós administração seguido por um declínio menor em seguida.

A razão da concentração de anticorpo para doxorrubicina foi de-terminada a partir dos dados apresentados nas figuras 13A-13B e é mostra-da nas figuras 14A-14B. Na figura 14A, a razão das concentrações de con-centração de anticorpo scFv/doxorrubicina em plasma, em ng/ug, é mostra-da. Na figura 14B, a razão é normalizada para a razão de anticor-po/doxorrubicina inicial e é expressa como uma porcentagem. Em ambasfiguras, os imunolipossomas administrados em dosagens de doxorrubicinade 1 mg/kg, 5 mg/kg e 10 mg/kg são identificados por diamantes, quadradose triângulos, respectivamente. Ambas representações dos dados ilustram aperda de anticorpo nas primeiras quatro horas após administração, com a-proximadamente 40% do anticorpo dissociados do lipossoma e liberados dacorrente sangüínea dentro de 8 horas após dosagem. Será compreendidoque os dados ilustram perda de anticorpo, que pode ser uma perda do anti-corpo do imunolipossoma ou perda do construto de lipídeo-polímero-anticorpo do imunolipossoma.

Deste modo, uma formulação de imunolipossoma é compreendi-da, onde os imunolipossomas perdem 20-50% dos anticorpos associadosdurante circulação in vivo por um tempo de cerca de 24 horas, ou 48 horas,ainda que os imunolipossomas retenham a ligação ao receptor HER2 sufici-ente para citotoxidade. Conforme acima ilustrado, mais do que cerca de doisanticorpos são requeridos para citotoxidade in vitro conforme comparadocom doxorrubicina lipossomal não-direcionada.

Deste modo, um método de preparação de uma formulação deimunolipossoma para administração in vitro é provido, onde um construto deporção hidrofóbica-polímero hidrofólico-anticorpo é incluído na formulaçãoem uma primeira quantidade suficiente para prover um primeiro número se-lecionado de anticorpos por imunolipossoma. Os imunolipossomas são trazi-dos em contato com sangue, in vitro ou in vivo, e o número de anticorpos porimunolipossoma em um ou mais pontos de tempo quando do contato doslipossomas com sangue é determinado. Por exemplo, uma alíquota de san-gue do recipiente in vitro é tomada ou a amostra de sangue de um animal éretirada. O sangue é analisado quanto à quantidade de anticorpo usandoqualquer número de técnicas analíticas adequadas, tal como radioimunoen-saio, cromatografia, eletroforese de gel, etc. Se o número de anticorpos emmais de um ponto de tempo for determinado, um gráfico pode ser construí-do, o qual mostra a perda de anticorpos como uma função de tempo emsangue. Usando esta informação, o número de anticorpos em um ponto detempo selecionado após contato com o sangue é determinado e uma segun-da quantidade de construto de porção hidrofóbica-polímero hidrofílico-anticorpo suficiente para prover um segundo número, maior, de anticorpospor lipossoma a fim de prover pelo menos dois anticorpos por lipossoma a-pós contato com sangue tem tal ponto de tempo é selecionado. Os imunoli-possomas são então preparados usando a segunda quantidade de constru-to. Por exemplo, se for desejado ter 5 anticorpos por imunolipossoma 96 ho-ras após administração, e os dados de incubação de sangue mostrarem quecerca de 50% dos anticorpos dissociam do imunolipossoma ou estão de ou-tro modo indisponíveis para interação com o receptor alvo, então os imunoli-possomas devem inicialmente, antes da dosagem in vivo, conter pelo menos10 anticorpos. Em geral, a segunda quantidade de conjugado, isto é, a quan-tidade de conjugado selecionada para prover uma inicial, antes do númerode dosagem de anticorpos, é selecionada para dar menos do que 50 anti-corpos por lipossoma, com mais preferência 30 ou menos anticorpos porlipossoma.

Em uma outra modalidade, e com base em parte nos dados far-macocinéticos acima, o método inclui provisão de lipossomas tendo umaprimeira quantidade de conjugado que prove menos do que 150 anticorpospor lipossoma, com mais preferência 100 ou menos anticorpos por liposso-ma, e com mais preferência ainda 75 ou menos anticorpos por lipossoma.III. Métodos de Uso

Os lipossomas incluem um agente terapêutico ou de diagnósticoem forma aprisionada. Aprisionada pretende incluir encapsulação de um a-gente no núcleo aquoso e espaços aquosos de lipossomas bem como apri-sionamento de um agente na(s) bicamada(s) de lipídeo dos lipossomas. A-gentes compreendidos para uso na composição da invenção são amplamen-te variados, e exemplos de agentes adequados para aplicações terapêuticae de diagnóstico são dados abaixo.

A dosagem administrada pode variar dependendo de fatores co-nhecidos, tal como as características farmacodinamicas do agente particulare de seu modo e via de administração; idade, saúde e peso do recipiente;natureza e extensão de sintomas, tipo de tratamento concomitante, freqüên-cia de tratamento e o efeito desejado. A dosagem pode ser uma dosagem deuma vez ou periódica dada em um intervalo de horas, dias ou semanas se-lecionado.

Qualquer via de administração é adequada, com modos intrave-nosos e outros parenterais sendo preferidos.

Em um outro aspecto, um regime de tratamento combinado écompreendido, onde a composição de imunolipossoma descrita acima é ad-ministrada em combinação com um segundo agente. O segundo agente po-de ser qualquer agente terapêutico, incluindo outros compostos de fármacobem como agentes biológicos, tal como peptídeos, anticorpos e similar. Osegundo agente pode ser administrado simultaneamente com ou seqüenci-almente à administração dos imunolipossomas, através da mesma via deadministração ou uma diferente. Combinações particularmente preferidasincluem, mas não estão limitadas a, ciclofosfamida, taxanos, vinorrelbina,Herceptin® e Avastin®. Lipossomas direcionados a Her2 provêem uma re-gressão de tumor mais completa com relação a uma dose equivalente domesmo fármaco administrado em um lipossoma não-direcionado, tal comoDOXIL®. Deste modo, um regime de tratamento é compreendido, o qualcompreende uma dose de um primeiro agente citotóxico aprisionado em i-munolipossomas direcionados a Her2 e um segundo agente terapêutico, on-de um ou ambos agentes são administrados em uma dose menos do que adose requerida para o agente administrado sozinho, para obter um resultadoclínico aperfeiçoado, tal como uma regressão de tumor maior do que espe-rado. Será também compreendido que os imunolipossomas direcionados aHer2 podem ser administrados em combinação com dois ou mais agentes.Agentes adequados para um paciente particular podem ser identificados porum profissional médico versado. Um regime de tratamento compreendido deuma composição de imunolipossoma direcionada a Her2 contendo um agen-te quimioterapêutico aprisionado nos lipossomas, e dois ou mais agentesadicionais, é compreendido, onde pelo menos um, e de preferência mais deum dos agentes, é administrado em dose menos do que a dose recomenda-da do agente quando dado sozinho, para se obter um resultado clínico aper-feiçoado.

