BRPI0506942B1 - Síntese bioquímica de ácido 6-amino capróico - Google Patents

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SÍNTESE BIOQUÍMICA DE ÁCIDO 6-AMINO CAPRÓICO [001] A presente invenção se refere a um novo processo para a síntese bioquímica de ácido 6-amino capróico. O ácido 6-amino capróico é aqui depois também referido como 6-ACA. O composto ácido 6-amino capróico (nome IUPAC: ácido 6-amino-hexanóico) é um possível intermediário para a produção de ε-caprolactama (aqui depois mais abreviadamente referido como caprolactama), o qual é a base para a produção de náilon-6. Por outro lado, o ácido 6-amino capróico também pode ser formado através de hidrólise de caprolactama. A caprolactama é um produto químico denso e está sendo produzido em uma escala muito grande no mundo. [002] Produtos químicos básicos para a produção industrial de caprolactama geralmente são produtos químicos densos, tais como benzeno, ciclohexano, ciclohexanona, etc., a partir dos quais ciclohexanona oxima está sendo produzida, a qual é, então, convertida em caprolactama via uma assim denominada reestruturação de Beckmann. Contudo, na reciclagem de materiais residuais de tapetes de náilon-6, por exemplo, o ácido 6-amino-capróico (bem como alguns outros produtos formados na etapa de despolarização de náilon-6) pode ser usado para a síntese de caprolactama através de uma reação de ciclização. Na reciclagem industrial de náilon-6, a produção de caprolactama é, frequentemente, a última etapa de síntese. O ácido 6-amino-capróico (6-ACA) é, assim, adequado para a síntese de caprolactama e subsequentemente para a produção de náilon-6. O 6-ACA, contudo, também pode ser usado diretamente como uma matéria prima para a produção de náilon-6. [003] Para a ciclização de 6-ACA e/ou ésteres do mesmo, vários processos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, referência pode ser feita aos processos conforme descrito no US-A-6.194.572, em que 6-ACA e/ou ésteres do mesmo são tratados em uma zona de reação, na ausência de um catalisador, com vapor superaquecido em uma temperatura na faixa de 270 a 400°C e uma pressão na faixa de 0,5 a 2 MPa. Esses processos podem ser operados continuamente e a caprolactama formada pode ser isolada através de condensação parcial em uma temperatura na faixa de 100 a 170°C imediatamente após a mistura de reação deixar a zona de reação. Conversão direta de 6-ACA em náilon-6, por exemplo, pode ser feita conforme descrito no JP-4050232-A. [004] Conforme entendido no presente pedido de patente, o termo "síntese bioquímica" (um termo que, no contexto do presente pedido de patente é, alternativamente, referido como "biotransformação") inclui não apenas processos os quais envolvem - além de uma série de etapas de reação puramente químicas - uma ou mais reações biocatalíticas, mas também processos puramente bioquímicos usando células inteiras de gêneros de produção adequados. Tais processos puramente bioquímicos, respectivamente, são referidos como fermentações no caso da síntese bioquímica iniciar a partir de uma fonte de carbono adequada, ou são referidos como fermentações precursoras no caso da biossíntese iniciar a partir de um produto intermediário já tendo um esqueleto de carbono a partir do qual a molécula alvo a ser sintetizada pode ser obtida. Os processos podem ser realizados sob condições aeróbicas ou anaeróbicas. [005] A síntese bioquímica pode ser realizada in vivo ou in vitro. Geralmente, processos in vivo são processos realizados quando de uso de células vivas (o termo "células vivas", desse modo, também inclui as assim denominadas células em repouso); processos in vitro, por outro lado, usualmente são realizados usando lisatos de células ou enzimas (parcialmente) purificadas. A síntese bioquímica, conforme entendido aqui, contudo, também pode ser realizada usando células permeabilizadas; a diferenciação entre in vivo e in vitro, contudo, não faz muito sentido para processos que estão sendo realizados com células permeabilizadas. [006] A presente invenção também se refere a processos para obtenção de células hospedeiras geneticamente manipuladas a serem usadas em um processo de biotransformação para a síntese de ácido 6-amino-capróico e também especificamente a processos até o momento desconhecidos para a fermentação precursora de ácido 6-amino-capróico a partir de intermediários que levam ao ácido β-amino-capróico, isto é, a partir de ácido 6-aminohex-2-enóico ou de um composto capaz de ser convertido ao mesmo, isto é, ácido 6-amino-2-hidróxi-hexanóico. Os referidos compostos ácido 6-aminohex-2-enóico e ácido 6-amino-2-hidróxi-hexanóico (conforme será explicado aqui depois) são referidos, respectivamente, como 6-AHEA e 6-AHHA no contexto do presente pedido. Na fermentação precursora de ácido 6-amino-capróico, intermediários adequados, conforme descrito abaixo, são tornados disponíveis para a fermentação precursora de uma forma tal que eles estão presentes em uma concentração não limitativa e não inibitória, por exemplo, através de alimentação ao vaso de reação, em que a síntese bioquímica (isto é, conversão) está sendo realizada. [007] A presente invenção ainda se refere também, especificamente, a novas células hospedeiras tendo atividade de redutase de enoato com relação ao ácido 6-aminohex-2-enóico, isto é, com relação ao 6-AHEA. Especialmente, ela também se refere a novas células tendo atividade de redutase de enoato aeroestável com relação ao 6-AHEA. Conforme usado aqui, o termo "aeroestável" significa tolerante ao oxigênio. [008] Finalmente, conforme também será explicado aqui depois, a presente invenção se refere aos novos compostos bioquimicamente produzidos 6-AHEA e 6-ACA, bem como a caprolactama produzido a partir de tal 6-ACA e a náilon-6 ou outros derivados produzidos a partir de tais compostos bioquimicamente produzidos ou a tal caprolactama. [009] Em geral, as vias para 6-ACA, conforme é conhecido atualmente, são muito trabalhosas e problemáticas. Usualmente, se 6-ACA não está sendo produzido a partir de materiais residuais de náilon-6, essas vias conhecidas requerem materiais de iniciação e reagentes relativamente caros (por exemplo, butadieno e gás hidrogênio) e condições de reação relativamente rigorosas de temperatura e pressão em um design com etapas múltiplas ou reatores múltiplos, bem como o uso de sistemas catalisadores caros. Consequentemente, permanece uma necessidade por vias alternativas ao 6-ACA, de preferência a partir de matérias primas muito mais baratas. É bem sabido que materiais que crescem naturalmente e, assim, renováveis, da produção agrícola são a base para fontes de carbono, tal como glicose (ou outras fontes de carbono apropriadas e misturas das mesmas), que podem ser usadas em fermentação ou fermentação precursora. Tais materiais renováveis são relativamente baratos e abundantemente disponíveis. Em geral, é considerado como sendo muito vantajoso se materiais renováveis podem ser utilizados com materiais de iniciação para todos os tipos de materiais químicos. [010] É um objetivo da presente invenção possibilitar a produção até o momento desconhecida de 6-ACA através de síntese bioquímica (isto é, através de biotransformação). [011] Os presentes inventores descobriram, surpreendentemente, um novo processo para a síntese bioquímica de ácido 6-amino-capróico, em que ácido 6-aminohex-2-enóico da formula [1] (6-AHEA): H2N-CH2-CH2-CH2-CH=CH-COOH [1] ou em que ácido 6-amino-2-hidróxi-hexanóico (6-AHHA), um composto capaz de ser transformado em ácido 6-aminohex-2-enóico, é tratado com uma enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato com relação a moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário, em particular com uma enzima tendo atividade de α,β-enoato com relação ao ácido 6-amino-hex-2-enóico. [012] Conforme entendido aqui, enzimas tendo atividade de redutase de α,β-enoato com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário são compreendidas como sendo enzimas que são capazes de converter a ligação dupla a,β-carbono-carbono na posição α,β próxima a um grupo ácido carboxílico (-COOH) (ou carboxilato (-COCT) ou éster (-COOR, com R representando um grupo alquila inferior de no máximo 6 átomos de C)) em uma ligação simples carbono-carbono em moléculas também contendo um grupo amino primário, isto é, um grupo -NH2 que não forma parte de um grupo amida. Grupos amino mono- ou di-substituídos não são compreendidos na definição de grupos amino primário, conforme usado aqui. 0 termo atividade de redutase de α,β-enoato é entendido como incluindo tal atividade em todos os possíveis níveis de atividade mensurável, incluindo níveis aumentados de atividade, conforme pode ser obtido por meio de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, tal como através de superexpressão, indução ou, de outro modo, regulação do gene relevante, aumento do número de cópias do gene relevante, aumento da atividade endógena da enzima relevante, etc. ou através de otimização das condições de ensaio. [013] Além de 6-AHEA, também o composto a-hidróxi-substituído saturado correspondente, 6-AHHA, capaz de ser transformado em 6-AHEA através de desidratação, pode ser aplicado no processo da presente invenção. Dentro do contexto do presente pedido de patente, esse composto é considerado como sendo equivalente ao 6-AHEA α,β-enoato a-não-substituído. [014] Deve ser observado que a reação bioquímica, conforme foi verificado pelos presentes inventores, não foi ainda descrita nem sugerida na técnica anterior para a conversão de moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário, mesmo embora enzimas tendo atividade de redutase de α,β-enoato, mais frequentemente especificamente para α,β-enoatos contendo um a-substituinte não sendo igual a hidrogênio, já sejam conhecidas por aqueles habilitados na técnica para outros tipos de reações para uma ampla faixa de substratos. Geralmente, tais reações conhecidas de enzimas com atividade de redutase de οί,β-enoato foram dirigidas à criação de sínteses enzimáticas enantioespecíficas. Por exemplo, veja H. Simon e colaboradores em Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , Vol. 13 (1974), páginas 608-609; B. Rambeck e colaboradores, ibid., na página 609; I. Thanos e colaboradores em J. Biotechnol. 