BRPI9715268B1 - preparações farmacêuticas liofilizadas estáveis de anticorpos monoclonais ou policlonais, bem como processo para sua produção - Google Patents

Abstract

preparações farmacêuticas liofilizadas estáveis de anticorpos monoclonais ou policlonais, bem como processo para sua produção. a invenção refere-se a preparações farmacêuticas liofihizadas de anticorpos monoclonais ou policlonais, que contém um açúcar ou um amino-açúcar, aminoácido e um tensoativo como estabilizadores. além do mais, a invenção refere-se a um processo para a produção desses liofilizados estáveis, bem como o uso de um açúcar ou aminoaçúcar, um aminoácido e um tensoativo como estabilizadores de agentes terapêuticos ou diagnósticos contendo anticorpos.

Description

(54) Título: PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS LIOFILIZADAS ESTÁVEIS DE ANTICORPOS MONOCLONAIS OU POLICLONAIS, BEM COMO PROCESSO PARA SUA PRODUÇÃO (51) lnt.CI.: A61K 39/395 (30) Prioridade Unionista: 19/11/1996 EP 96 118489.2 (73) Titular(es): ROCHE DIAGNOSTICS GMBH (72) Inventor(es): GEORG KALLMEYER; GERHARD WINTER; CHRISTIAN KLESSEN; HEINRICH WOOG (85) Data do Início da Fase Nacional: 20/06/2007

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS LIOFILIZADAS ESTÁVEIS DE ANTICORPOS MONOCLONAIS OU POLICLONAIS, BEM COMO PROCESSO PARA SUA PRODUÇÃO.

Dividido do PI9713521-6, depositado em 19.11.1997.

A invenção se refere a preparações farmacêuticas liofilizadas de anticorpos monoclonais ou policlonais, que contêm um açúcar ou um aminoaçúcar. Além do mais, a invenção se refere a um processo para a produção desses liofilizados estáveis, bem como o uso de um açúcar ou aminoaçúcar, um aminoácido e um tensoativo como estabilizadores de agentes terapêuticos ou diagnósticos contendo anticorpos.

A produção de imunoglobulinas, em particular anticorpos monoclonais e policlonais, para propósitos terapêuticos e diagnósticos é atualmente de grande e continuamente crescente importância.

O uso de anticorpos como agentes farmacológicos já é do conhecimento há um longo tempo e compreende inúmeras aplicações. Por conseguinte, os anticorpos foram usados com sucesso na profilaxia de tétano, para combater microorganismos patogênicos ou neutralizar as suas toxinas e também o envenenamento por venenos de cobra.

Se o antígeno envolvido no mecanismo da doença foi identificado, que é o caso para inúmeras indicações infecciosas e algumas oncológicas para terapia de anticorpos, utiliza-se a especificidade dos anticorpos para a terapia.

Em estudos clínicos e pré-clínicos, os anticorpos são atualmente usados para baixar o nível de colesterol, para influenciar o sistema angiotensina/renina, encefalite auto-imune, esclerose múltipla, poliartrite e miastenia grave auto-imune.

Ainda de maior importância terapêutica é a aplicação deles para contrapor às intoxicações por substâncias de baixo peso molecular, tal como, por exemplo, os fragmentos Fab de anticorpos antidigoxina, quando usados em intoxicações por digoxina ou de digitoxina e ouabaína de glicosídeos cardíacos. Além do mais, os anticorpos são usados no campo de diag2 nóstico par identificar, purificar e determinar o teor de proteínas.

A engenharia genética, que revolucionou a produção de anticorpos monoclonais em culturas de células na segunda metade dos anos 70 e nos anos 80, tem avançado bastante na preparação de anticorpos.

Para satisfazer essas diversas aplicações, é necessário ter preparações farmacêuticas de anticorpos monoclonais e policlonais, que são estáveis no armazenamento. Há várias publicações relativas às formulações líquidas ou liofilizados de anticorpos especiais. Desse modo, por exemplo, as formulações líquidos de anticorpos são descritas em EP 0 280 358, EP 0 170 983, WO 89/11298, EP 0 352 500 e JP 63088197.

De acordo com o patente européia EP 0 280 358, dextrana é adicionada à solução do anticorpo, para estabilizá-la contra certos hormônios, com o que foi possível obter estabilidade de mais de nove meses. De acordo com a patente européia EP 0 170 983, ovalbumina hidrolisada é adicionada para estabilizar um anticorpo monoclonal termolábil, quando aquecido, e, por conseguinte, o anticorpo poderia ser ainda usado após armazenamento a 45°C por 7 dias. Os poliidróxi álcoois (por exemplo, glicerol, inositol, poli (álcool vinílico), ou açúcares (por exemplo, sacarose e glicose, ou glicitóis (por exemplo, sorbitol, manitol) são conhecidos da patente japonesa JP 63088197, como estabilizadores adicionais para as formulações líquidas. O pedido de patente internacional WO 89/11298 demonstra o uso de maltose em um cloreto de sódio contendo tampão de fosfato como um outro processo para a estabilização do líquido de anticorpos monoclonais. A patente européia EP 0 352 500 descreve poli (etileno glicol) 4000 e 3-propiolactona para a estabilização de líquido de anticorpos monoclonais.

No entanto, em geral, as formulações líquidas não são uma ótima solução, devido à estabilidade no armazenamento, uma vez que as proteínas ou os seus agregados podem precipitar durante o armazenamento, em maiores temperaturas, quando transportado por diferentes zonas climáticas ou por armazenamento impróprio (por exemplo, interrupções na cadeia de resfriamento), e as soluções podem ter assim um teor de proteína reduzido e ficarem turvas. Por conseguinte, nesses casos não se pode garantir um

uso sem problemas das soluções.

Em contraste, no caso de uma formulação de liofílizado, a remoções de água minimiza a formação de produtos de degradação (por exemplo, por desamidação e hidrólise) e formação de agregados. O teor de água residual (água ligada) pode contribuir para a estabilidade, particularmente na presença de açúcares (Hsu et al., Dev. Biol. Stand. 1991, 74: 255 - 267 e Pikal et al., Dev. Biol. Stand. 1991, 74: 21 - 27).

As formulações de liofilizados com anticorpos especiais como substâncias ativas também são conhecidas da literatura, mas não propiciam uma informação consistente sobre o problema de estabilização. Por conseguinte, no pedido de patente internacional WO 93/00807, a estabilização de biomateriais é descrita, tais como proteínas humanas, hormônios de crescimento, inteleucinas, interferons, enzimas e também anticorpos monoclonais e policlonais por um sistema de dois componentes consistindo de agentes crioprotetores (por exemplo, poli (etileno glicóis)) e um composto que pode formar pontes de hidrogênio com proteínas. No entanto, uma desvantagem dessas preparações é que a adição de compostos de alto peso molecular, tais como poli (etileno glicóis), pode acarretar um acúmulo no corpo com efeitos colaterais potencialmente nocivos, se não há biodegradação. Além do mais, como é bem conhecido, os polímeros podem agir como antígenos, dependendo das suas massas molares.

