BRPI9915988B1 - Vacina para peptidase c5a estreptocócica - Google Patents

Description

"VACINA PARA PEPTIDASE C5a ESTREPTOCÓCICA" Este pedido é uma continuação-em-parte do pedido US número de série 08/589.756 depositado em 22 de janeiro de 1996. USSN 08/589.756 é aqui incorporado por referência.

Antecedentes da Invenção Existem várias espécies de estreptococos β-hemolíticos diferentes que foram identificadas. Streptococcus pyogenes, também denominado estreptococos do grupo A, é um patógeno bacteriano comum de humanos. Primariamente uma doença de crianças, ela causa uma variedade de infecções incluindo faringite, impetigo e sepsia em humanos. Subsequente à infecção, complicações autoimunes como febre reumática e glomerulonefrite aguda podem ocorrer em humanos. Este patógeno também causa doenças agudas graves como escarlatina, fascite necrosante e choque tóxico.

Garganta inflamada causada por estreptococos do grupo A, comumente denominada "garganta strep", totaliza pelo menos 16% de todas as consultas em uma prática médica, dependendo da estação. Hope- Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975," J. Hyg. Camb., 87:109-129 (1981). Esta espécie também é a causa do ressurgimento recente na América do Norte e em quatro outros continentes de choque tóxico associado com fascite necrosante. Stevens, D.L., "Invasive group A streptococcus infections," Clin. Infect, Pis., 14:2-13 (1992) - Também implicados na causa de tosse strep e ocasionalmente na causa de choque tóxicos são estreptococos do grupos C e G. Hope- Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962- 1975," J. Hyg, Camb., 87: 109- 129 (1981).

Estreptococos do grupo B, também conhecidos como Streptococcus agalactiae, são responsáveis por sepsia neonatal e meningite. T.R. Martin et al., "The effect of type- specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats", J. Infect Pis., 165:306-314 (1992). Apesar de frequentemente um membro da flora mucosal vaginal de fêmeas adultas, de 0,1 a 0,5/1000 recém-nascidos desenvolveram doença grave após infecção durante o parto. A despeito da alta mortalidade com infecções por estreptococos do grupo B, mecanismos da patogenicidade são fracamente compreendidos. Martin, T.R. et al., "The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of Group B streptococci from the lung of infant and adult rats," J. Infect, Pis,, 165:306-314 (1992).

Atualmente, infecções por estreptococos são tratadas por terapia com antibióticos. No entanto, 25-30% dos tratados têm doença recorrente e/ou abrigam no organismo secreções mucosais. Atualmente, nenhum meio está disponível para evitar infecções por estreptococos. Historicamente, o desenvolvimento de vacina estreptocócica está focalizado sobre a proteína M de superfície de células bacterianas. Bessen, D. et al., "Influence of intranasal immunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of M protein on mucosal colonization by group A streptococci," Inf ect. Iminun. , 56:2666-2672 (1988); Bronze, M.S. et al. , "Protective immunity evoked by locally administred group A streptococcal vaccines in mice," Journal of Immunology, 141:2767-2770 (1988).

Dois problemas principais limitarão o uso, comercialização e, possivelmente, aprovação do FDA, de uma vacina de proteína M. Em primeiro lugar, existem mais do que 80 serotipos de M diferentes de S. pyogenes e novos serotipos surgem continuamente. Fischetti, V.A. , "Streptococcal M protein: molecular design and biological behavior, Clin. Microbiol. Rev., 2:285-314 (1989). Assim, inoculação com uma proteína M específica de serotipo não será provavelmente eficaz na proteção contra outros serotipos de M. 0 segundo problema refere-se à segurança de uma vacina de proteína M. Várias regiões da proteína M contêm epítopos antigênicos que são imunologicamente reativos cruzados com tecido humano, particularmente tecido do coração. Os N-têrminos de proteínas M são altamente variáveis na sequência e especificidade antigênica. Inclusão de mais do que 80 peptídeos diferentes, representando esta sequência variável em uma vacina pode ser requerida para obter proteção ampla contra infecção por estreptococos do grupo A. Novas proteínas M variantes podem ainda continuar a surgir, requerendo controle contínuo de doença por estreptococos e mudanças na composição da vacina. Em contraste, os términos carboxila de proteínas M são conservados na sequência. Esta região da proteína M, no entanto, contém uma sequência de aminoácidos que é imunologicamente reativa cruzada com tecido de coração humano. Considera-se que esta propriedade da proteína M leva em conta dano à válvula cardíaca associado com febre reumática. P. Fernderson et al., "Tropomyosinsharies immunologíc epitopes with group A streptococcal M proteíns, J. Immunol. 142:2475-2481 (1989). Em uma experiência anterior, crianças que foram vacinadas com proteína M em 1979 tiveram uma incidência dez vezes maior de febre reumática e dano à válvula cardíaca associado. Massell, B.F. et al., "Rheumatic fever following streptococcal vacination, JAMA, 207:1115-1119 (1969).

Outras proteínas sob consideração para desenvolvimento de vacina são as toxinas eritrogênicas, exotoxina pirogênica estreptocócica A e exotoxina pirogênica estreptocócica B. Lee, P.K. et al. , ''Quantif ication and toxicity of group A streptococcal pyrogenic exotoxins in an animal model of toxic shock syndrome-like illness," J. Clin. Microb., 27:1890-1892 (1989). Imunidade destas proteínas pode evitar os sintomas mortais de choque tóxico, mas podem não evitar colonização por estreptococos.

Assim, permanece uma necessidade contínua de um meio eficaz para evitar ou melhorar infecções por estreptococos . Mais especificamente, existe uma necessidade de desenvolver composições utilizáveis em vacinas para evitar ou melhorar colonização de tecidos hospedeiros por estreptococos, desse modo reduzindo a incidência de garganta strep e impetigo. Eliminação de seqüelas como febre reumática, glomerulonefrite aguda, sepsia, choque tóxico e fascite necrosante pode ser uma consequência direta de reduzir a incidência de infecção aguda e conduta do organismo. Também existe uma necessidade de desenvolver composições utilizáveis em vacinas para evitar ou melhorar infecções causadas por todas as espécies estreptocócicas β-hemolíticas, a saber, grupos A, B, C e G.

Sumário da Invenção A presente invenção provê uma vacina e processos de vacinação, eficazes para imunizar um mamífero suscetível contra Streptococcus β- hemolítico. O mamífero suscetível pode ser um humano ou um animal doméstico como um cão, uma vaca, um porco ou um cavalo. Esta imunização pode evitar, melhorar ou reduzir a incidência de colonização de Streptococcus β- hemolítico no mamífero. A vacina contém uma quantidade imunogênica de peptidase C5a estreptocócica (SCP) , em que o SCP é uma variante de SCP do tipo selvagem em combinação com um veículo não tóxico, fisiologicamente aceitável.

Uma "variante" de SCP é um SCP polipeptídeo ou oligopeptideo que não é completamente idêntico a SCP nativo. Esta variante de SCP pode ser obtida alterando a sequência de aminoácidos por inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos. A sequência de aminoácidos da proteína é modificada, por exemplo por substituição, para criar um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma ou qualidades melhoradas como comparado ao polipeptídeo nativo. A substituição pode ser uma substituição conservada. Uma "substituição conservada" é uma substituição de um aminoãcido com outro aminoácidos tendo uma cadeia lateral similar. Uma substituição conservada pode ser uma substituição com um aminoãcido que faz a menor mudança possível na carga do aminoãcido ou tamanho da cadeia lateral do aminoãcido (alternativamente, no tamanho, carga ou tipo de grupo químico na cadeia lateral), de modo que o peptídeo total retém sua conformação espacial, mas tem atividade biológica alterada. Por exemplo, mudanças conservadas comuns podem ser Asp para Glu, Asn ou Gin; His para Lys, Arg ou Phe; Asn para Gin, Asp ou Glu e Ser para Cys, Thr ou Gly. Alanina é comumente usada para substituir por outros aminoácidos. Os 20 aminoácidos essenciais podem ser agrupados como a seguir: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina tendo cadeias laterais não polares; glicina, serina, treonina, cistina, tirosina, asparagina e glutamina tendo cadeias laterais polares não carregadas; aspartato e glutamato tendo cadeias laterais acídicas; e lisina, arginina e histidina tendo cadeias laterais básicas. L. Stryer, Biochemistry (2a ed.) p. 14-15; Lehninger, Biochemistry, p. 73-75.

As mudanças de aminoácidos são obtidas mudando os códons da sequência de ácidos nucléicos correspondente. Sabe-se que polipeptídeos podem ser obtidos com base na substituição de certos aminoácidos por outros aminoácidos na estrutura de polipeptídeo a fim de modificar ou melhorar atividade antigênica ou imunogênica. Por exemplo, através de substituição de aminoácidos alternativos, pequenas mudanças conformacionais podem ser conferidas a um polipeptídeo que resultam na atividade aumentada ou resposta imune melhorada. Alternativamente, substituições de aminoãcidos em certos polipeptídeos podem ser usadas para prover resíduos que podem então ser ligados a outras moléculas para prover conjugados peptídeo-molécula que retêm propriedades antigênicas suficientes do polipeptídeo de partida para serem utilizáveis para outros fins.

Pode-se usar índice hidropãtico de aminoãcidos para conferir função biológica interativa a um polipeptídeo, em que verifica-se que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoãcidos tendo índices hidropáticos similares e ainda retêm uma atividade biológica similar. Alternativamente, substituição de aminoãcidos semelhantes pode ser feita na base de hidrofilicidade, particularmente onde a função biológica desejada no polipeptídeo a ser gerado é pretendida para uso em formas de realização imunológicas. A maior hidrofilicidade média local de uma "proteína", como governada pela hidrofilicidade de seus aminoãcidos adjacentes, correlaciona-se com sua imunogenicidade. Patente US 4.554.101. Consequentemente, nota-se que substituições podem ser feitas com base na hidrofilicidade designada para cada aminoácido.

Usando-se tanto índice de hidrofilicidade como índice hidropãtico, que designa valores para cada aminoácido, prefere-se conduzir substituições de aminoãcidos onde estes valores são ± 2, com ± 1 sendo particularmente preferido, e as com ± 0,5 sendo as substituições mais preferidas . A SCP variante compreende pelo menos sete resíduos de aminoácidos, preferivelmente cerca de 100 a cerca de 1.500 resíduos, e mais preferivelmente cerca de 300 a cerca de 1.200 resíduos, e ainda mais preferivelmente cerca de 500 a cerca de 1.180 resíduos, em que o SCP variante tem pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos cerca de 80% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, mas menos do que 100%, de identidade ou homologia de sequência de aminoácidos contígua na sequência de aminoácidos de um SCP nativo correspondente. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo SCP variante corresponde essencialmente à sequência de aminoácidos de SCP nativo. Como usado aqui "corresponde essencialmente" refere-se a uma sequência de polipeptídeo que elicitará uma resposta imunológica protetora substancialmente igual à resposta gerada por SCP nativo. Esta resposta pode ser pelo menos 60% do nível gerado por SCP nativo, e pode ser ainda pelo menos 80% do nível gerado por SCP nativo. Uma resposta imunológica a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune mediada por anticorpo e/ou celular no polipeptídeo ou vacina de interesse. Geralmente, esta resposta consiste dos anticorpos produzindo, no indivíduo, célula B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. O SCP pode ser uma variante de SCP de Streptococcus do grupo A (SCPA), Streptoccus do grupo B (SCPB), Streptococcus do grupo C (SCPC) ou Streptococcus do grupo G (SCPG).

Uma variante da invenção pode incluir resíduos de aminoácidos não presentes no SCP nativo correspondente ou deleções relativas ao SCP nativo correspondente. Uma variante também pode ser um "fragmento" truncado como comparado ao SCP nativo correspondente, isto é, somente uma porção de uma proteína de comprimento completo. Por exemplo, o SCP variante pode variar de SCP nativo em que ele não contém um inserto de parede de células. Variantes SCP incluem também peptídeos tendo pelo menos um aminoácido D. O SCP variante da vacina pode ser expressado de uma sequência de DNA isolada codificando o SCP variante. Por exemplo, o SCP variante pode variar de SCP nativo em que ele não contém uma sequência de sinal ou um inserto de parede de células. O DNA pode codificar a fenda de especificidade ou o domínio catalítico. Em particular, o DNA pode codificar 130, 193, 295 ou 512 resíduos de aminoácidos do domínio catalítico, ou 260, 261, 262, 415, 416 ou 417 resíduos de aminoácidos da fenda de especificidade, ou codificar modificações nestes resíduos. Em particular, o DNA pode codificar SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA4 9S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1D512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A ou ASCPA49. Para a listagem acima, SCPA49H193A significa um SCP de estreptococos do grupo A serotipo 49, em que o His no resíduo número 193 é substituído com Ala. o SCP da vacina pode ser desprovido de atividade de peptidase ou C5ase enzimática. A vacina também pode conter um adjuvante imunológico. A vacina pode ser usada para evitar infecção por Streptococcus do grupo A, Streptococcus do grupo B, Streptococcus do grupo C ou Streptococcus do grupo G. A vacina pode compreender uma peptidase C5a estreptocócica recombinante imunogênico conjugada ou ligada a um peptídeo imunogênico ou a um polissacarídeo imunogênico. "Recombinante" é definido como um peptídeo ou ácido nucleico produzido pelos processos de engenharia genética. Os termos "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são usados aqui intercambiavelmente. A vacina peptidase C5a estreptocócica pode ser administrada por injeção subcutânea ou intramuscular. Alternativamente, a vacina pode ser administrada por ingestão oral ou inoculação intranasal. A presente invenção provê ainda peptídeos SCP isolados e purificados, em que o SCP é uma variante de SCP do tipo selvagem e polinucleotídeos isolados e purificados codificando um SCP variante. Por exemplo, o SCP pode incluir 130, 193, 295 ou 512 resíduos de aminoãcidos do domínio catalítico ou 260, 261, 262, 415, 416 e 417 resíduos de aminoãcidos da fenda de especificidade. O SCP pode ser SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA4 9N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A ou ASCPA49.

