BRPI0510819B1 - método para a preparação de metionina, seus precursores ou produtos derivados da mesma e microorganismo recombinante - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE METIONINA, SEUS PRECURSORES OU PRODUTOS DERIVADOS DA MESMA, HOMOSSERINA TRANSSSUCINILASE MUTADA, SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, S-ADENOSILMETIONINA SÍNTASE, E, MICROORGANISMO A presente invenção diz respeito ao uso de enzimas homosserina trans-succinilases recombinantes com sensibilidade de realimentação alterada (MetA*) e, eventualmente, enzimas S-adenosil metionina sintetase recombinantes com atividade reduzida (MetK*) para a produção de metionina, seus precursores ou seus derivados.

Description

Campo a Invenção

[0001] A presente invenção diz respeito ao uso de enzimas homosserina trans- succinilases recombinantes com sensibilidade de realimentação alterada (MetA*) e, eventualmente, enzimas S-adenosil metionina sintetase recombinantes com atividade reduzida (MetK*) para a produção de metionina, seus precursores ou seus derivados. Técnica Anterior

[0002] Os compostos contendo enxofre, tais como a cisteina, a homocisteína, a metionina ou a S-adenosilmetionina são fundamentais para o metabolismo celular e são industrialmente produzidos para serem usados como alimento ou aditivos alimentares e medicamentos. A metionina, em particular, um aminoácido essencial, que não pode ser sintetizado por animais, desempenha um importante papel em muitas funções do corpo. À parte sua função na biossíntese das proteínas, a metionina está envolvida na transmetilação e na biodisponibilidade do selênio e do zinco. A metionina é também diretamente usada como um tratamento para distúrbios como alergia e febre reumática. Apesar disso, a maior parte da metionina que é produzida é adicionada à alimentação animal.

[0003] Com o uso reduzido de proteínas de origem animal, como um resultado da BSE e da gripe aviária, a demanda por metionina pura tem aumentado. Quimicamente, a D,L-metionina é comumente produzida da acroleína, metil mercaptano e cianeto de hidrogênio. Não obstante, a mistura racêmica não se desempenha tão bem quanto a L-metionina pura, como por exemplo em aditivos alimentares para galinhas (Saunderson, C. L, (1985)

[0004] British Journal of Nutrition 54, 621-633). A L-metionina pura pode ser produzida a partir da metionina racêmica, por exemplo por meio do tratamento de acilase de N-acetil-D-L-metionina, o que aumenta dramaticamente os custos da produção. A demanda crescente por L-metionina pura, associada com os interesses ambientais, torna a produção microbiana da metionina atrativa.

[0005] Os microrganismos têm desenvolvido mecanismos reguladores sumamente complexos que sintonizam precisamente a biossíntese de componentes celulares permitindo deste modo índices máximos de crescimento. Consequentemente, apenas as quantidades necessárias de metabólitos, tais como aminoácidos, são sintetizadas e podem usualmente não ser detectadas no sobrenadante da cultura de cepas do tipo selvagem. A biossíntese de aminoácido controlada por bactérias, principalmente pela inibição de retroalimentação das enzimas, e repressão ou ativação da transcrição de genes. Efetores para estas vias reguladoras são, na maior parte dos casos, os produtos finais das vias pertinentes. Consequentemente, as estratégias para a superprodução de aminoácidos em microrganismos requerem a desregulação destes mecanismos de controle.

[0006] A via para a síntese de L-metionina em muitos microrganismos é bem conhecida (Figura 1 A/B). A metionina é derivada do aminoácido aspartato, mas sua síntese requer a convergência de duas vias adicionais, a biossíntese da cisteína e o metabolismo de C1 (N-metiltetraidrofolato). O aspartato é convertido em homosserina por uma sequência de três reações. A homosserina pode subsequentemente entrar na via biossintética da treonina/isoleucina ou da metionina. Na entrada de E. coli na via da metionina se requer a acilação da homosserina em succinil-homosserina. Esta etapa de ativação possibilita a subsequente condensação com a cisteína, conduzindo à cistationina contendo tioéter, que é hidrolisada para fornecer homocisteína. A transferência final de metil que conduz à metionina é realizada ou por uma metiltransferase dependente de B12 ou independente de B12.

[0007] A biossíntese da metionina em E. coli é regulada por repressão e ativação de genes biossintéticos da metionina através das proteínas MetJ e MetR, respectivamente (examinado em Neidhardt, F. C. (Editor em Chefe), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechtcr e H. E. Umbarger (editores). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology; Weissbach et al., 1991 Mol.Microbiol., 5, 1593-1597). MetJ usa S-adenosilmetionina como urn co- repressor, que é produzido de metionina pela enzima S-adenosilmetionina sintetase (EC 2.5.1.6) codificada pelo gene essencial metK. O metA codificando a homosserina trans-succinilase (EC 2.3.1.46), a primeira enzima única para a síntese da metionina, é outro ponto de controle principal para a produção da metionina. Além da regulação transcricional de metApor MetJ e MetR, a enzima é também regulada por retroalimentação pelos produtos finais metionina e S-adenosilmetionina (Lee, L.-W et al. (1966) Multimetabolite control of a biosynthetic pathway by sequential metabolites, JBC 241 (22), 5479-5780). A inibição da retroalimentação por estes dois produtos é sinergística, significando que baixas concentrações de cada metabólito sozinho são apenas levemente inibidoras, enquanto em combinação uma forte inibição é exercida.

[0008] Os análogos de aminoácido inibem o crescimento bacteriano através da síntese de polipeptídeos anormais e pela interferência com a inibição da retroalimentação, o que leva a processos prejudiciais dentro da célula. Mutantes resistentes aos análogos foram obtidos, os quais apresentam enzimas alteradas e desreguladas, levando a excesso de síntese dos metabólitos correspondentes que podem competir com o análogo. Vários grupos têm usado os análogos de metionina, a norleucina, etionina e oc-metilmetionina, para gerar cepas microbianas que superproduzem a metionina. Foi observado que a oc-metilmetionina é um inibidor potente da enzima homosserina trans-succinilase MetA (Rowbury, R. J., (1968) The inhibitory effect of a-methylmethionine on Escherichia coli, J. gen. Microbiol., 52, 223- 230). Os mutantes resistentes à retroalimentação na Salmonella typhimurium que evidenciaram o local metA foram isolados (Lawrence, D. A., (1972) Regulation of the methionine feedback-sensitive enzyme in mutants of Salmonella typhimurium; Lawrence, D. A., Smith, D. A., Rowbury, R. J. (1967) Regulation of methionine synthesis in Salmonella typhimurium: Mutants resistant to inhibition by analogues of methionine, Genetics 58, 473-492). Os mutantes resistentes à Norleucina foram observados evidenciarem o local metK. (Chattopadhyay, M. K., Ghosh, A. K. e Sengupta, S. (1991), Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli K12: a closer study with analogue resistant mutants, Journal of General Microbiology, 137, 685-691). Os mesmos autores relataram o isolamento dos mutantes metA resistentes à retroalimentação e mutantes resistentes à norleucina em E. coli, mas as mutações reais em metA e metK não foram descritas.

[0009] O papel crítico da homosserina trans-succinilase quanto à produção da metionina bacteriana mediante fermentação, foi demonstrado (Kumar, D., Garg, S., Bisaria, V. S., Sreekrishnan, T. R. e Gomes, J. (2003) Production of methionine by a multi-analogue resistant mutant of Corynebacterium lilium, Process Biochemistry 38, 1165-1171). O pedido de patente JP 2000139471 descreve um processo para a produção da L-metionina com o uso de mutantes nos genes metA e metK. Neste caso, a localização precisa das mutações foi determinada. As enzimas do mutante MetA perderam parcialmente a sensibilidade à inibição da retroalimentação pela metionina e a S-adenosilmetionina. Não obstante suas atividades iniciais terem sido reduzidas a cerca de 25% em comparação com a enzima do tipo selvagem, e nas concentrações de metionina 1 mM para alguns mutantes ou SAM 1 mM para outros, outros 25 a 90% da atividade enzimática são perdidos. Os mutantes metK não foram caracterizados enzimaticamente, mas usados em fermentações para aumentar a quantidade de metionina produzida.

Descrição Geral da Invenção

[0010] Esta invenção diz respeito a um método para a preparação de metionina, seus precursores ou produtos deles derivados, em um processo fermentativo com um microrganismo onde a L-homosserina é convertida em O-succinil-homoserina por uma homosserina trans-succinilase, incluindo a etapa de cultivo do microrganismo referido em um meio apropriado, e a recuperação da metionina, seus precursores ou produtos deles derivados uma vez produzidos, em que a homosserina trans-succinilase é a homosserina trans-succinilase mutante com sensibilidade reduzida para com os inibidores da retroalimentação, S-adenosilmetionina e metionina.

[0011] A invenção também diz respeito ao mesmo método com microrganismos, em que a atividade da enzima S-adenosilmetionina sintetase é reduzida.

[0012] A presente invenção também diz respeito a enzimas transformadas, a sequências de nucleotídeos codificando para as referidas enzimas com sensibilidade ou atividade reduzida, e microrganismos compreendendo as mencionadas sequências de nucleotídeos como descrito acima e abaixo.

[0013] As enzimas recombinantes podem ser usadas juntas e também podem ser combinadas com várias outras mudanças nos microrganismos correspondentes, tais como a superexpressão de genes ou sua supressão. Preferivelmente, o gene codificando a aspartocinase/homosserina desidrogenase (metL ou thrA) é superexpresso e o gene codificando o repressor da metionina metJ é suprimido.

[0014] Na descrição da presente invenção, os genes e as proteínas são identificadas com o uso de denominações dos correspondentes genes em E. coli. Entretanto, e a menos que de outra forma especificado, o uso destas denominações tem um significado mais geral de acordo com a invenção, e cobre todos os genes e proteínas correspondentes em outros organismos, mais particularmente em microorganismos.

[0015] PFAM (banco de dados de famílias protéicas de alinhamentos e modelos de Markov ocultos; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequências protéicas. Cada PFAM torna possível visualizar alinhamentos múltiplos, observar domínios protéicos, avaliar a distribuição entre os organismos, obter acesso a outros bancos de dados, e visualizar estruturas protéicas conhecidas.

[0016] COGs (agrupamentos de grupos ortólogos de proteínas; http//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos pela comparação de sequências de proteínas de 43 genomas completamente sequenciados representando 30 linhagens filogênicas principais. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhagens, as quais permitam a identificação dos domínios conservados precedentes.

[0017] Os meios de identificar sequências homólogas e suas homologias percentuais são bem conhecidos daqueles habilitados na técnica, e incluem, em particular, os programas BLAST, que podem ser usados do site da Web httpZZwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/com os parâmetros padrão indicados nesse site da Web. As sequências obtidas podem então ser utilizadas (por exemplo, alinhadas) com o uso, por exemplo, dos programas CLUSTALW (http://www.cbi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN (http://prodcs.Toulouse.infra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), com os parâmetros padrão indicados nesses sites da Web.

