BRPI0318199B1 - processo para o biobranqueamento de polpa kraft usando associações bacterianas - Google Patents

Abstract

"processo para o biobranqueamento de polpa kraft usando associações bacterianas". a presente invenção relaciona-se a um método de quatro etapas bom para o ambiente, seguro, e eficiente, de biobranquear a polpa kraft usando cepas bacterianas de n^ os^ de acesso mtcc 5096, mtcc 5094, mtcc 5095, e mtcc 5098, a uma associação microbiana compreendendo uma mistura sinérgica de isolados bacterianos ligninolíticos de n<sym> de acesso mtcc 5094, mtcc 5095, e mtcc 5098, às cepas bacterianas de n<sym> de acesso mtcc 5096, mtcc 5094, mtcc 5095, e mtcc 5098, e a um processo de preparar um inóculo do isolado bacteriano de n<o> de acesso mtcc 5096, adicionalmente, a um processo para a preparação de uma associação compreendendo os isolados bacterianos ligninolíticos de n<sym> acesso mtcc 5094, mtcc 5095, e mtcc 5098, além disso, a um processo para a preparação de suspensão de polpa para o biobranqueamento.

Description

"PROCESSO PARA O BIOBRANQUEAMENTO DE POLPA KRAFT USANDO ASSOCIAÇÕES BACTERIANAS" Campo da invenção A presente invenção relaciona-se a um método de quatro etapas bom para o ambiente, seguro e eficiente, de biobranquear polpa Kraft usando cepas bacterianas de n— de acesso MTCC 5096, MTCC 5094, MTCC 5095 e MTCC 5098, uma as- sociação microbiana compreendendo uma mistura sinérgica de isolados bacterianos ligninoliticos de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095 e MTCC 5098, cepas bacterianas de n— de acesso MTCC 5096, MTCC 5094, MTCC 5095 e MTCC 5098, e um processo de preparar um inóculo do isolado bacteriano de n- de acesso MTCC 5096, adicionalmente, um processo para a pre- paração de uma associação compreendendo os isolados bacteri- anos ligninoliticos de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095 e MTCC 5098, além disso, um processo para a preparação de sus- pensão de polpa para o biobranqueamento.

Antecedentes e referências da técnica anterior O processo de remoção de lignina de polpas quími- cas para produzir polpa acabada brilhante ou completamente branca é chamado "Branqueamento". Ele é necessário por ra- zões estéticas e para o aperfeiçoamento das propriedades do papel, porque a lignina residual excessiva deixada após a polpação confere ao papel uma cor marrom indesejada. O bran- queamento da polpa Kraft nos dias atuais usa grandes quanti- dades de substâncias químicas à base de cloro. O uso destas substâncias químicas gera substâncias orgânicas cloradas, as quais, sendo altamente tóxicas, causam diversos perigos à saúde. Assim, um método alternativo e de custo efetivo, i.e., o uso de micróbios e enzimas, têm proporcionado um mo- do muito simples e econômico de reduzir o uso de cloro e ou- tras substâncias químicas de branqueamento.

Visão Detalhada dos Diversos Organismos Fungos A lignina é o polímero aromático mais abundante na biosfera. Ela é encontrada na parede celular de todas as plantas vasculares em associação com a celulose e a hemice- lulose. Porque as ligações entre unidades na lignina não são hidrolisáveis, a lignina é difícil de degradar química ou biologicamente. A lignina circunda a celulose na parede ce- lular da planta formando uma matriz, a qual é ela própria resistente à degradação. A biodegradação da lignina é res- ponsável por muito da destruição natural da madeira em uso, e ela pode ter uma função importante na patogênese da plan- ta. Por outro lado, as aplicações potenciais utilizando or- ganismos que degradam a lignina e as suas enzimas tornaram- se atrativas, porque elas podem proporcionar tecnologias bo- as para o ambiente para a indústria de polpa e papel. Até o momento, somente alguns grupos de organismos são capazes de degradar os polímeros complexos de lignina, e eles são me- lhor exemplificados pelos fungos de decomposição branca. A maior parte da pesquisa em relação à biodegradação da ligni- na tem sido centrada em alguns fungos somente, tais como Phanerochaete chrysosporium, Streptomyces viridosporus, Pleurotus eryngii, Trametes trogii, Fusarium proliferatum (Regaldo e col., 1997) etc. (1) .

Os fungos basidiomicetos degradadores da madeira, gue causam a decomposição branca na madeira, são os degrada- dores de lignina mais eficientes na natureza (Kirk e Far- rell, 1987; Eriksson e col., 1990), e eles são, talvez, os maiores agentes da natureza para reciclar o carbono dos te- cidos lignifiçados. Nenhum outro microorganismo como cultura pura foi descrito por mineralizar os tecidos lignificados tão eficientemente (Kirk e Cullen, 1998). Eles são um grupo de fungos superiores taxonomicamente heterogêneos, caracte- rizados por sua capacidade única de despolimerizar e minera- lizar a lignina usando um grupo de enzimas ligninoliticas extracelulares. A degradação da lignina pelos fungos de de- composição branca tem sido extensivamente estudada durante os últimos trinta anos em relação às aplicações bioguimicas, tais como a biopolpação, o biobrangueamento, o tratamento dos efluentes da moagem da polpa e a biorremediação do solo (Akhtar e col., 1992, 1998; Lamar e col., 1992; Messner e Srebotnik, 1994) .

Em 1992, Frederick Archibald (2) demonstrou gue o fungo Trametes versicolor era capaz de descoloração e des- lignificação substanciais de polpas Kraft industriais não brangueadas, durante 2 a 5 dias.