Breve Descrição dos Desenhos Figura 1: Arquitetura de peptidase C5a estrepto- ócica β- hemolítica. D indica um resíduo de ácido aspártico; H indica histidina; S indica serina; L indica leucina; P indica prolina; T indica treonina; e N indica asparagina. Ri, R2, R3 e R4 indicam sequências repetidas. Os números indicam a posição de resíduos de aminoácidos na peptidase.

Figura 2: Alinhamento da sequência de aminoácidos de SCP de estreptococos do grupo A serotipo 49 (SEQ id NO: 1), estreptococos do grupo A serotipo 12 (SEQ ID NO: 2), estreptococos do grupo B (SEQ ID NO: 3) e estreptococos do grupo A serotipo 1 (SEQ ID NO: 23) . As sequências são idênticas exceto para as posições de aminoácidos indicadas. 0 triângulo (V) indica o ponto de divagem previsto da peptidase de sinal. Aminoácidos previstos serem sítio ativo na enzima são marcados por asteriscos. Deleções na sequência de aminoácidos são indicados por pontos e estão em caixas. Os asteriscos (*) indicam os resíduos de aminoácidos do domínio catalítico.

Figura 3. Construção de mutantes de seleção e inserção de SCP. Caixa preta indica região deletada.

Figura 4. Análise FACS em cor única. Dados de fluorescência foram analisados por retenção em PMNs. Uma segunda retenção foi fixada para contar células com alta coloração definidas pela primeira retenção. Sãculos de ar foram inoculados com 1 x 106 CFU.

Figura 5. Persistência de estreptococos serotipo 49 SCPA" e do tipo selvagem após infecção intranasal.

Figura 6. Comparação da capacidade de mutantes de SCPA’ de estreptococos do grupo A serotipo M6 para colonizar camundongos após infecção intranasal. Compara camundongos BALB/c (dez em cada grupo experimental) inoculados com 2 x 107 CFU de estreptococos M6. Esfregaços da garganta foram cultivados cada dia em placas de agar com sangue contendo estreptomicina. Camundongos foram considerados positivos se as placas continham colônia β- hemolítica. Dados foram analisados estatisticamente pelo teste χ2.

Figura 7. Construção de vacina ASCPA49 e protocolo de imunização.

Figura 8. Anticorpo de coelho neutraliza atividade de SCPA associada com serotipos diferentes. Barra 1 é um controle positivo e continha rhCSa que não foi pré- incubado antes de exposição a PMNs. Barra 10 é um controle no qual falta rhC5a. No todo, bactérias intactas, pré-incubadas com soro de coelho normal (barra 2, Ml 90-131; barra 4, M6 UAB2QQ; barra 6, M12 CS24; barra 8, M49 CS101) ou pré-incubadas com soro anti-SCPA49 de coelho (barra 3, Ml 90-131; barra 5, M6 UAB200; barra 7, M12 CS24; barra 9, M49 CS101), foram incubadas com 20 μΐ de rhCSa 5 μΜ durante 4 5 min. rhCSa residual foi testado por sua capacidade de ativar PMNs para aderir a reservatórios de placa de microtitulação revestida com BSA. PMNs aderentes foram coloridos com violeta cristal.

Figura 9. Respostas de IgG no soro e IgA secretório após imunização intranasal de camundongos com a proteína ASCPA49 purificada. Níveis de soro e saliva de IgG específico de SCPA49 foram determinados por ELISA indireto. Soros de cada camundongo foram diluídos em 1:2.560 em PBS; saliva foi diluída 1:2 em PBS. Figura 9A mostra os resultados experimentais com slgA; figura 9B mostra os resultados experimentais com IgG.

Figura 10. Comparação da capacidade de estrepto-cocos serotipo M59 colonizarem camundongos do sexo feminino CD1 imunizados e não- imunizados. Cada grupo experimental continha 13 camundongos que foram infectados intranasalmente (i.n.) com 2,0 x 108 CFU. Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste χ2. Figuras 10A e 10B mostram os resultados da experiência repetida.

Figura 11. Comparação ELISA competitiva de ligação tipo de SCP do tipo selvagem e variante a anticorpo policlonal. Antígeno de placa é SCPA49 do tipo selvagem recombinante (100 ng / reservatório). Antígeno de competição é indicado pela legenda.

Figura 12. Comparação ELISA competitiva de ligação de SCPA1, SCPA49 e SCPB a anticorpo policlonal. Antígeno de placa é SCPA4 9 do tipo selvagem recombinante (100 ng / reservatório). Antígeno de competição é indicado pela legenda. SCPA1 e SCPA49 usados nas experiências descritas nestas figuras compreenderam Asn32 até His1139. SCPB usado nas experiências descritas nesta figura foi produzido de acordo com Chmouryguina, I. et al. , "Conservation of the C5a Peptidase Gene in Group A and B Streptococci", Infect. Immun., 64:2387-2390 (1996).

Descrição Detalhada da Invenção Uma primeira linha importante de defesa contra infecção por muitos patógenos bacterianos é o acúmulo de leucócitos polimorfonucleares fagocíticos (PMNs) e células mononucleares no sítio da infecção. Atração destas células é mediada por estímulos quimiotáticos, como fatores de hospedeiro ou fatores secretados pelo organismo em invasão. O C5a quimioatraente é pivotal ao estímulo desta resposta inflamatória em mamíferos. C5a é um glicopeptídeo de resíduo 74 clivado do quinto componente (C5) de complemento. Células fagociticas respondem de um modo direto a um gradiente de CSa e acumulam- se no sítio de infecção. C5a pode ser o atraente mais imediato de fagócitos durante inflamação. Como PMNs infiltram uma lesão inflamatória, eles secretam outras quimiocinas, como IL8, que ainda intensificam a resposta inflamatória.

Peptidase CSa estreptocócica (SCP) é uma enzima proteolítica localizada na superfície de estreptococos patogênicos onde ela destroi CSa, uma vez que C5a é produzido localmente. SCP cliva especificamente a quimiotaxina C5a no sítio de ligação de PMN (entre resíduos de C5a His67-Lyss8) e remove os sete resíduos de CSa mais C-terminais. Esta divagem do sítio de ligação de PMN elimina o sinal quimiotático. Cleary, P. et al,, "Strepptococcal CSa peptidase is a highly specific endopeptidase," Infect. Immun., 60:5129-5223 (1992); Wexler, D.E. et al., "Mechanism of action of the group A streptococcal CSa inactivator," Proc■ Natl. Acad. Sei. USA, 82:8144-8148 (1985). SCP de estreptococos do grupo A ê uma serina protease como subtilisina com um Mr de 124.814 da e com um motivo âncora de parede de células que é comum a muitas proteínas de superfície bacteriana Gram- positivas. A arquitetura de peptidase C5a é dada na figura 1. A sequência de nucleotídeos completa do gene peptidase C5a estreptocócica de Streptococcus pyogenes foi publicado. Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a Peptidase gene of Streptococcus pyogenes", J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). Em contraste a subtilisinas, SCP tem uma especificidade de substrato muito estreita. Esta especificidade estreita é surpreendente à luz de similaridades marcantes entre seus domínios catalíticos. Cleary, P.et al. , "Streptococcal C5a Peptidase is a highly specific endopeptidase," Infect. Immun., 60:5219-5223 (1992) . Resíduos envolvidos na transferência de carga são conservados, uma vez que são resíduos em ambos os lados da bolsa de ligação. No entanto, a sequência de aminoácidos restante de SCP é não relacionada à de subtilisinas. Verificou-se que mais do que 40 serotipos de estreptococos do grupo A produzem proteína SCP ou abrigam o gene. Cleary, P. et al., "A streptococcal inactivator of chemotaxis: a new virulence factor specific to group A streptococci," in Recent Advances in Streptococci and Streptococcal Disease p. 179-180 (S. Kotami e Y. Shiokawa ed., Reedbooks Ltd., Berkshire, Inglaterra; 1984); Podbielski, A. et al. , "The Group A streptococcal virR49 gene Controls expression of four structural vir regulon genes," Infect Immun., 63:9-20 (1995) . O domínio catalítico ou sítio ativo de SCP é composto do sistema de transferência de carga e a fenda de especificidade. O sistema de transferência de carga, também denominado o domínio catalítico, contém resíduos Asp130, His193, Asn295 e Ser512 (figuras 1 e 2) . Uma modificação, isto é, uma deleção, inserção ou substituição, de qualquer um destes aminoácidos inativarão a enzima. A fenda de especificidade, por outro lado, é prevista para ser formada por Ser260 , Phe261, Gly262 , Ile415, Tyr4ie e Asp417. Modificação por substituição destes aminoácidos pode mudar a especificidade do substrato da enzima ou eliminar atividade proteolítica inteiramente. Modificação por deleção destes aminoácidos também pode inativar a enzima. 0 domínio catalítico depende da estrutura terciária da proteína que é criada quando a enzima madura duplica em seu estado ativo. Este domínio não é formado de um conjunto linear contíguo de resíduos de aminoácidos. Alternativamente, modificação também pode reduzir ligação de SCP variante ao substrato. A ligação pode ser reduzida em 50%, 70% ou mesmo 80%.

Uma enzima peptidase C5a associada com estreptococos do grupo B também foi identificada. Hill, H.R. et al. , "Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complement," J. Immunol., 141:3551-3556 (1988). Mapeamento de restrição e término da sequência de nucleotídeos scpB mostrou que scpB é 97-98% similar a scpA. Ver figura 2 para comparação da sequência de aminoácidos de SCP de estreptococos do grupo A serotipo 49, estreptococos do grupo A serotipo 12, estreptococos do grupo B serotipo 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 23, respectivamente) . Mais do que 3 0 cepas, representando todos os serotipos de estreptococos do grupo B contém o gene scpB. Cleary, P.P. et al., "Similarity between the Group B and A streptococcal C5a peptidase genes," Infect. Immun. 60:4239-4244 (1992);

Suvorov, A.N. et al. , "C5a Peptidase genes from group B streptococci," em Genetics and Molecular Biology of Streptococci Lactococci, and Enterococci, p. 230-232 (G. Dunny, P. Cleary e L. McKay (ed.); American Society for Microbiology, Washington, D.C.; 1991).

Isolados humanos de estreptococos dos grupos G e C também abrigam genes semelhantes a scpA. Algumas cepas do grupo G mostraram expressar atividade de protease específica de C5a em sua superfície. Cleary, P.P. et al. , "Virulent human strains of group G streptococci express a C5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci," Infect. Immun., 59:2305-2310 (1991). Consequentemente, todos serotipos (> 80) de estreptococos do grupo A, estreptococos do grupo B, estreptococos do grupo C e estreptococos do grupo G produzem a enzima SCP. SCP auxilia estreptococos a colonizar um sítio de infecção potencial, como a mucosa nasofaríngica, inibindo o influxo de células brancas fagocíticas no sítio de infecção. Isto impede a depuração inicial de estreptococos pelo hospedeiro. O impacto de SCP em inflamação, quimiotaxia de leucõcito C5a e virulência estreptocócica foi examinado usando cepas estreptocócicas com mutações bem definidas no gene estrutural de protease. Variantes de SCP foram construídas por inserção do plasmídeo marcado e por substituição do gene do tipo selvagem com scpA contendo uma deleção interna específica. Variantes eram desprovidas de atividade C5a protease e não inibiram a resposta quimiotática de PMNs humanos e de camundongo em C5a in vitro.

Um modelo de sãculo de ar de tecido conectivo de camundongo foi usado para confirmar que SCP retarda o influxo de células fagocíticas e depuração de estreptococos do sítio de infecção. Um sãculo de ar de tecido conectivo é gerado injetando-se uma pequena quantidade de ar e PBS (com ou sem estreptococos nos mesmos) com uma agulha calibre 25 sob a pele na traseira de um camundongo. Boyle, M.D.P. et al. , "Measurement of leukocyte chemotaxis in vivo," Meth. Enzymol., 162:101:115 (1988). Ao término da experiência, os camundongos foram eutanizados por deslocamento da cervical, os sáculos de ar dissecados dos animais e os sãculos de ar homogeneizados em tampão. Uma vantagem do modelo de sãculo de ar é que o sãculo de ar permanece inflado durante vários dias e livre de inflamação, a menos que um irritante seja injetado. Assim, injetou-se bactérias e a resposta inflamatória resultante permanece localizada durante períodos curtos de infecção. O modelo de sãculo de ar foi modificado para comparar depuração de estreptococos SCP" e SCP+ do tipo selvagem (isto é, estreptococos do grupo A que continham uma forma não funcional variante de SCP) e analisar o infiltrado de células em um estágio prematuro de infecção. Suspensões de tecidos foram testadas para estreptococos viáveis em placas de agar com sangue e o infiltrado celular foi analisado por classificação de células fluorescentes (FACS). Na análise FACS, células individuais em suspensão são rotuladas com monoanticorpos fluorescentes específicos. Alíquotas de células rotuladas são injetadas em um fluxocitômetro FAC-Scan, ou classificador de células fluorescentes, cuja contagem de células baseou-se em sua fluorescência única. As experiências usando o modelo de sáculo de ar indicaram que estreptococos que eram SCP+ eram mais virulentos do que estreptococos que eram SCP-.

