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BRPI0609224A2 - nanocorpos melhorados contra fator alfa de necrose tumoral - Google Patents

nanocorpos melhorados contra fator alfa de necrose tumoral Download PDF

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BRPI0609224A2
BRPI0609224A2 BRPI0609224-1A BRPI0609224A BRPI0609224A2 BR PI0609224 A2 BRPI0609224 A2 BR PI0609224A2 BR PI0609224 A BRPI0609224 A BR PI0609224A BR PI0609224 A2 BRPI0609224 A2 BR PI0609224A2
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BR
Brazil
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amino acid
nanobody
acid sequence
protein
seq
Prior art date
Application number
BRPI0609224-1A
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English (en)
Inventor
Els Beirnaert
Original Assignee
Ablynx Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by Ablynx Nv filed Critical Ablynx Nv
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Publication of BRPI0609224A2 publication Critical patent/BRPI0609224A2/pt
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Abstract

NANOCORPOS MELHORADOS CONTRA FATOR ALFA DE NECROSE TUMORAL. A presente invenção se refere aos nanocorpos melhorados contra Fator-Alfa de Necrose Tumoral (TNF-alfa), bem como a polipeptídios compreendendo ou essencialmente compostos de um ou vários de tais nanocorpos. A invenção também se refere aos ácidos nucléicos que codificam tais nanocorpos e polipeptídios; a métodos para preparar tais nanocorpos e polipeptídios; a células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar tais nanocorpos ou polipeptídios; a composições que compreendem tais nanocorpos, polipeptídios, ácidos nucléicos ou células hospedeiras; e aos usos de tais nanocorpos, tais polipeptídios, tais ácidos nucléicos, tais células hospedeiras ou tais composições, em particular para fins profiláticos, terapêuticos ou de diagnóstico.

Description

NANOCORPOS MELHORADOS CONTRA FATOR ALFA DE NECROSE
TUMORAL
A presente invenção se refere a nanocorpos melhorado contra fator alfa de necrose tumoral (TNF-alfa), bem como à polipeptidios compreendendo ou essencialmente compostos de um ou vários de tais nanocorpos. [Observação: Nanocorpo(s) se referem a Nanobodyaif Nanobodies™ e Nanoclone que são marcas registradas da Ablynx N.V.]
A invenção também se refere aos ácidos nucléicos que codificam tais nanocorpos e polipeptidios; a métodos para preparar tais nanocorpos e polipeptidios; apresentar células que expressam ou são capazes de expressar tais nanocorpos ou polipeptidios; a composições que compreendem tais nanocorpos, polipeptidios, ácidos nucléicos ou células hospedeiras; e a usos de' tais nanocorpos, tais polipeptidios, tais ácidos nucléicos, tais células hospedeiras ou tais composições, especialmente para objetivos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos, como objetivos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos mencionados mais adiante.
Outros aspectos, modalidades de execução, vantagens e aplicações da invenção ficarão claros da nova descrição a seguir.
0 WO 04/041862 pelo solicitante refere-se a nanocorpos contra o TNF-alfa e à preparação e uso do mesmo, especialmente para a prevenção e/ou o tratamento de doenças e desordens associadas com e/ou mediado pelo TNF-alfa, como inflamação, artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome inflamatória do intestino, esclerose múltipla, doença de Addison, hepatite autoimune, parotite autoimune, diabete tipo 1, epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, sindrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolitica, lupus eritematoso sistêmico, infertilidade masculina, esclerose múltipla, miastenia gravis, pênfigo, psoríase, febre reumática, artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma, sindrome de Sjogren, espondiloartropatias, tireoidite, e vasculite.
O nanocorpos anti-TNF segundo o WO 04/041862 pode ser humanizado e pode ser monovalente ou multivalente, o último do qual leva à afinidade aumentada para TNF. Os nanocorpos anti-TNF, segundo o WO 04/041862 também pode ser multiespecifico, e ser especialmente na forma de um construto multiespecifico compreendendo dois ou mais nanocorpos contra TNF e um novo Nanocorpo dirigido contra uma proteína de soro como albumina de soro humana, que leva a uma meia-vida aumentada in vivo.
O WO 04/041862 também se relaciona aos métodos para a preparação dos nanocorpos anti-TNF, aos ácidos nucléicos ou construtos que codificam os nanocorpos anti-TNF, bem como a composições farmacêuticas que compreendem os nanocorpos anti-TNF, que pode ser conveniente para administração intravenosa, subcutânea, oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal ou retal, ou para administração pela inalação. Os nanocorpos anti-TNF segundo o WO 04/041862 também pode ser usado com para objetivos de diagnósticos, opcionalmente na forma de um kit-de-partes.
O EP 0 486526 descreve o TNF-alfa que liga ligandos contra um epitope específico de TNF. Entre os ligandos de ligação, anticorpos de domínio únicos ("dAbs") são mencionados.
Reiter et al., J. Mol.Biol. (1999), 290, 685-698 descrevem anticorpos de domínio únicos contra o TNF-alfa obtida de uma biblioteca de exposição de fagos aleatória que foi gerada começando de um andaime de domínio VH de um hibridoma de rato.
O WO 00/29004 descreve anticorpos de domínio únicos murina ("microcorpos") contra o TNF-alfa.
O WO 04/003019 entre outras coisas descreve ligandos compreendendo um primeiro domínio obrigatório contra o TNF- alfa e um segundo domínio obrigatório contra uma proteína de soro como albumina de soro.
É um objeto geral da presente invenção fornecer nanocorpos contra o TNF-alfa, especialmente contra o TNF- alfa humana.
Especialmente, é um objeto da presente invenção fornecer nanocorpos contra o TNF-alfa, especialmente contra o TNF-alfa humana, e fornecer proteína ou polipeptídios que compreendam os mesmos, que sejam convenientes para o uso terapêutico e/ou diagnóstico, e especialmente para a prevenção, tratamento e/ou diagnóstico de uma ou várias doenças e desordens associadas com e/ou mediado pelo TNF- alfa como os acima mencionados, e/ou que pode usado na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou o tratamento de uma ou várias doenças associadas com e/ou mediadas pelo TNF-alfa, como os acima mencionados.
Mais especialmente, é um objeto da invenção fornecer nanocorpos contra o TNF-alfa, e fornecer proteína e polipeptídios que compreendam os mesmos, que são uma alternativa ao nanocorpos e polipeptídios contra o TNF-alfa descrita em WO 04/041862 e/ou que tem uma ou várias propriedades ou características melhoradas, em comparação com os nanocorpos e polipeptídios contra o TNF-alfa descrita em WO 04/041862.
Mais especialmente, é um objeto da invenção fornecer nanocorpos contra o TNF-alfa, e fornecer proteína ou polipeptídios que compreendam os mesmos, que são melhorados em comparação com os nanocorpos e polipeptídios contra o TNF-alfa descrita em WO 04/041862 com respeito a uma ou várias das propriedades ou características seguintes:
- afinidade aumentada para o TNF-alfa, seja em um formato monovalente, em um formato multivalente (por exemplo em um formato bivalente) e/ou em um formato multiespecífico (por exemplo um dos formatos multiespecíficos descritos em WO 04/041862 ou a seguir);
- melhor conveniência para formatação em um formato multivalente (por exemplo em um formato bivalente); melhor conveniência para formatação em um formato muitiespecifico (por exemplo um dos formatos
multiespecificos descritos em WO 04/041862 ou a seguir); conveniência melhorada ou suscetibilidade para
substituições "humanizantes" (conforme definido na presente); e/ou
- menos imunogenicidade, seja em um formato monovalente, em um formato multivalente (por exemplo em um formato bivalente) e/ou em um formato multiespecifico (por exemplo
um dos formatos multiespecificos descritos em WO 04/041862 ou a seguir) em um formato monovalente;
- estabilidade aumentada, seja em um formato monovalente, em iam formato multivalente (por exemplo em um formato bivalente) e/ou em um formato multiespecifico (por exemplo
um dos formatos multiespecificos descritos em WO 04/041862 ou a seguir) em um formato monovalente;
- especificidade aumentada em direção o TNF-alfa, seja em um formato monovalente, em um formato multivalente (por exemplo em um formato bivalente) e/ou em um formato multiespecifico (por exemplo um dos formatos multiespecificos descritos em WO 04/041862 ou a seguir) em um formato monovalente;
- reduzido ou onde desejado reatividade cruzada aumentada com TNF-alfa de espécie diferente;
e/ou
- uma ou várias outras propriedades melhoradas desejáveis para uso farmacêutico (inclusive uso profilático e/ou uso terapêutico) e/ou uso para diagnóstico (inclusive, mas não limitado a, usar para objetivos de visualização), seja em um formato monovalente, em um formato multivalente (por exemplo em um formato bivalente) e/ou em um formato multiespecifico (por exemplo um dos formatos multiespecificos descritos em WO 04/041862 ou a seguir).
Esses objetos são realizados pelo nanocorpos, proteína e polipeptídios descritos na presente. Esses nanocorpos também são mencionados na presente como "nanocorpos da invenção"; e essa proteína e os polipeptídios também são coletivamente mencionados na presente "os polipeptídios da invenção".
Desde que os nanocorpos e os polipeptídios descritos na presente são principalmente destinados para uso terapêutico e/ou diagnóstico, eles são dirigidos contra (conforme definido na presente) TNF-alfa humana. Não é contudo excluído (mas também não requerido) que nanocorpos e os polipeptídios descritos na presente mostrem reatividade cruzada com o TNF-alfa de uma ou várias outras espécies de animais de sangue quente, por exemplo, com o TNF-alfa de uma ou várias outras espécies de primatas e/ou com o TNF-alfa de uma ou várias espécies de animais que freqüentemente são usados em modelos animais para doenças (por exemplo camundongo, rato, coelho, porco ou cão), e especialmente em modelos animais para doenças e desordens associadas com o TNF-alfa (como a espécie e modelos animais mencionados na presente) . Neste aspecto, estará claro para a pessoa experimentada que tal reatividade cruzada, quando presente, pode ter vantagens do ponto de vista do desenvolvimento de fármaco, desde que permita que os nanocorpos e polipeptídios contra o TNF-alfa humana seja testado em tais modelos de doença.
A presente invenção também está, no seu sentido mais amplo, não particularmente limitada a ou definida para um determinante antigênico específico, epitope, parte, domínio, subunidade ou confirmação (onde aplicável) do TNF-alfa contra a qual os nanocorpos e os polipeptídios da invenção estão dirigidos.
Contudo, em uma modalidade de execução preferencial, o nanocorpos, a proteína ou os polipeptídios descritos na presente são dirigidos contra e/ou podem ligar a um epitope do TNF-alfa que está em e/ou é parte do(s) sítio (s) de ligação do receptor TNF (p. ex. os sítios de ligação para o TNF-RI, THF-RII, também conhecidos como p55 ou p75). Como é bem conhecido na técnica, um Trímero TNF compreende três sítios de ligação de receptor, que são essencialmente equivalentes e que são formados por/na interface de dois Monômeros TNF dentro do Trimero TNF. Por exemplo, o nanocorpos, a proteína ou os polipeptídios descritos na presente são preferivelmente dirigidos contra e/ou podem ligar a um epitope do TNF-alfa que compreende os resíduos aminoácidos seguintes do TNF-alfa: Gln na posição 88, Lys na posição 90, e/ou Glu na posição 146).
Especialmente, o nanocorpos, a proteína ou os polipeptídios descritos na presente são dirigidos contra e/ou podem ligar a um epitope do Trímero TNF-alfa, que está em e/ou é parte do(s) sítios que ligam receptor TNF. Por exemplo, o nanocorpos, a proteína ou os polipeptídios descritos na presente podem ser dirigidos contra e/ou podem ligar a um epitope do Trímero TNF-alfa que compreende os resíduos aminoácidos seguintes: o Gln na posição 88 e Lys na posição 90 em um primeiro Monômero TNF (mencionado na presente como "monômero A"), e Glu na posição 146 em um segundo Monômero TNF (mencionado na presente como "monômero B") (no qual Monômero A e Monômero B em conjunto, no Trímero TNF, formam o(s) sítio(s) que ligam receptor TNF).
Mais em particular, o nanocorpos, a proteína ou os polipeptídios descritos na presente podem ser dirigidos contra e/ou podem ligar a um epitope de Trímero TNF-alfa que compreende os aminoácidos acima mencionados (Gln na posição 8 8 no monômero A; Lys na posição 90 no monômero A e Glu na posição 146 no monômero Β) , e além disso, pelo menos um, preferivelmente dois ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, e preferivelmente todos ou essencialmente todos, dos resíduos aminoácidos seguintes do TNF-alfa monômero A: Gly na posição 24, Gln na posição 25, Thr na posição 72, His na posição 73, Val na posição 74, Leu na posição 75, Thr na posição 77, Thr na posição 79, Ile na posição 83, Thr na posição 89, Val na posição 91. Asn na posição 92, Ile na posição 97, Arg na posição 131, Glu na posição 135, Ile na posição 136, Asn na posição 137, Arg na posição 138, Pro na posição 139, Asp na posição 140 e os resíduos seguintes no monômero Β: Pro na posição 20, Arg na posição 32, Lys na posição 65, Lys na posição 112, Tyr na posição 115, Ala na posição 145, Ser na posição 147.
Alternativamente, o nanocorpos, a proteína ou os polipeptídios descritos na presente podem ser dirigidos contra e/ou podem ligar a um epitope do TNF-alfa que compreende os aminoácidos acima mencionados (Gln na posição 88 no monômero A; Lys na posição 90 no monômero A e Glu na posição 14 6 no monômero Β) , e além disso, pelo menos um, preferivelmente dois ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais e preferivelmente todos ou essencialmente todos, dos resíduos aminoácidos seguintes de TNF-alfa monômero A: Leu na posição 75, Thr na posição 77, Thr na posição 79, Ile na posição 80, Ser na posição 81, Tyr na posição 87, Thr na posição 89, Val na posição 91, Asn na posição 92, Ser na posição 95, Ile na posição 97, Glu na posição 135, Ile na posição 136, Asn na posição 137 e os resíduos seguintes no monômero B: Ala na posição 33, Ala na posição 145, Ser na posição 147.
Tal epitope pode ser delineado da análise estrutural do nanobody cristalizado no complexo com a molécula TNF, ou das outras aproximações como mapeamento de epitope via análise pepscan.
Por comparação, de dados cristalográficos (não mostrado), pode ser visto que o Nanocorpo 3E de WO 04/041862 liga a um epitope diferente (isto é, um epitope que compreende Tyr na posição 141, Asp na posição 140, Gln na posição 67, Gly na posição 24 e Glu na posição 23) do que o epitope preferencial da invenção.
Portanto, em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um domínio variável de imunoglobulina (ou um fragmento conveniente disso) que pode ligar a um epitope do TNF-alfa que está em e/ou é parte do sítio que liga o receptor TNF, e preferivelmente a um epitope que compreende pelo menos um, preferivelmente dois ou mais, e preferivelmente todos, dos resíduos aminoácidos seguintes de TNF-alfa: Gln na posição 88; Lys na posição 90 e Glu na posição 14 6. Tal dominio variável de imunoglobulina é preferivelmente um domínio variável de cadeia pesada ou um domínio variável de cadeia leve, e especialmente um domínio variável de cadeia pesada, que pode ser qualquer domínio variável de cadeia pesada de mamíferos, inclusive, mas não limitado a, domínios variáveis de cadeias pesadas humanos, domínios variáveis de cadeias pesadas de ratos e domínios variáveis de cadeias pesadas de camelídeos (como os domínios variáveis de cadeias pesadas de imunoglobulinas de 4 cadeias de camelídeos ou os domínios variáveis de cadeias pesadas (domínios de VHH) dos assim chamados anticorpos de cadeias pesadas). O domínio variável de imunoglobulina é preferivelmente um anticorpo de domínio ou um anticorpo de domínio único ou conveniente para usar como um anticorpo de domínio (único). Mais preferivelmente, o domínio variável de imunoglobulina é um nanocorpo (conforme definido na presente), e alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos de nanocorpos que são convenientes para usar neste aspecto da invenção são PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) e PMP5F10 (TNF3, SEQ ID n. 60), bem como outras variantes humanizadas dos mesmos (conforme mais adiante descrito na presente).
O domínio variável de imunoglobulina acima mencionado também pode ser humanizado (como por exemplo, e sem restrição) descrito na presente com respeito a nanocorpos. A invenção também se refere a proteína e polipeptídios que compreendem ou essencialmente se compõem de tais domínios variáveis de imunoglobulina, que, por exemplo, podem ser como definidos na presente. Alternativamente, tais domínios variáveis podem ser parte de Construtos ScFv, construtos duplos específicos, anticorpo quimérico ou estruturas de anticorpo e outros construtos de imunoglobulina, como, por exemplo, revisto por Hoogenboom (Biotecnologia da Natureza (1997), 15:125-126). Preferivelmente, contudo, os domínios variáveis de imunoglobulina dirigidos contra o epitope acima mencionado são nanocorpos, em cujo caso a proteína e os polipeptidios que compreendem tais nanocorpos podem ser conforme mais adiante descritos na presente.
Portanto, alguns aspectos preferenciais da invenção referem-se a :
I) Um Nanocorpo que é dirigido contra o mesmo epitope no trimero do TNF-alfa como Nanocorpo TNFl (SEQ ID η. 52).
II) Um Nanocorpo que é dirigido contra o mesmo epitope no trimero do TNF-alfa como Nanocorpo TNF3 (SEQ ID η. 60).
III) Um Nanocorpo que é dirigido contra um epitope do trimero do TNF-alfa que pelo menos compreende os resíduos aminoácidos seguintes: Gln na posição 8 8 no monômero A; Lys na posição 90 no monômero A e Glu na posição 14 6 no monômero B.
IV) Um Nanocorpo que é dirigido contra iam epitope do trimero do TNF-alfa que compreende os resíduos aminoácidos seguintes: Gln na posição 88 no monômero A; Lys na posição 90 no monômero A e Glu na posição 146 no monômero B; e que, além disso, compreende pelo menos um, preferivelmente dois ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, e preferivelmente todos ou essencialmente todos,
dos resíduos aminoácidos seguintes do TNF-alfa monômero A: Gly na posição 24, Gln na posição 25, Thr na posição 72, His na posição 73, Val na posição 74, Leu na posição 75, Thr na posição 77, Thr na posição 79, Ile na posição 83, Thr na posição 89, Val na posição 91. Asn na posição 92, Ile na posição 97, Arg na posição 131, Glu na posição 135, Ile na posição 136, Asn na posição 137, Arg na posição 138, Pro na posição 139, Asp na posição 140 e os resíduos seguintes no monômero B: Pro na posição 20, Arg na posição 32, Lys na posição 65, Lys na posição 112, Tyr na posição 115, Ala na posição 145, Ser na posição 147.
V) Um Nanocorpo que é dirigido contra um epitope do trimero do TNF-alfa que compreende os resíduos aminoácidos
seguintes: Gln na posição 88 no monômero A; Lys na posição 90 no monômero A e Glu na posição 14 6 no monômero B; e que, além disso, compreende pelo menos um, preferivelmente dois ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, e preferivelmente todos ou essencialmente todos, dos resíduos aminoácidos seguintes do TNF-alfa monômero
A Leu na posição 75, Thr na posição 77, Thr na posição 79, Ile na posição 80, Ser na posição 81, Tyr na posição 87, Thr na posição 89, Val na posição 91, Asn na posição 92, Ser na posição 95, Ile na posição 97, Glu na posição 135, Ile na posição 136, Asn na posição 137 e os resíduos seguintes no monômero B: Ala na posição 33, Ala na posição 145, Ser na posição 147.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que tem uma taxa K0ff para TNF de melhor do que 2. IO"3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10-3.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO:4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; ou uma variante humanizada de tal Nanoeorpo.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 12nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo..
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.. - Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que é um Nanocorpo humanizado.
e alguns aspectos preferenciais desta modalidade de execução relacionam-se a:
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que é um Nanocorpo de classe GLEW.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que é um Nanocorpo humanizado de classe GLEW.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que contém um resíduo de arginina (R) na posição 103.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que contém um resíduo de arginina (R) na posição 103, e que é humanizado
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que é um Nanoeorpo de classe GLEW, e que contém um resíduo de arginina (R) na posição 103, e que é humanizado.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que contém um resíduo de leucina (L) na posição 108.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que tem pelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 (TNFl) , 76 (TNF13) , 77 (TNF14) , 95 (TNF29) ou 96 (TNF30)
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, em que
a) O CDR1 compreende:
- a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida DYWMY;
e
b) O CDR2 compreende: - a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG;
e
c) O CDR3 compreende:
-a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
-uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SPSGFN; ou -umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida SPSGFN.
-Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR1 compreende a seqüência aminoácida DYWMY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, em que:
- O CDR1 compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- O CDR1 compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- 0 CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR1 compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN. - Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; o CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 compreendem a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, em que
a) O CDR1 é:
-a seqüência aminoácida DYWMY; ou
-uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida DYWMY;
e em que:
b) O CDR2 é:
- a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG;
e em que
c) O CDR3 é:
- a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR1 é a seqüência aminoácida DYWMY. - Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, em que:
- O CDR1 é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- O CDR1 é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- O CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR1 é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; o CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, em que qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
- a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
e alguns outros aspectos preferenciais desta modalidade de execução relacionam-se a :
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que é um Nanocorpo de classe KERE
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que é um Nanocorpo humanizado de classe KERE
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO'S 50 (TNF3), 83 (TNF20) , 85 (TNF21), 85 (TNF22) , 96 (TNF23) ou 98 (TNF33).
-Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, em que
- O CDRl é:
- a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, pref erivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NYYMG; ou
umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida NYYMG;
e
b) 0 CDR2 é:
- a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e
c) 0 CDR3 é:
- a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY. - Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, em que :
-O CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
-O CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
-O CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
-Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, no qual CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; o CDR2 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY e CDR3 é a seqüência aminoácida ILPLSDDPGWNTY.
-Um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima, em que
- qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
-a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s) aminoácida(s) acima mencionadas, e com ainda alguns outros aspectos particularmente preferenciais sendo:
VI) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende a ou essencialmente se compõe de um Nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima.
VII) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo conforme algum dos I) a V) acima. VIU) Uma proteína ou polipeptidio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima.
IX) Uma proteína ou o polipeptidio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, e que é tal que a referida proteína ou o polipeptidio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou de reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor.. X) Uma proteína ou polipeptidio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF.
XI) Uma proteína ou polipeptidio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, ligado através de um linker adequado.
XII) Uma proteína ou polipeptidio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, ligado através de um linker adequado, e que é pegilado. XIII) Uma proteína ou polipeptidio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, e que, além disso, compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
XIV) Uma proteína ou o polipeptidio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, e que, além disso, compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e que é tal que a referida proteína ou o polipeptidio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor..
XV) Uma proteína ou polipeptidio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, e que, além disso, compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trimero TNF.
XVI) Uma proteína ou polipeptídio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, e que, além
disso, compreende um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, na qual cada um dos dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima é ligado, opcionalmente através de um linker conveniente, a um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
XVII)Uma proteína ou o polipeptídio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, e que, além disso, compreende um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, na qual cada um dos dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima é ligado, opcionalmente através de iam linker conveniente, a um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e que é tal que a referida proteína ou o polipeptídio, para ligar a um Trimero TNF, é capaz de inibir ou de reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor..
XVIII)Uma proteína ou polipeptídio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima, e que, além disso, compreende um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, na qual cada um dos dois nanocorpos conforme algum dos I) a V) acima é ligado, opcionalmente através de um linker conveniente, a um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF.
Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos VI) a XVIII) acima, no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado. - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos VI) a XVIII) acima, no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID n. 63).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos VI) a XVIII) acima, no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n. 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102) ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos VI) a XVIII) acima, no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é a ALB 8.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos VI) a XVIII) acima, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos humanizados conforme algum dos I) a V) acima, e uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID η. 63).
Deve ser observado que quando um Nanocorpo é acima mencionado como sendo "conforme algum dos I) a V) acima", é pelo menos segundo um de I) a V) , pode ser segundo dois ou mais de I) a V) , e também incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme algum dos I) a V) acima". Semelhantemente quando uma proteína ou o polipeptidio são acima mencionados como sendo "conforme algum dos VI) a XVIII) acima", é pelo menos segundo um de VI) a XVIII), pode ser segundo dois ou mais de VI) a XVIII), e também pode incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme algum dos VI) a XVIII) acima.
Está também dentro dos limites da invenção que, onde aplicável, um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção podem ligar dois ou mais determinantes antigênicos, epitopes, partes, domínios, subunidades ou confirmações do TNF-alfa. Em tal caso, os determinantes antigênicos, epitopes, partes, domínios ou subunidades do TNF-alfa à qual os nanocorpos e/ou os polipeptídios da invenção ligam podem ser essencialmente o mesmo (por exemplo, se o TNF-alfa contiver motivos estruturais repetidos ou estiver presente como um multímero) ou pode ser diferente (e no último caso, os nanocorpos e os polipeptídios da invenção podem ligar a tais determinantes antigênicos diferentes, epitopes, partes, domínios, subunidades do TNF-alfa com uma afinidade e/ou especificidade que pode ser a mesma ou diferente). Também, por exemplo, quando o TNF-alfa existe em uma conformação ativada e em uma conformação inativa, os nanocorpos e os polipeptídios da invenção podem ligar a uma dessas conformações, ou ligar a ambas estas conformações (isto é, com uma afinidade e/ou especificidade que pode ser a mesma ou diferente). Também, por exemplo, os nanocorpos e os polipeptídios da invenção podem ligar a uma conformação do TNF-alfa na qual é ligado a um ligando pertinente, pode ligar a uma conformação do TNF-alfa na qual ele não está ligado a um ligando pertinente, ou pode ligar a ambas tais conformações (novamente com uma afinidade e/ou especificidade que pode ser a mesma ou diferente).
Também é esperado que os nanocorpos e os polipeptídios da invenção ligarão geralmente a todos os análogos sintéticos ou naturais, variantes, mutantes, alelos, partes e fragmentos do TNF-alfa, ou pelo menos àqueles análogos, variantes, mutantes, alelos, partes e fragmentos do TNF-alfa que contêm um ou vários determinantes antigênicos ou epitopes que são essencialmente o mesmo que o(s) determinante(s) antigênico(s) ou epitope(s) ao qual os nanocorpos e os polipeptídios da invenção ligam-se no TNF- alfa (p. ex. no TNF-alfa de tipo natural). Novamente, em tal caso, os nanocorpos e os polipeptídios da invenção podem ligar a tais análogos, variantes, mutantes, alelos, partes e fragmentos com uma afinidade e/ou especificidade que são o mesmo que, ou que diferente (isto é, mais alto do que, ou mais baixo do que), a afinidade e especificidade com a qual os nanocorpos da invenção ligam (ao tipo natural) o TNF- alfa. Também está incluído dentro dos limites da invenção que os nanocorpos e os polipeptídios da invenção ligam a alguns análogos, variantes, mutantes, alelos, partes e fragmentos do TNF-alfa, mas não a outros.
Geralmente, os nanocorpos e os polipeptídios da invenção ligarão pelo menos àquelas formas (inclusive monoméricas, multiméricas e formas associadas) que são as mais relevantes de um ponto de vista biológico e/ou terapêutico, como estará claro para a pessoa experimentada.
Também, como o TNF-alfa existe em uma forma monomérica e em formas multiméricas, e especialmente na forma trimérica, é dentro dos limites da invenção que os nanocorpos e os polipeptídios da invenção só ligam à TNF- alfa na forma monomérica, ou que os nanocorpos e os polipeptídios da invenção além disso, também ligam a uma ou várias de tais formas multiméricas, como a forma trimérica de TNF; ou só pode ligar a tais formas multiméricas (p. ex. triméricas). Portanto, geralmente, quando nesta descrição é feita referência a um Nanocorpo, proteína ou polipeptídio que é dirigido à TNF-alfa, deve ser entendido que isto também compreende nanocorpos dirigidos contra o TNF-alfa na sua forma trimérica (inclusive, mas não limitado a, nanocorpos contra o sítios que ligam receptor (p. ex. os sítios de ligação para o TNF-RI, THF-RII, também conhecido como p55 ou p75) de tal trímero) . Em todos esses casos, os nanocorpos e os polipeptídios da invenção podem ligar a tais multímeros ou complexos de proteína associados com uma afinidade e/ou especificidade que pode ser o mesmo que ou diferente (isto é, mais alto do que, ou mais baixo do que) a afinidade e/ou especificidade com a qual os nanocorpos e os polipeptídios da invenção ligam à TNF-alfa no seu estado monomérico e não-associado.
Também, geralmente, os polipeptídios da invenção que contêm dois ou mais nanocorpos dirigidos contra o TNF-alfa podem ligar com mais alta avidez do que os correspondentes Nanocorpo ou nanocorpos monoméricos.
Por exemplo, e sem restrição, uma proteína multivalente (conforme definido na presente) ou o polipeptidio que contém dois ou mais nanocorpos que são dirigidos contra epitopes diferentes do TNF-alfa multivalente (conforme definido na presente) proteína ou polipeptidio que contém dois ou mais nanocorpos que são dirigidos contra epitopes diferente do TNF-alfa podem ligar à TNF-alfa com mais alta avidez do que os monômeros correspondentes.
O que é mais importante, uma proteína multivalente (conforme definido na presente) ou o polipeptidio que contém dois ou mais nanocorpos que são dirigidos contra o TNF-alfa podem (e normalmente vão) ligar com mais alta avidez a um multímero do TNF-alfa do que a um monômero do TNF-alfa, e também ligará normalmente com mais alta avidez do que os nanocorpos monoméricos correspondentes. Em tal proteína ou polipeptidio multivalente, os dois ou mais nanocorpos, por exemplo, podem ser dirigidos contra os mesmos epitopes, epitopes substancialmente equivalentes, ou epitopes diferentes. Em uma modalidade de execução de uma tal proteína ou polipeptidio multivalente, os dois ou mais nanocorpos podem ser os mesmos (e por isso ser dirigidos contra o mesmo epitope).
O último tem importância particular, dado que se conhece que o modo primário da transdução de sinal por TNF implica ligação cruzada por receptores TNF por um trímero de moléculas TNF, que contém três sítios de ligação de receptor (ver, por exemplo, Peppel et al., J. Exp. Med., 174 (1991), 1483-1489; Engelmann et al., J. Biol. Chem., 265 (1990), 14497; Smith e Baglioni, J. Biol. Chem., 264 (1989), 14646). Por exemplo, como descrito por Peppel et al., um domínio extracelular monovalente projetado do receptor TNF - que foi só capaz de bloquear um sítio que liga um receptor único em um Trímero TNF - foi incapaz de prevenir ligação cruzada dos receptores TNF pelos dois sítios que ligam receptor; ao passo que uma proteína projetada que compreende dois tais domínios extracelulares - portanto sendo capaz de bloquear dois sítios que ligam receptor - forneceu uma eficácia impressionante em comparação com o domínio extracelular monovalente.
Na presente invenção, foi encontrado que nanocorpos monovalentes são capazes da ligação à TNF-alfa de tal modo que a atividade de TNF é reduzida, tanto em modelos in vitro, em modelos celulares como em modelos ex vivo (ver a Seção Experimental mais adiante). Embora a invenção não seja limitada a nenhum mecanismo específico, explicação ou hipótese, é assumido que por causa do seu pequeno tamanho e alta afinidade paro TNF-alfa, dois ou três nanocorpos monovalentes da invenção são capazes de simultaneamente ocupar dois ou três sítios de ligação de receptor diferentes no Trimero TNF, evitando portanto que o trímero inicie a ligação cruzada do receptor e conseqüentemente iniciar a transdução de sinal (contudo, outros mecanismos da ação não são excluídos: por exemplo, dependendo do epitope contra o qual é dirigido, um Nanocorpo da invenção também pode inibir a associação de TNF no estado trimérico).
Também deve ser observado que, além disso, ou como uma alternativa à ligação a dois ou mais sítios que ligam receptor a um TNF-trímero único, a proteína ou os polipeptídios da presente invenção compreendem ou essencialmente se compõem de dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina (ou fragmentos convenientes dos mesmos) que são dirigidos contra epitopes do TNF-alfa podem ligar (p. ex. intermolecularmente) epitopes em duas moléculas TNF- alfa separadas (p. ex. dois trímeros separados).
Contudo, segundo uma modalidade de execução em particular preferencial, a invenção refere-se a uma proteína ou polipeptídio que compreende ou essencialmente se compõe de dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina (ou fragmentos convenientes dos mesmos) que são cada um dirigidos contra epitopes no TNF-alfa (e especialmente do Trímero TNF-alfa) que se encontram em e/ou são a parte do(s) sitio (s) que ligam o receptor do Trimero TNF, tal que o referido polipeptidio, para ligar a um Trimero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trimero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor.
Especialmente, segundo esta modalidade de execução preferencial, a invenção refere-se a um polipeptidio de proteína que compreende ou essencialmente compõe-se de dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina (ou fragmentos convenientes dos mesmos) que são cada um dirigidos contra epitopes no TNF-alfa (e especialmente do Trimero TNF-alfa) que se encontram em e/ou é parte do(s) sítio (s) que ligam ao receptor do TNF-trímero, em que os referidos domínios variáveis de imunoglobulina são ligados um a outro de tal modo que a proteína ou o polipeptidio são capazes de ligar simultaneamente a dois ou mais sítios que ligam receptor em um Trimero TNF único (em outras palavras, é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trimero TNF). Nesta modalidade de execução, os dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina são preferivelmente conforme definidos acima e são mais preferivelmente nanocorpos (para que a proteína ou o polipeptidio sejam um construto Nanocorpo multivalente, conforme mais adiante descrito na presente). Também, nesta modalidade de execução, os dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina podem ser os mesmos ou diferentes; e podem ser dirigidos contra epitopes diferentes dentro dos sítio (s) que ligam ao receptor TNF, mas ser preferivelmente dirigidos contra o mesmo epitope.
Em um aspecto preferencial desta modalidade de execução, os dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina são dirigidos contra epitopes do Trimero TNF- alfa, no qual epitopes estão e/ou são parte do sítio(s) que ligam ao receptor TNF. Por exemplo, os dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina são preferivelmente dirigidos contra e/ou podem ligar a um epitope do Trimero TNF-alfa que compreende os resíduos aminoácidos seguintes: o Gln na posição 88 e Lys na posição 90 em um primeiro Monômero TNF (mencionado na presente como "monômero A") , e Glu na posição 14 6 em um segundo Monômero TNF (mencionado na presente como "monômero B") (no qual o Monômero A e Monômero B em conjunto, no Trimero TNF, formam o(s) sítio (s) que ligam receptor TNF).
Conforme além disso descrito mais adiante mais detalhadamente com respeito a nanocorpos, em tal proteína ou polipeptídio, pelo menos dois domínios variáveis de imunoglobulina são preferivelmente ligados de tal modo que a distância entre o N-termo e o C-termo dos dois domínios variáveis de imunoglobulina presentes em tal proteína ou polipeptídio é preferivelmente pelo menos 50 Angstrons, e mais preferivelmente na região de 55-200 Angstrons, e mais preferivelmente na região de Angstrons, e especialmente na região de 65-150 Angstrons.
Em um aspecto em particular preferencial desta modalidade de execução, essas duas ou mais seqüências de imunoglobulina são nanocorpos, e são preferivelmente escolhidas dos nanocorpos descritos na presente. Alguns nanocorpos particularmente preferíveis para usar nesta modalidade de execução da invenção são PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO: 52) e/ou PMP5F10 (TNF3, SEQ ID n. 60), bem como outras variantes humanizadas deles (conforme descrito na presente); com PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) e as suas variantes humanizadas que são em particular preferidas.
Conseqüentemente, a modalidade de execução presente será descrita agora mais detalhadamente com referência a nanocorpos. Contudo, estará claro para a pessoa experimentada que as presentes informações pode ser aplicado analogamente a domínios variáveis de imunoglobulina.
Nesta modalidade de execução da invenção, as duas ou mais seqüências de imunoglobulina serão normalmente ligadas via um ou vários linkers convenientes, cujos linkers são tais que cada seqüência de imunoglobulina pode ligar a um sítio que liga um receptor diferente no mesmo Trimero TNF. Linkers convenientes dependerá entre outras coisas (da distância entre) os epitopes no Trimero TNF ao qual as seqüências de imunoglobulina ligam, e estarão claros para a pessoa experimentada baseado na revelação presente, opcionalmente depois de algum grau limitado da experimentação de rotina. Por exemplo, quando as duas ou mais seqüências de imunoglobulina são anticorpos de domínio (únicos) ou nanocorpos, linkers convenientes podem ser escolhidos do linkers descritos na presente, mas com um comprimento de linker que é tal que dois ou mais (únicos) anticorpos de domínio ou nanocorpos podem ligar cada um a um sítio que liga um receptor diferente no mesmo Trimero TNF.
Também, quando as duas ou mais seqüências de imunoglobulina que ligam a sítios que ligam receptor do TNF- alfa são anticorpos de domínio (únicos) ou nanocorpos, eles também podem ser ligados um a outro via um terceiro (único) anticorpo de domínio ou Nanocorpo (no qual as duas ou mais seqüências de imunoglobulina podem ser ligadas diretamente ao terceiro (único) domínio anticorpo/Nanocorpo ou via linkers convenientes) . Tal terceiro (único) anticorpo de domínio ou Nanocorpo, por exemplo, pode ser um anticorpo de domínio (único) ou Nanocorpo que provê uma meia-vida aumentada, conforme mais adiante descrito na presente. Por exemplo, o último (único) anticorpo de domínio ou Nanocorpo podem ser um anticorpo de domínio (único) ou Nanocorpo que é capaz da ligação a uma proteína de soro (humana) como albumina de soro (humana), conforme mais adiante descrito na presente.
Alternativamente, as duas ou mais seqüências de imunoglobulina que ligam ao(s) sítio(s) que ligam ao receptor do TNF-alfa podem ser ligadas em série (diretamente ou através de um linker conveniente) e o terceiro (único) anticorpo de domínio ou Nanocorpo (que pode prover a meia- vida aumentada, como descrito anteriormente) pode ser conectado diretamente ou através de um linker a uma dessas duas ou mais seqüências de imunoglobulina acima mencionadas. Alguns exemplos não-restritivos de tais construtos são os construtos da SEQ ID NÚMEROS: 93 ou 94.
Especialmente, foi encontrado na invenção (ver os dados de cristalografia mencionados na presente) que, quando os nanocorpos presentes em uma proteína multiespecífica ou multivalente ou polipeptídio da invenção ligam a determinado epitope descrito anteriormente (que é o epitope de TNFl e as suas variantes humanizadas, bem como de TNF3 e as suas variantes humanizadas) então preferivelmente, os dois (ou mais) nanocorpos anti-TNF presentes em tal proteína ou polipeptídio devem ser ligados de tal modo que a distância entre o N-termo e o C-termo de dois nanocorpos anti-TNF presentes em tal proteína ou polipeptídio deve ser preferivelmente pelo menos 50 Angstrons, e mais preferivelmente na região de 55-200 Angstrons, e especialmente na região de 65-150 Angstrons (com o limite superior que é menos crítico, e é escolhido para razões da conveniência, p. ex. com a intenção da expressão/produção da proteína); ou mais geralmente que os referidos que a distância deve ser tal que permita que a proteína ou o polipeptídio experimente a ligação intramolecular ao TNF- trímero (isto é, em vez da ligação intermolecular). A distância entre o N-termo e o C-termo de dois nanocorpos anti-TNF pode ser determinada por qualquer meio conveniente, como por cristalografia ou modelagem molecular (conforme descrito na presente). Essas técnicas geralmente também permitem determinar se uma proteína multivalente específica ou uma proteína multiespecífica ou polipeptídio são capazes de fornecer a modelagem intramolecular. Alternativamente, a presente invenção também fornece um experimento simples que usa cromatografia de exclusão por tamanho (como descrito por Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129) que pode ser usado para determinar se uma proteína dada ou o polipeptídio da invenção fornecerão (predominantemente) a ligação intramolecular a um TNF-trímero ou ligação (predominantemente) intermolecular entre dois ou mais TNF- trimeros. Portanto, em uma determinada modalidade de execução da invenção, uma proteína ou o polipeptidio da invenção é preferivelmente tal que neste experimento, ele predominantemente ou essencialmente exclusivamente leva à ligação intramolecular Contudo, conforme enfatizado anteriormente, deve ser observado que a proteína ou os polipeptídios da invenção que funcionam via a ligação intermolecular de moléculas TNF-alfa separadas (p. ex. trímeros) estão também dentro dos limites da presente invenção.
Portanto, em outro aspecto preferencial, a invenção provê uma proteína multivalente ou multiespecífica ou polipeptidio que compreende pelo menos dois nanocorpos contra o TNF-alfa (e especialmente do Trímero TNF-alfa), no qual os referidos nanocorpos são preferivelmente dirigidos a essencialmente o mesmo epitope que o Nanocorpo PMP1C2 (como mencionado na presente) , e no qual os referidos pelo menos dois nanocorpos estão ligados de tal modo que a distância entre o N-termo e o C-termo de pelo menos dois nanocorpos anti-TNF é tal que a proteína ou o polipeptidio são capazes de experimentar a ligação intramolecular (conforme descrito na presente) com um TNF-trímero. Preferivelmente, em tal proteína ou polipeptidio, a distância entre o N-termo e o C- termo de dois nanocorpos anti-TNF é de pelo menos 50 Angstrons, e mais preferivelmente na região de 55-200 Angstrons, e especialmente na região de 65-150 Angstrons.
Em tal proteína preferencial ou polipeptidio, dois ou mais nanocorpos podem ser ligados em qualquer modo conveniente, enquanto a distância preferencial entre o N- termo e o C-termo de pelo menos dois nanocorpos anti-TNF possa ser realizada, e/ou enquanto a proteína ou o polipeptidio seja capaz de experimentar a ligação intramolecular (conforme descrito na presente) com um TNF- trímero.
Por exemplo, na sua forma mais simples, pelo menos dois nanocorpos são diretamente ligados através de um linker ou espaçador conveniente que provê a distância preferencial entre o N-termo e o C-termo do pelo menos dois nanocorpos anti-TNF e que pode permitir que a proteína ou o polipeptídio experimente a ligação intramolecular (conforme descrito na presente) com um TNF-trímero. Linkers convenientes são descritos na presente, e podem -, por exemplo, e sem restrição - compreender uma seqüência aminoácida, cuja seqüência aminoácida preferivelmente tem um comprimento de 14 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 17 aminoácidos, como aproximadamente seqüência aminoácida 20-40 (que, usando uma distância média de 3.5 Angstrom para um aminoácido, corresponde a comprimentos de linker de 49 Angstrons, 59.5 Angstrons e aproximadamente 70 Angstrons, respectivamente; com a quantidade máxima de aminoácidos que são calculados do mesmo modo baseado nas distâncias acima mencionadas). Preferivelmente, uma tal seqüência aminoácida também deve ser tal que permita que a proteína ou o polipeptídio experimente a ligação intramolecular (conforme descrito na presente) com um TNF- trímero .
Portanto, em outro aspecto preferencial, a invenção provê uma proteína multivalente ou multiespecífica ou o polipeptídio que compreende pelo menos dois nanocorpos contra o TNF-alfa (e especialmente do Trimero TNF-alfa), no qual os referidos nanocorpos são preferivelmente dirigidos a essencialmente o mesmo epitope que o Nanocorpo PMP1C2 (como mencionado na presente) , e no qual os referidos pelo menos dois nanocorpos são diretamente ligados um a outro usando um linker ou espaçador conveniente tal que a distância entre o N-termo e o C-termo de pelo menos dois nanocorpos anti-TNF é tal que a proteína ou o polipeptídio são capazes de experimentar a ligação intramolecular (conforme descrito na presente) com um TNF-trímero. Preferivelmente, em tal proteína ou polipeptídio, a distância entre o N-termo e o C- termo de dois nanocorpos anti-TNF (e conseqüentemente o comprimento preferencial do linker ou espaçador) é pelo menos 50 Angstrons, e mais preferivelmente na região de 55- 200 Angstrons, e especialmente na região de 65-150 Angstrons.
Mais preferivelmente, neste aspecto preferencial, o linker ou espaçador é uma seqüência aminoácida que compreende pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 17, mais preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos (com um limite superior não-critico escolhido para razões da conveniência sendo de cerca de 50, e preferivelmente aproximadamente 40 aminoácidos). Em uma modalidade de execução preferencial, mas não-restritiva, o linker essencialmente compõe-se de glicina e resíduos de serina (conforme adicionalmente descrito mais adiante). Por exemplo, um linker conveniente é o linker GS30 descrito na presente, que compreende 30 resíduos aminoácidos.
Em outra modalidade de execução, pelo menos dois nanocorpos contra o TNF-alfa são ligados um a outro via outra metade (opcionalmente via um ou dois linkers), como outra proteína ou polipeptídio. Nesta modalidade de execução, pode ser desejável ter a distância preferencial (isto é, conforme acima mencionado) entre o N-termo e o C- termo de pelo menos dois nanocorpos anti-TNF, por exemplo, tal que a proteína ou o polipeptídio ainda podem experimentar a ligação intramolecular (conforme descrito na presente) com um TNF-trímero. Nesta modalidade de execução, pelo menos dois nanocorpos podem ser ligados diretamente a outra metade, ou utilizando um linker ou espaçador conveniente, novamente enquanto a distância preferencial e/ou ligação intramolecular desejada ainda possa ser realizada. A metade pode ser qualquer metade conveniente que não diminua (demasiado) da ligação da proteína ou polipeptídio a TNF e/ou das novas propriedades biológicas ou farmacológicas desejadas da proteína ou polipeptídio. Como tal, a metade pode ser essencialmente inativa ou biologicamente ativa, e como tal pode melhorar ou não as propriedades desejadas da proteína ou polipeptidio e/ou conferir uma ou várias propriedades desejadas adicionais à proteína ou polipeptidio. Por exemplo, e sem restrição, a metade pode melhorar a meia-vida da proteína ou polipeptidio, e/ou reduzir a sua imunogenicidade ou melhorar qualquer outra propriedade desejada. Em uma modalidade de execução preferencial, a metade pode ser outro Nanocorpo (inclusive, mas não limitado a, um terceiro Nanocorpo contra o TNF-alfa, embora isto não seja necessário e normalmente menos preferencial), e especialmente outro Nanocorpo que melhore a meia-vida da proteína ou polipeptidio, como um Nanocorpo que é dirigido contra uma proteína de soro, por exemplo, contra uma albumina de soro humano. Os exemplos de tal proteína e polipeptídios são descritos na presente.
Portanto, em uma modalidade de execução, a invenção refere-se a um construto multiespecífico multivalente compreendendo duas ou mais seqüências de imunoglobulina (ou fragmentos convenientes dos mesmos) que são cada um dirigidos contra epitopes no TNF-alfa (p. ex. do Trímero TNF-alfa) que se encontram em e/ou faz parte do sítio que liga o receptor, e isto é, ligado um a outro via pelo menos uma seqüência de imunoglobulina que provê a meia-vida aumentada (e opcionalmente via um ou vários linkers convenientes), tal que o referido polipeptidio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por dito trímero TNF. Tal polipeptidio pode ser tal que as referidas duas ou mais seqüências de imunoglobulina podem ligar cada uma a um sítio que liga um receptor diferente em um Trímero TNF.
Especialmente, nesta modalidade de execução, o polipeptidio pode compreender um Nanocorpo biespecífico trivalente, que compreende dois nanocorpos que são cada um dirigidos contra epitopes no TNF-alfa (e especialmente do Trímero TNF-alfa) que se encontram em e/ou faz parte do sítio que liga o receptor, no qual os referidos nanocorpos são ligados um a outro via um terceiro Nanocorpo que provê uma meia-vida aumentada (p. ex. um Nanocorpo que é dirigido diretamente ligados ao referido terceiro Nanocorpo ou via um ou vários linkers convenientes, tal que o referido polipeptídio, para ligar a um Trimero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por dito trímero TNF. Tal polipeptídio pode ser tal que os referidos antes mencionados dois nanocorpos podem ligar cada um a um sítio que liga um receptor diferente em um Trímero TNF. Novamente, alguns nanocorpos em particular preferenciais para uso nesta modalidade de execução da invenção são PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO: 52) e/ou PMP5F10 (TNF3, SEQ ID n. 60), bem como outras variantes humanizadas deles (conforme descrito na presente); com PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) e as suas variantes humanizadas que são em particular preferidas; e nanocorpos dirigidos contra albumina de soro humana descrita na presente. Alguns preferidos, mas não-limitação construtos desta modalidade de execução da invenção são TNF 24 (SEQ ID n. 90), TNF 26 (SEQ ID n. 92), TNF 27 (SEQ ID n. 93), TNF 28 (SEQ ID n. 94), TNF 60 (SEQ ID n. 417) e TNF 62 (SEQ ID NO:418), do qual TNF 60 é em particular preferido.
Portanto, alguns aspectos preferenciais desta modalidade de execução da invenção relacionam-se a : XIX) Uma proteína ou o polipeptídio que compreende ou essencialmente se compõe de dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina (ou fragmentos convenientes dos mesmos) que são cada um dirigidos contra epitopes no TNF-alfa (e especialmente do Trímero TNF-alfa) que se encontram em e/ou fazem parte do(s) sítio(s) que ligam ao receptor do Trímero TNF, tais que os referidos polipeptídios, para ligar a um Trímero TNF, são capazes de inibir ou de reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor. XX) Uma proteína ou o polipeptidio que compreende ou essencialmente se compõe de dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina (ou fragmentos convenientes dos mesmos) que são cada um dirigidos contra epitopes no TNF-alfa (e especialmente do Trímero TNF-alfa) que se encontram em e/ou fazem parte do(s) sítio(s) que ligam ao receptor do Trímero TNF, tais que os referidos polipeptidio são a ligação intramolecular capaz de pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os referidos domínios variáveis de imunoglobulina são ligados um a outro de tal modo que a proteína ou o polipeptidio são capazes de ligar simultaneamente a dois ou mais sítios que ligam receptor em um trímero TNF único.
-Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os referidos domínios variáveis de imunoglobulina são capazes da ligação ao mesmo epitope que o Nanocorpo TNFl (SEQ ID n. 52).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os referidos domínios variáveis de imunoglobulina são capazes da ligação contra o epitope dentro do sítio que liga o receptor TNF do Trímero TNF que pelo menos compreende os resíduos aminoácidos seguintes: Gln na posição 88 no monômero A; Lys na posição 90 no monômero A e Glu na posição 14 6 no monômero B. - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os referidos domínios variáveis de imunoglobulina são capazes da ligação contra o epitope dentro do sítio que liga o receptor TNF do Trímero TNF que pelo menos compreende os resíduos aminoácidos seguintes: Gln na posição 88 no monômero A; Lys na posição 90 no monômero A e Glu na posição 146 no monômero B; e que, além disso, compreende pelo menos um, preferivelmente dois ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, e preferivelmente todos ou essencialmente todos, dos resíduos aminoácidos seguintes do TNF-alfa monômero A: Gly na posição 24, Gln na posição 25, Thr na posição 72, His na posição 73, Val na posição 74, Leu na posição 75, Thr na posição 77, Thr na posição 79, Ile na posição 83, Thr na posição 89, Val na posição 91. Asn na posição 92, Ile na posição 97, Arg na posição 131, Glu na posição 135, Ile na posição 136, Asn na posição 137, Arg na posição 138, Pro na posição 139, Asp na posição 140 e os resíduos seguintes no monômero B: Pro na posição 20, Arg na posição 32, Lys na posição 65, Lys na posição 112, Tyr na posição 115, Ala na posição 145, Ser na posição 147.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os referidos domínios variáveis de imunoglobulina são capazes da ligação contra o epitope dentro do sítio que liga o receptor TNF do Trímero TNF que pelo menos compreende os resíduos aminoácidos seguintes: Gln na posição 8 8 no monômero A; Lys na posição 90 no monômero A e Glu na posição 146 no monômero B; e que, além disso, compreende pelo menos um, preferivelmente dois ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, e preferivelmente todos ou essencialmente todos, dos resíduos aminoácidos seguintes do TNF-alfa monômero um Leu na posição 75, Thr na posição 77, Thr na posição 79, Ile na posição 80, Ser na posição 81, Tyr na posição 87, Thr na posição 89, Val na posição 91, Asn na posição 92, Ser na posição 95, Ile na posição 97, Glu na posição 135, Ile na posição 136, Asn na posição 137 e os resíduos seguintes no monômero B: Ala na posição 33, Ala na posição 145, Ser na posição 147.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual pelo menos dois domínios variáveis de imunoglobulina são ligados de tal modo que a distância entre o N-termo do primeiro domínio variável de imunoglobulina e o C-termo do segundo domínio variável de imunoglobulina presente em tal proteína ou polipeptidio é pelo menos 50 Angstrons.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual a distância entre o N-termo do primeiro domínio variável de imunoglobulina e o C-termo do segundo domínio variável de imunoglobulina está entre 55-200 Angstrons
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual a distância entre o N-termo do primeiro domínio variável de imunoglobulina e o C-termo do segundo domínio variável de imunoglobulina está entre 65-150 Angstrons
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o primeiro e segundo domínio variável de imunoglobulina são ligados um a outro através de um linker ou espaçador.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o linker ou o espaçador são uma seqüência aminoácida.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o linker ou o espaçador compreende pelo menos 14 resíduos aminoácidos.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o linker ou o espaçador compreende pelo menos 17 - 50 resíduos aminoácidos.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o linker ou o espaçador essencialmente se compõem de glicina e resíduos de serina.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o linker ou o espaçador é GS30 (SEQ ID n. 69).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o primeiro e segundo domínio variável de imunoglobulina são ligados um a outro via outra metade. - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os referidos outra metade é a metade de polipeptidio ou uma proteína.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os referidos outra metade confere pelo menos uma propriedade desejada à proteína ou polipeptidio, ou melhora pelo menos uma propriedade desejada da proteína ou polipeptidio.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os referidos outra metade melhora a meia- vida da proteína ou polipeptidio e/ou reduz a imunogenicidade da proteína ou polipeptidio.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual cada um do primeiro e segundo domínio variável de imunoglobulina são ligados a outra metade através de um linker ou espaçador.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o linker ou o espaçador são uma seqüência aminoácida.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual o linker ou o espaçador essencialmente se compõem de glicina e resíduos de serina.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual acima citada outra metade é um Nanocorpo.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual outra metade é um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID n. 63).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n. 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102) ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104).
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é a ALB 8.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos com uma taxa Koff para TNF de melhor do que 2. 10-3 (1/s), preferi velmente melhor do que 1.10-3 (1/s); ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.,
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos com um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo..
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos com um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 12nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos com um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo..
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios
variáveis de imunoglobulina são nanocorpos com um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos conforme algum dos XIX) a XX) acima, que são humanizados;
com alguns aspectos em particular preferenciais desta modalidade de execução sendo:
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos de classe GLEW.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos com um resíduo de arginina (R) na posição 103.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são a nanocorpos de classe GLEW com um resíduo de arginina (R) na posição 103..
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos com pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO' s 52 (TNFl), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) ou 96 (TNF30) - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX) em que:
a) 0 CDRl compreende:
- a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida DYWMY;
e
b) O CDR2 compreende:
- a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG;
e
c) O CDR3 compreende:
- a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) acima, no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) em que:
- 0 CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- 0 CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR2 compreende a seqüência aminoácida
EINTNGLITKYPDSVKG; ou
0 CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; o CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 compreendem a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX) em que
a) O CDRl é:
- a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida DYWMY;
e em que :
b) O CDR2 é:
- a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG;
e em que
c) O CDR3 é:
- a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de
imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de
imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de
imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) em que:
- O CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
-O CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR2 é a
seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- 0 CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptidios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; o CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN. - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptldios conforme algum dos XIX) a XX) em que
- qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
- a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são escolhidos do grupo composto do Nanocorpo TNF 1 (SEQ ID η. 52) e variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 1 (SEQ ID n. 52).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são escolhidos do grupo composto de TNF 13 (SEQ ID n. 76), TNF 14 (SEQ ID n. 77), TNF 29 (SEQ ID n. 95) e TNF 30 (SEQ ID NO: 96).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são TNF 30 (SEQ ID NO:96);
e com alguns aspectos em particular preferenciais desta modalidade de execução ser:
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são a KERE-classe nanocorpos.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos com pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) ou 98 (TNF33). - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX) em que:
a) 0 CDRl compreende:
- a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida NYYMG;
e
b) O CDR2 compreende:
- a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- lima seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG;
e
c) O CDR3 compreende:
- a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY. - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDR1 compreende a seqüência aminoácida NYYMG.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX) , no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX) no qual CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX), em que:
- O CDR1 compreende a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- O CDR1 compreende a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
-Uma proteína ou polipeptidio conforme alguma de XIX) a XX), na qual os primeiros e segundos domínios de variável de imunoglobulina são Nanobodies como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme alguma de XIX) a XX) , na qual CDR1 compreende a seqüência aminoácida NYYMG; CDR2 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY e CDR3 compreende a seqüência aminoácida ILPLSDDPGWNTY (SEQ ID n. 436). - Uma proteína ou polipeptidio conforme alguma de XIX) a XX) , na qual os primeiros e segundos domínios de variável de imunoglobulina são Nanobodies como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme alguma de XIX) a XX), em que
a) CDR1 é:
- a seqüência aminoácida NYYMG; ou uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NYYMG; ou
umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida NYYMG;
e
b) CDR2 é:
a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais
preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida
NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência
aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG;
e
c) CDR3 é:
a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou - Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX), no qual CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX), no qual CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX), no qual CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX), em que:
- 0 CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- 0 CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- 0 CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX), no qual CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; o CDR2 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY e CDR3 é a seqüência aminoácida ILPLSDDPGWNTY.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos como descrito para a proteína ou polipeptídios conforme algum dos XIX) a XX), em que qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
- a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são escolhidos do grupo composto do Nanocorpo TNF 3 (SEQ ID n. 60) e variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 3 (SEQ ID n. 60).
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XIX) a XX), no qual os primeiros e segundos domínios variáveis de imunoglobulina são escolhidos do grupo composto de 83 TNF20 (SEQ ID NO:83), TNF21 (SEQ ID n. 84), TNF 22 (SEQ ID n. 85), TNF23 (SEQ ID n. 86) ou TNF33 (SEQ ID n. 99).
Deve ser observado que quando uma proteína ou o polipeptídio são acima mencionados como sendo "conforme algum dos XIX) a XX) acima", é pelo menos segundo um de XIX) a XX) , e pode ser segundo ambos XIX) e XX) , e também pode incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme algum dos XIX) a XX) acima".
Contudo, deve ser observado que a invenção não é limitada a nenhum mecanismo específico de ação ou hipótese. Especialmente, foi encontrado que os nanocorpos monovalentes da invenção podem ser também ativos nos ensaios e modelos descritos na presente, que confirmam que a ligação intramolecular do Trimero TNF, embora preferido em uma modalidade de execução específica da invenção, não deve obter a ação e efeito desejado dos nanocorpos, proteína e polipeptídios descritos na presente. Semelhantemente também é incluído dentro dos limites da invenção que a proteína e os polipeptídios descritos na presente realizam a sua ação desejada via qualquer mecanismo apropriado (isto é, por ligação intramolecular, ligação intermolecular ou até ligando TNF monoméricos, portanto inibindo a formação de Trimeros TNF).
Está também dentro dos limites da invenção usar partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos e/ou derivados dos nanocorpos e os polipeptidios da invenção, e/ou usar proteína ou polipeptidios compreendendo ou essencialmente compostos do mesmo, enquanto eles sejam convenientes para os usos enfrentados na presente. Tais partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos, derivados, proteína e/ou polipeptidios serão descritos na futura descrição na presente.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um Nanocorpo (conforme definido na presente), contra o TNF-alfa, que se compõem de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), em que:
(i) O CDR1 é uma seqüência aminoácida escolhida do grupo composto das seqüências CDRl de SEQ ID NÚMEROS: 15 a 21 ou do grupo composto das seqüências CDRl de SEQ ID NÚMEROS: 164 a 197;
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com pelo menos uma das seqüências CDRl do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 15 a 21 ou com pelo menos uma das seqüências CDRl do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 164 a 197, em que
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com pelo menos uma das seqüências CDRl do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 15 a 21 ou com pelo menos uma das seqüências CDRl do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 164 a 197, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e em que :
(ii) O CDR2 é uma seqüência aminoácida escolhida do grupo composto das seqüências CDR2 de SEQ ID NÚMEROS: 22 a 28 ou do grupo composto das seqüências CDR2 de SEQ ID NÚMEROS: 232 a 2 65;
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com pelo menos uma das seqüências CDR2 do grupo composto de SEQ ID
NÚMEROS: 22 a 28 ou com pelo menos uma das seqüências CDR2 do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 232 a 2 65, em que
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com pelo menos uma das seqüências CDR2 do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 22 a 28 ou com pelo menos uma das seqüências CDR2 do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 2 32 a 2 65, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e em que :
(iii) 0 CDR3 é uma seqüência aminoácida escolhida do grupo composto das seqüências CDR3 de SEQ ID NÚMEROS: 29 a 33 ou do grupo composto das seqüências CDR3 de SEQ ID NÚMEROS: 300-333;
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com pelo menos uma das seqüências CDR3 do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 29 a 33 ou com pelo menos uma das seqüências CDR3 do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 300-333, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é
preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) ou com pelo menos uma das seqüências CDR3 do grupo composto de SEQ ID NÚMEROS: 300-333, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
ou do grupo composto das seqüências CDR3 de SEQ ID NÚMEROS: 34 e 35
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com pelo menos uma das seqüências CDR3 de SEQ ID NÚMEROS: 34 e 35, em quej_
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com pelo menos uma das seqüências CDR3 de SEQ ID NÚMEROS: 34 e 35, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou (2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
Os nanocorpos contra a tal TNF-alfa descrita anteriormente e conforme além disso descrito a seguir também são mencionados na presente como nanocorpos da invenção.
Do nanocorpos da invenção, nanocorpos que compreendem um ou vários do CDR's explicitamente enumerados anteriormente são em particular preferidos; os nanocorpos compreendendo dois ou mais dos CDR1S explicitamente enumerados anteriormente são mais em particular preferidos; e os nanocorpos compreendendo três dos CDR1S explicitamente enumerados anteriormente são mais em particular preferidos.
Algumas das combinações em particular preferidas, mas não-restritivas de seqüências CDR podem ser vistas na Tabela I mais adiante, que enumera o CDR1S e seqüências de armação que estão presentes em um número de nanocorpos preferenciais (mas não-limitados) da invenção. Como estará claro para a pessoa experimentada, uma combinação de CDRl, CDR2 e seqüências CDR3 que ocorrem no mesmo clone (isto é, CDR1, CDR2 e seqüências CDR3 que são mencionadas na mesma linha na Tabela I) será normalmente preferido (embora a invenção no seu sentido mais amplo não seja limitada a isso, e também compreenda outras combinações convenientes das seqüências CDR mencionadas na Tabela I) .
Também, nos nanocorpos da invenção que compreendem as combinações do CDR'S mencionado na Tabela I, cada CDR pode ser substituído por um CDR escolhido do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com o CDR1S mencionado; em que
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e/ou escolhido do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 (como indicado no parágrafo precedente) "diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com o CDR mencionado(s) uma das acima mencionadas seqüências aminoácidas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
Contudo, como estará claro para a pessoa experimentada, o (combinações de) seqüências de CDR mencionadas na Tabela I serão geralmente preferidas. Tabela I: Combinações preferenciais de armação e seqüências CDR
<table>table see original document page 56</column></row><table> Tabela (continua):
<table>table see original document page 57</column></row><table> Tabela (continua):
<table>table see original document page 58</column></row><table> Tabela (continua):
<table>table see original document page 59</column></row><table> Tabela (continua):
<table>table see original document page 60</column></row><table> Notas a Tabela I:
- O ID refere-se ao SEQ ID NO's na listagem de seqüência em anexo
- Para CDRl: o SEQ ID n. 164 corresponde a SEQ ID n. 15, SEQ ID n. 167 corresponde a SEQ ID n. 16; o SEQ ID n. 172 corresponde a SEQ ID n. 17, SEQ ID NÚMEROS: 165 e 166 correspondem a SEQ ID n. 18, SEQ ID n. 170 corresponde a SEQ ID n. 19, SEQ ID n. 171 corresponde a SEQ ID n. 20, e SEQ ID NÚMEROS: 168 e 169 correspondem a SEQ ID η. 21.
- Para CDR2: SEQ ID NÚMEROS: 232 e 233 correspondem a SEQ ID n. 22, SEQ ID n. 235 corresponde a SEQ ID n. 23, SEQ ID n. 240 corresponde a SEQ ID n. 24, SEQ ID n. 234 corresponde a SEQ ID n. 25, SEQ ID NÚMEROS: 236 e 237 correspondem a SEQ ID n. 26, SEQ ID n. 238 corresponde a SEQ ID n. 27, e SEQ ID n. 239 corresponde a SEQ ID n. 28.
- Para CDR3: o SEQ ID n. 303 corresponde a SEQ ID n. 29, SEQ ID n. 308 corresponde a SEQ ID n. 30, SEQ ID n. 306 corresponde a SEQ ID n. 31, SEQ ID n. 307 corresponde a SEQ ID n. 32, SEQ ID NÚMEROS: 304 e 305 corresponde a SEQ ID n. 33, SEQ ID n. 300 corresponde a SEQ ID n. 34, e SEQ ID NÚMEROS: 301 e 302 correspondem a SEQ ID n. 35.
Portanto, nos nanocorpos da invenção, pelo menos um dos CDRl, CDR2 e presente de seqüências CDR3 é apropriadamente escolhido do grupo composto do CDRl, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente, enumerado na Tabela I; ou do grupo de CDRl, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente, que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos "identidade de seqüência de 99%" (conforme definido na presente) com pelo menos um dos CDRl, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente, enumerado na Tabela I; e/ou do grupo composto do CDRl, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com pelo menos um dos CDR1, CDR2 e seqüências CDR3, respectivamente, enumerado na Tabela I. Neste contexto, por "apropriadamente escolhido" quer dizer que, como aplicável, uma seqüência CDR1 é escolhida de seqüências CDR1 convenientes (isto é, conforme definido na presente), uma seqüência CDR2 é escolhida de seqüências CDR2 convenientes (isto é, conforme definido na presente) e uma seqüência CDR3 é escolhida de seqüências CDR3 convenientes (isto é, conforme definido na presente), respectivamente.
Especialmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menos a seqüência CDR3 presente é apropriadamente escolhida do grupo composto das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I ou do grupo de seqüências CDR3 que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto das seqüências CDR3 que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com pelo menos uma das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I.
Preferivelmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menos duas das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamente escolhidas do grupo composto das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I ou do grupo composto das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 "diferença (s) aminoácida (s) " com pelo menos uma das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I.
Especialmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menos a seqüência CDR3 presente é apropriadamente escolhida do grupo composto das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I ou do grupo de seqüências CDR3 que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I, respectivamente; e pelo menos uma das seqüências CDRl e CDR2 presentes é apropriadamente escolhida do grupo composto das seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, enumeradas na Tabela I ou do grupo de Seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos um dos Seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto das seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com pelo menos uma das Seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, enumeradas na Tabela I.