Os métodos de tratamento descritos aqui são pretendidos, emuma modalidade, para administração a uma população de paciente expres-sando mais do que 105 receptores Her2 por célula, e de preferência mais doque 106 receptores Her2 por célula. A densidade de receptores celularespode ser determinada usando imunoistoquímica e estojos podem ser com-prados para tal determinação, tal como o HercepTest®. Indivíduos expres-sando mais do que 105, de preferência mais do que 106, receptores HER2por célula, respondem particularmente bem à composição de imunoliposso-ma direcionada a Her2 descrita aqui, porque o anticorpo descrito aqui é in-ternalizado pelas células, aumentando a aplicação de fármaco intracelular-mente. Um método onde uma biópsia ou amostra biológica apropriada é ob-tida de um paciente, a amostra é ensaiada para determinar o número de re-ceptores HER2 por célula de tumor, e se o número de receptores for maiordo que 106 receptores Her2 por célula, o paciente é tratado com a composi-ção de imunolipossoma descrita aqui. Em uma modalidade preferida, o paci-ente tem um score IHC de receptores 3+ (2.000.000) por célula.

IV. Exemplos

Os exemplos que seguem ilustram mais a invenção descrita aquie não pretendem de modo algum limitar o escopo da invenção.Materiais: Fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) foi comprada da li-poid K.G. (Ludwigshafen, Alemanha). Colesterol foi recebido da Croda, Inc.(Nova York, NY) e N-(carbonil-metoxipolietileno glicol 2000)-1,2-diestearoil-sn-glÍcero-3-fosfatidiletanolamina, sal de sódio (mPEG-DSPE) foi recebidoda Syngenta, Ltd. (Liestal, Suíça). Cloridrato de doxorrubicina foi recebido daMeiji Seika Kaisha Ltd. (Tóquio, Japão). Conjugado radiomarcado (scFv-PEG-DSPE) foi recebido da Hermes Bioscience (São Fracisco, CA) em uma _atividade específica de 0,0983 mCi/mL. Plasma humano foi recebido da Bio-reclamation (East Meadow, NY). Componente de coluna - Sepharose CL-4Bfoi recebido da Amersham Pharmacia, Uppsala, Suécia). Tampão de eluição- solução de cloreto de sódio (NaCI a 0,9%) era da Baxter (Deerfield, IL) econtinha azida de sódio a 0,4% (Sigma, St. Louis, Mo).

Exemplo 1

Preparação de Imunolipossomas Direcionados a HER2

Lipossomas contendo doxorrubicina aprisionada foram obtidosda Alza Corporation Mountain View, CA (Doxil®). Os lipossomas eram com-postos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC, 56,4% em mol), coles-terol (38,3% em mol) e metoxipolietilenoglicol-diestearoil-fosfatidileta-nolamina (mPEG-DSPE, 5,3% em mol, mPEG MW 2000 Da). A concentra-ção de doxorrubicina na preparação final era 100 ug/mM de lipídeo. O tam-pão interno usado para a preparação era de 10% de sacarose e o tampãoexterno era de 10% de sacarose e histidina a 10 mM. O diâmetro médio delipossomas na formulação final era 93 nm.

O anticorpo scFv do receptor anti-HER2 (SEQ ID NO:2) foi pri-meiro conjugado a um fosfolipídeo PEGuilado derivatizado com maleimida(mPEG-DSPE) para formar um conjugado de lipídeo-PEG-scFv, de acordocom procedimentos bem conhecidos na técnica e rapidamente discutidosacima e ilustrados nas figuras 1A-1B.

O construto de lipídeo-PEG-anticorpo anti-HER2 foi então asso-ciado com bicamadas lipossomais dos lipossomas carregados com doxorru-bicina através de incubação dos lipossomas com uma suspensão micelar doconstruto de lipídeo-polímero-anticorpo. Imunolipossomas carregando umamédia de 2, 5, 7,5, 15, 30, 45, 75, 100, 150 e 300 anticorpos foram prepara-dos através do ajuste da quantidade de anticorpo adicionado por mol de fos-folipídeo, conforme sumarizado na Tabela A.

Tabela A

<table>table see original document page 48</column></row><table>

O número médio teórico de anticorpos por imunolipossoma foiconfirmado através da determinação das concentrações de proteína e fosfo-lipídeo e cálcuto do número de anticorpos, com base em uma média de80.000 fosfolipídeos por 100 nm de lipossoma e um peso molecular de anti-corpo de 28,714 kDa. O número de anticorpos em um imunolipossoma podeser determinado pós-formação dos imunolipossomas através da determina-ção do peso molecular do anticorpo, do tamanho do lipossoma e da compo-sição do lipossoma. A título de exemplo, para a formulação de 15:1 de imu-nolipossoma, 15 moles de anticorpo scFv/80.000 moles de fosfolipídeo x28,714 kDa = 5,4 g/mol. Supondo que 90% do conjugado inserido ou asso-ciado com lipossomas durante a incubação: 5,4/90% = 6 ug de anticorposcFv adicionados por umol de fosfolipídeo. Então, o número de anticorpospor imunolipossoma relatado aqui reflete uma distribuição média de anticor-pos na população de lipossomas, com o número relatado o número médiode anticorpos por lipossoma na população.

Após associação dos conjugados de lipídeo-polímero-anticorpocom os lipossomas, a concentração de doxorrubicina era 86-92 Mm de lipí-deo e o diâmetro médio de imunolipossomas após era 93-117 nm.

Exemplo 2

Absorção In vitro de Imunolipossomas

Células SK-BR-3 e MCF7 foram compradas da American TypeCulture Collection (ATCC, Manassas, VA). Células SK-BR-3 foram mantidasem cultura in vitro em meio modificado da McCoy 5A suplementado com10% de soro bovino fetal. Células MCF7 foram mantidas em meio da Eaglemodificado com da Dulbecco com 10% de soro bovino fetal.

Células SK-BR-3 ou MCF-7 a 1,5 x 105 células/0,5 mL de meiode crescimento por cavidade foram adicionadas a uma placa de 24 cavida-des. Após incubação da noite para o dia para ligação e aclimatação, as célu-las foram tratadas com imunolipossomas (7,5:1, 15:1, 30:1 e 45:1 anticorposanti-HER2:lipossoma) ou lipossomas a 0,015 mg/mL em 0,5 mL de meio decrescimento/cavidade em duplicatas. As placas de 24 cavidades foram entãopostas em uma plataforma giratória dentro da incubadora com rotação a 40-60 rpm a 37° C, C02 a 5% e 100% de umidade por 4 horas. Após incubação,meio celular foi aspirado e as células foram lavadas quatro vezes com Solu-ção Salina Equilibrada de Hank's (HBSS). Após isso, as células foram lisa-das através da adição de 0,1 ml_ de Triton X-100 a 1% a cada cavidade. Asplacas foram giradas para misturar e postas em uma plataforma giratória por15 minutos em temperatura ambiente. Durante esta etapa, as células sepa-radas do fundo da placa e os núcleos celulares formaram grumos visíveis.Isopropanol ácido (1,0 ml_) foi adicionado às cavidades contendo a soluçãode Triton X-100 e misturado girando ou pipetando para cima e para baixo atéque grumos visíveis desaparecessem.