Um ano mais tarde, o mesmo grupo de trabalhadores demonstrou gue um sobrenadante de cultura de biobrangueamen- to continha todos os componentes necessários para o biobran- gueamento e a deslignificação da polpa Kraft de madeira-de- lei (HWKP), porém o sobrenadante necessitava de contato fre- guente com o fungo para manter estas atividades. Assim, me- tabólitos fúngicos pequenos instáveis podem ser os componen- tes vitais do sistema de Biobranqueamento renovados ou subs- tituídos pelo fungo. Quase todo o CO2 produzido pela HWKP contendo culturas origina-se da glicose adicionada, indican- do que a HWKP na cultura marcadamente aumentou a produção de diversos metabólitos acidicos da cultura, incluindo o oxala- to, o glioxilato e o glicolato.

Os Aspergilli, os ascomicetos versáteis, são tam- bém verificados por transformar em uma taxa rápida um amplo espectro de compostos aromáticos relacionados à lignina.

Eles são mostrados por superproduzir altos niveis de enzimas hemiceluloliticas. (4) Maria Teresa et al. mostraram que a Cepa B0S55 de Bjerkandera sp. é um fungo de decomposição branca que pode branquear a polpa Kraft de eucalipto deslignifiçada com oxi- gênio extraída com EDTA (UKP) sem nenhuma exigência por man- ganês. Além disso, sob condições livres de manganês, a adi- ção de ácidos orgânicos fisiológicos simples (p.ex., Glico- lato, glioxilato, oxalato e outros) a 1-5 mM estimulou os ganhos de brilho e a deslignificação da polpa duas a três vezes, em comparação com os resultados que não receberam ácidos. A estimulação foi atribuída à produção aumentada de MnP e LiP, bem como às concentrações fisiológicas aumentadas de álcool veratrílico e oxalato. Estes fatores contribuiram para a produção muito aperfeiçoada de radicais de ânion de superóxido, os quais podem ter sido responsáveis pelo bio- branqueamento mais extensivo. (5) Bactérias A função das bactérias na biodegradação da lignina ainda é uma guestão de conjetura. Alguns trabalhadores têm demonstrado que tanto a cultura mista (Sundman et al., 1968) quanto a cultura pura de bactérias (Sorensen, 1962) pode de- senvolver-se sobre a lignina como uma fonte de carbono. A

Pseudomonas spp. foi reivindicada por Kawakami (1976) e por Odier e Monties (1977) por degradar as ligninas das plantas.

Odier e Montis também indicaram diversas outras cepas bacte- rianas que podem usar, dentro de um tempo de sete dias, mais do que 50% da lignina suprida em um meio mineral contendo glicose.

Diversas Nocardia e Pseudomonas spp., bem como al- gumas bactérias não identificadas, isoladas de água de lago contendo altas cargas de lignina residual, foram testadas quanto a sua capacidade de liberar 14CC>2 de deidropolimero (DHP) especificamente marcado com 14C de ligninas de álcool coniferilico ou palha de milho. Entretanto, somente algumas delas puderam liberar quantidades significativas de 14C02 da lignina marcada. A Nocardia spp. testada era mais ativa do que a Pseudomonas spp. e as bactérias não identificadas. (6) Os Actinomicetos são bactérias filamentosas que são encontradas no solo e adubos compostos onde a lignocelu- lose é decomposta. Diversos relatórios proporcionam evidên- cia que diversas espécies pertencentes ao gênero Strep- tomyces são capazes de degradar a lignina. Os outros Actino- micetos degradadores de lignina incluem Thermomonospora me- sophila, Actinomadura, Micromonospora com Streptomyces exi- bindo a maior capacidade de degradação da lignina. Na maio- ria dos estudos, a enzima degradadora de lignina foi produ- zida em niveis mais elevados em culturas contendo lignocelu- lose, o gue sugere gue um mecanismo de indução estava ativo.

Ajit Verma et al. (1994), enguanto trabalhando so- bre a relação simbiótica entre as térmites e os seus micró- bios intestinais, concluiu gue ambas as bactérias do solo e do intestino das térmites desempenham uma função importante na despolimerização do polímero. As bactérias do intestino têm a capacidade de degradar materiais celulósicos e hemice- lulósicos mais eficientemente. Diversos isolados bacterianos gue hidrolisam a celulose e a hemicelulose foram obtidos na cultura pura a partir do intestino da térmite. Alguns destes são Arthrobacter sp., Bacillus cereus, Clostridium sp., Mi- crococcus sp., Streptomyces sp., Serratia marcescens. Somen- te algumas bactérias de decomposição de xilano foram obtidas a partir do intestino da térmite (Micrococcus luteuns, Pseu- domonas aeruginosa). A guestão da degradação da lignina pe- las térmites é intrigante, visto gue muito do intestino da térmite é anaeróbico e os mecanismos anaeróbicos naturais da degradação da lignina são desconhecidos. (7) Berrocal et al. (1997) mostraram gue os filtrados sem células de Streptomyces sp. desenvolvidos em fermentação no estado sólido eram capazes de solubilizar até 20% da lig- nina de [14C]. A atividade das duas enzimas, peroxidase ex- tracelular e fenol oxidase (lacase), foi verificada por cor- relacionar-se com as taxas tanto de solubilização guanto de mineralização da lignina. (8) A presença de bactérias na madeira decomposta fre- quentemente em associação com os fungos tem sido o assunto de diversos relatórios. Entretanto, a sua função exata na degradação dos componentes da madeira não está ainda clara.