Mais preferivelmente, nos nanocorpos da invenção, as três seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamente escolhidas do grupo composto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I ou do grupo das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com pelo menos uma das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I.
Mesmo mais preferivelmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menos uma das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 presentes é apropriadamente escolhida do grupo composto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I. Preferivelmente, nesta modalidade de execução, pelo menos uma ou preferivelmente ambas as outras duas seqüências CDR presentes são apropriadamente escolhidas de seqüências CDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR correspondentes, respectivamente, enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto das seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com pelo menos uma das seqüências correspondentes, respectivamente, enumeradas na Tabela I.
Especialmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menos a seqüência CDR3 presente é apropriadamente escolhida do grupo composto do CDR3 enumeradas na Tabela I. Preferivelmente, nesta modalidade de execução, pelo menos uma e preferivelmente ambas as seqüências CDRl e CDR2 presentes são apropriadamente escolhidas dos grupos de Seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com as Seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, enumerado em enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto das seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com pelo menos uma das Seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, enumeradas na Tabela I.
Mesmo mais preferivelmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menos duas das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamente escolhidas do grupo composto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I. Preferivelmente, nesta modalidade de execução, o resto das seqüências CDR presentes é apropriadamente escolhida do grupo de seqüências CDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR correspondentes enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida (s) com pelo menos uma das seqüências correspondentes enumeradas na Tabela I.
Especialmente, nos nanocorpos da invenção, pelo menos a seqüência CDR3 é apropriadamente escolhida do grupo composto das seqüências CDR3 enumeradas na Tabela I, e a seqüência CDRl ou a seqüência CDR2 são apropriadamente escolhidas do grupo composto das seqüências CDRl e CDR2, respectivamente, enumeradas na Tabela I. Preferivelmente, nesta modalidade de execução, o resto da seqüência CDR presente é apropriadamente escolhida do grupo de seqüências CDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com pelo menos uma das seqüências CDR correspondentes enumeradas na Tabela I; e/ou do grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a correspondência seqüências de CDR enumeradas na Tabela I.
Mesmo mais preferivelmente, nos nanocorpos da invenção, as três seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamente escolhidas do grupo composto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I.
Também, geralmente, as combinações do CDR1S enumeradas na Tabela I (isto é, as mencionadas na mesma linha na Tabela I) são preferidas. Portanto, é geralmente preferido que, quando um CDR em um Nanocorpo da invenção é uma seqüência CDR mencionada na Tabela I ou é apropriadamente escolhida do grupo de seqüências CDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com uma seqüência CDR enumerada na Tabela I; e/ou do grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com uma seqüência CDR enumerada na Tabela I, que pelo menos uma e preferivelmente ambas das outras CDR's são apropriadamente escolhidas das seqüências CDR que pertencem à mesma combinação na Tabela I (isto é, mencionado na mesma linha na Tabela I) ou são apropriadamente escolhidas do grupo de seqüências CDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a(s) seqüência (s) CDR que pertencem à mesma combinação e/ou do grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a(s) seqüência(s) CDR que pertencem à mesma combinação. Outras preferências indicadas nos acima mencionados parágrafos também se aplicam às combinações do CDR1S mencionado na Tabela I.
Portanto, por meio de exemplos não-restritivos, um Nanocorpo da invenção, por exemplo, pode compreender uma seqüência CDRl que tem a identidade de seqüência de mais de 80% com uma das seqüências CDRl mencionadas na Tabela I, uma seqüência CDR2 que tem 3, 2 ou 1 diferença aminoácida com uma das seqüências CDR2 mencionadas na Tabela I (mas pertencendo a uma combinação diferente), e uma seqüência CDR3.
Alguns nanocorpos preferidos da invenção, por exemplo, podem compreender: (1) uma seqüência CDRl que tem a identidade de seqüência de mais de 80% com uma das seqüências CDRl mencionadas na Tabela I; uma seqüência CDR2 que tem 3, 2 ou 1 diferença aminoácida com uma das seqüências CDR2 mencionadas na Tabela I (mas pertencendo a uma combinação diferente); e uma seqüência CDR3 que tem a identidade de seqüência de mais de 8 0% com uma das seqüências CDR3 mencionadas na Tabela I (mas pertencendo a uma combinação diferente); ou (2) uma seqüência CDRl que tem a identidade de seqüência de mais de 80% com uma das seqüências CDRl mencionadas na Tabela I; uma seqüência CDR2, e uma das seqüências CDR3 listadas na Tabela I; ou (3) uma seqüência CDRl; uma seqüência CDR2 que tem a identidade de seqüência de mais de 80% com uma da seqüência CDR2 enumerada na Tabela I; e uma seqüência CDR3 que tem 3, 2 ou 1 diferenças aminoácidas com a seqüência CDR3 mencionada na Tabela I que pertence à mesma combinação que a seqüência CDR2 .
Alguns nanocorpos particularmente preferidos da invenção, por exemplo, podem compreender: (1) uma seqüência CDRl que tem a identidade de seqüência de mais de 80% com uma das seqüências CDRl mencionadas na Tabela I; uma seqüência CDR2 que tem 3, 2 ou 1 diferença aminoácida com a seqüência CDR2 mencionada na Tabela I que pertence à mesma combinação; e uma seqüência CDR3 que tem a identidade de seqüência de mais de 80% com a seqüência CDR3 mencionada na Tabela I que pertence à mesma combinação; (2) uma seqüência CDR1; uma CDR 2 enumerada na Tabela I e uma seqüência CDR3 listada na Tabela I (na qual a seqüência CDR2 e a seqüência CDR3 podem pertencer a combinações diferentes).
Alguns nanocorpos até mais preferenciais da invenção, por exemplo, podem compreender: (1) uma seqüência CDRl que tem a identidade de seqüência de mais de 8 0% com uma das seqüências CDRl mencionadas na Tabela I; a seqüência CDR2 listadas na Tabela I que pertence à mesma combinação; e uma seqüência CDR3 mencionada na Tabela I que pertence a uma combinação diferente; ou (2) uma seqüência CDRl mencionada na Tabela I; uma seqüência CDR2 que tem 3, 2 ou 1 diferenças aminoácidas com a seqüência CDR2 mencionada na Tabela I que pertence à mesma combinação; e a identidade de seqüência de mais de 80% com a seqüência CDR3 listadas na Tabela I que pertence à mesma combinação diferente.
nanocorpos em particular preferidos da invenção, por exemplo, podem compreender uma seqüência CDRl mencionada na Tabela I, uma seqüência CDR2 que tem a identidade de seqüência de mais de 8 0% com a seqüência CDR2 mencionada na Tabela I que pertence à mesma combinação; e a seqüência CDR3 mencionada na Tabela I que pertence à mesma. No mais preferencial nos nanocorpos da invenção, as
seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamente escolhidas das combinações das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, enumeradas na Tabela I.
Preferivelmente, quando uma seqüência CDR é apropriadamente escolhida do grupo de seqüências CDR que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências CDR enumeradas na Tabela I; e/ou quando uma seqüência CDR é apropriadamente escolhida do grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com uma das seqüências CDR enumeradas na Tabela I:
i) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
ii) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a seqüência CDR enumerada na Tabela I.
Segundo uma modalidade de execução preferida mas não limitada da invenção, as seqüências CDR nos nanocorpos da invenção são como definidas anteriormente e são também tais que o Nanocorpo da invenção liga à TNF-alfa com uma dissociação constante (K0) de 10^5 a 10^12 mol/litro (M) ou menos, e preferivelmente 10^7 a 10^12 mol/litro (M) ou menos e mais preferivelmente IO"8 a 10^12 mol/litro (M) , e/ou com uma associação constante (Ka) de pelo menos 10^7 m-1, preferivelmente pelo menos 10^8 m-i, mais preferivelmente pelo menos 10^9 m-1, como pelo menos 10^12 m-1; e especialmente com um Kd de menos de 500 nM, preferivelmente menos de 200 nM, mais preferivelmente menos de 10 nM, como menos de 500 da tarde. O K0 e os valores de Ka do Nanocorpo da invenção contra o TNF-alfa podem ser determinados em uma maneira conhecida por si, por exemplo, usando o ensaio descrito na presente.
Segundo outra modalidade de execução preferida, mas não-restritiva da invenção (a) o CDRl tem um comprimento de entre 1 e 12 resíduos aminoácidos, e normalmente entre 2 e 9 resíduos aminoácidos, como 5, 6 ou 7 resíduos aminoácidos; e/ou (b) CDR2 tem um comprimento de entre 13 e 24 resíduos aminoácidos, e normalmente entre 15 e 21 resíduos aminoácidos, como 16 e 17 resíduos aminoácidos; e/ou (c) CDR3 tem um comprimento de entre 2 e 35 resíduos aminoácidos, e normalmente entre 3 e 30 resíduos aminoácidos, como entre 6 e 23 resíduos aminoácidos.
Em um aspecto, a invenção fornece nanocorpos contra o TNF-alfa que estão executando melhor do que o Nanocorpo 3E, a melhor execução do Nanocorpo segundo o WO 04/041862.
Mais especificamente, alguns aspectos preferenciais desta modalidade de execução da invenção são: XXI) Um Nanocorpo contra o TNF-alfa, que se compõe de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDRl a CDR3 respectivamente) , que tem uma taxa KQff para TNF de melhor do que 2. IO-3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10"3 (l/s); ou uma variante humanizada de tal
Nanocorpo.
XXII)Um Nanocorpo contra o TNF-alfa, que se compõem de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDRl a CDR3 respectivamente) , que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
XXIII)Um Nanocorpo contra o TNF-alfa, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 12nM; ou uma variante humanizada de tal
Nanocorpo. XXIV)Um Nanocorpo contra o TNF-alfa, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
XXV)Um Nanocorpo contra o TNF-alfa, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo;
com alguns aspectos em particular preferenciais sendo:
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV) , que é um Nanocorpo de classe GLEW.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), que contém um resíduo de arginina (R) na posição 103.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV) , que é iam Nanocorpo humanizado.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), que contém um resíduo de leucina (L) na posição 108.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 (TNFl), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF2 9) ou 96 (TNF30).
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que a) 0 CDRl compreende:
- a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida DYWMY;
e b) O CDR2 compreende:
- a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e
c) O CDR3 compreende:
- a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que:
- O CDR1 compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- O CDR1 compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
O CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN - Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; o CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 compreendem a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que
a) O CDRl é:
- a seqüência aminoácida DYWMY; ou uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida DYWMY;
e em que:
b) O CDR2 é:
- a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1
diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e em que
c) 0 CDR3 é:
- a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SPSGFN; ou umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY.
-Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que:
-O CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- O CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- O CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanoeorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV) , no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; o CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s) aminoácida (s) acima mencionadas.
e com alguns outros aspectos em particular preferenciais sendo:
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV) , que é um Nanocorpo de classe KERE.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22) , 96 (TNF23) ou 98 (TNF33).
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que a) O CDRl compreende:
- a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida NYYMG;
e
b) 0 CDR2 compreende:
- a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG;
e
c) 0 CDR3 compreende:
- a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY. - Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida NYYMG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG.
-Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que:
- O CDRl compreende a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
-O CDRl compreende a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
O CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida NYYMG; o CDR2 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY e CDR3 compreendem a seqüência aminoácida ILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que a) O CDRl é:
- a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida NYYMG;
e
b) O CDR2 é:
- a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG;
e
c) O CDR3 é:
- a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que:
- O CDR1 é a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- O CDR1 é a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- O CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), no qual CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; o CDR2 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY e CDR3 é a seqüência aminoácida ILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV), em que
qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
- a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s)
aminoácida(s) acima mencionadas.
- Um Nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV) , que é um
Nanocorpo humanizado. e com ainda alguns outros aspectos particularmente
preferenciais sendo:
XXVI)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo conforme algum dos XXI) a XXV). XXVII)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV).
XXVIII)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV) , e que é tal que a referida proteína ou o polipeptídio, para ligar a
iam Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação
cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor..
XXIX)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV), e que é capaz
da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF.
XXX)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV), ligado
através de um linker adequado.
XXXI)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV), ligado através de um linker adequado, e que é pegilado.
XXXÜ)Uma proteína ou polipeptídio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV) , e que, além
disso, compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
XXXIII)Uma proteína ou polipeptídio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV), e que, além disso, compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e que é tal que a referida proteína ou o polipeptidio, para ligar a um Trimero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor..
XXXTV)Uma proteína ou polipeptidio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV), e que, além disso, compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF.
XXXV)Uma proteína ou polipeptidio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV) , e que, além disso, compreende um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, em que cada um dos dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV) é ligado, opcionalmente através de um linker conveniente, a um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano. XXXVI)Uma proteína ou polipeptidio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV), e que, além disso, compreende um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, em que cada um dos dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV) é ligado, opcionalmente através de um linker conveniente, a um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e que é tal que os referidos proteína ou o polipeptidio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou de reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor..
XXXVII)Uma proteína ou polipeptidio que compreende dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV), e que, além disso, compreende um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, em que cada um dos dois nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV) é ligado, opcionalmente através de um linker conveniente, a um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trimero TNF.
Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XXVI) a XXXVII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XXVI) a XXXVII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID n. 63).
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XXVI) a XXXVII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n. 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102) ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104) .
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XXVI) a XXXVII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é a ALB 8.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XXVI) a XXXVII), que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos humanizados nanocorpos conforme algum dos XXI) a XXV), e uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID η. 63) .
Deve ser observado que quando um Nanocorpo é acima mencionado como sendo "conforme algum dos XXI) a XXV) acima", é pelo menos segundo um de XXI) a XXV) , pode ser segundo dois ou mais de XXI) a XXV), e também pode incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme algum dos XXI) a XXV) acima. Semelhantemente quando uma proteína ou o polipeptídio são acima mencionados como sendo "conforme algum dos XXVI) a XXXVII) acima", é pelo menos segundo um de XXVI) a XXXVII) , pode ser segundo dois ou mais de XXVI) a XXXVII), e também pode incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme algum dos XXVI) a XXXVII) acima.
Um clone que foi encontrado como sendo especialmente útil como um anti-TNF Nanocorpo é o clone PMP1C2 (TNFl). Como pode ser visto dos dados comparativos do ensaio KYM na Tabela 39, TNFl tem um valor de EC50 que é mais de 4 vezes melhor do que o melhor Nanocorpo monovalente descrito em WO 04/41862 (Nanocorpo 3E), isto é, 2,466 nM para PMP1C2 contra 12 nM para 3E (Como pode ser visto da Tabela 39, todo os nanocorpos TNFl a TNF 9 da invenção deram um melhor valor de EC50 neste ensaio do que 3E). Neste aspecto, também deve ser observado que o Nanocorpo 3E de WO 04/41862 pertence à "classe KERE" (conforme descrito na presente), e por isso pode ser humanizado a um grau menor do que o Nanocorpo PMP1C2 (que pertence à "classe GLEW"). Quando o Nanocorpo PMP1C2 é comparado com o Nanocorpo IA de WO 04/418 62, um Nanocorpo de classe GLEW com o grau mais alto na homologia de seqüência com PMP1C2 (tanto no CDR1S como nas armações), o valor de EC50 obtido para PMP1C2 no ensaio KYM é mais de 50 vezes melhor, isto é, 2.466 nM para PMP1C2 em comparação com 100 nM para IA.
Conseqüentemente, nanocorpos que compreendem um ou vários, preferivelmente quaisquer dois e mais preferivelmente todos os três CDR presentes no clone PMP1C2 (ou seqüências CDR que são derivadas disto ou correspondem a isso) são em particular preferidos na invenção. Também, esses nanocorpos preferivelmente pertencem ao "grupo 103 P,R,S" (conforme definido na presente), e o mais preferivelmente têm um R na posição 103, e preferivelmente também têm GLEW ou uma seqüência semelhante a GLEW nas posições 44-47. Também, quando esses nanocorpos pertencem ao "grupo 103 P,R,S" (e especialmente quando eles têm um R na posição 103), uma substituição humanizadora preferida, mas não limitadora é 108Q a 108L. Outras substituições humanizadoras preferenciais, mas não-limitadoras nesses nanocorpos preferidos são uma ou várias daquelas presentes nas variantes humanizadas de TNFl descritas na presente, como TNF13, TNF14, TNF 2 9 ou TNF30, como será imediatamente claro de uma comparação entre a seqüência de TNFl e essas seqüências humanizadas.
Portanto, em um Nanocorpo em particular preferencial da invenção, pelo menos uma das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes é apropriadamente escolhida do grupo composto da seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente (isto é, as seqüências CDR presentes no clone TNF1) , ou do grupo das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente 15 pelo menos "identidade de seqüência de 99%" (conforme definido na presente) com a seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente; e/ou do grupo composto das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com a seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente.
Preferivelmente, em esses nanocorpos preferidos da invenção, pelo menos duas das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamente escolhidas do grupo composto da seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente (isto é, as seqüências CDR presentes no clone TNFl), ou do grupo composto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente; e/ou do grupo composto das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" com a seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente.
Mais preferivelmente, nesses nanocorpos preferidos da invenção, as três seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamente escolhidas do grupo composto da seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente (isto é, as seqüências CDR presentes no clone TNF1), ou do grupo das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente; e/ou do grupo composto das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com a seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente.
Mesmo mais preferivelmente, em esses nanocorpos preferidos da invenção, pelo menos uma das seqüências CDRl, CDR2 e CDR3 presentes é apropriadamente escolhida do grupo composto da seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente (isto é, as seqüências CDR presentes no clone TNFl). Preferivelmente, nesta modalidade de execução, pelo menos uma ou preferivelmente ambas as seqüências CDR presentes são apropriadamente escolhidas de seqüências CDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente; e/ou apropriadamente escolhido do grupo composto das seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida (s) com a seqüência CDR1 de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente.
Mesmo mais preferivelmente, nesses nanocorpos preferidos da invenção, pelo menos duas das seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 presentes são apropriadamente escolhidas do grupo composto da seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente (isto é, as seqüências CDR presentes no clone TNF1). Preferivelmente, nesta modalidade de execução, o resto da seqüência CDR presente é apropriadamente escolhida do grupo de seqüências CDR que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência CDRl de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente; e/ou do grupo composto de seqüências CDR que têm 3, 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência CDR1 de SEQ ID n. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente.
Os nanocorpos em particular preferidos da invenção compreendem a seqüência CDR1 de SEQ ID η. 164, a seqüência CDR2 de SEQ ID n. 232, e a seqüência CDR3 de SEQ ID n. 300, respectivamente (isto é, as seqüências CDR presentes no clone TNF1).
Os nanocorpos com as seqüências CDR acima mencionadas preferivelmente têm seqüências de armação que são posteriormente definidas na presente. Algumas combinações em particular preferidas, mas não-restritivas das seqüências de armação podem ser vistas na Tabela I acima mencionada. Como estará claro para a pessoa experimentada, uma combinação de seqüências FRl, FR2, FR3 e FR4 que ocorrem no mesmo clone (isto é, seqüências FR1, FR2, FR3 e FR4 que são mencionadas na mesma linha na Tabela I) será normalmente preferido (embora a invenção no seu sentido mais amplo não seja limitada a isso, e também compreenda outras combinações convenientes das seqüências de armação mencionadas na Tabela I) ·
Mais especificamente, alguns aspectos preferenciais desta modalidade de execução da invenção são: XXXVIII)Um nanobody contra o TNF-alfa, que se compõem de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), em que:
a) 0 CDRl compreende:
- a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida DYWMY;
e
b) O CDR2 compreende:
- a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG;
e
c) O CDR3 compreende:
- a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um nanobody conforme XXXVIII), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY.
- Um nanobody conforme XXXVIII), no qual CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG.
- Um nanobody conforme XXXVIII), no qual CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um nanobody conforme XXXVIII), em que:
- O CDR1 compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- O CDR1 compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
O CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um nanobody conforme XXXVIII), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um nanobody conforme XXXVIII) no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida DYWMY; o CDR2 compreende a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 compreendem a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme XXXVIII), em que
- qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
- Um Nanocorpo conforme XXXVIII), que é um Nanocorpo de classe GLEW.
- Um Nanocorpo conforme XXXVIII), que contém um resíduo de arginina (R) na posição 103. - Um Nanocorpo conforme XXXVIII), que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 (TNFl) , 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) ou 96 (TNF30).
Um Nanocorpo conforme XXXVIII), que é um Nanocorpo humanizado.
- Um Nanocorpo conforme XXXVIII), que contém um resíduo de leucina (L) na posição 108.
- Um Nanocorpo conforme XXXVIII), que tem uma taxa K0ff para TNF de melhor do que 2.IO"3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10"3 (l/s); ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo;
- Um Nanocorpo conforme XXXVIII) , que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XXXVIII), que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XXXVIII), que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo. XXXDQUm Nanocorpo contra o TNF-alfa, que se compõem de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), em que a) O CDRl é:
- a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida DYWMY; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida DYWMY;
e em que:
b) O CDR2 é:
- a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG;
e em que
c) O CDR3 é:
- a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), no qual CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), no qual CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), em que:
- O CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN; ou
- O CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; ou - O CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN.
-Um Nanocorpo conforme XXXIX), no qual CDRl é a seqüência aminoácida DYWMY; o CDR2 é a seqüência aminoácida EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 é a seqüência aminoácida SPSGFN.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), em que:
qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
- a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX) , que é um Nanocorpo de classe GLEW.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que contém um resíduo de arginina (R) na posição 103.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 (TNFl) , 7 6 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF2 9) ou 96 (TNF30).
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que é um Nanocorpo humanizado.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que contém um resíduo de leucina (L) na posição 108.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX) , que tem uma taxa Koff para TNF de melhor do que 2.IO"3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10"3 (l/s); ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que é escolhido do grupo composto de TNF 13 (SEQ ID n. 76), TNF 14 (SEQ ID n. 77), TNF 29 (SEQ ID n. 95) e TNF 30 (SEQ ID NO:96).
- Um Nanocorpo conforme XXXIX), que é TNF 30 (SEQ ID n. 96); com alguns outros aspectos preferenciais sendo:
- XL) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de um Nanocorpo conforme XXXVIII) ou XXXIX).
- XLI) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo
conforme XXXVIII) ou XXXIX).
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX).
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) , e que é tal que a referida proteína ou o polipeptídio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor..
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX), e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF. - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX), que são diretamente ligados um a outro ou ligados um a outro via um linker.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) , que são ligados um a outro via uma seqüência aminoácida.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) , que são ligados um a outro via uma seqüência aminoácida (como, sem restrição, uma seqüência aminoácida que compreende glicina e resíduos de serina) que compreende pelo menos 14 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 17 aminoácidos, como aproximadamente 20-40 aminoácidos (como o linker GS30).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptidio TNF 7 (SEQ ID n. 73), no qual ambos nanocorpos TNF 1 foram humanizados.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende ou essencialmente se compõe o polipeptidio TNF 55 (SEQ ID n. 419) ou TNF 56 (SEQ ID n. 420) .
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que é pegilado.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) , e que é tal que a referida proteína ou o polipeptidio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor; e/ou que é tal que os referidos proteína ou o polipeptidio são capazes da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF, e que proteína ou o polipeptidio além disso compreendem pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou
XXXIX) , e que proteína ou o polipeptidio além disso compreendem pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, em que os dois nanocorpos conforme
XXXVIII) ou XXXIX) são ligados um a outro via pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e no
qual os dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) são ligados diretamente a pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, ou ligados a pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano via um linker.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou
XXXIX) , e que proteína ou o polipeptidio além disso compreendem pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, em que os dois nanocorpos conforme
XXXVIII) ou XXXIX) são ligados um a outro via pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e no qual os dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) são ligados diretamente a pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, ou ligados a pelo menos
um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano via um linker, no qual o linker é uma seqüência aminoácida (como, sem restrição, um linker que compreende glicina e resíduos de serina), e especialmente uma seqüência aminoácida que compreende entre 3 e 40 resíduos aminoácidos,
como entre 5 e 15 resíduos aminoácidos (como o linker GS9).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) , e que proteína ou o polipeptidio além disso compreendem pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma
albumina de soro humano, em que os dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) são ligados um a outro via pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, e no qual os dois nanocorpos conforme XXXVIII) ou XXXIX) são ligados diretamente a pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano, ou ligados a pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano via um linker, e que proteína ou o polipeptídio são tais que os referidos proteína ou o polipeptídio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou de reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor; e/ou que proteína ou o polipeptídio são tais que os referidos proteína ou o polipeptídio são capazes da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF.
- CJma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XL) ou XLI), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado.
- CJma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XL) ou XLI), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID n. 63).
- CJma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XL) ou XLI), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n. 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102) ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104) .
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XL) ou XLI), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é a ALB 8.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos humanizados conforme algum dos XL) ou XLI) e uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID η. 63). - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptidio TNF24 (SEQ ID n. 90), no qual tanto o Nanocorpo TNF 1 como a ALB Nanocorpo 1 foi humanizado.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos TNF 30 e uma ALB Nanocorpo 8.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XL) ou XLI), que compreende ou essencialmente se compõe o polipeptidio TNF 60 (SEQ ID n. 417).
Deve ser observado que quando um Nanocorpo é acima mencionado como sendo "conforme XXXVIII" ou "conforme XXXIX", é pelo menos segundo um de XXXVIII) e/ou XXXIX), e também pode incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme XXXVIII" ou "conforme XXXIX" anteriormente. Semelhantemente quando uma proteína ou o polipeptidio são acima mencionados como sendo "conforme algum dos XL) ou XLI)", é pelo menos segundo um de XL) a XLI), pode ser segundo dois ou mais de VI) a XVIII), e também pode incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme algum dos XL) ou XLI) acima.
Para os nanocorpos baseados em Nanocorpo TNF1 anteriormente (inclusive mas não limitado ao nanocorpos humanizados), as seqüências de armação podem ser geralmente como descritas na presente, e preferivelmente são como se segue:
a) O FR1 compreende ou é:
- a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 130; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo
menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 130; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 130; e
b) O FR2 compreende ou é:
- a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 198; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 198; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença(s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 198; e
c) O FR3 compreende ou é:
- a seqüência aminoácida de SEQ ID η. 2 66; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 2 66; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida de SEQ ID η. 2 66. e
d) O FR4 compreende ou é:
- a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 334; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 334; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 334; no qual as diferenças aminoácidas presentes nas seqüências de armação são mais preferivelmente como descritos na presente.
Os nanocorpos contra o TNF-alfa, que têm regiões de armação conforme descrito acima (isto é, semelhante a TNF1), e nos quais pelo menos uma das regiões de armação (como quaisquer duas, quaisquer três ou as quatro regiões de armação) foram humanizados, formam um novo aspecto da invenção. Tais nanocorpos podem ter especialmente CDR's que são tais que o Nanocorpo tem uma taxa Koff para TNF de melhor do que 2.10"3 (1/s), preferivelmente melhor do que 1.10"3 (1/s); e/ou tenha CDR1S que são tais que o Nanocorpo tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; e especialmente melhor do que 12nM, mais especialmente melhor do que 5 nM, até mais especialmente melhor do que 3nM. Também, ou alternativamente, tais nanocorpos são preferivelmente dirigidos contra o mesmo epitope de TNF (isto é, o Trimero TNF) como TNF1.
Especialmente, a invenção refere-se a um Nanocorpo contra o TNF-alfa, que é uma variante humanizada de um Nanocorpo contra o TNF-alfa, cujo Nanocorpo contra o TNF- alfa tem as seqüências de armação seguintes: FRl: SEQ ID n. 130; FR2: SEQ ID n. 198; FR3: SEQ ID n. 266; e FR4: SEQ ID n. 334. Tal Nanocorpo pode ter especialmente CDR's que são tais que o Nanocorpo tem uma taxa KQff para TNF de melhor do que 2. 10"3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10"3 (l/s); e/ou tenha o CDR1S que são tais que o Nanocorpo tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO:4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; e especialmente melhor do que 12nM, mais especialmente melhor do que 5 nM, até mais especialmente melhor do que 3nM. Também, ou alternativamente, tais nanocorpos são preferivelmente dirigidos contra o mesmo epitope de TNF (isto é, o Trimero TNF) como TNF1.
Outro clone que foi encontrado para ser especialmente útil como um anti-TNF Nanocorpo é o clone PMP5F10 (TNF3, SEQ ID n. 60). Como pode ser visto dos dados comparativos do ensaio KYM na Tabela 39, TNF3 tem um valor de EC50 que é mais de 15 vezes melhor do que o melhor Nanocorpo monovalente descrito em WO 04/41862.
Conseqüentemente, nanocorpos que compreendem um ou vários, preferivelmente quaisquer dois e mais preferivelmente todos os três dos CDR's presentes no clone PMP5F10 (ou seqüências CDR que são derivadas disto ou
correspondem a isso) são em particular preferidos na invenção. Também, esses nanocorpos preferivelmente pertencem à classe KERE.
Mais especificamente, alguns aspectos preferenciais desta modalidade de execução da invenção são:
XLII)Um Nanocorpo contra o TNF-alfa, que se compõem de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), em que
a) 0 CDRl compreende:
- a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1
diferença aminoácida com a seqüência aminoácida NYYMG; e
b) O CDR2 compreende:
- a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%,
preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou - umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e
c) 0 CDR3 compreende:
- a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou - uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; OU
umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme XLII), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida NYYMG.
- Um Nanocorpo conforme XLII), no qual CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme XLII), no qual CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme XLII), em que:
- O CDRl compreende a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- O CDRl compreende a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
O CDR2 compreende a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e o CDR3 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme XLII), no qual CDRl compreende a seqüência aminoácida NYYMG; o CDR2 compreende a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY e CDR3 compreendem a seqüência aminoácida ILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme XLII), em que qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou - a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
-Um Nanocorpo conforme XLII), que é um Nanocorpo de classe KERE.
- Um Nanocorpo conforme XLII) , que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 50 (TNF3) , 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) ou 99 (TNF33).
Um Nanocorpo conforme XLII), que é um Nanocorpo humanizado.
- Um Nanocorpo conforme XLII) , que tem uma taxa K0ff para TNF de melhor do que 2.IO-3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10"3 (l/s) ; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XLII) , que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no
Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XLII), que tem iam valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no
Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XLII) , que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no
Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo contra o TNF-alfa, que se compõem de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3
respectivamente), em que a) O CDRl é: - a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NYYMG; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida NYYMG;
e
b) O CDR2 é:
- a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
-umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e
c) O CDR3 é:
-a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou -uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
-umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), no qual CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), no qual CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), no qual CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), em que: - O CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY; ou
- O CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; e o CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; ou
- 0 CDR2 é a seqüência aminoácida NISWRGYNIYYKDSVKG; e o CDR3 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme XLIII) , no qual CDRl é a seqüência aminoácida NYYMG; o CDR2 é a seqüência aminoácida SILPLSDDPGWNTY e CDR3 é a seqüência aminoácida ILPLSDDPGWNTY.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), em que
qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora; e/ou
- a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), que é um Nanocorpo de classe KERE.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 50 (TNF3) , 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) ou 99 (TNF33).
Um Nanocorpo conforme XLIII), que é um Nanocorpo humanizado.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), que tem uma taxa Koff para TNF de melhor do que 2.IO"3 (l/s), preferivelmente melhor do que 2. IO"3 (l/s); ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
- Um Nanocorpo conforme XLIII), que é escolhido do grupo composto de SEQ ID NO's, 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) ou 98 (TNF33) TNF 13 (SEQ ID n. 76), TNF 14 (SEQ ID n. 77), TNF 29 (SEQ ID n. 95) e TNF 30 (SEQ ID NO:96) com alguns outros aspectos preferenciais sendo:
XLIV) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de um Nanocorpo conforme XLII) ou XLIII).
XLV) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo conforme XLII) ou XLIII).
XLVI) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende dois nanocorpos conforme XLII) ou XLIII).
XLVII) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende dois nanocorpos conforme XLII) ou XLIII), e que é tal que a referida proteína ou o polipeptídio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor.
XLVIII) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende dois nanocorpos conforme XLII) ou XLIII), e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF. - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XLIV) ou XLVIII), que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptidio TNF 6 (SEQ ID n. 72) ou TNF 9 (SEQ ID n. 75, no qual ambos nanocorpos TNF 3 foram humanizados
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XLIV) ou XLVIII), que é pegilado.
- Uma proteína ou polipeptidio, que compreende dois nanocorpos conforme XLII) ou XLIII) , e que é tal que a referida proteína ou o polipeptidio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor; e/ou que é tal que os referidos proteína ou o polipeptidio são capazes da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF, e que proteína ou o polipeptidio além disso compreendem pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XLIV) ou XLVIII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado. 105 Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XLIV) ou XLVIII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID η. 63).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XLIV) ou XLVIII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n. 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102) ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104) .
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XLIV) ou XLVIII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é a ALB 8. - Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XLIV) ou XLVIII), que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos humanizados conforme algum dos XLIV) ou XLVIII) e uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID n. 63).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos XLIV) ou XLVIII), que compreende ou essencialmente consiste do polipeptidio TNF26 (SEQ ID n. 92), no qual tanto os nanocorpos TNF 3 como a ALB Nanocorpo 1 foi humanizado.
Deve ser observado que quando um Nanocorpo é acima mencionado como sendo "conforme XLII" ou "conforme XLIII", é pelo menos segundo um de XLII) e/ou XLIII), e também pode incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme XLII)" ou "conforme XLIII)" anteriormente. Semelhantemente quando uma proteína ou o polipeptidio são acima mencionados como sendo "conforme algum dos XLIV) ou XLVIII)", é pelo menos segundo um de XL) a XLI), pode ser segundo dois ou mais de XLIV) a XLVIII), e também pode incluir algum ou mais de outros aspectos que são indicados como sendo "conforme algum dos XLIV) ou XLVIII) acima.
Para os nanocorpos baseados em Nanocorpo TNF3 anteriormente . (inclusive mas não limitado ao nanocorpos humanizado), as seqüências de armação podem ser geralmente como descritas na presente, e preferivelmente são como se segue:
a) O FRl compreende ou é:
- a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 138; ou uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 138; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 138;
e b) O FR2 compreende ou é:
- a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 206; ou
- uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 206; ou
umas seqüências aminoácidas que tem 2 ou só 1 diferença (s) aminoácida(s) com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 206; e
c) O FR3 compreende ou é:
- a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 274; ou
uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 274; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 274.
e
d) O FR4 compreende ou é:
- a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 342; ou
uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 342; ou
- umas seqüências aminoácidas que tem só 1 diferença aminoácida com a seqüência aminoácida de SEQ ID n. 342; no qual as diferenças aminoácidas presentes nas seqüências de armação são mais preferivelmente como descritos na presente.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um Nanocorpo com uma seqüência aminoácida que é escolhida do grupo composto de SEQ ID NO's: 52 a 60, do grupo composto de SEQ ID NO's: 7 6 para 8 6, do grupo composto de SEQ ID NO's: 95 para 99, do grupo composto de SEQ ID NO's 105 para 129 ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm mais de 80%, preferivelmente mais de 90%, mais preferivelmente mais de 95%, como 99% ou mais "identidade de seqüência" (conforme definido na presente) com uma ou várias das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's: 52 a 60, SEQ ID NO's: 7 6 para 86, SEQ ID NO's: 95 para 99 ou SEQ ID NO's 105 para 129, no qual as últimas seqüências aminoácidas mais preferivelmente têm seqüências de armação que são como mais adiante definidas embaixo conforme a descrição geral das seqüências de armação de nanocorpos.
Segundo uma modalidade de execução especifica, mas não- restritiva, as últimas seqüências aminoácidas são "humanizadas", conforme mais adiante descrito na presente.
Mais preferivelmente, os nanocorpos da invenção são escolhidos do grupo composto de SEQ ID NO's: 52 a 60, do grupo composto de SEQ ID NO's: 76 para 86, do grupo composto de SEQ ID NO's: 95 para 99, ou do grupo composto de SEQ ID NO's 105 para 129, de que os nanocorpos "humanizado" de SEQ ID NO's 76 para 86 e SEQ ID NO's: 95 para 99 pode ser em particular preferido.
Conforme acima mencionado, um Nanocorpo em particular preferencial da invenção é o clone PMP1C2 (TNF1; SEQ ID n. 52). Portanto, em um aspecto preferencial, a invenção refere-se a um Nanocorpo com uma seqüência aminoácida que é escolhida do grupo composto de SEQ ID η. 52 ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm mais de 8 0%, preferivelmente mais de 90%, mais preferivelmente mais de 95%, como 99% ou mais "identidade de seqüência" (conforme definido na presente) com a seqüência aminoácida de SEQ ID NO:52, no qual as últimas seqüências aminoácidas, mais preferivelmente, têm seqüências de armação que são mais adiante definidas conforme a descrição geral das seqüências de armação de nanocorpos. Particularmente preferidas são variantes humanizadas do clone PMP1C2 (TNF1; SEQ ID n. 52) . Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos de tais variantes humanizadas são os clones TNF13 (SEQ ID n. 76), TNF14 (SEQ ID NO: 77) , TNF29 (SEQ ID n. 95) e TNF 30 (SEQ ID n. 96). Portanto, em um aspecto preferencial, a invenção refere-se a um Nanocorpo humanizado com uma seqüência aminoácida que é escolhida do grupo composto de SEQ ID NO's: 76, 77, 95 ou 96, ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm mais de 80%, preferivelmente mais de 90%, mais preferivelmente mais de 95%, como 99% ou mais "identidade de seqüência" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's: 76, 77, 95 ou 96, no qual as últimas seqüências aminoácidas, mais preferivelmente, têm seqüências de armação que são mais adiante definidas conforme a descrição geral das seqüências de armação de nanocorpos.
Segundo uma modalidade de execução preferencial, o Nanocorpo da invenção é uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 1 (SEQ ID n. 52) .
Alguns aspectos preferenciais desta modalidade de execução da invenção são:
XLIX)Uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 1, que tem uma taxa Koff para TNF de melhor do que 2. IO"3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10"3 (l/s).
L) Uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 1, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO:4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio.
LI) Uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 1, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM. LII) Uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 1, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM.
LEI) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo que é uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 1 conforme algum dos XLIX) a LII)
LIV) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 1 conforme algum dos XLIX) a LII) (opcionalmente ligado via um linker).
LV) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 1 conforme algum dos XLIX) a LII) (opcionalmente ligado via um linker), e que é tal que a referida proteína ou o polipeptídio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor..
LVI) Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 1 conforme algum dos XLIX) a LII) e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF.
LVII)Uma proteína ou polipeptídio que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF 7 (SEQ ID n. 73) , no qual ambos nanocorpos TNF 1 foram humanizados.
LVHI)Uma proteína ou polipeptídio que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF 7 (SEQ ID n. 73) , no qual tanto nanocorpos TNF 1 foram humanizados, e que é pegilado. LEX) Uma proteína ou polipeptidio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 1 conforme algum dos XLIX) a LII) , e que, além disso, compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
LX) Uma proteína ou polipeptidio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 1 conforme algum dos XLIX) a LII), que são cada um ligados (opcionalmente ligado via um linker) a um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos LIII) a LX) , no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos LIII) a LX) , no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID n. 63).
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos LIII) a LX) , no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n. 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102) ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104) .
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos LIII) a LX) , no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é a ALB 8.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos LIII) a LX), que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptidio TNF24 (SEQ ID n. 90), no qual tanto o Nanocorpo TNF 1 como a ALB Nanocorpo TNF 1 foi humanizado.
- Uma proteína ou polipeptidio conforme algum dos LIII) a LX) , que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos TNF 30 e uma ALB Nanocorpo 8. Segundo uma modalidade de execução preferencial, o Nanocorpo da invenção é uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 3 (SEQ ID n. 60).
Alguns aspectos preferenciais desta modalidade de execução da invenção são:
LXI) Uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 3, que tem uma taxa Koff para TNF de melhor do que 2.10"3 (1/s), preferivelmente melhor do que 1.10"3 (1/s).
LXII)Uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 3, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO:4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio.
LXIII)Uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 3, que tem iam valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 5nM.
LXIV)Uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 3, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM.
LXV)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo que é uma variante humanizada do Nanocorpo TNF 3 conforme algum dos LXI) a LXIV)
LXVI)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 3 conforme algum dos LXI) a LXIV) (opcionalmente ligado via um linker).
LXVII)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 3 conforme algum dos LXI) a LXIV) (opcionalmente ligado via um linker), e que é tal que a referida proteína ou o polipeptídio, para ligar a um Trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trimero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor.. LXVIII)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 3 conforme algum dos LXI) a LXIV) e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trimero TNF.
LXIX)Uma proteína ou polipeptídio que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF 6 (SEQ ID n. 72) ou TNF 9 (SEQ ID n. 75), no qual ambos nanocorpos TNF 3 foram humanizados.
LXX)Uma proteína ou polipeptídio que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF 6 (SEQ ID n. 72) ou TNF 9 (SEQ ID n. 75), no qual tanto nanocorpos TNF 3 foram humanizados, e que é pegilado. LXXI)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 3 conforme algum dos LXI) a LXIV), e que, além disso, compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
LXXII)Uma proteína ou polipeptídio, que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas do Nanocorpo TNF 3 conforme algum dos LXI) a LXIV), que são cada um ligados (opcionalmente ligado via um linker) a um Nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos LXV) a LXXII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado. 120 Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos LXV) a LXXII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID η. 63).
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos LXV) a LXXII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é um escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n. 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102) ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104).
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos LXV) a LXXII), no qual pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma albumina de soro humano é a ALB 8.
- Uma proteína ou polipeptídio conforme algum dos LXV) a LXXII), que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF26 (SEQ ID n. 92), no qual tanto os nanocorpos TNF 3 como a ALB Nanocorpo 1 foi humanizado.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos iam nanocorpo contra o TNF-alfa conforme definido na presente. Tais polipeptídios também são mencionados na presente como "os polipeptídios da invenção" e podem ser conforme mais adiante descritos na presente e/ou como geralmente descrito em WO 04/0418 62 para os nanocorpos revelados na presente, e, por exemplo, podem ser polipeptídios multivalentes ou polipeptídios multiespecíficos, novamente como mais adiante descrito na presente.
Preferivelmente, um polipeptídio da invenção é bivalente ou trivalente (isto é, compreensão de dois ou três nanocorpos da invenção, respectivamente, opcionalmente ligado via um ou dois linkers conforme definido mais adiante, respectivamente) ou um polipeptídio multiespecífico, compreendendo um ou dois, e preferivelmente dois, nanocorpos da invenção e pelo menos um nanocorpo dirigido contra uma proteína de soro, e especialmente contra uma proteína de soro humana, como contra uma albumina de soro humano.
Em modalidades de execução preferenciais, mas não- restritivas, os nanocorpos da invenção presentes nos polipeptidios da invenção são escolhidos do grupo composto de SEQ ID NO's: 52 a 60 e SEQ ID NO's 105-129 ou de variantes humanizadas disso, e especialmente dos nanocorpos "humanizados" de SEQ ID NO's 7 6 para 8 6 e SEQ ID NO's: 95 para 99. Os nanocorpos contra a albumina de soro humano presente nos polipeptidios da invenção são preferivelmente como definidos mais adiante, e mais preferivelmente escolhidos do grupo composto de SEQ ID NO's: 61 para 67, SEQ ID NO's: 87 para 89 e SEQ ID NO's: 100-104, e especialmente dos nanocorpos "humanizados" contra albumina de soro humana de SEQ ID NO's 76 para 86 e SEQ ID NO's 100-104.
Com respeito aos nanocorpos que estão presentes nos polipeptidios da invenção, estará claro para a pessoa experimentada que os nanocorpos que são mencionados na presente como "preferidos" (ou como "mais preferenciais", "até mais preferenciais", etc.) também são preferidos (ou mais preferenciais, ou até mais preferencial, etc.) para usar nos polipeptidios descritos na presente. Portanto, os polipeptidios que compreendem ou essencialmente se compõem de um ou vários nanocorpos "preferidos" da invenção são geralmente preferidos, e os polipeptidios que compreendem ou essencialmente se compõem de um ou vários nanocorpos "mais preferenciais" da invenção serão geralmente mais preferidos,
Portanto, na invenção, polipeptidios que compreendem um ou vários nanocorpos que essencialmente se compõem de uma das variantes preferenciais do clone PMP1C2 (TNF1; o SEQ ID n. 52), no qual as referidas variantes preferenciais são como definidas na presente, são em particular preferidas. Mesmo mais preferenciais são polipeptidios que compreendem um ou vários nanocorpos que essencialmente se compõem de uma das variantes humanizadas do clone PMP1C2 (TNF1; o SEQ ID n. 52), no qual as referidas variantes humanizadas são como definidas na presente (exemplos ser, sem restrição, TNF13, TNF14, TNF29 e TNF30). 0 TNF30 é um "bloco de construção" humanizado em particular preferencial para uso nos polipeptidios da invenção.
Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos de tal proteína e polipeptidios são o próprio PMP1C2, as variantes humanizadas TNF13, TNF14, TNF29 e TNF30; construir de SEQ ID n. 70 (TNF4), SEQ ID n. 73 (TNF7), SEQ ID n. 90 (TNF24), SEQ ID n. 93 (TNF27); e construtos de SEQ ID n. 417 (TNF60), SEQ ID n. 419 (TNF55) e SEQ ID n. 420 (TNF56) , no qual os últimos três construtos contêm a variante humanizada TNF 30 como um bloco de construção.
Como mencionado na presente, os nanocorpos e construtos descritos na presente podem ser pegilados, ou conter um ou vários resíduos aminoácidos (adicionais) que levam em conta pegilação e/ou facilitam pegilação. Dois exemplos preferidos, mas não-restritivos de tais polipeptidios são TNF55 e TNF56, que ambos contêm um resíduo adicional de cisteina para fácil anexação de um grupo PEG.
Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos dos polipeptidios da invenção são os polipeptidios bivalentes da invenção de SEQ ID NO's: 70 para 75 e os polipeptidios multiespecíficos da invenção de SEQ ID NO's: 90 para 94 e SEQ ID NO's 417 para 420.
Como pode ser visto dos dados representados mais adiante, e especialmente dos dados no Exemplo Comparativo, os nanocorpos e/ou os polipeptidios da invenção melhoraram propriedades. Especialmente, a proteína e os polipeptidios da invenção podem ter melhorado a afinidade paro TNF-alfa humana (expresso como o valor EC50 no ensaio KYM descrito na presente), em comparação com o anti-TNF comercialmente disponível biologicals Enbrel™ Humira™ e Remicade ™. Também, os nanocorpos descritos na presente podem ter uma afinidade melhorada paro TNF-alfa em comparação com o Nanocorpo de melhor execução descrito no pedido Internacional WO 04/041862. Pode ser portanto esperado que os polipeptidios da invenção que compreendem pelo menos um dos nanocorpos da invenção também terão melhorado propriedades em comparação com polipeptidios que compreendem só os nanocorpos contra o TNF-alfa descrita em WO 04/041862.
Mais especialmente, um polipeptidio conforme descrito na presente que compreende dois ou mais (e preferivelmente dois) nanocorpos como na presente (e opcionalmente, por exemplo, um Nanocorpo contra uma albumina de soro humano), tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 de Humira® em Remicade®, e preferivelmente também melhor do que Enbrel® no mesmo ensaio.
Por exemplo, tal proteína ou o polipeptidio preferivelmente têm um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 0,2 nM, preferivelmente melhor do que 0,1 nM, como melhor do que 0,7 Nm e especialmente melhor do que 0,4 nM.
Também foi mostrado por solicitantes que nanocorpos contro TNF-alfa de rato e polipeptidios que compreendem nanocorpos contra o TNF-alfa de rato mostram uma atividade biológica benéfica nos modelos de doença seguintes (dados não mostrados):
- Sulfato de sódio dextran ("DSS") modelo da colite, usando tanto ratos regulares como ratos neutralizados IL-10, como descrito por Okayasu et al. (Gastroenterol 1990, 98 (3): 694)
- Artrite induzida por colágeno ("CIA") o modelo da artrite ("RA"), como descrito por Courtenay et al. (Nature 1980, 283
(5748): 666), usando tanto ratos regulares como Ratos neutralizados IL-10;
- Modelo de ratos neutralizados IL-10 de IBD, quanto a exemplo descrito por Rennick et al. (Clin Immunol
Immunopathol 1995, 76 (3 Pt 2) : S174) - Modelo de Kollias de RA quanto a exemplo descrito por Keffer et al. (EMBO J 1991, 10 (13): 4025)
- Ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfônico ("TNBS") modelo de IBD, como descrito por Elson et al. (J Immunol 1996, 157 (5): 2174)
- Modelo de CIA de RA, descrita por Koppieters e al (manuscrito em preparação);
Modelo fibroblasto sinovial-derivado (descrito mais adiante); e
- Modelo de bolsa de ar de ratos.
Preferivelmente, os nanocorpos descritos na presente são melhores do que o Nanocorpo IA de WO 04/0418 62 em pelo menos um desses modelos, e preferivelmente em todos esses modelos; e mais são melhores do que o Nanocorpo 3E de WO 04/041862 em pelo menos um desses modelos, e preferivelmente em todos esses modelos. Também, os polipeptidios descritos na presente são preferivelmente equivalentes a ou melhores do que Humira® ou Remicade® em pelo menos um desses modelos, e preferivelmente em todos esses modelos; e mais preferivelmente também equivalente a ou melhor do que Enbrel® em pelo menos um desses modelos, e preferivelmente em todos esses modelos.
Esses dados confirmam que nanocorpos contro TNF-alfa e polipeptidios que contendo o mesmo, como os nanocorpos e polipeptidios descritos em WO 04/041862 e especialmente os nanocorpos e polipeptidios descritos na presente, devem ter eficácia terapêutica contra doenças mediadas de TNF e desordens, como as doenças e desordens acima mencionadas.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um ácido 30 nucléico que codifica um Nanocorpo da invenção e/ou um polipeptidio da invenção. Um ácido nucléico tal também será referido a seguir como um "ácido nucléico da invenção" e, por exemplo, pode ser na forma de um construto genético, conforme definido mais adiante.
Em outro aspecto, a invenção refere-se à célula hospedeira ou hospedeira que expressa ou é capaz de expressar um Nanocorpo da invenção e/ou um polipeptidio da invenção; e/ou que contém um ácido nucléico que codifica um Nanocorpo da invenção e/ou um polipeptidio da invenção. Tal hospedeira ou uma célula hospedeira também podem ser análogos aos anfitriões e apresentar células descritas em WO 04/041862, mas expressando ou capazes de expressar um Nanocorpo da invenção e/ou um polipeptidio da invenção e/ou conter um ácido nucléico conforme descrito na presente.
A invenção além disso refere-se a um produto ou composição conter ou compreender um Nanocorpo da invenção, um polipeptidio da invenção; e/ou um ácido nucléico da invenção. Tal produto ou a composição, por exemplo, podem ser uma composição farmacêutica (conforme descrito mais adiante) ou um produto ou a composição para uso diagnóstico (como também descrito mais adiante). Tal produto ou a composição também podem ser análogos aos produtos e composições descritas em WO 04/041862, mas conter ou compreender um Nanocorpo da invenção, um polipeptidio da invenção ou um ácido nucléico da invenção.
A invenção além disso refere-se a métodos para preparar ou gerar nanocorpos, polipeptidios, ácidos nucléicos, células hospedeiras, produtos e composições descritas na presente, quais métodos são, conforme mais adiante descritos mais adiante. Também, geralmente, o nanocorpos, os polipeptidios, os ácidos nucléicos, as células hospedeiras, os produtos e as composições descritas na presente também podem estar preparados e usados em uma maneira análoga à maneira descrita em WO 04/041862.
A invenção além disso relaciona a aplicações e usos dos acima mencionados nanocorpos, polipeptidios, ácidos nucléicos, células hospedeiras, produtos e composições descritas na presente, cujas aplicações e usos incluem, mas não são limitados a, as aplicações e os usos descritos a seguir e/ou os novos usos e aplicações para nanocorpos contra o TNF-alfa e/ou para polipeptidios que contêm o mesmo em WO 04/041862. Outros aspectos, modalidades de execução, vantagens e aplicações da invenção ficarão claros da nova descrição a seguir.
Descrição detalhada da invenção
Os aspectos acima mencionados e outros e modalidades de execução da invenção ficarão claros da ulterior descrição a seguir, em que:
a) A menos que não indicado ou definido de outra maneira, todos os termos usados têm a sua significação habitual na técnica, que será clara à pessoa experimentada. A referência, por exemplo, é feita aos manuais padrão, como Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( 2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principies of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of Califórnia Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, IOth Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), , bem como aos fundamentos técnicos gerais citados na presente;
b) A menos que indicado de outra maneira, o termo "seqüência de imunoglobulina" - seja usado na presente para referir-se a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo de 4 cadeias convencional - é usado como um termo geral para incluir tanto anticorpo de tamanho natural, as cadeias individuais dele, como todas as partes, domínios ou fragmentos disso (inclusive, mas não limitado a, domínios obrigatórios de antígeno ou fragmentos como domínios VHH ou domínios VH/VL, respectivamente). Além do mais, o termo "seqüência" como usado na presente (por exemplo em termos como "seqüência de imunoglobulina", "a seqüência de anticorpo", "seqüência de domínio variável", "seqüência de VHH" ou "seqüência de proteína"), deve ser geralmente entendido para incluir tanto seqüência aminoácida relevante como seqüências ácidas nucléicas ou seqüências de nucleotídeos que codificam o mesmo, a menos que o contexto requeira uma interpretação mais limitada;
c) A menos que indicado de outra maneira, todos os métodos, os passos, as técnicas e as manipulações que não são especificamente descritas detalhadamente podem ser executados e foram executados em uma maneira conhecida por si, como estará claro para a pessoa experimentada. A referência, por exemplo, é novamente feita aos manuais padrão, à fundamentos técnicos gerais mencionados anteriormente e às novas referências citadas na presente;
d) Os resíduos de aminoácido serão indicados segundo o código padrão de três letras ou aminoácido de uma letra, conforme mencionado na Tabela 1;
Tabela 1: Código de aminoácidos de uma letra e de três letras
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e) Para os objetivos de comparar duas ou mais seqüências de nucleotídeos, a porcentagem da "identidade de seqüência" entre uma primeira seqüência de nucleotídeos e uma segunda seqüência de nucleotídeos podem ser calculados dividindo-se [o número de nucleotídeos na primeira seqüência de nucleotídeos que são idênticos aos nucleotideos nas posições correspondentes na segunda seqüência de nucleotídeos] [pelo número total de nucleotídeos na primeira seqüência de nucleotídeos] e multiplicado por [100%], nos quais cada eliminação, inserção, substituição ou adição de um nucleotideos na segunda seqüência de nucleotideos - em comparação com a primeira seqüência de nucleotideos - são consideradas como uma diferença em um nucleotideo único (posição).
Alternativamente, o grau da identidade de seqüência entre duas ou mais seqüências de nucleotideos pode ser calculado usando um algoritmo de computador conhecido para alinhamento de seqüência como NCBI Blast v2.0, usando configurações padrão.
Algumas outras técnicas, algoritmos de computador e configurações para determinar o grau da identidade de seqüência, por exemplo, são descritos em WO 04/037999, EP 0 967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 e a GB 2357 768-A.
Normalmente, para o objetivo de determinar a porcentagem da "identidade de seqüência" entre duas seqüências de nucleotideos conforme o método de cálculo delineado mais acima, a seqüência de nucleotideos com o número maior de nucleotideos será tomada como "a primeira" seqüência de nucleotideos, e outra seqüência de nucleotideos será tomada como "a segunda" seqüência de nucleotídeos; f) Para os objetivos de comparar duas ou mais seqüências aminoácidas, a porcentagem "da identidade de seqüência" entre uma primeira seqüência aminoácida e uma segunda seqüência aminoácida podem ser calculados dividindo-se [o número de resíduos aminoácidos na primeira seqüência aminoácida que são idênticos aos resíduos aminoácidos nas posições correspondentes na segunda seqüência aminoácida] [pelo número total de nucleotídeos na primeira seqüência aminoácida] e multiplicando por [100%], nos quais cada eliminação, inserção, substituição ou adição de um resíduo aminoácido na segunda seqüência aminoácida - em comparação com a primeira seqüência aminoácida - são consideradas como uma diferença em um resíduo aminoácido único (posição), isto é, como uma "diferença aminoácida" conforme definido mais adiante.
Alternativamente, o grau da identidade de seqüência entre duas seqüências aminoácidas pode ser calculado usando um algoritmo de computador conhecido, como os acima mencionados para determinação do grau da identidade de seqüência para seqüências de nucleotídeos, novamente usando configurações padrão.
Normalmente, para o objetivo de determinar a porcentagem "da identidade de seqüência" entre duas seqüências aminoácidas conforme o método de cálculo delineado mais acima, a seqüência aminoácida com o número maior de resíduos aminoácidos será tomada como "a primeira" seqüência aminoácida, e outra seqüência aminoácida será tomada como "a segunda" seqüência aminoácida.
Também, na determinação do grau da identidade de seqüência entre duas seqüências aminoácidas, a pessoa experimentada pode considerar as assim chamadas substituições aminoácidas "conservadoras", que podem ser geralmente descritas como substituições aminoácidas nas quais um resíduo aminoácido é substituído com outro resíduo aminoácido da estrutura química semelhante e que não tem pouco ou essencialmente nenhuma influência na função, atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptídio. Tais substituições aminoácidas conservadoras são bem conhecidas na técnica, por exemplo, de WO 04/037999, a GB uns 2357768, WO 98/49185, WO 00/46383 e WO 01/09300; e os tipos (preferidos) e/ou as combinações de tais substituições podem ser selecionados com base nos ensinos pertinentes de WO 04/037999 bem como WO 98/49185 e das novas referências citadas na presente.
Tais substituições conservadoras preferivelmente são substituições nas quais um aminoácido dentro dos grupos seguintes (a) - (e) é substituído por outro resíduo aminoácido dentro do mesmo grupo: (a) pequeno alifático, resíduos não-polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; (b) polar, resíduos negativamente carregados e His (não carregado) amidas: Asp, Asn, Glu e Gln; (c) polar, resíduos positivamente carregados: His, Arg e Lys; (d) grande alifático, resíduos não-polares: Met, Leu, He, Val e Cys; e resíduos aromáticos (e): Phe, Tyr e Trp.
As substituições conservadoras em particular preferenciais são como se segue: Ala em Gly ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Gln ou no Seu; Asp em Glu; Cys em Ser; Gln em Asn; Glu em Asp; Gly em Ala ou em Pro; His em Asn ou em Gln; Ile em Leu ou em Vai; Leu em Ile ou em Vai; Lys em Arg, em Gln ou em Glu; Met em Leu, em Tyr ou em Ile; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser; Trp em Tyr; Tyr em Trp; e/ou Phe em Vai, em Ile ou em Leu.
Qualquer substituição aminoácida aplicada aos polipeptídios descritos na presente também pode ser baseada na análise das freqüências de variações aminoácidas entre a proteína homóloga da espécie diferente desenvolvida por Schulz et al., Principies of Protein Structure, Springer- Verlag, 1978, nas análises de estrutura que forma potenciais desenvolvidos por Chou e Fasman, Bioquímica 13: 211, 1974 e Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, e na análise de modelos de hidrofobicidade em proteína desenvolvida por Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sei. USA 81: 140-144, 1984; Kyte e Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1, e Goldman et al., Ann. Ver. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, todos incorporado na presente no seu conjunto por referência. Informação na estrutura primária, secundária e terciária de nanocorpos dado na descrição na presente e na técnica de fundo geral citada anteriormente. Também, com esta finalidade, a estrutura cristalina de um domínio VHH de uma lhama, por exemplo, é dada por Desmyter et al., Natureza Biologia Estrutural, volume 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Nature Structural Biology, (1996); 3, 752-757; e Decanniere et al. , Structure, volume 7, 4, 361 (1999). A nova informação de alguns resíduos aminoácidos que em domínios VH convencionais formam a interface VH/VL e o substituições de camelização potencial dessas posições pode ser encontrada na técnica prévia em nanocorpos citado na presente;
g) diz-se que seqüências de aminoácido e seqüências ácidas nucléicas sejam "exatamente o mesmo" se eles tiverem a identidade de seqüência de 100% (conforme definido na presente) acima do seu comprimento inteiro;
h) comparando duas seqüências aminoácidas, o termo "diferença aminoácida" refere-se a uma inserção, eliminação ou substituição de um resíduo aminoácido único em uma posição da primeira seqüência, em comparação com a segunda seqüência; sendo entendido que duas seqüências aminoácidas pode conter uma, duas ou mais tais diferenças aminoácidas;
i) considera-se que uma seqüência ácida nucléica ou a seqüência aminoácida é "em essencialmente isolada (forma)" - por exemplo, em comparação com a sua fonte biológica nativa e/ou o meio de reação ou meio de cultivo do qual foi obtido - quando foi separada de pelo menos um outro componente com o qual ela se associa normalmente em fonte dita ou meio, como outro ácido nucléico, outra proteína/polipeptídio, outro componente biológico ou macromolécula ou pelo menos um contaminante, impureza ou componente menor. Especialmente, uma seqüência ácida nucléica ou a seqüência aminoácida são consideradas "essencialmente isoladas" quando foi purificado pelo menos 2 vezes, especialmente pelo menos 10 vezes, mais especialmente pelo menos 100 vezes, e até a 1000 vezes ou mais. Uma seqüência ácida nucléica ou a seqüência aminoácida que é "na forma essencialmente isolada" são preferivelmente essencialmente homogêneas, conforme determinado utilizando uma técnica conveniente, como uma técnica cromatográfica conveniente, como poliacrilamida-geleletroforese; j) O termo "domínio" como usado na presente geralmente refere-se a uma região globular de uma cadeia de anticorpos, e especialmente a uma região globular de um anticorpo de cadeia pesada, ou a um polipeptídio que essencialmente se compõe de tal região globular. Normalmente, tal domínio compreenderá laços de peptídeos (por exemplo 3 ou 4 laços de peptídeos) estabilizado, por exemplo, como uma folha ou por ligações bissulfeto.
k) O termo xantigênico determinante' refere-se ao epitope no antígeno reconhecido pela molécula de ligação de antígeno (como um Nanocorpo ou um polipeptídio da invenção) e mais especialmente pelo sítio de ligação de antígeno da referida molécula. Os termos "antigênico determinante" e "epitope' também podem ser usados de modo trocável na presente.
l) Uma seqüência aminoácida (como um Nanocorpo, um anticorpo, um polipeptídio da invenção, ou geralmente um proteína de ligação de antígeno ou polipeptídio ou um fragmento disso) que pode ligar a, que tem a afinidade para e/ou que tem a especificidade para um determinante antigênico específico, epitope, o antígeno ou a proteína (ou para pelo menos uma parte, fragmento ou epitope disso) esteja "contra" ou "dirigido contra" o referido determinante antigênico, epitope, antígeno ou proteína.
m) O termo "especificidade" refere-se ao número de tipos diferentes de antígenos ou determinantes antigênicos aos quais uma determinada molécula de ligação de antígeno ou proteína de ligação de antígeno (como um Nanocorpo ou um polipeptídio da invenção) a molécula pode ligar. A especificidade de uma proteína de ligação de antígeno pode ser determinada baseada na afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pelo equilíbrio constante para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação de antígeno (KD), é uma medida para a força de ligação entre um determinante antigênico e um sítio de ligação de antígeno na proteína de ligação de antígeno: o menor o valor do KD, quanto mais forte a força de ligação entre um determinante antigênico e a molécula de ligação de antigeno (alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a afinidade constante (KA), que é 1/KD). Como estará claro para a pessoa experimentada (por exemplo com base na nova revelação na presente), a afinidade pode ser determinada em uma maneira conhecida por si, dependendo do antigeno especifico de interesse. A avidez é a medida da força da ligação entre uma molécula de ligação de antigeno (como um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção) e o antigeno pertinente. A avidez está relacionada tanto à afinidade entre um determinante antigênico e sitio de ligação de antigeno na molécula de ligação de antigeno como ao número de sítios de ligação presentes pertinente na molécula de ligação de antigeno. Tipicamente, a proteína de ligação de antigeno (como os nanocorpos e/ou os polipeptídios da invenção) ligará com uma dissociação constante (KD) de IO-5 a IO-12 mol/litro (M) ou menos, e preferivelmente IO-7 a IO-12 mol/litro (M) ou menos e mais preferivelmente IO"8 a IO"12 mol/litro, e/ou com uma associação constante (KA) de pelo menos IO7 m_1, preferivelmente pelo menos IO8 m_1, mais preferivelmente pelo menos IO9 m_1, como pelo menos IO12 m_1. Considera-se geralmente que qualquer valor de KD maior do que 10~4 M indica a ligação não-específica. Preferivelmente, um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ligarão ao antigeno desejado com um KD menos de 500 nM, preferivelmente menos de 200 nM, mais preferivelmente menos de 10 nM, como menos de 500 pM. A ligação específica de uma proteína de ligação de antigeno a um antigeno ou determinante antigênico pode ser determinada em qualquer maneira conveniente conhecida por si, inclusive, por exemplo, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitivos, como rádio- inumoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA) e ensaios de competição de sandwitch, e as variantes diferentes deles conhecidas per se na técnica. n) conforme adicionalmente descrito a seguir, a seqüência aminoácida e a estrutura de um Nanocorpo podem ser considerados - sem ser limitados contudo a isso - para ser compreendidos de quatro regiões de armação ou "FR'S", que são referidos na técnica e a seguir como "região de Armação 1" ou nFRl"; como "região de Armação 2" ou "FR2"; como "região de Armação 3" ou "FR3"; e como "região de Armação 4" ou "FR4", respectivamente; cujas regiões de armação são interrompidas por três regiões de determinação complementares ou "CDR's", que são referidos na técnica como "Região que Determina Complementaridade 1" ou "CDR1"; como "Região que Determina Complementaridade 2" ou "CDR2"; e como "Região que Determina Complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente;
o) como também adicionalmente descrito a seguir, o número total de resíduos aminoácidos em um Nanocorpo pode estar na região de 110-120, é preferivelmente 112-115, e é mais preferivelmente 113. Deve contudo ser observado que as partes, os fragmentos ou os análogos (conforme adicionalmente descrito a seguir) de um Nanocorpo não são em particular limitados quanto ao seu comprimento e/ou tamanho, enquanto tais partes, os fragmentos ou os análogos satisfazem condições delineadas a seguir e são também preferivelmente convenientes para os objetivos descritos na presente;
p) os resíduos aminoácidos de um Nanocorpo são numerados segundo a numeração geral para domínios de VH dados por Kabat et al. (sySequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicação n. 91), aplicado a domínios Vhh de Camelídeos no artigo de Riechmann e Muyldermans, mencionado anteriormente (ver, por exemplo, a Figura 2 da referência dita). Segundo esta numeração, FRl de um Nanocorpo compreende os resíduos aminoácidos nas posições 1-30, CDRl de um Nanocorpo compreende os resíduos aminoácidos nas posições 31-36, FR2 de um Nanocorpo compreende os aminoácidos nas posições 36- 49, CDR2 de iam Nanocorpo compreende os resíduos aminoácidos nas posições 50-65, FR3 de um Nanocorpo compreende os resíduos aminoácidos nas posições 66-94, CDR3 de um Nanocorpo compreende os resíduos aminoácidos nas posições 95-102, e FR4 de um Nanocorpo compreende os resíduos aminoácidos nas posições 103-113. [Neste aspecto, deve ser observado que - como é bem conhecido na técnica para domínios de VH e para domínios de VHH - o número total de resíduos aminoácidos em cada um do CDR'S pode variar e corresponder não ao número total de resíduos aminoácidos indicados pela numeração de Kabat (isto é, uma ou várias posições segundo a numeração de Kabat não podem ser ocupadas na seqüência real, ou a seqüência real pode conter mais resíduos aminoácidos do que o número levado em conta pela numeração de Kabat). Isto significa que, geralmente, a numeração segundo Kabat pode ou não corresponder à numeração real dos resíduos aminoácidos na seqüência real. Geralmente, contudo, se pode dizer que, segundo a numeração de Kabat e independente do número de resíduos aminoácidos no CDR1S, a posição 1 segundo a numeração de Kabat corresponde ao início de FRl e vice-versa, a posição 36 segundo a numeração de Kabat corresponde ao início de FR2 e vice-versa, a posição 66 segundo a numeração de Kabat corresponde ao início de FR3 e vice-versa, e a posição 103 segundo a numeração de Kabat corresponde ao início de FR4 e vice-versa.].