[0018] Usando-se as referências dadas no GenBank para os genes conhecidos, aqueles habilitados na técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito com o uso de sequências de consenso que podem ser determinadas pela realização dos alinhamentos das sequências com genes derivados de outros microorganismos, e projetando-se sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Estes métodos de torina da biologia molecular são bem conhecidos daqueles habilitados na técnica, e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a edição. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York).

Descrição Detalhada da Invenção

[0019] As homosserina succiniltransferases modificadas apresentando uma sensibilidade de retroalimentação reduzida à metionina e à S-adenosilmetionina, em comparação com a enzima do tipo selvagem, de acordo com a presente invenção, compreendem pelo menos uma mutação de aminoácidos em comparação com a sequência do tipo selvagem. A mutação é preferivelmente selecionada nas regiões conservadas codificando para os aminoácidos 24 a 30 ou na região codificando para os aminoácidos 58 a 65, ou na região codificando para os aminoácidos 292 a 298 com o primeiro aminoácido a prolina após a contagem da formilmetionina como número 1.

[0020] Todas as referências às posições dos aminoácidos são feitas com base na homosserina succiniltransferase codificada pelo gene metA de E. coli representado na figura 2. As posições relativas das regiões conservadas correspondentes em outras homosserina succiniltransferases dos diferentes organismos podem ser encontradas por uma pessoa versada na técnica mediante simples alinhamento de sequências, como representado na figura 3, com as enzimas listadas abaixo: - gi|20138683|sp|Q97l29|META Clostridium acetobutylicum Homosserina O-succiniltransferase - gi|12230304|sp|Q9PLV2|META Campylobacter jejuni Homosserina O- succiniltransferase - gi|12230277|sp|Q9KAK7|META Bacillus halodurans Homosserina O- succiniltransferase - gi|20138686|sp|Q97PM9|META Streptococcus pneumoniae Homosserina O-succiniltransferase - gi|20138715|sp|Q9CEC5|META Lactococcus lactis Homosserina 0- succiniltransferase - gi|20138656|sp|Q92L99|META Sinorhizobium meliloti Homosserina 0- succiniltransferase - gi|20138618|sp|Q8YBV5|META Brucella melitensis Homosserina 0- succiniltransferase - gi|20141549|sp|P37413|META Salmonella typhimurium Homosserina 0- succiniltransferase - gi|20138601 |sp|Q8X610|META Escherichia coli O157:H7 Homosserina O-succiniltransferase - gi|12231004|sp|P07623|META Escherichia coli Homosserina 0- succiniltransferase - gi|12230285|sp|Q9KRM5|META Vibrio cholerae Homosserina 0- succiniltransferase - gi|38258142|sp|Q8FWG9|META Brucella melitensis biovar suis Homosserina O-succiniltransferase - gi|20138631 |sp|Q8ZAR4|META Yersinia pestis Homosserina 0- succiniltransferase - gi| 1223101 O|sp|P54167|META Bacillus subtilis Homosserina 0- succiniltransferase - gi|12230320|sp|Q9WZY3|META Thermotoga maritima Homosserina 0- succiniltransferase - gi|20138625|sp|Q8Z1 W1 |META Salmonella typhi Homosserina 0- succiniltransferase - >gi|31340217|sp|Q8D937|META Vibrio vulnificus Homosserina 0- succiniltransferase - gi|31340213|sp|Q87NW7|META Vibrio parahaemolyticus Homosserina O-succiniltransferase

[0021] As homosserina succiniltransferases modificadas de preferência apresentam uma atividade específica que é pelo menos dez vezes aquela da enzima do tipo selvagem na presença de metionina 10 mM e S-adenosilmetionina 1 mM, e pelo menos 80 vezes aquela da enzima do tipo selvagem na presença de metionina 10 mM e S-adenosilmetionina 0,1 mM. As enzimas preferidas retêm uma atividade de pelo menos dois por cento de sua atividade inicial na presença de metionina 100 mM e de S-adenosilmetionina 1 mM.

[0022] Preferivelmente, a sequência de proteínas da homosserina succiniltransferase modificada de acordo com a invenção contém a mutação de aminoácidos de pelo menos uma das sequências das regiões conservadas especificadas abaixo.

[0023] Preferivelmente, pelo menos uma mutação está presente na região conservada 1 compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo, na parte N-terminal das homosserina trans-succinilases do tipo selvagem, correspondentes aos aminoácidos 24 a 30 na sequência de aminoácidos de MctA de E. coli mostrada na SEQ ID NO: 1. Esta região conservada 1 não mutada tem a seguinte sequência: X1-X2-X3-A-X4-X5-Q

[0024] em que

[0025] X1 representa E, D, T, S, L, preferivelmente T

[0026] X2 representa D, S, K, Q, E, A, R, preferivelmente S

[0027] X3 representa R, E, D, preferivelmente R

[0028] X4 representa Y, I, F, A, K, S, V, preferivelmente S

[0029] X5 representa H, S, N, G, T, R, preferivelmente G

[0030] Em uma forma de realização preferida, a região conservada 1 da homosserina succiniltransferase não modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos: T-S-R-A-S-G-Q.

[0031] Em outra forma de realização preferida da invenção, pelo menos uma mutação está presente na região conservada 2, também na parte N-terminal da homosserina trans-succinilase do tipo selvagem, correspondente aos aminoácidos 58 a 65 na sequência de aminoácidos de MetA de E. coli mostrada na SEQ ID NO: 1. A região conservada 2 não mutada tem a seguinte fórmula: X1-X2-X3-P-L-Q-X4-X5

[0032] em que

[0033] X1 representa G, A, S, preferivelmente S

[0034] X2 representa N, A, preferivelmente N

[0035] X3 representa S, T, preferivelmente S

[0036] X4 representa V, L, I, preferivelmente V

[0037] X5 representa N, E, H, D, preferivelmente D.

[0038] Em uma forma de realização preferida, a região conservada 2 da homosserina succiniltransferase não modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos: S-N-S-P-L-Q-V-D.

[0039] Em uma terceira forma de realização da invenção, a homosserina succiniltransferase compreende pelo menos uma mutação em uma região conservada em sua parte C-terminal, correspondente aos aminoácidos 292 a 298 na sequência de aminoácidos de MetA de E. coli apresentada na SEQ ID NO: 1. A região conservada 3 não mutada tem a seguinte fórmula: X1-Y-Q-X2-T-P-X3

[0040] em que

[0041] X1 representa V, I, M, preferivelmente V

[0042] X2 representa E, K, G, I, Q, T, S, preferivelmente I

[0043] X3 representa F, Y, preferivelmente Y.

[0044] Em uma modalidade preferida, a região conservada 3 da homosserina succiniltransferase não modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos: V-Y-Q- l-T-P-Y.

[0045] Em uma forma de realização preferida, a alanina conservada na região conservada 1 é substituída por outro aminoácido, mais preferível por uma valina. A região conservada modificada tem o mais preferível a seguinte sequência de aminoácidos: T-S-R-V-S-G-Q.

[0046] Em uma outra forma de realização preferida, os aminoácidos conservados L e/ou Q na região conservada 2, são substituídos por outros aminoácidos. Preferivelmente, a leucina é substituída pela fenilalanina e/ou a glutamina é substituída por um glutamato ou aspartato. O mais preferível é que a região conservada 2 modificada tenha a seguinte sequência de aminoácidos: S-N-S-P-L-E- V-D.

[0047] Em uma outra forma de realização preferida, os aminoácidos conservados L e/ou Q na região conservada 3 são substituídos por outro aminoácido.

[0048] Em uma aplicação preferida, o gene metA é a enzima homosserina trans- succinilase de E. coli K12 representada pela SEQ ID NO: 1 e sequências homólogas àquela sequência que tem atividade de homosserina trans-succinilase e que compartilha pelo menos 80% de homologia, preferivelmente 90% de homologia com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0049] As homosserina succiniltransferases modificadas podem ser obtidas, por exemplo, pela seleção de cepas em cultivo na presença de análogos de metionina, tais como a oc-metilmetionina, a norleucina ou a etionina. Preferivelmente estas cepas serão selecionadas enquanto em cultivo na presença de oc-metilmetionina.

[0050] A presente invenção além disso diz respeito a sequências de nucleotídeos, sequências de DNA ou de RNA, as quais codificam uma homosserina succiniltransferase transformada de acordo com a invenção, como definido acima. Em uma forma de realização preferida, a sequência de DNA é caracterizadapelo fato de que compreende pelo menos uma mutação nas regiões codificadoras das regiões conservadas 1 a 3 do gene metA do tipo selvagem, representada na SEQ ID NO: 1, a referida mutação não sendo uma mutação silenciosa.

[0051] Estas sequências de DNA podem ser preparadas, por exemplo, das cepas em cultivo na presença dos análogos de metionina. O fragmento de DNA de partida, incluindo o gene metA modificado, é clonado em um vetor com o uso de técnica padrão conhecidas para preparar DNA recombinante.

[0052] Estas sequências de DNA também podem ser preparadas, por exemplo, por métodos não específicos ou de mutagênese dirigida das cepas que abrigam a sequência de DNA codificando a homosserina succiniltransferase do tipo selvagem.

[0053] As mutações não específicas dentro da referida região do DNA podem ser produzidas, por exemplo, por agentes químicos (por exemplo, nitrosoguanidina, ácido etilmetanossulfônico e outros) e/ou por métodos físicos e/ou por reações de PCR, que sejam realizados sob condições particulares.

[0054] Métodos para introduzir mutações em posições específicas dentro de um fragmento de DNA são conhecidos e descritos em Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989, 2a edição, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.

[0055] Com o uso dos métodos acima mencionados, uma ou mais mutações que fazem com que a homosserina succiniltransferase modificada possua uma sequência de aminoácidos que levem à insensibilidade da metionina e da S-adenosilmetionina, podem ser introduzidas na referida região de DNA de qualquer gene MetA. Preferivelmente, um ou mais nucleotídeos na sequência de DNA codificando a homosserina succiniltransferase são mudados de tal forma que a sequência de aminoácidos que é codificada pelo gene apresente pelo menos uma mutação.

[0056] Outro método de produzir alelos de metA resistentes à retroalimentação consiste em combinar diferentes mutações pontuais que levem à resistência à retroalimentação, dessa forma dando origem a mutantes múltiplos que possuam novas propriedades.

[0057] A S-adenosilmetionina sintetase modificada de acordo com a invenção possui atividade reduzida em comparação com a enzima do tipo selvagem, e tem pelo menos uma mutação em sua sequência protéica em comparação com a sequência do tipo selvagem.

