BRPI0517135B1 - Composições e métodos para tratar doenças neoplásticas - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR DOENÇAS NEOPLÁSTICAS. São descritas aqui composições e métodos para tratar doenças neoplásticas. São incluídos composições e métodos que são efetivo contra células de mieloma múltiplo resistente ao tratamento convencional com Bortezomiba. Além disso, o tratamento de combinação com dois inibidores de proteosoma diferentes demonstrou ser sinergístico para tratar mieloma múltiplo.

Description

A presente invenção se relaciona aos campos da quimica e da medicina. Mais particularmente, a presente invenção 5 se relaciona ao tratamento de doenças neoplásticas, tal como câncer.

Descrição do Estado da Arte Relacionada

O câncer é a causa principal de morte nos Estados Unidos. Apesar dos significativos esforços para encontrar novas 10 abordagens para tratar o câncer, as opções primárias de tratamento permanecem, como a cirurgia, a quimioterapia e a terapia de radiação, tanto sozinhas como em combinação. Porém, a cirurgia e a terapia de radiação somente são úteis geralmente para tipos bastante definidos de câncer, e são de uso limitado para tratar os 15 pacientes com a doença disseminada. A quimioterapia é o método que é geralmente útil para tratar os pacientes com câncer metastático ou cânceres difusos tais como leucemias. Embora a quimioterapia possa prover um beneficio terapêutico, ela frequentemente não resulta em cura da doença devido às células de câncer do paciente 20 que se tornam resistentes ao agente quimioterapêutico.

Então, existe necessidade de uma quimioterapia adicional para tratar o câncer. Um esforço continuo está sendo feito individualmente pelos pesquisadores, academias e companhias para identificar novos agentes e quimioterapias anti-microbianas, 25 potencialmente úteis.

O sucesso no desenvolvimento da terapia de Bortezomiba/PS-341 para o tratamento da recaida de mieloma múltiplo (MM) refratário estabeleceu a inibição de proteasoma como uma estratégia terapêutica efetiva. O ácido borônico de dipeptida, 30 análogo da Bortezomiba, é um potente, altamente seletivo, e reversivel, inibidor de proteasoma, visando complexo de proteasoma 26S inibindo sua função. O proteasoma 26S é uma protease multicatalitica dependente de trifosfato de adenosina (TFA) mediando a degradação de proteina de intracelular. A degradação 35 proteasomal de proteinas defeituosas ou danificadas procede pelo reconhecimento de proteinas poli-ubiquitinadas pela sub-unidade reguladora 19S da protease 26S, e subseqüente hidrólise para pequenas polipeptidas. A bortezomiba inibe principalmente a atividade quimiotriptica, sem alterar atividade a triptica ou a atividade do tipo caspase, de proteasoma. Além de inibir FN-kB, a Bortezomiba tem efeitos pleiotrópicos na biologia MM, visando: 1) 5 proteinas reguladoras de ciclo de célula; 2) o caminho de DPR por meio de modulação da atividade transcripcional do fator de diferenciação de célula de plasma da proteina-1 de ligação de caixa-X (P-1CX); 3) a apoptose/MDM2 medida por p53; 4) os mecanismos de reparo de DNA; 5) os caminhos de resposta à tensão 10 (stress) clássicos por meio de cascatas de morte de célula, tanto intrinseca (mediada por caspase-9) e extrínseca (mediada por caspase-8). Especificamente, a Bortezomiba ativa JNK, que dispara a sinalização apoptótica mitocondrial: liberação de citocromo-c (cito-c) e do segundo ativador mitocondrial de caspases (Same) a 15 partir dos mitocôndrios para citosol, seguido por ativação de caspase-9 e caspase-3. Porém, tanto a resistência intrinseca como a adquirida já foi observada, e não há nenhuma terapia para superar a resistência à Bortezomiba no momento.

Sumário da Invenção

Um aspecto da presente invenção é um método para tratar uma doença neoplástica, incluindo administrar a um paciente infligido com a doença neoplástica um composto da fórmula (I) ou um sal ou pró-droga relacionado farmaceuticamente aceitável:

Onde X é selecionado do grupo que consiste em fluorina, cloro, bromo ou iodo, e onde a doença neoplástica é susceptível à resistência a pelo menos um outro agente quimioterapêutico.

Outro aspecto da presente invenção é um método para tratar uma doença neoplástica, incluindo administrar a um 5 paciente infligido com a doença neoplástica um composto da fórmula (I) ou um sal ou pró-droga relacionado farmaceuticamente aceitável onde X é selecionado do grupo que consiste em fluorina, cloro, bromo ou iodo, em combinação com pelo menos um agente quimioterapêutico adicional.

Outro aspecto da presente invenção é uma composição farmacêutica, incluindo um composto da fórmula (I) ou um sal ou pró-droga relacionado farmaceuticamente aceitável, onde X é selecionado do grupo que consiste em fluorina, cloro, bromo ou iodo, e pelo menos um agente quimioterapêutico adicional.

Outro aspecto da presente invenção é um método para tratar uma doença neoplástica, incluindo administrar a um paciente infligido com a doença neoplástica uma combinação sinergistica de pelo menos dois inibidores de proteosoma.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 ilustra a inibição de atividades de proteasoma do tipo químiotripsina, do tipo caspase, e do tipo tripsina em proteasomas 20S derivados de eritrócitos humanos por NPI-0052.

A figura 2 ilustra a atividade do tipo 25 químiotripsina in vivo de NPI-0052 em ratos. A figura 3 descreve a auto-radiografia obtida depois do tratamento de células de mieloma múltiplo (MM) MM.1S com NPI-0052 (7 nM) e da incubação de extratos de proteína com AdaY (125I) Ahx3L3VS a 37 °C.

A figura 4 descreve imuno-manchas obtidas depois do tratamento de células MM.1S com NPI-0052 e então incubando-se com Dansyl-Ahx3L3VS.

A figura 5A ilustra a viabilidade de célula de várias linhagens de célula de mieloma múltiplo tratadas com doses 35 indicadas de NPI-0052 por 24h.

A figura 5B ilustra ensaios de fragmentação de DNA de apoptose depois do tratamento com NPI-0052 de células de MM obtidas de pacientes.

A figura 6 ilustra ensaios de fragmentação de DNA 5 de apoptose depois do tratamento com NPI-0052 de células estromais de medula óssea obtidas de pacientes.

A figura 7 ilustra um ensaio de MTT da viabilidade de células MM.1S após tratamento com NPI-0052 ou Dex na presença ou ausência de IL-6 ou FCI-I. A figura 8 ilustra o efeito de NPI-0052 em migração de células MM.1S induzida por FCEV.

A figura 9 ilustra o efeito de NPI-0052 na viabilidade de células MM.1S com super-expressão de Bcl2. As figuras 10A e 10B descrevem o efeito de NPI- 15 0052 no crescimento de tumor quando administrado oralmente em ratos.

A figura 10C ilustra o efeito de NPI-0052 na sobrevivência quando administrado oralmente a ratos. A figura 10D ilustra o efeito de NPI-0052 no peso 20 de corpo quando administrado oralmente a ratos. A FIGUIRA 10E ilustra seções de tecido de locais de inoculação de ratos tratados com NPI-0052 e tratados com controle.

A figura 10F compara o efeito de NPI-0052 e Bortezomiba no crescimento de tumor quando administrados i.v. a ratos. A figura 10G compara o efeito de NPI-0052 e Bortezomiba na sobrevivência quando administrados i.v. a ratos.

A figura 11A ilustra o efeito de NPI-0052 no 30 potencial de membrana mitocondrial em células MM.1S incubadas com CMXRos.

A figura 11B ilustra o efeito de NPI-0052 na geração de super-óxido em células MM.1S tingidas com tintura di- hidro-etidio (HE) permeável na membrana.

A figura 11C descreve que imuno-manchas mitocondriais e frações de proteina citosólica obtidas de células MM.1S tratadas com NPI-0052.

A figura 11D descreve imuno-manchas de proteínas citosólicas obtidas de células MM.IS tratadas com NPI-0052 e analisadas com Abs anti-caspase-9.

A figura HE descreve imuno-manchas de proteínas 5 citosólicas obtidas de células MM.IS tratadas com NPI-0052 e analisadas com Abs anti-caspase-8.

A figura 11F descreve imuno-manchas de células de MM MM.IS ou MM.1R tratadas com NPI-0052 e avaliadas tanto por ensaios de apoptose por PARP como de divisão de caspase-3.

A figura 12A ilustra a viabilidade de células MM.1S depois do tratamento com NPI-0052 ou Bortezomiba na presença ou ausência de um inibidor de caspase-3, caspase-8, ou caspase-9.

A figura 12B ilustra a viabilidade de células MM.1S para células transfectadas com um vetor sozinho, DN-caspase- 15 8, e DN-caspase-9 depois do tratamento com NPI-0052 ou Bortezomiba.

A figura 12C descreve imuno-manchas de extratos citosólicos de células MM.1S transfectadas por DN-caspase-8 e DN- caspase-9 tratadas com dexametasona ou anti-Fas MoAb.

A figura 12D ilustra a viabilidade de células MM.1S para o vetor ou células transfectadas DN-DMAF após tratamento com NPI-0052 ou Bortezomiba.

A figura 12E descreve imuno-manchas de extratos de proteína mitocondrial a partir de células de MM MM.1S tratadas 25 com a concentração indicada de NPI-0052 ou de Bortezomiba e analisadas com anti-Bax ou anti-Hsp60 Abs.

A figura 12F ilustra a viabilidade de célula de células de fibroblastos embrionários de rato (FER) com Bax de tipo selvagem ou deletado (abatido) tratadas com as concentrações 30 indicadas de NPI-0052 ou Bortezomiba.

A figura 13 ilustra a viabilidade de linfócitos normais a partir de cinco doadores saudáveis tratados com as concentrações indicadas de NPI-0052 ou Bortezomiba.

A figura 14A ilustra a viabilidade de célula de 35 células MM.1S transfectadas com um vetor sozinho ou Bcl-2 depois do tratamento com NPI-0052 ou Bortezomiba.

A figura 14B descreve imuno-manchas de extratos citosólicos a partir de células MM.1S transfectadas por vetor ou por Bcl-2 tratadas com NPI-0052 ou Bortezomiba.

A figura 15 ilustra a viabilidade de célula de células de MM MM.1S e MM.1R tratadas com a concentração indicada de NPI-0052, Bortezomiba, ou NPI-0052 + Bortezomiba.

Descrição Detalhada da Forma de Incorporação Preferida

Em uma forma de incorporação, um composto de acordo com a fórmula (I) é provido para uso conforme aqui descrito:

Onde X pode ser fluorina, cloro, bromo ou iodo.

Em uma forma de incorporação, X é cloro. Em uma forma de incorporação, a combinação de fórmula (I) tem estéreo-quimica de 15 acordo com a fórmula (II):

O composto da fórmula (II) onde X = Cl também é aqui referido como NPI-0052. Os compostos de acordo com as fórmulas (I) ou (II) podem ser derivados da fermentação de Salinospora, um actinomicete gram-positivo marinho.

Em algumas formas de incorporação, são providos pró-drogas, metabolites, estéreo-isômeros, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos citados para uso conforme aqui descrito.