Realizou-se um estudo para medir a produção de anticorpo humano, tanto IgA como IgA, contra SCP em saliva e soros humanos. 0'Connor, SP, et al., "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase," J. Infect. Pis. 163:109-16 (1991). Geralmente, soros e saliva de crianças não infectadas são desprovidos de anticorpo para SCP. Em contraste, mais amostras de soros e saliva de adultos saudáveis tiveram níveis mensuráveis de IgA secretório específico de SCP e IgG anti - SCP (slgA anti- SCP) . Soros de pacientes em estado agudo e convalescente emparelhados de pacientes com faringite estreptocócica possuíam níveis significativamente mais altos de IgG anti-SCP do que soros de indivíduos saudáveis. Soros contendo concentrações altas de imunoglobulina anti-SCP foram capazes de neutralizar atividade de SCP. Detecção deste anticorpo em > 90% das amostras de saliva obtidas de crianças que experimentaram recentemente faringite estreptocócica demonstrou que crianças podem produzir uma resposta de anticorpo.

Ainda que os indivíduos humanos produziram IgG e IgA contra SCP em resposta a uma infecção por estreptococos natural, não se soube se a imunoglobulina anti-SCP provê qualquer proteção contra infecção. Além disso, não se soube se a proteína SCP age como uma vacina contra infecção ou colonização de estreptococos β-hemolíticos. Primeiramente, foi realizado um estudo para examinar o papel de SCP na colonização da nasofaringe. Após infecção intranasal com estreptococos do grupo A vivos, culturas da garganta foram tomadas diariamente durante até dez dias. Estreptococos mutantes deficientes de SCP isogênico e do tipo selvagem foram comparados para a capacidade de persistirem na garganta durante este período de dez dias. Como previsto, os estreptococos mutantes deficientes de SCP foram depurados da nasofaringe mais rapidamente. O mesmo modelo de camundongo intranasal foi usado para testar a capacidade de SCP induzir imunidade que evitara colonização. Uma forma variante do gene . scpA49 recombinante começando no nucleotídeo que codifica Thr63 foi clonada. Esta variante é referida como ASCPA49, e tem 2908 bp em comprimento (ver exemplo 4 abaixo). Proteína SCP variante foi purificada de um E. coli recombinante por cromatografia de afinidade. Soros de coelhos vacinados intradermicamente com esta preparação de proteína neutralizaram atividade de SCP in vitro. Proteína purificada (40 μg) foi administrada intranasalmente em camundongos durante um período de cinco semanas. Camundongos imunizados depuraram estreptococos em 1- 2 dias; enquanto culturas da garganta de camundongos não- imunizados permaneceram positivos durante até 10 dias. A experiência foi repetida em três conjuntos de camundongos, vacinados com três preparações separadas de uma proteína SCP.

Outras experiências foram realizadas para determinar se imunização de um animal com um antígeno único pode evitar colonização por vários serotipos. ASCPA49 foi clonado em um vetor de expressão e expressado em E. coli. A proteína ÁCSPA40 variante purificada por afinidade provou ser altamente imunogênica em camundongos e coelhos. Apesar do imunogene ASCPA49 variante purificado ser desprovido de atividade enzimãtica, ele induz altos títulos de anticorpos de coelho que foram capazes de neutralizar atividade de peptidase associada com estreptococos Ml, M6, M12 e M49 in vitro. Isto confirmou que anticorpos anti- peptidase são desprovidos de especificidade de serotipo. Quatro conjuntos de camundongos foram então imunizados intranasalmente com ASCPA49 variante purificada e cada um foi desafiado com um serotipo diferente de estreptococos do grupo A. A imunização de camundongos com proteína ASCPA49 estimulou níveis significativos de slgA salivar específico e anticorpos IGg de soro e reduziu o potencial de estreptococos Ml, M2, M6, Mil e M4 9 do tipo selvagem se colonizarem. Estas experiências confirmam que imunização com vacina peptidase C5a estreptocócica á eficaz na prevenção da colonização da nasofaringe.

Experiências também foram realizadas para desenvolver SCPs variantes de uma cepa OF' de Ml e da cepa 0F+ de M4 9. Uma vez que SCP ativo pode ser prejudicial ao hospedeiro, foi importante que proteínas variantes desprovidas de atividade enzimática. Aminoãcidos que são requeridos para atividade catalítica foram substituídos pelos que, como se espera, inativam a enzima.

Duas propriedades das proteínas variantes foram avaliadas. Em primeiro lugar, as atividades específicas das proteínas variantes e do tipo selvagem foram determinadas pelo teste de aderência de PMN. Estas experiências indicaram que os aminoãcidos substituídos reduziram atividade enzimática em mais do que 90%. Em segundo lugar, as proteínas variantes também foram comparadas à proteína do tipo selvagem para sua capacidade de ligar anticorpo dirigido contra a enzima do tipo selvagem. Testes ELISA competitivos foram usados para este fim. Os resultados indicaram que as substituições de aminoãcidos não alteraram a capacidade do anticorpo ligar- se às proteínas variantes.

Todos os estudos de proteção anteriores foram realizados administrando proteína ASCPA49 purificada por afinidade intranasalmente sem adjuvante. Injeção intramuscular ou subcutânea (SQ) de antígenos, no entanto, é historicamente um processo mais aceito, preferido de liberação de vacina. Consequentemente, experiências foram realizadas para testar se injeções SQ de ASCPA com lipídeo monofosforila A (MPL) e alume (A1P04) induziram uma resposta imune protetora e se essa resposta reduziu colonização quando a cepa desafio de estreptococos do grupo A diferiu no serotipo da fonte da vacina SCPA. A capacidade de camundongos imunizados depurar estreptococos da mucosa faríngica oral-nasal foi avaliada por cultura da garganta ou por amostragem de tecido nasal dissecado. O número de estreptococos associados com tecido nasal diminuiu com o tempo, como esperado, e o decréscimo foi mais rápido e complexo em camundongos imunizados com antígeno SCPA. Os resultados confirmaram que um antígeno SCPA único pode induzir proteção contra serotipos heterólogos. Proteção é dada por anticorpo que neutraliza atividade de peptidase na superfície bacteriana. Isto aumenta o influxo de fagócitos em umas poucas horas do tempo em que estreptococos são depositados no tecido mucosal. Presume-se que depuração rápida de estreptococos por fagócitos evita persistência e multiplicação subsequentes das bactérias. Assim, injeção SQ de antígeno SCPA com adjuvante induziu consistentemente uma resposta de anticorpo vigorosa. A presente invenção provê, assim, uma vacina para uso para proteger mamíferos contra infecção ou colonização por Streptococcus β-hemolítico. Em uma forma de realização desta invenção, como é comum para vacinas, a peptidase C5a estreptocócica variante poder ser liberada em um mamífero em um veículo farmacologicamente aceitável. Vacinas da presente invenção também podem incluir quantidades eficazes de adjuvantes imunológicos, conhecidos melhorar uma resposta imune. O SCP pode ser conjugado ou ligado a outro peptídeo ou a um polissacarídeo. Por exemplo, proteínas imunogênicas bem conhecidas na arte, também conhecidas como "condutoras" podem ser empregadas. Proteínas imunogênicas utilizáveis incluem hemocianina de lapa (KLH), albumina de soro bovino (BSA), ovalbumina, albumina de soro humano, gama globulina humana, imunoglobulina de frango G e gama globulina bovina. Polissacarídeos imunogênicos utilizáveis incluem polissacarídeo de estreptococos do grupo A, C-polissacarídeos de estreptococos do grupo B, ou os polissacarídeos capsulares de Streptococcus penumoniae ou estreptococos do grupo B. Alternativamente, polissacarídeos ou proteínas de outros patógenos que são usadas como vacinas podem ser conjugadas a, ligadas a, ou misturadas com SCP.

Também são providas moléculas de ácido nucléico isoladas e purificadas, por exemplo, moléculas de DNA, compreendendo um segmento de ácido nucléico pré- selecionado que codifica pelo menos uma porção de uma peptidase C5a estreptocócica, isto é, elas codificam SCP ou uma variante do mesmo como descrito aqui, por exemplo, SCPA49S512A, SCPA49D13 OA, SCPA4 9N295A, SCPA1S512A, SCPA1D130A, SCPA1N295A, ASCPA49, SCPBS512A, SCPBD13 OA, SCPBH193A ou SCPBN295A, ou qualquer combinação destas mutações. Por exemplo, a invenção provê um cassete de expressão compreendendo um segmento de DNA pré- selecionado que codifica uma molécula de RNA que é substancialmente idêntica (sentido) a todo ou uma porção de um RNA mensageiro (mRNA de "marcação"), isto é, um mRNA de SCP endógeno ou "nativo". O segmento de DNA pré- selecionado no cassete de expressão é ligado de modo operativo a um promotor. Como usado aqui, "substancialmente idêntico" na sequência significa que duas sequências de ácido nuclêico têm pelo menos cerca de 65%, preferivelmente cerca de 70%, mais preferivelmente cerca de 90%, e ainda mais preferivelmente cerca de 98%, de identidade da sequência de nucleotídeo contígua uma com a outra. Preferivelmente, o segmento de DNA pré- selecionado hibridiza em condições de hibridização, preferivelmente em condições de hibridização estringente, em uma molécula de ácido nuclêico codificando o SCP nativo correspondente.

Como usado aqui, "substancialmente puro" significa que uma espécie objeto é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar ela é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição) e, preferivelmente, uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objeto compreende pelo menos cerca de 50 por cento (em uma base molar) de toda a espécie macromolecular presente. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais do que cerca de 80 por cento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, mais preferivelmente mais do que cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% e cerca de 99%. Mais preferivelmente, a espécie objeto é purificada para homogeneidade essencial (espécie contaminante não pode ser detectada na composição por processos de detecção convencionais) , em que a composição consiste essencialmente de uma espécie macromolecular única.

Como usado aqui, o termo "ácido nuclêico recombinante" ou "ácido nuclêico pré-selecionado", por exemplo, "segmento ou sequência de DNA recombinante" ou "segmento ou sequência de DNA pré- selecionado" refere-se a um ácido nucleico, por exemplo, a DNA, que foi derivado ou isolado de qualquer fonte apropriada, que pode ser, subsequentemente, alterado in vitro, de modo que sua sequência não ocorre naturalmente, ou corresponde a sequências de ocorrência natural que não estão posicionadas como podem ser posicionadas em um genoma que não foi transformado com DNA exógeno. Um exemplo de DNA pré-selecionado "derivado" de uma fonte, pode ser uma sequência de DNA que é identificada como um fragmento utilizável em um dado organismo, e que é então sintetizado quimicamente na forma essencialmente pura. Um exemplo de DNA "isolado" de uma fonte pode ser uma sequência de DNA utilizável que é excisada ou removida de referida fonte por meios químicos, por exemplo, pelo uso de endonucleases de restrição, de modo que ela pode ser ainda manipulada, por exemplo, ampliada, para uso na invenção, pela metodologia de engenharia genética.

Recuperação ou isolamento de um dado fragmento de DNA de um dígesto de restrição pode empregar separação do digesto em poliacrilamida ou gel agarose por eletroforese, identificação do fragmento de interesse por comparação de sua mobilidade versus a dos fragmentos do DNA marcador de peso molecular conhecido, remoção da seção de gel contendo o fragmento desejado e separação do gel de DNA. Ver Lawn et al. , Nucleic Acids Res. , 9, 6103 (1981) e Goeddel et al, , Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980). Consequentemente, "DNA pré- selecionado" inclui sequências de DNA completamente sintéticas, sequências de DNA semi- sintéticas, sequências de DNA isoladas de fontes biológicas e sequências de DNA derivadas de RNA, bem como misturas das mesmas.

Como usado aqui, o termo "derivado", com respeito a uma molécula de RNA, significa que a molécula de RNA tem identidade de sequência complementar em uma molécula de DNA particular.

Moléculas de ácido nucleico codificando variantes de sequência de aminoãcidos de um SCP são preparados por uma variedade de processos conhecidos na arte. Estes processos incluem, mas não estão limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida ao sítio) , mutagênese de PCR e mutagênese cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do SCP.

Para imunizar um indivíduo, o SCP variante é administrado parenteralmente, geralmente por injeção intramuscular ou subcutânea em um veículo apropriado. Outros modos de administração, no entanto, como liberação oral ou liberação intranasal, também são aceitáveis. Formulações de vacina conterão uma quantidade eficaz do ingrediente ativo em um veículo. A quantidade eficaz é suficiente para evitar, melhorar ou reduzir a incidência de colonização de Streptococcus β- hemolítico no mamífero de marcação. A quantidade eficaz ê prontamente determinada por um versado na arte. O ingrediente ativo pode estar, tipicamente, na faixa de cerca de 1% a cerca de 95% (p/p) da composição, ou ainda mais alta ou mais baixa, se apropriado. A quantidade a ser administrada depende de fatores como idade, peso e condição física do animal ou indivíduo humano considerado para vacinação. A quantidade depende também da capacidade do sistema imune do animal para sintetizar anticorpos, e o grau de proteção desejada. Dosagens eficazes podem ser estabelecidas prontamente por um versado na arte através de experiências de rotina estabelecendo curvas de resposta de dosagem. 0 indivíduo é imunizado por administração do SCP em uma ou mais dosagens. Dosagens múltiplas podem ser administradas como é requerido para manter um estado de imunidade em estreptococos.

Formulações intranasais podem incluir veículos que nem causam irritação na mucosa nasal nem perturbam significativamente a função ciliar. Diluentes como água, solução salina aquosa ou outras substâncias conhecidas podem ser empregadas com a presente invenção. As formulações nasais também podem conter conservantes como, mas não limitados a, clorobutanol e cloreto de benzalcônio. Um tensoativo pode estar presente para melhorar absorção das proteínas objeto pela mucosa nasal.

