BRPI0616211A2 - mÉtodos para o diagnàstico de cÂncer pancreÁtico - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA O DIAGNàSTICO DE CÂNCER PANCREÁTICO. A presente invenção fornece um método de identificação da origem de uma metástase de origem desconhecida por obtenção de uma amostra que contém células metastáticas; medida de biomarcadores associados a pelo menos dois carcinomas diferentes; combinação dos dados dos biomarcadores em um algoritmo, em que o algoritmo normaliza os biomarcadores contra uma referência; e imposição de um valor de corte que otimiza a sensibilidade e a especificidade de cada biomarcador, pondera a prevalência dos carcinomas e seleciona um tecido de origem, determinando a origem com base na probabilidade mais elevada determinada pelo algoritmo, ou determinando que o carcinoma não é derivado de um conjunto de carcinomas em particular; e, opcionalmente, a medida de biomarcadores específicos para um ou mais carcinomas diferentes adicionais, e repetição das etapas para biomarcadores adicionais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA O DIAGNÓSTICO DE CÂNCER PANCREÁTICO".CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos de diagnóstico de câncer pancreático.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O câncer pancreático é uma doença mortal que tem uma taxa demortalidade nos Estados Unidos de mais de 27.000 pessoas por ano (Lille-moe e cols. (2000)). Cerca de 85% das pessoas diagnosticadas com a do-ença têm metástase ou disseminação da doença fora do pâncreas e sãoquase impossíveis de serem curadas com ressecção cirúrgica. Caso o cres-cimento seja encontrado mais cedo, ele pode ser ressecado com uma chan-ce de cura bem maior. Apenas 20% dos tumores são ressecáveis, e os be-nefícios em termos de sobrevida dos regimes aprovados de quimioterapiasão pobres, e as chances de uma cura são normalmente de 25% ou menos(Kroep e cols. (1999), Wiesenauer e cols. (2003), Ros e cols. (2001), Ryu ecols. (2002) e Ito e cols. (2001)). O diagnóstico precoce é necessário paraum tratamento precoce bem sucedido.

Apesar dos avanços nos métodos diagnósticos de imagem, co- mo a ultra-sonografia (US), a ultra-sonografia endoscópica (USE), tomogra-fia computadorizada (TC) em espiral de dupla fase, o exame de ressonânciamagnética nuclear (RMN), colangiopancreatografia endoscópica retrógrada(CPER) e aspiração com agulha fina transcutânea ou guiada por USE (AAF),a distinção entre o carcinoma pancreático e doenças pancreáticas benignas,especialmente a pancreatite crônica, é difícil por causa das similaridades emtermos de características radiológicas e de imagem e da ausência de sinto-mas clínicos específicos para o carcinoma pancreático.

Foram dirigidos esforços substanciais para o desenvolvimentode ferramentas úteis para o diagnóstico precoce de carcinomas pancreáti-cos. No entanto, um diagnóstico definitivo depende freqüentemente de cirur-gia exploratória que inevitavelmente é realizada após a doença ter avançadoalém do ponto em que o tratamento precoce pode ser realizado(20060029987).

As neoplasias do pâncreas exócrino podem surgir de célulasductais, acinares e estromais. Oitenta por cento dos carcinomas pancreáti-cos são derivados do epitélio ductal; 60% desses tumores estão localizadosna cabeça do pâncreas, 10% na cauda e 30% estão situados no corpo dopâncreas ou são difusos (Warshau e cols. (1992)). Histologicamente, essestumores são graduados como bem diferenciados, moderadamente diferenci-ados e pouco diferenciados. Alguns tumores são classificados como adeno-escamosos, mucinosos, indiferenciados ou indiferenciados com células gi-gantes semelhantes a osteoblastos (Gibson e cols. (1978)).

Foram apresentados vários perfis de expressão gênica e mar-cadores genéticos relacionados ao câncer pancreático (20050009067,20040219572 e 20030212264).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 revela dados de microarranjo que mostram as inten-sidades de dois genes em um painel de tecidos. (A) antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA). (B) fator V da coagulação (F5). Os gráficos debarras mostram a intensidade no eixo y e o tecido no eixo x. Panc Ca, cân-cer pancreático; Panc N, pâncreas normal.

A Figura 2 revela eletroferogramas obtidos por um Agilent Bioa-nalyzer. O RNA foi isolado de tecido FFPE (fixado em formalina e embebidoem parafina) com o uso de uma digestão com proteinase K por três horas(A) ou dezesseis horas (Β). A amostra C22 (vermelho) era um bloco com umano, enquanto a amostra C23 (azul) era um bloco com cinco anos. Uma es-cala de tamanho é mostrada em verde.

A Figura 3 revela uma comparação de valores de Ct obtidos portrês métodos de qRTPCR diferentes: iniciação com hexâmeros randômicosna transcrição reversa, seguida por qPCR com o cDNA resultante (etapa RH2), iniciação com especificidade gênica (iniciador reverso) na transcrição re-versa, seguida por qPCR com o cDNA resultante (etapa GSP 2) ou iniciaçãocom especificidade gênica e qRTPCR em uma reação em uma única etapa(etapa GSP 1). O RNA de onze amostras foi dividido nos três métodos, e osníveis de RNA para três genes foram medidos: β-actina (A), HUMSPB (B) eTTF (C). O valor médio de Ct obtido com cada método é indicado pela linhasólida.

A Figura 4 revela a otimização do ensaio. (A e B) Eletrofero-gramas obtidos por um Agilent Bioanalyzer. O RNA foi isolado de tecido FF-PE com o uso de uma digestão com proteinase K por três horas (A) ou de-zesseis horas (Β). A amostra C22 (vermelho) era um blocó com um ano, en-quanto a amostra C23 (azul) era um bloco com cinco anos. Uma escala detamanho é mostrada em verde. (C e D) A comparação de valores de Ct obti-dos por três métodos de qRTPCR diferentes: iniciação com hexâmeros ran-dômicos na transcrição reversa, seguida por qPCR com o cDNA resultante(etapa RH 2), iniciação com especificidade gênica (iniciador reverso) natranscrição reversa, seguida por qPCR com o cDNA resultante (etapa GSP2), ou iniciação com especificidade gênica e qRTPCR em uma reação emuma única etapa (etapa GSP 1). O RNA de onze amostras foi dividido nostrês métodos, e os níveis de RNA para dois genes foram medidos: β-actina(C), HUMSPB (D). O valor de Ct médio obtido com cada método é indicadopela linha sólida.

A Figura 5 é um gráfico que mostra os níveis de expressão rela-tivos do painel de 10 marcadores através de 239 amostras. Vermelho indicamaior expressão.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Um biomarcador é constituído por quaisquer indícios do nívelde expressão de um gene marcador indicado. Os indícios podem ser diretosou indiretos, e medem a super- ou subexpressão do gene considerando osparâmetros fisiológicos e em comparação com um controle interno, tecidonormal ou outro carcinoma. Biomarcadores incluem, sem limitação, ácidosnucléicos (tanto super- quanto subexpressão, e direta e indireta). O uso deácidos nucléicos como biomarcadores pode incluir qualquer método conhe-cido na técnica, incluindo, sem limitação, a medida da amplificação de DNA,RNA, micro RNA, perda de heterozigosidade (LOH), polimorfismos de nucle-otídeo único (SNPs, Brookes (1999)), DNA microssatélite, hipo- ou hiperme-tilação de DNA. O uso de proteínas como biomarcadores pode incluir qual-quer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, a medida daquantidade, atividade, modificações, tais como glicosilação, fosforilação, ri-bosilação de ADP, ubiqüitinação etc., imunoistoquímica (IHC). Outros bio-marcadores incluem marcadores de imagens, de contagem de células e deapoptose.

Os genes indicados aqui fornecidos são aqueles associados aum tipo de tumor ou tecido em particular. Um gene marcador pode estar as-sociado a vários tipos de câncer, mas, desde que a expressão do gene este-ja suficientemente associada a um tipo de tumor ou tecido a ser identificadocom o uso do algoritmo aqui descrito para ser específico para uma origemem particular, o gene pode ser usado na invenção reivindicada para deter-minar o tecido de origem para um carcinoma de origem primária desconhe-cida (CUP). Vários genes associados a um ou mais cânceres são conheci-dos na técnica. A presente invenção fornece genes marcadores preferidos ecombinações de genes marcadores ainda mais preferidas, que serão aquidescritos detalhadamente.

Origem", como presente em 'tecido de origem', significa o tipode tecido (pulmão, cólon etc.) ou o tipo histológico (adenocarcinoma, carci-noma de células escamosas etc.) dependendo da circunstância médica es-pecífica, e será entendido por aqueles habilitados na técnica.

Um gene marcador corresponde à seqüência designada por umN9 ID. DE SEQ. quando ele contiver aquela seqüência. Um segmento oufragmento gênico corresponde à seqüência desse gene quando ele contiver uma porção daquela seqüência citada, ou seu complemento suficiente paradistingui-la como sendo a seqüência do gene. Um produto da expressão gê-nica corresponde a essa seqüência quando seu RNA, mRNA ou cDNA hibri-diza para a composição que possui tal seqüência (por exemplo, uma sonda)ou, no caso de um peptídeo ou uma proteína, ele é codificado por esse mR-NA. Um segmento ou fragmento de um produto da expressão gênica corres-ponde à seqüência desse gene ou desse produto da expressão gênicaquando ele contiver uma porção do produto da expressão gênica citado, ouseu complemento suficiente para distingui-la como sendo a seqüência dogene ou do produto da expressão gênica.

Os métodos da invenção, composições, artigo e kits descritos ereivindicados nesta especificação incluem um ou mais genes marcadores. Otermo "marcador" ou "gene marcador" é usado ao longo desta especificaçãopara se referir aos genes e aos produtos da expressão gênica que corres-pondem a qualquer gene cuja super- ou subexpressão está associada a umtipo de tumor ou tecido. Os genes marcadores preferidos são descritos commais detalhes nas Tabelas 1 e 15.

Tabela 1

Painel de CUP

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A presente invenção fornece um método de diagnóstico de cân-ceres pancreáticos. Dessa forma, a presente invenção fornece métodos paraa determinação do direcionamento da terapia pela identificação de câncerespancreáticos de um modo potencialmente precoce o suficiente para evitarressecção e, assim, permitir regimes quimioterápicos.

A presente invenção fornece ainda uma composição que con-tém pelo menos uma seqüência isolada selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos:39-41 e 43-45. A presente invenção fornece ainda kits para a realização deum ensaio de acordo com os métodos aqui apresentados e que ainda con-tém reagentes de detecção do biomarcador.

A presente invenção fornece ainda métodos para a medida daexpressão gênica por geração dos amplicons dos IDS. DE SEQ. Nos: 42 e 46para determinar a expressão gênica e comparação dos níveis de pelo menosum desses amplicons com a expressão gênica em tecido normal para diag-nóstico câncer pancreático.

A presente invenção fornece ainda microarranjos ou chips gêni-cos para a realização dos métodos aqui descritos.

A presente invenção fornece ainda portfólios diagnósti-cos/prognósticos que contêm seqüências isoladas de ácidos nucléicos, seuscomplementos, ou porções destas, de uma combinação de genes, como a-qui descrito, em que a combinação é suficiente para medir ou caracterizar aexpressão gênica em uma amostra biológica que possui células metastáticasem relação às células de diferentes carcinomas ou de tecido normal.

Qualquer método descrito na presente invenção pode ainda in-cluir a medida da expressão de pelo menos um gene expresso constitutiva-mente na amostra.

