BRPI0303266B1 - PROTEÍNA RECOMBINANTE Sm14, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E,KIT DE DIAGNÓSTICO. - Google Patents
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Abstract
"antígenos derivados de helmintos com capacidade de conferir proteção contra parasitos". o objetivo principal da presente invenção é o desenvolvimento de novas formas mutantes da proteína sm14 para a produção de volumes maiores de produção. as proteinas recombinantes aqui obtidas foram capazes de conferir proteção contra a infecção causada por schistosomas e fasciola. o nível de proteção das proteinas sm14 recombinantes obtidas na presente invenção foi semelhante àquele alcançado com o extrato salino do parasita. as proteinas mutantes da presente invenção conseguiram aproximadamente 100% de renaturação após o aquecimento a 80<198>c, diferente das formas selvangens da proteina sm14. além disso, após armazenamento por 2 meses a 4<198>c, as proteínas mutantes apresentaram uma menor perda de estrutura-<225> do que as formas selvagens, as quais mostraram formação de estrutura randômica, como mostrou a análise por dicroísmo circular, o que indica o sucesso das mutações.
Description
PROTEÍNA RECOMBINANTE Sm14, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E,
KIT DE DIAGNÓSTICO
Campo Técnico
A presente invenção, em seu aspecto mais geral, se refere a material antigênco derivado de helmintos capaz de conferir proteção contra parasitos.
A invenção também se refere a vacinas que conferem imunidade protetora contra infecção causada por helmintos.
A invenção também está relacionada a um método de vacinação de um hospedeiro mamífero contra infecções causadas por helmintos.
Fundamentos da Invenção
Entre os helmintos, os trematódeos digenéticos compreendem mais de 100 famílias. A maioria deles são parasitas relativamente pouco agressivos que vivem no intestino e outros órgãos de vertebrados e, consequentemente, têm recebido pouca atenção dos parasitologistas que fazem uso da parasitologia aplicada. Aqueles trematódeos que causam sérias doenças no homem são os trematódeos da corrente sanguínea, os Schístosomas, e os trematódeos do fígado e pulmão que são parasitas muito importantes que infectam animais.
A esquistossomose é uma doença causada por trematódeos sanguíneos, que pertencem à família Schistosornatidae, classe Trematoda, sub-classe
Petição 870190003002, de 10/01/2019, pág. 7/10
127 • ··· · ··· · ··· · ·· ·· • · · · · · · ···· * ········ · ·· ·· •·· · · · · ··· · · japonicum localizam-sem nas veias mesentéricas do intestino, enquanto que o S. haematobium encontram-se nas veias que rodeiam a bexiga.
A Fasciola, que é o trematódeo mais importante do fígado, é o parasito preferencial em ruminantes domésticos e é responsável por sérias perdas econômicas no mundo todo,
atingindo o gado bovino, ovino e caprino.
A principal característica da doença, e que é responsável pela patologia, morbidade e mortalidade dos animais mencionados, está baseada na destruição do tecido hepático do hospedeiro em consequência aos dutos biliares aonde vive o
A morbidade especialmente consequência espécime dos danos adulto da causados
Fasciola.
é elevada em infectados pela morrem. Fasciola, animais jovens que
Fasciola hepatica e, em algumas ocasiões, são em pode também parasitar o homem, quando ocorre uma oportunidade de
este entrar em contato com o habitat da doença animal e isso é mais frequente em Cuba e em alguns paises da América
Latina. Entretanto, o verdadeiro trematódeo do fígado do homem é outro parasita, chamado Clonorchis sinensis, o qual é muito difundido na China, Japão, Coréia, Vietnã e índia. A patologia é basicamente causada pelo espessamento das paredes dos dutos biliares e, em casos mais severos, causam cirrose do fígado e morte.
Ambas a Fasciola e a Clonorchis entram no hospedeiro passivamente como uma forma larval chamada metacercária ingerida com a comida (pastagem e peixe cru para Fasciola e Clonorchis, respectivamente), mas sua via de migração no organismo do hospedeiro vertebrado é através dos dutos
biliares e diferem entre si. Enquanto Clonorchis ganha a árvore biliar através do intestino e através da ampola de Vater, a Fasciola migra através da cavidade abdominal penetrando ativamente a parede do fígado por sua cápsula, ganham o parênquima e depois o sistema biliar causando sérios danos aos tecidos do hospedeiro.
Em relação à Fasciolose em animais domésticos, existem resultados conflitantes e poucas evidências a sugerir que carneiros ou cabras adquiram imunidade contra Fasciola hepatica (Sinclair, 1967) após imunização com extratos brutos.
Existem também evidências que mostram que a infecção pode persistir por pelo menos 11 anos em carneiros infectados experimentalmente (Durbin, 1952). Foi também relatado que muito pouca ou nenhuma reação contra o parasita ocorra por parte do hospedeiro, assim a sobrevivência dos carneiros infectados dependerá inteiramente do número de metacercárias ingeridas (Boray, 1969). 0 gado bovino é considerado mais resistente contra a F. hepatica. A Fasciola nestes casos, geralmente vive no hospedeiro por uma média de 9-12 meses, mas são os animais jovens os mais atingidos clinicamente pela fasciolose.
Diversas tentativas vêm sendo feitas para identificar os antígenos comprometidos com a resistência e que possam ser usados para a imunoprofilaxia e, que pudessem servir de base para o desenvolvimento de vacinas eficazes contra fasciolose. Basicamente, duas estratégias experimentais independentes têm sido seguidas por diversos cientistas, baseadas em: 1) imunidade induzida por cercárias vivas
3# • ♦·· · ··« * ·· • · · · · ♦ · · · • · · · · ··« · «b irradiadas, que é a base da considerada vacina viva e, imunidade induzida por vacinas chamadas de mortas.
No entanto, poucos trabalhos têm sido publicados no contexto da obtenção de resistência adquirida à Fasciola hepatica em bezerros usando extratos brutos somáticos do parasita adulto. Ross,
1967; Hall and
Lang, 1978, Hillyer,
1979 relatam dados conflitantes nesse contexto.
A imunidade induzida por vacinas obtidas através da irradiação de metacercárias, chamadas de vacinas vivas irradiadas ou atenuadas, também levou a resultados frustantes em experimentos realizados em camundongos, coelhos e carneiros (Campbell et al, 1978, Hughes, 1963), já que nenhuma evidência do desenvolvimento de imunidade importante nesses animais ocorreu após a administração metacercárias irradiadas.
Adicionalmente, experimentos com diferentes extratos produtos de excreção e secreção trematódeos, obtidos diretamente mostraram imunogênicos já que materiais oriundos dessas formas de de dos os da forma adulta dutos biliares, não de se animais vacinados com parasitárias, apresentavam, semelhantemente aos controles dos experimentos, muito baixa ou nenhuma proteção e lesões do ponto de vista patológico no parênquima do figado.
esperado, com base no estado da técnica, que o gado bovino possa responder melhor à vacinação com as vacinas mortas.
No caso, do gado caprino não há indicações experimentais a sugerir que situação similar pudesse ser previsível com base na proteção apenas medíocre que é ·· »·· * ··« · · ·· • « · · · ♦ · · · · · · C) ·····*··· · ·· «· '-, ·· · · · ··· »··«·· • · ········· «te·· • ·<* * · · ·* ··« t « induzida pela administração de uma série de antígenos diferentes em experimentos desses animais.
A indução de imunidade protetora, por meio de imunidade heteróloga, tem sido uma perspectiva focalizada por Campbell et al (1977) que mostrou que a infecção de carneiros por
Cysticercus tenuicollis, que é o estágio de metacestódeo da
tênia de cães, que é a Taenia hydatigena, produz proteção parcial contra a Fasciola hepatica. Entretanto, Hughes et al (1978) não confirmaram esse resultado. Em outros experimentos, viu-se também a incapacidade de induzir proteção com esse cestódeo contra a Fasciola hepatica em animais de experimentação.
Os camundongos infectados com S. mansoni bissexuais adultos desenvolveram resistência estatisticamente significante à Fasciola hepatica e, também contra infecções simultâneas por ambos os parasitos que resultaram em um número reduzido da carga parasitária posterior e também na redução do número de ovos por verme adulto (Christensen et al, 1978). Os bezerros infectados com S. bovis também mostraram alguma resistência contra Fasciola hepatica e dano hepático menos pronunciado (Sirag et al, 1981) .
Pelley e Hillyer, 1978 e Hillyer e de Atica, 1980, relataram antígenos comuns entre Fasciola hepatica e Schistosoma mansoni encontrados nos ovos do Schistosoma.
Outro achado, que indica reatividade cruzada e imunidade cruzada, é a ocorrência de reações falso-positivas em áreas onde ambos os parasitos são endêmicos. Hillyer, 1985 (Hillyer, G.V. 1985 Induction of immunity in mice to Fasciola hepatica with a Fasciola/Schistosoma cross-reactive
45/ • · ·· • · ·· • · ·♦ • · · ··· ' ··· ··· • ·· ·♦ ··· ···· · • · · · · ·· ·· ··· · · ···· ······· ···· • · 9 · ·· · · defined immunity antigen. Am. J. Trop. Med. Hyg.34(6), pp. 1127-1131) e Hillyer et al, 1987 (Hillyer, G.V., Haroun, E.T.M., Hernandez, A. e Soler de Galanes, M. 1987. Aquired resistance to F. hepatica in cattle using a purified adult worm antigen. Am. J. Trop. med. Hyg. 37(2). pp. 363-369) demonstraram também que uma mistura antigênica derivada de Fasciola hepatica pode conferir proteção contra infecções subsequentes causadas por Fasciola hepatica e Schistosoma mansoni.