Preparações líquidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem ser apresentadas na forma seca em comprimidos ou um produto para reconstituição com água ou outro veículo apropriado antes de usar. As preparações líquidas podem conter aditivos convencionais como agentes de suspensão, agentes emulsificantes, veículos não aquosos (que podem incluir óleos cosmetíveis), ou conservante.

Para preparar uma vacina, o SCP purificado pode ser isolado, liofilizado e estabilizado, O peptídeo SCP pode então ser ajustado em uma concentração apropriada, opcionalmente combinada com um adjuvante de vacina apropriado, e embalado para uso. Adjuvantes apropriados incluem, mas não estão limitados a tensoativos, por exemplo, hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamônio, N,N- dioctadecil -N',N- bis (2-hidroxietil - propano di- amina), metoxi-hexadecil glicerol e polióis pluronic; poliânions, por exemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol; peptídeos, por exemplo, dipeptídeo muramila, MPL, aimetilglicina, tuftsina, emulsões de óleo, alume, e misturas dos mesmos. Outros adjuvantes potenciais incluem as subunidades de peptídeo B de toxina lãbil a quente de E.coli ou da toxina do cólera. McGhee, J.R. et al. , "On vaccine development," Sem. Hematol. 30: 3- 15 (1993) . Finalmente, o produto imunogênico pode ser incorporado em lipossomas para uso em uma formulação de vacina, ou pode ser conjugado a proteínas como hemocianina de lapa (KLH) ou albumina de soro humano (HSA) ou outros polímeros. A aplicação de SCP para vacinação de um mamífero contra colonização oferece vantagens sobre outros candidatos a vacina. Prevenção de colonização ou infecção por inoculação com uma proteína única não somente reduzirá a incidência dos problemas mais comuns de garganta strep e impetigo, mas também eliminarão sequelas de febre reumática, glomerulonefrite aguda, sepsia, choque tóxico e fascite necrosante.

Os seguintes exemplos pretendem ilustrar mas não limitar a invenção. EXEMPLO 1 Construção e a Análise In Vitro de Mutantes de Inserção e Deleção em scpA49 e scpA6 a) Cepas Bacterianas e Condições de Cultura. Cepa CS 101 de S. pyogenes é um serotipo M49, e cepa (0F+) positiva de opacidade de soro. CS159 ê um isolado clínico com uma deleção que estende-se através do agrupamento de genes M e scpA. Um derivado resistente à estreptomicina, espontâneo de cepa CS101, denominado CSlOlSm, foi selecionado depositando em placa estreptococos de uma cultura de fase estacionária em agar - sangue-triptose contendo estreptomicina (200 pg / ml) . Cepas CS210 e CS463 estreptocócicas são derivados espontâneos resistentes a estreptomicina, de OF+, classe II, serotipo M2, e cepas Mil, respectivamente. Cepas estreptocócicas 90-131 e UAB200 são derivados espontâneos resistentes a estreptomicina de OF', classe I, serotipo Ml e M6 de isolados humanos de estreptococos do grupo A, respectivamente. CS101: :pG+host5 é cepa CS101 com pG+host5 integrado no cromossoma em um local desconhecido, mas externo a scpA e a agrupamento de gene emm. Cepa ER1821 de Escherichia coli (de New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) foi usada como o recipiente para o vetor suicida, plasmídeo pG+host5. Plasmídeo pG+host5 foi obtido de Appligene, Inc. Pleasanton, CA. Estreptococos foram cultivados em caldo Todd- Hewitt suplementado com 2% de neopeptona ou 1% de extrato de levedura, ou em placas de agar triptose com 5% de sangue de ovelha. Cepa ER1821 de E. coli contendo plasmídeo pG+host5 foi cultivada em caldo LB com eritromicina (3 00 μg/ ml) . Estreptococos com plasmídeo pG+host5 foram cultivados em caldo Todd- Hewitt com 1% de extrato de levedura (THY) contendo 1 \xqf ml de eritromicina (Erm) . SCP refere-se a peptidase C5a de estreptocócica β-hemolítica, SC0A1, SCPA12, SCPA49, SCPA46 são as peptidases específicas de cepas de serotipo Μ 1, 12, 49 e 6 de Streptococcus do grupo A, respectivamente. 0 termo scpA refere-se ao gene codificando SCP de estreptococos do grupo A. ScpAl, scpA12, scpAG e scpA49 são os genes codificando as peptidases SCPA1, SCPA12, SCPA49 e SCPA6. SCPB e scpB referem-se â peptidase e gene de estreptococos do grupo B. As sequências de aminoácidos para SCPA4 9 (SEQ ID NO: 1) , SCPA12 (SEQ ID NO: 2), SCPA1 (SEQ ID NO: 23) e SCPB (SEQ ID NO: 3) são dadas na figura 2. b) Construção do Mutante de Inserção de scpA49. Mutantes de inserção de scpA49 bem definidos foram construídos usando processos de inserção de plasmídeo e de substituição de gene. Um fragmento BglIII - BamHI de scpA49 interno, o alvo de inserção, foi ligado no vetor shuttle termossensível pG+host5 para formar o plasmídeo pG::scpA1.2 e transformado em ER1821 de E. coli (figura 3) . O vetor de pG+host5 contém uma origem de replicação de E. coli que é ativa a 39°C, uma origem de replicação gram positiva sensível a temperatura (ativa a 30 °C e inativa a 39°C em estreptococos), e um gene de resistência a eritromicina para seleção. Temperatura alta força o plasmídeo a integrar no DNA cromossômico de estreptococos do grupo A por recombinante homólogo em frequências na faixa de 10~2 a 10'3. pG::scpAl.2 de DNA de plasmídeo recombinante foi eletroporado em células recipientes CS101. Transformantes foram selecionados em placas de agar THY contendo 1 μg/ml de eritromicina a 30°C. Integrantes cromossômicos que resultaram de recombinação entre o inserto de plasmídeo e o scpA49 cromossômico foram selecionados por resistência a eritromicina a 39 °C. Dois mutantes de inserção, M14 e M16, foram analisados. Reversores EmrS de M14 e M16 na cepa foram obtidos por passagem em THY sem antibiótico, a 30 °C e, finalmente, depositados em placas a 3 7 °C sem seleção de Erm. Colônias que perderam o plasmídeo foram isoladas para confirmar que o fenõtipo mutante resultou de inserção do plasmídeo em scpA49, em vez de uma mutação não relacionada simultânea. c) Construção dos Mutantes de Inserção de scpA6. 0 mutante de inserção de scpA6, AK1.4, foi construído como descrito na seção (b) acima. DNA de plasmídeo recombinante, pG::scpAl.2, contém um fragmento BglII - HindIII interno do gene scpA. Este plasmídeo foi eletroporado em células recipientes UAB200 e transformantes foram selecionados em placas de agar THY contendo eritromicina a 30°C. Um integrante cromossômico de pG::scpA1.2, cepa AK1.4, que resultou de recombinação entre o inserto de plasmídeo e o scpA6 cromossômico foi selecionado por cultura em meio agar contendo eritromicina a 39eC. Inserção em scpA6 foi confirmada por Southern blotting usando scpA como a sonda, e PCR usando um iniciador universal de M13 (5'- GTAAAACGACGGCCAGT-3' ) (SEQ ID NO: 6), específico para o plasmídeo, e um iniciador For835 de scpA (5'- AAGGACGACACATTGCGTA- 3') (SEQ ID NO: 7), específico para o scpA cromossômico de GAS. d) Introdução de uma Deleção Definida em scpA (figura 3) . Uma cepa mutante com uma deleção interna definida em scpA49 foi construída para eliminar a possibilidade de que inserções em scpA49 possam ser polares e reduzir expressão de genes a jusante, genes desconhecidos que também podem contribuir para a virulência do organismo. Primeiro, uma deleção definida no fragmento BglII- HindIII de scpA foi produzido por PCR interno com iniciador 1 (5'- GGGGGGGAATTCGTAGCGGGTATCATGGGAC- 3' ) , SEQ ID NO: 4, e iniciador 2 (5'- GGGGGGGAATTCGGGTGCTGCAATATCTGGC- 3' ) , SEQ ID NO: 5. Nucleotídeos sublinhados correspondem a sequências de scpA com 2398 e 2322 coordenadas, respectivamente, e os nucleotídeos em negrito correspondem a um sítio de reconhecimento EcoRI. Os iniciadores foram selecionados para produzir deleção no quadro no gene scpA. Estes iniciadores copiam DNA de plasmídeo em direções opostas e definem os limites da deleção. Innis, M.A. et al., eds., PCR Protocole A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990). DNA do plasmídeo pG::scpA1.2 foi usado como gabarito. 0 produto amplificado foi digerido com EcoRl e ligado ao plasmídeo pG+host5. O plasmídeo pG::AscpAl.l continha uma deleção de 76 bp interna a scpA. Esta deleção no quadro removeu 25 aminoácidos, incluindo a serina que faz parte do centro catalítico previsto de proteases serina. Chen. C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a Peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). Um sítio EcoRV foi criado no ponto de deleção. DNA que sobrepõe a deleção foi sequenciado para confirmar os limites da deleção. O plasmídeo pG: -. AscpAl. 1, que contém a deleção, foi transformado em ER1821 de E. coli. Colônias foram selecionadas de ErmR e então tríadas para a deleção de scpA apropriada usando miniprep de DNA de plasmídeo restrita por EcoRl. Os limites precisos da deleção foram confirmados por sequenciamento de DNA. Plasmídeo pG::AscpAl.l foi eletroporado na cepa CSlOlSm como descrito acima, depois integrantes foram selecionados por cultura em Erm a 39°C. Integração do plasmídeo no cromossoma da cepa CSlOlsm de M49 usando seleção em alta temperatura. O local da inserção foi confirmado por PCR. Cultura de CSlOlsm (pG::scpAl.1) em baixa temperatura, sem seleção de eritromicina, resultou em segregação em alta frequência de reversores de ErmS que perderam o plasmídeo por evento de deleção aleatória ou por excisão devido a recombinação entre as sequências de scpA duplicadas criadas pela inserção. Dois mutantes de deleção foram identificados, MJ2-5 e MJ3-15, e foram ainda estudados. A deleção cromossômica deixada por excisão recombinacional do plasmídeo pG::AscpAl.l foi definida por PCR e hibridização Southern em DNA digerido com EcoRV. e) Efeitos In Vitro de Mutações em SCP. 0 impacto de inserções e deleções na expressão de atividade de peptidase e antígeno SCP foi avaliado por Western blot e testes de aderência de PMNs. Estreptococos foram incubados em 100 ml de THY a 37°C durante a noite. A pelota da cultura foi lavada duas vezes em 5 ml de acetato de Na 0,2 M frio (pH 5,2) , depois colocada em suspensão em 1 ml de tampão de TE- sacarose (20% de sacarose Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0) e 4 0 μΐ de mutanolisína. A mistura foi girada a 37°C durante 2 h, depois centrifugada durante 5 min a 4500 rpm. Sobrenadantes continham inibidor de protease, sulfonil fluoreto de fenilmetila 100 mM (PMSF). Processos de eletroforese e Western blotting foram realizados como descrito em Laemmli, U.K., "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4," Nature 227:680-685 (1970). 0 anti- soro primário usado para detectar proteína SCP em Western blots e de colônias foi preparado por imunização de um coelho com proteína SCP recombinante. Ligação foi detectada por conjugado fosfatase alcalina anticorpo anti- coelho.

Atividade de peptidase C5a foi medida usando um teste de aderência de PMN. Booth, S.A. et al. , "Dapsone suppresses integrin- mediated neutrophil adherence function," J. Invest. Dermatol. 98:135-140 (1992). Após incubação de C5a (Sigma, St. Louis, MO) com extratos estreptocócicos ou protease purificada, C5a residual pode ativar PMNs para tornar os mesmos aderentes a reservatórios revestidos com BSA. Primeiramente, reservatórios de microtitulação foram revestidos com 0,5% de BSA em PBS e incubados durante 1 h a 37°c. PMNs humanos foram isolados por centrifugação em Ficoll Hypaque (Sigma, St. Louis, MO) . 40 μΐ de extratos de estreptococos intactos ou de proteínas foram incubados com 20 μΐ de C5a 5 μΜ em 340 μΐ de PBS com 1% de glucose e 0,1% de CaCla a 3 7 °C durante 4 5 min. Reservatórios revestidos com BSA foram lavados com PBS, e PMNs recolocados em suspensão e CSa residual foram adicionados aos reservatórios. A mistura foi incubada durante 45 min a 37 °C em 7% de C02. Finalmente, os reservatórios lavados para remover PMNs não aderentes. PMNs aderentes foram coloridos com violeta cristal e o OD570nra foi lido em uma leitora ELISA. A densidade ótica é proporcional à quantidade de C5a residual ou inversamente proporcional à quantidade de atividade de SCP.

