BRPI0406469B1 - Construções de expressão recombinante e métodos de regulação da expressão de pelo menos uma sequência de nucleotídeos - Google Patents
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Abstract
"fragmentos de ácido nucleico isolados, construção de expressão recombinante, planta e métodos de regulagem da expressão". são descritos promotores de p34 e anexina vegetais específicos de sementes e seus subfragmentos, bem como seu uso na promoção da expressão de um ou mais fragmentos de ácido nucleico heterólogos em plantas.
Description
“CONSTRUÇÕES DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE E MÉTODOS DE REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PELO MENOS UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS”
O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 60/446,833, depositado em 12 de fevereiro de 2003, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente como referência.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a um promotor vegetal, particularmente a promotores de P34 e anexina e seus subfragmentos e a seu uso na regulagem da expressão de pelo menos um fragmento de ácido nucléico heterólogo em plantas.
Antecedentes da Invenção
Avanços recentes na engenharia genética das plantas abriram novas portas para plantas de engenharia que possuem características ou traços aprimorados, tais como resistência a doenças vegetais, resistência a insetos, resistência a herbicidas, maior estabilidade ou meia-vida do produto de consumo final obtido de plantas e melhoria da qualidade nutricional das partes comestíveis da planta. Desta forma, um gene desejado (ou genes) de uma fonte diferente da planta, mas elaborado para proporcionar características ou qualidades diferentes ou aprimoradas, pode ser incorporado ao genoma da planta. Este(s) novo(s) gene(s) pode(m) ser então expresso(s) na célula vegetal para exibir o fenótipo desejado, tal como novo traço ou característica.
Os sinais reguladores adequados devem estar presentes e estar no local adequado com relação ao gene, a fim de obter expressão do gene recém-inserido na célula vegetal. Estes sinais reguladores incluem uma região promotora, uma sequência líder não traduzida 5' e uma sequência de poliadenilação/término de transcrição 3'.
Um promotor é uma sequência de DNA que dirige a maquinaria celular de uma planta para produzir RNA da sequência de codificação contígua a jusante (3') do promotor. A região promotora influencia a velocidade, estágio de desenvolvimento e tipo de célula em que é elaborado o RNA transcrito do gene. O RNA transcrito é processado para produzir RNA mensageiro (RNAm) que serve como modelo para tradução da sequência de RNA para a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado. A sequência líder não traduzida 5' é uma região do RNAm a montante da região de codificação de proteína que pode desempenhar um papel no início e tradução do RNAm. O sinal de poliadenilação/término de transcrição 3' é uma região não traduzida a jusante da região de codificação da proteína que funciona nas células vegetais para causar o término do RNA transcrito e a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do RNA.
Demonstrou-se que certos promotores são capazes de dirigir a síntese de RNA em velocidade mais alta que outros. Estes são denominados “promotores fortes”. Demonstrou-se que alguns outros promotores dirigem a produção de RNA em níveis mais altos somente em tipos específicos de células ou tecidos e são frequentemente denominados “promotores específicos de tecidos”. Neste grupo, muitos promotores de genes de proteínas de armazenagem de sementes foram bem caracterizados e são utilizados amplamente, tais como o promotor de gene faseolina de Phaseolus vulgaris, gene heliantina de girassol, o gene β-conglicinina de soja (Chen et al., (1989), Dev. Genet. 10, 112-122), o promotor gênico de napina de Brassica napus (Ellerstrom et al., (1996), Plant Mol. Biol. 32, 1019-1027), os promotores gênicos de oleosina de Brassica e Arabidopsis (Keddie et al., (1994), Plant Mol. Biol. 24, 327-340; Li (1997), Texas A&M Ph.D Dissertation, págs. 107-128; Plant et al.,, (1994), Plant Mol. Biol. 25, 193-205). Outra classe de promotores específicos de tecidos é descrita na patente US 5.589.583, emitida para Klee et al., em 31 de dezembro de 1996; estes promotores vegetais são capazes de conferir altos níveis de transcrição de genes quiméricos em tecidos meristemáticos e/ou células em rápida divisão. Ao contrário de promotores específicos de tecidos, “promotores indutíveis” dirigem a produção de RNA em resposta a certos fatores ambientais, tais como choque de calor, luz, hormônios, concentrações de íons etc. (Espartero et al., (1994), Plant Mol. Biol. 25, 217-227; Gomez-Gomez e Carrasco (1998), Plant Physiol. 117, 397-405; Holtorf et al., (1995), Plant Mol. Biol. 29, 637-646; MacDowell et al., (1996), Plant Physiol. 111, 699-711; Mathur et al., (1992), Biochem. Biophys. Acta 1137, 338348; Mett et al., (1996), Transgenic Res. 5, 105-113; Schoffi et al., (1989), Mol. Gen. Genet. 217, 246-253; Ulmasov et al., (1995), Plant Physiol. 108, 919-927).
Como os padrões de expressão de gene quimérico (ou genes) introduzidos em uma planta são controlados através do uso de promotores, existe interesse contínuo no isolamento e identificação de promotores inovadores que sejam capazes de controlar a expressão de um ou mais genes quiméricos. São de interesse específico promotores que se expressam somente nas sementes em desenvolvimento. Outra característica desejável de um promotor seria um padrão de expressão que ocorre logo após a polinização na semente em desenvolvimento.
Descrição Resumida da Invenção
A presente invenção refere-se a um fragmento de ácido nucléico isolado que compreende um promotor em que o mencionado promotor consiste essencialmente na sequência de nucleotídeos descrita na SEQ ID N° 1, 2, ou 13 a 22 ou o mencionado promotor consiste essencialmente em um fragmento ou subfragmento que é substancialmente similar e funcionalmente equivalente à sequência de nucleotídeos descrita na SEQ ID N° 1,2 ou 13 a 22.
Em uma segunda realização, a presente invenção refere-se a um gene quimérico que compreende pelo menos um fragmento de ácido nucléico heterólogo operacionalmente ligado ao promotor de acordo com a presente invenção.
Em uma terceira realização, a presente invenção refere-se a plantas que compreendem esse gene quimérico e sementes obtidas a partir dessas plantas.
Em uma quarta realização, a presente invenção refere-se a um método de aumento ou redução da expressão de pelo menos um fragmento de ácido nucléico heterólogo em uma célula vegetal que compreende:
(a) a transformação de uma célula vegetal com o gene quimérico descrito acima;
(b) o cultivo de plantas maduras férteis a partir da célula vegetal transformada da etapa (a); e (c) a seleção de plantas que contenham a célula vegetal transformada, em que a expressão do fragmento de ácido nucléico heterólogo é aumentada ou reduzida.
Em uma quinta realização, a presente invenção refere-se a um fragmento de ácido nucléico isolado que compreende um promotor vegetal específico de semente de anexina, ou P34.
Breve Descrição das Figuras e Listagem de Sequências
A presente invenção pode ser mais facilmente compreendida a partir do relatório descritivo detalhado a seguir, das figuras e da listagem de sequências que fazem parte do presente pedido. A listagem de sequências contêm os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido em 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825, que são incorporados ao presente como referência.
SEQ ID N° 1 é a sequência de DNA que compreende um promotor de anexina de soja de 2012 nucleotídeos.
SEQ ID N° 2 é a sequência de DNA que compreende um promotor de P34 de soja de 1408 nucleotídeos.
SEQ ID N° 3 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na primeira amplificação por PCR do promotor de anexina.
SEQ ID N° 4 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na segunda amplificação por nested PCR do promotor de anexina.
SEQ ID N° 5 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na primeira amplificação por PCR do promotor P34.
SEQ ID N° 6 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na segunda amplificação por nested PCR do promotor de P34.
SEQ ID N° 7 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na amplificação por PCR do promotor de anexina quando pareado com SEQ ID N° 8 ou 11.
SEQ ID N° 8 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na amplificação por PCR do promotor de anexina quando pareado com SEQ ID N° 7.
SEQ ID N° 9 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na amplificação por PCR do promotor de P34 quando pareado com SEQ ID N° 10 ou 12.