De preferência, os marcadores para câncer pancreático são fa-tor V da coagulação (F5), antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), in-tegrina, β6 (ITGB6), calicreína 10 (KLK10), claudina 18 (CLDN18), isoformatrio (TR10), e proteína hipotética FLJ22041, similar às proteínas de ligaçãoFK506 (FKBP10). De preferência, os biomarcadores para F5 e PSCA sãomedidos juntos. Os biomarcadores para ITGB6, KLK10, CLDN18, TR10 eFKBP10 podem ser medidos em adição ou no lugar de F5 e/ou PSCA. F5 édescrito, por exemplo, por 20040076955; 20040005563; e WO 2004031412.PSCA é descrito, por exemplo, por W01998040403; 20030232350; e WO2004063355. ITGB6 é descrito, por exemplo, por WO 2004018999; e6339148. KLK10 é descrito, por exemplo, por WO 2004077060; e20030235820. CLDN18 é descrito, por exemplo, por WO 2004063355; e WO2005005601. TR10 é descrito, por exemplo, por 20020055627. FKBP10 édescrito, por exemplo, por WO 2000055320.A invenção ainda fornece um método para a formulação de umprognóstico pela determinação da presença de câncer pancreático de acor-do com os métodos aqui descritos, e identificação do seu prognóstico cor-respondente.

A invenção ainda fornece um método para o encontro de bio-marcadores que compreende a determinação do nível de expressão de umgene marcador de um uma metástase em particular, a medição de um bio-marcador para o gene marcador para determinar sua expressão, a análiseda expressão do gene marcador de acordo com os métodos aqui descritos,e a determinação de se o gene marcador é efetivamente específico paracâncer pancreático.

A invenção ainda fornece composições que compreendem pelomenos uma seqüência isolada selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 39-46.

A invenção ainda fornece kits, artigos, microarranjos ou chipgênico, portfólios diagnósticos/prognósticos para a realização dos ensaiosaqui descritos e relatórios de pacientes para o registro dos resultados obti-dos pelos presentes métodos.

Verificou-se que simples presença ou ausência de seqüênciasespecíficas de ácidos nucléicos em uma amostra de tecido raramente possuivalor diagnóstico ou prognóstico. As informações sobre a expressão de vá-rias proteínas, peptídeos ou mRNA, por outro lado, são consideradas cadavez mais importantes. A simples presença de seqüências de ácidos nucléi-cos que possuem o potencial para expressar proteínas, peptídeos ou mRNA(tais seqüências sendo citadas como "genes") dentro do genoma por si sónão é determinante para definir se uma proteína, um peptídeo ou um mRNAé expresso em certa célula. Se certo gene é ou não capaz de expressar pro-teínas, peptídeos ou mRNA, e em que extensão essa expressão ocorre, ca-so ocorra, é determinado por diversos fatores complexos. Independentemen-te das dificuldades na compreensão e avaliação desses fatores, a avaliaçãoda expressão gênica pode gerar informações úteis sobre a ocorrência deeventos importantes como, por exemplo, tumorigênese, metástases, apopto-se e outros fenômenos clinicamente relevantes. Indicações relativas ao grauno qual os genes são ativos ou inativos podem ser encontradas em perfis deexpressão gênica. Os perfis de expressão gênica desta invenção são usa-dos para gerar um diagnóstico e tratar pacientes com CUP.

Nos métodos acima, a amostra pode ser preparada por qual-quer método conhecido na técnica incluindo, sem limitação, preparação detecido em massa e microdissecção por captura a laser. A preparação de te-cido em massa pode ser obtida, por exemplo, a partir de uma biópsia ou es-pécime cirúrgico.

Nos métodos acima, a medida da expressão gênica tambémpode incluir a medida do nível de expressão de pelo menos um gene ex-presso constitutivamente na amostra.

Nos métodos acima, a especificidade é, de preferência, de pelomenos cerca de 40%, e uma sensibilidade de pelo menos cerca de 80%.

Nos métodos acima, os níveis de corte predeterminados são desuper- ou subexpressão de pelo menos cerca de 1,5 vez na amostra em re-lação às células benignas ou ao tecido normal.

Nos métodos acima, os níveis de corte predeterminados possu-em pelo menos uma superexpressão de valor ρ estatisticamente significativona amostra que possui células metastáticas em relação às células benignasou ao tecido normal, de preferência, o valor ρ é de menos de 0,05.

Nos métodos acima, a expressão gênica pode ser medida porqualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, em um mi-croarranjo ou chip gênico, amplificação de ácido nucléico realizada por rea-ção em cadeia de polimerase (PCR), por exemplo, reação em cadeia de po-limerase por transcrição reversa (RT-PCR), a medida ou a detecção de umaproteína codificada pelo gene, por exemplo, um anticorpo específico para aproteína ou por medida de uma característica do gene, por exemplo, amplifi-cação de DNA, metilação, mutação e variação alélica. O microarranjo podeser, por exemplo, um arranjo de cDNA ou um arranjo de oligonucleotídeo.Todos esses métodos podem ainda conter um ou mais reagentes de contro-le interno.

A presente invenção fornece um método de geração de um re-latório prognóstico de um paciente com câncer pancreático pela determina-ção dos resultados de qualquer um dos métodos aqui descritos, e prepara-ção de um relatório que apresenta os resultados e os relatórios de pacientespor ele gerados. O relatório pode ainda conter uma avaliação do resultadofinal do paciente e/ou da probabilidade de risco em relação à população depacientes.

A preparação da amostra requer a coleta de amostras do paci-ente. As amostras do paciente usadas no método da invenção são aquelassuspeitas de conter células doentes, por exemplo, células retiradas de umnódulo em um aspirado com agulha fina (AAF) de tecido. A preparação detecido em massa obtida a partir de uma biópsia ou de um espécime cirúrgicoe por microdissecção por captura a laser também é adequada para uso. Atecnologia de microdissecção por captura a laser (LCM) é uma forma de se-lecionar as células a serem estudadas, minimizar a variabilidade causadapor heterogeneidade de tipo de célula. Conseqüentemente, podem ser facil-mente detectadas alterações moderadas ou pequenas na expressão do ge-ne marcador entre células normais ou benignas e células cancerosas. Asamostras também podem compreender células epiteliais circulantes extraí-das do sangue periférico. Essas podem ser obtidas de acordo vários méto-dos, mas o método mais preferido é a técnica de separação magnética des-crita em 6136182. Após a obtenção da amostra que contém as células deinteresse, é obtido um perfil de expressão gênica com o uso de um biomar-cador, para genes nos portfólios apropriados.

Métodos preferidos para o estabelecimento de perfis de expres-são gênica incluem a determinação da quantidade de RNA que é produzidapor um gene que pode codificar uma proteína ou um peptídeo. Isso pode serfeito por PCR com transcriptase reversa (RT-PCR), RT-PCR competitiva,RT-PCR em tempo real, RT-PCR por exibição diferencial, análise NorthernBlot e outros testes relacionados. Embora sejas possível efetuar essas téc-nicas com o uso de reações de PCR individuais, é melhor amplificar DNAcomplementar (cDNA) ou RNA complementar (cRNA) produzidos a partir demRNA e analisá-lo por meio de microarranjo. Diversas configurações e mé-todos diferentes de arranjo para sua produção são conhecidos por aqueleshabilitados na técnica, e são descritos, por exemplo, em 5445934, 5532128,5556752, 5242974, 5384261, 5405783, 5412087, 5424186, 5429807,5436327, 5472672, 5527681, 5529756, 5545531, 5554501, 5561071,5571639, 5593839, 5599695, 5624711,5658734 e 5700637.

Tecnologia de microarranjo permite a medida do nível de mRNAem estado estacionário de milhares de genes simultaneamente apresentan-do, dessa forma, uma ferramenta poderosa para a identificação de efeitoscomo o surgimento, interrupção ou modulação da proliferação celular des-controlada. Atualmente, duas tecnologias de microarranjo são amplamenteusadas. A primeira são arranjos de cDNA, e a segunda são arranjos oligonu-cleotídeos. Embora existam diferenças na construção desses chips, pratica-mente toda a análise de dados abaixo e os resultados são iguais. Os produ-tos dessas análises são tipicamente medidas da intensidade do sinal recebi-do por uma sonda marcada usada pra detectar uma seqüência de cDNA daamostra que hibridiza para uma seqüência de ácidos nucléicos em uma loca-lização conhecida no microarranjo. Tipicamente, a intensidade do sinal éproporcional à quantidade de cDNA e, portanto, de mRNA, expressa nascélulas da amostra. Várias dessas técnicas estão disponíveis e são úteis.Métodos preferidos para a determinação da expressão gênica podem serencontrados em 6271002, 6218122, 6218114 e 6004755.

A análise dos níveis de expressão é feita comparando-se essasintensidades de sinal. A melhor forma para fazer essa comparação é porgeração de uma matriz de proporção das intensidades de expressão gênicaem uma amostra de teste versus aquelas em uma amostra de controle. Porexemplo, as intensidades da expressão gênica de um tecido doente podemser comparadas com as intensidades de expressão geradas por tecido be-nigno ou normal do mesmo tipo. Uma proporção dessas intensidades de ex-pressão indica o número de vezes de alteração na expressão gênica entreas amostras de teste e de controle.

A seleção pode se basear em testes estatísticos que produzemlistas ranqueadas relacionadas à evidência de significância para cada ex-pressão diferencial do gene entre fatores relacionados ao local de origemoriginal do tumor. Exemplos de tais testes incluem ANOVA e Kruskal-Wallis.As classificações podem ser usadas como ponderações em um modelo pro-jetado para interpretar a soma de tais ponderações, até um valor de corte,5 como a preponderância de evidência em favor de uma classe em relação àoutra. Evidências anteriores, como descrito na literatura, também podem serusadas para ajustar as ponderações.

Uma modalidade preferida é a normalização de cada medidapela identificação de um conjunto de controle estável e o escalonamento10 desse conjunto até variância zero através de todas as amostras. Esse con-junto de controle é definido como qualquer transcrito endógeno simples ouconjunto de transcritos endógenos afetados por erro sistemático no ensaio, eque sabidamente não se altera independentemente desse erro. Todos osmarcadores são ajustados pelo fator específico da amostra que gera variân-15 cia zero para qualquer estatística descritiva do conjunto de controle, por e-xemplo, média ou mediana, ou para uma medida direta. Alternativamente,caso a premissa de variação de controles relacionada somente ao erro sis-temático não seja verdadeira, embora o erro de classificação resultante sejamenor quando a normalização é realizada, o conjunto de controle ainda será20 usado como estabelecido. Controles de pico não endógenos também podemser úteis, mas não são preferidos.

Os perfis de expressão gênica podem ser exibidos de diversasformas. A mais comum é o arranjo das intensidades de fluorescência brutasou a matriz de proporção em um dendograma gráfico no qual as colunas25 indicam amostras de teste e as linhas indicam os genes. Os dados são dis-postos de tal forma que genes que possuem perfis de expressão similaresestão próximos uns dos outros. A proporção de expressão para cada gene évisualizada como uma cor. Por exemplo, uma proporção menor do que um(infra-regulação) aparece na porção azul do espectro, enquanto uma propor-30 ção maior do que um (supra-regulação) aparece na porção vermelha do es-pectro. Há programas de computador comercialmente disponíveis que exi-bem esses dados, incluindo "Genespring" (Silicon Genetics, Inc.) e "Disco-very" e "Infer" (Partek, Inc.).

No caso de medidas dos níveis de proteína para determinaçãoda expressão gênica, qualquer método conhecido na técnica é adequado,desde que ele resulte em uma especificidade e sensibilidade adequadas.