[0058] A mutação acha-se preferivelmente em uma das regiões conservadas definidas abaixo.

[0059] Todas as referências às posições de aminoácidos são feitas com base no S-adenosilmetionina sintetase codificada pelo gene metK de E. coli. As posições relativas das regiões conservadas correspondentes em outras S-adenosilmetionina sintetases de diferentes organismos podem ser encontradas por uma pessoa habilitada na técnica mediante simples alinhamento de sequências como representado na Figura 4, com as enzimas listadas abaixo: >gi|39574954|emb|CAE78795.11 metionina adenosiltransferase Bdellovibrio bacteriovorus HD100] >gi|45657232|ref]YP_001318.11 proteína de s-adenosilmetioniπa siπtetase Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130 >gi|28378057|ref|NP_784949.11 metionina adenosiltransferase Lactobacillus plantarum WCFS1 >gi|26453553|dbj| BAC43885.11 S-adenosilmetionina sintetase Mycoplasma penetrans >gi|24212014|sp|Q9K5E4| S-adenosilmetionina sintetase Corynebacterium glutamicum >gi| 18145842|dbj|BAB81883.11 S-adenosilmetionina sintetase Clostridium perfringens str. 13 >gi| 13363290|dbj| BAB37241.11 metionina adenosiltransferase 1 Escherichia coli O157:H7 >gi|45443250|ref|NP_994789.11 S-adenosilmetionina sintetase Yersinia pestis biovar Mediacvails str. 91001 >gi|44888151 |sp|Q7WQX8|METK S-adenosilmetionina sintetase Borrelia burgdorferi >gi|4488814|sp|Q7U4S6| S-adenosilmetionina sintetase Synechococcus sp. WH8102 >gi|44888135|sp|Q7MHK6| S-adenosilmetionina sintetase Vibrio vulnificus YJ016 >gi|23466330|ref|NP_696933.11 S-adenosilmetionina sintetase Bifidobacterium longum NCC2705] >gi|21219978|ref|NP_625757.11 S-adenosilmetionina sintetase Streptomyces coelicolor A3(2)] >gi|39937076|ref|NP_949352.11 metionina S-adenosiltransferase Rhodopseudomonas palustris CGA009 >gi|16766391 |ref|NP_462006.11 metionina adenosiltransferase 1 Salmonella typhimurium LT2 >gi|33594910|ref|NP_882553.11 S-adenosilmetionina sintetase Bordetella parapertussis 12822 >gi|44888148|sp|Q7VRG5| S-adenosilmetionina sintetase Candidatus Blochmannia floridanus >gi|44888147|sp|Q7VNG7|METK_HAEDU S-adenosilmetionina sintetase Haemophilus ducreyi >gi|44888146|sp|Q7VFY5| S-adenosilmetionina sintetase Helicobacter hepaticus >gi|44888145|sp|Q7VDM7| S-adenosilmetionina sintetase Prochlorococcus marinus >gi|44888142|sp|Q7URU7| S-adenosilmetionina sintetase Pirellula spec. >gi|44888138|sp|Q7NHG0| S-adenosilmetionina sintetase Gloeobacter violaceus >gi|44888137|sp|Q7N119| S-adenosilmetionina sintetase Photorhabdus luminescens subsp. laumondii >gi|44888136|sp|Q7MTQ0| S-adenosilmetionina sintetase Porphyromonas gingivalis >gi|39650934|emb|CAE29457.11 metionina S-adenosiltransferase Rhodopseudomonas palustris CGA009 >gi|15792421 |ref|NP_282244.11 S-adenosilmetionina sintetase Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168 >gi|39574954|emb|CAE78795.11 metionina adenosiltransferase Bdellovibrio bacteriovorus HD100 >gi|45657232|ref|YP_001318.11 proteína de s-adenosilmetionina sintetase Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz LI-130 >gi|28378057|ref|NP_784949.11 metionina adenosiltransferase Lactobacillus plantarum WCFS1 >gi|45600470|gb|AAS69955.11 proteína de s-adenosilmetionina sintetase Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130 >gi|26453553|dbj|BAC43885.11 S-adenosilmetionina sintetase Mycoplasma penetrans >gi| 18145842|dbj|BAB81883.11 S-adenosilmetionina sintetase Clostridium perfringens str. 13 >gi| 13363290|dbj|BAB37241.11 metionina adenosiltransferase 1 Escherichia coli O157:H7 >gi|45443250|ref|NP_994789.11 S- adenosilmetionina sintetase Yersinia pestis biovar Mediaevails str. 91001 >gi|44888153|sp|Q8CXS7| S-adenosilmetionina sintetase Leptospira interrogans >gi|44888151 |sp|Q7WQX8| S-adenosilmetionina sintetase Bordetella bronchiseptica >gi|44888150|sp|Q7W200| S-adenosilmetionina sintetase Bordetella parapertussis >gi|44888149|sp|Q7VUL5| S-adenosilmetionins sintetase Bordetella pertussis

[0060] A S-adenosilmetionina sintetase modificada preferivelmente apresenta uma atividade específica que é pelo menos cinco vezes menor do que aquela da enzima do tipo selvagem.

[0061] Preferivelmente, a sequência protéica de uma S-adenosilmetionina sintetase modificada contém a mutação de aminoácido de pelo menos uma das sequências especificadas abaixo.

[0062] Em uma forma de realização da invenção, as mudanças de aminoácidos dizem respeito à cisteína na posição 89 ou à cisteína na posição 239 que reduzem, ambas, a atividade de MetK (Reczkowski e Markham, 1995, JBC 270, 31, 18484- 18490).

[0063] Em uma modalidade, pelo menos uma mutação está presente na região conservada 1, correspondente aos aminoácidos 54 a 59 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 1 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: G-E-XI-X2-X3-X4

[0064] em que

[0065] X1 representa I, V, L, T preferivelmente I

[0066] X2 representa T, K, S, R, preferivelmente T

[0067] X3 representa T, S, G, preferivelmente T

[0068] X4 representa S, N, T, K, E, R, P, N, A preferivelmente S.

[0069] Preferivelmente a região conservada 1 não modificada da S- adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: G-E-l-T-T-S.

[0070] Em outra forma de realização preferida pelo menos uma mutação acha-se presente na região conservada 2, correspondendo aos aminoácidos 98 a 107 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 2 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: Q-S-X1-D-I-X2-X3-G-V-X4

[0071] em que

[0072] X1 representa P, Q, A, S, preferivelmente P

[0073] X2 representa A, N, Q, S, F, preferivelmente N

[0074] X3 representa V, Q, Y, R, M, N, preferivelmente Q

[0075] X4 representa K, D, N, T, S, A, E, preferivelmente D.

[0076] Preferivelmente a região conservada 2 não modificada da S- adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: Q-S-P-D-l-N- Q-G-V-D.

[0077] Em outra forma de realização preferida pelo menos uma mutação se acha presente na região conservada 3, correspondendo aos aminoácidos 114 a 121 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 3 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: X1-G-A-G-D-Q-G-X2

[0078] em que

[0079] X1 representa Q, A, I, V, E, T, preferivelmente Q

[0080] X2 representa L, I, S, V, M, preferivelmente L.

[0081] Preferivelmente a região conservada 3 não modificada da S- adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: Q-G-A-G-D- Q-G-L.

[0082] Em outra forma de realização preferida, pelo menos uma mutação está presente na região conservada 4, correspondendo aos aminoácidos 137 a 144 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 4 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: X1-I-X2-X3-X4-H-X5-X6

[0083] em que

[0084] X1 representa S, P, T, A, preferivelmente P

[0085] X2 representa A, T, W, Y, F, S, N, preferivelmente T

[0086] X3 representa M, Y, L, V, preferivelmente Y

[0087] X4 representa S, A, preferivelmente A.

[0088] X5 representa K, R, E, D, preferivelmente R

[0089] X6 representa L, I, preferivelmente L.

[0090] Preferivelmente, a região conservada 4 não modificada da S- adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: P-l-T-Y-A-H- R-L.

[0091] Em outra forma de realização preferida pelo menos uma mutação está presente na região conservada 5, correspondente aos aminoácidos 159 a 163 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli apresentada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 5 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: X1-L-X2-X3-D

[0092] em que

[0093] X1 representa W, F, Y, V, E, preferivelmente W

[0094] X2 representa R, G, L, K, preferivelmente R

[0095] X3 representa P, L, H, V, preferivelmente P.

[0096] Preferivelmente a região conservada 5 não modificada de S- adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: W-L-R-P-D.

[0097] Preferivelmente pelo menos uma mutação está presente na região conservada 6, correspondente aos aminoácidos 183 a 189 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli apresentada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 6 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: X1-X2-X3-S-X4-Q-H

[0098] em que

[0099] X1 representa V, I, preferivelmente V

[0100] X2 representa V, L, I, preferivelmente V

[0101] X3 representa V, L, I, M, preferivelmente L

[0102] X4 representa T, V, A, S, H, preferivelmente T.

[0103] Em uma forma de realização preferida, a região conservada 6 não modificada da S-adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: V-V-L-S-T-Q-H.

[0104] Preferivelmente as mutações são introduzidas na região conservada 7, correspondentes aos aminoácidos 224 a 230, na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli apresentada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 7 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: X1-N-P-X2-G-X3-F

[0105] em que

[0106] X1 representa I, V, preferivelmente I

[0107] X2 representa T, G, S, preferivelmente T

[0108] X3 representa R, T, Q, K, S, preferivelmente R.

[0109] Em uma forma de realização preferida, a região conservada 7 não modificada da S-adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: l-N-P-T-G-R-F.

[0110] Preferivelmente as mutações são introduzidas na região conservada 8, correspondente aos aminoácidos 231 a 237 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli mostrada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 8 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: X1-X2-G-X3-P-X4-X5

[0111] em que

[0112] X1 representa T, V, I, Y, E, preferivelmente V

[0113] X2 representa V, I, L, N, preferivelmente I

[0114] X3 representa G, S, preferivelmente G

[0115] X4 representa M, I, Q, A, H, D, preferivelmente M.

[0116] X5 representa G, S, A, H, preferivelmente G.

[0117] Em uma forma de realização preferida, a região conservada 8 não modificada de S-adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: V-l-G-G-P-M-G.

[0118] Preferivelmente, as mutações são introduzidas na região conservada 9, correspondente aos aminoácidos 246 a 253 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli apresentada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 9 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: X1-X2-D-T-Y-G-G

[0119] em que

[0120] X1 representa M, I, preferivelmente I

[0121] X2 representa V, I, preferivelmente I.

[0122] Em uma forma de realização preferida, a região conservada 9 não modificada da S-adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: l-V-D-T-Y-G-G.