O teor de doxorrubicina nos lisatos de célula foi medido atravésde um espectrofluorômetro usando um comprimento de onda de excitaçãode 470 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm. Os ajustes doespectrofluorômetro eram como segue: largura da fenda 2 nm, tempo deintegração 1 segundo, tensão do fotomultiplicador 950 V e modo de aquisi-ção de comprimento de onda simples. Fluorescência do lisato de célula debase foi subtraída e a quantidade de doxorrubicina nos lisatos de célula foideterminada a partir dos padrões concomitantemente medidos (10, 25, 50,100, 250, 500, 1000 e 2500 ng de doxorrubicina por amostra) ajustados auma curva padrão usando regressão polinomial quadrática. Absorção porcélula de doxorrubicina foi determinada através de interpolação a partir dacurva padrão. Os dados são expressos em pg de doxorrubicina por célulassemeadas e são mostrados na Tabela 1. Valores abaixo do nível de detec-ção foram chamados não-significantes (NS).

Exemplo 3

Citotoxidade In vitro de Lipossomas Direcionados a HER2

Linhagem de célula de carcinoma de mama humano SK-BR-3 foicomprada da American Tissue Type Collection (ATCC, Manassas, VA). Ascélulas foram mantidas em cultura in vitro em meio modificado da McCoy 5Asuplementado com 10% de soro bovino fetal e foram mantidas em uma in-cubadora umidificada a 37° C.

As células foram expostas por 10 minutos à doxorrubicina (1,8mg/mL) em forma livre, doxorrubicina aprisionada em lipossomas PEGuila-dos (2,06 mg/mL) ou uma formulação de imunolipossoma tendo 2 anticorpospor lipossoma (1,86 mg/mL), 5 anticorpos por lipossoma (2,12 mg/mL), 7,5anticorpos por lipossoma (1,99 mg/mL) ou 15 anticorpos por lipossoma (2mg/mL).

Células de câncer de mama SK-BR-3 de fase log foram coletadasusando Versene (1:5000), ressuspensas em meio de crescimento em umaconcentração de 5 x 104 células/mL. Uma alíquota de 0,1 ml_ (5 x 103 células)foi adicionada a cavidades apropriadas de uma placa de 96 cavidades. Apósincubação da noite para o dia para ligação, meio foi removido e substituídocom os materiais de teste. Uma alíquota de 0,1 ml_ de doxorrubicina, varian-tes de formulação S-DOX ou STEALTH 49, diluída com meio de crescimentopara 0,0137, 0,0412, 0,1235, 0,37, 1,11, 3,33, 10 e 30 ug/kg, foi adicionada acada cavidade em triplicata. Meio sem material de teste foi adicionado às ca-vidades de controle. As células foram expostas ao artigo de teste a 37° C por10 minutos. No final da incubação, o meio contendo fármaco foi aspirado e ascélulas foram lavadas com 0,2 mL de meio de crescimento. Após lavagem, ascélulas foram incubadas em 0,2 mL de meio fresco sob condições de cresci-mento por mais 72 horas. No final da incubação, a quantidade de células viá-veis foi determinada usando o Promega CelITiter 96® Aqueous One SolutionCell Proliferation Assay (um método colorimétrico baseado em tetrazólio paradeterminação do número de células viáveis em proliferação, Madison, Wl).Resumidamente, meios das cavidades foram aspirados e substituídos com0,1 mLde meios frescos e 0,02 mL de Promega (Lote No. 186817). As placasforam então incubadas por 3-4 horas após o que absorbância foi registrada a490 nm com uma leitora de microplaca. A viabilidade celular foi calculada co-mo % de controle não-tratado usando a fórmula:

% de Viabilidade = (A-A0)/(A100-Ao) x 100%

onde A é a absorbância medida, A0 é a absorbância das vazias e A10o é aabsorbância das cavidades com células não-tratadas. Viabilidade de célulapercentual foi posta em gráfico como uma função de concentração de fár-maco e IC5o (concentração resultando em 50% de inibição de crescimentocelular) foi determinado através de interpolação.

A viabilidade celular como porcentagem de controle para as for-mulações de imunolipossoma é sumarizada na figura 2A.Exemplo 4

Dissociação in vitro de Porção de Direcionamento a Her2 de Lipossomas emPlasma

Lipossomas PEGuilados contendo doxorrubicina, preparadosconforme descrito no Exemplo 1, foram combinados com conjugado de lipí-deo-PEG-scFv marcado com 125l, preparado conforme descrito no Exemplo1, para gerar um imunolipossoma tendo 7,5, 15, 30, 45 e 90 anticorpos scFvpor lipossoma. Os lipossomas e os conjugados foram incubados a 60° C por1 hora para permitir inserção do conjugado na bicamada externa dos lipos-somas. No final da incubação a solução foi esfriada e subseqüentementearmazenada a 2-8° C. Cada formulação de lipossoma foi dializada contra10% de sacarose/histidina a 10 mM e medida quanto ao teor de doxorrubici-na. Os lipossomas em cada formulação foram caracterizados quanto ao ta-manho, encapsulação de doxorrubicina, porcentagem de inserção de conju-gado de lipídeo-PEG-anticorpo e concentração de anticorpo scFv, que sãosumarizados na Tabela B. A atividade específica final da formulação conten-do 15 anticorpos scFv era 28,4 uCi/mL.

Tabela B

<table>table see original document page 52</column></row><table>

A dissociação do marcador 125l dos lipossomas, indicativo dadissociação do anticorpo, do conjugado, ou ambos, foi medida como segue.Plasma humano foi misturado com imunolipossoma direcionado a HER2marcado com 125l e incubado a 37° C durante 96 horas. Em cada ponto detempo (0, 1, 4, 8, 72, 96 horas) alíquotas de plasma foram removidas e pos-tas em uma coluna Sepharose CL-4B de 28 x 1,2 cm preparada com um vo-lume de leito de 32 ml_. A coluna Sepharose CL-4B foi pré-condicionada com1 ml_ de lipossomas de placebo a 100 mM e 1 ml_ de plasma de rato. As co-lunas foram eluídas com solução salina a 0,9% contendo azida de sódio a0,4%. Cada fração (1 ml_) foi contada usando um contador gamma para radioatividade de 125l.

A atividade total foi também determinada para cada alíquota erecuperação a partir da coluna Sepharose CL-4B foi de -90% ou mais paracada amostra aplicada. Em todos os pontos de tempo, não houve menos doque 90% de recuperação de radioatividade a partir da coluna com relação àfração total removida da alíquota aplicada. Os resultados são mostrados naTabela abaixo, e perfis de eluição para formulação de imunolipossoma de15:1 são mostrados nas figuras 3A-3H. A figura 4A mostra a dissociação demarcador 125l a partir das formulações de imunolipossoma como uma funçãode tempo. A figura 4B mostra a porcentagem de marcador 125l restante noslipossomas como uma função de tempo. A figura 5A mostra a taxa de disso-ciação de marcador 125l a partir da formulação de imunolipossoma tendo 15anticorpos por lipossoma em dois estudos diferentes. A figura 5B mostra aliberação induzida por plasma de marcador 125l a partir de formulação deimunolipossoma tendo 15 anticorpos por lipossoma.

