BRPI0619738A2 - sirna isolado, compreendendo um filamento de arn sentido e um filamento de arn anti-sentido complementar que formam juntos um dúplex de arn, composição compreendendo pelo menos um sirna e utilização do mesmo - Google Patents
sirna isolado, compreendendo um filamento de arn sentido e um filamento de arn anti-sentido complementar que formam juntos um dúplex de arn, composição compreendendo pelo menos um sirna e utilização do mesmo Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0619738A2 BRPI0619738A2 BRPI0619738-8A BRPI0619738A BRPI0619738A2 BR PI0619738 A2 BRPI0619738 A2 BR PI0619738A2 BR PI0619738 A BRPI0619738 A BR PI0619738A BR PI0619738 A2 BRPI0619738 A2 BR PI0619738A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- sirna
- seq
- protein
- exon
- myosin
- Prior art date
Links
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 title abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 47
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 40
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000035614 depigmentation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 34
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 27
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 239000007854 depigmenting agent Substances 0.000 claims description 7
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 5
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010040865 Skin hyperpigmentation Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 41
- DJDSLBVSSOQSLW-UHFFFAOYSA-N mono(2-ethylhexyl) phthalate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O DJDSLBVSSOQSLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 26
- 210000002780 melanosome Anatomy 0.000 description 24
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 21
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 15
- 208000000069 hyperpigmentation Diseases 0.000 description 15
- 230000003810 hyperpigmentation Effects 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 12
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 101000583031 Homo sapiens Unconventional myosin-Va Proteins 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 10
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 102000052628 human MYO5A Human genes 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 9
- -1 2,3-dihydroxyphenyl Chemical group 0.000 description 8
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 8
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 230000008101 melanin synthesis pathway Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 description 4
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 4
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N hydroquinone O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 4
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M (E)-Ferulic acid Natural products COC1=CC(\C=C\C([O-])=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M 0.000 description 2
- 150000005207 1,3-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 2
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000349 Acanthosis Diseases 0.000 description 2
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 2
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010036229 Post inflammatory pigmentation change Diseases 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 229960000271 arbutin Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 150000005205 dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N ferulic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N 0.000 description 2
- 229940114124 ferulic acid Drugs 0.000 description 2
- KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N ferulic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001785 ferulic acid Nutrition 0.000 description 2
- LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N guaiacol Chemical class COC1=CC=CC=C1O LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenyl beta-D-alloside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CN)=C1O NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 2
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N trans-isoferulic acid Natural products COC1=CC=C(C=CC(O)=O)C=C1O QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTQUILVPBZEHTK-ZOQUXTDFSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1N(C)C(=O)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UTQUILVPBZEHTK-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- MBERTAKFBYOAHR-IVZWLZJFSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-propylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(CCC)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 MBERTAKFBYOAHR-IVZWLZJFSA-N 0.000 description 1
- TYYHDKOVFSVWON-UHFFFAOYSA-N 2-butyl-2-methoxy-1,3-diphenylpropane-1,3-dione Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)C(OC)(CCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1 TYYHDKOVFSVWON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-DOMIDYPGSA-N 2-sulfanylidene-(214C)1H-pyrimidin-4-one Chemical compound N1[14C](=S)NC(=O)C=C1 ZEMGGZBWXRYJHK-DOMIDYPGSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- ZRFXOICDDKDRNA-IVZWLZJFSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(C#CC)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 ZRFXOICDDKDRNA-IVZWLZJFSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 5-bromouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- ATMUYWZMPLKPEJ-UHFFFAOYSA-N 7a-methyl-1-(6-methylheptan-2-yl)-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1h-inden-4-one Chemical compound O=C1CCCC2(C)C(C(C)CCCC(C)C)CCC21 ATMUYWZMPLKPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000945470 Arcturus Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 206010008570 Chloasma Diseases 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010052465 Congenital poikiloderma Diseases 0.000 description 1
- 208000014311 Cushing syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010012468 Dermatitis herpetiformis Diseases 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 206010016741 Fixed eruption Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 208000018565 Hemochromatosis Diseases 0.000 description 1
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000685323 Homo sapiens Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010027145 Melanocytic naevus Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101001026869 Mus musculus F-box/LRR-repeat protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 201000009053 Neurodermatitis Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 201000010394 Ochronosis Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010057041 Poikiloderma Diseases 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000015766 Protein Kinase C beta Human genes 0.000 description 1
- 108010024526 Protein Kinase C beta Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000000791 Rothmund-Thomson syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010082714 Silver Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010040825 Skin depigmentation Diseases 0.000 description 1
- 239000004902 Softening Agent Substances 0.000 description 1
- 102100023155 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- HAMNKKUPIHEESI-UHFFFAOYSA-N aminoguanidine Chemical compound NNC(N)=N HAMNKKUPIHEESI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 229960005193 avobenzone Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 208000012587 fixed pigmented erythema Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N hydantoin Chemical compound O=C1CNC(=O)N1 WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940091173 hydantoin Drugs 0.000 description 1
- VVIUBCNYACGLLV-UHFFFAOYSA-N hypotaurine Chemical compound [NH3+]CCS([O-])=O VVIUBCNYACGLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000003410 keratolytic agent Substances 0.000 description 1
- BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N kojic acid Chemical compound OCC1=CC(=O)C(O)=CO1 BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004705 kojic acid Drugs 0.000 description 1
- WZNJWVWKTVETCG-UHFFFAOYSA-N kojic acid Natural products OC(=O)C(N)CN1C=CC(=O)C(O)=C1 WZNJWVWKTVETCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002647 laser therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000025609 melanosome localization Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L methylphosphonate(2-) Chemical compound CP([O-])([O-])=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 208000029347 ochronosis disease Diseases 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N penetratin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 108010043655 penetratin Proteins 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 150000002990 phenothiazines Chemical class 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000017983 photosensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 201000009395 primary hyperaldosteronism Diseases 0.000 description 1
- 235000008151 pyridoxamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011699 pyridoxamine Substances 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013456 study Methods 0.000 description 1
- 230000002739 subcortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000475 sunscreen effect Effects 0.000 description 1
- 239000000516 sunscreening agent Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 1
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SHWIJIJNPFXOFS-UHFFFAOYSA-N thiotaurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=S SHWIJIJNPFXOFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001550 time effect Effects 0.000 description 1
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- PBKWZFANFUTEPS-CWUSWOHSSA-N transportan Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 PBKWZFANFUTEPS-CWUSWOHSSA-N 0.000 description 1
- 108010062760 transportan Proteins 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
siRNA ISOLADO, COMPREENDENDO UM FILAMENTO DE ARN SENTIDO E UM FILAMENTO DE ARN ANTI-SENTIDO COMPLEMENTAR QUE FORMAM JUNTOS UM DúPLEX DE ARN, COMPOSIçãO COMPREENDENDO PELO MENOS UM siRNA E UTILIZAçãO DO MESMO. A presente invenção refere-se aos novos siRNA isolados, compreendendo um filamento de ARN sentido e um filamento de ARN anti-sentido complementar que formam juntos um dúplex de ARN, caracterizado pelo fato de que o filamento de ARN sentido compreende uma sequência que possui no máximo um nucleotídeo distinto em relação a um fragmento de 14 a 30 nucleotídeos contíguos da seqúência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va, assim como composições que compreendem pelo menos um siRNA e a utilização de pelo menos esse siRNA como agente cosmético ou terapêutico para a despigmentação da pele.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "siRNA ISOLADO, COMPREENDENDO UM FILAMENTO DE ARN SENTIDO E UM FILAMENTO DE ARN ANTI-SENTIDO COMPLEMENTAR QUE FORMAM JUNTOS UM DÚPLEX DE ARN, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO PELO MENOS UM siRNA E UTILIZAÇÃO DO MESMO".
A presente invenção refere-se aos novos siRNA isolados com- preendendo um filamento de ARN sentido e um filamento de ARN anti- sentido complementar, formando juntos um dúplex de ARN, caracterizado pelo fato de o filamento de ARN sentido compreender uma seqüência que possui no máximo um nucleotídeo distinto em relação a um fragmento de 14 a 30 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va1 assim como composições que com- preendem pelo menos esse siRNA, e a utilização de pelo menos esse siRNA como agente cosmético ou terapêutico para a despigmentação da pele.
A pigmentação da pele é um processo complexo, compreenden- do numerosas etapas. Os melanócitos, que ficam situados na camada basal da epiderme, podem ser ativados por estímulos internos ou externos (por exem- plo, uma exposição aos ultravioletas (UV)) a serem produzidos da melanina em órgãos especializados similares aos Iisossomas denominados melanossomas. Após maturação, os melanossomas perinucleares são transportados ao longo dos microtubos e da cito-estrutura de actina até a periferia dos dendritos dos me- lanócitos (Lambert J et ai. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand): 45: 905-18, 1999; Hara M et al. J Invest Dermatol.: 114: 438-43, 2000; Vancoillie G et al. J Invest Derma- tol.: 114: 421-9, 2000). Os melanossomas, que contêm a melanina, são, em se- guida, transferidos aos queratinócitos adjacentes a partir das extremidades dos dendritos por um mecanismo ainda desconhecido.
Qualquer alteração de uma etapa desse processo complexo po- de chegar a alterações da pigmentação da pele. Em particular, um aumento do número de melanócitos ativos, e / ou um aumento da produção de mela- nina, e / ou um aumento da transferência de melanossomas dos melanócitos para os queratinócitos podem levar a uma hiperpigmentação (ou discroma- tose) da pele. Essa hiperpigmentação pode ser induzida por numerosos fa- tores, tais como os medicamentos, o sol, os disfuncionamentos metabólicos ou nutricionais, ou ainda por doenças genéticas ou auto imunes. Isto implica geralmente conseqüências cosméticas e psicológicas importantes para o paciente, que vai em numerosos casos buscar um tratamento adequado.
Numerosos esforços foram, portanto, feitos para desenvolver tratamentos eficazes contra a hiperpigmentação. A maior parte dos trata- mentos químicos existentes compreendem agentes despigmentadores que atingem a via de síntese da melanina, notadamente inibindo a atividade da enzima tirosinase que é necessária à síntese da melanina. Esses agentes despigmentadores incluem notadamente a hidroquinona e seus derivados, o retinol ou a tretinoína, o ácido ascórbico e seus derivados, extratos placentários, o ácido cójico, o ácido ferúlico, a arbutina, os derivados de diidroxibenzeno (WO 00/47045), os derivados do guaiacol (WO 00/47179), o 4-(2,3-diidroxi- fenil)-cicloexanol (WO 00/56279), os derivados do resorcinol (WO 00/56702), as amidas fenólicas (WO 99/32077). Essas substâncias podem apresentar certos inconvenientes. Elas podem ser instáveis, necessitar de uma utiliza- ção com concentrações elevadas, não ter especificidade, quanto ao seu mo- do de ação, ou apresentar um poder citotóxico ou irritante.
Tratamentos de tipo físico foram também desenvolvidos, tais como a esfoliação de profundidade média, a dermabrazão ou a terapia laser. Todavia esses tratamentos são geralmente menos eficazes e podem causar efeitos secundários incômodos, tais como riscos de hipo- ou de hiperpigmen- tação pós-inflamatórios, uma ocronose ou uma cicatrização, podendo provo- car os efeitos carcinógenos (Briganti S et al. Pigment Cell. Res.: 16: 101-10, 2003; Halder RM, Nootheti PK. J Am Acad Dermatol.: 48: S143-48, 2003; Halder RM, Richard GM. Skin Therapy Lett.: 9: 1 -3, 2004).
Existe, portanto, uma necessidade de desenvolvimento de novos tratamentos cosméticos e / ou terapêuticos da hiperpigmentação que sejam eficazes e seguros.
Além dos tratamentos químicos, uma outra possibilidade para se conseguir a inibição da expressão do gene determinado consiste em utilizar ácidos nucléicos anti-sentido ou em tirar proveito de um processo denomi- nado ARN interferência (Dykxhoorn DM et al. Nat Vide Mol Cell Biol.: 4: 457- 67, 2003; Soutschek J et al. Nature: 432: 173-8, 2004). O ARN interferência (denominado na seqüência de RNAi) é o processo pelo qual um ARN duplo filamento (dsRNA) de seqüência nucléico sentido determinado induz a degradação de todos os ARN messager (ARNm), compreendendo essa seqüência nucléica, de uma maneira especí- fica dessa seqüência nucléica. Embora o processo de RNAi tenha sido inici- almente colocado em evidência no Caenorhabditis elegans, fica então claro que o processo de RNAi é um fenômeno muito geral, e a inibição da expres- são de genes humanos por RNAi foi obtida.