9, 13-29 (1987); H. Simon e colaboradores em Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 24 (1985), páginas 539-553; e US-A-4.464.235. Uma revisão lidando com enzimas tendo atividade de redutase de οί,β-enoato pode ser encontrada em Chem. Biochem. Flavoenzymes (1991), Capítulo, páginas 317-328 por H. Simon; Publisher: CRC, Boca Raton. A última dessas referências sugere que a atividade de redutase de enoato envolverá uma transferência de hidreto da enzima redutase para o composto de enoato. I. Thanos e colaboradores (citados acima) se focalizaram sobre os aspectos de redução eletroenzimáticos quando do uso de redutase de enoato a partir de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 para enoatos a-substituídos. Outros exemplos de enzimas tendo atividade de redutase de οί,β-enoato estão sendo mostrados para a síntese de compostos de carbonila oí-substituidos estereoquimicamente puros no WO-03/066863. Essa referência não mostra qualquer substrato contendo um grupo amino primário para as redutases de enoato usadas. Assim, não existe indicação em geral de que enzimas com atividade de redutase de α,β-enoato possam ser adequadamente usadas para a síntese bioquímica de compostos que não são substituídos na posição oí próxima a um grupo carboxilico e que também contenham um grupo amino primário, por exemplo, 6-ACA. Na verdade, aqueles habilitados na técnica, levando em conta o mecanismo de transferência de hidreto presumível mencionado acima, poderão esperar que a presença de um grupo amino primário em uma molécula a ser convertida por meio de uma enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato teria um efeito negativo sobre tal reação. 0 grupo amino positivamente carregado parece ser o aceitador preferido para o hidreto a ser transferido, desse modo, interferindo negativamente com a atividade de redutase de enoato. [015] Deve ser ainda notado que a observação feita por Steinbacher e colaboradores (veja Banco de Dados STN, no. de acesso 2003: 101473) de que redutases de enoato têm ampla especificidade de substrato, uma observação que também é consistente com os dados de outras referências, por exemplo, de H. Simon e colaboradores citados acima, onde o uso de uma ampla faixa de substratos para a reação com redutase de enoato no gênero Clostridium tyrobutyricum DSM1460 (o mesmo gênero que também tinha sido usado no trabalho de I. Thanos e colaboradores, citados acima) está sendo mostrada, não altera o referido ponto de vista. [016] Além disso, na literatura, clonagem, sequenciamento e expressão de redutases de enoato de diferentes clostrídios foram descritos (veja F. Rohdich e colaboradores em J. Biol. Chem. 276 (6), 5779-5787 (2001). Especialmente, os genes de redutase de enoato (enr) de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 e Clostridium thermoaceticum DSM1974 (um gênero muito recentemente tendo sido também renomeado junto com uma série de espécies Clostridium e, assim, agora também é referido como Moorella thermoacetica) foram clonados e sequenciados. [017] Contudo, tal clonagem até o momento não tinha sido realizada em qualquer espécie, por exemplo, dos gêneros Bacillus, Corynebacterium ou Pichia. Em particular, contudo, a clonagem do gene enr de Moorella thermoacetica e de Clostridium tyrobutyricum em E. coli não tinha sido descrita por F. Rohdich. Com essa clonagem, percebeu-se que a última (a partir de C. tyrobutyricum) não tinha sido testada por Rohdich e colaboradores sob condições anaeróbicas (isto é, com crescimento sob condições anaeróbicas) e - em testes sob condições aeróbicas resultou em uma forma inativa de redutase de enoato, enquanto que a primeira (a partir de M. thermoacetica) proporcionou o mesmo resultado quando expressa anaerobicamente e proporcionou apenas uma forma ativa da redutase de enoato sob condições anaeróbicas. Contudo, no WO-03/066863, a clonagem em E. coli de enzimas redutase de enoato obtidas de espécies Burkholderia é descrita e essas enzimas foram sequenciadas. [018] Consequentemente, nenhuma das referências citadas ensina a reação de formação de 6-ACA, que forma a base da presente invenção. [019] Conforme os inventores descobriram, a enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato (conforme usado no processo da presente invenção) pode ser qualquer enzima adequada (isto é, a enzima é adequada se ela pode ser confirmada como tendo atividade de redutase de α,β-enoato com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário, especialmente com relação ao ácido 6- amino-hex-2-enóico) originária de um grande grupo de gêneros de microorganismos (aqueles anaeróbicos, bem como aeróbicos) tais como, por exemplo, de Acetobacterium, Achromobacter, Acremonium, Agrobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Bradyrhizobium, Burkholderia, Caloramator, Cephalosporium, Clostridium, Escherichia, Eubacterium, Filifactor, Fusobacterium, Kluyveromyces, Mesorhizobium, Moorella, Ochrobactrum, Oxalophagus, Oxobacter, Paenibacillus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Rhodotorula, Salmonella, Shigella, Sinorhizobium, Sporohalobacter, Syntrophospora, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium, Tilachlidium, Vibrio, Xanthobacter ou Yersinia. [020] De preferência, no processo da presente invenção, a enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato é uma enzima originária de um microorganismo do grupo de espécies de Acetobacterium sp., Acremonium sp., Agrobacterium sp., Burkholderia sp., Cephalosporium sp., Clostridium sp., Escherichia sp., Moorella sp., Ochrobactrum sp., Pseudomonas sp., Salmonella sp., Shigella sp., Tilachlidium sp., Yersinia sp. e Vibrio sp. [021] Mais preferivelmente, as enzimas tendo atividade de redutase de α,β-enoato são enzimas originárias de Acremonium sp., Clostridium sp., Moorella sp. ou Ochrobactrum sp. [022] Mais preferivelmente, a enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato é uma enzima de Acremonium strictum CBS114157 (data de depósito, 1 de Dezembro de 2003; depositado sob os termos do Tratado de Budapeste), Clostridium tyrobutyricum DSM1460 (disponível do Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen), Moorella thermoacetica DSM1974 (disponível do Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen) (uma enzima a qual também sob DSM1974 - até 1 de Janeiro de 1980, era denominada Clostridium thermoaceticum), Ochrobactrum anthropi NCIMB41200 (data de depósito 16 de Dezembro de 2003; depositada sob os termos de Tratado de Budapeste) ou Clostridium kluyveri DSM555 (disponível do DeutscheSammiung Mikroorganismen und Zellkulturen). No presente contexto, deve ser observado que uma série de espécies Clostridium foi muito recentemente renomeada. Os nomes fornecidos aqui acima se destinam apenas a serem indicativos da variedade de espécies e gêneros (células) que podem ser considerados para obtenção de enzimas com atividade de redutase de α,β-enoato. [023] Bons resultados na conversão bioquímica a 6-ACA de acordo com a presente invenção foram obtidos pelos inventores quando do uso de uma enzima tendo atividade de redutase de οί,β-enoato de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 ou de Moorella thermoacetica DSM1974. [024] De preferência, a enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário tem atividade de redutase de α,β-enoato aeroestável. Isso significa que a enzima, sem qualquer desativação significativa, isto é, a desativação não será mais do que o desvio padrão de atividade enzimática durante o processo de biotransformação, será capaz de catalisar a biotransformação desejada sob condições onde o oxigênio livre está presente. Tais enzimas tendo atividade aeroestável também podem ser denominadas enzimas oxigênio-tolerantes. [025] Consequentemente, em uma modalidade preferida da presente invenção, a enzima tendo atividade de redutase de οί,β-enoato tem atividade de redutase de α,β-enoato aeroestável e é uma enzima originária de um microorganismo do grupo de espécies de Agrobacterium sp., Burkholderia sp., Escherichia sp., Pseudomonas sp., Salmonella sp., Shigella sp., Yersinia sp. e Vibrio sp. Mais preferivelmente, a enzima tendo atividade de redutase de οί,β-enoato aeroestável é uma enzima originária de espécies Escherichia coli e, mais preferivelmente, a enzima se origina de Escherichia coli K12. [026] O processo da presente invenção pode, muito adequadamente, ser realizado através de conversão de ácido 6-amino-hex-2-enóico em ácido 6-amino capróico em um pH na faixa de 3 a 9, de preferência de 4 a 8, mais preferivelmente de 5 a 8 e ainda mais preferivelmente de 5,5 a 7 sob condições anaeróbicas e de 6,5 a 8 sob condições aeróbicas. [027] O material de iniciação ácido 6-amino-hex-2-enóico (6-AHEA) pode ser tornado disponível para a conversão bioquímica de acordo com a presente invenção através de fornecimento desse composto ou de um produto capaz de ser metabolizado ao mesmo (mas sendo diferente de uma mera fonte de carbono tal como, por exemplo, glicose) de uma forma tal que ele está presente no reator usado em uma concentração não limitativa e não inibitória, por exemplo, através de alimentação ao vaso de reação, por exemplo, um fermentador, onde o processo bioquímico está sendo realizado. Processos de acordo com a invenção nos quais o 6-AHEA (ou um precursor metabolizável do mesmo) é usado de tal forma no vaso de reação podem também ser referidos como "fermentações precursoras". [028] Naturalmente, conforme entendido aqui, 6-AHEA (ou qualquer produto capaz de ser metabolizado ao mesmo e sendo diferente de uma mera fonte de carbono) também podem ser tornados disponíveis para a conversão de acordo com a presente invenção através de qualquer processo bioquímico adequado que ocorre no microorganismo contendo a atividade de redutase de α,β-enoato. Sabe-se, por exemplo, que lisina pode ser produzida através de biotransformação em células de Corynebacterium glutamicum (por exemplo, veja Pfefferie W. em Adv. Biochem. Eng. (2003), Vol. 79, páginas 59-112). O fato de que a sequência do genoma complete de Corynebacterium glutamicum se tornou agora disponível tem um grande impacto sobre o aperfeiçoamento da fabricação biotecnológica de lisina. Admitindo que a lisina no microorganismo pode, então, ser subsequentemente convertida em 6-AHEA, um processo que até o momento não tinha sido divulgado nem sugerido, esse pode ser um método adequado para tornar o 6-AHEA disponível para a conversão da presente invenção. [029] A lisina produzida através de síntese bioquímica (biotransformação) pode ser convertida em 6-AHEA através de métodos químicos prontamente disponíveis para aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, através primeiro de proteção do grupo amino usando o método com complexo de lisina-cobre(II), conforme descrito em Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry (4a edição), Vol. E22a, Thieme, Stuttgart, 2002, páginas 166-191. Grupos de proteção opcionais são acetila, benzoila, fenilacetila, benzilóxicarbonila ou ftaloilimida. Subsequente reação de nitrosação do grupo α-amino na presença de mercaptanos ou selenóis, então, resulta na formação do oí-tio ou a-seleno éter correspondente. Essa nitrosação pode ser realizada em um meio aquoso com NaN02/H2SC>4 ou sob condições anidricas usando, por exemplo, iso-amilnitrila. Exemplos adequados de mercaptanos são (substituídos) tiofenol e benzilmercaptano; benzeno-selenol é um selenol preferido nessa reação. Subsequente oxidação do α-tio éter ou a-seleno éter com H2O2, seguido por uma reação de eliminação in situ resultará no 6-AHEA ε-protegido. Um exemplo desse procedimento é descrito por S. Bory, M. Gaudry, A. Marquet; Nouveau Journal of Chimie (1986), 10, 709-713. Através de hidrólise catalisada por ácido ou base do grupo de ε-proteção, 6-AHEA é obtido.