Liberação por Plasma de I F5 a partir de Imunolipossomas em Razões deF5/Lipossoma Diferentes

<table>table see original document page 53</column></row><table>Exemplo 5

Dissociação In vivo de Porção de Direcionamento a Her2 a partir de Lipos-somas em Plasma

Anticorpo scFv marcado com 125l foi preparado usando contasde iodo usando técnicas conhecidas. Resumidamente, o anticorpo scFv(SEQ ID NO:2), Na[125l] e contas de iodo foram combinados e a reação foideixada continuar por 20 minutos em temperatura ambiente. A reação foiextinta com tiossulfato. A fim de remover o N[125l] em excesso, a soluçãoreagida foi separada usando uma coluna de dessalinização DG-10. O mate-rial no primeiro pico contendo a quantidade maior de radioatividade foi agru-pado e avaliado quanto à concentração de proteína, que foi determinadausando A280. O anticorpo scFv iodado foi finalmente passado por um filtrode 0,2 um para esterilidade e armazenado a 4o C. O material foi usado den-tro de 1 mês.

Imunolipossomas tendo 15 anticorpos por lipossoma foram pre-parados conforme acima descrito através da incubação de lipossomas pré-formados com o conjugado de anticorpo scFv marcado com 125l-PEG-lipídeoa 60° C por 1 hora. No final da incubação, a solução foi esfriada e subse-qüentemente armazenada a 2-8° C. Os imunolipossomas foram então diali-zados contra 10% de sacarose/histidina a 10 mM e medidos quanto ao teorde doxorrubicina. O teor de doxorrubicina final era 2,1 mg/mL. Uma amostrada formulação foi caracterizada quanto ao tamanho = 96 nm, pH 6,5, % dedoxorrubicina = 99%, porcentagem de inserção de anticorpo = 89% e con-centração de anticorpo = 49 ug/mL. A atividade específica final dos imunoli-possomas era 0,018 mCi/mL.

Anticorpo scFv 125l livre-PEG-lipídeo foi diluído em 10% de saca-rose/histidina a 10 mM para uma concentração final de 49 ug/mL. A fim deprover conjugado radiomarcado suficiente, conjugado de anticorpo scFv-PEG-lipídeo frio foi adicionado à solução resultando em uma atividade espe-cífica final de 0,5 uCi/mL.

Nove ratos machos CD-1 (Charles River Laboratories) de apro-ximadamente 11 semanas de vida e 358-376 g de peso foram usados nesteestudo. Os animais foram aclimatados para as condições de laboratório porpelo menos 1 semana.

No Dia 0, todos os animais foram aquecidos em um caixa quentede roedor antes da dosagem. Os animais foram manualmente retidos e ad-ministrados com um bolo intravenoso único ou de imunolipossomas marca-dos com 125l ou conjugado de F5-125l livre através da veia do rabo lateral. Adose administrada por rato era aproximadamente 2 mg/kg de doxorrubicinae/ou 49 mg/kg do conjugado de anticorpo-PEG-lipídeo.

Pesos do corpo e observações clínicas foram registrados no diade dosagem (Dia 0). Observações ao lado da gaiola foram feitas diariamentepor 4 dias. Amostras de sangue foram coletadas através do sino retroorbitalsob anestesia inalada (isoflurano/02) em tubos de microfuga heparinizados.Seis ratos foram administrados com imunolipossomas e amostras de sangue(-1,2 mL) foram coletadas (3 animais por ponto de tempo) aproximadamente5 minutos e 1, 3, 8, 24, 48, 72 e 96 horas pós-dose. Três ratos foram admi-nistrados com conjugado de anticorpo-PEG-lipídeo e amostras de sangue(-0,6 mL) foram coletadas aproximadamente 5 min e 1, 3, 8, 24 e 48 horaspós-dose.

Uma alíquota de 100 ul de amostra de sangue integral de cadaanimal foi contada quanto a 125l usando um contador gama. A amostra desangue restante foi centrifugada a 2500 RPM (-750 xg) por 20 minuto as 4-8o C para se obter plasma. Uma alíquota a amostra de plasma (50 ou 100uL) foi retida e contada quanto a 125l. Para ratos dosados com imunolipos-somas, um conjunto separado de amostras de plasma foi armazenado a -40°C e mais tarde ensaiado quanto à concentração de doxorrubicina usando umespectrofluorômetro. O resto do plasma foi eluído através de uma coluna deexclusão de tamanho para separar o conjugado de anticorpo-PEG-DSPElivre do ligado a lipossoma. A coluna continha contas de Sepharose-CL-4Bcom um volume de leito de aproximadamente 22 mL. A solução tampão dacoluna (solução salina a 0,9% e NaN3 a 0,02%) foi alimentada com gravida-de em uma taxa de fluxo de aproximadamente 0,5 mL/min.

Para todas as amostras, um pico principal foi observado próximoàs frações 10-15 correspondendo ao anticorpo scFv associado com a fraçãode lipossoma. Radioatividade recuperada de frações além da fração lipos-somal foi considerada ser "anticorpo scFv livre". Isto é, conjugado de anti-corpo scFv-PEG-DSPE micelar ou monomérico que pode ser associado comou incorporado a proteínas do plasma. Aproximadamente quarenta fraçõescom 1 ml_ cada foram coletadas e contadas quanto a 125l.

A Tabela C mostra a concentração recuperada de anticorpo as-sociado com a fração lipossomal e da fração dissociada livre. Os resultadossão mostrados nas figuras 6A-6C.

Tabela C

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Parâmetros Farmacocinéticos

Amostras de sangue integral e plasma foram contadas quanto à

radioatividade (CPM, contagens por minuto) de 125l em um Packard Cobra5010 Gamma Counter (No. Serial 401611). A CPM foi convertida em porcen-tagem (%) de dose injetada de acordo com a fórmula que segue,% inj. = [(CPM/mL observada)/((CPM/mL Inj. x Vol. lnj.)/BW x 0,065/x 100onde Inj.: Injetado; BW: peso do corpo; e 0,065 é usado para estimar o vo-lume de sangue total de um animal (isto é, 6,5% BW). Para calcular a por-centagem de dose injetada em plasma, o volume de plasma foi estimado ser60% (0,6) daquele do volume de sangue.

A meia-vida de eliminação (Ti/2p) de 125l em sangue e plasma foicalculada como o que segue,Ti/2p=ln(2)/Kel

onde ln(2) = 0,693 e Kel (constante de eliminação) = (lnc(C1)-ln(C2)/DT1-T2D,

onde C1 e C2 são iguais à porcentagem média de dose injetada nos temposT1 e T2. Para ratos dosados com imunolipossomas, T1 e T2 eram 8 h e 96h, respectivamente, enquanto que para ratos dosados com o conjugado descFv-PEG-DSP, T1 e T2 eram 5 min e 8 h, respectivamente.

Ainda, a concentração de doxorrubicina no plasma foi medidausando um espectrofluorômetro. Parâmetros farmacocinéticos, por exemplo,área sob a curva (AUC), volume de distribuição de estado fixo (Vss), Libera-ção (CLt) e meia-vida foram calculados usando o WINNONLIN Noncom-partmental Analysis Program Version 4.1.

Os dados originais são mostrados na Tabela D. Os parâmetrosfarmacocinéticos são mostrados na Tabela 2 e figuras 7A-7B.