Enquanto que a disponibilidade de nitrogênio nutriente re- prime o metabolismo da lignina de 14C sintética a CO2 pelo Phanerochaete Chrysosporium, altos niveis de nitrogênio or- gânico eram ótimos para a degradação da lignina pela bacté- ria Streptomyces badius. (9) As enzimas são a base catalítica do metabolismo e, como tais, são o foco de pesquisa mundial intensa, não so- mente na comunidade biológica, como também com projetis- tas/engenheiros de processo, engenheiros químicos e pesqui- sadores que trabalham em outros campos científicos. Desde os tempos antigos, as enzimas têm desempenhado uma função cen- tral em muitos processos de fabricação, tal como na produção de vinho, queijo, pão, etc. A metade final do século vinte viu uma expansão sem precedente em nosso conhecimento do uso de microorganismos, seus produtos metabólicos, e enzimas em uma área ampla de pesquisa básica e suas aplicações indus- triais potenciais. Somente nas duas décadas passadas, entre- tanto, as enzimas microbianas têm sido usadas comercialmente na indústria de Polpa e Papel. (10) A aplicação mais comum das enzimas na indústria de papel é para aumentar o branqueamento. Pelo menos 15 paten- tes ou divulgações de patentes tratando dos tratamentos en- zimáticos para aumentar o branqueamento de polpas Kraft fo- ram apresentados entre 1988 e 1993. A polpação Kraft, também conhecida como polpação de sulfato, ou química, utiliza o enxofre para retirar a fi- bra das árvores. A polpação Kraft usa menos do que 50% da árvore. O restante acaba como lama, que é queimada, espalha- da sobre a terra ou misturada com terra. Um prêmio da polpa- ção Kraft é que as substâncias químicas podem ser recicladas e reutilizadas na moaqem. Um outro é que a fibra Kraft é ex- cepcionalmente forte ("Kraft" siqnifica "forte" em Alemão). A polpa Kraft é normalmente escura e é frequentemente bran- queada com compostos de cloro. O processo Kraft é responsável por 85% da produção total de polpa nos Estados Unidos, e é o maior componente da manufatura de papel no mundo. A polpação Kraft remove a lig- nina, dissolve e degrada a hemicelulose sem danificar a ce- lulose. Infelizmente, os produtos da degradação gerados du- rante a polpação ficam presos na matriz e conferem uma cor marrom à polpa Kraft. O cozimento consome substâncias quími- cas de polpação, e o xilano residual (juntamente como os produtos da degradação covalentemente ligados) precipita-se sobre as superfícies das fibras celulósicas. Os cromóforos são acreditados serem compostos de lignina residual e produ- tos da degradação de carboidratos. Eles são difíceis de ex- trair porque estão covalentemente ligados às porções de car- boidrato na matriz da polpa. Os fabricantes usam o cloro elementar (CI2) e o dióxido de cloro (CIO2) para branquear os cromóforos, e então eles extraem a polpa para produzir o papel branco. O custo do CI2 é aproximadamente de $12 a $15 por tonelada métrica de polpa, porém, porque isto resulta na produção de compostos aromáticos clorados, são empregados agentes de brangueamento alternativo, tais como 02, CIO2 ou H2C>2. Estes podem ser diversas vezes mais caros do gue o CI2. 0 brangueamento aumenta substancialmente o valor do produto, assim a despesa adicional pode ser justificada. 0 brangueamento com cloro pode criar problemas am- bientais. Os subprodutos da utilização destas substâncias guimicas são substâncias orgânicas cloradas, algumas das guais são tóxicas, mutagênicas, persistentes, e bioacumulam- se, e causam diversas desordens nocivas nos sistemas bioló- gicos (Onysko, 1993). As opções disponíveis são a desligni- ficação com oxigênio, o cozimento prolongado, e a substitui- ção por cloro, peróxido de hidrogênio, e ozônio do dióxido de cloro. Porém, a maioria destes métodos envolve alto in- vestimento de capital para a mudança de processo. Assim, um método alternativo e de custo efetivo, i.e., o uso de enzi- mas, tem proporcionado um modo muito simples e econômico de reduzir o uso de cloro e de outras substâncias guimicas de brangueamento.

Até agora, todos os trabalhos básicos e de pesgui- sa aplicada têm se concentrado nos fungos somente. No caso do biobrangueamento da polpa bruta, a aplicação de fungos não é viável devido ao seu impedimento estrutural causado pelas hifas fúngicas. 0 brangueamento da polpa usando enzi- mas purificadas a partir de fungos não é econômico, visto gue as etapas de purificação das enzimas tornam o processo caro e longo. Portanto, existe uma necessidade de se desen- volver um processo economicamente viável e eficaz para o bi- obranqueamento da polpa.

Objetivos da presente invenção 0 objetivo principal da presente invenção é pro- porcionar um processo para branquear a polpa Kraft de madei- ra-de-lei usando isolados bacterianos através de um processo de quatro estágios.

Um outro objetivo da invenção é proporcionar uma associação bacteriana definida para o branqueamento da polpa Kraft de madeira-de-lei, que seja segura, econômica, e efi- ciente .

Um outro objetivo da invenção é proporcionar as cepas bacterianas usadas nesta invenção para o biobranquea- mento da polpa Kraft.

Ainda um outro objetivo da presente invenção é de- senvolver um método de preparar um inóculo usando as cepas do presente Pedido.

Sumário da presente invenção A presente invenção relaciona-se a um método de quatro etapas bom para o ambiente, seguro, e eficiente, de biobranquear a polpa Kraft usando cepas bacterianas de n— de acesso MTCC 5096, MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, uma associação microbiana compreendendo uma mistura sinérgica de isolados bacterianos ligninoliticos de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, cepas bacterianas de N— de acesso MTCC 5096, MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, e um processo de preparar um inóculo do isolado bacteriano de n- de acesso MTCC 5096, adicionalmente, um processo para a pre- paração de uma associação compreendendo os isolados bacteri- anos ligninolíticos de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, além disso, um processo para a preparação de sus- pensão de polpa para o biobranqueamento.

Descrição detalhada da presente invenção A presente invenção relaciona-se a um método de quatro etapas, bom para o ambiente, seguro, e eficiente, de biobranquear a polpa Kraft usando cepas bacterianas de n— de acesso MTCC 5096, MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, uma associação microbiana compreendendo uma mistura sinérgica de isolados bacterianos ligninolíticos de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, cepas bacterianas de N— de acesso MTCC 5096, MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, e um processo de preparar um inóculo do isolado bacteriano de n- de acesso MTCC 5096, adicionalmente, um processo para a pre- paração de uma associação compreendendo os isolados bacteri- anos ligninolíticos de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, além disso, um processo para a preparação de sus- pensão de polpa para o biobranqueamento.