SEQ ID N° 10 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na amplificação por PCR do promotor de P34 quando pareado com SEQ ID N° 9.
SEQ ID N° 11 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na amplificação por PCR do promotor de anexina quando pareado com SEQ ID N° 7.
SEQ ID N° 12 é um primer de oligonucleotídeo utilizado na amplificação por PCR do promotor de anexina quando pareado com SEQ ID N° 9.
SEQ ID N° 13 é uma forma truncada a 93,6% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 14 é uma forma truncada a 85,4% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 15 é uma forma truncada a 77,2% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 16 é uma forma truncada a 67,9% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 17 é uma forma truncada a 57,7% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 18 é uma forma truncada a 48,1% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 19 é uma forma truncada a 38,3% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 20 é uma forma truncada a 29,0% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 21 é uma forma truncada a 21,2% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
SEQ ID N° 22 é uma forma truncada a 8,6% do promotor de anexina (SEQ ID N° 1).
Figura 1: Expressão do GUS-Promotor de Anexina de Soja em Arabidopsis. As sementes escuras em desenvolvimento são manchadas de azul devido à expressão específica de GUS nas sementes. Isso demonstra que o promotor de anexina é capaz de dirigir a expressão específica de semente de uma construção repórter. As sementes não transformadas não são azuis e aparecem como sementes claras.
Figura 2: Expressão do GUS-Promotor de P34 da soja em Arabidopsis. Como ocorre na Figura 1, as sementes com manchas azuis são transformadas com a construção de GUS-Promotor de P34 e demonstram que P34 é capaz de direcionar a expressão específica de sementes.
Figura 3: Padrões de Expressão Temporal de Promotores de Sementes de Soja. Os padrões de expressão de promotores de anexina, P34, subunidade β de β-conglicinina, subunidade α de β-conglicinina, glicinina, inibidor de tripsina de Kunitz e 2S albumina são exibidos em cronograma de desenvolvimento de sementes de soja. Os tempos são “dias após a fertilização” (DAF). O promotor de anexina é o promotor específico de semente mais precocemente conhecido.
Figura 4: Acúmulo de GLA em Embriões Somáticos de Soja. A expressão de δ-6-dessaturase em sementes de soja permite o acúmulo de ácido λ-linolênico (GLA, normalmente não encontrado em sementes de soja). A expressão de δ-6-dessaturase pelos promotores específicos de sementes de subunidade α de β-conglicinina, anexina, glicinina e P34 é capaz de gerar GLA em soja transgênica. Os níveis de GLA produzidos por anexina são comparáveis com os níveis obtidos pelos fortes promotores de glicinina e βconglicinina.
Figura 5: Análise de Exclusão do Promotor de Anexina de Soja. O promotor de anexina de soja de comprimento total (SEQ ID N° 1) foi truncado para formar fragmentos de deleção que são testados para determinar a atividade promotora (SEQ ID N° 13 a 22). São exibidos os elementos reguladores discutidos no Exemplo 3.
Figura 6: Testes de Resistência do Promotor. Os promotores de comprimento total e truncados exibidos na Figura 5 foram fundidos a um repórter GUS e transformados em Arabidopsis. Sementes de transformantes de Arabidopsis foram testadas para determinar a atividade de GUS, para definir as resistências correspondentes dos vários promotores. Os resultados são exibidos com os desvios padrão dos testes.
Descrição Detalhada da Invenção
Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações mencionadas no presente são integralmente incorporadas como referência.
No contexto do presente relatório descritivo, deverá ser utilizada uma série de termos.
Da forma utilizada no presente documento, “fragmento de ácido nucléico isolado” é um polímero de ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA) que possui fita simples ou dupla e contém opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Fragmento de ácido nucléico isolado na forma de DNA pode ser composto de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.
As expressões “polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeos”, “sequência de ácido nucléico” e “fragmento de ácido nucléico”/“fragmento de ácido nucléico isolado” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Estas expressões englobam sequências de nucleotídeos e similares. Um polinucleotídeo pode ser um polímero de RNA ou DNA que seja de fita simples ou dupla e que contenha opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo na forma de polímero de DNA pode ser composto de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou suas misturas. Os nucleotídeos (normalmente encontrados na sua forma de 5'-monofosfato) são indicados por uma designação de uma letra conforme segue: “A” para adenilato ou deoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), “C” para citidilato ou deoxicitidilato, “G” para guanilato ou deoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para deoxitimidilato, “R” para purinas (A ou G), “Y” para pirimidinas (C ou T), “K” para G ou T, “H” para A, C ou T, “I” para inosina e “N” para qualquer nucleotídeo.
As expressões “subfragmento que é funcionalmente equivalente” e “subfragmento funcionalmente equivalente” são utilizadas de forma intercambiável no presente documento. Estas expressões designam uma parte ou subsequência de um fragmento de ácido nucléico isolado em que a capacidade de alteração da expressão genética ou produção de um certo fenótipo é retida caso o fragmento ou subfragmento codifique ou não uma enzima ativa. O fragmento ou subfragmento pode ser utilizado, por exemplo, no design de genes quiméricos para produzir o fenótipo desejado em planta transformada. Os genes quiméricos podem ser projetados para uso em cosupressão ou antisense através da ligação de um fragmento de ácido nucléico ou subfragmento destes, codificando ou não uma enzima ativa, na orientação apropriada com relação a uma sequência promotora vegetal.
As expressões “substancialmente similar” e “substancialmente correspondente”, da forma utilizada no presente, designam fragmentos de ácidos nucléicos em que modificações em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a capacidade do fragmento de ácido nucléico de mediar a alteração da expressão gênica ou produzir um certo fenótipo. Estas expressões também designam modificações dos fragmentos de ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, tais como deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alterem substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucléico resultante com relação ao fragmento não modificado inicial. Compreende-se, portanto, como apreciarão os técnicos no assunto, que a presente invenção engloba mais que as sequências de exemplos específicas.
Além disso, os técnicos no assunto reconhecem que sequências de ácido nucléico substancialmente similares englobadas pela presente invenção também são definidas pela sua capacidade de hibridização sob condições moderadamente estringentes (tais como 0,5 X SSC, 0,1% SDS, 60 °C) com as sequências exemplificadas no presente, ou a qualquer parte das sequências de nucleotídeos relatadas no presente documento e que são funcionalmente equivalentes ao promotor de acordo com a presente invenção. As sequências de ácido nucléico substancialmente similares preferidas englobadas pela presente invenção são as sequências que são 80% idênticas aos fragmentos de ácido nucléico relatados no presente ou que são 80% idênticas a qualquer parte das sequências de nucleotídeos relatadas no presente. São de maior preferência fragmentos de ácido nucléico que são 90% idênticos às sequências de ácido nucléico relatadas no presente documento ou que são 90% idênticos a qualquer parte das sequências de nucleotídeos relatadas no presente. São de preferência superior fragmentos de ácidos nucléicos que são 95% idênticos às sequências de ácidos nucléicos relatadas no presente ou que são 95% idênticos a qualquer parte das sequências de nucleotídeos relatadas no presente. É bem compreendido pelo técnico no assunto que muitos níveis de identidade de sequências são úteis na identificação de sequências de polinucleotídeos relacionadas. Exemplos úteis de identidades percentuais são as registrados acima, ou também é preferido qualquer percentual inteiro de 80% a 100%.