Os liofilizados de um anticorpo monoclonal, que é lábil quando congelado são estabilizados por um ano, de acordo com a patente japonesa JP 60146833, pela adição de albumina (albumina humana, de cavalo ou bovina). Albumina sérica humana (HSA) também é descrita na patente européia 0 303 088, em combinação com um carboidrato (por exemplo, dextrose, sacarose ou maltose), para estabilizar um anticorpo monoclonal para o tratamento de infecções de Pseudomonas aeruginosa.

A albumina sérica humana (em combinação com açúcares e aminoácidos) é também o princípio pelo qual os anticorpos monoclonais são estabilizados na patente européia EP 0 413 188. Na patente japonesa JP 01075433, uma mistura de albumina sérica humana, manitol e poli (etileno

glicol) é usada para estabilizar um anticorpo monoclonal humano como um liofilizado. Um outro exemplo do uso de macromoléculas, tais como, por exemplo, poli (etileno glicóis), e proteínas protetoras, tais como albuminas séricas humanas, para estabilizar gama-globulinas durante a liofilização, é apresentado no pedido de patente internacional WO 84/00890.

No pedido de patente internacional WO 93/01835, Hagiwara et al. descrevem a estabilização de um anticorpo monoclonal humano por liofilização com manitol e glicina em uma solução contendo cloreto de sódio e tampão de fosfato. Preparações estáveis são obtidas com relação ao congelamento, liofilização e reconstituição.

Draber et al. (J. Immun. Methods, 1995, 181:37 - 43) foram capazes de produzir uma formulação estável de anticorpos IgM monoclonais de camundongo a 4°C, pela adição apenas de trealose e em combinação com poli (etileno glicol) 8.000. No entanto, os anticorpos são apenas estáveis por 14 dias a 50°C. Usando outros monossacarídeos ou dissacarídeos apenas, tais como, por exemplo, sacarose, maltose, lactose ou galactose, não é possível estabilizar esses anticorpos.

Um anticorpo monoclonal de camundongo é convertido em um liofilizado estável no pedido de patente internacional WO 89/11297, usando um carboidrato (maltose) e um tampão na faixa ácida (tampão de acetato). Neste caso, uma desvantagem é a limitação para tamponamento na faixa ácida.

Gelatina polimérica, como um protetor e estabilizador de congelamento em um liofilizado, é usado no pedido de patente internacional WO 92/15 331. A estabilização também é obtida em combinação com um ácido carboxílico (por exemplo, ácido cítrico) ou um sal dele, bem como um álcool primário, secundário ou terciário, ou um aminoácido em uma faixa de pH de 6,8 a 8,1.

Em uma série integral das publicações mencionadas acima, são propostas substâncias farmacêuticas aditivas e auxiliares, como estabilizadores, que não são aceitáveis de um ponto de vista médico. Por conseguinte, polímeros (tal como PEG ou gelatina) e proteínas (tais como albuminas séricas) possuem um certo risco, devido às suas origens e às suas propriedades físico-químicas e podem deflagrar reações alérgicas, mesmo ao ponto de um choque anafilático. As proteínas de origem humana ou animal, bem como as proteínas obtidas de culturas de células, acarretam o risco residual de contaminações virais. No entanto, outras contaminações similares àquelas das proteínas, que são difíceis de detectar analiticamente, podem provocar reações imunológicas em seres humanos, devidos às suas propriedades.

A adição de compostos poliméricos, tais como, por exemplo, poli (etileno glicóis) (PEG) ou gelatina pode acarretar um acúmulo no corpo com efeitos colaterais potencialmente tóxicos, se não houver biodegradação. Os polímeros também podem ter propriedades antigênicas, dependendo das suas massas molares. Também é difícil garantir a pureza dos polímeros, devido aos catalisadores usados na produção deles, ou à presença de monômero e outros fragmentos de polímeros. O uso de polímeros em formas de administração farmacêuticas, especialmente na forma de drogas, que podem ser administradas subcutaneamente, deve ser evitado, se outro tipo de estabilização é possível.

Em contraste com o uso de açúcares sem outros aditivos, nem sempre garante um efeito protetor adequado, quando os anticorpos são liofilizados.

Por conseguinte, o objeto da invenção foi o de proporcionar uma preparação farmacêutica estável de anticorpos monoclonais ou policlonais, que é essencialmente isenta dos polímeros ou substâncias auxiliares proteináceas mencionados acima. Isto se aplica particularmente àqueles anticorpos que são lábeis aos processos de congelamento e descongelamento, ou aos processos de congelamento e descongelamento múltiplos.

Verificou-se, surpreendentemente, que são obtidos liofilizados farmacêuticos estáveis de anticorpos monoclonais ou policlonais, se esses contêm açúcar ou aminoaçúcar, um aminoácido e um tensoativo, como aditivos. Os liofilizados são compostos, de preferência, de a) o anticorpo, b) um açúcar ou aminoaçúcar, c) um aminoácido, d) um tampão para ajuste do valor de pH e e) um tensoativo. Esses liofilizados particularmente preferidos

contêm apenas um único ou dois diferentes aminoácidos.

Essas preparações são fisiologicamente bem toleradas, têm uma composição relativamente simples e podem ser dosadas exatamente. Além de serem estáveis, isto é, não apresentam produtos de degradação ou agregados de proteína detectáveis, quando submetidas a processos de congelamento e descongelamento múltiplos, bem como a armazenamento mais longo. Os liofilizados podem ser ainda armazenados sem problemas de estabilidade em temperatura de refrigerador (4 - 12°C) ou mesmo à temperatura ambiente (18 - 23°C), por um período de tempo de pelo menos três meses, de preferência, pelo menos seis meses e, em particular, de pelo menos um a dois anos. Além do mais, também são estáveis quando armazenados em temperaturas mais altas (por exemplo, até 30°C). A estabilidade no armazenamento é indicada, por exemplo, pelo fato de que durante o dito período de armazenamento, apenas um número de partículas muito pequeno pode ser detectado, quando os liofilizados são reconstituídos nos recipientes com água, para os propósitos de injeção, ou com soluções isotônicas. Em particular, os recipientes têm menos do que 6.000 partículas com um tamanho de partícula superior a 10 pm e/ou menos do que 60 partículas com um tamanho de partícula superior a 25 pm. As soluções preparadas dessa maneira são estáveis por um período de tempo até cerca de cinco dias, de preferência, até três dias.

O fato de que as preparações protegem contra o congelamento, devido à combinação selecionada de aditivos, é particularmente vantajoso. Por conseguinte, em particular, isso possibilita uma liofilização em temperaturas abaixo de -45°C, sem prejudicar a estabilidade dos anticorpos. Além dos liofilizados conterem a combinação de aditivos de acordo com a invenção, também são estáveis por um longo período e durante armazenamento mesmo em temperaturas relativamente altas. Especialmente comparados com as formulações convencionais, não apresentam qualquer formação de partículas após reconstituição com água, isto é, as soluções são essencialmente isentas de turbidez.