Em mais uma outra modalidade da presente invenção, em que um método de quatro etapas, bom para o ambiente, se- guro, e eficiente, de biobranquear a polpa Kraft usando ce- pas bacterianas de n— de acesso MTCC 5096, MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098, o dito método compreendendo as etapas de: • inocular a suspensão de polpa com um inóculo da cepa bacteriana MTCC 5096 tendo atividade de xilanase como o estágio um, • incubar a polpa inoculada por duração de tempo variando entre cerca de 15-20 horas, em torno de 100-120 rpm, em aproximadamente 26-32°C, • adicionar hidróxido de sódio e peróxido de hidrogênio à polpa inoculada da etapa (c) para a extração com álcali como o estágio dois, • incubar em torno de 65-70°C por duração de tempo de aproximadamente 1,5 - 2,5 horas, • filtrar a polpa e lavar com água destilada estéril, • suspender a polpa lavada em meio de sal minimo novo, • inocular a suspensão de polpa com a associação compre- endendo as cepas bacterianas ligninoliticas de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098 como o estágio três, • incubar a polpa inoculada da etapa (g) por um período de cerca de 15 - 20 horas, em torno de 100-120 rpm, em aproximadamente 26-32°C, em pH de cerca de 5-9, • repetir as etapas (b) a (e) com extração por álcali co- mo o estágio 4 para obter a polpa com % de brilho de cerca de 17%.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a temperatura durante o 3- estágio do biobrangueamento é apro- ximadamente 30 °C.

Em mais uma outra modalidade da presente invenção, o pH durante o 3- estágio de biobrangueamento é de aproxima- damente 8.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, são adicionados 20-30 mg de hidróxido de sódio e 200- 250 ul de peróxido de hidrogênio.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, o meio de sal mínimo (MSM) tem cerca de 0,1 a 1,0% de glicose.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, as cepas da associação estão na razão de 1:1:1.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, uma associação microbiana compreende uma mistura sinér- gica de isolados bacterianos ligninolíticos de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, uma cepa bacteriana de N- de acesso MTCC 5096 é útil para biobranquear a polpa.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, a cepa mostra biobranqueamento de cerca de 8%.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, uma cepa bacteriana é de N- de acesso MTCC 5094.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, uma cepa bacteriana é de N- de acesso MTCC 5095.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, uma cepa bacteriana é de N- de acesso MTCC 5098.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, um processo de preparar um inóculo do isolado bacteria- no de n- de acesso MTCC 5096 compreende as etapas de: • isolar a cepa bacteriana, • cultivar o isolado bacteriano sobre o meio contendo o extrato de solo e os meios nutrientes, • inocular o isolado bacteriano, • incubar e centrifugar a cultura resultante após atingir a D.O. desejada (1,00-2,00) para obter a pelota, • suspender a pelota em tampão de fosfato de aproximada- mente 0,03-0,05M em torno de pH 6,8, e • obter o inóculo.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, o isolado é cultivado sobre o meio contendo o extrato de solo e os meios nutrientes em proporções iguais.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, o isolado bacteriano é inoculado em meio de sal mínimo com glicose e a incubação é realizada por agitação a 100-120 rpm e em uma temperatura variando de 28-34°C.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, o crescimento resultante é centrifugado em rpm apropri- ada, preferivelmente a 8000-12000 rpm, por um período de apro- ximadamente 20-30 minutos, em uma temperatura de 1-4°C.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, a pelota é suspensa em tampão apropriado, tal como o tampão de fosfato ou o tampão de tris.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, um processo para a preparação de uma associação compre- endendo os isolados bacterianos ligninoliticos de n— de aces- so MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098 compreende as etapas de: • isolar as cepas bacterianas, • inocular os isolados bacterianos individualmente, incu- bar e desenvolver sob condições definidas e misturá-los em proporções aproximadamente iguais na base dos valo- res de densidade óptica, e • centrifugar a suspensão resultante para obter a pelota, • suspender a pelota em tampão de fosfato, e • obter a associação consistindo em três cepas bacteria- nas.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, a incubação dos isolados bacterianos é realizada por agitação em aproximadamente 100-120 rpm e a 30-35°C, por um período de 16 a 18 horas.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, a incubação dos isolados bacterianos é efetuada em uma temperatura variando entre 30°C - 37°C, por um período de 16 - 18 horas.

Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, a associação microbiana resultante é centrifugada em aproxi- madamente rpm, preferivelmente a 8000 - 12000 rpm, por um período de aproximadamente 20 - 30 minutos de 1-4°C.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, a pelota é suspensa em tampão apropriado, tal como o tampão de fosfato ou o tampão de tris.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, um processo para a preparação de suspensão de polpa pa- ra o biobranqueamento compreende as etapas de: • autoclavar a polpa não branqueada úmida em torno de 82,74- 193,05 kPa (12-28 psi) por aproximadamente 15-25 minutos, e • suspender a polpa autoclavada em um meio compreendendo meio de sais mínimos com 0,2% de glicose, sob condições estéreis.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, em que a polpa não branqueada a 7 - 10% é autoclavada. A relação entre o n- de depósito local e os n— de depósitos internacionais é como dada abaixo: 1. CBTCC/51-03 - MTCC 5096 2. CBTCC/52-03 - MTCC 5094 3. CBTCC/53-03 - MTCC 5095 4. CBTCC/54-03 - MTCC 5098 Características das Bactérias: MTCC 5096 Gram -, bastões MTCC 5094 Gram -, pequenos bastões MTCC 5095 Gram -, cocos MTCC 5098 Gram -, bastões longos Os n— acima estabelecidos são usados de forma in- tercambiável, entretanto, as reivindicações estão estrita- mente restritas aos detalhes do depósito Internacional so- mente .