Métodos alternativos para numeração dos resíduos aminoácidos de domínios VH, cujos métodos também podem ser aplicados em uma maneira análoga a domínios VHH de Camelideos e a nanocorpos, são o método descrito por Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), a assim chamada "definição de AbM" e a assim chamada "definição de contato". Contudo, na descrição presente, as reivindicações e as figuras, a numeração segundo Kabat aplicada a domínios VHH por Riechmann e Muyldermans serão seguidas, a menos que indicado de outra maneira; e q) as Figuras, a Listagem de Seqüência e a Parte/Exemplos Experimentais só são dados para ilustrar além disso a invenção e não devem ser interpretadas ou entendidas como limitação do alcance da invenção e/ou das reivindicações anexas de qualquer modo, a menos que explicitamente indicado de outra maneira na presente.
Para uma descrição geral de anticorpos de cadeias pesadas e domínios variáveis dos mesmos, a referência é entre outras coisas feita às referências seguintes, que são mencionadas como fundamentos técnicos gerais: WO 94/04678, WO 95/04079 e WO 96/34103 de Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 e WO 02/48193 de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 e WO 03/055527 do Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 de Algonomics N.V. e solicitante; WO 01/90190 pelo Conselho de Pesquisa Nacional do Canadá; WO 03/025020 (= EP 1433793) pelo Instituto de Anticorpos; bem como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 por solicitante e as novas solicitações de patente publicadas por solicitante; Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8; Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies and Riechmann, Protein Eng. 1996 Jun; 9(6): 531-7; Desmyter et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 803-11; Sheriff et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 733-6; Spinelli et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414(3): 521-6; Vu et al., Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch et al., Journal of Camel Practice and Research 1997; 4: 177-182; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 1998 Jan 23; 275(3): 413-8; Lauwereys et al., EMBO J. 1998 Jul 1; 17(13): 3512-20; Frenken et al., Res Immunol. 1998 Jul-Aug;149 (6) :589-99; Transue et al., Proteins 1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Muyldermans and Lauwereys, J. Mol. Recognit. 1999 Mar-Apr; 12 (2): 131-40; van der Linden et al., Biochim. Biophys. Acta 1999 Apr 12; 1431(1): 37-46.; Decanniere et al., Structure Fold. Des. 1999 Apr 15; 7(4): 361-70; Ngyuen et al., Mol. Immunol. 1999 Jun; 36(8): 515-24; Woolven et al., Immunogeneties 1999 Oct; 50 (1-2): 98-101; Rieehmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2): 25-38; Spinelli et al. , Bioehemistry 2000 Feb 15; 39(6): 1217-22; Frenken et al., J. Bioteehnol. 2000 Feb 28; 78(1): 11-21; Nguyen et al., EMBO J. 2000 Mar 1; 19(5): 921-30; van der Linden et al., J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2) : 185-95; Deeanniere et al., J. Mol. Biol. 2000 Jun 30; 300 (1): 83-91; van der Linden et al., J. Biotechnol. 2000 Jul 14; 80(3): 261-70; Harmsen et al., Mol. Immunol. 2000 Aug; 37 (10): 579-90; Perez et al., Bioehemistry 2001 Jan 9; 40(1): 74-83; Conrath et al., J. Biol. Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Muyldermans et al., Trends Bioehem Sei. 2001 Apr; 26(4):230- 5; Muyldermans S., J. Biotechnol. 2001 Jun; 74 (4): 277-302; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 2001 Jul 13; 276 (28): 26285-90; Spinelli et al., J. Mol. 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Conforme a terminologia usada nas acima mencionadas referências, os domínios variáveis presentes em anticorpos de cadeias pesadas que ocorrem naturalmente também se mencionarão como "domínios de VHH", para distingui-los dos domínios variáveis de cadeias pesadas que estão presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais (que serão referidos a seguir como "domínios de VH") e dos domínios variáveis de cadeia leves que estão presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais (que serão referidos a seguir como "Domínios VL").
Como mencionado na técnica prévia mencionada anteriormente, os domínios de VHH têm um número de características estruturais e propriedades funcionais únicas que fazem os domínios de VHH isolados (bem como nanocorpos baseados nisso, que compartilham essas características estruturais e propriedades funcionais com domínios de VHH naturais) e proteínas que contêm o mesmo altamente vantajoso para uso como domínios obrigatórios de antígeno funcionais ou proteína. Especialmente, e sem ser limitados à isso, os domínios de VHH (que foram "projetados" pela natureza para ligar funcionalmente a um antígeno sem a presença de, e sem qualquer interação com, um domínio variável de cadeia leve) e nanocorpos podem funcionar como uma unidade estrutural obrigatória de antígeno única, relativamente pequena, funcional, domínio ou proteína. Isto distingue os domínios VHH do VH e Domínios VL de anticorpos de 4 cadeias convencionais, que por eles não são geralmente apropriados para aplicação prática como proteína de ligação de antígeno única ou domínios, mas têm de ser combinados em alguma forma ou outra para fornecer uma unidade obrigatória de antígeno funcional (como em, por exemplo, fragmentos de anticorpos convencionais como fragmentos Fab; em fragmentos de ScFv, que se compõem de um domínio Vh covalentemente ligado a um domínio VL).
Por causa dessas propriedades únicas, o uso de domínios VHH e nanocorpos como proteína de ligação de antígeno única ou como domínios obrigatórios de antígeno (isto é, como parte de uma maior proteína ou polipeptídio) oferece um número de vantagens significativas por cima do uso de VH convencional e Domínios VL, os scFv ou fragmentos de anticorpo convencionais (como Fab-ou F (ab') 2 fragmentos):
■só um domínio único deve ligar um antígeno com alta afinidade e com alta seletividade, para que não haja nenhuma necessidade de ter dois domínios separados presentes, nem assegurar que esses dois domínios estejam presentes na conformação espacial direita e configuração (isto é, através do uso de linkers especialmente projetados, como com o scFv1s);
•Os domínios de VHH e nanocorpos podem ser expressos de um gene único e não requerer nenhuma dobra pós-translação ou modificações; Os domínios de VHH e nanocorpos podem ser facilmente projetados em formatos multivalente e multiespecíficos (conforme adicionalmente discutido na presente);
•Os domínios de VHH e nanocorpos são altamente solúveis e não têm uma tendência de agregar-se (como com os domínios de ligação de antígeno derivados de rato descritos por Ward et al., Nature, volume 341, 1989, p. 544);
•Os domínios de VHH e nanocorpos são altamente estáveis ao calor, pH, proteases e outros agentes ou condições desnaturantes (ver, por exemplo, Ewert e al, supra); Os domínios de VHH e nanocorpos são fáceis e relativamente baratos para preparar-se, até em uma escala requerida para produção. Por exemplo, os domínios de VHH, nanocorpos e a
proteína/polipeptídios que contém o mesmo podem ser produzidos usando fermentação microbial (p. ex. conforme adicionalmente descrito mais adiante) e não requerem o uso de sistemas de expressão mamíferos, como com fragmentos de anticorpo convencionais por exemplo;
Os domínios de VHH e nanocorpos são relativamente pequenos (aproximadamente 15 kDa, ou 10 vezes menores do que um IgG convencional) em comparação com anticorpos de 4 cadeias convencionais e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, e por isso mostram (mais) alta penetração em tecidos (inclusive mas não limitados a tumores sólidos e outros tecidos densos) do que tais anticorpos de 4 cadeias convencionais e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos;
Os domínios de VHH e nanocorpos podem mostrar assim chamadas propriedades de ligação de cavidade (entre outras coisas devido ao seu laço CDR3 extenso, em comparação com domínios VH convencionais) e por isso também acessar objetivos e epitopes não acessíveis a anticorpos de 4 cadeias convencionais e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos. Por exemplo, foi mostrado que os domínios VHH e nanocorpos podem inibir enzimas (ver, por exemplo, WO 97/49805; Transue et al., (1998), supra; Lauwereys et al., (1998), supra.
Conforme acima mencionado, a invenção geralmente refere-se a nanocorpos dirigidos contra o TNF-alfa, bem como à polipeptídios compreendendo ou essencialmente compostos de um ou vários de tais nanocorpos, que podem ser usados para fins profiláticos, terapêuticos e/ou diagnósticos descritos mais adiante e em WO 04/041862.
Conforme também acima mencionado e além disso descrito mais adiante, a invenção além disso se refere aos ácidos nucléicos que codificam tais nanocorpos e polipeptidios, a métodos para preparar tais nanocorpos e polipeptidios, apresentar células que expressam ou são capazes de expressar tais nanocorpos ou polipeptidios, a usos de tais nanocorpos, polipeptidios, ácidos nucléicos ou células hospedeiras, e a composições que compreendem tais nanocorpos, polipeptidios, ácidos nucléicos ou células hospedeiras.
Geralmente, deve ser observado que o termo Nanocorpo como usado na presente no seu sentido mais amplo não é limitado a uma fonte biológica especifica ou a um método especifico da preparação. Por exemplo, como será discutido mais detalhadamente mais adiante, os nanocorpos da invenção podem ser obtidos (1) isolando o domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada que ocorre naturalmente; (2) por expressão de uma seqüência de nucleotídeos que codifica um domínio de VHH que ocorre naturalmente; (3) "por humanização" (conforme descrito mais adiante) de um domínio de VHH de ocorrência natural ou por expressão de um ácido nucléico que codifica tal domínio VHH humanizado; (4) por "camelização" (conforme descrito mais adiante) de um domínio de ocorrência natural de VH de qualquer espécie dos animais, especialmente uma espécie de mamífero, como de um ser humano, ou por expressão de um ácido nucléico que codifica tal domínio VH camelizado; (5) por "camelização" "de um anticorpo de domínio" ou "Dab" como descrito por Ward e al (supra), ou pela expressão de um ácido nucléico que codifica tal domínio VH camelizado; (6) usando técnicas sintéticas ou semi- sintéticas para preparar proteína, polipeptidios ou outras seqüências aminoácidas; (7) preparando um ácido nucléico que codifica um Nanocorpo utilizando técnicas de síntese ácida nucléica, seguida por expressão do ácido nucléico conseqüentemente obtido; e/ou (8) por qualquer combinação do precedente. Métodos convenientes e técnicas para executar o precedente serão claros para a pessoa experimentada baseado na revelação na presente e, por exemplo, incluirão os métodos e técnicas descritas mais detalhadamente a seguir.
Contudo, segundo uma modalidade de execução especifica, os nanocorpos da invenção não têm uma seqüência aminoácida que é exatamente a mesmo como (isto é, como um grau de identidade de seqüência de 100%) a seqüência aminoácida de um domínio VH de ocorrência natural, como a seqüência aminoácida de um domínio VH de ocorrência natural de um mamífero, e especialmente de um ser humano.
Uma classe em particular preferencial de nanocorpos da invenção compreende nanocorpos com uma seqüência aminoácida que corresponde à seqüência aminoácida de um domínio VHH de ocorrência natural, mas que foi "humanizado", isto é, substituindo um ou vários resíduos aminoácidos na seqüência aminoácida da referida seqüência VHH de ocorrência natural por um ou vários dos resíduos aminoácidos que ocorrem na posição(ões) correspondente em um domínio VH de um anticorpo de 4 cadeias convencional de um ser humano (p. ex. indicado anteriormente) . Isto pode ser executado em uma maneira conhecida por si, o que ficará claro para a pessoa experimentada, por exemplo, com base na nova descrição mais adiante e a arte prévia na humanização mencionada na presente. Novamente, deve ser observado que tais nanocorpos humanizados da invenção podem ser obtidos em qualquer maneira conveniente conhecida por si (isto é, como indicado sob os pontos (1) - (8) acima) e portanto não são estritamente limitados a polipeptídios que foram obtidos usando um polipeptídio que compreende um domínio VHH de ocorrência natural como um material inicial.
Uma substituição preferencial, mas não-limitadora, humanizante para nanocorpos que pertencem ao 103 P, R, S- grupo e/ou o GLEW-grupo (conforme definido na presente) é 108Q a 108L.
Outra classe em particular preferencial de nanocorpos da invenção compreende nanocorpos com uma seqüência aminoácida que corresponde à seqüência aminoácida de um domínio VH de ocorrência natural que foi "camelizado", isto é, substituindo um ou vários resíduos aminoácidos na seqüência aminoácida de um domínio VH de ocorrência natural de um anticorpo de 4 cadeias convencional por um ou vários dos resíduos aminoácidos que ocorrem na posição(ões) correspondente em um domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada. Isto pode ser executado em uma maneira conhecida por si, o que ficará claro para a pessoa experimentada, por exemplo, com base na nova descrição mais adiante. A referência também é feita a WO 94/04678. Tal camelização pode ocorrer preferencialmente nas posições aminoácidas que estão presentes na interface VH-VL e nos assim chamados resíduos de Hallmark Camelidae (ver, por exemplo, também WO 94/04678), como também mencionado mais adiante. Preferivelmente, o domínio VH ou a seqüência que é usada como um material inicial ou ponto de partida que gera ou projeta o Nanocorpo camelizado são preferivelmente uma seqüência VH de um mamífero, mais preferivelmente a seqüência VH de um ser humano. Contudo, deve ser observado que tais nanocorpos camelizados da invenção podem ser obtidos em qualquer maneira conveniente conhecida por si (isto é, como indicado conforme os pontos (1) - (8) acima) e portanto não são estritamente limitados a polipeptídios que foram obtidos usando um polipeptídio que compreende um domínio VH de ocorrência natural como um material inicial.
Por exemplo, novamente conforme adicionalmente descrito mais adiante, tanto a "humanização" como a "camelização" pode ser executada fornecendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma tal domínio VHH ou domínio VH que ocorrem naturalmente, respectivamente, e logo modificando, em uma maneira conhecida por si, um ou vários codons na seqüência de nucleotídeos tal que a nova seqüência de nucleotídeos codifica um Nanocorpo humanizado ou camelizado da invenção, respectivamente, e logo expressando a seqüência de nucleotídeos portanto obtida em uma maneira conhecida por si para fornecer o Nanocorpo desejado da invenção. Alternativamente, baseado na seqüência aminoácida de um domínio VHH de ocorrência natural ou o domínio VH, respectivamente, a seqüência aminoácida do desejado Nanocorpo humanizado ou camelizado da invenção, respectivamente, podem ser projetados e logo sintetizados de novo utilizando técnicas para síntese de peptídeo conhecidas por si. Também, baseado na seqüência aminoácida ou a seqüência de nucleotídeos de um domínio VHH de ocorrência natural ou o domínio VH, respectivamente, uma seqüência de nucleotídeos que codifica o desejado Nanocorpo humanizado ou camelizado da invenção, respectivamente, podem ser projetados e logo sintetizados de novo utilizando técnicas de síntese ácida nucléica conhecida por si, depois do qual a seqüência de nucleotídeos portanto obtida pode ser expressa em uma maneira conhecida por si para fornecer o Nanocorpo desejado da invenção.
Outros caminhos convenientes e técnicas para obter nanocorpos da invenção e/ou seqüências de nucleotídeos e/ou ácidos nucléicos que codificam o mesmo, que começa (da seqüência aminoácida de) domínios VH que ocorrem naturalmente ou preferivelmente os domínios de VHH e/ou de seqüências de nucleotídeos e/ou seqüências ácidas nucléicas que codificam o mesmo serão claros para a pessoa experimentada, e pode, por exemplo, compreendendo combinar uma ou várias seqüências aminoácidas e/ou seqüências de nucleotídeos de domínios VH que ocorrem naturalmente (como um ou vários FR'S e/ou CDR's) com uma ou várias uma ou várias seqüências aminoácidas e/ou seqüências de nucleotídeos de domínios VHH que ocorrem naturalmente (tal um ou vários FR'S ou CDR's), em uma maneira conveniente para fornecer (uma seqüência de nucleotídeos ou codificação de ácido nucléico) um Nanocorpo da invenção.
Segundo um aspecto preferencial, mas não-restritivo do aspecto da invenção, um Nanocorpo no seu sentido mais amplo pode ser geralmente definido como um polipeptídio compreendendo:
a) uma seqüência aminoácida que é compreendida de quatro regiões/seqüências de armação interrompidas por três regiões/seqüências que determinam complementaridade,
nas quais o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é Q;
e/ou:
b) uma seqüência aminoácida que é compreendida de quatro regiões/seqüências de armação interrompidas por três regiões/seqüências que determinam complementaridade, nas quais o resíduo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é E e no qual o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é um R;
e/ou:
c) uma seqüência aminoácida que é compreendida de quatro regiões/seqüências de armação interrompidas por três regiões/seqüências que determinam complementaridade, nas quais o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, R e S, e é especialmente escolhido do grupo composto de R e S.
Portanto, em um primeiro aspecto preferido, mas não- restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que
i) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é Q;
e/ou em que: ii) o resíduo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é E e no qual o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é um R; e/ou em que:
iii) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, R e S, e especialmente escolhido do grupo composto de Re S; e em que
iv) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
Especialmente, um Nanocorpo contra o TNF-alfa segundo a invenção pode ter a estrutura:
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que
i) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é Q;
e/ou em que:
ii) o resíduo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é E e no qual o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é um R;
e/ou em que:
iii) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, R e S, e especialmente escolhido do grupo composto de Re S; e em que iv) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
Especialmente, segundo um aspecto preferencial, mas não-restritivo do aspecto da invenção, um Nanocorpo pode ser geralmente definido como um polipeptidio que compreende uma seqüência aminoácida que é compreendida de quatro regiões/seqüências de armação interrompidas por três regiões/seqüências que determinam complementaridade, em que;
a-1) o resíduo aminoácido na posição 4 4 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de G, E, D, G, Q, R, S, L; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de G, E ou Q; e
a-2) o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de L, R ou C; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de L ou R; e a-3) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de W, R ou S; e é preferivelmente W ou R, e é mais preferivelmente W; a-4) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é Q; ou em que:
b-1) o resíduo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de E e Q; e b-2) o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é R; e
b-3) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de W, R e S; e é preferivelmente W;
b-4) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de Q e L; e é preferivelmente Q; ou em que:
c-1) o resíduo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de G, E, D, Q, R, S e L; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de G, Ee Q; e
c-2) o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de L, Re C; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de L e R; e
c-3) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, R e S; e é especialmente escolhido do grupo composto de R e S; e
c-4) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de Q e L; é preferivelmente Q.
Portanto, num outro aspecto preferido, mas não- restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação Ia 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que:
i) o resíduo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de G, E, D, G, Q, R, S, L; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de G, E ou Q;
e em que:
ii) o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de L, R ou C; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de L ou R;
e em que: iii) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de W, R ou S; e
é preferivelmente W ou R, e é mais preferivelmente W; e em que
iv) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é Q;
e em que:
ν) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
No outro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que:
i) o resíduo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de E e Q;
e em que:
ii) o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é R;
e em que:
iii) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de W, R e S; e é
preferivelmente W;
e em que:
iv) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é Q;
e em que: vi) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
No outro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que:
i) o resíduo aminoácido na posição 44 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de G, E, D, Q, R, S e L; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de G, Ee Q; e em que:
ii) o resíduo aminoácido na posição 45 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de L, Re C; e é preferivelmente escolhido do grupo composto de L e R; e em que:
iii) o resíduo aminoácido na posição 103 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de P, R e S; e é especialmente escolhido do grupo composto de Re S; e em que:
iv) o resíduo aminoácido na posição 108 segundo a numeração de Kabat é escolhido do grupo composto de Q e L; é preferivelmente Q;
e em que:
v) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
Dois grupos em particular preferidos, mas não- restritivos dos nanocorpos da invenção são aqueles segundo o
a) acima; segundo o I) a a-4) acima; segundo b) acima; segundo o b-1) a b-4) acima; segundo o c) acima; e/ou segundo o c-1) a c-4) acima, em que;
a) os resíduos aminoácidos nas posições 44-47 segundo a numeração de Kabat formam a seqüência GLEW (ou uma seqüência semelhante a GLEW conforme definido mais adiante) e o resíduo aminoácido na posição 108 é Q; ou em que:
b) os resíduos aminoácidos nas posições 43-4 6 segundo a numeração de Kabat formam a seqüência KERE ou KQRE (ou uma seqüência semelhante a KERE) e o resíduo aminoácido na posição 108 é Q ou L, e é preferivelmente Q. Portanto, num outro aspecto preferido, mas não- restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que:
i) os resíduos aminoácidos nas posições 44-47 segundo a numeração de Kabat formam a seqüência GLEW (ou uma seqüência semelhante a GLEW conforme definido mais adiante) e o resíduo aminoácido na posição 108 é Q; e em que :
ii) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima. No outro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que:
i) os resíduos aminoácidos nas posições 43-4 6 segundo a numeração de Kabat formam a seqüência KERE ou KQRE (ou uma seqüência semelhante a KERE) e o resíduo aminoácido na posição 108 é Q ou L, e é preferivelmente Q; e em que:
ii) O CDR1, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
Nos nanocorpos da invenção na qual os resíduos aminoácidos nas posições 43-46 segundo a numeração de Kabat formam a seqüência KERE ou KQRE, o resíduo aminoácido na posição 37 é o mais preferivelmente F. Nos nanocorpos da invenção na qual os resíduos aminoácidos nas posições 44-47 segundo a numeração de Kabat formam a seqüência GLEW, o resíduo aminoácido na posição 37 é escolhido do grupo composto de Υ, Η, I, V ou F, e é mais preferivelmente F.
Portanto, sem ser limitado a isto de qualquer modo, com base nos resíduos aminoácidos presentes nas posições acima mencionadas, os nanocorpos da invenção podem ser geralmente classificados com base nos três grupos seguintes:
a) O "GLEW-grupo": nanocorpos com a seqüência aminoácida GLEW nas posições 44-47 segundo a numeração de Kabat e Q na posição 108 segundo a numeração de Kabat. Conforme mais adiante descrito na presente, nanocorpos dentro deste grupo normalmente têm um V na posição 37, e podem ter um W, P, R ou S na posição 103, e preferivelmente ter um W na posição 103. 0 grupo GLEW também compreende algumas seqüências semelhantes a GLEW como as mencionadas na Tabela 2 mais adiante;
b) O "Grupo KERE": nanocorpos com a seqüência aminoácida KERE ou KQRE ou nas posições 43-4 6 segundo a numeração de Kabat e Q ou L na posição 108 segundo a numeração de Kabat. Conforme mais adiante descrito na presente, nanocorpos dentro deste grupo normalmente têm um F na posição 37, um L ou F na posição 47; e podem ter um W, P, R ou S na posição 103, e preferivelmente ter um W na posição 103;
cj Os "103 P, R, S-grupo": nanocorpos com um P R ou S na posição 103. Esses nanocorpos podem ter seqüência
aminoácida GLEW nas posições 44-47 da numeração de Kabat ou a seqüência aminoácida KERE ou KQRE nas posições 43-46 segundo a numeração de Kabat, o último mais preferivelmente em combinação com um F na posição 37 e um L ou um F na posição 47 (conforme definido para
o Grupo KERE) ; e podem ter Q ou L na posição 108 segundo a numeração de Kabat, e preferivelmente ter Q. Portanto, num outro aspecto preferido, mas não- restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ser um Nanocorpo que pertence ao GLEW-grupo (conforme definido na presente), e no qual CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
No outro aspecto preferido, mas não-restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ser um Nanocorpo que pertence ao Grupo KERE (conforme definido na presente), e no qual CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
Portanto, num outro aspecto preferido, mas não- restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ser um Nanocorpo que pertence ao 103 P, R, S-grupo (conforme definido na presente), e no qual CDR1, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
Também, mais geralmente e além dos resíduos 108Q, 43E/44R e 103P, R, S acima mencionados, os nanocorpos da invenção pode conter, em uma ou várias posições que, em um domínio VH convencional, formariam (parte de) a interface VH/VL, conteriam um ou vários resíduos aminoácidos que são mais altamente carregados do que os resíduos aminoácidos que ocorrem naturalmente na mesma posição(ões) no domínio VH ou VHH que ocorre naturalmente, e especialmente um ou vários resíduos aminoácidos carregados (como mencionado na Tabela 1) .
Tais substituições incluem, mas não são limitadas às seqüências Semelhantes a GLEW mencionadas na Tabela 2 mais adiante; bem como as substituições que são descritas na Solicitação Internacional WO 00/29004 para assim chamados "microcorpos", p. ex. um Q na posição 108 e KLEW nas posições 44-47.
Em algumas modalidades de execução dos nanocorpos da invenção, o resíduo aminoácido na posição 83 é escolhido do grupo composto de L, M, S, V e W; e é preferivelmente L.
Também, em algumas modalidades de execução dos nanocorpos da invenção, o resíduo aminoácido na posição 83 é escolhido do grupo composto de R, Κ, Ν, Ε, I e Q; e é mais preferivelmente K ou E (para nanocorpos correspondentes a domínios VHH que ocorrem naturalmente) ou R (para nanocorpos "humanizados", conforme descrito mais adiante). 0 resíduo aminoácido na posição 84 em algumas modalidades de execução é escolhido do grupo composto de P, A, R, S, D e V, e é mais preferivelmente P (para nanocorpos correspondentes a domínios VHH que ocorrem naturalmente) ou R (para nanocorpos "humanizados", conforme descrito mais adiante).
Além disso, em algumas modalidades de execução dos nanocorpos da invenção, o resíduo aminoácido na posição 104 é escolhido do grupo composto de G e D; e é mais preferivelmente G.
Coletivamente, os resíduos aminoácidos nas posições 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 e 108, cujos nanocorpos são acima mencionados, também serão mencionados na presente como "Resíduos de Hallmark". Os Resíduos de Hallmark e os resíduos aminoácidos nas posições correspondentes do domínio VH humano mais estreitamente relacionado, VH3, são resumidos na Tabela 2 .
Algumas combinações especialmente preferenciais desses Resíduos de Hallmark conforme ocorrem em domínios VHH que ocorrem naturalmente são mencionados na Tabela 3. Para comparação, os correspondentes resíduos aminoácidos do VH3 humano chamados DP-47 são indicados em itálico.
Tabela 2: Resíduos de Hallmark em nanocorpos
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Notas:
(1): Especialmente, mas não exclusivamente, em combinação com KERE (SEQ ID n. 437) ou KQRE (SEQ ID n. 438) nas posições 43-46.
(2) : Normalmente como GLEW (SEQ ID n. 439) nas posições 44- 47 .
(3) : Normalmente como KERE ou KQRE nas posições 43-46, p.
ex. como KEREL (SEQ ID n. 440), KEREF (SEQ ID n. 441), KQREL (SEQ ID n. 442), KQREF (SEQ ID n. 443) ou KEREG
(SEQ ID n. 444) nas posições 43-47. Alternativamente, também as seqüências como TERE (SEQ ID n. 445) (por exemplo, TEREL (SEQ ID n. 446)), KECE (SEQ ID n. 447) (por exemplo KECEL (SEQ ID n. 448) ou KECER (SEQ ID n. 449)), RERE (SEQ ID n. 450) (por exemplo REREG.(SEQ ID n. 451)), QERE (SEQ ID n. 452) (por exemplo QEREG (SEQ ID n. 453)), KGRE (SEQ ID n. 454) (por exemplo KGREG (SEQ ID n. 455)), KDRE (SEQ ID n. 456) (por exemplo KDREV (SEQ ID n. 457)) são possíveis. Algumas outras seqüências possíveis, mas menos preferenciais incluem por exemplo DECKL (SEQ ID n. 458) e NVCEL (SEQ ID n. 459) .
(4): Tanto com GLEW nas posições 44-47 como com KERE ou KQRE nas posições 43-46. (5) : Muitas vezes como KP ou EP nas posições 83-84 de domínios VHH que ocorrem naturalmente.
(6): Especialmente, mas não exclusivamente, em combinação com GLEW nas posições 44-47.
(7) : Com a condição de que quando as posições 44-47 são GLEW, a posição 108 seja sempre Q.
(8) : O grupo GLEW também contém seqüências semelhantes a
GLEW nas posições 44-47, como por exemplo GVEW (SEQ ID n. 460), EPEW (SEQ ID n. 461), GLER (SEQ ID n. 462), DQEW (SEQ ID n. 463), DLEW (SEQ ID n. 464), GIEW (SEQ ID n. 465), ELEW (SEQ ID η. 466), GPEW (SEQ ID n. 467), EWLP (SEQ ID η. 468), GPER (SEQ ID n. 469), GLER (SEQ ID n. 47 0) e ELEW.
Tabela 3: Algrimas combinações preferenciais de Resíduos de Hallmark em nanocorpos que ocorrem naturalmente.
Para a humanização dessas combinações, é feita referência à especificação.
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Nos nanocorpos, cada resíduo aminoácido em qualquer outra posição do que os Resíduos de Hallmark pode ser qualquer resíduo aminoácido que naturalmente ocorre na posição correspondente (segundo numeração de Kabat) de um domínio VHH de ocorrência natural.
Tais resíduos aminoácidos serão claros para a pessoa experimentada. As tabelas 4-7 mencionam alguns resíduos não-restritivos que podem estar presentes em cada posição (segundo numeração de Kabat) do FR1, FR2, FR3 e FR4 de domínios VHH que ocorrem naturalmente. Para cada posição, o resíduo aminoácido que mais freqüentemente ocorre em cada posição de um domínio VHH de ocorrência natural (e que é o resíduo aminoácido mais preferencial para a referida posição em um Nanocorpo) é indicada em negrito; e outros resíduos aminoácidos preferenciais para cada posição foram sublinhados (nota: o número de resíduos aminoácidos que são encontrados nas posições 26-30 de domínios VHH que ocorrem naturalmente apoia a hipótese que é a base da numeração Chothia (supra) de que os resíduos nessas posições já fazem parte de CDRl.)
Nas Tabelas 4-7, alguns resíduos não-restritivos que podem estar presentes em cada posição de um domínio VH3 humano também foram mencionados. Novamente, para cada posição, o resíduo aminoácido que mais freqüentemente ocorre em cada posição de um domínio VH3 humano que ocorre naturalmente é indicada em negrito; e outros resíduos aminoácidos preferenciais foram sublinhados.
Tabela 4: Exemplos não-restritivos dos resíduos aminoácidos em FRl (para as notas, ver as notas à Tabela 2)
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Tabela 4: Exemplos não-restritivos de resíduos aminoácidos em FRl (continua)
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Tabela 5: os exemplos não-restritivos dos resíduos aminoácidos em FR2 (paira as notas, ver as notas a Tabela 2)
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Tabela 6: Exemplos não-restritivos dos resíduos aminoácidos em FR3 (para as notas, ver as notas à Tabela 2)
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Tabela 6: Exemplos não-restritivos de resíduos amlnoácidos em FR3 (continua) Pos. Resíduo(s) Aminoácido(s):
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Tabela 7: Exemplos não-restrítivos dos resíduos aminoácidos em FR4 (para as notas, ver as notas à Tabela 2)
<table>table see original document page 156</column></row><table>
Portanto, num outro aspecto preferido, mas não restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que: i) os resíduos de Hallmark são conforme definidos acima; e em que:
ii) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima.
Num outro aspecto preferido, mas não restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que: e em que
i) O FRl é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[1]QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG [2 6] [SEQ ID n.
1]
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com a seqüência aminoácida acima; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou (2) a referida seqüência aminoácida
preferivelmente só contém substituições
aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que: (1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou (2) a referida seqüência aminoácida
preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e em que:
ii) O FR2 é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[36]WXRQAPGKXXEXVA [49] [SEQ ID n. 2]
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com a seqüência aminoácida acima; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e em que:
iii) O FR3 é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID n. 3]
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com a seqüência aminoácida acima; em que (1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e em que:
iv) 0 FR4 é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[103]XXQGTXVTVSS [113] [SEQ ID n. 4]
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com a seqüência aminoácida acima; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas;
e em que:
v) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima; no qual os Resíduos de Hallmark são indicados por "X" e como definidos mais acima e no qual os números entre colchetes se referem às posições aminoácidas segundo a numeração de Kabat.
Num outro aspecto preferido, mas não restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que:
e em que
i) 0 FRl é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [2 6] [SEQ ID n. 5]
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de
99% (conforme definido na presente) com a seqüência aminoácida acima; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência (s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) o resíduo de Hallmark na posição é como indicado na seqüência acima;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark
é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) o resíduo de Hallmark na posição é como indicado na seqüência acima;
e em que:
ii) O FR2 é escolhido do grupo composto das seqüências aminoácidas:
<table>table see original document page 163</column></row><table>
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, mais pref erivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e 47 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e 47 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
e em que: O FR3 é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID η. 12] ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com a seqüência aminoácida acima; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 83 e 84 são como indicados em cada uma das seqüências acima; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 83 e 84 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
e em que:
iv) O FR 4 é escolhido do grupo composto das seqüências aminoácidas:
[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID n. 13]
[103]WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID n. 14]
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e 108 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e 108 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
e em que:
v) 0 CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima. Num outro aspecto preferido, mas não restritivo, um Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que: e em que
i) O FRl é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida: [1]QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID n. 5]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s) " (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) o resíduo de Hallmark na posição é como indicado na seqüência acima;
e em que:
ii) O FR2 é escolhido do grupo composto das seqüências aminoácidas:
[36] WFRQAPGKERELVA [49]
[36] WFRQAPGKEREFVA [49]
[36] WFRQAPGKERE6A [49]
[36] WFRQAPGKQRELVA [49]
[36] WFRQA P GKQRE FVA [49]
[SEQ ID NO: 6]
[SEQ ID NO: 7]
[SEQ ID NO: 8]
[SEQ ID NO: 9]
[SEQ ID NO: 10]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e 47 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
em que:
O FR3 é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID n. 12]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 83 e 84 são como indicados em cada uma das seqüências acima; e em que:
iv) O FR4 é escolhido do grupo composto das seqüências aminoácidas:
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s) " (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 7; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e 108 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
e em que:
v) 0 CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima. Num outro aspecto preferido, mas não restritivo, um
Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
[103] WGíQGTQVTVSS [113] [103] WGQGTLVTVSS [113]
[SEQ ID NO: 13] [SEQ ID NO: 14]
FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 no qual FRl a FR4 se referem a regiões de armação Ia 4, respectivamente, e no qual CDRl a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que: e em que
i) O FRl é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências
aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) o resíduo de Hallmark na posição é como indicado na seqüência acima;
e em que:
ii) O FR2 é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[36] WYRQAPGKGLEWA [49] [SEQ ID NO: 11]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e 47 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
em que:
O FR3 é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e (3) os resíduos de Hallmark nas posições 83 e 84 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
em que:
iv) O FR4 é escolhido do grupo composto da seqüência aminoácida:
[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 7; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e 108 são como indicados em cada uma das seqüências acima;
em que:
v) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima. Algumas outras seqüências de armação que podem estar presentes nos nanocorpos da invenção podem ser encontradas na patente européia EP 656946 acima mencionada (ver, por exemplo, também o equivalente US 5,759,808 outorgado).
Num outro aspecto preferido, mas não restritivo, um
Nanocorpo da invenção pode ter a estrutura
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
no qual FR1 a FR4 se referem a regiões de armação 1 a 4, respectivamente, e no qual CDR1 a CDR3 se referem à regiões que determinam complementaridade 1 a 3, respectivamente, e em que: e em que
i) O FR1 é escolhido do grupo composto de seqüências FR1 presentes nos nanocorpos de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, e especialmente nos nanocorpos humanizados de SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99,
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das
referidas seqüências FR1; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na
presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme
definido na Tabela 4; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação
com a referida seqüência FR1; e
(3) o resíduo de Hallmark na posição é como indicado na referida seqüência FR1; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das referidas seqüências FR1, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 4; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a referida seqüência FRl; e
(3) o resíduo de Hallmark na posição é como indicado na referida seqüência FRl;
e em que:
ii) 0 FR2 é escolhido do grupo composto das seqüências FR2 presentes nos nanocorpos de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, e especialmente nos nanocorpos humanizados de SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das referidas seqüências FR2; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou (2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a referida seqüência FR2; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e 47 são como indicados na referida seqüência FR2; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das referidas seqüências
FR2, em que :
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 5; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a referida seqüência FR2; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 37, 44, 45 e 47 são como indicados na referida seqüência FR2; e em que:
iii) 0 FR3 é escolhido do grupo composto das seqüências FR3 presentes nos nanocorpos de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID
NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, e especialmente nos nanocorpos humanizados de SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99,
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais
preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das referidas seqüências FR3; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou (2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente
só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a referida seqüência FR3; e (3) os resíduos de Hallmark nas posições 83 e 84 são como indicados na referida seqüência FR3; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das referidas seqüências FR3, em que :
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a referida seqüência FR3; e (3) os resíduos de Hallmark nas posições 83 e 84 são como indicados na referida seqüência FR3; e em que:
iv) 0 FR4 é escolhido do grupo composto das seqüências FR4 presentes nos nanocorpos de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID
NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, e especialmente nos nanocorpos humanizados de SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99,
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das referidas seqüências FR4; em que
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a referida seqüência FR4; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e 108 são como indicados na referida seqüência FR3;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das referidas seqüências FR4, em que :
(1) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida conforme definido na Tabela 6; e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a referida seqüência FR4; e
(3) os resíduos de Hallmark nas posições 103, 104 e 108 são como indicados na referida seqüência FR4;
e em que:
ν) O CDRl, CDR2 e CDR3 são conforme definidos acima, e preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições preferenciais acima, e mais preferivelmente conforme definidos segundo uma das definições mais preferenciais acima. Alguns nanocorpos particularmente preferidos da invenção podem ser escolhidos do grupo composto das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, e especialmente nos nanocorpos humanizados de SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99 ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, pref erivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99; em que
(1) os resíduos de Hallmark podem ser como indicados na Tabela 2 acima;
(2) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida como definido em Tabelas 4-7; e/ou
(3) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as seqüência(s) aminoácida(s) acima mencionadas.
Alguns nanocorpos até mais particularmente preferidos da invenção podem ser escolhidos do grupo composto das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, e especialmente nos nanocorpos humanizados de SEQ ID NO's 7 6 a 8 6 ou SEQ ID NO's 95 a 99 ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99; em que
(1) os resíduos de Hallmark são como indicados na seqüência pertinente escolhida de SEQ ID NO' s 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99;
(2) qualquer substituição aminoácida em qualquer outra posição que não seja uma posição de Hallmark é preferivelmente qualquer uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente) e/ou uma substituição aminoácida como definido em Tabelas 4-7; e/ou
(3) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com a seqüência pertinente escolhida de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99.
Alguns nanocorpos mais preferenciais da invenção podem ser escolhidos do grupo composto das seqüências aminoácidas de SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, e especialmente dos nanocorpos humanizados de SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99.
Como ficará claro do acima mencionado, o termo nanocorpos da invenção como usado na presente no seu sentido mais amplo também compreende mutantes naturais ou sintéticos, variantes, alelos, análogos e ortólogos (a seguir tratados coletivamente como "análogos") dos nanocorpos mencionado no SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 7 6 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99.
Geralmente, tais análogos, por exemplo, podem compreender seqüências homólogas, porções funcionais, ou uma porção funcional de uma seqüência homóloga (conforme posteriormente definido mais adiante) de um Nanocorpo. Geralmente, em tais análogos, cada resíduo aminoácido (outro que não o Resíduo de Hallmark) em cada uma das regiões de armação pode ser substituído por qualquer outro resíduo aminoácido, contanto que o grau total da identidade de seqüência das regiões de armação permaneça conforme definido acima. Preferivelmente, contudo, em tais análogos: um ou resíduos aminoácidos nas acima mencionadas seqüências de armação são substituídos por um ou vários resíduos aminoácidos que ocorrem naturalmente na mesma posição em um domínio VHH que ocorre naturalmente. Alguns exemplos de tais substituições são mencionados em Tabelas 4-7 acima; e/ou:
- um ou resíduos aminoácidos nas acima mencionadas seqüências de armação são substituídos por um ou vários resíduos aminoácidos que podem ser considerados uma substituição aminoácida "conservadora", conforme descrito mais acima;
e/ou:
- um ou resíduos aminoácidos nas acima mencionadas seqüências de armação são substituídos por um ou vários resíduos aminoácidos que ocorrem naturalmente na mesma posição em um domínio VH que ocorre naturalmente de um ser humano. Isto é, geralmente tratado como "humanização" de VHH/Nanocorpo que ocorre naturalmente em geral e da referida posição em particular, e será discutido mais detalhadamente a seguir; e:
- posições para as quais só um resíduo aminoácido é mencionado tanto para domínio VH como para o domínio VHH nas Tabelas 4-7 acima não são preferivelmente substituídas.
Também, embora geralmente menos preferencial, em tais análogos, iam ou vários resíduos aminoácidos podem ser eliminados das regiões de armação e/ou inseridos nas regiões de armação (opcionalmente além de uma ou várias substituições aminoácidas conforme acima mencionado), contanto que o grau total da identidade de seqüência das regiões de armação permaneça conforme definido acima. Os resíduos de Hallmark não devem ser eliminados. Também, mais preferivelmente, resíduos aminoácidos para os quais só um resíduo aminoácido é mencionado tanto para o domínio VH como para o domínio VHH nas Tabelas 4-7 acima não são preferivelmente eliminados.
Preferivelmente, tais análogos devem ser tais que eles ainda podem ligar a, ter afinidade para e/ou ter especificidade paro TNF-alfa, isto é, com uma afinidade e/ou uma especificidade que é pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mesmo mais preferivelmente pelo menos 80%, como pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou mais, da afinidade e/ou a especificidade de pelo menos um dos nanocorpos de SEQ ID No's SEQ ID NO's 52 a 60, SEQ ID NO's 76 a 86 ou SEQ ID NO's 95 a 99, conforme determinado utilizando um ensaio conveniente, por exemplo, um ensaio para determinar a ligação do análogo a TNF, e em particular um dos ensaios conforme usados nos Exemplos apresentados posteriormente.
Geralmente, tais análogos, por exemplo, podem ser obtidos fornecendo um ácido nucléico que codifica um domínio VHH de ocorrência natural, modificando os codons para um ou vários resíduos aminoácidos que devem ser humanizados nos codons para o(s) resíduo(s) aminoácido(s) humano(s) correspondente(s), expressando a seqüência ácida/nucleotídea nucléica portanto obtida em um hospedeiro ou sistema de expressão conveniente; e opcionalmente isolação e/ou purificação do análogo portanto obtido para prover o referido análogo na forma essencialmente isolada (conforme definido acima). Isto pode ser geralmente executado usando métodos e técnicas conhecidas por si, o que ficará claro para a pessoa experimentada, por exemplo, dos manuais e referências citadas na presente e/ou da nova descrição a seguir. Alternativamente, e por exemplo, um ácido nucléico que codifica um análogo pode ser sintetizado em uma maneira conhecida por si (por exemplo usando um aparelho automatizado que sintetiza seqüências ácidas nucléicas com uma seqüência aminoácida predestinada) e pode ser expresso em um hospedeiro ou sistema de expressão conveniente, sobre o qual ο análogo portanto obtido pode ser opcionalmente isolado e/ou purificado para prover os referidos análogos na forma essencialmente isolada (conforme definido acima). Outro modo de fornecer os análogos implica a síntese química da seqüência aminoácida pertinente que usa técnicas para síntese de peptídeo conhecida por si, como as mencionadas a seguir.
Será também geralmente ser claro para a pessoa experimentada que nanocorpos (inclusive análogos dos mesmos) também podem ser preparados começando de seqüências VH humanas (isto é, seqüências aminoácidas ou as seqüências de nucleotídeos correspondentes), como seqüências VH3, por exemplo, humanas como DP-47, DP-51, DP-54 ou DP-29, modificando um ou vários resíduos aminoácidos na seqüência aminoácida do referido domínio VH humano, para fornecer uma seqüência aminoácida que tem a um Q na posição 108; e/ou (b) E na posição 44 e/ou R na posição 45, e preferivelmente E na posição 44 e R na posição 45; e/ou (c) P, R ou S na posição 103, conforme descrito acima. Novamente, isto pode ser geralmente executado usando vários métodos e técnicas mencionadas no parágrafo prévio, usando uma seqüência aminoácida e/ou seqüência de nucleotídeos para um domínio VH humano como um ponto de partida.
O termo nanocorpos conforme usado na presente no seu sentido mais amplo também compreende partes ou fragmentos dos nanocorpos (inclusive análogos) da invenção conforme definida acima, que pode ser novamente conforme adicionalmente descrito mais adiante.
Geralmente, as partes ou os fragmentos dos nanocorpos e/ou análogos têm seqüências aminoácidas nas quais, em comparação com a seqüência aminoácida do Nanocorpo ou análogo de comprimento completo correspondente, um ou vários dos resíduos aminoácidos no fim do N-terminal, um ou vários resíduos aminoácidos no fim do C-terminal, um ou vários resíduos aminoácidos internos contíguos, ou qualquer combinação dos mesmos, foram eliminados e/ou retirados. É também possível combinar uma ou várias de tais partes ou fragmentos para fornecer um Nanocorpo da invenção.
Preferivelmente, a seqüência aminoácida de um Nanocorpo que compreende uma ou várias partes ou fragmentos de um Nanocorpo e/ou análogo de comprimento completo deve ter um grau de identidade de seqüência de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, como pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%, com a seqüência aminoácida do correspondente Nanocorpo de comprimento completo.
Também, a seqüência aminoácida de um Nanocorpo que compreende uma ou várias partes ou fragmentos de um Nanocorpo e/ou análogo de comprimento completo é preferivelmente tal que compreende pelo menos 10 resíduos aminoácidos contíguos, preferivelmente pelo menos 2 0 resíduos aminoácidos contíguos, mais preferivelmente pelo menos 30 resíduos aminoácidos contíguos, como pelo menos 40 resíduos aminoácidos contíguos, da seqüência aminoácida do correspondente Nanocorpo de comprimento completo.
Geralmente, tais partes ou fragmentos dos nanocorpos da invenção terão seqüências aminoácidas nas quais, em comparação com a seqüência aminoácida do correspondente Nanocorpo de comprimento completo da invenção, um ou vários dos resíduos aminoácidos no fim do N-terminal, um ou vários resíduos aminoácidos no fim do C-terminal, um ou vários resíduos aminoácidos internos contíguos, ou qualquer combinação dos mesmos, foram eliminados e/ou retirados. É também possível combinar uma ou várias de tais partes ou fragmentos para fornecer um Nanocorpo da invenção.
Segundo uma modalidade de execução preferencial, um fragmento conforme usado na presente compreende pelo menos iam dos CDR' s presentes em um Nanocorpo de tamanho natural da invenção, preferivelmente pelo menos dois dos CDR's presentes em um Nanocorpo de tamanho natural da invenção, mais preferivelmente pelo menos CDR2 e CDR3 presentes em um Nanocorpo de tamanho natural da invenção, tais como, por exemplo, o três CDR's presentes em um Nanocorpo de tamanho natural da invenção.
Segundo outra modalidade de execução em particular preferida, mas não-restritiva, tal parte ou o fragmento compreendem pelo menos FR3, CDR3 e FR4 do correspondente Nanocorpo de comprimento completo da invenção, isto é, como, por exemplo, descrito na solicitação internacional WO 03/050531 (Lasters et al.).
Preferivelmente, tais partes ou fragmentos devem ser tais que eles ainda podem ligar a, ter afinidade para e/ou ter especificidade paro TNF-alfa, isto é, com uma afinidade e/ou uma especificidade que é pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mesmo mais preferivelmente pelo menos 80%, como pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou mais, da afinidade e/ou a especificidade do Nanocorpo de tamanho natural correspondente da invenção, por exemplo, um ensaio para determinar a ligação do análogo a TNF, e em particular um dos ensaios conforme usados nos Exemplos apresentados posteriormente.
Da descrição mais acima, ficará claro que as seqüências aminoácidas dos nanocorpos usados na presente se diferenciam em pelo menos uma posição aminoácida em pelo menos uma das regiões de armação das seqüências aminoácidas de domínios VH que ocorrem naturalmente, como as seqüências aminoácidas de domínios VH que ocorrem naturalmente de anticorpos de seres humanos. Especialmente, ficará claro que as seqüências aminoácidas dos nanocorpos usados na presente se diferenciam em pelo menos um dos Resíduos de Hallmark de seqüências aminoácidas de domínios VH que ocorrem naturalmente, como as seqüências aminoácidas de domínios VH que ocorrem naturalmente de anticorpos de Camelídeos e/ou seres humanos.
Portanto, segundo uma modalidade de execução específica, um Nanocorpo da invenção tem uma seqüência aminoácida que se diferencia em pelo menos uma posição aminoácida em uma das regiões de armação da seqüência aminoácida de um domínio VH que ocorre naturalmente. Segundo uma modalidade de execução mais específica, mas não- restritiva da invenção, um Nanocorpo da invenção tem uma seqüência aminoácida que se diferencia em pelo menos um dos resíduos de Hallmark da seqüência aminoácida de um domínio VH que ocorre naturalmente.
Da descrição mais acima, também ficará claro que as seqüências aminoácidas de alguns nanocorpos da invenção, como os nanocorpos humanizados da invenção, se diferenciarão em pelo menos uma posição aminoácida em pelo menos uma das regiões de armação (isto é, na posição de um resíduo de Hallmark ou em outra posição) das seqüências aminoácidas de domínios VHH que ocorrem naturalmente. Portanto, segundo uma modalidade de execução específica, mas não-restritiva, um Nanocorpo da invenção tem uma seqüência aminoácida que se diferencia em pelo menos uma posição aminoácida em uma das regiões de armação da seqüência aminoácida de um domínio VHH de ocorrência natural. Segundo uma modalidade de execução mais específica, mas não-restritiva da invenção, um Nanocorpo da invenção tem uma seqüência aminoácida que se diferencia em pelo menos um dos resíduos de Hallmark da seqüência aminoácida de um domínio VHH de ocorrência natural.
A invenção no seu sentido mais amplo também compreende derivados dos nanocorpos da invenção. Tais derivados podem ser geralmente obtidos pela modificação, e especialmente por modificação química e/ou biológica (por exemplo enzimática), dos nanocorpos da invenção e/ou de um ou vários dos resíduos aminoácidos que formam os nanocorpos da invenção.
Exemplos de tais modificações, bem como os exemplos dos resíduos aminoácidos dentro da seqüência do Nanocorpo que pode ser modificada em tal maneira (isto é, na espinha dorsal da proteína mas preferivelmente em uma cadeia lateral), métodos e técnicas que podem ser usadas para introduzir tais modificações e usos e vantagens potenciais de tais modificações serão claros para a pessoa experimentada.
Por exemplo, tal modificação pode implicar a introdução (p. ex. por enlace covalente ou em outra maneira conveniente) de um ou vários grupos funcionais, resíduos ou metades em ou para o Nanocorpo da invenção, e especialmente de um ou vários grupos funcionais, resíduos ou metades que conferem uma ou várias propriedades ou funcionalidades desejadas ao Nanocorpo da invenção. O exemplo de tais grupos funcionais ficará claro para a pessoa experimentada.
Por exemplo, tal modificação pode compreender a introdução (p. ex. por ligação covalente ou em qualquer outra maneira conveniente) de um ou vários grupos funcionais que aumentam a meia-vida, a solubilidade e/ou a absorção dos Nanocorpo da invenção, que reduzem a imunogenicidade e/ou a toxicidade dos Nanocorpo da invenção, que eliminam ou atenuam qualquer efeito colateral indesejável do Nanocorpo da invenção, e/ou que confere outras propriedades vantajosas e/ou reduz as propriedades indesejadas dos nanocorpos e/ou os polipeptídios da invenção; ou qualquer combinação de dois ou mais do precedente. Exemplos de tais grupos funcionais e de técnicas para introduzi-los serão claros para a pessoa experimentada, e podem compreender geralmente todos os grupos funcionais e técnicas mencionadas na técnica de fundo geral citada mais acima bem como os grupos funcionais e técnicas conhecidas por si para a modificação da proteína farmacêutica, e especialmente para a modificação de anticorpos ou fragmentos de anticorpo (inclusive ScFv e anticorpos de domínio únicos), para o qual referência, por exemplo, é feita a Remington's Pharmaceutical Science, 16o ed., Mack Publishing Co, Easton, PA (1980). Tais grupos funcionais, por exemplo, podem ser ligados diretamente (por exemplo covalentemente) a um Nanocorpo da invenção, ou opcionalmente através de um linker ou espaçador conveniente, conforme ficará novamente claro para a pessoa experimentada.
Uma das técnicas mais largamente usadas que para aumentar a meia-vida e/ou a reduzir a imunogenicidade da proteína farmacêutica compreende a adição de um polímero conveniente farmacologicamente aceitável, como poli (etileneglicol) (PEG) ou derivados disso (como metoxipoli (etileneglicol) ou mPEG). Geralmente, qualquer forma conveniente de pegilação pode ser usada, como a pegilação usada na técnica para anticorpos e fragmentos de anticorpo (inclusive mas não limitado a anticorpos de domínio (únicos) e ScFv); é feita referência a, por exemplo, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); por Veronese e Harris, Adv. Drug Deliv. Chapman 54, 453-456 (2003), por Harris e Chess, Nat. Chapman Drug. Discov., 2, (2003) e em WO 04/060965. Vários reagentes para pegilação da proteína estão também comercialmente disponíveis, por exemplo, da Terapêutica Nektar Therapeutics, os EUA.
Preferivelmente, é usada pegilação direcionada a local, especialmente via um cisteina-resíduo (ver, por exemplo, Yang et al., Protein Engeneering, 16, 10, 761-770 (2003). Por exemplo, com esta finalidade, o PEG pode ser ligado a um resíduo cisteina que naturalmente ocorre em um Nanocorpo da invenção, um Nanocorpo da invenção pode ser modificado para introduzir apropriadamente um ou vários resíduos cisteina para o anexo do PEG, ou uma seqüência aminoácida que compreende um ou vários resíduos cisteina para o anexo do PEG pode ser fundido ao N-e/ou o C-termo de um Nanocorpo da invenção, todas as técnicas de utilização da Protein Engeneering conhecidas por si à pessoa experimentada.
Preferivelmente, para os nanocorpos e a proteína da invenção, um PEG é usado com um peso molecular de mais de 5000, como mais de 10, 000 e menos de 200, 000, como menos de 100,000;, por exemplo, na variedade de 20,000-80,000.
Quanto a pegilação, deve ser observado que geralmente, a invenção também abrange qualquer Nanocorpo da invenção e/ou o polipeptídio da invenção que foi pegilado em uma ou várias posições aminoácidas, preferivelmente de tal modo que qualquer pegilação preferida (1) aumenta a meia-vida in vivo; (2) reduz imunogenicidade; (3) fornece uma ou várias novas propriedades benéficas conhecidas por si para pegilação; (4) não afeta essencialmente a afinidade do Nanocorpo e/ou polipeptidio paro TNF-alfa (p. ex. não reduz a referida afinidade em mais de 90%, preferivelmente não em mais de 50%, e mais preferivelmente não em mais de 10%, como determinado por um ensaio conveniente, como os descritos nos Exemplos mais adiante); e/ou (4) não afeta nenhuma das outras propriedades desejadas dos nanocorpos e/ou polipeptidios da invenção. Os grupos PEG e os métodos convenientes para ligá-los, especificamente ou não- especificamente, serão claros para a pessoa experimentada. Os conjuntos convenientes e os reagentes para tal pegilação, por exemplo, podem ser obtidos de Nektar (CA, EUA).
O outro, a modificação normalmente menos preferencial compreende N-Iigada ou 0-ligada glicosilação, normalmente como a parte da modificação co-de translação e/ou pós- translação, dependendo da célula hospedeira usada para expressar o Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção.
Ainda outra modificação pode compreender a introdução de uma ou várias etiquetas detectáveis ou outros grupos que geram sinal ou metades, dependendo do uso desejado do Nanocorpo etiquetado. Etiquetas convenientes e as técnicas para ligar, usar e descobri-las serão claras à pessoa experimentada, e, por exemplo, incluirão, mas não são limitadas a, etiquetas fluorescentes (como fluoresceina, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehido, e fluorescamina e metais fluorescentes como 152Eu ou outros metais da série lantanideos), etiquetas fosforescentes, etiquetas quimioluminiscentes ou etiquetas bioluminescentes (como luminal, isoluminol, acridinium ester teromático, imidazole, acridinium sais, oxalato ester, dioxetano ou GFP e os seus análogos), isótopos radiativos (como 3H, 1251, 32P, 35, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 58Co, 59Fe, e 75Se), metais, metais quelatos ou cations metálicos (cations, por exemplo, metálicos como 99mTc, 1231, lllln, 1311, 97Ru, 67Cu, 67Ga, e 68Ga ou outros metais ou cations metálicos que são em particular adequados para uso em in vivo, in vitro ou em diagnóstico situ e visualização, como (157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, e 56Fe), bem como cromóforos e enzimas (como malato dehidrogenase, staphylococcal nuclease, delta-V-steroid isomerase, álcool de levedura dehidrogenase, alfa- glicerofosfato dehidrogenase, triose fosfato isomerase, biotinavidin peroxidase, rábano-sivestre peroxidase, fosfatase alcalino, asparaginase, glicose oxidase, β- galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-VI- fosfato dehidrogenase, glucoamilase e acetilcolina esterase). Outras etiquetas convenientes serão claras à pessoa experimentada, e, por exemplo, incluirão metades que podem ser descobertas usando NMR ou espectroscopia ESR.
Tais nanocorpos etiquetados e os polipeptidios da invenção, por exemplo, podem ser usado para ensaios em vitro, in vivo ou em situ (inclusive imunoensaios conhecidos por si como ELISA, RIA, EIA e outros "ensaios de sandwitch", etc.) bem como diagnóstico in vivo e objetivos de visualização, dependendo da escolha da etiqueta especifica.
Como estará claro para a pessoa experimentada, outra modificação pode implicar a introdução de um grupo quelato, por exemplo, quelar um dos metais ou cations metálicos mencionados anteriormente. Os grupos quelato convenientes, por exemplo, incluem, sem restrição, dietil- enetriaminepentaacético ácido (DTPA) ou ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA).
Ainda outra modificação pode compreender a introdução de um grupo funcional que é uma parte de um par de ligação especifico, como o par de ligação biotina-(strept) avidin. Tal grupo funcional pode ser usado para ligar o Nanocorpo da invenção a outra proteína, polipeptídio ou composto químico que é ligado a outra metade do par de ligação, isto é, através da formação do par de ligação. Por exemplo, um Nanocorpo da invenção pode ser conjugado a biotina, e ligado a outra proteína, polipeptídio, composto ou transportadora conjugada a avidin ou streptavidin. Por exemplo, tal Nanocorpo conjugado pode ser usado como um repórter, por exemplo, em um sistema diagnóstico onde um agente detectável que produz sinal é ligado a avidin ou streptavidin. Tais pares de ligação, por exemplo, também podem ser usados para ligar o Nanocorpo da invenção a um transportador, inclusive transportadores convenientes para fins farmacêuticos. Um exemplo não-restritivo são as formulações liposomais descritas por Cao e Suresh, Jornal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000) . Tais pares de ligação também podem ser usados para ligar iam agente terapeuticamente ativo ao Nanocorpo da invenção.
Para algumas aplicações, especialmente para aquelas aplicações destinadas a matar uma célula que expressa o objetivo contra o qual os nanocorpos da invenção são dirigidos (p. ex. no tratamento do câncer), ou reduzir ou diminuir a velocidade do crescimento e/ou a proliferação tal célula, os nanocorpos da invenção também podem ser ligados a uma toxina ou a um resíduo tóxico ou metade. Os exemplos de metades tóxicas, compostos ou resíduos que podem ser ligados a um Nanocorpo da invenção para prover -, por exemplo, - um composto citotóxico serão claros para a pessoa experimentada e, por exemplo, podem ser encontrados na técnica prévia citada anteriormente e/ou na nova descrição na presente. Um exemplo é a assim chamada tecnologia ADEPT ™ WO 03/055527.
Outro produto químico potencial e as modificações enzimáticas serão claros para a pessoa experimentada. Tais modificações também podem ser introduzidas para objetivos de pesquisa (p. ex. para estudar relações de atividade de função). A referência, por exemplo, é feita a Lundblad e Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997).
Conforme acima mencionado, a invenção também se refere a proteína ou polipeptídios que compreendem pelo menos um domínio VHH (isto é, como identificado utilizando os métodos da invenção) ou pelo menos um nanocorpo baseado nisso.
Segundo uma modalidade de execução não-restritiva da invenção, tal polipeptidio da invenção essencialmente compõe-se de um Nanocorpo. Por "essencialmente compõem-se" de quer dizer que a seqüência aminoácida do polipeptidio da invenção é exatamente a mesma que a seqüência aminoácida de um Nanocorpo (como acima mencionado) ou corresponde à seqüência aminoácida de um Nanocorpo no qual um número limitado de resíduos aminoácidos, como 1-10 resíduos aminoácidos e preferivelmente 1-6 resíduos aminoácidos, como 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 resíduos aminoácidos, foram acrescentados ao fim terminal amino, ao fim terminal carboxi, ou ao fim terminal amino e ao fim terminal carboxi da seqüência aminoácida do Nanocorpo.
Ditos resíduos aminoácidos podem ou não modificar-se, alterar-se ou de outra maneira influir nas propriedades (biológicas) do Nanocorpo e podem ou não acrescentar a nova funcionalidade ao Nanocorpo. Por exemplo, tais resíduos aminoácidos:
a) pode compreender um Resíduo N-terminal Met, por exemplo, como o resultado da expressão em uma célula hospedeira heteróloga ou organismo hospedeiro.
b) pode formar uma seqüência de sinal ou a seqüência líder que dirige a secreção do Nanocorpo de uma célula hospedeira sobre a síntese. Os peptídeos líder secretores convenientes serão claros para a pessoa experimentada, e podem ser conforme mais adiante descritos na presente. Normalmente, tal seqüência líder será ligada à N-término do Nanocorpo, embora a invenção no seu sentido mais amplo não seja limitada a isso;
c) pode formar uma seqüência ou o sinal que permite que o Nanocorpo seja dirigido em direção a e/ou penetre ou entre em órgãos específicos, tecidos, células, ou partes ou compartimentos de células, e/ou que permite que o Nanocorpo penetre ou cruze uma barreira biológica como uma membrana de célula, uma camada de célula como uma camada de células epiteliais, um tumor inclusive tumores sólidos, ou a barreira cerebral de sangue. Os exemplos de tais seqüências aminoácidas serão claros para a pessoa experimentada. Alguns exemplos não-restritivos são os pequenos vetores de peptideo ("vetores de Pep- trans") descrito em WO 03/026700 e em Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani e Vidal, Drogue Discov. Hoje, 9, 1012 (004) e Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001), e a seqüência translocadora de membrana descrita por Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003). Seqüências aminoácidas de C-terminal e N-terminal para apontamento intracelular de fragmentos de anticorpo, por exemplo, são descritos por Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004). Outras técnicas convenientes para apontamento intracelular implicam a expressão e/ou o uso de assim chamados "intracorpos" que compreendem um Nanocorpo da invenção, como mencionado mais adiante;
d) pode formar "uma etiqueta", por exemplo uma seqüência ou resíduo aminoácido que permite ou facilita a purificação do Nanobody, por exemplo usando técnicas de afinidade dirigidas contra a referida seqüência ou resíduo. Depois disso, a referida seqüência ou resíduo podem ser retirados (p. ex. por produto químico ou rachadura enzimática) para fornecer a seqüência do Nanobody (com esta finalidade, a etiqueta pode ser opcionalmente ligada à seqüência do Nanobody através de uma seqüência de linker separável ou conter um motivo separável). Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos de tais resíduos são resíduos de histidina múltiplos, resíduos de glutatione e uma myc-etiqueta tal como AAAEQKLISEEDLNGAA [SEQ ID NO:476];
e) pode ser um ou vários resíduos aminoácidos que foram funcionalizados e/ou que podem servir como um local para a ligação de grupos funcionais. Resíduos aminoácidos e grupos funcionais convenientes serão claros para a pessoa experimentada e incluirão, mas não são limitados a, resíduos aminoácidos e grupos funcionais mencionados na presente para os derivados dos Nanobodies da invenção.
Segundo outra modalidade de execução, um polipeptidio da invenção compreende um Nanobody da invenção, que é fundido na sua extremidade terminal amino, na sua extremidade terminal carboxi, ou tanto na sua extremidade terminal amino quanto na sua extremidade terminal carboxi a pelo menos uma nova seqüência aminoácida, isto é, de modo a fornecer uma proteína de fusão que compreende o referido Nanobody da invenção e uma ou mais seqüências amino ácidas adicionais. Tal fusão também será chamada na presente como uma "fusão de Nanobody".
A uma ou mais seqüências aminoácidas podem ser qualquer seqüência aminoácida conveniente e/ou desejada. As novas seqüências aminoácidas podem ou não modificar, alterar ou de outra maneira influir nas propriedades (biológicas) do Nanobody, e podem ou não acrescentar uma nova funcionalidade ao Nanobody ou polipeptidio da invenção. Preferivelmente, a nova seqüência aminoácida é tal que ela confere uma ou várias propriedades ou funcionalidades desejadas ao Nanobody ou ao polipeptidio da invenção.
Um exemplo de tais seqüências aminoácidas será claro para a pessoa experimentada, e pode compreender geralmente todas as seqüências aminoácidas que são usadas em fusões de peptídeos baseadas em anticorpos convencionais e fragmentos dos mesmos (inclusive, mas não limitado a, anticorpos de domínio de ScFv e simples). Referência por exemplo é feita à revisão por Holliger e Hudson, Nature Biotecnology, 23, 9, 1126-1136 (2005),
Por exemplo, uma seqüência aminoácida tal pode ser uma seqüência aminoácida que aumenta a meia-vida, a solubilidade ou a absorção, reduz a imunogenicidade ou a toxicidade, elimina ou atenua efeitos colaterais indesejáveis, e/ou confere outras vantagens a e/ou reduz as propriedades indesejadas dos polipeptídios da invenção, em comparação com Nanocorpo da invenção por si. Alguns exemplos não- restritivos de tais seqüências aminoácidas são a proteina de soro, como albumina de soro humana (ver, por exemplo, WO 00/27435) ou moléculas haptênicas (por exemplo haptenos que são reconhecidos por anticorpos circulantes, ver, por exemplo, WO 98/22141).