Uma "pró-droga" se refere a um agente que é convertido na droga de origem in vivo. As pró-drogas são freqüentemente úteis porque, em algumas situações, elas podem ser mais fáceis de administrar do que a droga de origem. Por exemplo, elas podem ser bio-disponiveis para administração oral considerando que a droga de origem não é. A pró-droga também pode ter melhor solubilidade em composições farmacêuticas do que a droga de origem. Um exemplo, sem limitações, de uma pró-droga seria um composto que é administrado como um éster (a "pró-droga") para facilitar a transmissão através de uma membrana de célula onde a solubilidade à água é prejudicial para a mobilidade mas que é então hidrolizado metabolicamente para o ácido carboxilico, a entidade ativa, uma vez dentro da célula onde a solubilidade à água é benéfica. Um exemplo adicional de uma pró-droga pode ser uma peptida curta (poli-amino-ácido) ligado a um grupo ácido onde a peptida é metabolizada para revelar o meio ativo. Procedimentos convencionais para a seleção e preparação de derivados de pró- droga satisfatórios são descritos, por exemplo, em Design of

Prodrugs, (ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985) que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. O termo "éster de pró-droga" derivados dos compostos aqui descritos formados pela adição de 5 quaisquer de vários grupos formadores de éster que são hidrolizados sob condições fisiológicas. Exemplos de grupos éster de pró-droga incluem pivoilóximetila, acetóximetila, ftalidila, indanila e metóximetila, bem como também outros grupos conhecidos na arte, incluindo um grupo (5-R-2-oxo-l,3-dioxoleno-4-ila)metila.

Outros exemplos de grupos éster de pró-droga podem ser encontrados em, por exemplo, T. Higuchi e V. Stella, em "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, da Sociedade Quimica Americana (1975); e "Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application", editada por E.B. Roche, Pergamon

Press: Nova Iorque, 14-21 (1987) (provendo exemplos de ésteres úteis como pró-drogas para compostos contendo grupos carboxila). Cada uma das referências acima mencionada está aqui incorporada como referência na sua totalidade.

Metabolites dos compostos aqui descritos incluem espécies ativas que são produzidas na introdução dos compostos no ambiente biológico.

Onde os compostos aqui descritos têm pelo menos um centro quiral, eles podem existir como uma raça coincidente ou como enantiômeros. Deve ser notado que tais isômeros e suas misturas são todos incluidos no escopo da presente invenção. Além disso, algumas das formas cristalinas para os compostos aqui descritos pode existir como polimorfos. Tais polimorfos estão incluidos em uma forma de incorporação da presente invenção. Além do mais, alguns dos compostos da presente invenção podem formar solvatos com água (isto é, hidratos) ou solventes orgânicos comuns. Tais solvatos estão incluidos em uma forma de incorporação da presente invenção.

O termo "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal de um composto que não causa irritação 35 significativa a um organismo ao qual ele é administrado e não ab- roga a atividade biológica e propriedades do composto. Em algumas formas de incorporação, o sal é um sal de adição de ácido do composto. Sais farmacêuticos podem ser obtidos reagindo-se um composto com ácidos inorgânicos tal como ácido hidro-hálico (por exemplo, ácido clorídrico ou ácido bromidrico), ácido sulfúrico, ácido nitrico, ácido fosfórico e similares. Sais farmacêuticos 5 também podem ser obtidos reagindo-se um composto com um ácido orgânico tal como um ácido alifático, carboxilico aromático ou sulfônico, por exemplo ácido acético, sucinico, láctico, málico, tartárico, citrico, ascórbico, nicotinico, metanosulfônico, etanosulfônico, p-toluenosulfônico, salicilico ou naftalenosulfônico. Sais farmacêuticos também podem ser obtidos reagindo-se um composto com uma base para formar um sal tal como um sal de amónio, um sal de metal alcalino, tal como um sal de sódio ou de potássio, um sal de metal alcalino-terroso, tal como um sal de cálcio ou de magnésio, um sal de bases orgânicas como 15 diciclo-hexilamina, N-metil-D-glucamina, tris(hidróximetil)metilamina, alquilamina C1-C7, ciclo-hexilamina, tri-etanolamina, etilenodiamina, e sais com amino-ácidos tal como arginina, lisina, e similares.

Se a fabricação de formulações farmacêuticas 20 envolve a mistura intima dos excipientes farmacêuticos e do ingrediente ativo na sua forma de sal, então pode ser desejável usar excipientes farmacêuticos que não sejam básicos, isto é, excipientes ácidos ou neutros.

Em várias formas de incorporação, os compostos 25 aqui descritos podem ser usados sozinhos, em combinação com outros compostos aqui descritos, ou em combinação com um ou mais agentes ativos nas áreas terapêuticas aqui descritas.

O termo "átomo de halogênio" como usado aqui, significa qualquer um dos átomos rádio-estáveis da coluna 7 da 30 Tabela Periódica de Elementos, por exemplo, fluorina, cloro, bromo, ou iodo, com fluorina e cloro sendo preferidos.

O termo "éster" se refere a um meio quimico com fórmula -(R)n-COOR', onde R e R' são selecionados independentemente do grupo que consiste em alquila, ciclo-alquila, 35 arila, hetero-arila (ligada por meio um carbono do anel) e um hetero-aliciclico (ligado por mio de um carbono do anel), e onde n é 0 ou 1.

Uma "amida" é um meio químico com fórmula - (R) n—C (0) NHR' ou - (R) n-NHC (O) R', onde R e R' são selecionados independentemente do grupo que consiste em alquila, ciclo-alquila, arila, hetero-arila (ligada por meio de um carbono do anel) e um 5 hetero-alicíclico (ligado por um carbono do anel), e onde n é 0 ou 1. Uma amida pode ser um amino-ácido ou uma molécula de peptida ligada a uma molécula da presente invenção, formando assim uma pró-droga.

Qualquer amina, hidróxi, ou cadeia lateral de 10 carboxila nos compostos da presente invenção pode ser esterificado ou amidificado. Os procedimentos e grupos específicos a serem usados para alcançar esta finalidade são conhecidos por aqueles com habilidades na arte e podem ser encontrados prontamente em fontes de referência tal como Greene e Wuts, Protective Groups in 15 Organic Synthesis, 3a. Ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque, NY, 1999, que é aqui incorporada em sua totalidade.

Os termos "puro", "purificado", "substancialmente purificado", e "isolado", como usados aqui, se referem ao composto da forma de incorporação livre de outros compostos, dissimilares, 20 com os quais o composto, se encontrado em seu estado natural, estaria associado em seu estado natural, de modo que os compostos da invenção compreendem pelo menos 0,5%, 1%, 5%, 10%, ou 20%, e mais preferivelmente pelo menos 50% ou 75% da massa, em peso, de uma determinada amostra.

Métodos de Uso

Como demonstrado pelos exemplos aqui apresentados, o composto da fórmula (I) inibe as atividades de proteasoma do tipo químiotripsina, do tipo tripsina, e do tipo caspase. Em contraste, a Bortezomiba mostrou inibir apenas a atividade de proteasoma do tipo químiotripsina. Veja-se Goldberg, A.L. & Rock, K. (2002) Nat. Med. 8, 338-40 e Adams, J. (2004) Nat. Rev. Cancer 4, 349-60; ambas aqui incorporadas como referência na sua totalidade. É demonstrado mais adiante que os compostos da fórmula (I) têm um mecanismo de ação diferente da Bortezomiba.

Além disso, o composto da fórmula (I) induz apoptose em várias linhagens de células de mieloma múltiplo incluindo, mas não se limitando a, MM.1S sensível à Dexametasona, MM.1R resistente à Dexametasona, RPMI-8226, OPM2, U266, e Dox-40 resistente à

Doxorubicina. 0 composto da fórmula I também induz apoptose em linhagens de célula obtidas de pacientes humanos com mieloma múltiplo que tinham recaido depois de múltiplas terapias 5 anteriores com Dexametasona, Bortezomiba, e talidomida. Assim, o composto da fórmula (I) é efetivo contra células de MM que são resistentes a outros agentes quimioterapêuticos, incluindo Dexametasona, Doxorubicina, Bortezomiba/PS-341, e talidomida.

Adequadamente, em uma forma de incorporação, é 10 provido um método para tratar uma doença neoplástica que é susceptível a resistência a pelo menos um agente quimioterapêutico incluindo administrar a um paciente, como um humano, um composto da fórmula (I) ou um sal ou éster de pró-droga relacionado farmaceuticamente aceitável. Por "resistência a pelo menos um 15 agente quimioterapêutico" entende-se que a administração do agente quimioterapêutico ao paciente não resulta em melhora significativa dos sintomas da doença neoplástica. Em algumas formas de incorporação onde a doença neoplástica é caracterizada por um tumor, "resistência a pelo menos um agente quimioterapêutico" 20 significa que a administração do agente quimioterapêutico não resulta em inibição apreciável do crescimento do tumor, ou redução no tamanho do tumor. "Resistência a pelo menos um agente quimioterapêutico" também pode significar que quando o agente é exposto a células de tumor resistentes, nenhuma apoptose apreciável é induzida. Por "susceptível a" resistência a pelo menos um agente quimioterapêutico, entende-se que a doença neoplástica é atualmente resistente a pelo menos um agente quimioterapêutico ou desenvolverá resistência com a administração repetida do agente quimioterapêutico.

Os exemplos aqui também demonstram que os compostos da fórmula (I) quando combinados com Bortezomiba ativam a apoptose sinergistica em células de MM. Assim, um composto da fórmula (I) pode ser administrado em combinação com Bortezomiba/PS-341 para alcançar a apoptose usando doses mais 35 baixas de cada agente do que se os agentes fossem administrados separadamente, reduzindo assim a toxicidade dos agentes.

Surpreendentemente, estes resultados demonstram que um resultado sinergístico pode ser obtido administrando dois inibidores de proteasoma diferentes. Por "sinergistico" entende-se que a combinação de dois ou mais agentes obtém um indice de combinação (IC) < 1,0. Também foi demonstrado que a combinação do composto da fórmula (I) com agentes inibidores de não-proteasoma provê um efeito aditivo. Por "aditivo” entende-se que a combinação de dois ou mais agentes obtém um IC aproximadamente igual a um. Por exemplo, o IC pode ser determinado pelo método Chou-Talalay de acordo com a seguinte equação: IC = (D)l/(Dx)l + (D)2/(Dx)2 + (D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2 onde (D) 1 e (D) 2 são as doses de droga 1 e de droga 2 que têm um efeito x quando usadas em combinação; e (Dx)l e (Dx)2 são as doses de droga 1 e de droga 2 que têm o mesmo efeito x quando usadas sozinhas.

Adequadamente, em uma forma de incorporação, é provido um método para tratar uma doença neoplástica incluindo administrar dois ou mais inibidores de proteasoma em combinação sinergistica. Exemplos não limitativos de classes de inibidores de proteasoma que podem ser combinadas incluem inibidores de proteasoma de boronato de peptida, inibidores de proteasoma de aldeido de peptida, e inibidores de proteasoma de não-peptida. Um exemplo não limitativo de um inibidor de proteasoma de boronato de peptida é a Bortezomiba. Um exemplo não limitativo de um inibidor de proteasoma de aldeido de peptida é MG-132. Exemplos não limitativos de inibidores de proteasoma de não-peptida incluem omuralida e o composto da fórmula (I) • Em uma forma de incorporação, pelo menos um dos inibidores de proteasoma é um composto da fórmula (I) ou Bortezomiba. Por administração em "combinação" entende-se que dois ou mais agentes podem ser encontrados ao mesmo tempo na circulação sangüinea do paciente, 30 sem levar em conta quando ou como eles são de fato administrados.

Em uma forma de incorporação, os agentes são administrados simultaneamente. Em uma forma de incorporação, a administração em combinação é realizada combinando-se os agentes em uma única forma de dosagem. Em outra forma de incorporação, os agentes são administrados consecutivamente. Em uma forma de incorporação os agentes são administrados pela mesma rota, tal como oralmente. Em outra forma de incorporação, os agentes são administrados por rotas diferentes, tal como um sendo administrado oralmente e outro sendo administrado i.v.. Em uma forma de incorporação vantajosa, as farmacocinéticas dos dois ou mais agentes são substancialmente 5 iguais.