O processo de RNAi pode ser obtido, utilizando pequenos ARN interferentes (ou siRNA). Esses siRNA são dsRNA de menos de 30 nucleotí- deos, compreendendo em sua seqüência sentido uma seqüência muito ho- móloga, de preferência idêntica, a um fragmento do ARN atingido. Quando um siRNA atravessa a membrana plásmica, a reação da célula é de destruir o siRNA, assim como todas as seqüências que comportam uma seqüência idêntica ou muito homóloga. Assim, um ARNm possuindo um fragmento i- dêntico ou muito homólogo à seqüência do siRNA será destruído, a expres- são desse gene sendo assim inibida.
Para o tratamento da hiperpigmentação, foi proposto na técnica anterior utilizar oligonucleotídeos anti-sentido dirigidos contra os genes da tirosinase ou da proteína TRP-1 (WO 01/58918), ou contra o gene da proteí- na PKC β1 que é implicada no processo de fosforilação da tirosinase (WO 2005/073243). Foi também proposta a utilização dos siRNA atingindo o gene da tirosinase (WO 2005/060536).
Todavia, todos esses genes são implicados na via de síntese da melanina, e jamais foi divulgado, nem sugerido de siRNA que atinge um ge- ne implicado, não na via de síntese da melanina, mas no transporte mela- nossomas no meio dos melanócitos no meio dos melanócitos e sua transfe- rência para os queratinócitos.
Foi mostrado, notadamente pelos inventores, que a proteína mi- osina Va é implicada no transporte dos melanossomas no meio dos melanó- citos (Lambert J et al. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand): 45: 905-18, 1999; Lambert et al. J Invest Dermatol.: 111: 835-40, 1998), Mais precisamente, a proteína miosina Va possui muitas variantes de entrelaçamento, e o variante compor- tando o exon F é necessário ao transporte dos melanossomas (Westbroek W et al. J Invest Dermatol.: 120: 465-75, 2003).
Até o presente, todavia, nenhuma tentativa foi feita para inibir a expressão do variante da proteína miosina Va, comportando o exon F, utili- zando os siRNA, nem para aplicar essa abordagem no tratamento cosmético ou terapêutico da hiperpigmentação.
Os inventores descobriram que era possível sintetizar os siRNA atingindo o exon F da proteína miosina Va e induzir, graças a esses siRNA, um processo de RNAi específico do exon F da proteína miosina Va. Mostra- ram também que esses siRNA são eficazes para inibir a expressão do vari- ante da proteína miosina Va, comportando o exon F a concentrações de siRNA, não induzindo baixa da confiabilidade celular e que o efeito é dose- dependente. Além disso, os inventores descobriram também que a presença de siRNA atingindo o exon F da proteína miosina Va permite inibir a transfe- rência dos melanossomas dos melanócitos para os queratinócitos.
A invenção se refere, portanto, um siRNA isolado, compreen- dendo um filamento de ARN sentido e um filamento de ARN anti-sentido complementar, formando juntos um dúplex de ARN, caracterizado pelo fato de o filamento de ARN sentido compreender uma seqüência que possui no máximo um nucleotídeo distinto em relação a um fragmento de 14 a 30, van- tajosamente de 15 a 29, 16 a 28, 17 a 27, 18 a 25, 18 a 23, ou 18 a 21 nu- cleotídeos contíguos da seqüência nucleotídica do exon F do gene codifi- cando para a proteína miosina Va. Por "compreende um fragmento da se- qüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va", entende-se em toda a descrição da invenção o fato de compreender uma seqüência de ARN correspondente à seqüência gênica, isto é, uma se- qüência de ARN que corresponde à seqüência gênica na qual os T são substituídos por U.
O filamento sentido de um siRNA, de acordo com a invenção, compreende, portanto, seja um fragmento de 14 a 30, vantajosamente 15 a 29, 16 a 28, 17 a 27, 18 a 25, 18 a 23, ou 18 a 21 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína mio- sina Va, seja uma seqüência que apresenta um nucleotídeo distinto em rela- ção a esse fragmento. Com efeito, o processo de RNAi é específico da se- qüência, e uma forte homologia de seqüência é necessária para se obter uma RNAi eficaz. De maneira vantajosa, o filamento de ARN sentido com- preende uma seqüência idêntica a um fragmento de 14 a 30, vantajosamen- te 15 a 29, 16 a 28, 17 a 27, ou 18 a 25 nucleotídeos contíguos da seqüên- cia nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va.
A proteína miosina Va foi descrita em diferentes espécies, em particular o homem, o rato, o camundongo. Em um modo de realização van- tajoso, a seqüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a prote- ína miosina Va é a seqüência humana do exon F da proteína miosina Va, que é representada pela SEQ ID Ns 1. A seqüência da proteína miosina Va humana está representada na figura 1A, a parte correspondente ao exon F (SEQ ID Ns 1) sendo sublinhada.
Todos os siRNA que atingem um fragmento de 14 a 30, vantajo- samente 15 a 29, 16 a 28, 17 a 27, 18 a 25, 18 a 23, ou 18 a 21 nucleotídeos contíguos da seqüência SEQ ID Ns 1 são incluídos no alcance da invenção. Todavia, é vantajoso que o fragmento do exon F da proteína miosina Va que é atingido, isto é, do qual a seqüência está compreendida no filamento senti- do do siRNA, não seja um fragmento que possui uma estrutura característica no ARNm da proteína miosina Va ou ao qual vêm se ligar proteínas regula- doras. Por "estrutura característica", entende-se, no sentido da invenção, uma estrutura de tipo haste ou circuito ou grampo de cabelo capaz de se formar em um ARNm da proteína miosina Va. Diferentes instrumentos são colocados à disposição gratuitamente da Internet por várias organizações (vide tabela 1 abaixo), e podem ser utilizados para desenhar siRNA atingin- do o exon F da proteína miosina Va humana. Tabela 1: sites Internet que colocam àa disposição instrumentos de seleção de siRNA.
<table>table see original document page 7</column></row><table>
A maior parte das sociedades que comercializa siRNA garante a
eficácia de siRNA sintetizados. Além disso, a eficácia de qualquer siRNA que atinge o exon F da proteína miosina Va pode verificada por diferentes testes, notadamente aqueles descritos em detalhes nos exemplos 1 e 2.
Os inventores sintetizaram e testaram vários siRNA particulares que atingem diferentes fragmentos do exon F da proteína miosina Va huma- na em um modo de realização vantajoso de um siRNA, de acordo com a in- venção, o fragmento de 14 a 30, vantajosamente 15 a 29, 16 a 28, 17 a 27, 18 a 25, 18 a 23, ou 18 a 21 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotí- dica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va humana é constituída de uma seqüência nucleotídica escolhida dentre SEQ ID Ns 2, SEQ ID Nq 3, SEQ ID N2 4. A posição das três seqüências SEQ ID NQ2, SEQ ID N9 3 e SEQ ID NQ 4 é precisada na figura 1B. Em um modo de realização particularmente vantajoso, o fragmento de 14 a 30, vantajosamente 15 a 29, 16 a 28, 17 a 27, 18 a 25, 18 a 23, ou 18 a 21 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína mio- sina Va é constituído da seqüência nucleotídica SEQ ID Ne 3.
Um siRNA, de acordo com a invenção, é um pequeno ARN, du- plo filamento, cujos filamentos sentido e anti-sentido são emparelhados por ligações de tipo Watson-Crick, e cuja seqüência do filamento sentido é cons- tituída de ou compreende um fragmento de 14 a 30, vantajosamente 15 a 29, 16 a 28, 17 a 27, 18 a 25, 18 a 23, ou 18 a 21 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotídica do exon F da proteína miosina Va.
É conhecido que os siRNA cuja seqüência é composta de 30 a 50 % de guaninas e citosinas são mais eficazes que as seqüências com uma proporção mais importante de guaninas e citosinas. Os siRNA, de acordo com a invenção, possuem, portanto, vantajosamente uma seqüência com- posta de 30 a 50 % de guaninas e citosinas.
Deve ficar entendido que um siRNA, de acordo com a invenção, pode indiferentemente compreender duas moléculas de ARN simples fila- mentos complementares, ou uma só molécula de ARN simples filamento na qual duas partes complementares são emparelhadas por ligações de tipo Watson-Crick e são ligadas de um lado de forma covalente por uma estrutu- ra de tipo grampo de cabelo (fala-se então mais precisamente de shRNA (para "Short haipin RNA), que pode ser considerado como uma subcategoria de siRNA). Em toda a descrição, entender-se-á o termo siRNA em seu sen- tido amplo, incluindo shRNA, salvo indicação contrária. Em um modo de rea- lização vantajoso, um siRNA, de acordo com a invenção, compreende duas moléculas de ARN simples filamento complementares. Em um outro modo de realização vantajoso, um siRNA, de acordo com a invenção, compreende ou é constituído de uma única molécula de ARN simples filamento, na qual duas partes complementares são emparelhadas por ligações de tipo o Wat- son-Crick são ligados de um lado de forma covalente por uma estrutura de tipo grampo de cabelo, isto é, um shRNA.
Além disso, os filamentos de ARN sentido e / ou anti-sentido po- dem compreender, além disso, um fragmento 3' em ressalto de 2 a 4 nucleo- tídeos, em particular quando um siRNA, de acordo com a invenção, compre- ende duas moléculas de ARN simples filamento complementares. Por "frag- mento 3' em ressalto de 2 a 4 nucleotídeos", entende-se a presença de em pelo menos um filamento do dúplex de ARN de 2 a 4 nucleotídeos não em- parelhados ao filamento complementar à extremidade 3' desse filamento. Os nucleotídeos utilizados no fragmento 3' em ressalto podem ser nucleotídeos naturais (ribonucleotídeos ou deóxi-ribonucleotídeos), ou dos nucleotídeos modificados, tais como os LNA (Locked Nucleic Acid) que comportam uma ponte metileno entre as posições 2' e 4' da ribose (Soutschek J. et al. Natu- re, 2004 Nov 11; 432 (7014): 173-8). O fragmento 3' em ressalto pode tam- bém ter sofrido qualquer tipo de modificação química descrita no parágrafo seguinte para o filamento de ARN sentido e / ou o filamento de ARN anti- sentido de um siRNA, de acordo com a invenção, vantajosamente, o frag- mento 3' em ressalto é constituído de 2 nucleotídeos. Nesse caso, seqüên- cias preferidas para o fragmento 3' em ressalto são "TT" (no qual T repre- senta a dioxitimidina) ou "UU" (no qual U representa a uracila). Vantajosa- mente também, os dois filamentos complementares de um siRNA, de acordo com a invenção, compreendem um fragmento 3' em ressalto. Nesse caso, o comprimento e a seqüência dos dois fragmentos 3' em ressalto podem ser idênticos ou diferentes. De maneira vantajosa, os dois filamentos comple- mentares de um siRNA, de acordo com a invenção, compreendem, cada um, o mesmo fragmento 3' em ressalto de 2 nucleotídeos de seqüência "TT". Esses siRNA compreendendo as seqüências ARN correspondentes à SEQ ID N9 1, SEQ ID Ne 2, SEQ ID N5 3 ou SEQ ID Nº 4 e sobre cada filamento um fragmento 3' em ressalto de seqüência "TT" estão representados na figu- ra 1C e correspondem a modos de realização vantajosos da invenção. Eles correspondem:
- ao siRNA MioVa nº 1 compreendendo a seqüência ARN da seqüência gênica SEQ ID Nº 2, cujos filamentos têm por seqüências preci- sas:
filamento sentido: (5'-UGACCCUAAGAAGUAUCAATT-3' (SEQ ID NO:9) filamento anti sentido: 5'-UUGAUACUUCUUAGGGUCATT-3* (SEQ ID NO:10);
- ao siRNA MioVa nº 2 compreendendo a seqüência ARN da seqüência gênica SEQ ID Nº 3, cujos filamentos têm por seqüências precisas: filamento sentido: 5'-GUAUCAAUCAUAUCGGAUUTT-3' (SEQ ID NO:11) filamento anti sentido: 5'-AAUCCGAUAUGAUUGAUACTT-3' (SEQ ID NO:12);
- ao siRNA Mio Va nº 3 compreendendo a seqüência ARN da seqüência gênica SEQ ID Nº 4, cujos filamentos têm por seqüências preci- sas: filamento sentido: 5'-UCAUAUCGGAUUUCCCUUUTT-3' (SEQ ID NO:13) filamento anti sentido: 5-AAAGGGAAAUCCGAUAUGATT-3' [SEQ ID N°14].