Por exemplo, os níveis de proteína podem ser medidos por ligação de umanticorpo ou fragmento de anticorpo específico para a proteína e medindo-sea quantidade de proteína ligada ao anticorpo. Os anticorpos podem ser mar-cados por reagentes radioativos, fluorescentes ou por outros reagentes de-tectáveis para facilitar a detecção. Métodos de detecção incluem, sem Iimita-ção, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e técnicas de imunob-lot.

Os genes modulados usados nos métodos da invenção serãodescritos nos Exemplos. Os genes que são expressos diferencialmente sãosupra-regulados ou infra-regulados em pacientes com carcinoma de uma15 origem em particular em relação àqueles com carcinomas de origens dife-rentes. A supra-regulação e a infra-regulação são termos relativos que signi-ficam que uma diferença detectável (além da contribuição do ruído no siste-ma usado para medi-la) é encontrada na quantidade de expressão dos ge-nes em relação a algum nível basal. Nesse caso, o nível basal é determina-20 do com base no algoritmo. Os genes de interesse nas células doentes sãoentão supra-regulados ou infra-regulados em relação ao nível basal usandoo mesmo método de medição. Células doentes, nesse contexto, referem-sea uma alteração do estado de um corpo que interrompe ou perturba, ou temo potencial para perturbar, o desempenho correto das funções corpóreas,25 como ocorre com a proliferação descontrolada de células. A pessoa é diag-nosticada com uma doença quando algum aspecto do genótipo ou fenótipoda pessoa é consistente com a presença da doença. No entanto, o ato deelaboração de um diagnóstico ou de um prognóstico pode incluir a determi-nação de questões do estado de doença, por exemplo, a determinação da30 probabilidade de reçidiva, tipo de terapia e monitoramento da terapia. Nomonitoramento da terapia, são feitas avaliações clínicas em relação aos efei-tos de certo esquema de terapia por comparação da expressão de genes aolongo do tempo para determinar se os perfis de expressão gênica se altera-ram ou estão se alterando para padrões mais consistentes com tecido normal.

Os genes podem ser agrupados de tal forma que as informa-ções obtidas sobre o conjunto de genes no grupo fornecem uma base sólidapara a elaboração de uma avaliação clinicamente relevante, por exemplo,um diagnóstico, prognóstico ou escolha de tratamento. Esses conjuntos degenes constituem os portfólios da invenção. Como ocorre com a maioria dosmarcadores diagnósticos, freqüentemente é desejável usar o menor númerode marcadores, o suficiente para fazer uma avaliação médica correta. Issoevita um retardo do tratamento até uma análise posterior, bem como o usonão produtivo de tempo e de recursos.

Um método para o estabelecimento de portfólios de expressãogênica é através do uso de algoritmos de otimização, por exemplo, o algo-ritmo de variância média, amplamente usado no estabelecimento de portfó-lios de stock. Esse método é descrito em detalhe em 20030194734. Essen-cialmente, o método se baseia no estabelecimento de um conjunto de entra-das (títulos, em aplicações financeiras, expressão, aqui medida pela intensi-dade) que otimizarão o retorno (por exemplo, o sinal que é gerado) recebidopor seu uso, ao mesmo tempo em que minimiza a variabilidade do retorno.Há muitos programas de computador comerciais disponíveis para a realiza-ção dessas operações. "Wagner Associates Mean-Variance Otimização Ap-plication", aqui citado como "Wagner Software" ao longo desta especificação,é preferido. Esse software usa funções da "Wagner Associates Mean-Variance Otimização Library" para determinar uma fronteira eficiente, e pre-ferem-se portfólios ótimos no sentido de Markowitz (Markowitz (1952)). Ouso desse tipo de software exige que os dados de microarranjo sejam trans-formados de modo a serem tratados como um dado de entrada, para que seuse o retorno de títulos e medidas de risco quando o software se destina àanálise financeira.

O processo de deleção de um portfólio também pode incluir aaplicação de regras heurísticas. De preferência, essas regras são formula-das com base na biologia e compreensão da tecnologia usada para a produ-ção de resultados clínicos. De preferência, elas são aplicadas para gerarresultados pelo método de otimização. Por exemplo, o método de variânciamédia da seleção do portfólio pode ser aplicado aos dados de microarranjopara vários genes expressos diferencialmente em indivíduos com câncer. Osresultados do método seriam um conjunto otimizado de genes que poderiaincluir genes que são expressos no sangue periférico, bem como no tecidodoente. Se as amostras usadas no método de teste fossem obtidas do san-gue periférico e certos genes expressos diferencialmente em casos de cân-cer também pudessem ser expressos diferencialmente no sangue periférico,também poderia ser aplicada uma regra heurística na qual um portfólio éselecionado a partir da fronteira eficiente que exclui aqueles que são expres-sos diferencialmente no sangue periférico. Evidentemente, a regra pode seraplicada antes da formação da fronteira eficiente, por exemplo, por aplicaçãoda regra durante a pré-seleção de dados.

Podem ser aplicadas outras regras heurísticas que não estejamnecessariamente relacionadas à biologia em questão. Por exemplo, pode-seaplicar uma regra em que apenas uma percentagem prescrita do portfóliopossa ser representada por um gene ou grupo de genes em particular. Umsoftware disponível comercialmente, por exemplo, o Software Wagner, facil-mente acomoda esses tipos de heurísticas. Isso pode ser útil, por exemplo,quando outros fatores que não a exatidão e precisão (por exemplo, taxas delicenciamento antecipadas) têm um impacto sobre a conveniência de incluirum ou mais genes.

Os perfis de expressão gênica desta invenção também podemser usados em conjunto com outros métodos diagnósticos não genéticosúteis no diagnóstico, prognóstico, ou monitoramento do tratamento de cân-cer. Por exemplo, em alguns casos, pode ser benéfico combinar o poder di-agnóstico da expressão gênica com base nos métodos descritos acima comdados de marcadores convencionais, tais como marcadores de proteína sé-rica (por exemplo, Antígeno de Câncer 27.29 ("CA 27.29")). Existem váriosdesses marcadores, incluindo analisados como CA 27.29. Em um dessesmétodos, o sangue é coletado periodicamente de um paciente tratado, e de-pois submetido a um imunoensaio enzimático para um dos marcadores séri-cos descritos acima. Quando a concentração do marcador sugere o retornodos tumores ou o insucesso da terapia, é então colhida uma fonte de amos-tra passível de análise da expressão gênica. Quando existe uma massasuspeita, é colhido um aspirado com agulha fina (AAF), e os perfis de ex-pressão gênica das células colhidas da massa são então analisados comodescrito acima. Alternativamente, podem ser coletadas amostras de tecidode áreas adjacentes ao tecido do qual um tumor foi previamente removido.Essa abordagem pode ser particularmente útil quando outros testes produ-zem resultados ambíguos.

Kits feitos de acordo com a invenção incluem ensaios formata-dos para a determinação dos perfis de expressão gênica. Esses podem in-cluir todos ou alguns dos materiais necessários para se realizar os ensaios,15 tais como reagentes e instruções e um meio através dos quais os biomarca-dores são testados.

Os artigos desta invenção incluem representações dos perfis deexpressão gênica úteis para tratamento, diagnóstico, prognóstico e, de resto,avaliação de doenças. Essas representações do perfil são reduzidas a um20 meio que pode ser lido automaticamente por uma máquina, por exemplo,uma mídia que possa ser lida por um computador (magnética, óptica, e se-melhante). Os artigos também podem incluir instruções para avaliação dosperfis de expressão gênica nessas mídias. Por exemplo, os artigos podemcompreender um CD-ROM que possui instruções computacionais para a25 comparação de perfis de expressão gênica dos portfólios de genes descritosacima. Os artigos também podem ter perfis de expressão gênica nele grava-dos digitalmente, de forma que possam ser comparados com dados de ex-pressão gênica de amostras do paciente. Alternativamente, os perfis podemser registrados em diferentes formatos de representação. Um registro gráfico30 é um desses formatos. Algoritmos de agrupamento, tais como aqueles in-corporados nos softwares "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc. mencio-nados acima, podem ajudar na visualização desses dados.Diferentes tipos de produtos manufaturados de acordo com ainvenção são meios ou ensaios formatados usados para revelar perfis deexpressão gênica. Esses podem compreender, por exemplo, microarranjosnos quais complementos de seqüências ou sondas são afixados a uma ma-triz à qual as seqüências indicativas dos genes de interesse se combinam,criando um determinante detectável de sua presença. Alternativamente, osartigos de acordo com a invenção podem ser apresentados em kits reagen-tes para a realização de hibridização, amplificação e geração de sinal indica-tivo do nível de expressão dos genes de interesse para a detecção de cân-cer.

Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar, mas não limi-tar, a invenção reivindicada. Todas as referências citadas são aqui incorpo-radas por referência.Exemplo 1Materiais e métodos

Descoberta de genes marcadores de câncer pancreático.

Foi isolado RNA de tumor pancreático, tecidos normais do pân-creas, pulmão, cólon, mama e ovário usando Trizol. O RNA foi então usadopara gerar RNA marcado amplificado (Lipshutz e cols. (1999)), que foi entãohibridizado em arranjos Affymetrix U133A. Os dados foram então analisadosem duas formas.

No primeiro método, esse conjunto de dados foi filtrado para re-ter somente aqueles genes com pelo menos dois tipos presentes através detodo o conjunto de dados. Essa filtragem deixou 14.547 genes. Foi determi-nado que 2.736 genes eram superexpressos em câncer pancreático versuspâncreas normal com um valor ρ de menos de 0,05. Quarenta e cinco genesdos 2.736 também eram superexpressos em pelo menos duas vezes, com-parados com a intensidade máxima encontrada em tecidos do pulmão e có-lon. Finalmente, foram encontrados seis conjuntos de sondas que eram su-perexpressas em pelo menos duas vezes, comparados com a intensidademáxima encontrada em tecidos do pulmão, cólon, mama e ovário.

No segundo método, esse conjunto de dados foi filtrado para re-ter somente aqueles genes com não mais que dois tipos presentes em teci-dos do cólon, pulmão e ovário. Essa filtragem deixou 4.654 genes. Verificou-se que 160 genes dos 4.654 genes possuem pelo menos dois tipos presen-tes nos tecidos pancreáticos (normal e com câncer). Finalmente, foram sele-cionados oito conjuntos de sondas que mostravam a maior expressão dife-rencial entre tecidos de câncer pancreático e normal.Amostras de tecido.

Foi adquirido um total de 260 tecidos FFPE de metástases eprimários de vários vendedores comerciais. As amostras testadas incluíram:30 metástases da mama, 30 metástases cólon-retais, 56 metástases pulmo-nares, 49 metástases ovarianas, 43 metástases de pâncreas, 18 primáriasda próstata e 2 metástases da próstata e 32 de outras origens (6 do estôma-go, 6 do rim, 3 da laringe, 2 do fígado, 1 do esôfago, 1 da faringe, 1 do duetobiliar, 1 da pleura, 3 da bexiga, 5 de melanoma, 3 de linfoma).15 Extração de RNA.