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, a presente invenção fornece um novo processo biológico para branquear a polpa Kraft de madeira-de-lei. Este proces- so envolve exclusivamente o uso de isolado bacteriano para branquear a polpa. O processo de quatro estágios inclui a inoculação da polpa duas vezes com os isolados bacterianos em estágios diferentes, seguida por lavagem com álcali. Os isolados bacterianos usados no presente processo foram iso- lados de um local especifico, localizado em Roorkee, índia.

Os isolados bacterianos relacionados à presente invenção estão depositados no Depósito Internacional, Insti- tuto de Tecnologia Microbiana, Chandigarh, índia, um depósi- to reconhecido pela WIPO.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, estes isolados bacterianos estão exibindo uma capacida- de notável de branguear a polpa Kraft de madeira-de-lei sob condições definidas.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, os isolados bacterianos na presente invenção foram iso- lados de uma armazenagem de madeira situada em Roorkee, ín- dia, onde a serragem acumulava-se continuamente durante o período de 10-12 anos.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, os isolados bacterianos na presente invenção incluem bactérias degradadoras de xilano e as bactérias ligninolíti- cas, de modo gue foi realizado um enriguecimento diferente para ambos os tipos de bactérias, antes do isolamento.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, para aperfeiçoar o rendimento das bactérias degradado- ras de xilano, 5 g de solo novo do dito local foram inocula- dos no frasco autoclavado de 500 mL contendo 100 mL de ex- trato de solo, 0,2% de xilano e 50 pL de Candid B (antifún- gico). O frasco de enriguecimento foi mantido a 120 rpm por 96 horas, a 30°C.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, em um esforço de induzir as bactérias ligninoliticas, 5 g do dito solo novo foram inoculados em frasco de 500 mL contendo 100 mL de caldo nutriente, 100 mL de extrato de so- lo, 0,3% de lignina, álcool veratrilico a 1 mM, guaicol a 1 mM e 50 ul de Candid B. O frasco de enriquecimento foi man- tido a 30°C/120 rpm por 96 horas.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, para a preparação do extrato de solo, 1 kg de solo foi retirado e seco a 50°C por 2 horas. 400 g de solo seco foram dissolvidos em 960 mL de água destilada simples e autoclava- dos a 103, 42 kPa (15 lbs) por 1 hora. Após autoclavar, a amostra foi centrifugada a 5000 rpm por 10 minutos. O sobre- nadante (extrato) foi coletado e armazenado em frasco esté- ril para a preparação do frasco de enriquecimento e uso adi- cional .

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, as amostras de solo enriquecido foram diluídas em série em solução salina a 0,85%. 100 pL de cada diluição respecti- va foram espalhados sobre placas de Petri contendo extrato de solo, 50% de nutriente ágar e 0,2% de xilano para as bac- térias degradadoras de xilano ou 0,2% de lignina para o iso- lamento das bactérias ligninoliticas. As placas assim obti- das foram incubadas a 30 ± 2 °C por 24 - 96 horas na posição invertida.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, na base de morfologia e cor da colônia, 60 isolados to- tais foram selecionados para checar a sua capacidade para branquear a polpa de madeira-de-lei. As colônias isoladas individuais foram coletadas e estriadas sobre placas novas contendo o mesmo meio. A etapa acima descrita foi repetida até que fossem obtidas colônias puras.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, a triagem das culturas isoladas para a secreção de xi- lanases extracelulares foi feita, para a qual diferentes isolados foram cultivados em MSM e 0, 7% de xilano a 120 rpm/37°C. O ensaio de xilanase foi feito após cada 24 hs.

Para a determinação da atividade da β-xilanase, 200 pL de cultura de isolados e 800 pL de 0,7% (peso/vol) de xilano foram misturados e incubados a 55° C por 10 min. A reação foi interrompida por adição de 1,5 mL de ácido 3,5- dinitrossalicílico e a solução foi bem misturada e então aquecida em banho de água fervente por 15 min. Como um con- trole, 800 pL de xilano foram incubados e esfriados, e 200 pL de tampão de fosfato e 1,5 mL de ácido 3,5- dinitrossalicílico foram adicionados para corrigir os açúca- res redutores na solução de substrato. Os equivalentes de açúcares redutores foram medidos nas soluções tanto original quanto de controle por medição da densidade óptica a 540 nm (Miller et al. 1960) com D-xilose como o padrão. Uma unidade de atividade da β-xilanase foi definida como a quantidade de enzima que produziu 1 |lmol de açúcar redutor por minuto, sob as condições dadas.

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, para checar a atividade ligninolitica das bactérias isoladas, 10 mL de 0,4% de lignina foram levados para tubos de teste de 30 mL e o isolado bacteriano individual foi ino- culado. Após 3 dias, a descoloração da lignina foi observa- da .

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, o branqueamento da polpa Kraft de madeira-de-lei usando bactérias isoladas foi realizado em quatro estágios. No pri- meiro estágio, foi usado o isolado bacteriano que secreta xilanase, enquanto o segundo estágio envolveu a lavagem com álcali. O terceiro estágio incluiu o uso de bactérias ligni- noliticas, seguido por extração com álcali no quarto está- gio .