As preparações de acordo com a invenção têm a vantagem adi-

cional de serem essencialmente isentas de substâncias auxiliares na forma de proteína ou poliméricas, cujo uso pode ser problemático de um ponto de vista médico. Devido ao fato de que os agentes terapêuticos ou diagnósticos líquidos contendo anticorpos com um valor de pH de cerca de 5 a 8, de preferência, com um valor de pH de 6,0 - 7,4 (valor de pH do sangue de 7,2 7,4) poderem ser então preparados por dissolução de liofilizados, têm a vantagem adicional de serem bem tolerados e podem ser administrados substancialmente sem dor. Isto é acima de tudo importante para administração subcutânea, uma vez que neste caso as intolerâncias se desenvolvem mais facilmente do que quando administrados intravenosamente.

As formulações de acordo com a invenção podem ser genericamente produzidas em faixas de concentração clinicamente relevantes do anticorpo, por exemplo, de até 20 mg/ml, de preferência, até 10 mg/ml. As faixas de concentração preferidas são as concentrações acima de 0,01 mg/ml, em particular acima de 0,05 e 0,1 mg/ml. Em particular, as faixas de concentração de 0,05 -10 mg/ml ou 0,1 - 5 mg/ml, por exemplo, cerca de 5, 8 ou 10 mg/ml, são usadas. Os volumes de injeção das soluções usadas são inferiores a 2 ml, de preferência, cerca de 1 ml, no caso de injeções subcutâneas ou intravenosas. Pequenos volumes de injeção são particularmente vantajosos para administração subcutânea, uma vez que apenas provocam uma ligeira irritação mecânica no tecido subcutâneo. Basicamente, as soluções também são diretamente adequadas como aditivos para soluções de infusão, ou como soluções de infusão. Se são usados como aditivos para soluções de infusão, a concentração dos anticorpos é em níveis mais altos, por exemplo, até 10 mg/ml. Essas soluções concentradas dos anticorpos são depois adicionadas às soluções de infusão convencionais, de modo que a concentração do anticorpo na solução de infusão a ser administrada é na faixa terapeuticamente relevante. Esta faixa é normalmente de 0,001 - 0,5 mg/ml.

As formas de administração farmacêutica únicas podem estar presentes como soluções de infusão, ou soluções de injeção ou também como liofilizados prontos-para-uso. Se as preparações farmacêuticas são

usadas na forma de liofilizados, os recipientes de dose única, por exemplo, ampolas de vidro com um volume de 10 ml, contêm o anticorpo em proporções de 0,1 - 500 mg, de preferência, 10-100 mg, dependendo da respectiva dose terapeuticamente relevante do anticorpo. O liofilizado contém, opcionalmente, substâncias auxiliares farmacêuticas convencionais adicionais. O liofilizado é dissolvido com uma quantidade apropriada de solução de reconstituição e podem ser usados diretamente como uma solução de injeção ou como um aditivo para uma solução de infusão. Se é usado como um aditivo para soluções de infusão, o liofilizado é usualmente dissolvido com cerca de 10 ml de uma solução de reconstituição e adicionado a uma solução salina fisiológica (0,9% de NaCl) de 250 ml. A solução de infusão resultante é depois usualmente administrada ao paciente dentro de cerca de 30 minutos.

Os açúcares usados de acordo com a invenção podem ser monossacarídeos, dissacarídeos ou trissacarídeos. Glicose, manose, galactose, frutose e sorbose são considerados como os monossacarídeos. Sacarose, lactose, maltose ou trealose são considerados como os dissacarídeos. Rafinose é, de preferência, usada como o trissacarídeo. De acordo com a invenção, sacarose, lactose, maltose, rafinose ou trealose são, especialmente, preferivelmente usadas. Em vez de maltose, também é possível usar os dissacarídeos estereoisoméricos celobiose, gentibiose ou isomaltose.

Esses monossacarídeos são genericamente referidos e usado como aminoaçúcares que têm um grupo amino (-Nhb, -NHR, -NR₂) ou amino acilado (-NH-CO-R), em vez de um grupo hidróxi. Para isto, glicosamina, Nmetil-glicosamina, galactosamina e ácido neuramínico são particularmente preferidos de acordo com a invenção. O teor de açúcar ou teor de aminoaçúcar é, por exemplo, até 2.000 mg, de preferência, até 1.000 mg, especialmente até 800 ou até 500 mg por forma de administração única. As proporções de mais do que 10, 50 ou 100 mg são consideradas como o limite inferior para o teor de açúcar. As faixas preferidas são 200 - 1.000 mg, especialmente 400 - 800 mg. As quantidades indicadas por forma de administração única se referem à formas de administração única, que são comercializadas como liofilizados. Esses liofilizados são, de preferência, enchidos em garrafas de injeção com um volume de 10 ml. Após dissolução dos liofilizados com uma solução de reconstituição de 10 ml, são obtidas formas de administração líquidas, que podem ser diretamente administradas. A concentração de açúcar nessas soluções de injeção é de até 200 mg/ml, de preferência, de até 100 mg/ml, com base nas quantidades indicadas acima dos açúcares usados.

Os aminoácidos usados de acordo com a invenção podem ser aminoácidos básicos, tais como arginina, lisina, histidina, ornitina, etc., os aminoácidos sendo usados, de preferência, na forma de seus sais inorgânicos (de preferência, na forma de sais de ácido fosfórico, isto é, fosfatos de aminoácidos). Se são usados aminoácido livres, o valor de pH desejado é ajustado por adição de uma substância tampão fisiologicamente tolerada adequada, tal como, por exemplo, um ácido inorgânico, em particular ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido fórmico ou seus sais. Neste caso, o uso de fosfatos tem a vantagem particular que são obtidos liofilizados particularmente estáveis. Foi provado como sendo vantajoso, quando as preparações são essencialmente isentas de ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, etc., ou os ânions correspondentes (malatos, oxalatos, citratos, succinatos, fumaratos, etc.) não estão presentes.

Os aminoácidos preferidos são arginina, lisina ou ornitina. Além deles, também é possível usar aminoácidos ácidos, tais como ácido glutâmico e ácido aspártico, ou aminoácidos neutros, tais como, por exemplo, isoleucina, leucina e alanina, ou aminoácidos aromáticos, tais como, por exemplo, fenilalanina, tirosina ou triptofano. O teor de aminoácido nas preparações aquosas de acordo com a invenção é de até 100 mg/ml, de preferência, até 50 mg/ml ou até 30 mg/ml. O limite inferior pode ser, por exemplo, concentrações acima de 1, 5 ou 10 mg/ml. As concentrações preferidas são, por exemplo, na faixa de 3 - 30 mg/ml ou 10 - 25 mg/ml.

Se as formas de administração correspondentes são comercializadas como liofilizados, esses liofilizados são produzidos, de preferência, em garrafas de injeção (volumes de, por exemplo, 10 ml). Essas formas de administração únicas contêm os aminoácidos em quantidades de até 1.000 mg, de preferência, até 500 mg ou até 300 mg.