[0123] Preferivelmente as mutações são introduzidas na região conservada 10, correspondente aos aminoácidos 269 a 275 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli apresentada na SEQ ID NO: 2, a região conservada 10 não mutada compreendendo a sequência de aminoácidos definida abaixo: K-V-D-R-S-X1-X2

[0124] em que

[0125] X1 representa A, G, preferivelmente A

[0126] X2 representa A, S, L, preferivelmente A.

[0127] Em uma forma de realização preferida, a região conservada 10 não modificada de S-adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos: K-V-D-R-S-A-A.

[0128] Em outra aplicação preferida da invenção, pelo menos uma mutação está presente na região conservada 11. A S-adenosilmetionina sintetase não modificada abriga a região conservada em sua parte C-terminal com a seguinte sequência de aminoácidos: X1-X2-Q-X3-X4-Y-A-I-G-X5-X6

[0129] em que

[0130] X1 representa L, E, I, Q, T, preferivelmente E

[0131] X2 representa V, I, L, preferivelmente I

[0132] X3 representa V, L, I, preferivelmente V

[0133] X4 representa A, S, preferivelmente S.

[0134] X5 representa V, I, R, K, A, preferivelmente V

[0135] X6 representa A, V, T, S, preferivelmente A.

[0136] Esta região corresponde aos aminoácidos 295 a 305 na sequência de aminoácidos de MetK de E. coli apresentada na SEQ ID NO: 2.

[0137] Em uma forma de realização preferida da invenção, a região conservada 11 não modificada da S-adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de am inoácidos: E-l-Q-V-S-Y-A-l-G-V-A.

[0138] Em outra aplicação preferida da invenção, as mutações são introduzidas no término N da proteína levando a um deslocamento e a mudanças nos últimos 6 aminoácidos.

[0139] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida, preferivelmente a serina na região conservada 1 é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a serina é substituída por uma asparagina.

[0140] Em uma forma de realização preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 1: G-E-l- T-T-N.

[0141] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida preferivelmente a glicina conservada na região conservada 2 é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a glicina conservada é substituída por uma serina.

[0142] Em uma forma de realização preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 2: Q-S- P-D-l-N-Q-S-V-D.

[0143] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida preferivelmente a glicina conservada na região conservada 3 é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a glicina conservada é substituída por uma serina.

[0144] Em uma forma de realização preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 3: Q-S- A-G-D-Q-G-L.

[0145] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida preferivelmente a histidina conservada e/ou a prolina semiconservada na região conservada 4 é/são substituída(s) por outros aminoácidos. Em uma aplicação preferida da invenção, a histidina conservada é substituída por uma tirosina e/ou a prolina semiconservada é substituída por uma leucina.

[0146] Em uma modalidade preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem uma das seguintes sequências de aminoácidos na região conservada 4: P-l-T-Y-A-Y-R-L, L-l-T-Y-A-H-R-L, L-l-T-Y-A-Y-R-L.

[0147] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida preferivelmente a arginina semiconservada na região conservada 5 é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a arginina é substituída por uma cisteína.

[0148] Em uma forma de realização preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 5: W-L- C-P-D.

[0149] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida preferivelmente a histidina conservada ou a valina semiconservada na região conservada 6 é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a histidina conservada é substituída por uma tirosina e/ou a valina por aspartato.

[0150] Em uma modalidade preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem uma das seguintes sequências de aminoácidos na região conservada 6: V-V-L-S-T-Q-Y V-D-L-S-T-Q-H V-D-L-S-T-Q-Y.

[0151] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida preferivelmente a treonina semiconservada na região 7 cibservada é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a treonina é substituída por uma isoleucina.

[0152] Em uma forma de realização preferida, a S-adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 7: l-N-P-l-G-R-F.

[0153] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida, preferivelmente a prolina conservada na região conservada 8 é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a prolina é substituída por uma serina.

[0154] Em uma forma de realização preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 8: V-l-G- G-S-M-G.

[0155] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida, preferivelmente a segunda glicina conservada na região conservada 9 é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a glicina é substituída por um aspartato.

[0156] Em uma modalidade preferida, a S-adenosilmetionina sintetase tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 9: l-V-D-T-Y-G-D.

[0157] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida, preferivelmente a serina conservada na região conservada 10 é substituída por outro aminoácido. Em uma aplicação preferida da invenção, a serina é substituída por uma fenilalanina.

[0158] Em uma forma de realização preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 10: K-V- D-R-F-A-A.

[0159] Na S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida, preferivelmente a isoleucina conservada na região conservada 11 é substituída por outros aminoácidos. Em uma aplicação preferida da invenção, a isoleucina é substituída pela leucina.

[0160] Em uma forma de realização preferida, a S-adenosilmetionina sintetase modificada tem a seguinte sequência de aminoácidos na região conservada 11: E-l- Q-V-S-Y-A-L-G-V-A.

[0161] A presente invenção, outrossim, diz respeito a sequências de nucleotídeos, sequências de DNA ou de RNA, as quais codificam uma S-adenosilmetionina sintetase transformada de acordo com a invenção, como definido acima. Em uma forma de realização preferida, estas sequências de DNA são caracterizadas pelo fato de que elas compreendem pelo menos uma mutação nas regiões de sequências de DNA codificadoras quanto às regiões conservadas 1 a 11 do gene metK do tipo selvagem, representado como tipo selvagem na SEQ ID NO: 2, a referida mutação não sendo uma mutação silenciosa.

[0162] Em uma aplicação preferida, o gene metK é a S-adenosilmetionina sintetase de K12 de E. coli representada pela SEQ ID NO: 2 e sequências homólogas àquelas sequências que têm atividade da S-adenosilmetionina sintetase e que compartilham pelo menos 80% de homologia, preferivelmente 90% de homologia, com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[0163] Os genes da S-adenosilmetionina sintetase transformada descritos acima podem ser obtidos por técnicas convencionais conhecidas da pessoa habilitada na técnica apresentada acima e abaixo, incluindo a mutagênese aleatória ou dirigida ou a construção de DNA sintético.

[0164] O gene metA que codifica a homosserina succiniltransferase modificada e/ou o gene metK que codifica a S-adenosilmetionina sintetase modificada podem ser codificado de forma cromossômica ou extracromossômica. Cromossomicamente pode haver uma ou várias cópias no genoma que possam ser introduzidas por métodos de recombinação conhecidas das pessoas experientes na área. Extracromossomicamente, ambos os genes podem ser carregados por diferentes tipos de plasmídeos que difiram em relação à sua origem de replicação e, assim, ao seu número de cópias na célula. Eles podem estar presentes como 1 a 5 cópias, cerca de 20 ou até 500 cópias correspondentes aos plasmídeos de baixo número de cópias com replicação firme (pSC101, RK2), plasmídeos de baixo número de cópias (pACYC, pRSF1010) ou plasmídeos com elevado número de cópias (pSK bluescript II).

[0165] O gene metA e/ou metK pode ser expresso com o uso de promotores com diferentes intensidades que necessitam ou não ser induzidos pelas moléculas indutoras. Exemplos são os promotores Ptrc, Ptac, Plac, o promotor lambda cl ou outros promotores conhecidos das pessoas habilitadas na área.

[0166] A expressão de MetA e/ou MetK pode ser reforçada ou reduzida por elementos estabilizantes ou desestabilizantes do RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog.15, 58-64) ou a proteína (por exemplo, rótulos de GST, Amersham Biosciences).

[0167] A presente invenção também diz respeito a microorganismos que contêm um alelo de metA resistente à retroalimentação de acordo com a invenção e, eventualmente, um alelo de metK com atividade reduzida de acordo com a invenção.

[0168] Tais cepas são caracterizadas pelo fato de que elas possuem um metabolismo de metionina que é desregulado por pelo menos um alelo de metA resistente à retroalimentação e/ou por uma produção reduzida de SAM causada por uma enzima MetK com atividade reduzida.

[0169] As novas cepas podem ser preparadas de qualquer microorganismo em que o metabolismo da metionina prossegue pela mesma via metabólica.

[0170] As bactérias Gram-negativas, em particular E. coli, são especialmente adequadas.

[0171] Com a finalidade de expressar a enzima homosserina succiniltransferase e S-adenosilmetionina sintetase, os alelos de metA resistentes à retroalimentação e os alelos de metK com atividade reduzida, são transformados em uma cepa hospedeira com o uso de métodos costumeiros. A triagem quanto às cepas que possuem propriedades modificadas da homosserina succiniltransferase e S-adenosilmetionina sintetase é, por exemplo, realizada com o uso de testes enzimáticos.

[0172] Por exemplo, a atividade da homosserina succiniltransferase pode ser determinada em um teste enzimático com homosserina e succinil-CoA como substratos. A reação é iniciada pela adição do extrato protéico contendo a enzima homosserina succiniltransferase, e a formação da O-succinil-homosserina é monitorada por GC-MS após a precipitação protéica e derivação com um reagente sililante. A inibição da retroalimentação é testada na presença de metionina e S- adenosilmetionina na mistura de reação.

[0173] A atividade da S-adenosilmetionina sintetase pode ser determinada em um teste enzimático com metionina e ATP como substratos. A reação é iniciada pela adição do extrato protéico contendo a enzima S-adenosilmetionina sintetase, e a formação da S-adenosilmetionina é monitorada por FIA-MS/MS.

[0174] Preferivelmente, faz-se uso das cepas de E. coli em que os genes endógenos metA e metK são inativados e complementados por novos genes recombinantes.

[0175] Os alelos de metA e de metK resistentes à retroalimentação com atividade reduzida tomam possível abolir o controle em pontos de controle biossintéticos importantes, dessa forma ampliando a produção de um grande número de compostos que são situados a jusante do aspartato. Estes incluem, em particular, a homosserina, a O-succinil-homosserina, a cistationina, a homocisteína, a metionina e a S- adenosilmetionina.

[0176] Em particular, a invenção diz respeito à preparação de L-metionina, seus precursores ou compostos deles derivados, por meio da cultura de novos microorganismos. Os produtos acima descritos são classificados abaixo como composto (I).