Quando um siRNA, de acordo com a invenção, é um shRNA constituído de uma única molécula de ARN simples filamento na qual duas partes complementares são emparelhadas por ligações de tipo Watson-Crick e são ligadas de um lado de forma covalente por uma estrutura de tipo grampo de cabelo, isto é, quando o siRNA, de acordo com a invenção, é um shRNA, esse shRNA compreende ou é constituída de preferência da seguin- te seqüência:
5-GUAUCAAUCAUAUCGGAUUCUCAAGAGAAAUCCGAUAUGAUUGAUAC-3' (SEQ ID N0:17), na qual as partes em negrito correspondem às duas partes comple- mentares emparelhadas com ligações de tipo Watson-Crick1 correspondendo à ARN de seqüência gênica Seq ID N9 3 compreendida no filamento sentido do siRNA Mio Va ns 2 e sua seqüência complementar, e a parte não em ne- grito corresponde à seqüência da estrutura de tipo grampo de cabelo, ligan- do os dois filamentos complementares.
Além disso, em um siRNA, de acordo com a invenção, o filamen- to de ARN sentido e / ou o filamento de ARN anti-sentido podem também compreender pelo menos uma modificação química no nível de suas partes açúcares, de suas partes nucleobases ou de sua estrutura internucleotídica. Essas modificações podem notadamente permitir inibir a degradação dos siRNA pelas nucleases in vivo. Todas as modificações químicas, permitindo melhorar a estabilidade e a biodisponibilidade in vivo. Todas as modificações químicas, permitindo melhorar a estabilidade e a biodisponibilidade in vivo dos siRNA, de acordo com a invenção, são assim incluídas no alcance da invenção. Dentre as modificações vantajosas nas partes açúcares, podem- se notadamente citar as modificações que intervém em posição 2' da ribose, tais como as modificações 2'-deóxi, 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-tio, ou 2'-0-alquila, em particular 2'-0-metila, ao invés do grupamento 2'-0H normal sobre os ribonucleotídeos, ou ainda a presença de uma ponte metileno entre as posi- ções 2' e 4' da ribose (LNA). Com referência às nucleobases, é possível uti- lizar bases modificadas, tais como notadamente a 5-bromo-uridina, o 5-iodo- uridina, a N3- metil-uridina, uma 2,6-diamino purina (DAP), a 5-metil-2-deóxi Cytidina, a 5-(1-propil)-2'-deóxi- Uridina (pdU), a 5-(1-propinil)-2'-deóxi Citidi- na (pdC), ou das bases conjugadas com colesterol. Enfim, modificações van- tajosas da estrutura internucleotídica compreendem a substituição de gru- pamentos fosfodiésteres dessa estrutura por grupamentos fosforotioato, me- til fosfonato, fósforo diamidato ou a utilização de uma estrutura composta de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina ligadas por ligações peptídicas (PNA, Peptide Nucleic AcicJ). As diferentes modificações (base açúcar, estrutura) podem naturalmente ser combinadas para dar ácidos nucléicos modificados de tipo morfolino (bases fixadas sobre um ciclo morfolino e ligadas por gru- pos fósforo diamidato) ou PNA (bases fixadas sobre unidades de N-(2- aminoetil)- glicina ligadas por ligações peptídicas).
Os siRNA, de acordo com a invenção, são "isolados", o que sig- nifica que não estão em um estado natural, mas foram obtidos por qualquer meio, implicando uma intervenção humana. Notadamente, os siRNA, de a- cordo com a invenção, podem ser obtidos por purificação de siRNA pré- existentes, por síntese química, por amplificação das seqüências nucleotídi- cas desejadas por uma reação de polimerização em cadeia (PCR), ou por síntese recombinante. Numerosas sociedades propõem também a síntese de siRNA, tais como notadamente as sociedades Eurogentec, Ambiom, Dharmacon ou Qiagen.
A invenção se refere também aos siRNA, de acordo com a in- venção, como agente cosmético. Por "agente cosmético", entende-se uma substância que permite manter ou melhorar o aspecto estético de uma parte externa do corpo humano ou animal.
A invenção se refere, além disso, aos siRNA, de acordo com a invenção, como medicamento. Com efeito, os siRNA, de acordo com a in- venção, são novos como medicamento.
A invenção tem também por objeto uma composição que com- preende pelo menos um siRNA, de acordo com a invenção, e um suporte aceitável. Por "suporte aceitável", entende-se qualquer suporte cosmetologi- camente ou farmacologicamente aceitável, conhecido do técnico. Uma composição, de acordo com a invenção, é destinada ao tratamento cosmético e / ou terapêutico da pele e é, portanto, vantajosamen- te administrada por via tópica.
Uma composição para aplicação tópica, de acordo com a inven- ção, pode ser formulada sob qualquer forma galênica habitualmente utilizada para uma aplicação tópica, como, por exemplo, sob a forma de uma solução aquosa, de um creme branco ou colorido, de uma pomada, de um leite ou de uma loção, de um gel, de um ungüento, de um soro, de uma pasta, de uma emulsão óleo na água ou água no óleo, ou de uma espuma. Ela pode even- tualmente ser aplicada sobre a pele sob a forma de aerossol. Ela pode tam- bém se apresentar sob a forma sólida pulverulenta ou não, por exemplo sob a forma de bAstão. Ela pode ainda se apresentar sob a forma de adesivos, de lápis, de pincéis e de aplicadores que permitem uma aplicação localizada sobre as manchas do rosto ou das mãos.
Uma composição, de acordo com a invenção, pode, além disso, compreender qualquer tipo de veículo conhecido do técnico, permitindo me- lhorar a liberação e a biodisponibilidade dos siRNA, de acordo com a inven- ção. Veículos particulares que podem ser utilizados com siRNA compreen- dem notadamente os Iipossomas e os peptídeos capazes de atravessar a membrana celular (denominados CPP para "Cell-Permeable peptides"). Por "lipossoma", entende-se uma vesícula lipídica artificial, cuja membrana é constituída de uma ou várias bicamadas lipídicas e que possui a capacidade de encapsular e de proteger proteínas ou ácidos nucléicos e de fundir com a membrana celular, permitindo assim liberar o produto encapsulado no interi- or das células. A utilização de Iipossomas permite, portanto, proteger os siRNA e facilitar sua penetração no meio das células. Por CPP, são entendi- dos peptídeos capazes de serem internalizados e de atingirem em seguida os compartimentos citoplásmico e / ou nuclear de células vivas. Exemplos desses CPP compreendem os peptídeos Penetratina, Transportan, Tat, MAP e SynBI. Exemplos particularmente úteis de CPP consiste em peptídeos antipáticos derivados de vírus que interagem diretamente com os ácidos nu- cléicos a liberar para formar nonopárticulas capazes de se propagarem atra- vés da membrana plásmica. A conjugação dos siRNA, de acordo com a in- venção, a qualquer um CPP pode, portanto, também permitir proteger os siRNA e facilitar sua entrada nas células in vivo.
Uma composição, de acordo com a invenção, pode também compreender um ou vários ativos, visando a reforçar os efeitos buscados. Em um modo de realização particular, uma composição, de acordo com a invenção, pode notadamente compreender, além disso, pelo menos um ou- tro agente despigmentador. Por "agente despigmentador", entende-se qual- quer substância que age diretamente sobre os melanócitos, inibindo seja sua atividade, seja uma das etapas da via de síntese da melanina, seja ainda o transporte dos melanossomas para os dendritos e sua transferência para os queratinócitos. Dentre os agentes despigmentadores conhecidos capazes de serem acrescentados a uma composição, de acordo com a invenção, po- dem-se notadamente citar a hidroquinona e seus derivados, o retinol ou a tretinoína, o ácido ascórbico e seus derivados, extratos placentários, o ácido cógico, o ácido ferúlico, a arbutina, derivados de diidroxi benzeno (WO 00/47045), derivados do guaiacol (WO 00/47179), o 4-(2,3-di-hidroxi fene- cido -hexanol (WO 00/56279), derivados do resorcinol (WO 00/56702), ami- das fenólicos (WO 99/32077). Outros agentes despigmentadores capazes de serem acrescentados de uma composição, de acordo com a invenção, com- preendem oligonucleotídeos anti-sentido ou siRNA dirigidos contra outros genes que aquele codificando para a proteína miosina Va implicados em uma etapa da via de síntese da melanina ou no transporte dos melanosso- mas para os dendritos e sua transferência para os queratinócitos, tais como oligonucleotídeos anti-sentido ou siRNA que atingem a tirosinase (vide WO 01/58918 e WO 2005/060536), a proteína TRP-1 (vide WO 01/58918) ou a proteína PKC β 1 (vide WO 2005/073243).
As composições, de acordo com a invenção, podem também conter outras substâncias ativas ou excipientes utilizados habitualmente em composições tópicas destinadas ao cuidado da pele, tais como, por exem- plo, filtros solares químicos ou físicos (tais como, por exemplo, o metóxi ci- namato de octila, o butil-metóxi dibenzoil- metano, o óxido de titânio e o óxi- do de zinco), agentes antiglicação e / ou antioxidantes considerados sozi- nhos ou em associação (tais como, por exemplo, tocoferol e seus derivados, a ergotioneína, a tiotaurina, a hipotaurina, a aminoguanidina, o pirofosfato de tiamina, a piridoxamina, a lisina, a histidina, a argenina, a fenilalanina, a pi- rodoxina, o trifosfato de adenosina), agentes anti-inflamatórios (tais como, por exemplo o estearilglicirretinato), agentes calmantes e suas misturas, a- gentes conservantes (antibacterianos ou antifúngicos), agentes hidratantes, modificadores de pH, agentes queratolíticos e / ou descamadores (tais co- mo, por exemplo, o ácido salicílico e seus derivados), vitaminas, espessan- tes, agentes emolientes, águas termais, tensoativos, polímeros, óleos de silicone, óleos vegetais, óleos essenciais, perfumes, matérias corantes ou pigmentos, etc.
A invenção se refere também à utilização de pelo menos um siRNA ou de uma composição, de acordo com a invenção, como agente cosmético para a despigmentação ou embranquecimento da pele. Os siRNA e as composições, de acordo com a invenção, podem ser utilizados como agente cosmético para a despigmentação ou o embranquecimento da pele, seja de forma global para diminuir a pigmentação da pele em seu conjunto, seja no nível de zonas hiperpigmentadas, independentemente da origem de hiperpigmentação dessas zonas. Essa utilização permite, com efeito, homo- geneizar a pigmentação da pele, melhorando assim seu aspecto estético. Além disso, mesmo na ausência de zonas hiperpigmentadas, certas pessoas podem desejar uma pigmentação global mais clara, o que pode ser obtido por uma utilização cosmética, de acordo com a invenção.