Os tensoativos que são considerados são todos os tensoativos que são usualmente utilizados em preparações farmacêuticas, de preferência, polissorbatos e polímeros de polioxietileno-polioxipropileno, tal como, por exemplo, Tween®. Proporções baixas de tensoativo de 0,05 a 0,5 mg/ml, de preferência, 0,1 mg/ml, são suficientes para estabilizar os anticorpos. Nas formas de administração únicas mencionadas acima, a quantidade de tensoativos é de 0,5 - 5 mg, no caso de um liofilizado, que é cheio em uma garrafa de injeção de 10 ml.

A estabilização de anticorpos obtida pelos ditos aditivos se refere, em princípio, a todos os anticorpos monoclonais e policlonais e os seus fragmentos Fab. Os anticorpos humanizados e os anticorpos modificados (cf., por exemplo, patente U.S. 5.624.821; patente européia EP 0 592 106; PCT/EP96/0098) são preferivelmente usados. O peso molecular dos anticorpos é de 50 kDa - 200 kDa por unidade monomérica, em particular, o peso molecular é cerca de 80- 150 kDa. Em particular, os anticorpos para o vírus de hepatite B (cf. pedido de patente internacional WO 94/11495), para vírus de AIDS, citomegalovírus, vírus de meningoencefalite (FSME), vírus de rubéola, vírus de sarampo, agentes patogênicos de raiva, bactéria de Pseudomonas aeruginosa, vírus de varicela-Zoster, agentes patogênicos do tétano, fator de van Willebrandt (cf. pedido de patente internacional WO 96/17078), NGRF (receptor de fator de crescimento nerval), PDGFR (receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas: Shulman, Sauer, Jackman, Chang, Landolfi, J. Biol. Chem. 1997, 272 (28): 17400-4, selectina, em particular, E-selectina, L-selectina (cf. Takashi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1990, 87: 2244 - 2248; pedido de patente internacional WO 94/12215) ou P-selectina; integrinas ou agentes patogênicos de difteria podem ser estabilizados de acordo com a invenção. A concentração de anticorpos pode ser, de preferência, até 8 mg/ml. É preferível, por exemplo, 0,05 - 2 mg/ml. A quantidade de anticorpo na forma de administração única, por exemplo, em

um liofilizado em uma garrafa de injeção de 10 ml, é até 100 mg, de preferência, até 80 mg, 50 mg, 20 mg ou 10 mg. A concentração dos anticorpos, após reconstituição dos liofilizados com um volume de 10 ml, é na faixa de 1 -10 mg/ml, de preferência, a 5 - 8 mg/ml.

Além dos ditos aditivos, açúcar, aminoácido e tensoativo, os liofilizados de acordo com a invenção podem conter substâncias auxiliares fisiologicamente toleradas do grupo compreendendo ácidos, bases, tampões ou agentes isotonificantes, para ajustar o valor de pH a 5 a 8, de preferência, 6,0 a 7,4. A capacidade de tamponamento das preparações é ajustada de modo que quando os liofilizados são dissolvidos com soluções de reconstituição padrão, tais como, por exemplo, água para finalidade de injeção, a concentração de tampão é na faixa entre 10-20 mmol/l a cerca de 15 mmol/l.

A ordem de adição das várias substâncias auxiliares ou do anticorpo é bastante independente do processo de produção e é por conta do julgamento de uma pessoa versada na técnica. O valor de pH desejado da solução é ajustado por adição de bases, tais como, por exemplo, hidróxidos metais alcalinos, hidróxidos de metais alcalino-terrosos ou hidróxido de amônio. Hidróxido de sódio é, de preferência, usado para isso. O valor de pH desejado pode ser, a princípio, ajustado por adição de soluções básicas. Neste sentido, sais de bases fortes com ácidos fracos são geralmente adequados, tais como acetato de sódio, citrato de sódio, fosfato diácido dissódico ou sódico, ou carbonato de sódio. Se a solução farmacêutica das substâncias auxiliares tem um valor de pH básico, é ajustada por titulação com um ácido até que o valor de pH tenha sido atingido. Os ácidos inorgânicos ou orgânicos fisiologicamente tolerados são considerados como os ácidos, tais como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico ou soluções convencionais de substâncias que têm um valor de pH ácido. Neste sentido, as substâncias preferidas são sais de ácidos fortes com bases fracas, tal como, por exemplo, fosfato diácido sódico ou fosfato ácido dissódico. O valor de pH da solução é, de preferência, ajustado com ácido fosfórico ou uma solução aquosa de hidróxido de sódio.

Para produzir formas de droga parenterais bem toleradas, é

conveniente adicionar substâncias auxiliares isotonificantes, se a isotonicidade não pode ser já obtida pelas propriedades osmóticas do anticorpo e dos aditivos usados para estabilização. As substâncias auxiliares bem toleradas não-ionizadas são usadas inteiramente para isso. Sais, tal como NaCI, devem, no entanto, ser apenas adicionados em pequenas quantidades, em particular um valor de 30 mmol/l na solução de injeção ou infusão final para administração não deve ser excedido.

Além do mais, as preparações farmacêuticas podem conter outras substâncias auxiliares ou aditivos comuns. Os antioxidantes, tal como, por exemplo, glutationa ou ácido ascórbico, ou substâncias similares podem ser adicionados.

Para a produção dos liofilizados, as soluções aquosas farmacêuticas que contêm o anticorpo são primeiramente produzidas. Uma solução de anticorpos tamponada contendo cloreto de sódio é, de preferência, preparada. Esta solução de anticorpos é misturada com uma solução aquosa contendo os aditivos açúcar, aminoácido e tensoativo, durante o que o valor de pH é ajustado com um ácido ou uma base a 5 a 8. Ácido fosfórico ou sais de fosfato e cloreto de sódio são adicionados em quantidades tais que são obtidas as concentrações definidas previamente. Subseqüentemente, é esterilizada por filtração e a solução preparada dessa maneira é liofilizada.

A invenção também propicia soluções aquosas instáveis contendo anticorpos, que são sensíveis ao congelamento e também são convertidas por meio de congelamento-secagem em preparações estáveis, que também são estáveis em altas temperaturas sem prejudicar a qualidade.

Uma outra vantagem dos liofilizados de acordo com a invenção é que, além de evitar dano aos anticorpos durante o congelamento, também não apresentam qualquer redução no teor de anticorpos e nenhuma formação de agregados ou floculação, mesmo após um armazenamento de longa duração a 50°C. São assim estáveis com relação ao teor de anticorpos e pureza. A formação de partículas é evitada, que é mostrada pelos baixos valores de turbidez após reconstituição dos liofilizados com água para a finalidade de injeção.

A invenção é elucidada em mais detalhes a seguir, com base em exemplos de aplicação.

Os Exemplos 1 a 10 mostram por qual maneira os liofilizados de acordo com a invenção podem ser formulados, produzidos e examinados com relação à estabilidade dos anticorpos.