[0177] Um aumento na produção do composto (I) pode ser obtido pela mudança nos níveis de expressão ou supressão dos seguintes genes implicados na produção do aspartato, um precursor do composto (I) Gene entrada no genbank nome ackA g1788633 acetato cinase pta g1788635 fosfotransacetilase acs g1790505 acetato sintase aceA g1790445 isocitrato liase aceB g1790444 malato sintase aceE g1786304 piruvato desidrogenase E1 aceF g1786305 piruvato desidrogenase E2 Ipd g1786307 piruvato desidrogenase E3 aceK g1790446 isocitrato desidrogenase cinase/fosfatase sucC g1786948 succinil-CoA sintetase, subunidade beta sucD g1786949 succinil-CoA sintetase, subunidade alfa ppc g1790393 fosfoenolpiruvato carboxilase pck g1789807 fosfoenolpiruvato carboxicinase pykA g1788160 piruvato cinase II pykF g1787965 piruvato cinase I poxB g1787096 piruvato oxidase PPS g1787994 fosfoenolpiruvato sintase ilvB g1790104 ácido acetoidróxi sintase I, subunidade grande ilvN g1790103 ácido acetoidróxi sintase I, subun. pequena ilvG g1790202 ácido acetoidróxi sintase II, subun. Grande g1790203 ilvM g1790204 ácido acetoidróxi sintase II, subun. pequena ilvl g1786265 ácido acetoidróxi sintase III, subun. grande ilvH g1786266 ácido acetoidróxi sintase III, subun. pequena aroF g1788953 DAHP sintetase aroG g1786969 DAHP sintetase aroH g1787996 DAHP sintetase aspC g1787159 aspartato aminotransferase

[0178] Além disso, a piruvato carboxilase de Rhizobium etli (número de acesso U51439) pode ser introduzida por engenharia genética em E. coli e superexpresso.

[0179] Um aumento adicional na produção do composto (I) pode ser obtido pela superexpressão de genes da via de lisina/metionina, tal como a homosserina sintetizando enzimas codificadas pelos genes thrA (homosserina desidrogenase/aspartocinase, g1786183) ou metL (homosserina desidrogeπase/aspartocinase, g1790376) ou lysC (aspartocinase, g1790455) ou asd (aspartato semialdeido desidrogenase, g1789841), ou uma combinação destes.

[0180] Um outro aumento na produção de (I) é possível pela superexpressão de genes envolvidos na assimilação de sulfato e na produção de cisteína. Isto pode ser alcançado pela superexpressão dos seguintes genes (ver abaixo) ou pela desregulação da via através da introdução de um alelo de cysB constitutivo como descrito por Colyer e Kredich (1994 Mol Microbiol 13 797-805) e pela introdução de um alelo de cysE codificando uma serina acetil transferase com sensibilidade reduzida quanto a seu inibidor L-cisteína (pedido de patente U.S. 6.218.168, Denk & Bock 1987 J Gen Microbiol 133 515-525). Os seguintes genes necessitam ser superexpressos. CysA g1788761 sulfato permease CysU g1788764 sistema de transporte da cisteína CysW g1788762 sistema de transporte de sulfato ligado às membranas CysZ g1788753 ORF a montante de cysK CysN g1789108 ATP sulfurilase CysD g1789109 sulfato adenililtransferase CysC g1789107 adenililsulfato cinase CysH g1789121 adenililsulfato redutase Cysl g1789122 sulfito redutase, subunidade alfa CysJ g1789123 sulfito redutase, subunidade beta cysE g1790035 serina acetiltransferase cysK g1788754 cisteína sintase cysM g2367138 O-acetil-sulfidrolase

[0181] Além disso, os genes envolvidos na produção dos grupos C1 (metila) podem ser intensificados por superexpressão dos seguintes genes. serA g1789279 fosfoglicerato desidrogenase serB g1790849 fosfosserina fosfatase serC g1787136 fosfosserina aminotransferase glyA g1788902 serina hidroximetiltransferase metF g1790377 5,10-metilenotetraidrofolato redutase

[0182] Além disso, os genes diretamente envolvidos na produção da metionina podem ser superexpressos: metB g1790375 cistationina gama-sintase metC g1789383 cistationina beta-liase metH g1790450 homocisteína-N5-metiltetraidrofolato trans-metilase dependente de B12 metE g2367304 tetraidropteroiltriglutamato metiltransferase metF g1790377 5,10-metilenotetraidrofolato redutase metR g1790262 gene regulador positivo para metE e metH e regulação autógena

[0183] Além do mais, a expressão de genes nas vias de degradação da metionina ou desvio da via de produção de metionina, pode ser reduzida ou os genes podem ser suprimidos. speD g1786311 S-adenosilmetionina descarboxilase speC g1789337 Ornitina descarboxilase thrB g1786184 Homosserina cinase astA g1788043 Arginina succiniltransferase dapA g1788823 Diidrodipicolinato sintase

[0184] Um outro aumento na produção de (I) é possível por meio da supressão do gene para a proteína repressora MetJ, responsável pela infra-regulação do regulon da metionina como foi sugerido na JP 2000157267-A/3 (ver também GenBank g1790373).

[0185] A produção de (I) pode ser ainda aumentada mediante o uso de um alelo de metB alterado que use preferível ou exclusivamente H2S e, assim, produza homocisteína a partir da O-succinil-homosserina como foi descrito no pedido de patente PCT n° PCT/FR04/00354, cujo conteúdo fica aqui incorporado como referência.

[0186] Em outra forma de realização preferida, 0 gene codificando aspartocinase/homosserina desidrogenase é superexpresso e/ou o gene codificando o repressor metJ da metionina é suprimido no microorganismo da presente invenção e no microorganismo usado no método de acordo com a invenção.

[0187] Preferivelmente, a aspartocinase/homosserina desidrogenase é codificada por um alelo de ThrA desregulado da retroalimentação. Tal desregulação da retroalimentação pode ser obtida pela introdução da mutação Phe318Ser na enzima de ThrA. A posição da enzima é dada aqui por referência à sequência de ThrA apresentada no genbank, número de acesso V00361.1 (g1786183).

[0188] Os alelos de metA e metB descritos acima podem ser usados em eucariotas e procariotas. Preferivelmente, o organismo usado é um procariota. Em uma aplicação preferida, o organismo é ou E. coli ou C. glutamicum.

[0189] A invenção também diz respeito a processo para a produção do composto (I). O composto (I) é usualmente preparado pela fermentação da cepa bacteriana designada.

[0190] De acordo com a invenção, os termos ‘cultura’ e ‘fermentação’ são usados indiferentemente para denotar o crescimento de um microorganismo ou um meio de cultura apropriado contendo uma fonte simples de carbono.

[0191] Em conformidade com a invenção, uma fonte simples de carbono é uma fonte de carbono que pode ser usada por aqueles habilitados na técnica para obterem o crescimento normal de um microorganismo, em particular de uma bactéria. Em particular, pode ser um açúcar assimilável tal como a glicose, a galactose, a sacarose, a lactose ou melaço, ou os subprodutos destes açúcares. Uma fonte de carbono simples especialmente preferida é a glicose. Outra fonte simples de carbono preferida é a sacarose.

[0192] Aqueles habilitados na técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microorganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias são fermentadas em uma temperatura entre 20°C e 55°C, preferivelmente entre 25°C e 40°C, e mais especificamente de cerca de 30°C quanto ao C. glutamicum e de cerca de 37°C quanto ao E. coli.

[0193] A fermentação é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura inorgânico de composição definida conhecida adaptada às bactérias usadas, contendo pelo menos uma fonte simples de carbono e, se necessário, um co-substrato necessário para a produção do metabólito.

[0194] Em particular, o meio de cultura inorgânico para E. coli pode ser de composição idêntica ou semelhante a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32: 120-128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou urn meio tal como o definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).

[0195] Analogamente, o meio de cultura inorgânico para C. glutamicum pode ser de composição idêntica ou semelhante ao meio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) ou a um meio tal como aquele descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583). O meio pode ser suplementado para compensar quanto às auxotrofias introduzidas pelas mutações.

[0196] Após a fermentação, o composto (I) é recuperado e purificado, se necessário. Os métodos para a recuperação e a purificação do composto (I), tal como a metionina no meio de cultura, são bem conhecidos daqueles habilitados na técnica. - Figura 1A/B: Metabolismo da metionina em Escherichia coli. - Figura 2: Alinhamento dos genes metA do tipo selvagem e recombinantes, obtidos após a seleção em oc-metil-metionila. Os resíduos conservados são representados por caixas cinza claro e os resíduos transformados são indicados por caixas brancas. - Figura 3: Alinhamento das sequências de MetA de diferentes microorganismos. - Figura 4: Alinhamento das sequências de MetK de diferentes microorganismos. - Figura 5: Substituições de aminoácidos na proteína MetK de E.coli. Os aminoácidos acima das linhas coerentes indicam a posição e o aminoácido de substituição.

EXEMPLOS Exemplo 1

[0197] Isolamento dos mutantes de E. coli contendo enzimas homosserina trans- succinilase as quais apresentam sensibilidade de retroalimentação reduzida com respeito à metionina e à S-adenosilmetionina.

[0198] Isolamento das cepas de E. coli crescendo em oc-metilmetionina

[0199] A oc-metilmetionina é um análogo de metionina inibidor do crescimento, produzindo um efeito imediato sobre a taxa de crescimento de E. coli em concentrações muito baixas (concentração inibidora mínima de 1 pg/ml e concentração mínima para uma inibição máxima de 5 pig/ml, Rowbury et al., 1968). Os análogos podem imitar a metionina na inibição da retroalimentação da homosserina trans-succinilase e interfere com a síntese protéica sem que tenha sido metabolizada. Apenas as cepas mutantes são capazes de crescer em um meio contendo o análogo.

[0200] O E. coli era rotineiramente cultivado aerobicamente a 37°C em LB suplementado, quando necessário, com o antibiótico apropriado. O meio usado para o análogo de oc-metil-metionina resistente foi um meio mínimo contendo (por litro): 8 g de K2HPO4, 2 g de Na2HPO4, 0,75 g de (NH^SCU, 8 g de (NH^HPCU, 0,13 g de NH4CI, 6,55 g de ácido cítrico, 2,05 g de MgSCh, 40 mg de CaCl2, 40 mg de FeSCM, 20 mg de MnSCU, 8 mg de C0CI2, 4 mg de ZnSCh, 2,8 mg de (NH4)2Mθ2θ?, 2 mg de CuCI2, 1 mg de H3BO3. O pH foi ajustado em 6,7 e o meio foi esterilizado. Antes do uso, 10 g/litro de glicose e 10 mg/litro de tiamina foram adicionados.

[0201] O pó de oc-metilmetionina comercializado pela Sigma contém traços de metionina. Uma cultura líquida noturna de uma cepa de E. coli (MG1655 ΔmetE) incapaz de crescer sem a adição de metionina, foi realizada para eliminar a metionina (proveniente da oc-metilmetionina) do meio mínimo. A cultura foi centrifugada por 10 minutos a 7000 rpm e o sobrenadante foi filtrado (Sartorius 0,2 pm). 15 g/litro de agar foram adicionados a este meio mínimo.

[0202] 1*108 células/ml de uma cultura noturna em meio mínimo da cepa do tipo selvagem (MG1655) foram dispersos sobre placas com meio mínimo e oc- metilmetionina após 4 etapas de lavagem em água estéril. As placas foram incubadas a 37°C até que as colônias aparecessem.