Em uma forma de incorporação, é provido um método para tratar uma doença neoplástica incluindo administrar um composto da fórmula (I) em combinação com outro agente quimioterapêutico. Em uma forma de incorporação, o outro agente 10 quimioterapêutico é dexametasona, doxorubicina, ou talidomida. Em uma forma de incorporação, o outro agente quimioterapêutico é outro inibidor de proteasoma tal como Bortezomiba. Em uma forma de incorporação, uma composição farmacêutica é provida de modo a combinar um composto da fórmula (I) com o agente quimioterapêutico 15 adicional.

Em algumas formas de incorporação, a doença neoplástica tratada por quaisquer dos métodos acima pode ser um câncer, selecionado de câncer de mama, sarcoma, leucemia, câncer ovariano, câncer uretal, câncer de bexiga, câncer de próstata, 20 câncer de cólon, câncer retal, câncer de estômago, câncer do pulmão, linfoma, mieloma múltiplo, câncer pancreático, câncer de figado, câncer de rim, câncer endócrino, câncer de pele, melanoma, angioma, e câncer de cérebro ou do sistema nervoso central (SNC). Em uma forma de incorporação, a doença neoplástica é um mieloma 25 múltiplo.

Composições Farmacêuticas

Em outro aspecto, a presente descrição se relaciona a uma composição farmacêutica compreendendo agentes ativos de superficie fisiologicamente aceitáveis, carreadores, 30 diluentes, excipientes, agentes suavizadores, agentes de suspensão, substâncias formadoras de filme, e assistentes de cobertura, ou uma combinação relacionada; e um composto ou combinação aqui descrito. Os carreadores ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na arte farmacêutica, e 35 são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. Ed., Mack Publishing Cia., Easton, PA (1990), que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. Agentes preservativos, estabilizadores, tinturas, adoçantes, fragrâncias, flavorizantes, e similares podem ser providos na composição farmacêutica. Por exemplo, podem ser adicionados benzoato de sódio, ácido ascórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzóico como 5 preservativos. Além disso, agentes anti-oxidantes e de suspensão podem ser usados. Em várias formas de incorporação, álcoois, ésteres, álcoois alifáticos sulfatados, e similares podem ser usados como agentes ativos de superficie; sacarose, glicose, lactose, amido, celulose cristalizada, manitol, silicato anidro 10 leve, aluminato de magnésio, aluminato de metasilicato de magnésio, silicato de aluminio sintético, carbonato de cálcio, carbonato de ácido de sódio, fosfato de hidrogênio de cálcio, carboximetil celulose de cálcio, e similares podem ser usados como excipientes; estearato de magnésio, talco, óleo endurecido e 15 similares podem ser usados como agentes suavizadores; óleo de coco, óleo de azeitona, óleo de sésamo, óleo de amendoim, óleo de soja podem ser usados como agentes de suspensão ou lubrificantes; ftalato de acetato de celulose como um derivado de um carbohidrato tal como celulose ou açúcar, ou um copolimero de 20 metilacetato-metacrilato, podem ser usados como um derivado de polivinila, como agentes de suspensão; e plasticizantes como ftalatos de éster e similares podem ser usados como agentes de suspensão.

O termo "composição farmacêutica" se refere a uma 25 mistura de um composto ou combinação de compostos aqui descritos com outros componentes quimicos, tais como diluentes ou carreadores. A composição farmacêutica facilita administração do composto a um organismo. Existem múltiplas técnicas de administração de um composto no estado da arte, incluindo, mas não 30 se limitando a, administração oral, por injeção, por aerossol, parenteral, e tópica. As composições farmacêuticas também podem ser obtidas reagindo os compostos com ácidos inorgânicos ou orgânicos tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido bromidrico, ácido nitrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfônico, 35 ácido etanosulfônico, ácido p-toluenosulfônico, ácido salicilico e similares.

O termo "carreador" define um composto químico que facilita a incorporação de um composto em células ou tecidos. Por exemplo, sulfóxido de dimetila (DMSO) é um carreador comumente utilizado para facilitar a absorção de muitos compostos orgânicos 5 nas células ou tecidos de um organismo. define compostos químicos diluídos em água que dissolverão o composto de interesse bem como também estabilizarão a forma biologicamente ativa do composto. Sais dissolvidos em soluções tamponadas são utilizados como 10 diluentes do estado da arte. Uma solução tamponada comumente usada é salina tamponada para fosfato porque imita as condições salinas do sangue humano. Considerando que sais tamponados podem controlar o pH de uma solução em baixas concentrações, um diluente tamponado raramente modifica a atividade biológica de um composto.

O termo "fisiologicamente aceitável" define um carreador ou diluente que não ab-roga a atividade biológica e propriedades do composto.

As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas a um paciente humano sozinhas, ou em composições 20 farmacêuticas onde elas são misturadas com carreadores ou excipientes satisfatórios. Técnicas para formulação e administração dos compostos, de aplicação imediata, podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. Ed., Mack Publishing Cia., Easton, PA (1990).

Rotas de administração satisfatórias podem, por exemplo, incluir administração oral, retal, transmucosal, tópica, ou intestinal; liberação parenteral, incluindo intramuscular, subcutânea, intravenosa, injeções intramedulares, bem como injeções intratecais, intraventriculares diretas, intraperitoneais, intranasais, ou intra-oculares. Os compostos também podem ser administradas em formas de dosagem de liberação contínua ou controlada, incluindo injeções de deposição, bombas osmóticas, pílulas, transdermal (incluindo eletro-transporte) adesivos, e similares, para administração prolongada e/ou ritmada, 35 pulsada a uma taxa pré-determinada.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas de uma maneira já conhecida, por exemplo, por meio de misturas convencionais, dissolviçâo, granulação, manufatura de drágeas, levigação, emulsão, encapsulamento, ou processos de fabricação de tabletes ou cápsulas.

Composições farmacêuticas para uso conforme a presente invenção podem assim ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais carreadores aceitáveis fisiologicamente incluindo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação apropriada é dependente da rota de administração escolhida. Quaisquer técnicas bem conhecidas, carreadores, e excipientes podem ser usados conforme julgado adequado e compreendido no estado da arte; por exemplo, nas Remington's Pharmaceutical Sciences, acima citada.

Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, como soluções liquidas ou suspensões, formas sólidas satisfatórias para solução ou suspensão em liquido antes da injeção, ou como emulsões. Por exemplo, excipientes satisfatórios são água, salina, dextrose, manitol, lactose, lecitina, albumina, glutamato de sódio, cisteina hidroclorida, e similares. Além do mais, se desejado, as composições farmacêuticas injetáveis podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas, tais como agentes umedecedores, agentes tamponantes de pH, e similares. Tamponantes fisiologicamente compatíveis incluem, mas não se limitam a, solução de Hanks, solução de Ringer, ou um tamponante salino fisiológico. Se desejado, preparações aumentadoras de absorção (por exemplo, liposomos), podem ser utilizadas.

Para administração transmucosal, penetrantes apropriados para a barreira a ser penetrada podem ser usados na 30 formulação.

Formulações farmacêuticas para administração parenteral, por exemplo, por injeção de bolus ou infusão contínua, incluem soluções aquosas dos compostos ativos na forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser 35 preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas.

Solventes lipofílicos ou veículos satisfatórios incluem óleos graxos tal como óleo de sésamo, ou outros óleos orgânicos tal como óleo de feijão de soja, toronja ou de amêndoa, ou ésteres de ácido graxo sintético, tal como oleato de etila ou triglicérides, ou liposomos. Suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão, tal como carboximetil 5 celulose de sódio, sorbitol, ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes satisfatórios que aumentem a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de 10 dosagem por unidade, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de multi-doses, com um preservativo adicionado. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veiculos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores tais como agentes de suspensão, estabilizadores e/ou de dispersão. 15 Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar em forma de pó para constituição com um veiculo satisfatório, por exemplo, água livre de pirogênio estéril, antes do uso.

Para administração oral, os compostos podem ser formulados prontamente combinando-se os compostos ativos com 20 carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na arte.

Tais carreadores habilitam os compostos da invenção a serem formulados como tabletes, pilulas, drágeas, cápsulas, liquidos, géis, xaropes, borras, suspensões, e similares, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. Preparações farmacêuticas para uso 25 oral podem ser obtidas combinando-se os compostos ativos com um excipiente sólido, moendo-se opcionalmente a mistura resultante, e processando-se a mistura de grânulos, depois da adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter tabletes ou núcleos de drágeas. Excipientes satisfatórios são, em particular, 30 preenchedores tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, goma de milho, goma de trigo, goma de arroz, goma de batata, gelatina, goma tragacante, metil celulose, carboximetilcelulose de sódio, hidróxi-propilmetilcelulose, e/ou 35 polivinil-pirrolidona (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, tal como polivinil-pirrolidona de ligação cruzada, ágar, ácido alginico ou um sal relacionado tal como alginato de sódio. Os núcleos de drágeas são providos com coberturas adequadas. Para este propósito, podem ser usadas soluções de açúcar concentradas que podem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinil-pirrolidona, gel de carbopol, 5 polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos ou misturas de solvente satisfatórios. Podem ser acrescentados corantes ou pigmentos aos tabletes ou camadas de drágeas para identificação ou para caracterizar compostos diferentes com doses do composto ativo.

Preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de empurrar-encaixar feitas de gelatina, bem como cápsulas macias, seladas, feitas de gelatina e um plasticizante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de empurrar-encaixar podem conter os ingredientes ativos em admissão 15 com preenchedores tais como lactose, ligantes tais como gomas, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os compostos ativas podem ser dissolvidos ou suspensos em liquidos satisfatórios, tais como óleos graxos, parafina liquida, ou

polietileno glicol liquido. Além disso, podem ser adicionados estabilizadores. Todas as formulações para administração oral devem estar em dosagens satisfatórias para tal administração.

Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de tabletes ou pastilhas formuladas da maneira 25 convencional.

Para administração através de inalação, os compostos para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente distribuidos em uma forma de apresentação em spray de aerossol a partir de pacotes pressurizados ou de um 30 nebulizador, com o uso de um propelente satisfatório, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoro- etano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada provendo-se uma válvula para liberar uma quantidade medida.

Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador, podem ser formuladas contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido.

Mais adiante são descritas aqui várias composições farmacêuticas conhecidas na arte farmacêutica para 5 usos que incluem distribuição intra-ocular, intranasal, e intra- auricular. Penetrantes satisfatórios para estes usos são já geralmente conhecidos no estado da arte. Composições farmacêuticas para distribuição intra-ocular incluem soluções oftálmicas aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água, tal como colirio, ou em goma de gel (Shedden et al., Clin. Ther., 23(3):440-50 (2001)) ou hidrogéis (Mayer et al., Ophthalmologica, 210(2) :101-3 (1996)); ungüentos oftálmicos; suspensões oftálmicas, tais como micro-particulados, pequenas partículas poliméricas contendo droga que são suspensas em um meio carreador liquido (Joshi, A., J.Ocul. Pharmacol., 10(l):29-45 (1994)), formulações solúveis em lipidios (Aim et al., Prog. Clin. Biol. Res., 312:447-58 (1989)), e micro-esferas (Mordenti, Toxicol. Sei., 52(1):101-6 (1999)); e insertos oculares. Todas as referências acima mencionadas, estão aqui incorporadas como referência na sua totalidade. Tais 20 formulações farmacêuticas satisfatórias são freqüentemente e preferivelmente formuladas para serem estéreis, isotônicas e tamponadas para maior estabilidade e conforto. As composições farmacêuticas para distribuição intranasal também podem incluir gotas e sprays freqüentemente preparados para simular as secreções 25 nasais em muitos aspectos, para assegurar a manutenção da ação ciliar normal. Conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. Ed., Mack Publishing Cia., Easton, PA (1990) que é aqui incorporada como referência em sua totalidade, e é bem conhecida por aqueles qualificados na arte, formulações 30 satisfatórias são freqüentemente e preferivelmente isotônicas, ligeiramente tamponadas para manter um pH de 5,5 a 6,5, e freqüentemente e preferivelmente incluem preservativos antimicrobials e estabilizadores de droga apropriados. Formulações farmacêuticas para distribuição intra-auricular incluem suspensões e ungüentos para aplicação tópica ao ouvido. Solventes comuns para tais formulações auriculares incluem glicerina e água.