Desta forma, admite-se que uma vacina eficaz venha a ser o método mais poderoso e de melhor relação custobeneficio, no sentido de interromper a transmissão da doença e erradicá-la no contexto humano da questão, no que toca a esquistossomose, e no contexto veterinário, no que toca a fasciolose.
Uma variedade de espécies de hospedeiros podem desenvolver resistência parcial ao Schistosoma mansoni a partir de uma infecção inicial ou a partir da imunização com cercárias irradiadas (Smithers, S.R. e Doenhoff, M. 1982. Schistosomiasis In: Immunology of Parasitic Infections. Blackwell Scientific Publications, 2a Edição, Capítulo 17, pp. 527-607). As informações do estado da técnica com relação à possibilidade de se imunizar com extratos brutos ou material oriundo de formas parasitárias de Schistosoma mansoni (Clegg & Smith, 1978) têm dado lugar à possibilidade de produzir-se uma vacina definida e eficaz contra o parasita através de antígenos do parasita, ou seja, vacinas mortas (Tendler, M. 1987. S. mansoni: Protective antigens. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. Vol. 82. Suppl. IV. pp. 125-128).
• · • ·
Entretanto, a maior limitação estava no grau
incompleto de proteção que se obtém em animais, na maioria dos experimentos com material purificado e quimicamente definido. Como descrito por vários autores e revisado por
Smithers em 1982 (Smithers,
S.R.
1982. Fascioliasis and other Trematode Infections.
In:
Immunology of Parasitic
Infections. Blackwell Scientific
Publications 2a Edição,
Capítulo 17, necessidade de imunoprofilaxia pp.
se aumentar o experimental.
havia já um consenso da nível de proteção induzida na
Entretanto, o estabelecimento de um bom modelo animal para o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a esquistossomose tem sido muito difícil de se estabelecer. O progresso nesse sentido depende da identificação e purificação de moléculas antigênicas 15 altamente eficazes que poderíam mediar a imunidade protetora. (Tendler, M. Schistosoma mansoni: Protective | Antigens, Mem. do Inst. Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Vol.
82, Suppl. IV: 125-128, 1987).
Em estudos anteriores na busca de antígenos que mediam a imunidade protetora contra os esquistossomas, foram relatado o uso de uma
Schistosoma (chamado incubação de vermes tamponada (Tendler, M.
S.
mistura complexa de componentes do adultos vivos em solução salina
Scarpin, M.1979. The presence of mansoni antigens in solutions used for storing adult worms. Rev. Inst. Med.
Trop. 21(6), pp. 293-296; Kohn et a obtenção de proteção contra a infecção cercariana por meio de uma vacina, um modelo experimental foi observado em dois hospedeiros animais não • · ·
singênicos, com suscetibilidades diferentes à infecção pelo
S. mansoni. Sendo um suscetível, o camundongo, e o outro, parcialmente resistente à infecção, o coelho.
No modelo de S. mansoni em coelho da Nova Zelândia foi possível estabelecer um padrão confiável de infecção percutânea, com a recuperação de cargas parasitárias homogêneas em número e tamanho dos parasitos e relação macho/fêmea, por longos períodos pós-infecção (Tendler, M.,
Lima, A., Pinto, R., Cruz, M., Brascher, H., Katz, N. 1982
Immunogenic and protective activity of an extract of S.
mansoni. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro. Vol.
77(3), pp. 275-283; Tendler, M. 1985 e Tendler, M. 1986). Dados recentes sugerem que o uso do coelho como um hospedeiro experimental do S. mansoni pode representar um 15 novo modelo da imunidade da doença.
Experimentos de imunização que foram realizados em coelhos com a mistura SE resultaram em níveis de proteção muito elevados após a infecção desafio (Scarpin, M., Tendler, M. Messineo, L., Katz, N. 1980 preliminary studies 20 with a Schistosoma mansoni saline extract inducinq protection in rabbits against the challenge infection. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo. 22(4), pp. 164-172; Tendler, M. 1980; Tendler, M. 1982) (90% de redução da carga parasitária média dos animais vacinados comparados com os controles 25 pareados por sexo e idade dos animais, infectados com o mesmo lote de cercárias obtidas da cepa LE, uma cepa brasileira do S. mansoni). Camundongos SW imunizados com SE também apresentaram proteção significativa quando desafiados com cercárias, além de apresentarem proteção total contra infecções letais (Tendler,1986).
Para a avaliação da
resistência, animais vacinados e desafiados e, seus respectivos controles, são submetidos à perfusão venosa dos sistemas porta-hepático e mesentérico para a recuperação e 5 contagem da carga parasitária adulta. 0 grau de proteção é calculado pela diferença entre o número de parasitos recuperados dos controles em comparação com os animais vacinados (Tendler
Com base nas evidências in vitro de que anticorpos contra diferentes fases evolutivas dos parasitas são eficazes em ensaios de citotoxicidade com eosinófilos ou dependente de complemento (Grzych et al,
1982; Smith et al.,1982), a caracterização de antígenos reconhecidos pelo soro de animais sabidamente resistentes é usada para a identificação de moléculas antigênicas potencialmente capazes de mediar a imunidade protetora (Bickle et al., 1986; Horowitz & Arnon, 1985). Experimentos de Western blot foram realizados para analisar a resposta de anticorpos de coelhos vacinados com SE. Testando os antígenos de SE contra um painel de anti-soros de coelhos imunizados com o mesmo esquema (SE-ACF - Mistura Complexa de Componentes do
Schistossoma-Adjuvante Completo de Freund) os autores foram capazes de demonstrar em imunoblots, a ocorrência de dois padrões de reconhecimento dos componentes do SE.
Interessantemente, alguns componentes do SE só foram reconhecidos pelos soros de coelhos que desenvolveram proteção total. Este resultado permitiu aos autores identificar dois grupos de componentes de SE: um comum a todos os indivíduos e outro grupo de antígenos que só é • ·· • ·· • ·· • · • · ·· · • · ·· • ···· • · · ·· • · · ·· • · · ·· reconhecido pelo soro de animais (coelhos) vacinados com w
SE e que foram totalmente protegidos. Estes dois padrões de reconhecimento foram denominados de padrão de
Alta e de
Baixa proteção e foram usados como anticorpos diferenciais.
Com base nestes dois padrões de reconhecimento dos componentes do SE por soros policlonais de coelhos que respondem diferencialmente ao mesmo esquema de imunização (provavelmente por conta do padrão individual de variação que se espera singênicas) , foi usada a estratégia de rastreamento de bibliotecas de cDNA com esses dois soros.
Com a limitação do conhecimento incompleto sobre os mecanismos críticos de resposta protetora, tanto em animais de experimentação quanto na esquistossomose clínica, os 15 procedimentos de rastreamento (screening) adotados, freqüentemente, envolvem o uso de soros humanos de indivíduos infectados potencialmente imunes ou suscetíveis (Carter & Colley, 1986) ou anticorpos monoclonais ou policlonais de animais imunizados dirigidos contra vários 20 antígenos não caracterizados (Lanar et al., 1986; Balloul et al., 1987).
Em tentativas inicias de clonagem molecular dos componentes potencialmente protetores do SE, duas bibliotecas de cDNA de vermes adultos do S. mansoni e S.
japonicum, construídas pelos Drs. Klinkert, University of
Heidelberg e Donnelson/Henkle, Iowa University, respectivamente, foram rastreadas com filtros duplos (differential screening). Um paralelo pode ser traçado com os resultados dos imunoblots nos quais dois grupos • · · ··· · · diferentes de clones foram selecionados, correspondendo potencialmente ao padrão diferencial de reconhecimento de soros de coelho anti-SE de alta e baixa proteção. Em experimentos paralelos, objetivando a identificação de componentes de SE, foram comparados em imunoblots soros policlonais de coelho anti-SE (alta e baixa proteção) com o soro de coelhos, contra paramiosina purificada do Schistosoma (cedida pelo Dr. A. Sher, NIH). Esta proteína havia sido definida como uma molécula parcialmente protetora contra a infecção de camundongos singênicos pelo Schistosoma mansoni (Lanar et al, 1986), a molécula possui peso molecular Mr(xl0~3) 97, e é sensível à degradação proteolítica, resultando em dois subprodutos de Mr(xl0-3) 95 e 78 (Pearce et al., 1986).
O complexo 97/95/78 foi reconhecido pelos soros anti-SE de baixa e alta proteção e pelo soro monoespecífico contra a paramiosina. Os soros anti-SE de alta proteção reconheceram, ainda, além da paramiosina, outros peptídeos e proteínas a serem caracterizados e testados em termos de sua proteção e função imunológica.
A detecção de paramiosina como um dos componentes de SE, reforça dados anteriores de ensaios de imunofluorescência indireta, realizados em corte de vermes adultos do Schistosoma com soro de coelho anti-SE que reagiram com a superfície do parasita e com a região entre as camadas musculares (Mendonça et al., 1987), de forma semelhante ao que havia sido demonstrado para a paramiosina (Pearce et al., 1986).