Alinhamentos de sequências e cálculos de similaridade percentual podem ser determinados utilizando o programa Megalign da suíte de computação bioinformática Lasargene (DNASTAR Inc., Madison WI, Estados Unidos). O alinhamento múltiplo das sequências foi realizado através da utilização do método Clustal de alinhamento (Higgins e Sharp (1989), CABIOS. 5: 151-153) com os parâmetros padrão (Penalidade Do Intervalo (gap penalty) = 10, Penalidade Do Comprimento Do Intervalo (gap length) = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo do percentual de identidade de sequências de proteínas utilizando o método Clustal foram Comprimento De Palavra (ktuple) = 1, Penalidade Do Intervalo (gap penalty) = 3, Visualização Do Melhor Resultado (window) = 5 e Espaçamento Em Diagonais (diagonals saved) = 5. Para ácidos nucléicos, estes parâmetros são Penalidade Do Intervalo (gap penalty) = 10, Penalidade Do Comprimento Do Intervalo (gap length penalty) = 10, Comprimento De Palavra (ktuple) = 2, Penalidade Do Intervalo (gap penalty) = 5, Visualização Do Melhor Resultado (window) = 4 e Espaçamento Em Diagonais (diagonals saved) = 4. “Parte substancial” de uma sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos compreende sequência de aminoácidos suficiente de um polipeptídeo ou da sequência de nucleotídeos de um gene para gerar suposta identificação daquele polipeptídeo ou gene, seja através de avaliação manual da sequência pelos técnicos no assunto ou de comparação automatizada de sequências e identificação utilizando algoritmos tais como BLAST (Altschul, S. F. et al., (1993), J. Mol. Biol. 215: 403-410) e Gapped Blast (Altschul, S. F. et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
“Dessaturase” é um polipeptídeo que pode dessaturar um ou mais ácidos graxos para produzir um ácido graxo mono- ou poliinsaturado ou o precursor que seja de interesse.
“Gene” designa um fragmento de ácido nucléico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras 5') e posteriores (sequências não codificadoras 3') à sequência de codificação. “Gene nativo” indica um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. “Gene quimérico” ou “construção de DNA recombinante”, que são utilizados de forma intercambiável, indica qualquer gene que não seja um gene nativo, compreendendo sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de maneira diferente da encontrada na natureza. “Gene endógeno” indica um gene nativo no seu local natural no genoma de um organismo. Um gene “exógeno” indica um gene normalmente não encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro através de transferência genética. Os genes exógenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um “transgene” é um gene que foi introduzido no genoma através de procedimento de transformação.
“Fragmento de ácido nucléico heterólogo” designa um fragmento de ácido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucléico que é diferente da sequência de ácido nucléico que compreende o promotor vegetal de acordo com a presente invenção.
“Sequência de codificação” indica uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos específica. “Sequências reguladoras” indicam sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificadoras 5'), na própria ou a jusante (sequências não codificadoras 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, processamento de RNA ou estabilidade, ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir, mas sem limitar-se a promotores, sequências líderes de tradução, íntrons e sequências de reconhecimento de poliadenilação.
“Promotor” designa uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. A sequência promotora consiste de elementos montantes próximos e mais distantes, com estes últimos muitas vezes denominados amplificadores. Consequentemente, um “amplificador” é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade promotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível ou a especificidade de tecido de um promotor. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo ou podem ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. Os técnicos no assunto compreendem que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maior parte dos tipos de células na maior parte das vezes são comumente denominados “promotores constitutivos”. Novos promotores de diversos tipos úteis em células vegetais estão constantemente sendo descobertos; numerosos exemplos podem ser encontrados na compilação de Okamuro e Goldberg (1989, Biochemistry of Plants 15: 1-82). Reconhece-se adicionalmente que, como na maior parte dos casos as fronteiras exatas das sequências reguladoras não foram completamente definidas, fragmentos de DNA com alguma variação podem apresentar atividade promotora idêntica. “Íntron” é uma sequência interveniente em um gene que é transcrito em RNA mas é excisado em seguida no processo de geração do mRNA maduro. O termo também é utilizado para as sequências de RNA excisadas. “Éxon” é uma parte da sequência de um gene que é transcrita e encontrada no RNA mensageiro maduro derivado do gene, mas não é necessariamente uma parte da sequência que codifica o produto genético final.
Dentre os promotores mais comumente utilizados, encontram-se o promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:5745-5749), o promotor de octapina sintase (OCS), promotores de caulimovírus, tais como o vírus mosaico da couve-flor (CaMV) 19S (Lawton et al., (1987), Plant Mol. Biol. 9:315-324), o promotor CaMV 35S (Odell et al., (1985), Nature 313:810-812) e o promotor do vírus mosaico da escrofulária 35S, o promotor indutível pela luz da subunidade pequena de rubisco, o promotor Adh (Walker et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 662466280, o promotor sintase de sacarose (Yang et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 4144-4148), o promotor complexo de gene R (Chandler et al., (1989), Plant Cell, 1: 1175-1183), o promotor de gene de proteína de ligação a/b de clorofila etc. Outros promotores comumente utilizados são os promotores para os genes ADPGPP de tubérculo de batata, o promotor sintase de sacarose, o promotor sintase de amido ligado por grânulos, o promotor de gene de glutelina, o promotor do milho ceroso, promotor de gene Brittle e promotor Shrunken 2, o promotor de gene quitinase ácida e os promotores de gene zeina (15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD e 27 kD; Perdersen et al., (1982), Cell 29: 1015-1026). Uma série de promotores é descrita no documento WO 00/18963, publicado em 6 de abril de 2000, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência.
Exemplos de um promotor específico de sementes incluem, mas sem limitar-se a, o promotor para β-conglicinina (Chen et al., (1989), Dev. Genet. 10: 112-122), o promotor de napina e o promotor de faseolina. Outros promotores específicos de tecidos que podem ser utilizados para atingir a presente invenção incluem, mas sem limitar-se a, o promotor glutamina sintase de cloroplasto (GS2) (Edwards et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:3459-3463), o promotor frutose 1,6-biofosfatase de cloroplasto (Lloyd et al., (1991), Mol. Gen. Genet. 225:209-2216), o promotor nuclear fotossintético (STLS1) (Stockhaus et al., (1989), EMBO J. 8:2445-2451), o promotor de serinotreonina quinase (PAL), o promotor da glicoamilase, os promotores para os genes Cab (cab6, cab-1 e cab-1 R, Yamamoto et al., (1994), Plant Cell Physiol. 35:773-778; Fejes et al., (1990), Plant Mol. Biol. 15:921-932; Lubberstedt et al., (1994), Plant Physiol. 104:997-1006; Luan et al., (1992), Plant Cell 4:971-981), o promotor piruvato orto-fosfato diquinase (Matsuoka et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590), o promotor LhcB (Cerdan et al., (1997), Plant Mol. Biol. 33:245-255), o promotor PsbP (Kretsch et al., (1995), Plant Mol. Biol. 28:219-229), o promotor co-transportador SUC2 de H+ e sacarose (Truernit et al., (1995), Planta 196:564-570) e os promotores para os genes de membrana tilacóide (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD), etc.
“Sequência líder de tradução” designa uma sequência de DNA localizada entre a sequência promotora de um gene e a sequência de codificação. A sequência líder de tradução está presente no RNAm totalmente processado a montante da sequência de início de tradução. A sequência líder de tradução pode afetar o processamento de transcrição primária do RNAm, a estabilidade do RNAm ou a eficiência da tradução. Foram descritos exemplos de sequências líderes de tradução (Turner, R. e Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225).
A expressão “sequências não-codificadoras 3'” designa sequências de DNA a jusante a uma sequência de codificação e inclui sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências codificadoras de sinais reguladores capazes de afetar o processamento de RNAm ou a expressão gênica. O sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado por afetar a adição de traços de ácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor de RNAm. A utilização de diferentes sequências não-codificadoras 3' é exemplificada por Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-680.
“RNA transcrito” designa o produto resultante da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o RNA transcrito for uma cópia complementar idêntica a sequência de DNA, ele é denominado transcrito primário ou pode ser uma sequência de RNA derivada do processamento pós-transcricional do transcrito primário, sendo denominado RNA maduro. “RNA mensageiro” (“RNAm”) designa o RNA que não contém íntrons e que pode ser traduzido em proteína pela célula. “cDNA” designa DNA que é complementar a um modelo de RNAm e dele sintetizado utilizando a enzima transcriptase reversa. O cDNA pode ser de fita simples ou convertido em forma de fita dupla utilizando, por exemplo, o fragmento klenow da DNA polimerase I. RNA “sense” designa um RNA transcrito que inclui RNAm e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. “RNA antisense” designa um RNA transcrito que é complementar, no todo ou em parte, de um transcrito primário alvo ou de um RNAm, e que bloqueia a expressão ou acúmulo de transcritos de um gene alvo (US 5.107.065). A complementaridade de um RNA antisense pode dar-se de qualquer parte do gene específico transcrito, ou seja, na sequência não-codificadora 5', sequência nãocodificadora 3', íntrons ou na sequência codificadora. “RNA funcional” designa RNA antisense, RNA ribossômico ou outro RNA que pode não ser traduzido, mas que ainda tenha efeito sobre processos celulares.