[030] No caso onde 6-AHEA está sendo produzido bioquimicamente na célula (ou a partir de lisina que tenha sido produzida por meio de biotransformação), o 6-ACA resultante (e o caprolactama derivado do mesmo após excreção da célula e ciclização através de quaisquer métodos conhecidos) será facilmente distinguível de 6-ACA (e/ou caprolactama obtido a partir do mesmo, respectivamente, produtos derivados do mesmos, por exemplo, náilon-6 obtido de tal caprolactama) , conforme é obtido através de vias químicas a partir de um estoque de alimentação de fosseis. No último caso, a ausência de 14C nas cadeias de carbono das moléculas será facilmente demonstrável. Alternativamente, a proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C (conforme pode ser determinado através de métodos de Espectrometria de Massa da Proporção de Isótopos Estável (SIRMS)) ou através do assim denominado Fracionamento Isotópico Natural Sitio-Especifico estudado por meio de Ressonância Magnética Nuclear (SNIF-NMRO, conforme vem sendo usado para a identificação de bio-substâncias) pode ser usada como uma característica para a origem do 6-ACA (e/ou caprolactama) porque a proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C terá cerca do mesmo valor conforme ocorre no dióxido de carbono ambiental. [031] O material de iniciação, ácido 6-amino-hex-2-enóico (6-AHEA) também pode ser obtido puramente de modo químico, por exemplo, análogo às etapas a e i do esquema 2 no método descrito por P. Hughes e colaboradores para a síntese de treo-3-hidróxilisina em J. Org. Chem. vol. 59 (1994), páginas 5799-5802. Isso é mostrado na parte experimental do presente pedido. [032] O processo de acordo com a invenção é, de preferência, realizado em um organismo hospedeiro selecionado do grupo de gêneros consistindo de Aspergillus, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia e Pichia. Organismos hospedeiros pertencendo ao grupo de Corynebacterium sp., por exemplo, C. glutamicum, são especialmente preferidos porque esses microorganismos são conhecidos por serem adequados para a produção biossintética de lisina. [033] Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, o gênero hospedeiro e, assim, célula hospedeira adequada para a síntese bioquímica de ácido 6-amino-capróico, é selecionado do grupo de células hospedeiras de Escherichia coli, Bacillus, Corynebacterium glutamicum, Aspergillus niger ou Pichia pastoris, nas quais um gene de redutase de α,β-enoato que codifica uma enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário é clonado e expresso. Ao invés de qualquer um dos referidos genes de redutase de α,β-enoato, também qualquer outro gene que codifica uma enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato e capaz de conversão de 6-AHEA em 6-ACA em um grau adequado, pode ser usado e é considerado como sendo abrangido no escopo da modalidade reivindicada. Das células mencionadas no presente pedido, apenas células de Escherichia coli clonadas com o gene de redutase de α,β-enoato de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum foram descritas na técnica anterior; as outras células mencionadas são células novas. [034] Além disso, conforme os presentes inventores descobriram, também genes que codificam enzimas tendo atividade de redutase de α,β-enoato aeroestável com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário podem ser aplicados no processo de acordo com a presente invenção. Por exemplo, os inventores descobriram que o gene nemA de Escherichia coli K12 (gênero W3110) (número de acesso: D86931), um gene que é conhecido por ter atividade de redutase de N-etilmaleimida, também tem atividade de redutase de α,β-enoato com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário. Tal atividade de redutase de α,β-enoato do gene nemA não era conhecida até o momento. Baseado na homologia de sequência com o gene nemA de E. coli, outros genes que codificam enzimas tendo atividade de redutase de α,β-enoato aeroestável com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário estarão disponíveis a partir de gêneros, por exemplo, Agrobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Yersinia e Vibrio. Todos esses outros genes que codificam enzimas tendo atividade de redutase de οί,β-enoato aeroestável com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário são, para fins do presente pedido de patente, considerados como sendo equivalentes ao nemA. [035] Consequentemente, a presente invenção também se refere, especificamente, às seguintes novas células: - uma célula hospedeira de Escherichia coli na qual o gene de redutase de α,β-enoato de Ochrobactrum anthropi NCIMB41200 ou de Acremonium strictum CBS114157 é clonado e expresso; - uma célula hospedeira de Bacillus na qual o gene de redutase de α,β-enoato de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 ou de Ochrobactrum anthropi NCIMB41200 ou de Acremonium strictum CBS114157 é clonado e expresso; - uma célula hospedeira de Corynebacterium glutamicum na qual o gene de redutase de α,β-enoato de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 ou de Ochrobactrum anthropi NCIMB41200 ou de Acremonium strictum CBS114157 é clonado e expresso; - uma célula hospedeira de Aspergillus niger na qual o gene de redutase de α,β-enoato de Acremonium strictum CBS114157 ou de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 ou de Ochrobactrum anthropi NCIMB41200 é clonado e expresso; - uma célula hospedeira de Pichia pastoris na qual o gene de redutase de α,β-enoato de Acremonium strictum CBS114157 ou de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 ou de Ochrobactrum anthropi NCIMB41200 é clonado e expresso; e uma célula hospedeira selecionada do grupo consistindo de células hospedeiras de Aspergillus, Bacillus, Corynebacterium e Pichia nas quais um gene nemA de redutase de α,β-enoato aeroestável de E. coli K12 é clonado e expresso. [036] Em geral, enzimas tendo atividade de redutase de α,β-enoato aeroestável são, evidentemente, preferidas no contexto da presente invenção. Isso é porque elas podem ser expressas e usadas em microorganismos que são cultivados e/ou usados sob condições aeróbicas. [037] Células hospedeiras de Escherichia coli ou Bacillus ou Corynebacterium glutamicum ou Aspergillus niger ou Pichia pastoris nas quais o gene de redutase de α,β-enoato de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 ou de Ochrobactrum anthropi NCIMB41200, respectivamente, de Acremonium strictum CBS114157, é clonado e expresso (ou qualquer gene sendo homólogo ao mesmo e que codifica enzimas tendo atividade de redutase de α,β-enoato e capazes de conversão de 6-AHEA em 6-ACA em um grau adequado) , podem ser obtidas por meio de por meio de qualquer estratégia de clonagem adequada conhecida por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, através dos métodos descritos na parte experimental aqui. Referência é feita também ao livro bem conhecido de Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Similarmente, tais estratégias de clonagem também podem ser aplicadas para a construção dos clones de nemA antes mencionados (ou clones equivalentes ao mesmo) . Além disso, especialmente nos casos onde um gene originário de fungo é clonado em uma espécie bacteriana, aqueles habilitados na técnica tomarão medidas apropriadas para não apenas adaptar sequências de controle transcricional e traducionais, mas, além disso, usar as sequências de cDNA sinteticamente obtidas, de forma a obter expressão funcional da enzima a ser produzida. [038] A presente invenção, além disso, também se refere a um processo para a fermentação precursora de ácido 6-amino-capróico (6-ACA) começando a partir de ácido 6-amino-hex-2-enóico (6-AHEA) ou de ácido 6-amino-2-hidróxi-hexanóico (6-AHHA) e aplicação de pelo menos uma etapa enzimática com uma enzima tendo atividade de redutase de οί,β-enoato com relação à moléculas contendo um grupo α,β-enoato e um grupo amino primário, em particular com uma enzima tendo atividade de redutase de α,β-enoato com relação ao ácido 6-amino-hex-2-enóico. [039] Na modalidade mais preferida, tal fermentação precursora é realizada em um microorganismo em que ácido 6-amino-hex-2-enóico (6-AHEA) está sendo formado in vivo. Na verdade, em tal caso, a formação de 6-ACA de acordo com a presente invenção é uma biotransformação em 6-ACA começando a partir de qualquer fonte de carbono adequada. [040] Fontes de carbono as quais podem, adequadamente, ser usadas nessas modalidades especificas do processo de acordo com a invenção são: oligossacarídeos e dissacarideos, por exemplo, maltose, β-galactosídeo, melibiose, epimelibiose, galactinol, melibitol, galactosil glicerol e trealose, hexoses, por exemplo, D-glicose, D-frutose, D-manose, L-sorbose e D-galactose, soluções ou pastas contendo glicose, amido, soluções ou pastas contendo fonte de carbono, amino açúcares, por exemplo, N-acetil-D-glicosamina e D-glicosamina, metilpentoses, por exemplo, L-fucose e L-rhamnose, pentoses e trioses, por exemplo, L-arabinose, D-arabinose, D-xilose, xilitol, D-lixose, D-ribose, 2-deóxi-D-ribose e dihidróxiacetona, pentoses em nucleosideos e deóxinucleosideos, por exemplo, citidina, deóxicitidina, adenosina, deóxiadenosina, uridina, xantosina, timidina (deóxiuridina), purina (adenina, hipoxantina, ribonucleosideo de guanina), hexuronideos, hexuronatos e hexonatos, por exemplo, D-gluconato e D-galactonato, açúcares e carboxilatos fosforilados, por exemplo, fosfatos de hexose e 3-fosfato de sn-glicerol, dicarboxilatos, por exemplo, succinato, fumarato e L-malato, ácidos tricarboxilicos, polióis, por exemplo, D-manitol, D-glucitol, D-sorbitol, galactitol, dulcitol, D-arabitol, ribitol e xilitol, glicerol, compostos com dois carbonos, por exemplo, etanol e acetato, ácidos graxos, glicolato e glioxilato, mas também metanol, óleos ingeriveis ou misturas de qualquer um dos compostos acima. [041] Mais preferivelmente, o ácido 6-amino-hex-2-enóico (6-AHEA) é formado in vivo a partir de uma solução ou pasta contendo uma fonte de carbono adequada. Tais fontes de carbono adequadas podem ser selecionadas do grupo de glicose, soluções ou pastas contendo glicose, (m) etanol, gluconato, pentoses, hexoses, amido e ácidos graxos. Em particular, a fonte de carbono usada é glicose. [042] Em virtude do fato, conforme mencionado acima, de que enzimas tendo atividade de redutase de enoato com relação ao 6-AHEA, as quais são tolerantes contra o oxigênio livre (e, assim, podem ser mencionadas como sendo aeroestáveis) são preferidas no contexto da presente invenção (isto é, enzimas que podem ser expressas e usadas em microorganismos os quais são cultivados e/ou usados sob condições aeróbicas), de preferência são usados microorganismos que podem ser usados sob condições aeróbicas. A eficácia de crescimento (isto é, também de produção de biomassa) sob condições aeróbicas, bem como a eficácia de produção de enzima(s) relevante(s) e/ou de substâncias a serem produzidas, é geralmente muito maior do que o crescimento sob condições anaeróbicas. Por exemplo, rendimentos muito melhores sobre glicose (ou outras fontes de carbono) são obtidas. Tais vantagens são descritas, por exemplo, no livro texto geral "Allgemeine Mikrobiologie" de H. Schlegel, Thieme, Alemanha (1981). [043] Ainda, a presente invenção se refere a novas substâncias bioquimicamente produzidas conforme divulgado aqui e a produtos derivados das mesmas e tendo uma proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C em torno do mesmo valor conforme ocorre em dióxido de carbono ambiental, isto é, ao ácido 6-amino-hex-2-enóico bioquimicamente produzido tendo uma proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C em torno do mesmo valor conforme ocorre em dióxido de carbono ambiental; ácido 6-amino-hexanóico bioquimicamente produzido tendo uma proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C em torno do mesmo valor conforme ocorre em dióxido de carbono ambiental; ε-caprolactama tendo uma proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C em torno do mesmo valor conforme ocorre em dióxido de carbono ambiental, produzido a partir de ácido 6-carbóxi-6-aminohex-2-enóico ou ácido 6-amino-hexanóico bioquimicamente produzido; e a náilon-6 e outros derivados tendo uma proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C em torno do mesmo valor conforme ocorrem em dióxido de carbono ambiental, produzidos a partir de ácido 6-aminohex-2-enóico ou ácido 6-amino-hexanóico bioquimicamente produzido ou de ε-caprolactama que tenha sido produzida a partir de ácido 6-amino-hex-2-enóico ou ácido 6-amino-hexanóico bioquimicamente produzido. [044] Cada uma dessas novas substâncias pode ser prontamente identificada por meio de métodos conforme descrito acima, por exemplo, através de métodos de Espectrometria de Massa da Proporção de Isótopos Estável (SIRMS)) ou através de Fracionamento Isotópico Natural Sitio-Especifico estudado por meio de NMR. Essas novas substâncias são, evidentemente, diferentes (isto é, quanto à sua proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C) das substâncias conhecidas de estrutura química correspondente e fórmula, conforme foi obtido através de síntese química a partir de fontes de carbono de fosseis e é descrito nas referências da técnica anterior. [045] A invenção será agora elucidada por meio dos resultados experimentais a seguir sem, contudo, estar limitada de qualquer forma aos métodos ou princípios dessa parte experimental. Além disso, deverá estar claro que a presente invenção também será aplicável - por analogia -para a (bio) síntese de ácidos a, ω-amino carboxílicos superiores a partir de ácidos ω-amino 2-alceno carboxílicos (e a subsequente produção de poliamidas a partir dos mesmos). Por exemplo, ácido ll-amino-2-undecenóico podería ser um composto de iniciação para a sintese de poliamida-11. Modalidades para a produção de ácidos ω-amino carboxílicos superiores através de tratamento de seus ácidos carboxílicos o,β-insaturados correspondentes são consideradas como caindo dentro do escopo das presentes reivindicações. I. Preparo de ácido 6-amino-hex-2-enóico (6-AHEA) a partir de 4-aminobutiral aldeido dietilacetal [046] As etapas de reação relevantes são descritas em E.Hamilton e colaboradores, Tet. Letters 1993 (34), páginas 2847-2850; em P. Hughes e colaboradores, J. Org. Chem. 1994 (59), páginas 5799- 5802; e em C, Stammer e colaboradores, J. Org. Chem. 1969 (34), páginas 2306-2311, respectivamente. [047] 4-aminobutiral aldeido dietilacetal (técnico, 90%. 202,4 g, 1130 moles) e anidrido ftálico (186 g, 1256 moles) foram reagidos sob condições de Dean-Stark durante 4 h em tolueno (1700 ml), contendo cerca de 10% em peso de trietilamina (TEA; 166 g, 1640 rnmoles) . Após esfriar para a temperatura ambiente (RT), o solvente e excesso de TEA foram evaporados in vácuo. O resíduo foi dissolvido e submetido a refluxo durante 20 minutos em uma mistura de HCl aquoso a 2M (2000 ml) e acetona (2800 ml). Após esfriar para a RT, a acetona foi removida in vacuo e o resíduo foi extraído com CH2CI2 (5 x 200 ml) . A fase orgânica foi lavada com HC1 aquoso a 2M (3 x 200 ml) e com NaHCC>3 aquoso saturado (2 x 200 ml) . Após secagem da solução sobre Na2S04, o 4-ftalimidobutanal foi isolado através de evaporação do CH2CI2 in vacuo. Após secagem em um secador sobre P2O5 in vacuo, 240,5 g de 4-f talimidobutanal foram obtidos (rendimento: 98%). [048] 4-ftalimidobutanal (120,9 g, 556 mmoles) foi, então, dissolvido em 600 ml de CH2CI2 e tratado com acetato de metil (trifenilfosforanilideno) (186 g, 556 mmoles) em 600 ml de CH2CI2. Após 1 h, a mistura foi concentrada in vacuo e cromatografada em sete partes iguais (coluna Merck Kieselgel 60; 7 x 14 cm; eluente: acetato de etila em hexano a 30%) a fim de proporcionar 145,6 g (96%) de metil-6-ftalimidohex-2-enoato como um sólido branco. [049] Metil-6-ftalimidohex-2-enoato (145,6 g; 533 mmoles) foi dissolvido em metanol (900 ml) e agitado com 71,6 g de NaOH (1790 mmoles) em 1700 ml de água destilada em RT durante 8 h. A solução foi tratada com carvão e filtrada. O filtrado foi acidificado com 260 ml de HC1 aquoso a 37% e, então, submetido a refluxo durante 3 h. Após esfriar para a RT, uma pequena quantidade de precipitado foi filtrada e a solução foi concentrada in vacuo até que cristalização começasse. O precipitado foi filtrado e a solução foi evaporada até secagem in vacuo. O residuo foi submetido à ebulição com uma mistura a 7:1 (vol/vol) de 2-propanol e acetato de etila (2 x 800 ml) de forma a extrair o produto. Após filtração, os solventes foram evaporados in vacuo e o residuo foi recristalizado a partir de 2-propanol (385 ml) a fim de proporcionar 36,7 g (42%) de sal de HC1 de ácido 6-amino-hex-2-enóico. [050] Os dados de NMR para 6-AHEA, medidos usando NMR a 250 MHz em CD^OD eram como segue: [051] Os prótons a, b, c, d e e estavam localizados, respectivamente, no átomo de carbono α, β, γ, δ e ε. II. Meios e preparo em si 11.1 Meio PYG (náo-seletivo): [052] A 1 L de água desionizada são adicionados: 1,25 g de peptona, 1,25 g de extrato de levedo e 3 g de glicose; o pH é ajustado para um pH de 5,8. Dividir sobre garrafas de penicilina <50 ml de meio em garrafas de 100 ml) , aquecer {colocando em um banho de água em ebulição, mas sem levar à ebulição as amostras nas garrafas) para remover O? e submeter a fluxo {através do meio e sob ligeira super-pressão com 1½ acima do meio) Com Nj. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Opcionalmente, os últimos vestígios de O2 podem ser removidos através da adição de 0,05% de tioglicolato de sódio estéril. 11.2 Meio seletivo (meio de crotonato; de acordo com F.