3¾
Esse resultado também foi concordante com os resultados de rastreamento das bibliotecas de cDNA realizadas como mencionado. Novamente, clones comuns de paramiosina foram isolados com os soros anti-paramiosina e anti-SE e, foram também obtidos clones reconhecidos somente pelos soros de coelho anti-SE (de alta
Entre os outros componentes do
SE de menor peso molecular, foi também identificado componente de 31/32 kDa, descrito como candidato potencial para diagnóstico da esquistossomose (Klinkert et al., 1987) e, recentemente, identificado como protease localizada no tubo digestivo, (Klinkert et al., 1988). Esses antígenos e outros que foram identificados em SE induziram proteção muito baixa em testes de vacinação.
A incubação de vermes adultos vivos, recém perfundidos em meio quimicamente definido (PBS-Phosphate Buffered
Saline), foi utilizada para a obtenção de antígenos liberados precocemente dos vermes adultos vivos (especialmente de secreção/excreção e componentes do tegumento).
Essa estratégia foi adotada com base em tentativas frustradas anteriores, de outros autores, visando a indução de alta resistência contra a infecção pelo Schistosoma a partir de diferentes extratos brutos do S. mansoni que 25 poderiam estar teoricamente depletados de antígenos funcionais relevantes. Esta premissa foi influenciada, principalmente porque os procedimentos de extração de antígenos comumente adotados por outros autores, utilizaram parasitas mortos. De fato, usando-se SE emulsionado em ACF • · · · • · · · • · · · · • · · · · • ·
(Adjuvante Completo de Freund, como adjuvante preferencial) e administrado pela via intradérmica/subcutânea, obtém-se alta proteção e de longa duração em dois modelos experimentais animais contra a infecção pelo S. mansoni. A 5 razão para o uso de um modelo usando coelho, que é um tanto raro para ensaio de proteção, era alcançar uma identificação inicial de antígenos potencialmente protetores em hospedeiros parcialmente resistentes (para ser testado posteriormente em hospedeiros suscetíveis) que poderíam, no 10 entanto, amplificar a resposta imune e mecanismos eficazes de morte parasitária, pois os coelhos são reconhecidamente potentes produtores de anticorpos.
Estudos sobre a resposta imune induzida em animais vacinados, objetivando a identificação de componentes 15 protetores de SE funcionais e relevantes, sítio e mecanismos de morte parasitária, assim como marcadores de proteção foram o foco de nossos esforços nos últimos anos. Porém, apenas recentemente, tornaram-se disponíveis informações sobre a composição do SE, a partir da identificação e o 20 isolamento dos seus componentes protetores.
A Patente US 4.396.000, publicada em 02 de Agosto de 1983, em nome de Luigi Messineo & Mauro Scarpin (de acordo com o Certificado de Reexame 461 BI 4.396.000 publicada em 11 de fevereiro de 1986, a patente foi cancelada) descreve 25 um extrato de vermes adultos de Schistosoma mansoni, obtidos pela incubação em tampão fosfato de sódio - cloreto de sódio - PBS 0,15 M (pH=5,8), que contém proteínas, carbohidratos e ácidos nucléicos e/ou sub-produtos deste último componente os quais se separam em 4 frações principais por
| 14 | • · | ··· ♦ ··· · ·♦· · | |||
| • · | • ·· '··· ·· | ||||
| • • | •·· ’·' ’·’ ’· · ··· | ||||
| cromatografia | em gel | em | coluna | Sephadex G-100 e G-200. | |
| Testes de imunodifusão | com | soro de | coelho | anti-extrato total | |
| revelaram 3 | linhas | de | precipitação, | correspondendo às |
frações I • · e II e uma com as frações
III e IV. Coelhos • · • · • · • · imunizados com este extrato total desenvolveram resistência total ou parcial (pelo menos 77%), contra infecção desafio
posterior. 0 material antigênico do extrato salino mostrou ser uma vacina eficaz para o tratamento e a imunização da esquistossomose e outras infecções por Schistosoma.
A título ilustrativo, salientamos que a patente US
4.396.000 foi anulada com base em artigos publicados. Entre o conjunto de dados que correspondem aos antecedentes da presente invenção, temos a clonagem e sequenciamento de um componente derivado do SE, identificado como Sml4.
Um estudo publicado é o de Moser et al (Moser, D.,
Tendler, M., Griffiths, G. e Klinkert, M. Q. A 14 kDa | Schistosoma mansoni Polypeptide is Homologous to a gene family of Fatty Acid Binding Proteins Journal of Biological Chemistry vol. 266, N° 13, pp. 8447-8454, 1991). Este estudo descreve o sequenciamento do gene e a demonstração da atividade funcional do Sml4 como uma proteína que se liga a lácidos graxos.
Foi obtida a sequência nucleotídica completa que codifica a proteína do Schistosoma mansoni, chamada Sml4, e 25 que foi determinada a partir de clones de cDNA propagados no bacteriófago Xgt 11 em Escherichia coli. A proteína de 14,8 kDa apresenta similaridade significante, indicativa de homologia, com uma família de polipeptídeos relacionados que se ligam a ligantes hidrofóbicos. Membros deste grupo de
• · · « ·· ·· • ♦ · · · proteínas citosólicas foram originalmente identificados baseados na sua afinidade por ácidos graxos de cadeia longa. A proteína recombinante purificada exibia afinidade com ácidos graxos, em contraste com um mutante no qual faltam os
16 primeiros aminoácidos da porção N- terminal. A sequência completa de nucleotídeos pode ser descrita como uma região iniciadora começando com o tripleto ATG na altura dos nucleotídeos 123-125. A região codificadora compreende 399 nucleotídeos, finalizando na posição 521. A proteína de 133 resíduos de aminoácidos tem uma massa molecular de 14,847 kDa, calculada com base na sua sequência.
Perez, J.R. et al, (Perez, J>R., Medina, J.R.R., Blanco, M.A.G. e Hillyer. 1992. Fasciola hepatica: Molecular Cloning, Nucleotide Sequence and Expression of a
Gene Encoding a Polypeptide Homologous to a Schistosoma mansoni Fatty Acid-Binding Protein. Journal of Experimental | Parasitology, Vol. 74: n° 4, pp. 400-407) evidenciaram que um polipeptídeo que apresenta reatividade cruzada com antisoro contra proteína imunoprofilática Fhl2, compartilha significante homologia em termos da sequência de aminoácidos com a proteína de 14,8 kDa do Schistosoma mansoni, chamada Sml4 (Moser et al., 1991). Adicionalmente, foi evidenciado que Fhl2 é um imunógeno potente e uma molécula a ser um candidato para a imunoprofilaxia tanto da esquistossomose quanto da fasciolose (Hillyer, 1985; Hillyer et al., 1987), assim como um importante marcador de imunodiagnóstico na fasciolose humana (Hillyer et al., 1992). Além disso, os autores estavam tentando conseguir um antígeno recombinante
374 · ··♦ · ··· · · ·«····· · ·· ··< * ♦ * · ·*· contendo epitopos do Fhl5 e que estas porções de Fhl5 poderíam representar a mesma proteína descrita como Fhl2.
Estudos de proteção contra esquistossomose em camundongos e coelhos com a proteína Sml4 recombinante foram 5 realizados por Tendler et al. (1995, 1996). Para tanto, o cDNA da proteína Sml4 foi subclonado no vetor pGEMEX-1
(Promega). A construção obtida, pGEMEX-Sml4, expressa a proteína Sml4 como uma fusão com o produto do gene 10 do bacteriófago T7 (major T7 capside protein), resultando numa proteína quimérica de aproximadamente 45 KDa. Esta proteína de fusão, purificada em géis preparativos de SDS-PAGE, conferiu cerca de 50% de proteção contra a infecção por cercárias de S. mansoni em animais de experimentação, semelhante ao nível de proteção alcançado pelo extrato salino (SE) destes vermes, usado como controle positivo. Por outro lado esta mesma proteína recombinante conferiu 100% de proteção contra a infecção por metacercárias de Fasciola hepatica (Tendler et al., 1995, 1996), mostrando que a proteína Sml4 pode ser usada como vacina anti-helmíntica. A 20 esse respeito também deve aqui ser mencionada a patente US
5.730.984, de titularidade do depositante.
Entretanto, foi observado que durante a estocagem da proteína recombinante Sml4 ocorria a formação de um precipitado de difícil controle. Além disso, a obtenção das 25 proteínas recombinantes de Sml4, conforme o estado da técnica, por exemplo em pGEMEX, apresenta a desvantagem de ser demorada e resultar em um baixo rendimento para produção em larga escala.
Assim,
existe ainda uma necessidade para a obtenção de um material antigênico que possa ser obtido com alto rendimento, em escala piloto em condições de GMP, e que não perca a característica de estabilidade.
Sumário da Invenção
Um objetivo da presente invenção é obter um material
antigênico derivado de helmintos, mas factível de ser gerado numa forma recombinante, que possa ser usado para produzir uma proteína em escala piloto em condições GMPs.
Ainda um outro objetivo está relacionado às formas mutantes da proteína Sml4 que sejam mais estáveis.
Ainda um outro objetivo da presente invenção é a molécula Sml4 definida como um antígeno protetor contra infecções causadas por helmintos.