Extratos de mutanolisina de proteínas de superfície de células de culturas parentais e de mutantes foram analisados por Western blot usando soro específico de SCPA. Mutantes foram confirmados como desprovidos de SCPA. Extratos de mutantes SCPA- AK1.4 e MJ3-15 não reagem com soro anti- SCPA. Proteínas SCPA do tamanho esperado foram observadas nos extratos de cepas CS101 e UAB200 do tipo selvagem. Falha de cepas AK1.4 e MJ3-15 mutantes na produção de atividade de peptidase CSa foi verificada comparando sua capacidade de destruir rhC5a. Exposição de PMNs isolados a rhC5a induziu os mesmos a tornarem-se aderentes a reservatórios de microtitulação revestidos com BSA. Incubação com estreptococos e SCPA purificado clivou especificamente rhC5a e alterou seu potencial para ativar PMNs. PMNs que respondem a rhCSa residual e ligam-se a reservatórios revestidos com BSA foram coloridos, depois medidos espectrofotornetricamente. Incubação de rhC5a com culturas parentais UAB200 e CS101 destruiu rhC5a, que inibiu aderência de PMN em 58,8% e 54,5%, respectivamente. Em contraste, mutantes SCPA, AK1.4 e MJ3-15 não alteraram rhC5a ou aderência de PMNs a reservatórios revestidos com BSA (tabela 1) . Esta experiência confirmou os Western blots e demonstrou as culturas de SCPA em que faltam outras proteases que podem degradar rhCSa. TABELA 1 Teste de Fagocitose e Teste de Aderência de PMN de Cepas Mutantes e do Tipo Selvagem * Inibição percentual = [ (OD570nm de PMNs ativados por C5a sozinho - OD57onm PMNs ativados por C5a pré- incubado com bactérias / ODs7onm de PMNs ativados por C5a sozinho) ] x 100%.

Apesar de não se esperar que expressão de proteína M seja influenciada por mutação em scpA, testes foram realizados para avaliar se estreptococos mutantes SCPA-ainda expressavam proteína M e tinham a capacidade de resistir a fagocitose. Cultivo de estreptococos em sangue humano novo durante 3 h de incubação é indicativo de proteína M anti- fagocítica em sua superfície. R.C. Lancefield, "Differentiation of Group A Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericide Teste," J. Exp. Med., 106, pp. 525-685 (1957). Como esperado, estreptococos parentais UAB200 e CS101 aumentaram 40 e 49 vezes, respectivamente {tabela 1). As culturas de SCPA' de M+, cepas AK1,4 e MJ3-15, aumentaram 37,5 e 14 vezes, respectivamente, confirmando que mutações scpA tiveram pequeno efeito sobre expressão de proteína M ou resistência a fagocitose no sangue humano total. A cultura um tanto mais fraca de ambas as cepas mutantes no sangue girado foi reprodutível e inesperada. As taxas de crescimento de culturas mutantes e parentais em plasma humano foram indistinguíveis. É possível que inativação de SCPA permita que C5a acumule-se no sangue girado que por sua vez ativou PMNs. PMNs ativos são mais fagocíticos e mais capazes de exterminar estreptococos M+. Extratos de proteína de superfície contêm antígeno M6 e M49 quando analisados por Western blot usando anti- soros anti- M49 e anti- M6, confirmando que mutações em SCPA não alteraram expressão de proteína M. EXEMPLO 2 SCP Retarda Recrutamento de Fagôcitos e Depuração de Estreptococos de Sítios Subdérmicos de Infecção. A fim de verificar qual SCP foi responsável pela inativação de C5a, os mutantes de inserção e deleção de scpA49 foram construídos como descrito no Exemplo 1 acima e testados para atividade. Quando inserções ou deleções foram introduzidas em scpA49, a variante SCP não foi capaz de destruir aderência de PMNs ativada por C5a em placas de microtítulo. 0 impacto de mutações em scpA49 sobre virulência foi testado usando um modelo animal onde estreptococos permaneceram localizados, e onde o influxo de células inflamatõrias pode ser analisado. Para testar a hipótese de que SCP funciona muito prematura para retardar depuração inicial do organismo, o fato de estreptococos SCP+ e SCP~ em apenas 4 h após inoculação em sáculos de ar de tecido conectivo foi comparado. Além disso, a disseminação de estreptococos em gânglios linfáticos e baços apôs este curto período de infecção também foi avaliada.

Camundongos sem raça do sexo masculino CD1 (25 g) obtidos de Charles River Breeding Laboratory, Wilmington, MA foram usados para todas as experiências. Um sáculo de ar de tecido conectivo foi gerado injetando 0,9 ml de ar e 0,1 ml de estreptococos do grupo A em PBS com uma agulha calibre 25 sob a pele na traseira do camundongo. Em algumas experiências, o pG::host5 CS101 SCP+ foi usado como um controle positivo. Em outras experiências, cepa CSlOlSm foi usada como o controle positivo. Os camundongos foram eutanizados por deslocamento da cervical 4 h após infecção. Onde indicado, todos os quatro gânglios linfãticos inguinais, baço e sãculo de ar foram dissecados dos animais e homogeneizados em PBS. Suspensões de tecidos foram testadas para unidade de formação de colônias viáveis *CFU) em placas de agar com sangue contendo 1 pg/ ml de eritromicina ou 200 pg/ ml de estreptomicina.

Em uma experiência preliminar, sáculos de ar foram fixados em lâminas, coloridos com mancha Wright e examinados microscopicamente. Apesar de contagens de granulócitos por este processo ser insegura, pareceu haver SCP-significativamente menos residual do que estreptococos do tipo selvagem no tecido fixado. Experiências adicionais foram realizadas em uma tentativa de medir esta diferença. Populações de células de sáculos de ar foram preparadas por trituração dos sáculos de ar em PBs e passando-os dispersados através de malha de monofilamento de náilon (TETKO Co. New York).

As células foram pelotizadas por centrifugação 5 min a 300 x g e ressuspensas em 5 x 106/ ml em tampão FACS (solução salina equilibrada de Hank sem vermelho fenol, 0,1% de NaN3, 1,0% de fração V de BSA). Células (1,0 x 106) foram coloridas diretamente com 1 pg de FTIC Mac-1 anti-camundongo ou indiretamente com 1 μ9 de Gr-1 anti-camundongo conjugado com biotina seguido por 1 μ9 de estreptavidina rotulada com fluorescência ou FITC. Anticorpos monoclonais, Mac-1 e Gr-l foram obtidos de Pharmingen, Inc. CA. Células rotuladas foram fixadas em 1,0% de paraformaldeído. Perfis de fluorescência foram gerados usando um fluxocitômetro FAC-Scan e software Consort-32 (Becton Dickínson). PMNs de camundongo foram purificados do sangue total por centrifugação do gradiente de densidade Ficoll Hypaque e usados como um padrão para PMNs definidos em populações misturadas. Para medição de células especificamente rotuladas, a fluorescência média para cada marcador de anticorpo foi determinada e retenções foram fixadas para refletir células intensamente rotuladas. Controles incluíram células não coloridas e células expostas somente a FITC estreptavidina.

Duas experiências foram realizadas. A primeira comparou o mutante Ml6 de inserção de scpA49 à sua cultura parental de SCP+, cepa CS101. A segunda comparou o mutante MJ3-15 de deleção de scpA4, à sua cepa CSlOlSm parental (Tabela 2) . Em ambas as experiências, sãculos de ar homogeneizados de camundongos inoculados com estreptococos SCP~ continham poucos números de estreptococos após 4 h do que sáculos de ar inoculados com estreptococos do tipo selvagem. A primeira experiência mostrou uma redução duas vezes e a segunda mostrou uma redução de quatro vezes. Estas diferenças foram estatisticamente significativas em P < 0,05 e Ρ < 0,001, respectivamente, usando um t-teste não disposto em pares. Observou-se que estreptococos SCP+ do tipo selvagem foram encontrados em homogenados do baço de 7 de 8 camundongos e de 6 de 8 camundongos; enquanto que os mutantes SCP+ foram raramente encontrados no baço. 0 oposto foi verdadeiro para homogenados de gânglios linfáticos. Gânglios de 10 de 16 camundongos infectados com estreptococos SCP~ abrigaram estreptococos viáveis; enquanto que, somente 4 de 16 gânglios de camundongos infectados com estreptococos do tipo selvagem continham bactérias viáveis. Esta diferença foi determinada ser estatisticamente significativa em P < 0,05 usando o teste exato de Fisher. TABELA 2 Distribuição de Estreptococos SCP+ e SCP~ 4 h após Infecção de Sáculos de Ar. a Cada camundongo foi inoculado com 3 x 10a CFU de estreptococos em fase estacionária. b Diferença na frequência de isolamento de estreptococos SCP+ de baços relativos a estreptococos SCP' foi estatisticamente significativa (P <0,05) para cada experiência pelo teste exato de Fisher. c Diferenças em CFU isoladas de sáculos de ar homogeneizados (média ± SEMs) foram significativas, cepas CSlOlpG (SCP+) e M16 (SCP") e MJ3-15 (SCP') (P < 0,001) para cada experiência pelo teste t não disposto em pares. A depuração mais rápida de estreptococos de sáculos de ar resultou de recrutamento de PMNs mais intenso. A população de células total, a porcentagem de granulócitos positivos em Mac-1 (Springer, G. et al. , "Mac-1: macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody," Eur. J. Immunol. 9: 301- 306 (1979)), e a porcentagem de PMN positivo em Gr-1 (Brummer, E. et al. , "Immunological activation of polymorphonuclear neutrophlis for fungai killing: studies with murine cells and blastomyces dermatitidis in vitro," J. Leuko. Bio. 36: 505- 520 (1984)) em sáculos de ar foram comparados por análise FACS de cor única. Clark, J.M., "A new method for quantification of cell- mediated immunity in the mouse," J. Reticuloendothel. Soc. 25:255-267 (1979) . Resumidamente, em uma análise FACS, células individuais em suspensão são rotuladas com monoanticorpos fluorescentes específicos. Alíquotas de células rotuladas são injetadas em um fluxocitômetro FAC-Scan ou classificador de células fluorescentes que conta células com base em sua fluorescência única. Sáculos de ar infectados com o mutante de deleção SCP' continham duas vezes tantas células inflamatórias quantas as inoculadas com estreptococos SCP+ (figura 4) . Um aumento de cem vezes no tamanho do inóculo não altera esta diferença, sáculos de ar infectados com 1 x 106 células SCP' , cepa MJ3-15, continham três vezes mais células positivas de Gr-1 do que os inoculados com a cultura de SCP+. Em sáculos de ar inoculados com estreptococos SCP+, aproximadamente 6% das células eram PMNs e 21% eram outros tipos de granulócitos Mac-1+, incluindo PMNs. Em contraste, sáculos de ar inoculados com estreptococos SCP' continham predominantemente PMNs. Células positivas de Gr-1 foram iguais a ou maiores do que o número de células positivas de Mac-1. Retenções com fluxocitômeros foram fixadas para medir somente granulócitos de alta coloração. Os restantes 70- 80% de células não coloridas com nenhum anticorpo foram provavelmente tanto granulócitos com baixa coloração, células do sangue vermelho ou linfócitos. Números grandes de linfócitos foram observados microscopicamente em preparações de sáculos de ar coloridos de Wrights.

Colônias de SCP+ de estreptococos que emergiram de homogenados de baço foram altamente encapsuladas, assemelhando-se a gotas de água. Em contraste, as poucas colônias de SCP' aumentando de gânglios linfáticos foram mais semelhantes a inóculo. Elas eram misturas de colônias não mucóides e moderamente mucóides. Estes dados sugerem que estreptococos encapsulados com M+SCP+ podem adaptar, multiplicar e invadir a corrente sangüínea em 4 h após infecção. A base para trânsito diferencial de estreptococos mutantes e do tipo selvagem pode ser devido ao influxo mais vigoroso de células fagocíticas em resposta a bactérias SCP' . Macrófagos e/ou células dendríticas da pele podem engolir mais rapidamente estreptococos SCP e liberar os mesmos em gânglios linfãticos. Redução de estreptococos mutantes relativa ao tipo selvagem é uma descoberta inesperada, porque estreptococos SCP' são M+ e resistentes a fagocitose por neutrófilos humanos in vivo. EXEMPLO 3 SCP ê Requerido para Colonização da Nasofaringe de Camundongos Camundongos foram inoculados intranasalmente para avaliar a capacidade relativa de estreptococos SCP" e do tipo selvagem (SCP+) para colonizar a nasofaringe. Cepa CS101 de M49 resistente a estreptomicina e mutante de deleção MJ3-15 foram usados nestas experiências. As culturas não foram aprovadas para camundongos de modo a impedir seleção de variantes que podem ser unicamente virulentas em camundongo, mas não mais dependem da proteína M e/ou SCP para persistência no animal.

Culturas de dezesseis horas de cepas estreptocócicas de desafio (1 x 10® 9 x 10® CFU) , cultivadas em caldo Todd- Hewitt contendo 20% de soro de coelho normal e recolocadas em suspensão em 10 μΐ de PBS, foram administradas intranasalmente em CD1 do sexo feminino com 25 g (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA) ou camundongos BALB/c (Sasco, Omaha, NE) . Contagens viáveis foram determinadas depositando em placa diluições de cultura em placas de agar com sangue. Esfregaços da garganta foram tomados diariamente de camundongos anestesiados durante 6 a 10 dias após inoculação e riscados em placas de agar com sangue contendo 200 μg/ ml de estreptomicina. Após incubação durante a noite a 3?0C, o número de colônias β- hemolíticas nas placas foram contadas. Todas as cepas de desafio foram marcadas por resistência a estreptomicina para distinguir as mesmas de bactérias β-hemolíticas que podem persistir na flora normal. Esfregaços da garganta foram cultivados em agar com sangue contendo estreptomicina. A presença de uma colônia β- hemolítica foi tomada como uma positivos para cultura.