O isolamento de RNA de cortes de tecido em parafina se base-ou nos métodos e reagentes descritos no manual do Kit "High Pure RNA Pa-raffin" (Roche) com as seguintes modificações. Amostras de tecido embebi-das em parafina foram cortadas de acordo com o tamanho das metástases20 embebidas (2-5 mm = 9 X 10 pm, 6-8 mm = 6 X 10 μηη, 8->10 mm = 3 X 10pm), e colocadas em tubos de Eppendorf com 1,5 ml de RNase/DNase. Oscortes foram desparafinizados por incubação e 1 ml de xileno por 2-5 minu-tos em temperatura ambiente após um turbilhonamento de 10-20 segundos.Os tubos foram então centrifugados e o sobrenadante foi removido e a etapa25 de desparafinização foi repetida. Após o sobrenadante ser removido, foi adi-cionado 1 ml de etanol, e a amostra foi turbilhonada por 1 minuto, centrifu-gada, e o sobrenadante removido. Esse processo foi repetido mais uma vez.O etanol residual foi removido e o pélete foi seco em um forno a 55°Ç por 5-10 minutos, e ressuspenso em 100 μΙ de tampão de Iise de tecido, 16 μΙ de30 SDS 10% e 80 μΙ de Proteinase K. As amostras foram turbilhonadas e incu-badas em um termo-misturador ajustado em 400 rpm por 2 horas a 55°C.Foram adicionados 325 μΙ de tampão de ligação e 325 μΙ de etanol a cadaamostra que era então misturada, centrifugada, é o sobrenadante era adi-cionado à coluna do filtro. A coluna do filtro e um tubo de coleta foram centri-fugados por 1 minuto a 8.000 rpm, e o fluxo foi descartado. Foi realizadauma série de lavagens seqüenciais (500 μl de Tampão de Lavagem I -> 500μl de Tampão de Lavagem II -> 300 μl de Tampão de Lavagem II), em quecada solução era adicionada à coluna, centrifugada, e o fluxo descartado. Acoluna foi então centrifugada em velocidade máxima por 2 minutos, colocadaem um tubo fresco de 1,5 ml, e foram acrescentados 90 μl de tampão deeluição. O RNA foi obtido após uma incubação de 1 minuto em temperaturaambiente, seguida por uma centrifugação por 1 minuto a 8.000 rpm. A amos-tra era tratada com DNase com a adição de 10 μl de tampão de incubaçãode DNase, 2 μl de DNase I, e incubada por 30 minutos a 37°C. A DNase erainativada após a adição de 20 μl de tampão de lise de tecido, 18 μl de SDS10% e 40 μl de Proteinase K. Novamente, 325 μl de tampão de ligação e325 μl de etanol foram adicionados a cada amostra que era então misturada,centrifugada, e o sobrenadante era adicionado na coluna do filtro. As lava-gens seqüenciais e a eluição de RNA foram feitas como apresentado acima,com a exceção de 50 μl de tampão de eluição que foram usados para eluir oRNA. Para eliminar a contaminação por fibra de vidro trazida pela coluna, oRNA foi centrifugado por 2 minutos em velocidade total, e o sobrenadante foiremovido .em um tubo de Eppendorf de 1,5 ml fresco. As amostras foramquantificadas por leituras da OD 260/280 obtidas por um espectrofotômetro,e foram diluídas até 50 ng/μl. O RNA isolado foi estocado em água livre deRNAse a -80°C até ser usado.

Iniciador TaqMan e projeto da sonda.

Foram usados números de acesso da seqüência de mRNA dereferência apropriados em conjunto com Oligo 6.0 para o desenvolvimentode ensaios TaqMan® CUP (marcadores pulmonares: proteína surfactantehumana B associada ao pulmão (HUMPSPBA), fator de transcrição da tire-óide 1 (TTF1), desmogleína 3 (DSG3), marcador cólon-retal: caderina 17(CDH17), marcadores de mama: mamaglobina (MG), fator de transcrição etsderivado da próstata (PDEF), marcador ovariano: tumor de Wilms 1 (WT1),marcadores pancreáticos: antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA),fator V da coagulação (F5), marcador da próstata calicreína 3 (KLK3)) e en-saios de manutenção de beta-actina (β-Actin), hidroximetilbilano sintase(PBGD). Os iniciadores e as sondas de hidrólise para cada ensaio estão Iis-tados na Tabela 2. A amplificação de DNA genômico foi excluída projetando-se ensaios em torno de sítios de junção de éxon-íntron. As sondas de hidró-lise foram marcadas no nucleotídeo 5' com FAM como corante repórter e nonucleotídeo 3' com BHQ1-TT como corante de extinção interna.Reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real.

A quantificação de RNA com especificidade gênica foi realizadaem uma placa de 384 poços em um sistema de detecção de seqüências ABIPrism 7900HT (Applied Biosystems). Para cada rodada do termociclador,foram amplificados calibradores e curvas-padrão. Os calibradores para cadamarcador consistiam nos transcritos in vitro do gene-alvo que eram diluídosèm RNA transportador de rim de rato a 1 X 105 cópias. Curvas-padrão paramarcadores de manutenção consistiram em transcritos in vitro do gene-alvoque foram diluídos serialmente em RNA transportador de rim de rato a 1 X107, 1 X 105 e 1 X 103 cópias. Foram incluídos controles-alvo em cada roda-da do ensaio para assegurar a ausência de contaminação ambiental. Todasas amostras e controles foram executados em duplicata. qRTPCR foi reali-zada com reagentes gerais em laboratório em uma reação de 10 μΙ conten-do: Tampão de RT-PCR (50 nM de Bicina/KOH pH 8,2, 115 nM de KAc, gli-cerol 8%, 2,5 mM de MgCI2, 3,5 mM de MnSO4, 0,5mM de cada um dedCTP, d ATP, dGTP e dTTP), Aditivos (2 mM de Tris-Cl pH 8, 0,2 mM de Al-bumina Bovina, 150 mM de Trehalose, Tween 20 0,002%), Mistura de Enzi-ma (2U Tth (Roche), 0,4 mg/μΙ de Ab TP6-25), Mistura de Iniciadores e Son-das (0,2 μΜ de Sonda, 0,5 μΜ de Iniciadores). Foram seguidos os seguintesparâmetros de ciclagem: 1 ciclo a 95°C por 1 minuto; 1 ciclo a 55°C por 2minutos; Ramp 5%; 1 ciclo a 70°C por 2 minutos; e 40 ciclos de 95°C por 15segundos, 58°C por 30 segundos. Após o término da reação de PCR, osvalores basais e limítrofes foram ajustados no software ABI 7900HT Prism, eos valores de Ct calculados foram exportados para Excel da Microsoft.Reação em uma etapa vs. Em duas etapas.

A síntese da primeira fita foi realizada usando 100 ng de hexâ-meros randômicos ou de iniciadores com especificidade gênica por reação.Na primeira etapa, 11,5 μΙ de Mistura-1 (iniciadores e 1 pg de RNA total) fo-ram aquecidos até 65°C por 5 minutos, e resfriados no gelo. Foram adicio-nados 8,5 μΙ de Mistura-2 (Tampão 1 x, 0,01 mM de DTT, 0,5 mM de cadadNTPs, 0,25 U/μΙ de RNasin®, 10 U/μΙ de Superscript III) à Mistura-1, e incu-bados a 50°C por 60 minutos, seguido por 95°C por 5 minutos. O cDNA foiestocado a -20°C até estar pronto para ser utilizado. A qRTPCR para a se-gunda etapa da reação de duas etapas foi realizada como definido acima,com os seguintes parâmetros de ciclagem: 1 ciclo a 95°C por 1 minuto; 40ciclos de 95°C por 15 segundos, 58°C por 30 segundos. A qRTPCR para areação em uma única etapa foi realizada como definido no parágrafo prece-dente. Tanto a reação em uma única etapa quanto a reação em duas etapasforam realizadas em 100 ng de modelo (RNA/cDNA). Após o término da rea-ção de PCR, os valores basais e limítrofes foram ajustados no software ABI7900HT Prism e os valores de Ct calculados foram exportados para o Excelda Microsoft.

Geração de um gráfico de cores.

Para cada amostra, foi calculado um ACt considerando a Ct mé-dia de cada marcador de CUP, e subtraindo-se a Ct .média de uma médiados marcadores de manutenção (ACt = Ct(marcador de CUP) - Ct(média domarcador HK)). O ACt mínimo para cada conjunto de marcadores de tecidode origem (pulmão, mama, próstata, cólon, ovário e pâncreas) foi determina-do para cada amostra. O tecido de origem com o ACt mínimo global recebeua pontuação de um, e todas as outras origens de tecido receberam a pontu-ação de zero. Os dados foram classificados de acordo com o diagnósticopatológico. Partek Pro foi abastecido com os dados modificados de praticabi-lidade, e foi gerado um gráfico de intensidade.Resultados.

Descoberta de marcadores inéditos de tumor de origem pan-creática e do estado do câncer.Primeiro, foram analisados cinco candidatos a marcador pancre-ático: antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), inibidor de serina pro-teinase, membro 1 do ciado A (SERPINA1), citoqueratina 7 (KRT7), metalo-protease da matriz 11 (MMP11) e mucina 4 (MUC4) (Varadhachary e cols.

(2004); Fukushima e cols. (2004); Argani e cols. (2001); Jones e cols.(2004); Prasad e cols. (2005); e Moniaux e cols. (2004)) usando microarran-jos de DNA e um painel de 13 adenocarcinomas pancreáticos ductais, cincotecidos normais do pâncreas e 98 amostras de tumores da mama, cólon-retais, pulmonares e ovarianos. Apenas PSCA demonstrou sensibilidademoderada (seis entre treze, ou 46% dos tumores pancreáticos foram detec-tados) com uma especificidade alta (91 entre 98, ou 93% foram identificadoscorretamente como não sendo de origem pancreática) (Figura 1A). Em con-traste, KRT7, SERPINA1, MMP11 e MUC4 demonstraram sensibilidades de38%, 31%, 85% e 31%, respectivamente, em especificidades de 66%, 91%,82% e 81%, respectivamente. Esses dados eram concordantes com aqRTPCR realizada em 27 metástases de origem pancreática e 39 metásta-ses de origem não pancreática para todos os marcadores, exceto paraMMP11, que mostrou uma sensibilidade e especificidade mais pobres comqRTPCR e as metástases. Em conclusão, os dados de microarranjo em te-cido primário congelado bruscamente servem como um bom indicador dahabilidade do marcador para identificar uma metástase FFPE como sendode origem pancreática com o uso de qRTPCR, mas que marcadores adicio-nais podem ser úteis para um desempenho ótimo.

Como o adenocarcinoma pancreático ductal se desenvolve apartir de células epiteliais ductais que compõem apenas uma pequena per-centagem de todas as células pancreáticas (com células acinares e célulasda ilhota compreendendo a maioria), e como tecidos de adenocarcinomapancreático contêm uma quantidade significativa de tecido adjacente normal(Prasad e cols. (2005); e Ishikawa e cols. (2005)), foi difícil identificar marca-30 dores de câncer pancreático (ou seja, supra-regulados no câncer) que tam-bém diferenciassem esse órgão de outros órgãos. Para uso em um painel deCUP1 essa diferenciação é necessária. O primeiro método de pesquisa (vejamateriais e métodos) gerou seis conjuntos de sondas: fator V da coagulação(F5), uma proteína hipotética FLJ22041, similar às proteínas de ligaçãoFK506 (FKBP10), β-integrina 6 (ITGB6), transglutaminase 2 (TGM2), ribonu-cleoproteína nuclear heterogênea AO (HNRPO) e BAX delta (ΒΑΧ). O segun-do método de pesquisa (veja materiais e métodos) gerou oito conjuntos desondas: F5, TGM2, fator de transcrição de homeodomínio paired-like 1(PITX1), mRNA de isoforma trio (TRIO), mRNA para p73H (p73), uma prote-ína desconhecida para MGC:10264 (SCD) e dois conjuntos de sondas paraclaudina 18. F5 e TGM2 estavam presentes nos resultados de ambas aspesquisas e, dos dois, F5 parecia o mais promissor (Figura 1B).Otimização de prep de amostra e qRTPCfí usando tecidos FFPE.