Os compostos também podem ser formulados em composições retais tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases para supositórios convencionais tal como manteiga de cacau ou outros glicérides.

Além das formulações previamente descritas compostos podem ser formulados também como uma preparação de deposição. Tais formulações de ação longa podem ser administradas através de implante (por exemplo subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por meio de injeção intramuscular. Assim, 10 por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos satisfatórios (por exemplo como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca de ions, ou como derivados solúveis para dispensar, por exemplo, como um sal solúvel para dispensar.

Para compostos hidrofóbicos, um carreador farmacêutico satisfatório pode ser um sistema de co-solvente compreendendo álcool de benzila, um surfactante não-polar, um polimero orgânico miscivel em água, e uma fase aquosa. Um sistema de co-solvente comum usado é o sistema de co-solvente VPD, que é 20 uma solução de 3% em peso/volume de álcool de benzila, 8% em peso/volume de surfactante não-polar Polisorbato 80®, e 65% em peso/volume de polietileno glicol 300, feita pelo volume de etanol absoluto. Naturalmente, as proporções de tal sistema de co- solvente pode variar consideravelmente sem alterar 25 significativamente suas características de solubilidade e toxicidade. Além do mais, a identidade dos componentes do co- solvente pode variar: por exemplo, outros surfactantes podem ser usados em vez de Polisorbato 80®; o tamanho de fração de polietileno glicol pode variar; outros polimeros bio-compativeis 30 podem substituir o polietileno glicol, por exemplo, polivinil pirrolidona; e outros açúcares ou polisacaridas podem substituir a dextrose.

Alternativamente, podem ser empregados outros sistemas de distribuição para compostos farmacêuticos hidrofóbicos. Liposomos e emulsões são exemplos bem conhecidos de veiculos de distribuição ou carreadores para drogas hidrofóbicas. Também podem ser empregados certos solventes orgânicos tal como sulfóxido de dimetila, embora normalmente às custas de uma maior toxicidade. Adicionalmente, os compostos podem ser distribuídos usando um sistema de liberação continua, como matrizes semi- permeáveis de polimeros hidrofóbicos sólidos contendo o agente terapêutico. Vários materiais de liberação continua foram estabelecidos e são bem conhecidos por aqueles qualificados na arte. Cápsulas de liberação continua podem, dependendo da sua natureza quimica, liberar os compostos durante algumas semanas e até por mais de 100 dias. Dependendo da natureza quimica e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, podem ser empregadas estratégias adicionais para estabilização de proteína.

Os agentes pretendidos podem ser administrados intracelularmente usando técnicas bem conhecidas daqueles com habilidades comuns na arte. Por exemplo, tais agentes podem ser encapsulados em liposomos. Todas as moléculas presentes em uma solução aquosa no momento da formação de liposomos são incorporadas no interior aquoso. Os conteúdos liposomais são ambos protegidos do micro-ambiente externo e, porque os liposomos se fundem com as membranas das células, eles são distribuídos 20 eficazmente no citoplasma das células. Os liposomos podem ser recobertos com um anti-corpo especifico ao tecido. Os liposomos serão visados e tomados seletivamente pelo órgão desejado. Alternativamente, pequenas moléculas orgânicas hidrofóbicas podem ser administradas diretamente intracelularmente.

Agentes terapêuticos ou de diagnóstico adicionais podem ser incorporados nas composições farmacêuticas.

Alternativamente ou adicionalmente, as composições farmacêuticas podem ser combinadas com outras composições contendo outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico.

Métodos de Administração

Os compostos ou composições farmacêuticas podem ser administrados ao paciente por qualquer meio satisfatório. Exemplos não limitativos de métodos de administração incluem, entre outros, (a) administração através de caminhos orais, cuja 35 administração inclui administração em cápsulas, tabletes, grânulos, sprays, xarope, ou outras formas; (b) administração por caminhos não-orais tais como retal, vaginal, intra-uretral, intra- ocular, intranasal, ou intra-auricular, cuja administração inclui a administração como uma suspensão aquosa, uma preparação oleosa ou similares, ou como uma goteira, spray, supositório, pomada, ungüento ou similares; (c) administração por injeção, subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, intradermalmente, intra-orbitalmente, intracapsularmente, intra-espinhalmente, intra-esternamente, ou similares, incluindo distribuição por bomba de infusão; (d) administração local tal como por injeção diretamente na área renal ou cardiaca, por exemplo, através de implantes de deposição; bem como (e) administração tópica; conforme julgado apropriado por aqueles com habilidade na arte, para colocar o composto da invenção em contato com o tecido vivo.

Composições farmacêuticas satisfatórias para administração incluem composições onde os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade efetiva para alcançar seu propósito planejado. A quantidade terapeuticamente efetiva dos compostos aqui descritos requerida como uma dose dependerá da rota de administração, do tipo de animal, incluindo humano, que é tratado, e das características fisicas do animal especifico em consideração. A dose pode ser ajustada para alcançar um efeito desejado, mas dependerá de fatores como peso, dieta, medicamentos simultâneos e outros fatores que aqueles qualificados nas artes médicas reconhecerão. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente efetiva significa uma quantidade de composto efetivo para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas da doença ou prolongar a sobrevivência do individuo tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva está bem dentro da capacidade daqueles qualificados na arte, especialmente levando-se em conta a descrição detalhada aqui provida.

Como será prontamente aparente para aquele qualificado na arte, o dosagem útil in vivo a ser administrada e o modo particular de administração variará, dependendo da idade, peso e espécie de mamifero tratado, dos compostos particulares empregados, e do uso especifico para o qual estes compostos são empregados. A determinação de niveis de dosagem efetivos, que são os niveis de dosagem necessários para alcançar o resultado desejado, pode ser realizada por aqueles qualificados na arte usando métodos farmacológicos rotineiros. Tipicamente, as aplicações clinicas humanas dos produtos começam a niveis mais baixos de dosagem, com o nivel de dosagem sendo aumentado até o 5 efeito desejado ser alcançado. Alternativamente, estudos in vitro aceitáveis podem ser usados para estabelecer as doses úteis e as rotas de administração das composições identificadas pelos presentes métodos usando métodos farmacológicos estabelecidos.

Em estudos de animais não-humanos, as aplicações 10 dos produtos potenciais começam em niveis de dosagem mais altos, com a dosagem sendo diminuida até que o efeito desejado já não seja mais alcançado ou que os efeitos colaterais adversos desapareçam. O dosagem pode variar amplamente, dependendo dos efeitos desejados e da indicação terapêutica. Tipicamente, a 15 dosagem pode estar entre aproximadamente 10 microgramas/kg e 100 mg/kg do peso do corpo, preferivelmente entre aproximadamente 100 microgramas/kg e 10 mg/kg do peso do corpo. Alternativamente as dosagens podem ser baseadas e calculadas pela área da superficie do paciente, como entendido por aqueles com habilidade na arte.

A formulação, rota de administração e dosagem exatas para uma composição farmacêutica da presente invenção podem ser escolhidas pelo médico individual visando a condição de um paciente. (Veja-se por exemplo, Fingi et al. 1975, em "The Pharmacological Basis of Therapeutics", que é aqui incorporada 25 como referência em sua totalidade, com referência particular ao Cap. 1 pág. 1). Tipicamente, a faixa de dose da composição administrada ao paciente pode ser de aproximadamente 0,5 a 1.000 mg/kg do peso do corpo do paciente. A dosagem pode ser única ou uma série de duas ou mais dadas no curso de um ou mais dias, 30 conforme necessário para o paciente. Em exemplos onde dosagens humanos para compostos foram estabelecidas para pelo menos alguma condição, a presente invenção usará essas mesmas dosagens, ou dosagens que estão entre aproximadamente 0,1% e 500%, mais preferivelmente entre aproximadamente 25% e 250% da dosagem humana 35 estabelecida. Onde nenhuma dosagem humana está estabelecida, como será o caso para compostos farmacêuticos recentemente descobertos, uma dosagem humana satisfatória pode ser deduzida dos valores de ED50 ou ID50, ou outros valores apropriados derivados de estudos in vitro ou in vivo, conforme qualificado por estudos de toxicidade e estudos de eficácia em animais.

Deve ser notado que o médico em assistência sabe como e quando terminar, interromper, ou ajustar a administração devido à toxicidade ou deficiências orgânicas dos órgãos. Reciprocamente, o médico em assistência também sabe ajustar o tratamento para niveis mais altos se a resposta clinica não for adequada (impedindo toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no gerenciamento da doença de interesse variará com a severidade da condição a ser tratada e com a rota de administração. A severidade da condição pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, através de métodos de avaliação de prognóstico padrão. Mais adiante, a dose e talvez freqüência da dose, também variará de acordo com a idade, peso do corpo, e resposta do paciente individual. Um programa comparável àquele discutido acima pode ser usado na medicina veterinária.

Embora a dosagem exato seja determinada em uma base de droga-por-droga, na maioria dos casos, podem ser feitas algumas generalizações relativas à dosagem. O regime de dosagem diária para um paciente adulto humano pode ser, por exemplo, de uma dose oral entre 0,1 mg e 2.000 mg de cada ingrediente ativo, preferivelmente entre 1 mg e 500 mg, por exemplo 5 a 200 mg. Em outras formas de incorporação, uma dose intravenosa, subcutânea, ou intramuscular de cada ingrediente ativo entre 0,01 mg e 100 mg, preferivelmente entre 0,1 mg e 60 mg, por exemplo 1 a 40 mg, é usada. Em casos de administração de um sal farmaceuticamente aceitável, a dosagem pode ser calculada em uma base livre. Em algumas formas de incorporação, a composição é administrada 1 a 4 vezes por dia. Alternativamente as composições da invenção podem ser administradas por infusão intravenosa continua, preferivelmente a uma dose de cada ingrediente ativo de até 1.000 mg por dia. Como será entendido por aqueles com habilidade na arte, em certas situações pode ser necessário administrar os compostos aqui descritos em quantidades que excedem, ou até mesmo excedem bastante, a faixa de dosagem preferida acima citada para tratar efetivamente e agressivamente doenças ou infecções particularmente agressivas. Em algumas formas de incorporação, os compostos serão administrados em um periodo de terapia continua, por exemplo durante uma semana ou mais, ou por meses ou anos.

A quantidade de dosagem e intervalos podem ser ajustados individualmente para prover niveis de plasma do meio ativo suficientes para manter os efeitos de modulação, ou a concentração minima efetiva (CME). A CME variará para cada composto mas pode ser calculada a partir de dados in vitro. A dosagem necessária para alcançar a CME dependerá de características individuais e da rota de administração. Porém, ensaios de CLAP ou bio-ensaios podem ser usados para determinar as concentrações de plasma.

Os intervalos de dosagem também podem ser determinados usando o valor de CME. As composições devem ser administradas usando um regime que mantém os niveis de plasma acima da CME por 10-90% do tempo, preferivelmente entre 30-90% e preferivelmente entre 50-90%.