“RNA sense” designa transcrito de RNA que inclui o RNAm e pode ser traduzido desta forma em proteína pela célula. “RNA antisense” designa um transcrito de RNA que é complementar de um RNAm ou transcrito primário alvo, no todo ou em parte, e que bloqueia a expressão de um gene alvo (US 5.107.065). A complementaridade de um RNA antisense pode dar-se com qualquer parte do gene específico transcrito, ou seja, na sequência nãocodificadora 5', sequência não-codificadora 3', íntrons ou na sequência codificadora. “RNA funcional” designa RNA antisense, RNA ribossômico ou outro RNA que pode não ser traduzido, mas que ainda tenha efeito sobre processos celulares.
A expressão “operacionalmente ligado” designa a associação de sequências de ácidos nucléicos sobre um único fragmento de ácido nucléico, de tal forma que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação, quando for capaz de afetar a expressão daquela sequência codificadora (ou seja, que a sequência codificadora esteja sob o controle transcricional do promotor). As sequências codificadoras podem ser operacionalmente ligadas a sequências reguladoras em orientação sense ou antisense.
O termo “expressão”, da forma utilizada no presente, designa a síntese de um produto final funcional, ou seja, RNAm ou proteína (precursora ou madura).
A expressão “cassete de expressão”, da forma utilizada no presente, refere-se a um fragmento de ácido nucléico discreto no qual uma sequência de ácido nucléico ou fragmento pode ser movido.
A expressão ou a sobreexpressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do RNAm em um precursor ou em uma proteína madura. “Inibição antisense” designa a produção de RNA antisense transcritos capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. “Sobreexpressão” designa a síntese de um produto gênico em organismos transgênicos que exceda os níveis de produção em organismos normais ou não transformados. “Co-supressão” designa a produção de RNA sense transcritos capazes de suprimir a expressão ou acúmulo de transcritos de genes exógenos ou endógenos idênticos ou substancialmente similares (US 5.231.020). O mecanismo de co-supressão pode estar ao nível de DNA (tal como metilação de DNA), ao nível de transcrição ou ao nível de póstranscrição.
“Inibição antisense” designa a produção de RNA antisense transcritos capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. “Co-supressão” designa a produção de RNA sense transcritos capazes de suprimir a expressão de genes exógenos ou endógenos idênticos ou substancialmente similares (US 5.231.020). Construções de co-supressão em plantas foram projetadas anteriormente através da focalização na sobreexpressão de uma sequência de ácido nucléico que possui homologia para um RNAm endógeno, na orientação sense, o que resulta na redução de todo o RNA que possui homologia para a sequência sobreexpressa (vide Vaucheret et al., (1998), Plant J. 16:651-659; e Gura (2000), Nature 404:804-808). A eficiência geral deste fenômeno é baixa e a extensão da redução de RNA é amplamente variável. Trabalhos recentes descreveram o uso de estruturas em “grampo” (“hairpin”) que incorporam totalmente, ou em parte, uma sequência codificadora de RNAm em orientação complementar que resulta em estrutura em “stem-loop” potencial para o RNA expresso (WO 99/53050, publicada em 21 de outubro de 1999, e WO
02/00904, publicada em 3 de janeiro de 2002). Isso aumenta a frequência de co-supressão nas plantas transgênicas recuperadas. Outra variação descreve o uso de sequências virais vegetais para dirigir a supressão, ou “silenciamento”, de sequências codificadoras de RNAm proximais (WO 98/36083, publicada em 20 de agosto de 1998). Nenhum destes fenômenos de co-supressão foi elucidado mecanicamente a nível molecular, embora tenham sido obtidas evidências genéticas que podem levar à identificação de potenciais componentes (Elmayan et al., (1998), Plant Cell 10:1747-1757).
“Expressão alterada” designa a síntese de produto(s) genético(s) em organismos transgênicos, em quantidades ou proporções que diferem significativamente da quantidade do(s) produto(s) genético(s) sintetizado(s) pelos organismos de tipo selvagem correspondentes.
“Transformação” designa a transferência de um fragmento de ácido nucléico para o genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácidos nucléicos transformados são denominados organismos “transgênicos”. O método preferido de transformação de células de milho é o uso de tecnologia de transformação acelerada por partículas ou por “arma de genes” (gene gun) (Klein et al., (1987), Nature (London) 327:70-73 (1987); US 4.945.050).
As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecular utilizadas no presente são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas de forma mais completa em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (a seguir, “Sambrook et al., 1989”) ou Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. e Struhl, K. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Nova Iorque, Estados Unidos, 1990 (a seguir, “Ausubel et al., 1990”).
“PCR” ou “Reação em Cadeia da Polimerase” é uma técnica de síntese de grandes quantidades de segmentos de DNA específicos, consiste de uma série de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk CT, Estados Unidos). Tipicamente, o DNA de fita dupla é desnaturado por aquecimento, os dois primers complementares às extremidades 3' do segmento alvo são anelados sob baixa temperatura e estendidos em seguida sob temperatura intermediária. Um conjunto destas três etapas consecutivas compreende um ciclo.
Uma “construção de expressão” é um vetor de plasmídeo ou seu subfragmento que compreende o gene quimérico da presente invenção. A seleção do vetor de plasmídeo é dependente do método que será utilizado para transformar plantas hospedeiras. Os técnicos no assunto conhecem bem os elementos genéticos que devem estar presentes sobre o vetor de plasmídeo a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras que contêm o gene quimérico. Os técnicos no assunto também reconhecerão que eventos de transformação independentes diferentes resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al., (1985), EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989), Mol. Gen. Genetics 218:78-86) e, desta forma, que diversos eventos devem ser selecionados a fim de obter linhagens que exibam o nível de expressão desejado e o padrão. Tal seleção pode ser realizada através de análise Southern de DNA, análise Northern de expressão de RNAm, análise Western de expressão de proteína ou análise fenotípica.
Embora os polipeptídeos de anexina ou P34, estejam conhecidamente presentes em sementes, os promotores responsáveis pela expressão destes polipeptídeos e o tempo de desenvolvimento destes promotores não foram descritos anteriormente. Não foi possível prever, antes dos estudos relatados pela presente invenção, se qualquer gene de anexina ou P34, foi controlado por um promotor específico de sementes. Demonstra-se no presente que promotores de anexina ou P34, específicos de sementes de fato existem em plantas e que tais promotores podem ser facilmente isolados e utilizados pelos técnicos no assunto.
A presente invenção refere-se a um fragmento de ácido nucléico isolado que compreende um promotor vegetal de anexina ou P34 específico de sementes. A presente invenção também se refere a um fragmento de ácido nucléico isolado que compreende um promotor, em que o mencionado promotor consiste essencialmente da sequência de nucleotídeos descrita em SEQ ID N° 1 ou 2 ou o mencionado promotor consiste essencialmente de um fragmento ou subfragmento que é substancialmente similar e funcionalmente equivalente à sequência de nucleotídeos descrita na SEQ ID N° 1 ou 2. Um fragmento de ácido nucléico que é funcionalmente equivalente ao promotor de anexina ou P34 da presente invenção é qualquer fragmento de ácido nucléico que seja capaz de controlar a expressão de uma sequência codificadora ou RNA funcional de maneira similar ao promotor de anexina ou P34. Os padrões de expressão de promotores de anexina ou P34, encontram-se descritos nos Exemplos 2 e 3.