A invenção se refere, além disso, à utilização de pelo menos um siRNA ou de uma composição, de acordo com a invenção, para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento ou à prevenção da hiperpig- mentação da pele, em particular hiperpigmentações epidérmicas, melasmas e hiperpigmentações pós-inflamatórias. A hiperpigmentação pode ter como origem numerosos distúrbios diferentes. Podem-se citar notadamente as melanoses do rosto e do pescoço, tais como o cloasma, a melanose de Rie- hl, a Poiquilodermia Reticulada Pigmentar do rosto e do pescoço, ou a Poi- quilodermia hereditária acroqueratósica; as efélidas; as manchas café com leite, naevus de Sutton; as hiperpigmentações devido a causas metabólicas, tais como hemocromatose, o Mal de Addison, a síndrome de Cushing ou a hipertireose; e as hiperpigmentações devido a causas exógenas, tais como as hiperpigmentações de origem medicamentosa (substâncias, tais como a clorpromazina, as fenotiazinas, a hidantoína, o arsênico inorgânico, os anti- malariais) ou por metais pesados (prata, ouro, mercúrio); as hiperpigmenta- ções pós-inflamatórios induzidas após traumatismos, erupções eczemato- sas, líquen simples crônico, lúpus eritomatoso e dermatoses incluindo pytyri- asis rosea, psoríase, dermatite herpetiforme, eritema pigmentado fixo, e fo- todermatite; a síndrome de Rothmund-Thomson; a acanthosis nigrícans be- nigna ou acanthosis nigrícans maligna. A utilização de um siRNA ou de uma composição, de acordo com a invenção, para a fabricação de um medica- mento permite tratar essas diferentes patologias e fazer desaparecer as zo- nas de hiperpigmentação induzidas por esses distúrbios. Ela permite tam- bém prevenir o aparecimento de zonas de pigmentação induzidas por esses diferentes distúrbios.
A invenção se refere também a um método de tratamento cos- mético destinado à despigmentação e ao embranquecimento da pele, com- preendendo a administração por via tópica de uma composição, de acordo com a invenção.
A invenção se refere, além disso, a um método de tratamento terapêutico das hiperpigmentações da pele, compreendendo a administração por via tópica de uma composição, de acordo com a invenção.
Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção, sem toda- via limitá-la.
Descrição das Figuras
Figura 1. Desenho de 3 siRNA atingindo o exon F da proteína miosina Va humana. A. Seqüência codificante nucleotídica transcritos da proteína miosina Va humana, compreendendo o exon F (compreende os exons ABCDEF). A parte correspondente ao exon F é sublinhada. B. Detalhe da seqüência do exon F. As posições correspondentes aos três siRNA esco- Ihidos são seja sublinhados (siRNA Mio Va n9 2 (SEQ ID N5 3)) seja sobreli- nhados (siRNA Mio Va n9 1 (SEQ ID Ne 2), ou Mio Va n9 3 (SEQ ID N9 4)). C. Estrutura dos 3 siRNA escolhidos que atingem o exon F da proteína miosina Va humana.
Figura 2. Redução da quantidade de transcritos da proteína mio- sina Va comportando o exon F em células MEHP eletroporadas com 2 μΜ de siRNA Mio Va n9 2 (SEQ ID N2 3). Células MEHP foram eletroporadas com 2 μΜ de siRNA controle negativo, de siRNA que atinge o gene GAPDH ou de siRNA Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3). O efeito dos diferentes siRNA é medido no nível ARN por QPCR. A. Nível de expressão relativo do gene GAPDH em função do siRNA eletroporado. B. Nível de expressão dos trans- critos da proteína miosina Va, comportando o exon F em função do siRNA eletroporado.
Figura 3. Redução específica da quantidade de transcritos da proteína miosina Va comportando o exon F, mais não transcritos não com- portando o exon F. A. Nível de expressão relativo dos transcritos da proteína miosina Va1 comportando o exon F em função do siRNA eletroporado. B. Nível de expressão relativo de todos os transcritos da proteína miosina Va por detecção da parte globular (GP) em função do siRNA eletroporado.
Figura 4. Determinação da concentração mínima que tem uma eficácia máxima para os siRNA Mio Va n9 1 (SEQ ID Ns 2) e Mio Va ne 2 (SEQ ID N9 3). Diferentes concentrações de siRNA atingindo o exon F da proteína miosina Va foram testadas para os siRNA A. Mio Va n9 1 (SEQ ID Ns 2) e B. Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3). Para Mio Va n9 2, os resultados estão representados sob a forma de médias com erro padrão.
Figura 5. Efeito da concentração em siRNA sobre a confiabilida- de das células. O nível de expressão relativo dos transcritos que comportam o exon Fea confiabilidade das células foram determinados em paralelo pa- ra diferentes concentrações do siRNA A. Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3). As con- centrações em siRNA são indicadas em abscissa, o nível de expressão rela- tivo dos transcritos que comportam o exon Fea confiabilidade das células em ordenadas, respectivamente sob a forma de um histograma (barras cin- zas) e de uma curva que representa o valor médio e o erro padrão.
Figura 6. Eficácia dos siRNA que atingem o exon F da proteína miosina Va no decorrer do tempo. As células MEHP foram analisadas em diferentes tempos após eletroporação de 0,5 μΜ de siRNA Mio Va n° 1 (SEQ ID N° 2) ou Mio Va n° 2 (SEQ ID N° 3). A. Nível de expressão relativo para Mio Va n9 1 (SEQ ID N°2). B. Nível de expressão relativo para Mio Va ns 2 (SEQ ID N° 3).
Figura 7. Princípio do teste de inibição in vitro da transferência dos melanossomas dos melanócitos para os queratinócitos, pelos siRNA que atingem o exon F da proteína miosina Va humana.
Figura 8. Avaliação da inibição no nível dos transcritos que com- preendem o exon F (transcritos Mio Va exF) e dos transcritos totais da prote- ína miosina Va detectados no nível da parte GP (transcritos Mio Va GP) em MEHP transfectatos com 25nM ou 10 nM de siRNA Mio Va n° 2 (SEQ ID N° 3, exF) ou de oligonucleotídeo BLOCK-iT® Fluorescente oligo (siNEG) e 12 ou 18 μl de reagente HiPerFect. A. Transcritos Mio Va exF, 12 μl de reagen- te HiPerFect. B. Transcritos Mio Va GP, 12 μΙ de reagente HiPerFect C. Transcritos Mio Va exF, 18 μl de reagente HiPerFect. D. Transcritos Mio Va GP1 18 μl de reagentes HiPerFect.
Figura 9. Avaliação da inibição no nível ARN e no nível protéico durante uma experiência a longo prazo (segundo dia, quarto dia, sexto dia, oitavo dia, após transfecção). A. análise por PCR quantitativa em tempo real no nível ARN B. Análise no nível protéico por Western blot com um anticorpo dirigido especificamente contra as isoformas da proteína miosina Va, con- tendo o exon FC. Quantificação estabelecida pelo soft Quantity One Softwa- re com normalização em relação à tubulina, a partir dos resultados brutos.
Figura 10. Avaliação da inibição no nível dos transcritos, com- preendendo o exon F (transcritos Mio Va exF) em MEHP transfectados com o siRNA Mio Va n° 1 (SEQ ID N° 2, exF) ou o oligonucleotídeo BLOCK-iT® Fluorescente oligo (siNEG) e 18 μl de reagente HiPerFect. Exemplos Exemplo 1
Desenho, síntese e estudo de 3 siRNA que atingem o exon F da proteína miosina Va humana
1.1 Desenho e síntese dos 3 siRNA
A seqüência do variante de entrelaçamento da proteína miosina Va humana, compreendendo um exon F (compreende na realidade os exons ABCDEF) está representada na figura 1A .
No meio do exon F1 3 siRNA que atingem o exon F da proteína miosina Va humana foram desenhados e sintetizados, recorrendo aos servi- ço do desenho e síntese de siRNA da sociedade Eurogentec. As partes do exon F das quais esses siRNA são específicos são indicadas na figura 1B.
Os três siRNA foram sintetizados com fragmentos 3' em ressalto de seqüência "TT", conforme representado na figura 1C. Esses três siRNA são denominados na seqüência Mio Va n9 1 (filamento sentido compreende SEQ ID Ns 2), Mio Va ne 2 (filamento sentido compreende SEQ ID Ns 3) ou Mio Va nõ 3 (filamento sentido compreende SEQ ID Ns 4), o número de SEQ ID indicado entre parênteses correspondendo à SEQ do fragmento do exon F da proteína miosina Va humana compreendida no filamento de ARN senti- do do siRNA.
1.2 Teste da eficácia dos siRNA, após eletroporação em mela- nócitos epidérmicos humanos primários (MEHP)
1.2.1 Escolha do programa de eletroporação
Melanócitos epidérmicos humanos primários (MEHP) foram cul- tivados em meio Ham's F10 (Gibco, Invitrogen Ltd. Paisley, UK) suplemen- tado com 2,5 % de soro de bezerro fetal (SBF), 1 % de Ultroser, 5 ng/ml de fator de crescimento básico dos fibroblastos (bFGF), 10 ng/ml de endotelin-1 (ET-1), 0,33 nM de toxina colérica (TC), 0,033 mM de isobutil-metil-xantina (IBMX) e 5,3 nM de 12-O-tetradecanoil forbol-13-acetato (TPA). As células foram cultivadas até uma confluência de 40-70 % e utilizadas entre as pas- sagens 2 e 5.
Em uma primeira etapa, o plasmídeo pMAX-GFP (3 pg) foi utili- zado para testar três programas diferentes de eletroporação dos melanóci- tos, a saber os programas U16, U20 e U24. 500 000 células foram utilizadas por eletroporação. O kit NHEM-Neo Nucleofector (Amaxa, n2 VDP-1 003) para melanócitos humanos epidérmicos normais - Neonatal foi utilizado para todas as eletroporações.
As células eletroporadas em placas T25 foram avaliadas vivas em 24-48 horas sob um microscópio Arcturus (LCM) equipado com um filtro fluorescente capaz de detectar os sinais de fluorescência verde emitidos pe- lo plasmídeo pMAX-GFP.
As células eletroporadas foram também cultivadas sobre lâminas de vidro. 24 horas após eletroporação, as células foram fixadas em metanol gelado e montadas sobre lâminas de vidro com fluido de montagem (DAKO). A análise das células referentes à expressão de sinais de fluorescência foi feito sob um microscópio de fluorescência Zeiss.
Os resultados obtidos sobre as células vivas mostraram que uma quantidade igual de células mortas é observada independentemente do programa de eletroporação, mas que a melhor eficácia de eletroporação é obtida com o programa U24. Os resultados obtidos sobre as células fixadas conformaram que o programa U24 dá a melhor eficácia de eletroporação. O programa U24 foi portanto utilizado na seqüência em todas as outras experi- ências.
1.2.2 Análise preliminar da eficácia do siRNA Mio Va n° 2 (SEQ ID N° 3)
500 000 células MEHP foram eletroporadas com o plasmídeo pMAX-GFP )3 ug) e os seguintes dúplex de siRNA: um controle positivo que atinge o GAPDH marcado FAM (3 ug ou 2 μΜ, Ambion), um controle negati- vo BLOCK-iT® Fluorescente Oligo (Invitrogen), e o dúplex de siRNA Mio Va ns 2 (SEQ ID N° 3) específico do exon F dos gene da proteína miosina Va. O programa U24 foi utilizado para a eletroporação e as células foram recupe- radas 24 horas após eletroporação.
A análise foi em seguida realizada no nível ARN por RT-PCR quantitativa em tempo real (QPCR). Em resumo, após extração de ARN, as amostras foram tratadas com Dnase e o ADNc foi sintetizado, utilizando-se a transcriptase inversa iScript (Biorad). As atrações de QPCR para o exon F da proteína miosina Va (atração sentido: 5' CAGCCTGCAGCACGAGATC 3', SEQ ID NO: 5, atração anti-sentido: 5'TCTTAGGGTCATCTGCATATAATTCCT 3', SEQ ID NO: 6) e o GAPDH foram desenhadas, utilizando-se o programa PrimerExpress 2.0 (Applied Biosystems) com os parâmetros Taqman por defeito, modificando somente a dificuldade de tamanho mínimo do amplicon (75 pb). Os níveis relativos de expressão dos genes foram determinados com auxílio de um teste SYBR verde/ RT-PCR em duas etapas otimizado. O método de comparação dos valores Ct foi aplicado para a quantificação. As reações de PCR foram feitas em um ABI Prism 7 000 Sequence Detection System (Applied Biosystem). Para corrigir as diferenças em quantidade de ARN extraído e em eficácia de síntese do ADNc, os níveis relativos de ex- pressão dos genes foram normalizados em relação à média geométrica de três genes de relacionamento (RPL 13a, SDHA e UBC) que foram utilizados para análises sobre melanócitos (Vandesompele J et al. Genome Biol.: 3: research0034.001 - research0034.001, 2002).