[0203] Evidência das mutações na sequência codificadora do gene metA codificando para a enzima homosserina trans-sucinilase

[0204] O DNA genômico foi preparado de 4 clones que haviam crescido em oc- metilmetionina a 4 mg/ml após cultivo em meio LB. A pelota celular foi lavada uma vez com água estéril e recolocada em suspensão em 30 pl de água estéril. As células foram rompidas por aquecimento por 5 minutos a 95°C e os detritos foram pelotizados. O gene metA foi amplificado por PCR com o uso da Taq polimerase e dos seguintes iniciadores: MetAF (SEQ ID NO: 3): tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc (4211759- 4211788) MetAR (SEQ ID NO: 4): ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt (4212857- 4212828).

[0205] Em três clones, mutações pontuais foram detectadas, as quais levaram às substituições de aminoácidos. No clone metA11, CAG foi trocado por um GAC levando à substituição de Q por E. No metA*13, TTG foi trocado por um TTT, levando à substituição de L por F. No metA*14, GCG foi trocado por GTG levando à substituição de A por V (ver a figura 2).

[0206] Como pode ser observado do alinhamento mostrado na Figura 3, todos os três aminoácidos que são substituídos são altamente conservados nas proteínas MetA das várias espécies.

[0207] As enzimas homosserina trans-succinilase mutadas apresentam sensibilidade de retroalimentação reduzida com respeito à metionina e à S- adenosilmetionina.

[0208] A atividade da homosserina trans-succinilase foi determinada in vitro. As cepas de E. coli carregando ou as enzimas do tipo selvagem ou mutantes foram cultivadas em meio rico com 2,5 g/litro de glicose e colhidas em fase log tardia. As células foram recolocadas em suspensão em tampão de fosfato de potássio frio e sonicadas sobre gelo (sonificador Branson, 70 W). Após a centrifugação, as proteínas contidas nos sobrenadantes foram quantificadas (Bradford, 1976).

[0209] Dez pl dos extratos foram incubados por 30 minutos a 25°C com homosserina 30 mM e succinil-CoA 4 mM. A metionina e/ou a S-adenosilmetionina foram adicionadas como indicado. A succinil-homosserina produzida pelas enzimas homosserina trans-succinilases foi quantificada por GC-MS após derivação com terc- butiIdimetilsiliItrifluoroacetamida (TBDMSTFA). A L-serina[1 -13C] foi incluída como um padrão interno.

[0210] Os resultados das atividades da homosserina trans-succinilase são relatados na Tabela 1 abaixo: Tabela 1. Atividades específicas das enzimas homosserina trans-succinilase do tipo selvagem e mutantes após a adição dos inibidores L-metionina e S-adenosil- metionina.

[0211] As enzimas homosserina trans-succinilase mutadas assim apresentam sensibilidade à retroalimentação reduzida em relação à metionina e à S- adenosilmetionina.

Exemplo 2

[0212] Isolamento dos mutantes de E. coli contendo enzimas S-adenosilmetionina sintetase com atividade reduzida

[0213] Isolamento das cepas de E. coli que crescem sobre a norleucina

[0214] A norleucina é um análogo da metionina inibidor do crescimento. Nas concentrações mais elevadas (50 mg/litro) apenas as cepas mutantes são capazes de crescer em um meio contendo o análogo. A maioria destas mutações evidenciam os locais de metK e metJ.

[0215] E. coli foi rotineiramente cultivado aerobicamente a 37°C em LB suplementado, quando necessário, com o antibiótico apropriado. O meio usado para o análogo da norleucina resistente foi um meio mínimo contendo (por litro): 8 g de K2HPO4, 2 g de Na2HPO4, 0,75 g de (NH4)2SO4, 8 g de (NH4)2HPO4, 0,13 g de NH4CI, 6,55 g de ácido cítrico, 2,05 g de MgSCh, 40 mg de CaCI2, 40 mg de FeSCU, 20 mg de MnSO4, 8 mg de CoCI2, 4 mg de ZnSCh, 2,8 mg de (NH4)2Mo2O?, 2 mg de CuCI2, 1 mg de H3BO3. O pH foi ajustado em 6,7 e o meio foi esterilizado. Antes do uso, 10 g/litro de glicose e 10 mg/litro de tiamina foram adicionados.

[0216] 1*108 células/ml de uma cultura noturna em meio mínimo da cepa do tipo selvagem (MG1655) foram dispersos sobre placas com meio mínimo e norleucina (50 a 200 g/litro) após 4 etapas de lavagem em água estéril. As placas foram incubadas a 37°C até que as colônias aparecessem.

[0217] Evidência das mutações na sequência codificadora do gene metK codificando para a enzima S-adenosilmetionine sintetase

[0218] O DNA genômico foi preparado de culturas cultivadas em meio líquido LB. A pelota celular foi lavada uma vez com água estéril e recolocada em suspensão em 30 |il de água estéril. As células foram rompidas por aquecimento por 5 minutos a 95°C e os detritos foram extraídos. O DNA foi amplificado por PCR com o uso da Taq polimerase e com o uso dos seguintes iniciadores:

[0219] MetKpF: cccggctggaagtggcaacacg (3084372-3084393) (SEQ ID NO: 5)

[0220] MetKR: gccggatgcggcgtgaacgcctatcc (3085956-3085931) (SEQ ID NO: 6).

[0221] O gene metK foi sequenciado. Em 10 clones, mutações pontuais foram detectadas, as quais levaram às substituições de aminoácidos. No clone metK*59/105, AGC foi trocado por AAC, levando à substituição de S por N (posição 59) e GGC foi trocado por AGC levando à substituição de G por S (posição 105). No clone metK*105, GGC foi trocado por AGC, levando à substituição de G por S. Em metK*115, GGC foi trocado por AGC levando à substituição de G por S. Em metK*137, CCT foi substituído por CTT levando à substituição de P por L. Em metK*142, CAC foi substituído por TAC levando à substituição de H por Y. Em metK*161/235, CGC foi substituído por TGC levando à substituição de R por C, e CCA foi substituído por TCA levando à substituição de P por S. Em metK*189, CAC foi substituído por TAC levando à substituição de H por Y. Em metK*227, ACC foi substituído por ATC levando à substituição de T por I. Em metK*253, GGC foi substituído por GAC levando à substituição de G por D. Em metK*273, TCC foi substituído por TTC levando à substituição de S por F (ver a figura 5).

[0222] Como pode ser observado do alinhamento mostrado na Figura 4, todos os aminoácidos que são substituídos são conservados nas proteínas MetK das várias espécies.

[0223] Enzimas S-adenosilmetionina sintetase recombinantes com atividade reduzida

[0224] A atividade da S-adenosilmetionina sintetase foi determinada in vitro. Cepas de E. coli carregando enzimas ou do tipo selvagem ou mutantes foram cultivadas em meio mínimo com 5 g/litro de glicose e colhidas em fase log tardia. As células foram recolocadas em suspensão em tampão de fosfato de potássio frio e sonicadas sobre gelo (sonificador Branson, 70 W). Após a centrifugação, as proteínas contidas nos sobrenadantes foram quantificadas (Bradford, 1976).

[0225] Cem jnJ dos extratos foram incubados por 30 minutos a 37°C com metionina 10 mM e ATP 10 mM. Cloreto de potássio foi incluído para ativar as enzimas. A adenosilmetionina produzida pelas enzimas metionina adenosiltransferase foi quantificada por FIA-MS/MS.

[0226] Os resultados das atividades da S-adenosilmetionina sintase são relatados na Tabela 2 abaixo: Tabela 2: Atividades da S-Adenosilmetionina Sintetase (Mat) de Mutantes do Tipo Selvagem e Metk*

Exemplo 3

[0227] Construção das cepas de E. Coli para a produção de O-succinil- homosserina ou metionina mediante super-expressão da homosserina trans- succinilase alterada e outras enzimas da via da biossíntese da metionina

[0228] Para a construção das cepas de E. coli que possibilitam a produção da O- succinil-homosserina, um plasm ideo superexpressando o gene metL, codificando para a homosserina desidrogenase e aspartocinase, foi introduzido nas cepas abrigando diferentes alelos de metA. O plasm ideo superexpressando metL foi construído como segue:

[0229] Os seguintes dois oligonucleotídeos foram usados: MetLF com 32 bases (SEQ ID NO: 7): TATTCatgagtgtgattgcgcaggcaggggcg com - uma região (caixa baixa) homóloga à sequência (4127415 a 4127441) do gene metL (sequências 4127415 a 4129847, sequência de referência no site da Web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/). - uma região (caixa alta) que, junto com a sequência pertencente a metL forma um sítio de restrição para a enzima BspHI (sublinhada). - MetBLAR com 38 bases (SEQ ID NO 8) TATAAGCTTccataaacccgaaaacatgagtaccgggc

[0230] com - uma região (caixa baixa) homóloga à sequência (4129894 a 4129866) do gene metL - uma região (caixa alta) que abriga o sítio de restrição Hindlll.

[0231] O gene metL foi amplificado por PCR com o uso dos oligonucleotídeos MetLF e MetBLAR, e os sítios de restrição BspHI e Hindlll foram introduzidos nos términos N e C do gene MetL, respectivamente. O fragmento de PCR resultante ficou restrito por BspHI e Hindlll e clonado no vetor pTRC99A (Stratagene) previamente cortado por Ncol e Hindlll.

[0232] As preparações de plasmídeos foram examinadas quanto à presença de insertos do tamanho correto. A sequência de DNA de metL foi verificada e o plasm ideo pTRCmetL resultante foi transformado nas cepas abrigando os alelos metA*11 e metA*13.

[0233] A atividade da Homosserina desidrogenase II (HDH) foi determinada in vitro. As cepas de E. coli foram cultivadas em meio mínimo com 10 g.l'1 de glicose e colhidas na fase log tardia. As células foram recolocadas em suspensão em tampão de fosfato de potássio frio e sonicadas sobre gelo (sonificador Branson, 70 W). Após a centrifugação, as proteínas contidas nos sobrenadantes foram quantificadas (Bradford, 1976).

[0234] Trinta pl dos extratos foram incubados a 30°C em um espectrofotômetro, com homosserina 25 mM e NADP+ 1 mM. Cloreto de potássio foi incluído para ativar a enzima. Tendo em vista que E. coli abriga um segundo gene codificando uma atividade da homosserina desidrogenase (thrA), a treonina foi adicionada, a qual inibe esta atividade. A aparência de NADPH foi monitorada por 30 minutos a 340 nm.