A atividade promotora do fragmento de DNA genômico da soja a montante da sequência codificadora de proteína de anexina ou P34, foi determinada através da ligação do fragmento a um gene repórter, o gene βglicuronidase de E. coli (GUS) (Jefferson (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5:387405), transformando o promotor de anexina ou P34:: cassete de expressão de GUS em em Arabidopsis e analisando a expressão de GUS em vários tipos de células das plantas transgênicas (vide Exemplo 2). A expressão de GUS foi restrita às sementes, embora todas as partes das plantas transgênicas fossem analisadas. Estes resultados indicaram que o fragmento de ácido nucléico continha promotores específicos de sementes.
Fica claro a partir do relatório descritivo da presente invenção que os técnicos no assunto poderão isolar facilmente um promotor de anexina vegetal ou P34, a partir de qualquer planta ao realizarem o procedimento a seguir:
1. obtenção de um cDNA de anexina ou P34, de uma planta desejada através de qualquer dentre uma série de métodos bem conhecidos no estado da técnica que incluem, mas sem limitar-se a, (a) sequenciamento aleatório de ESTs de uma biblioteca de cDNA e caracterização dos ESTs através de pesquisa BLAST conforme descrito acima; (b) hibridização de biblioteca de cDNA para um cDNA de anexina vegetal ou P34, conhecido; ou (c) amplificação por PCR utilizando primers de oligonucleotídeos projetados a partir de cDNA de anexina ou P34, conhecidos;
2. fragmentação de DNA genômico com uma enzima de restrição deixando extremidades cegas e adaptadores de anelamento sobre as extremidades dos fragmentos; utilizando primers específicos para a extremidade 5' da anexina ou de P34 transcrito, e primers específicos para os adaptadores, para amplificar a região promotora por reação em cadeia de polimerase;
3. ligação de forma operacional do fragmento de ácido nucléico que contém a sequência promotora de anexina ou P34, a um gene repórter apropriado; existe uma série de genes repórteres que são bem conhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo o gene bacteriano GUS, o gene luciferase de vaga-lume e o gene de proteína fluorescente verde; qualquer gene para o qual seja disponível teste fácil e confiável pode servir de gene repórter;
4. transformação de um cassete de expressão quimérico promotor de anexina ou P34::gene repórter em uma planta apropriada para a expressão do promotor. Existe uma série de plantas apropriadas que podem ser utilizadas como hospedeiro para transformação que são bem conhecidas pelos técnicos no assunto, incluindo as dicotiledôneas, Arabidopsis, tabaco, soja, canola, amendoim, girassol, açafrão, algodão, tomate, batata, cacau e monocotiledôneas, milho, trigo, arroz, cevada e palma. As expressões “canola” e “Brassica de semente oleaginosa” são utilizadas no presente documento de forma intercambiável; e
5. teste de expressão do promotor de anexina ou P34, em vários tipos celulares de tecidos vegetais transgênicos, tais como folhas, raízes, flores e sementes transformadas com cassete de expressão quimérico promotor de anexina ou P34::gene repórter, através de teste da expressão, pelo produto do gene repórter. Um forte promotor de anexina ou P34, específico de semente produzirá expressão de alto nível do repórter em sementes sem a produção de expressão detectável em outros tecidos vegetais.
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma construção de DNA recombinante que compreende pelo menos um fragmento de ácido nucléico heterólogo operacionalmente ligado a qualquer promotor, ou combinação de elementos promotores da presente invenção. Construções de DNA recombinante podem ser elaboradas através da ligação de forma operacional do fragmento de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, ou seja, qualquer promotor de anexina ou P34, ou fragmento ou subfragmento que seja substancialmente similar e funcionalmente equivalente a qualquer parte da sequência de nucleotídeo descrita na SEQ ID N° 1,2 ou 13 a 22, a um fragmento de ácido nucléico heterólogo. Qualquer fragmento de ácido nucléico heterólogo pode ser utilizado para a prática da presente invenção. A seleção dependerá da aplicação desejada ou fenótipo a ser atingido. As várias sequências de ácido nucléico podem ser manipuladas de forma a fornecer as sequências de ácido nucléico na orientação adequada. Acredita-se que várias combinações de elementos promotores conforme descrito no presente possam ser úteis na prática da presente invenção.
Podem ser então construídos vetores de plasmídeos que compreendem as construções de DNA recombinante da presente invenção. A seleção de vetor de plasmídeo é dependente do método que será utilizado para transformar células hospedeiras. Os técnicos no assunto conhecem bem os elementos genéticos que devem estar presentes sobre o vetor de plasmídeo a fim de transformar, selecionar e propagar com sucesso células hospedeiras que contêm o gene quimérico.
Os métodos de transformação de dicotiledôneas, principalmente através do uso de Agrobacterium tumefaciens, e obtenção de plantas transgênicas foram publicados, entre outros, para algodão (US 5.004.863, US 5.159.135); soja (US 5.569.834, US 5.416.011); Brassica (US 5.463.174); amendoim (Cheng et al., (1996), Plant Cell Rep. 15:653-657, McKently et al., (1995), Plant Cell Rep. 14:699-703); mamão (Ling, K. et al., (1991), Bio/Technology 9:752-758) e ervilhas (Grant et al., (1995), Plant Cell Rep. 15:254-258). Para análise de outros métodos comumente utilizados de transformação vegetal, vide Newell, C. A. (2000), Mol. Biotechnol. 16:53-65. Um destes métodos de transformação utiliza Agrobacterium rhizogenes (Tepfler, M. e Casse-Delbart, F. (1987), Microbiol. Sci. 4:24-28). A transformação de soja utilizando fornecimento direto de DNA foi publicada utilizando fusão de PEG (WO 92/17598), eletroporação (Chowrira, G. M. et al., (1995), Mol. Biotechnol. 3:17-23; Christou, P. et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:3962-3966), microinjeção ou bombardeamento de partículas (McCabe, D. E. et al., (1988), Bio/Technology 6:923; Christou et al., (1988), Plant Physiol. 87:671 -674).
Existe uma série de métodos de regeneração de plantas a partir de tecido vegetal. O método específico de regeneração dependerá do tecido vegetal de partida e da espécie vegetal específica a ser regenerada. A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partir de transformadores protoplastos vegetais isolados ou de vários explantes transformados é bem conhecida no estado da técnica (Weissbach e Weissbach (1988) em Methods for Plant Molecular Biology (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego CA, Estados Unidos). Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de células transformadas, cultivo dessas células individualizadas através dos estágios habituais de desenvolvimento embriônico através do estágio de plântula enraizada. Embriões e sementes transgênicas são regeneradas de forma similar. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são plantados posteriormente em meio de crescimento vegetal apropriado, tal como solo. Preferencialmente, as plantas regeneradas são auto-polinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigóticas. Caso contrário, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado em plantas cultivadas por sementes de linhagens agronomicamente importantes. Por outro lado, o pólen de plantas dessas linhagens importantes é utilizado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica de acordo com a presente invenção que contém polipeptídeo desejado é cultivada utilizando métodos bem conhecido no estado da técnica.
Além dos procedimentos discutidos acima, os técnicos são familiares com os materiais de recurso padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (tais como moléculas de DNA, plasmídeos etc.), geração de fragmentos de DNA recombinantes e construções de expressão recombinante e a seleção e isolamento de clones (vide, por exemplo, Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Maliga et al., (1995), Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press; Birren et al., (1998), Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Estados Unidos; Birren et al., (1998), Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Estados Unidos; Plant Molecular
Biology: A Laboratory Manual, eds., Clark, Springer, Nova Iorque, Estados Unidos (1997)).
O gene GUS bacteriano pode ser expresso de forma bem sucedida em embriões de Arabidopsis (vide Figuras 1 e 2). Além disso, um gene que codifica delta-6-dessaturase de M. alpina também foi expresso de forma sucedida por este promotor em soja transgênica, conforme ilustrado na Figura 4. Isso valida adicionalmente a aplicação do promotor de anexina ou P34, de acordo com a presente invenção na prática de engenharia genética vegetal.
Os técnicos no assunto também reconhecerão que eventos de transformação independentes diferentes resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão dos genes quiméricos (Jones et al., (1985), EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989), Mol. Gen. Genetics 218:78-86). Desta forma, diversos eventos devem ser selecionados a fim de obter linhagens que exibam o nível de expressão desejado e o padrão. Essa seleção pode ser realizada através de análise Northern de expressão de RNAm, análise Western de expressão de proteína ou análise fenotípica. Também são de interesse sementes obtidas a partir de plantas transformadas que exibem o perfil de expressão desejado.