Em casos de administração local ou absorção seletiva, a concentração local efetiva da droga pode não estar relacionada com a concentração de plasma.

A quantia de composição administrada vai, é claro, ser dependente do individuo sendo tratado, do peso do indivíduo, da severidade da aflição, da maneira de administração e do julgamento do médico em assistência.

Os compostos aqui descritos podem ser avaliados para a eficácia e toxicidade usando métodos conhecidos. Por exemplo, a toxicologia de um composto particular, ou de um subconjunto de compostos, compartilhando certos meios quimicos, pode ser estabelecida determinando-se a toxicidade in vitro para uma linhagem de células, tal como um linhagem de células de um mamifero, preferivelmente humano. Os resultados de tais estudos são frequentemente preditivos de toxicidade em animais, tal como dos mamiferos, ou mais especificamente, dos humanos. Alternativamente, a toxicidade de compostos particulares pode ser determinada em um modelo animal, tal como de ratos, camundongos, coelhos, ou macacos, usando métodos conhecidos. A eficácia de um composto particular pode ser estabelecida usando vários métodos “ Φ reconhecidos, tais como em métodos in vitro, modelos animais, ou experiências clinicas humanas. Existem modelos in vitro reconhecidos para quase toda classe de condição, incluindo, mas não limitando a, câncer, doenças cardiovasculares, e várias 5 deficiências imunológicas. Semelhantemente, modelos animais aceitáveis podem ser usados para estabelecer a eficácia de substâncias quimicas para tratar tais condições. Ao selecionar um modelo para determinar a eficácia, o artesão qualificado pode ser guiado pelo estado da arte para escolher um modelo apropriado, 10 dosagem, rota de administração, e regime. É claro que também podem ser usadas experiências clinicas humanas para determinar a eficácia de um composto em humanos.

As composições podem, se desejado, ser apresentadas em um pacote ou dispositivo dispensador que pode 15 conter uma ou mais unidades de dosagem de forma a conter o ingrediente ativo. O pacote pode incluir uma chapa de metal ou plástico, tal como um pacote bolha (blister), por exemplo. O pacote ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado por instruções de administração. O pacote ou dispensador também pode 20 ser acompanhado por uma notificação associada com o recipiente na forma prescrita por uma agência governamental regulado a fabricação, uso, ou venda de produtos farmacêuticos, tal notificação sendo refletiva da aprovação pela agência da forma da droga para administração humana ou veterinária. Por exemplo, tal 25 notificação pode ser a etiqueta aprovada pela agência norte- americana de Administração de Droga e Alimentos para prescrição da droga, ou o inserto do produto aprovado. Composições compreendendo um composto da invenção formuladas em um carreador farmacêutico compatível também podem ser preparadas, colocadas em um recipiente 30 apropriado, e rotuladas para o tratamento de uma condição indicada.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Procedimentos Gerais Cultura de célula e reagentes

Linhagens de células de MM MM.1S sensiveis a Dex e MM.1R resistentes a Dex foram obtidas do Dr. Steven Rosen (Northwestern University, Chicago, IL). Veja-se Moalli, P.A., Pillay, S., Weiner, D., Leikin, R. & Rosen, S.T. (1992) Blood, 79, 213-22 e Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002) Blood, 5 100, 2187-94; ambas sendo aqui incorporadas como referência na sua totalidade. Células RPMI-8226 e (Dox-40) resistentes a Doxorubicina (Dox) foram obtidas do Dr. William Dalton (Moffit Cancer Center, Tampa, FL) . Linhagens de células de MM U266 e OPM2 foram obtidas da Coleção de Cultura de Tipo Americana (ATCC - 10 American Type Culture Collection, Rockville, MD) . As linhagens de células de tumor humano DU 145, HT-29, Jurkat, LoVo, MDA-MB-231, MIA PaCa-2, NCI-H292, OVCAR-3, PANC-1, e PC-3 foram compradas da ATCC (Manassas, VA). As linhagens de células de MM cresceram em urn meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) 15 desativado por calor, 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina. As células de MM foram recentemente isoladas de pacientes com recaida depois de múltiplas terapias anteriores incluindo Dexametasona (Dex), melfalano, talidomida ou Bortezomiba. As células de MM foram purificadas a 20 partir de amostras da medula óssea de pacientes pelo método de seleção positiva CD138 usando Micro-Contas CD138 (Sindecano-1) e o separador de célula magnético Auto MACS (Miltenyi Biotec. Inc., Auburn, CA). Veja-se Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., 25 Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K. C. (2002) Blood, 100, 2187-94; que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. Fibroblastos de pele humana normal CCD-27sk foram obtidos da ATCC, e cresceram em DMEM suplementado com 10% de SBF desativado por calor, 100 unidades/ml de 30 penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 4 mM de L-glutamina e 1 mM de piruvato de sódio. As células foram tratadas com várias concentrações do composto da fórmula II (X = Cl) (Nereus Pharmaceuticals, Incorporação., San Diego, CA), Bortezomiba ou Dex (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Ensaios de apoptose e de viabilidade de célula

A viabilidade de célula foi avaliada por ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiozol-2-ila)-2,5-difeniltetrazolina (MTT; Chemicon International Inc., Temecula, CA) , de acordo com as instruções do fabricante (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), e como descrito em Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., 5 Richardson, P., Schlossman, R. L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002) Blood, 100, 2187-94; que é aqui incorporado como referência em sua totalidade. Foi utilizada detecção de morte de célula ELISAplus para quantificar a morte de células, conforme as instruções do fabricante (Roche Applied 10 Sciences, Indianapolis, IN).

Exemplo 2 - Ensaio de atividade de proteasoma 20S in vitro

A atividade do tipo químiotripsina do proteasoma 20S foi medida conforme descrito em Stein, R.L., Melandri, F. & 15 Dick, L. (1996) Biochemistry, 35, 3899-908 e Lightcap, E.S., McCormack, T.A., Pien, C.S., Chau, V., Adams, J. & Elliott, P.J. (2000) Clin. Chem. 46, 673-83; ambos estando aqui incorporadas como referência em sua totalidade. Os proteasomas 20S derivado de eritrócitos humanos purificados foram obtidos da Biomol, Plymouth 20 Meeting, PA. As atividades do proteasoma 20S do tipo químiotripsina, do tipo caspase e do tipo tripsina foram determinadas usando Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC (Boston Biochem, Cambridge, MA) e Boc-LRR-AMC (Bachem Bioscience, King of Prussia, PA) como substratos de peptida, respectivamente. A fluorescência 25 do substrato de peptida dividido foi medida usando um leitor de micro-placas Fluoroskan Ascent com 96 recipientes (Thermo Electron, Waltham, MA) . Os valores de EC50 foram calculados por Prisma (GraphPad Software) usando um modelo de declive variável, com resposta a dose sigmoidal. Os valores de EC50 foram definidos 30 como a concentração de droga na qual 50% da fluorescência máxima relativa é inibida. Os resultados, grafados na figura 1, indicaram que o composto da fórmula (II) (X = Cl) inibe todas as três atividades de proteasoma, embora com concentrações diferentes. Exemplo 3 - Análise da atividade de proteasoma 35 20S ex vivo em células de sangue inteiras em ratos (administração única i.v. ou oral)

Para determinar diretamente se o composto da fórmula (II) (X = Cl) inibe a atividade de proteasoma in vivo, o composto da fórmula (II) (X = Cl) foi dissolvido em 100% de DMSO e serialmente diluido com 5% de Solutol (Solutol® HS15; polietileno 5 glicol 660 12-hidróxi-estearato, BASF, Shreveport, LA) obtendo uma concentração final de 2% de DMSO. O controle de veiculo consistiu em 2% de DMSO e 98% de Solutol (5% de Solutol® HS15). Ratos machos Webster suiços (cinco por grupo, 20-25 gramas de peso) foram tratados na Bolder BioPATH, Inc. (Boulder, CO) com várias 10 concentrações do composto, intravenosamente ou oralmente, a um volume de 10 mL/kg. Um grupo de animais ficou sem tratamento para estabelecer uma linha-base da atividade de proteasoma. Noventa minutos depois da administração do composto, os animais foram anestesiados e foi retirado sangue através de uma punção cardiaca.

As células de sangue inteiras empacotadas foram coletadas por centrifugação, lavadas com STF, e congeladas em gelo seco para determinação da atividade de proteasoma ex vivo. A atividade do tipo químiotripsina da proteasoma 20S em lisados de células brancas de sangue (CBS) foi determinada usando o substrato de 20 peptida suc-LLVY-AMC. As Unidades de Fluorescência Relativa (UFR) foram normalizadas usando as concentrações de proteina dos lisados de célula. A atividade de proteasoma 20S dos ratos individuais é mostrada na figura 2 com a barra horizontal representando a atividade média. A linha-base representa a atividade de proteasoma S observada em lisados de CBS preparados de ratos sem tratamento. Os resultados, descritos na figura 2, indicam que o composto da fórmula (II) (X = Cl) inibe a atividade do tipo químiotripsina de proteasoma 20S em células brancas de sangue de uma maneira dependente da dose. Importante, estes achados 30 estabelem que o composto é ativo oralmente e inibe a atividade de proteasoma in vivo.

Exemplo 4 - Determinação de alterações ativadas na atividade de proteasoma em células de MM (in vitro)

A determinação sobre se o composto da fórmula II 35 (X = Cl) afeta a atividade de proteasoma em células de mieloma múltiplo in vitro foi feita usando uma experiência de competição com AdaY (Iz5I) ahx3L3VS. Neste ensaio, os locais que não são visados pelo composto da fórmula II (X = Cl) são rotulados por AdaY (123I) ahx3L3VS e visualizados por auto-radiografia, enquanto os locais que são visados pelo composto da fórmula II (X = Cl) não podem ser vistos no auto-radiograma. Células de MM MM.1S foram incubadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (7 nM) por 30 min, 1 h, 3h, ou 6h, e a lise de célula foi executada com contas de vidro. 60 μg de extratos de proteina foram incubados por 2h com o inibidor de proteasoma iodinado AdaY (125I) ahx3L3VS a 37 °C. As proteinas foram então desnaturadas por fervura reduzindo-se em tamponante de amostra e separadas em um 12,5% de gel SDS-PAGE, seguido por auto-radiografia. Como pode ser visto na figura 3, a sub-unidade beta-5 (β—5) do proteasoma está notadamente menos rotulada pelo AdaY (125I) ahx3L3VS nas células tratadas do que nas células de controle. Dado que a sub-unidade beta-5 medeia a atividade do tipo químiotripsina, estes resultados sugerem que o composto da fórmula (II) (X = Cl) se liga à sub-unidade beta-5, inibindo assim a atividade do tipo químiotripsina em células MM.1S. Além disso, o tratamento de células MM.1S com o composto (7 nM) por 6h também diminuiu a rotulação das sub-unidades β-2 (atividade triptica) e as sub-unidades β-1 (atividade do tipo caspase) (dados não mostrados).