Após o isolamento de RNA e da qRTPCR, os métodos foram o-timizados com o uso de tecidos fixados antes de examinar o desempenho dopainel de marcadores. Primeiro, foi analisado o efeito da redução do tempode incubação de proteinase K de dezesseis horas para 3 horas. Não houveefeito sobre o rendimento. No entanto, algumas amostras mostraram frag-mentos mais longos de RNA quando a etapa de proteinase K mais curta erausada (Figura 2). Por exemplo, quando o RNA foi isolado de um bloco de umano (C22), não foram observadas diferenças nos eletroferogramas. No en-tanto, quando o RNA foi isolado de um bloco de cinco anos (C23), foi obser-vada uma fração maior de RNAs de peso molecular maior, como avaliadopelo salto na curva, quando era usado o digestor de proteinase K mais curto.Essa tendência geralmente se mantinha quando outras amostras eram pro-cessadas, independentemente do órgão de origem para a metástase FFPE.Em conclusão, o encurtamento do tempo de digestão com proteinase K nãosacrifica os rendimento de RNA e pode ajudar no isolamento de RNA maislongo e menos degradado.

A seguir, foram comparados três métodos diferentes de trans-crição reversa: transcrição reversa com hexâmeros randômicos seguida porqPCR (de duas etapas), transcrição reversa com um iniciador com especifi-cidade gênica, seguida por qPCR (de duas etapas), e a qRTPCR em umaetapa com o uso de iniciadores com especificidade gênica. RNA foi isoladode onze metástases e os valores de Ct foram comparados através dos trêsmétodos para β-actina, proteína surfactante humana B (HUMSPB) e fator detranscrição de tireóide (TTF) (Figura 3). Houve diferenças estatisticamentesignificativas (p < 0,001) para todas as comparações. Para todos os três ge-nes, a transcrição reversa com hexâmeros randômicos, seguida por qPCR(reação em duas etapas), gerou os valores de Ct mais elevados, enquanto atranscrição reversa com um iniciador com especificidade gênica, seguida porqPCR (reação em duas etapas), gerou valores de Ct ligeiramente menores(mas estatisticamente significativos) do que a reação da etapa 1 correspon-dente. No entanto, a RT-PCR em duas etapas com iniciadores com especifi-cidade gênica teve uma etapa de transcrição reversa mais longa. Quando osvalores de Ct de HUMSPB e TTF foram normalizados para o valor corres-pondente de β-actina para cada amostra, não houve diferenças nos valoresde Ct normalizados através dos três métodos. Em conclusão, a otimizaçãodas condições da reação de RT-PCR pode gerar valores de Ct menores, oque pode ajudar na análise de blocos de parafina mais velhos (Cronin e cols.(2004)), e uma reação de RT-PCR em uma etapa com iniciadores com es-pecificidade gênica pode gerar valores de Ct comparáveis àqueles geradosna reação em duas etapas correspondente.

Desempenho diagnóstico de um ensaio de qRT-PCR de CUP.

A seguir, foram realizadas 12 reações de qRT-PCR (10 marca-dores e dois genes de manutenção) em 239 metástases FFPE. Os marcado-res usados para o ensaio são mostrados na Tabela 2. Os marcadores pul-monares foram proteína surfactante humana B associada ao pulmão(HUMPSPB), fator de transcrição da tireóide 1 (TTF1) e desmogleína 3(DSG3). O marcador cólon-retal foi caderina 17 (CDH17). Os marcadores demama foram mamaglobina (MG) e fator de transcrição Ets derivado da prós-tata (PDEF). O marcador ovariano foi tumor de Wilms 1 (WT1). Os marcado-res pancreáticos foram antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA) e fatorV da coagulação (F5), e o marcador da próstata foi calicreína 3 (KLK3). Paradescrições dos genes, veja a Tabela 15.

Tabela 2Seqüências de iniciadores e de sondas, números de acesso e compri-mentos dos amplicons.

<table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table>

'Sondas são 5'ΡΑΜ-3'ΒΗ01-ΤΤ

A análise dos valores de Ct normalizados em um gráfico de co-res revelou a especificidade alta dos marcadores de mama e de próstata,especificidade moderada dos marcadores de cólon, pulmão e de ovário, euma especificidade um pouco menor dos marcadores pancreáticos. A com-binação dos dados normalizados de qRT-PCR com refinamento computa-cional melhora o desempenho do painel de marcadores. Os resultados foramobtidos a partir dos dados normalizados de qRT-PCR combinados com oalgoritmo e foi determinada a exatidão do ensaio de qRT-PCR .

Discussão.

Neste exemplo, a criação de um perfil de expressão baseada emmicroarrànjos foi usada em tumores primários para a identificação de mar-cadores candidatos para uso com metástases. O fato de tumores primáriospoderem ser usados para a descoberta de marcadores de origem tumoralpara metástases é consistente com vários achados recentes. Por exemplo,Weigelt e colaboradores demonstraram que perfis de expressão gênica detumores primários da mama são mantidos em metástases distantes. Weigelte cols. (2003). Italiano e colaboradores demonstraram que o estado de EG- FR, avaliado por IHC era similar em 80 tumores cólon-retais primários e nas80 metástases relacionadas (Italiano e cols. (2005)). Apenas cinco dos 80apresentaram discordância no estado de EGFR (Italiano e cols. (2005)).Backus e colaboradores identificaram supostos marcadores para a detecçãode metástases de câncer de mama usando uma análise de expressão gêni-ca ampla do genoma de tecidos da mama e outros tecidos, e demonstraramque mamaglobina e CK19 detectaram metástase clinicamente acionáveis emIinfonodos sentinelas da mama com 90% de sensibilidade e 94% de especi-ficidade (Backus e cols. (2005)).

Os estudos baseados em microarranjos com tecido primário con-firmaram a especificidade e a sensibilidade de marcadores conhecidos. Co-mo resultado, com a exceção de F5, todos os marcadores usados possuemespecificidade alta para os tecidos aqui estudados (Argani e cols. (2001);Backus e cols. (2005); Cunha e cols. (2005); Borgono e cols. (2004); McCar-thy e cols. (2003); Hwang e cols. (2004); Fleming e cols. (2000); Nakamura ecols. (2002); e Khoor e cols. (1997)). Um estudo recente determinou que,com o uso de IHC, PSCA é superexpresso em metástases de câncer depróstata (Lam e cols. (2005)). Dennis e cols. (2002) também demonstraramque PSCA poderia ser usado como um marcador de origem tumoral parapâncreas e próstata. Como aqui demonstrado, a forte expressão de PSCA éencontrada em alguns tecidos da próstata no nível de RNA, mas, com a in-clusão de PSA no ensaio, pode-se agora diferenciar entre cânceres de prós-tata e de pâncreas. Um achado inédito desse estudo foi o uso de F5 comoum marcador complementar (ao PSCA) para tecido originário do pâncreas.Tanto no conjunto de dados de microarranjo com tecido primário quanto noconjunto de dados de qRT-PCR com metástases FFPE, verificou-se que F5complementa o PSCA (Figura 4 e Tabela 3).Tabela 3

Dados de praticabilidade

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Investigadores anteriores geraram ensaios de CUP com o usode IHC ou microarranjos (Su e cols. (2001); Ramaswamy e cols. (2001); eBloom e cols. (2004)). Mais recentemente, SAGE foi acoplado a um pequenopainel de marcadores de qRT-PCR (Dennis (2002); e Buckhaults e cols.(2003)). Esse estudo é o primeiro a combinar a criação de um perfil de ex-pressão baseada em microarranjos com um pequeno painel de ensaios deqRT-PCR. Estudos de microarranjo com tecido primário identificaram alguns,mas nem todos, os mesmos marcadores de tecido de origem que os identifi-cados previamente por estudos de SAG E. Alguns estudos demonstraramque existe uma concordância modesta entre dados de criação de perfil porSAGE e microarranjo de DNA, e que a correlação aumenta para genes comníveis de expressão mais elevados (van Ruissen e cols. (2005) e Kim(2003)). Por exemplo, Dennis e colaboradores identificaram PSA, MG, PSCAe HUMSPB, enquanto Buckhaults e colaboradores (Dennis e cols. (2002))identificaram PDEF. Prefere-se a execução do ensaio de CUP com o uso deqRT-PCR, pois ela é uma tecnologia mais robusta e pode ter vantagens emtermos de rendimento em relação à IHC (Al-Mulla e cols. (2005) e Haas ecols. (2005)). Como aqui demonstrado, o protocolo de qRT-PCR foi aprimo-rado com o uso de iniciadores com especificidade gênica em uma reação emuma única etapa. Essa é a primeira demonstração do uso de iniciadores comespecificidade gênica na reação de qRT-PCR em uma etapa com tecido FF-PE. Outros investigadores fizeram uma qRT-PCR em duas etapas (síntesede cDNA em uma reação, seguida por qPCR) ou usaram hexâmeros randô-micos ou iniciadores truncados com especificidade gênica (Abrahamsen ecols. (2003); Specht e cols. (2001); Godfrey e cols. (2000); Cronin e cols.(2004); e Mikhitarian e cols. (2004)).

Exemplo 2

O adenocarcinoma pancreático ductal se desenvolve a partir decélulas epiteliais ductais que compõem apenas uma pequena percentagemde todas as células pancreáticas (com células acinares e da ilhota compre-endendo a maioria) no pâncreas normal. Além disso, tecidos de adenocarci-noma pancreático contêm uma quantidade significativa de tecido adjacentenormal (Prasad e cols. (2005) e Ishikawa e cols. (2005)). Por isso, os candi-datos a marcadores pancreáticos foram enriquecidos por genes elevados noadenocarcinoma de pâncreas em relação às células pancreáticas normais. Oprimeiro método de pesquisa gerou seis conjuntos de sondas: fator V da co-agulação (F5), uma proteína hipotética FLJ22041, similar às proteínas deligação FK506 (FKBP10), beta 6 integrina (ITGB6), transglutaminase 2(TGM2), ribonucleoproteína nuclear heterogênea AO (HNRPO) e BAX delta(ΒΑΧ). O segundo método de pesquisa (veja a seção de Materiais e méto-dos para detalhes) gerou oito conjuntos de sondas: F5, TGM2, fator detranscrição de homeodomínio paired-like 1 (PITX1), mRNA de isoforma trio(TRIO), mRNA para p73H (p73), uma proteína desconhecida paraMGC: 10264 (SCD) e dois conjuntos de sondas para claudina 18.

Um total de 23 candidatos a marcador com especificidade de te-cido foi selecionado para validação adicional por RT-PCR em tecidos metas-táticos de carcinoma FFPE por qRT-PCR. Os candidatos a marcador foramtestados em 205 FFPE carcinomas metastáticos do pulmão, pâncreas, có-lon, mama, ovário, próstata e carcinomas primários da próstata. A Tabela 4fornece os símbolos dos genes dos marcadores com especificidade de teci-do selecionados para validação por RT-PCR e também resume os resulta-dos dos testes realizados com esses marcadores.<table>table see original document page 34</column></row><table>Tabela: 4-Continuacao

<table>table see original document page 35</column></row><table>Dos 23 marcadores testados, 13 foram rejeitados com base emsua reatividade cruzada, nível de expressão baixo nos tecidos metastáticoscorrespondentes, ou redundância. Foram selecionados dez marcadores paraa versão final do ensaio. Os marcadores pulmonares foram a proteína sur-factante humana B associada ao pulmão (HUMPSPB), o fator de transcriçãoda tireóide 1 (TTF1) e a desmogleína 3 (DSG3). Os marcadores pancreáti-cos foram o antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA) e o fator V da co-agulação (F5), e o marcador da próstata foi a calicreína 3 (KLK3). O marca-dor cólon-retal foi a caderina 17 (CDH17). Os marcadores da mama foram amamaglobina (MG) e o fator de transcrição Ets derivado da próstata (PDEF).O marcador ovariano foi o tumor de Wilms 1 (WT1).