Tabela D: Porcentagem de Dose Injetada de 125l em Sangue e Plasma. Por-centagem de Dose Injetada de Doxorrubicina (DOX) e Concentração de Do-xorrubicina em Plasma

<table>table see original document page 57</column></row><table>Tabela D (Continuação)

<table>table see original document page 58</column></row><table>

na = amostra não tomada

número em [ ] : dados normalizados para % de dose injetada no ponto detempo de 5 minutos

Exemplo 6

Administração In vivo de Imunolipossomas a Camundonqos

Lipossomas tendo um revestimento de PEG e imunolipossomastendo 15, 75, 150 e 300 anticorpos scFv por lipossoma foram preparadosconforme descrito no Exemplo 1. As formulações são sumarizadas na Tabela E.

Tabela E

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Cento e quinze (21 por grupo de dose x 5 grupos de dose maisextra = 115) camundongos ICR fêmeas foram obtidos da Charles River.Os animais foram alojados em gaiolas de fundo plástico convencionais sobum programa de iluminação 12 h/12 h luz/escuro com alimento e água adlibitum. Os animais foram aclimatados para as condições de laboratório porpelo menos 1 semana antes do início do estudo.

O dia da dosagem foi considerado Dia 0. Todos os camundon-gos usados foram administrados com uma injeção de bolo única ou de con-trole ou uma das formulações de teste de imunolipossoma descritas acimaatravés de uma veia lateral do rabo. Volumes de dose foram calculados paracada animal individual e variaram de 0,24 a 0,33 ml_. Os camundongos fo-ram aquecidos antes da injeção em uma caixa aquecida de roedor. Os ca-mundongos administrados com a formulação de lipossoma de controle e asformulações de imunolipossoma 15:1 e 300:1 foram dosados em aproxima-damente 2,0 mg/kg. Os camundongos administrados com as formulações deimunolipossoma de 75:1 e 150:1 foram dosados em aproximadamente 2,40e 1,65 mg/kg, respectivamente.

Amostras de sangue (~1 ml_ cada) foram coletadas de três ca-mundongos por ponto de tempo (5 min, 4, 8, 24, 48, 72 e 96 h) por formula-ção. Amostras de sangue foram coletadas através da veia portal hepáticasob anestesia inalada (oxigênio/lsoflurado) em seringas revestidas com he-parina e imediatamente transferidas para um tubo eppendorph de polipropi-leno. Amostras de sangue foram então armazenadas em gelo úmido atécentrifugação em aproximadamente 2500 CPM (-750 xg) por 10 minutos a3-8° C. Amostras de plasma foram coletadas e armazenadas a -40° C. Asamostras de plasma e as soluções de dose foram ensaiadas quanto à doxor-rubicina total através de análise LC/MS.

As concentrações de doxorrubicina de plasma médias forampostas em gráfico contra tempo (figura 9) e usadas para calcular os parâme-tros farmacocinéticos. Devido ao fato das concentrações de plasma seremtodas de animais individuais, os parâmetros farmacocinéticos foram calcula-dos usando as concentrações de HCI de doxorrubicina no plasma médias eentão quaisquer desvios padrão estavam presentes para os parâmetros far-macocinéticos. Parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando WIN-NONLIN versão 4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Parâmetros far-macocinéticos são mostrados na Tabela 3.

Exemplo 7

Eficácia In vivo

Lipossomas tendo um revestimento de PEG e imunolipossomastendo 15, 75, 150 e 330 anticorpos scFv por lipossoma foram preparadosconforme descrito no Exemplo 1.

Camundongos homozigotos NCR.nu/nu fêmeas (Charler RiverLaboratories, Hollister, CA), aproximadamente 4-5 semanas de vida, foramusados para o obtido. O peso do corpo médio era aproximadamente 25 g.Os animais foram mantidos em gaiolas isoladas em um ciclo de luz-e-escurode 12 horas. Alimento e água estavam disponíveis ad libitum.

As células de mama humanas BT-474 foram mantidas em cultu-ra in vitro (meio RPMI 1640 suplementado com 10 ug/mL de insulina bovina,300 mg/mL de L-glutamina e 10% de soro bovino fetal) a 37° C em uma in-cubadora de C02 a 5% umidificada. As células de câncer de mama de faselog foram tripsinizadas e coletadas de frascos de cultura de célula para daruma concentração final de 16 x 107 células/mL Uma injeção subcutânea foifeita (16 x 106 células em 0,1 mL) na parte de trás da área do pescoço decada camundongo. Um pélete de estradiol (0,72 mg de 17(3 estradiol, Inno-vative Research of America, Sarasota, FL) foi também implantado subcuta-neamente no flanco de cada camundongo dois dias antes da inoculação dacélula de tumor para aumentar a tumorigenicidade. O tratamento começou23 dias após inoculação da célula de tumor quando o volume de tumor mé-dio atingiu aproximadamente 80 mm3.

Cinco animais foram designados para cada grupo de tratamento.Formulações de imunolipossoma contendo várias razões de anticor-po:imunolipossoma foram diluídas, conforme apropriado, e administradasintravenosamente (IV) em um volume de aproximadamente 0,2 mL nas veiaslaterais do rabo de camundongos retidos em gaiolas de contenção de latãoaquecidas (40° C). Imediatamente antes de cada injeção, os camundongosforam mantidos aquecidos em uma caixa de acrílico bem ventilada com umbulbo de luz de aquecimento. Tratamento com os lipossomas de controle(Doxil®) foi também incluído e serviu como um controle positivo. Os animaistratados com solução salina serviram como controles negativos. A dose dedoxorrubicina usada para todos os grupos de tratamento era aproximada-mente 4 mg/kg por semana (qw) e o tratamento continuou por duas sema-nas.

Os pesos do corpo dos animais foram medidos duas vezes porsemana para avaliar a toxidade do fármaco. Os animais foram removidos doestudo e providos com eutanásia se uma perda de peso de >15% aconte-cesse ou quaisquer condições anormais se desenvolvessem. Observaçõesclínicas incluíam comportamento, atividade dentro da gaiola, desidratação esinais de dor ou sofrimento. Todas as observações clínicas foram registra-das na pasta de estudo. No final do período de estudo, todos os animais fo-ram providos com eutanásia através de inalação de dióxido de carbono a100% de acordo com o AVMA Panei on Euthanasia (1993).

Os tumores foram medidos em três dimensões duas vezes porsemana por até 38 dias. O volume do tumor foi calculado de acordo com afórmula:

V = 1/2xD1xD2x D3;

onde Di-3 são diâmetros perpendiculares medidos em milímetros (mm).

O tempo de quadruplicação de volume de tumor (TVQT), defini-do como o tempo requerido para um tumor crescer para quatro vezes (4x)seu volume inicial (no momento de tratamento), foi usado como ponto finalde estudo. O TVQT foi determinado para cada grupo de tratamento e ex-presso em dias como a média ± erro padrão (SE).

Análise estatística de retardo em crescimento de tumor entre osvários grupos de tratamento foi realizada através do teste t de Student.