Rohdich e colaboradores, J. Biol. Chem. 276 (6), 5779-5787 {2001); e Bader, J. e colaboradores, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., Bd. 359, páginas 19-27, (1978)): [053] A 1 L de água desionizada são adicionados: 6 g de ácido crotõnico, 0,3 g de NaOH, 150 mg de {NH4) jHPQ,,, 100 mg de K2HPO4, 33 mg de MgCl2.6H20, 50 mg de NH4C1, 1 g de extrato de levedo, 1 g de caseina triptica, 40 mg de CaCl2.2H20, 0,4 mg de MnS04.2H20, 0,4 mg de FeS04.2H20, 10 mg de (NH4) 6M07024.4H20, 0,04 mg de biotina, 0,8 mg de ácido p-aminobenzóico, 0,5 mg de resazurina, 8 mg de K2CC>3 a 50% e 0,05% de tioglicolato de sódio. [054] Todos os ingredientes (exceto a solução de vitamina, K2CC>3 e tioglicolato de sódio) foram misturados e divididos sobre algumas garrafas de penicilina (50 ml em garrafas de 100 ml) . Após isso, as garrafas foram submetidas a fluxo com uma corrente de N2 e esterilizadas (durante 15 minutos a 121°C). Subsequentemente, uma mistura esterilizada e isenta de 02 dos outros compostos foi adicionada. O pH foi verificado e, se necessário, solução de K2CC>3 estéril adicional foi adicionada para ajustar o pH para um pH de cerca de 6,4. [055] Para uma escala maior (culturas de 500 ml), o mesmo procedimento foi seguido, exceto quanto ao procedimento para adição de crotonato de FeSC>4. De acordo com Arch. Microbiol, 127, 279-287 (Bader, J. e colaboradores (1980)), a quantidade de redutase de enoato aumenta se um procedimento de cultura ótimo é seguido, isto é, começando com crotonato a 35 mM ao invés de 7 0 mM e FeSC>4 a 1,8 * 10”5 M. Quando a cultura se torna estacionária, crotonato a 35 mM e FeS04 a 2 * 10-5 M são adicionados. O melhor momento para coletar as células é 12 h após a fase de crescimento estacionária.