A nova seqüência aminoácida também pode fornecer um segundo local de ligação, cujo local de ligação pode ser dirigido contra qualquer proteina desejada, polipeptidio, antigeno, antigênico determinante ou epitope (mas não limitada à mesma proteina, polipeptidio, antigeno, antigênico determinante ou epitope contra o qual o Nanocorpo da invenção é dirigido, ou uma proteina diferente, polipeptidio, antigeno, antigênico determinante ou epitope). Por exemplo, a nova seqüência aminoácida pode fornecer um segundo local de ligação que é dirigido contra uma proteina de soro (como, por exemplo, albumina de soro humana ou outra proteina de soro como IgG), para fornecer meia-vida aumentada no soro. A referência, por exemplo, é feita a EP 0 368684, WO 91/01743, WO 01/45746 e WO 04/003019 (no qual várias proteínas de soro é mencionadas) , a solicitação internacional pelo solicitante intitulada "nanocorpos™ contra amyloid-beta e polipeptídios que compreendem o mesmo para o tratamento de doenças neurais degenerativas como a doença de Alzheimer" (no qual várias outras proteínas são mencionadas), bem como a Harmsen et al., Vacine, 23 (41); 4926-42.
Segundo outra modalidade de execução, uma ou várias seqüências aminoácidas adicionais podem compreender uma ou várias partes, fragmentos ou domínios de anticorpos de 4 cadeias convencionais (e em determinados anticorpos humanos) e/ou de anticorpos de cadeia pesadas. Por exemplo, embora normalmente menos preferencial, o Nanocorpo da invenção possa ser ligado a um domínio convencional (preferivelmente humano) VH ou VL ou a um domínio análogo natural ou sintético VH ou VL, novamente opcionalmente via uma seqüência de linker (inclusive, mas não limitado a, outros (únicos) anticorpos de domínio, como os dAb's descritos por Ward et al.) .
Pelo menos um nanocorpo também pode ser ligado a um ou vários domínios CHI, CH2 e/ou CH3 (preferivelmente humanos), opcionalmente via uma seqüência de linker. Por exemplo, Nanocorpo ligado a um domínio CHl conveniente, por exemplo, pode ser usado - em conjunto com cadeias leves convenientes - para gerar fragmentos/estruturas de anticorpo análogos a fragmentos Fab convencionais ou F (ab') 2 fragmentos, mas nos quais ou (em caso de um fragmento F (ab') 2) um ou ambos dos domínios VH convencionais foi substituído por Nanocorpo da invenção. Também, dois nanocorpos podem ser ligados a um domínio CH3 (opcionalmente via um linker) para fornecer um construto com a meia-vida aumentada in vivo.
Segundo uma modalidade de execução específica de um polipeptídio da invenção, um ou vários nanocorpos da invenção podem ser ligados a uma ou várias partes de anticorpo, fragmentos ou domínios que conferem uma ou várias funções de executor ao polipeptídio da invenção e/ou podem conferir a capacidade de ligar a um ou vários receptores Fc. Por exemplo, com esta finalidade, e sem ser limitados a isso, uma ou várias seqüências aminoácidas adicionais podem compreender um ou vários domínios CH2 e/ou CH3 de um anticorpo, como de um anticorpo de cadeia pesada (conforme descrito na presente) e mais preferivelmente de um anticorpo de 4 cadeias humano convencional; e/ou pode formar-se (parte de) e região Fc, por exemplo, de IgG, de IgE ou de outro Ig humano. Por exemplo, WO o 94/04678 descreve anticorpos de cadeias pesadas que compreendem um Domínio VHH Camelideo ou um derivado humanizado disso (isto é, Nanocorpo), no qual os Camelidae CH2 e/ou domínio CH3 foram substituídos por domínios humanos CH2 e CH3, para fornecer uma imunoglobulina que se compõe de 2 cadeias pesadas cada compreendendo Nanocorpo e CH2 humano e domínios CH3 (mas não domínio CHI), cuja imunoglobulina tem a função de executor fornecida pelo CH2 e domínios CH3 e suja imunoglobulina pode funcionar sem a presença de qualquer cadeia leve. Outras seqüências aminoácidas que podem ser apropriadamente ligadas aos nanocorpos da invenção para fornecer uma função de executor serão claras à pessoa experimentada, e podem ser escolhidas com base na função(ões) executor desejada. Referência, por exemplo, é feita a WO 04/058820, WO 99/42077 e WO 05/017148, bem como a revisão por Holliger e Hudson, supra. A união do Nanocorpo da invenção a uma porção Fc também pode levar a uma meia-vida aumentada, em comparação com o Nanocorpo correspondente da invenção. Para algumas aplicações, o uso de uma porção Fc e/ou de domínios constantes (isto é, 0 CH2 e/ou domínios CH3) que conferem a meia-vida aumentada sem qualquer função de executor biologicamente significativa também pode ser convenientes ou até preferenciais. Outro construto conveniente compreendendo de um ou vários nanocorpos e um ou vários domínios constantes com a meia- vida aumentada in vivo serão claros para a pessoa experimentada, e, por exemplo, podem compreender dois nanocorpos ligados a um domínio CH3, opcionalmente via uma seqüência de linker. Geralmente, qualquer proteína de fusão ou os derivados com a meia-vida aumentada terão preferivelmente um peso molecular de mais de 50 kD, o valor de atalho absorção renal.
As novas seqüências aminoácidas também podem formar uma seqüência de sinal ou a seqüência líder que dirige a secreção do Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção de uma célula hospedeira sobre síntese (por exemplo para prover uma pre-, pro- ou prepro-forma do polipeptídio da invenção, dependendo da célula hospedeira usada para expressar o polipeptídio da invenção).
A nova seqüência aminoácida também pode formar uma seqüência ou sinal que permite que o Nanocorpo ou polipeptídio da invenção seja dirigido em direção a e/ou penetre ou entre em órgãos específicos, tecidos, células, ou partes ou compartimentos de células, e/ou que permita que o Nanocorpo ou polipeptídio da invenção penetre ou cruze uma barreira biológica como uma membrana de célula, uma camada de célula como uma camada de células epiteliais, um tumor inclusive tumores sólidos, ou a barreira cerebral de sangue. Exemplos convenientes de tais seqüências aminoácidas serão claros para a pessoa experimentada, e, por exemplo, incluirão, mas não são limitados a, os vetores "Peptrans" acima mencionados, as seqüências descritas por Cardinale et al. e as seqüências aminoácidas e fragmentos de anticorpo conhecidos por si que podem ser usados para expressar ou produzir os nanocorpos e polipeptidios da invenção como os assim chamados "intracorpos", por exemplo, como descrito em WO 94/02610, WO 95/22618, US-A-7004940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1512696; e em Cattaneo, A. e Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes e Springer-Verlag; e em Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170, e as novas referências descritas na presente.
Para algumas aplicações, especialmente para aquelas aplicações destinadas a matar uma célula que expressa o objetivo contra o qual os nanocorpos da invenção são dirigidos (p. ex. no tratamento do câncer), ou reduzir ou diminuir a velocidade do crescimento e/ou a proliferação tal célula, os nanocorpos da invenção também podem ser ligados a uma proteína (cito)tóxica ou polipeptidio. Exemplos de tal proteína tóxica e polipeptidios que podem ser ligados ao Nanocorpo da invenção para prover -, por exemplo, - um polipeptidio citotóxico da invenção serão claros para a pessoa experimentada e, por exemplo, podem ser encontrados na técnica prévia citada anteriormente e/ou na nova descrição na presente. Um exemplo é a assim chamada tecnologia ADEPT ™ WO 03/055527.
Segundo uma modalidade de execução não-restritiva, um ou vários resíduos aminoácidos podem ser acrescentados a, inseridos em e/ou substituídos na seqüência aminoácida do Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção, para fornecer um ou vários resíduos aminoácidos específicos para ligação de um grupo PEG.
A eficácia de farmacêuticos de proteína depende da sua potência para neutralizar o objetivo mas também da farmacocinética intrínseca da fármaco potencial. Como o rim geralmente filtra moléculas abaixo de 60,000 Daltons (Da), os esforços para reduzir o despejo têm focalizado no aumento do peso molecular do biofarmacéutico através de fusões de proteína (Syed et al., 1997), glicosilação ou modificação com polímero de glicol de polietileno, isto é, Pegilação (Sotavento et al. , 1999; Abuchowski et al., 1977; Nucci et al., 1991; Lecolley, et al. Chem Commun, 2004; Tao et al., os J São Chem Soe, 2004; Mantovani et al., 2005). Esses métodos com sucesso estendem-se na exposição in vivo do biofarmacéutico.
Alternativamente, a meia-vida pode ser estendida usando outro agente pegilante, POLY PEG para conjugação aos nanocorpos bivalentes, TNF5 6 ou TNF55. 0 POLY PEG é o polímero de forma de pente com dentes PEG em uma espinha dorsal metacrílica. Os POLY PEGs podem variar no comprimento da cadeia de PEG, na espinha dorsal metacrílica e no grupo de fim ativo que determina o método da conjugação do POLY PEG ao Nanocorpo. A conjugação específica de sítio ao C- terminal cisteina presente nos nanocorpos pode ser realizada através do grupo de fim maleimide ativo no POLY PEG.
A invenção também abrange qualquer Nanocorpo da invenção e/ou o polipeptídio da invenção que foi glicosilado em uma ou várias posições aminoácidas, normalmente dependendo do hospedeiro usado para expressar Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção (conforme adicionalmente descrito mais adiante).
Segundo uma modalidade de execução não-restritiva, um ou vários resíduos aminoácidos podem ser acrescentados a, inseridos em e/ou substituídos na seqüência aminoácida do Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção, para fornecer um ou vários resíduos aminoácidos específicos e/ou um sítio que pode ser glicosilado pelo organismo hospedeiro usado. Por meio de um exemplo preferencial, mas nâo-restritivo, o N- residuo na posição 50 dentro de CDR2 do Nanocorpo da invenção, por exemplo, pode ser substituído por um Resíduo Q, D ou S para fornecer um sítio de glicosilação, p. ex. para glicosilação por Pichia.
Segundo outra modalidade de execução, um polipeptídio da invenção pode compreender a seqüência aminoácida do Nanocorpo, que é fundido na sua extremidade terminal amino, na sua extremidade terminal carboxi, ou tanto na sua extremidade terminal amino como na sua extremidade terminal carboxi com pelo menos uma nova seqüência aminoácida.
Novamente, ditas seqüências aminoácidas adicionais podem ou não modificar-se, alterar-se ou de outra maneira influir nas propriedades (biológicas) do Nanocorpo e podem ou não acrescentar a nova funcionalidade ao Nanocorpo.
Por exemplo, segundo uma modalidade de execução preferencial, mas não-restritiva, as referidas seqüências aminoácidas adicionais compreendem pelo menos um novo Nanocorpo, para fornecer um polipeptídio da invenção que compreende pelo menos dois, como três, quatro ou cinco, nanocorpos, nos quais os referidos nanocorpos podem ser opcionalmente ligados via uma ou várias seqüências de linkers (conforme definido na presente).
Os polipeptídios da invenção que compreendem dois ou mais nanocorpos serão também mencionados na presente como polipeptídios "multivalentes". Por exemplo, um polipeptídio "bivalente" da Invenção compreende dois nanocorpos, opcionalmente ligados via uma seqüência de linker, ao passo que um polipeptídio "trivalente" da invenção compreende três nanocorpos, opcionalmente ligados via duas seqüências de linkers; etc.
Em um polipeptídio multivalente da invenção, dois ou mais nanocorpos podem ser os mesmos ou diferentes. Por exemplo, dois ou mais nanocorpos em um polipeptídio multivalente da invenção: - pode ser dirigido contra o mesmo antigeno, isto é, contra as mesmas partes ou epitopes do referido antigeno ou contra duas ou mais partes diferentes ou epitopes do referido antigeno; e/ou:
- pode ser dirigido contra os antigenos diferentes; ou uma combinação disso.
Portanto, um polipeptidio bivalente da invenção por exemplo:
- pode compreender dois nanocorpos idênticos;
- pode compreender um primeiro Nanocorpo dirigido contra uma primeira parte ou epitope de um antigeno e um segundo Nanocorpo dirigido contra a mesma parte ou epitope do referido antigeno ou contra outra parte ou epitope do referido antigeno;
- ou pode compreender um primeiro Nanocorpo dirigido contra iam primeiro antigeno e um segundo Nanocorpo dirigido contra um segundo antigeno diferente do primeiro referido antigeno; ao passo que um Polipeptidio trivalente da Invenção por exemplo:
- pode compreender três nanocorpos idênticos ou diferentes dirigidos contra as mesmas partes ou diferentes ou epitopes do mesmo antigeno;
- pode compreender dois nanocorpos idênticos ou diferentes dirigidos contra as mesmas partes ou diferentes ou epitopes em um primeiro antigeno e um terceiro Nanocorpo dirigido contra um segundo antigeno diferente do primeiro referido antigeno; ou
- pode compreender um primeiro Nanocorpo dirigido contra um primeiro antigeno, um segundo Nanocorpo dirigido contra um segundo antigeno diferente do primeiro referido antigeno, e um terceiro Nanocorpo dirigido contra um terceiro antigeno diferente do primeiro e segundo referido antigeno,
Os polipeptidios da invenção que contêm pelo menos dois nanocorpos, nos quais pelo menos um nanocorpo é dirigido contra iam primeiro antigeno e pelo menos um nanocorpo é dirigido contra um segundo Nanocorpo diferente do primeiro antigeno, também se mencionará como nanocorpos "multiespecifico". Portanto, Nanocorpo "biespecifico" é um Nanocorpo que compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra um primeiro antigeno e pelo menos iam novo Nanocorpo dirigido contra um segundo antigeno, ao passo que o Nanocorpo "triespecifico" é um Nanocorpo que compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra um primeiro antigeno, pelo menos um novo Nanocorpo dirigido contra um segundo antigeno, e pelo menos um novo Nanocorpo dirigido contra um terceiro antigeno; etc.
Conseqüentemente, na sua forma mais simples, um polipeptidio biespecifico da invenção é um polipeptidio bivalente da invenção (conforme definido na presente), compreendendo primeiro Nanocorpo dirigido contra um primeiro antigeno e um segundo Nanocorpo dirigido contra um segundo antigeno, no qual os referidos primeiro e segundo Nanocorpo podem ser opcionalmente ligados via uma seqüência de linker (conforme definido na presente); ao passo que um polipeptidio triespecifico da invenção na sua forma mais simples é um polipeptidio trivalente da invenção (conforme definido na presente), compreendendo primeiro Nanocorpo dirigido contra um primeiro antigeno, um segundo Nanocorpo dirigido contra um segundo antigeno e um terceiro Nanocorpo dirigido contra um terceiro antigeno, no qual os referidos primeiro, segundo e terceiro Nanocorpo pode ser opcionalmente ligado via uma ou mais, e em particular uma, e mais em particular, duas seqüências de linkers.
Contudo, como ficará claro da descrição mais acima, a invenção não é limitada a isso, no sentido de que um polipeptidio multiespecifico da invenção pode compreender qualquer número de nanocorpos dirigidos contra dois ou mais antigenos diferentes.
Para polipeptidios multivalentes e multiespecificos que contêm um ou vários domínios VHH e a sua preparação, a referência também é feita a Conrath et al., J. Biol. Chem., volume 276, 10. 7346-7350, bem como a EP 0 822985. Nos polipeptidios da invenção, um ou vários nanocorpos e um ou vários polipeptidios podem ser diretamente ligados um a outro (como, por exemplo, descrito em WO 99/23221) e/ou ligados um a outro via um ou vários espaçadores convenientes ou linkers, ou qualquer combinação disso.
Espaçadores ou linkers convenientes para usar em polipeptidios multivalentes e multiespecificos serão claros para a pessoa experimentada, e podem ser geralmente qualquer linker ou o espaçador usado na técnica para ligar seqüências aminoácidas. Preferivelmente, dito linker ou espaçador é conveniente para uso na construção de proteínas ou polipeptidios que são destinados para uso farmacêutico.
Alguns espaçadores em particular preferenciais incluem espaçadores e linkers que são usados na técnica para ligar fragmentos de anticorpo ou domínios de anticorpo. Esses incluem os linkers mencionados na técnica de fundo geral citada anteriormente, bem como, por exemplo, linkers que são usados na técnica para construir diabodies ou fragmentos de ScFv (neste aspecto, contudo, deve ser observado que, ao passo que em diabodies e em fragmentos de ScFv, a seqüência de linker usada deve ter um comprimento, um grau da flexibilidade e outras propriedades que permitem que os Domínios VH e VL pertinentes venham em conjunto para formar o sítio de ligação de antígeno completo, não há nenhuma determinada limitação do comprimento ou flexibilidade do linker usado no polipeptídio da invenção, desde que cada Nanocorpo por si mesmo forma um sítio de ligação de antígeno completo).
Outros linkers convenientes geralmente compreendem compostos ou polímeros orgânicos, especialmente os convenientes para uso em proteínas o uso farmacêutico. Por exemplo, poli (etileneglicol) metades foram usadas para ligar domínios de anticorpo, ver, por exemplo, WO 04/081026.
Está também dentro dos limites da invenção que os linker(s) usados conferem uma ou várias outras propriedades favoráveis ou a funcionalidade aos polipeptidios da invenção, e/ou fornecem um ou vários sítios para a formação de derivados e/ou para a ligação de grupos funcionais (p. ex. conforme descrito na presente para os derivados de nanocorpos da invenção). Por exemplo, linkers contendo um ou vários resíduos aminoácidos carregados (ver a Tabela a-3 acima) pode prover propriedades hidrofílicas melhoradas, ao passo que linkers que formam ou contêm pequenos epitopes ou etiquetas podem ser usados para os objetivos de detecção, identificação e/ou purificação. Novamente, baseado na revelação na presente, a pessoa experimentada será capaz de determinar os linkers ótimos para uso em um polipeptídio específico da invenção, opcionalmente depois em alguns experimentos de rotina limitados.
Finalmente, quando dois ou mais linkers são usados nos polipeptídios da invenção, esses linkers podem ser os mesmos ou diferentes. Novamente, baseado na revelação na presente, a pessoa experimentada será capaz de determinar os linkers ótimos para uso em um polipeptídio específico da invenção, opcionalmente depois em alguns experimentos de rotina limitados.
Os Linkers para uso em polipeptídios multivalentes e multiespecíficos serão claros para a pessoa experimentada, e, por exemplo, incluirão gly-ser linkers, por exemplo, do tipo (glyxsery) z, como (por exemplo (gly4ser) 3 ou (gly3ser2) 3, como descrito em WO 99/42077, regiões pregadas como as regiões pregadas de anticorpos de cadeias pesadas que ocorrem naturalmente ou seqüências semelhantes. Para outros linkers convenientes, a referência também é feita à fundamentos técnicos gerais citada anteriormente. Alguns em particular preferiram que linkers sejam dados em SEQ ID NO's 68 e 69.
Linkers também podem fornecer um pouco de funcionalidade para o polipeptídio multivalente ou multiespecífico. Por exemplo, linkers contendo um ou vários resíduos aminoácidos carregados (ver a Tabela 1 anteriormente) podem prover propriedades hidrofílicas melhoradas, ao passo que linkers que formam ou contêm pequenos epitopes ou etiquetas podem ser usados para os objetivos de detecção, identificação e/ou purificação.
Como mencionado na presente, em uma proteína ou o polipeptídio da invenção, nanocorpos anti-TNF mencionados na presente são pref erivelmente ligados de tal modo que as referidas proteinaa ou polipeptidios, para ligar a um Trimero TNF, é capaz de inibir ou de reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor; e/ou de tal modo que a proteína ou o polipeptídio são capazes da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trímero TNF. Linkers convenientes são como descritos na presente.
Como também mencionado na presente, se uma proteína ou o polipeptídio fornecem a ligação intermolecular ou a ligação de extramolecular pode ser avaliado (pelo menos inicialmente) por uma cromatografia de exclusão por tamanho. Pela Cromatografia de exclusão por tamanho os complexos de TNF-alfa e anticorpos podem ser analisados para determinar o número e a proporção de anticorpo e moléculas TNF-alfa no complexo. Desses dados pode ser deduzido se ocorrem ligações inter- ou intramoleculares, como foi feito por Santora e colegas (Santora, L.C., e al, Biochem Anal. 2001) para estabelecimento do estequiometria de ligação de anticorpo monoclônico D2E7 (Humira) o TNF-alfa. em proporções diferentes de anticorpo e objetivo. Do peso molecular do complexo foi concluído que três moléculas de anticorpo complexado com três Trímeros TNFs, conseqüentemente indicando que o anticorpo liga em um modo intermolecular. Experimentos semelhantes foram executados com nanocorpos bivalentes, no qual um linker muito curto induziu a formação de grandes complexos moleculares, que foram obtidos por ligações intermoleculares. Contudo, o mesmo nanocorpos bivalente construtos com linkers mais longos eluídos da coluna de filtração de gel como pequenos complexos discretos, conseqüentemente demonstrando que as ligações intramoleculares foram formadas. Combinado com os dados do bioensaio, nos quais o linker mais longo que contém Nanocorpo TNFl teve uma ótima potência (a neutralização completa da quantidade de TNF usado no ensaio, isto é, às 22h00), pode ser concluído que a ligação intramolecular do Nanocorpo bivalente eficientemente impede a ligação cruzada de dos receptores ligados por célula e a ativação de receptor associada. Os anticorpos monoclônicos conhecidos como Humira ou Remicade não podem formar tais ligações intramoleculares, deixando sempre dois locais de ligação de receptor na molécula trimérica TNF a certo grau disponível para a interação com receptor ligado por célula, que traduz para a neutralização menos potente como medido no bioensaio.
Alternativamente, se uma proteína ou o polipeptídio fornecem a ligação intermolecular ou a ligação extramolecular pode ser avaliada por cristalografia e/ou modelagem molecular (ou outras silicotécnicas convenientes). Um modelo de um complexo trimérico TNF30/TNF-alfa foi gerado baseado na estrutura cristalina do complexo do tipo natural monomérico TNFl/TNF-alfa . Desta estrutura o construto final TNF30-linker-ALB8-linker-TNF30 foi modelado. 0 construto TNF30-linker-ALB8-linker-TNF30 foi modelado começando do trímero de TNFa com duas moléculas TNF30 ligadas. Como a estrutura do ALB8 não é conhecida, uma terceira molécula de TNF30 foi usada em vez disso, que foi colocada no meio outros dois nanocorpos ao longo da linha entre o N-e C- términos. Os 9 linkers aminoácidos então foram acrescentados manualmente.
O modelo é mostrado na Figura 62. Claramente, 9 linkers aminoácidos em conjunto com o ALB8 fornece amplo espaço para abarcar os aproximadamente 66 Â entre dois domínios TNF30 ligados a TNFa. 0 ALB8 por si mesmo já abarca 40 Á, e cada linker pode abarcar outro -27 Â em conformação completamente estendida. Por conseguinte, o ALB8 tem bastante flexibilidade do movimento, e não é esperado que a sua ligação à albumina interferiria muito na ligação a TNFa.
Além disso, é provável que os linkers possam ser encurtados sem afetar a avidez, especialmente no caso do linker que é o C-terminal de ALB8. Isto pode ter o efeito benéfico da ligação aumentada ao mesmo TNFa trimero contra trimeros de ligação cruzada, porque a probabilidade que o segundo TNF30 se associe com um TNFa diferente aumenta com o comprimento do linker.
Como também além disso descrito na presente, um polipeptidio multiespecifico da invenção dirigido contra um antigeno desejado e contra pelo menos uma proteína de soro, como a proteína de soro mencionada a seguir, e especialmente contra uma albumina de soro humano, pode mostrar meia-vida aumentada no soro, em comparação com o correspondente Nanocorpo monovalente.
Como mencionado mais acima, os métodos descritos na presente são em particular ajustados para gerar tais polipeptídios multiespecificos multivalentes da invenção.
Em um polipeptidio da invenção, pelo menos um nanocorpo também pode ser ligado a um domínio Vh convencional ou a um análogo natural ou sintético de um domínio Vhí opcionalmente via uma seqüência de linker.
Em um polipeptidio da invenção, pelo menos um nanocorpo também pode ser ligado a um domínio VL ou a um análogo natural ou sintético de um domínio VL, opcionalmente via uma seqüência de linker, para fornecer um polipeptidio da invenção que está na forma análoga a um fragmento scFv convencional, mas conter um Nanocorpo em vez de um domínio VH.
Em um polipeptidio da invenção, pelo menos um nanocorpo também pode ser ligado a um ou vários domínios CHI, CH2 e/ou CH3, opcionalmente via uma seqüência de linker. Por exemplo, um Nanocorpo ligado a um domínio CHl conveniente, por exemplo, pode ser usado - em conjunto com cadeias leves convenientes - para gerar fragmentos/estruturas de anticorpo análogos a fragmentos Fab convencionais ou F (ab') 2 fragmentos, mas no qual ou (em caso de um F (ab') 2 fragmento) um ou ambos dos domínios Vh convencionais foi substituído por um Nanocorpo. Tais fragmentos também podem ser heteroespecíficos ou biespecíficos, isto é, dirigido contra dois ou mais antígenos. Um Nanocorpo ligado a CH2 conveniente e domínios CH3, por exemplo, derivado de Camelídeos, pode ser usado para formar um anticorpo de cadeia pesada monoespecífico ou biespecífico. Finalmente, um Nanocorpo ligado a CHl conveniente, CH2 e domínios CH3, por exemplo, derivado de um ser humano, pode ser usado - em conjunto com cadeias leves convenientes - para formar um anticorpo que é análogo a um anticorpo de 4 cadeias convencional, mas no qual um ou ambos dos domínios Vh convencionais foram substituídos por um Nanocorpo.
Também, além de um ou vários nanocorpos, os
Polipeptídios da Invenção também podem conter grupos funcionais, metades ou resíduos, por exemplo, substâncias terapeuticamente ativas, como os mencionados mais adiante, e/ou marcadores ou etiquetas, como marcadores fluorescentes, isótopos, etc., conforme adicionalmente descrito a seguir.
Os nanocorpos da invenção, os polipeptídios da invenção, e ácidos nucléicos que codificam o mesmo, podem estar preparados em uma maneira conhecida por si, como estará claro para a pessoa experimentada da nova descrição na presente. Alguns dos métodos preferidos, mas não- restritivos para preparar os nanocorpos, polipeptídios e ácidos nucléicos incluem os métodos e técnicas acima mencionadas e/ou novas descritas a seguir.
Como estará claro para a pessoa versada, um método especialmente útil para preparar um Nanocorpo e/ou um polipeptídio da invenção geralmente compreende as etapas de:
- a expressão, em uma célula hospedeira conveniente ou organismo hospedeiro (também mencionado na presente como "um hospedeiro da invenção") ou em outro sistema de expressão conveniente de um ácido nucléico que codifica os referidos Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção (também mencionado na presente como "um ácido nucléico da invenção") , opcionalmente seguido por:
- isolação e/ou purificação do Nanocorpo ou polipeptídio da invenção portanto obtido.
Especialmente, tal método pode compreender as etapas de:
- cultivar e/ou manter um hospedeiro da invenção em condições que são tais que o referido hospedeiro da invenção expressa e/ou produz pelo menos um nanocorpo e/ou o polipeptídio da invenção; opcionalmente seguido por :
- isolação e/ou purificação do Nanocorpo ou polipeptídio da invenção portanto obtido.
Um ácido nucléico da invenção pode ser na forma de ADN ou ARN de trançado simples ou duplo, e é preferivelmente na forma do ADN de trançado duplo. Por exemplo, as seqüências de nucleotídeos da invenção podem ser ADN genômico, cDNA ou o ADN sintético (como ADN com um uso de codon que foi especificamente adaptado para expressão na célula hospedeira desejada ou organismo hospedeiro).
Segundo uma modalidade de execução da invenção, o ácido nucléico da invenção está em essencialmente isolado de, conforme definido acima.
O ácido nucléico da invenção também pode ser na forma de, estar presente em e/ou ser parte de um vetor, como, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo ou YAC, que novamente pode estar na forma essencialmente isolada.
Os ácidos nucléicos da invenção podem estar preparados ou obtidos em uma maneira conhecida por si, baseado na informação dadas nas seqüências aminoácidas para os polipeptídios da presente invenção, e/ou ser isolados de uma fonte natural conveniente. Para fornecer análogos, seqüências de nucleotídeos que codificam domínios de VHH que ocorrem naturalmente, por exemplo, podem ser submetidos a mutagenese direcionada a local, de modo a fornecer um ácido nucléico da invenção que codifica os referidos análogos. Também, como estará claro para a pessoa experimentada, preparar um ácido nucléico da invenção, também várias seqüências de nucleotideos, como pelo menos uma seqüência de nucleotideos que codifica Nanocorpo e ácidos, por exemplo, nucléicos que codificam um ou vários linkers podem ser ligadas em conjunto em uma maneira conveniente.
As técnicas para gerar os ácidos nucléicos da invenção serão claras à pessoa experimentada e podem incluir por exemplo, mas não são limitadas a, síntese de ADN automatizada; mutagenese direcionada a local; a combinação de duas ou mais seqüências que ocorrem naturalmente e/ou sintéticas (ou dois ou mais partes das mesmas), a introdução de mutações que levam à expressão de um produto de expressão truncado; a introdução de um ou vários sítios de restrição (p. ex. para criar cassetes e/ou regiões que podem ser facilmente digeridas e/ou ligadas utilizando enzimas de restrição convenientes), e/ou a introdução de mutações por meio de uma reação PCR que usa um ou vários escorvadores "mal combinados", usando, por exemplo, uma seqüência de uma GPCR de ocorrência natural como um padrão. Estas e outras técnicas serão claras à pessoa experimentada, e a referência é novamente feita aos manuais padrão, como Sambrook. e Ausubel et al., acima mencionado, bem como os Exemplos mais adiante.
O ácido nucléico da invenção também pode ser na forma de, estar presente em e/ou ser parte de um construto genético, como estará claro para a pessoa experimentada na técnica. Tal construto genético geralmente compreende pelo menos um ácido nucléico da invenção que é opcionalmente ligado a um ou vários elementos de construto genético conhecido por si, como, por exemplo, um ou vários elementos reguladores convenientes (como um promotor (es) conveniente, realçador(es), exterminadores(s), etc.) e os novos elementos dos construtos genéticos mencionados a seguir. Tais construtos genéticos compreendendo pelo menos um ácido nucléico da invenção também serão referidos na presente como "construto genético da invenção".
O construto genético da invenção pode ser ADN ou o ARN, e são o ADN preferivelmente de trançado duplo. O construto genético da invenção também pode estar em uma forma conveniente para a transformação da célula hospedeira desejada ou organismo hospedeiro, em uma forma conveniente para integração no ADN genômico da célula hospedeira desejada ou em uma forma de réplica independente conveniente, manutenção e/ou herança no organismo hospedeiro desejado. Por exemplo, o construto genético da invenção pode ser na forma de um vetor, como, por exemplo, um plasmideo, cosmídeo, YAC, um vetor viral ou transposon. Especialmente, o vetor pode ser um vetor de expressão, isto é, um vetor que pode prover a expressão in vitro e/ou in vivo (p. ex. em uma célula hospedeira conveniente, organismo hospedeiro e/ou sistema de expressão).
Em uma modalidade de execução preferencial mas não- restritiva, um construto genético da invenção compreende
a) pelo menos um ácido nucléico da invenção; operavelmente conectado a
b) um ou vários elementos reguladores, como um promotor e opcionalmente um exterminador conveniente;
c) e opcionalmente também
d) um ou vários novos elementos dos construtos genéticos conhecido por si;
no qual os termos "elemento regulador", "o promotor", "exterminadores" e "operavelmente conectado" tem a sua significação habitual na técnica (conforme adicionalmente descrito mais adiante); e no qual os referidos "novos elementos" o presente no construto genético, por exemplo, pode ser 3'-ou 5 seqüências '-UTR, seqüências de lider, marcadores de seleção, genes de marcadores/repórter de expressão, e/ou elementos que podem facilitar ou aumentar (a eficiência de) a transformação ou a integração. Estes e outros elementos convenientes para tal construto genético ficará claro para a pessoa experimentada, e pode depender, por exemplo, do tipo de construto usado, a célula hospedeira desejada ou organismo hospedeiro; a maneira na qual as seqüências de nucleotideos da invenção do interesse devem ser expressas (p. ex. via a expressão constitutiva, passageira ou induzivel); e/ou a técnica de transformação a ser usada.
Preferivelmente, no construto genético da invenção, os referidos pelo menos um ácido nucléico da invenção e os referidos elementos reguladores, e opcionalmente os referidos um ou vários novos elementos, são "operavelmente ligados" iam a outro, pelo qual geralmente quer dizer que eles estão em uma relação funcional um com outro. Por exemplo, um promotor é considerado "operavelmente ligado" a uma seqüência de codificação se o referido promotor for capaz de iniciar ou controlar/regular de outra maneira a transcrição e/ou a expressão de uma seqüência de codificação (no qual a referida codificação de seqüência deve ser entendida como estando "no controle de " os referidos promotores). Geralmente, quando duas seqüências de nucleotideos são operavelmente ligadas, elas estarão na mesma orientação e normalmente também na mesma armação de leitura. Eles também serão normalmente essencialmente contíguos, embora isto também não possa ser requerido.
Preferivelmente, os elementos reguladores e novos dos construtos genéticos da invenção são tais que eles são capazes de fornecer a sua função biológica desejada na célula hospedeira desejada ou organismo hospedeiro.
Por exemplo, um promotor, realçador ou exterminadores deve ser "operável" na célula hospedeira desejada ou organismo hospedeiro, pelo qual se quer dizer que (por exemplo) o referido promotor deve ser capaz da iniciação ou de outra maneira controlar/regular a transcrição e/ou a expressão de uma seqüência de nucleotideos - p. ex. uma seqüência de codificação - ao qual ele está operavelmente ligado (conforme definido na presente). Alguns promotores em particular preferenciais incluem, mas não são limitados a, promotores conhecidos por si para a expressão em células bacterianas, como as mencionadas a seguir e/ou os usados nos Exemplos.
Um marcador de seleção deve ser tal que permita - isto é, em condições de seleção apropriadas - células hospedeiras e/ou organismos hospedeiros que foram (com sucesso) transformados com a seqüência de nucleotideos da invenção a ser distinguida de células/organismos hospedeiros que não foram (com sucesso) transformados. Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos de tais marcadores são genes que fornecem a resistência contra antibióticos (como canamicina ou ampicilina), genes que provêem resistência à temperatura, ou genes que permitem a célula hospedeira ou organismo hospedeiro a serem mantidos na ausência de certos fatores, compostos e/ou componentes (alimentares) no meio que são essenciais para a sobrevivência das células não- transformadas ou organismos.
Uma seqüência lider deve ser tal que - na célula hospedeira desejada ou organismo hospedeiro - ela leva em conta as modificações pós-translação desejadas e/ou tal que ela dirige o mRNA transcrito a uma parte desejada ou organela de uma célula. Uma seqüência lider também pode levar em conta a secreção do produto de expressão da referida célula. Como tal, a seqüência lider pode ser alguma pro-, pre, ou a prepro-seqüência operável na célula hospedeira ou organismo hospedeiro. As seqüências de lider não podem ser requeridas para expressão em uma célula bacteriana.
Um marcador de expressão ou o gene de repórter devem ser tais que - na célula hospedeira ou organismo hospedeiro - ele leva em conta a detecção da expressão (de um gene ou seqüência de nucleotideos presente em) os construtos genéticos. Um marcador de expressão também pode levar em conta opcionalmente a localização do produto expresso, p. ex. em uma parte especifica ou organela de uma célula e/ou em célula(s) especifica (s), tecido(s), órgão (s) ou parte (s) de um organismo multicelular. Tais genes de repórter também podem ser expressos como uma fusão de proteína com a seqüência aminoácida da invenção. Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos incluem a proteína fluorescente como GFP.
Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos dos promotores convenientes, exterminadores e novos elementos incluem os usados nos Exemplos mais adiante. Para alguns (novos) exemplos não-restritivos dos promotores, marcadores de seleção, seqüências de líder, marcadores de expressão e novos elementos que podem ser apresentados/usados no construto genético da invenção - como exterminadores, realçadores transcricionais e/ou de translação e/ou fatores de integração - é feita referência aos manuais gerais como Sambrook. e Ausubel acima mencionados, bem como aos exemplos que são dados em WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US 6,207,410, US - - 5,693,492 e EP 1085089. Outros exemplos serão claros para a pessoa experimentada. A referência também é feita à fundamentos técnicos gerais citados anteriormente e as novas referências citadas a seguir.
O construto genético da invenção pode ser geralmente fornecido ligando apropriadamente seqüência (s) de nucleotídeos da invenção a iam ou vários novos elementos descritos anteriormente, por exemplo, usando as técnicas descritas nos manuais gerais como Sambrook. e Ausubel et al., acima mencionados.
Freqüentemente, o construto genético da invenção será obtido inserindo uma seqüência de nucleotídeos da invenção em um vetor conveniente (expressão) conhecido por si. Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos dos vetores de expressão convenientes são os usados nos Exemplos mais adiante, bem como os mencionados mais adiante.
Os ácidos nucléicos da invenção e/ou o construto genético da invenção pode ser usado para transformar uma célula hospedeira ou o organismo hospedeiro. A célula hospedeira ou hospedeira pode ser alguma célula conveniente (fungosa, procariótica ou eucariótica) ou linha de célula ou algum organismo conveniente fungoso, procariótico ou eucariótico, por exemplo:
- uma classe bacteriana, inclusive, mas não limitado a, classes negativas de grama como classes de Escherichia coli; de Proteus, por exemplo, de Proteus mirabilis; de Pseudomonas, por exemplo, de Pseudomonas fluorescens; e classes positivas de grama como classes de Bacillus, por exemplo, de Baeillus subtilis ou de Baeillus brevis; de Streptomyees, por exemplo, de Streptomyces lividans; de Estafiloeoeo, por exemplo, de Estafiloeoeo carnosus; e de Laetocoecus, por exemplo, de Lactoeoceus laetis;
- uma célula fungosa, inclusive, mas não limitado a, células de espécie de Triehoderma, por exemplo, de Triehoderma reesei; de Neurospora, por exemplo, de Neurospora crassa; de Sordaria, por exemplo, de Sordaria maerospora; de Aspergillus, por exemplo, do Niger Aspergillus ou de Aspergillus sojae; ou de outros fungos filamentosos;
- uma célula de levedura, inclusive, mas não limitado a, células de espécie de Saccharomyees, por exemplo, de Saceharomyces cerevisiae; de Schizosaecharomyees, por exemplo, de Schizosaecharomyees pombe; de Pichia, por exemplo, de Pichia pastoris ou de Pichia methanolica; de Hansenula, por exemplo, de Hansenula polymorpha; de Kluyveromyces, por exemplo, de Kluyveromyces lactis; de Arxula, por exemplo, de Arxula adeninivorans; de Yarrowia, por exemplo, de Yarrowia lipolytiea;
uma linha de célula ou célula anfíbia, como Xenopus oocytes;
- uma linha de célula ou célula derivada por inseto, como linhas de células/célula derivou de lepidoptera, inclusive mas não limitado a Spodoptera SF9 e células Sf 21 ou as linhas de células/célula derivaram de Drosophilal como Schneider e células Kc;
- uma planta ou célula de planta, por exemplo, em plantas de fumo; e/ou
- uma linha de célula ou célula de mamífero, por exemplo, derivada de uma linha de célula ou célula derivada de um ser humano, de mamíferos inclusive mas não limitado a CHO- células, BHK-células (por exemplo células de BHK-21) e células humanas ou linhas de célula como HeLa, COS (por exemplo COS 7) e PER C6 células;
bem como todos outros anfitriões ou células hospedeiras conhecidas por si para a expressão e a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo (inclusive, mas não limitado a, anticorpos de domínio (únicos) e fragmentos ScFv), o que ficará claro para a pessoa experimentada. A referência também é feita à fundamentos técnicos gerais citados mais acima, bem como a, por exemplo, WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann e Muyldermans, (1999), supra; perua der Tília, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten et al. , (2003), supra; Joosten et al., (2005), supra; e as novas referências citadas na presente.
Os nanocorpos e os polipeptídios da invenção também podem ser introduzidos e expressos em uma ou várias células, tecidos ou órgãos de um organismo multicelular, por exemplo, para objetivos profiláticos e/ou terapêuticos (p. ex. como uma terapia genética). Com esta finalidade, as seqüências de nucleotídeos da invenção podem ser introduzidas nas células ou tecidos de qualquer modo conveniente, por exemplo, como tal (p. ex. utilização de lipossomas) ou depois que eles foram inseridos em um vetor de terapia genético conveniente (por exemplo derivados de retroviruses como adenovirus, ou parvoviruses como vírus adeno-associado). Como também ficará claro para a pessoa experimentada, tal terapia genética pode ser executada in vivo e/ou em situ no corpo de um paciente administrando um ácido nucléico da invenção ou um vetor de terapia genético conveniente codificando o mesmo ao paciente ou a células especificas ou um tecido especifico ou órgão do paciente; ou as células convenientes (freqüentemente tomado do corpo do paciente a ser tratado, como linfócitos explantados, aspirados do tutano dos ossos ou biópsias de tecido) podem ser tratadas in vitro com uma seqüência de nucleotideos da invenção e logo ser apropriadamente (re) introduzidas no corpo do paciente. Tudo isso pode ser executado usando vetores de terapia genéticos, técnicas e sistemas de entrega que são bem conhecidos à pessoa experimentada, para Culver, K. W., "Terapia Genética", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, Nova York,N.Y.). Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Ciência 256 (1992), 808-813; Verma, Natureza 389 (1994), 239; Isner, Lanceta 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077- 1086; Onodera, Sangue 91; (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N. Y. Acad. Sci .: 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; 1 US 5,5895466; ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Por exemplo, expressão in situ de fragmentos ScFv (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) e de diabodies (Blanco et al., J. O Immunol, 171, 1070-1077 (2003)) foi descrito na técnica.
Para a expressão dos nanocorpos em uma célula, eles também podem ser expressos como assim chamados ou como os assim chamados "intracorpos", como, por exemplo, descrito em WO 94/02610, WO 95/22618 e US A-7004940; WO 03/014960; em Cattaneo, A. e Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes e Springer-Verlag; e em Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.
Para a produção, os nanocorpos e os polipeptidios da invenção, por exemplo, também podem ser produzidos no leite de mamíferos transgênicos, por exemplo, no leite de coelhos, vacas, cabras ou ovelhas (ver, por exemplo, US A-6,741,957, US-A-6,304,489 e US-A-6,849,992 para técnicas gerais para introduzir transgenes em mamíferos), em plantas ou partes de plantas inclusive mas não limitado às suas folhas, flores, frutos, semente, raízes ou tubérculos (por exemplo em fumo, milho, feijão-soja ou alfafa) ou em, por exemplo, pupas do bicho da seda Bombix mori.
Além disso, os nanocorpos e os polipeptídios da invenção também podem ser expressos e/ou produzidos em sistemas de expressão sem célula, e os exemplos convenientes de tais sistemas serão claros para a pessoa experimentada. Alguns exemplos preferidos, mas não-restritivos incluem a expressão no sistema de germe de trigo; em reticulocite lysates em coelhos; ou no sistema E. coli Zubay.
Conforme acima mencionado, uma das vantagens do uso de nanocorpos é que os polipeptídios baseados neles podem estar preparados através de expressão em um sistema bacteriano conveniente, e sistemas de expressão bacterianos convenientes, vetores, células hospedeiras, os elementos reguladores, etc., serão claros para a pessoa experimentada, por exemplo, das referências citadas anteriormente. Deve contudo ser observado que a invenção no seu sentido mais amplo não é limitada à expressão em sistemas bacterianos.
Preferivelmente, na invenção, um (em vivo ou em vitro) sistema de expressão, como um sistema de expressão bacteriano, é usado que fornece os polipeptídios da invenção em uma forma que é conveniente para uso farmacêutico, e tais sistemas de expressão serão novamente claros para a pessoa experimentada. Como também ficará claro para a pessoa experimentada, os Polipeptídios da invenção convenientes para uso farmacêutico podem ser preparados usando técnicas para síntese de peptídeo.
Para produção em escala industrial, anfitriões heterólogos preferidos para a produção (industrial) de nanocorpos ou proteína terapêutica que contém Nanocorpo inclui classes de E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae que são convenientes para expressão/produção/fermentação em grande escala, e especialmente para
expressão/produção/fermentação farmacêutica em grande escala. Os exemplos convenientes de tais classes serão claros para a pessoa experimentada. Tais classes e os sistemas de produção/expressão também são postos à disposição por companhias como Biovitrum (Úpsala, Suécia).
Alternativamente, as linhas de célula de mamíferos, em determinadas células dos ovários de hamster chinês (CHO), podem ser usadas para expressão/produção/fermentação em grande escala, e especialmente para
expressão/produção/fermentação farmacêutica em grande escala. Novamente, tais sistemas de expressão/produção também são postos à disposição por algumas companhias acima mencionadas.
A escolha do sistema de expressão específico dependeria em parte do requisito para certas modificações pós- translação, mais especificamente glicosilação. A produção de uma proteína recombinante que contenha Nanocorpo para a qual a glicosilação é desejada ou requerida exigiria o uso de anfitriões de expressão mamíferos que têm a capacidade de glicosilar a proteína expressa. Neste aspecto, estará claro para a pessoa experimentada que o modelo de glicosilação obtido (isto é, a espécie, número e posição de resíduos ligados) dependerá da linha de célula ou célula que é usada para a expressão. Preferivelmente, uma linha de célula ou célula humana é usada (isto é, levar a uma proteína que essencialmente tem um modelo da glicosilação humana) ou outra linha de célula de mamífero é usada que pode fornecer um modelo de glicosilação que é essencialmente e/ou funcionalmente o mesmo como glicosilação humana ou pelo menos imita glicosilação humana. Geralmente, anfitriões procarióticos como E. coli não têm a capacidade de glicosilar proteína, e o uso de eucariotes inferiores como levedura que normalmente leva a um modelo de glicosilação que se diferencia da glicosilação humana. Sem embargo, deve ser entendido que todas as células hospedeiras precedentes e os sistemas de expressão podem ser usados na invenção, dependendo do Nanocorpo desejado ou proteína a ser obtida.
Portanto, segundo uma modalidade de execução não- restritiva da invenção, o Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção é glicosilado. Segundo outra modalidade de execução não-restritiva da invenção, o Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção é não-glicosilado.
Segundo uma modalidade de execução preferencial, mas não-restritiva da invenção, o Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção é produzido em uma célula bacteriana, especialmente uma célula bacteriana conveniente para produção farmacêutica em grande escala, como as células das classes acima mencionadas.
Segundo outra modalidade de execução preferida, mas não-restritiva da invenção, o Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção é produzido em uma célula de levedura, especialmente uma célula de levedura conveniente para produção farmacêutica em grande escala, como as células da espécie acima mencionada.
Segundo ainda outra modalidade de execução preferida, mas não-restritiva da invenção, o Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção é produzido em uma célula de mamífero, especialmente em uma célula humana ou em uma célula de uma linha de célula humana, e mais especialmente em uma célula humana ou em uma célula de uma linha de célula humana que é conveniente a para produção farmacêutica em grande escala, como as linhas de célula mencionadas mais acima.
Quando a expressão em uma célula hospedeira é usada para produzir os nanocorpos e a proteína da invenção, os nanocorpos e a proteína da invenção podem ser produzidos intracelularmente (p. ex. no cytosol, no periplasma ou em corpos de inclusão) e logo isolados das células hospedeiras e opcionalmente além disso purificados; ou podem ser produzidos extracelularmente (p. ex. no meio no qual as células hospedeiras são cultivadas) e logo isolados do meio de cultura e opcionalmente além disso purificados. Quando as células hospedeiras eucarióticas são usadas, a produção extracelular é normalmente preferida desde que isto consideravelmente facilita a nova isolação e processamento posterior dos nanocorpos e proteína obtida. As células bacterianas como as classes de E. coli acima mencionadas normalmente não segregam a proteína extracelularmente, exceto algumas classes da proteína como toxinas e hemolisina, e produção secretores em Ε. o coli refere-se à deslocamento da proteína através da membrana interior ao espaço periplásmico. A produção de Periplásmico fornece várias vantagens acima da produção citosólica. Por exemplo, a seqüência ácida do N-terminal amino do produto segregado pode ser idêntica ao produto genético natural depois da rachadura da seqüência de sinal de secreção por um sinal específico peptidase. Também, parece haver muito menos atividade de protease no periplasma do que no citoplasma. Além do mais, a purificação de proteína é mais simples devido a menos proteína de contaminação no periplasma. Outra vantagem é que as ligações bissulfeto corretas podem formar- se porque o periplasma fornece mais ambiente oxidativo do que o citoplasma. A proteína sobreexpressada em E. coli freqüentemente é encontrada em agregados insolúveis, assim chamados corpos de inclusão. Esses corpos de inclusão podem ser localizados no cytosol ou no periplasma; a recuperação da proteína biologicamente ativa desses corpos de inclusão requer um processo de denaturação/repregado. Muita proteína recombinante, inclusive a proteína terapêutica, é recuperada de corpos de inclusão. Alternativamente, como estará claro para a pessoa experimentada, classes recombinantes de bactérias que foram geneticamente modificadas para segregar uma proteína desejada, e especialmente um Nanocorpo ou um polipeptídio da invenção, pode ser usado.
Portanto, segundo uma modalidade de execução não- restritiva da invenção, o Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção é um Nanocorpo ou o polipeptídio que foi produzido intracelularmente e foi isolado da célula hospedeira, e especialmente de uma célula bacteriana ou de um corpo de inclusão em uma célula bacteriana. Segundo outra modalidade de execução não-restritiva da invenção, o Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção é um Nanocorpo ou o polipeptídio que foi produzido extracelularmente, e foi isolado do meio no qual a célula hospedeira é cultivada.
Alguns promotores preferidos, mas não-restritivos para uso com essas células hospedeiras incluem,
- para expressão em E. coli: promotor de Iac (e derivados disso como o promotor lacUV5); promotor de arabinose; promotor esquerda-(PL) e direita-(PR) de lambda fago; promotor do trp operon; híbrido lac/trp promotores (tac e trc); T7-promotor (mais especificamente que de 10 genes T7- fago) e outros promotores T-fago; promotor do Gene TnlO resistente à tetraciclina; as variantes projetadas dos promotores acima mencionados que incluem uma ou várias cópias de uma seqüência de operador reguladora estranha;
- para expressão em S. cerevisiae: constitutivo: ADHl (álcool dehidrogenase 1), ENO (enolase), CYCl (citocromo c iso-1), GAPDH (gliceraldeidos-3-fosfato dehidrogenase); PGKl (fosfoglicerato quinase), PYKl (piruvato quinase); regulado: GAL1,10,7 (galactose enzimas metabólicas), ADH2 (álcool dehidrogenase 2), PH05 (ácido fosfatase), CUPl (cobre metalotioneina); heterólogo: CaMV (promotor de 35 de vírus de mosaico de couve-flor);
- para expressão em Pichia pastoris: o promotor AOXl (álcool oxidase I)
- para expressão em células de mamíferos: cytomegalovirus humano (hCMV) primeiro realçador/promotor imediato; cytomegalovirus humano (hCMV) primeira variante de promotor imediata que contém duas seqüências de operador tetraciclina tal que o promotor pode ser regulado pelo Tet repressor; Promotor de timidina quinase (TK) do Vírus de Herpes Simplex; realçador/promotor de repetição terminal longa do Virus de Sarcoma de Rous (RSV LTR) ; promotor de ser humano, chimpanzé, rato ou camundongo de fator de alongamento 1 α (hEF-1 a); o primeiro promotor SV40; HIV-I promotor de repetição terminal longo; Promotor de D-actin; Alguns que os vetores preferidos, mas não-restritivos para uso com essas células hospedeiras incluem: - vetores para expressão em células de mamiferos: pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen) , pMClneo (Stratagene) , pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199) , pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) e 1ZD35 (ATCC 37565), bem como sistemas de expressão virais, como aqueles baseados em adenovirus; - vetores para expressão em células bacteriais: vetores de estimação (Novagen) e vetores pQE (Qiagen); vetores para expressão em levedura ou outras células fungosas: pYES2 (Invitrogen) e vetores de expressão Pichia (Invitrogen);
1 vetores para expressão em células de inseto: pBlueBacII
(Invitrogen) e outros vetores baculovirus - vetores para expressão em plantas ou células de planta:, por exemplo, os vetores baseados em virus de mosaico de couve-flor ou virus de mosaico de fumo, as classes convenientes do Agrobacterium, ou Vetores baseados em Ti- plasmideo.
Algumas seqüências secretoras preferidas, mas não-limitadas para uso com essas células hospedeiras incluem: - para uso em células bacterianas como E. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, e assim por diante; peptideo de sinal TAT, sinal de secreção de C-terminal hemolisina - para uso em levedura: prepro-seqüência de fator de a- acoplamento, fosfatase (phol), invertase (Sue), etc.; - para uso em células de mamiferos: sinal nativo em caso de que a proteína objetivo seja de origem eucariótica; peptideo de sinal V-J2-C de κ-cadeia de Ig murina; etc. As técnicas convenientes que para transformar uma célula hospedeira ou hospedeiro da invenção serão claras à pessoa experimentada e podem depender do organismo hospedeiro/ célula hospedeira desejado e os construtos genéticos a serem usados. A referência é novamente feita aos manuais e pedidos de patentes acima mencionados.
Depois da transformação, um passo para detectar e selecionar aquelas células hospedeiras ou organismos hospedeiros que foram com sucesso transformados com a seqüência de nucleotideos / construto genético da invenção pode ser executado. Isto pode ser, por exemplo, um passo de seleção baseado em um marcador selecionável presente no construto genético da invenção ou um passo que implica a detecção da seqüência aminoácida da invenção, p. ex. usando anticorpos específicos.
A célula hospedeira transformada (que pode estar na forma ou uma linha de célula estável) ou organismos hospedeiros (que pode ser na forma de uma linha ou classe mutante estável) formam novos aspectos da presente invenção.
Preferivelmente, essas células hospedeiras ou os organismos hospedeiros são tais que eles expressam, ou são (pelo menos) capazes de expressar (p. ex. em condições convenientes), uma seqüência aminoácida da invenção (e em caso de um organismo hospedeiro: em pelo menos uma célula, parte, tecido ou órgão disso). A invenção também inclui novas gerações, progênie e/ou descendência da célula hospedeira ou o organismo hospedeiro da invenção, que pode ser, por exemplo, obtida pela divisão de célula ou pela reprodução sexual ou assexual.
Produzir/obter a expressão das seqüências aminoácidas da invenção, a célula hospedeira transformada ou o organismo hospedeiro transformado podem ser geralmente guardados, mantidos e/ou cultivados em condições tais que a seqüência aminoácida (de sejada) da invenção é expressada/produzida. As condições convenientes serão claras à pessoa experimentada e dependerão normalmente do organismo hospedeiro/ célula hospedeira usado, bem como dos elementos reguladores que controlam a expressão da seqüência de nucleotideos (relevante) da invenção. Novamente, é feita referência aos manuais e pedidos de patentes acima mencionados nos parágrafos no construto genético da invenção.
Geralmente, as condições convenientes podem incluir o uso de um meio conveniente, a presença de uma fonte conveniente de nutrimentos alimentares e/ou convenientes, o uso de uma temperatura conveniente, e opcionalmente a presença de um fator de indução ou composto conveniente (p. ex. quando as seqüências de nucleotideos da invenção estão sob o controle de um promotor induzivel) ; todos os quais podem ser selecionados pela pessoa experimentada. Novamente, em tais condições, as seqüências aminoácidas da invenção podem ser expressas em uma maneira constitutiva, de uma maneira transiente, ou só quando apropriadamente induzido.
Também estará claro para a pessoa experimentada que a seqüência aminoácida da invenção pode ser (primeiro) gerada em uma forma imatura (como acima mencionado), que então pode ser submetida à modificação pós-translação, dependendo do organismo hospedeiro/ célula hospedeira usado. Também, a seqüência aminoácida da invenção pode ser glicosilada, novamente dependendo do organismo hospedeiro/ célula hospedeira usado.
A seqüência aminoácida da invenção então pode ser isolada do organismo hospedeiro/ célula hospedeira e/ou do meio no qual os referidos célula hospedeira ou organismo hospedeiro foram cultivados, usando isolação de proteína e/ou técnicas de purificação conhecidas por si, como cromatografia (preparativo) e/ou técnicas de eletroforese, técnicas de precipitação diferenciais, técnicas de afinidade (p. ex. usando uma seqüência aminoácida específica, separável fundida com a seqüência aminoácida da invenção) e/ou técnicas imunológicas preparativas (isto é, usando anticorpos contra a seqüência aminoácida a ser isolada).
Geralmente, para uso farmacêutico, os polipeptídios da invenção podem ser formulados como uma preparação farmacêutica que compreende pelo menos um polipeptidio da invenção e pelo menos uma transportadora farmaceuticamente aceitável, diluente ou excipiente e/ou adjuvante, e opcionalmente um ou vários polipeptidios novos farmaceuticamente ativos e/ou compostos. Por meio de exemplos não-restritivos, tal formulação pode estar em uma forma conveniente para administração oral, para administração parenteral (como por injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea ou infusão intravenosa), para administração tópica, para administração pela inalação, por um adesivo na pele, por um implante, por um supositório, etc... . Tais formas de administração convenientes - que pode ser sólido, semi-sólido ou liquido, dependendo da maneira de administração - bem como métodos e transportadoras para uso na preparação disso, serão claras à pessoa experimentada, e são além disso descritas a seguir.
Geralmente, os nanocorpos e os polipeptidios da invenção podem ser formulados e administrados em qualquer maneira conveniente conhecida por si, para que referência, por exemplo, é feita à fundamentos técnicos gerais citada anteriormente (e especialmente a WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865 e WO 04/041867) bem como aos manuais padrão, como Remington's Pharmaceuticals Sciences, 18o ed., Mack Publishing Co., USA (1990) ou Remington, Sciences and Practice of Pharmacy, 21a Ed., Lippincott Williams e Wilkins (2005).
Por exemplo, os nanocorpos e os polipeptidios da invenção podem ser formulados e administrados em qualquer maneira conhecida por si para anticorpos convencionais e fragmentos de anticorpo (inclusive ScFv e diabodies) e outra proteína farmaceuticamente ativa. Tais formulações e métodos para preparar o mesmo serão claros para a pessoa experimentada, e, por exemplo, incluirão preparações convenientes para administração parenteral (por exemplo intravenoso, intraperitoneal, subcutâneo, intramuscular, intraluminal, administração intra-arterial ou intratecal) ou para administração tópica (isto é, transdérmica ou intradérmica).
As preparações a para administração parenteral, por exemplo, podem ser soluções estéreis, suspensões, dispersões ou emulsões que são convenientes para a infusão ou a injeção. As transportadoras convenientes ou os diluentes para tais preparações, por exemplo, incluem, sem restrição, água estéril e buffers aquosos e soluções salinas armazenada em buffer por fosfato fisiológica, soluções de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank; óleos aquosos; glicerol; etanol; glicol como glicol de propileno ou bem como óleos minerais, óleos animais e óleos vegetais, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de feijão-soja, bem como misturas convenientes disso. Normalmente, soluções aquosas ou suspensões serão preferidas.
Os nanocorpos e os polipeptidios da invenção também podem ser administrados usando métodos de administração de terapia genética. Ver, p. ex.,Patente U.S. n. 5,399,346, que é incorporada por referência em sua totalidade. Usando um método de administração por terapia genética, as células primárias transfetadas com o gene que codifica um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção podem ser adicionalmente transfetadas com promotores específicos de tecido para visar órgãos específicos, tecido, enxertos, tumores, ou células e ser adicionalmente transfetadas com o sinal e as seqüências de estabilização para expressão localizada subcelularmente .
Portanto, os nanocorpos e os polipeptidios da invenção podem ser sistemicamente administrados, p. ex., oralmente, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável como um diluente inerte ou uma transportadora comestível assimilável. Eles podem ser incluídos em cápsulas de gelatina de capas duras ou suaves, podem ser compressos em pastilhas, ou incorporados diretamente com a comida da dieta do paciente. Para a administração terapêutica oral, os nanocorpos e os polipeptidios da invenção podem ser combinados com um ou vários excipientes e usados na forma de pastilhas ingeriveis, pastilhas bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolinhos delgados, e assim por diante. Tais composições e as preparações devem conter pelo menos 0,1% do Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção. A porcentagem das composições e preparações pode ser, naturalmente, variada e pode estar convenientemente entre aproximadamente 2 a aproximadamente 60% do peso de uma forma de dosagem de unidade dada. A quantidade do Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção em tais composições terapeuticamente úteis é tal que um nivel de dosagem eficaz será obtido.
As pastilhas, comprimidos, pílulas, cápsulas, e assim por diante também podem conter o seguinte: aglutinantes como goma tragacanth, acácia, amido de grão ou gelatina; excipientes como fosfato bicálcico; um agente que se desintegra como amido de grão, amido de batatas, algínico ácido e assim por diante; um lubrificante como magnésio estearato; e um agente de adoçamento como sacarose, fructose, lactose ou aspartame ou um agente de sabor como hortelã, o óleo de pirola, ou sabor de cereja pode ser acrescentado. Quando a forma de dosagem de unidade é uma cápsula, ela pode conter, além de materiais do tipo acima mencionado, um portador líquido, como um óleo vegetal ou um glicol de polietileno. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou modificar de outra maneira a forma física da forma de dosagem de unidade sólida. Por exemplo, as pastilhas, as pílulas, ou as cápsulas podem ser cobertas de gelatina, cera, goma-laca ou açúcar e assim por diante. Um xarope ou o elixir podem conter os nanocorpos e polipeptídios da invenção, sacarose ou fructose como um agente de adoçamento, metila e propilparabenos como preservantes, uma tintura e sabor como sabor de cereja ou cor de laranja. Naturalmente, qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem de unidade deve ser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não-tóxica nas quantidades empregadas. Além do mais, os nanocorpos e os polipeptidios da invenção podem ser incorporados em preparações e dispositivos de administração prolongada.
As preparações e as formulações a para administração oral também podem ser munidas de um revestimento entérico que permitirá que o construto da invenção resista o ambiente gástrico e a passagem nos intestinos. Mais geralmente, as preparações e as formulações para administração oral podem ser apropriadamente formuladas para administração em qualquer parte desejada do trato gastrintestinal. Além do mais, supositórios convenientes podem ser usados para administração no trato gastrintestinal.
Os nanocorpos e os polipeptidios da invenção também podem ser administrados intravenosamente ou intraperitonealmente por infusão ou injeção. As soluções dos nanocorpos e os polipeptidios da invenção ou os seus sais podem ser preparadas em água, opcionalmente misturada com um surfactante não-tóxico. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, glicol de polietileno liquido, triacetin, e misturas disso e em óleos. Em condições ordinárias de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microrganismos.
As formas de dosagem farmacêuticas convenientes para a injeção ou a infusão podem incluir soluções aquosas estéreis ou dispersões ou pó estéril que compreendem o ingrediente ativo que são adaptados para a preparação extemporânea de soluções injetáveis ou infusiveis estéreis ou dispersões, opcionalmente encapsuladas em lipossomas. Em todos os casos, a forma de dosagem última deve ser estéril, fluida e estável nas condições de fabricação e armazenamento. A transportadora liquida ou o veiculo podem ser um meio de dispersão solvente ou liquido, compreendendo, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, glicol de propileno, glicol de polietileno liquido, e assim por diante), óleos vegetais, ésteres gliceril não-tóxicos, e misturas convenientes disso. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula requerido em caso de dispersões ou pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser ocasionada por vários agentes antibacterianos e antifungosos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e assim por diante. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcar, buffers ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser ocasionada pelo uso nas composições de agentes que atrasam absorção, por exemplo, alumínio monostearato e gelatina.
As soluções injetáveis estéreis estão preparadas incorporando os nanocorpos e os polipeptídios da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários de outros ingredientes enumerados anteriormente, como requerido, seguido pela esterilização com filtro. Em caso do pó estéril para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais da preparação são a secagem à vácuo e a técnicas de secagem por congelamento, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer presente de ingrediente desejado adicional nas soluções anteriormente estéreis-filtradas.
Para administração tópica, os nanocorpos e os polipeptídios da invenção podem ser aplicados na forma pura, isto é, quando eles são líquidos. Contudo, será geralmente desejável administrá-los à pele como composições ou formulações, em combinação com uma transportadora dermatologicamente aceitável, que pode ser um sólido ou um líquido.
Os portadores sólidos úteis incluem sólidos finamente divididos como talco, barro, celulose microcristalina, sílica, alumina e assim por diante. Os portadores líquidos úteis incluem água, hidroálcalis ou glicol ou misturas de água-álcool/glicol, nas quais os nanocorpos e os polipeptídios da invenção podem ser dissolvidos ou dispersados a níveis eficazes, opcionalmente com a ajuda de surfactantes não-tóxicos. Adjuvantes como fragrâncias e agentes antimicrobiais adicionais podem ser acrescentados para otimizar as propriedades para um uso dado. As composições líquidas resultantes podem ser aplicadas de almofadas absorventes, usadas para impregnar bandagens e outro curativos, ou borrifados na área afetada que usa pulverizadores de aerossol ou tipo de bomba.
Os espessantes como polímero sintético, ácidos gordurosos, sais e ésteres de ácidos gordurosos, álcoois gordurosos, celuloses modificadas ou materiais minerais modificados também podem ser empregados com transportadoras líquidas para formar pastas para borrifar, géis, ungüentos, sabões, e assim por diante, para aplicação diretamente à pele do usuário.
Exemplos de composições dermatológicas úteis que podem ser usadas para entregar os nanocorpos e polipeptídios da invenção à pele são conhecidos na técnica; por exemplo, ver Jacquet et al. (U.S. Pat. N°. 4, 608, 392), Geria (U.S. Pat. N°. 4, 992, 478), Smith et al. (U.S. Pat. N°. 4,559, 157) e Wortzman (U.S. Pat. N°. 4,820,508).
As dosagens úteis dos nanocorpos e os polipeptídios da invenção podem ser determinadas comparando sua atividade in vitro, e na atividade in vivo em modelos animais. Os métodos para a extrapolação de dosagens eficazes em ratos, e outros animais, a seres humanos são conhecidos na técnica; por exemplo, ver U.S. Pat. N°. 4,938,949.
Geralmente, a concentração dos nanocorpos e os polipeptídios da invenção em uma composição líquida, como uma loção, será de aproximadamente 0,1-25 wt-%, preferivelmente de aproximadamente 0,5-10 wt-%. A concentração em uma composição semi-sólida ou sólida como um gel ou um pó será aproximadamente 0,1-5 wt-%, preferivelmente aproximadamente 0,5-2.5 wt-%.
A quantidade dos nanocorpos e os polipeptídios da invenção requeridos para uso no tratamento varia não só com o Nanocorpo ou polipeptidio determinado selecionado mas também com a via de administração, a natureza da condição que é tratada e a idade e a condição do paciente e será enfim à discrição do médico ou clinico atendente. Também a dosagem dos nanocorpos e os polipeptidios da invenção varia dependendo da célula objetivo, tumor, tecido, enxerto, ou órgão.
A dose desejada pode ser convenientemente apresentada em uma dose única ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como dois, três, quatro ou mais sub-doses por dia. A própria sub-dose pode ser além disso dividida, p. ex., em um número de administrações discretas livremente espaçadas; como múltiplas inalações de um insuflador ou pela aplicação de uma pluralidade de gotas no olho.