Ainda outro objetivo da invenção é uma vacina contra infecções causadas por Fasciola hepatica em gado bovino, | caprino, e ovino.
É também objetivo da presente invenção uma vacina contra infecções causadas por Schistosoma mansoni e todas as 20 outras espécies de Schistosoma, as quais são responsáveis por infecções e doenças em humanos e animais.
Um objeto adicional da presente invenção é o reagente de diagnóstico para esquistossomose e fasciolose.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 mostra a estrutura tridimensional do modelo molecular para a proteína Sml4.
A Figura 2A mostra a estratégia das subclonagens do cDNA da proteína Sml4 nos vetores de expressão pRSETA e pET3-His e obtenção do vetor de expressão pRSETA-6xHis-Sml4.
A Figura 2Β mostra a comparação das fusões resultantes nos plasmideos de expressão pRSETA-Sml4, pET3-His-Sml4 e pRSETA-6xHis-Sml4.
As Figuras 3A e 3B
A Figura 4 mostra a mostram a obtenção do vetor de e seu sítio múltiplo de clonagem estratégia de mutagênese para a obtenção da proteína Sml4-A20.
A Figura 5 mostra os primers usados no processo para obtenção da forma mutante Sml4-A20.
A Figura 6 mostra a análise eletroforética dos produtos de amplificação do processo da mutagênese, onde M.- IKbp DNA ladder; 1.- produto do PCR 1; 2.- produto do PCR 2; 3.amplifiçado do PCR 1 purificado; 4.- amplificado do PCR 2 15 purificado; 5.- produto do PCR 3; 6.- produto do PCR 4.
A Figura 7 mostra a sequência parcial do plasmídeo pAESml4-A20, mostrando a presença da alanina na posição 20 da proteína Sml4.
A Figura 8 mostra o espectro de Dicroísmo Circular das proteínas Sml4-M20, onde Sml4-M20: -Proteína Sml4-M20 com cauda de 6xHis e Sml4-M20-AHis.- Proteína Sml4-M20 sem cauda de 6xHis.
A Figura 9 mostra o espectro de CD das proteínas Sml4M20 e Sml4-T20 (com cauda de 6xHis).
A Figura 10 mostra a desnaturação das proteínas Sml4M20 e Sml4-T20 por uréia.
A Figura 11 mostra a análise eletroforética da proteína
Sml4-T20 armazenada por 3 meses a 4°C.
• ·
A Figura 12 mostra o esquema da estratégia usada para mutagênese da cisteina 62 da proteina Sml4.
A Figura 13 mostra a comparação dos seqüênciamentos parciais das formas mutantes de Sml4 mostrando os sítios das 5 mutagêneses (mostrados pela barra cheia).
A Figura 14 mostra a comparação das distintas formas da
proteina Sml4 em condições não-redutoras, onde M.- Marcador de massa molecular; 1.- Sml4-M20; 2.- Sml4-T20; 3.- Sml4A20; 4.- Sml4-M20S62; 5.- Sml4-M20V62. Todas as proteínas
Sml4 estão com a cauda de 6xHis. Para induzir a formação de dimeros as amostras foram aquecidas a 95°C por 5 minutos.
A Figura 15 mostra a termoestabilidade das proteínas Sml4-M20S62 e Sml4-M20V62.
A Figura 16 a estabilidade a 4°C ao longo do tempo das proteínas Sml4-M20C62 e Sml4-M20S62.
A Figura 17 mostra estabilidade a 28°C das isoformas e | mutantes da proteína Sml4.
Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas
Os objetivos da presente invenção são alcançados através da obtenção de um material antigênico que confere imunidade protetora contra infecções helmínticas de hospedeiros mamíferos.
De acordo com um aspecto da presente invenção foram construídas formas mutantes da proteína recombinante Sml4, as quais apresentam maior estabilidade térmica e maior estabilidade contra agentes químicos desnaturantes, permitindo sua produção em larga escala, onde tais proteínas mutantes conservam as propriedades funcionais e antigênicas da proteína rSml4. Deve ser salientado que o rSml4 se refere ··· · ··· · ··· ·
a qualquer forma recombinante da molécula Sml4, seja em forma de fusão com outra proteína ou peptídeo.
De acordo com a presente invenção, o antígeno é selecionado dentre as várias formas mutantes da proteína 5 derivada do Schistosoma mansoni, Sml4, a qual tem a capacidade de estimular a imunidade protetora em hospedeiros
mamíferos contra infecções helmintológicas, em particular
Schistosoma mansoni e Fasciola hepatica.
A proteína Sml4 que tem um peso molecular de 14,8 kDa e apresenta um significativo grau de identidade com as proteínas que pertencem à família de proteínas que se ligam a lipídeos, é caracterizada pela seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1):
| CO | 1------1 | cs | cs | β | β | Φ | |||||
| <—1 | 05 | 1------i | «—1 | Φ o | 1------1 | 1—1 | |||||
| < | > | 0 | 0 | Ui cr> | 0 | M | |||||
| CL | β | Cl | CL | β | ty> | CO LO | |||||
| co | xq | LO | 0 | m | t—1 | β | <—1 CM | ||||
| Η | CO | Eh | < | 0 | τ—1 | ||||||
| Φ | β | β | Φ | β | I—1 | β | |||||
| XS | CO | Φ | 0 o | Φ | 05 | 0 | |||||
| CL | < | 0 | CL Γ- | ω | > | Eh | |||||
| α | Ι>Ί | 4-1 | CS | β | Φ | LO | l------1 | ||||
| co | LO | s—| | φ | 1---------1 | CO | r-{ | O | cO | |||
| x—1 | 0 | S | 0 | M | <—1 | t> | |||||
| CO | Φ | D | cs | CO | <—1 | CL | |||||
| •Η | í—1 | 0 | O | r—{ | <Ü | CO | |||||
| rc | H | Eh | LO | 0 | 0 | > | |||||
| Cl | β | 4-> | >1 | β | β | 0 | |||||
| φ | <—1 | Φ | 1—1 | rH LO | 0 | i—1 | |||||
| ω | 0 | s | 0 | 0 CO | Eh | 0 | |||||
| cs | Cn | CO | Φ | 1—1 | β | 0 o | |||||
| 1------1 | 5h | o | 0 | 05 | 0 | <0 CM | |||||
| 0 | < | CO | 0 | CL | > | Eh | > 0 | ||||
| Cl | β | CL | CO | ,-H | β | β | |||||
| φ | 0 | CO | >1 LO | rO | CO | 0 | |||||
| ω | Eh | < | 0 x> | > | Eh | ||||||
| cs | Φ | > | Φ | β | CO | o | rH | ||||
| φ | o | f—! | •—l | 0 | Φ | 0 | o | CO | |||
| t-q | t—1 | c | 0 | CL | ω | 0 | rH | > | |||
| <0 | β | CL | Cl | CO | O | β | |||||
| £L | CO | LO | 0 | 5h | β | 0 | |||||
| ι-q | Eh | < | Eh | 0 | CL | Eh | |||||
| β | β | 4J | W | 1------1 | CL | β | |||||
| CL | Φ | Φ | >1 | co o | (0 | xq | |||||
| H | Ui | S | O | > CO | < | Eh | |||||
| CO | <—1 | Cl | Cl | β | .—1 | C0 LO | β | ||||
| <0 | LO | xq | Φ | CO | co | 0 0 | φ | ||||
| i-q | > | CO | Eh | ω | > | >21 <—i | Ui | ||||
| 5h | 5h | Φ | cs | CD | β | j_> | β | ||||
| i—1 | <—1 | xq | Φ o | β | 1--------1 | Φ | φ | ||||
| 0 | 0 | CL | 0 | c | 0 | S | 0 | ||||
| cs | cs | Cl | β | >1 | β | β | Cd . | ||||
| Φ | Φ | xq | CO | 0 | 0 | lO | xq | β | |||
| 0 | LO | 0 | EH | < | 0 | Eh | ΟΊ | Eh | < | ||
| Φ | CO | I—1 | CO | CL | β | CL | co ο | ||||
| 0 | >1 | <0 | o | 5h | CO | 1--------1 | CO | >1 co | |||
| CL | t-q | > | 0 | 0 | 0 0 | ||||||
| Cl | β | SH | ω | β | β | 0 | β | ||||
| Φ | Φ | 0 | 0 | Φ LO | 0 | l—1 | 01 | ||||
| CQ | CO | CL | CO t~~ | 0 | 0 | Eh | |||||
| Cl | 4-> | o | β | β | β | CL O | β | ||||
| Φ | Φ | o | β | 0 | 0 | Φ | co <—i | (0 | |||
| ω | S | CO | 0 | Eh | EH | i-q | ,—l | < | |||
| 4-J | 1---------1 | SH | β | (0 | CO | —1 | CD | ||||
| Φ | 05 | 0 | Φ LO | ω | β | ||||||
| s | x—1 | > | Eh | Ui X) | 0 | 0 | > |
A estrutura tridimensional da proteína Sml4 foi prevista através de modelagem molecular por homologia computadorizada, a qual permitiu a identificação dos epitopos protetores em potencial e, possibilitou o uso do 5 rSml4 da presente invenção como antígeno de vacinação (Tendler et al., 1996).