O nível de atividade do promotor de anexina ou P34, é comparável com o de muitos promotores fortes conhecidos, tais como o promotor CaMV 35S (Atanassova et al., (1998), Plant Mol. Biol. 37: 275-285; Battraw e Hall (1990), Plant Mol. Biol. 15:527-538; Holtorf et al., (1995), Plant Mol. Biol. 29:637-646; Jefferson et al., (1987), EMBO J. 6:3901-3907; Wilmink et al., (1995), Plant Mol. Biol. 28:949-955), os promotores de oleosina de Arabidopsis (Plant et al., (1994), Plant Mol. Biol. 25:193-205; Li, (1997), Texas A&M University Ph.D. Dissertation, págs. 107-128), os promotores de proteína de extensão de ubiquitina de Arabidopsis (Callis et al., 1990), promotor de gene ubiquitina de tomate (Rolfinke et al., 1998), promotor de proteína de choque de aquecimento de soja (Schoffi et al., 1989) e promotor de gene histona H3 de milho (Atanassova et al., 1998).
A expressão de genes quiméricos na maior parte das células vegetais torna o promotor de anexina ou P34, de acordo com a presente invenção especialmente útil quando é necessária a expressão específica de sementes de um fragmento de ácido nucléico heterólogo alvo. Outra característica útil do promotor de anexina é o seu perfil de expressão em sementes em desenvolvimento. O promotor de anexina de acordo com a presente invenção é mais ativo em sementes em desenvolvimento em estágios precoces (em até dez dias após a polinização) e é grandemente silencioso em estágios posteriores (vide Figura 3). O perfil de expressão do promotor de anexina reivindicado é diferente de muitos promotores específicos de sementes, ou seja, promotores de proteínas de armazenagem de sementes, o que frequentemente proporciona atividade mais alta em estágios posteriores de desenvolvimento (Chen et al., (1989), Dev. Genet. 10:112-122; Ellerstrom et al., (1996), Plant Mol. Biol. 32:1019-1027; Keddie et al., (1994), Plant Mol. Biol. 24:327-340; Plant et al., (1994), Plant Mol. Biol. 25:193-205; Li, (1997), Texas A&M University Ph.D Dissertation, págs. 107-128). O promotor P34 possui perfil de expressão mais convencional, mas permanece distinto de outros promotores específicos de sementes conhecidos (vide Figura 3). Desta forma, o promotor de anexina ou P34, será candidato muito atraente quando a sobreexpressão, ou supressão, de um gene em embriões for desejada em estágio de desenvolvimento precoce. Pode ser desejável, por exemplo, sobreexpressar um gene que regula o desenvolvimento precoce de embriões ou um gene envolvido no metabolismo antes do amadurecimento de sementes.
Os métodos de isolamento de óleos de sementes são bem conhecidos no estado da técnica (Young et al., Processing of Fats and Oils,
The Lipid Handbook (Gunstone et al., eds.), capítulo 5, págs. 253-257; Londres, Inglaterra, Chapman e Hall, 1994).
Outra aplicação geral do promotor de anexina ou P34, de acordo com a presente invenção é a construção de genes quiméricos que possam ser utilizados para reduzir a expressão de pelo menos um fragmento de ácido nucléico heterólogo em uma célula vegetal. Para atingir isso, um gene quimérico projetado para co-supressão de um fragmento de ácido nucléico heterólogo pode ser construído através de ligação do fragmento ao promotor de anexina ou P34, de acordo com a presente invenção (US 5.231.020, WO 99/53050 publicada em 21 de outubro de 1999, WO 02/00904 publicada em 3 de janeiro de 2002 e WO 98/36083 publicada em 20 de agosto de 1998, em busca de metodologia para bloquear a expressão genética vegetal através de co-supressão). Alternativamente, um gene quimérico projetado para expressar RNA antisense para um fragmento de ácido nucléico heterólogo pode ser construído através de ligação do fragmento em orientação reversa ao promotor de anexina ou P34, de acordo com a presente invenção (vide US 5.107.065 para metodologia de bloqueio da expressão de genes vegetais através de RNA antisense). O gene quimérico antisense ou de co-supressão pode ser introduzido em plantas através de transformação. São selecionados em seguida transformadores em que a expressão do fragmento de ácido nucléico heterólogo é reduzida ou eliminada.
A presente invenção também se refere a um método de aumento ou redução da expressão de pelo menos um fragmento de ácido nucléico heterólogo em célula vegetal, que compreende:
(a) a transformação de uma célula vegetal com os genes quiméricos descritos na presente invenção;
(b) o cultivo de plantas maduras férteis a partir da célula vegetal transformada da etapa (a); e (c) a seleção de plantas que contenham uma célula vegetal transformada em que a expressão do fragmento de ácido nucléico heterólogo é aumentada ou reduzida.
A transformação e seleção pode ser obtida utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica que incluem, mas sem limitar-s, os métodos descritos no presente documento.
Exemplos
A presente invenção é definida adicionalmente nos Exemplos a seguir, nos quais partes e percentuais são em peso e os graus são Celsius, a menos que indicado em contrário. As técnicas de biologia molecular foram realizadas tipicamente conforme descrito em Ausubel, F. M. et al., (1990, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Nova Iorque, Estados Unidos) ou Sambrook, J. et al., (1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Estados Unidos). Dever-se-á compreender que estes Exemplos, embora indiquem realizações preferidas da presente invenção, são fornecidas apenas como forma de ilustração. Da discussão acima e destes Exemplos, especialista neste estado da técnica podem determinar as características essenciais da presente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, podem elaborar várias mudanças e modificações da presente invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Desta forma, várias modificações da presente invenção além das exibidas e descritas no presente serão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima. Essas modificações também se destinam a enquadrar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.
A descrição de cada referência indicada no presente é integralmente incorporada ao presente como referência.
Exemplo 1
Isolamento de Promotores de Anexina e P34 de Soja
Os promotores de anexina e P34 de soja foram isolados utilizando abordagem com base em reação em cadeia da polimerase (PCR). DNA genômico de soja foi digerido até o término com enzima de restrição de DNA que gera extremidades rômbicas (blunt ends) (Dral, EcoRV, Pvull ou StuI, por exemplo) de acordo com protocolos padrão. O sistema Universal GenomeWalker® da Clonetech® (manual de usuário PT3042-1) foi utilizado para ligar adaptadores às extremidades dos fragmentos de DNA genômicos. Também são fornecidos primers aninhados que são específicos para a sequência adaptadora (AP1 e AP2, para o primeiro e segundo primer adaptador, respectivamente). Dois primers específicos de genes (GSP1 e GSP2) foram projetados para o gene de anexina de soja com base nas sequências de codificação 5' em DNAc de anexina em banco de dados de EST da DuPont. As sequências de oligonucleotídeos dos primers GSP1 e GSP2 possuem as sequências exibidas abaixo (SEQ ID N° 3 e 4):
SEQ ID N° 3: 5’-GCCCCCCATCCTTTGAAAGCCTGT-3’ SEQ ID N° 4:5’-CGCGGATCCGAGAGCCTCAGCATCTTGAGCAGAA-3’
As bases sublinhadas são o sítio de reconhecimento para a enzima de restrição BamH I. O primer AP2 do kit GenomeWalker® contém um sítio de restrição Sal I.