Otimização da preparação de amostras e qRT-PCR com o uso de tecidos FFPE.

A seguir, o isolamento de RNA e os métodos de qRT-PCR foramotimizados com o uso de tecidos fixados, antes do examine do desempenhodo painel de marcadores. Primeiro, foi analisado o efeito da redução do tem-po de incubação de proteinase K de dezesseis horas para três horas. Nãohouve efeito sobre o rendimento. No entanto, algumas amostras mostraramfragmentos mais longos de RNA quando a etapa de proteinase K mais curtaera usada (Figura 4A, B). Por exemplo, quando o RNA foi isolado de um blo-co de um ano (C22), não foram observadas diferenças nos eletroferogramas.No entanto, quando o RNA foi isolado de um bloco de cinco anos (C23), foiobservada uma fração maior de RNAs de peso molecular mais elevado, co-mo avaliado pelo salto na curva, quando era usado o digestor de proteinaseK mais curto. Essa tendência geralmente se mantinha quando outras amos-tras eram processadas, independentemente do órgão de origem para a me-tástase FFPE. Em conclusão, o encurtamento do tempo de digestão comproteinase K não sacrifica os rendimento de RNA e pode ajudar no isola-mento de RNA mais longo e menos degradado.

A seguir, foram comparados três métodos diferentes de trans-crição reversa: transcrição reversa com hexâmeros randômicos, seguida porqPCR (de duas etapas), transcrição reversa com a iniciador com especifici-dade gênica, seguida por qPCR (de duas etapas), e uma qRT-PCR em umaetapa com o uso de iniciadores com especificidade gênica. O RNA foi isola-do de onze metástasès e os valores de Ct foram comparados através dostrês métodos para β-actina, HUMSPB (Figura 4C, D) e TTF. Os resultados5 mostraram diferenças estatisticamente significativas (p < 0,001) para todasas comparações. Para ambos os genes, a transcrição reversa com hexâme-ros randômicos, seguida por qPCR (reação em duas etapas), gerou os valo-res de Ct mais elevados, enquanto a transcrição reversa com um iniciadorcom especificidade gênica, seguida por qPCR (reação em duas etapas), ge-10 rou valores de Ct ligeiramente menores (mas estatisticamente significativos)do que uma reação da etapa 1 correspondente. No entanto, a RT-PCR emduas etapas com iniciadores com especificidade gênica tinha uma etapa detranscrição reversa mais longa. Quando os valores de Ct de HUMSPB foramnormalizados para o valor correspondente de β-actina para cada amostra,15 não houve diferenças nos valores de Ct normalizados através dos três mé-todos. Em conclusão, a otimização das condições da reação de RT-PCRpode gerar valores de Ct menores, o que ajuda na análise de blocos de pa-rafina mais velhos (Cronin e cols. (2004)), e uma reação de RT-PCR emuma etapa com iniciadores com especificidade gênica pode gerar valores de20 Ct comparáveis àqueles gerados na reação em duas etapas correspondente.Desempenho diagnóstico de ensaio de qRT-PCR otimizado.

Foram realizadas 12 reações de qRT-PCR (10 marcadores e 2genes de manutenção) em um novo conjunto de 260 metástases FFPE. Vin-te e uma amostras geraram valores de Ct elevados para os genes de manu-25 tenção e, portanto, somente 239 foram usados em uma análise de gráfico decores. A análise dos valores de Ct normalizados em um gráfico de cores re-velou a alta especificidade dos marcadores de mama e de próstata, especifi-cidade moderada dos marcadores de cólon, pulmão e de ovário, e uma es-pecificidade um pouco menor dos marcadores pancreáticos (Figura 5). A30 combinação dos dados normalizados de qRT-PCR com refinamento compu-tacional melhora performance do painel de marcadores.

Com o uso dos valores de expressão, normalizados para a mé-dia de expressão de dois genes de manutenção, foi desenvolvido um algo-ritmo para prever o tecido de origem de metástases que combina os dadosnormalizados de qRT-PCR com o algoritmo, e foi determinada a exatidão doensaio de qRT-PCR pela realização de um teste de validação cruzada "umde fora" (ieave-one-ouf) (LOOCV). Para os seis tipos de tecidos incluídosnos ensaio, foi estimado separadamente que tanto o número de resultadosfalso-positivos, quando uma amostra era fortemente prevista como outro tipode tumor incluído no ensaio (pâncreas como cólon, por exemplo), quanto onúmero de tempos em que uma amostra não era prevista como aquelas in-cluídas nos tipos de tecido do ensaio (outros). Os resultados do LOOCV sãoapresentados na Tabela 5.

Tabela 5

<table>table see original document page 38</column></row><table>

O tecido de origem foi previsto corretamente para 204 das 260 amos-tras testadas com uma precisão global de 78%. Uma proporção significativados resultados falso-positivos foi causada por reatividade cruzada dos mar-cadores em tecidos histologicamente similares. Por exemplo, três carcino-mas de células escamosas metastáticos originados da faringe e esôfago for-ram erradamente previstos como pulmão em função da expressão de DSG3nos nesses tecidos. A expressão positive de CDH17 em outros carcinomasque não nos carcinomas Gl do cólon, incluindo estômago e pâncreas, cau-sou uma classificação falsa em 4 de 6 metástases de estômago testadas e 3de 43 metástase de câncer pancreático testadas como cólon.

Além do teste LOOCV, os dados foram aleatoriamente divididos em 3pares separados de conjuntos de treinamento e de teste. Cada divisão con-tinha aproximadamente 50% das amostras de cada classe. Em 50/50 dasdivisões em três pares separados de conjuntos de treinamento e de teste, asprecisões globais do ensaio foram de 77%, 71% e 75%, confirmando a esta-bilidade do desempenho do ensaio.

Por último, outro conjunto independente de 48 carcinomas metastáti-cos FFPE que incluíam carcinoma metastático de tumor primário conhecido,foram testados espécimes de CUP com um diagnóstico do tecido de origemgerado por avaliação patológica que inclui IHC, e espécimes de CUP quepermaneceram CUP após teste IHC. A precisão da previsão do tecido deorigem foi estimada separadamente para cada categoria de amostras. A Ta-bela 6 resume os resultados do ensaio.

Tabela 6

<table>table see original document page 39</column></row><table> A previsão do tecido de origem foi, com raras exceções, consistentecom o diagnóstico primário conhecido ou com o diagnóstico do tecido deorigem avaliado por avaliação clínica/patológica, incluindo IHC. Similar aoconjunto de treinamento, o ensaio não foi capaz de diferenciar carcinomasde células escamosas originários de diferentes fontes e os previu falsamentecomo de pulmão.

O ensaio também fez supostos diagnósticos de tecido de origempara oito de onze amostras que permaneceram CUP após testes diagnósti-cos padronizados. UM dos casos de CUP cases foi especialmente interes-sante. Um paciente do sexo masculino com uma história de câncer de prós-tata foi diagnosticado com carcinoma metastático no pulmão e pleura. Tes-tes de PSA sérico e IHC com anticorpos de PSA em tecido metastático fo-ram negativos e, portanto, o diagnóstico do patologista foi de CUP1 com umainclinação em direção a tumores gastrointestinais. O ensaio previu fortemen-te (probabilidade posterior de 0,99) o tecido de origem como cólon.Discussão.

Nesse estudo, foi usada a criação de um perfil de expressão ba-seada em microarranjos em tumores primários para identificar candidatos amarcadores para uso com metástases. O fato de tumores primários poderemser usados para a descoberta de marcadores de origem tumoral para metás-tases é consistente com vários achados recentes. Por exemplo, Weigelt ecolaboradores demonstraram que perfis de expressão gênica de tumoresprimários da mama são mantidos em metástases distantes (Weigelt e cols.(2003)). Backus é colaboradores identificaram supostos marcadores para adetecção de metástases de câncer de mama com o uso uma análise de ex-pressão gênica ampla do genoma de tecidos da mama e de outros tecidos, edemonstraram que mamaglobina e CK19 detectaram metástase clinicamen-te acionável em Iinfonodos sentinelas da mama com 90% de sensibilidade e94% de especificidade (Backus e cols. (2005)).

Durante o desenvolvimento do ensaio, a seleção se concentrouem seis tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão, pâncreas e cólon, queestão entre os mais prevalentes em CUP (Ghosh e cols. (2005); e Pavlidis ecols. (2005)) e de mama, ovário e próstata, para os quais o tratamento pode-ria ser potencialmente o mais benéfico para os pacientes (Ghosh e cols.(2005)). No entanto, podem ser acrescentados tipos e marcadores de tecidoadicionais ao painel, desde que a precisão global do ensaio não seja com-prometida e, se aplicável, a logística das reações de RT-PCR não seja so-brecarregada.

Os estudos baseados em microarranjos com tecido primário con-firmaram a especificidade e a sensibilidade de marcadores conhecidos. Co-mo resultado, a maioria dos marcadores com especificidade de tecido possuiespecificidade alta para os tecidos aqui estudados. Um estudo recente verifi-cou que, com o uso de IHC1 PSCA é superexpresso em metástases de cân-cer de próstata (Lam e cols. (2005)). Dennis e cols. (2002) também demons-traram que PSCA poderia ser usado como um marcador de origem tumoralpara pâncreas e próstata. A forte expressão de PSCA em alguns tecidos dapróstata no nível de RNA estava presente, mas, por causa da inclusão dePSA no ensaio, os cânceres de próstata e de pâncreas podem agora serdiferenciados. Um achado inédito desse estudo foi o uso de F5 como ummarcador complementar (ao PSCA) para tecido originário do pâncreas. Tan-to no conjunto de dados de microarranjo com tecido primário quanto no con-junto de dados de qRT-PCR com metástases FFPE, verificou-se que F5complementa o PSCA.

Investigadores anteriores geraram ensaios de CUP com o usode IHC (Brown e cols. (1997); DeYoung e cols. (2000); e Dennis e cols.(2005a)) ou microarranjos (Su e cols. (2001); Ramaswamy e cols. (2001); eBloom e cols. (2004)). Mais recentemente, SAGE foi acoplado a um pequenopainel de marcadores de qRT-PCR (Dennis e cols. (2002) e Buckhaults ecols. (2003)). Esse estudo é o primeiro a combinar a criação de um perfil deexpressão baseada em microarranjos com um pequeno painel de ensaios deqRT-PCR. Os estudos de microarranjo com tecido primário identificou al-guns, mas nem todos, os mesmos marcadores de tecido de origem que a-queles identificados previamente por estudos de SAGE. Esse achado não ésurpreendente, considerando-se que os estudos demonstraram que existeuma concordância modesta entre dados de criação de perfil por SAGE e mi-croarranjo de DNA, e que a correlação aumenta para genes com níveis deexpressão mais elevados (van Ruissen e cols. (2005) e Kim e cols. (2003)).Por exemplo, Dennis e colaboradores identificaram PSA, MG, PSCA eHUMSPB, enquanto Buckhaults e colaboradores (Buckhaults e cols. (2003))identificaram PDEF. A execução do ensaio de CUP é, de preferência, porqRT-PCR, pois ela é uma tecnologia mais robusta, e pode ter vantagens emtermos de rendimento em relação à IHC (Al-Mulla e cols. (2005) e Haas ecols. (2005)). Além disso, como aqui demonstrado, o protocolo de qRT-PCRfoi aperfeiçoado através do uso de iniciadores com especificidade gênica emuma reação em uma única etapa. Essa é a primeira demonstração do uso deiniciadores com especificidade gênica na reação de qRT-PCR em uma etapacom tecido FFPE. Outros investigadores fizeram uma qRT-PCR em duasetapas (síntese de cDNA em uma reação, seguida por qPCR) ou usaramhexâmeros randômicos ou iniciadores truncados com especificidade gênica(Abrahamsen e cols. (2003); Specht e cols. (2001); Godfrey e cols. (2000);Cronin e cols. (2004); e Mikhitarian e cols. (2004)).