Camundongos sem raça CD1 foram inoculados intranasalmente com 2 x 108 CFU em fase estacionária. As nasofaringes de camundongos anestesiados foram esfregadas diariamente durante 8 a 10 dias e riscadas em agar com sangue contendo estreptomicina. Diferenças entre SCP+ e SCP" foram evidentes no dia 1, no entanto, diferenças estatisticamente significativas não foram observadas até os dias 3 e 4 figura 5). No dia quatro, 9/18 de camundongos infeccionados com estreptococos M+SCP+ produziram culturas de garganta positivas, enquanto somente 2/18 de camundongos infectados com cepa M+SCP+ retiveram estreptococos em suas gargantas. Quatro de 18 de camundongos morreram de infecção com estreptococos SCP+. Nenhum dos camundongos após infecção com bactérias SCP' sucumbiu à infecção. Os números de colônias nas placas de agar com sangue também foram consistentes com depuração mais rápida de estreptococos SCP" Por exemplo, nas culturas do terceiro dia de sete camundongos continham > 100 SCP+ CFU, enquanto que, somente um camundongo inoculado com estreptococos SCP' continha > 100 CFU.

Devido aos estreptococos M4 9 serem mais frequentemente associados com infecções da pele, as experiências acima foram repetidas com uma cepa M6, um serotipo mais frequentemente associado com infecções da garganta. Um mutante de inserção, cepa AK1.4, foi construído usando a cepa UAB200 M6 e a estratégia anteriormente descrita no exemplo 1. Cepa AK1.4 também foi depurada mais rapidamente do que cultura de M6 do tipo selvagem da nasofaringe. (Figura 6). As experiências acima confirmam que estreptococos do grupo A são dependentes de SCP para persistência na nasofaringe do camundongo. Todas as variantes de SCP" usadas nas experiências acima foram M+, isto é, elas resistiram a fagocitose em sangue humano novo. Ainda, elas foram depuradas da mucosa nasofaringeal. EXEMPLO 4 Imunização Intranasal de Camundongos com SCPA49 Recombinante Purificado Colonização de Blocos Após Desafio Intranasal a) Construção de Vacina ASCPA49 Recombinante Codificando Thr63 até His1031 (Figuras 2 e 7) .

Um fragmento PCR que corresponde a uma forma truncada do gene scpA49 foi clonado de estreptococos do grupo A M49 CS101 (ASCPA49) . Este fragmento foi amplificado por PCR usando um iniciador dianteiro começando no nucleotídeo 1033 e um iniciador reverso começando no nucleotídeo 3941 (numeração correspondente à de Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a Peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol, Chem., 265:3161-3167 (1990)). 0 fragmento foi ligado ao sítio de ligação de trombina do gene glutationa transferase no vetor de alta expressão pGex-4T-l de Pharmacia Inc. O plasmídeo contendo o fragmento de scpA recombinante, designado pJC6, foi depositado no American Type Culture Collection, Rockville, MD, sob a provisão do Tratado de Budapeste, e designado o número de acesso 98225 ATCC. 0 ASCPA49, um fragmento de 2908 bp de scpA4 9, foi amplificado por PCR usando um iniciador dianteiro de scpA49 contendo uma sequência de reconhecimento de BamHI (5'-CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC -3') (SEQ ID NO: 8) e um iniciador reverso de scpA (5'- GAGTGGCCCTCCAATAGC -3') (SEQ ID NO: 9) . Sequências que codificam o peptídeo de sinal e regiões âncora de membrana da proteína SCPA foram deletadas do produto PCR resultante. Produtos PCR foram digeridos com BamHI e ligados a sítios de restrição BamHI e Smal no sítio de reconhecimento de trombina do gene glutationa S-transferase no vetor de alta expressão pGEX-4T-l de Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ) . O plasmídeo recombinante foi transformado em DH5tx de E. coli. A proteína de fusão ASCPA49 de um transformante, E. coli (pJC6) , foi purificada por cromatograf ia de afinidade em uma coluna 4B de glutationa Sepharose. A proteína de fusão transferase - SCP de um clone de E. coli foi expressada e purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna 4b de glutationa Sepharose. Todos os processos são descritos pelo fabricante (Pharmacia}. O ASCPA49 foi clivado da proteína híbrida por digestão de trombina. A trombina foi removida de SCP eluído por cromatografia, em uma coluna 6B de benzamidina Sepharose (Pharmacia) . Após digestão com trombina, trombina foi removida por cromatograf ia em uma coluna 6B de benzamidina Sepharose. Processos de expressão e purificação são descritos pelo fabricante. Confirmou-se que a proteína purificada por afinidade é ASCPA49 puro por SDS- PAGE e por Western blot. À proteína ASCPA49 truncada, purificada por afinidade faltou atividade de peptidase quando testada pelo teste de aderência de PMN (descrito no exemplo 1 acima) . Anti- soro hiperimune, dirigido contra ASCPA49 purificado foi preparada em coelhos. b) Imunização e Protocolo de Desafio. Camundongos do sexo feminino CD1, sem raça, de quatro semanas de idade foram imunizados por administração de 2 0 pg de ASCPA4 9 purificado por afinidade em 10 μΐ de PBS em cada narina. Camundongos foram imunizados 3 vezes em dias alternados e reforçados novamente três semanas após a terceira imunização. Após descansar duas semanas, os camundongos foram novamente reforçados. D. Bessen et al. , "Influence of Intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to Conserved Epitopes of M Protein on Mucosal Colonization by Group A Streptococci," Infect. Immun., 56, pp. 2666-2672 (1988). Camundongos de controle receberam somente PBS. Antes da infecção, todos os camundongos que foram imunizados com proteína ASCPA49 foram determinados por ELISA ter altos títulos de anticorpos contra antígeno ASCPA49 em seu soro e saliva. Estreptococos do grupo A, cepa CS101 (2,0 x 10® CFU) , CS210 (3,6 x 108 CFU) , CS463 (7,8 X 108 CFU), 90-131 (3,4 x 108 CFU) e UAB200 (9,6 x 108 CFU) foram usados para desafiar intranasalmente os camundongos 7 dias após o último reforço da vacina. Estudos dos animais foram realizados de acordo com orientações do National Institutes of Health. c) Coleta de Amostras e ELISA. Amostras de sangue e de saliva foram coletadas de camundongos anestesiados após imunização. Todos os soros foram testados para a presença de anticorpos SCPA49 por ELISA, como descrito anteriormente. S.P. 0'Connor et al., "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase," J. Infect. Pis, 163, pp. 109-116 (1990). Proteína SCPA49 purificada foi ligada a reservatórios de microtítulo por adição de 500 ng de proteína purificada em tampão de bicarbonato 0,05M (pH 9,6). Após incubação durante a noite a 4°C, os reservatórios foram lavados, depois bloqueados com 0,5% de BSA em PBS durante 1 h. Salivação foi estimulada em camundongos por injeção de 100 μΐ de uma solução de pilocarpina a 0,1% (Sigma) subcutaneamente. Amostras de saliva foram coletadas e giradas a 14.000 rpm, durante 5 min, em uma microcentrífuga Eppendorf. Os sobrenadantes foram testados para a presença de IgA secretório contra proteína ASCPA49 por ELISA. Títulos de ELISA representam a diluição mais alta de saliva e soro individuais que tinha OD40s ^ 0,1. d) Avaliação da Resposta de Anticorpo a ASCPA49. A imunogenicidade da subunidade da vacina ASCPA49 foi avaliada. Coelhos foram imunizados com ASCPA49 purificado. Os coelhos desenvolveram níveis altos de anticorpos contra proteína ASCPA49, como determinado por ELISA. Apesar do imunogene ASCPA49 purificado ser desprovido de atividade funcional, anti- soro de coelho hiperimune pode neutralizar a atividade de peptidase de enzima SCPA49 do tipo selvagem in vitro. Além disso, anti- soro de coelhos não diluído contra a proteína ASCPA49 foi capaz de neutralizar atividade de peptidase C5a associada com serotipos diferentes (figura 8) . Atividade de peptidase C5a associada com estreptococos Ml, M6 e M12 foi inibida por este anti- soro, confirmando que anticorpo contra proteína ÁSCPA49 é desprovido de especificidade de serotipo.

Também, amostras de soro e de saliva foram obtidas de dez camundongos imunizados e dez de controle para avaliar a imunogenicidade da proteína ASCPA49 quando administrada pela via intranasal sem adjuvantes. Camundongos que foram imunizados com proteína ASCPA49 purificada desenvolveram altos títulos de IgG específico de ÁSCPA49 em seus soros, comparado a camundongos de controle imunizados com PBS (figura 9) . Títulos de soro IgG dirigidos contra ASCPA49 estavam na faixa de 1:10.240 a 1:20.480. Em contraste, título IgG específico de ASCPA49 de camundongos de controle não foi detectãvel no soro. Camundongos imunizados com proteína ASCPA49 purificada também mostraram um aumento significativo em slgA salivar específico de ASCPA49 relativo a camundongos de controle. Títulos IgA específicos em saliva de camundongos imunizados foram maiores do que 1:16. Em contraste, slgA dirigido contra ASCPA49 na saliva de camundongos de controle não foi detectãvel. A concentração relativa de IgG e slgA em soro diluído 1/2560 e saliva diluída 1/2, respectivamente, é mostrada na figura 9. Estes resultados demonstram que proteína ASCPA49 purificada é um imunogene eficaz para a indução de respostas de anticorpos secretórios e sistêmicos específicas em camundongos quando administrado intranasalmente. e) Impacto de Vacina ASCPA49 na Depuração de Estreptococos de Camundongos Infectados.

Experiências foram realizadas para determinar se imunização com a peptidase C5a pode melhorar depuração de estreptococos de nasofaringe. Ambos soros humanos e de coelhos hiperimunes que contêm altos níveis de anticorpo anti- SCPA podem neutralizar atividade de SCPA in vitro. S.P. 0'Connor et al. , "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase," J. Infect. Pis., 163, pp. 109-116 (1990) . O fato de que SCPA facilita significativamente colonização da mucosa oral sugere que imunização de camundongos com ASCPA49 purificado pode reduzir a capacidade de estreptococos colonizarem a nasofaringe. Camundongos foram imunizados intranasalmente com SCPA geneticamente inativado, purificado por afinidade para testar esta possibilidade. A proteína truncada, ASCPA49, foi administrada intranasalmente sem adjuvantes ou veículos. Colonização faringeal de camundongos vacinados por estreptococos SCPA+ M+ do tipo selvagem diferiu significativamente dos imunizados com PBS em três experiências independentes usando camundongos vacinados com duas preparações diferentes de proteína ASCPA49 (TABELAS 3 e 4; figura 10). Somente um de 13 camundongos imunizados com proteína ASCPA49 foi cultivado positivo para estreptococos dez dias após inoculação (tabela 4; figura 10). Em contraste, 30-58% dos controles não vacinados permaneceram positivos para cultura durante seis dias, e alguns foram ainda positivos dez dias após infecção. Os números de colônias resistentes a estreptomicina, β- hemolíticas, em placas de agar com sangue também, mostraram uma diferença significativa entre camundongos de controle e vacinados com ASCPA49. Conjuntos diferentes de camundongos imunizados depuraram estreptococos serotipo M4 9 significativamente mais rapidamente de suas nasofaringes do que controle não-imuni zado. TABELA 3 Culturas da Garganta para Estreptococos Após Desafio Intranasal de Camundongos Vacinados Intranasalmente com PBS ou SCP Expressados em DH5a de E. coli (CFU após vacina) Dias após Desafio Camundongo 1_2 3__4__5_6 7__8__9 10 PBSCT-II 1 oooooooooo 2 3000000000 3 77 >200 150 4 11 3 0 51 97 53 4 9 >200 >200 3 11 3 0 0 0 0 ___5___oooooooooo 6 4 6 45 47 3 >200 29 >200 83 70 7 15 194 >200 9 172 10 5 3 0 Ο 8 0000000000 9 0 32 44000000 10 2000000000 Continuação da TABELA 3 Camundongo 1_2 3__4__5___6___7___8___9 10 11 3000000000 12 0000000000 13 127 400000000 N° de 8655442322 Positivos SCPAD-II 1 0000000000 2 0000000000 3 0000000000 4 0000000000 5 35 000000000 6 0000000000 7 0000000000 8 0000000000 9 0000000000 10 0000000000 11 000 21 000000 12 0000000000 13 0000000000 N° de_____________________________1001000000 Positivos____________ TABELA 4 Culturas da Garganta para Estreptococos Após Desafio Intranasal de Camundongos Vacinados Intranasalmente com PBS ou SCP Expressados em DH5oc de E. coli (CFU apôs vacina) Dias após Desafio Camundongo* 1 2____3____4____5____6____7____8____9 10 PBSCT-I 1 112 143 85 16 0 0 0 0 0 0 2 127 27 18 89 3 7 7 7 70 3 3 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 108 >200 66 4 31 200 42000000 5 4003300000 6 0000000000 7 >200 >200 120 125 91 145 >200 >200 >200 166 8 2000000000 9 0000000000 10 0000000000 11 37 >200 194 16 >200 47 >200 101 >200 >200 N° de 8667544444 Positivos SCPAD-I 1 6000000000 2 105 41 00000000 3 0000000000 4 2000000000 5 2000000000 6 90 11 0000000 7 0000000000 8 26 000000000 Continuação da TABELA 4 Dias após Desafio Camundongo* 1_2__3_4_5_6__7_8_9 10 9 0 19 0 0 5 57 0 0 21 91 10 0000000000 11 7000000000 N° de 7210110011 Positivos_ __________________ * Camundongos foram inoculados duas vezes, porque a dosagem de bactérias foi muito baixa na primeira inoculação.