Um regime de administração pode incluir o tratamento de longo prazo, diário. Por "de longo prazo" se entende pelo menos duas semanas e preferivelmente, várias semanas, meses, ou anos da duração. As modificações necessárias nesta variedade de dosagem podem ser determinadas por uma habilidade ordinária na técnica usando só experimentação de rotina dada nos ensinamentos na presente. Ver Remington's Pharmaceuticals Sciences (Martin, E.W., editor 4), Mack Publishing Co, Easton, PA. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico individual no caso de qualquer complicação.
Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para a prevenção e/ou o tratamento de pelo menos cada uma das doenças ou desordens relativos a TNF conforme mencionado na presente, o referido método compreendendo a administração, a um sujeito na necessidade disso, de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um Nanocorpo da invenção, de um polipeptidio da invenção, e/ou de uma composição farmacêutica que compreende o mesmo.
No contexto da presente invenção, o termo "prevenção e/ou tratamento" não só compreende a prevenção e/ou o tratamento da doença, mas também geralmente compreendem a prevenção do ataque da doença, redução de velocidade ou reversão do progresso de doença, prevenção ou redução de velocidade do ataque de um ou vários sintomas associados com a doença, redução e/ou alivio de um ou vários sintomas associados com a doença, redução da gravidade e/ou a duração da doença e/ou de qualquer sintoma associado com isso e/ou prevenção de um novo aumento na gravidade da doença e/ou de qualquer sintoma associado com isso, prevenção, redução ou reversão de qualquer dano fisiológico causado pela doença, e geralmente qualquer ação farmacológica que é benéfica ao paciente que é tratado.
O sujeito a ser tratado pode ser qualquer animal de sangue quente, mas é especialmente um mamífero, e mais especialmente um ser humano. Como estará claro para a pessoa experimentada, o sujeito a ser tratado será especialmente uma pessoa que sofre de, ou em perigo de, as doenças e desordens mencionadas na presente.
A invenção se refere a um método para a prevenção e/ou o tratamento de pelo menos uma doença ou desordem que pode ser prevenida e/ou tratada administrando um Nanocorpo ou polipeptídio da invenção a um paciente, o referido método compreendendo a administração a um sujeito na necessidade disso, de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um Nanocorpo da invenção, de um polipeptídio da invenção, e/ou de uma composição farmacêutica que compreende o mesmo.
Mais especialmente, a invenção se refere a um método para a prevenção e/ou o tratamento de pelo menos uma doença ou desordem escolhida do grupo composto das doenças e desordens enumerados na presente, o referido método compreendendo a administração, a um sujeito na necessidade disso, de uma quantidade farmaceuticamente ativa de um Nanocorpo da invenção, de um polipeptídio da invenção, e/ou de uma composição farmacêutica que compreende o mesmo.
Em outra modalidade de execução, a invenção se refere a um método para a imunoterapia, e especialmente para imunoterapia passiva, cujo método compreende a administração, a um sujeito que sofre de ou está em perigo das doenças e desordens mencionados na presente, uma quantidade farmaceuticamente ativa de um Nanocorpo da invenção, de um polipeptídio da invenção, e/ou de uma composição farmacêutica que compreende o mesmo.
Nos acima mencionados métodos, os nanocorpos e/ou os polipeptidios da invenção e/ou as composições que compreendem o mesmo podem ser administrados em qualquer maneira conveniente, dependendo da formulação farmacêutica especifica ou composição a ser usada. Portanto, os nanocorpos e/ou os polipeptidios da invenção e/ou as composições que compreendem os mesmos, por exemplo, podem ser administrados oralmente, intraperitonealmente (p. ex. intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, ou via qualquer outra via de administração que acesse o trato gastrintestinal), intranasalmente, transdermicamente, topicamente, por meio de um supositório, pela inalação, novamente dependendo da formulação farmacêutica especifica ou composição a ser usada. 0 clinico será capaz de selecionar uma via conveniente de administração e uma formulação farmacêutica conveniente ou composição a ser usada em tal administração, dependendo da doença ou desordem a ser prevenida ou tratada e outro fatores bem conhecidos ao clinico.
O nanocorpos e/ou os polipeptidios da invenção e/ou as composições que compreendem o mesmo são administrados segundo um regime do tratamento que é conveniente para a prevenção e/ou o tratamento da doença ou desordem a ser prevenida ou tratada. 0 clinico será geralmente capaz de determinar um regime de tratamento conveniente, dependendo de fatores como a doença ou desordem a ser prevenida ou tratada, a gravidade da doença a ser tratada e/ou a gravidade dos sintomas disso, o Nanocorpo especifico ou o polipeptídio da invenção a ser usado, a via especifica de administração e formulação farmacêutica ou composição a ser usada, a idade, gênero, peso, dieta, a condição geral do paciente, e fatores semelhantes bem conhecidos ao clinico.
Geralmente, o regime de tratamento compreenderá a administração de um ou vários nanocorpos e/ou os polipeptidios da invenção, ou de uma ou várias composições que compreendem os mesmos, em uma ou várias quantidades farmaceuticamente eficazes ou doses. A quantidade(s) especifica ou as doses a serem administradas podem ser determinadas pelo clinico, novamente baseado nos fatores citados anteriormente.
Geralmente, para a prevenção e/ou o tratamento das doenças e desordens mencionadas na presente e dependendo da doença especifica ou desordem a ser tratada, a potência do Nanocorpo especifico e o polipeptidio da invenção a ser usado, a via especifica de administração e a formulação farmacêutica especifica ou composição usada, os nanocorpos e polipeptidios da invenção serão geralmente administrados em uma quantidade entre 1 grama e 0,01 microgramas por peso de corpo de quilograma por dia, preferivelmente entre 0,1 gramas e 0,1 microgramas por peso de corpo de quilograma por dia, como aproximadamente 1, 10, 100 ou 1000 microgramas por peso de corpo de quilograma por dia, qualquer continuamente (p. ex. pela infusão), como uma dose diária única ou como múltiplas doses divididas durante o dia. O clinico será geralmente capaz de determinar uma dose diária conveniente, dependendo dos fatores mencionados na presente. Também ficará claro que em casos específicos, o clínico pode decidir desviar-se dessas quantidades, por exemplo, com base nos fatores citados anteriormente e o seu juízo de perito. Geralmente, um pouco de orientação nas quantidades a ser administradas pode ser obtida das quantidades normalmente administradas para anticorpos convencionais comparáveis ou fragmentos de anticorpo contra o mesmo objetivo administrado via essencialmente a mesma rota, considerando contudo diferenças em afinidade/avidez, eficácia, biodistribuição, meia-vida e fatores semelhantes bem conhecidos à pessoa experimentada.
Normalmente, no acima mencionado método, um Nanocorpo único ou o polipeptidio da invenção serão usados. É contudo dentro dos limites da invenção para usar dois ou mais nanocorpos e/ou polipeptidios da invenção em combinação.
Os nanocorpos e os polipeptidios da invenção também podem ser usados em combinação com iam ou vários compostos ou princípios novos farmaceuticamente ativos, isto é, como um regime de tratamento combinado, que pode ou pode não levar a um efeito sinergistico. Novamente, o clínico será capaz de selecionar tais novos compostos ou princípios, bem como um regime de tratamento combinado conveniente, baseado nos fatores citados anteriormente e o seu juízo de perito.
Especialmente, os nanocorpos e os polipeptidios da invenção podem ser usados em combinação com outros compostos farmaceuticamente ativos ou princípios que são ou podem ser usados para a prevenção e/ou o tratamento das doenças e desordens citadas na presente, em conseqüência do qual um efeito sinergistico pode ou não ser obtido. Os exemplos de tais compostos e princípios, bem como vias, métodos e formulações farmacêuticas ou composições que para os administram serão claros ao clínico.
Quando duas ou mais substâncias ou princípios devem ser usados como parte de um regime de tratamento combinado, eles podem ser administrados via a mesma rota de administração ou via rotas diferentes da administração, em essencialmente o mesmo tempo ou em tempos diferentes (p. ex. essencialmente simultaneamente, consecutivamente, ou segundo um regime alternante). Quando as substâncias ou os princípios são administrados para ser simultaneamente via a mesma rota de administração, eles podem ser administrados como formulações farmacêuticas diferentes ou composições ou parte de uma formulação farmacêutica combinada ou composição, como estará claro para a pessoa experimentada.
Também, quando duas ou mais substâncias ativas ou princípios devem ser usados como parte de um regime de tratamento combinado, cada uma das substâncias ou princípios pode ser administrada na mesma quantidade e segundo o mesmo regime que usado quando o composto ou o princípio são usados sozinhos, e tal uso combinado pode ou não levar a um efeito sinergístico. Contudo, quando o uso combinado de duas ou mais substâncias ativas ou princípios leva a um efeito sinergístico, também pode ser possível reduzir a quantidade de um, mais ou todas das substâncias ou princípios a ser administrados, ainda realizando a ação terapêutica desejada. Isto, por exemplo, pode ser útil para a evitação, a limitação ou a redução de qualquer efeito colateral não desejado que se associa com o uso de uma ou várias das substâncias ou princípios quando eles são usados nas suas quantidades habituais, ainda obtendo o efeito farmacêutico ou terapêutico desejado.
A eficácia do regime de tratamento usado segundo a invenção pode ser determinada e/ou seguida em qualquer maneira conhecida por si para a doença ou a desordem implicada, como serão claras ao clínico. O clínico também será capaz, onde apropriado e ou uma base de caso-por-caso, de mudar ou modificar um determinado regime de tratamento, para realizar o efeito terapêutico desejado, para evitar, para limitar ou reduzir efeitos colaterais não desejados, e/ou realizar um equilíbrio apropriado entre a realização do efeito terapêutico desejado de um lado e evitação, limitação ou redução dos efeitos colaterais indesejados de outro lado.
Geralmente, o regime de tratamento será seguido até que o efeito terapêutico desejado seja realizado e/ou contanto que o efeito terapêutico desejado seja mantido. Novamente, isto pode ser determinado pelo clínico.
Portanto, em um novo aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que contém pelo menos um nanocorpo da invenção ou pelo menos um polipeptídio da invenção e pelo menos uma transportadora conveniente (isto é, uma transportadora conveniente para uso veterinário), e opcionalmente uma ou várias novas substâncias ativas.
A invenção também se relaciona ao uso de um Nanocorpo da invenção e/ou de um polipeptidio da invenção na preparação de uma composição farmacêutica, especialmente na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento (inclusive mas não se limitando ao alivio de pelo menos um sintoma) de uma doença ou desordem mediada pelo TNF-alfa e/ou associado com o TNF-alfa (por exemplo associado com uma atividade anormal do TNF-alfa, níveis anormais da expressão TNF-alfa, anormal da sensibilidade TNF-alfa e/ou resposta anormal à TNF-alfa, ou de um dos fenômenos biológicos associados com o TNF-alfa), como uma das doenças ou desordens acima mencionados.
A invenção também se refere a um método para prevenção e/ou tratamento (inclusive mas não se limitando ao alívio de pelo menos um sintoma) de uma doença ou desordem mediada pelo TNF-alfa e/ou associado com o TNF-alfa (por exemplo associado com uma atividade anormal do TNF-alfa, níveis anormais da expressão TNF-alfa, sensibilidade anormal TNF- alfa e/ou resposta anormal à TNF-alfa, ou de um dos fenômenos biológicos associados com o TNF-alfa), como uma das doenças ou desordens acima mencionado, cujo método compreende a administração a um sujeito na necessidade disso uma quantidade terapeuticamente ativa de um Nanocorpo da invenção, do polipeptidio da invenção, e/ou de uma composição farmacêutica conforme descrito acima.
A presente invenção fornece polipeptídios que compreendem um ou vários nanobodies dirigidos em direção ao fator Alfa de Necrose Tumoral (TNF-alfa). A presente invenção além disso refere-se ao seu uso em diagnóstico e terapia. Tais anticorpos podem ter uma seqüência de armação com a alta homologia às seqüências de armação humanas. As composições que compreendem anticorpos ao fator Alfa de Necrose Tumoral (TNF-alfa) sozinha ou em combinação com outras fármacos são descritas.
Acredita-se que o fator Alfa de Necrose Tumoral (TNF- alfa) desempenha um papel importante em várias desordens, por exemplo, em desordens inflamatórias como artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa e esclerose múltipla. Tanto o TNF-alfa como os receptores (CD120a, CD120b) foram estudados em grande detalhe. A TNF-alfa na sua forma bioativa é um trimero e a ranhura formada confinando subunidades é importante para a interação de citoquina- receptor. Várias estratégias de antagonizar a ação da citoquina foram desenvolvidas e são atualmente usadas para tratar vários estados de doença.
Um inibidor TNF-alfa que tem a especificidade suficiente e a seletividade à TNF-alfa pode ser um composto farmacêutico profilático ou terapêutico eficiente para prevenir ou tratar desordens onde o TNF-alfa foi implicada como agente causativo. Os métodos de tratar choque tóxico (EP 486526), regressão de tumor, inibição de citotoxicidade (US 6448380, US 6451983, US 6498237), doença autoimune como RA e doença de Crohn (EP 663836, US 5672347, US 5656272), enxerto contra a reação de hospedeira (US 5672347), meningite bacteriana (EP 585705) por meio de um anticorpo à TNF-alfa foram descritos.
Ainda nenhum dos fármacos logo disponíveis é completamente eficaz para o tratamento da doença autoimune, e mais é limitada pela toxicidade severa. Além do mais, é extremamente difícil e um longo processo para desenvolver uma nova entidade química (NCE) com potência suficiente e seletividade a tal seqüência de objetivo. A terapêutica à base de Anticorpo por outro lado tem o potencial significativo como fármacos porque eles têm a especificidade seleta ao seu objetivo e uma toxicidade inerente baixa. Além do mais, o tempo de desenvolvimento pode ser reduzido consideravelmente quando em comparação com o desenvolvimento de novas entidades químicas (NCE's). Contudo, os anticorpos convencionais são difíceis de levantar contra a proteína multiméricas onde o domínio obrigatório de receptor do ligando é embutido em uma ranhura, como é o caso com o TNF- alfa. Os anticorpos de cadeias pesadas descritos na invenção que são derivados de Camelidae, são conhecidos ter a propensão obrigatória de cavidade (W097/4 98 05; Lauwereys e al, EMBO J. 17, 5312, 1998)). Por isso, tais anticorpos de cadeias pesadas são inerentemente ajustados para ligar ao receptor domínios obrigatórios de tais ligandos como TNF. Além do mais, conhece-se que tais anticorpos são estáveis por cima de períodos de tempo longos, por isso aumentando o seu prazo da validade (Perez e al, Biochemistry, 40, 74, 2001) . Além disso, tais fragmentos de anticorpo de cadeias pesadas podem ser produzidos 'em massa' em fermentadores utilização de sistemas de expressão baratos em comparação com a fermentação de cultura de célula de mamífero, como levedura ou outros microrganismos (EP 0 698097).
O uso de anticorpos derivados de fontes como rato, ovelhas, cabra, coelho etc., e derivados humanizados disso como um tratamento para condições que requerem que uma modulação da inflamação é problemático por várias razões. Os anticorpos tradicionais não são estáveis na temperatura ambiente, e têm de ser refrigerados para preparação e armazenamento, requerendo equipamento de laboratório refrigerado necessário, armazenamento e transporte, que aumentam o tempo e a despesa. A refrigeração não é às vezes fativei em países em desenvolvimento. Além disso, a fabricação ou a produção em escala modesta de ditos anticorpos são caras porque os sistemas celulares mamíferos necessários para a expressão de anticorpos intactos e ativos requer altos níveis do suporte quanto a tempo e equipamento, e os rendimentos são muito baixos. Além disso o grande tamanho de anticorpos convencionais, restringiria a penetração de tecido, por exemplo, no sítio do tecido inflamado. Além disso, os anticorpos tradicionais têm uma atividade obrigatória que depende de pH, e daqui é imprópria para uso em ambientes fora da variedade de pH fisiológica habitual como, por exemplo, no tratamento de hemorragia gástrica, cirurgia gástrica. Além disso, os anticorpos tradicionais são movediços em pH baixo ou alto e daqui não convenientes para administração oral. Contudo, foi demonstrado que os anticorpos camelidae resistem condições ásperas, como pH extremo, reagentes desnaturantes e altas temperaturas (Dumoulin e al, Protein Science 11, 500, 2002), fazendo assim eles convenientes para administração pela via oral. Além disso, os anticorpos tradicionais têm uma atividade obrigatória, que depende da temperatura, e daqui é imprópria para uso em ensaios ou conjuntos executados em temperaturas fora de variedades biologicamente de temperatura ativas (p. ex. 37 ± 20°C).
A terapêutica de polipeptidio e na determinada terapêutica à base de anticorpo tem o potencial significativo como fármacos porque eles têm a especificidade seleta ao seu objetivo e uma toxicidade inerente baixa. Contudo, é conhecido pelo destinatário experimentado que um anticorpo que foi obtido para um objetivo terapeuticamente útil requer a modificação adicional para prepará-lo para terapia humana, para evitar uma reação imunológica não desejada em um indivíduo humano com a administração a ele. O processo de modificação é comumente denominado "humanização". É conhecido pelo técnico experimentado que os anticorpos levantados em espécies, outras do que em seres humanos, requererem de humanização para dar o anticorpo terapeuticamente útil em seres humanos ((1) enxerto de CDR: Laboratórios de Desenho de Proteína: US 6180370, US 5693761; Genentech US 6054297; Celltech: 460167, EP 626390, US 5859205; (2) Embutimento: Xoma: US 5869619, US 5766886, US 5821123) . Há uma necessidade de um método para produzir anticorpos que evite o requisito de humanização substancial, ou que completamente obvie a necessidade de humanização. Há uma necessidade de uma nova classe de anticorpos que definam regiões de armação ou resíduos aminoácidos e que possam ser administrados a um sujeito humano sem o requisito de humanização substancial, ou a necessidade de humanização em absoluto. Outra desvantagem importante de anticorpos convencionais consiste em que eles são moléculas complexas, grandes e por isso relativamente instáveis, e eles são sensíveis ao esgotamento por proteases. Isto significa que os fármacos de anticorpo convencionais não podem ser administrados oralmente, sublingualmente, topicamente, nasalmente, vaginalmente, retalmente ou pela inalação porque eles não são resistentes ao pH baixo nesses sítios, a ação de proteases nesses sítios e no sangue e/ou por causa do seu grande tamanho. Eles têm de ser administrados pela injeção (intravenosamente, subcutaneamente, etc.) superar alguns desses problemas. A administração pela injeção requer o treinamento de especialista para usar uma seringa hipodérmica ou a agulha corretamente e seguramente. Ele além disso requer o equipamento estéril, uma formulação líquida do polipeptídio terapêutico, a embalagem de frasco do referido polipeptídio em uma forma estéril e estável e, do sujeito, um sítio conveniente para a entrada da agulha. Além disso, os sujeitos comumente experimentam estresse físico e psicológico antes de e para receber uma injeção. Por isso, há necessidade de um método de administração de polipeptídios terapêuticos que evite a necessidade de injeção que não é só a economia de custo/tempo, mas que também seria mais conveniente e mais cômoda para o sujeito.
A terapêutica Baseada em Nanocorpo tem o potencial significativo como fármacos porque eles têm a especificidade seleta ao seu objetivo e uma toxicidade inerente baixa. Contudo, a melhoria ulterior de sua afinidade intrínseca e funcional pode levar a muitos benefícios para um paciente como dose reduzida de terapia terapêutica, mais rápida, e efeitos colaterais reduzidos.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um anti-TNF-alfa nanobody, que o Nanocorpo é preferivelmente conforme adicionalmente definido anteriormente.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um polipeptídio anti-TNF-alfa que compreende pelo menos um anti-TNF-alfa nanobody, cujo polipeptidio é preferivelmente conforme adicionalmente definido anteriormente.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa como descrito acima compreendendo adicionalmente pelo menos um nanobody dirigido contra uma proteína de soro.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima em que os referidos proteína de soro é alguma dentre albumina de soro, imunoglobulinas de soro, proteína ligada com tiroxina, transferrina, ou fibrinogênio.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa como descrito acima compreende adicionalmente pelo menos um nanobody selecionado do grupo composto de anti-IFN-gamma nanobody, anti-TNF-alfa receptor nanobody e receptor anti-IFN-gamma nanobody.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima, em que o número de nanocorpos dirigidos contra o TNF-alfa é pelo menos dois.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima, em que pelo menos um nanobody é um Camelidae humanizado VHHs.
Outra modalidade de execução da presente invenção é uma composição que compreende um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima e pelo menos um nanobody do grupo composto de anti-IFN-gamma nanobody, anti-TNF-alfa receptor nanobody e receptor anti-IFN-gamma nanobody, para administração simultânea, separada ou seqüente a um sujeito.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente, ou uma composição conforme descrito acima, em que o referido Nanocorpo é uma seqüência homóloga, uma porção funcional, ou uma porção funcional de uma seqüência homóloga de nanobody de o comprimento completo.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente, ou uma composição conforme descrito acima, em que o polipeptidio anti-TNF-alfa é uma seqüência homóloga, uma porção funcional, ou uma porção funcional de uma seqüência homóloga do anti-TNF-alfa polipeptidio de comprimento completo.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente, ou uma composição conforme descrito acima em que pelo menos um nanobody é um Camelidae VHH.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um ácido nucléico que codifica um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um método de identificar um agente que modula a ligação de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima, ao fator Alfa de Necrose Tumoral compreendendo as etapas de:
(a) contatar com um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima com um objetivo que é o fator Alfa de Necrose
Tumoral, na presença e a ausência de um modulador candidato em condições que permitem a ligação entre os referidos polipeptidio e objetivo, e
(b) medir a ligação entre o polipeptidio e o objetivo do passo (a) , em que uma redução na ligação na presença do referido modulador candidato, quanto à ligação na ausência do referido modulador candidato identificado o referido modulador candidato como um agente que modula a ligação de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima e Fator Alfa de Necrose Tumoral.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um método de identificar um agente que modula as desordens mediadas por fator alfa de Necrose Tumoral através da ligação de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima ao Fator Alfa de Necrose Tumoral compreendendo: (a) contatar com um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima com um objetivo que é o fator Alfa de Necrose Tumoral, na presença e a ausência de um modulador candidato em condições que permitem a ligação entre os referidos polipeptidio e objetivo, e
(b) medir a ligação entre o polipeptidio e o objetivo do passo (a) , em que uma redução na ligação na presença do referido modulador candidato, quanto à ligação na ausência do referido modulador candidato identificado o referido modulador candidato como um agente que modula as desordens mediadas por Fator alfa de Necrose Tumoral.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um método de identificar um agente que modula a ligação da fator Alfa de Necrose Tumoral ao seu receptor através da ligação de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima ao Fator Alfa de Necrose Tumoral compreendendo: (a) contatar com um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima com um objetivo que é o fator Alfa de Necrose Tumoral, na presença e a ausência de um modulador candidato em condições que permitem a ligação entre os referidos polipeptidio e objetivo, e (b) medir a ligação entre o polipeptidio e o objetivo do passo (a) , em que uma redução na ligação na presença do referido modulador candidato, quanto à ligação na ausência do referido modulador candidato identificado o referido modulador candidato como um agente que modula a ligação da Fator Alfa de Necrose Tumoral ao seu receptor.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um conjunto para proteger agentes que modulam as desordens mediadas por fator alfa de Necrose Tumoral que compreendem um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima e Fator Alfa de Necrose Tumoral.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um agente desconhecido que modula a ligação de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima ao fator Alfa de Necrose Tumoral, identificada segundo o método conforme descrito acima.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um agente desconhecido que modula a Necrose de Tumor desordens Mediadas por fator alfa, identificadas segundo os métodos conforme descrito acima.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um agente desconhecido conforme descrito acima em que as referidas desordens são uma ou várias dentre inflamação, artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome inflamatória do intestino e esclerose múltipla.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente, ou iam ácido nucléico conforme descrito anteriormente, ou uma composição conforme descrito anteriormente, ou um agente como descrito acima de tratar para e/ou prevenir e/ou alivio de desordens que se relacionam com processos inflamatórios.
Outra modalidade de execução da presente invenção está no uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou um ácido nucléico conforme descrito anteriormente, ou uma composição conforme descrito anteriormente, ou um agente como descrito acima para a preparação de um medicamento para tratar e/ou impedir e/ou aliviar desordens que se relacionam com reações inflamatórias.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para tratar e/ou impedir e/ou aliviar desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção que é capaz de passar através do ambiente gástrico sem que a substância seja inativada.
Outra modalidade de execução da presente invenção está no uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção que é capaz de passar através do ambiente gástrico sem que a substância seja inativada.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para tratar e/ou impedir e/ou aliviar desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado ao trato vaginal e/ou retal.
Outra modalidade de execução da presente invenção está no uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado ao trato vaginal e/ou retal.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para tratar e/ou impedir e/ou aliviar desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado ao nariz, trato respiratório superior e/ou pulmão.
Outra modalidade de execução da presente invenção está no uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado ao nariz, trato respiratório superior e/ou pulmão.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para tratar e/ou impedir e/ou aliviar desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado à mucosa intestinal, em que os referidos desordens aumentam a permeabilidade da mucosa intestinal.
Outra modalidade de execução da presente invenção está no uso de um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção ministrado à mucosa intestinal, em que os referidos desordens aumentam a permeabilidade da mucosa intestinal.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para tratar e/ou impedir e/ou aliviar desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar através dos tecidos abaixo da língua com efetividade.
Outra modalidade de execução da presente invenção está no uso de um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar através dos tecidos abaixo da língua com efetividade.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para tratar e/ou impedir e/ou aliviar desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar através da pele efetivamente.
Outra modalidade de execução da presente invenção está no uso de um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente ou uma composição conforme descrito acima, para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar através da pele efetivamente.
Outra modalidade de execução da presente invenção está um método conforme descrito anteriormente, um conjunto conforme descrito anteriormente, um ácido nucléico ou agente conforme descrito acima, uso de um ácido nucléico ou agente conforme descrito anteriormente, uma composição conforme descrito anteriormente, o uso de uma composição conforme descrito anteriormente, um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito anteriormente, o uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima em que as referidas desordens são alguma dentre inflamação, artrite reumatóide, COPD, asma, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome inflamatória do intestino, esclerose múltipla, doença de Addison, hepatite Autoimune, parotite Autoimune, Diabete Tipo I, Epididimite, Glomerulonefrite, doença de Graves, sindrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia Hemolitica, lupus eritematoso sistêmico, infertilidade Masculina, Esclerose múltipla, Miastenia Gravis, Pênfigo, Psoriase, febre Reumática, artrite Reumatóide, Sarcoidose, Escleroderma, sindrome de Sjogren, Espondiloartropatias, Tiroidite, e Vasculite.
Outra modalidade de execução da presente invenção é uma composição que compreende um ácido nucléico ou agente conforme descrito anteriormente, um polipeptidio anti-TNF- alfa conforme descrito anteriormente, ou uma composição conforme descrito acima, e um veiculo farmacêutico conveniente.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um método de diagnosticar uma desordem caracterizada pela disfunção de Fator Alfa compreendendo de Necrose Tumoral: (a) contatar uma amostra com um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima, (b) detecção de ligação do referido polipeptidio à referida amostra, e
(c) comparação da ligação detectada no passo (b) com um padrão, em que uma diferença na ligação quanto à referida amostra é o diagnóstico de uma desordem caracterizada pela disfunção da Fator Alfa de Necrose Tumoral.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um conjunto para análise de uma desordem conforme citado anteriormente, usando um método conforme descrito acima.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um conjunto para análise de uma desordem conforme citado acima da compreensão de um polipeptidio anti-TNF-alfa isolado conforme descrito acima.
Outra modalidade de execução da presente invenção é o uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa como descrito acima para a purificação do referido Fator Alfa de Necrose Tumoral.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa como descrito acima de inibir a interação entre o fator Alfa de Necrose Tumoral e um ou vários receptores de Fator Alfa de Necrose Tumoral.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um método para produzir um polipeptidio anti-TNF-alfa como descrito acima compreendendo as etapas de:
(a) obtenção de ADN de trançado duplo que codifica um Camelidae VHH dirigido ao fator Alfa de Necrose Tumoral7
(b) clonagem e expressão do ADN selecionado no passo (b). Outra modalidade de execução da presente invenção é um método de produzir um polipeptidio anti-TNF-alfa como descrito acima compreendendo:
(a) cultivo de células hospedeiras compreendendo ácido nucléico capaz de codificar um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima, em condições que permitem a expressão do polipeptidio, e,
(b) recuperação do polipeptidio produzido da cultura.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um método conforme descrito acima, em que as referidas células hospedeiras são bacterianas ou levedura.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um conjunto para análise de alguma dentre inflamação, artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome inflamatória do intestino ou esclerose múltipla que compreende um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito acima.
Os VHHs, segundo a invenção presente, e como conhecido ao destinatário experimentado são domínios variáveis de cadeias pesadas derivados de imunoglobulinas naturalmente destituídas de cadeias leves como os derivados de Camelidae conforme descrito em WO 94/04678 (e mencionada doravante como domínios de VHH ou nanobodies). As moléculas de VHH são cerca de IOx menores do que moléculas IgG. Eles são polipeptídios únicos e muito estáveis, resistindo pH e condições de temperatura extremas. Além disso, eles são resistentes à ação de proteases que não é o caso anticorpos convencionais. Além disso, a expressão in vitro de VHHs produz alto rendimento, propriamente VHHs funcional dobrado. Além do mais, os anticorpos gerados em Camelídeos reconhecerão epitopes outros que os reconhecidos por anticorpos gerados in vitro através do uso de bibliotecas de anticorpo ou via a imunização de mamíferos outros do que Camelídeos (WO 9749805). Como tal, anti-TNF-alfa VHH's podem interagir mais eficientemente com o TNF-alfa do que anticorpos convencionais, conseqüentemente bloqueando a sua interação com o receptor TNF-alfa mais eficientemente.
A TNF-alfa é também um fragmento do TNF-alfa, capaz de eliciar uma resposta imune. A TNF-alfa é também um fragmento do TNF-alfa, capaz da ligação a um nanobody levantado contra o TNF-alfa de comprimento completo.
Um nanobody dirigido contro TNF-alfa significa nanobody que é capaz da ligação à TNF-alfa com uma afinidade de melhor do que IO-6 M.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um polipeptídio anti-TNF, em que os nanobodies compreendem CamelidaeVHH dirigidos contra o TNF-alfa.
Um ou vários nanobodies do polipeptídio anti-TNF que são dirigidos contra umo TNF-alfa podem ser da mesma seqüência. Alternativamente eles podem não ter todos a mesma seqüência. É dentro dos limites da invenção que um polipeptídio anti-TNF compreende anti-TNF-alfa nanobodies que não compartilham todos a mesma seqüência, mas que são dirigidos contra o mesmo objetivo, um ou vários antigenos disso.
A presente invenção além disso refere-se a um polipeptidio anti-TNF-alfa, em que o referido Nanocorpo é um VHH dirigido contra o TNF-alfa, em que o VHH pertence a uma classe que tem seqüências humanóides. A classe é caracterizada em que os VHHs transportam um aminoácido do grupo composto de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofan, metionina, serina, treonina, asparagina, ou glutamina na posição 45, como, por exemplo, L45 e um triptofan na posição 103, segundo a numeração de Kabat. Outra classe humanóide de Camelidae nanobodies foi descrita em WO03035694 e contém resíduos hidrofóbicos FR2 tipicamente encontrados em anticorpos convencionais de origem humana ou de outra espécie, mas compensando esta perda em hidrofilicidade pelo resíduo de arginina carregado na posição 103 que substitui o presente de resíduo triptofan conservado em VH de anticorpos de cadeia dupla. Como tais, os peptídeos que pertencem a essas duas classes mostram uma alta homologia de seqüência aminoácida a regiões de armação VH humanas e os referidos peptídeos poderiam ser administrados a um ser humano diretamente sem expectativa de uma resposta imune não desejada disto, e sem a carga de nova humanização. A invenção também se refere aos ácidos nucléicos capazes da codificação dos referidos polipeptídios.
Algum dos VHHs como usado pela invenção pode ser da classe tradicional ou das classes de anticorpos Camelidae parecidos a um ser humano. Os ditos anticorpos podem ser dirigidos contra o TNF-alfa inteira ou um fragmento disso, ou um fragmento de uma seqüência homóloga disso. Esses polipeptídios incluem os anticorpos Camelidae de comprimento completo, a saber Fc e domínios VHH, as versões quiméricas da cadeia pesada anticorpos de Camelidae com um domínio de ser humano Fc ou VHH's por eles ou fragmentos derivados. O VHH1S de albumina de anti-soro pode interagir de um modo mais eficiente com a albumina de soro do que anticorpos convencionais que é conhecida por ser uma proteína transportadora. Como uma proteína de transportadora alguns epitopes da albumina de soro podem ser inacessíveis por proteínas ligadas, peptídeos e pequenos compostos químicos. Como os VHH'S são conhecidos por ligar em epitopes 'excepcionais' ou não-convencionais como cavidades (WO 97/49805), a afinidade de tal VHH's à albumina circulante pode ser aumentada.
A presente invenção também se relaciona ao achado que iam polipeptídio anti-TNF conforme descrito na presente que além disso compreende um ou vários nanobodies dirigidos contra uma ou várias proteína de soro de um sujeito, surpreendentemente prolongando significativamente a meia- vida na circulação do referido sujeito comparado com a meia- vida do anti-TNF-alfa nanobody quando não parte dos referidos construtos. Além disso, os acima citados polipeptídios demonstraram mostrar as mesmas propriedades favoráveis de nanobodies como alta estabilidade que permanecem intactos em ratos, resistência de pH extrema, alta estabilidade de temperatura e alta afinidade de obj etivo.
A proteína de soro pode ser qualquer proteína conveniente encontrada no soro do sujeito. Em um aspecto da invenção, a proteína de soro é albumina de soro, imunoglobulinas de soro, proteína ligada com tiroxina, transferrina, ou fibrinogênio. Dependendo do uso desejado como a meia-vida requerida para tratamento eficaz e/ou compartimentalização do antígeno de objetivo, o VHH-parceiro pode ser dirigido a uma das acima mencionadas proteína de soro.
Segundo um aspecto específico, mas não-restritivo da invenção, o Nanocorpo contra uma albumina de soro humano compõe-se de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), em que: (iv) O CDRl é uma seqüência aminoácida escolhida do grupo composto de :
SFGMS [SEQ ID n. 36]
LNLMG [SEQ ID η. 37]
INLLG [SEQ ID n. 38]
NYWMY; [SEQ ID n. 39]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências
aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as acima mencionadas seqüências aminoácidas; e em que:
(ν) 0 CDR2 é uma seqüência aminoácida escolhida do grupo composto de :
SISGSGSDTLYADSVKG [SEQ ID n. 40]
TITVGDSTNYADSVKG [SEQ ID n. 41]
TITVGDSTSYADSVKG [SEQ ID η. 42]
SINGRGDDTRYADSVKG [SEQ ID n. 43]
AISADSSTKNYADSVKG [SEQ ID n. 44]
AISADSSDKRYADSVKG [SEQ ID n. 45]
RISTGGGYSYYADSVKG [SEQ ID η. 4 6]
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais
preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas; em que (1) qualquer substituição aminoácida é
preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou (2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as acima mencionadas seqüências aminoácidas;
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as acima mencionadas seqüências aminoácidas;
e em que:
(vi) O CDR3 é uma seqüência aminoácida escolhida do grupo composto de :
DREAQVDTLDFDY [SEQ ID η. 47]
ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas; em que
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as acima mencionadas seqüências aminoácidas; e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as acima mencionadas seqüências aminoácidas; ou do grupo composto de :
GGSLSR [SEQ ID n. 48]
RRTWHSEL [SEQ ID n. 49]
GRSVSRS [SEQ ID n. 50]
GRGSP [SEQ ID n. 51]
e/ou do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 "diferença(s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com uma das seqüências aminoácidas acima mencionadas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as acima mencionadas seqüências aminoácidas.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um Nanocorpo contra uma albumina de soro humano, que se compõem de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDRl a CDR3 respectivamente), que é escolhido do grupo composto de anticorpos de domínio e/ou anticorpos de domínio únicos com aquela das combinações seguintes de CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente:
10 CDRl: SFGMS;CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG;CDR3: GGSLSR; 11 CDRl: LNLMG;CDR2: TITVGDSTNYADSVKG;CDR3: RRTWHSEL; 12 CDRl: INLLG;CDR2: TITVGDSTSYADSVKG;CDR3: RRTWHSEL; 13 CDRl: S FGMS;CDR2: SINGRGDDTRYADSVKG;CDR3 GRSVSRS; 14 CDRl: S FGMS;CDR2: AISADS S DKRYADSVKG;CDR3 GRGSP; 15 CDRl: S FGMS;CDR2: AISADS S DKRYADSVKG;CDR3 GRGSP; 16 CDRl: NYWMY;CDR2: RISTGGGYSYYADSVKG;CDR3: DREAQVDTLDFDY.
Nos nanocorpos da invenção que compreendem as combinações do CDR'S acima mencionado, cada CDR pode ser substituído por um CDR escolhido do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% (conforme definido na presente) com o CDR'S mencionado; em que
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as acima mencionadas seqüências aminoácidas;
e/ou escolhido do grupo composto de seqüências aminoácidas que têm 3, 2 ou só 1 (como indicado no parágrafo precedente) "diferença (s) aminoácida(s)" (conforme definido na presente) com o CDR mencionado(s) um do acima mencionado seqüências aminoácidas, em que:
(1) qualquer substituição aminoácida é preferivelmente uma substituição aminoácida conservadora (conforme definido na presente); e/ou
(2) a referida seqüência aminoácida preferivelmente só contém substituições aminoácidas, e nenhuma eliminação ou inserções aminoácidas, em comparação com as acima mencionadas seqüências aminoácidas.
Contudo, dos nanocorpos da invenção que compreendem as combinações do CDR'S acima mencionado, nanocorpos que compreendem um ou vários do CDR1S enumerado anteriormente são em particular preferidos; os nanocorpos compreensão de dois ou mais do CDR'S enumerado anteriormente são mais em particular preferidos; e os nanocorpos compreensão de três do CDR1S enumerado anteriormente são mais em particular preferidos.
Nesses nanocorpos contra uma albumina de soro humano, as regiões de Armação FRl a FR4 são preferivelmente como definidos mais acima para os nanocorpos da invenção.
nanocorpos em particular preferidos contra uma albumina de soro humano são escolhidos do grupo composto de SEQ ID NO's: 61 para 67, SEQ ID NO's 87 para 89 e SEQ ID NO's 100- 104. As combinações preferenciais de CDR1S e presente de regiões de armação nesses nanocorpos também são enumeradas na Tabela II
Tabela II: combinação preferencial de seqüências de Armação e CDR's em nanocorpos contra albumina de soro humana.
<table>table see original document page 258</column></row><table> Outro aspecto da invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa que conforme revelado na presente além disso compreende pelo menos um polipeptidio selecionado do grupo composto de um polipeptidio anti-IFN-gamma, um polipeptidio de receptor anti-TNF-alfa e polipeptidio de receptor anti-IFN-gamma.
Segundo um aspecto da invenção, um nanobody é dirigido contra o receptor TNF-alfa. Dito nanobody pode ser um Camelidae vhh·
Segundo um aspecto da invenção, um nanobody é dirigido contra o receptor IFN-gama. Dito nanobody pode ser um Camelidae vhh·
Outro aspecto da invenção é um método de tratar uma doença autoimune ou a condição como citado na presente, compreendendo administrando a um paciente uma quantidade eficaz de um polipeptidio anti-TNF-alfa que, além disso, compreende um polipeptidio menor selecionado do grupo composto do polipeptidio anti-IFN-gamma, anti-TNF-alfa polipeptidio de receptor e polipeptidio de receptor anti- IFN-gamma, tais polipeptidios juntados um a outro conforme descrito mais adiante.
Tais construtos multiespecificos podem ter melhorado a potência como o composto terapêutico inflamatório por cima de construtos mono-especificos .
Um aspecto da invenção é uma composição que compreende um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente e pelo menos um polipeptidio selecionado do grupo composto do polipeptidio anti-IFN-gamma, anti-TNF-alfa polipeptidio de receptor e polipeptidio de receptor anti-IFN-gamma, para administração simultânea, separada ou seqüente a um sujeito.
Um aspecto da invenção é um método que para tratamento de doença autoimune compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptidio anti- TNF-alfa e um polipeptidio menor selecionado do grupo composto do polipeptidio anti-IFN-gamma, anti-TNF-alfa polipeptidio de receptor e polipeptidio de receptor anti- IFN-gamma, simultaneamente, separadamente ou em seqüência.
Outro aspecto da invenção é um conjunto que contém um polipeptidio anti-TNF-alfa e um polipeptidio menor selecionado do grupo composto do polipeptidio anti-IFN- gamma, anti-TNF-alfa polipeptidio de receptor e polipeptidio de receptor anti-IFN-gamma para administração simultânea, separada ou seqüente a um sujeito. É um aspecto da invenção que o conjunto pode ser usado segundo a invenção. É um aspecto da invenção que o conjunto pode ser usado para tratar as doenças como citado na presente.
Por meios de administração simultâneos que os polipeptidios são administrados a um sujeito ao mesmo tempo. Por exemplo, como uma mistura dos polipeptidios ou uma composição que compreende os referidos polipeptidios. Os exemplos incluem, mas não são limitados a uma solução administrada intravenosamente, uma pastilha, liquida, creme tropical, etc., em que cada preparação compreende os polipeptidios do interesse.
Por meios de administração separados os polipeptidios são administrados a um sujeito ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo. Os polipeptidios estão presentes no conjunto como preparações separadas, não misturadas. Por exemplo, os polipeptidios diferentes podem estar presentes no conjunto como pastilhas individuais. As pastilhas podem ser administradas ao sujeito engolindo ambas as pastilhas ao mesmo tempo, ou uma pastilha diretamente depois do outra.
Por meios de administração seqüentes que os polipeptidios são administrados a um sujeito em seqüência. Os polipeptidios estão presentes no conjunto como preparações separadas, não misturadas. Há um intervalo de tempo entre doses. Por exemplo, um polipeptidio poderia ser administrado até 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1, ou 0,5 horas depois de outro componente.
Na administração seqüente, um polipeptidio pode ser administrado uma vez, ou qualquer número de tempos e em várias doses antes e/ou depois da administração de outro polipeptidio. A administração seqüente pode ser combinada com a administração simultânea ou seqüente.
Os usos médicos do polipeptidio anti-TNF-alfa descrito mais adiante, também se aplica à composição que compreende iam polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente e pelo menos um polipeptidio selecionado do grupo composto do polipeptidio anti-IFN-gamma, anti-TNF-alfa polipeptidio de receptor e polipeptidio de receptor anti-IFN-gamma, para administração simultânea, separada ou seqüente a um sujeito como revelado aqui anteriormente.
Segundo um aspecto da invenção, um polipeptidio anti- IFN-gamma anti-TNF-alfa um nanobody dirigido contra IFN- gama. Dito nanobody pode ser um Camelidae vhh·
Segundo um aspecto da invenção, anti-TNF-alfa um nanobody dirigido contra receptor TNF-alfa. Dito nanobody pode ser um Camelidae vhh·
Segundo um aspecto da invenção, um polipeptidio de receptor anti-IFN-gamma anti-TNF-alfa um nanobody dirigido contra receptor IFN-gama. Dito nanobody pode ser um Camelidae Vhh-
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente, em que o número de nanocorpos dirigidos contra o TNF-alfa é dois ou mais. Tais polipeptidios multivalentes anti-TNF-alfa têm a vantagem da afinidade funcional excepcionalmente alta para o objetivo, expondo muito mais alto do que propriedades inibidoras esperadas em comparação com os seus duplos monovalentes.
Os polipeptidios multivalentes anti-TNF-alfa têm afinidades funcionais que são várias ordens de magnitude mais altos do que os polipeptidios anti-TNF-alfa de pais monovalentes. Os inventores encontraram que as afinidades funcionais desses polipeptidios multivalentes são muito mais altas do que os informados na técnica para prévia anticorpos bivalentes e multivalente. Surpreendentemente, anti-TNF-alfa os polipeptidios da presente invenção ligados um a outro diretamente ou via uma seqüência de linker curta mostram as altas afinidades funcionais esperadas teoricamente com anticorpos de quatro cadeias convencionais multivalentes.
Os inventores encontraram que tais grandes atividades funcionais aumentadas podem ser descobertas preferivelmente com antigenos compostos de multidominio e proteína multiméricas, em ensaios de ligação diretos ou em ensaios funcionais, p. ex. citotoxicidade ensaios.
O nanobodies pode ser juntado para formar algum dos polipeptidios revelados na presente compreendendo mais de um nanobody utilizando métodos conhecidos na técnica ou qualquer futuro método. Por exemplo, eles podem ser fundidos pela ligação cruzada química reagindo resíduos aminoácidos com um agente de derivação orgânico como descrito por Blattler e al, Bioquímica 24,1517-1524; EP294703. Alternativamente, o nanobody pode ser fundido geneticamente ao nível de ADN isto é, um construto polinucleotídeo formado que codifica o construto polipeptídio completo compreendendo de um ou vários nanobodies anti-alvo e um ou vários nanobodies de proteína anti-soro. Um método para produzir construtos bivalente ou multivalente de polipeptídio VHH é revelado na aplicação de patente PCT WO 96/34103. Um modo de juntar múltiplos nanobodies é através da via genética ligando seqüências de codificação de nanobody diretamente ou via um linker de peptídeo. Por exemplo, o fim de C-terminal do primeiro nanobody pode ser ligado ao fim do N-terminal do seguinte nanobody. Este modo de vinculação pode ser estendido para ligar nanobodies adicionais para a construção e a produção de construtos tri-, tetra-, etc. funcionais.
Segundo um aspecto da presente invenção, os nanobodies são ligados um a outro diretamente, sem o uso de um linker. Ao contrário da junção de anticorpos convencionais grandes onde uma seqüência de linker é necessária para reter a atividade obrigatória nas duas subunidades, os polipeptidios da invenção podem ser ligados diretamente conseqüentemente evitando problemas potenciais da seqüência de linker, como antigenicidade quando administrado a um sujeito humano, instabilidade da seqüência de linker que leva a dissociação das subunidades.
Segundo outro aspecto da presente invenção, os nanobodies são ligados um a outro via um linker de seqüência de peptideo. Tal seqüência de linker pode ser uma seqüência que ocorre naturalmente ou uma seqüência que ocorre não naturalmente. Espera-se que a seqüência de linker seja não- imunogênica no sujeito ao qual o polipeptidio anti-TNF-alfa é administrado. A seqüência de linker pode fornecer a flexibilidade suficiente ao polipeptidio multivalente anti- TNF-alfa, ao mesmo tempo sendo resistente à degradação proteolitica. Um exemplo não-restritivo de umas seqüências de linkers é aquele que pode ser derivado da região pregada de VHHs descrito em WO 96/34103.
Segundo outro aspecto da invenção, nanobodies multivalentes compreendendo mais de dois nanobodies podem ser ligados um a outro diretamente ou via uma seqüência de linker. Tal construtos são difíceis de produzir com anticorpos convencionais e devido ao amplo impedimento das subunidades grandes, a funcionalidade será perdida ou muito diminuída e não aumentada consideravelmente como visto com o VHH'S da invenção em comparação com o construto monovalente.
Os construtos polipeptídios revelados na presente pode ser feitos pelo técnico experimentado segundo os métodos conhecidos na técnica ou qualquer futuro método. Por exemplo, VHHs pode ser obtido usando métodos conhecidos na técnica como imunizando um camelo e obtendo hibridomas disto, ou clonando uma biblioteca de nanobodies utilizando técnicas de biologia molecular conhecidas na seleção de arte e subseqüente usando fago-exposição.
Segundo um aspecto da invenção iam polipeptidio anti- TNF-alfa pode ser uma seqüência homóloga de um polipeptidio anti-TNF-alfa de corpo inteiro. Segundo outro aspecto da invenção, um polipeptidio anti-TNF-alfa pode ser uma porção funcional de um polipeptidio anti-TNF-alfa de corpo inteiro. Segundo outro aspecto da invenção, um polipeptidio anti-TNF- alfa pode ser uma seqüência homóloga de um polipeptidio anti-TNF-alfa de corpo inteiro. Segundo outro aspecto da invenção, um polipeptidio anti-TNF-alfa pode ser uma porção funcional de uma seqüência homóloga de um polipeptidio anti- TNF-alfa de corpo inteiro. Segundo um aspecto da invenção um polipeptidio anti-TNF-alfa pode compreender uma seqüência de um polipeptidio anti-TNF-alfa.
Segundo um aspecto da invenção um nanobody usado para formar um polipeptidio anti-TNF-alfa pode ser um nanobody completo (p. ex. um VHH) ou uma seqüência homóloga disso. Segundo outro aspecto da invenção, um nanobody usado para formar construtos polipeptidios pode ser uma porção funcional de um nanobody completo. Segundo outro aspecto da invenção, um nanobody usado para formar construtos polipeptidios pode ser uma seqüência homóloga de um nanobody completo. Segundo outro aspecto da invenção, um nanobody usado para formar construtos polipeptidios pode ser uma porção funcional de uma seqüência homóloga de um nanobody completo.
Como usado na presente, uma seqüência homóloga da presente invenção pode compreender adições, eliminações ou substituições de um ou vários aminoácidos, que não alteram substancialmente as características funcionais dos polipeptidios da invenção. 0 número de eliminações aminoácidas ou substituições está à altura preferivelmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 aminoácidos.
Uma seqüência homóloga segundo a presente invenção pode ser um polipeptidio modificado pela adição, eliminação ou substituição de aminoácidos, a referida modificação substancialmente não alterando as características funcionais comparadas com o polipeptídio não modificado.
Uma seqüência homóloga segundo a presente invenção pode ser um polipeptídio modificado pela adição, eliminação ou substituição de aminoácidos, a referida modificação substancialmente não altera as características funcionais comparadas com o polipeptídio não modificado.
Uma seqüência homóloga segundo a presente invenção pode ser uma seqüência que existe em outra espécie Camelidae como, por exemplo, camelo, dromedário, lhama, alpaca, guanaco etc.
Onde a seqüência homóloga indica a identidade de seqüência, ela significa uma seqüência que apresenta uma alta identidade de seqüência (mais de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, identidade de seqüência de 95% ou de 98%) com a seqüência de pais e é preferivelmente caracterizada por propriedades semelhantes da seqüência de pais, a saber afinidade, a referida identidade calculada usando métodos conhecidos.
Alternativamente, uma seqüência homóloga também pode ser qualquer seqüência aminoácida que resulta de substituições permitidas em qualquer número de posições da seqüência de pais segundo a fórmula mais adiante: Ser substituído por Ser, Thr, Gly, e Asn; Arg substituído por um de Arg, His, Gln, Lys, e Glu; Leu substituído por um de Leu, lie, Phe, Tyr, Met, e Vai; Pro substituído por um de Pro, Gly, Ala, e Thr; Thr substituído por um de Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, e Gln;
Ala substituído por um de Ala, Gly, Thr, e Pro; Val substituído por um de Vai, Met, Tyr, Phe, lie, e Leu; Gly substituído por um de Gly, Ala, Thr, Pro, e Ser; Ile substituído por um de lie, Met, Tyr, Phe, Vai, e Leu; Phe substituído por um de Phe, Trp, Met, Tyr, lie, Vai, e Leu;
Tyr substituído por um de Tyr, Trp, Met, Phe, lie, Vai, e Leu;
His substituído por um do Seu, Glu, Lys, Gln, Thr, e Arg; Gln substituído por um de Gln, Glu, Lys, Asn, His, Thr, e Arg;
Asn substituído por um de Asn, Glu, Asp, Gln, e Ser; Lys substituído por um de Lys, Glu, Gln, His, e Arg; Asp substituída por uma de Asp, Glu, e Asn;
Glu substituído por um de Glu, Asp, Lys, Asn, Gln, His, e Arg;
Met substituído por um dos Met, Phe, lie, Vai, Leu, e Tyr.
Uma seqüência de nucleotídeos homóloga segundo a presente invenção pode referir-se a seqüências de nucleotídeos de mais de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 ou 1000 nucleotídeos capaz de hibridizar o complemento inverso da seqüência de nucleotídeos capaz de codificar a seqüência evidente, em condições de hibridização estritas (como aqueles descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, Nova York).
Como usado na presente, uma porção funcional refere-se a uma seqüência de um nanobody que é do tamanho suficiente tal que a interação do interesse é mantida com a afinidade de 1 10-6 M χ ou melhor.
Alternativamente, uma porção funcional compreende uma eliminação parcial da seqüência aminoácida completa e ainda mantém o sítio(s) de ligação e o domínio(s) de proteína necessário para a ligação de e interação com o objetivo.
Como usado na presente, uma porção funcional refere-se a menos de 100% da seqüência completa (p. ex., 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% etc.), mas compreende 5 ou mais aminoácidos ou 15 ou mais nucleotídeos.
Objetivos como mencionado, na presente como TNF-alfa, receptor TNF-alfa, proteína de soro (p. ex. albumina de soro, imunoglobulinas de soro, proteína ligada com tiroxina, transferrina, fibrinogênio) e IFN-gama, o receptor IFN-gama pode ser fragmentos dos referidos objetivos. Portanto um objetivo é também um fragmento do referido objetivo, capaz de eliciar uma resposta imune. Um objetivo é também um fragmento do referido objetivo, capaz da ligação a um nanobody levantado contra o objetivo de comprimento completo.
Um fragmento conforme usado na presente refere-se a menos de 100% da seqüência (p. ex., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% etc.), mas compreendendo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais aminoácidos. Um fragmento é do comprimento suficiente tal que a interação do interesse é mantida com a afinidade de 1 10-6 M x ou melhor.
Um fragmento conforme usado na presente também se refere a inserções opcionais, as eliminações e as substituições de um ou vários aminoácidos que não alteram substancialmente a capacidade do objetivo de ligar a um nanobody levantado contra o objetivo de tipo natural. O número de eliminações de inserções aminoácidas ou substituições está à altura preferivelmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 aminoácidos.
Uma seqüência homóloga da presente invenção pode incluir um polipeptidio anti-TNF-alfa que foi humanizado, a humanização de anticorpos da nova classe de VHHs reduziria além disso a possibilidade da reação imunológica não desejada em um indivíduo humano sobre a administração.
Uma modalidade de execução da presente invenção refere- se a um método para preparar polipeptídios modificados baseados sobre anticorpos de lhama determinando os resíduos aminoácidos do domínio variável de anticorpo (VHH) que pode ser modificado sem diminuir a afinidade nativa do domínio para antígeno e reduzindo o seu imunogenicidade com respeito a uma espécie heteróloga; o uso de vhhs tendo modificações nos resíduos identificados que são úteis para a administração à espécie heteróloga; e ao vhh assim modificado.
Mais especificamente, a invenção refere-se ã preparação de VHHs modificados, que são modificados para administração a seres humanos, o próprio VHH resultante, e o uso de tal VHHs "humanizado" no tratamento de doenças em seres humanos. Humanizado quer dizer transformado para que a imunogenicidade sobre a administração em pacientes humanos seja menor ou não existente. A Humanização de um polipeptídio, segundo a invenção presente, compreende um passo de substituir um ou vários dos Camelidae aminoácidos pelo seu duplo humano como encontrado na seqüência de consenso humana, sem aquele polipeptídio que perde o seu caráter típico, isto é, a humanização não afeta significativamente a capacidade de ligação do antígeno do polipeptídio resultante. Tais métodos são conhecidos pelo destinatário experimentado.
A humanização de Camelidae nanobodies requer a introdução e mutagenese de uma quantidade limitada de aminoácidos em uma cadeia de polipeptídio única. Isto é, em contraste com a humanização de scFv, Fab, (Fab) 2 e IgG, que requer a introdução de modificações aminoácidas em duas cadeias, a cadeia leve e pesada e a preservação da união de ambas as cadeias.
Como descrito em WO 04/041862, um anti-TNF nanobody pode ser humanizado. A humanização, por exemplo, pode implicar mutagenese de resíduos em FRl na posição 1 e 5 que foram introduzidos pelo escorvador usado para clonagem de repertório e não ocorrer naturalmente na seqüência de lhama. A Mutagenese daqueles resíduos não resultou na perda de atividade de inibição e/ou ligação. A humanização também pode implicar mutagenese de resíduos em FR3 na posição 74, 76, 83, 84, 93. A Mutagenese daqueles resíduos não resultou em uma perda dramática de atividade de inibição e/ou ligação. A Combinação das mutações de FRl e FR3, por isso, não afetou a atividade de inibição e/ou a ligação. A humanização também pode implicar mutagenese de resíduos em FR4 na posição 108. A Mutagenese de Q108L resultou no nível de produção mais baixo em Escherichia coli. A posição 108 é exposta a solvente em VHH camelídeo, enquanto em anticorpos humanos esta posição é enterrada na interface VH-VL (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). Na posição VHs isolada 108 é exposta a solvente. A introdução de um Leu hidrofóbico não- polar em vez de polar não mudado Gln pode ter um efeito drástico na dobra/estabilidade intrínseca da molécula. Também, a substituição dos resíduos hidrofílicos por resíduos hidrofóbico humanos nas posições 44 e 45 (E44G e R45L), não teve um efeito em ligação e/ou inibição. Contudo, a perda de ligação e/ou atividade de inibição foi observada quando F37V e F47W foram introduzidos. Modelagem de dados confirmou o resíduo crítico 37 para conservar a integridade da conformação de laço CDR3 e daqui na atividade (toda a numeração segundo Kabat).
Segundo uma modalidade de execução da presente invenção, a humanização implica a substituição de algum dos resíduos seguintes sozinhos ou em combinação:
1 Posição de FRl 1, 5, 28 e 30,
2 o Hallmark aminoácido na posição 44 e 45 em FR2,
3 Resíduos de FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 e 94,
4 e posições 103, 104, 108 e 111 em FR4;
5 numeração segundo a numeração de Kabat.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um polipeptídio anti-TNF-alfa, ou um ácido nucléico capaz da codificação do referido polipeptídio para uso em tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de desordens que se relacionam com processos inflamatórios. A TNF-alfa está implicada em processos inflamatórios, e o bloqueio da ação TNF-alfa pode ter um efeito anti-inflamatório, que é altamente desejável em certos estados de doença como, por exemplo, a doença de Crohn. Os Exemplos demonstram VHHs segundo a invenção que ligam o TNF-alfa e além disso, bloqueiam a sua ligação ao receptor TNF-alfa.
Os polipeptidios anti-TNF-alfa da presente invenção são aplicáveis a doenças autoimunes, como a doença de Addison as doenças (adrenais), Autoimunes da orelha (orelha), as doenças Autoimunes do olho (olho), hepatite Autoimune (fígado), parotite Autoimune (glândulas parótidas), a doença de Crohn (intestino), Diabete Tipo I (pâncreas), Epididimite (epidídimo), Glomerulonefrite (rins) , a doença de Graves (tireóide), síndrome de Guillain-Barre (células nervosas), a doença de Hashimoto (tireóide), anemia Hemolitica (células de sangue vermelhas), lupus eritematoso sistêmico (múltiplos tecidos), infertilidade Masculina (esperma), Esclerose múltipla (células nervosas), Miastenia Gravis (neuromuscular ligação), Pênfigo (principalmente pele), Psoriase febre (de pele), Reumática (coração e uniões), artrite Reumatóide (revestimento de união), Sarcoidose (múltiplos tecidos e órgãos), Escleroderma (tecidos de pele e conetivos), a síndrome de Sjogren (glândulas exocrinas, e outros tecidos), Espondiloartropatias (esqueleto axial, e outros tecidos), Tiroidite (tireóide), Vasculite (vasos sangüíneos).
Dentro do parêntese está o tecido afetado pela doença. Esta listagem de doenças autoimunes é destinada para ser exemplar e não inclusiva.
As condições autoimunes para as que os polipeptidios anti-TNF-alfa da presente invenção são aplicáveis incluem, por exemplo, AIDS, alergia atópica, asma bronquial, eczema, lepra, esquizofrenia, depressão hereditária, a transplantação de tecidos e órgãos, síndrome de fadiga crônica, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, enfarte do miocárdio, derrame, autismo, epilepsia, fenômeno de Arthus, anafilaxe, e propensão a drogas e álcool. Nas condições autoimunes acima mencionadas, o tecido afetado é o objetivo primário, em outros casos ele é o objetivo secundário. Essas condições são em parte ou síndromes pela maior parte autoimunes. Por isso, no tratamento deles, é possível usar os mesmos métodos, ou aspectos dos mesmos métodos que são na presente revelados, às vezes em combinação com outros métodos.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa segundo a invenção, ou um ácido nucléico capaz da codificação do referido polipeptidio para a preparação de um medicamento para tratar uma desordem que se relaciona com processos inflamatórios. Os exemplos de desordens incluem a artrite reumatóide, a doença de Crohn, a colite ulcerativa, a sindrome inflamatória do intestino e esclerose múltipla.
Os polipeptidios e os ácidos nucléicos segundo a presente invenção podem ser administrados a um sujeito por vias convencionais, como intravenosamente. Contudo, uma propriedade especial dos polipeptidios anti-TNF-alfa da invenção é que eles penetram barreiras como membranas de tecido e/ou tumores e atuam localmente nisso, e eles são suficientemente estáveis para resistir ambientes extremos como no estômago. Por isso, outro aspecto da presente invenção refere-se à administração de polipeptidios anti- TNF-alfa.
Quando os nanocorpos e/ou os polipeptidios da invenção são usados para, ou destinados para uso em, a prevenção ou tratamento de doenças e desordens do trato gastrintestinal, especialmente por meio da administração oral ou outra administração no trato gastrintestinal, não será normalmente necessário usar polipeptidios da invenção que aumentaram a meia-vida no soro (isto é, foi pegilado ou contém um Nanocorpo dirigido contra uma proteína de soro). Portanto, para tais indicações, os polipeptidios da invenção podem ser usados os que só contêm nanocorpos da invenção.
Especialmente, foi encontrado isto a para administração oral para a prevenção e o tratamento de doenças ou desordens do trato gastrintestinal associado com e/ou mediadas pelo TNF- alfa (como IBD e outras doenças e as desordens do trato gastrintestinal acima mencionado), o uso de um Nanocorpo monovalente da invenção ou de um polipeptidio da invenção que essencialmente se compõe de um Nanocorpo monovalente da invenção pode ser preferido. Para outras indicações, como o tratamento da artrite reumatóide (RA) , o uso de iam Nanocorpo bivalente da invenção pode ser preferido. Quando tal Nanocorpo tem de conseguir o seu sitio desejado da ação via a corrente de sangue, o uso de um polipeptidio da invenção que aumentou a meia-vida no soro pode ser preferido.
Um sujeito segundo a invenção pode ser qualquer mamífero suscetível ao tratamento por polipeptídios terapêuticos.
A administração oral de polipeptídios anti-TNF-alfa da invenção resulta na provisão de tais moléculas em uma forma ativa no cólon em sítios locais que são afetados pela desordem. Esses sítios podem ser altamente inflamados e conter células Que produzem TNF-alfa. Os polipeptídios anti- TNF-alfa da invenção que ligam à TNF-alfa podem neutralizar o TNF-alfa localmente, evitando distribuição em todas as partes do corpo inteiro e portanto limitando efeitos colaterais negativos. Os microrganismos geneticamente modificados como Micrococcus lactis são capazes de segregar anticorpo ou porções funcionais disso. Tais microrganismos modificados podem ser usados como veículos para a produção e administração local de anticorpos ou porções funcionais disso no intestino. Usando uma classe que produz um polipeptidio anti-TNF-alfa, a síndrome inflamatória do intestino pode ser tratada.
Outro aspecto da invenção implica a administração de polipeptídios anti-TNF usando expressão superficial em ou secreção de bactérias não-invasivas, como organismos hospedeiros Gram-Positivos como Lactococcus spec. utilizando iam vetor como descrito em WOOO/23471.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para uso em tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção que é capaz de passar através do ambiente gástrico sem que a substância seja inativada.
Os exemplos de desordens são qualquer inflamação de causa, inclusive, mas não limitados a artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome inflamatória do intestino, e esclerose múltipla. Como conhecido por pessoas experimentadas na técnica, uma vez na posse do referido construto polipeptidio, a tecnologia de formulação pode ser aplicada para lançar uma quantidade máxima do polipeptidio na posição certa (no estômago, no cólon, etc.). Este método de administração é importante para tratar, prevenir e/ou aliviar os sintomas de desordens cujos objetivos são localizados no sistema intestinal.
Um aspecto da invenção é um método para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de uma desordem suscetível à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção que é capaz de passar através do ambiente gástrico sem ser inativado, por administração oral a um sujeito de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção que é capaz de passar através do ambiente gástrico sem ser inativado.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ao sistema intestinal sem que a referida substância seja inativada, por administração oral a um sujeito de um polipeptidio anti-TNF- alfa conforme revelado na presente.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção à circulação sangüínea de um sujeito sem que a substância seja inativada, por administração oral a um sujeito de um polipeptidio anti- TNF-alfa conforme revelado na presente.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para uso em tratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas ou desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção ministrado ao trato vaginal e/ou retal.
Os exemplos de desordens são qualquer inflamação de causa, inclusive, mas não limitados a artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome inflamatória do intestino, e esclerose múltipla. Em um exemplo não- restritivo, uma formulação segundo a invenção compreende um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente, na forma de um gel, creme, supositório, filme, ou na forma de uma esponja ou como um anel vaginal que lentamente lança o ingrediente ativo dentro de algum tempo (tais formulações são descritas em EP 707473, EP 684814, US 5629001).
Um aspecto da invenção é um método para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção ministrado ao trato vaginal e/ou retal, por administração vaginalmente e/ou retalmente a um sujeito um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção ministrado ao trato vaginal e/ou retal.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção ao trato vaginal e/ou retal sem que a referida substância seja inativada, administrando ao trato vaginal e/ou retal de um sujeito um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção à circulação sangüínea de um sujeito sem que a referida substância seja inativada, administrando ao trato vaginal e/ou retal de um sujeito um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente, para usar em tratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado ao nariz, trato respiratório superior e/ou pulmão.
Os exemplos de desordens são qualquer inflamação de causa, inclusive, mas não limitados a artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome inflamatória do intestino, e esclerose múltipla. Em um exemplo não- restritivo, uma formulação segundo a invenção, compreende um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente na forma de um borrifo nasal (p. ex. um aerossol) ou inalador. Desde que o construto de polipeptidio seja pequeno, ele pode conseguir o seu objetivo muito mais efetivamente do que moléculas IgG terapêuticas.
Um aspecto da invenção é um método para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado ao trato respiratório superior e pulmão, administrando a um sujeito um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente, pela inalação através da boca ou nariz.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado ao nariz, trato respiratório superior e/ou pulmão, sem que o referido polipeptidio seja inativado.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ao nariz, trato respiratório superior e pulmão sem inativação, administrando ao nariz, trato respiratório superior e/ou pulmão de um sujeito um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção à circulação sangüínea de um sujeito sem inativação administrando ao nariz, trato respiratório superior e/ou pulmão de um sujeito um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para uso em tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado à mucosa intestinal, em que os referidos desordens aumentam a permeabilidade da mucosa intestinal. Por causa do seu pequeno tamanho, um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente pode passar pela mucosa intestinal e atingir a circulação sangüínea mais eficientemente em sujeitos que sofrem de desordens que causam um aumento na permeabilidade da mucosa intestinal, por exemplo, a doença de Crohn.