Experimentos comparativos sem substâncias auxiliares ou apenas com sacarose, ou com manitol como um substituto para o componente açúcar, ou com apenas o componente aminoácido, ou apenas o componente açúcar ou aminoácido, sem o tensoativo mostrar que a seleção da combinação de aditivos de acordo com a invenção é essencial para obter uma formulação estável. Apenas sacarose, apenas aminoácido ou ambos os componentes sem o tensoativo acarretam formulações instáveis.

As formulações de acordo com a invenção são insensíveis ao congelamento e é possível omitir, completamente, os polímeros ou proteínas que são considerados como sendo tóxicos, tais como poli (etileno glicóis), gelatina, albuminas séricas. No caso dos tensoativos, apenas estão presentes quantidades relativamente pequenas de tensoativo fisiologicamente bem tolerado.

O anticorpo para HBV usado nos seguintes exemplos de aplicação é um anticorpo monoclonal humano recombinante (MAB) de uma célula de murina. Tem um peso molecular de cerca de 147 kDa e é direcionado contra o antígeno superficial da hepatite B (HBsAg) do vírus da hepatite Β. O anticorpo monoclonal reconhece o a-determinante do HBsAg, que é constante em quase todas as variantes do vírus. Este anticorpo pode ser, por exemplo, usado para as seguintes indicações médicas: tratamento de hepatite crônica para a qual não tinha sido ainda um método de tratamento satisfatório; tratamento de imunoprofilaxia passiva em pacientes de transplante de fígado HbsAg-positivos. Na Europa central e do norte e nos EUA, até 2% da população são portadores do vírus de hepatite B, no sul da Europa até 3%, na África e no Extremo Oriente é de 10 -15%. Uma conseqüência desta infecção crônica é que o risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular é aumentado por 100 vezes, 40% dos portadores do vírus morrem em con14 seqüência desta infecção.

Os anticorpos para L-selectina, o receptor de NGF ou o receptor de PDGF podem ser preferivelmente usados como anticorpos dentro do sentido da invenção.

O Exemplo 1 mostra as propriedades de uma solução aquosa de um anticorpo monoclonal para o vírus da hepatite B (MAB HBV; nome INN: Tuvirumab) contendo tampão de fosfato de cloreto de sódio a pH = 5, pH = 6,5 e pH = 8, após congelamento e descongelamento. Mostra que o congelamento e descongelamento danificam o anticorpo monoclonal.

O Exemplo 2 demonstra a possibilidade de estabilização de uma preparação de acordo com a invenção com sacarose ou maltose ou um aminoaçúcar (N-metilglicosamina ou galactosamina) e fosfato de arginina e Tween 20, com uma concentração do anticorpo de 2 mg/ml, isto é, 2 mg no liofilizado.

A mesma preparação do Exemplo 2 é mostrada no Exemplo 2a, exceto que a concentração do anticorpo é de 8 mg/ml. Pode-se notar dos Exemplos 2 e 2a que a combinação das ditas substâncias auxiliares não apenas evita os danos para o anticorpo, durante o congelamento, mas tem também uma influência positiva na estabilidade durante armazenamento a longo prazo.

O Exemplo 3 elucida a necessidade de aminoácidos e tensoativo na preparação de acordo com a invenção. O uso de sacarose como um reforçador sozinho propicia um liofilizado instável.

O Exemplo 4 descreve variações do componente aminoácido. Parece que a variação dos aminoácidos básicos na forma de arginina ou ornitina, bem como a substituição do aminoácido básico por um aminoácido neutro, tal como, por exemplo, leucina, ou por um aminoácido ácido, tal como, por exemplo, ácido aspártico, propicia uma preparação estável no armazenamento.

No Exemplo 5, a liofilização de uma formulação contendo sacarose, arginina e Tween 20, bem como tampão de fosfato e cloreto de sódio, é comparada em vários valores de pH (pH 5, pH 6,5 e pH 8). Os dados obti15

dos mostram que é possível liofilizar dentro dessa faixa de pH, sem prejudicar a estabilidade.

Se o dito tensoativo Tween 20 é substituído por um representante da classe superficialmente ativa dos compostos de polímeros de polioxietileno-polioxipropileno (nome comercial Pluronic®), como no Exemplo 6, isto também resulta em uma estabilidade adequada da preparação de acordo com a invenção.

O Exemplo 7 demonstra a instabilidade de uma formulação contendo manitol como o reforçador, como um substituto para sacarose, maltose ou o aminoaçúcar (consultar o Exemplo 2).

Se o açúcar e o tensoativo são omitidos na formulação, a preparação se torna instável, como mostrado no Exemplo 8.

Embora uma combinação de açúcar (por exemplo, sacarose) e aminoácidos sem tensoativo no Exemplo 9 produza bons resultados, com relação ao teor de parâmetros e de agregados, a turbidez é, no entanto, substancialmente aumentada comparada com as formulações de acordo com a invenção contendo açúcar, aminoácido e tensoativo.

O Exemplo 10 mostra que outros anticorpos monoclonais também podem ser estabilizados com uma combinação do açúcar, aminoácido e tensoativo. O anticorpo anti-L-selectina é, por exemplo, estável a uma concentração de 7 mg no liofilizado. A liofilização é conduzida partindo com um volume de 1 ml de uma solução aquosa.

Métodos investiqativos para determinar a estabilidade

As preparações liofilizadas foram armazenadas sob condições de armazenamento definidas, na ausência de luz, e subseqüentemente analisadas. Os seguintes métodos de teste foram usados para as análises.

OD28Q: Densidade óptica a 280 nm. Na determinação fotométrica do teor de proteína, a absorbância em UV é devida aos cromóforos das cadeias laterais, tais como resíduos de tirosina de triptofano e fenilalanina. Especificação: 95 -105%.

SE-HPLC: Cromatografia de alto desempenho por exclusão de tamanho para determinar agregados. Especificação: máx. 2%.

Medida da turbidez: Após reconstituição do liofilizado, a solução de anticorpos não-diluída foi medida em um fotômetro de turbidez adequada. Especificação: máx. de 6 unidades de turbidez.

Exemplo 11:

Uma solução aquosa padrão de MAB em HBV descrita acima, contendo tampão de fosfato e cloreto de sódio, é preparada e examinada. A concentração do MAB é cerca de 15 mg/ml.

A Tabela 1a mostra, por um lado, a labilidade ao congelamento da solução de anticorpos monoclonais em vários valores de pH a -20°C, que já resulta em uma diminuição do teor de proteína após 4 semanas para 92,1 e 94,2 e 94,0%. Uma diminuição do teor de proteína também é observada em armazenamento a 25°C. Sob as condições de armazenamento a 4 - 8°C em um refrigerador, o anticorpo é adequadamente estável por 9 meses.

As Tabelas 1b - 1d mostram os dados de estabilidade da solução de anticorpos monoclonais, preparada em valores de pH de 5, 6,5 e 8 a -20°C, 4 - 8°C e 25°C. Isto também mostra que apenas um armazenamento a 4 - 8°C é aceitável.