Modelos moleculares construídos tanto para a Sml4 quanto para a Fhl5 (esta última sendo uma molécula homóloga à Sml4 oriunda da Fasciola hepática, com a qual compartilha 10 44% de identidade seqüencial) mostram que essas duas moléculas adotam configurações tridimensionais semelhantes às moléculas de outros membros da família de proteínas que se ligam a lipídeos (Fatty Acid Binding Proteins - FABP). O modelo molecular da Sml4 consiste de 10 fitas β 15 antiparalelas formando a estrutura de um barril do tipo sobe-desce (ou β-clam) com curtas conexões inter-fitas | que, em geral, formam loops β, como mostrado na Figura 1.
Os modelos também permitiram previsões sobre (1) a importância de determinados resíduos em conferir a 20 propriedade de imunogenicidade cruzada contra S. mansoni e F. hepatica, (como descrito no pedido de patente US 10/113.946 e na patente US 5.730.984), (2) os resíduos envolvidos na interação com ácidos graxos e (3) resíduos importantes para estabilidade estrutural e agregação 25 covalente. Os resíduos envolvidos na formação dos epitopos descontínuos responsáveis pela reação cruzada são previstos estarem localizados principalmente na região C-terminal da molécula (aproximadamente a partir do resíduo 85).
305
As proteínas recombinantes invenção podem ser obtidas a partir mutantes da presente de vetores que permitam a expressão dos genes codificantes da Sml4, devidamente modificados, mas que mantenham a característica antigênica da molécula (epitopos descontínuos acessíveis principalmente na porção C-terminal da Sml4).
Será demonstrado aqui a capacidade que as formas recombinantes mutantes de conferir uma alta proteção contra infecções causadas por Fasciola hepatica e Schistosoiaa mansoni, assim como todas as outras espécies de Schistosoma e Echinococcus e potencialmente outros helmintos supostamente patogênicos em relação a humanos e animais.
Um antígeno vacinai deve ser um componente homogêneo e conservado no parasita, não apresentando grandes diferenças na sua estrutura e sequência primária de aminoácidos, para o organismo que o apresenta) seja também a mais homogênea e eficiente no mamífero vacinado. Por isto um levantamento do polimorfismo do gene correspondente a qualquer antígeno vacinai em potencial é um fator relevante ao seu desenvolvimentio. O seqüenciamento realizado nos clones originais (pGEMEX-Sml4), verificou uma discrepância com relação à sequência descrita por Moser et al. (1991), no que diz respeito ao aminoácido presente na posição 20. Foi constatado que essa discrepância de sequência era devida à mutação existente na sequência genômica da proteína Sml4 decorrente do polimorfismo natural da molécula do Sml4.
• ·
As análises de seqüências mostraram duas isoformas principais para a proteína Sml4: Sml4-M20, com sequência idêntica a proteína Sml4 previamente reportada para a linhagem de Puerto Rico de S. mansoni (Moser et al., 1991), e Sml4-T20, onde o códon da Met20 (ATG) mudou para o códon de Thr (ACG) (polimorfismo M20T).
Obtenção da forma mutante Sml4-A20
Para permitir um controle nos experimentos de comparação de estrutura e função das isoformas Sml4-M20 e
Sml4-T20, foi realizada a mutagênese sítio dirigida do códon
ACG da T20 no vetor pRSETA-6xHis-Sml4 para GCG correspondente ao aminoácido alanina. Desta forma, obteve-se a proteína Sml4-A20, semelhante aos mutantes usados nos trabalhos de Richieri et al. (1997, 1998) para as proteínas
A-FABP e I-FABP (proteínas de ligação de ácido graxo da adipócito e intestino, respectivamente).
A estratégia da mutagênese por PCR para a obtenção da
Sml4-A20 está detalhada na
Figura 4. Para a escolha das seqüências dos iniciadores mutagênicos F
A20 e R
A20, mostrados na Figura 5 junto com a sequência parcial do cDNA da proteína Sml4, tivemos o cuidado para que na extremidade
5', o nucleotídeo vizinho fosse uma timina (mostrado em negrito), uma vez existe uma tendência da Taq DNA polimerase de adicionar adenina nas extremidades
3' dos amplificados.
Desta forma, a adenina adicionada pela
Taq DNA polimerase no amplificado complementa-se com a timina, no momento em que são misturados os produtos de amplificação do PCR 1 e 2. O uso como template do pRSETA-Sml4 e iniciador F pRSETA, facilitaram a mutagênese, pelo tamanho do amplificado do PCR ··· · ··· · • · · · · · · • · · · · · · ··· · ·· ·· • · · · · • · ·· ·· (ver Figura 6) . Caso fosse usado o pRSETA-6xHis-Sml4 como template, o amplificado do PCR1 seria muito pequeno e não facilitaria o seu processo de purificação. Numa última etapa (PCR 4) foram usados os iniciadores F Sml4 e R Sml4. Assim, todas as proteínas que serão analisadas comparativamente terão exatamente a mesma fusão N-terminal, de forma que as
comparações dependerão apenas dos aminoácidos relacionados à proteína Sml4. 0 sucesso da mutagênese foi confirmado por análise de restrição e por seqüênciamento, como está mostrado na Figura 7.
Análise da estrutura e estabilidade dos mutantes da proteína
Sml4
Para o determinação da estrutura e estabilidade das proteínas recombinantes, foram obtidos espectros de CD 15 (dicroísmo circular) a 20°C usando 10 μΜ de proteína em 10 mM de tampão Na-fosfato, pH 7,4. Inicialmente foram comparados os espectros da proteína Sml4-M20 com e sem cauda de 6xHis em tampão fosfato (Figura 8). Nesta análise, é mostrado que não há diferenças substanciais no espectro das 20 duas formas, que geram espectros típicos de proteínas com conformação de estrutura-β, característica das FABP. Estes resultados são consistentes com a modelagem da estrutura da proteína Sml4. Como a cauda de 6xHis não interfere significativamente na estrutura da proteína Sml4, os 25 experimentos a seguir, foram feitos com as proteínas com a cauda de 6xHis, que são obtidos em maior quantidade e maior grau de pureza do que as proteínas sem cauda de 6xHis.
Para determinar a termoestabilidade das distintas formas de Sml4, primeiro foram analisados espectros de CD
das amostras a distintas temperaturas (dados não mostrados).
Foi observado que a proteína perde gradualmente a estruturaβ à medida que a temperatura aumenta, até chegar a um espectro onde observamos o desaparecimento da estrutura-β 5 acompanhado por um aumento de estrutura randômica a 80°C.
Para poder caracterizar a transição do estado nativo para o
estado desnaturado, medimos a elipticidade (Θ) a 216 nm durante a mudança de temperatura de 15 a 8 0°C, como mostrase na Figura 9. Estes experimentos permitiram determinar a temperatura de transição do estado nativo a desnaturado (melting temperature, Tm) das proteínas. Foram também realizados espectros no início e final das mudanças de temperatura e também gerado um espectro após esfriamento da amostra a
15°C após aquecimento a 80°C, para observar reversibilidade da desnaturação das proteínas (Figura 9
Tabela I).
Tabela I: Comparação dos valores das proteínas Sml4-M20, Sml4-T20 de termoestabilidade e Sml4-A20.
| Proteína | [Θ] zero, nm (*) | Δ [Θ] zero, nm | % de renaturação | Tm em °C (***) | |
| 15°C | 15°CR | ||||
| M20C62 | 204,7 | 202,4 | 2,3 | 82,5 | 55,2 |
| T20C62 | 204,1 | 199,0 | 4,2 | 59,5 | 44,6 |
| A20C62 | 204,6 | 199,0 | 5,6 | 57,2 | 45,8 |
A troca de temperatura foi realizada a 1°C por minuto tanto para o aquecimento como para o esfriamento da amostra.
······ ····· • · · · ··· · · (*) O deslocamento do passo do espectro por zero de [Θ] para comprimentos de onda menores é sinal de perda de estrutura-β e aparecimento de estrutura randômica. 15°C, espectro inicial e 15°C R espectro coletado após o retorno das amostras a 15°C (**) 0 percentual de renaturação foi deteminado arbitrariamente, comparando o comprimento de onda do passo por zero de [Θ] dos espectros CD com o valor de 191,5 nm (passo por zero de [Θ] do espectro a 80°C, estrutura randômica) dos espectros a 15°C antes (100%) e depois do aquecimento a 80°C (Figura 9).
(***) 0 Tm foi determinado em experiências, como o ponto de inflexão na curva de desnaturação, usando equação de Boltzman do programa Microcal Origin™.
Os resultados obtidos no estudo da estabilidade das proteínas estão resumidos na Tabela I. Pela comparação dos Tm pode-se concluir que as proteínas Sml4-T20 e Sml4-A20 são menos termoestáveis (Tm 44,6 e 45,8°C, respectivamente) do que a proteína Sml4-M20 (Tm 55,2°C). Portanto, é importante notar que uma única troca de aminoácido (M20T) resulta numa diferença de Tm de cerca de 10°C no caso da proteína Sml4 com cauda de 6xHis. Isto representa um importante ganho em termoestabilidade no caso da Sml4-M20. Por outro lado, todas estas proteínas não conseguem renaturar a valor de 100% após o aquecimento a 80°C, sendo as proteínas mais afetadas pelo aquecimento as formas Sml4-A20 e Sml4-T20 (57,2 e 59,5% de renaturação, respectivamente), seguidos pela proteína Sml4M20 (82,5% de renaturação).