Exemplo 5 - Determinação de alterações ativadas na atividade de proteasoma em células de MM (in vivo)

A determinação in vivo da atividade de proteasoma foi conduzida usando uma experiência de competição com Dansyl- AhX3L3VS, que modifica covalentemente todas as sub-unidades de proteasoma ativas. Este inibidor contém um hapteno de hexanoila de sulfonamida de dansyl que pode ser visualizado por imuno- tingimento usando anti-corpos contra o meio de dansyl. As células MM.1S foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (7 nM) por 30 min, 1 h, ou 3h, seguido por incubação de 1 h com 5 μM de Dansyl-Ahx3L3VS a 37 °C. As células foram lisadas por incubação por 30 min em tamponante de lise NP-40 (50 mM de Tris-HCl, pH = 8,0, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40), seguido por 5 min de centrifugação para remover frações de membrana, núcleos, e restos de células. 60 μg de extrato de proteina forma separados por 12,5% de gel SDS-PAGE, seguido por análise de imuno-tingimento usando policlonal anti-dansyl policlonal Ab (1:7500, coelho, Molecular Probes) e peroxidase de horseradish acoplada com anti-corpo secundário anti-coelho de cabra (Southern Biotech). As manchas foram desenvolvidas por quimio-luminescêcia aumentada (Western 5 Lightning, Perkin-Elmer). Como pode ser visto na figura 4, o tratamento de células MM.1S com o composto da fórmula (II) (X = Cl) diminui a rotulaçâo de Dansyl-Ahx3L3VS das sub-unidades β-5. Além disso, o composto também diminuiu a rotulaçâo de Dansyl- Ahx3L3VS das sub-unidades β-1 e β-2, embora com concentrações mais 10 altas: 1 nM e 20 nM, respectivamente. Em contraste, o tratamento de células MM.1S com doses ainda mais altas de Bortezomiba não inibe as sub-unidades β-2 (dados não mostrados). Tomados juntos, estes achados demonstram a habilidade do composto da fórmula (II) (X = Cl) em inibir todas as três atividades de proteasoma em 15 células de MM.

Exemplo 6 - Efeito da viabilidade de células de MM

A viabilidade de célula foi avaliada por ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiozol-2-ila) -2,5-difeniltetrazolina 20 (MTT; Chemicon International Inc., Temecula, CA), de acordo com as instruções do fabricante (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), e como descrito em Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R. L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002) Blood, 100, 2187-94; que é aqui incorporado como referência em sua totalidade. A viabilidade de célula depois do tratamento de células MM.1S (-■-), MM.1R resistentes a Dex (-□-), RPMI-8226 (-•-), Dox-40 resistentes a Doxorubicina (-♦-) , OPM2 (-O-) , e U266 (-0-) com o composto da fórmula (II) (X = Cl) durante 24h é ilustrada na figura 5A. Os resultados são a média ± D.P. de três experiências independentes (P < 0,005; n = 3 para todas as linhagens de célula). Uma diminuição significativa dependente da dose na viabilidade de célula em todas as linhagens de células foi observada (IC50 variando de 7 a 24 nM).

A viabilidade de célula também foi avaliada em células de MM purificadas de pacientes. Células de tumor de MM recentemente isoladas de nove pacientes com recaida depois de múltiplas terapias anteriores incluindo Dex, Bortezomiba, e talidomida foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (10 nM) por 24 h e analisadas para apoptose. Como visto na figura 5 5B, uma apoptose significativa foi observada nestas células conforme medido por ensaios de fragmentação de DNA (P < 0,005; n = 2). Os valores grafados são a média ± D.P. de amostras em triplicata. Importante, 4 de 9 pacientes examinados eram refratários à terapia com Bortezomiba, e 5 pacientes eram resistentes à terapias com Talidomida e Dex. Estes dados sugerem que 1) o composto da fórmula (II) (X = Cl) induz apoptose em células de MM sensiveis e resistentes a terapias convencionais e com Bortezomiba; e 2) o IC50 do composto para células de MM está dentro da concentração nanomolar.

Exemplo 7 - Efeito da viabilidade de Células Estromais da Medula Óssea (CEMO)

As células de MM se localizam predominantemente no micro-ambiente da medula óssea e sua interação com as CEMO induz a produção de citoquinas que medeiam o crescimento de 20 células de MM, bem como também protegem contra apoptose induzida por droga. Veja-se Anderson, K.C. (2003) Cancer 97, 796-801; que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. Então, o efeito do composto da fórmula (II) (X = Cl) em cinco CEMO derivadas de MM de pacientes foi determinado. Como visto na figura 25 6, o tratamento de CEMO (Paciente #1-5) com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (20 nM) por 24h não induz apoptose nestas células, como comprovado pelo ensaio de fragmentação de DNA. O controle positivo mostrado é um controle interno para o ensaio. As células de MM purificadas (CD138 + ) de dois dos cinco pacientes com MM 30 também foram examinadas dentro das mesmas experiências. Os resultados são a média ± D.P. de amostras em triplicata. O composto ativou um significativo aumento (10-12 vezes) na apoptose de células de MM purificadas (CD138-positivo) dos pacientes. Estes resultados sugerem que o composto da fórmula (II) (X = Cl) age 35 diretamente nas células de MM, mas não nas CEMO.

Exemplo 8 - Efeito anti-apoptótico da interleucina-6 recombinante humana (ILrh-6) e do fator-I de crescimento da insulina recombinante humana (FCrhI-I)

A adesão de células de MM às CEMO induz secreção 5 de IL-6 e FCI-I a partir das CEMO, que não só regula o crescimento das células de MM mas também protege contra a quimioterapia. Veja- se Hardin, J., MacLeod, S., Grigorieva, I., Chang, R., Barlogie, B., Xiao, H. & Epstein, J. (1994) Blood, 84, 3063-70 e Chauhan, D., Kharbanda, S., Ogata, A., Urashima, M., Teoh, G., Robertson, M., Kufe, D.W. & Anderson, K.C. (1997) Blood, 89, 227-234; ambas estando aqui incorporadas como referência em sua totalidade. Assim, foi avaliado se ILrh-6 ou FCrhl-I inibe apoptose em células de MM induzida pelo composto da fórmula (II) (X = Cl). Células MM.1S foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (7 15 nM) ou Dex (0,5 μM) por 24h, na presença e ausência de ILrh-6 (10 ng/ml) ou FCrhl (50 ng/ml) . Com 24h as células foram colhidas e a viabilidade foi analisada por ensaios MTT. Como visto na figura 7, a viabilidade de célula mediana foi de 47 ± 2,3% depois do tratamento com o composto sozinho; 51,2 ± 3,2% com o composto + ILrh-6 (P = 0,26, teste de Wilcoxon), e 50,3% ± 2,0% com o composto + FCrhl-I (P = 0,28). A viabilidade mediana foi de 51 ± 2,1% depois do tratamento com Dex e 92 ± 5,5% para Dex + ILrh-6 (P = 0,05, conforme determinado pelo teste de soma de classificação de Wilcoxon unilateral). Os resultados são a média ± D.P. de três experiências independentes. Estes achados sugerem que nem IL-6 nem FCI-I bloqueiam a atividade anti-MM do composto da fórmula (II) (X = Cl). Em contraste, e como em outros estudos, ambos IL-6 e FCI-I bloqueiam a viabilidade de células MM.1S diminuida induzida por Dex. Veja-se Chauhan, D., Hideshima, T. & Anderson, K.C. (2003) Int. J. Hematol. 78, 114-20 e Mitsiades, C.S., Mitsiades, N., Poulaki, V., Schlossman, R., Akiyama, M., Chauhan, D., Hideshima, T., Treon, S.P., Munshi, N.C, Richardson, P.G. & Anderson, K.C. (2002) Oncogene, 21, 5673-83; ambas aqui incorporadas como referência na sua totalidade. Assim, os dados sugerem que o composto da fórmula (II) (X = Cl) supera o crescimento e os efeitos protetores de IL-6 e FCI-I em células de MM, e indica mecanismos distintos de ação para o composto e Dex contra células de MM. Os relatos de que altos niveis de soro de IL-6 contribuem para a quimio-resistênia clinica e para a falha do tratamento, juntou com a habilidade do composto da fórmula (II) (X = Cl) em 5 induzir apoptose de células de MM mesmo na presença de IL-6 ou de FCI-I, sugerem que o composto pode superar a resistência a drogas em pacientes com MM avançado. Veja-se Kyrstsonis, M.C, Dedoussis, G., Baxevanis, C, Stamatelou, M. & Maniatis, A. (1996) Br. J. Haematol. 92, 420-422; que é aqui incorporado como referência em 10 sua totalidade.

Exemplo 9 - Efeito na migração de células de MM induzida por fator de crescimento endotelial vascular (FCEV)

O FCEV é elevado no micro-ambiente da medula óssea e ativa a migração, crescimento, e angiogênese em células de 15 MM. Veja-se Podar, K., Tai, Y. T., Lin, B.K., Narsimhan, R.P., Sattler, M., Kijima, T., Salgia, R., Gupta, D., Chauhan, D. & Anderson, K.C. (2002) J. Biol. Chem. 277, 7875-81; que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. Assim, foi avaliado se o composto da fórmula (II) (X = Cl) altera a migração induzida 20 por FCEV de células de MM. A migração induzida por FCEV foi examinada na presença ou ausência do composto (7 ou 10 nM) . A migração de célula foi analisada como previamente descrito em Podar, K., Tai, Y.T., Davies, F.E., Lentzsch, S., Sattler, M., Hideshima, T., Lin, B. K., Gupta, D., Shima, Y., Chauhan, D., Mitsiades, C, Raje, N., Richardson, P. & Anderson, K.C. (2001) Blood, 98, 428-35; que é aqui incorporado como referência em sua totalidade. Como mostrado na figura 8, o composto da fórmula (II) (X = Cl) diminui significativamente (P < 0,05) a migração de células de MM MM.1S induzida por FCEV. Estes achados indicam que o 30 composto pode regular negativamente o caminho de volta das células de MM par a medula óssea e o seu egresso ao sangue periférico.

Exemplo 10

Efeito nos efeitos protetores mediados por Bcl2 Bcl2 confere resistência a terapias convencionais 35 em células de câncer, incluindo de MM. Veja-se Cory, S. & Adams, J.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2, 647-56 e Gazitt, Y., Fey, V., Thomas, C. & Alvarez, R. (1998) Int. J. Oncol. 13, 397-405; ambas aqui incorporadas como referência em sua totalidade. Bcl2 pode atenuar modestamente a apoptose induzida por Bortezomiba. Assim, foi avaliado se a expressão ectópica de Bcl2 em células MM.1S afeta a responsividade ao composto da fórmula (II) (X = Cl) . As células MM.IS foram transfectadas estavelmente com Bcl2 construído e analisadas para alterações de viabilidade de célula usando um ensaio MTT. Como visto na figura 9, o composto da fórmula (II) (X = Cl) diminui significativamente a viabilidade de célula das células MM.1S transfectadas por Bcl2 (P < 0,005) de uma maneira dependente da dose. No entanto, o composto induziu 15 ± 1,1% menos morte de célula nas células transfectadas por Bcl2 comparado às células MM.1S vazias transfectadas por vetor. Os resultados são a média ± D.P. de três experiências independentes. Estes achados sugerem que o composto pode superar a proteção mediada por Bcl2.

Exemplo 11

Avaliação in vivo no modelo de tumor de murina Ratos bege-nus-xid (BNX) triplamente imuno- deficientes com seis semanas de idade foram obtidos do Centro Frederick de Desenvolvimento e Pesquisa de Câncer (Frederick, MD).

Todos os estudos animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Câncer Dana- Farber. Os ratos foram observados diariamente para sinais de toxicidade. A hemorragia terminal foi feita sob anestesia usando inalação de isoflourano, e os animais foram sacrificados através de asfixia com CO2. Par determinar a atividade anti-MM in vivo do composto da fórmula (II) (X = Cl), 21 ratos BNX foram inoculados subcutaneamente no flanco com 3 x 107 células de MM RPMI 8226 em 100 μl de um meio RPMI-1640. Quando os tumores ficaram mensuráveis, os ratos foram designados para grupos de tratamento recebendo o composto da fórmula (II) (X = Cl), 0,25 mg/kg (n = 7), 0,5 mg/kg (n = 7), ou para grupos de controle (n = 7) recebendo apenas o veiculo. O tratamento da droga começou depois do desenvolvimento do tumor mensurável. A droga (0,25 mg/kg ou 0,5 mg/kg) foi dado oralmente duas vezes por semana. Medições seriais dos diâmetros perpendiculares foram feitas com calibrador a cada dois dias para calcular o volume do tumor, usando a seguinte fórmula: 4/24 x (diâmetro mais curto)2 x (diâmetro mais longo). Os animais eram sacrificados se o tumor fosse > 2 cm ou necrótico.