Os primers AP1 e GSP1 foram utilizados na primeira rodada de PCR utilizando cada uma das populações de DNA genômicas ligadas por adaptador (DraI, EcoRV, PvuII ou StuI) sob condições definidas no protocolo GenomeWalkei®. As condições de ciclo foram de 94°C por 4 minutos; 94°C por 2 segundos e 72 °C por 3 minutos, 7 ciclos; 94 °C por 2 segundos e 67 °C por 3 minutos, 32 ciclos; 67 °C por 4 minutos. Os produtos de cada uma das primeiras PCRs conduzidas foram diluídos 50 vezes. Um microlitro de cada um dos produtos diluídos foi utilizado como modelo para a segunda PCR com o AP2 e GSP2 como primers. As condições de ciclo foram de 94 °C por 4 minutos; 94 °C por 2 segundos e 72 °C por 3 minutos, 5 ciclos; 94 °C por 2 segundos e 67 °C por 3 minutos, 20 ciclos; 67 °C por 3 minutos. Géis de agarose foram conduzidos para determinar qual PCR gerou comprimento de fragmento ideal. Um fragmento genômico de 2,1 kb foi detectado e isolado da reação de DNA genômico digerido por EcoRV. O fragmento genômico foi digerido com BamH I e Sal I e clonado em vetor Bluescript KS para sequenciamento. Por fim, os dados de sequenciamento indicaram que este fragmento genômico continha sequência promotora de anexina de soja de 2012 bp conforme exibido em SEQ ID N° 1.
Dois primers específicos de genes (GSP3 e GSP4) foram projetados para o gene P34 de soja com base nas sequências codificadoras 5' em DNAc de P34 em NCBI Genebank (J05560). As sequências de oligonucleotídeos dos primers de GSP3 e GSP4 possuem as sequências exibidas abaixo (SEQ ID N° 5 e 6):
SEQ ID N° 5: 5’-GGTCCAATATGGAACGATGAGTTGATA-3’
SEQ ID N° 6: 5’-CGCGGATCCGCTGGAACTAGAAGAGAGACCTAAGA-3’
Os primers AP1 e GSP3 foram utilizados na primeira rodada de PCR utilizando as mesmas condições definidas no protocolo do sistema GenomeWalker®. As condições do ciclo utilizadas para o promotor de anexina de soja não funcionaram bem para as reações do promotor P34 de soja. Foi utilizado protocolo de PCR modificado. As condições de ciclo foram: 94 °C por 4 minutos; 94 °C por 2 segundos e 74 °C por 3 minutos, 6 ciclos em que a temperatura de anelamento cai 1 °C a cada ciclo; 94 °C por 2 segundos e 69 °C por 3 minutos, 32 ciclos; 69 °C por 4 minutos. Os produtos da primeira condução de PCR foram diluídos 50 vezes. Um microlitro dos produtos diluídos foi utilizado como modelo para a segunda PCR com o AP2 e GSP4 como primers. As condições de ciclo foram: 94 °C por 4 minutos; 94 °C por 2 segundos e 74 °C por 3 minutos, 6 ciclos em que a temperatura de anelamento cai 1 °C a cada ciclo; 94 °C por 2 segundos e 69 °C por 3 minutos, 20 ciclos; 69 °C por 3 minutos. Fragmento genômico de 1,5 kb foi amplificado e isolado da biblioteca GenomeWalker digerida por Pvu II. O fragmento genômico foi digerido com BamH I e Sal I e clonado em vetor Bluescript KS para sequenciamento. Os dados de sequenciamento indicaram que este fragmento genômico continha uma sequência promotora de P34 de soja de 1408 bp conforme exibido em SEQ ID N° 2.
Exemplo 2
Elaboração de Construções Repórteres de GUS Ligadas a Promotor de Anexina ou Promotor de P34 de Soja e Expressão em Sementes de Arabidopsis
Dois oligonucleotídeos foram projetados para reamplificar o promotor de anexina com sítios de BamH I ou Nco I (sublinhados abaixo em SEQ ID N° 7 e 8, respectivamente). As sequências de oligonucleotídeos destes dois oligonucleotídeos são exibidas em SEQ ID N° 7 e 8.
SEQ ID N° 7: 5’-CGCGGATCCATCTTAGGCCCTTGATTATATGGTGTTT-3’
SEQ ID N° 8: 5’-CCTTGACCATGGAAGTATTGCTTCTTAGTTAACCTTTCC-3’
O fragmento promotor de anexina reamplificado foi digerido com BamH I e Nco I, purificado e clonado nos sítios BamH I e Nco I do plasmídeo pG4G para fazer a fusão entre a fusão de GUS e promotor de anexina de soja (pJS86). O plasmídeo pG4G foi descrita na US 5.968.793, cujo teor é incorporado ao presente como referência.
Dois oligonucleotídeos com sítios BamH I ou Nco I nas extremidades 5' foram projetados para reamplificar o promotor P34. As sequências de oligonucleotídeos destes dois primers de PCR são exibidas em SEQ ID N° 9 e 10.
SEQ ID N° 9: 5'-CGCGGATCCAACTAAAAAAAGCTCTCAAATTACATTTTGAG-3' SEQ ID N° 10: 5'-CCTTGACCATGGCTTGGTGGAAGAATTTTATGATTTGAAATT3'.
O fragmento promotor de p34 reamplificado foi digerido com BamH I e Nco I, purificado e clonado nos sítios BamH I e Nco I do plasmídeo pG4G para fazer a fusão entre a fusão de GUS e promotor p34 de soja (pJS87).
As construções recombinantes de GUS e promotor quimérico foram clonadas na forma de fragmento de BamH I-Sal I no vetor binário pZBL120 de Agrobacterium tumefaciens para criar pJS90 e pJS91. O vetor binário pZBL120 é o mesmo vetor binário pZBL1 descrito na patente US n° 5.968.793 (ATCC n° 209128), exceto pela substituição do promotor NOS com um promotor 35S de 963 bp (NCBI número de acesso V00141 do nucleotídeo 6494 a 7456) no gene Nos/P-nptII-OCS 3'. O novo promotor 35S-nptII-gene OCS 3' serve de marcador de seleção vegetal de resistência a canamicina em pZBL120. As construções de vetor binário de pJS90 e pJS91 foram transformadas em Agrobacterium tumefaciens LBA4404, que foi utilizado em seguida para inocular plantas de Arabidopsis através de infiltração a vácuo (Guang-Ning Ye et al., Plant Journal 19, 249-257, 1999). As sementes de Arabidopsis de transformadores primários foram selecionadas por 100 mg/l de Kan sobre placas de cultivo MS. As mudas resistentes a Kan foram transferidas para o solo e analisadas para determinar a atividade de GUS em sementes, folhas, caules, flores e revestimentos de síliqua. A atividade de GUS foi analisada através de manchas histoquímicas por X-Gluc e teste MUG GUS fluorométrico quantitativo conforme descrito por Jefferson (Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405, 1987).
Conforme exibido na Figura 1 e na Figura 2, promotor de anexina e promotor de P34 de soja fornecem expressão de GUS muito específica em sementes (as sementes escuras são manchadas de azul nas figuras). Outras partes de plantas transformadas, tais como folhas, caules, flores e revestimentos de síliqua, não exibiram manchas de GUS (dados não exibidos). O promotor de anexina é muito mais forte que o promotor de p34 é para expressão específica de sementes. Conforme exibido na Figura 3, o gene de anexina é expresso em estágio muito precoce do desenvolvimento de sementes, em comparação com um gene P34 em estágio intermediário-posterior e outros genes de proteína de armazenagem de sementes.
Exemplo 3
Elaboração de Construções de Promotor M de Anexina, Delta-6 Dessaturase e Produção de Ácidos Graxos Poliinsaturados em Embriões Somáticos de Soja Transgênica
Com base nas sequências de promotor de anexina de soja clonado, outro oligo com sítio Not I na extremidade 5' foi projetado e utilizado com primer BamH I (SEQ ID N° 7) para reamplificar o promotor de anexina. A sequência de oligonucleotídeos deste oligo que contém Not I é exibida em SEQ ID N° 11.
SEQ ID N° 11: GAATTCGCGGCCGCTGAAGTATTGCTTCTTAGTTAACCTTTCC.