Um aspecto da invenção é um método para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado à mucosa intestinal, em que os referidos desordens aumentam a permeabilidade da mucosa intestinal, por administração oral a um sujeito de um polipeptidio anti- TNF-alfa conforme revelado na presente.
Este processo pode ser até adicionalmente realçado por um aspecto adicional da presente invenção - o uso de transportadoras de transporte ativas. Neste aspecto da invenção, VHH é fundido a uma transportadora que realça a transferência através da parede intestinal na circulação sangüínea. Em um exemplo não-restritivo, esta "transportadora" é um segundo VHH que é fundido ao VHH terapêutico. Tais construtos de fusão são feitos usando métodos conhecidos na técnica. O VHH "de transportadora" liga especificamente a um receptor na parede intestinal que induz uma transferência ativa através da parede.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis ã modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção ministrado à mucosa intestinal, em que os referidos desordens aumentam a permeabilidade da mucosa intestinal.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção à mucosa intestinal sem ser inativada, administrando oralmente a um sujeito um polipeptidio anti-TNF-alfa da invenção.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção à circulação sangüínea de um sujeito sem ser inativada, administrando oralmente a um sujeito um polipeptidio anti-TNF-alfa da invenção.
Este processo pode ser até adicionalmente realçado por um aspecto adicional da presente invenção - o uso de transportadoras de transporte ativas. Neste aspecto da invenção, um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme descrito na presente é fundido a uma transportadora que realça a transferência através da parede intestinal na circulação sangüínea. Em um exemplo não-restritivo, esta "transportadora" é um VHH que é fundido ao referido polipeptidio. Tais construtos de fusão são feitos utilizando métodos conhecidos na técnica. 0 VHH "de transportadora" liga especificamente a um receptor na parede intestinal que induz uma transferência ativa através da parede.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um polipeptidio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para uso em tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptidio da invenção que é capaz de passar através dos tecidos abaixo da língua com efetividade. Os exemplos de desordens são qualquer inflamação de causa, inclusive, mas não limitados a artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome inflamatória do intestino, e esclerose múltipla. Uma formulação do referido construto de polipeptidios conforme revelado na presente, por exemplo, uma pastilha, borrifo, uma gota é colocada embaixo da língua e adsorvida através das membranas de muco na rede capilar embaixo da língua.
Um aspecto da invenção é um método para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar através dos tecidos abaixo da língua com efetividade, por administração sublingual a um sujeito de um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar pelos tecidos abaixo da língua.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção aos tecidos abaixo da língua sem ser inativada, administrando sublingualmente a um sujeito um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção à circulação sangüínea de um sujeito sem ser inativada, administrando oralmente a um sujeito um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para uso em tratamento, prevenção e/ou alívio dos sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar através da pele efetivamente. Os exemplos de desordens são qualquer inflamação de causa, inclusive, mas não limitados a artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome inflamatória do intestino, e esclerose múltipla. Uma formulação do referido construto de polipeptidios, por exemplo, uma creme, filme, borrifo, uma gota, o remendo, é colocada na pele e passa através dela.
Um aspecto da invenção é um método para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar através da pele efetivamente, por administração tópica a um sujeito de um polipeptídio anti- TNF-alfa conforme revelado na presente.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente para a preparação de um medicamento para tratar, impedir e/ou aliviar os sintomas de desordens suscetíveis à modulação por um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção que é capaz de passar através da pele efetivamente.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção à pele sem ser inativada, administrando topicamente a um sujeito um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Um aspecto da invenção é um método para a administração de um Nanocorpo ou o polipeptídio da invenção à circulação sangüínea de um sujeito, administrando topicamente a um sujeito um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente.
Em outra modalidade de execução da presente invenção, um polipeptídio anti-TNF-alfa além disso compreende um nanobody transportador (p. ex. VHH) que atua como uma transportadora de transporte ativa para transportar os referidos polipeptídio anti-TNF-alfa, do lúmen de pulmão ao sangue.
Um polipeptídio anti-TNF-alfa que, além disso, compreende uma transportadora que liga especificamente a um receptor presente na superfície de mucosa (células epiteliais bronquiais) resultando no transporte ativo do polipeptídio do lúmen de pulmão ao sangue. 0 nanobody transportador pode ser fundido ao construto de polipeptídio.
Tais construtos de fusão podem ser feitos usando métodos conhecidos na técnica e são descritos na presente. 0 nanobody "transportador" liga especificamente a um receptor na superfície da mucosa que induz uma transferência ativa através da superfície.
Outro aspecto da presente invenção é um método para determinar que nanobodies (p. ex. 0 VHHs) são ativamente transportados na circulação sangüínea sob administração nasal. Semelhantemente uma biblioteca de fagos VHH inócua ou imune podem ser administrados nasalmente, e depois de pontos de tempo diferentes depois da administração, o sangue ou os órgãos podem ser isolados para resgatar fagos que foram ativamente transportados à circulação sangüínea. Um exemplo não-restritivo de um receptor para transporte ativo do lúmen de pulmão à circulação sangüínea é o receptor Fc N (FcRn). Um aspecto da invenção inclui as moléculas VHH identificadas pelo método. Tal VHH então pode ser usado como uma transportadora VHH para a entrega de um VHH terapêutico ao objetivo correspondente na circulação sangüínea sob administração nasal.
Em um aspecto da invenção, cada um pode usar um polipeptídio anti-TNF-alfa conforme revelado na presente, para analisar agentes que modulam a ligação do polipeptídio à TNF-alfa. Quando identificado em um ensaio que mede a ligação ou o referido deslocamento de polipeptídio sozinho, os agentes terão de ser submetidos à prova funcional para determinar se eles modulariam a ação do antígeno in vivo.
Em um exemplo de iam experimento de deslocamento, o fago ou as células que expressam TNF-alfa ou um fragmento disso são incubados na ligação de buffer com o polipeptídio da invenção que foi etiquetada, na presença ou a ausência de concentrações crescentes de um modulador candidato. Para validar e calibrar o ensaio, a utilização de reações de competição de controle que aumenta as concentrações do referido polipeptidio e que é não etiquetado, pode ser executada. Depois da incubação, as células são lavadas extensivamente, e ligadas, o polipeptidio etiquetado é medido conforme apropriado para a etiqueta dada (p. ex., contagem de cintilação, fluorescência, etc.). Uma redução de pelo menos 10% na quantidade do polipeptidio etiquetado ligado na presença do modulador candidato indica o deslocamento da ligação pelo modulador candidato. Considera- se que moduladores candidatos ligam especificamente nisto ou outros ensaios descritos na presente se eles deslocarem 50% do polipeptidio etiquetado (dose de polipeptidio sub- saturada) em uma concentração de 1 μ M ou menos.
Alternativamente, ligação ou o deslocamento da ligação podem ser controladas pela ressonância de plasmon superficial (SPR). Ensaios de ressonância de plasmon superficial podem ser usados como um método quantitativo para medir a ligação entre duas moléculas pela modificação na massa perto de um sensor imobilizado causado pela ligação ou perda da ligação do polipeptidio da invenção da fase aquosa à TNF-alfa imobilizada em uma membrana no sensor.
Esta modificação na massa é medida como unidades de ressonância contra o tempo depois de injeção ou retirada do acima citado polipeptidio ou modulador candidato e medida usando um Biosensor Biacore (Biacore AB) . A TNF-alfa, por exemplo, pode ser imobilizada em um chip sensor (por exemplo, grau de pesquisa chip CM5; Biacore AB) em uma membrana de lipidio de filme fina segundo os métodos descritos por Salamon et al. (Salamon et ai., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557- 1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sei. 24: 213- 219, cada um dos quais é incorporado na presente por referência.). Sarrio et al. demonstrou que SPR pode ser usado para descobrir ligando que liga ao GPCR A(I) receptor adenosina imobilizado em uma camada de lipidio no chip (Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174, incorporado na presente por referência). As condições para a ligação de um polipeptidio da invenção à TNF-alfa em um ensaio SPR podem ser controladas em detalhe por alguém com habilidades na técnica que usa as condições informadas por Sarrio. como um ponto de partida.
0 SPR pode ensaiar moduladores da ligação de pelo menos dois modos. Primeiro, um polipeptidio da invenção pode ser pré-ligado à TNF-alfa imobilizada seguida pela injeção do modulador candidato em uma concentração nos limites de 0,1 nM a 1 μΜ. 0 deslocamento do polipeptidio ligado pode ser quantificado, permitindo a detecção da ligação de modulador. Alternativamente, o TNF-alfa ligada de membrana pode ser pré-incubada com um modulador candidato e desafiada com o polipeptidio da invenção. Uma diferença na afinidade de ligação entre o referido polipeptidio e o TNF-alfa pré- incubada com o modulador, comparado com isto entre o referido polipeptidio e o TNF-alfa na ausência do modulador demonstrará a ligação ou o deslocamento do referido polipeptidio na presença do modulador. No ensaio, uma redução de 10% ou em mais na quantidade do referido polipeptidio ligado na presença do modulador candidato, quanto à quantidade do referido polipeptidio ligado na ausência do modulador candidato indica que o modulador candidato inibe a interação do TNF-alfa e do referido polipeptidio.
Outro método de descobrir a inibição da ligação de, por exemplo, um polipeptidio da invenção, à TNF-alfa usa transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). FRET é um fenômeno mecano-quântico que ocorre entre um doador de f luorescência (D) e um aceitante de fluorescência (A) na proximidade fechada um a outro (normalmente <100 Â da separação) se o espectro de emissão de D fica sobreposto com o espectro de excitação de A. As moléculas a ser testadas, p. ex. um polipeptidio da invenção e umo TNF-alfa são etiquetados com um par complementar de fluoroforos doador e aceitante. Enquanto ligado estreitamente em conjunto pelo TNF-alfa: a interação de polipeptidio, a fluorescência emitida sobre a excitação do doador fluoroforo terá um comprimento de onda diferente do emitido em resposta àquele comprimento de onda de excitação quando o acima citado polipeptidio e o TNF-alfa não estão ligados, provendo quantificação das moléculas ligadas contra as não ligadas pela medição da intensidade de emissão em cada comprimento de onda. Os fluoroforos doadores com que etiquetar o TNF-alfa são bem conhecidos na técnica. De determinado interesse são variantes do A. Victoria GFP conhecido como Cyan FP (CFP, Doador (D)) e FP Amarelo (YFP, Aceitante (A)). Como um exemplo, a variante YFP pode ser feita como uma proteína de fusão com o TNF-alfa. Os vetores para a expressão de variantes GFP como fusões (Clontech) bem como reagentes fluoroforo-etiquetados (Sondas Moleculares) são conhecidos na técnica. A adição de um modulador candidato à mistura de polipeptidio fluorescentemente- etiquetado e YFP-TNF-alfa resultará em uma inibição da transferência de energia evidenciada por, por exemplo, uma redução na fluorescência YFP quanto a uma amostra sem o modulador candidato. Em um ensaio que usa FRET para a detecção de TNF-alfa: a interação de polipeptidio, uns 10% ou uma maior redução na intensidade da emissão fluorescente no comprimento de onda de aceitante em amostras que contêm um modulador candidato, quanto a amostras sem o modulador candidato, indicam que o modulador candidato inibe a interação TNF-alfaipolipeptídio.
Uma amostra como usada na presente pode ser qualquer TNF-alfa de amostra biológica que contém como clínico (p. ex. frações de célula, sangue inteiro, plasma, soro, tecido, células, etc.), derivada de clínica, agrícola, forense, pesquisa, ou outras amostras possíveis. As amostras clínicas podem ser de origem dos animais ou ser humano. A amostra analisada pode ser sólida ou líquida por natureza. É evidente que quando materiais sólidos são usados, esses são primeiro dissolvidos em uma solução conveniente.
Uma variação na FRET usa a extinção de f luorescência para controlar interações moleculares. Uma molécula no par que interage pode ser etiquetada com iam fluoroforo, e outra com uma molécula que extingue a fluorescência do fluoroforo quando trazido em justaposição fechada com ele. Uma modificação na fluorescência sobre a excitação é indicativa de uma modificação na associação das moléculas marcadas com o par de fluoroforo:quencher. Geralmente, um aumento na fluorescência do TNF-alfa etiquetado é indicativo que o polipeptidio anti-TNF-alfa que carrega o quencher foi deslocado. Para ensaios de quenching, 10% ou maior aumento na intensidade da emissão fluorescente em amostras que contêm um modulador candidato, quanto a amostras sem o modulador candidato, indica que o modulador candidato inibe o TNF-alfa: interação de polipeptidio de anti-TNF-alfa.
Além da ressonância de plasmon superficial e métodos de FRET, a medição de polarização de fluorescência é útil à ligação de quantidade. 0 valor de polarização de fluorescência para uma molécula fluorescentemente marcada depende do tempo de correlação rotativo ou tarifa que cai. Os complexos, como os formados pelo TNF-alfa que se associa com polipeptidio anti-TNF-alfa fluorescentemente etiquetado, têm mais altos valores de polarização do que o polipeptidio não complexado, etiquetado. A inclusão de um inibidor de candidato da interação de polipeptidio TNF-alfa:anti-TNF- alfa resulta em uma redução na polarização de fluorescência, quanto a uma mistura sem o inibidor de candidato, se o inibidor de candidato interromper ou inibir a interação do TNF-alfa com o referido polipeptidio. A polarização de fluorescência é bem ajustada para a identificação de pequenas moléculas que interrompem a formação de complexos de polipeptidio TNF-alfa:anti-TNF-alfa. Uma redução de 10% ou mais na polarização de fluorescência em amostras que contêm um modulador candidato, quanto à polarização de fluorescência em uma amostra que necessita do modulador candidato, indica que o modulador candidato inibe o TNF- alfa: interação de polipeptidio de anti-TNF-alfa.
Outra alternativa para monitorar TNF-alfa: as interações de polipeptidio de anti-TNF-alfa usam um ensaio de biosensor. Os biosensores de CCI foram descritos na técnica (Instituto de Pesquisa de Biotecnologia de Membrana Australiano; Cornell B, Braach-Maksvytis V, Rei L, Osman P, Raguse B, Wieczorek L, e Pace R. " Um biosensor que usa comutadores de canal de ion", Nature, 1997, 387, 580). Nesta tecnologia, a associação do TNF-alfa e um polipeptidio anti- TNF-alfa é ligada ao encerramento de canais de ion gramacidin-facilitados nas bicamadas de membrana suspensa e portanto a uma modificação mensurável na admissão (semelhante a impedância) do biosensor. Esta aproximação é linear mais de seis ordens da magnitude da admissão modificam-se e é de maneira ideal ajustado para grande escala, alta análise de quantidade tratada da bibliotecas combinatórias de pequenas moléculas. Uns 10% ou maior modificação (aumento ou redução) na admissão em uma amostra que contém um modulador candidato, quanto à admissão de uma amostra que necessita do modulador candidato, indicam que o modulador candidato inibe a interação do TNF-alfa e do referido polipeptidio. É importante observar que em ensaios que testam a interação do TNF-alfa com um polipeptidio anti- TNF-alfa, é possível que um modulador da interação não necessariamente tenha de interagir diretamente com o domínio(s) da proteína que fisicamente interage com o referido polipeptidio. É também possível que um modulador interaja em uma posição retirada do sítio de interação e cause, por exemplo, uma modificação conformacional no TNF- alfa. Os moduladores (nervos inibidores ou agonistas) que atuam nesta maneira são todavia do interesse como agentes para modular a ligação do TNF-alfa ao seu receptor.
Algum dos ensaios de ligação descritos podem ser usados para determinar a presença de um agente em uma amostra, p. ex., uma amostra de tecido, que liga à TNF-alfa, ou que afeta a ligação de, por exemplo, um polipeptidio de polipeptidio da invenção à TNF-alfa. Para fazer assim umo TNF-alfa é reagida com o referido polipeptidio na presença ou a ausência da amostra, e a ligação de polipeptidio é medida como apropriada para o ensaio de ligação que é usado.
Uma redução de 10% ou mais na ligação do referido polipeptidio indica que a amostra contém um agente que modula a ligação do referido polipeptidio à TNF-alfa. Naturalmente, o acima mencionado - o método generalizado poderia ser facilmente aplicado à análise para moduladores candidatos que alteram a ligação entre qualquer polipeptidio anti-TNF-alfa da invenção, uma seqüência homóloga disso, uma porção funcional disso ou uma porção funcional de uma seqüência homóloga disso, e TNF-alfa ou um fragmento disso.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um agente desconhecido identificado pelo método revelado na presente.
Uma modalidade de execução da presente invenção é um agente desconhecido identificado pelo método revelado na presente para uso em tratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de desordens que se relacionam com processos inflamatórios.
Outra modalidade de execução da presente invenção é um uso de um agente desconhecido identificado pelo método revelado na presente para uso em tratamento, prevenção e/ou alivio dos sintomas de desordens que se relacionam com processos inflamatórios.
Os exemplos de desordens incluem a artrite reumatóide, a doença de Crohn, a colite ulcerativa, a sindrome inflamatória do intestino e esclerose múltipla.
Uma célula que é útil segundo a invenção é preferivelmente selecionada do grupo composto de células bacterianas como, por exemplo, E. coli, células de levedura como, por exemplo, S. cerevisiae, P. pastoris, células de inseto ou células de mamífero.
Uma célula que é útil segundo a invenção pode ser qualquer célula na qual uma seqüência ácida nucléica que codifica um polipeptidio que compreende um anti-TNF-alfa da invenção, uma seqüência homóloga disso, uma porção funcional disso ou uma porção funcional de uma seqüência homóloga disso segundo a invenção pode ser introduzida tal que o polipeptidio é expresso a níveis naturais ou acima de níveis naturais, conforme definido na presente. Preferivelmente um polipeptidio da invenção que é expressa em uma célula expõe normal ou perto da farmacologia normal, conforme definido na presente.
Segundo uma modalidade de execução preferencial da presente invenção, uma célula é selecionada do grupo composto de C0S7-células, uma célula CHO, um LM (TK-) célula, uma célula NIH-3T3, célula de HEK-293, célula de K- 562 ou um 1321N1 célula astrocitoma mas também outras linhas de célula transfectável.
Em geral, "a quantidade terapeuticamente eficaz", "a dose terapeuticamente eficaz" e "quantidade eficaz" significa a quantidade necessária para atingir o resultado ou resultados desejados (modulando ligação TNF-alfa; tratamento ou prevenção de inflamação). Uma habilidade ordinária na técnica reconhecerá que a potência e, por isso, "uma quantidade eficaz" pode variar para vários compostos que modulam a ligação de TNF-alfa usada na invenção. Um experimentado na técnica pode avaliar prontamente a potência do composto.
Como usado na presente, o termo "composto" refere-se a iam polipeptidio anti-TNF-alfa da presente invenção, uma composição, ou um ácido nucléico capaz da codificação do referido polipeptidio ou um agente identificado segundo o método de análise descrito na presente ou os referidos o polipeptidio que compreende um ou vários aminoácidos derivatizados.
"Por farmaceuticamente aceitável" se que dizer um material que não é biologicamente ou de outra maneira indesejável, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo junto com o composto sem causar qualquer efeito biológico indesejável ou interagir em uma maneira deletéria com algum de outros componentes da composição farmacêutica na qual é contido.
Os polipeptídios de Anti-TNF-alfa conforme revelado na presente são úteis para o tratamento ou a prevenção de condições em um sujeito e compreendem a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto ou composição.
Os polipeptídios de Anti-TNF da presente invenção são úteis para o tratamento ou a prevenção de condições que se relacionam com artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome inflamatória do intestino e esclerose múltipla em um sujeito e compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto ou composição que liga o TNF-alfa.
Os polipeptídios de Anti-TNF-alfa como revelado aqui em são úteis para o tratamento ou a prevenção de condições em um sujeito e compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma combinação composta com o outro, como, por exemplo, aspirina.
Os polipeptídios anti-TNF-alfa como revelado aqui em são úteis para o tratamento ou a prevenção de condições que se relacionam com artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome inflamatória do intestino e esclerose múltipla em um sujeito e compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma combinação composta com o outro, como, por exemplo, aspirina.
A presente invenção não é limitada à administração de formulações que compreendem um composto único da invenção. É dentro dos limites da invenção para fornecer tratamentos de combinação em que uma formulação é administrada a um paciente na necessidade disso que compreende mais de um composto da invenção.
As condições mediadas pelo TNF-alfa incluem, mas não são limitadas a artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome inflamatória do intestino e esclerose múltipla.
Um composto útil na presente invenção pode ser formulado como composições farmacêuticas e administrado a um hospedeiro mamífero, como um paciente humano ou um animal doméstico em várias formas adaptadas à via escolhida da administração, isto é, oralmente ou parenteralmente, por intranasalmente por inalação, vias intravenosas, intramusculares, tópicas ou subcutâneas.
Um composto da presente invenção também pode ser administrado usando métodos de administração de terapia genética. Ver, p. ex.,Patente U.S. n. 5,399,346, que é incorporada por referência em sua totalidade. Usando um método de administração por terapia genética, células primárias transfetadas com o gene para o composto da presente invenção pode ser adicionalmente transfetadas com promotores específicos de tecido para visar órgãos específicos, tecido, enxertos, tumores, ou células.
Portanto, o composto presente pode ser sistemicamente administrado, p. ex., oralmente, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável como um diluente inerte ou lima transportadora comestível assimilável. Eles podem ser incluídos em cápsulas de gelatina de capas duras ou suaves, podem ser compressos em pastilhas, ou incorporados diretamente com a comida da dieta do paciente. Para administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser combinado com um ou vários excipientes e usado na forma de pastilhas ingeríveis, pastilhas bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolinhos delgados, e assim por diante. Tais composições e as preparações devem conter pelo menos 0,1% do composto ativo. A porcentagem das composições e preparações pode ser, naturalmente, variada e pode estar convenientemente entre aproximadamente 2 a aproximadamente 60% do peso de uma forma de dosagem de unidade dada. A quantidade do composto ativo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que um nível de dosagem eficaz será obtido.
As pastilhas, comprimidos, pílulas, cápsulas, e assim por diante também podem conter o seguinte: aglutinantes como goma tragacanth, acácia, amido de grão ou gelatina; excipientes como fosfato bicálcico; um agente que se desintegra como amido de grão, amido de batatas, algínico ácido e assim por diante; um lubrificante como magnésio estearato; e um agente de adoçamento como sacarose, fructose, lactose ou aspartame ou um agente de sabor como hortelã, o óleo de pirola, ou sabor de cereja pode ser acrescentado. Quando a forma de dosagem de unidade é uma cápsula, ela pode conter, além de materiais do tipo acima mencionado, um portador líquido, como um óleo vegetal ou um glicol de polietileno. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou modificar de outra maneira a forma física da forma de dosagem de unidade sólida. Por exemplo, as pastilhas, as pílulas, ou as cápsulas podem ser cobertas de gelatina, cera, goma-laca ou açúcar e assim por diante. Um xarope ou o elixir podem conter o composto ativo, a sacarose ou fructose como um agente de adoçamento, metila e propilparabenos como preservantes, uma tintura e sabor como sabor de cereja ou cor de laranja. Naturalmente, qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem de unidade deve ser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não-tóxica nas quantidades empregadas. Além do mais, o composto ativo pode ser incorporado em preparações e dispositivos de administração prolongada.
O composto ativo também pode ser administrado intravenosamente ou intraperitonealmente por infusão ou injeção. As soluções do composto ativo ou os seus sais podem ser preparadas em água, opcionalmente misturada com um surfactante não-tóxico. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, glicol de polietileno líquido, triacetin, e misturas disso e em óleos. Em condições ordinárias de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microrganismos.
As formas de dosagem farmacêuticas convenientes para a injeção ou a infusão podem incluir soluções aquosas estéreis ou dispersões ou pó estéril que compreende o ingrediente ativo que são adaptados para a preparação extemporânea de soluções injetáveis ou infusiveis estéreis ou dispersões, opcionalmente encapsuladas em lipossomas. Em todos os casos, a forma de dosagem última deve ser estéril, fluida e estável nas condições de fabricação e armazenamento. A transportadora liquida ou o veiculo podem ser um meio de dispersão solvente ou liquido, compreendendo, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, glicol de propileno, glicol de polietileno liquido, e assim por diante), óleos vegetais, ésteres gliceril não-tóxicos , e misturas convenientes disso. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula requerido em caso de dispersões ou pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser ocasionada por vários agentes antibacterianos e antifungosos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e assim por diante. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcar, buffers ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser ocasionada pelo uso nas composições de agentes que atrasam a absorção, por exemplo, alumínio monostearato e gelatina.
As soluções injetáveis estéreis estão preparadas incorporando o composto ativo na quantidade requerida no solvente apropriado com vários de outros ingredientes enumerados anteriormente, como requerido, seguido pela esterilização com filtro. Em caso do pó estéril para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais da preparação são a secagem à vácuo e a técnicas de secagem por congelamento, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer presente de ingrediente desejado adicional nas soluções anteriormente estéreis- filtradas.
Para administração tópica, o composto presente pode ser aplicado na forma pura, isto é, quando eles são líquidos. Contudo, será geralmente desejável administrá-los à pele como composições ou formulações, em combinação com uma transportadora dermatologicamente aceitável, que pode ser um sólido ou um líquido.
Os portadores sólidos úteis incluem sólidos finamente divididos como talco, barro, celulose microcristalina, sílica, alumina e assim por diante. Os portadores líquidos úteis incluem água, hidroálcalis ou glicol ou misturas de água-álcool/glicol, nas quais o composto presente pode ser dissolvido ou dispersado a níveis eficazes, opcionalmente com a ajuda de surfactantes não-tóxicos. Adjuvantes como fragrâncias e agentes antimicrobiais adicionais podem ser acrescentados para otimizar as propriedades para um uso dado. As composições líquidas resultantes podem ser aplicadas de almofadas absorventes, usadas para impregnar bandagens e outro curativos, ou borrifados na área afetada que usa pulverizadores de aerossol ou tipo de bomba.
Os espessantes como polímero sintético, ácidos gordurosos, sais e ésteres de ácidos gordurosos, álcoois gordurosos, celuloses modificadas ou materiais minerais modificados também podem ser empregados com transportadoras líquidas para formar pastas para borrifar, géis, ungüentos, sabões, e assim por diante, para aplicação diretamente à pele do usuário.
Exemplos de composições dermatológicas úteis que podem ser usadas para administrar o composto à pele são conhecidos na técnica; por exemplo, ver Jacquet et al. (U.S. Pat. N°. 4, 608,392), Geria (U.S. Pat. N°. 4, 992, 478), Smith et al. (U.S. Pat. N°. 4,559, 157) e Wortzman (U.S. Pat. N°. 35 4, 820, 508) .
Dosagens úteis do composto podem ser determinadas comparando sua atividade in vitro, e na atividade in vivo em modelos animais. Os métodos para a extrapolação de dosagens eficazes em ratos, e outros animais, a seres humanos são conhecidos na técnica; por exemplo, ver U.S. Pat. N°. 4,938,949.
Geralmente, a concentração do composto(s) em uma composição liquida, como uma loção, será de aproximadamente 0,1-25 wt-%, preferivelmente de aproximadamente 0,5-10 wt-%. A concentração em uma composição semi-sólida ou sólida como um gel ou um pó será aproximadamente 0,1-5 wt-%, preferivelmente aproximadamente 0,5-2.5 wt-%.
A quantidade do composto, ou um sal ativo ou derivado disso, requerido para uso no tratamento variará não só com o determinado sal selecionado mas também com a via de administração, a natureza da condição que é tratada e a idade e a condição do paciente e será enfim à discrição do médico ou clinico atendente. Também a dosagem do composto varia dependendo da célula objetivo, tumor, tecido, enxerto, ou órgão.
A dose desejada pode ser convenientemente apresentada em uma dose única ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como dois, três, quatro ou mais sub-doses por dia. A própria sub-dose pode ser além disso dividida, p. ex., em um número de administrações discretas livremente espaçadas; como múltiplas inalações de um insuflador ou pela aplicação de uma pluralidade de gotas no olho.
Um regime de administração pode incluir o tratamento de longo prazo, diário. Por "de longo prazo" se entende pelo menos duas semanas e preferivelmente, várias semanas, meses, ou anos da duração. As modificações necessárias nesta variedade de dosagem podem ser determinadas por uma habilidade ordinária na técnica usando só experimentação de rotina dada nos ensinamentos na presente. Ver Remington's Pharmaceuticals Sciences (Martin, E.W., editor 4), Mack Publishing Co, Easton, PA. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico individual no caso de qualquer complicação.
A invenção provê um agente que é um modulador do TNF- alfa / interações de TNF-alfa-receptor.
O agente de candidato pode ser um agente sintético, ou uma mistura de agentes, ou ser um produto natural (p. ex. um extrato de planta ou cultura supernadante). Um agente de candidato segundo a invenção inclui uma pequena molécula que pode ser sintetizada, um extrato natural, peptideos, proteína, carboidratos, lipidios etc.
Os Agentes moduladores candidato de grandes bibliotecas de agentes sintéticos ou naturais podem ser protegidos. Meios numerosos são atualmente usados para a síntese casual e dirigida de sacarídeo, peptídeo, e agentes baseados em ácido nucléico. As bibliotecas de agente sintéticas são comercialmente disponíveis de um número de companhias inclusive Maybridge Chemical Co (Trevillet, o Cornwall, Reino Unido), Comgenex (Princeton, NJ) , Sócios de Brandon (Merrimack, NH), e Microsource (New Milford, CT) . Uma biblioteca química rara é disponível de Aldrich (Milwaukee, WI). As bibliotecas combinatórias são disponíveis e podem ser preparadas. Alternativamente, as bibliotecas de agentes naturais na forma de extratos bacteriano, fungoso, planta e dos animais são disponíveis de p. ex., Pan Laboratories (Bothell, WA) ou MycoSearch (NC), ou são prontamente produzíveis por métodos bem conhecidos na técnica. Adicionalmente, as bibliotecas naturais e sinteticamente produzidas e os agentes são prontamente modificados por meios químicos, físicos, e bioquímicos através de convencionais.
Os agentes úteis podem ser encontrados dentro de classes químicas numerosas. Os agentes úteis podem ser agentes orgânicos, ou pequenos agentes orgânicos. Os pequenos agentes orgânicos têm um peso molecular de mais de 50 ainda menos de aproximadamente 2,500 daltons, preferivelmente menos de aproximadamente 750, mais preferivelmente menos de aproximadamente 350 daltons. As classes exemplares incluem heterociclos, peptideos, sacarideos, esteróides, e assim por diante. Os agentes podem ser modificados para realçar a eficácia, a estabilidade, a compatibilidade farmacêutica, e assim por diante. A identificação estrutural de um agente pode ser usada para identificar, gerar, ou proteger agentes adicionais. Por exemplo, onde os agentes de peptideo são identificados, eles podem ser modificados de vários modos para realçar a sua estabilidade, como utilização de um aminoácido desnatural, como um ácido D-amino, em particular D-alanina, por funcionalização do amino ou término carboxilico, p. ex. para o grupo amino, acilação ou alquilação, e para o grupo carboxilo, esterificação ou amidificação, ou o parecido.
Para análise primária, uma concentração útil de um agente de candidato segundo a invenção é de aproximadamente mm a aproximadamente 100 μ M ou mais (isto é, 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M etc.). A concentração de análise primária será usada como um limite superior, junto com nove concentrações adicionais, em que as concentrações adicionais são determinadas reduzindo a concentração de análise primária em intervalos de meio-log (p. ex. para mais 9 concentrações) para análises secundárias ou para geração de curvas de concentração.
Um conjunto de análise de alto rendimento segundo a invenção compreende todos os meios necessários e meios de comunicação para executar a detecção de um agente que modula interações de receptor TNF-alfa/TNF-alfa interagindo com o TNF-alfa na presença de um polipeptidio, preferivelmente em uma concentração na variedade de 1 μ M a 1 mm.
O conjunto compreende o seguinte. As células Recombinantes da invenção, compreendendo e expressando a seqüência de nucleotideos que codifico TNF-alfa, que são cultivados segundo o conjunto em um suporte sólido, como uma chapa de microtitragem, mais preferivelmente uma placa de microtritragem com 96 cavidades, segundo os métodos bem conhecidos à pessoa experimentada na técnica sobretudo como descrito em WO 00/02045. Alternativamente TNF-alfa é fornecido em uma forma purificada a ser imobilizada em, por exemplo, uma placa de microtritragem com 96 cavidades pela pessoa experimentada na técnica. Alternativamente TNF-alfa é fornecido no conjunto pré-imobilizado em, por exemplo, uma placa de microtritragem com 96 cavidades. A TNF-alfa pode ser TNF-alfa inteira ou um fragmento disso.
Agentes moduladores segundo a invenção, em concentrações de aproximadamente IpMal mm ou mais, são acrescentados a cavidades definidas na presença de uma concentração apropriada do polipeptidio anti-TNF-alfa, uma seqüência homóloga disso, uma porção funcional disso ou uma porção funcional de uma seqüência homóloga disso, a referida concentração do referido polipeptidio preferivelmente na variedade de 1 μM a 1 mm. Os conjuntos podem conter um ou vários polipeptidios anti-TNF-alfa da invenção.
Os ensaios de ligação são executados como segundo os métodos já revelados na presente e os resultados são em comparação com o nivel de base de, por exemplo, ligação de TNF-alfa a um polipeptidio anti-TNF-alfa, uma seqüência homóloga disso, uma porção funcional disso ou uma porção funcional de uma seqüência homóloga disso, mas a ausência do agente modulador acrescentado. As cavidades que mostram pelo menos 2 vezes, preferivelmente 5 vezes, mais preferivelmente 10 vezes e o mais preferivelmente uma 100 vezes ou mais aumento ou redução em TNF-alfa-polipeptideo que liga (por exemplo) comparando com o nivel da atividade a ausência do modulador, são selecionados para nova análise.
A invenção provê outros conjuntos úteis para proteção para os moduladores da ligação de receptor TNF-alfa/TNF- alfa, bem como conjuntos úteis para o diagnóstico de desordens caracterizadas pela disfunção do TNF-alfa. A invenção também provê conjuntos úteis para proteção para os moduladores das desordens bem como conjuntos para o seu diagnóstico, os referidos desordens caracterizadas por um ou vários processos que implicam TNF-alfa. Os conjuntos úteis segundo a invenção podem incluir umo TNF-alfa isolada. Alternativamente, ou além do mais, um conjunto pode compreender células transformadas para expressar o TNF-alfa. Em uma nova modalidade de execução, um conjunto segundo a invenção pode compreender um polinucleotideo de codificação de TNF-alfa. Em uma ainda nova modalidade de execução, um conjunto segundo a invenção pode compreender os escorvadores específicos úteis para a amplificação do TNF-alfa. Os conjuntos úteis segundo a invenção podem compreender um polipeptídio TNF-alfa isolado, um homólogo disso, ou uma porção funcional disso. Um conjunto segundo a invenção pode compreender as células transformadas para expressar o referido polipeptídio. Os conjuntos podem conter mais de um polipeptídio. Em uma nova modalidade de execução, um conjunto segundo a invenção pode compreender um polinucleotideo codificação de TNF-alfa. Em uma ainda nova modalidade de execução, um conjunto segundo a invenção pode compreender os escorvadores específicos úteis para a amplificação de uma macromolécula como, por exemplo, TNF- alfa. Todos os conjuntos segundo a invenção compreenderão os itens determinados ou combinações de itens e materiais de embalagem, por isso. Os conjuntos também incluirão instruções para uso.
Além disso, também estará claro para a pessoa experimentada que pode ser possível "enxertar" um ou vários dos CDR'S acima mencionados para os nanocorpos da invenção para outros "andaimes", inclusive, mas não limitado a, andaimes humanos ou andaimes de não-imunoglobulina. Andaimes convenientes e técnicas para tal enxerto de CDR estará claro para a pessoa experimentada e é bem conhecido na técnica, vide, por exemplo, os US-A-7,180,370, WO 01/27160, EP0 605522, EP 0 460167, os US-A-7, 054, 297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Métodos, 2004 Oct; 34 (2):184-199; Kettleborough et al., Protein Eng. Oct de 1991; 4 (7): 773-783; 0'Brien e Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100; e Skerra, J. Mol. Recognit. 2000: 13: 167-187, e Saerens et al. , J. Mol. Biol. 2005 Sep 23; 352 (3):597-607, e as novas referências citadas na presente. Por exemplo, as técnicas conhecidas por si para enxerto de CDR's de rato ou camundongo em armações e andaimes humanos podem ser usadas em uma maneira análoga para fornecer a proteína quimérica que compreende um ou vários do CDR1S dos nanocorpos da invenção e um ou regiões ou seqüências de armação humanas.
Portanto, em outra modalidade de execução, a invenção compreende um polipeptídio quimérico que compreende pelo menos uma seqüência CDR escolhida do grupo composto de seqüências CDR1, as seqüências de CDR2 e as seqüências CDR3 mencionadas na presente para os nanocorpos da invenção. Preferivelmente, tal polipeptídio quimérico compreende pelo menos uma seqüência CDR escolhida do grupo composto das seqüências CDR3 mencionada na presente para os nanocorpos da invenção, e opcionalmente também pelo menos uma seqüência CDR escolhida do grupo composto das Seqüências CDRl e CDR2 mencionada na presente para os nanocorpos da invenção. Por exemplo, tal polipeptídio quimérico pode compreender uma seqüência CDR escolhida do grupo composto das seqüências CDR3 mencionada na presente para os nanocorpos da invenção, uma seqüência CDR escolhida do grupo composto das seqüências CDRl mencionada na presente para os nanocorpos da invenção e uma seqüência CDR escolhida do grupo composto das seqüências CDRl e CDR2 mencionadas na presente para os nanocorpos da invenção. As combinações do CDR'S que são mencionadas na presente como preferidas para os nanocorpos da invenção também serão normalmente preferidas para esses polipeptídios quiméricos.
nos referidos polipeptídios quiméricos, o CDR1S pode ser ligado a novas seqüências de seqüências aminoácidas e/ou ligado um a outro via seqüências aminoácidas, nas quais as referidas seqüências aminoácidas são preferivelmente seqüências de armação ou são seqüências aminoácidas que atuam como seqüências de armação, ou em conjunto formam um andaime para apresentar o CDR'S. A referência é novamente feita à arte prévia mencionada no parágrafo último. Segundo uma modalidade de execução preferencial, as seqüências aminoácidas são seqüências de armação humanas, por exemplo, seqüências de armação áe Vh3- Contudo, seqüências de armação não-humanas, sintéticas, semi-sintéticas ou de não- imunoglobulina também pode ser usadas. Preferivelmente, as seqüências de armação usadas são tais que (1) o polipeptidio quimérico é capaz de ligar xxxx, isto é, com uma afinidade que é pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 5%, mais preferivelmente pelo menos 10%, como pelo menos 25% e até 50% ou 90% ou mais da afinidade do correspondente Nanocorpo da invenção; (2) o polipeptidio quimérico é conveniente para uso farmacêutico; e (3) o polipeptidio quimérico é preferivelmente essencialmente não-imunogênico nas condições desejadas para uso farmacêutico (isto é, indicação, modo de administração, dose e regime de tratamento) disso (que pode ser essencialmente análogo às condições descritas na presente para o uso dos nanocorpos da invenção).
Segundo uma modalidade de execução não-restritiva, o polipeptidio quimérico compreende pelo menos duas seqüências CDR (como acima mencionado) ligado via pelo menos uma seqüência de armação, na qual preferivelmente pelo menos uma de duas seqüências CDR é uma seqüência CDR3, com outra seqüência CDR que é um CDRl ou seqüência CDR2. Segundo uma modalidade de execução preferencial, mas não-restritiva, o polipeptidio quimérico compreende pelo menos duas seqüências CDR (como acima mencionado) ligado pelo menos duas seqüências de armação, nas quais preferivelmente pelo menos uma de três seqüências CDR é uma seqüência CDR3, com outras duas seqüências CDR que são seqüências CDRl ou CDR2, e preferivelmente sendo uma seqüência CDRl e uma seqüência CDR2. Segundo uma modalidade de execução especificamente preferencial, mas não-restritiva, os polipeptidios quiméricos têm a estrutura FRl' - CDRl - FR2' - CDR2 - FR3' - CDR3 - FR4', no qual CDRl, CDR2 e CDR3 são como definidos na presente para o CDR'S dos nanocorpos da invenção, e FRl', FR2', FR3' e FR4' são seqüências de armação. FRl', FR2' , FR3' e FR4' pode ser especialmente Armação 1, Armação 2, Armação 3 e Armação 4 seqüências, respectivamente, de um anticorpo humano (como seqüências Vh3) e/ou partes ou fragmentos de tais seqüências de Armação. É também possível usar partes ou fragmentos de um polipeptídio quimérico com a estrutura FRl' - CDRl - FR2' - CDR2 - FR3' - CDR3 - FR4. Preferivelmente, tais partes ou fragmentos são tais que eles encontram os critérios estabelecidos no parágrafo precedente.
A invenção também se refere a proteína e polipeptídios compreendendo e/ou essencialmente compostos de tais polipeptídios quiméricos, aos ácidos nucléicos que codificam tal proteína ou polipeptídios; a métodos para preparar tal proteína e polipeptídios; apresentar células que expressam ou são capazes de expressar tal proteína ou polipeptídios; a composições, e especialmente a composições farmacêuticas, que compreendem tal proteína ou polipeptídios, ácidos nucléicos ou apresentar células; e a usos de tal proteína ou polipeptídios, tais ácidos nucléicos, tais células hospedeiras e/ou tais composições, especialmente para objetivos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos, como objetivos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos mencionados na presente. Por exemplo, tal proteína, os polipeptídios, os ácidos nucléicos, os métodos, as células hospedeiras, as composições e os usos podem ser análogos à proteína, os polipeptídios, os ácidos nucléicos, os métodos, as células hospedeiras, as composições e o uso descreveram na presente para os nanocorpos da invenção.
Também deve ser observado que, quando os nanocorpos das invenções contêm uma ou várias outras seqüências CDR do que as seqüências CDR preferenciais acima mencionadas, essas seqüências CDR podem ser convenientes (isto é, conveniente para os objetivos descritos na presente) as seqüências de CDR e/ou essas seqüências CDR podem ser obtidas em qualquer maneira conhecida por si, por exemplo, de nanocorpos (preferido), domínios de vh de anticorpos convencionais (e especialmente de anticorpos humanos), anticorpos de cadeia pesadas, anticorpos de 4 cadeias convencionais (como anticorpos de 4 cadeias humanos convencionais) ou outras seqüências de imunoglobulina dirigidas contra TNF. Tais seqüências de imunoglobulina dirigidas contra xxxx podem ser geradas em qualquer maneira conhecida por si, como serão claras à pessoa experimentada, isto é, pela imunização com TNF ou analisando uma biblioteca conveniente de seqüências de imunoglobulina com TNF, ou qualquer combinação conveniente disso. Opcionalmente, isto pode ser seguido por técnicas como mutagenese casual ou direcionada a local e/ou outras técnicas para maturação de afinidade conhecida por si. As técnicas convenientes para gerar tais seqüências de imunoglobulina serão claras à pessoa experimentada, e, por exemplo, incluirão as técnicas de proteção revisadas por Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005) . Outras técnicas para gerar imunoglobulinas contra um objetivo especificado incluem, por exemplo, a tecnologia Nanoclone (como, por exemplo, descrito na aplicação 60/648,922 para patente provisória dos Estados Unidos não- prepublicada), assim chamada tecnologia SLAM (como, por exemplo, descrito na aplicação 0 542810 de patente européia), o uso de ratos transgênicos que expressam imunoglobulinas humanas ou as técnicas de hibridoma bem conhecidas (ver, por exemplo, Larrick e al, Biotecnologia, Volume 7, 1989, p. 934) . Todas essas técnicas podem ser usadas para gerar imunoglobulinas contra TNF, e o CDR'S de tais imunoglobulinas pode ser usado nos nanocorpos da invenção, isto é, como delineado anteriormente. Por exemplo, a seqüência de tal CDR pode ser determinada, sintetizada e/ou isolada, e inserida na seqüência de um Nanocorpo da invenção (p. ex. para substituir o CDR nativo correspondente), todas as técnicas de utilização conhecidas por si como as descritos na presente, ou nanocorpos da invenção que contém tal CDR's (ou ácidos nucléicos que codificam o mesmo) pode ser sintetizado de novo, novamente usando as técnicas mencionadas na presente.
A invenção será além disso descrita agora por meio dos exemplos não-restritivos seguintes e figuras, nas quais as Figuras mostram:
nanocorpos TNFα Monovalentes
Figura 1: alinhamento de seqüência de nanocorpos TNFα humanos
Figura 2: alinhamento de seqüência de nanocorpos TNFα especifico de albumina de soro
Figura 3: Ligação de nanocorpos TNFα especifico de albumina a albumina de soro humana
Figura 4: Ligação de nanocorpos TNFα especifico de albumina a albumina de soro de rhesus
Figura 5: Ligação de nanocorpos TNFα especifico de albumina a albumina de soro de rato
Figura 6: Pureza de TNFα e nanobodies de albumina de soro (SDS-PAGE)
Figura 7: análise de Western Blot de TNFα e nanobodies de albumina de soro
Figura 8: Ligação de nanocorpos TNFα a TNFα humano (ELISA)
Figura 9: Ligação de nanocorpos TNFα a TNFα de rhesus (ELISA)
Figura 10: ensaio de inibição de receptor em Enbrel para TNFα humano
Figura 11: ensaio de inibição de receptor em Enbrel para TNFα de rhesus
Figura 12: Ligação de nanocorpos TNFα a TNFα humano (Biacore)
Figura 13: Ligação de nanocorpos TNFα a TNFα de rhesus (Biacore)
Figura 14: Ligação de nanocorpos TNFα a Proteína A (Biacore)
Figura 15: tratamento de Temperatura de TNFα e nanobodies de albumina de soro (Western Blot) Figura 16: Estabilidade: tratamento de temperatura de nanocorpos TNFa (ELISA)
Figura 17: tratamento de Temperatura de nanobodies de albumina de soro (Biacore) nanocorpos TNFa bivalentes
Figura 18: Pureza_de nanocorpos TNFa bivalentes (SDS-PAGE) Figura 19: análise de Western Blot de nanocorpos TNFa bivalentes
Figura 20: ensaio de inibição de receptor em Enbrel para nanobodies TNFa bivalentes
Figura 21: Estabilidade: tratamento de temperatura de nanocorpos TNFa bivalentes (ELISA) nanocorpos TNFa Monovalentes Humanizados
Figura 22: múltiplo alinhamento de seqüência de nanobodies humanizados TNFl
Figura 23: múltiplo alinhamento de seqüência de nanobodies humanizados TNF2
Figura 24: múltiplo alinhamento de seqüência de nanobodies humanizados TNF3
Figura 25: múltiplo alinhamento de seqüência de nanobodies humanizados ALBl
Figura 26: Pureza de nanobodies TNF humanizados e de albumina de soro (SDS-PAGE)
Figura 27: análise de Western Blot de nanobodies TNF humanizados e de albumina de soro
Figura 28: Ligação de nanobodies TNFa humanizados a TNFa humano
Figura 29: Ligação de nanobodies de albumina de soro humanizada a albumina de soro humana
Figura 30: Estabilidade: tratamento de temperatura de nanobodies TNFa humanizados (ELISA) nanocorpos TNFa trivalentes
Figura 31: Pureza_de nanocorpos TNFa trivalentes (SDS-PAGE) Figura 32: análise de Western Blot de nanocorpos TNFa trivalentes
Figura 33: Estabilidade: tratamento de temperatura de nanocorpos TNFa trivalentes (ELISA)
nanocorpos TNFa Monovalentes Humanizados (segundo círculo)
Figura 34: múltiplo alinhamento de seqüência de nanobodies humanizados TNF1
Figura 35: múltiplo alinhamento de seqüência de nanobodies humanizados TNF2
Figura 36: múltiplo alinhamento de seqüência de nanobodies humanizados TNF3
Figura 37: múltiplo alinhamento de seqüência de nanobodies humanizados ALB1
Figura 38: Pureza de nanobodies TNFa humanizados (SDS-PAGE)
Figura 39: análise de Western Blot de nanobodies TNFa humanizados
Figura 40: Ligação de nanobodies TNFa humanizados a TNFa humano
Figura 41: Estabilidade: tratamento de temperatura de nanobodies TNFa humanizados (ELISA)
Figura 42: Análise de TNF60 purificado em Prata gel de SDS- PAGE manchado (A) Coomassie gel de SDS-PAGE manchado (B) e em análise de Western blot que usa anti-NB (C) para detecção Figura 43: Cromatograma de exclusão de tamanho analítica de TNF60 em Superdex HR75
Figura 44: Ligação de TNF60 o TNF-alfa humana
Curva de resposta da figura 45:Dose obtida em ensaio citotoxicidade com TNF-alfa humana que usa Nanocorpo™ TNF60 em comparação com Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) e Remicade (Infliximab)
Figura 46: curva de resposta de dose obtida em ensaio citotoxicidade com TNFa de rhesus usando Nanocorpo™ TNF60 em comparação com Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) e Remicade (Infliximab)
Figura 47: perfil de Farmacocinética de TNF60 em ratos
Figura 48: perfil de Imunogenicidade de TNF60 em ratos
Figura 49: Análise de TNF56-PEG40 purificado, TNF5 6-PEG60, TNF56-biotina, TNF55-PEG40, TNF55-PEG60 e TNF55-biotina em Coomassie gel de SDS-PAGE manchado Figura 50: Análise de TNF56-PEG40 purificado em gel de SDS- PAGE que usa mancha de Prata (A) Coomassie mancha (B) e em análise de Western blot que usa anti-NB (C) para detecção Figura 51: Cromatograma de exclusão de tamanho analítica de TNF56-PEG40 em HORA Superdex 75
Figura 52: Cromatograma de exclusão de tamanho analítica de TNF56-PEG40 em HORA Superdex 200
Figura 53: curva de resposta de dose obtida em ensaio citotoxicidade com TNFa humano usando Nanocorpo™ TNF56-PEG40 e o tipo natural Nanocorpo monovalente ™ TNFl em comparação com Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) e Remicade (Infliximab)
Figura 54: curva de resposta de dose obtida em ensaio citotoxicidade com TNFa de rhesus usando Nanocorpow TNF56- PEG40 em comparação com Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) e Remicade (Infliximab)
Figura 55: análise de Farmacocinética do Nanocorpo bivalente pegilado ™ TNF56-PEG40 e TNF56-PEG60 depois de administração intravenosa em ratos
Figura 56: análise de Farmacocinética do Nanocorpo bivalente pegilado ™ 3E-3E-PEG20, pegilado Nanocorpo bivalente ™ 3E- 3E-PEG4 O e biespecífico Nanocorpo™ 3E-3E-AR1 depois de administração intravenosa em ratos
Figura 57: perfil de Imunogenicidade de TNF56-PEG40 e TNF56- PEG60 em ratos
Figura 58: Eficácia de TNF60 na prevenção de poliartrite crônica em ratos
Figura 59: Eficácia de TNF60 em tratamento terapêutico de poliartrite crônica em ratos
Figura 60: Efeito de TNF60 Nanocorpo™ formatação em eficácia na prevenção de poliartrite crônica em ratos
Figura 61: alinhamento de seqüência de nanocorpos™ PMP1C2, 3E, IA e 3G
Figura 62: modelo molecular de TNF-60
As Tabelas anexadas formam uma parte integrante da especificação presente e são como se segue: nanocorpos TNFa Monovalentes
Tabela 8: listagem de seqüência_de nanocorpos TNFa Tabela 9: valores de Koff de nanocorpos TNFa humanos Tabela 10: Homologia de TNFa e nanobodies de albumina de soro a seqüências germline humanas
Tabela 11: níveis de expressão de TNFa e nanobodies de albumina de soro
Tabela 12: ELISA que liga o TNFa do ser humano e rhesus Tabela 13: ensaio de inibição de receptor de nanocorpos TNFa Tabela 14: análise de Biacore de nanocorpos TNFa Tabela 15: Ligação de nanocorpos TNFa a TNFa (KD-valores) Tabela 16: Potência de nanocorpos TNFa para neutralizar TNFa de ser humano (a) e rhesus (b) Tabela 17: OD280nm de TNFa e nanobodies de albumina de soro depois de tratamento de temperatura
Tabela 18: Potência de nanocorpos TNFa depois de tratamento de temperatura
nanocorpos TNFa bivalentes
Tabela 19: listagem de seqüência_de nanocorpos TNFa bivalentes e seqüências de linkers
Tabela 20: Construtos de nanobody TNF α bivalente
Tabela 21: níveis de expressão de nanocorpos TNFa bivalentes
Tabela 22: ensaio de inibição de receptor de nanocorpos TNFa bivalentes
Tabela 23: a Potência de nanocorpos TNFa para neutralizar TNFa de ser humano (a) e rhesus (b) Tabela 24: 00280nm de nanocorpos TNFa bivalentes nanocorpos TNFa Monovalentes Humanizados
Tabela 25: listagem de seqüência de TNFa monovalente humanizado e nanobodies de albumina de soro
Tabela 26: níveis de expressão de nanobodies TNF humanizados e de albumina de soro Tabela 27: a Potência de nanocorpos TNFa para neutralizar TNFa humano Tabela 28: OD280nm de nanobodies TNF humanizados e de albumina de soro nanocorpos TNFa trivalentes
Tabela 29: listagem de seqüência_de nanocorpos TNFa trivalentes
Tabela 30: Construtos de nanobody TNF α trivalentes
Tabela 31: níveis de expressão de nanocorpos TNFa trivalentes
Tabela 32: a Potência de nanocorpos TNFa trivalentes para neutralizar TNFa humano
Tabela 33: Ligação de nanobodies trivalente a albumina de soro (KD-valores)
Tabela 34: OD280nm de nanocorpos TNFa trivalentes nanocorpos TNFa Monovalentes Humanizados (segundo circulo)
Tabela 35: a listagem de seqüência do segundo círculo nanocorpos TNFa humanizados Monovalentes
Tabela 36: níveis de expressão de nanobodies TNFa humanizados
Tabela 37: a Potência de nanocorpos TNFa para neutralizar TNFa humano
Tabela 38: OD280nm de nanobodies TNFa humanizados
Tabela 39: Comparação de atividade bio de nanobodies· Novas tabelas
Tabela 40: Resumo de oligonucleotídeos usado em formatação de nanocorpos™ trivalentes
Tabela 41: Resumo de oligonucleotídeos usado em clonagem de nanocorpos™ trivalentes
Tabela 42:_Valores de EC50 obtidos em ensaio citotoxicidade que usa Nanocorpo trivalente ™ TNF60 em comparação com controles comerciais (Enbrel, Remicade, Humira)
Tabela 43: determinação de afinidade de TNF60 e TNF24 em albumina de soro humana em Biacore. Nd, não determinado. Tabela 44: Resumo de oligonucleotídeos usados em formatação de nanocorpos™ bivalentes
Tabela 45: Valores de EC50 obtido em ensaio citotoxicidade que usa nanocorpos™ bivalentes em comparação com controles comerciais (Enbrel, Remicade, Humira)
Tabela 46: Resultados de estudos de fibroblastos derivados de sinóvia
Tabela 47: Resultados estudos de bolsa de ar de murinos
EXEMPLOS
Exemplo 1: Identificação de TNFa e nanobodies de albumina de soro especifico
nanocorpos antagônicos foram identificados usando duas lhamas (Lhama glama) imunizado com TNFa humano por 6 injeções de 100 da citoquina em intervalos semanais. A
análise foi executada usando o ensaio baseado de uma competição, no qual nanobodies individuais foram analisados para a sua capacidade de inibir a ligação de TNFa etiquetado ao seu receptor. Os nanobodies específicos de albumina foram identificados de uma lhama imunizada com a albumina de soro humana. A proteção de nanobodies individual foi executada por ELISA utilizando albumina de ser humano, rhesus e de rato, produzindo um painel nanobodies reagindo cruzadamente com a albumina de soro de várias espécies.
Exemplo 2: análise de seqüência de nanobodies isolados
As classes diferentes de nanobodies foram identificadas baseadas na análise de seqüência (Figura 1) que usa uma matriz de contagem BLOSUM62 e um atalho de valor de significação de semelhança de 60% >: Classe I (PMP1 C2, PMPl Gll, PMPl H6), Classe II (PMP1 G5, PMPl H2, PMP3 G2) , Classe IIb (PMPl D2), Classe III (PMP3 D10, PMP5 FIO). A Tabela 8 listas as seqüências desses nanocorpos TNFa (SEQ ID NÚMEROS: 52 a 60) .
Baseado na análise de seqüência (a Figura 2) as classes diferentes da nanobodies de albumina de soro foram identificadas usando a matriz de contagem BLOSUM62 e um atalho de valor de significação de semelhança de 60% A Tabela 8 listas as seqüências desses nanobodies de albumina de soro (SEQ ID NÚMEROS: 61 para 67).
Exemplo 3: análise de Biacore
TNFα
A ligação de nanobodies a TNFα foi caracterizada pela
ressonância de plasmon superficial em um Instrumento Biacore 3000. O TNF da espécie diferente foi covalentemente ligado à superfície de chips de sensor CM5 via amina ligando até que um aumento de 250 unidades de resposta fosse conseguido. Os grupos reativos restantes foram inativados. A ligação do Nanocorpo foi avaliada em uma concentração (1 em 1,000 diluído) . Cada nanobody foi injetado por 4 minutos em uma taxa de fluxo de 45 μl/min para levar em conta a ligação ao antígeno ligado por chip. 0 buffer de ligação sem nanobody foi enviado sobre o chip na mesma taxa de fluxo para permitir a dissociação espontânea do Nanocorpo ligado para 4 horas. Os valores de Koff foram calculados do sensorgramas obtidos para os nanocorpos diferentes.
De cada classe de nanobodies proteínas não purificadas foram analisadas em Biacore. Os dados de Koff são enumerados na Tabela 9.
nanocorpos representativos de cada classe foram retidos para nova análise baseada no valor de Koff. Para a Classe I PMP1C2 (TNFl) foi selecionada; o PMP1G5 (TNF2) foi selecionado como o representante da Classe II; o PMP5F10 (TNF3) foi selecionado como o representante da Classe III.
Albumina de soro
A ligação esteve ensaiada conforme descrito acima exceto que 1 em 20 diluições foram usados. As figuras 3, 4 e 5 ilustram a proteção da nanocorpos TNFa específico de albumina contra ser humano, rhesus e albumina de soro de rato que usa proteína não purificada.
Os nanobodies são colocados segundo os koff-valores, vide a Tabela III mais adiante: <table>table see original document page 310</column></row><table>
Tabela III
Os melhores koff foram obtidos para os membros da família C e família Β. A reatividade cruzada entre rato, ser humano e albumina de soro de rhesus também foi observada para os membros daquelas famílias. Um nanobody representativo da classe BeC foi definido para nova análise: o PMP6A6 (ALBl) foi selecionado como representativo da Classe B e PMP6A8 (o ALB2) foi selecionado como o representante da Classe C.
Exemplo 4: Clonagem de nanobodies monovalente em ρΆΧ051
Descrição de Vetor de expressão Escherichia coli o pAX051 é um derivado de pUC19. Ele contém o promotor LacZ que permite uma indução controlada da expressão que usa IPTG. O vetor tem um gene de resistência para Ampicilina ou Carbenicilina. Os sítios de multiclonagem abrigam vários sítios de restrição de que SfiEu e BstEII são freqüentemente usados para clonagem de nanocorpos™. Na armação com a seqüência que codifica NB o vetor codifica para um C- terminal c-myc etiqueta e (A sua) 6 etiqueta. 0 peptídeo de sinal é a seqüência líder gen3 que desloca o Nanocorpo™ expresso ao periplasma.
O ADN que codifica para os nanocorpos selecionados TNFl (PMP1C2), TNF2 (PMP1G5), TNF3 (PMP5F10), ALBl (PMP6A6) e ALB2 (PMP6A8) foi clonado em pAX051 e o construto foi transformado a TGl células eletrocompetentes. Os clones foram analisados para a inserção de PCR e a seqüência de nucleotideos foi determinada de 4 clones positivos. Estoques de glicerol foram preparados de clones que contêm a seqüência correta e armazenados a-80°C.
Exemplo 5: Expressão de nanobodies monovalentes
Uma precultura foi começada inoculando uma colônia única do clone que expressa o respectivo nanobodies em 37°C em Caldo Luria, Ampicilina/Carbenicilina (100 pg/ml) e glicose de 2% durante a noite. Esta precultura foi usada para inocular. O Inoculum é 1% (v/v) da cultura de produção (meio de TB + Ampicilina/Carbenicilina + Glicose de 0,1%). A cultura de produção é cultivada em 37°C até que um OD600nm de 5-10 seja conseguido e a expressão de nanobody é induzida acrescentando IPTG (concentração final de 1 mm) . Permite-se que a expressão de proteína continue por 4h a 37 °C ou durante a noite a 28°C, no qual as células de ponto são reunidas por centrifugação e armazenadas como pasta de célula úmida a -20°C.
Extratos periplásmico preparativos da pasta de células
úmida armazenada a -20 ° são feitos re-suspendendo a pílula no Peri-buffer (NaH2P04 - 50 mm, NaCl - 300 mm, pH ajustado a 8.0), fazendo girar a mistura por 30 minuto a 4°C e centrifugando a mistura usando uma centrifugadora preparativa (Sorvall RC-3C Plus com rotor H-6000A) para comprimir as células. O Supernadante, representando um extrato áspero do espaço periplásmico, é reunido para nova purificação.
Os nanobodies His(6)-marcados são purificados em Cromatografia de Afinidade Metálica Imobilizada (IMAC). A resina de TALON (Clontech) é processada segundo instruções do fabricante. Os extratos são incubados com a resina por 30 minutos em RT em um rotor. A resina é lavada com o PSB e transferida a uma coluna. A resina empacotada é lavada com Imidazole - 15 mm. Os nanobodies são eluídos da coluna que usa Imidazole - 150 mm. As frações eluidas são analisadas por mancha em Membrana Hybond e visualizadas com Ponceau. As frações que contêm proteína são juntadas e dialisadas contra o PSB. As proteínas dialisadas são reunidas, esterilizadas com filtro, concentração determinada e armazenada em partes alíquotas a -20°c.
Caracterização de nanocorpos TNFa Monovalentes Exemplo 6: Homologia a seqüências germline humanas
As seqüências aminoácidas de nanobody foram comparadas com as seqüências germline humanas como representado na Tabela 10. Em ordem da homologia a seqüências humanas os nanobodies figuram como se segue: TNF1> TNF2> TNF3 para o nanocorpos TNFa; ALB1> ALB2 para a nanobodies de albumina de soro .
Exemplo 7: nível de expressão
Os níveis de expressão foram calculados e representados na Tabela 11. Em ordem do rendimento os nanobodies figuram como se segue: TNF1> TNF2> TNF3 para o nanocorpos TNFa; ALB1> ALB2 para a nanobodies de albumina de soro .
Exemplo 8: Análise SDS-Page
Para determinar a pureza, amostras de proteína foram analisadas em um gel de SDS-PAGE de 15%. 10 μl Laemmli buffer de amostra foi acrescentado a 10 μl (Iug) proteína purificada, a amostra foi aquecida por 10 minutos em 95°C, esfriada e carregada em um gel de SDS-PAGE de 15%. 0 gel foi processado segundo os procedimentos gerais e manchado com o Coomassie Brilliant Blue (CBB). A figura 6 representa a SDS- PAGE para o TNF α-específico e nanobodies específico de soro de albumina.
Exemplo 9: análise de Western Blot
100 ng da proteína purificada foram carregados no gel. Depois do SDS-PAGE a proteína foi transferida a uma membrana de nitrocelulose que usa o Mini Trans-Blot® Célula de Transferência Eletroforética (Biorad). A membrana foi bloqueada durante a noite no PSB, caseina 1% a 4°C. Como todos os construtos foram fundidos à etiqueta de c-myc, foi usado como ferramenta de detecção anticorpo de rato anti-myc monoclônico. Além do mais, anti-Nanocorpo policlônico de coelho (R23) foi usado como ferramenta de detecção. O blot (borrão) foi incubado por 1 h na temperatura ambiente com a agitação no anticorpo anti-myc diluído de 1/2000 no PSB ou 1/2000 anticorpo anti-Nanocorpo em PSB, caseina 1%. A membrana foi lavada 5 vezes no PSB antes que o anticorpo secundário fosse aplicado (coelho- anti-rato IgG fosfatase alcalino conjugado, Sigma, A1902, diluído 1/1000 em PSB ou anti-coelho de cabra IgG fosfatase alcalino conjugado, Sigma, A8025, caseina 1%). Depois da incubação com agitação suave por Ih na temperatura ambiente, a membrana foi lavada 5 vezes no PSB. Os borrões foram desenvolvidos usando soluções de BCIP/NBT e a reação foi parada lavando o borrão com a água milliQ quando as bandas foram claramente visíveis. A figura 7 representa a análise de Western Blot.
Exemplo 10: ELISA que liga a TNFa humano e rhesus
Um ELISA foi executado para examinar a ligação a TNFa de ser humano e rhesus. Uma chapa Maxisorp de 96 cavidades foi coberta de 2 pg/ml Neutravidin em PSB a 4°C. As chapas foram bloqueadas com caseina 1% por 2 horas em RT. TNFa biotinilado (400 ng/ml) foi acrescentado às cavidades e incubado por 1 h em RT. As amostras do Nanocorpo foram diluídas começando em 2 μg/ml e utilização 1 em 3 diluições. Os nanocorpos foram descobertos usando fosfatase alcalina de rato anti-myc (1/2000 diluído) e anti-rato de coelho (1/2000 diluído, Sigma, A1902) e pNPP (2mg/ml) como substrato. As figuras 9 e 10 representam a ligação em ELISA a ser TNFa humano e rhesus.
Os resultados são resumidos na Tabela 12. TNFl e TNF3 mostram ligação tanto a TNFa de ser humano como de rhesus. 0 TNF2 está ligando a TNFa humano mas é só fracamente reativo ao TNFa rhesus .
Exemplo 11: ensaio de inibição de receptor
A capacidade de inibir interação de receptor-ligando foi analisada para TNFa rhesus e humano. Uma chapa Maxisorp de 96 cavidades foi coberta de 2 μg/ml Enbrel em PSB à 4°C. As chapas foram bloqueadas com Caseina 1% por 2 horas em RT. As amostras do Nanocorpo foram pré-incubadas por 30 minutos em RT com TNFa biotinilado (lOng/ml) começando em uma concentração de 5 μg/ml e utilizando 1 em 2 diluições. As amostras foram acrescentadas às chapas e incubaram por 1 hora em RT. 0 TNFa biotinilado foi descoberto usando Extravidin fosfatase alcalino (1/2000 diluído) e pNPP (2mg/ml) como substrato. As figuras 11 e 12 representam uma inibição ELISA para TNFa de ser humano e rhesus. Os resultados são resumidos na Tabela 13. A inibição da ligação de ligando/receptor é observada para TNFl e TNF3 tanto para TNF de ser humano como rhesus, enquanto TNF2 só está inibindo TNFa humano.