II.3 Meio para clones de E. coli TOPIO [056] Um meio rico, meio de Luria Bertani (meio LB; também denominado caldo de Luria ou caldo Lenox; contendo, por L: 10 g de bacto triptona, 5 g de extrato de levedo e 5 g de NaCl) , sob atmosfera de 1%, foi usado para cultura de E. coli TOPIO/pBAD-Ctyr{1)-enr-DEST, E. coli TOPIÜ/pBAD-Hther{1)-enr-DEST e E. colí TOP10/pBAD-nemA_Eco. Cada meio contém um antibiótico apropriado, conforme indicado na parte III abaixo. II. 4 Condições de cultura [057] C. tyrobutyricum DSM14 60 foi cultivado sob condições anaeróbicas {atmosfera de 1½) sobre meio seletivo {veja acima). [058] M. thermoacetica DSM1974 foi cultivado sob condições anaeróbicas (atmosfera de 1½) sobre meio nào-seletivo {PYG) (veja acima). [059] C. tyrobutyricum DSM146Q foi incubado a 37°C e Moorella thermoacetica DSM1974 a 55-60°C. [060] E. coli TOPlO/pBAD-Ctyr(1)-enr-DEST e E. coli TOPlQ/pBAD-Mther(1)-enr-DEST foram cultivados sob condições anaeróbicas {atmosfera de Ν2) a 28°C. [061] E.coli TOPIO/pBAD-nemA_Eco foi cultivado sob condições aeróbicas, a 28°C. III, Construção de vetores e plasmideos III. 1 Procedimentos Gerais [062] Técnicas padrões de clonagem molecular, tais como isolamento de DNA de plasmídeo, eletroforese em gel, modificação por restrição enzimãtica de ácidos nucieicos, transformação em E. coli, etc., foram realizadas conforme descrito por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ou o manual do fornecedor.

Enzimas de clonagem molecular padrões, tais como endonucieases de restrição, T4 DMA ligase, etc. foram obtidas da Invitrogen (Breda, Países Baixos), a menos que de outro modo estabelecido. 01igodeóxinúcleotideos sintéticos foram obtidos da Sigma-Genosys (Cambridge, Reino Unido) e Invitrogen {Paisley, Scotland, Reino Unido). Análise de sequência de DNA foi realizada pela BaseClear (Leiden, Países Baixos) usando o método de término de cadeia com dideóxi-terminadores corante-rotulados.

II 1.2 Construção do Vetor de Destino Gateway™ pBAD/Myc-His-DEST {063) 0 vetor de destino pBAD/Myc-His-DEST, que foi usado para a expressão dos genes de redutase de enoato de Clostridium tyrobutyricum DSM1460 e Moocella thcrmoacetíca DSM1974 em E. coli, bem como para o gene de redutase de N~ etilmaleimida {n emA) de Es cheri chia coli K12 em E. coli TOPIO, foi preparado através de introdução de um cassete cat/ccdB no vetor de expressão de E, coli comercialmente disponível pBAD/Myc-HisC. 0 cassete cat/cedB foi amplificado através de PCR usando: 5*- AAGAAGACCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTC-TACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAACACAAG7TTGT- ACAAAAAAGCTGAAC-y [SEQ ID: No. 1 ] como primer dianteiro {com a sequência promotora duplamente sublinhada, o sitio de reconhecimento e divagem Bpi 1 sublinhado e sequências attR em itálico) e 5'- TTGTTCTACGTAACCAC77TG TACAAGAAAGClGAAC-3’ [SEQ ID. No,2] como primer reverso {com o sitio de divagem SnaBI sublinhado e sequências attR em itálico) e o vetor pDESTlS {Invitrogen) como modelo. A PCR, a qual foi realizada com polimerase Expand High Fidelity (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante, proporcionou um único fragmento. 0 tamanho correto (1792 bp) do fragmento amplificado foi confirmado através de eletroforese em gel de agarose. Após purificação do fragmento amplificado a partir do gel de agarose preparativo com o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha), o fragmento foi digerido até término com BpiI (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) (resultando em uma saliência complementar a BamHI) e SnaBI (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha) e ligado com T4 DNA ligase no vetor de expressão de E. coli pBAD/Myc-HisC (Invitrogen), o qual tinha sido digerido com BamHI e SnaBI. A mistura de ligação foi subsequentemente usada para transformar células de E. coli DB3.1 quimicamente competentes (Invitrogen). Células recombinantes foram selecionadas colocando em lâminas a mistura de transformação inteira sobre lâminas 2*TY contendo 35 ocg/ml de cloramfenicol, seguido por incubação durante a noite a 37°C. Após isolamento do plasmideo recombinante das colônias individuais, os insertos foram sequenciados. Um desses clones provou conter o inserto desejado e foi denominado pBAD/Myc-His-DEST. Embora 7 aberrações fossem observadas entre a sequência de nucleotideos da parte sequenciada do plasmideo pBAD/Myc-His-DEST e a sequência de referência (sequência de nucleotideos de pDEST15 da Invitrogen), todas as características essenciais (resistência ao cloramfenicol, seleção de ccdB e recombinação de attR) do pBAD/Myc-His-DEST eram totalmente funcionais.

III.3 Construção do plasmideo pBAD-Ctyr(1)-enr-DEST (0641 O gene de redutase de enoato de C. Tyrobutyricum foi clonado no vetor de expressão de E. col i pBAD/Myc-His-DEST usando PCR e a Tecnologia Gateway™ (Invitrogen Corp. , Car1sbad, Califórnia, EUA) para clonagem. A rede de leitura aberta da redutase de enoato foi primeiro amplificada por PCR usando: 5 - fi ΠΠACAAfíTTTGTACAAAAAAGCAG GCTAGGAGGAATTAACC-A TGAAAAACAAATCTTTATTTGAACC-3’ [SEQ ID: No.3] como priraer dianteiro {com o sitio de Shine-Delgarno sublinhado, códon inicial ATG em itálico e sitio attBl duplamente sublinhado) e: CCAATTTCATTTCC-3’ [SEQ ID: No.4] como primer reverso (com o códon terminal em itálico e sitio attB2 duplamente sublinhado) e DNA genômico como modelo. O códon inicial foi alterado (GTG para ATG). (065] O DMA genômico foi isolado seguindo um protocolo universal usando produtos Promega. Para isso, 50 ml de meio seletivo com crotonato foram inoculados com C. tyrobutyricum, seguido por subsequente crescimento durante a noite a 28°C. Durante a última meia hora desse crescimento, carbenicilina (concentração final de 200 acg/ml) foi adicionada para enfraquecer a parede celular. Todas as células foram coletadas através de centrifugaçâo e a pelota recebida foi resuspensa em 2,5 ml de Tris-HCl a 50 mM, pH de 8,0 contendo EDTA a 50 mM. Após a adição de 50 ocl de lisüzima (100 mg/ml) e 12,5 «1 de proteinase K (20 mg/ml), a suspensão foi incubada durante 30 minutos a 37DC. Adição de 3 ml de Nuclei Lysis Solution (Promega Corporation, Madison, EUA), seguido por incubação durante 15 minutos a 80°C, levou à lise completa. Após tratamento com RNase (concentração final de 4 ocg/ml) incubada durante 30 minutos a 37°C, 1 ml de Protein Precipitation Solution (Promega Corporation, Madison, EUA) foi adicionado e a solução submetida a turbilhonamento durante 20 segundos e incubada sobre gelo durante 15 minutos. Após centrifugação (15 minutos a 4000 x g, 4°C), o sobrenadante foi transferido para uma mistura de 0,1 volumes de NaAc (3M, pH de 5) e 2 volumes de etanol absoluto. O DNA precipitado foi coletado através de centrifugação (14000 x g durante 15 minutos a 4°C). Finalmente, a pelota foi dissolvida em 1 ml de Tris-HCl a 10 mM (pH de 8). [066] A PCR, a qual foi realizada com PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fornecedor, proporcionou um único fragmento. O tamanho correto (2076 bp) do fragmento amplificado foi confirmado através de eletroforese em gel de agarose. [067] Após purificação do fragmento de PCR amplificado com o kit de purificação por PCR da QIAGEN GmbH, o fragmento foi usado como um substrato para a assim denominada reação de recombinação in vitro BP, a qual foi realizada de acordo com o manual Gateway™ do fornecedor (Invitrogen). Recombinação entre o fragmento de PCR-attB e o Vetor Doador pDONR201 e subsequente transformação da mistura obtida em células competentes de E. coli TOP10 (Invitrogen) resultaram no clone de ENTRADA pDONRCtyr(1)enr. As células recombinantes foram selecionadas colocando em lâminas a mistura de transformação toda sobre lâminas com LB contendo 50 ocg/ml de canamicina, seguido por cultura a 20°C durante o fim de semana. Todas as colônias foram coletadas da lâmina de agar LB e o DNA de plasmideo foi isolado usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH). [068] Subsequentemente, o fragmento de PCR contendo redutase de enoato foi introduzido no vetor de Destino pBAD/Myc-His-DEST (vide infra) via a assim denominada reação de recombinação in vitro LR usando uma mistura dos clones pDONR-Ctyr(1)enr e pBAD/Myc-His-DEST. Também, essa reação foi realizada de acordo com o procedimento do fornecedor. A mistura de recombinação foi usada para transformar células de E. coli TOPIO quimicamente competentes One Shot (Invitrogen). As células recombinantes foram selecionadas colocando em lâminas a mistura de transformação toda sobre lâminas de agar LB contendo 100 ocg/ml de carbenicilina, seguido por incubação durante a noite a 28°C. Após cultura durante a noite das 16 colônias em meio LB contendo 100 ocg/ml de carbenicilina, DNA de plasmideo foi isolado usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, GmbH). Digestão com enzimas de restrição Accl e Rsrll, respectivamente, provou que 11 das 16 colônias testadas continham o plasmideo recombinante desejado pBAD-Ctyr(1)enr-DEST. [069] Uma única colônia do gênero E. coli TOPlO/pBAD-Ctyr(1)enr-DEST foi usada para inocular, sob atmosfera de N2, 5 ml de meio LB suplementado com fosfato de potássio a 50 mM e 100 ocg/ml de carbenicilina. Após crescimento durante a noite, 2,5 ml dessa pré-cultura foram usados para inocular 500 ocl do mesmo meio sob atmosfera de N2. Quando, após umas poucas horas de incubação a 28°C, uma OD62o nm de 0,4 foi atingida, arabinose a 0,05% foi adicionada para iniciar a indução, Após incubação durante a noite a 28eC, as células foram coletadas via centrlfugaçào {10 minutos a 4000 x g, 4 °C) . Após resuspensào das pelotas de células em tampão de fosfato de potássio isento de oxigênio (100 mM, pH de 7,0) com certa de um peso em volume de tampão, as pelotas de células foram armazenadas a - 2 0 ° C, até uso em reações de bioconversão.