Os resultados são mostrados nas figuras 10A-10B e sumariza-dos na Tabela F.Tabela F

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Tabela F (Continuação) <table>table see original document page 62</column></row><table>

aUm animal no Grupo 1 foi excluído do estudo devido à regres-são de tumor.

bSe qualquer tumor individual em um grupo de tratamento nãotivesse atingido seu volume de 4x no final do período de estudo de 38 dias, odia 38 seria usado no cálculo, e um sinal '>' era anotado para este grupo.

cTamanho do tumor <10 mm3 como para o dia 38.Exemplo 8

Estudo de Variação de Dose In vivo

Camundongos nus/nus atímicos fêmeas (Harlan Laboratories,IN), aproximadamente 4-5 semanas de vida, foram usados para o estudo. Opeso do corpo médio era aproximadamente 20 g. Os animais foram manti-dos em gaiolas isoladoras em um ciclo de luz-e-escuro de 12 horas. Alimen-to e água estavam disponíveis ad libitum.

As células de mama humanas BT-474 foram mantidas em cultu-ra in vitro (meio RPMI 1640 suplementado com 10 ug/mL de insulina bovina,300 mg/mL de L-glutamina e 10% de soro bovino fetal) a 37° C em incuba-dora de C02 a 5% umidificada. Células de câncer de mama de fase log fo-ram tripsinizadas e coletadas de frascos de cultura de célula para dar umaconcentração final de 15 x 107 células/mL. Uma injeção subcutânea foi feita(30 x 106 células em 0,2 ml_) na parte de trás da área do pescoço de cadacamundongo. Um pélete de estradiol (0,72 mg de 17(3 estradiol, InnovativeResearch of America, Sarasota, FL) foi também implantado subcutaneamen-te no flanco de cada camundongo dois dias antes da inoculação da célula detumor para aumentar a tumorigenicidade. O tratamento começou 17 diasapós inoculação da célula de tumor quando o volume de tumor médio paratodos os grupos de tratamento variou de 106 a 126 mm3.

Os grupos de tratamento são sumarizados na Tabela G. Seteanimais foram designados para cada grupo de tratamento. Formulações delipossoma e imunolipossoma foram administradas intravenosamente (IV) àsveias do rabo laterais de camundongos retidos em uma gaiola de contençãode latão (40° C) no volume de aproximadamente 0,2 ml_. Imediatamente an-tes de cada injeção, os camundongos foram mantidos aquecidos em umacaixa acrílica bem ventilada com um bulbo de luz de aquecimento. A dose dedoxorrubicina usada para a formulação de lipossoma e as formulações deimunolipossoma era 2, 3 ou 4 mg/kg. Todos os tratamentos continuaramuma vez por semana por três semanas.Tabela G

<table>table see original document page 64</column></row><table>

aTempo de triplicação do volume do tumor

Os tumores foram medidos em três dimensões duas vezes por semana poraté 49 dias. O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula:

V = 1/2 x Di x D2 x D3;onde Di.3são diâmetros perpendiculares medidos em milímetros (mm).

O tempo de triplicação do tumor (TVTT), definido como o temporequerido para que um tumor cresça para três vezes (3x) o seu volume inici-al (no momento de tratamento), foi usado como um ponto final de estudo. Otempo de triplicação de volume do tumor foi determinado para cada grupo detratamento e expresso em dias como a média ± erro padrão (SE). Os pesosdo corpo do animal foram medidos duas vezes por semana para avaliar atoxidade do fármaco.

Análise estatística de retardo em crescimento de tumor entre osvários grupos de tratamento foi realizada através do teste t de Student. Osresultados são mostrados na figura 11.

Exemplo 9

Farmacocinética e Estudo de Toxidade In vivo

Trinta e oito macacos cinomólogos inocentes (Macaca fascicula-rís), 3 a 8 anos de idade e pesando 2,5 a 4,5 kg, foram aleatorizados paraseis grupos de tratamento, com 3 machos e 3 fêmeas por grupo, sumarizadona Tabela H.

Tabela H

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Imunolipossomas tendo 15 anticorpos anti-HER2 de cadeia sim-ples, em média, foram preparados conforme acima descrito. No Dia 1, osanimais receberam uma injeção intravenosa lenta única (-1 mL/min) emuma veia periférica, e monitorados por 28 dias pós-dose. Observações clíni-cas e monitoramento do consumo de alimento foram realizados pelo menosuma vez por dia. Os pesos do corpo foram medidos duas vezes por dia.Sangue foi coletado para hematologia e análise química de soro pré-dosenos Dias 1 (1 hora pós-dose), 4, 14 e 28. Sangue foi coletado para análisetoxicocinética em pré-dose e 5 min, 1, 4, 8, 24, 48, 72 e 96 horas seguindo otérmino da dose. As amostras de soro foram analisadas quanto à doxorrubi-cina no plasma e concentração de anticorpo. Os resultados são mostradosnas figuras 12-14.

Exemplo 10

Estudo de Toxidade de Dose Repetida In vivo

Setenta macacos cinomólogos inocentes (Macaca fascicularis),3 a 8 anos de idade e pesando 2,5 a 4,5 kg, foram aleatorizados para setegrupos de tratamento, com 5 machos e 5 fêmeas por grupo, sumarizado na

Tabela 1.

Tabela I

<table>table see original document page 66</column></row><table>

Imunolipossomas tendo 15 anticorpos de cadeia simples comafinidade de ligação para o receptor de célula HER2, em média, foram pre-parados conforme acima descrito. Os animais receberam a dose indicadaintravenosamente uma vez a cada quatro semanas por um total de seis tra-lamentos. Sangue foi coletado para hematologia e análise química do soropré-dose e em pontos de tempo selecionados. As amostras de sangue foramanalisadas quanto à doxorrubicina no plasma e os resultados são mostradosnas figuras 15A-15C.

Embora vários aspectos exemplares e modalidades tenham sidodiscutidos acima, aqueles versados na técnica vão reconhecer certas modifi-cações, permutações, adições e subcombinações deles. É então pretendidoque as reivindicações apensas que seguem e reivindicações introduzidas nofuturo sejam interpretadas para incluir todas tais modificações, permutações,adições e subcombinações uma vez que estão dentro de seu verdadeiro es-pírito e escopo.Listagem de Seqüência

<110> Alza Corporation

Hjortsvang, KristenGuof LukeWong, Francis M.P.Najafi, AzarHuang, AnthonyAbra, RobertKelley, Laura

<120> COMPOSIÇÃO OE IMUNOUPOSSOMA PARA DIRECIONAMENTO A UM RECEPTOR CELULAR HER2<130> 553258195WO0

<no> Ainda não determinado<141> Aqui apresentado

<1S0> US 60/674,029<151> 2005-04-22

<150> US 60/736,669<151> 2005-11-14

<160> 2

<i7o> versão da Patente 3.3

<210> 1

<2U> 738

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr

20 2S 30

Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr cys Thr Cys Cys Thr

50 55 60

Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Cys Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr

85 90 95

Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cya Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys

130 135 140

Thr Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Cys

145 150 155 160

Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala

195 200 205Thr Cys Thr Cys

210

Cys Ala Ala Gly

225

Cys Thr Gly Cys

Thr Gly Ala Gly

260

Gly Gly Cys Cys

275

Gly Cys Gly Ala

290

Ala Cys Gly Cys

305

Cys Thr Ala Cys

Ala Cys Cys Cys

340

Cys Cys Thr Cys

355

Thr Thr Cys Ala

370

Thr Cys Thr Gly

385

Cys Gly Cys Ala

Gly Cys Ala Gly

420

Thr Cys Thr Gly

435

Ala Gly Ala Gly

450

Cys Thr Gly Cys

4 65

Thr Cys Cys Ala

Gly Thr Thr Ala

500

Gly Thr Ala Cys

515

Gly Gly Ala Ala

530

Thr Cys Cys Thr

545

Cys Ala Cys Cys

Gly Gly Gly Gly

580

Thr Cys Thr Cys

595

Thr Gly Gly Cys

610

Cys Thr Gly Gly

625

Thr Cys Cys Ala

Gly Gly Cys Thr

660

Cys Ala Gly Thr

675

Gly Cys Cys Thr

690

Cys Ala Gly Ala

215

Ala Ala Cys Ala

230

Ala Ala Ala Thr

245

Ala Gly Cys Cys

Gly Thr Thr Thr

280

Ala Ala Ala Thr

295

Gly Thr Thr Cys

310

Thr Gly Gly Gly

325

Thr Gly Gly Thr

Ala Gly Gly Thr

360

Gly Gly Cys Gly

375

Gly Cys Gly Gly

390

Gly Thr Cys Thr

405

Cys Cys Gly Cys

Gly Gly Gly Cys

440

Gly Gly Thr Cys

455

Ala Cys Thr Gly

470

Ala Cys Ala Thr

485

Thr Gly Gly Thr

Cys Ala Gly Cys

520

Cys Ala Gly Cys

535

Cys Ala Thr Cys

550

Ala Ala Thr Cys

565

Thr Cys Cys Cys

Thr Gly Gly Cys

600

Ala Cys Cys Thr

615

Cys Cys Ala Thr

630

Gly Gly Cys Thr

645

Gly Ala Thr Thr

Cys Cys Thr Ala

680

Gly Ala Gly Thr

695

Gly Ala Cys Ala

220

Cys Gly Cys Thr

235

Gly Ala Ala Cys

250

Gly Ala Gly Gly

265

Ala Thr Thr Ala

Gly Ala Cys Ala

300

Gly Cys Ala Thr

315

Gly Cys Cys Ala

330

Cys Ala Cys Cys

345

Gly Gly Ala Gly

Gly Ala Gly Gly

380

Thr Gly Gly Cys

395

Gly Thr Gly Thr

410

Cys Cys Thr Cys

425

Cys Cys Cys Ala

Ala Cys Cys Ala

460

Gly Gly Ala Gly

475

Cys Gly Gly Gly

490

Gly Thr Ala Cys

505

Ala Gly Cys Thr

Cys Cys Cys Cys

540

Thr Ala Thr Gly

555

Gly Gly Cys Cys

57 0

Thr Gly Ala Cys

585

Thr Thr Cys Ala

Cys Ala Gly Cys

620

Cys Ala Cys Thr

635

Gly Ala Gly Gly

650

Ala Thr Thr Ala

665

Thr Gly Ala Cys

Gly Gly Thr Thr

700

Ala Thr Thr Cys

Gly Thr Ala Thr

240

Ala Gly Cys Cys

255

Ala Cys Ala Cys

270

Cys Thr Gly Thr

285

Ala Gly Thr Ala

Thr Thr Gly Ala

320

Gly Gly Gly Ala

335

Gly Thr Cys Thr

350

Gly Cys Gly Gly

365

Thr Gly Gly Cys

Gly Gly Ala Thr

400

Thr Gly Ala Cys

415

Ala Gly Thr Gly

430

Gly Gly Gly Cys

445

Thr Cys Thr Cys

Cys Ala Gly Cys

480

Gly Cys Ala Gly

495

Ala Cys Thr Gly

510

Thr Cys Cys Ala

525

Ala Ala Ala Cys

Gly Thr Ala Ala

560

Cys Thr Cys Ala

575

Cys Gly Ala Thr

590

Ala Gly Thr Cys

605

Cys Thr Cys Cys

Gly Gly Gly Cys

640

Ala Thr Gly Ala

655

Cys Thr Gly Cys

670

Ala Gly Cys Ala

685

Gly Gly Gly ThrGly Thr Thr Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys

705 710 715 720

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Ala Gly

725 730 735

Gly Thr

<210> 2

<211> 246

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gln Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai

35 40 45

Ser Ala lie Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe Asp Xyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Vai Leu Thr Gln Pro Pro Ser Vai

130 135 140

Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Vai Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser

145 150 155 160

Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Gly Vai His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro

165 170 175

Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Phe Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser

195 200 205

Leu Ala lie Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Vai Leu Gly

245

Claims

1. Composição compreendendolipossomas compreendidos de (i) lipídeos de formação de vesí-cula; (ii) um lipopolímero; (iii) um conjugado compreendido de uma porçãohidrofóbica, um polímero hidrofílico e um anticorpo que se liga especifica-mente a um domínio extracelular de um receptor HER2; e (iv) um fármacocapturado, o dito conjugado presente em uma quantidade eficaz para prover,em média, mais do que cerca de 2 e menos do que cerca de 25 anticorpospor lipossoma.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, onde o dito an-ticorpo tem um peso molecular entre 20.000-50.000 Dáltons.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação-2, onde o dito anticorpo tem pelo menos cerca de 80% de identidade de se-qüência com a SEQ ID NO: 2.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação-2, onde o dito polímero hidrofílico é polietileno glicol tendo um peso molecu-lar entre 750-5000 Dáltons.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1-4, onde o dito fármaco capturado é um fármaco citotóxico ou um agenteantitumor.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 -4, onde o dito fármaco capturado é uma antraciclina.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, onde o ditofármaco é doxorrubicina.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 -4, onde a dita quantidade de conjugado prove menos do que cerca de 20anticorpos por lipossoma, em média, 48 horas após administração in vivo.

9. Formulação de lipossoma compreendendolipossomas compreendidos de (i) pelo menos um lipídeo de for-mação de vesícula rígido; (ii) um lipopolímero compreendido de uma porçãohidrofóbica e polietileno glicol; (iii) um conjugado compreendido de uma por-ção hidrofóbica, polietileno glicol e um anticorpo de cadeia simples que seliga especificamente a um domínio extracelular de um receptor HER2; o ditoanticorpo de cadeia simples tendo a identidade de SEQ ID NO:2 ou substituições conservativas dela; e (iv) um fármaco capturado tendo atividade antitumor.onde os ditos lipossomas são caracterizados por uma quantida-de de conjugado eficaz para prover mais do que cerca de 2 e menos do quecerca de 15 anticorpos por lipossoma 96 horas após administração in vitro,conforme evidenciado por um ensaio in vitro onde os lipossomas são incu-bados a 37° C por 96 horas e dissociação do anticorpo de cadeia simples apartir do lipossoma é determinada.

10. Formulação de acordo com a reivindicação 10, onde o ditolipídeo de formação de vesícula rígido é fosfatidilcolina de soja hidrogenada.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 9 ou reivindica-ção 10, onde os ditos lipossomas compreendem ainda colesterol.

12. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-9-11, onde o dito fármaco capturado é uma antraciclina.

13. Formulação de acordo com a reivindicação 12, onde o ditofármaco capturado é doxorrubicina.

14. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-9-11, onde a dita quantidade de conjugado prove menos do que cerca de 12anticorpos por lipossoma, em média, 48 horas após administração in vivo.