* Λ
Α diferença de estabilidade térmica anteriormente
descrita, foi corroborada usando uréia como agente desnaturante e medindo o deslocamento para comprimentos de onda maiores (red-shift) do máximo de fluorescência 5 inerente do triptofano para caracterizar a desnaturação.
Para tal as amostras foram diluídas em distintas
concentrações de uréia (0-7M) para uma concentração final de
2μΜ, exitadas a 285nm a os espectros registrados na faixa de
300 a 400nm.
Os dados obtidos foram submetidos a regressão não linear pelo modelo de Boltzman do programma Microcal
Origin™. Na Figura 10 estão mostradas as curvas obtidas por esta análise. Os pontos de inflexão nas curvas ocorrem nas concentrações de 1,85 e 3,2 M de uréia para as proteínas 15 Sml4-T20 e Sml4-M20, respectivamente, o que confirma a maior estabilidade da forma Sml4-M20. Com estes dados podemos
concluir que a troca M20T desestabiliza consideravelmente a proteína Sml4 frente a desnaturação química com uréia.
O conjunto de dados apresentados acima mostra uma maior estabilidade estrutural da isoforma Sml4-M20 comparado com Sml4-T20 ou o mutante Sml4-A20.
A metionina é mais hidrofóbica e sua cadeia lateral é mais longa do que a treonina ou a alanina, o que pode favorecer a estabilidade termodinâmica da proteína tanto por 25 entropia (o efeito hidrofóbico) como por entalpia (interações com outros resíduos da proteína através de forças de Van der Waals, etc.), quando comparado com a treonina ou a alanina nesta posição. 0 modelo da estrutura tridimensional da Sml4 sugere um empacotamento menos • ···♦··♦*· · *·· · · · · ··· ♦ eficiente para alanina ou treonina, que no caso do último podería levar a um grupo polar (a hidroxila da cadeia laterial) insatisfeito em termos de ligações de hidrogênio.
Aumento da Estabilidade da Proteína Sml4
Os preparados vacinais devem ser estáveis ao armazenamento por tempo suficientemente prolongado para chegar seu destino com atividade protetora.
efetivamente um dos aspectos abordados na presente invenção.
Observações feitas por mais de 3 meses nos lotes proteína. Também, o nível de proteção contra esquistossomose diminui com o tempo de armazenamento da proteína, e os soros de animais imunizados com a proteína recentemente preparada não reconhecem a proteína armazenada (dados não mostrados).
Com a finalidade de aumentar a estabilidade da proteína
Sml4, foi alguns nos preparados proteicos.
Os preparados de Sml4 que mostraram precipitação foram submetidos a análise eletroforética. Esta análise mostrou a presença de dímeros de Sml4, originada pela formação de pontes dissulfeto intermoleculares, como é mostrado na
Figura 11. Esta afirmação se baseia na observação de uma única banda no gel (correspondente a monômeros de Sml4, Mr 25 -14,9 kDa) na presença do agente redutor β-mercaptoetanol e duas bandas na sua ausência. Neste último caso a segunda banda corresponde a uma proteína que possui o dobro da massa molecular da Sml4, compatível com a formação de dímeros através de uma ponte disulfeto. A Figura 11 mostra que quase a metade da proteína encontra-se na forma de dímeros.
A seqüência da proteína Sml4 apresenta apenas um resíduo de cisteína na posição 62, que forma parte da fita βΏ. Na estrutura da Sml4 a fita βϋ não forma pontes de hidrogênio com a fita βΕ adjacente. O espaço entre estas
fitas-β é preenchido pelas cadeias laterais dos seus aminoácidos, com participação da Cys62.
grupo -SH da cisteína 62 não é accessível ao solvente. Consequentemente a formação de dímeros intermoleculares deve acontecer por estrutura-β das proteínas (desnaturação completa ou parcial), estado que pode ser estabilizado pela formação da ponte dissulfeto entre proteínas pelo menos parcialmente desenoveladas. 0 estabelecimento desta ponte possivelmente determina a irreversibilidade da desnaturação da proteína.
Foi observado que o processo depender do tempo e temperatura de armazenamento, assim como da concentração dos preparados proteicos, sendo este fenômeno maior no caso da forma Sml420
T20.
Em geral, um dos problemas que atinge a estabilidade das proteínas recombinantes expressas em E. coli, é a formação de pontes dissulfeto intermoleculares. Por exemplo, o interferon de fibroblasto humano é purificado em grande quantidade de E. coli, porém tem pouca atividade e estabilidade comparado com a proteína selvagem. Mark et al. (1984) trocaram por mutagênese sítio-específica uma Cys, não envolvida na formação de pontes dissulfeto intramoleculares, por serina, resultando numa proteína com maior atividade e • ·
elevada estabilidade ao longo do tempo.
semelhante foi observado com o ··· • · • · • · • · • · ··· • · ··· «· • · • · • · ·· • · • ·
Um fenômeno
FGF-1 (fibroblast growth três cisternas presentes na seqüência desta proteína (140 resultou num incremento de sua vida média fisiológica.
Estudos termodinâmicos não revelaram maior termoestabilidade das proteínas mutantes, portanto a maior vida média destas proteínas foi relacionada com a eliminação do grupo sulfidrila reativo (formação de dímeros, oxidação para S10
A presença do aminoácido cisteína não é muito comum na família das FABP. Assim, a estrutura de algumas FABP está estabilizada por pontes dissulfeto intramoleculares, como é o caso das L-FABP de peixes como Lepídosiren paradoxa,
Lateolabrax japonicus. A L-FABP de rato possui uma cisteína na posição 69 cuja cadeia lateral está dirigida para o
interior da molécula, como indica sua baixa reatividade com
DTNB [ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico)]. A I-FABP de rato, uma das proteínas mais estudadas da família, não contém resíduos de cisteína. Num estudo (Jiang e Frieden,
1993), foram introduzidas trocas de aminoácidos da cadeia polipeptídica da I-FABP por cisteína, com o intuito de usar a sua reatividade com reagentes como DTNB para estudar trocas conformacionais e funcionais desta proteína. Uma das 25 trocas estudadas foi a V60C (que corresponde exatamente à posição 62 na proteína Sml4), que resultou numa proteína menos estável do que a proteína selvagem. Por outro lado, a baixa reatividade desta proteína mutante com o reagente DNTB • · • · :λ revela que o resíduo nesta posição está dirigido para o interior da proteína I-FABP no estado enovelado.
Sendo que a cisteína não é importante na atividade de
ligação de ácidos graxos e tendo como objetivo abolir a formação de pontes dissulfeto intermoleculares e outros efeitos do grupo sulfidrila, foi efetuado a troca da cisteína 62 na proteína Sml4 por serina (análogo estrutural) e por valina (encontrada nesta posição na FABP de S. japonicum, que possui alta identidade com a proteína Sml4 e também na I-FABP de rato). Para isto, foi realizada mutagênese sítio-dirigida por PCR, conforme a estratégia mostrada na Figura 12.
Os iniciadores usados para as mutagêneses, além do iniciador F Sml4 já descrito foram:
iniciadorR S62: 5’ TCGAATTCCTCGCCGAACTTGAACGTAGAAGAAAG 3’.
iniciadorR V62: 5’ TCGAATTCCTCGCCGAACTTGAACGTAAÇAGAAAG 3’.
Em negrito está o sítio de reconhecimento da enzima
EcoRI; sublinhada está a posição do códon do aminoácido na posição 62, em itálico negritado ressalta-se os nucleotídeos trocados para as mutações de Cys62 (códon TGT) por Ser (TCT) ou Vai (GTT).
As construções obtidas foram analisadas por restrição fazendo digestões com as endonucleases EcoRV (proveniente do inserto) e HindIII, (contida no vetor). A liberação do inserto de aproximadamente 600 bp, indicou o sucesso das construções. As mutagêneses foram confirmadas por sequenciamento, como se mostra na Figura 13. Os plasmídeos
resultantes foram denominados pAE-Sml4-M20S62 (troca C62S) e pAE-Sml4-M20V62 (troca C62V).
As proteínas Sml4-M20S62 e Sml4-M20V62 foram expressas e purificadas a partir de culturas da cepa E coli BL21 (DE3)
transformada com os plasmídeos pAE-Sml4-M20S62 ou pAE-Sml4M20V62, usando os mesmos procedimentos descritos anteriormente para as proteínas com cauda de 6xHis. Os rendimentos em termos de quantidade e pureza foram os mesmos para todas as formas de Sml4. Na Figura 14 está mostrado a análise eletroforética das proteínas em condições não redutoras.
Nesta análise podemos observar a ausência de dímeros nas proteínas onde a cisteina 62 foi substituída por serina ou valina, indicando o sucesso da mutagênese e que o objetivo de erradicar a formação de dímeros foi atingido.
Em seguida, foi estudado termo-estabilidade da Sml4M20S62 e
Sml4M20V62 usando metodologia anteriormente descrita para as isoformas
Sml4-M20 e Sml4-T20, por dicroísmo circular. Os espectros CD dos mutantes Sml4-M20S62 e Sml4-M20V62 revelaram que eles mantém a estrutura-β semelhante a proteína Sml4 nativa. Na Figura 15 mostramos as curvas de desnaturação por temperatura das proteínas mutantes Sml4-M20S62 e Sml4-M20V62.