Os resultados obtidos mostram que os siRNA utilizados induzem uma redução de expressão de ARN dos genes atingidos após eletroporação em células MEHP. Com efeito, uma redução de 75 % para o GAPDH (figura 2A) e de 62 % para os transcritos da proteína miosina Va, compreendendo o exon F (figura 2B) foi observada em relação ao controle negativo.
1.2.3 Expressão dos transcritos do gene da proteína miosina Va em células MEHP, após eletroporação com os siRNA Mio Va na 1 (SEQ ID Ne 2), Mio Va n9 2 (SEQ ID Ne 3) ou Mio Va n9 3 (SEQ ID N9 4).
500 000 células MEHP foram eletroporadas com o reagente Nú- cleo Fector sozinho (MOCK), o siRNA alvejante GAPDH (1 μΜ), um siRNA controle negativo, ou um dos três siRNA Mio Va n9 1 (SEQ ID N9 2), Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3), ou Mio Va n9 3 (SEQ ID N9 4) específicos do exon F do gene da proteína miosina Va. O programa U24 foi utilizado para eletropora- ção e as células foram recuperadas 48 horas após eletroporação.
A análise foi em seguida feita no nível ARN por QPCR, conforme descrito anteriormente sobre os transcritos, compreendendo o exon F (detec- ção do exon F) ou sobre o conjuntos dos transcritos, detectando a parte globu- Iar (GP) da proteína miosina Va. As atrações de QPCR para a parte globular (GP) da proteína miosina Va (atração sentido:
5' GCAGTCAATTTGATTCCAGGATT 3', SEQ ID NO:7; atração anti-sentido: 5' TGATCATCATTCAGGTAGTCAGCAT 3', SEQ ID NO:8) foram desenha- das, utilizando o programa PrimerExpress 2.0 (Applied Biosystems), tal co- mo descrito anteriormente.
Para os transcritos que compreendem o exon F da proteína mio- sina Va, inibições de 85 %, 94 % e 60 % foram observadas para os siRNA Mio Va ns 1 (SEQ ID N5 2) Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3), ou Mio Va n9 3 (SEQ ID Ne 4) respectivamente (figura 3A). A inibição máxima foi portanto obtida com o siRNA Mio Va ηδ 2 (SEQ ID Ns 3).
Com referência ao conjunto dos transcritos da proteína miosina Va, detectados pela parte globular (GP)1 inibições de 39 %, 56 % e 0 % fo- ram observados para os siRNA Mio Va ns 1 (SEQ ID Nq 2), Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3) e Mio va n9 3 (SEQ ID N9 4) respectivamente (figura 3B). Essa inibição reduzida pode notadamente ser explicada pelo fato de os siRNA utilizados atingirem especificamente o exon F e não induzem portanto a de- gradação dos transcritos que não compreendem o exon F. 1.2.4 Conclusões
Esses primeiros resultados mostram claramente que é possível reduzir especificamente e de modo significativo a quantidade de transcritos da proteína miosina Va humana que compreende o exon F, utilizando os três siRNA sintetizados, sem afetar para tanto os transcritos que não compreen- dem o exon F.
Os resultados os mais significativos foram obtidos com o siRNA Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3). 1.3 Otimização da concentração de siRNA
1.3.1 Determinação de uma concentração mínima de eficácia máxima.
Com a finalidade de determinar a concentração mínima em siR- NA, permitindo uma eficácia máxima, diferentes concentrações que vão de 0,05 a 2 μΜ foram testadas pelo mesmo protocolo anteriormente descrito. O siRNA controle negativo e o siRNA que atinge o GAPDH foram utilizados a uma concentração de 1 μΜ.
O programa U24 foi utilizado e as células foram analisadas em 48 horas após eletroporação.
A análise foi feita por QPCR conforme anteriormente descrito sobre os transcritos que compreendem o exon F (detecção específica de exon F).
Para o siRNA Mio va ns 1 (SEQ ID N2 2), uma redução em trans- critos, compreendendo o exon F de 47,5%, 31%, 73% e 79% foi observa- da em relação ao controle negativo para as concentrações de 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 e 1 μΜ respectivamente (figura 4A). A melhor eficácia é portanto obtida com uma concentração de 1 μΜ, mas uma inibição quase também eficaz é obtida com as concentrações de 0,25 e 0,5 μΜ.
No que se refere ao siRNA Mio Va n9 2 (SEQ ID N2 3), uma forte redução foi observada em todas as concentrações testadas (figura 4B). A eficácia máxima foi observada para uma concentração de 1 μΜ, mas a inibi- ção obtida com uma concentração de 0,5 μΜ é quase também forte.
Uma concentração ótima em siRNA se situa portanto em torno de 0,5 -1 μΜ.
1.3.2 Influência da concentração em siRNA sobre a confiabilida- de das células.
A influência da concentração em siRNA sobre a confiabilidade das células foi em seguida analisada com o siRNA Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3). Para isso, a mesma faixa de concentrações (0,05 a 2 μΜ) foi testada em paralelo com um teste MTS (Promega Benelux) que permite determinar o número de células confiáveis. As células foram analisadas em 48 horas após eletroporação pelo programa U24.
Os resultados foram representados na figura 5 e mostram que a confiabilidade das células é apenas significativamente reduzida (aproxima- damente 20%) para concentrações em siRNA de 1 ou 2 μΜ. Abaixo de 1 μΜ, a confiabilidade das células é superior a 90 %. 1.3.3 Conclusões
Esses resultados mostram que o efeito dos siRNA que atingem o exon F da proteína miosina Va é dose - dependente, e que uma eficácia máxi- ma pode ser obtida para uma concentração compreendida entre 0,5 e 1 μΜ.
Além disso, abaixo de 1 μΜ, a presença dos siRNA não afetam a confiabilidade das células MEHP.
Uma concentração de 0,5 μΜ parece, portanto ótima, já que ela combina uma forte eficácia e uma forte confiabilidade celular. Essa concen- tração foi utilizada em todas as experiências seguintes descritas abaixo.
1.4 Análise do decorrer do tempo.
Para analisar o efeito no tempo dos siRNA, de acordo com a in- venção, células MEHP eletroporadas com 0,5 μΜ de siRNA, Mio Va ne 1 (SEQ ID Ne 2) ou Mio Va n9 2 (SEQ ID Ns 3) foram analisadas por QPCR conforme anteriormente descrito em 24, 48, 72 e 96 horas após eletropora- ção. As células tratadas com os controles positivo ou negativo (0,5 μΜ) fo- ram analisadas em 48 horas após eletroporação.
Para o siRNA Mio Va n9 1 (SEQ ID Ne 2), a redução em transcri- tos que compreendem o exon F é máxima em 24 horas (mais de 90 %) e diminui em seguida em 48 horas (65 %) e 72 horas (60 %) o nível de ex- pressão retornando ao normal em 96 horas (vide figura 6A).
No que se refere ao siRNA Mio Va ns 2 (SEQ ID N9 3), uma re- dução de mais 85 % foi observada em 24 e 48 horas, que diminui em segui- da em 72 e 96 horas, permanecendo significativa em relação ao controle negativo (figura 6B).
Assim, esses resultados mostram que a eficácia máxima é obti- da em 24 - 48 horas após eletroporação, e que a eficácia do siRNA Mio Va n9 2 (SEQ ID N9 3) é superior no tempo àquela do siRNA Mio Va n9 1 (SEQ ID N9 2).
1.5 Conclusões
Assim, os resultados apresentados acima mostram claramente que é possível reduzir muito fortemente a quantidade de transcritos da prote- ína miosina Va1 compreendendo o exon F, utilizando siRNA que atingem esse Exon F. Três siRNA diferentes foram testados, e cada um desses siR- NA permite reduzir a quantidade de transcritos da proteína miosina Va que compreende o exon F. O siRNA Mio Va ns 1 (SEQ ID N° 2) e sobretudo o siRNA Mio Va n° 2 (SEQ ID N° 3) são particularmente eficazes.
Além disso, o efeito desses siRNA que atingem o exon F da pro- teína miosina Va é dose dependente e pode ser obtido com uma eficácia máxima a uma concentração que não afeta a confiabilidade das células.
A eficácia varia também no decorrer do tempo e é máxima a 24 - 48 horas após eletroporação.
Exemplo 2
Influência da presença de um siRNA que atinge o exon F da proteína miosi- na Va sobre a transferência dos melanossomas dos melanócitos para os gueratinócitos iri vitro.
2.1 Princípio do teste
Afim de testar a influência dos siRNA, de acordo com a invenção, que atinge o exon F da proteína miosina Va sobre a transferência da melanina dos melanócitos para os queratinócitos, um teste in vitro foi desenvolvido.
O princípio desse teste está representado na figura 7.
Melanócitos (MC) humanos normais são ou não eletroporados com um siRNA que atinge o exon F da proteína miosina Va às concentra- ções de 0,1 μΜ; 0,25 μΜ; e 0,5 μΜ. Em seguida, os melanócitos eletropora- dos (siRNA MC) ou não (MC) são cultivados em um meio TFA enriquecido em presença de 2[2-14C]tiouracila, que é incorporado na melanina produzida pelos MC, o que permite obter melanócitos contendo a melanina marcada no 14C (MC* ou siRNA MC*).
Os MC* ou siRNA MC* são colocados em cultura em um meio para queratinócitos sem soro e com um baixo teor em cálcio (K-SFM, Gibco) com queratinócitos (KC) que sofreu 1 ou 2 passagens nesse mesmo meio. Os MC* ou siRNA MC* e os KC são colocados em cultura em uma proporção de 1 para 3.
A co-cultura é em seguida opcionalmente irradiada aos UV para estimular a transferência dos melanossomas dos MC* ou siRNA MC* para os KC. Com efeito, é conhecido que a irradiação pelos UV estimula a transfe- rência dos melanossomas dos malanócitos para os queratinócitos. Após co- cultura irradiação UV eventual, os queratinócitos são radioativos no 14C (KC*) proporcionalmente à quantidade de melanina transferida a partir de MC* ou siRNA MC*.
Em seguida os KC* são purificados por seleção negativa, utili- zando-se a tecnologia MACS (Miltenyi Biotec), com o auxílio de um anticorpo anti-CD117 PE que se fixa sobre os melanócitos e esferas anti-PE.
Enfim, a radioatividade 14C dos KC* purificados é medida.
2.2 Resultados.
Os resultados obtidos mostram que na ausência de eletropora- ção com um siRNA que atinge o exon F da proteína miosina Va, irradiação UV permite estimular eficazmente a transferência da melanina dos melanóci- tos para os queratinócitos.
Ao contrário, em caso de eletroporação com siRNA que atinge o exon F da proteína miosina Va, a quantidade de melanina radioativa no 14C transferida aos queratinócitos após irradiação UV é reduzida em relação ao controle sem eletroporação.
2.3 Conclusões.
Esses resultados mostram claramente que a utilização de siRNA que atinge o exon F da proteína miosina Va permite reduzir a transferência da melanina dos melanócitos para os queratinócitos, validando assim a es- tratégia utilizada pelos inventores para reduzir a pigmentação da pele.
Exemplo 3
Eficácia dos siRNA que atingem o exon F da proteína miosina Va após transfeccão em melanócitos epidérmicos humanos primários (MEHP).
3.1 Transfecção de MEHP com siRNA que atinge exon F da pro- teína miosina Va
3.1.1 Otimização da transfecção com reagentes de transfecção Hiperfect
200 000 MEHP (em 0,5 ml de meio / placa de 6 cavidades) fo- ram transfectados com o siRNA Mio Va nQ 2 (SEQ ID Nq 3) e o oligonucleotí- deo BLOCK-iT® fluorescente oligo (Invitrogen) como controle negativo. Para cada transfecção, 25 nM ou 10 nM de cada siRNA foi utilizado em combina- ção com 12 ou 18 μΙ de reagente Hiperfect (Qiagen).