III.4 Construção do plasmideo pBAD-Mther(1)-enr-DEST 1 0 7 0 ] 0 gene de redutase de enoato de Moorella thermoacetica foi subclonado no vetor de expressão de E. coli pBAD/Myc-His-DEST usando PCR e a Tecnologia Gateway™ {Invitrogen) , A rede de leitura aberta da redutase de enoato foi primeiro amplificada por PCR usando: 5’- GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGGAGGAATTAACC- A FGGTAGCCTATACCAGACTTTTTG-3' [SEQ ID: No.5] como primer dianteiro (com o sítio de Shine-Delgarno sublinhado, códon inicial ATG em, itálico e sitio afcfcBl duplamente sublinhado) e: 5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC7AAATCCCTCGCCCTACCTC-3 [SEQ ID: No.6] como primer reverso {cora o códon terminai em itálico e sitio attB2 duplamente sublinhado) e DMA genômico como modelo. O códon inicial foi alterado· {GTG para ATG) . 1071) 0 DNA genômico foi isolado seguindo um protocolo universal usando produtos Promega. Para isso, Moorella therrúoacetica foi isolada de um estoque de glicerol feito após crescimento em meio PYG. Todas as células foram coletadas através de centrifugação e a pelota recebida foi resuspensa em 0,25 ml de Tris-HCl a 50 mM, pH de 8,0 contendo EDTA a 50 mM. Após a adição de 0,5 xl de lisozima (100 mg/ml) e 1,25 ocl de proteinase K (20 mg/ml) , a suspensão foi incubada durante 30 minutos a 37°C. Adição de 0,3 ml de Nuclei Lysis Solution (Promega Corporation, Madison, EUA), seguido por incubação durante 15 minutos a 80 °C, levou à lise completa. Após tratamento com RNase (concentração final de 4 ocg/ml) e incubação durante 30 minutos a 37°C, 1 ml de Protein Precipitation Solution (Promega Corporation, Madison, EUA) foi adicionado e a solução foi submetida a turbilhonamento durante 20 segundos e incubada sobre gelo durante 15 minutos. Após centrifugação (15 minutos a 4000 x g, 4°C) o sobrenadante foi transferido para uma mistura de 0,1 volume de NaAc (3M, pH de 5) e 2 volumes de etanol absoluto. O DNA precipitado foi coletado através de centrifugação (a 14000 x g durante 15 minutos; a 4°C). Finalmente, a pelota foi dissolvida em 0,05 ml de Tris-HCl a 10 mM (pH de 8). [072] A PCR, a qual foi realizada com PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fornecedor, ainda proporcionou fragmentos suficientes. Contudo, após uma segunda PCR, fragmentos de PCR suficientes foram recebidos. Além disso, o tamanho correto (2045 bp) do fragmento amplificado foi confirmado através de eletroforese em gel de agarose. [073] Após purificação do fragmento amplificado com o kit de purificação por PCR da QIAGEN GmbH, o fragmento foi usado como um substrato para a assim denominada reação de recombinação in vitro BP, a qual foi realizada de acordo com o manual Gateway™ do fornecedor (Invitrogen). Recombinação entre o fragmento de PCR-attB e o Vetor Doador pDONR201 e subsequente transformação da mistura obtida em células competentes de E. coli TOPIO (Invitrogen) resultaram no clone de ENTRADA pDONR-Mther(1)enr. As células recombinantes foram selecionadas colocando em lâminas a mistura de transformação toda sobre lâminas com LB contendo 50 ocg/ml de canamicina, seguido por cultura a 20 °C durante o fim de semana. Todas as colônias foram coletadas da lâmina de agar LB e o DNA de plasmideo foi isolado usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH). [074] Subsequentemente, o fragmento de PCR contendo redutase de enoato foi introduzido no vetor de Destino pBAD/Myc-His-DEST (vide infra) via a assim denominada reação de recombinação in vitro LR usando uma mistura dos clones pDONR-Mther(1)enr e pBAD/Myc-His-DEST. Também, essa reação foi realizada de acordo com o procedimento do fornecedor. A mistura de recombinação foi usada para transformar células de E. coli TOPIO quimicamente competentes One Shot (Invitrogen). As células recombinantes foram selecionadas colocando em lâminas a mistura de transformação toda sobre lâminas de agar LB contendo 100 ocg/ml de carbenicilina, seguido por incubação durante a noite a 28°C. Após cultura durante a noite das 16 colônias em meio LB contendo 100 ocg/ml de carbenicilina, DNA de plasmideo foi isolado usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, GmbH). Digestão com enzimas de restrição Xmal e BarnHI, respectivamente, provou que 4 das 16 colônias testadas continham o plasmideo recombinante desejado pBAD-Mther(1)enr-DEST. [075] Uma única colônia do gênero E. coli TOPlO/pBAD-Mther(1)enr-DEST foi usada para inocular, sob atmosfera de N2, 5 ml de meio LB suplementado com fosfato de potássio a 50 raM e 100 ocg/ml de carbenicilina. Após crescimento durante a noite, 2,5 ml dessa pré-cultura foram usados para inocular 500 ocl do mesmo meio sob atmosfera de Nj. Quando, após umas poucas horas de incubação a 28°C, uma ODèjo nm de 0,4 foi atingida, arabinose a 0,05% foi adicionada para iniciar a indução. Após incubação durante a noite a 28°C, as células foram coletadas via centriíugação (10 minutos a 4000 κ g, 4 eC) . Após resuspensão das pelotas de células em tampão de fosfato de potássio isento de oxigênio (100 mM, pH de 7,0) com certa de um peso em volume de tampão, as pelotas de células foram armazenadas a -20eC, até uso em reações de bioconversâo. III,5 Construção do plasmideo pBAD-nemA_Eco [076J 0 gene nem A de Escherichia coli K12 (gênero W3110) (número de acesso: D86931) para redutase de N- etilmaleimida foi clonado no vetor de expressão de E. col i pBAD/Myc-His-DEST usando PCR e a Tecnologia Gateway™ {Invitrogen). A rede de leitura aberta do nemA foi primeiro amplificada foi PCR usando: ArGTCATCTGAAAAACTGTATTCCCC-3· [SEG ID: No.7] como primer dianteiro (com o sitio de Shine-Delgarno sublinhado, códon inicial ATG em itálico e sitio attBl duplamente sublinhado) e: 5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT7TACAACGTCGGGTAATCGG TATAGC-3’ [SEQ 1D: No.8] como primer reverso (com códon terminal em itálico e sítio attB2 duplamente sublinhado) e DNA genômico de Escherichia coli Kl2 (gênero W3110) como modelo. 1077 J A PCR, realizada com AccuPrime Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fornecedor, proporcionou um único fragmento final. 0 tamanho correto (1169 bp) do fragmento amplificado foi confirmado através de eletroforese em gel de agarose. [078] Após purificação do fragmento amplificado com o kit de purificação por PCR da QIAGEN GmbH, o fragmento foi usado como um substrato para a assim denominada reação de recombinação in vitro BP, a qual foi realizada de acordo com o manual Gateway™ do fornecedor (Invitrogen). Recombinação entre o fragmento de PCR-attB e o Vetor Doador pDONR201 e subsequente transformação da mistura obtida em células competentes de E. coli DH5 (Invitrogen) resultaram no clone de ENTRADA pENTR-nemA_Eco. As células recombinantes foram selecionadas colocando em lâminas a mistura de transformação toda sobre lâminas com LB contendo 50 ocg/ml de canamicina, seguido por cultura a 20 °C durante o fim de semana. Todas as colônias foram coletadas da lâmina de agar LB e o DNA de plasmideo foi isolado usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH). [079] Subsequentemente, o fragmento de PCR contendo nemA foi introduzido no vetor de Destino pBAD/Myc-His-DEST (vide infra) via a assim denominada reação de recombinação in vitro LR usando uma mistura dos clones pENTR-nemA_Eco e pBAD/Myc-His-DEST. Também, essa reação foi realizada de acordo com o procedimento do fornecedor. A mistura de recombinação foi usada para transformar células de E. coli TOPIO quimicamente competentes One Shot (Invitrogen). As células recombinantes foram selecionadas colocando em lâminas a mistura de transformação toda sobre lâminas de agar LB contendo 100 ocg/ml de carbenicilina, seguido por incubação durante a noite a 28°C. Após cultura durante a noite de 3 clones em meio LB contendo 100 ocg/ml de carbenicilina, DNA de plasmideo foi isolado usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, GmbH). Digestão com enzimas de restrição EcoRV e FspI, respectivamente, provou que todas as colônias testadas continham o plasmideo recombinante desejado pBAD-nemA_Eco. [080] Adicionalmente, esses clones do gênero E. coli TOPIO/ pBAD-nemA_Eco foram usados para inocular 50 ml de meio LB suplementado com 100 ocg/ml de carbenicilina em frascos de Erlenmeyer de 500 ml estéreis até uma densidade celular de OD62o de 0,05. Essas culturas de 50 ml foram incubadas a 28°C sobre um agitador orbital com 180 rotações por minuto (rpm) . Em uma OÜ620 de 0,6, arabinose a 0,02% foi adicionada para iniciar a indução. Após incubação durante a noite a 28°C, as células foram coletadas via centrifugação (10 minutos a 4000 x g, 4°C) . Após resuspensão das pelotas de células em 2 ml de tampão de fosfato de potássio (100 mM, pH de 7,0), as pelotas de células foram armazenadas a -20°C em porções de 1 ml até outro uso. [081] As células foram subsequentemente rompidas através de ultra-som (usando um MSE Soniprep 150 com um pequeno bocal; 10 segundos de ultra-som com uma altitude de 5-10 microns, seguido por 10 segundos de ruptura. O ciclo total durou 5 minutos. Durante esse procedimento, a solução foi mantida gelada usando um banho gelado de acetona). As células rompidas foram centrifugadas (16.000 x g durante uma hora) e o extrato isento de células foi armazenado a 4°C até o ensaio para redução de 6-ACA ser realizado. IV. Métodos Analíticos [082] Dependendo dos componentes a serem analisados, alguns métodos de HPLC (Cromatografia de Liquido de Elevado Desempenho) diferentes e LC-MS (Cromatografia de Liquido acoplada com Espectrometria de Massa) usando técnicas de MS em estágio múltiplo, como MS2-SRM (Monitoramento de Reação Seletiva) e/ou MS3-CRM (Monitoramento de Reação Consecutiva), foram usados, as condições dos quais sendo mostradas abaixo.