Por último, foi examinado se SCP de um serotipo pode vacinar animais contra infecção de outros serotipos. Existem mais do que 80 serotipos diferentes de estreptococos do grupo A. Uma vacina eficaz deve evitar infecção em mais de um serotipo estreptocócico. Proteção cruzada foi produzida contra colonização pelos serotipos OF+ M2 e Mil estreptocócicos e os serotipos OF" Ml e M6. O fato de que soro de coelho dirigido contra proteína ASCPA49 de estreptococos serotipo M49 neutralizou atividade de peptidase associada com vários serotipos sugeriu que imunização intranasal com uma vacina de subunidade única pode reduzir ou eliminar colonização faríngica por estes serotipos. Para explorar esta possibilidade, quatro grupos de vinte camundongos foram imunizados por inoculação intranasal com proteína ASCPA49 purificada por afinidade como acima descrito. Camundongos de controle receberam PBS. Antes de serem desafiados com estreptococos, amostras de soro e de saliva de camundongos de controle e imunizados, escolhidos aleatoriamente foram testadas para anticorpo anti- SCPA. Todos os camundongos imunizados testados desenvolveram uma resposta de anticorpo salivar mensurável e de soro forte. Colonização faríngica de camundongos imunizados com proteína ASCPA49 por cepas de todos os quatro serotipos foi reduzida com relação a controles não imunizados. As diferenças foram mais significativas nos dias 3 e 5 após inoculação (tabela 5). TABELA 5 Proteção Imune é Independente de Serotipo + significa camundongos positivos em cultura. * Diferenças entre camundongos imunizados e não imunizados são estatisticamente significativas (P < 0,05). Valores P foram calculados por análise x2.

Diferenças estatisticamente significantes foram observadas entre camundongos imunizados e de controle inoculados com cepas de serotipos M2, Mil e Ml. No entanto, os serotipos 0F+ M2 e Mil foram mais eficazmente eliminados por camundongos imunizados do que as cepas OF', Ml e M6. Colonização estreptocócica de Ml de camundongos imunizados foi reduzida significativamente com relação a camundongos de controle. Somente 10,5% dos camundongos imunizados foram positivos para cultura no dia 5 pós-infecção. Em contraste, 37% dos camundongos de controle foram positivos para cultura com esta cepa. Apesar de camundongos imunizados parecerem depurar estreptococos M6 mais rapidamente, as diferenças não foram estatisticamente significativas. Como nas experiências anteriores, o número de colônias estreptocócicas β-hemolíticas em placas de agar com sangue foi significati-vamente menor em amostras tomadas de camundongos vacinados do que nas tomadas de animais de controle. Assim, a proteína ASCPA49 foi uma vacina eficaz que deu proteção cruzada contra outros serotipos estreptocócicos. EXEMPLO 5 Mutagênese de SCPA49 dirigida ao sítio Serotipos estreptocócicos do grupo A podem ser divididos em dois grupos maiores, cepas 0F+ e OF'. As últimas são mais frequentemente associadas com febre reumática e choque tóxico, enquanto cepas 0F+ são uma causa comum de impetigo e glomerulonefrite aguda. Apesar de proteínas SCPA destes grupos serem 95-98% idênticas, é possível que a resposta imune nas mesmas podem ser um pouco diferente. Isto diz respeito a esforços feitos para desenvolver SCPAs variantes definidas de uma cepa OF" Ml e de uma cepa 0F+ M4 9 em paralelo. Aminoãcidos que são requeridos para atividade catalítica foram substituídos com os que se espera inativar a enzima (figura 1). Os limites de aminoãcido C e N- terminais de SCPA49, expressados os subclones pGEX-4T-l, foram Asn32 e His1139, respectivamente (figuras 1 e 8). Ser512 (SCPA49S512A) , Asn295 (SCPA49N295A) e Asp130 (SCPA49N295R) na proteína SCPA49 foram substituídos com Ala, e Asn295 (SCPA49N295R) foi substituído por Arg (Deborah Stafslien, M.S. Thesis, Universidade de Minnesota). O processo usado para introduzir mutações no gene scpA49 da cepa CS101 de estreptococos foi o processo "megainiciador" de mutagênese dirigida ao sítio. Barik, S., "Site directed mutagenesis in vitro megaprimer PCR," em Methods in Molecular Biology, vol. 57: In Vitro Mutagenesis Protocols, Humana Press, Inc. Totowa, NJ (1996). A mutação de serina foi introduzida usando iniciadores scpFor940 (5'-CCCCCCGGATCCAATACTGTGACAGAAGACACTCC -3'), SEQ ID NO: 10, e s cpmut revi883 (5'- TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC- 3'), SEQ ID NO: 11, para amplificar um produto PCR de filamento duplo de 1450 bp. O primeiro produto PCR, "um megainiciador", foi purificado usando o kit de extração de gel Qiagen Qiaquick, depois usado em uma segunda reação PCR assimétrica para amplificar o gene scpA49 de 3,3 kb contendo a mutação desejada. Cinco ciclos de desnaturação (93°C, 1 min) e extensão (72°C, 5 min) foram realizadas antes da adição do iniciador reverso scpRev4263, (3'-CCCCCCCTCGAGATGTAAACGATTT GTATCCTTGTCATTAG -3') SEQ ID NO: 12. Durante o quinto ciclo a 72°C, o iniciador reverso foi adicionado em uma concentração de 1 mM. A amplificação foi concluída usando 25 ciclos a 94 °C durante 1 min, 58 °C durante 2 min e 72 °C durante 2-3,5 min. Concentrações de reagentes foram iguais às descritas na seção anterior, exceto que um iniciador dianteiro não foi adicionado e o megainiciador foi adicionado em uma concentração de 4-6 μg por 100 μΐ de reação. Este processo forneceu proteína variante SCPA49S512A (ver tabela 6 abaixo).

As variantes de aspartato e asparagina foram construídas do mesmo modo, usando os iniciadores reversos SCpmutrev717 (5'- CAGTGATTGATGGTTTTGATAA -3') SEQ ID NO: 13 e scpmutrevl214 (5'- AGCTACTATCAGCACCAG -3') SEQ ID NO: 14 para construir megainiciadores de 311 bp e 805 bp, respectivamente. 0 iniciador scpmutrev717 foi usado para gerar proteína SCPA49D130A variante, e usou-se iniciador scpmutrevl212 para gerar proteína SCPA49N295A variante (ver tabela 6 abaixo). Após purificação com Qiaquick, no entanto, o megainiciador foi tratado com 0,1 U de nuclease de munguba (por 4 μg de DNA) e incubado a 30 °C durante 10 min. A nuclease foi removida por extração com fenol/clorofórmio e o mega iniciador recuperado na fase aquosa por precipitação com etanol. A pelota foi recolocada em suspensão em 80 μΐ de água estéril duplamente destilada e 37 μΐ da mesma foram usados em cada 100 μΐ de reação PCR assimétrica. O gene que sofreu mutação foi então clonado em pGEX 4T-1 como anteriormente descrito. Sequenciamento de variantes foi realizado usando dATP rotulado com 3BS e o kit Sequenase (Stratagene) ou usando sequenciamento de fluorescência automático Na University of Minnesota Microchemical Facility. TABELA 6 Comparação da Sequência de Aminoácidos de Proteínas Variantes SCPA-49 do tipo 127 132 291 297 508 514 876 883 selvagem_____AVI PAG_____TSAGNDS________LSGTSGT_____STLGSRF

SCP S512A49 AVIDAG TSAGNDS LSGTAGT STLGSRF

SCP D130A49 AVIAAG TSAGNDS LSGTSGT STLGSRF

SCP N295A49 AVIDAG TSAGADS LSGTSGT STLGSRF O vetor de expressão pGEX 4T-1 de E. coli foi usado para superexpressar SCPA variante como proteínas de fusão GST. SCPA rcombinante foi purificada de acordo com o protocolo fornecido em GST Gene Fusion System Handbook (Pharmacia) anterior a este trabalho. O antígeno da proteína SCPA foi purificado por cromatografia de afinidade como acima descrito. EXEMPLO 6 Construção de Variantes SCPA1 e SCPB O gene scpAl do tipo selvagem foi amplificado por PCR de serotipo Ml de S. pyogenes (cepa 90-226) do seguinte modo. Iniciadores foram designados de modo que somente um fragmento do gene completo pode ser expressado. Este fragmento corresponde ao início da proteína madura e termina justo antes da parede da célula associar -se ao resíduo dos domínios Asn32 até Asp1038 (figura 2) . 0 iniciador dianteiro 5'- CCCCCCGAATTCATTACTGTG ACAGAAGACACTCCTGC -3' (SEQ ID NO: 15} anela começando na base número 940 (numeração correspondente à de Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the estreptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265: 3161- 3167 (1990) . O iniciador de PCR reverso, oposto, 5'-CCCCCOGGATÇCTTATTGTTCTGGTTTATTAGA GTGGCC -3' (SEQ ID NO: 16) anela na base número 3954 justo a montante de uma região de repetições de DNA. Esta região de repetição da proteína é prevista ser a parte que passa através, e então fixa-se ao peptidoglicano da parede da célula. A região em itálico de cada iniciador é sequência adicional que foi adicionada à sequência de S. pyogenes para possibilitar o processo de clonagem. A região sublinhada do iniciador dianteiro incorpora um sítio de restrição EcoRI, a porção sublinhada do iniciador reverso, um sítio BamHI. O iniciador reverso também incorpora um códon de parada (TAA) no quadro do gene que termina translação. O produto PCR resultante correspondente às bases 940-3954 foi clonado em um vetor intermediário pCR2.1 (Invitrogen, Inc.) e transformado em células ToplOF de E. coli (Invitrogen, Inc.). DNA do plasmídeo de um transformante apropriado foi restringido com EcoRI e BamHI. 0 fragmento de base 3018, contendo o fragmento de scpAl, foi purificado com gel seguindo procedimentos padrão e ligados no vetor de expressão pTrc99a (Pharmacia) restringido com as mesmas enzimas. Esta ligação foi transformada em células DH5a de E. coli e um transformante foi selecionado, o qual continha a construção de plasmídeo desejada. 0 plasmídeo resultante coloca o fragmento PCR de scpAl atrás de uma sequência Shine-Dalgarno e sítio de partida ATG, e está sob o controle transcripcional do promotor trc, que é indutível com o IPTG análogo de alolactose.

Variantes genéticas específicas do sítio de scpAl do tipo selvagem foram construídas seguindo o procedimento descrito por C.L. Fisher e G.K. Pei, "Modification of a PCR-based site- directed mutagenesis method," BioTechniques, 23: 570- 574 (1997) . Os resíduos de aminoácidos apropriados em SCPAl, importantes para atividade de protease, foram previstos por comparações de sequências à família de serina proteases como subtilisina. Siezen, R.J. et al., "Homology modeling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases," Protein Engineering, 4: 719- 737 (1991); Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). Três resíduos, conservados entre esta família, estão envolvidos na formação do sítio ativo. Em SCPA1, estes correspondem a Asp130, His193 e Ser512. Três conjuntos de oligonucleotídeos não em sobreposição foram designados para uso em PCR para alterar cada um dos resíduos de aminoácidos. Estes oligonucleotídeos foram designados para amplificar de modo distante um do outro em filamentos de DNA opostos. Em cada conjunto, a extremidade 5' de um dos iniciadores pode conter o códon codificando um destes aminoãcidos para mutação e este códon pode ser alterado para codificar uma alanina. Estes três conjuntos de iniciadores são listados abaixo; os códons que são mudanças estão em itálico. D130A: Dianteiro (SEQ ID NO: 7) 5' - ATT GCT GCT GGT TTT GAT AAA AAT CAT GAA GCG - 3' Mudança do códon GAT em GCT corresponde a uma mudança do aminoãcido aspartato em alalina.

Reverso (SEQ ID NO: 18) 5'- CAC TGC AAC AAC AGT CCC -3' H193A: Dianteiro (SEQ ID NO: 19) 5' - GAG GCC GGC ACA CAC GTG -3' Mudança do códon CAC em GCC corresponde a uma mudança do aminoãcido histidina em alanina.

Reverso (SEQ ID NO: 20) 5' - TTG ANTICORPOS GAC AGC GGT TTT ACC -3' S512A: Dianteiro (SEQ ID NO: 21) 5'- ACT GCT ATG TCT GCT CCA TTA G-3' Mudança do códon ACT em GCT corresponde a uma mudança do aminoácido serina em alanina.

Reverso (SEQ ID NO: 22) 57 - TCC AGA AAG TTT GGC ATA CTT GTT GTT AGC C

Estes conjuntos de iniciadores PCR foram usados em três reações de aspartato. O DNA padrão foi pLP605, que continha a sequência scpAl do tipo selvagem. Os produtos PCR foram auto-ligados subsequentemente e transformados na cepa ToplOf' de E. coli (Invitrogen, Inc.) . Transformantes foram triados para o tamanho apropriado e padrão de restrição. A mudança na sequência na variante S512A destroi um sítio de restrição Spel único de modo que esta mutação pode ser identificada por análise de restrição. Todas as variantes potenciais foram confirmadas por sequenciamento de DNA. Subsequentemente, a mutação D130A foi combinada com a mutação S512A para formar uma variante dupla utilizando um sítio PstI único entre estas duas regiões da proteína. A alteração final foi mudar a seleção de antibiótico de amplicilina para canamicina movendo os genes scpAl variantes em um vetor pTRC99a anteriormente alterado {Pharmacia, Inc.) contendo o gene de canamicina.