Em resumo, a precisão global de 78% do ensaio para seis tiposde tecidos se compara favoravelmente com outros estudos (Brown e cols.(1997); DeYoung e cols. (2000); Dennis e cols. (2005a); Su e cols. (2001);Ramaswamy e cols. (2001); e Bloom e cols. (2004)).

Exemplo 3

Nesse estudo, foram construídos portfólios de genes marcado-res com o uso de classificador por escolha de MVO, e o uso desse classifi-cador para prever o tecido de origem e o estado do câncer para cinco tiposprincipais de câncer, incluindo câncer de mama, cólon, pulmão, ovário epróstata. Foram analisados 378 cânceres primários, 23 lesões epiteliais pro-liferativas benignas e 103 espécimes de tecido humano normal congeladasbruscamente com o uso de um GeneChip Affymetrix U133A humano. Tam-bém foram analisadas amostras de leucócitos a fim de subtrair a expressãogênica potencialmente mascarada por co-expressão em células leucitáriasde fundo. Foi desenvolvido um método de bioinformática baseado em MVOinédito para a seleção de portfólios de genes marcadores para tecido de ori-gem e estado do câncer. Os dados demonstraram que um painel de 26 ge-nes poderia ser usado como classificador para previr com precisão o tecidode origem e o estado do câncer entre os 5 tipos de câncer. Desse modo,pode ser obtido um método de classificação multicâncer por determinaçãode perfis de expressão gênica de um número razoavelmente pequeno degene marcadores.

A Tabela 7 mostra os marcadores identificados para as origensde tecido indicadas. Para descrições dos genes, veja a Tabela 15.Tabela 7

<table>table see original document page 43</column></row><table>

O conjunto de amostras incluiu um total de 299 carcinomas me·tastáticos do cólon, mama, pâncreas, ovário, próstata, pulmão e outros, eamostras de câncer primário da próstata. Foi implementado um QC baseadona avaliação histológica, rendimento de RNA e expressão do gene de beta-actina de controle. Outra categoria de amostras incluiu metástases origina-das do estômago (5), rim (6), colângio/vesícula biliar (4), fígado (2), cabeça epescoço (4), íleo (1) carcinomas e um mesotelioma. A Tabela 8 resume osresultados.Tabela 8

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Os testes das amostras acima resultaram an reducao do conjun-to de marcadores naqueles na Tabela 9, com os resultados observados naTabela 10.

Tabela 9

<table>table see original document page 44</column></row><table>Tabela 10

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Os resultados mostraram que de 205 tumores embebidos em

parafina, 166 amostras (81%) tiveram resultados conclusivos no ensaio, Ta-bela 11.

Tabela 11

<table>table see original document page 45</column></row><table> Dos resultados falso-positivos, muitos falsos derivaram de tecidos his-tológica e embriologicamente similares, Tabela 12.Tabela 12

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Foram considerados os seguintes parâmetros para o desenvol-vimento do modelo:

Marcadores separados em conjuntos femininos e masculinoscalculam a probabilidade de CUP separadamente para pacientes do sexomasculino e feminino. O conjunto masculino incluiu: SP_B, TTF1, DSG3,PSCA, F5, PSA1 HPT1; o conjunto feminino incluiu: SP_B, TTF1, DSG3,PSCA, F5, HPT1, MGB, PDEF, WT1. A expressão basal foi excluída dosresultados do ensaio: Pulmão: SP_B, TTF1, DSG3; Ovário: WT1; e Cólon:HPT1.

O modelo de CUP foi ajustado para a prevalência de CUP (%):pulmão 23, pâncreas 16, cólon-retal 9, mama 3, ovariano 4, próstata 2, ou-tros 43. A prevalência para mama e ovariano ajustada para 0% para pacien-tes do sexo masculino, e de próstata ajustada para 0% para pacientes dosexo feminino.

Foram realizadas as seguintes etapas:Colocar os marcadores em escala similar.Reduzir o número de variáveis de 12 para 8 por seleção de umvalor mínimo para cada conjunto específico de tecido.Deixar de fora 1 amostra. Construir o modelo a partir das amos-tras restantes. Testar a amostra deixada de fora. Repetir até 100% das a-mostras serem testadas.

Deixar de fora aleatoriamente -50% das amostras (-50% por te-cido). Construir o modelo a partir das amostras restantes. Testar -50% dasamostras. Repetir por 3 divisões aleatórias diferentes.

A precisão da classificação foi ajustada para à prevalência dostipos de câncer para produzir os resultados resumidos na Tabela 13 com osdados brutos mostrados na Tabela 14.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita èm algumdetalhe como forma de ilustração e exemplo com o objetivo de facilitar suacompreensão, as descrições e exemplos não devem ser considerados comolimitantes do escopo da invenção.

Tabela 13

<table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>Tabela 15

<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>

REFERÊNCIAS

Publicações de pedidos de patentes e patentes U.S.:

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5384261 5554501 6339148

5405783 5556752 20020055627

5412087 5561071 20030194733

5424186 5571639 20030212264

5429807 5593839 200302323505436327 5599695 200302358205445934 5624711 200400055635472672 5658734 200400769555527681 5700637 200402195725529756 6004755 200500090675532128 6218114 20060029987

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<213> humano

<400> 1

gaaaáaccag ccactgcttt acaggacagg gggttgaagc tgagccccgc ctcacaccca 60cccccatgca ctcaaagatt ggattttaca gctacttgca attcaaaatt cagaagaata 120aaaaatggga acatacagaa ctctaaaaga tagacatcag aaattgttaa gttaagcttt 180ttcaaaaaat cagcaattcc ccagcgtagt caagggtgga cactgcacgc tctggcatga 240tgggatggcg accgggcaag ctttcttcct cgagatgctc tgctgcttga gagctattgc 300tttgttaaga tataaaaagg ggtttctttt tgtctttctg taaggtggac ttccagattt 360tgattgaaag tcctagggtg attctatttc tgctgtgatt tatctgctga aagctcagct 420ggggttgtgc aagctaggga cccattcctg tgtaatacaa tgtctgcacc aatgct 476<210> 2 <211> 493 <212> DNA <213> humano <400> 2 gtgattcaaa tgggttttcc acgctagggc ggggcacaga ttggagaggg ctctgtgctg 60acatggctct ggactctaaa gaccaaactt cactctgggc acactctgcc agcaaagagg 120actcgcttgt aaataccagg attttttttt ttttttgaag gga:ggacggg agctggggag 180aggaaagagt cttcaacata acccacttgt cactgacaca aaggaagtgc cccctccccg 240gcaccctctg gccgcctagg ctcagcggcg accgccctcc gcgaaaatag tttgtttaat 300gtgaacttgt agctgtaaaa cgctgtcaaa agttggacta aatgcctagt ttttagtaat 360ctgtacattt tgttgtaaaa agaaaaacca ctcccagtcc ccagcccttc acatttttta 420tgggcattga caaatctgtg tatattattt ggcagtttgg tatttgcggc gtcagtcttt 480

ttctgttgta act 493

<210> 3<211> 545<212> DNA<213> humano<400> 3

ccatcccata gaagtccagc agacaggatt tgttaagtgcaggagcttct gctttgtccg cctctgggtc tgtccagccatctgcagcat ggtaactatt tagtaacgga gacttactcgaccttccact gcaggctttg atccacttct cacacaaaatgatctgtccc atttccagtg ttcctggcaa cctagctggcacatactatg ctctgtacag aggatccttg ctcccgtctaaataccacac tgaccaaatc tggatctttg gactaaagtactcactgtat tgggctaata atttggcact tattagcttctataaattaa atgtttgggt tcatacccca aaagcaatatagtac<210> 4<211> 284<212> DNA<213> humano<400> 4

ctgcacccac ctacttagat atttcatgtg ctatagacat

ccatgacatt tttcctctct gcaaatggct tagctacttg

agacagactc attaaatatt ctgtacattt tttctttatc

tctcatagaa ctgcctggat tccatttatg ttttttctga

atccttgact cctttggtat ttcactgaat ttcaaacatt

<210> 5

<211> 394

<212> DNA

<213> humano

<220>

<221> misc_feature<222> (58) .. (58)<223> η is a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (95)..(95)<223> η is a, c, g, ou t<220>

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cagactttgt caggaagtca 60gctgtttcca tccctgaccc 120gcttctggtt ccctcgtgca 180gtgatagtga cagaaagggt 240ccaacgcagc tacgagggtc 300atatgaccag aatgagctgg 360ttcaaaatag catagcaaag 420tctcataaac tgatcacgat 480gttgtcactc ctaattctca 540 545

tagagagatt tttcattttt 60tgtttttccc ttttggggca 120aaggagatat atcagtgttg 180ttccatcctg tgtccccttc 240tgtc 284<221> misc_feature<222> (123)..(123)<223> η is a, c, g, ou t<220>

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ttcctgaggc acatcctaac gcaagtttga ccatgtatgt ttgcacccct tttccccnaa 60

ccctgacctt cccatgggcc ttttccagga ttccnaccng gcagatcagt tttagtgana 120canatccgcn tgcagatggc ccctccaacc ntttntgttg ntgtttccat ggcccagcat 180tttccaccct taaccctgtg ttcaggcact tnttccccca ggaagccttc cctgcccacc 240ccatttatga attgagccag gtttggtccg tggtgtcccc cgcacccagc aggggacagg 300caatcaggag ggcccagtaa aggctgagat gaagtggact gagtagaact ggaggacaag 360agttgacgtg agttcctggg agtttccaga gatg 394

<210> 6<211> 470<212> DNA<213> humano<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> η is a, c, g, ou t