IV.a Analise por HPLC para medição de 6-AHEA e 6-ACA [083] Coluna: Prevail C18 da Alltech (D.I. de 250 mm x 4,6 mm, 5 oc) [084] Temperatura da coluna: ambiente (± 22°C) [085] Fluxo: ±1,0 ml/min [086] Volume de injeção: 20 ou 100 ocl (maior sensitividade do método a 100 ocl) [087] Tempo de operação: 20 a 40 minutos (dependendo da base da matriz, isto é, tempo de operação mais longo no caso de mais picos laterais presentes) [088] Eluente: ácido perclórico a 100 mM em água, pH de 1,0 (16,3 g de ácido perclórico a 70%/litro de água) [089] Solução de amostra: eluente [090] Detecção: reação pós-coluna/fluorescência (simultaneamente a Xex 388 ηιη/λθΐη > 420 nm) (reação pós-coluna com aldeido orto-ftálico/mercaptoetanol (OPA/MCE), temperatura ambiente, a 1,0 ml/min) [091] Tempos de retenção: 14,2 minutos para 6-ACA; 11,7 minutos para 6-AHEA

IV.bl Analise por LC-MS2 foi usada sob as seguintes condições de LC-, resp. MS [092] Equipamento: espectrômetro de massa por contenção de ions LCQ da Thermo Finnigan [093] Coluna: Prevail C18 de 250 x 4,6 mm (Alltech) [094] Eluente: ácido fórmico a 0,025% (v/v) em água (pH de 3,2) [095] Fluxo: 1 ml/min; antes de entrar no MS o fluxo é dividido a 1:5 [096] Volume de injeção: 100 ocl [097] Eletropulverização MS no modo de íons positivo: no modo de LC-MS2-SRM (uma análise altamente seletiva e sensível), com condições de MS como segue: [098] Condições da fonte: : gás da bainha: 60 : gás aux./varredura: 25 : tensão de pulverização: 5 kV

: temperatura do capilar: 300°C

: tensão do capilar: 5V

: offset das lentes do tubo: 25V [099] Evento de exploração: : massa original: 132,0 : largura de isolamento: 1,1 amu : energia de colisão norm.: 28% : ativação Q: 0,250 : energia de ativação: 30 mseg. : faixa de SRM: 114, largura 1,2 (113,4-114,6 amu) IV. b2 Análise por LC-MS2 foi usada (em outras análises, conforme indicado abaixo) sob as seguintes condições de LC-, resp. MS, diferindo daquelas mencionadas em IV.lb: [100] Equipamento: HP1100 LC System (Agilent Technologies) acoplado a um espectrômetro de massa por contenção de ions LCQ Deca XP da Thermo Finnigan. [101] Coluna LC: Nucleosil 120-5 Cl8 de 50 x 4,6 mm (Machery & Nagel) em série com dCl8 Atlantis de 150 x 4 mm, 5 acm (Waters) [102] Temperatura da coluna: ambiente (± 22eC) [103] Eluente: ácido fórmico a 0,025% (v/v) + acetonitrilo em água a 1% (pH de 3,2) [104] Fluxo: 1 ml /min; antes de entrar no MS o fluxo ê dividido a 1: 5 [105] Volume de injeção: 2 acl [10 6] Modo dé MS CRM [Monitoramento dé Reação Consecutiva) [uma análise altamente seletiva e sensível), foi usado para detectar seletivamente o 6-ACA, com condições de MS como segue: [107] Técnica de ionização: eletropulverização por ions positivos [108] Condições da fonte: : gás da bainha: 60 : gás aux,/varredura: 10 ; tensão de pulverização: 4 kV

; temperatura do capilar: 330°C

: tensão do capilar: 5V

: offset das lentes do tubo: 1SV [109] CRM no modo de exploração: MS1: massa original: 132,0 : largura de isolamento: 1,0 amu : energia de colisão norm,: 26% MS':: massa original: 114,0 : largura de isolamento: 1,0 amu : energia de colisão norm.: 26% : faixas de CRM: 78,5-79,5 e 95,5- 96,5 amu [110] Sob as condições cromatográficas conforme descrito em IV.bl, 6-ACA eluiu a 3,5 minutos. 6-ACA foi, então, determinado quantitativamente usando as condições cromatográficas sob IV.b2 combinado com condições de SRM espectrométrica de massa, conforme descrito sob IV.bl. A presença de 6-ACA em amostras positivas a partir de análise por SRM é confirmada realizando o experimento de CRM MS3 e verificando a presença e proporção de intensidade de ions m/z 79 e 96. IV.c Análise por GC-MS foi realizada na maioria das análises, usando um cromatógrafo de gás HP6890 sob as seguintes condições de GC-, resp. MS: [111] Condições de GC: Tipo de GC: HP6890 GC + Ata Focus Autosampler Tipo de coluna: CPSIL8CB, Low Bleed/MS

Dimensões da coluna: D.I. de 30 m x 0,25 mm x 1,0 ocl Temperatura do forno: 60°C (1 min) —» 20°C/min —> 280°C (0 min) Fluxo da coluna: 1,2 ml/min, hélio, fluxo constante Tipo de injeção: sem divisão (tempo sem divisão de 1 min) Revestimento: Altech (art. 4928) adaptado com um tampão de lã de vidro desativada Temperatura de injeção: 300°C

Volume de injeção: 0,5 ocl Condições de MS: Tipo de MS: HP5973 MSD Temperatura da fonte de MS: 230°C Temperatura quad. MS: 150°C Temperatura aux.: 250°C Modo de exploração: SIM, m/z 113 V. Bioconversões V. (a) Bioconversão de 6-AHEA em 6-ACA por C. tyrobutyricum; análise por HPLC [112] Tampão isento de O2 (fosfato de potássio a 100 mM, pH de 6,0) foi transferido para garrafas de penicilina sob uma corrente de nitrogênio em uma caixa com luva. As garrafas foram fechadas com rolhas de borracha de butila. Após isso, as reações foram iniciadas através de injeção de substrato 6-AHEA (solução de estoque a 100 mM; ajustado para um pH de 6) e/ou células (pelotas de células de C. tyrobutyricum armazenadas a -20°C e resuspensas em fosfato de potássio a 100 mM, pH de 7) através da rolha. Finalmente, NADH foi adicionado (100 ocl de uma solução de estoque a 5 mM) . A mistura de reação (volume total de 2,3 ml) consistia de tampão de fosfato (100 mM, pH de 6,0), ácido 6-amino-hex-2-enóico a 5 mM e NADH a 0,23 mM. [113] Além disso, uma mistura de células placebo (sem substrato) e uma mistura placebo quimica (sem células) foram feitas. Todas as garrafas de reação foram incubadas a 37°C. Em diferentes intervalos de tempo, amostras de 0,5 ml foram tomadas, a partir das quais células foram subsequentemente removidas através de centrifugação (centrifuga Eppendorf 5415 C, 10 minutos, rpm max., 4°C) e as amostras foram armazenadas a -20°C até análise.

Exatamente antes de análise por HPLC, as amostras foram diluídas 5 a 10 vezes com eluente {ácido perclórico a 100 mM em água, pH de 1,0). Os resultados são resumidos na Tabela 1.