Tabela 1a: Variação do teor de anticorpos na solução de substância ativa (tampão de fosfato 10 mM, cloreto de sódio 30 mM, água para finalidade de injeção)

	pH 5
Tempo	-20°C	4-8°C	25°C
Início		>99
4 semanas	92,1	>99	>99
13 semanas	78,9	>99	97,2
6 meses	61,2	>99	94,1
9 meses	47,8	>99	88,7

pH 6,5
-20°C	4-8°C	25°C
	>99
94,2	>99	>99
81,2	>99	98,1
69,9	>99	94,4
55,6	>99	90,2

pH 8
-20°C	4-8°C	25°C
	>99
94,0	>99	>99
77,8	>99	96,1
65,8	>99	91,9
51,0	>99	84,3

Todos os dados em %. A proteína foi determinada por medida da absorbância a 280 nm (OD 280).

Tabela 1b: Formação de agregados e valores de turbidez para a solução da substância ativa de anticorpos, pH = 5

Tempo	Turbidez dos agregados a -20°C	Turbidez dos agregados a 4-8°C	Turbidez dos agregados a 25°C
Início	n.d. 1,5	n.d.	1,5	n.d.	1,5
4 semanas	agregados floculação	n.d.	1,5	0,7%	1,5
13 semanas	agregados floculação	0,2%	1,8	1,9%	1,8
6 meses	agregados floculação	0,3%	1,9	agregados 9,9
9 meses	agregados floculação	0,6%	2,1	agregados 10,9

n.d. = não-detectável

Tabela 1c: Formação de agregados e valores de turbidez para a solução da 5 substância ativa de anticorpos, pH = 6,5

Tempo	Turbidez dos agregados a -20°C	Turbidez dos agregados a 4-8°C	Turbidez dos agregados a 25°C
Início	n.d. 1,2	n.d.	1,2	n.d.	1,2
4 semanas	agregados floculação	n.d.	1,3	0,5%	1,4
13 semanas	agregados floculação	0,2%	1,4	1,8%	1,7
6 meses	agregados floculação	0,3%	1,9	4,9%	floculação
9 meses	agregados floculação	0,6%	2,1	9,3%	floculação

Tabela 1d: Formação de agregados e valores de turbidez para a solução da substância ativa de anticorpos, pH = 8

Tempo	Turbidez dos agregados a -20°C	Turbidez dos agregados a 4-8°C	Turbidez dos agregados a 25°C
Início	n.d.	1,4	n.d.	1.4	n.d.	1.4
4 semanas	2,0%	floculação	0,3%	1,5	0,74%	1,7
13 sema-	2,8%	floculação	0,5%	1,8	1,95%	2,1
nas
6 meses	3,7%	floculação	0,6%	1,9	3,0%	floculação
9 meses	5,4%	floculação	0,8%	2,1	4,3%	floculação

Agregados em % usando SE-HPLC; turbidez em unidades de turbidez (turbidez) usando um fotômetro de turbidez.

Exemplo 2:

Uma solução do anticorpo monoclonal para HBV de acordo com o Exemplo 1 foi adicionada às soluções aquosas dos seguintes açúcares ou aminoaçúcares: sacarose (formulação 1). maltose (formulação 2) e Nmetilglicosamina (formulação 3) contendo tampão de fosfato de arginina e Tween 20 como o tensoativo. A formulação é listada no Exemplo 2a. A concentração final do MAB é de 2 mg/ml. Após ajuste do valor de pH com ácido fosfórico a 6,5, as soluções foram esterilizadas por filtração (filtro de membrana de 0,22 pm) e enchidos em garrafas esterilizadas e despirogenadas feitas de vidro (classe hidrolítica I) (volumes de enchimento de 1 ml) e liofilizadas. Após liofilização, as garrafas de injeção foram aeradas com nitrogênio, seladas automaticamente com tampões na câmara de secagem de con10 gelamento e subseqüentemente flangeadas.

As garrafas de injeção flangeadas foram armazenadas na ausência de luz por 4 a 13 semanas a várias temperaturas. Após esses períodos, a estabilidade dos liofilizados foi examinada com os métodos de exame descritos.

Tabela 2a: Armazenamento a 25°C

	4 semanas de armaze-	13 semanas de armaze-
	namento a 25°C	namento a 25°C
	I II III	I II III
form. 1 sacarose	100 n.d. 1,7	100 n.d. 1,6
form. 2 maltose	100 n.d. 1,6	100 n.d. 1,8
form. 3 N-metilglicosamina	100 n.d. 1,8	100 n.d. 1,5
Tabela 2b: Armazenamento a 50°C
	4 semanas de armaze-	13 semanas de armaze-
	namento a 25°C	namento a 25°C
	I II III	I II III
form. 1 sacarose	>99 n.d. 2,0	>99 n.d. 2,0
form. 2 maltose	>99 n.d. 1,9	>99 n.d. 2,1
form. 3 N-metilglicosamina	>99 n.d. 1,7	>99 n.d. 2,0

Legenda:

I teor de proteína em % com OD 280

II agregados em % com SE-HPLC

III turbidez da solução reconstituída em unidades de turbidez (nú mero adimensional)

n.d. não-detectável (usado do mesmo modo que em todas as outras tabelas)

Exemplo 2a

No Exemplo 2a, a formulação 1 do Exemplo 2 é preparada com 8 mg/ml de anticorpos (= formulação 1 a). Parece que em concentrações superiores a 8 mg/1 ml, os anticorpos são adequadamente estáveis nesta formulação.

Composições das formulações 1 e 1 a:

	Formulação 1	Formulação 1a
MAB HBV	2,0 mg	8,0 mg
tampão de fosfato	15 mM	15 mM
cloreto de sódio	30 mM	30 mM
sacarose	68,0 mg	58,0 mg
arginina	10,0 mg	10,0 mg
ácido fosfórico	ad pH 6,5	ad pH 6,5
Tween 20	0,1 mg	0,1 mg
água para finalidade de injeção	ad 1,0 ml	ad 1,0 ml

Tabela 3a: Dados de estabilidade para a formulação 1 e a formulação 1a a 25°C

	4 semanas de armazenamento a 25°C	13 semanas de armazenamento a 25°C
I II	III	I II	III
form. 1: 2 mg/1 ml	100 n.d.	1,7	100 n.d.	1,6
form. 1a: 8 mg/ml	>99 n.d.	4,8	>99 n.d.	4,7

Tabela 3b: Dados de estabilidade para a formulação 1 e a formulação 1a a 50°C

	4 semanas de armazenamento a 25°C	13 semanas de armazenamento a 25°C
I II	III	I II	III
form. 1: 2 mg/1 ml	>99 n.d.	2,0	>99 n.d.	2,0
form. 1a: 8 mg/ml	>99 n.d.	4,7	>99 n.d.	5,5

I teor de proteína em % com OD 280

II agregados em % com SE-HPLC

III turbidez da solução reconstituída em unidades de turbidez (número adimensional)

Exemplo 3

Comparação das formulações 1 e 4. A formulação 4 contém apenas sacarose como o reforçador e nenhum fosfato de arginina e nenhum Tween 20. A formulação 4 é instável.