[0235] A expressão de metL do promotor Ptrc aumenta drasticamente a atividade da HDH em comparação com uma cepa semelhante com o plasmídeo. Tabela 3: Atividades da proteína MetL da homosserina desidrogenase na cepa de E. coli abrigando a mutação metA*11 com ou sem superexpressão de metL do promotor Ptrc

[0236] Em outra aplicação, o gene metJ regulador da metionina foi suprimido nas cepas que abrigavam os alelos metA*11, metA*13 e metA*14. Para inativar o gene metJ, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko e Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol, ao mesmo tempo em que suprime a maioria dos genes envolvidos. Para este fim, 2 oligonucleotídeos foram usados:

[0237] DmetJF com 100 bases (SEQ ID NO 9):

[0238] Caggcaccagagtaaacattgtgttaatggacgtcaatacatctggacatctaaacttctttgcgtatag attgagcaaaC AT AT G AAT ATC CTC CTT AG

[0239] com - uma região (caixa baixa) homóloga às sequências (4126216 a 4126137) do gene metJ (sequências 4125658 a 4125975, sequência de referência no site da Web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - uma região (caixa alta) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K. A. e Wanner, B. L, 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - DmetJR com 100 bases (SEQ ID NO 10):

[0240] tgacgtaggcctgataagcgtagcgcatcaggcgattccactccgcgccgctcttttttgctttagtattcc cacgtctcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

[0241] com - uma região (caixa baixa) homóloga à sequência (4125596 a 4125675) do gene metJ - uma região (caixa alta) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol.

[0242] Os oligonucleotídeos DmetJR e DmetJF foram usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol do plasm ideo pKD3. O produto da PCR obtido foi então introduzido por eletroporaçâo na cepa MG1655 (pKD46), em que a enzima recombinase Red expressa permitiu a recombinação homóloga. Os transform antes resistentes ao cloranfenicol foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os ooligonucleotídeos MetJR e MetJF definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 (ΔmetJ::Cm) metA*

[0243] MetJR (SEQ ID NO 11): ggtacagaaaccagcaggctgaggatcagc (homólogo à sequência de 4125431 a 4125460).

[0244] MetBR (SEQ ID NO 12): ttcgtcgtcatttaacccgctacgcactgc (homólogo à sequência de 4126305 a 4126276).

[0245] O cassete de resistência ao cloranfenicol foi então eliminado. O plasm ideo pCP20 carregando FLP recombinante nos sítios FRT do cassete de resistência ao cloranfenicol foi introduzido nas cepas recombinantes por eletroporaçâo. Após uma série de culturas a 42°C, a perda do cassete de resistência ao cloranfenicol foi verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos como aqueles usados anteriormente. As cepas retidas foram designadas MG1655 (ΔmetJ) metA*.

[0246] Subsequentemente o plasm ideo pTRCmetL abrigando o gene metL foi introduzido nestas cepas, dando origem a ΔmetJ metA*11 pTRCmetL, ΔmetJ metA*13 pTRCmetL e ΔmetJ metA*14 pTRCmetL.

Exemplo 4

[0247] Construção de alelos de homosserina succiniltrans-ferase expressando enzimas com sensibilidade de retroalimentação ainda reduzida

[0248] Para ainda reduzir a sensibilidade da homosserina trans-sucinilase a seus inibidores metionina e SAM, outros mutantes metAforam construídos pormutagênese dirigida ao sítio.

[0249] Inicialmente os alelos metA e metA*11 foram clonados no vetor pTRC99A (Stratagene). Os seguintes dois oligonucleotídeos foram usados: - MetA-Ncol com 49 bases (SEQ ID NO: 13):

[0250] TATTAAATTACCatggcaccgattcgtgtgccggacgagctacccgccg

[0251] com - uma região (caixa baixa) homóloga à sequência (4211862 a 4211892) do gene metA (sequência 4211859 a 4212788, sequência de referência no site da Web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - uma região (caixa alta) que, junto com a sequência pertencente a metA forma um sítio de restrição para a enzima Ncol (sublinhada), - MetA-EcoRI com 47 bases (SEQ ID NO 14):

[0252] TATTAAATTAGaattccgactatcacagaagattaatccagcgttgg

[0253] com - uma região (caixa baixa) homóloga à sequência (4212804 a 42127774) do gene metA - uma região (caixa alta) que abriga o sítio de restrição EcoRI.

[0254] Os alelos metA e metA*11 foram amplificados por PCR com o uso dos oligonucleotídeos MetAF e MetAR, e os sítios de restrição Ncol e EcoRI foram introduzidos nos términos N e C do gene metA, respectivamente. Os fragmentos de PCR resultantes foram restringidos por Ncol e EcoRI e clonados no vetor pTRC99A (Stratagene) previamente cortado por Ncol e EcoRI.

[0255] As preparações de plasmídeos foram examinadas quanto à presença de insertos do tamanho correto e as sequências de DNA de metA e metA*11 foram verificadas por sequenciação.

[0256] A análise enzimática dos clones expressando metA e metA*11 deu atividade de MetA muito baixa. Nós presumimos que a introdução de uma alanina entre os aminoácidos 1M e 2P, que foi necessária para clonagem do metA no vetor pTRC99A, causou esta perda de atividade. Portanto, usando-se a mutagênese dirigida ao sítio (Stratagene), a alanina foi eliminada com o uso dos oligonucleotídeos:

[0257] metA-alaF (Afllll) (SEQ ID NO 15): cacacaggaaacagaccatgccgatacgtgtgccggacgagctaccc

[0258] metA-alaR (Afllll) (SEQ ID NO 16): gggtagctcgtccggcacacgtatcggcatggtctgtttcctgtgtg

[0259] Subsequentemente os mutantes metA*15 (A27V + Q64E), metA*16 (Q64D) e metA*17 (A27V + Q64D) foram construídos por mutagênese dirigida ao sítio (Stratagene) com o uso da sequência metA correta como matriz. Para a construção de pTRCmetA*15 (A27V + Q64E), os seguintes oligonucleotídeos foram usados:

[0260] MetAA28VF (Xbal) (SEQ ID NO 17): Gtgatgacaacttctagagtgtctggtcaggaaattcgtcc

[0261] MetAA28VR(Xbal) (SEQ ID NO 18): Ggacgaatttcctgaccagacactctagaagttgtcatcac

[0262] e pTRCmetA*11 como matriz.

[0263] Para a construção de pTRCmetA*16 (Q64D) os seguintes oligonucleotídeos foram usados:

[0264] MetAQ64DF (EcoRV) (SEQ ID NO 19): Gctttcaaactcacctttggatgtcgatatccagctgttgc

[0265] MetAQ64DR (EcoRV) (SEQ ID NO 20) gcaacagctggatatcgacatccaaaggtgagtttgaaagc

[0266] e pTRCmetA como matriz.

[0267] Para a construção de pTRCmetA*17 (A27V + Q64D) os seguintes oligonucleotídeos foram usados: MetAA28VF (Xbal) (SEQ ID NO 17) e MetAA28VR (Xbal) (SEQ ID NO 18); e pTRCmetA*16 como matriz.

[0268] Os plasm ídeos foram verificados por sequenciação.

[0269] Para transferir os alelos metA*15, metA*16 e metA*17 para o local de metA sobre o cromossoma, uma supressão de metA foi construída na retroalimentação de ΔmetJ aplicando-se a mesma estratégia usada para a supressão de metJ. Os seguintes oligonucleotídeos foram usados para suprimir metA:

[0270] DmetAF (4211866-4211945) (SEQ ID NO 21)

[0271] ttcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaamcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatgacaacttct cgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

[0272] DmetAR (4212785-4212706) (SEQ ID NO 22)

[0273] Atccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagacgtaatagttgagccagttg gtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAG A região indicada em caixa baixa corresponde à sequência entre metA e yjaB. A região em caixa alta é usada para amplificar o cassete de resistência à canamicina (Datsenko e Wanner, 2000). (Os números em parênteses correspondem à sequência de referência no site da Web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/).

[0274] A supressão resultante foi verificada com o uso dos seguintes oligonucleotídeos (Os números em parênteses correspondem à sequência de referência no site da Web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/).

[0275] MetAF (SEQ ID NO 3) e MetAR (SEQ ID NO 4).

[0276] DmetJ DmetA da cepa resultante foi usado para introduzir os alelos metA*15, metA*16 e metA*17 no cromossoma. Para este fim, o plasm ideo pKD46 foi introduzido na cepa DmetJ DmetA (Datsenko e Wanner, 2000). Os alelos foram amplificados a partir dos vetores pTRCmetA*15, pTRCmetA*16 e pTRCmetA*17 com o uso dos seguintes oligonucleotídeos:

[0277] MetArcF (4211786-4211884) (SEQ ID NO 23)

[0278] Ggcaaattttctggttatcttcagctatctggatgtctaaacgtataagcgtatgtagtgaggtaatcaggtt atgccgattcgtgtgccggacgagc

[0279] MetArcR (4212862-4212764) (SEQ ID NO 24)

[0280] Cggaaataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggtaaggtgctgaatcgcttaacgatcgactatc acagaagattaatccagcgttggattcatgtgc

[0281] A sequência em negrito é homóloga à sequência do gene metA; o restante da sequência é adjacente a metA.

[0282] Para verificação por PCR, foram usados os seguintes oligonucleotídeos: MetAF (SEQ ID NO 3) e MetAR (SEQ ID NO 4).

[0283] Como descrito acima, as cepas resultantes foram cultivadas em meio mínimo, os extratos brutos foram preparados, e a atividade de MetA foi determinada. Como pode ser observado da Tabela 4, os alelos recém-construídos são menos sensíveis à inibição pela metionina e SAM do que os alelos descritos acima. Especialmente interessante é o alelo metA*15 com alta atividade intrínseca que não pode ser inibida pelo SAM nem pela metionina. Tabela 4: Atividades da homosserinatrans-succinilase dos mutantes MetA na ausência e na presença de metionina 100 mm e SAM 1 mM. Os valores percentuais entre parênteses indicam a quantidade de atividade remanescente após a inibição.

Exemplo 5

[0284] Construção de cepas de E. coli para a produção de O-succinil homosserina ou metionina pela combinação dos alelos de meta resistentes à retroalimentação com os alelos metk com atividade reduzida

[0285] De modo a transferir os alelos de metK recombinantes para as cepas que abrigam os alelos metA resistentes à retroalimentação, um cassete de resistência à canamicina foi introduzido entre o gene metK e o galP.