Tabela 1: Formação de 6-ACA através de bio-reduçáo de 6-ΑΗΞΛ por células de Clostridium tyrobutyrícum [114] A Tabela 1 mostra que Clostridium tyrobutyrícum pode realizar a bío-redução de 6-AHEA em 6-ACA. A concentração de 6-ACA aumenta com o tempo. Nenhum 6-ACA pôde ser observado na mistura de células placebo ou na mistura placebo química. A identidade química do 6-ACA resultante foi confirmada com LC-MS-MS usando monitoramento de reação seletiva nas condições de fonte e evento de exploração conforme descrito em IV.b. V.(b) Bioconversão de 6-AHEA em 6-ACA por E.coli pBAD-Ctyr (1)-enr-DEST e E. coli pBAD-Mther(1)-enr-DEST; análise através de HFLC e LC-MS-MS SRM: [115] Uma solução isenta de 02 de 6-AHEA (20 mM em tampão de fosfato de potássio a 20 mM, pH de 6,0) foi transferida para garrafas de penicilina sob uma corrente de nitrogênio em uma caixa com luva. As garrafas foram fechadas com rolhas de borracha de butíla. Após o que, as reações foram iniciadas através de injeção células (pelotas de células armazenadas a -20°C, resuspensas em fosfato de potássio a 100 mM, pH de 7,0) e solução de NADH através da rolha. A mistura de reação {tendo um volume total de cerca de 3 ml) consistia de tampão de fosfato (100 mM, pH de 6,0), 6-AHEA a 20 mM e NADH a 0,23 mM. [116] Além disso, uma mistura de células placebo (sem substrato) e uma mistura placebo química {sem células) foram feitas. Após 44 horas de incubação, amostras de 0,5 ml foram tomadas, a partir das quais células foram, subsequentemente removidas através de centrífugação {centrífuga Eppendorf 5415 R, 14.000 rpm, 10 minutos, 40C) e as amostras foram armazenadas a -2G°C até análise. Exatamente antes de análise por HPLC, as amostras foram diluídas 5 a 10 vezes com eluente para HPLC {ácido perclóríco a 100 mM em água, pH de 1,0) e exatamente antes de análise por LC-MS-MS, as amostras foram diluídas 5 a 10 vezes com eluente para MS (ácido fórmico a 0,0251 {v/v) em água (pH de 3,2)). Os resultados são resumidos na Tabela 2.

Tabela 2: 6-ACft formado através de bio-redução de 6-AHEA pelos clones de redutase de enoato E. coli pBAD-Ctyr(1) -enr-DF.ST e E. coli pBAD-Mther (1) -enr-DF.ST [117] A Tabela 2 mostra que E, coli pBAD-Ctyr (1) -en r-DEST e E, coli pBAD-Mther(1)-enr-DEST realizam a bio-reduçao de 6-AHEA em 6-ACA. Nenhum 6-ACA pôde ser observado na mistura de células placebo ou na mistura placebo química.

V. (c) Bioconversão de 6-AHEA em 6-ACA por E. coli TOPlO/pBAD-nemA_Eco; análise por LC-MS3 CRM [118] Uma mistura de reação consistindo de tampão de Tris a 100 mM, pH de 7,5, incluindo glicose a 20 mM, 6-AHEA a 5 mM, NADPH a 7,0 mM, NADH a 7,0 mM e 10 U/ml de oxidase de glicose foi preparada. Para iniciar a bioconversão de 6-AHEA em 6-ACA, 400 «d, de extrato isento de células de E, coli TGPl0/pBAD-nemA_Eco foram adicionados [volume total de reação de 1 ml). Após 23 horas e 48 horas, amostras de 250-300 acl foram tomadas para análise por LC-MS'" SRM. Além disso, uma mistura placebo química (sem extrato isento de células) foi incubada sob as mesmas condições e amostras coletadas após os mesmos tempos de incubação. Os resultados são resumidos na Tabela 3.

Tabela 3. Formação de 6-ACA através de bio-redução de 6-AHEA por extrato isento de células de E. coli TOPlO/pBAD- nemA_Eco [119] A Tabela 3 mostra que extrato isento de células de E. coli TOPlG/pBAD-nemA_Eco realiza a bio-redução de 6-AHEA em 6-ACA. Nenhum 6-ACA pôde ser observado na mistura placebo química. [120] Confirmação de 6-ACA nessas amostras foi realizada através de determinação da presença e proporção de intensidade dos íons do fragmento MS'1 com m/z 96 e 79, conforme determinado na análise por CRM e comparando a proporção com aquelas de um padrão de calibração de 6-ACA tratado da mesma maneira. Os resultados são resumidos na Tabela 4.

Tabela 4. Proporção de intensidade para íons de fragmento m/z 96 e 79 a partir da análise por CEM

VI. Biotransformação de 6-AHEA em 6-ACA; ciclizaçâo de 6-ACA [121] Uma solução isenta de 02 de 6-AHEA (2 0 mM em tampão de fosfato a 100 mM, pH de 6,0) foi transferida para garrafas de penicilina sob uma corrente de N; em uma caixa com luva. As garrafas foram fechadas com rolhas de borracha de butila. Após o que, a bio transformação foi iniciada através de injeção de células do clone de redutase de enoato E. coli pBAD-Ctyr(1}-enr-DEST (pelotas de células armazenadas a -20 “C, resuspensas em tampão de fosfato de potássio a 100 mM, pH de 7,0) e solução de NADH através da rolha. A mistura de reação, tendo um volume total de cerca de 3 ml, continha tampão de fosfato de potássio (100 ml, pH de 6,0), 6-AHEA a NADH a 0,23 mM. [122] Após 44 horas de incubação, uma amostra de 0,5 ml foi tomada, a partir da qual células foram removidas através de centrífugação (centrifuga Eppendorf 5415 R; 14.000 rpm; 10 minutos; 4 °C) e a amostra foi armazenada a - 20°C até ciclização do 6-ACA formado em caprolactama ser iniciada através de injeção da amostra sobre um cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massa (GC-MS, conforme descrito acima). Através de comparação dos resultados com aqueles obtidos com injeção sobre o mesmo cromatógrafo a gás de uma solução placebo quimica consistindo de tampão de fosfato de potássio (100 ml, pH de 6,0), 6-AHEA a 20 mM e NADH a 0,23 mM, a ciclização de 6-ACA formado na biotransformação pôde ser confirmada. A quantidade de caprolactama assim obtida foi calculada em torno de 2,7 ppm.

Claims (24)

1. Processo para a síntese bioquímica de ácido 6-amino capróico (6-ACA) caracterizado pelo fato do ácido 6-amino-hex-2-enóico da fórmula [1] (6-AHEA): ou do ácido 6-amino-2-hidróxi-hexanóico (6-AHHA), um composto capaz de ser transformado em ácido 6-amino-hex-2-enóico, ser tratado com uma redutase de enoato ou uma redutase de N-etilmaleimida.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a redutase de N-etilmaleimida se origina a partir de uma espécie do gênero Escherichia.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a redutase de enoato se origina a partir de uma espécie do gênero Clostridium ou Moorella.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a redutase de enoato se origina a partir de Clostridium tyrohutyricum DSM1460 ou Moorella thermoacetica DSM1974.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da redutase de enoato ou da redutase de N-etilmaleimida ser aeroestável.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a redutase de N-etilmaleimida se origina a partir de uma espécie Escherichia coli.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a espécie Escherichia coli é Escherichia coli K12.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato do 6-AHEA ser convertido no 6-ACA em um pH na faixa de 3 a 9.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato do pH estar na faixa de 4 a 8.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do pH estar na faixa de 5 a 8.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato do pH estar na faixa de 5,5 a 7 sob condições anaeróbicas e de 6,5 a 8 sob condições aeróbicas.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato do processo ser realizado em um organismo hospedeiro selecionado do grupo de gêneros consistindo em Aspergillus, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia e Pichia.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato do processo ser realizado em um organismo hospedeiro selecionado do grupo de organismos hospedeiros Escherichia coli, Bacillus, Corynebacterium glutamicum, Aspergillus niger ou Pichia pastoris.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que, no organismo hospedeiro, um gene que codifica a redutase de enoato ou uma redutase de N-etilmaleimida é clonado e expresso.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato do processo ser realizado em um microorganismo em que o 6-AHEA está sendo formado in vivo.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato do 6-AHEA ser formado in vivo a partir de soluções ou pastas contendo uma fonte de carbono adequada.

17. Célula hospedeira de Bacillus caracterizada por compreender o gene de redutase de enoato de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460, em que o gene é clonado e expresso.

18. Célula hospedeira de Corynebacterium glutamicum caracterizada por compreender o gene de redutase de enoato de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460, em que o gene é clonado e expresso.

19. Célula hospedeira de Aspergillus niger caracterizada por compreender o gene de redutase de enoato de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460, em que o gene é clonado e expresso.

20. Célula hospedeira de Pichia pastoris caracterizada por compreender o gene de redutase de enoato de Moorella thermoacetica DSM1974 ou de Clostridium tyrobutyricum DSM1460, em que o gene é clonado e expresso.

21. Célula hospedeira selecionada do grupo de células hospedeiras de Aspergillus, Bacillus, Corynebacterium e Pichia, caracterizada por compreender o gene nemA de E. coli K12, em que o gene é clonado e expresso.

22. Ácido β-amino-hexanóico (β-ACA) bioquimicamente produzido caracterizado pelo fato de ter uma proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C em torno do mesmo valor conforme ocorre em dióxido de carbono ambiental.

23. ε-Caprolactama caracterizada pelo fato de ser produzida a partir do β-ACA bioquimicamente produzido, conforme definido na reivindicação 22, e ter uma proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C em torno do mesmo valor conforme ocorre em dióxido de carbono ambiental.

24. Náilon-6 caracterizado pelo fato de ser produzido a partir do 6-ACA bioquimicamente produzido, conforme definido na reivindicação 22, ou da ε-caprolactama, conforme definida na reivindicação 23, e ter uma proporção de isótopos 12C versus 13C versus 14C em torno do mesmo valor conforme ocorre em dióxido de carbono ambiental.