Em ainda uma outra modalidade da presente inven- ção, a polpa Kraft de madeira-de-lei não branqueada foi re- tirada do Century Paper Mill, índia. 7 g de polpa autoclava- da úmida foram dissolvidos em 100 mL de meio de sal mínimo (MSM) autoclavado com 0,3% de glicose em frasco esterilizado de 250 mL. O isolado bacteriano positivo de xilanase tendo D.O. de 1,00 foi inoculado em razão de 1:5. O frasco de branqueamento acima mencionado foi mantido a 28°C/120 rpm por 20 horas. Após 20 horas de incubação, 30 mg de hidróxido de sódio (NaOH) e 250 pL de peróxido de hidrogênio (H2O2) foram adicionados e o frasco foi mantido a 70°C por 2 horas. A polpa foi filtrada usando papel Whatman simples e novamen- te suspensa em 100 mL de MSM novo com 0,3% de glicose em condições estéreis. A associação compreendendo três bacté- rias ligninolíticas foi adicionada em razão de 1:5 e o fras- co foi mantido a 30°C/120 rpm por 20 h. Novamente foi feita a extração com álcali por adição de 30 mg de NaOH e 250 pL de H202, seguida por 2 horas de incubação a 70°C. A polpa foi filtrada e suspensa em 100 mL de água tri-destilada fresca. A mesma experiência foi feita para o frasco de con- trole não tendo nenhuma bactéria. A invenção adicionalmente fornece um processo de quatro estágios para branquear a polpa Kraft de madeira-de- lei usando as bactérias isoladas de local especifico, o qual compreende: a) cultivar as ditas bactérias isoladas de local espe- cifico, sob condições definidas, tais como meios, temperatura, pH, fonte de carbono, etc.; b) manter a densidade da cultura bacteriana para os di- ferentes estágios do processo de branqueamento. O MSM tendo 1,0% de glicose foi usado para desenvolver a cultura em frasco de 250 mL tendo 100 mL de cultu- ra. O frasco de cultura foi incubado a 30°C/120 rpm por 16-18 horas, a fim de obter a D.O. igual a 1,00; c) centrifugar a cultura resultante após obter a D.O. desejada (1,00), para obter a pelota; d) dissolver a pelota acima mencionada em 20 mL de tam- pão de P04-3, 0, 05 M, pH 6,8; e) preparar a polpa em MSM tendo 0,3% de glicose. 7 g da polpa não branqueada nova são dissolvidos em frasco de 250 mL tendo 100 mL de meio de sais míni- mos ; f) inocular a polpa com a pelota bacteriana específica para xilanase como formada em (d) e incubar o frasco a 28°C/120 rpm por 20 horas; g) adicionar 30 mg de hidróxido de sódio e 250 pL de peróxido de hidrogênio no frasco mencionado em (f) e incubar de 2 horas a 70°C; h) lavar e filtrar a polpa usando papel Whatman sim- ples ; i) suspender a polpa lavada em 100 mL de MSM novo com 0,3% de glicose e álcool veratrilico a 1 mM; j) inocular a associação compreendendo três bactérias ligninoliticas como preparadas em (b) , (c) e (d) e incubar por 20 horas a 30°C/120 rpm; k) adicionar 30 mg de hidróxido de sódio e 250 pL de peróxido de hidrogênio no frasco mencionado em (f) e incubar de 2 horas a 70°C como em (g); l) lavar e filtrar a polpa usando papel Whatman sim- ples ; m) secar a polpa a 50°C por 5 horas e medir o brilho.

Em uma modalidade da presente invenção, as bacté- rias são isoladas de local especifico com serragem, locali- zado em Roorkee, índia. O isolamento envolve enriquecimento definido e meios diferentes para as bactérias que secretam xilanase e as bactérias ligninoliticas.

Em uma outra modalidade da presente invenção, os isolados bacterianos acima mencionados são cultivados em meio de sal mínimo tendo 1% de glicose e o crescimento é mo- nitorado para obter a D.O. desejada a 30°C/120 rpm/16-18 h.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a cultura bacteriana é centrifugada e suspensa em 20 mL de tampão de P04-3, 0, 05 M, pH 6,8, para preparar o inóculo para o estudo de branqueamento.

Na modalidade adicional da presente invenção, a xilanase é testada por um método conhecido (Miller et ai. 1960) .

Em uma outra modalidade da presente invenção, a polpa é preparada em MSM tendo 0,3% de glicose, 7-10 gramas de polpa não branqueada nova são dissolvidos em frasco de 250 mL tendo 100 mL de MSM.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a polpa é inoculada com pelota bacteriana especifica para xi- lanase e o frasco é mantido a 28°C/120 rpm por 20 horas.

Na modalidade da presente invenção, 20-30 mg de hidróxido de sódio e 200-250 pL de peróxido de hidrogênio são adicionados no frasco e incubados a 70°C/2 horas.

Em uma outra modalidade da presente invenção, a lavagem e a filtração da polpa são realizadas usando papel Whatman simples e a polpa é transferida para 100 mL de MSM novo com 0,3% de glicose e álcool veratrilico a 1 mM.

Na modalidade adicional da presente invenção, a associação ligninolitica compreendendo três isolados bacte- rianos é adicionada e o frasco é mantido a 30°C/100-120 rpm por duas horas.

Em uma outra modalidade da presente invenção, 20- 30 mg de hidróxido de sódio e 200-250 pL de peróxido de hi- drogênio são adicionados no frasco e incubados a 70°C/2 ho- ras .

Na modalidade adicional da presente invenção, a lavagem e a filtração da polpa são realizadas usando papel Whatman simples e a polpa é seca a 50°C por 5 horas.

Exemplo 1 Uma alça da placa de ágar de isolado bacteriano designado como CBTCC/51-03 foi inoculada em 100 mL de MSM com 1% de glicose. A cultura foi incubada a 30°C por 16-24 horas em um agitador incubador a 100-120 rpm. Após incuba- ção, a densidade óptica foi medida a 650 nm. A densidade óp- tica da cultura foi mantida em 1,00 por diluição ou concen- tração da suspensão bacteriana. A cultura foi centrifugada a 10.000 rpm por 30 minutos a 4°C. A pelota foi dissolvida em 20 mL de tampão de fosfato, 0,05 M, pH 6,8. A suspensão de polpa da madeira-de-lei é preparada dissolvendo 10 g de polpa úmida autoclavada em 100 mL de MSM tendo 0,2% de glicose. 1 mL de pelota bacteriana como prepa- rada acima foi inoculado na polpa e o frasco foi incubado a 35°C, a 100 rpm, por 15 h. Não foi observada nenhuma brancu- ra significativa na polpa por causa da temperatura inadegua- da e menos inóculo bacteriano.