15. Formulação de imunolipossoma compreendendolipossomas compreendidos de (i) pelo menos um lipídeo de for-mação de vesícula rígido; (ii) um lipopolímero compreendido de uma porçãohidrofóbica e polietileno glicol; (iii) um conjugado compreendido de uma por-ção hidrofóbica, polietileno glicol e um anticorpo de cadeia simples que seliga especificamente a um domínio extracelular de um receptor HER2, o ditoanticorpo de cadeia simples tendo pelo menos 80% de identidade com aSEQ ID NO: 2; e (iv) um fármaco capturado tendo atividade antitumor,a dita formulação de imunolipossoma quando administrada invivo provendo uma área sob a curva que é maior do que ou não mais do que-25% menor do que a área sob a curva de lipossomas compreendidos decomponentes similares mas sem o dito anticorpo.

16. Formulação de acordo com a reivindicação 15, onde o ditolipídeo de formação de vesícula rígido é fosfatidilcolina de soja hidrogenada.

17. Formulação de acordo com a reivindicação 15 ou reivindica-ção 16, onde os ditos lipossomas compreendem ainda colesterol.

18. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-15-17, onde o dito fármaco capturado é uma antraciclina.

19. Formulação de acordo com a reivindicação 18, onde o ditofármaco capturado é doxorrubicina.

20. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-15-17, onde a dita quantidade de conjugado prove maior do que dois anti-corpos por lipossoma e menos do que cerca de 20 anticorpos por lipossoma,em média, 48 horas após administração in vivo, conforme evidenciado porum ensaio in vitro onde os lipossomas são incubados a 37° C por 48 horas edissociação do anticorpo de cadeia simples a partir do lipossoma é determi-nada.

21. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-15-17, onde a dita quantidade de conjugado prove mais do que dois anticor-pos por lipossoma e menos do que cerca de 15 anticorpos por lipossoma,em média, 96= horas após administração in vivo, conforme evidenciado por-um ensaio in vitro onde os lipossomas são incubados a 37° C por 96 horas edissociação do anticorpo de cadeia simples a partir do lipossoma é determi-nada.

22. Formulação de imunolipossoma compreendendolipossomas compreendidos de (i) pelo menos um lipídeo de for-mação de vesícula rígido; (ii) um lipopolímero compreendido de uma porçãohidrofílica e polietileno glicol; (iii) um conjugado compreendido de uma por-ção hidrofóbica, polietileno glicol e um anticorpo de cadeia simples que seliga especificamente a um domínio extracelular de um receptor HER2 e ten-do uma seqüência identificada como SEQ ID NO: 2; e (iv) um fármaco captu-rado tendo atividade antitumor,onde 96 horas após administração dos ditos lipossomas, entre30-60% dos anticorpos dissociam de cada lipossoma para prover uma com-posição, 96 horas após administração in vivo, que tem menos do que cercade 25 anticorpos por lipossoma, conforme evidenciado por um ensaio in vitroonde os lipossomas são incubados a 37° C por 96 horas e dissociação doanticorpo de cadeia simples a partir do lipossoma é determinada.

23. Composição de lipossoma de acordo com o processo deprovisão de lipossomas tendo um revestimento externo de ca-deias de polímero hidrofílico e um fármaco capturado;incubação dos ditos lipossomas com uma quantidade de conju-gado compreendido de uma porção hidrofóbica, polietileno glicol e um anti-corpo de cadeia simples que especificamente se liga a um domínio extrace-lular de um receptor HER2; a dita quantidade de conjugado sendo selecio-nada para prover mais do que cerca de 2 e menos do que cerca de 15 anti-corpos por lipossoma em média 96 horas após administração in vivo, con-forme evidenciado por um ensaio in vitro onde os lipossomas são incubadosa 37° C por 96 horas e dissociação do anticorpo de cadeia simples a partirdo lipossoma é determinada.

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, onde o ditoanticorpo tem uma seqüência identificada como SEQ ID NO: 2.

25. Composição de acordo com a reivindicação 23 ou reivindica-ção 24, onde o dito fármaco é doxorrubicina.

26. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 23-25, onde a dita quantidade de conjugado prove entre cerca de 2-10anticorpos por lipossoma, em média.

27. Composição compreendendolipossomas compreendidos de (i) lipídeos de formação de vesí-cula; (ii) um lipopolímero; (iii) um conjugado compreendido de uma porçãohidrofóbica, um polímero hidrofílico e um anticorpo que se liga especifica-mente a um domínio extracelular de um receptor HER2; e (iv) um fármacocapturado, os ditos lipossomas antes da administração in vivo tendo menosdo que 25 anticorpos por lipossoma, onde após administração in vivo, osditos lipossomas perdem 20-50% dos ditos anticorpos ainda retendo ligaçãodo dito receptor HER2 suficiente citotoxidade.

28. Composição de acordo com a reivindicação 27, onde o ditoanticorpo é SEQ ID NO: 2.

29. Composição de acordo com a reivindicação 27 ou reivindica-ção 28, onde o dito fármaco é doxorrubicina.

30. Método de preparação de uma composição de lipossomacompreendendo:provisão de lipossomas compreendidos de (i) lipídeos de forma-ção de vesícula; (ii) um lipopolímero; (iii) um conjugado compreendido deuma porção hidrofóbica, um polímero hidrofílico e um anticorpo que especifi-camente se liga a um domínio extracelular de um receptor HER2; o dito con-jugado incluído em uma primeira quantidade suficiente para prover um pri-meiro número selecionado de anticorpos por lipossoma; e (iv) um fármacocapturado,contato dos ditos lipossomas com sangue;determinação do número de anticorpos por lipossoma em um oumais pontos de tempo quando do contato dos ditos lipossomas com sangue;seleção, com base na dita determinação, de uma segunda quan-tidade de um conjugado suficiente para prover um segundo número, maior,de anticorpos por lipossomas a fim de prover pelo menos dois anticorpos porlipossoma após contato com sangue.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, onde o dito conta-to inclui contato dos ditos lipossomas com sangue in vitro.

32. Método de acordo com a reivindicação 30, onde o dito conta-to inclui contato dos ditos lipossomas com sangue in vivo.

33. Método de acordo com a reivindicação 31 ou 32, onde a ditaprovisão inclui provisão de lipossomas tendo um conjugado compreendidode um fosfolipídeo, uma porção hidrofílica de polietileno glicol e um anticorpode cadeia simples tendo uma seqüência identificada aqui como SEQ ID NO: 2.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, onde a dita provi-são inclui provisão de lipossomas tendo doxorrubicina como o fármaco cap-turado.

35. Método de acordo com a reivindicação 30, onde a dita sele-ção compreende seleção de uma segunda quantidade de conjugado eficazpara prover menos do que 50 anticorpos por lipossoma.

36. Método de acordo com a reivindicação 30, onde a dita provi-são inclui provisão de lipossomas tendo uma primeira quantidade de conju-gado que prove menos do que 150 anticorpos por lipossoma.

37. Método de acordo com a reivindicação 30, onde a dita sele-ção compreende seleção de uma segunda quantidade de conjugado eficazpara prover 30 ou menos anticorpos por lipossoma.