A avaliação da inibição no nível ARN, seja unicamente para os transcritos que compreendem o exon F (transcritos Mio Va exF), ou para o conjunto dos transcritos da proteína miosina Va detectados no nível da parte GP (transcritos Mio Va GP), foi medida por PCR quantitativa em tempo real conforme descrito anteriormente no parágrafo exemplo 1.2.2.
Os resultados obtidos com 12 μΙ ou 18 μΙ de reagente Hiperfect sobre os transcritos Mio va exF ou Mio Va GP são apresentados na figura 8 e mostram que:
- para os transcritos Mio va exF com 12 μΙ de reagentes Hiper- Fect uma inibição de 80 % e 85 % foi observada para 25 nM e 10 nM de siRNA Mio Va ns 2 (SEQ ID Ns 3) respectivamente (figura 8A);
- para os transcritos Mio Va GP com 12 μΙ de reagente Hiper- Fect, uma inibição de 50 % e 60 % foi observada para 25 nM e 10 nM de siRNA Mio Va ns 2 (SEQ ID Ns 3) respectivamente (figura 8B);
- para os transcritos de Mio Va exF com 12 μΙ de reagentes Hi- perFect uma inibição de 90 % e 85 % foi observada para 25 nM e 10 nM de siRNA Mio Va nQ 2 (SEQ ID Nq 3) respectivamente (figura 8C);
- para os transcritos de Mio Va GP com 18 μΙ de reagentes Hi- perFect uma inibição de 63 % e 58 % foi observada para 25 nM e 10 nM de siRNA Mio Va n9 2 (SEQ ID Ns 3) respectivamente (figura 8D).
3.1.2 Conclusão.
Esses resultados mostram uma inibição significativa e específica do número transcritos de proteína miosina Va, compreendendo o exon F (transcritos Mio Va exF) por transfecção de MEHP com o siRNA Mio Va n- 2 (SEQ ID Ne 3) e o reagente HiperFect. A inibição a mais eficaz é obtida com 25 nM de siRNA ns 2 (SEQ ID N9 3) e 18 μΙ de reagente HiperFect.
Essas condições ótimas são utilizadas em todas as experiências do exemplo 3 descritas abaixo. 3.2 Avaliação da inibição obtida após transfecção de MEHP com o siRNA Mio Va nQ 2 (SEQ ID Ns 3)
3.2.1 avaliação da inibição no nível ARN e no nível protéico du- rante uma experiência a longo prazo.
800 000 MEHP (em 2,5 ml de meio / placa P60) foram transfec- tados com 18 μl de reagente HiperFect e 25 nM de siRNA Mio Va ns 2 (SEQ ID N° 3) ou com 25 nM de oligonucleotídeo BLOCK-iT® fluorescente oligo (controle negativo). O efeito da inibição foi avaliado em um período de 8 di- as. Um terço das células foi utilizado para a purificação de ARN e dois ter- ços das células foram utilizados para purificar os Iisados celulares.
A avaliação da inibição no nível ARN para os transcritos que compreendem o exon F (transcritos Mio Va exF) foi medida por PCR quantitativa em tempo real, conforme descrito anteriormente no parágrafo exemplo 1.2.2.
Para correlacionar a inibição observada no nível ARN com a ex- pressão no nível protéico, um anticorpo policlonal dirigido especificamente contra as isoformas da proteína miosina Va contendo o exon F foi desenvol- vido pela sociedade Eurogentec. A reatividade e a especificidade do anticor- po purificado foram testadas por análise por Western blot e por imunoisto- química.
Em seguida, os Iisados celulares obtidos no decorrer da experi- ência foram analisados por Western blot.
No nível ARN.
Os resultados foram apresentados na figura 9A e mostram que, comparado com os controles negativos, uma redução de 72 %, 81 %, 78 % e 82 % foi observada para os transcritos Mio Va exF nos diferentes pontos no tempo (segundo dia, quarto dia, sexto dia e oitavo dia respectivamente).
No nível protéico.
Os resultados da análise dos Iisados celulares por Western blot nas figuras 9B e C representando respectivamente os resultados brutos do Western blote a quantificação obtida com o programa Quantity One software (Biorad) com normalização em relação à tubulina.
Esses resultados mostram que, em relação aos controles nega- tivos, uma redução de 35 %, 40 %, 70 % e 75 % foi observada para os transcritos Mio Va exF nos diferentes pontos no tempo (segundo dia, quarto dia, sexto dia e oitavo dia respectivamente).
3.2.2 Efeito da inibição induzida pelo siRNA Mio Va exF ne 2 (SEQ ID Ne 3), sobre a localização / distribuição dos melanossomas nos MEHP.
Foi anteriormente mostrado que os transcritos Mio Va exF são implicados na captura dos melanossomas na rede de aquitina subcortical. A inibição dos transcritos Mio Va exF poderia, portanto, resultar em uma captu- ra diminuída dos melanossomas na periferia dos dendritos dos melanócitos, e eventualmente um acúmulo perinuclares dos melanossomas.
Para testar essa hipótese transfecções com 25 nM de siRNA Mio va exF ns 2 (SEQ ID Ns 3) e 25 nM de um siRNA controle negativo foram realizadas sobre 300 000 MEHP inseminados sobre lâminas de vidro redon- das. Os MEHP foram fixados em paraformaldeído 3 % com diferentes pontos no tempo após transfecção (terceiro dia, sexto dia e oitavo dia).
Em seguida, para as experiências de imunoistoquímica, o anti- corpo específico do exon F da proteína miosina Va (diluição 1 / 500) (vide acima) foi utilizado em combinação com um anticorpo monoclonal NKI-beteb (diluição 1 / 40) dirigido contra a proteína (pré)-melanossomal silver (Sanbio B. V., Uden, The Netherlands). A análise foi então feita por microscopia com focai. Resultados:
Terceiro dia, após transfecção.
Nenhuma diferença foi observada na distribuição dos melanos- somas (presentes na periferia e nas extremidades dos dendritos) entre os MEHP transfectados com o siRNA controle negativo e os MEHP transfecta- dos com o siRNA Mio Va exF ns 2 (SEQ ID Nq 3).
Sexto dia após transfecção.
A co-marcação com o anticorpo anti NKI-beteb e o anticorpo anti exon F da proteína miosina Va mostra uma mudança na distribuição dos me- lanossomas nos MEHP transfectados com o siRNA Mio Va exF nQ 2 (SEQ ID N9 3): os melanossomas ficam situados principalmente na zona perinuclear. Além disso, a marcação para as isoformas da proteína miosina que compreen- de o exon F está ausente ou fraca no nível das extremidades dos dendritos.
Oitavo dia após transfecção.
Os mesmos resultados que aqueles observados no sexto dia são observados. Conclusão.
A análise imunoistoquímica de MEHP transfectados pelo siRNA Mio Va exF ns (SEQ ID N9 3) ou por um siRNA controle com o anticorpo anti NKI-beteb e o anticorpo anti exon F da proteína miosina Va permite visualizar o transporte intracelular dos melanossomas (por NKI-beteb) e também detectar a expressão das isoformas da proteína miosina Va contendo o exon F.
Os resultados obtidos permitem concluir que a inibição das iso- formas da proteína miosina Va contendo o exon F leva a uma distribuição anormal dos melanossomas nos MEHP, isto é, uma distribuição perinuclear ao invés de uma localização periférica com presença no nível das extremi- dades dos dendritos nos controles negativos, nos sexto e oitavo dias, após transfecção.
3.3 Confirmação do efeito de inibição dos transcritos Mio Va exF após transfecção de MEHP com o siRNA Mio Va exF ne 1 (SEQ ID Ns 2)
Nessas experiências, um siRNA diferente, a saber o siRNA Mio Va n9 1 (SEQ ID N9 2) foi utilizado para a transfecção dos MEHP, de modo a confirmar que a inibição é bem-específica do exon F da proteína miosina Va e a excluir um efeito não específico de tipo artificial.
3.3.1 Avaliação da inibição no nível ARN e no nível protéico du- rante uma experiência a longo prazo.
A mesma experiência que no parágrafo 3.2.1 foi reproduzida com o siRNA Mio Va n9 1 (SEQ ID N0 2) ao invés do siRNA Mio Va ne (SEQ ID Ne 3).
Os resultados no nível ARN foram apresentados na figura 10 e mostram uma redução de 58 %, 59 %, 41 % e 51 % nos diferentes pontos no tempo (segundo dia, quarto dia, sexto dia e oitavo dia respectivamente).
Além disso, os resultados obtidos no nível protéico estavam em correlação com aqueles obtidos no nível ARN (dados não mostrados). 3.3.2 Efeito da inibição induzida pelo siRNA Mio Va exf n9 1 (SEQ ID Nº 2) sobre a localização / distribuição dos melanossomas nos MEHP.
A mesma experiência a mesma experiência que no parágrafo 3.2.2 foi reproduzida com o siRNA Mio Va ne 1 (SEQ ID N5 2) ao invés do siRNA Mio Va nº 2 (SEQ ID Ne 3) uma distribuição perinuclear dos melanos- somas nos MEHP por comparação nos controles negativos (dados não mos- trados).
3.3.3 Conclusões
Embora a inibição das isoformas da proteína miosina Va com- preendendo o exon F (transcritos Mio Va exF) seja menos eficaz com o siR- NA Mio Va exF n9 1 (SEQ ID N0 2) do que com o siRNA Mio Va exF ne 2 (SEQ ID Nº 3), a expressão dos transcritos Mio Va exF permanece significa- tivamente reduzida, utilizando o siRNA Mio Va exF ns 1 (SEQ ID N- 2), tanto no nível ARN quanto no nível protéico.
Além disso, a análise imunoistoquímica sobre MEHP transfecta- dos fixados revela também uma localização e um transporte perturbados dos melanossomas nos MEHP. Pode-se portanto concluir que a inibição das iso- formas da proteína miosina Va1 compreendendo o exon Feo efeito fenotípi- co observados induzidos pela utilização dos siRNA Mio va exF nQ 1 e 2 (SEQ ID Ng 2 e 3) são específicos e não artefactuais. Exemplo 4
Indução de um efeito fenotípico por inibição a longo prazo dos transcritos da proteína miosina Va, compreendendo o exon F (transcritos Mio va exF).
De modo a se obter em MEHP uma inibição estável a longo pra- zo das isoformas da proteína miosina Va, compreendendo o exon F, vetores Ientivirais expressando pequenos ARN em grampo (short hairpin RNA, ou siRNA) dirigidos contra o exon F da proteína miosina Va foram construídos. 4.1 Materiais e métodos
As seqüências de shRNA foram desenvolvidas a partir da se- qüência siRNA do siRNA o mais eficaz para inibir os transcritos Mio Va exF, isto é, o siRNA Mio Va nõ 2 (compreendendo ARN da seqüência gênica SEQ ID Ne 3). Mais precisamente, um oligonucleotídeo duplo filamento constituído das seqüências a seguir foi sintetizado:
- filamento sentido:
5-GATCGT ATCAATCAT ATCGGATTCTCAAGAGAAATCCGAT ATG ATTGAT AC 77T7T- 3' (SEQ ID NO:15)
- filamento anti-sentido:
5'-AGCTA4AA>4GT ATCAATCAT ATCGG ATTTCTCTTG AG AATCCGAT ATG ATTG AT AC-3' (SEQ ID NO:16),
nas quais
- as partes em negrito correspondem às duas partes comple- mentares do shRNA emparelhadas por ligações de tipo Watson-Crick, cor- respondendo à seqüência ARN da seqüência gênica SEQ ID Ns 3 do fila- mento sentido do siRNA Mio Va ne 2 e sua seqüência complementar;
- a parte de seqüência não modificada corresponde à seqüência da estrutura de tipo grampo de cabelo, ligando os dois filamentos comple- mentares;
- a parte sublinhada corresponde a um fragmento 5' em ressalto, permitindo clonar o oligonucleotídeo duplo filamento em um vetor de expres- são e
- a parte em itálico corresponde a uma seqüência de terminação da transcrição iniciada por um promotor RNApollll tipo Hl.
Esse oligonucleotídeo duplo filamento foi então clonado em um vetor Ientiviral sob controle de um promotor RNApollll tipo Hl.