Para estudos de crescimento de tumor, 7 ratos foram usados em cada grupo.

Como visto nas figuras 10A-C, o tratamento de ratos portando tumor com o composto da fórmula (II) (X = Cl), mas não com o veiculo sozinho, inibiu significativamente o crescimento de tumor de MM e prolongou a sobrevivência destes ratos. Todos os ratos no grupo de controle desenvolveram tumores progressivos, considerando que a regressão completa dos tumores foi observada em 70% dos ratos tratados. O rato no painel superior da Figura 10B recebeu doses orais somente de veiculo, considerando que o rato no painel inferior recebeu o composto da fórmula (II) (X = Cl) (0,25 mg/kg). Os painéis esquerdos na figura 10B são ampliações de plasmacitomas subcutâneos crescendo nos flancos direitos dos ratos. A sobrevivência foi avaliada a partir do primeiro dia de tratamento até a morte; os ratos foram sacrificados quando os diâmetros dos tumores alcançaram 2 cm ou eles se tornaram moribundos (figura 10C). Além disso, nenhuma mudança de comportamento neurológica foi observada mesmo depois de 12 semanas de tratamento. As concentrações do composto administrado foram bem toleradas pelos ratos, sem evidência de perda de peso. Os ratos em ambos grupos sem tratamento e tratados foram pesados a cada semana. As mudanças médias no peso do corpo dos ratos são mostradas na figura 10D.

A análise no dia 300 mostrou nenhum retorno de tumor em 57% dos ratos tratados com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (figura 10C). Além do mais, a análise histológica executada nos locais de inoculação confirmou o desaparecimento das células de plasma no composto da fórmula (II) (X = Cl) versus os ratos tratados com veiculo (figura 10E, painéis esquerdo e direito, respectivamente). Estes dados mostram que o composto é oralmente ativo; inibe o crescimento de tumor de MM in vivo; e prolonga a sobrevivência.

Exemplo 12 - análise Comparativa da atividade anti-tumor in vivo Para comparar a atividade in vivo do composto da fórmula (II) e da Bortezomiba, os modelos de ratos conforme descrito acima foram tratados com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (0,15 mg/kg i.v.) ou Bortezomiba (1,0 mg/kg i.v.) duas vezes por semana. Ambos os agentes reduziram significativamente a progressão de tumor (p < 0,01) e prolongaram a sobrevivência (p = 5 0,0137) (figuras 10F e 10G).

Exemplo 13 - Mecanismos que medeiam a atividade anti-MM

Os mitocôndrios cumprem um papel critico na indução de apoptose durante tensão (stress) . Veja-se Bossy-Wetzel, 10 E. & Verde, D.R. (1999) Mutat. Res. 434, 243-51 e Chauhan, D. & Anderson, K.C. (2003) Apoptose 8, 337-43; ambas aqui incorporadas como referência na sua totalidade. Células MM.1S privadas de soro foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (7 nM) por 12h e incubadas com CMXRos durante os últimos 20 min; tingidas com 15 corante catiônico lipofilico CMXRos (Mitotracker Red) (Molecular Probes, Eugene, OR) em salina tamponada com fosfato (STF) por 20 min a 37 °C; e analisadas por citometria de fluxo para analisar as alterações em ΔTm (potencial de membrana mitocondrial). A produção de super-óxido (O2) foi medida tingindo-se as células com corante 20 permeável à membrana di-hidro-etidio (HE) durante os últimos 15 min. Os ânions de super-óxido oxidam o HE para etidio fluorescente, permitindo a análise através de citometria de fluxo.

Como visto nas figuras 11A e 11B, o composto da fórmula (II) (X = Cl) diminui o ATm, comprovado por um número aumentado de células negativas CMXRos (P < 0,005, n = 2) , e ativa a produção de O2 em células MM.1S. Os resultados são a média ± D.P. de duas experiências independentes. As alterações em ΔTm estão associadas com a liberação de proteinas mitocondriais cito-c e Same para o citosol, ativando assim a caspase 9 e a caspase-3. Veja-se Du, C, Fang, M., Li, Y., Li, L. & Wang, X. (2000) Cell 102, 33-42 e Liu, X., Naekyung Kim, C, Yang, J., Jemmerson, R. & Wang, X. (1996) Cell 86, 147-157; ambas aqui incorporadas como referência em sua totalidade.

Como visto na figura 11C, o tratamento de células 35 MM.1S com o composto de fórmula (II) (X = Cl) dispara uma diminuição em cito-c (painel superior, esquerdo) e em Same mitocondriais (painel superior, direito) , e um aumento simultâneo destas proteínas nas frações citosólicas (painéis do meio, da esquerda e direito, respectivamente). Re-provando as imuno-manchas com anti-Hsp60 (painel esquerdo, inferior) e com anti-tubulina (painel direito, inferior), Abs confirma a pureza dos extratos mitocondriais e da carga igual de proteínas. A liberação de proteínas cito-c e Samc/DIABLO apoptogênicas mitocondriais induz a ativação de caspase-9 e caspase-3. As células MM.1S foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (7 nM) por 24h e colhidas; as frações de proteína mitocondriais e citosólicas foram separadas por 12,5% de SDS-PAGE e analisadas através de imuno-tingimento com anti-cito-c (painel superior) ou anti-Samc (painel do meio) Abs. Como um controle para carga igual de proteínas e pureza das frações mitocondriais, os filtros também foram re-provados com anti-tubulina (painel inferior direito) e anti-Hsp60 Abs (painel inferior esquerdo), respectivamente. As manchas são representativas de três experiências independentes. Células MM.1S foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (7 nM) por 24h e colhidas; as proteínas citosólicas foram separadas por 12,5% de SDS-PAGE e analisadas 20 através de imuno-tingimento com anti-caspase-8 Abs e anti-caspase- 9 Abs. Como visto na figura 11D, o tratamento de células MM.1S com o composto da fórmula (II) (X = Cl) induz a divisão proteolítica de caspase-9. Além disso, o composto também ativa a caspase-8 (figura 11E) . Ambas a caspase-9 (dependente de mitocôndrios) e a 25 caspase-8 (independente de mitocôndrios) são conhecidas por dividir proteoliticamente e ativar um agente comum de capsase-3 mais adiante, resultando em divisão de PARP. Veja-se Miller, L.K. (1999) Trends. Cell. Biol. 9, 323-8; que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. Assim, as células de MM MM.1S ou MM.1R foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (7 nM) por 24h e avaliados para ensaios de apoptose por PARP e de divisão de caspase-3. Os lisados de proteína totais foram sujeitos à análise de SDS-PAGE. A análise de imuno-tingimento dos lisados foi executada com anti-PARP (painel superior) ou anti-caspase-3 (painel inferior) Abs. 'CC indica 'comprimento completo' e 'FD' denota fragmento dividido. Estes dados mostram que o composto da fórmula (II) (X = Cl) ativa a caspase-3 e a divisão de PARP (figura 11F).

A análise de imuno-tingimento foi executada usando anti-corpos para citocromo-c, Same, Caspase-8, -9, ou -3 (Cell Signaling, Beverly, MA), tubulina (Sigma, St. Louis, MO), PARP, HspôO, ou Bax (BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA) . As manchas foram desenvolvidas através de quimio-luminescência aumentada (QLA; Amersham, Arlington Heights, IL). Exemplo 14 — Diferenças mecanísticas da apoptose de células de MM comparado a Bortezomiba Células MM.1S foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) ou Bortezomiba na presença ou ausência de inibidor de caspase-9 (LEHD-FMK), inibidor de caspase-8 (IETD-fmk) ou inibidor de caspase-3 (Z-Val-Ala-Asp-fluorometilquetona, z-VAD - fmk) . Como visto na figura 12A, a inibição de caspase-3 ab-roga notadamente o composto da fórmula (II) (X = Cl) e a apoptose induzida por Bortezomiba. Os resultados são a média ± D.P. de quatro experiências independentes (P < 0,004). O bloqueio de caspase-8 levou a uma diminuição significativa da morte de células 20 ativada pelo composto da fórmula (II) (X = Cl) (P < 0,005, n = 4), considerando que a inibição de caspase-9 somente bloqueou moderadamente a viabilidade diminuida em células MM.1S ativadas pelo composto. Em contraste, a diminuição induzida por Bortezomiba na viabilidade de células MM.1S é similarmente bloqueada na 25 presença de caspase-8 ou de inibidor de caspase-9 (P < 0,005). Juntos, estes dados sugerem que a ativação de caspase-8 e de caspase-9 contribuem igualmente durante a morte de células ativada por Bortezomiba, considerando que a apoptose disparada pelo composto da fórmula (II) (X = Cl) procede principalmente por meio 30 do caminho de sinalização de caspase-8.

Estes dados bioquímicos foram confirmados por estudos genéticos usando estratégias negativo-dominantes (ND). As células MM.1S também foram transfectadas transientemente usando o kit V de linhagem de células Nucleofecto, de acordo com as instruções do fabricante (Amaxa Biosystems, Alemanha), com o vetor sozinho, ND-caspase-8, ND-caspase-9, ou ND-DMAF e co-transfectadas com o vetor contendo proteina de fluorescência verde (PFV) sozinha. Depois das transfecções, as células de PFV-positivas foram selecionadas através de citometria de fluxo, tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) ou Bortezomiba, e analisadas para viabilidade. 0 tratamento de células de MM transfectadas por 5 ND-caspase-8 com o composto da fórmula (II) (X = Cl) (IC50, 7 nM) notadamente aumentou a sobrevivência destas células, comparado às células transfectadas com ND-caspase-9 (figura 12B). Em contraste, o tratamento de células MM.1S tranfectadas tanto por ND-caspase-8 como por ND-caspase-9 com Bortezomiba (IC50, 5 nM) aumentou a sobrevivência em uma extensão semelhante. A especificidade funcional de ND-caspase-8 e ND-caspase-9 foi confirmada pelo tratamento de células MM.1S com indutores conhecidos de caspase-9 (Dex) e caspase-8 nestas células (anti-Fas MoAb) (Chauhan et al., 1997) (figura 12C). Estes dados sugerem que (1) a apoptose de células de MM induzida pelo composto da fórmula (II) (X = Cl) é mediada predominantemente por caspase-8; e (2) a apoptose induzida por Bortezomiba requer caspase-8 e a ativação de caspase-9.