Com base nas sequências de promotor P34 de soja clonado, outro oligo com sítio NotI na extremidade 5' foi projetado e utilizado com primer BamH I (SEQ ID N° 9) para reamplificar o promotor de P34. A sequência de oligonucleotídeos deste oligo que contém NotI é exibida em SEQ ID N° 12. SEQ ID N° 12: GAATTCGCGGCCGCAACTTGGTGGAAGAATTTTATGATTTGAAA
A anexina reamplificada e o fragmento de promotor de P34 foram digeridos com BamH I e Not I, purificados e clonados nos sítios BamH I e Not I do plasmídeo pZBL115 para sintetizar pJS88 e pJS89. O plasmídeo pZBL115 contém a origem de reprodução de pRB322, o gene de resistência a higromicina de HPT bacteriana dirigido pelo promotor de T7 e término de T7 e um gene promotor de 35S-HPT-Nos 3' para servir de marcador de seleção vegetal resistente a higromicina. O gene delta 6 dessaturase de M. alpina foi clonado no sítio Not I de pJS88 e pJS89 na orientação sense para elaborar os cassetes de expressão vegetal pJS92 e pSJ93. O pJS92 e pJS93 foram transformados em um sistema de embrião somático de soja. Os embriões transgênicos amadurecidos foram analisados para determinar a produção de GLA (ácido γ-linolênico) inovador através de HPLC/GC.
Conforme exibido na Figura 4, o acúmulo de GLA em embriões somáticos de soja foi detectado quando o gene de delta 6 dessaturase de M. alpina sob o controle de uma série de promotores específicos de sementes de soja. Com promotores específicos de sementes muito fortes tais como promotor de subunidade alfa de β-conglicinina de soja, promotor Gy1 de glicinina de soja, o nível de GLA é de cerca de 35 a 40%. Com o promotor de anexina de soja, o nível de GLA atinge cerca de 40% do total de ácidos graxos. Como ocorre com o promotor P34 de soja, o nível de GLA é de cerca de 8%. Todos estes resultados demonstraram que os promotores de anexina e P34 de soja são funcionais em embriões somáticos de soja para produzir ácido graxo inovador GLA.
Exemplo 4
Elementos de Consenso Específicos de Sementes de Identificação em Promotores de Anexina e P34
O promotor de anexina de soja contém as sequências promotoras de núcleo de consenso conhecidas como caixa CCAAT, caixa TATA e local de início de transcrição. O promotor de anexina também contém vários elementos responsivos a ABA e específicos de sementes, tais como os elementos de acoplamento específicos de sementes de caixa RY-G (CATGCAA, CATGCCT,
CATGCAG, CTACGTCA, TAACGTGC), elementos ACAC (CCTACACTCT, CCAACACTGG, TATACACTCC, TGTACACATA, TTCACACCAT, ACAACACTTT, CTAACACGAT), elementos GTGT (ATGGTGTTTA, GTAGTGTGAA, AATGTGTTAT, CATGTGTAAA) e sequências ricas em AT. Todos estes elementos conservados, individualmente ou em combinação, podem ser muito importantes para a expressão genética temporal e específica de tecidos do promotor de anexina de soja.
O promotor P34 de soja contém duas supostas caixas TATA (TATATA e TATATATA). O promotor P34 também contém vários elementos responsivos a ABA e específicos de sementes, tais como os elementos de acoplamento específicos de semente de caixa RY-G (CATGCAG, CATGCAA, CATGCTA, ACACGTTA, AGACGTGT, GGACGTATACACGTTT, TTACGTAT), elementos ACAC (CAACACGT, AAACACACAT, ATACACGT), elementos GTGT (GACGTGTACG, GACAGTGTCGA, CATGTGTGAA, ACTGTGTGCT, TTTGTGTTAG). É interessante observar que existem dois elementos sobrepostos de ACAC elemento/ACTG e um elemento sobreposto de ACGT elemento/GTGT no promotor, que podem desempenhar papel muito importante para expressões genéticas específicas de sementes e reguladas por ABA. Todos estes elementos conservados, individualmente ou em combinação, podem ser muito importantes para a expressão genética específica de tecido e temporal do promotor P34 de soja.
Exemplo 5
Exclusão e M utagênese Dirigida ao Sítio dos Promotores de Anexina e P34
A fim de definir adicionalmente os elementos de transcrição que controlam a expressão gênica temporal e específica de tecido destes novos promotores específicos de sementes de soja, uma série de exclusões unidirecionais 5' dos promotores foi elaborada utilizando PCRs. PCRs também foram utilizados para elaborar exclusão interna e mutagênese dirigida aos sítios nos promotores. Todas estas exclusões ou mutações do promotor GUS construído foram transferidas para vetores binários e transformados em Arabidopsis transgênicos (conforme descrito no Exemplo 2).
A Figura 5 exibe os dez diferentes fragmentos de exclusão que foram testados para determinar o promotor de anexina (SEQ ID N° 13 a 22). Os elementos de consenso identificados no Exemplo 4 são exibidos na forma de caixas. Os comprimentos de fragmentos são de 1883 bp, 1719 bp, 1553 bp, 1367 bp, 1160 bp, 967 bp, 770 bp, 584 bp, 425 bp e 174 bp (SEQ ID N° 13 a 22, respectivamente).
Análise das resistências de promotores correspondentes e sua especificidade de expressão em tecido foi realizada através de manchas de GUS histoquímicas com X-Gluc e teste de MUC GUS fluorométrico quantitativo (conforme descrito no Exemplo 2). Os resultados exibidos na Tabela 1 e na Figura 6 demonstram que todos os promotores de anexina testados, exceto pelo mais curto (-174 bp, SEQ ID N° 22), retêm altos níveis de atividade promotora. O promotor de -174 pode reter alguma atividade de nível muito baixo. A atividade promotora mais alta é observada com o promotor de -770 (SEQ ID N° 19).
Tabela 1
| GUS (pmol MU/pg de proteína.h | Desvio padrão | |
| Sementes WT | -0,19173 | 0,55127 |
| -1883 | 1164,2 | 543,89 |
| -1719 | 1418,8 | 606,94 |
| -1553 | 1340,4 | 379,76 |
| -1367 | 913,87 | 434,63 |
| -1160 | 1161,2 | 895,42 |
| GUS (pmol MU/gg de proteína.h | Desvio padrão | |
| Sementes WT | -0,19173 | 0,55127 |
| -967 | 1407,9 | 760,74 |
| -770 | 2831,7 | 1233,1 |
| -584 | 1388,2 | 760,81 |
| -425 | 519,22 | 221,11 |
| -174 | 0,99894 | 1,9657 |
Claims (7)
- Reivindicações1. CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um fragmento de ácido nucléico heterólogo operacionalmente ligado a um fragmento de ácido nucléico isolado contendo um promotor de anexina de soja específico de semente, em que dito promotor consiste essencialmente da sequência de nucleotídeos descrita em qualquer dentre SEQ ID N° 1 ou 13 a 22.
- 2. CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do fragmento de ácido nucléico heterólogo codificar uma enzima relacionada à produção de pelo menos um ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa.
- 3. MÉTODO DE REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PELO MENOS UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS heteróloga em planta, caracterizado pelo fato de compreender:(a) a transformação de uma célula vegetal com a construção de expressão recombinante conforme descrita na reivindicação 1 ou 2;(b) o cultivo de plantas maduras férteis a partir da célula vegetal transformada da etapa (a); e (c) a seleção de plantas que compreendem uma célula vegetal transformada que expressa a sequência de nucleotídeos heteróloga.
- 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato da planta ser uma planta de soja.
- 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato do fragmento de ácido nucléico heterólogo codificar uma enzima relacionada à produção de pelo menos um ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa.
- 6. MÉTODO DE REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PELO MENOS UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS heteróloga em planta, caracterizado pelo fato de compreender:(a) a transformação de uma célula vegetal com uma5 construção de expressão recombinante que compreende pelo menos um fragmento de ácido nucléico heterólogo operacionalmente ligado ao fragmento de ácido nucléico isolado conforme descrito em uma das reivindicações 1 ou 2;(b) o cultivo de plantas maduras férteis a partir da célula
- 10 vegetal transformada da etapa (a); e (c) a seleção de plantas que compreendem uma célula vegetal transformada que expressa a sequência de nucleotídeos heteróloga durante o desenvolvimento precoce da semente.
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| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 16/07/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. (CO) 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 16/07/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |
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| B25A | Requested transfer of rights approved |
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