Com estes dados foi calculado o Tm dos mutantes Sml425 M20S62 e Sml4-M20V62 e o percentual de renaturação, que estão apresentados na Tabela II, onde estão resumidos os resultados de termo-estabilidade obtidos para todas as formas da proteína Sml4 discutidas na presente invenção.
• · · ·
A desnaturação foi avaliada pela elipticidade a 216 nm durante a titulação com a temperatura. No início (15°C) e final (80°C) foram obtidos espectros CD (em azul e vermelho, respectivamente). Um último espectro foi coletado após o retorno das amostras a 15°C (em verde). para caracterizar a capacidade de renaturação da proteína (comparar com a Figura
10) .
Tabela II: Comparação dos valores de termoestabilidade das distintas formas da proteína Sml4
| Proteína | [Θ] zero, nm (*) | Δ [Θ] zero, nm | % de renaturação (*) | Tm em °C (*) | |
| 15°C | 15°CR | ||||
| M20C62 | 204,7 | 202,4 | 2,3 | 82,5 | 55,2 |
| T20C62 | 204,1 | 199,0 | 4,2 | 59,5 | 44,6 |
| A20C62 | 204,6 | 199,0 | 5,6 | 57,2 | 45,8 |
| M20S62 | 204,6 | 204,4 | 0,2 | 98,5 | 52,5 |
| M20V62 | 204,6 | 203,8 | 0,8 | 93,9 | 55,8 |
(*) Dados calculados conforme descrito na Tabela I.
Por estes dados concluímos que a troca da cisteína 62 na proteína Sml4-M20 por serina (Sml4-M20S62) não resulta em uma molécula com maior termoestabilidade, conforme pode-se observar pela pequena diferença de Tm entres estas formas.
No caso da proteína Sml4, a forma mutante Sml4-M20S62 é ligeiramente menos termoestável do que a proteína selvagem 15 (Sml4-M20), mas a renaturação desta forma mutante foi maior do que no caso da Sml4-M20, como se pode observar comparando os espectros CD antes e depois do aquecimento (Figura 15, Tabela II), fato que pode estar associado com a eliminação dos efeitos da química do grupo sulfidrila (já mencionado ··· · ··· · · · · ♦ ·· • · · · ··· ···· • · · · · ·· · ··· • · ··· ♦ · · · ··· ·
anteriormente) durante o aquecimento das proteínas, o que tornaria irreversível o processo de desnaturação, conforme foi observado para a proteína FGF-1.
A troca da cisteína 62 por valina (Sml4-M20V62) resultou numa proteína mais termoestável do que a proteína
Sml4-M20. Os resultados mostrados aqui são semelhantes
àqueles obtidos da comparação do mutante V60C com a proteína selvagem da I-FABP (Jiang e Frieden, 1993), onde a inserção do grupo de cisteína resultou numa proteína menos estável.
Estabilidade das formas da proteína Sml4
O objetivo agora foi obter proteínas mais estáveis ao longo do tempo. Por isto, estudamos por dicroísmo circular a estabilidade das proteínas Sml4-M20, Sml4-T20 e Sml4-M20S62 armazenadas a 4°C por dois meses. A concentração aproximada 15 das proteínas foi de 70 μΜ. Os resultados dos experimentos estão resumidos na Figura 16 onde mostramos que a proteína
Sml4-M20S62, perde a intensidade do seu espectro ao longo do tempo, porém mantendo a estrutura-β, diferentemente das proteínas Sml4-M20 (Figura 15) e Sml4-T20 (dados não mostrados) que perderam estrutura-β durante a armazenagem.
Em seguida, para acelerar o processo de perda de estrutura-β, as proteínas Sml4-M20, Sml4-T20, Sml4-A20,
Sml4-M20S62 e Sml4-M20V62 foram incubadas a 28°C por 80 horas. A concentração das proteínas foi de 10 μΜ, para a 25 coleta do espectro CD. Espectros CD foram coletados em intervalos de tempo de 8 a 12 horas. Observou-se que o perfil de estrutura-β é mantido, só com menor intensidade das bandas. Baseado nesses espectros foi caracterizado a estrutura-β independentemente da intensidade do espectro CD.
• · · · • · · ·
A relação de elipticidade molar 216 nm/ 196 nm, foi usada para este fim. A está mostrada na
Figura 17.
desvio da relação elipticidade molar 216 nm/196 nm do valor -2 alteração para valores positivos indica formação de estrutura randômica. A diminuição da intensidade nas curvas das formas Sml4-T20 e Sml4-A20 após agregação das proteínas (Figura 16). Sob estas condições, as proteínas Sml4-T20 e
Sml4-A20 perderam estrutura-β após 37 horas enquanto que a proteína Sml4-M20,
Sml4-M20S62 e Sml4M20V62 mantiveram estrutura-β durante o tempo do experimento. Estes dados concordam com a observação do fato de que a proteína Sml4-M20 é mais estável do que a Sml4-T20 durante o armazenamento.
Cabe destacar que, pelo Tm determinado para as a temperatura de 28°C afeta com maior intensidade as formas
Sml4-T20 e Sml4-A20. Assim, para poder diferenciar a estabilidade ao longo do tempo das formas Sml4-M20, Sml420
M20S62 e Sml4-M20V62, foi usada uma maior temperatura e uma maior concentração de proteínas.
Tendo em conta os dados de armazenagem a 4°C, esperamos que em condições mais restritas a proteína Sml4-M20 também perca as formas Sml4-M20S62 e Sml4-M20V62 devem ser mais estáveis.
Assim, as observações feitas durante análise dos dados de ressonância magnética nuclear, com as proteínas
Sml4-M20,
Sml4-M20S62 e Sml4-M20V62, expressas e purificadas sem cauda de 6xHis, mostrou que a forma Sml4-M20V62 manteve-se mais estável altas
(aproximadamente lmM) e durante um mês a uma temperatura de
20°C.
A estabilidade ao longo do tempo tem uma relação direta com a capacidade de renaturação das proteínas recombinantes após o aquecimento a 80°C. Desta forma a eliminação do grupo sulfidrila da proteína Sml4 também resultou em proteínas com maior estabilidade ao longo do tempo.
É possível que durante a armazenagem a 4 proteínas percam sua conformação terciária as fitas βϋ e βΕ fiquem separadas, de forma que o grupo sulfidrila da cisteína possa ser oxidado ou interagir com grupos semelhantes de outras proteínas no mesmo estado, estabilizando-se a perda de estrutura-β. Por outro lado, a estabilidade ao longo do tempo das proteínas não depende da termoestabilidade das 15 proteínas. Estes dados podem ser de importância para planejar mutantes com maior tempo de vida médio em outras ) proteínas.
Desta forma, o objetivo de obter uma variante de Sml4 mais estável foi atingido. Neste sentido, a proteína Sml420 M20V62 (o mutante com maior estabilidade) apresenta-se como um candidato adicional como modelo vacinai contra a esquistossomose e fasciolose.
A seguir serão apresentados os experimentos de proteção contra infecções causadas por helmintos, usando as proteínas mutantes de Sml4 da presente invenção.
Materiais e Métodos
O processo para obtenção, caracterização e purificação do Sml4 recombinante é aquele conforme descrito em Mem.
• ··· · ··· · ·*· ·······( • · · · ··· · • ····*··· ··· · · · • ···· • · ·· • ···· • ·· • ·· ····
Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 96, Suppl.: 131135, 2001, e mostrado em detalhes nas Figuras 2Ά e 2B.
Um outro processo para obtenção, caracterização e purificação da proteina Sml4 recombinante é aquele conforme 5 mostrado em detalhes nas Figuras 3A e 3B.
A avaliação da atividade protetora das proteínas
recombinantes foi realizada, conforme os Exemplos a seguir.
De acordo com a presente invenção, a quantidade das proteínas utilizadas nos animais, para conferir proteção contra helmintos, pode variar amplamente, e está intimamente relacionada ao peso e espécie do animal receptor e ao helminto contra o qual se deseja inferir a proteção.
Preferivelmente a dita quantidade está na faixa de 1 μς a
1000 μς.
Exemplo 1:
O Exemplo 1 apresenta uma tabela comparativa entre resultados de proteção obtidos em camundongos, com as diversas formas mutantes construídas e obtidas a partir da rSml4.
O protocolo de vacinação foi realizado conforme abaixo.
| Grupo | 0 dia | 7 dias | 28 dias | 88 dias | 133 dias |
| Vacinado | V | V | V | C | P |
| Controle | C | P |
Onde: V significa vacinação; C significa desafio (do inglês challenge); e, P significa perfusão (para recuperação de vermes adultos e avaliação da proteção).