	Formulação 1	Formulação 4
MAB HBV	2,0 mg	2,0 mg
tampão de fosfato	15 mM	15 mM
cloreto de sódio	30 mM	30 mM
sacarose	68,0 mg	68,0 mg
arginina	10,0 mg	-
ácido fosfórico ou NaOH	ad pH 6,5	ad pH 6,5
Tween 20	0,1 mg	-
água para finalidade de injeção	ad 1,0 ml	ad 1,0 ml

Tabela 4a: Armazenamento a 25°C

	4 semanas de armazenamento a 25°C I II III	13 semanas de armazenamento a 25°C I II III
form. 1: sacarose com fosf. de arg. e Tween 20	100 n.d. 1,7	>99 n.d. 1,6
form. 4: sacarose sem fosf. de arg. e Tween 20	98,3 1,6 6,1	96,0 4,3 9,5
Tabela 4b: Armazenamento a 50°C
	4 semanas de armazenamento a 25°C I II III	13 semanas de armazenamento a 25°C I II III
form. 1: sacarose com fosf. de arg. e Tween 20	100 n.d. 2,0	>99 n.d. 2,0
form. 4: sacarose sem fosf. de arg. e Tween 20	96,0 4,2 8,5	89,8 10,1 10,9

Legenda

I teor de proteína em % com OD 280

II agregados em % com SE-HPLC

III turbidez da solução reconstituída em unidades de turbidez (nú5 mero adimensional)

Exemplo 4

Variação do componente aminoácido da formulação. As formulações com aminoácidos básicos, ácidos e neutros são estáveis.

Composição das formulações:

10	MAB HBV tampão de fosfato	2,0 mg 15 mM
	cloreto de sódio	30 mM
	sacarose	35 - 70 mg
	arginina	variável
15	ácido fosfórico ou NaOH	ad pH 6,5
	Tween 20	0,1 mg
	água para finalidade de injeção	ad 0,1 ml

Tabela 5

	Amino ácido
Formulação 1	arginina (básica)
Formulação 5	ornitina (básica)
Formulação 6	leucina (neutra)
Formulação 7	ácido aspártico (ácido)

O valor do pH é ajustado por meio de solução de ácido fosfórico 20 ou hidróxido de sódio.

Tabelas 6a - d

Resultados do exame das formulações 1,5,6, 7, após armazenamento por 4 e 13 semanas.

a) Tabela 6a, Formulação 1 (arginina):

	Período de armazenamento a 25°C	4 semanas a 50°C	Período de armazenamento a 25°C	13 semanas a 50°C
% do teor de pro-	100	>99	100	>99
teína (OD 280)
% agregados	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
(SE-HPLC)
turbidez	1,7	2,0	1,6	2,0

b) Tabela 6b, Formulação 5 (ornitina):

	Período de armazenamento a 25°C	4 semanas a 50°C	Período de armazenamento a 25°C	13 semanas a 50°C
% do teor de pro-	>99	>98	>98	>98
teína (OD 280)
% agregados	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
(SE-HPLC)
turbidez	1,9	1,9	2,0	2,1

c) Tabela 6c, Formulação 6 (leucina):

	Período de armazenamento a 25°C	4 semanas a 50°C	Período de armazenamento a 25°C	13 semanas a 50°C
% do teor de pro-	>98	>98	>98	>98
teína (OD 280)
% agregados	n.d.	n.d.	0,1	0,1
(SE-HPLC)
turbidez	2,2	2,4	2,8	2,7

d) Tabela 6d, Formulação 7 (ácido aspártico):

	Período de armazenamento a 25°C	4 semanas a 50°C	Período de armazenamento a 25°C	13 semanas a 50°C
% do teor de pro-	>98	>98	>98	>98
teína (OD 280)
% agregados	n.d.	n.d.	0,1	0,1
(SE-HPLC)
turbidez	2,7	2,7	3,4	4,0

Exemplo 5

O Exemplo 5 contém a formulação 1 em vários valores de pH, os liofilizados são preparados como descrito no Exemplo 2, o pH da solução de substâncias auxiliares e da solução do produto foi ajustado antes da liofiliza5 ção com ácido fosfórico 85%.

Formulação:

MAB HBV	2,0 mg
tampão de fosfato	15 mM
cloreto de sódio	30 mM
sacarose	68 mg
arginina	10 mg
ácido fosfórico ou NaOH	ad pH 5; 6,5; 8
Tween 20	0,1 mg
água para finalidade de injeção	ad 0,1 ml
Os liofilizados foram preparados com os valores de pH apresen-

tados na Tabela 7.

Após fazer flange nas garrafas de injeção, estas foram armazenadas na ausência de luz sob condições de temperatura definidas. Após períodos de armazenamento de 4 semanas e 13 semanas, as amostras foram analisadas (teor de proteína em %: OD 280, agregados em %: SE-HPLC, turbidez). A formulação era estável em todos os valores de pH.

Tabela 7:

	PH
Formulação 8	5
Formulação 9 (idêntica a 1)	6,5
Formulação 10	8

Tabela 8a: Armazenamento a 25°C

	4 semanas de armazenamento a 25°C	13 semanas de armazenamento a 25°C
I II	III	I II	III
Formulação 8	100	n.d.	1,9	>99	n.d.	2,3
Formulação 9 (=1)	100	n.d.	1,7	100	n.d.	1,6
Formulação 10	>99	n.d.	2,3	>99	n.d.	2,6

Tabela 8b: Armazenamento a 50°C

	4 semanas de armazenamento a 25°C	13 semanas de armazenamento a 25°C
I II	III	I II	III
Formulação 8	>99	n.d.	2,2	>99	n.d.	2,3
Formulação 9 (=1)	>99	n.d.	2,0	>99	n.d.	2,0
Formulação 10	>98	n.d.	2,5	>98	n.d.	2,6

Legenda:

I teor de proteína em % com OD 280

II agregados em % com SE-HPLC

III turbidez da solução reconstituída em unidades de turbidez (número adimensional)

Exemplo 6

A formulação descrita a seguir contendo o tensoativo Pluronic F 68, em vez de Tween 20, foi preparada como descrito acima.

O armazenamento e o exame da estabilidade foram conduzidos de maneira análoga àquelas dos outros exemplos.

Formulação 11:

	MAB HBV	2,0 mg
	tampão de fosfato	15 mM
15	cloreto de sódio	30 mM
	sacarose	68 mg
	arginina	10,0 mg
	ácido fosfórico ou NaOH	ad pH 6,5
	Pluronic F 68	0,1 mg
20	água para finalidade de injeção	ad 0,1 ml
	A Formulação 1 é selecionada como uma comparação e é idên-

tica à Formulação 11, exceto para Tween 20 em vez de Pluronic F 68. Ambas as formulações eram estáveis.

Tabela 9: Dados de estabilidade da formulação contendo os tensoativos Pluronic F 68 e Tween 20.