Exemplo 2 Uma alça da placa de ágar do isolado bacteriano designado como CBTCC/51-03 foi inoculada em 100 mL de MSM com 1% de glicose. A cultura foi incubada a 30°C por 16-24 horas em um agitador incubador a 100-120 rpm. Após incuba- ção, a densidade óptica foi medida a 650 nm. A densidade óp- tica da cultura foi mantida em 1,00 por diluição ou concen- tração da suspensão bacteriana. A cultura foi centrifugada a 10.000 rpm por 30 minutos a 4°C. A pelota foi dissolvida em 20 mL de tampão de fosfato, 0,05 M, pH 6,8. A suspensão de polpa da madeira-de-lei é preparada dissolvendo 7 g de polpa úmida autoclavada em 100 mL de MSM contendo 0,2% de glicose. 10 mL de pelota bacteriana como preparada acima foram inoculados na polpa e o frasco foi in- cubado a 35°C, a 100 rpm, por 15 h. Não foi observada nenhu- ma brancura significativa na polpa por causa da temperatura inadequada e menos inóculo bacteriano.

Exemplo 3 400 mL de MSM foram inoculados com uma cultura com alças cheias a partir de placa de ágar do isolado bacteriano designado como CBTCC/51-03. A cultura foi incubada a 30°C por 16-24 horas em um agitador incubador a 100-120 rpm. Após incubação, a densidade óptica foi medida a 650 nm. A densi- dade óptica da cultura foi mantida em 1,00 por diluição ou concentração da suspensão bacteriana. A cultura foi centri- fugada a 10.000 rpm por 30 minutos a 4°C. A pelota foi dis- solvida em 80 mL de tampão de fosfato, 0,05 M, pH 6,8.

Quatro frascos de suspensão de polpa foram prepa- rados individualmente por dissolução de 7 g de polpa úmida autoclavada em 100 mL de MSM tendo 0,2% de glicose. 20 mL de inóculo bacteriano como preparado acima foram inoculados em cada frasco. O primeiro frasco foi mantido a 22°C, enquanto que o segundo frasco a 28°C, o terceiro a 34°C e o quarto a 40°C. A extração com álcali foi feita para todos os frascos por incubação da polpa a 70°C por duas horas na presença de NaOH e H2O2 · O frasco mantido a 28°C era mais brilhante (8%) em comparação com os outros frascos (Tabela 1).

Tabela 1: Otimização da temperatura do processo de biobran- queamento usando CBTCC/51-03 Exemplo 4 0 experimento de biobranqueamento foi realizado em quatro etapas. 0 primeiro inóculo foi preparado por inocula- ção de 400 mL de MSM com um crescimento de alças cheias a partir da placa de ágar do isolado bacteriano designado como CBTCC/51-03. 0 segundo inóculo foi preparado por inoculação de três frascos individualmente tendo 150 mL de MSM com um crescimento de alças cheias de CBTCC/52-03, CBTCC/53-03 e CBTCC/54-03. Todos os frascos foram incubados a 30°C por 16- 24 horas em um agitador incubador a 100-120 rpm. Após incu- bação, a densidade óptica foi medida a 650 nm. A densidade óptica da cultura foi mantida em 1,00 por diluição ou con- centração da suspensão bacteriana. A primeira cultura foi centrifugada separadamente, enquanto as três culturas para preparar o segundo inóculo foram misturadas igualmente e centrifugadas juntas. A pelota da primeira cultura foi dis- solvida em 80 mL de tampão de fosfato, 0,05 M, pH 6,8, en- quanto a pelota das três culturas reunidas foi dissolvida em 90 mL de tampão de fosfato, 0,05 M, pH 6,8.

Oito frascos de polpa foram preparados por disso- lução de 7 g de polpa úmida em cada 100 mL de MSM tendo 0,2%. Os primeiros quatro frascos foram inoculados com 20 mL do primeiro inóculo de CBTCC/51-03. Todos os frascos foram incubados a 28°C/120 rpm por 20 horas. Após 20 horas de in- cubação, 30 mg de NaOH e 250 ul de H2O2 foram adicionados em cada frasco e incubados a 70°C por 2 horas. A polpa foi fil- trada usando papel Whatman simples e novamente suspensa nos quatro frascos tendo 100 mL de MSM novo com 0,2% de glicose, em condições estéreis. 20 mL do segundo inóculo (associação) compreendendo três bactérias ligninolíticas foram adiciona- dos a cada frasco. Todos os frascos foram mantidos a 35°C/120 rpm por 20 h. Novamente foi feita a extração com álcali por adição de 30 mg de NaOH e 250 pL de H202, seguida por incubação de 2 horas a 70°C. A polpa foi filtrada e sus- pensa em 100 mL de água tri-destilada fresca. A mesma expe- riência foi realizada para o frasco de controle não tendo nenhuma bactéria. Finalmente, 10-11% de brilho foi observado nos frascos de polpa de teste (Tabela 2) .

Tabela 2: Efeito combinado de uma única bactéria e uma asso- ciação de três bactérias na experiência de branqueamento.

Exemplo 5 A fim de ver o efeito do pH e da temperatura sobre o estudo de biobranqueamento, o primeiro inóculo foi prepa- rado para dezesseis frascos de polpa de 100 mL. Para o se- gundo inóculo, uma associação de três bactérias foi também preparada para dezesseis frascos. 0 inóculo foi preparado conforme mencionado nos exemplos anteriores.