Exemplo 12: análise de Biacore
TNFa ligação
A análise foi executada como descrito no Exemplo 3. As figuras 13 e 14 ilustram a ligação a TNFa de ser humano e rhesus via a análise Biacore. Os resultados são resumidos na Tabela 14. Os experimentos obrigatórios em Biacore confirmam os resultados de ELISA: a ligação reativa cruzada para TNFl e TNF3, enquanto TNF2 só significativamente liga TNFa humano.
Albumina de soro
A ligação esteve ensaiada conforme descrito acima exceto que séries de concentrações diferentes foram usadas. Cada concentração foi injetada por 4 minutos em uma taxa de fluxo de 45 μl/min para levar em conta a ligação ao antigeno ligado de chip. Ligação de buffer sem analito foi enviada por cima do chip na mesma taxa de fluxo para levar em conta a dissociação do Nanocorpo ligado. Depois de 15 minutos, permanecendo ligado analito foi retirado pela injeção da solução de regeneração (NaOH - 25 mm).
Dos sensorgramas obtidos para as concentrações diferentes de cada um dos KD-valores de analito foram calculados via a afinidade de estado constante quando o equilíbrio foi conseguido.
Os resultados são resumidos na Tabela 15. A reatividade cruzada é observada tanto para ALBl como ALB2. A afinidade mais alta é observada para ALB2 em TNFoí de ser humano e rhesus. Contudo, a diferença na afinidade para o ser humano/rhesus contra a albumina de soro de rato é mais pronunciado para ALB2 (fator 400), enquanto para ALBl uma diferença de um fator 12 é observada.
Exemplo 13: Bio-Ensaio
A linha de célula de fibroblasto de rato sensível a TNFa L92 9s foi usada para medir a atividade anti-TNFa dos nanocorpos selecionados. Em uma concentração suficientemente alta de TNFa no meio, isto é, dose de citotóxico, as células de L929s sofrem a necrose. A inibição da interação TNFa com o seu receptor foi determinada pré-incubando uma série de diluições de anticorpo com uma concentração citotóxica de TNFa antes de acrescentar a mistura às células. A presença de actinomicina D no meio sensibiliza as células adicionalmente a TNFa, resultando em sensibilidade aumentada do bioensaio para TNFa livre.
As células L929 foram cultivadas a quase confluência, colocadas em placa de microtitragem com 96 cavidades com 5000 células por cavidade e incubadas durante a noite. Actinomicina D foi acrescentada às células em uma concentração final de 1 ug/ml. As diluições seriais dos nanocorpos a serem testados foram misturadas com uma concentração citotóxica de TNFa (a concentração de ensaio final é 0,5 ng/ml ou 15 IU/ml) . Depois de pelo menos 30 minutos de incubação a 37°C, esta mistura foi acrescentada às células na placa. As chapas foram incubadas por 24 horas a 37°C e C02 de 5%. A viabilidade de célula foi determinada pelo uso do sal tetrazolium WST-I. As curvas de resposta de dose e os valores de EC50 foram calculados com o Prisma Graphpad.
Os resultados são resumidos na Tabela 16 para TNFa de ser humano e rhesus. Baseado na sua potência para neutralizar atividade citotóxica, as moléculas são colocadas como se segue: TNF3> TNF1> TNF2 para TNFa humano, e TNFl = TNF3> TNF2 para TNFa rhesus.
Exemplo 14: Ligação Proteína A
A figura 14 representa a ligação de Proteína A analisada em Biacore como descrito no Exemplo 12. A ligação positiva foi obtida para TNFl, TNF2, ALBl. Nenhuma ligação débil foi observada para TNF3 e ALB2.
Exemplo 15: Estabilidade de Temperatura
As amostras foram diluídas em 200 μg/ml e dividido em 8 alíquotas que contêm 500 μΐ. Os frascos diferentes foram incubados cada um em uma temperatura dada nos limites de RT a 90°C. Depois do tratamento as amostras foram esfriadas por 2 horas em RT, elas foram guardadas a 4°C. Precipitados foram retirados por centrifugação por 30 minuto em 14,000 rotações por minuto. 0 SN foi cuidadosamente retirado e além disso analisado.
OD280nm
O OD em 28 0 nm foi medido e a concentração foi calculada. Os resultados são resumidos na Tabela 17. Uma redução no conteúdo de proteína foi observada para TNF2 e TNF3 que começa em 80°C, enquanto para ALB2 uma redução é observado começando de 70°C. Western Blot
2 μg da proteína tratada foram separados em uma SDS- PAGE de 15% e transferidos a uma membrana nitrocellulose e tratados conforme descrito acima. A detecção foi executada usando anti-Nanocorpo policlônico (R23, 1/2000 diluído) e rabanete de cavalo de anti-coelho peroxidase (DAKO, P0448, 1/2000 diluído). A figura 15 representa a análise de Western Blot. Uma gota clara na concentração de proteína foi observado para ALB2 tratado a 70, 80 e 90°C. A agregação ainda era observada para TNFl tratado a 70, 80 e 900C; para o TNF3 tratado a 90°C; para o ALBl tratado a 90°C, significando que o SN ainda contém traços de precipitado que resultam em uma mais alta leitura OD280nm. Isto explica por que a concentração de proteína como medido em 00280nm não reduz para TNFl, TNF3 e ALBl tratados a estas altas T mais altas.
ELISA
O ELISA para descobrir ligação a TNFa humano foi essencialmente executado como descrito no Exemplo 10. Os resultados são apresentados na Figura 16. Ligação de TNFa humano é reduzida para TNFl, TNF2, TNF3 começando a 80°C.
Bio-Ensaio
0 Bio-Ensaio foi executado como descrito no Exemplo 13. Os resultados são resumidos na Tabela 18. A potência dos nanocorpos é reduzida para TNFl que começa em 70°C; para TNF2 e TNF3 que começa em 80°C.
Biacore
Ligação à albumina de soro humana foi determinada como descrito no Exemplo 12. Uma concentração fixa foi usada (1 em 50 diluído). Os resultados são apresentados na Figura 17.
O tratamento de temperatura não está influindo na ligação à albumina de soro para ALBl. 0 tratamento tem um efeito no kon_para ALB2 que começa de T=7 0°C.
nanocorpos bivalente
Exemplo_16: Formatação de nanocorpos TNFa bivalentes específicos
O TNF1, TNF2 e TNF3 foram formatados a nanobodies bivalentes. Como o espaçador entre as duas construções bloqueia qualquer um 9AA GlySer linker (Tabela 19 SEQ ID n. 68) ou uns 30 AA GlySer linker (Tabela 19 SEQ ID n. 69) foi usado. Isto gerou os construtos representados pela Tabela 20. Tabela 19 lista as seqüências desses nanobodies TNF a bivalentes (SEQ ID NÚMEROS: 70 para 75).
Exemplo 17: Expressão de nanocorpos TNFa bivalentes específicos
A expressão foi executada como descrito no Exemplo 5. Os nanobodies His(6)-marcados foram purificados na Cromatografia por Afinidade Metálica Imobilizada (IMAC). A resina Ni-NTA (Qiagen) foi processada segundo instruções do fabricante. Os extratos foram incubados com a resina e incubaram por 30 minutos em RT em um rotor. A resina foi lavada com PSB e transferida a uma coluna. A resina empacotada foi lavada com PSB (1 em 10 diluído) . A coluna foi pre-eluída com Imidazole de 15 mm. Os nanobodies foram eluídos da coluna usando Ácido cítrico de 25 mm pH=4. As frações eluidas foram analisadas manchando-se na Membrana Hybond e pela visualização com Ponceau. As frações que contêm proteína foram juntadas e além disso purificadas na troca de Cations seguida pela exclusão de tamanho. A proteína purificada foi reunida, filtro esterilizada, concentração determinada e armazenada em alíquotas a -20°C.
Caracterização de nanocorpos TNFa bivalentes específicos Exemplo 18: nivel de expressão
Os níveis de expressão do nanocorpos TNFoí bivalentes foram calculados e representados na Tabela 21. 0 linker não tem nenhum efeito significativo no nivel de expressão do nanobodies.
Exemplo 19: SDS-PAGE
A SDS-Page foi executada como descrito no Exemplo 8. A figura 18 mostra o resultado da SDS-Page.
Exemplo 20: Western Blot
A análise de Western Blot foi executada como descrito no Exemplo 9. A figura 19 representa os resultados de Western Blot.
Exemplo 21: Ensaio de inibição de receptor
0 ensaio foi executado como descrito no Exemplo 11. A figura 20 e a Tabela 22 representam os resultados. 0 aumento da inibição da ligação de ligando/receptor foi observado para todos os nanocorpos bivalentes em comparação com o formato monovalente.
Exemplo 22: Bio-Ensaio
0 ensaio foi executado como descrito no Exemplo 13. Os resultados são resumidos na Tabela 23. Baseado na sua potência para neutralizar atividade citotóxica TNF8, TNF7, TNF9 e TNF5 têm uma potência na variedade de Enbrel.
Exemplo 23: Estabilidade de Temperatura
As amostras foram analisadas como descrito no Exemplo 15.
OD2 8Q nm
O OD em 280 nm foi medido e a concentração foi calculada. Resultados são resumidos na Tabela 24. Uma redução no conteúdo de proteína foi observada para TNF4 e TNF7 que começa em 70°C, enquanto para TNF5, TNF6, TNF8 e TNF9 uma redução foi observada começando de 80°C. Western Blot
As amostras foram analisadas para a presença de agregados como descrito no Exemplo 15.
ELISA
O ELISA para descobrir ligação a TNFa humano foi essencialmente executado conforme descrito acima. Os resultados são apresentados na Figura 21. Ligação TNFoí humano foi reduzido para TNF5, TNF6, TNF8 e TNF9 que começa em 80°C, para TNF4 e TNF7 que começa de 70°C.
nanocorpos monovalente Humanizados
Exemplo 24: Identificação de posições aminoácidas não- humanas em TNFa e nanobodies de albumina de soro especifico
A figura 22 (TNFl), a Figura 23 (TNF2), a Figura 24 (TNF3) e a Figura 25 (ALBl) representam múltiplos alinhamentos de seqüência (Clustal W 1.7) com DP51, DP53, DP54 e seqüências DP29.
Além das mutações aminoácidas, codon otimização foi executado produzindo as seqüências da Tabela 25 SEQ ID NÚMEROS: 7 6 para 89 (nanocorpos contra albumina de soro TNF- alfa e humana, respectivamente).
Exemplo 25: a Geração de codon otimizou mutantes
Os Oligonucleotideos foram sintetizados medindo por palmos a seqüência inteira do nanobodies.
Exemplo 26: Expressão de nanocorpos TNFa bivalentes especifico
A expressão foi executada como descrito no Exemplo 5.
Caracterização do Nanocorpo humanizado
Exemplo 27: nivel de expressão
A tabela 2 6 representa níveis de expressão calculados. A expressão foi realizada com rendimentos na variedade de 3.5-11.7 mg/ml. O tempo de indução não influiu no rendimento.
Exemplo 28: SDS-PAGE
A SDS-PAGE foi executada como descrito no Exemplo 8. A figura 26 representa o gel de SDS-PAGE.
Exemplo 29: Western Blot
A análise de Western Blot foi executada como descrito no Exemplo 9. A figura 27 representa os resultados de Western Blot.
Exemplo 30: Bio-Ensaio
O ensaio foi executado como descrito no Exemplo 13. Os resultados dos nanocorpos humanizado são resumidos na Tabela 27. Os nanobodies de tipo natural estão incluídos como referência.
Exemplo 31: Biacore
A análise foi executada como descrito no Exemplo 12. A figura 28 e 31 mostra resultados de Biacore.
Exemplo 32: estabilidade de Temperatura
As amostras foram analisadas como descrito no Exemplo 15.
OD280 nm
O OD em 280 nm foi medido e a concentração foi calculada. Os resultados são resumidos na Tabela 28.
Nenhuma redução significativa na concentração de proteína é observada para os nanobodies TNFl humanizados (TNF13-14). Uma redução na concentração de proteína é observada para TNF2 humanizado (TNF15-19) e TNF3 (TNF20-23) 35 começando em 80°C. Uma redução na concentração de proteína é observada para humanizada ALBl (ALB4-5) começando em 70°C e para ALB3 que começa em 60°C.
Western Blot
As amostras foram analisadas para a presença de agregados como descrito no Exemplo 15.
ELISA
O ELISA para descobrir ligação a TNFa humano foi essencialmente executado como descrito no Exemplo 15. Os resultados são apresentados na Figura 30.
Ligação TNFa humano é comparável para a WT TNFl tratado a temperatura e o TNF13 humanizado e 14; para a WT TNF2 tratado a temperatura e o TNF15-19 humanizado; Ligação TNFa humano é reduzido para TNF21 e 22, e a menos extensão para TNF23, enquanto nenhum efeito é observado para TNF20 em comparação com a WT TNF3 tratado a temperatura.
nanocorpos TNFa trivalentes
Exemplo 33: Formatação_de nanocorpos TNFa trivalentes específicos
O TNF1, TNF2, TNF3 e ALB1 foram formatados a nanobodies trivalentes. Como o espaçador entre 2 construções bloqueia qualquer um 9AA GlySer linker (Tabela 19 SEQ ID n. 68) ou uns 30 AA GlySer linker (Tabela 19 SEQ ID n. 69) foi usado. Isto gerou os construtos da Tabela 30. Tabela 29 lista as seqüências de nanocorpos TNFa trivalentes (SEQ ID NÚMEROS: 91 para 94).
Exemplo 34: Expressão de Nanocorpo específico TNFa trivalente
A expressão foi executada como descrito no Exemplo 5. nanocorpos marcados His(6) são purificados na Cromatografia por Afinidade Metálica Imobilizada (IMAC). A resina Ni-NTA (Qiagen) é processada segundo instruções do fabricante. Os extratos são incubados com a resina e incubados por 30 minutos em RT em um rotor. A resina é lavada com o PSB e transferida a uma coluna. A resina empacotada é lavada com o PSB (1 em 10 diluído). Pre-eluido com Imidazole de 15 mm. Os nanobodies são eluídos da coluna que usa Ácido cítrico de 25 mm pH=4. As frações eluidas são analisadas manchando-se em Membrana Hybond e visualização com Ponceau. As frações que contêm proteína são juntadas e além disso purificadas na troca de Cation seguida pela exclusão de tamanho. A proteína purificada é reunida, esterilizada com filtro, concentração determinada e armazenada em alíquotas a -20°C.
Caracterização de nanocorpos específicos TNFg/SA trivalentes Exemplo 35: Nível de expressão
Os níveis de expressão foram calculados e representados na Tabela 31.
Exemplo 36: análise de SDS-PA6E
A SDS-PAGE foi executada como descrito no Exemplo 8. A figura 31 representa o gel de SDS-PAGE.
Exemplo 37: Análise de Western Blot
A análise de Western Blot foi executada como descrito no Exemplo 9. A figura 32 representa a análise de Western Blot.
Exemplo 38: Bio-Ensaio
O ensaio foi executado como descrito no Exemplo 13.
Os resultados dos nanocorpos bivalentes são resumidos na Tabela 32. Baseado na sua potência para neutralizar atividade citotóxica, as moléculas são igualmente potentes e comparáveis com a sua potência como moléculas bivalentes.
Exemplo 39: Ligação a Albumina de Soro Humana
A ligação esteve ensaiada conforme descrito acima exceto que séries de concentrações diferentes foram usadas. Cada concentração foi injetada por 4 minutos em uma taxa de fluxo de 45 μl/min para levar em conta a ligação ao antigeno ligado de chip. Depois, ligação de buffer sem analito foi enviada por cima do chip na mesma taxa de fluxo para levar em conta a dissociação do Nanocorpo ligado. Depois de 15 minutos, permanecendo ligado, o analito foi retirado pela injeção da solução de regeneração (NaOH de 25 mm).
Dos sensorgramas obtidos para as concentrações diferentes de cada um os KD-valores do analito foram calculados via a afinidade de estado constante quando o equilíbrio foi conseguido.
Os resultados são resumidos na Tabela 33. Uma redução na afinidade foi observada para a aglutinante ALBl formatado em comparação com o tipo natural ALBl. A afinidade contudo está ainda na variedade de 7.2-14 nM.
Exemplo 40: estabilidade de Temperatura
As amostras foram analisadas como descrito no Exemplo 15.
OD280 nm
O OD em 280 nm foi medido e a concentração foi calculada. Os resultados são resumidos na Tabela 34. Uma redução no conteúdo de proteína é observada para TNF24, TNF27 e TNF28 que começa em 60°C, enquanto para TNF25 e TNF2 6 que começa de 70°C.
Western Blot
As amostras foram analisadas para a presença de agregados como descrito no Exemplo 15.
ELISA
O ELISA para descobrir ligação a TNFa humano foi essencialmente executado conforme descrito acima. Os resultados são apresentados na Figura 33. Ligação TNFcx humano é reduzido para TNF24 e TNF27, que começa de 600C e para TNF25, TNF2 6 e TNF28 que começa em 70°C.
nanocorpos monovalente Humanizados (segundo círculo) Exemplo 41: Identificação de posições aminoácidas não- humanas em TNFa e nanobodies de albumina de soro específico
A figura 34 (TNFl), a Figura 35 (TNF2), a Figura 36 (TNF3) e a Figura 37 (ALBl) representam múltiplos alinhamentos de seqüência (Clustal W 1.7) com DP51, DP53, DP54 e seqüências DP29. As moléculas transformadas foram expressadas e purificadas conforme descrito acima, produzindo as seqüências da Tabela 35 SEQ ID N°: 95 a 104 (contra albumina de soro TNF-alfa e humana, respectivamente).
Caracterização do Nanocorpo humanizado Exemplo 42: nível de expressão
A tabela 36 representa níveis de expressão calculados. A expressão foi realizada com rendimentos na variedade de 0, 5-2.7 mg/ml.
Exemplo 43: SDS-PA6E
A SDS-Page foi executada como descrito no Exemplo 8. A figura 38 representa o gel de SDS-Page.
Exemplo 44: Western Blot
A análise de Western Blot foi executada como descrito no Exemplo 9. A figura 39 representa os resultados de Western Blot.
Exemplo 45: Bio-Ensaio
0 ensaio foi executado como descrito no Exemplo 13.
Os resultados dos nanocorpos humanizado são resumidos na Tabela 37. Os nanobodies de tipo natural e primeiro ao redor de nanobodies humanizados estão incluídos como referência.
Exemplo 46: Biacore
A análise foi executada como descrito no Exemplo 12. A figura 40 mostra resultados de Biacore.
Exemplo 47: estabilidade de Temperatura
As amostras foram analisadas como descrito no Exemplo 15.
OD2 8Q nm
O OD em 280 nm foi medido e a concentração foi calculada. Os resultados são resumidos na Tabela 38.
Nenhuma redução significativa na concentração de proteína é observada para os nanobodies TNFl humanizados (TNF2 9-30). Uma redução na concentração de proteína é observada para TNF2 humanizado (TNF31-32) e TNF3 (TNF33) começando em 80°C.
Western Blot
As amostras foram analisadas para a presença de agregados como descrito no Exemplo 15.
ELISA
O ELISA para descobrir ligação a TNFa humano foi essencialmente executado como descrito no Exemplo 15. Os resultados são apresentados na Figura 41.
Ligação TNFa humano é comparável para a WT TNFl e o TNF2 9 humanizado e TNF30; comparável para WT TNF2 e o TNF31 humanizado e TNF32; e também para WT TNF3 e TNF33 humanizado.
Exemplo Comparativo
Neste Exemplo Comparativo, nove nanocorpos da invenção foram comparados com três nanocorpos de WO 04/0418 62, chamado "VHH#1A" ou "1A", "VHH3E" ou "3E" e "VHH#3G" ou "3G" respectivamente (SEQ ID N0S:1, 4 e 5 em WO 04/041862). O ensaio usado foi o ensaio baseado da célula que usa KYM- células mencionadas em WO 04/41862 (ver, por exemplo, o Exemplo 1, conforme 3) ). Os resultados são mencionados na Tabela 39 mais adiante. Como pode ser visto, os nanocorpos da invenção têm um valor de EC50 neste ensaio que é de 18 vezes melhor do que o valor de EC50 de 3E, o Nanocorpo de melhor execução segundo o WO 04/041862.
Exemplo 48: a Geração de nanocorpos™ humanizados biespecificos trivalentes
nanocorpos Biespecificos trivalentes foram formatados e clonados no E. coli o vetor de expressão pAX054 primeiro e logo resgatado através de PCR e clonado no vetor de expressão pPICZaA.
Descrição de Vetor de expressão Escherichia coli
O pAX54 é um derivado de pUCl9. Ele contém o promotor LacZ que permite uma indução controlada da expressão que usa IPTG. O vetor tem um gene de resistência para Ampicilina ou Carbenicilina. Os sitios que se multiclonam abrigam vários sítios de restrição em que SfiEu e BstEII são freqüentemente usados para clonagem de nanocorpos™. O peptídeo de sinal é a seqüência líder gen3 que desloca o Nanocorpo™ expresso ao periplasma.
Descrição do vetor de expressão Pichia pastoris
O pPICZαA contém uma origem pUC-derivada da réplica que permite propagação em E coli. Ele contém o promotor do gene Pichia pastoris AOXl (álcool oxidase 1). Esta 942 região de promotor bp (i) permite o metanol-induzível, expressão de alto nível do gene do interesse, e (ii) objetiva a integração de plasmídeo ao local AOXl depois da transformação de Pichia com o ADN vetorial que é linearizado dentro da 5a região de promotor de AOX1. Observe que pPICZα vetores não contêm uma origem de levedura da réplica e que, conseqüentemente, os transformantes só podem ser isolados se a recombinação ocorrer entre o plasmideo e a genoma Pichia.
O vetor especifica a resistência ao antibiótico Zeocin tanto em células hospedeiras E. coli como em Pichia pastoris. O vetor incorpora o sinal de secreção do fator de oí- acoplamento de Saccharomyces cerevisiae levando em conta a secreção eficiente da maior parte de proteína ao meio de cultura. A iniciação ATG na seqüência do sinal de fator α corresponde à iniciação nativa ATG do gene AOX1. O sítio que se multiclona abriga vários sítios de restrição dos quais Xhol/EcoRl ou Xhol/Notl são tipicamente usados para fusão das seqüências de codificação do Nanocorpo™ ao sinal de secreção. O sítio que se multiclona é seguido pela região de terminação de transcrição AOXl. Mais detalhes deste vetor de expressão podem ser encontrados no web site de Invitrogen (http://www. invitrogen. com/content/sfs/manuals/ppiczalpha ma n.pdf).
Formatação de nanocozpos trivalentes
Três reações PCR separadas foram fundadas para amplificar a subunidade N-terminal, o meio e o C-terminal Nanocorpo™ usando as oligo-combinações indicadas no WPA- 0012. O N-terminal Nanocorpo™ foi amplificado usando m13_rev/Rev_9GlySer_L108; o meio Nanocorpo™ foi amplificado usando For_GlySer/Curto e Rev_15BspEI_L108; o C-terminal Nanocorpo™ foi amplificado usando For_BspEI/M13_for. Uma reação PCR de 1 μl plasmideo ADN (50-100 ng), 1.5 μl escorvador direto (10 μ M — 300 nM), 1.5 μl escorvador inverso (10 μ M -> 300 nM), 1 μΐ dNTPs (10 mM - 0,2 mM), 5 μl buffer (10x -> 1x), 0,75 μΐ enzima (3.5 U / μl -> 2.6 U / μl) e 39.25 μl H20 com um volume total de 50 μΐ foi preparado. As seqüências de escorvador são dadas na Tabela 40. Um programa PCR foi começado com 2 minutos a 94°C. Um ciclo de 30 segundos a 94°C, 30 segundos em 50°C e 1 minuto em 72°C foi repetido 30 vezes e seguido por 10 minutos em 72°C. A amplificação foi verificada separando 5 µl da reação PCR em 2% agarose gel. O produto PCR foi purificado usando o QIAquick PCR Conjunto de Purificação segundo instruções do fabricante. Uma coluna foi usada e eluida com 50 µl EB buffer. O fragmento N-terminal de VHH foi preparado incubando 50 µl ADN e 2 µl BamHI (10 U / µl) no buffer apropriado recomendado pelo fabricante em 370C para 2 horas. Posteriormente, 2 µl SfiI (10U / µl) foi acrescentado e a mistura foi incubada em 55°C para 2 horas. O fragmento de VHH meio foi preparado incubando 50 µl ADN e 2 µl BamHI (10 U / µl) e 2 µl BspEI (10 U / µl) no buffer apropriado recomendado pelo fabricante em 370C para 2 horas. O Fragmento C-terminal de VHH foi preparado incubando 50 µl ADN com 2 µl BspEI (10 U / µl) no buffer apropriado recomendado pelo fabricante em 37 0C para 2 horas. Posteriormente, 2 µl BstEII (10U / µl) foi acrescentado e a mistura foi incubada em 60 0C por 1 hora. As reações de digestão prévias foram separadas em 2% agarose gel. As bandas de VHH (350-450 bp) foram cortadas do gel e o ADN foi purificado usando o Conjunto de Extração de Gel QIAquick segundo instruções do fabricante. Uma coluna (com um máximo de 400 mgs agarose gel por coluna) foi usada e o ADN ligado foi eluido com 50 µl EB buffer. A concentração de ADN foi determinada medindo OD2 60 (1 unidade OD = 50 µg/ml) . Uma mistura de ligação com um volume final de 10 µl contendo 100 ng vetor pAX54, 12 N-terminal ng VHH, 12 fragmento de VHH meio ng, 12 C-terminal ng fragmento de fragmento de VHH, 1 µl de buffer de ligação e 1 µl ligase (3U) foi preparado e incubou-se por 2 horas na temperatura ambiente. A transformação de E. coli, TGl foi executada usando 2 µl de mistura de ligação. As colônias são analisadas usando PCR como descrito em WPA-0010. A análise de seqüência é executada em clones positivos. A preparação de Plasmideo foi executada usando o conjunto Qiaprep spin Miniprep (Qiagen) segundo instruções do fabricante e descrito anteriormente. 0 Seqüenciamento foi executado na instalação de seqüência VIB, Antuérpia, Bélgica.
Amplificação de DNA de Codificação
A região de codificação do Nanocorpo™ clonada no pAX054 E. coli vetor de expressão é resgatada através de PCR utilizando um par de escorvador apropriado. Para assegurar que o Nanocorpo™ é expresso com um N-término nativa, a região de codificação é clonada na armação com o sitio de rachadura Kex2 do sinal de secreção. 0 escorvador avançado funde a parte C-terminal do sinal de secreção, até o sitio de reconhecimento Xhol, ao Nanocorpo™ codificação de região. Uma reação PCR de 1 μl plasmideo ADN (50-100 ng), 1.5 μl expede o escorvador (10 μ M 300 nM), 1.5 μl inverte o escorvador (10 μ M - 300 nM), 1 μl dNTPs (10 mM -> 0,2 mM), 5 μl buffer (IOx - lx), 0,75 μΐ enzima (3.5 U / μl -? 2.6 U) e 39.25 μl H20 com um volume total de 50 μΐ foi preparado. As seqüências de escorvador são dadas na Tabela 41. Um programa PCR foi começado com 2 minutos a 94°C. Um ciclo de 30 segundos a 94°C, 30 segundos em 50°C e 2 minutos em 72°C foi repetido 20 vezes e seguido por 10 minutos em 72°C. A amplificação foi verificada separando 5 μl da reação PCR em 2% agarose gel. 0 produto PCR foi purificado usando o QIAquick PCR Conjunto de Purificação segundo instruções do fabricante. Uma coluna foi usada e o ADN ligado foi eluido com 50 μl de buffer EB.
Estratégia de Clonagem
0 fragmento de ADN que codifica para NB bem como o vetor de expressão pPICZaA é digerido com as enzimas de restrição apropriadas (XhoI + NotI). A inserção é obtida incubando 50 μl do produto PCR com 2 μl XhoI (10 U / μl) e 2 μl NotI (10 U / μl) no buffer apropriado recomendado pelo fabricante para 3 horas em 37°C. O vetor é obtido semelhantemente adaptando a quantidade de enzimas de restrição para a quantidade de plasmideo. Tanto o vetor como o fragmento que codifica NB são purificados e a concentração de ADN é quantificada usando o BioPhotometer (Eppendorf). O fragmento e o vetor de aceitante são ligados utilizando proporção equimolar 1 Unidade T4 ligase (Promega) por 30 minutos na temperatura ambiente ou durante a noite a 16°C. O ADN (20-30 ng) é transformado a células TGl. As colônias são analisadas através de PCR utilizando escorvadores 3'AOXl R e 5Ά0Χ1 F. A análise de seqüência é executada em clones positivos. 0 TNF30, TNF33 e ALB 8 foram formatados a nanocorpos™ trivalentes biespecificos. Como o espaçador entre as construções bloqueia um 9AA GlySer linker foi usado.
Transformação P. pastoris
Para isolar o ADN plasmideo, uma precultura é começada inoculando uma colônia única do clone em 50 ml Caldo Luria + Ampicilina ou Carbenicilina (100 μg/ml) + glicose a 2% e incubação a 370C durante a noite. 0 ADN Plasmideo é preparado usando o conjunto Midi Plasmideo (Qiagen) segundo instruções do fabricante. 0 ADN é linearizado incubando 30 μg plasmideo ADN com 6 μΐ BstXl (10 U / μl) no buffer apropriado segundo as instruções do fabricante por 3 horas a 45°C. O ADN digerido é purificado usando o conjunto de Purificação PCR (Qiagen) segundo instruções do fabricante. 0 ADN é concentrado usando precipitação de EtOH segundo os procedimentos padrão. As células X-33 eletrocompetentes são transformadas com 10 μg de DNA linearizado e células são deixadas crescer por 48 horas em uma chapa de ágar-ágar YPD seletiva que contém Zeocin (100/250/500 μg/ml). 0 X-33 é uma classe de tipo natural de Pichia pastoris; a própria classe bem como as classes de recombinante derivadas contêm o gene AOXl nativo e são capazes de metabolizar o metanol (Mut +).
Os clones são protegidos para nivel de expressão inoculando as colônias únicas em 1 ml BGCM em uma placa de 24 orifícios e cultivando-os por 48 horas a 30°C a 120 rotações por minuto. As células são centrifugadas e BMCM fresco é acrescentado às células para crescimento a 30°C a 120 rotações por minuto durante 48 horas. Depois, MeOH é acrescentado a uma concentração final de 0,5% e as células são cultivadas a 300C a 120 rotações por minuto durante 8 horas, depois do qual MeOH é acrescentado novamente a uma concentração final de 0,5%. As células são cultivadas noturnas a 30°C a 120 rotações por minuto. As células são centrifugadas e o supernadante é colhido e analisado em ELISA como descrito no exemplo 10.
Exemplo 49: Expressão e a purificação de nanocorpos™ humanizados biespecíficos trivalentes
Produção em Pichia pastoris
A composição de buffers, soluções e outros pode ser encontrada no web site de Invitrogen (http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha_ma n.pdf).
Uma precultura foi começada inoculando uma colônia única da chapa em 5 ml YPD. A cultura foi cultivada noturnamente a 180 rotações por minuto e 30°C. No dia seguinte, a pré- cultura foi diluída a 50 ml de YPD e cultivada noturnamente a 180 rotações por minuto e 30°C. As culturas de produção foram começadas inoculando a pré-cultura a um OD600nm final = 0,04-0,08. As culturas foram cultivadas em BGCM por 24 horas a 30 ºC a 180 rotações por minuto e centrifugadas a 4,500 rotações por minuto por 30 minutos. As células foram re-suspensas em 1/3 do volume original no meio BMCM com um final OD600 nm = 15-20. As células não foram induzidas com MeOH em pontos de tempo regulares, tipicamente 3 tempos/dia, nunca excedendo o conteúdo de MeOH de 1%. Depois de 50 horas da indução o supernadante é colhido. Purificação do Nanocorpo expressado em Pichia pastoris
A cultura supernadante é filtrada sobre uma membrana de micro filtração de 22 μπι (Hydrosart, Sartorius). A amostra é concentrada usando diafiltração em 10kDa membrana de filtração extrema (HydroSart, Sartorius) e concentrada a 0,5-1L.
Os nanocorpos™ são purificados usando Cromatografia de afinidade à Proteína A (MabSelect Xtra, GE Healthcare) utilizando PSB como buffer de trabalho e Glicina [100 mm pH=2.5] para eluição. As amostras são neutralizadas usando 1.5 M Tris pH=8.8. Os nanocorpos™ são além disso processados na Cromatografia de Troca de Anion (Fonte 30Q, GE Healtcare) . As amostras são diluídas 10 vezes com 10 mm Piperazina pH=10,2 e ajustadas a pH=10,2 com IM NaOH e uma condutividade de <2mS/cm com a água MilliQ.
Os nanocorpos são processados na Cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 75pg, Hiload XK26/60, GE Healtcare) e LPS é retirado via Cromatografia de Troca de Anion (Fonte 30Q, GE Healtcare) pela passagem através de coluna de 5ml, que é sanitizada com IM NaOH e equilibrada no PSB Dulbecco.
Para determinar a pureza, as amostras de proteína foram analisadas em um gel de SDS-PAGE de 15% como descrito no exemplo 8. 0 gel é processado usando o SilverQuest ™ segundo os procedimentos gerais descritos pelo fabricante (Invitrogen). Alternativamente, o gel é processado usando coomassie brilliant blue ou no western blot como descrito no exemplo 8 e 9. Os resultados são dados na Figura 42.
Exemplo 50: a Caracterização de nanocorpos™ humanizados hiespecificos trivalentes
0 TNF60 compõe-se de 363 aminoácidos. A proteína tem um peso molecular de 38, 441 Da. 0 pi é 8.71. 0 coeficiente de extinção em 280 nm é 1.736. Espectrofotcmietria de massa.
A massa da proteína foi determinada na ESI-MS segundo os procedimentos padrão. A massa teórica de TNF60 é 38,441 Da. A proteína tem 2 pontes de S-S que devem resultar em uma massa de 38, 435 Da na ESI-MS. A massa que foi experimentalmente determinada para TNF60 derivada de 3 variedades de lotes diferentes de 38,433 Da a 38,435 Da, diferenciando-se maximamente 0,005% com a massa teórica.
Sequenciamento de N-terminal
O Sequenciamento do N-terminal foi executado pela degradação Edman segundo os procedimentos padrão. 0 Sequenciamento do N-terminal mostrou que a seqüência de proteína para 7 primeiros aminoácidos é como se segue: EVQLVES. Isto é, compatível com a seqüência de proteína teórica, que indica o processamento de N-terminal próprio.
Ajustamento analítico
As amostras (100 ug) foram analisadas na coluna Superdex75 de alta resolução, para caracterizar os lotes diferentes do Nanocorpo™. A cromatografia de exclusão por tamanho do Nanocorpo™ tipicamente produz um pico simétrico, com um tempo de retenção de 11.5 ml em Superdex75. A absorbância é tipicamente registrada em 280, 254 e 214 nm. A medição 214 nm permite a mais alta sensibilidade de detecção. 0 ajustamento analítico no PSB fornece um pico simétrico. Nenhum contaminante foi observado. 0 tempo de retenção observado para 3 lotes diferentes é 11,5-11,55 ml.
Um perfil representativo é mostrado na Figura 43.
Exemplo 51: Ligação de TNF60 a TNFa humano em ELISA
A funcionalidade de TNF60, isto é, ligando a TNFa humano foi analisada em ELISA como descrito no exemplo 10.
Os resultados são resumidos na Figura 4 4 e claramente demonstram uma ligação dependente de dose e saturável de 2 lotes de TNF60 a TNFcx humano.
Exemplo 52: Funcionalidade em ensaio à base de Célula
A potência para neutralizar a atividade citotóxica de TNFa foi analisada em um ensaio à base de célula como descrito no exemplo 13. Os resultados são resumidos na Tabela 42 e nas Figuras 45 e 46.
Os dados mostram que TNF60 tem a potência na variedade de Enbrel/Etanercept e uma melhor potência de 10 vezes do que Humira/Adalimumab e Remicade/Infliximab.
Exeoplo 53: Ligação de TNF60 a albumina de soro
Ligação a albumina de soro de ser humano e de rhesus foi analisada em Biacore como descrito no exemplo 12. Os KD, kon e os valores de koff são representados na Tabela 43. O TNF60 é em comparação com TNF2 4, que é o Nanocorpo pai biespecifico trivalente ™ com o tipo natural de blocos de construção.
A afinidade de TNF60 para albumina de soro de ser humano e rhesus é semelhante. A afinidade é de 2 vezes mais baixa comparando com a afinidade observada para TNF24 que é o análogo de tipo natural de TNF60. O Kon é idêntico para ambas as moléculas, mas o koff é de 2 vezes mais alto para TNF60.
Exeogplo 54: Farmacocinética e a análise de imunogenicidade de nanocorpos humanizados biespecificos trivalentes em ratos Animais
Ratos DBAl ou BALBc foram aquecidos embaixo de uma lâmpada infravermelha e 200 μl Nanocorpo™ (100 μg por rato) foi injetado intravenosamente no rabo. As amostras de sangue foram obtidas em pontos de tempo diferentes fazendo uma pequena incisão no rabo e reunindo o sangue em um microtubo. Tipicamente, o sangue foi experimentado no minuto t=15, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 7 dias, 14 dias. 0 soro foi preparado segundo os procedimentos padrão.
Determinação da concentração de Nanocorpo™ em soro de rato
Uma microplaca de titragem (NUNC, Maxisorb) foi coberta de 2 μg/ml neutravidin durante a noite a 4 °C. A chapa foi lavada 5 vezes com o% de PBS/0,05 Tween-20 e bloqueada para 2 horas em RT com o caseina 1% de PBS/1. TNFa biotinilado humano (1/2000 em PBS/0,2% caseina; 400 ng/ml) foi aplicado às cavidades e incubado por Ihr em RT. O Nanocorpo™ referência padrão foi aplicado começando em uma concentração de 5 pg/ml e utilizando diluições de 5 vezes em PSB que contém plasma de rato de 1%. Permitiu-se que os nanocorpos™ se ligassem por 2 horas ao RT. A chapa foi lavada 5 vezes e foi aplicado anti-Nanocorpo policlônico de coelho (R23) em uma diluição de 2000 vezes para uma hora em RT. Depois de lavar a chapa, a ligação foi descoberta com cabra- policlonal-anti-coelho-HRP (DAKO) em uma diluição de 3000 vezes por uma hora em RT, e manchada com ABTS/H202. 0 OD405nm foi medido.
O primeiro ELISA foi usado para determinar a variedade linear da referência padrão. Em um segundo ELISA, a referência padrão foi usada em concentrações nesta variedade linear e tipicamente utilizando diluições de 2 vezes. Neste segundo ELISA, as amostras de teste de soro foram diluidas às diluições de 5 vezes de 100 vezes e novas foram feitas no plasma de rato de 1%, para determinar a diluição na qual as amostras de soro fornecem uma leitura na variedade linear da curva padrão. Em um terceiro ELISA, as amostras de soro são diluidas em uma concentração apropriada determinada no segundo ELISA e utilizando diluições de 2 vezes para determinação exata da concentração de Nanocorpo™ nas amostras de soro.
Os experimentos foram executados para determinar o perfil farmacocinético de TNF60 em ratos (n=3). Um valor de Cmax de 103, 84 ± 31 μ o g/ml foi conseguido 15 minutos depois da administração. A meia-vida (tl/2 β) foi determinada para ser 1.9 dias, semelhantes à meia-vida da 5 albumina de soro de rato, indicando que TNF60 adota a meia- vida da albumina de soro. Os dados são apresentados na Figura 47.
Determinação de anticorpos anti-Nanocorpo em ratos
Nanocorpo™ foi coberto em 5 μg/ml em PSB a 40C durante a noite. A chapa foi lavada 5 vezes com o% de PBS/0,05 Tween-20 e bloqueada por 2 horas em RT com o PBS/1% caseina. As amostras de soro foram diluídas 100 vezes e se aplicaram às cavidades para a incubação durante 1 hora na temperatura ambiente. A detecção foi executada usando o HRP de coelho policlônico diluído de 1000 vezes anti-rato (DAKO, P0260) e usando ABTS como substrato.
As amostras de soro foram diluídas 50 vezes e analisadas para a presença de anticorpos de rato anti-TNF60. A falta de imunogenicidade foi demonstrada para TNF60. Os dados são apresentados na Figura 48.
Exemplo 55: Geração de nanocorpos™ humanizados de meia-vida longa bivalentes
Descrição de vetor de escpressão Pichia pastoris
Ver o exemplo 48 Formatação de nanocorpos™ bivalentes
Duas reações PCR separadas foram estabelecidas para amplificar a subunidade do Nanocorpo™ N-terminal e C- terminal que usa os procedimentos como indicado no WPA-0011. Para a amplificação do N-terminal Nanocorpo™ PiForLong e Rev_30GlySer_L108 foram usados como combinação de escorvador; para a amplificação do C-terminal Nanocorpo™ For_GlySer e PiRevCyslhum foi usado ou alternativamente For_GlySer e PiRevCys2hum, introduzindo os sítios de restrição requeridos para formatando e resíduos de cisteina livres requeridos para modificações de C-terminal. A reação de PCR de 1 μΐ plasmídeo ADN (50-100 ng) , 1.5 μl escorvador direto (10 μ M 300 nM) , 1.5 μl escorvador inverso (10 μ M - 300 nM), 1 μl dNTPs (10 mM → 0,2 mM), 5 μl buffer (10x lx) , 0,75 μΐ enzima (3.5 U / μl → 2.6 U / μl) e 39.25 μl H20 com um volume total de 50 μl foi preparado. As seqüências de escorvador são dadas na Tabela 44. Um programa PCR foi começado com 2 minutos a 94°C. Um ciclo de segundos a 94°C, 30 segundos em 50°C e 1 minuto em 72°C foi repetido 30 vezes e seguido por 10 minutos em 72°C. A amplificação foi verificada separando 5 μl da reação PCR em 2% agarose gel. O produto PCR foi purificado usando o QIAquick PCR Conjunto de Purificação segundo instruções do fabricante. Uma coluna foi usada e eluída com 50 μl EB buffer. O fragmento N-terminal de VHH foi preparado incubando 50 μl ADN e 2 μl BamHI (10 U / μl) e 2 μl XhoI (10 U / μl) no buffer apropriado recomendado pelo fabricante a 37°C por 1.5 horas. O fragmento de VHH foi preparado incubando 50 μl de DNA e 2 μl de BamHI (10 U/μΙ) e 2 μl de EcoRI (10 U/μΙ) no buffer apropriado recomendado pelo fabricante a 37°C por 1 hora. As reações de digestão prévias foram separadas em gel agarose a 2%. As bandas de VHH (350- 450 bp) foram cortadas do gel e o DNA foi purificado usando o Conjunto de Extração de Gel QIAquick segundo instruções do fabricante. Uma coluna (com um máximo de 400 mgs de gel agarose por coluna) foi usada e o DNA ligado foi eluído com 50 μl de EB buffer. A concentração de DNA foi determinada medindo OD2 60 (1 unidade OD = 50 μg/ml) . Uma mistura de ligação com um volume final de 10 μl contendo 100 ng de vetor pPICZoíA, linearizada com Xhol/EcoRI, 30 ng de N- terminal VHH, 30 ng de N-terminal VHH fragmento fragmento, 1 μl de buffer de ligação e 1 μl de ligase (3U) foi preparada e incubada por 1 hora em RT. A transformação de E. coli, TGl foi executada usando 2 μl de ligação de mistura. As colônias são analisadas usando PCR conforme descrito em WPA-0010, mas usando a combinação de escorvador AOXIFor/AOXIRev. A análise de seqüência é executada em clones positivos. A preparação de plasmideo foi executada usando o conjunto Qiaprep spin Miniprep (Qiagen) segundo instruções do fabricante e descrita anteriormente. O seqüenciamento foi executado na instalação de seqüência VIB, Antuérpia, Bélgica.
Transformação de P. pastoris
Ver o exemplo 48.
TNF30 foi formatado a Nanobodies™ bivalente. Como espaçador entre os 2 blocos de construção foi usado um linker 30 AA GlySer. Para permitir modificações especificas de local do C-terminal, uma cisteina livre foi introduzida, como o ultimo AA do Nanobody™ ou com um espaçador extra consistente em GlyGlyGlyCys (SEQ ID n. 471).
Exemplo 56: Expressão e purificação Nanobodies™ de meia-vida estendida bivalentes
Produção em Pichia pastoris Ver exemplo 4 9
Purificação de Nanobodies bivalentes
O meio de cultura foi feito sem célula através de centrifugação e filtração 0,22 μ m. O meio estéril foi armazenado a 40C até processamento posterior. Peso molecular baixo foram reduzidos via ultrafiltração em uma membrana IOkDa de ultrafiltração (UF) (HydroSart Sartocon Slice Cassete, Sartorius) como se segue: o meio de quatro litros foi concentrado a 0,5-1 lt, logo diluiu-se com 5 Iit PSB e novamente concentrou-se a 0,5 Iit. Esta ação foi executada duas vezes.
O retentor do UF foi filtrado através de membranas de 47 mm de náilon 0,45 μ m (Alltech #2024). Em um seguinte passo o Nanocorpo bivalente ™ foi capturado do meio concentrado via purificação por afinidade de Proteína A (usando MabSelectXtraTM, GE Healtcare). A coluna [35X100 mm] foi equilibrada no PSB e depois da aplicação de mostra lavada extensivamente com o PSB. O TNF56 foi eluída com Glicina [100 mm, pH=2.5].
As frações eluídas de MabSelectXtraTM foram neutralizadas com Tris [1,5M, pH 8,8] e armazenadas a 4°C. O TNF56 foi concentrado e purificado via AEX (A= 10 mm piperazina, pH 10,8 e B=IM NaCl em 50 mm Tris, pH 7,5) utilizando Fonte 30Q (GE Healtcare). A este fim as frações de Nanocorpo™ foram diluídas com um buffer (10 mm piperazina, pH 10,8) a uma condutividade de 5mS/cm e o pH foi ajustado a 10,8. A coluna [25X100 mm] foi equilibrada em um buffer antes de carregar a amostra para a coluna. O TNF56 foi eluído com um gradiente de 5 Volume de Coluna (CV). O pH das frações colecionadas foi ajustado a 7.8 utilização IM Tris pH=7.8.
Pegilação de nanocorpos™ bivalentes expresso em Pichia pastoris
Redução de C-terminal cisteinas
O Dithiotreitol (DTT, Aldrich Cat 15,046-0) foi acrescentado às frações neutralizadas para reduzir as pontes de bissulfeto potenciais que se formaram entre o terminal carboxi cisteinas dos nanocorpos™ (normalmente aproximadamente 20%). Uma concentração final de DTT de 10 mm e incubação durante a noite a 4 0C foi considerada como 30 ótima. A redução foi avaliada por cromatografia de exclusão de tamanho analítica (SEC) . Por isso, 25 μΐ do Nanocorpo reduzido foi acrescentado a 75 μΐ D-PBS e injetado em um Sup75 10/300 coluna de GL equilibrada no PSB de Dulbecco (D- PBS, GibcoTM REF 14190-094). 35 0 Nanocorpom e DTT Não reduzido foi retirado por SEC preparativo em uma coluna Hiload 2 6/60 Superdex75 de grau preparatória equilibrada em D-PBS.
A concentração do Nanocorpo™ reduzido foi medida medindo a absorbância em 2 8 0nm. Um Espectrofotômetro de Raio Duplo Uvikon 943 UV/VIS (método: ver o SOP ABL-0038) foi usado. A absorção foi medida em um exame de comprimento de onda 245-330nm. Duas células de Precisão feitas do Quartzo Suprasil® foram usadas (tipo de Hellma n.: 104-QS; caminho da luz: 10 mm). Primeiro a absorção do branco foi medida em 280nm colocando duas células enchidas com 900 μl D-PBS. A amostra foi diluída (1/10) acrescentando 100D1 da amostra à primeira célula. A absorção da amostra foi medida em 280nm. OD 280 Sample - OD 280 blank
<formula>formula see original document page 341</formula>
A concentração foi calculada com a fórmula seguinte:
Para TNF55 : D=I, 85 Para TNF56: D=I,83.
Pegilação
Para PEGylar o Nanocorpo™ um excesso molar 5X da solução de PEG40 de 1 mm recentemente feita foi acrescentado à solução do Nanocorpo™ reduzido. (MPEG2-MAL-4OK de NEKTAR ™ Transformação Terapêutica (2D3Y0T01) Mw = 40,000 g/mol; MPEG2-MAL-60K de NEKTAR™ Transformação Terapêutica (2D3Y0V01) Mw = 60,000 g/mol).
A mistura Nanocorpo™-PEG foi incubada por Ih na temperatura ambiente (RT) com a agitação suave e logo transferida para 4°C. A Pegilação foi avaliada via SEC analítico. Por isso, 25 μl do Nanocorpo™ acrescentado a 75 μl D-PBS e injetado em uma coluna Sup75HR 10/300 equilibrada em D-PBS. 0 Nanocorpo™ Pegilado eluído na variedade do volume de exclusão da coluna (> 75kDa).
Os Nanocorpo™ Pegilado e não Pegilado foram separados via cromatografia de troca de cation (CEX, usando Source30S, GE Healtcare; um buffer =25mM ácido cítrico pH=4 e B=IM NaCl em PSB). A amostra foi diluída a uma condutividade de <5mS/cm e o pH foi ajustado a 4,0. A coluna [25X100 mm] foi equilibrada e depois da aplicação de amostra lavada extensivamente com o A-buffer. O Nanocorpo™ Pegilado foi eluido com um 3 gradiente de CV.
O Nanocorpo™ colhido foi trocado por buffer a D-PBS por SEC em uma coluna Hiload 26/60 Superdex 75 de grau preparatório equilibrada em D-PBS.
Finalmente o Nanocorpo™ foi tornado livre de LPS via a passagem por cima da coluna (Source30Q) de troca de anion. A coluna (10x100 mm) foi sanitizada durante a noite em NaOH [1M] e posteriormente equilibrada em endotoxina liberada D- PBS.
Biotínilação
Para biotinilar Nanocorpo™ um excesso de Molar 5X de biotina (EZ-Link® Maleimide-P02-Biotina, Furo #21901) de uma solução de estoque de 10 mm foi acrescentado ao Nanocorpo™ reduzido (ver 5.5.1). A mistura de biotina-Nanocorpo™ foi incubada por 1 h em RT com a agitação leve e logo armazenada a 4°C.
A pureza do Nanocorpo™ biotinilado foi controlada via SEC analítico. Por isso, 25 μΐ de Nanocorpo™ biotinilado foi acrescentado a 7 5 μΐ D-PBS e injetado em uma coluna Sup75HR 10/300 equilibrada em D-PBS. Do cromatograma obtido pode ser concluído que o Nanocorpo™-biotina não precisa de nenhuma nova purificação: nenhuma dimerização do Nanocorpo™ via uma oxidação de sulfidrilos livres pode ser descoberta. Uma modificação de buffers a D-PBS foi feita por uma passagem pela coluna de dessalinização Sephadex G25 coluna fina (90ml).
Finalmente o Nanocorpo™-biotina foi tornado livre de LPS pela passagem pela coluna de troca de anion (Source30Q, GE Healtcare). A coluna (1x10 cms) foi sanitizada durante a noite em IM NaOH e logo equilibrada em D-PBS. Para determinar a pureza, as amostras de proteína foram analisadas em um gel de SDS-PAGE de 15% como descrito no exemplo 8 e 49. Os resultados são apresentados na Figura 49 e 50.
Exemplo 57: Caracterização de nanocorpos™ humanizados de meia-vida longa bivalentes
Caracterização bioquímica
0 TNF55 compõe-se de 2 60 peso molecular de 27,106 Da. extinção em 280 nm é 1.850.
O TNF56 compõe-se de 2 64 peso molecular de 27,365 Da. extinção em 280 nm é 1.830. aminoácidos. A proteína tem um A pi é 8.67. 0 coeficiente de
aminoácidos. A proteína tem um A pi é 8.67. O coeficiente de
Espectrofotametria de massa
A massa teórica de TNF55 é 27,106 Da. A proteína TNF55- Biotina tem 2 pontes de S-S e uma modificação biotina que deve resultar em uma massa de 27, 627 Da na ESI-MS. A massa que foi experimentalmente determinada para TNF55-biotina é 27,627 Da.
A massa teórica de TNF56 é 27,365 Da. A proteína TNF55- Biotina tem 2 pontes de S-S e uma modificação de biotina que deve resultar em uma massa de 27, 886 Da na ESI-MS. A massa que foi experimentalmente determinada para TNF55-biotina é 27,886 Da.
Sequenciamento do N-terminal
O Sequenciamento do N-terminal de TNF56-PEG40 mostrou que a seqüência de proteína para os 7 primeiros aminoácidos é como se segue: EVQLVES. Isto é, compatível com a seqüência de proteína teórica, que indica o processamento de N- terminal próprio. Ajustamento analítico
O ajustamento analítico de TNF56-PEG40 no PSB fornece um pico simétrico. Nenhum contaminante foi observado. 0 tempo de retenção observado é 8.5 ml no Superdex HR 75 e 10,32 ml no Superdex HR 200. Um perfil representativo é mostrado nas Figuras 51 e 52.
Exemplo 58: fvmcionalida.de em ensaio à base de célula
A potência para neutralizar a atividade citotóxica de TNFcx foi analisada em um ensaio à base de célula. A potência foi examinada em concentrações diferentes do Nanocorpo™ bem como do Enbrel comercialmente disponível, Humira e Remicade em uma base de molar. Quanto mais alto o EC50, mais baixa foi a atividade do composto para neutralizar TNFoí.
Os resultados são resumidos na Tabela 45 e as Figuras 53 e 54.
Os dados mostram um aumento na potência para os nanocorpos™ bivalentes quando em comparação com o Nanocorpo monovalente ™ TNFl. A potência de derivados TNF55 é semelhante a derivados TNF56, que está na variedade de Enbrel e 10 vezes melhor do que Humira e Remicade.
Exemplo 59: Análise Farmacocinética e de imunogenicidade de nanocorpos humanizados de meia-vida longa em ratos
Ver o exemplo 54
Os experimentos foram executados para examinar a meia- vida de nanocorpos™ pegilados em ratos. A meia-vida de TNF56-PEG40 bivalente foi comparada com a meia-vida de TNF56-PEG60. Ambos nanocorpos™ têm a meia-vida comparável de ~ 2 dias. Os resultados são apresentados na Figura 55.
Além do mais, a meia-vida de 3E-3E bivalente pegilado foi explorada. A meia-vida de 3E-3E-PEG20 foi comparada com a meia-vida de 3E-3E-PEG40 depois da administração intravenosa de 100 μg dos nanocorpos™. 0 3E-3E-PEG20 tem uma meia-vida de 17 horas, enquanto 3E-3E-PEG40 tem uma meia- vida de 2.1 dias, comparáveis com a meia-vida de 3E-3E- MSA21. Os resultados são apresentados na Figura 56.
As amostras de soro foram diluídas 100 vezes e analisadas para a presença de anticorpos de rato anti-TNF56- PEG40 ou anti-TNF56-PEG60. A falta de imunogenicidade foi demonstrada para ambas as moléculas. Os dados são apresentados na Figura 57.
Exeznplo 60: Eficácia de anti-TNF-A Nanocorpo TNF60 (TNF60) em prevenção de poliartrite crônica
Linhas de ratos transgênicos e expressando um transgene de fator de necrose de tumor humano 3'-modificado (hTNF- alfa, cachectin) foram usados como um modelo para estudar a eficácia de TNF60 (TNF60) na prevenção do desenvolvimento da artrite (EMBO J. 10, 4025-4031). Esses ratos foram mostrados para desenvolver a poliartrite crônica com a incidência de 100% em quatro para sete semanas da idade.
Da terceira semana da idade, as crias de ratos transgênicos foram divididas em grupos de oito animais. Antes de inicializar o estudo, o peso médio do corpo foi calculado para cada grupo. A partir daí, durante todo o estudo os pesos dos animais foram registrados uma vez por semana para cada grupo.
Para testar a eficácia de TNF60 na prevenção da poliartrite crônica, injeções intraperitoneais foram dadas duas vezes por semana a cada animal de um determinado grupo segundo o esquema seguinte:
- Grupo 1 (controle negativo): fosfato em buffer salino (PSB) (buffer de formulação)
- Grupo 2 (tratamento do Nanocorpo): TNF60 em uma dose final de 30 mgs/kg
- Grupo 3 (tratamento do Nanocorpo): TNF60 em uma dose final de 10 mgs/kg
- Grupo 4 (tratamento do Nanocorpo): TNF60 em uma dose final de 3 mgs/kg - Grupo 5 (lo controle positivo) : Enbrel em uma dose final de 30 mgs/kg
- Grupo 6 (lo controle positivo) : Enbrel em uma dose final de 10 mgs/kg
- Grupo 7 (2o controle positivo): Remicade em uma dose final de 30 mgs/kg
- Grupo 8 (2o controle positivo): Remicade em uma dose final de 10 mgs/kg
- Grupo 9 (2o controle positivo): Remicade em uma dose final de 3 mgs/kg
Para cada grupo, as datas de volumes de injeção e injeção foram observadas.
As injeções continuaram por sete semanas. Durante este período, dados clínicos foram registrados observando modificações macroscópicas na morfologia conjunta para cada animal.
Em 10 semanas da idade, todos os ratos foram sacrificados e os soros e as articulações foram reunidas. Os soros foram armazenados a -70 ° O C e as articulações de tornozelo foram conservadas em formalina.
Para os grupos selecionados, as articulações do tornozelo foram embutidas na parafina e seccionadas. As seções de articulação do tornozelo foram posteriormente usadas para avaliação histopatológica da progressão da doença.
Os resultados são representados na figura 58.
Exemplo 61: Eficácia do Nanocorpo TNF60 anti-TNF-A (TNF60) no tratamento terapêutico da poliartrite crônica
Linhas de ratos transgênicos carregando e expressado um transgene de fator de necrose de tumor humano 31-modificado (hTNF-alfa, cachectin) foram usados como modelo para estudar a eficácia de TNF60 (TNF60) no tratamento terapêutico da artrite (EMB0 J. 10, 4025-4031). Esses ratos foram mostrados para desenvolver a poliartrite crônica com a incidência de 100% em quatro para sete semanas da idade. Da sexta semana da idade, as crias de ratos transgênicos foram divididas em grupos de oito animais. Antes de inicializar o estudo, o peso de corpo médio foi calculado para cada grupo. A partir dai, durante todo o estudo os pesos dos animais foram registrados uma vez por semana para cada grupo.
Para testar a eficácia de TNF60 no tratamento terapêutico da poliartrite crônica, injeções intraperitoneais foram dadas duas vezes por semana a cada animal de um determinado grupo segundo o esquema seguinte:
- Grupo 1 (controle negativo): o fosfato em buffer salino (PSB) (buffer de formulação)
- Grupo 2 (tratamento do Nanocorpo): TNF60 em uma dose final de 30 mgs/kg
- Grupo 3 (tratamento do Nanocorpo): TNF60 em uma dose final de 10 mgs/kg
- Grupo 4 (lo controle positivo) : Enbrel em uma dose final de 30 mgs/kg
- Grupo 5 (2o controle positivo): Remicade em uma dose final de 30 mgs/kg
Para cada grupo, as datas de volumes de injeção e injeção foram observadas.
As injeções continuaram por sete semanas. Durante este período, o número clínico foi registrado observando modificações macroscópicas na morfologia conjunta para cada animal.
Em 13 semanas da idade, todos os ratos foram sacrificados e soros e as articulações foram reunidas. Os soros foram armazenados a -70 ° 0 C e as articulações do tornozelo foram conservados em formalina.
Para grupos selecionados, as articulações do tornozelo foram embutidas em parafina e seccionadas. As seções de articulação de tornozelo foram posteriormente usadas para a avaliação histopatológica da progressão de doença.
Os resultados são representados na figura 59. Exemplo 62: Efeito de formatação na eficácia de um Nanocorpo anti-TNF-α na prevenção da poliartrite crônica
Linhas de ratos transgênicos levando e expressando um transgene de fator de necrose de tumor humano 31-modificado (hTNF-alfa, cachectin) foram usadas como um modelo para estudar a eficácia de um Nanocorpo anti-TNF-A formado de maneiras diferentes na prevenção da poliartrite crônica (EMBO J. 10, 4025-4031). Esses ratos foram mostrados para desenvolver a poliartrite crônica com a incidência de 100% em quatro para sete semanas da idade.
Da terceira semana da idade, as crias de ratos transgênicos foram divididas em grupos de oito animais. Antes de inicializar o estudo, o peso médio do corpo foi calculado para cada grupo. A partir dai, durante todo o estudo dos animais os pesos dos animais foram registrados uma vez por semana para cada grupo.
Estudar a eficácia de um Nanocorpo anti-TNF-A em formatos diferentes para a prevenção da poliartrite crônica, injeções intraperitoneais foram dadas duas vezes por semana a cada animal de um determinado grupo segundo o esquema seguinte:
- Grupo 1 (controle negativo): fosfato em buffer salino (PSB) (buffer de formulação)
- Grupo 2 (o formato 1 do final de 10 mgs/kg
- Grupo 3 (o formato 1 do final de 2.5 mgs/kg
- Grupo 4 (o formato 1 do final de 1 mg/quilograma
- Grupo 5 (o formato 2 do dose final de 10 mgs/kg
- Grupo 6 (o formato 2 do dose final de 1.8 mgs/kg
- Grupo 7 (o formato 2 do dose final de 0,7 mgs/kg
- Grupo 8 (o formato 3 do Nanocorpo): TNF56-biot em uma dose
Nanocorpo): TNF60 em uma dose
Nanocorpo) : TNF60 em uma dose
Nanocorpo) : TNF60 em uma dose
Nanocorpo): TNF56-PEG40 em uma
Nanocorpo) : TNF56-PEG40 em uma
Nanocorpo): TNF56-PEG40 em uma final de 1.8 mgs/kg
- Grupo 9 (o formato 4 do Nanocorpo) : TNF30 em uma dose final de 1 mg/quilograma
- Grupo 10 (o formato 5 do Nanocorpo) : TNFl em uma dose final de 1 mg/quilograma
- Grupo 11 (lo controle positivo): Enbrel em uma dose final de 10 mgs/kg
- Grupo 12 (2o controle positivo): Remicade em uma dose final de 10 mgs/kg
Para cada grupo, as datas de volumes de injeção e injeção foram observadas.
As injeções continuaram por sete semanas. Durante este periodo, o número clinico foi registrado observando modificações macroscópicas na morfologia conjunta para cada animal.
Em 10 semanas da idade, todos os ratos foram sacrificados e soros e as articulações foram reunidas. Os soros foram armazenados a -70 ° 0 C e as articulações do tornozelo foram conservadas em formalina.
Para grupos selecionados, as articulações de tornozelo foram embutidas em parafina e seccionadas. As articulações de união de tornozelo foram posteriormente usadas para a avaliação histopatológica da progressão da doença.
Os resultados são representados na figura 60.
Exemplo 63: estudo de Farmacocinética de nanocorpos TNF60 anti-TNF-A (TNF60) e TNF56-PEG40 em macacos rhesus
Macacos rhesus reproduzidos em cativeiro (Macaca mulatta) são usados para determinar o perfil farmacocinético de TNF60 e TNF56-PEG40.
Dezesseis animais são usados neste estudo (oito machos e oito fêmeas) e divididos em quatro grupos (dois machos e duas fêmeas por grupo). Todos os animais pesaram aproximadamente 5 kg e estão sem doença por pelo menos seis semanas antes do uso. Fungue® Pri vegetarisch o V3994 serve de comida. Sessenta g/kg b.w. são oferecidos a cada macaco. 0 resíduo é retirado. Regularmente (pelo menos duas vezes por ano) a comida é analisada baseado no EPA/EUA para contaminantes por LUFA-ITL. Água de torneira é oferecida ad libitum. Os animais em cada grupo de tratamento são alojados em um bloco de várias jaulas adjacentes dentro da unidade de macacos. Os macacos são mantidos isoladamente em jaulas de aço V2A com um tamanho de 90 cms χ 82 cms χ 96 cms. A temperatura ambiente é mantida em 23°C ± 3°C (variedade máxima) e a umidade relativa em 60% ± 20% (variedade máxima). Os desvios da variedade máxima causada, por exemplo, durante a limpeza de procedimento são tratados em SOPs. As salas são iluminadas e escurecidas por períodos das 12 horas cada um.
Dois grupos são infundidos com TNF60 e dois grupos são infundidos com TNF56-PEG40. As infusões intravenosas de TNF60 e TNF56-PEG40 (dissolvido no PSB) na veia cefálica do braço direito ou o esquerdo que usa cateteres internos e uma bomba de infusão TSE (veja abaixo) são dadas em uma dose fixa de 2 mgs/kg.
Quatro administrações únicas são executadas, separadas a um período de limpeza de pelo menos catorze dias. Depois da administração da última o período posterior é pelo menos oito semanas. Dois dos quatro grupos são tratados com TNF60 OU TNF56-PEG40 em combinação com metotrexato (MTX) (dissolvido no PSB). 0 grupo 2 é tratado com TNF60 e MTX; o grupo 4 é tratado com TNF56-PEG40 e MTX. 0 MTX é dosado semanalmente intramuscularmente em 0,2 mgs/kg. Nos dias de administração, MTX é dado aproximadamente 30 minutos antes da administração. A dosagem começa na primeira administração de Nanocorpo e continuará através de todo o período de limpeza de oito semanas depois da quarta dose. Há catorze administrações MTX únicas, separadas por um período de limpeza de pelo menos uma semana que começa na primeira administração de item de teste.
Exemplo 64: Estudos de fibroblasto derivados de sinóvia
Neste estudo foi avaliada a capacidade do anti-TNF biológicos, ALX0071 e Etanercept, para atenuar a produção de IL-6 induzida por TNFa por fibroblastos derivados de RA- sinóvia.
Isolação de fibroblastos sinoviais
Tecido de articulação sinovial de pacientes RA que aceitaram foi armazenado num meio baseado em DMEM com antibióticos a 4 °C até por 96 horas depois da cirurgia de substituição de articulação. Células sinoviais foram isoladas de sinóvia dissecada por digestão de colagenase a 37 °C por 2 horas. A suspensão celular resultante foi então lavada por uma série de passos de centrifugação e re- suspensão e as células resultantes então cultivadas a 37°C no meio de cultura baseado em DMEM complementado com 10% de FCS (v/v). Os fibroblastos resultantes foram usados para o seguinte experimento na segunda ou na terceira passagem. Células de quatro doadores foram usadas em experimentos individuais. Fibroblastos foram semeados em placas de poliestireno de fundo plano de 96 cavidades a 1.5xl04 células em um volume final de 250 μL do meio de cultura baseado em DMEM complementado com 10% de FCS (v/v) por cavidade e cultivados durante a noite.
Estimulação de fibroblastos sinoviais
As células foram então incubadas por 72 horas no meio de cultura baseado em DMEM complementado com TNFa a 50 ng por mL (3 nM (R&D Systems 210-TA/CF) sozinhas ou na presença de doses crescentes de ALX0071 (0, 575 a 1920 ng por mL; 0,015 a 50 nM) ou Etanercept (Wyeth Labs; 3.75 a 11250 ng por mL; 0,025 a 75 nM). O volume final em cada cavidade foi de 250 μL e cada avaliação foi executada em triplicata. Depois de 72 horas, o meio supernadante foi retirado e armazenado a -40°C antes da análise por IL-6 ELISA (R&D Systems). A inibição da produção de IL-6 induzida por TNFa foi determinada e os valores de IC5o foram calculados tanto para ALX0071 quanto para Etanercept.