Tabela Comparativa
| Grupos experimentais | N | Vermes adultos | X+SEM | Proteção | |
| Min | Max | ||||
| Sml4TC + Ribi (1 exp.)* | 12 | 12 | 28 | 18,6+0,45 | 24,10% |
| Sml4TC+Alúmen (4 exp) | 47 | 2 | 26 | 13,8+0,14 | 43,70% |
| Sml4TC (3 exp) | 34 | 6 | 36 | 18,3+0,19 | 25,30?/« |
| Sml4AC+Alúmen (1 exp) | 14 | 6 | 34 | 19,4+0,6 | 20,80% |
| Sm 14 AC (1 exp) | 13 | 10 | 36 | 20,1+0,6 | 17,90% |
| Sml4MS+ Alúmen (2 exp) | 22 | 2 | 24 | 11,2+0,3 | 54,30% |
| Sml4MS (1 exp) | 15 | 0 | 20 | 10,6+0,4 | 56,70% |
| Sm 14MV+Alúmen (2 exp) | 28 | 2 | 22 | 11,8+0,5 | 51,80% |
| Sml4MV (1 exp) | 12 | 6 | 24 | 15,2+0,5 | 38,00% |
| Sm 14TI+Alúmen (2 exp) | 28 | 4 | 24 | 10,6+0,2 | 56,70% |
| Sml4TI (1 exp) | 12 | 4 | 22 | 14,0+0,4 | 43,00% |
| Sm 14MC+Alúmen (2 exp) | 25 | 0 | 20 | 8,16+0,2 | 66,70% |
| Sml4MC (1 exp) | 13 | 6 | 20 | 12,9+0,3 | 47,40% |
| Adjuvante (9 exp) | 120 | 6 | 44 | 22,5+0,06 | 0% |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) (9 exp) | 118 | 8 | 46 | 24,5+0,06 |
Onde: N significa o número de animais por grupo experimental e X + SEM significa a média padrão mais ou menos o erro padrão. A proteção média para cada grupo de animais (animais • · · imunizados/desafiados e respectivos controles) é calculada como a seguir.
100 onde C = parasitas recuperados dos controles; V = parasitas recuperados dos animais vacinados e P = proteção.
Os adjuvantes usados conforme a presente invenção podem ser selecionados dentre
Alúmen, adjuvante de Freund, MPL+TDM (monophosphoryl lipid dicorynomycolate),
MPL+TDM+CWS OU
Quil
A, entretanto, quaisquer outros adjuvantes similares podem ser empregados para a formulação.
A Tabela Comparativa anterior mostra, que as proteínas mutantes planejadas (Sml4-M20S62 e niveis de proteção comparáveis com a
Sml4-M20V62) apresentam proteina original Sml4M20 (Sml4-M20C62).
A vantagem dos mutantes para uso como base de uma vacina contra helmintos portanto não reside em providenciar niveis de proteção mais elevadas mas em manter a integridade estrutural do principio ativo da vacina (Sml4), inclusive por mais tempo.
Exemplo 2:
O Exemplo 2 apresenta os resultados de proteção obtidos em camundongos, com as diversas formas mutantes construídas e obtidas a partir da rSml4. A metodologia empregada para o
Exemplo 2 foi a mesma empregada no Exemplo 1.
Foram utilizadas 100 metacercárias/camundongo para o desafio. A vacinação foi realizada com 3 doses de
10pg da proteína conforme o mesmo protocolo descrito no Exemplo 1.
• ·
Resultados
| Sml4TC | Sml4MS | Sml4MV | Sml4TI | Sml4MC | Adjuv. | PBS |
| 2 | 2 | 4 | 6 | 0 | 10 | 10 |
| 2 | 6 | 4 | 6 | 0 | 12 | 10 |
| 4 | 6 | 6 | 6 | 0 | 12 | 14 |
| 4 | 6 | 6 | 8 | 2 | 12 | 14 |
| 6 | 10 | 6 | 8 | 4 | 16 | 14 |
| 6 | 12 | 8 | 8 | 4 | 16 | 16 |
| 6 | 12 | 8 | 10 | 4 | 16 | 16 |
| 8 | 12 | 8 | 10 | 4 | 16 | 18 |
| 8 | 14 | 12 | 10 | 6 | 18 | 18 |
| 12 | 14 | 14 | 10 | 6 | 20 | 20 |
| 14 | 9,4 | 14 | 12 | 8 | 22 | 22 |
| 14 | 44,70% | 14 | 12 | 8 | 22 | 22 |
| 16 | 16 | 16 | 10 | 26 | 22 | |
| 18 | 18 | 9,384615 | 10 | 28 | 22 | |
| 8,571429 | 9,857143 | 44.80% | 10 | 17,57143 | 17 | |
| 49.60% | 42.40% | 5,066667 | 0% | |||
| 70,20% |
Os números inteiro (0 a 28) representam o número de vermes recuperados por camundongo por grupo vacinado. O resultado médio (média de vermes/camundongo) encontrado 5 (i.e., Sml4TC de 8,571429) é obtido através da soma dos números de vermes recuperados dividido por 14 (n=14).
Exemplo 3
O Exemplo 3 mostra os dados do experimento de vacinação de camundongos com mutantes da proteína Sml4 contra F.
• ···· · · ····· ·
Hepatica. 0 desafio foi feito com 3 metacercárias. Os resultados numéricos são apresentados da seguinte maneira.
N° animais com lesão hepática / N° animais vivos no final do experimento.
| Exp. | Proteína | No animais com lesão hepática | No animais vivos no final |
| 1 | TI (T20C62) | 2 | 18 |
| 2 | A20C62 | 4 | 18 |
| 3 | T20C62 | 4 | 17 |
| 4 | M20C62 | 5 | 20 |
| 5 | M20S62 | 4 | 15 |
| 6 | M20V62 | 7 | 16 |
| Controle | 17 | 17 |
0 grupo de controle não recebeu nenhum antígeno e só recebeu a infecção simultaneamente aos grupos vacinados.
A partir dos resultados acima, observa-se que as formas mutantes dos Experimentos 5 e 6, que são mais estáveis do que a forma selvagem (Cys62), conferiram proteção nos 10 animais vacinados. Deve ser salientado que embora as formas mutantes não tenham alcançado os altos índices de proteção da forma selvagem (Cys62), essas novas formas mutantes podem ser perfeitamente obtidas em larga escala, já que foi conseguido uma renaturação de aproximadamente 100%. Além 15 disso, o resultado final (%) não pode ser considerado • · · · · · isoladamente, mas também é importante observar o impacto da vacinação na redução da patologia.
Como j á mencionado anteriormente, o objetivo principal da presente invenção era o desenvolvimento de novas formas mutantes da proteína Sml4 para a produção de volumes maiores de produção. Nesse sentido, foram utilizados sistemas de
Sml4 com uma fusão terminal e sem fusão.
A pureza e rendimento da proteína Sml4 nestes sistemas foram superiores àquele obtido anteriormente com o plasmideo pGEMEX-Sml4, permitindo a produção desta proteína em maior escala.
As proteínas recombinantes aqui obtidas foram capazes de conferir proteção contra a infecção com cercárias de
S.
mansoni.
Quanto ao polimorfismo M20T na fisiologia dos vermes
S.
associação estrutural funcional da proteína Sml4 com o grupo de proteínas formado pelas FABP de adipócito, cérebro, coração, epitélio e as
Foi encontrado que a única cisteína na posição 62 da proteína
Sml4 poderia estar participando na formação de dímeros intermoleculares por pontes disulfetos. Com intuito de obter proteínas recombinantes mais estáveis, trocou-se este resíduo de cisteína por serina (análogo estrutural) ou valina (presente em outras FABP) por mutagênese sítio dirigida. As proteínas mutantes obtidas (Sml4-M2S62 e Sml4-M20V62) não foram tão mais termoestáveis do que a proteína selvagem
Sml4-M20, porém conseguiram • ♦·· · ··· · ··· ♦ ·· ·· • · · · · · · · · · · · • · ·· · · · · ··· ·· aproximadamente
100% de renaturação após o aquecimento a
80°C, diferente das formas selvagens da proteína Sml4. Além disso, após armazenamento por 2 meses a 4°C, as proteínas mutantes Sml4-M20S62 e Sml4-M20V62 apresentaram uma menor 5 perda de estrutura-β do que as formas selvagens, as quais mostraram formação de estrutura randômica, como mostrou a
análise por dicroísmo circular, o que confirma o sucesso das mutações.
As proteínas mutantes de acordo com a presente invenção apresentam as seguintes sequências.
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES
1. Proteína recombinante Sm14 caracterizada por possuir a SEQ ID NO: 2. 2. Proteína recombinante Sm14 caracterizada por possuir a SEQ ID NO: 3. 3 . Proteína recombinante Sm14 caracterizada por possuir a SEQ ID NO: 4. 4. Proteína recombinante Sm14 caracterizada por possuir a SEQ ID NO: 5. - 5. Composição imunogênica capaz de conferir proteção contra infecções com helmintos caracterizada por compreender uma quantidade efetivamente protetora de qualquer uma das proteínas descritas nas reivindicações 1 a 4 e um veículo veterinário e/ou farmaceuticamente aceitável, diluente, excipiente e/ou adjuvante.
- 6. Composição de acordo com a reivindicação 5 caracterizada por a quantidade efetivamente protetora de qualquer uma das proteínas estar na faixa de 1 pg a 1000 pg por dose.
- 7. Composição de acordo com a reivindicação 5 caracterizada por o adjuvante ser selecionado do grupo consistindo de Alúmen, adjuvante de Freund, TDM+MPL ou semelhantes.
- 8. Kit de diagnóstico caracterizado por compreender ao menos uma das proteínas conforme descritas nas reivindicações 1 a 4.Petição 870190003002, de 10/01/2019, pág. 8/10
- 9. Kit de diagnóstico de acordo com a reivindicação8 caracterizado por incluir ainda um veículo veterinário e/ou farmaceuticamente aceitável.
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Cited By (1)
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