<220>

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atcctctaca gccagatgtc acagggatac gtctactttc acttggtgct ggagaattca 60naagtcaaga acatgctaag cntaagggacacaggttctc ctggatgaaa ttactagcacctggttctcc ttccggaatg aggccctgggcttccagaat gaggccctgg aaggaccctcactcatctaa gattttggtt gggagatggctaatccaaga tactgatgaa gacacagctgcctcacgtgc ttggggagaa agcacccctc<210> 7<211> 396<212> DNA<213> humano<400> 7

gcagcagcct caccatgaag ttgctgatgggctacgcagg ctctggctgc cccttattggaagtgtctaa gactgaatac aaagaacttccaaatgccat agatgaattg aaggaatgttatgttgaggt gtttatgcaa ttaatatatgctgcaagacc tttggctcac agaactgcaggcaaaccaca ccttctcttt cttatgtctt<210> 8<211> 491<212> DNA<213> humano<400> 8

gagtggggcc cttaaactgg attcaaaaaacttgcagtct tcagatgaaa ctaaatctctcatccaaggg ccaccggaag taattagagcgctatatttg gaggaagcat tacagaacgagcctgcaaat ttagaggcta ttgctaagaatgtggatgta ctccaagtaa agctccagtgaatatgaaca tcagttaaaa aaaaaattcttttaatcatt tgaaatctga actcatttactttactgcgt a<210> 9<211> 265<212> DNA<213> humano<400> 9

tggtgtaatt ttgtcctctc tgtgtcctggctcaatttct ctgaggacac agataggatgatgaaagagg ggtgggatcc acactgagagcatgaagcac tgagcagaag ctggaggcacgctgaaaaca taacccactc tgtcc<210> 10<211> 441

ccaaggtaga aagagatcaa gcagcaaagc 120ataaagttgg gagacaccta agccaagaca 180aggaccttcc tagccaagac actggttctc 240ctagtgatct gttactctta aaacaaagta 300atttggcttc tgagaaaggt agctatgaaa 360ttaacaattg gctgatcagc ccccagaatg 420ttgccaacaa gcctggaaag 470

tcctcatgct ggcggccctc tcccagcact 60agaatgtgat ttccaagaca atcaatccac 120ttcaagagtt catagacgac aatgccacta 180ttcttaacca aacggatgaa actctgagca 240acagcagtct ttgtgattta ttttaacttt 300ggtatggtga gaaaccaact acggattgct 360tttact 396

tgctctaaac ataggaatgg ttgaagaggt 60agaagaggca caagaatggc taaagcaatt 120tttgaaaaaa tctgtttgtt caggcagaga 180aagagatctt ttaggaacag tttggggtgg 240aggaaaattt aataaataat tggtttttcg 300actaatatgt ataaatgtta aatgatatta 360ttaaggctac tattaatatg cagacttact 420ctcatttctt gccaattact cccttgggta 480 491

ggaatactgg ccatgcctgg agacatatca 60gggtgtctgt gttatttgtg gggtacagag 120agtggagagt gacatgtgct ggacactgtc 180aacgcaccag acactcacag caaggatgga 240 265<212> DNA<213> humano<400> 10

atagatgtac atacctcctt gcacaaatgg aggggaattc attttcatca ctgggagtgt 60

ccttagtgta taaaaaccat gctggtatat ggcttcaagt tgtaaaaatg aaagtgactt 120taaaagaaaa taggggatgg tccaggatct ccactgataa gactgttttt aagtaactta 180aggacctttg ggtctacaag tatatgtgaa aaaaatgaga cttactgggt gaggaaatcc 240attgtttaaa gatggtcgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgttgtgt tgtgttttgt 300tttttaaggg agggaattta ttatttaccg ttgcttgaaa ttactgtgta aatatatgtc 360tgataatgat ttgctctttg acaactaaaa ttaggactgt ataagtacta gatgcatcac 420tgggtgttga tcttacaaga t 441

<210> 11<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 11

cacagccccg acctttgatg a 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 12

ggtcccagag cccgtctca 19

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> humano

<400> 13

agctgtccag ctgcaaagga aaagcc 2 6

<210> 14

<211> 75 ■

<212> DNA

<213> humano

<400> 14

cacagccccg acctttgatg agaactcagc tgtccagctg caaaggaaaa gccaagtgag 60

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<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> humano

<400> 15

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<210> 16<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 16

cgcccatgcc gctcatgttc a 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> humano

<400> 17

cccgccatct cccgcttcat g 21

<210> 18

<211> 78

<212> DNA

<213> humano

<400> 18

ccaacccaga cccgcgcttc cccgccatct cccgcttcat gggcccggcg agcggcatga 60

acatgagcgg catgggcg 78

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 19

gagagaagga gaagataact caa 23

<210> 20<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 20

actccagaga ttcggtaggt ga 22

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> humano

<400> 21

attgccaaga ttacttcaga ttacca 26

<210> 22

<211> 97

<212> DNA

<213> humano

<400> 22

gcagagaagg agaagataac tcaaaaagaa acccaattgc caagattact tcagattacc 60aagcaaccca gaaaatcacc taccgaatct ctggagt 97

<210> 23<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 23

tccctcggca gtggaagctt a 21

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> humano

<400> 24

tcctcaaact ctgtgtgcct ggta 24

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> humano

<400> 25

ccaaaatcaa tggtactcat gcccgactg 29

<210> 26

<211> 95

<212> DNA

<213> humano

<400> 26

tccctcggca gtggaagctt acaaaacgac tgggaagttt ccaaaatcaa tggtactcat 60

gcccgactgt ctaccaggca cacagagttt gagga 95

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> humano

<400> 27

agttgctgat ggtcctcatg c 21

<210> 28<211> 24<212> DNA<213> humano<400> 28

cacttgtgga ttgattgtct tgga 24

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 29

ccctctçcca gcactgctac gca 23

<210> 30

<211> 107

<212> DNA

<213> humano

<400> 30

agttgctgat ggtcctcatg ctggcggccc tctcccagca ctgctacgca ggctctggct 60gccccttatt ggagaatgtg atttccaaga caatcaatcc acaagtg 107

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> humano

<400> 31

cgcccacctg gacatctgga 20

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 32

cactggtcga ggcacagtag tga 23

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> humano

<400> 33

gtcagcggcc tggatgaaag agcgg 25

<210> 34

<211> 86

<212> DNA

<213> humano

<400> 34

cgcccacctg gacatctgga agtcagcggc ctggatgaaa gagcggactt cacctggggc 60

gattcactac tgtgcctcga ccagtg 86

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> humano

<400> 35

gcggagccca atacagaata cac 23

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 36

cggggctact ccaggcaca 19

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> humano

<400> 37

tcagaggcat tcaggatgtg cgacg 25

<210> 38<211> 80<212> DNA<213> humano<400> 38

gcggagccca atacagaata cacacgcacg gtgtcttcag aggcattcag gatgtgcgac 60

gtgtgcctgg agtagccccg 80

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> humano

<400> 39

ctgttgatgg caggcttggc 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> humano

<400> 40

ttgctcacct gggctttgca 20

<210> 41<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 41

gcagccaggc actgccctgc t 21

<210> 42

<211> 74

<212> DNA

<213> humano

<400> 42

ctgttgatgg caggcttggc cctgcagcca ggcactgccc tgctgtgcta ctcctgcaaa 60

gcccaggtga gcaa 74

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> humano

<400> 43

tgaagaaata tcctgggatt attca 25

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> humano

<400> 44

tatgtggtat cttctggaat atcatca 27

<210> 45<211> 27<212> DNA<213> humano<400> 45

acaaagggaa acagatattg aagactc 27

<210> 46

<211> 87

<212> DNA

<213> humano

<400> 46

tgaagaaata tcctgggatt attcagaatt tgtacaaagg gaáacagata ttgaagactc 60

tgatgatatt ccagaagata ccacata 87

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 47

cccccagtgg gtcctcaca 19

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 48

aggatgaaac aagctgtgcc ga 22

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> humano

<400> 49

caggaacaaa agcgtgatct tgctgg 26

<210> 50

<211> 82

<212> DNA

<213> humano

<400> 50

cccccagtgg gtcctcacag ctgcccactg catcaggaac aaaagcgtga tcttgctggg 60

tcggcacagc ttgtttcatc ct 82

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 51

gccctgaggc actcttcca 19

<210> 52<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 52

cggatgtcca cgtcacactt ca 22

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

< 213 > humano

<400> 53

cttccttcct gggcatggag tcctg 25

<210> 54<211> 100<212> DNA<213> humano<400> 54

gccctgaggc actcttccag ccttccttcc tgggcatgga gtcctgtggc atccacgaaa 60

ctaccttcaa ctccatcatg aagtgtgacg tggacatccg 100

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 55

ccacacacag cctactttcc aa 22

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> humano

<400> 56

tacccacgcg aatcactctc a 21

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> humano

<400> 57

aacggcaatg cggctgcaac ggcggaa 27

<210> 58

<211> 103

<212> DNA

<213> humano

<400> .58

ccacacacag cctactttcc aagcggagcc atgtctggta acggcaatgc ggctgcaacg 60

gcggaagaaa acagcccaaa gatgagagtg attcgcgtgg gta 103

<210> 59

<211> 2724

<212> DNA

<213> humano<400> 59

ggtgccatgg ctgagtcaca cctgctgcag tggctgctgc tgctgctgcc cacgctctgt 60ggcccaggca ctgctgcctg gaccacctca tccttggcct gtgcccaggg ccctgagttc 120tggtgccaaa gcctggagca agcattgcag tgcagagccc tagggcattg cctacaggaa 180gtctggggac atgtgggagc cgatgaccta tgccaagagt gtgaggacat cgtccacatc 240cttaacaaga tggccaagga ggccattttc caggacacga tgaggaagtt cctggagcag 300gagtgcaacg tcctcccctt gaagctgctc atgccccagt gcaaccaagt gcttgacgac 360tacttccccc tggtcatcga ctacttccag aaccagactg actcaaacgg catctgtatg 420cacctgggcc tgtgcaaatc ccggcagcca gagccagagc aggagccagg gatgtcagac 480cccctgccca aacctctgcg ggaccctctg ccagaccctc tgctggacaa gctcgtcctc 540cctgtgctgc ccggggccct ccaggcgagg cctgggcctc acacacagga tctctccgag 600cagcaattcc ccattcctct cccctattgc tggctctgca gggctctgat caagcggatc 660caagccatga ttcccaaggg tgcgctagct gtggcagtgg cccaggtgtg ccgcgtggta 720cctctggtgg cgggcggcat ctgccagtgc ctggctgagc gctactccgt catcctgctc 780gacacgctgc tgggccgcat gctgccccag ctggtctgcc gcctcgtcct ccggtgctcc 840atggatgaca gcgctggccc aaggtcgccg 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<210> 79<211> 3745<212> DNA<213> humano<400> 79

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<210> 80<211> 901<212> DNA<213> humano<400> 80

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<210> 83

<211> 1372

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<400> 83

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Claims (9)

1. Método de identificação de carcinoma pancreático que com-preende as etapas de:a. obtenção de uma amostra contendo células metastáticas;b. medida de biomarcadores associados à expressão de genesmarcadores F5, PSCA, ITGB6, KLK10, CLDN18, TR10 ou FKBP10.em que níveis de expressão dos genes marcadores acima ouabaixo dos níveis de corte predeterminados são indicativos da presença decâncer pancreático na amostra.

2. Método da reivindicação 1 em que os genes marcadores sãoF5 e PSCA.

3. Método da reivindicação 2 em que os genes marcadores ain-da compreendem ou são substituídos por ITGB6, KLK10, CLDN18, TR10e/ou FKBP10.

4. Método de uma das reivindicações 1-3, em que a expressãogênica é medida com o uso de pelo menos um dos IDS. DE SEQ. Nos: 39-41e 43-45.

5. Composição que compreende pelo menos uma seqüência i-solada selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 39-41 e 43-45.

6. Kit para a realização de um ensaio de acordo com uma dasreivindicações 1 -3 que compreende: reagentes de detecção do biomarcador.

7. Microarranjo ou chip gênico para a realização do método deuma das reivindicações 1 -3.

8. Portfólio diagnóstico/prognóstico que compreende seqüên-cias isoladas de ácidos nucléicos, seus complementos, ou porções destas,de uma combinação de genes de acordo com uma das reivindicações 1-3 ou-1 -3, em que a combinação é suficiente para medir ou caracterizar a expres-são gênica em uma amostra biológica que possui células metastáticas emrelação às células de carcinomas diferentes ou de tecido normal.

9. Método de acordo com uma das reivindicações 1-3 ou 1-3,que ainda compreende a medida da expressão de pelo menos um gene ex-presso constitutivamente na amostra.