Sumário de resultados
Tanto ALX10071 como Etanercept dependentemente de dose reduziram a produção de IL-6 TNFa-induzida pelos fibroblastos derivados de Synovium RA dos quatro doadores. Houve uma potência semelhante entre os dois reagentes nessas condições de ensaio.
Exemplo 65: estudos de bolsa aérea de Marina
Neste estudo a capacidade do anti-TNF biológicas, ALX0071 e Etanercept, para atenuar a infiltração de célula induzida por TNFa- em uma bolsa de murina aérea foi avaliada.
Criação de Bolsa Aérea
As bolsas de ar foram formadas pela injeção subcutãnea (s.c). de 2.5mL de ar estéril na superfície dorsal de ratos C57B1/6/J masculinos anestesiados (25-30g, Harlan). A bolsa foi re-inflada injetando 2.5 ml de ar estéril 3 dias depois.
Estimulação de TNFa
Seis dias depois da criação inicial da bolsa aérea, os animais foram anestesiados e a bolsa injetada com 1 ml de 0,5% CarboxyMethylCellulose (CMC) veículo que contém 0,1 Dg recombinante TNFa humano (R&D Systems 210-TA-050/CF). Em três outros grupos de animais, ALX0071 (0,0625, 0,125 e 0,25 mgs/kg) foi injetado s.c. 19 horas antes da injeção de TNFa. Uns segundos três grupos de animais foram injetados (s.c). com Etanercept (Wyeth Labs, 0,125, 0,25 e 0,5 mgs/kg) imediatamente antes da injeção de TNFa.
24 horas depois da injeção de TNFa, os ratos foram separados com uma concentração crescente de C02. As bolsas foram lavadas com 2 ml de PBS estéril sem endotoxina frio como gelo contendo 5 IU/ml de heparina. Os volumes foram registrados e alíquotas de 0,5 ml foram separadas para contar a população total de glóbulos brancos (WBC) em um contador de células Sysmex XT-Vet. A média e o erro padrão das contagens WBC totais médias (SEM) para cada grupo foram calculados por ml de fluido de lavagem retirado. A análise estatística foi por ANOVA com o pós-teste de Kruskal-Wallis em dados não transformados.
Sumário de resultados
Tanto ALX0071 como Etanercept atenuaram a infiltração de WBC induzida por TNFanas bolsas de ar (Tabela). Enquanto esta atenuação conseguiu significação estatística em ambos os grupos de doses 0,125 (P <0,01) e 0,25 mgs/kg (P <0,05) ALX0071, a significação estatística não foi observada com nenhum grupo de dose de Etanercept.
Tabela 8
<table>table see original document page 353</column></row><table> <table>table see original document page 354</column></row><table> <table>table see original document page 355</column></row><table> <table>table see original document page 356</column></row><table>
Tabela 9
<table>table see original document page 356</column></row><table>
Tabela 10
<table>table see original document page 356</column></row><table>
Tabela 11
<table>table see original document page 356</column></row><table> Tabela 12
<table>table see original document page 357</column></row><table>
Tabela 13
<table>table see original document page 357</column></row><table>
Tabela 14
<table>table see original document page 357</column></row><table>
Tabela 15
<table>table see original document page 357</column></row><table> <table>table see original document page 358</column></row><table>
Tabela 16 ensaio : L929s + Act D (5000c/w) TNF : humano TNFa @ 0,5ng/ml <table>table see original document page 358</column></row><table>
ensaio : L929s + Act D (5000c/v) TNF : rhesus TNFo @ 0,5ng/ml
<table>table see original document page 358</column></row><table> Tabela 17
<table>table see original document page 359</column></row><table>
Tabela 18
<table>table see original document page 359</column></row><table> <table>table see original document page 360</column></row><table>
Tabela 19
<table>table see original document page 360</column></row><table> <table>table see original document page 361</column></row><table>
Tabela 20
<table>table see original document page 361</column></row><table> <table>table see original document page 362</column></row><table>
Tabela 22
<table>table see original document page 362</column></row><table>
Tabela 23 ensaio
L929s + Act D (5000c/-») TNF : humano TNFa θ 0,5ng/ml
<table>table see original document page 362</column></row><table> ensaio
L929s + Act D (5000c/w) TNF : rhesus TNFa θ 0,5ng/ml
<table>table see original document page 363</column></row><table>
Tabela 24
<table>table see original document page 363</column></row><table>
Tabela 25
<table>table see original document page 363</column></row><table> <table>table see original document page 364</column></row><table> <table>table see original document page 365</column></row><table>
Tabela 26
<table>table see original document page 365</column></row><table>
Tabela 27 ensaio
L929s + Act D (5000c/w) TNF : humano TNFa Θ 0,5ng/ml
<table>table see original document page 365</column></row><table> <table>table see original document page 366</column></row><table>
Tabela 28
<table>table see original document page 366</column></row><table> Tabela 29
<table>table see original document page 367</column></row><table> <table>table see original document page 368</column></row><table>
Tabela 30
<table>table see original document page 368</column></row><table> Tabela 32 ensaio
L929s + Act D (5000c/w) TNF : humano TNFa @ 0, 5ng/ml
<table>table see original document page 369</column></row><table>
Tabela 33
<table>table see original document page 369</column></row><table>
Tabela 34 <table>table see original document page 370</column></row><table>
Tabela 35
<table>table see original document page 370</column></row><table> <table>table see original document page 371</column></row><table>
Tabela 36
<table>table see original document page 371</column></row><table>
Tabela 37
ensaio : 1,929s + Act D (50OOc/w) TNF : humano TNFa @ 0,5ng/ml
<table>table see original document page 371</column></row><table>
Tabela 38
<table>table see original document page 371</column></row><table> Tabela 39
ensaio : alphaKYM (lOOOOc/w)
TNF : humano TNFa @ lng/ml
<table>table see original document page 372</column></row><table>
Resultados de WO 04/41862
<table>table see original document page 372</column></row><table>
Tabela 40
<table>table see original document page 372</column></row><table>
Tabela 41
<table>table see original document page 372</column></row><table> <table>table see original document page 373</column></row><table>
Tabela 42
<table>table see original document page 373</column></row><table>
Tabela 43
<table>table see original document page 373</column></row><table>
Tabela 44
<table>table see original document page 373</column></row><table> <table>table see original document page 374</column></row><table>
tabela 45
<table>table see original document page 374</column></row><table> <table>table see original document page 375</column></row><table>
Tabela 46
Tabela 47
<table>table see original document page 375</column></row><table>
*P<0,05, **P<0,01 vs 0,1 μς humano TNFa
Os experimentados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de apurar, utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades de execução especificas da invenção descrita na presente. Tais equivalentes são destinados para ser abrangido pelas reivindicações seguintes.
Todas as referências reveladas na presente são incorporadas por referência no seu conjunto. LISTAGEM DE SEQÜENCIA
<110> Ablynx N.V.
<120> nanocorpos™ Melhorados contra Fator-alfa de Necrose Tumoral
<130> P05-004PCT
<160> 435
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> -
<220>
<221> misc_feature
<222> (11) . . (11)
<223> Resíduo de Hallmark
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Xaa Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<220>
<221> misc_feature
<222> (2) .. (2)
<223> Resíduo de Hallmark
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Resíduo de Hallmark
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Resíduo de Hallmark
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Resíduo de Hallmark <400> 2
Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Xaa Xaa Glu Xaa Val Ala 15 10
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<22 0>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Resíduo de Hallmark
<22 0>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Resíduo de Hallmark
<400> 3
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 40 Gln
15 10 15
Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 45 Ala
20 25 30
<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> -
<220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> Resíduo de Hallmark
<220>
<221> misc_feature <222> (2) . . (2)
<223> Resíduo de Hallmark
<220>
<221> misc_feature <222> (6) . . (6)
<223> Resíduo de Hallmark
<400> 4
Xaa Xaa Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> -
<400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> -
10
20
30
40
50
<400> 6
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala 15 10
<210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> -
<400>
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 15 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> -
<400> 8
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ala <210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> -
380
<400> 9
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10
<210> 10 <211> 14 <212> PRT
<213>
<400> 10
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> -
<400> 11
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala 1 5 10
<210> 12 <211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 12
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> -
<400> 13
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 14
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> -
<400> 15
Asp Tyr Trp Met Tyr 1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> -
<400> 16
Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly 1 5 10
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 17
Asn Tyr Tyr Met Gly 1 5
<210> 18 <211> 5
<212> PRT <213> - <400> 18
Val Ser Trp Met Tyr 1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> -
<400> 19
Ala His Ser Val Tyr Thr Met Gly 1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 20
Gly Tyr Tyr Met Gly 40 1 5
<210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> -
<400> 21 Asp Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly 1 5 10
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 22
Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
20 1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<4 0 0> 23
Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 40 Lys
15 10 15
Gly
<210> 24 50 <211> 17 <212> PRT <213> -
10
<400> 24
Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 25
<211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 25
Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Val Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 26 <211> 17
<212> PRT <213> -
<400> 26
Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15 Gly
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 27
Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
Gly
10 15
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 28
Ser Ile Ser Trp Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Lys Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29 <211> 15
<212> PRT <213> - <400> 29
Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Gly Ser Tyr Asn Tyr 1 5 10 15
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 30
Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr 1 5 10
<210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> -
<400> 31
Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ala Tyr Asn Tyr 15 10 15
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> -
50
<400>
32 Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Asn 15 10
10
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> -
15 <400> 33
Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ser Tyr Asn Tyr 15 10 15
20
<210> 34 <211> 6 25 <212> PRT <213> -
30
35
40
45
<4 00> 34
Ser Pro Ser Gly Phe Asn 1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> -
<400> 35
Ser Pro Ser Gly Ser Phe 50 1 5
<210> 36 <211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 36
Ser Phe Gly Met Ser 1 5
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 37
Leu Asn Leu Met Gly 1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 38
Ile Asn Leu Leu Gly 1 5
<210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> -
<400> 39
Asn Tyr Trp Met Tyr 1 5
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 40
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
<213> -
<400> 41
Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 42
<211> 16
<212> PRT <213> -
<400> 42
Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 43
Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 44
Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly <210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 45
Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 46
Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> - <400> 47
Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> -
<400> 48
Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> -
<400> 49
Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu 1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> -
<400> 50
Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser 1 5 <210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 51
Gly Arg Gly Ser Pro
1 5
<210> 52
<211> 115
<212> PRT <213> -
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 53 <211> 115
<212> PRT <213> -
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly 30 Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Gly Val 35 Ser
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75
80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Ser Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 54 <211> 115 <212> PRT <213> -
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asp Phe Ser Val Ser
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
50 65 70 75
80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Ser Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 55 <211> 129 <212> PRT
<213> -
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85
90
95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 56
<211> 129
<212> PRT
<213> -
<400> 56
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75 80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Glu Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 57
<211> 129
<212> PRT
<213> -
<400> 57
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr
50 55 60 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Glu Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 58 <211> 127
<212> PRT <213> - <400> 58
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala His
20 25 30
Ser Arg
Val
Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu 35 40 45 Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75
80
Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Cys Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu
100 105 110
Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 59 <211> 123 <212> PRT <213> -
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Leu Leu
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Trp Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Lys Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Asn
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 60 <211> 123 <212> PRT
<213> -
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
10 Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 61
<211> 117
<212> PRT
<213> -
<400> 61
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Leu Asn
20 25 30
Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gln Thr Val Tyr
65 70 75
80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 62
<211> 116
<212> PRT
<213> -
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Glu Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Trp Asp Ile Asn
20 25 30
Leu Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75
80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 63
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 63
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 64 <211> 116 <212> PRT <213> -
<400> 64
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser Arg Thr Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 65
<211> 114
<212> PRT <213> - <400> 65
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Gln Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr 65 70 75
80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ser Ser Pro Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 66
<211> 114
<212> PRT
<213> -
<400> 66
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ala Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 67
<211> 123
<212> PRT
<213> -
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Val Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Ile
35 40 45
Ser Arg Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75
80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr
100 105 110
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> -
<400> 68
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5
<210> 69
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 69
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 70
<211> 239
<212> PRT
<213> -
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
115 120 125 45
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn
165 170 175
Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
180 185 190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
195 200 205
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro
210 215 220
Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 225 230 235
<210> 71 <211> 267 <212> PRT <213> -
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro
20
25
30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
145 150 155
160
Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr
165 170 175
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
195 200 205
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu
210 215 220
Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235
240
Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Gly Ser Tyr Asn Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 72
<211> 255
<212> PRT
<213> -
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu
35 40 45 Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser
145 150 155
160
Leu Ser Asn Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
165 170 175
Arg Glu Leu Leu Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr
180 185 190
Lys Lys
Asp
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala 195 200 205 Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly
225 230 235
240
Trp Asn Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
<210> 73
<211> 260
<212> PRT
<213> -
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155
25 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp
165 170 175
Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
225 230 235
240 Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser 260
<210> 74
<211> 288
<212> PRT
<213> -
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
145 150 155
160
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro Ser
180 185 190
Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
195 200 205
Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr
210 215 220
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys
225 230 235
240
Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
245 250 255
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val 260 265 270
Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 75
<211> 276
<212> PRT
<213> -
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
10 15
25
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu
35 40 45
35
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
40
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
8 0
45
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
50
Ala Tyr
Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155
160
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser
165 170 175
Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly
195 200 205
Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys
225 230 235
240
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
260 265 270 10
15
Thr Val Ser Ser 275
<210> 76
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp 25 Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 30 Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser 35 Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu 40 Tyr
65 70 75
80
45 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
50
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110 Val Ser Ser 115
<210> 77 <211> 115 10 <212> PRT <213> - <400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr
Arg
Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Val Ser Ser 115
<210> 78 <211> 129 <212> PRT
<213> - <4 0 0> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
50 100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 79
<211> 129
<212> PRT
<213> -
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Pro 20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40 45
Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr 50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala 65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser 100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 80 <211> 129 <212> PRT <213> -
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
30 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro
20 25 30 Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 81
<211> 129
<212> PRT
<213> -
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80 Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 82
<211> 129 <212> PRT <213> -
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro
40 20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
45 35 40 45
Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 83 <211> 123 <212> PRT
<213> - <400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 84
<211> 123
<212> PRT
<213> -
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr 65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 85 <211> 123 <212> PRT <213> -
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu
35 40 45
50
Gly Val
Asn 50
Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser
55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 86
<211> 123
<212> PRT
<213> -
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu
35 40 45
Gly Val
Asn 50
Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser
55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 87 <211> 115 25 <212> PRT <213> -
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va'1 Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
2 0 2 5 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asri Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 88
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 89
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 90
<211> 363
<212> PRT
<213> -
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu 130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp 145 150 155
160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser
165 170 175
Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
180 185 190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
195 200 205
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly
210 215 220
Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu
290 295 300
Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
305 310 315
32 0
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
325 330 335
Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn
340 345 350
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 355 360
<210> 91 <211> 391
<212> PRT <213> -
<400>
91 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
145 150 155
160
Ala
Ala
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr
165 170 175
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
180 185 190
Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
195 200 205
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu
210 215 220
Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235
240
Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Gly Ser Tyr Asn Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
275 280 285
Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
290 295 300
Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
305 310 315
320
Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr 325
330
335
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
340 345 350
Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
355 360 365
Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly
370 375 380
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 385 390
<210> 92
<211> 379
<212> PRT
<213> -
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155
160
Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
165 170 175
Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr
180 185 190
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
195 200 205
Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly 225 230 235
240 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 245 250 255
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 260 265 270
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr 275 280 285
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu 290 295 300
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val 305 310 315
320
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr 325 330 335
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 340 345 350
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr 355 360 365
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 370 375
<210> 93 <211> 384 <212> PRT <213> -
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130
135
140
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155
160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp
165 170 175
Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
225 230 235
240
Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
260 265 270
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg
275 280 285
50
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser
290 295 300 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile
305 310 315
320
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
325 330 335
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met
340 345 350
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly
355 360 365
Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
370 375 380
<210> 94
<211> 400
<212> PRT <213> -
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu
35 40 45 Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Val Val Glu Ser
145 150 155
160
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser
165 170 175
Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln
180 185 190
Ala Gly
Pro
Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu Gly Asn Ile Ser Trp Arg 195 200 205 Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys
225 230 235
240
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
275 280 285
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg
290 295 300
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser
305 310 315
320
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile
325 330 335
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
340 345 350
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met
355 360 365 Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly
370 375 380
Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
385 390 395
400
<210> 95 <211> 115 <212> PRT
<213> -
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 96 <211> 115 <212> PRT <213> -
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 2 5 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 97
<211> 129
<212> PRT
<213> -
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 98
<211> 129
<212> PRT
<213> -
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Pro
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 45
Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala
65 70 75
80
Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser
100 105 110
Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 99 <211> 123 <212> PRT <213> -
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 100
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 101 <211> 115 <212> PRT <213> - <400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75
80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 102 <211> 115 <212> PRT
<213> -
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 8 0
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 103
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 104 <211> 115 <212> PRT <213> -
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 105 <211> 130
<212> PRT <213> -
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gln Ile Ile Phe Gly Ser His
20 25 30
Val Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe 35 Val
40 45
Ala Glu Ile Arg Pro Ser Gly Asp Phe Gly Pro Glu Gly Glu Phe Glu
50 55 60
His Val Thr Ala Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Lys Asn Ser
65 70 75
80
Val Asp Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Tyr Arg Gly Gly Arg Asp
100 105 110
Tyr Arg Trp Glu Tyr Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val 130
<210> 106
<211> 122
<212> PRT
<213> -
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Ser Asn Ala Tyr
20 25 30
Ala Thr Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
40 35 40 45
Ala Gly Ile Gln Trp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Arg Ile Thr Arg Asp Pro Asp Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75
80 Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gln Lys Leu Ser Pro Tyr Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Ser Asn Tyr Glu
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120
<210> 107
<211> 119
<212> PRT
<213> -
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Gln Leu Phe Ser Thr Asn
20 25 30
Asp Val Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Asp Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Gly Asp Asp Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Val Ile Ser Arg Glu Gly Glu Met Val Tyr Leu Glu Met
65 70 75
80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ile Asn
85 90 95
Arg Leu Arg Ser Thr Trp Gly Ile Arg Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 108
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<4 0 0> 108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Thr
20 25 30
Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Phe Glu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Ser Lys Gly Ile Gln Val Thr
100 105 110
Val Ala Ser 115
<210> 109 <211> 121 <212> PRT <213> -
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Val
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Ala Gly Val Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Gly Asn Arg Glu Ser Thr Val Phe
65 70 75
80
Leu Gln Met Glu Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95 Thr Ala Glu Pro Ile Gly Ala Tyr Glu Gly Leu Trp Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 110
<211> 124
<212> PRT
<213> -
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> unknown amino acid residues, probably EVQL, QVQL ou a similar seq uence
<400> 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Ser Asp Ser 20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Ser Ser Tyr Ala Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Thr Pro Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Ser Asn Gly Asn Pro His Arg Phe Ser Gln Tyr Gln
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 111
<211> 120
<212> PRT
<213> -
<220>
<221> misc_feature
<222> (77) .. (77)
<223> Unknown amino acid residue
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Thr Tyr
20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Ile Val Tyr Ala Glu Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Xaa Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Asn Asn Ile Ala Thr Leu Arg Gln Gly Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 112 <211> 127
<212> PRT <213> -
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Tyr
Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Asn Phe Val Thr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Trp Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75
Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Val Gln Val Ile Asp Pro Ser Trp Ser Gly Val Asn Leu Asp
100 105 110
Asp Tyr Asp Tyr Leu Gly Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 113 <211> 124 <212> PRT <213> -
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Ser Asn Ala Tyr
50 20 25 30
Ala Thr Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gln Trp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Arg Ile Thr Arg Asp Pro Asp Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75
80
Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gln Lys Leu Ser Pro Tyr Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Ser Asn Tyr Glu
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 114
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Thr Ile Ser Ser Ile Val
20 25 30
Met Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ile Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75
80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn
85 90 95
Ala Val Pro Pro Arg Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 115
<211> 121
<212> PRT
<213> -
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45 Ala Arg Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Arg Ala
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asp Arg Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Val Pro Arg Tyr Glu Asn Gln Trp Ser Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 116
<211> 127
<212> PRT
<213> -
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 Ser Gly Ile Asp Ser Gly Gly Gly Ser Pro Met Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
10 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
15 85 90 95
Ala Lys Phe Ser Thr Gly Ala Asp Gly Gly Ser Trp Tyr Trp Ser Tyr
20 100 105 110
Gly Met Asp Ser Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
25
30
35
<210> 117
<211> 121
<212> PRT
<213> -
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 40 Asp
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Glu Arg Ser Ser Asn Arg 45 Tyr
20 25 30
Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 50 Leu
35 40 45 10
15
20
Ala Arg Val Asp Val Ser Gly Gly Asn Thr Leu Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Ile Asn Gly Lys Asn Ala Met Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Trp Gly Thr Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
25
30
<210> 118
<211> 117
<212> PRT
<213> -
35
<400> 118
40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr Phe Ser
45 20 25 30
Ala Tyr Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu
50 35 40 45
Trp Val Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Ser Val Asn Gly Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr
65 70 75
80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Gln Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Arg Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 119
<211> 129
<212> PRT
<213> -
<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Arg Gly Phe Tyr Lys Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Lys Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Thr Glu Asn
65 70 75
80
Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ser Ser His Tyr Ser Tyr Val Tyr Ser Lys
100 105 110
Ala Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 120
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Phe Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ser
20 25 30
Ser Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Tyr Glu Glu Trp Val
35 40 45 Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Ser Gln Gly Ile Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 121 <211> 127 <212> PRT <213> - <220> <221> misc_feature <222> (119)..(119) <223> Unknown amino acid residue <400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Thr Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val His
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Val Val Gln Pro Tyr Ser Gly Gly Asp Tyr Tyr Thr Gly Val Glu
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Xaa Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 122 <211> 115
<212> PRT <213> -
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Thr
20 25 30
Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asp Asp Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 123 <211> 121 <212> PRT <213> -
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Arg Glu Ile Val
35 40 45
Ala Arg Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Ser Ser Asn Arg Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Ala Ala Arg Tyr Asn Gly Thr Trp Ser Ser Asn Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 124
<211> 117
<212> PRT
<213> -
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr Phe Ser 20
25
30
Ala Tyr Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu
35 40 45
Phe Val Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asn
50 55 60
Ser Val Asn Gly Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr
65 70 75
80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Gln Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Arg Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 125
<211> 121
<212> PRT
<213> -
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala
20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45
Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 30 115 120
<210> 126 <211> 115 <212> PRT <213> - <400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Thr 20 25 30 Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Phe Glu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Ser Lys Gly Ile Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 127 <211> 118
<212> PRT <213> -
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Asn
Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Ser Gly Val Lys Val 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Asp Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Glu Asp Phe Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75
80
Gln Met Asn Ser Leu Leu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Arg Thr Tyr Trp Ala His Leu Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 128
<211> 121
<212> PRT
<213> -
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Gly Ser Val
50 20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35
40
45
Ala Ala Ile Gly Tyr Asp Gly Asn Ser Ile Arg Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ile Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75
80
Leu Glu Met Glu Asn Leu Asn Ala Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Leu Ala Arg Tyr Glu Gly Leu Trp Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 129
<211> 121
<212> PRT
<213> -
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Thr Arg Thr Asn Asp Arg Phe
20 25 30
Asn Met Ala Trp Phe His Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val 35
40
45
Ser Arg Ile Asp Val Ala Gly Tyr Asn Thr Ala Tyr Gly Asp Phe Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Glu Asn Thr Val Val
65 70 75
80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Trp Gly Ile Ser Gln Ser Asp Tyr Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 130
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 130
40
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
45
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30
50 <210> 131 <211> 30 <212> PRT <213> -
5
<400> 131
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly 10 Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Gly 1 5 20 25 30
<210> 132 20 <211> 30 <212> PRT <213> -
25
<400> 132
30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asp Phe Ser
20 25 30
<210> 133
40
<211> 30 <212> PRT 45 <213> -
<400> 133
50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15 10
15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30
<210> 134
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 134
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 Asp
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 25 20 25 30
<210> 135 30 <211> 30 <212> PRT <213> -
35
<400> 135
40 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp
15 10 15
45 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
50
<210> 136 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 136
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30
<210> 137 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr 20 25 30
<210> 138 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 138 Glu Val Gln Gly 1
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser 20 25 30
<210> 139
<211> 30
10 <212> PRT
<213> -
<4 0 0> 139
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
20 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gln Ile Ile Phe Gly 20 25 30
<210> 140
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 40 Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Ser Asn 45 20 25 30
<210> 141 50 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 141
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Gln Leu Phe Ser 20 25 30
<210> 142 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30
<210> 143
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 143
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly Asp
15 10 15 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser 20 25 30
<210> 144
<211> 30
<212> PRT
<213> -
15 <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (4)
20
<223> Unknown amino acid residues, probably EVQL, QVQL ou a similar seq uence
<4 0 0> 144
Xaa Xaa Xaa Xaa Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Pro Gly 30 Gly
15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Ser 35 20 25 30
40
45
<210> 145
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 145
50
Glu Val Gln Gly 1
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly 20 25 30
<210> 146
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 146
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Asn Phe Val 20 25 30
<210> 147
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Ser Asn 20 25 30
<210> 148
<211> 30
<212> PRT <213> -
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Thr Ile Ser Ser 20 25 30
<210> 149 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 149
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser 20 25 30
<210> 150 <211> 30
<212> PRT <213> -
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser 20 25 30
<210> 151
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 151
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Glu Arg Ser Ser Asn 20 25 30
<210> 152 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 152
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr 20 25 30
<210> 153 <211> 30 <212> PRT <213> - <400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Arg Gly Phe Tyr 20 25 30
<210> 154
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Phe Ser Gly Phe Ala Phe Ser 20 25 30
<210> 155 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser <210> 156
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30
<210> 157
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 157
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ala Phe Ser 20 25 30
<210> 158
<211> 30
<212> PRT
<213> - <400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr
20 25 30
<210> 159
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 159
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser 20 25 30
<210> 160
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 161 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Ser Gly Val Lys 20 25 30
<210> 162 <211> 30 <212> PRT <213> - <400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Gly 20 25 30
<210> 163
<211> 29
<212> PRT
<213> - <400> 163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Thr Arg Thr Asn 20 25
<210> 164
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 164
Asp Tyr Trp Met Tyr 1 5
<210> 165
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 165
Val Ser Trp Met Tyr 1 5
<210> 166
<211> 5
<212> PRT
<213> - <400> 166
Val Ser Trp Met Tyr 1 5
<210> 167 <211> 10 <212> PRT <213> -
<400> 167
Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly 15 10
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> -
45
<400> 168
Asp Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly 15 10
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> -
<400> 169
Asp Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly 1 5 10 <210> 170
<211> 8
<212> PRT
<213> -
<4 0 0> 170
Ala His Ser Val Tyr Thr Met Gly 1 5
10
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 171
Gly Tyr Tyr Met Gly 1 5
<210> 172
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 172
Asn Tyr Tyr Met Gly 1 5
<210> 173 <211> 5 <212> PRT
<213> -
<400> 173
Ser His Val Ala Ala 1 5
<210> 174
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 174
Ala Tyr Ala Thr Gly 1 5
<210> 175
<211> 5 <212> PRT
<213> -
<400> 175
Thr Asn Asp Val Gly 1 5
<210> 176
<211> 5
<212> PRT
<213> - <400> 176
Thr Thr Ser Met Thr 1 5
<210> 177
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 177
Ser Val Ala Met Gly 1 5
<210> 178
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 178
Asp Ser Ala Met Gly 1 5
<210> 179
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 179
Thr Tyr Ala Met Gly 1 5
<210> 180
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 180
Thr Tyr Ala Met 1
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 181
Ala Tyr Ala Thr 1
<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 182
Ile Val Met Leu 1
5
Ser 5
Gly 5
Gly 5
<210> 183 <211> 5 <212> PRT <213> -
<400> 183
Ser Tyr Asp Met Gly 1 5
15 <210> 184
<211> 5
<212> PRT
<213> -
25 <400> 184
Thr Tyr Asp Met Ser 1 5
<210> 185 <211> 5 <212> PRT <213> -
<400> 185
Arg Tyr Asn Met Ala 1 5
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> - <400> 186
Phe Ser Ala Tyr Ser Met Thr 1 5
<210> 187
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 187
Lys Asn Ala Met Gly 1 5
<210> 188
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 188
Ala Ser Ser Met Ala 1 5
<210> 189
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 189 10
Ser Tyr Ala Met Gly 1 5
<210> 190
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 190
Ala Thr Ser Met Thr 1 5
<210> 191
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 191
Asn Tyr Asp Val Gly 1 5
<210> 192
<211> 7
<212> PRT
<213> -
<400> 192
Phe Ser Ala Tyr Ser Met Thr 1 5
<210> 193 <211> 5 <212> PRT <213> -
<400> 193
Thr Ala Asp Met Gly 1 5
<210> 194 <211> 5 <212> PRT <213> -
<400> 194
Thr Thr Ser Met Thr 1 5
<210> 195
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 195
Val Asn Asp Met Gly 1 5
<210> 196 <211> 5
<212> PRT <213> -
<400> 196
Ser Val Ala Met Gly 1 5
<210> <211> <212> <213>
<400> 197
Asp Arg Phe Asn Met Ala 1 5
<210> 198 <211> 14
<212> PRT <213> -
<400> 198
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10
<210> 199
<211> 14
<212> PRT
<213> -
197 6
PRT
<400>
199 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 15 10
<210> 200
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 200
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 15 10
<210> 201
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 201
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 202
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 202
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 15 10 <210> 203
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 203
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 204
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 204
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 205
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 205
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Leu Leu Ala 1 5 10
<210> 206 <211> 14 <212> PRT <213> -
<400> 206
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu Gly 1 5 10
<210> 207
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 207
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 208
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 208
Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 209
<211> 14
<212> PRT
<213> - <400> 209
Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10
<210> 210
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 210
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Phe Glu Glu Trp Val Ser 1 5 10
<210> 211
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 211
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Leu Ala 1 5 10
<210> 212
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 212
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 213
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 213
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 214 20 <211> 14 <212> PRT <213> - <400> 214 Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 15 10
<210> 215
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 215
Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 216 <211> 14 <212> PRT <213> -
<400> 216
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val Ala 1 5 10
<210> 217 <211> 14 <212> PRT <213> -
<400> 217
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 218 <211> 14 <212> PRT
<213> -
<400> 218
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10
<210> 219
<211> 14
<212> PRT
<213> - <400> 219
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu Ala 1 5 10
<210> 220
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 220
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val Ser 1 5 10
<210> 221
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 221
Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 222
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 222
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Tyr Glu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 223
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 223
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10
<210> 224
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 224
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val Ser 1 5 10
<210> 225
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 225
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Arg Glu Ile Val Ala 1 5 10
<210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> -
<400> 226
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Phe Val Ser 1 5 10
<210> 227
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 227
Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala 15 10
<210> 228
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 228
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Phe Glu Glu Trp Val Ser 1 5 10
<210> 229
<211> 14
<212> PRT
<213> - <400> 229
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala 15 10
<210> 230
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 230
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 15 10
<210> 231
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 231
Trp Phe His Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val Ser 15 10
<210> 232
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 232
Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 233
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 233
Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 234
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 234
Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 235 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 235
Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 236
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 236
Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 237
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 237
Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 238 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 238
Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 239
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 239
Ser Ile Ser Trp Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Lys Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 240
<211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 240
Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 241
<211> 23
<212> PRT
<213> -
<400> 241
Glu Ile Arg Pro Ser Gly Asp Phe Gly Pro Glu Gly Glu Phe Glu His
1 5 10 15
Val Thr Ala Ser Leu Lys Gly 20
<210> 242 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 242
Gly Ile Gln Trp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Val Lys
1 5 10 15 50
Gly
<210> 243
<211> 16
<212> PRT
<213> -
<400> 243
Thr Ile Thr Asp Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Gly Asp Asp Val Lys Gly
15 10 15
<210> 244
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 244
Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 245
<211> 17
<212> PRT
<213> - <400> 245
Gly Val Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ala Glu Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 246 15 <211> 17 <212> PRT <213> - <400> 246
Thr Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Ser Ser Tyr Ala Asp Phe Val Lys
15 10 15
30 Gly
<210> 247
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 247
Ala Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Ile Val Tyr Ala Glu Ser Ala Lys
15 10 15
Gly <210> 248
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 248
Ser Ile Ser Trp Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 249 <211> 17 <212> PRT <213> - <400> 249
Gly Ile Gln Trp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 250
<211> 16
<212> PRT
<213> - <400> 250
Ser Ile Thr Gly 1
<210> 251
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 251
Arg Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Arg Ala Lys
15 10 15
Asp
Ile Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15
<210> 252
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 252
Gly Ile Asp Ser Gly Gly Gly Ser Pro Met Tyr Val Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 253 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 253
Arg Val Asp Val Ser Gly Gly Asn Thr Leu Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 254 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 254
Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Asn
1 5 10 15
Gly
<210> 255
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 255
Ser Ile Lys Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg
1 5 10 15 Gly
<210> 256
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 256
Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 257
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 257
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Thr Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 258 <211> 17 <212> PRT 15
20
25
35
<213>
<400> 258
Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
10 1 5 10 15
Gly
<210> 259
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 259
Arg Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Ser Ser Asn Arg Ala Lys
15 10 15
Gly
<210> 260 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 260
Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asn Ser Val Asn
15 10 15 Gly
<210> 261
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 261
Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 262
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 262
Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 263 <211> 16 <212> PRT <213>
<400> 263
Thr Ile Thr Asp Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Glu Asp Phe Ala Lys Gly
15 10 15
<210> 264
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<4 0 0> 264
Ala Ile Gly Tyr Asp Gly Asn Ser Ile Arg Tyr Gly Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 265 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 265
Arg Ile Asp Val Ala Gly Tyr Asn Thr Ala Tyr Gly Asp Phe Val Lys
15 10 15
Gly <210> 266
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 266
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 267 <211> 32 <212> PRT <213> -
<400> 267
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 268
<211> 32
<212> PRT
<213> - <400> 268
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asp Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 269
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 269
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu
15 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 270 <211> 32 40 <212> PRT <213> -
<400> 270
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu
1 5 10 15
Met Asn Asn
Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20
25
30
10
<210> 271
<211> 32
<212> PRT
<213> -
15 <400> 271
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu
15 10 15
20
Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
25
30
<210> 272
<211> 32
<212> PRT
<213> -
35
<400> 272
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu 40 Leu
15 10 15
Met Asn Cys Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 45 Ala
20 25 30
50
<210> 273 <211> 32 <212> PRT <213> -
<400> 273
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
15 20 25 30
<210> 274
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 274
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln
15 10 15
Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 275
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 275
Arg Phe Thr Ile Ala Lys Asn Ser Val Asp Asn Thr Val Tyr Leu Gln 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 276
<211> 31
<212> PRT
<213> -
<400> 276
Arg Phe Arg Ile Thr Arg Asp Pro Asp Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
1 5 10 15
Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln 20 25 30
<210> 277
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 277
Arg Phe Val Ile Ser Arg Glu Gly Glu Met Val Tyr Leu Glu Met Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ile 20 25 30
<210> 271 <211> 32 <212> PRT
<213> -
<400> 278
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
15 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg
20 25 30
<210> 279
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 279
Arg Phe Thr Ile Ala Arg Gly Asn Arg Glu Ser Thr Val Phe Leu Gln
15 10 15
Met Glu Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Ala
20 25 30
<210> 280
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 280 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
15 10 15
Met Asn Gly Leu Thr Pro Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gly
20 25 30
<210> 281 <211> 32 <212> PRT <213> - <220>
<221> misc_feature <222> (11) . . (11)
<223> unknown amino acid residue
<400> 281
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Xaa Thr Met Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
40 20 25 30
<210> 282 <211> 32 <212> PRT <213> - <400> 282 Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Arg
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val
20 25 30
<210> 283
<211> 31
<212> PRT
<213> -
<400> 283
Arg Phe Arg Ile Thr Arg Asp Pro Asp Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
1 5 10 15
Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln 30 20 25 30
<210> 284 <211> 32 <212> PRT <213> -
<400> 284
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala
20 25 30 <210> 285 <211> 32
<212> PRT <213> -
<400> 285
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln
15 10 15
Met Asp Arg Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Val
20 25 30
<210> 286
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 286
Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
15 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 287 <211> 32 <212> PRT <213> - <400> 287
Arg Phe Thr Val Ser Arg Ile Asn Gly Lys Asn Ala Met Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 288
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 288
Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Arg
20 25 30
<210> 289
<211> 35
<212> PRT
<213> -
<400> 289
Arg Phe Thr Val 1
Ile Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Thr Glu Asn Thr 5 10 15 Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr
20 25 30
Cys Ala Ala 35
<210> 290
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 290
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg
20 25 30
<210> 291 <211> 32
<212> PRT <213> -
<400> 291
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val His Leu 45 Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Ala Val
20 25 30 <210> 292
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 292
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asp Asp Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg
20 2 5 3 0
<210> 293
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 293
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
15 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Ala
20 25 30
<210> 294
<211> 32
<212> PRT
<213> - <400> 294
Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Arg
20 25 30
<210> 295
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 295
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15
Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Ser
20 25 30
<210> 296 <211> 32 <212> PRT <213> -
<400> 296
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg
20
25
30
10
<210> 297
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 297
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
15 10 15
Met Asn Ser Leu Leu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
20 25 30
<210> 298
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 298
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ile Lys Asn Thr Met Tyr Leu 40 Glu
15 10 15
Met Glu Asn Leu Asn Ala Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Leu Cys Ala 45 Ala
20 25 30
<210> 299 <211> 32 <212> PRT <213> -
<400> 299
Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Glu Asn Thr Val Val Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 300
<211> 6
<212> PRT
<213> -
<400> 300
Ser Pro Ser Gly Phe Asn 1 5
<210> 301
<211> 6
<212> PRT <213> -
<400> 301
Ser Pro Ser Gly Ser Phe 1 5
<210> 302
<211> 6 <212> PRT <213> -
<400> 302
Ser Pro Ser Gly Ser Phe 1 5
<210> 303 <211> 15 <212> PRT <213> -
<400> 303
Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Gly Ser Tyr Asn Tyr 1 5 10 15
<210> 304
<211> 15
<212> PRT
<213> -
<400> 304
Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ser Tyr Asn Tyr 1 5 10 15
<210> 305
<211> 15
<212> PRT
<213> - <400> 305
Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ser Tyr Asn Tyr 15 10 15
<210> 306
<211> 15
<212> PRT
<213> -
<400> 306
Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ala Tyr Asn Tyr 15 10 15
<210> 307
<211> 14
<212> PRT
<213> -
45
<400> 307
Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Asn 15 10
<210> 308
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 308
Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr 15 10 <210> 309 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 309
Ala Pro Tyr Arg Gly Gly Arg Asp Tyr Arg Trp Glu Tyr Glu Tyr Glu
15 10 15
Tyr
<210> 310
<211> 16
<212> PRT
<213> -
<400> 310
Lys Leu Ser Pro Tyr Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Ser Asn Tyr Glu Tyr
15 10 15
<210> 311 <211> 13 <212> PRT <213> -
<400> 311
Asn Arg Leu Arg Ser Thr Trp Gly Ile Arg Tyr Asp Val 10
<210> 312
<211> 6
<212> PRT
<213> -
25
45
50
<400> 312
Arg Gly Tyr Gly Arg Asp 1 5
<210> 313 <211> 12 <212> PRT <213> -
<400> 313
Glu Pro Ile Gly Ala Tyr Glu Gly Leu Trp Thr Tyr 15 10
<210> 314 <211> 15 <212> PRT <213> -
<400> 314
Ser Tyr Ser Asn Gly Asn Pro His Arg Phe Ser Gln Tyr Gln Tyr 15 10 15
<210> 315 <211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 315
Ala Asn Asn Ile Ala Thr Leu Arg Gln Gly Ser 15 10
<210> 316
<211> 18
<212> PRT
<213> -
<400> 316
Val Gln Val Ile Asp Pro Ser Trp Ser Gly Val Asn Leu Asp Asp Tyr
15 10 15
Asp Tyr
<210> 317
<211> 16
<212> PRT
<213> -
<400> 317
Lys Leu Ser Pro Tyr Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Ser Asn Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 318 <211> 7
<212> PRT
<213> -
<400> 318
Val Pro Pro Arg Asp Asp Tyr 1 5
<210> 319
<211> 12
<212> PRT
<213> -
<400> 319
Pro Arg Tyr Glu Asn Gln Trp Ser Ser Tyr Asp Tyr 15 10
<210> 320
<211> 18
<212> PRT
<213> -
<400> 320
Phe Ser Thr Gly Ala Asp Gly Gly Ser Trp Tyr Trp Ser Tyr Gly Met
15 10 15
Asp Ser
<210> 321 <211> 12
<212> PRT
<213> -
<400> 321
Gly Gly Trp Gly Thr Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr 1 5 10
<210> 322 <211> 6 <212> PRT <213> -
<400> 322
Arg Gly Tyr Ala Leu Asp 1 5
<210> 323
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 323
Asp Ser Ser His Tyr Ser Tyr Val Tyr Ser Lys Ala Tyr Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 324 <211> 6 <212> PRT <213> -
<400> 324
Arg Gly Tyr Gly Arg Asp 1 5
<210> 325 <211> 18 20 <212> PRT <213> -
<400> 325
Val Gln Pro Tyr Ser Gly Gly Asp Tyr Tyr Thr Gly Val Glu Glu Tyr
30 1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 326
<211> 6
<212> PRT
<213> -
<400> 326
Arg Gly Tyr Gly Arg Asp 50 1 5
<210> 327 <211> 12 <212> PRT <213> -
<400> 327
Ala Arg Tyr Asn Gly Thr Trp Ser Ser Asn Asp Tyr 1 5 10
<210> 328 <211> 6 <212> PRT <213> -
<400> 328
Arg Gly Tyr Ala Leu Asp 1 5
<210> 329
<211> 12
<212> PRT
<213> -
<400> 329
Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10
<210> 330 <211> 6
<212> PRT <213> -
<400> 330
Arg Gly Tyr Gly Arg Asp 1 5
<210> 331
<211> 10
<212> PRT
<213> -
<400> 331
Arg Thr Tyr Trp Ala His Leu Pro Thr Tyr 1 5 10
<210> 332
<211> 12
<212> PRT
<213> -
<400> 332
Glu Pro Leu Ala Arg Tyr Glu Gly Leu Trp Thr Tyr 1 5 10
<210> 333 <211> 12 <212> PRT <213> - <400> 333 Gly Gly Trp Gly Ile Ser Gln Ser Asp Tyr Asp Leu 15 10
<210> 334
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 334
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 335
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 335
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 336
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 336
Arg Gly Gln 1
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 337
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 337
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 338
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 338
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 339 <211> 11 <212> PRT <213> -
<400> 339
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 340 <211> 11 <212> PRT <213> -
<400> 340
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 341
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 341
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 342
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 342
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 343
<211> 11
<212> PRT
<213> - <400> 343
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 344
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 344
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 345
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<4 0 0> 345
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 346
<211> 11
<212> PRT
<213> -
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 347
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20 <211> 11 <212> PRT <213> -
<400> 348
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<210> 349 <211> 11 <212> PRT 40 <213> -
<4 00> 349
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<400> 350
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 351
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 352
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<213> - <400> 353
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 354
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
45
<400> 355
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 356
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 357
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 358
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 358
Arg Ser Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 359
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<220>
<221> misc_feature
<222> (3) .. (3)
<223> Unknown amino acid residue, probably Q <400> 359
Trp Gly Xaa Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 360
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 360
Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 361
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 361
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<210> 362
<211> 11 <212> PRT <213> -
<400> 362
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<400> 363
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
40
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
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10 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 367
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<211> 30
<212> PRT
<213> -
40 <400> 368
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1 5 10 15
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<210> 369
<211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 369
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Glu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Trp Asp
20 25 30
<210> 370
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 370
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg 20 25 30
<210> 371
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 371
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly 20 25 30
<210> 372 <211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 372
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg 20 25 30
<210> 373
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 373
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly 20 25 30
<210> 374
<211> 30 <212> PRT <213> -
<400> 374
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30
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<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 375
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<210> 376
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 376
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<211> 5 <212> PRT
<213> -
<400> 377
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<211> 5
<212> PRT
<213> -
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<212> PRT
<213> -
<400> 379
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<212> PRT
<213> - <400> 380
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<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 381
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<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 382
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<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 383
Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val Ala 15 10 <210> 384 <211> 14 <212> PRT <213> -
<400> 384
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser 15 10
<210> 385
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 385
Trp Val Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser 15 10
<210> 386
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 386
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Gln Glu Trp Val Ser 1 5 10
<210> 387
<211> 14 <212> PRT <213> -
<400> 387
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val Ser 15 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> -
25
35
50
<400> 388
Trp Val Arg Val Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Ile Ser 15 10
30 <210> 389
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 389
Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
45
Gly
<210> 390 <211> 16 <212> PRT <213> -
<400> 390
Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> -
<400> 391
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 392
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 392
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1 5 10 15
Gly <210> 393
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 393
Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 394 <211> 17 <212> PRT <213> -
<400> 394
Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
45
<210> 395
<211> 18
<212> PRT
<213> - <400> 395
Arg Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 396
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 396
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1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys Ile
20 25 30
<210> 397 <211> 32 <212> PRT <213> -
<400> 397
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys Ile
20
10
<210> 398
<211> 32
<212> PRT
<213> -
25
30
<400> 398
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln
15 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile
20 25 30
25
30
35
50
<210> 399
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 399
Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
15 10 15
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20 25 30
<210> 400 <211> 32 <212> PRT <213> -
<400> 400
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ile
20 25 30
<210> 401 <211> 32 <212> PRT <213> -
<400> 401
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr Leu Glu
15 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ile
20 25 30
<210> 402
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 402
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 403
<211> 8
<212> PRT
<213> -
<400> 403
Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu 1 5
<210> 404
<211> 8 <212> PRT
<213> -
<400> 404
Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu 1 5
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<213> -
<400> 405
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<211> 7
<212> PRT
<213> -
<400> 406
Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser 1 5
<210> 407
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 407
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<210> 408
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 408
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<400> 409
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<210> 410
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 410
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<210> 411 <211> 11 <212> PRT <213> -
<400> 411
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10
<210> 412
<211> 11
<212> PRT
<213> - <400> 412
Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 413
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 413
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<210> 414 <211> 11 <212> PRT <213> -
<400> 414
Ser Ser Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 415
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 415 Ala Ser 1
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5
10
<210> 416
<211> 11
<212> PRT
<213>
<400> 416
Arg Gly 1
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
5
10
<210> 417
<211> 363
<212> PRT
<213> -
<400> 417
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 80 70 75
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp
145 150 155
160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser
165 170 175
Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
180 185 190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
195 200 205
Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly
210 215 220
Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 225 230 235
240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu
290 295 300
Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
305 310 315
320
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
325 330 335
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn
340 345 350
Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 355 360
<210> 418
<211> 379
<212> PRT
<213> - <400> 418
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr
65 70 75
80
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85 90 95
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155
160 Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr
10 180 185 190
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
15 195 200 205
Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly
225 230 235
240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr
275 280 285
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu
290 295 300
Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
305 310 315
320 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr
325 330 335
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
340 345 350
Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr
355 360 365
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 370 375
<210> 419 <211> 260 25 <212> PRT <213> -
<400> 419
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65
80
70
75
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155
160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp
165 170 175
Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser
195 200 205
45
50
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Tyr
Leu
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 240
230
235
Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
245 250 255
Thr Val Ser Cys
260
<210> 420
<211> 264
<212> PRT
<213> -
<400> 420
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85
90
95
Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155
160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp
165 170 175
Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
180 185 190
Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235
240
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245 250 255 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Cys 260
<210> 421
<211> 20
<212> DNA
<213> -
<400> 421
ggataacaat ttcacacagg
20
<210> 422
<211> 55
<212> DNA
<213> -
<400> 422
tcagtaacct ggatccgcca ccgctgcctc caccgcctga ggagacggtg accag 55
<210> 423
<211> 39
<212> DNA
<213> -
<400> 423
aggttactga ggatccgagg tgcagctggt ggagtctgg
39
50
<210> 424 <211> 46 <212> DNA
<213>
<400> 424
tcagtaacct tccggaaccg ccaccgcctg aggagacggt gacaag 46
<210> 425
<211> 48
<212> DNA
<213>
<400> 425
aggttactga tccggaggcg gtagcgaggt gcagctggtg gagtctgg 48
<210> 426
<211> 19
<212> DNA
<213>
<400> 426
cacgacgttg taaaacgac
19
<210> 427
<211> 43
<212> DNA
<213> - <400> 427
atggtggtgt gcggccgcct attatgagga gacggtgacc agg 43
<210> 428
<211> 45
<212> DNA
<213> -
<400> 428
aggggtatct ctcgagaaaa gagaggtgca gctggtggag tctgg 45
<210> 429
<211> 56
<212> DNA
<213> -
<400> 429
gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa agagaggtgc agctggtgga gtctgg 56
<210> 430
<211> 88
<212> DNA
<213> -
<400> 430
tcagtaacct ggatcccccg ccaccgctgc ctccaccgcc gctacccccg ccaccgctgc 60
ctccaccgcc 88
tgaggagacg
gtgacaag <210> 431
<211> 69
<212> DNA
<213> -
<400> 431 aggttactga tgcagctggt
ggagtctgg 69
ggatccggcg gtggaggcag cggtggcggg ggtagcgagg 60
<210> 432
<211> 41
<212> DNA
<213> -
<400> 432 atggtggtgt 41
gaattcttat
tagcaggaga
cggtgacaag
g
<210> 433
<211> 53
<212> DNA
<213> -
<400> 433
atggtggtgt gaattcttat tagcaacctc cacctgagga gacggtgaca agg 53
<210> 434 <211> 21 <212> DNA <213>
<400> 434
gactggttcc aattgacaag c
21
<210> 435
<211> 21
<212> DNA
<213>
<400> 435
gcaaatggca ttctgacatc c
21

Claims (111)

1. Nanocorpo contra o TNF-alfa, que se compõe de 4 regiões de armação (FRl a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), CARACTERIZADO pelo fato de que: a) O CDRl compreende: a seqüência de aminoácidos DYWMY; ou uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos -80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, inclusive mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência de aminoácidos DYWMY; ou umas seqüências de aminoácidos que tem só 1 diferença de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos DYWMY; e b) 0 CDR2 compreende: a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; ou - uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos -80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, inclusive mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; ou - umas seqüências de aminoácidos que tem 2 ou só 1 diferença (s) de aminoácidos(s) com a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; c) O CDR3 compreende: a seqüência de aminoácidos SPSGFN; ou uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, inclusive mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência de aminoácidos SPSGFN; ou uma seqüência de aminoácidos que tem só 1 diferença de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos SPSGFN.
2. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRl compreende a seqüência de aminoácidos DYWMY.
3. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que CDR2 compreende a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
4. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que CDR3 compreende a seqüência de aminoácidos SPSGFN.
5. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: - CDR1 compreende a seqüência de aminoácidos DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência de aminoácidos SPSGFN; ou - CDR1 compreende a seqüência de aminoácidos DYWMY; e CDR2 compreende a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; ou - CDR2 compreende a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 compreende a seqüência de aminoácidos SPSGFN
6. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRl compreende a seqüência de aminoácidos DYWMY; e o CDR3 compreende a seqüência de aminoácidos SPSGFN.
7. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRl compreende a seqüência de aminoácidos DYWMY; o CDR2 compreende a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 compreende a seqüência de aminoácidos SPSGFN.
8. Nanocorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que: qualquer substituição de aminoácidos é uma substituição de aminoácidos conservadora; e/ou a referida seqüência de aminoácidos só contém substituições de aminoácidos, e nenhuma eliminação ou inserções de aminoácidos, em comparação com a(s) seqüência (s) de aminoácidos acima mencionadas.
9. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é um Nanocorpo humanizado.
10. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é um Nanocorpo de classe GLEW.
11. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que contém um resíduo de arginina (R) na posição 103.
12. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é um Nanocorpo de classe GLEW.
13. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é um Nanocorpo de classe GLEW com um resíduo de arginina (R) na posição 103.
14. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO's 52 (TNFl) , 76 (TNF13) , 77 (TNF14) , 95 (TNF29) ou 96 (TNF30).
15. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que contém um resíduo de leucina (L) na posição 108.
16. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma taxa Koff para TNF de melhor do que 2.10-3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10-3 (l/s); ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
17. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
18. Nanocorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/0418 62 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
19. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
20. Nanocorpo, contra o TNF-alfa, CARACTERIZADO pelo fato de que se compõe de 4 regiões de armação (FR1 a FR4 respectivamente) e 3 regiões que determinam complementaridade (CDR1 a CDR3 respectivamente), em que a) CDR1 é: - a seqüência de aminoácidos DYWMY; ou - uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, inclusive mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência de aminoácidos DYWMY; ou as seqüências de aminoácidos que tem só 1 diferença de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos DYWMY; e em que: b) CDR2 é: - a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; ou - uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, inclusive mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; ou as seqüências de aminoácidos que tem 2 ou só 1 diferença (s) de aminoácidos(s) com a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; e em que c) O CDR3 é: - a seqüência de aminoácidos SPSGFN; ou - uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 8 0%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, inclusive mais preferivelmente pelo menos identidade de seqüência de 99% com a seqüência de aminoácidos SPSGFN; ou - as seqüências de aminoácidos que tem só 1 diferença de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos SPSGFN.
21. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRl é a seqüência de aminoácidos DYWMY.
22. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que CDR2 é a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
23. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que CDR3 é a seqüência de aminoácidos SPSGFN
24. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que: - CDR1 é a seqüência de aminoácidos DYWMY; e o CDR3 é a seqüência de aminoácidos SPSGFN; ou - CDR1 é a seqüência de aminoácidos DYWMY; e o CDR2 é a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; ou - CDR2 é a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; e o CDR3 é a seqüência de aminoácidos SPSGFN
25. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRl é a seqüência de aminoácidos DYWMY; e o CDR3 é a seqüência de aminoácidos SPSGFN.
26. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que CDRl é a seqüência de aminoácidos DYWMY; o CDR2 é a seqüência de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG e CDR3 é a seqüência de aminoácidos SPSGFN.
27. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que: qualquer substituição de aminoácidos é preferivelmente uma substituição de aminoácidos conservadora; e/ou - a referida seqüência de aminoácidos preferivelmente só contém substituições de aminoácidos, e nenhuma eliminação ou inserções de aminoácidos, em comparação com as seqüência(s) de aminoácidos acima mencionadas.
28. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que é um Nanocorpo humanizado.
29. Nanocorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 0 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que é um Nanocorpo de classe GLEW.
30. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 0 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que contém um resíduo de arginina (R) na posição 103.
31. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o nNanocorpo definido nas reivindicações de 1 a 8 ser um nanocorpo de classe GLEW com um resíduo de arginina (R) na posição 103.
32. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conforme definido na presente) com uma das seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO's 52 (TNFl), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) ou 96 (TNF30).
33. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que contém um resíduo de leucina (L) na posição 108.
34. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 0 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que tem uma taxa Koff para TNF de melhor do que 2.10-3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10-3 (l/s); ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
35. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3) , de WO -04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO:4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
36. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3) , de WO -04/041862 que é melhor do que 5nM; ou uma variante humanizada de tal Nanocorpo.
37. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que tem iam valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3) , de WO -04/041862 que é melhor do que 3nM; ou uma variante humanizada de tal nanocorpo.
38. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que é escolhido do grupo composto de TNF 13 (SEQ ID n. 76), TNF 14 (SEQ ID n. 77), TNF 29 (SEQ ID n. 95) e TNF 30 (SEQ ID NO: -96).
39. Nanocorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que é TNF 30 (SEQ ID n. 96).
40. Proteína ou o polipeptídio, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe de um nanocorpo definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a -39.
41. Proteina ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo de definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 39.
42. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 0-41, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 39.
43. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-42, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende compreende dois nanocorpos definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 39, e que é tal que a referida proteína ou o polipeptídio, para se ligar a um trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor.
44. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 42, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 39, e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos locais de ligação de receptor TNF em um trimero TNF.
45. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 44, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 39, que são diretamente ligados um ao outro ou ligados um ao outro através de um linker.
46. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o linker é uma seqüência de aminoácidos.
47. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 4 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o linker é uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 14 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 17 aminoácidos, tais como aproximadamente 20-40 aminoácidos.
48. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de que o linker compreende resíduos de glicina e serina.
49. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que e compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF 7 (SEQ ID n. 73), no qual ambos nanocorpos TNF 1 foram humanizados.
50. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptidio TNF 55 (SEQ ID n. 419) ou TNF 56 (SEQ ID n. 420) .
51. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que é pegilado.
52. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano.
53. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano tem presentes seqüências CDR na ALB 8 (SEQ ID n. 102) .
54. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 39, que adicionalmente compreende pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano.
55. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois nanocorpos definidos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 39 são ligados diretamente a pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano, ou ligados a pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano através de um linker.
56. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 55,. CARACTERIZADO pelo fato de que o linker é uma seqüência de aminoácidos.
57. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que o linker é uma seqüência de aminoácidos que compreende entre 3 e 40 resíduos aminoácidos, tal como entre 5 e 15 resíduos aminoácidos
58. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 e 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o linker se compõe de resíduos de glicina e serina.
59. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 54 a 58, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano tem presentes as seqüências CDR na ALB 8 (SEQ ID n. 102).
60. Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 59, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado.
61. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos iam nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano é uma variante humanizada do Nanocorpo ALB 1 (SEQ ID n. 63).
62. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano é um escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n. 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102), ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104).
63. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano é a ALB 8 (SEQ ID n. 102).
64. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas de um Nanocorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-39 e uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID η. 63).
65. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 64, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF24 (SEQ ID n. 90), no qual tanto o nanocorpo TNF 1 como o nanocorpo ALB 1 foi humanizado.
66. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 65, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos TNF 30 e um Nanocorpo ALB 8.
67. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 54 a 66, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF 60 (SEQ ID n. 417).
68. Nanocorpo contra o TNF-alfa, CARACTERIZADO pelo fato de que é uma variante humanizada de um Nanocorpo contra o TNF-alfa, cujo Nanocorpo contra o TNF-alfa tem as seqüências de armação seguintes: FRl: SEQ ID n. 130; FR2: SEQ ID n. 198; FR3: SEQ ID n. 266; e FR4: SEQ ID n. 334.
69. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que tem CDR'S que são tais que o Nanocorpo tem uma taxa K0ff para TNF de melhor do que 2.10-3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10-3 (l/s).
70. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 68 ou 69, CARACTERIZADO pelo fato de que tem CDR'S que são tais que o Nanocorpo tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID N0:4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; e especialmente melhor do que 12nM, mais especialmente melhor do que 5 nM, até mais especialmente melhor do que 3nM.
71. Nanocorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 68 a 70, CARACTERIZADO pelo fato de que é dirigido contra o mesmo epitope de TNF (isto é, o trimero TNF) como o TNFl.
72. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que é dirigido contra o mesmo epitope no trimero do TNF-alfa o como Nanocorpo TNFl (SEQ ID η. 52).
73. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que é dirigido contra o mesmo epitope no trimero do TNF-alfa como o Nanocorpo TNF3 (SEQ ID η. 60).
74. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de que tem CDR'S que são tais que o Nanocorpo tem uma taxa K0ff para TNF de melhor do que 2.10-3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10-3 (l/s).
75. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, CARACTERIZADO pelo fato de que tem CDR'S que são tais que o Nanocorpo tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; e especialmente melhor do que 12nM, mais especialmente melhor do que 5 nM, até mais especialmente melhor do que 3nM.
76. Nanocorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que é uma variante humanizada do Nanocorpo TNFl (SEQ ID n. 52).
77. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 7 6, CARACTERIZADO pelo fato de que tem CDR'S que são tais que o Nanocorpo tem uma taxa KQff para TNF de melhor do que 2.10-3 (l/s), preferivelmente melhor do que 1.10-3 (l/s).
78. Nanocorpo, de acordo com a reivindicação 76 ou 77, CARACTERIZADO pelo fato de que tem CDR'S que são tais que o Nanocorpo tem um valor de EC50 no ensaio à base de células usando células KYM descritas no Exemplo 1, conforme 3), de WO 04/041862 que é melhor do que o valor de EC50 do Nanocorpo VHH 3E (SEQ ID NO: 4) de WO 04/041862 no mesmo ensaio; e especialmente melhor do que 12nM, mais especialmente melhor do que 5 nM, até mais especialmente melhor do que 3nM.
79. Proteína ou o polipeptídio, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe de um Nanocorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 68 a 78.
80. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 79, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe de pelo menos um nanocorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 68 a -78.
81. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 9 a 80, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos conforme qualquer uma das reivindicações de 68 a 78.
82. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 9 a 81, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos conforme qualquer uma das reivindicações de 68 a 78, e que é tal que a referida proteína ou o polipeptídio, para se ligar a um trímero TNF, é capaz de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor.
83. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 9 a 81, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos conforme qualquer uma das reivindicações de 68 a 78, e que é capaz da ligação intramolecular a pelo menos dois sítios que ligam o receptor TNF a um Trimero TNF.
84. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 81 a 83, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos conforme qualquer uma das reivindicações de 68 a 78, que são diretamente ligados um a outro ou ligados um ao outro através de um linker.
85. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 84, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linker é uma seqüência de aminoácidos.
86. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linker é uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos 14 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 17 aminoácidos, tais como aproximadamente 20-40 aminoácidos.
87. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 8 6, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linker compreende resíduos de glicina e serina.
88. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 81 a 83, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe do polipeptídio TNF 7 (SEQ ID n. 73), no qual ambos nanocorpos TNF 1 foram humanizados.
89. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 80 a 88, CARACTERIZADOS pelo fato de que é pegilado.
90. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende dois nanocorpos definidos conforme qualquer uma das reivindicações de 68 a 78, e cuja proteína ou polipeptídio além disso compreendem pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano.
91. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 90, CARACTERIZADOS pelo fato de que os dois nanocorpos definidos conforme qualquer uma das reivindicações de 68 a 78 são ligados diretamente a pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano, ou ligados a pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano através de um linker.
92. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 91, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linker é uma seqüência de aminoácidos.
93. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 92, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linker é uma seqüência de aminoácidos que compreende entre 3 e 4 0 resíduos aminoácidos, tal como entre 5 e 15 resíduos aminoácidos
94. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92 ou 93, CARACTERIZADOS pelo fato de que o linker se compõe de resíduos de glicina e serina.
95. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação alguma de reivindicações de 90 a 94, CARACTERIZADOS pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano tem presentes as seqüências CDR na ALB 8 (SEQ ID η. 102).
96. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 90 a 95, CARACTERIZADOS pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano é um Nanocorpo humanizado.
97. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 96, CARACTERIZADOS pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano é uma variante humanizada da ALB Nanocorpo 1 (SEQ ID η. 63).
98. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 97, CARACTERIZADOS pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano é escolhido do grupo composto da ALB 3 (SEQ ID n. 87), ALB 4 (SEQ ID n. 88), ALB 5 (SEQ ID n. 89), ALB 6 (SEQ ID n, 100), ALB 7 (SEQ ID n. 101), ALB 8 (SEQ ID n. 102), ALB 9 (SEQ ID n. 103) e ALB 10 (SEQ ID n. 104).
99. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 98, CARACTERIZADOS pelo fato de que pelo menos um nanocorpo dirigido contra a albumina de soro humano é a ALB 8 (SEQ ID n. 102).
100. Proteína ou polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 81 a 99, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreende ou essencialmente se compõe de dois nanocorpos que são variantes humanizadas de um nanocorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 65 a -67 e uma variante humanizada do Nanocorpo ALB 1 (SEQ ID n. -63).
101. Proteína ou polipeptídio, CARACTERIZADOS pelo fato de que que compreende ou essencialmente se compõe de dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina (ou fragmentos convenientes dos mesmos) que são cada um dirigidos contra epitopes no TNF-alfa (e especialmente do trímero TNF-alfa) que está situado em e/ou faz parte do(s) sítio (s) de ligação do receptor do trímero TNF, tal que o referido polipeptídio, para se ligar a um trímero TNF, é capazes de inibir ou reduzir a ligação cruzada do receptor TNF que é mediada pelo referido trímero TNF e/ou a transdução de sinal que é mediada por tal ligação cruzada de receptor.
102. Proteína ou polipeptídio CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendem ou essencialmente se compõem de dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina (ou fragmentos convenientes dos mesmos) que são cada um direcionado contra epitopes no TNF-alfa (e especialmente do trímero de TNF- alfa) que se encontra em e/ou faz parte do(s) sítio (s) de ligação do receptor do trímero TNF, tal que o referido polipeptídio é capaz de ligação intramolecular a pelo menos dois sítios de ligação de receptor TNF em um trímero TNF.
103. Proteína ou polipeptídio, de acordo com a reivindicação 101 ou 102, CARACTERIZADOS pelo fato de que os dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina são dirigidos contra o mesmo epitope que o Nanocorpo TNFl (SEQ ID η. 52).
104. Proteína ou polipeptidio, de acordo com a reivindicação 101 ou 102, CARACTERIZADOS pelo fato de que os dois ou mais domínios variáveis de imunoglobulina são nanocorpos.
105. Seqüência de Nucleotideo ou ácido nucléico, CARACTERIZADOS pelo fato de que codificam um Nanocorpo, Proteína ou polipeptidio, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.
106. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendende uma seqüência de nucleotídeo ou ácido nucléico segundo a reivindicação 105, ou que expressa ou é capaz de expressar um Nanocorpo, Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 104.
107. Método para prepara um Nanocorpo, Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 102, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar ou manter uma célula hospedeira conforme definida na reivindicação 106 em condições tais que a referida célula hospedeira produz ou expressa um Nanocorpo, Proteína ou polipeptidio, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 104; e que opcionalmente, além disso, compreende a isolação do Nanocorpo, Proteína ou polipeptidio, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 104.
108. Composição farmacêutica, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um nanocorpo, Proteína ou polipeptidio, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 104, e opcionalmente pelo menos um portador farmaceuticamente aceitável.
109. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 108, ou um Nanocorpo, Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 104, CARACTERIZADOS pelo fato de que servem para o tratamento de pelo menos uma doença e desordem escolhida do grupo composto de inflamação, artrite reumatóide, COPD, asma, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome inflamatória do intestino, esclerose múltipla, doença de Addison, hepatite autoimune, parotidite autoimune, diabetes Tipo I, epididimite, glomerulonefrite, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistêmico, infertilidade masculina, esclerose múltipla, miastenia gravis, pênfigo, psoríase, febre reumática, artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatias, tiroidite e vasculite.
110. Uso de um Nanocorpo, Proteína ou polipeptidio, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 104, CARACTERIZADO pelo fato de ser aplicado na preparação de um medicamento para o tratamento de pelo menos uma doença e desordem escolhido do grupo composto de inflamação, artrite reumatóide, COPD, asma, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome inflamatória do intestino, esclerose múltipla, doença de Addison, hepatite autoimune, parotidite autoimune, diabetes Tipo I, epididimite, glomerulonefrite, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistêmico, infertilidade masculina, esclerose múltipla, miastenia gravis, pênfigo, psoriase, febre reumática, artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma, sindrome de Sjogren, espondiloartropatias, tiroidite e vasculite.
111. Proteína ou o polipeptídio, CARACTERIZADO pelo fato de que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou identidade de seqüência pelo menos de 99% (conforme definido na presente) com o polipeptídio TNF 60 (SEQ ID n. 417).
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