[0286] Para introduzir o cassete, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko e Wanner (2000) é usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência à canamicina, enquanto suprime a maior parte dos genes em questão. Com esta finalidade, 2 oligonucleotídeos são usados: - DMetKFscr com 100 bases (SEQ ID NO 25):

[0287] ccgcccgcacaataacatcattcttcctgatcacgtttcaccgcagattatcatcacaactgaaaccgat tacaccaaccTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

[0288] com - uma região (caixa baixa) homóloga à sequência da região entre metK e galP (sequência 3085964 a 3086043, sequência de referência no site da Web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/). - uma região (caixa alta) para a amplificação do cassete de resistência da canamicina (sequência de referência em Datsenko, K. A. e Wanner, B. L, 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - DmetKRscr com 100 bases (SEQ ID NO 26):

[0289] gagttatatcatcatagattaaacgctgttatctgcaatiaagactttactgaaaagaaatgiaacaactgi gaaaaccgCATATGAATATCCTCCTTAG

[0290] com - uma região (caixa baixa) homóloga à região entre o gene metK e o galP (3086162 a 3086083) - uma região (caixa alta) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina do plasmídeo pKD4. O produto da PCR obtido é então introduzido por eletroporaçâo na cepa MG1655 (pKD46) em que a enzima recombinase Red expressa permite a recombinação homóloga. Os transform antes resistentes à canamicina são então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos MetKFscr e MetKRscr definidos abaixo. A cepa retida é designada MG1655 (metK, Km).

[0291] MetKFscr (SEQ ID NO 27): gcgcccatacggtctgattcagatgctgg (homólogo à sequência de 3085732 a 3085760).

[0292] MetKRscr (SEQ ID NO 28): gcgccagcaattacaccgatatccaggcc (homólogo à sequência de 3086418 a 3086390).

[0293] Para transferir os alelos de metK, o método de transdução P1 de fago é usado. O protocolo seguido é implementado em 2 etapas com a preparação do lisado de fago da cepa MG1655 (metK, Km) e depois a transdução na cepa MG1655 ΔmetJ metA*1 IpTRCmetL.

[0294] A construção da cepa (metK, Km) é descrita acima.

[0295] Preparação do lisado P1 de fago: - Inoculação com 100 pil de uma cultura noturna da cepa MG1655 (metK, Km) de 10 ml de LB + 50 pg/ml de Km + glicose 0,2% + CaCL 5 mM. - Incubação por 30 minutos a 37°C com agitação. - Adição de 100 pl de lisado P1 de fago preparado sobre a cepa selvagem MG 1655 (cerca de 1.109 fago/ml) - Agitação a 37°C por 3 horas, até que todas as células ficassem lisadas - Adição de 200 pl de clorofórmio e turbilhonamento. - Centrifugação por 10 minutos em 4500 g para eliminar detritos celulares - Transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 pl de clorofórmio - Armazenagem do lisado a 4°C.

[0296] Transdução - Centrifugação por 10 minutos em 1500 g de 5 ml de uma cultura noturna da cepa MG1655 ΔmetJ metA*11 pTRCmerL em meio LB - Suspensão da pelota celular em 2,5 ml de MgSCM 10 mM, CaCh 5 mM -Tubos de controle: 100 pl de células 100 pl de fagos P1 da cepa MG1655 (ΔmetK, Km) - Tubo de teste: 100 pl de células + 100 pl de fagos P1 da cepa MG1655 (ΔmetK, Km) - Incubação por 30 minutos a 30°C sem agitação - Adição de 100 pl de citrato de sódio 1 M em cada tubo e turbilhonamento -Adição de 1 ml de LB - Incubação por 1 hora a 37°C com agitação - Espalhar sobre placas 50 gg/ml de LB + Km após a centrifugação dos tubos por 3 minutos a 7000 rpm - Incubação a 37°C durante a noite. Verificação da cepa

[0297] Os transformantes resistentes à canamicina são então selecionados e a inserção da região contendo (metK, Km) é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos MetKFscr e MetKRscr. A cepa retida é designada MG1655 ΔmetJ metA*11 pTRCmetL metK*

[0298] O cassete de resistência à canamicina pode então ser eliminado. O plasm ideo pCP20 carregando a FLP recombinase atuando nos sítios FRT do cassete de resistência à canamicina é então introduzido nos sítios recombinantes mediante eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C, a perda do cassete de resistência à canamicina é verificada por uma análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos como usados anteriormente (MetKFscr e MetKRscr).

Exemplo 6

[0299] Fermentação das cepas de produção de E. coli e análise da produção

[0300] As cepas de produção foram inicialmente analisadas em pequenas culturas em frasco de Erlenmeyer com o uso de meio M9 modificado (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32: 120-128), que foi suplementado com 5 g/litro de MOPS e 5 g/litro de glicose. Carbenicilina foi adicionada, se necessário, em uma concentração de 100 mg/litro. Uma cultura noturna foi usada para inocular uma cultura de 30 ml a uma OD600 de 0,2. Depois que a cultura havia alcançado uma OD600 de 4,5 a 5, 1,25 ml de uma solução de glicose a 50% e 0,75 ml de um MOPS 2M (pH 6,9) foram adicionados e a cultura foi agitada por 1 hora. Subsequentemente, IPTG era adicionado, se necessário.

[0301] Metabólitos extracelulares foram analisados durante a fase de batelada. Os aminoácidos foram quantificados por HPLC após a derivação de OPA/Fmoc e outros metabólitos relevantes foram analisados com o uso de GC-MS após a sililação.

[0302] Os seguintes resultados foram obtidos para as cepas MG1655. MG1655 pTRCmetL, MG1655 metA*11 pTRCmetL, MG1655 metA*13 pTRCmetL, MG1655 metA*11 ΔmetJ pTRCmetL, MG1655 metA*11Δ |metJ pTRCmetL metK*H142Y. Tabela 5. Concentrações específicas de metabólitos extracelulares (mmol/g de peso seco) após fermentação da batelada (frasco de Erlenmeyer). ND = não detectado.

[0303] Para ainda reforçar a produção da homosserina, a aspartocinase/homosserina, urn alelo thrA* com resistência de retroalimentação reduzida à treonina, é expressa a partir do plasmídeo pCL1920 (Lerner e Inouye, 1990, NAR 18, 15 p. 4631) usando o promotor Ptrc. Para a construção do plasmídeo pME107, thrA foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico usando os seguintes oligonucleotídeos:

[0304] BspHIthrA (SEQ ID NO 29): ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc

[0305] SmalthrA (SEQ ID NO 30): ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc

[0306] O fragmento amplificado de PCR é cortado com as enzimas de restrição BspHI e Smal e clonado nos sítios de Ncol / Smal do vetor pTRC99A (Stratagene). Para a expressão de um vetor de baixa cópia o plasmídeo pME101 é construído como segue. O plasmídeo pCL1920 é amplificado em PCR com o uso dos oligonucleotídeos PME101F e PME101R e o fragmento BstZ17l-Xmnl do vetor pTRC99A abrigando o gene lacl, e o promotor Ptrc é inserido no vetor amplificado. O vetor resultante e o vetor que abriga o gene thrA são restringidos por Apal e Smal e o fragmento contendo thrA é clonado no vetor pME101. Para aliviar ThrA da inibição de retroalimentação, a mutação F318S é introduzida por mutagênese dirigida ao sítio (Stratagene) com o uso dos oligonucleotídeos ThrAF F318S e ThrAR F318S, resultando no vetor pME107. O vetor pME107 foi introduzido nas cepas ΔmetJ metA*11 com diferentes alelos metK*.

[0307] PME101F (SEQ ID NO 31): Ccgacagtaagacgggtaagcctg

[0308] PME101R (SEQ ID NO 32): Agcttagtaaagccctcgctag

[0309] ThrAF F318S (Smal) (SEQ ID NO 33): cccaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggcccggg

[0310] ThrAR F318S (Smal) (SEQ ID NO 34): cccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattgg

[0311] As cepas produziram quantidades substanciais de metabólitos de interesse foram subsequentemente testadas sob condições de produção em 300 ml de fermentadores (DASGIP) usando um protocolo de batelada alimentada.

[0312] Para este fim, o fermentador foi enchido com 145 ml de meio mínimo modificado e inoculado com 5 ml de pré-cultura até uma densidade óptica (QD600 nm) entre 0,5 e 1,2.

[0313] A temperatura da cultura foi mantida constante em 37°C e o pH foi permanentemente ajustado a valores entre 6,5 e 8, com o uso de uma solução de NH4OH. O índice de agitação foi mantido entre 200 e 300 rpm durante a fase de batelada e foi aumentado até 1000 rpm no final da fase de batelada alimentada. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em valores entre 30 e 40% de saturação mediante o uso de um controlador de gases. Quando a densidade óptica alcançou um valor entre três e cinco, a batelada alimentada foi iniciada com uma taxa de fluxo inicial entre 0,3 e 0,5 ml/hora e um aumento progressivo até valores da taxa de fluxo entre 2,5 e 3,5 ml/hora. Neste ponto, a taxa de fluxo foi mantida constante por 24 a 48 horas. A média da batelada alimentada baseou-se no meio mínimo contendo glicose em concentrações entre 300 e 500 g/litro.

[0314] A Tabela 6 mostra as concentrações de metionina quanto às cepas ΔmetJ metA*11 pME107 metK*H142Y e ΔmetJ metA*l1 pME107 metK*T227l em comparação com a capa de referência ΔmetJ metA*11 pME107 após cerca de 75 horas de operação. Ambas as cepas abrigando os alelos metK* alcançam uma concentração de metionina aumentada em comparação com a cepa de referência. Assim, as mutações de metK conferem uma vantagem industrial sobre a produção de metionina mediante o aumento da produtividade das cepas. Tabela 6. Produção de metionina da cepa de referência ΔmetJ metA*11 pME107 e duas cepas abrigando as mutações de metK* APÓS O TEMPO indicado de operação incluindo a batelada e a batelada alimentada

Claims (6)

1. Método para a preparação de metionina, seus precursores ou produtos derivados da mesma, em um processo fermentativo com um microorganismo em que a L-homosserina é convertida em O-succinil-homosserina com uma homosserina trans-succinilase, compreendendo a etapa de cultivar o microorganismo em um meio apropriado, e recuperar a metionina, seus precursores ou produtos dela derivados uma vez produzidos, em que a homosserina trans- succinilase é uma homosserina trans-succinilase mutada com sensibilidade reduzida quanto aos inibidores da retroalimentação S-adenosilmetionina e metionina em comparação com a enzima do tipo selvagem, caracterizado pelo fato de que a homosserina trans-succinilase mutada é a homosserina trans-succinilase tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID No: 35 ou SEQ ID No: 36.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microorganismo modificado é selecionado entre os procariotas e os eucariotas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o microorganismo modificado é selecionado dentre os procariotas, especialmente Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

4. Microorganismo recombinante caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeo, de acordo com a SEQ ID No: 37 ou SEQ ID No: 38.

5. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é selecionado dentre Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

6. Microorganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica a aspartocinase/homosserina desidrogenase é superexpresso e/ou o gene que codifica metJrepressor da metionina é suprimido.

Images