Os dezesseis frascos de polpa totais foram prepa- rados por dissolução dos 7 g de polpa úmida em cada 100 mL de MSM tendo 0,2%. Os primeiros quatro frascos foram inocu- lados com 20 mL do primeiro inóculo do isolado bacteriano designado como CBTCC/51-03. O frasco foi incubado a 28°C/120 rpm por 20 horas. Após 20 horas de incubação, 30 mg de NaOH e 250 ul de H2O2 foram adicionados e o frasco foi mantido a 70°C por 2 horas. A polpa foi filtrada usando papel Whatman simples e novamente suspensa em quatro 100 mL de MSM novo com 0,2% de glicose, em condições estéreis. 20 mL do segundo inóculo (associação) compreendendo três bactérias ligninolí- ticas foram adicionados ao frasco. Para ver o efeito da tem- peratura, os frascos de polpa foram mantidos a 27°C, 30°C, 33°C e 37°C por 20 horas, sob condição de agitação (120 rpm). Novamente foi feita a extração com álcali por adição de 30 mg de NaOH e 250 pL de H2O2, seguida por incubação de 2 horas a 70°C. A polpa foi filtrada e suspensa em 100 mL de água tri-destilada fresca. A mesma experiência foi realizada para o frasco de controle não tendo nenhuma bactéria. Mais brilho foi observado a 30°C (Tabela 3).

Para ver o efeito do pH sobre o estudo de biobran- queamento, os frascos de polpa foram ajustados para pH 5, pH 7, pH 8 e pH 9 usando diferentes tampões. Após o ajuste do pH, estes frascos foram inoculados com 20 mL do primeiro inóculo de isolado bacteriano designado como CBTCC/51-03. O frasco foi incubado a 28°C/120 rpm por 20 horas. Após 20 ho- ras de incubação, 30 mg de NaOH e 250 pL foram adicionados e o frasco foi mantido a 70°C por 2 horas. A polpa foi filtra- da usando papel Whatman simples e novamente suspensa em qua- tro 100 mL de MSM novo tendo pH's 5, 7, 8 e 9 diferentes. 20 mL do segundo inóculo (associação) compreendendo três bacté- rias ligninoliticas foram adicionados aos frascos. Todos os frascos foram mantidos a 30°C/120 rpm por 20 h. Novamente foi feita a extração com álcali por adição de 30 mg de NaOH

e 250 pL de H2O2, seguida por incubação de 2 horas a 70°C. A polpa foi filtrada e suspensa em 100 mL de água tr i- destilada fresca. A mesma experiência foi realizada para o frasco de controle não tendo nenhuma bactéria. 15% de brilho da polpa foi observado em pH 8 (tabela 4).

Tabela 3: Otimização da temperatura durante o terceiro está- gio de experiência de biobranqueamento Tabela 4: Otimização do pH na experiência de biobranqueameri- to____________________________________________________ As vantagens principais da invenção 1. 0 processo de biobranqueamento de quatro estágios de- senvolvido substitui o uso de cloro e dióxido de cloro na moagem da polpa e do papel. Assim, não há nenhuma geração de substâncias orgânicas cloradas tóxicas, tais como a dioxina, a bifenila etc. 2. A suspensão bacteriana preparada e a associação cortam o estágio CD de branqueamento químico na moagem da polpa, quando elas atuam de modo sinérgico. 3. Em comparação com o branqueamento químico, o processo desenvolvido é altamente econômico. 4. 0 processo de biobranqueamento desenvolvido é ambien- talmente seguro porque não há nenhuma geração de polu- entes clorados. 5. 0 processo desenvolvido é altamente competitivo em termos de tecnologia, viabilidade e aplicabilidade.

Claims (6)

1. Método de quatro etapas, bom para o ambiente, seguro e eficiente, de biobranquear a polpa Kraft de madei- ra-de-lei usando uma cepa bacteriana xilanolitica, Providen- cia rettgeri, de n- de acesso MTCC 5096, e uma associação bacteriana de três bactérias ligninoliticas consistindo em Serratia marcescens, de n- de acesso MTCC 5094, Pseudomonas aeruginosa, de n- de acesso MTCC 5095, e Pseudomonas aerugi- nosa, de n- de acesso MTCC 5098, o dito método sendo CARACTERIZADO por compreender as etapas de: a. autoclavar a polpa não branqueada úmida a 82,74- 193,05 kPa (12-28 psi) por 15-25 minutos, b. suspender a polpa autoclavada em um meio compreen- dendo meio de sais mínimos com 0,2% de glicose, sob condições estéreis, c. inocular a suspensão de polpa com um inóculo da cepa bacteriana MTCC 5096 tendo atividade de xilanase co- mo o estágio um, d. incubar a polpa inoculada por duração de tempo vari- ando entre 15-20 horas, com uma rotação de 100-120 rpm a 26-32°C, e. adicionar hidróxido de sódio e peróxido de hidrogê- nio à polpa inoculada da etapa (c) para a extração com álcali como o estágio dois, f. incubar a polpa a 65-70°C por duração de tempo de 1,5-2,5 horas, g. filtrar a polpa e lavar com água destilada estéril, h. suspender a polpa lavada em meio de sal minimo novo, i. inocular a suspensão de polpa com a associação com- preendendo as cepas bacterianas ligninolíticas de n— de acesso MTCC 5094, MTCC 5095, e MTCC 5098 em pro- porções iguais, como o estágio três, j . incubar a polpa inoculada da etapa (g) por um perío- do de 15-20 horas, com uma rotação de 100-120 rpm a 26-32°C em pH de 5-9, e k. repetir as etapas (b) a (e) com extração por álcali como o estágio guatro para obter a polpa com % de brilho de 15%.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a temperatura durante o 3£ estágio do biobranqueamento é de 30°C.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH durante o 3£ estágio de biobranqueamento é de 8.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que são adicionados 2 0-3 0 mg de hidróxido de sódio e 200-250 pL de peróxido de hidrogênio.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de sal mínimo (MSM) possui 0,2% de glicose.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as cepas da associação estão na razão de 1:1:1.