Depois foi determinado se a inibição de um caminho anterior de sinalização que leva à ativação de caspase-8 afeta a resposta ao composto da fórmula (II) (X = Cl) ou da Bortezomiba. A proteina de dominio de morte associado com Fas (DMAF) é uma parte importante dos complexos de sinalização de indução de morte (CSIM) que surgem no engajamento dos membros da familia do receptor de TNF, tal como Fas, resultando em processamento proteolitico e auto-ativação de pró-caspase-8. Uma vez que ambos o composto da fórmula (II) (X = Cl) e a Bortezomiba disparam a ativação de caspase-8, o papel da DMAF durante este evento em células de MM foi avaliado usando ND-DMAF. O bloqueio de DMAF com ND-DMAF atenuou significativamente a citotoxicidade induzida pelo composto da fórmula (II) (X = Cl) comparado às células MM.1S transfectadas pelo vetor vazio (42% ± 2,0% de células viáveis nas células transfectadas pelo vetor versus 76% ± 5,1% de células viáveis em células transfectadas por ND-DMAF; p < 0,05) (figura 12D). A ND-DMAF diminuiu a ativação de caspase-8 induzida pelo composto da fórmula (II) (X = Cl) ; porém, uma ativação minima de caspase-8 ainda foi notada (dados não mostrados), que pode ser devido a ativadores anteriores de caspase-8 diferentes de DMAF. Importante, o tratamento de células MM.IS transfectadas por ND-DMAF com Bortezomiba resultou apenas em um aumento de 16% na sobrevivência comparado às células transfectadas por vetor (39% ± 2,4% de células viáveis nas células 5 transfectadas por vetor versus 55% ± 4,1% de células viáveis em células transfectadas por ND-DMAF; p < 0,05) (figura 12D). Estes dados, juntou com os estudos de inibição de caspase-8 ou de caspase-9, sugerem que o composto da fórmula (II) se apóia mais no eixo de sinalização de caspase-8 por DMAF do que a Bortezomiba, 10 confirmando o mecanismo diferencial de ação do composto da fórmula (II) versus Bortezomiba em células de MM.

Estudos prévios estabeleceram que Bax induz o caminho apoptótico mitocondrial. Veja-se Wei, M. C, Zong, W.X., Cheng, E.H., Lindsten, T., Panoutsakopoulou, V., Ross, A.J., Roth, 15 K.A., MacGregor, G.R., Thompson, C.B. & Korsmeyer, S.J. (2001)

Science 292, 727-30 e Lei, K., Nimnual, A., Zong, W.X., Kennedy, N.J., Flavell, R.A., Thompson, C.B., Barra-Sagi, D. & Davis, R.J. (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 4929-42; ambas aqui incorporadas como referência em sua totalidade. Assim, foi avaliado se a apoptose de 20 células de MM induzida pelo composto da fórmula (II) (X = Cl) se correlata com alterações em Bax. As células de MM MM.1S foram tratadas com o composto da fórmula (II) (X = Cl) ou com Bortezomiba e extratos de proteina mitocondrial foram sujeitos à análise de imuno-tingimento com anti-Bax ou anti-Hsp60 Abs. Como 25 visto na figura 12E, o composto da fórmula (II) (X = Cl) induz pouco, se houver, aumento nos niveis de Bax nos mitocôndrios. As manchas são os representativas de três experiências independentes. Importante, a Bortezomiba ativa um acúmulo significativo de Bax nos mitocôndrios.

Os fibroblastos embrionários de rato (FER) portando Bax do tipo selvagem ou desativadores foram tratados com o composto da fórmula (II) (X = Cl) ou Bortezomiba por 48h e analisados para viabilidade de célula através de ensaios MTT. Como visto na figura 12F, o composto da fórmula (II) (X = Cl) diminui a 35 viabilidade tanto em Bax (tipo selvagem) e Bax (desativadores) , considerando que o apagamento de Bax confere resistência significativa á Bortezomiba. Os resultados são a média ± D.P. de três experiências independentes (P < 0,05). Estes dados mostram a exigência diferencial de Bax durante apoptose induzida pelo composto da fórmula (II) (X = Cl) e pela Bortezomiba e sugerem o mecanismo distinto de ação destes agentes.

Exemplo 15 - Efeitos diferenciais em linfócitos normais comparado com a Bortezomiba

A terapia de Bortezomiba é associada com a toxicidade em pacientes. Assim, os efeitos do composto da fórmula (II) (X = Cl) e da Bortezomiba em células normais foi comparado.

Linfócitos de cinco doadores saudáveis foram tratados com várias concentrações (0-20 nM) do composto da fórmula (II) (X = Cl) ou com Bortezomiba (0-20 nM) por 72h e analisados para citotoxicidade por ensaios MTT. Como visto na figura 13, o composto da fórmula (II) (X = Cl) não diminui significativamente a sobrevivência de linfócitos normais (P = 0,27 pelo teste de tendência J-T), mesmo com doses mais altas (20 nM) . Os resultados são a média ± D.P. de três experiências independentes. Em contraste, a Bortezomiba diminui significativamente a viabilidade de linfócitos mesmo a concentrações mais baixas de 6-10 nM. De nota, o IC50 de células de MM de pacientes é alcançado a concentrações do composto da fórmula (II) (X = Cl) que não tem nenhum efeito nos linfócitos normais, considerando que o IC50 da Bortezomiba para células de MM ativa 50% de diminuição na viabilidade dos linfócitos normais. Junto, estes dados sugerem que o composto da fórmula (II) (X = Cl) tem atividade seletiva anti-MM; e particularmente, é menos tóxico às células normais que a Bortezomiba.

Foi também examinado se o composto da fórmula (II) ou a Bortezomiba alteram a atividade de proteasoma em linfócitos normais e fibroblastos de pele. Ambos o composto da fórmula (II) (X = Cl) e a Bortezomiba inibiram significativamente a atividade de proteasoma nestas células; 20 nM do composto da fórmula (II) (X = Cl) ou de Bortezomiba ativaram 99% ou 59 ± 11% de inibição da atividade do tipo quimiotripsina de proteasoma, respectivamente (dados não mostrados). Assim, embora 20 nM do composto da fórmula (II) (X = Cl) não ativem uma citotoxicidade significativa em linfócitos normais, eles reduzem a atividade de proteasoma do tipo quimiotripsina nestas células. Semelhantemente, o tratamento de fibroblastos CCD-27sk normais no IC50 para o composto da fórmula (II) (X = Cl) (317 nM) ou Bortezomiba (15 nM) também inibiu a atividade de proteasoma (dados não mostrados).

Exemplo 16 - Efeitos diferenciais em células de MM de super-expressão de Bcl-2 comparado à Bortezomiba

Durante apoptose Bax neutraliza a função anti- apoptótica de Bcl-2, facilitando assim a liberação de cito-c e a ativação de caspase-9. Bcl-2 também confere resistência à droga em células de câncer, incluindo MM, e provê proteção parcial contra a morte induzida por Bortezomiba. Então, foi avaliado se a expressão ectópica de Bcl-2 em células MM.1S afeta a habilidade do composto da fórmula (II) ou da Bortezomiba em ativar a citotoxicidade e a sinalização apoptótica pós-mitocondrial em células de MM. A super- expressão de Bcl-2 promoveu um aumento modesto na viabilidade de células tratadas com ambos os agentes: para o composto da fórmula (II) (X = Cl), 50% ± 2,6% de viabilidade nas células transfectadas por Bcl-2 versus 39% ± 1,5% de viabilidade nas células transfectadas por vetor (p < 0,05); e para a Bortezomiba, 61% ± 2,9% de viabilidade nas células transfectadas por Bcl-2 versus 40% ± 2,1% de viabilidade nas células transfectadas por vetor (p < 0,05) (figura 14A). A sobrevivência aumentada dos transfectantes Bcl-2 em resposta à Bortezomiba foi maior (21%) do que aquela em resposta ao composto de fórmula (II) (X = Cl) (11%) (p < 0,04; n = 3) (figura 14A). Além disso, a Bortezomiba ativou uma divisão significativa de caspase-9 nas células de controle transfectadas por vetor, que é notadamente atenuada (diminuição de 3 vezes por densitometria) em células transfectadas por Bcl-2; em contraste, a divisão de caspase-9 induzida pelo composto da fórmula (II) (X = Cl) é minimamente afetada pela super-expressão de Bcl-2 (figura 14B). Estes achados, junto com os resultados de viabilidade, sugerem que Bcl-2 provê mais proteção contra a Bortezomiba do que o composto da fórmula (II).

Exemplo 17 - Tratamento em Combinação

Como visto na figura 15, o tratamento de células de MM MM.1S ou MM.1R com o composto da fórmula (II) (X = Cl) em combinação com Bortezomiba por 24h induz inibição de crescimento sinergistica. Os resultados são a média ± D.P. de três experiências independentes (P < 0,005). A interação entre agentes anti-MM da fórmula (II) (X = Cl) e Bortezomiba foi analisada usando uma análise de isobolograma com um programa de software "CalcuSyn" (Biosoft, Ferguson, MO e Cambridge, UK) . Os dados do 5 ensaio de viabilidade de célula (MTT) foram expressos como a fração de células com crescimento afetado (CA) em células tratadas droga versus células sem tratar. O programa CalcuSyn é baseado no método Chou-Talalay de acordo com a seguinte equação: "IC = (D)l/(Dx)l + (D)2/(Dx)2 + (D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2" onde (D)1 e (D)2 10 são as doses de droga 1 e de droga 2 que têm efeito x quando usadas em combinação; e (Dx)l e (Dx)2 são as doses de droga 1 e de droga 2 isso têm o mesmo efeito x quando usadas sozinhas. Quando IC = 1, esta equação representa o isobolograma de conservação e indica efeitos aditivos. Valores de IC < 1,0 indicam sinergismo.

Um indice de combinação (IC) <1,0 foi obtido para a Bortezomiba + NPI-0052, indicando sinergismo. Além disso, a máxima atividade anti-MM foi observada quando dada concomitantemente, em lugar de outros esquemas de tratamento. Baixas doses combinadas do composto da fórmula (II) (X = Cl) e de Bortezomiba não afetam 20 significativamente a viabilidade de PBMNCs normais (dados não mostrados). A terapia de combinação com Bortezomiba e o composto da fórmula (II) (X = Cl) pode então: 1) permitir o uso de concentrações sub-tóxicas de cada agente; 2) atrasar ou prevenir o desenvolvimento de resistência à droga; e 3) permitir escalar 25 doses sinergisticas destes agentes para aumentar o limiar apoptótico.

Claims (11)

1. “COMPOSIÇÕES” farmacêuticas, caracterizadas pelo fato de compreenderem: um composto da fórmula (I) um sal ou pró-droga farmaceuticamente aceitável relacionado:

onde X é selecionado do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo ou iodo; e pelo menos um agente quimioterapêutico adicional, em que dito pelo menos um agente quimioterapêutico adicional é um Bortezomiba.

2. “COMPOSIÇÕES”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que X é cloro.

3. “COMPOSIÇÕES”, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas pelo fato de que o composto da fórmula (I) tem a estrutura da fórmula (II):

4. “COMPOSIÇÕES” de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que a composição é para o tratamento de uma doença neoplástica.

5. “COMPOSIÇÕES” de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de que a doença neoplástica é câncer.

6. “COMPOSIÇÕES” de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas pelo fato de que o câncer é selecionado de um grupo que consiste em câncer de mama, sarcoma, leucemia, câncer ovariano, câncer uretal, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer retal, câncer de estômago, câncer do pulmão, linfoma, mieloma múltiplo, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer de rim, câncer endócrino, câncer de pele, melanoma, angioma, e câncer de cérebro ou do sistema nervoso central (SNC).

7. “COMPOSIÇÕES” de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de que o câncer é selecionado de um grupo que consiste em mieloma múltiplo, carcinoma colo-retal, carcinoma de próstata, adenocarcinoma de mama, carcinoma pulmonar de célula não-pequena, e um carcinoma ou melanoma ovariano.

8. “COMPOSIÇÕES” de acordo com a reivindicação 7, caracterizadas pelo fato de que o câncer é mieloma múltiplo.

9. “COMPOSIÇÕES” de acordo com a reivindicação 8, caracterizadas pelo fato de que o mieloma múltiplo é resistente a dexametasona.

10. “COMPOSIÇÕES” de acordo com a reivindicação 9, caracterizadas pelo fato de que o mieloma múltiplo é resistente a talidomida.

11. “COMPOSIÇÕES” de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato de que o mieloma múltiplo é resistente a doxorubicina.

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