Uma variante da proteína SCPB foi construída usando o processo descrito acima para mutantes de SCPA1. O gene SCPB do tipo selvagem foi clonado de 78 - 471 estreptococos do grupo B (tipo Iia+) . EXEMPLO 7 Análise de Proteínas Variantes Proteínas expressadas de cada uma das construções variantes foram analisadas por eletroforese de gel poliacrilamida SDS. O tamanho esperado da proteína é 121 kD, no entanto, o domínio da extensão de parede de célula rica em prolina no término carbóxi da enzima faz com que a proteína corra levemente mais devagar durante SDS- PAGE. Consequentemente, o peso molecular aparente é 130 kD quando determinado por SDS-PAGE. Uma vez que SCP ativo pode ser prejudicial ao hospedeiro, foi importante que as proteínas variantes fossem desprovidas de atividade enzimãtica. Duas propriedades das proteínas variantes foram avaliadas. As atividades específicas de proteínas variantes e do tipo selvagem, como determinado por teste de aderência de PMN, são comparadas na tabela 7. Estas experiências indicaram que os aminoácidos substituídos reduziram atividade enzimática em mais do que 90%. TABELA 7 Determinação do Teste de Aderência de PMN de Atividade de Protease Variante Proteína Atividade (U/mg*10~3)_____ Tipo Selvagem 170 SCPA49D130A <20 SCPA49N295A <20 SCPA49S512A <20 As proteínas variantes também foram comparadas à proteína do tipo selvagem para sua capacidade de ligar anticorpo dirigido contra a enzima do tipo selvagem. Testes ELISA competitivos foram usados para este fim. ELISAs competitivos mediram a inibição de ligação de anticorpo a antígeno imobilizado por antígeno solúvel. Uma quantidade constante de antígeno do tipo selvagem foi ligada a reservatórios da placa de microtítulo. Uma quantidade constante de anticorpo é adicionada ao mesmo tempo com quantidades variadas de antígeno competitivo solúvel. O declive da inibição percentual versus curvas de concentração de antígeno estimam a afinidade de ligação relativa do antígeno solúvel para anticorpo. Apesar de constantes de ligação não poderem ser calculadas sem conhecer a concentração exata de anti-SCPA no anti-soro, as afinidades de ligação relativas de várias proteínas foram comparadas (figura 11) . Uma vez que declives da inibição percentual versus curvas de concentração são iguais para as proteínas variantes e do tipo selvagem, concluiu-se que substituição de aminoácidos não alterou a capacidade do anticorpo ligar-se às proteínas variantes.

Proteínas SCPA1, SCPA49 e SCPB recombinantes também foram determinadas para ligar igualmente reservatório a anticorpo anti-SCP (figura 12). Nesta experiência o antígeno da placa foi SCPA49 e o anticorpo foi anti-SCPA49 de coelho. As afinidades relativas deste anticorpo para estes antígenos, indicadas pelo declive das curvas são altamente similares. Estes resultados demonstram que proteína SCPA de estreptococos do grupo A OF+ M4 9 e OF' Ml, e de estreptococos do grupo B, são equivalentes com respeito ao reconhecimento do anticorpo e pode ser usada intercambiavelmente em uma preparação de vacina. EXEMPLO 8 Administração Subcutânea (SQ) de Antígeno SCPA Induz Proteção em Camundongos Todos os estudos de proteção anteriores foram realizados administrando proteína SCPA49 purificada por afinidade intranasalmente sem adjuvante. Injeção intramuscular ou SQ de antígenos é historicamente um processo mais aceito preferido de liberação de vacina. Consequentemente, experiências foram realizadas para testar se injeções SQ de SCPA com MPL/alume induziram uma resposta imune protetora e se esta resposta reduziu colonização quando a cepa de desafio de estreptococos do grupo A diferiu em serotipo da fonte da vacina SCPA. A capacidade de camundongos imunizados depurarem estreptococos da mucosa oral- nasal faríngica foi avaliada por cultura da garganta ou por amostragem de tecido nasal dissecado. Dados de cultura da garganta representativos são apresentados na tabela 8. TABELA 8 Vacinação Subcutânea de Camundongos ___Percentual Colonizado c____ Bactériasb Camundongos de Camundongos Vacina3 Desafios Controle Imunizados com _____________________________________________________SCPA_____ SCPA49S512A OF+M49 64% (3) 36% ASCPA49 0F+M4 9 64% (3) 20% ASCPA4 9 0F~M1 33% (5) 8% SCPA1S512A OF'M49 23% (5) 8% a Vacinas continham 10 μg dos antígenos indicados misturados com adjuvantes MPL e alume. Grupos experimentais continham cada um 13-20 camundongos. Camundongos de controle forarr imunizados com toxóide de tétano misturado com o mesmo adjuvante. b Camundongos foram infectados por inoculação intranasal. c Colonização foi avaliada por cultura da garganta. Os números entre parênteses indicam o dia em que as culturas foram tomadas.

Camundongos imunizados por injeção SQ de cada uma de três formas diferentes de proteção moderada induzida por antígeno SCPA. Imunização com ASCPA49 protegeu contra ambas as cepas OF' Ml e 0F+ M4 9. SCPA49S512A e SCPA1S512A foram escolhidos para estudo subsequente.

Persistência de estreptococos após desafio intranasal também foi avaliada por um teste mais quantitativo. Este processo envolveu sacrificar grupos de camundongos em períodos diferentes após infecção, e dissecar tecido nasal (NT), que foi então testado para estreptococos viáveis (CFU) Quantidades padrão de NT foram homogeneizadas em tampão e o número de CFU/ mg de tecido foi determinado por contagem viável.

Três grupos de camundongos foram imunizados SQ com SCPA49S512A, SCPA1S512A ou toxóide de tétano. Todas as vacinas foram misturadas com adjuvantes MPL/alume como acima. Camundongos receberam quatro injeções de 5 μg de antígeno de proteína e depois desafiados duas semanas após a última injeção. Tecido nasal foi coletado 16 h após desafio com a cepa CS101 0F+ M4 9. As médias geométricas de CFU/ mg de tecido são mostradas na tabela 9. TABELA 9 Médias Geométricas de CFU/ mg de Tecido Nasal Antígeno vacina___________________16 horas *______________ Tétano 5,71b SCPA49S512A 2,27 SCPA1S512A 1,60 a O tempo em que NT foi tomado após infecção intranasal de camundongos. b Os valores são valores log 0 número de estreptococos associados com tecido nasal diminuiu com o tempo, como esperado, e o decréscimo foi mais rápido e completo em camundongos imunizados com antígeno SCPA. Todos os grupos de camundongos que foram imunizados com SCPA retiveram menos estreptococos do que camundongos de controle. Nesta experiência, imunização com SCPA1S512A foi mais eficaz e induziu uma resposta de proteção cruzada, uma vez que a cepa CS101 de desafio ê OF+ M49 e a fonte da proteína da vacina SCPA1S512A de uma cepa OF- Ml. Estes resultados confirmam que um antígeno SCPA único pode induzir proteção contra serotipos heterólogos. Proteção é dada por anticorpo que neutraliza atividade de peptidase na superfície bacteriana. Isto aumenta o influxo de fagócitos em poucas horas do tempo em que estreptococos são depositados no tecido mucoso. Presume-se que depuração rápida de estreptococos por fagócitos evita multiplicação subsequente e persistência das bactérias. Camundongos tinham, uniformente, títulos IgG no soro de 1:32.000 ou maior quando testados por ELISA, indicando que injeção SQ de antígeno SCPA com adjuvante induziu consistentemente uma resposta de anticorpo vigorosa. EXEMPLO 9 Peptidase C5a de Estreptococos do Grupo B é quase Idêntica na Sequência à de Estreptococos do Grupo A Ml2 e M49 O gene Peptidase C5a de estreptococos do grupo B (SCPB) foi clonado, sequenciado e comparado ao de estreptococos do grupo A serotipos M12 e M49. O gene scpB total foi amplificado por PCR usando iniciadores que correspondem a porções da sequência de scpA12 usando o processo descrito acima. O gene SCPB codifica um quadro de leitura aberta (ORF) de 3450 bp que especifica uma proteína de 1150 aminoãcidos com Mr de 126.237 da. A sequência de aminoãcidos de SCPB é mostrada na figura 2. Comparação do nucleotídeo scpB e sequência de aminoácidos deduzida com os estreptococos do grupo Ml 2 e M49 mostrou elevadas similaridades, 98% e 97%, respectivamente. ScpB continha uma deleção de 50 bp que sobrepôs duas das repetições C-terminais, e tinha várias outras diferenças menores com relação aos genes scpA. 0 alinhamento das sequências mostrou que scpA12 é realmente filogeneticamente mais próximo de scpB do que é para scpA49. Trinta cepas representando sorotipos III, III/R, II, Ia/c, NT/c, NT/c/Rl transportam uma cópia de scpB. SCP recombinante foi expresso em E. coli usando plasmídeo de vetor de expressão pGEX-4T-l (número de acesso ATCC 98225) e foi mostrado como sendo idêntico à enzima extraída da cepa estreptocócica de grupo B parental 78-741 (tipo II a + b) . A análise de Western blot sugeriu que SCP recombinante é idêntico à enzima C5ase previamente purificada de estreptococo de grupo B.

Todas as publicações, patentes e documentos de patente são incorporados por referência aqui, como se fossem individualmente incorporados por referência. A invenção foi descrita com referência às várias formas de realização preferidas e específicas e técnicas. No entanto, deve ser entendido que muitas variações e modificações podem ser feitas enquanto permanecendo no escopo da invenção.

Claims (43)

1. Vacina compreendendo uma peptidase C5a estreptocócica (SCP) enzimaticamente inativa, que é útil para imunizar um mamífero susceptível contra Streptococcus β- hemolítico em combinação com um veículo não tóxico, fisiologicamente aceitável, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP tem uma substituição por alanina no resíduo de aminoácido 130, 295 ou 512 de SEQ ID No:l.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que SCP é expresso a partir de uma sequência de DNA isolada codificando SCP.

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende um domínio catalítico ou fenda de especificidade.

4. Vacina, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende uma fenda de especificidade.

5. Vacina, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende resíduos de aminoácidos contíguos de cerca de resíduo 260 a resíduo 417 da SEQ ID No: 1.

6. Vacina, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende um ou mais dos resíduos de aminoácido 260, 261, 262, 415, 416 ou 417 da SEQ ID No: 1.

7. Vacina, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende um domínio catalítico.

8. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende resíduos de aminoácidos contíguos de cerca de resíduo 130 a resíduo 512 da SEQ ID No: 1.

9. Vacina, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos 130, 193, 295, ou 512 da SEQ ID No: 1.

10. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP enzimaticamente inativa tem atividade de ligação reduzida a C5a como comparada com a atividade de ligação a C5a da SCP de tipo selvagem.

11. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende um adjuvante imunológico.

12. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o mamífero é um humano, cachorro, bovino, suíno ou cavalo.

13. Vacina, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o mamífero é humano.

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o Streptococcus β- hemolítico é um Streptococcus de grupo A, Streptococcus de grupo B, Streptococcus de grupo C, ou Streptococcus de grupo G.

15. Vacina, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o Streptococcus β- hemolítico é Streptococcus de Grupo A.

16. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP é de Streptococcus de grupo A, Streptococcus de grupo B, Streptococcus de grupo C, ou Streptococcus de grupo G.

17. Vacina, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o Streptococcus é Streptococcus de grupo A.

18. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma SCP enzimaticamente inativa conjugada ou ligada a um peptideo.

19. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma SCP enzimaticamente inativa conjugada ou ligada a um polissacarideo.

20. Peptideo isolado e purificado compreendendo uma peptidase C5a estreptocócica (SCP) enzimaticamente inativa, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP tem uma substituição por alanina no resíduo de aminoácido 130, 295 ou 512 de SEQ ID No:l.

21. Peptideo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que SCP é expresso de uma sequência de DNA isolada codificando SCP.

22. Peptideo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que SCP tem uma fenda de especificidade ou domínio catalítico.

23. Peptideo, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o SCP compreende um fenda de especificidade.

24. Peptideo, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP compreende resíduos de aminoácidos contíguos de cerca de resíduo 260 a resíduo 417 da SEQ ID No: 1.

25. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o SCP tem um domínio catalítico.

26. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP compreende resíduos de aminoácidos contíguos de resíduo 130 a resíduo 512 da SEQ ID No: 1.

27. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos 130, 193, 295 ou 512 da SEQ ID No: 1.

28. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP enzimaticamente inativa tem uma substituição em um ou mais dos resíduos de aminoácidos 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 ou 512 da SEQ ID No: 1.

29. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP enzimaticamente inativa é de Streptococcus de grupo A, Streptococcus de grupo B, Streptococcus de grupo C, ou Streptococcus de grupo G.

30. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o Streptococcus é Streptococcus de grupo A.

31. Polinucleotídeo isolado e purificado compreendendo uma sequência de nucleotideos codificando uma peptidase C5a estreptocócica (SCP) enzimaticamente inativa, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP tem uma substituição por alanina no resíduo de aminoácido 130, 295 ou 512 de SEQ ID No:1.

32. Sequência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que o polinucleotídeo é DNA.

33. Sequência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que o polinucleotídeo é RNA.

34. Sequência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende uma fenda de especificidade ou domínio catalítico.

35. Sequência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende uma fenda de especificidade.

36. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP compreende resíduos de aminoácidos contíguos de cerca de resíduo 260 a resíduo 417 da SEQ ID No:1.

37. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos 260, 261, 262, 415, 416 ou 417 da SEQ ID No:l.

38. Sequência de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que a SCP compreende um domínio catalítico.

39. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP compreende resíduos de aminoácidos contíguos de cerca de resíduo 130 a resíduo 512 da SEQ ID No:l.

40. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a SCP compreende um ou mais dos resíduos de aminoácidos 130, 193, 295 ou 512 da SEQ ID No:1.

41. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o SCP é de Streptococcus de grupo A, Streptococcus de grupo B, Streptococcus de grupo C, ou Streptococcus de grupo G.

42. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o Streptococcus é Streptococcus de grupo A.

43. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a vacina compreende uma peptidase C5a estreptocócica (SCP) enzimaticamente inativa que tem reduzida atividade de ligação como comparada com SCP tipo selvagem.