Isto permite produzir nas células transfectadas shRNA de se- qüência:
5-GUAUCAAUCAUAUCGGAUUCUCAAGAGAAAUCCGAUAUGAUUGAUAC-3' (SEQ ID NO:17),
na qual as partes em negrito correspondem às duas partes com- plementares emparelhadas por ligações de tipo Watson-Crick (correspon- dendo à seqüência ARN da seqüência gênica SEQ ID N5 3 do filamento sen- tido do siRNA Mio Va ne 2 e sua seqüência complementar), e a parte sem modificação corresponde à seqüência da estrutura de tipo grampo de cabelo que liga os dois filamentos complementares.
Vetores lentivirais, expressando shRNAs turvados foram tam- bém gerados para serem utilizados como controle negativo. Nesse caso, as seqüências filamentos sentido e anti sentido do oligonucleotídeo clonado no vetor Ientiviral sobre controle de um promotor RNApollll tipo H1 eram as se- guintes seqüências:
- filamento sentido:
5'- GATCATTATCTAGGAGATATCACCTCAAGAGAGTGATATCTCCTAGATAA7T7TT-3' (SEQ ID NO:18)
- filamento anti sentido:
5'- AGCT A4A44ATT ATCT AGGAGAT ATCACTCTCTTGAGGTGAT ATCTCCT AGAT AAT-3' (SEQ ID N0:19) nas quais
- as partes em negrito correspondem às duas partes comple- mentares do shRNA emparelhadas por ligações de tipo Watson-Crick1 cor- respondendo as bases na desordem da seqüência ARN da seqüência gêni- ca SEQ ID Ne 3 do filamento sentido do siRNA Mio Va ns 2 e sua seqüência complementar;
- a parte de seqüência não modificada corresponde à seqüência da estrutura de tipo grampo de cabelo, ligando os dois filamentos comple- mentares;
- a parte sublinhada corresponde a um fragmento 5' em ressalto, permitindo clonar o oligonucleotídeo duplo filamento em um vetor de expres- são e
- a parte em itálico corresponde a uma seqüência de terminação da transcrição iniciada por um promotor RNApollll tipo Hl.
Isto permite produzir nas células transfectadas dos shRNA de
seqüência:
5'-AUUAUCUAGGAGAUAUCACCUCAAGAGAGUGAUAUCUCCUAGAUAA-3' (SEQ ID N0:20), na qual as partes em negrito correspondem às duas partes comple- mentares emparelhadas por ligações de tipo Watson-Crick (correspondendo às bases na desordem da seqüência ARN gênica SEQ ID N5 3 do filamento sentido do siRNA Mio Va n9 2 e sua seqüência complementar), e a parte sem modificação corresponde à seqüência da estrutura de tipo grampo de cabelo, ligando os dois filamentos complementares.
4.2 Eficácia de transduccão
A eficácia de transducção em MEHP foi determinada por análise por FACS sobre a base da presença de um marcador GFP nos vetores Ienti- virais mencionados acima.
A transducção de 100 000 MEHP com lentivírus em uma multi- plicidade de infecção (Ml) de 10 leva a uma eficácia de transducção de 90 % após duas séries de infecção.
4.3 Avaliação da inibição ao nível ARN e no nível protéico.
Para avaliar o efeito de inibição no nível ARN e no nível protéico, 600 000 MEHP foram transductados em uma Ml de 10 com vetores Ientivi- rais, contendo shRNAs Mio Va exF n9 2 ou shRNAs turvados (controle nega- tivo), respectivamente.
Os resultados mostram, tanto no nível ARN quanto no nível pro- téico, uma forte redução das isoformas da proteína miosina Va1 compreen- dendo o exon F nas células transductadas com os vetores lentivirais, con- tendo shRNAs Mio Va exF n9 2 em relação ao controle negativo.
4.4 Efeito da inibição sobre o transporte dos melanossomas
Em seguida uma análise imunoistoquímica de MEHP transduc- tadas com vetores lentivirais, contendo shRNAs Mio Va exF n9 2 dos shR- NAs turvados (controle negativo) foi realizada. Os resultados mostram uma distribuição perinuclear dos melanossomas com os vetores lentivirais con- tendo shRNAs Mio Va exF n9 2 em relação ao controle negativo.
Esses resultados confirmam os efeitos anteriormente observa- dos em caso de inibição dos transcritos Mio Va exF por utilização de siRNAs sintéticos.
4.5 Efeito da inibição dos transcritos Mio Va exF sobre a transfe- rência da melanina dos melanócitos nos queratinócitos em um modelo 3D de epiderme reconstruído.
50 000 MEHP foram transductados com os vetores lentivirais, expressando os shRNAs Mio Va exF ns 2. Esses MEHP transductados de forma estável foram introduzidos, com 500 000 queratinócitos, em um mode- lo de pelo reconstruída. MEHP transductados de forma estável com vetores lentivirais expressando shRNAs turvados foram utilizados como controles negativos. As peles reconstruídas foram em seguida irradiadas ou não com UV simulando o sol.
A inspeção visual das peles reconstruídas mostra então que ne- nhum aumento da pigmentação não é observada após irradiação no nível das peles contendo MEHP transductados com os vetores lentivirais, expres- sando os shRNAs Mio Va exF ns 2, contrariamente às peles contendo MEHP transductados com os vetores lentivirais expressando os shRNAs turvados. Uma avaliação quantitativa da pigmentação por uma marcação Fontana- Masson e análise de imagem colorimétrica digital permitiu em seguida con- firmar essas observações.
A distribuição dos melanossomas nos melanócitos e nos quera- tinócitos foi em seguida examinada por microscopia eletrônica. Essas análi- ses mostraram uma estimulação da transferência de pigmentos dos melanó- citos para os queratinócitos nas peles reconstruídas irradiadas nos UV, con- tendo MEHP transductados com os vetores lentivirais, expressando os shR- NAs turvados em relação às mesmas peles não irradiadas. Ao contrário, nas peles reconstruídas irradiadas aos UV, contendo MEHP transductados com os vetores lentivirais expressando shRNA Mio Va exF ns 2, só uma transfe- rência reduzida de melanina foi observada em relação às peles controles não irradiadas.
4.6 Conclusões.
Assim, esses resultados demonstram que uma transfecção está- vel de MEHP com vetores lente virais expressando um shRNAs atingindo especificamente o exon F da proteína miosina Va humana permite interferir de forma significativa com a quantidade de transcritos Mio Va exF e de iso- formas da proteína miosina Va, compreendendo o exon F, assim como com o transporte dos melanossomas e sua transferência dos melanócitos para os queratinócitos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> PIERRE FABRE DERMO-COSMETIQUE
<120> siRNA ANTIMIOSiNA VA E DESPIGMENTAÇÃO DA PELE
<130> D23968
<140> PCT/EP2006/069618 <141> 2006-12-12
<150> FR 0512553 <151> 2005-12-12
<160> 20
<170> Versão de patente 3.3
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<223> fragmento do exon F da proteína miosina Va humana
<400> 1
tattttgagg aattatatgc agatgaccct aagaagtatc aatcatatcg gatttccctt tacaaacgga tgatt
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<223> Fragmento do exon F da proteína miosina Va humana <400> 2
tgaccctaag aagtatcaa
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<223> Fragmento do exon F da proteína miosina Va humana <400> 3
gtatcaatca tatcggatt
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> homo sapiens
<220>
<223> Fragmento do exon F da proteína miosina Va humana <400> 4
tcatatcgga tttcccttt
<210> 5 <211> 19 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador senso de amplificação do exon F da proteína miosina Va hu- mana
<400> 5
cagcctgcag cacgagatc 19
<210> 6 <211> 27 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador anti-senso de amplificação do exon F da proteína miosina Va humana
<400> 6
tcttagggtc atctgcatat aattcct 27
<210> 7 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador senso de amplificação da parte GP da proteína miosina Va humana
<400> 7
gcagtcaatt tgattccagg att 23
<210> 8 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador senso de amplificação da parte GP da proteína miosina Va humana
<400> 8
tgatcatcat tcaggtagtc agcat 25
<210> 9 <211> 21 <212> RNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Filamento senso siRNA antimiosina Va n°l
<400> 9
ugacccuaag aaguaucaat t 21
<210> 10 <211> 21 <212> ARN
<213> Seqüência Artificial <220> <223> Filamento anti-senso siRNA antimiosina Va n°l <400> 10
uugauacuuc uuagggucat t 21
<210> 11 <211> 21 <212> RNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Filamento anti-senso siRNA antimiosina Va n°2 <400> 11
guaucaauca uaucggauut t 21
<210> 12 <211> 21 <212> RNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Filamento anti-senso siRNA antimiosina Va n°2 <400> 12
aauccgauau gauugauact t 21
<210> 13 <211> 21 <212> RNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Filamento anti-senso siRNA antimiosina Va n°3 <400> 13
ucauaucgga uuucccuuut t 21
<210> 14 <211> 21 <212> RNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Filamento anti-senso siRNA antimiosina Va n°3 <400> 14
aaagggaaau ccgauaugat t 21
<210> 15 <211> 56 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Filamento senso oligonucleotideo para clonagem dentro de um vetor Ien- tiviral de um shRNA antimiosina Va
<400> 15
gatcgtatca atcatatcgg attctcaaga gaaatccgat atgattgata cttttt 56 <210> 16 <211> 56 <212> DNA <213> Seqüência Artificial
<220> <223> Filamento anti-senso oligonucleotideo para clonagem dentro de um ve- tor lentiviral de iam shRNA antimiosina Va
<400> 16 agctaaaaag tatcaatcat atcggatttc tcttgagaat ccgatatgat tgatac 56
<210> 17 <211> 47 <212> RNA <213> Seqüência Artificial
<220> <223> shRNA antimiosina Va
<400> 17 guaucaauca uaucggauuc ucaagagaaa uccgauauga uugauac 47
<210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Seqüência Artificial
<220> <223> Filamento senso oligonucleotideo para clonagem dentro de um vetor len- tiviral de um shRNA controle turvado
<400> 18 gatcattatc taggagatat cacctcaaga gagtgatatc tcctagataa ttttt 55
<210> 19 <211> 56 <212> DNA <213> Seqüência Artificial
<220> <223> Filamento anti-senso oligonucleotideo para clonagem dentro de um vetor lentiviral de um shRNA controle turvado
<400> 19 agctaaaaaa ttatctagga gatatcactc tcttgaggtg atatctccta gataat 56
<210> 20 <211> 46 <212> RNA <213> Seqüência Artificial
<220> <223> shRNA controle turvado
<400> 20 auuaucuagg agauaucacc ucaagagagu gauaucuccu agauaa 46
Claims (15)
1. siRNA isolado, compreendendo um filamento de ARN sentido e um filamento de ARN anti-sentido complementar que formam juntos um dúplex de ARN1 caracterizado pelo fato de que o filamento de ARN sentido compreende uma seqüência que possui no máximo um nucleotídeo distinto em relação a um fragmento de 14 a 30 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va.
2. siRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o filamento de ARN sentido compreende uma seqüência idêntica a um fragmento de 14 a 30 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotídi- ca do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va.
3. siRNA de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a seqüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va é a seqüência humana SEQ ID N° 1.
4. siRNA de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que esse fragmento de 14 a 30 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va hu- mana é constituído de uma seqüência nucleotídica escolhida dentre SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4.
5. siRNA de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que esse fragmento de 14 a 30 nucleotídeos contíguos da seqüência nucleotídica do exon F do gene codificando para a proteína miosina Va é constituído da seqüência nucleotídica SEQ ID N° 3.
6. siRNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que esse siRNA é um shRNA constituído de uma única molécula de ARN simples filamento na qual duas partes complementares são empare- lhadas por ligações de tipo Watson-Crick e são ligadas de um lado de forma covalente por uma estrutura de tipo grampo de cabelo, na qual esse shRNA compreende ou é constituído da seqüência SEQ ID n° 17.
7. siRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os filamentos de ARN sentido e / ou anti- sentido compreendem, além disso, um fragmento 3' em ressalto de 2 a 4 nu cleotídeos naturais ou modificados de tipo LNA.
8. siRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o filamento de ARN sentido e/ou o filamento de ARN anti-sentido compreende pelo menos uma modificação química no nível de suas partes açúcares, de suas partes nucleobase ou de sua estrutu- ra internucleotídica.
9. siRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser como agente cosmético.
10. siRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -8, caracterizado pelo fato de ser como medicamento.
11. Composição compreendendo pelo menos um siRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de ter um suporte aceitável.
12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- da pelo fato de que é administrada por via tópica.
13. Composição de acordo com a reivindicação 11 ou 12, carac- terizada pelo fato de que compreende pelo menos um outro agente despig- mentador.
14. Utilização de pelo menos um siRNA, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 8, ou de uma composição, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de ser como agente cosmético para a despigmentação ou o embranquecimento da pele.
15. Utilização de pelo menos um siRNA, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 8, ou de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento ou à preven- ção da hiperpigmentação da pele.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0512553A FR2894582B1 (fr) | 2005-12-12 | 2005-12-12 | Sirna anti myosine va et depigmentation de la peau |
| FR0512553 | 2005-12-12 | ||
| PCT/EP2006/069618 WO2007068704A1 (fr) | 2005-12-12 | 2006-12-12 | Sirna anti myosine va et depigmentation de la peau |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0619738A2 true BRPI0619738A2 (pt) | 2011-10-11 |
Family
ID=36617133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0619738-8A BRPI0619738A2 (pt) | 2005-12-12 | 2006-12-12 | sirna isolado, compreendendo um filamento de arn sentido e um filamento de arn anti-sentido complementar que formam juntos um dúplex de arn, composição compreendendo pelo menos um sirna e utilização do mesmo |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7999096B2 (pt) |
| EP (2) | EP2264171A1 (pt) |
| JP (1) | JP2009518022A (pt) |
| KR (1) | KR20080079298A (pt) |
| CN (1) | CN101326286A (pt) |
| AT (1) | ATE484585T1 (pt) |
| AU (1) | AU2006325359A1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0619738A2 (pt) |
| CA (1) | CA2632837A1 (pt) |
| DE (1) | DE602006017586D1 (pt) |
| DK (1) | DK1963507T3 (pt) |
| ES (1) | ES2351996T3 (pt) |
| FR (1) | FR2894582B1 (pt) |
| HR (1) | HRP20100666T1 (pt) |
| IL (1) | IL191728A0 (pt) |
| MA (1) | MA30034B1 (pt) |
| NO (1) | NO20083089L (pt) |
| PL (1) | PL1963507T3 (pt) |
| PT (1) | PT1963507E (pt) |
| RU (1) | RU2008125041A (pt) |
| TN (1) | TNSN08252A1 (pt) |
| WO (1) | WO2007068704A1 (pt) |
| ZA (1) | ZA200805739B (pt) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019144209A1 (pt) | 2018-01-24 | 2019-08-01 | Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul | Composição farmacêutica nanométrica de liberação de moléculas de rna de interferência e uso da mesma |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4981381B2 (ja) * | 2006-08-04 | 2012-07-18 | 株式会社ナリス化粧品 | 美白用皮膚外用剤 |
| EP2105145A1 (en) * | 2008-03-27 | 2009-09-30 | ETH Zürich | Method for muscle-specific delivery lipid-conjugated oligonucleotides |
| KR101494375B1 (ko) * | 2008-09-10 | 2015-02-17 | 엘브이엠에이취 러쉐르쉐 | 피부 또는 헤어의 색소침착 연구 또는 조절에 유용한 방법, 화장 관리 방법 및 조성물용 식물 추출물 |
| JP2012502991A (ja) | 2008-09-22 | 2012-02-02 | アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション | 皮膚適用におけるｒｎａ干渉 |
| EP3560503B1 (en) | 2010-03-24 | 2021-11-17 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Rna interference in dermal and fibrotic indications |
| WO2011133876A2 (en) * | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs |
| US9295631B2 (en) | 2012-02-13 | 2016-03-29 | Conopco, Inc. | Skin lightening composition |
| CN102925443A (zh) * | 2012-11-01 | 2013-02-13 | 东北师范大学 | 靶向沉默MyoⅩ的序列制备及其载体的构建 |
| KR102506169B1 (ko) * | 2014-09-05 | 2023-03-08 | 피오 파마슈티칼스 코프. | Tyr 또는 mmp1을 표적화하는 핵산을 사용한 노화 및 피부 장애의 치료 방법 |
| CN105560635A (zh) * | 2015-09-17 | 2016-05-11 | 张名静 | 一种治疗黑色棘皮病的中药 |
| WO2018195355A1 (en) | 2017-04-19 | 2018-10-25 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Topical delivery of nucleic acid compounds |
| EP3999523A4 (en) * | 2019-07-18 | 2023-08-16 | Olipass Corporation | MELANOPHILIN ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES |
| US20220267778A1 (en) * | 2019-07-30 | 2022-08-25 | Shionogi & Co., Ltd. | Nucleic acid drug targeting murf1 |
| EP4674965A1 (en) * | 2023-03-02 | 2026-01-07 | Tuojie Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Sirna targeting inhibin ?e, sirna conjugate, and medical use thereof |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2772607B1 (fr) | 1997-12-19 | 2000-02-04 | Oreal | Utilisation de derives amides d'amino phenol comme agents depigmentants |
| GB9903216D0 (en) | 1999-02-13 | 1999-04-07 | Zylepsis Ltd | Preservative compounds,compositions and methods of making and using the same |
| NZ513452A (en) | 1999-03-22 | 2004-03-26 | Pfizer | Resorcinol derivatives |
| HN2000000033A (es) | 1999-03-22 | 2001-02-02 | Pfizer Prod Inc | Composicion de resorcinol |
| FR2804960B1 (fr) | 2000-02-11 | 2005-06-24 | Lvmh Rech | Nouveaux oligonucleotides et utilisation d'oligonucleotides modulant l'expression de la tyrosinase et de la tyrosinase- related-protein 1 comme agents depigmentants |
| US7504385B2 (en) * | 2003-12-17 | 2009-03-17 | Avon Products, Inc. | si-RNA-mediated gene silencing technology to inhibit tyrosinase and reduce pigmentation |
| FR2864539B1 (fr) | 2003-12-30 | 2012-10-26 | Lvmh Rech | Oligonucleotide et son utilisation pour moduler l'expression de la proteine-kinase c isoforme beta-1 comme agent de depigmentation cutanee |
| CN101052717A (zh) * | 2004-05-11 | 2007-10-10 | α基因株式会社 | 诱发rna干扰的多核苷酸以及使用该多核苷酸的基因表达抑制方法 |
-
2005
- 2005-12-12 FR FR0512553A patent/FR2894582B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-12-12 JP JP2008543854A patent/JP2009518022A/ja active Pending
- 2006-12-12 PL PL06830566T patent/PL1963507T3/pl unknown
- 2006-12-12 RU RU2008125041/13A patent/RU2008125041A/ru not_active Application Discontinuation
- 2006-12-12 BR BRPI0619738-8A patent/BRPI0619738A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-12-12 US US12/086,242 patent/US7999096B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-12 DK DK06830566.3T patent/DK1963507T3/da active
- 2006-12-12 AT AT06830566T patent/ATE484585T1/de active
- 2006-12-12 DE DE602006017586T patent/DE602006017586D1/de active Active
- 2006-12-12 EP EP10172940A patent/EP2264171A1/fr not_active Withdrawn
- 2006-12-12 PT PT06830566T patent/PT1963507E/pt unknown
- 2006-12-12 WO PCT/EP2006/069618 patent/WO2007068704A1/fr not_active Ceased
- 2006-12-12 CA CA002632837A patent/CA2632837A1/fr not_active Abandoned
- 2006-12-12 EP EP06830566A patent/EP1963507B1/fr active Active
- 2006-12-12 ES ES06830566T patent/ES2351996T3/es active Active
- 2006-12-12 CN CNA2006800465110A patent/CN101326286A/zh active Pending
- 2006-12-12 AU AU2006325359A patent/AU2006325359A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-12 HR HR20100666T patent/HRP20100666T1/hr unknown
- 2006-12-12 KR KR1020087016595A patent/KR20080079298A/ko not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-05-27 IL IL191728A patent/IL191728A0/en unknown
- 2008-06-06 MA MA31010A patent/MA30034B1/fr unknown
- 2008-06-11 TN TNP2008000252A patent/TNSN08252A1/en unknown
- 2008-07-01 ZA ZA200805739A patent/ZA200805739B/xx unknown
- 2008-07-10 NO NO20083089A patent/NO20083089L/no not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019144209A1 (pt) | 2018-01-24 | 2019-08-01 | Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul | Composição farmacêutica nanométrica de liberação de moléculas de rna de interferência e uso da mesma |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1963507B1 (fr) | 2010-10-13 |
| ES2351996T3 (es) | 2011-02-14 |
| CA2632837A1 (fr) | 2007-06-21 |
| DK1963507T3 (da) | 2011-01-03 |
| HRP20100666T1 (hr) | 2011-03-31 |
| EP1963507A1 (fr) | 2008-09-03 |
| AU2006325359A1 (en) | 2007-06-21 |
| FR2894582A1 (fr) | 2007-06-15 |
| PT1963507E (pt) | 2010-11-24 |
| PL1963507T3 (pl) | 2011-04-29 |
| WO2007068704A1 (fr) | 2007-06-21 |
| TNSN08252A1 (en) | 2009-10-30 |
| NO20083089L (no) | 2008-07-10 |
| KR20080079298A (ko) | 2008-08-29 |
| US20090239934A1 (en) | 2009-09-24 |
| EP2264171A1 (fr) | 2010-12-22 |
| AU2006325359A2 (en) | 2008-07-31 |
| RU2008125041A (ru) | 2010-01-20 |
| ZA200805739B (en) | 2009-07-29 |
| CN101326286A (zh) | 2008-12-17 |
| FR2894582B1 (fr) | 2008-02-22 |
| JP2009518022A (ja) | 2009-05-07 |
| ATE484585T1 (de) | 2010-10-15 |
| DE602006017586D1 (de) | 2010-11-25 |
| MA30034B1 (fr) | 2008-12-01 |
| US7999096B2 (en) | 2011-08-16 |
| IL191728A0 (en) | 2011-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2850186B1 (en) | Compositions and methods for modulating smn gene family expression | |
| ES2585829T3 (es) | Tratamiento de las enfermedades relacionadas con la proteína tumoral 63 (p63) por inhibición de transcripción antisentido natural a p63 | |
| KR101900588B1 (ko) | hsp47 발현의 조절 | |
| JP6836988B2 (ja) | Ｈａｏ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ））遺伝子の発現の阻害のための組成物および方法 | |
| RU2687223C2 (ru) | Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1 | |
| CN102014859B (zh) | 抑制黑素生成的新组合物及其应用 | |
| BRPI0619738A2 (pt) | sirna isolado, compreendendo um filamento de arn sentido e um filamento de arn anti-sentido complementar que formam juntos um dúplex de arn, composição compreendendo pelo menos um sirna e utilização do mesmo | |
| BR112015029276B1 (pt) | Agente de irna fita dupla capaz de inibir a expressão de tmprss6, composição farmacêutica e uso dos mesmos | |
| TWI694080B (zh) | 抑制ａｌａｓ１基因表現的組合物及方法 | |
| TW201249991A (en) | Modulation of TIMP1 and TIMP2 expression | |
| PT2049664E (pt) | Oligonucleotídeos de cadeia simples complementares dos elementos repetitivos para tratar perturbações genéticas associadas à instabilidade das repetições do adn | |
| CA3161513A1 (en) | Antisense oligonucleotide targeting linc00518 for treating melanoma | |
| EP2184352B1 (en) | Double-stranded nucleic acid molecule, cancer cell proliferation inhibitor and pharmaceutical agent suitable for prevention or treatment of uterine cancer, breast cancer and bladder cancer | |
| HK1121778A (en) | Anti-myosin va sirna and skin depigmentation | |
| WO2025253282A1 (en) | Small interfering nucletides (sioligo) for the treatment of cole-carpenter syndrome (ccs) | |
| WO2025128816A1 (en) | Methods of modulating expression of ube3a gene | |
| HK40058745A (en) | Compositions and methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A 6A ANUIDADE. |
|
| B08K | Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6 PUBLICADO NA RPI 2206 DE 16/04/2013. |