	Formulação 11	Formulação 1
período de armazena- mento 4 semanas	período de armazena- mento 13 semanas	período de armazena- mento 4 semanas	período de armazena- mento 13 semanas
25°C	50°C	25°C	50°C	25°C	50°C	25°C	50°C
% do teor de proteína (OD 280)	>98	>98	>98	>98	100	>99	100	>99
% agregados (SE-HPLC)	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
turbidez	1,9	1,9	2,5	2,2	1,7	2,0	1,6	2,0

Exemplo 7:

A Formulação 12 descrita neste exemplo corresponde, essenci5 almente à formulação 1, exceto que manitol foi usado em vez de sacarose como um reforçador. Pode-se observar que a formulação de manitol é instável.

Formulação 12:

	MAB HBV	2,0 mg
10	tampão de fosfato	15 mM
	cloreto de sódio	30 mM
	manitol	25,0 mg
	arginina	10,0 mg
	ácido fosfórico ou NaOH	ad pH 6,5
15	Tween 20	0,1 mg
	água para finalidade de injeção	ad 0,1 ml

Tabela 10: Dados de estabilidade das formulações contendo o reforçador manitol (formulação 12) e sacarose (formulação 1)

	Formulação 12	Formulação 1
período de armazena- mento 4 semanas	período de armazena- mento 13 semanas 25°C 50°C	período de armazena- mento 4 semanas	período de armazena- mento 13 semanas
25°C	50°C
25°C	50°C	25°C	50°C
% do teor de pro-	96,2	91,8	94,0 84,5	100	>99	100	>99
teína (OD 280)
% agregados	3,6	8,4	5,8 15,9	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
(SE-HPLC)
turbidez	3,2	6,9	4,9 13,2	1,7	2,0	1,6	2,0

Exemplo 8

Mais evidência para a necessidade da combinação de açúcar, aminoácido e tensoativo é dada pela formulação 1 de comparação, que con5 têm todos os componentes listados com a formulação 13 composta de anticorpo, tampão de fosfato, cloreto de sódio e fosfato de arginina. A formação do agregado é aumentada e os valores de turbidez ficam piores sem açúcar e tensoativo.

Formulação 13

MAB HBV	2,0 mg
tampão de fosfato	15 mM
cloreto de sódio	30 mM
arginina	35,0 mg
ácido fosfórico ou NaOH	ad pH 6,5
água para finalidade de injeção	ad 0,1 ml

Tabela 11: Dados de estabilidade para a formulação 13 (sem sacarose e Tween 20, apenas com fosfato de arginina como reforçador) e a formulação 1

	Formulação 13	Formulação 1
período de armazena- mento 4 semanas	período de armazena- mento 13 semanas	período de armazena- mento 4 semanas	período de armazena- mento 13 semanas
25°C	50°C	25°C	50°C	25°C	50°C	25°C	50°C
% do teor de proteína (OD 280)	97,6	94,9	95,8	89,0	100	>99	100	>99
% agregados (SE-HPLC)	2,6	4,5	4,0	10,7	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
turbidez	2,9	4,5	3,8	12,3	1,7	2,0	1,6	2,0

Exemplo 9

Embora uma formulação estável seja obtida sem tensoativo (Tween 20) e apenas com sacarose e arginina, os valores de turbidez pioram (formulação 14).

Formulação 15

MAB HBV	2,0 mg
tampão de fosfato	15 mM
cloreto de sódio	30 mM
sacarose	68,0 mg
arginina	10,0 mg
ácido fosfórico ou NaOH	ad pH 6,5
água para finalidade de injeção	ad 0,1 ml

Tabela 12: Dados de estabilidade da formulação 14 e formulação 1

	Formulação 14	Formulação 1
período de armazena- mento 4 semanas	período de armazena- mento 13 semanas	período de armazena- mento 4 semanas	período de armazena- mento 13 semanas
25°C	50°C	25°C	50°C	25°C	50°C	25°C	50°C
% do teor de proteína (OD 280)	>99	>98	>98	>98	100	>99	100	>99
% agregados (SE-HPLC)	0,2	0,3	0,5	1,3	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
turbidez	3,4	4,8	8,8	13,3	1,7	2,0	1,6	2,0

Exemplo 10

A tabela a seguir mostra os componentes da formulação 15. O anticorpo usado é anti-L-selectina. Os dados apresentados na Tabela 13a, para o exame da estabilidade, mostram que a formulação usada propicia uma estabilização adequada.

Composição da formulação 15:

	Formulação 15
anti-L-selectina	7,0 mg
tampão de fosfato	15 mM
cloreto de sódio	30 mM
sacarose	68,0 mg
arginina	10,0 mg
ácido fosfórico	ad pH 6,5
Tween 20	0,1 mg
água para finalidade de injeção	ad 1,0 ml

Tabela 13a: Dados de estabilidade para a formulação 15a 25°C

	4 semanas de armaze-	13 semanas de armaze-
	namento a 25°C	namento a 25°C
	I II III	I II III
form. 15:7 mg/1ml	>99 n.d. 2,5	>99 n.d. 2,9

Tabela 13b: Dados de estabilidade para a formulação 15a 50°C

	4 semanas de armazenamento a 25°C I II III	13 semanas de armazenamento a 25°C I II III
form. 15:7 mg/1 ml	99 n.d. 4,1	99 n.d. 5,2

I teor de proteína em % com OD 280

II agregados em % com SE-HPLC

III turbidez da solução reconstituída em unidades de turbidez (número adimensional)

Exemplo 11

Estabilização do anticorpo anti-L-NGFR (anti-L-receptor de fator de crescimento nerval)

Formulação 16:

Um liofilizado com a seguinte formulação (análoga à formulação 1) é preparado:

	Formulação 16
anti-L-NGFR	0,25 mg
tampão de fosfato	15 mM
sacarose	75,0 mg
arginina	10 mg
ácido fosfórico	ad pH 6,5
Tween 20	0,1 mg
água para finalidade de injeção	ad 1,0 ml

O liofilizado do anti-L-NGFR é analogamente preparado à preparação dos liofilizados de MAB-HBV e anti-L-selectina.

Uma solução aquosa contendo os aditivos açúcar, aminoácido e tensoativo a pH 5 a 8 é misturada com uma solução do anti-L-NGFR em um tampão de fosfato. Os sais de fosfato são adicionados em quantidades tais que são obtidas as concentrações definidas anteriormente. Subseqüentemente, é esterilizada por filtração e a solução preparada dessa maneira é liofilizada. Após liofilização, obtém-se um bolo de liofilização opticamente perfeito. O anticorpo anti-L-NGFR permanece estável. Após reconstituição do liofilizado com água para finalidade de injeção, obtém-se uma solução clara.

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Preparação farmacêutica liofilizada estável de um anticorpo monoclonal ou policlonal, caracterizada pelo fato de que contém sacarose, arginina, um tensoativo e uma substância tampão inorgânica, contendo 7,25-35 mg de sacarose, 1,25-5 mg de arginina e 0,0125-0,05 mg de um tensoativo com base em 1 mg do referido anticorpo monoclonal ou policlonal, em que a preparação é essencial mente livre de poli etileno glicóis e/ou isenta de substâncias auxiliares farmacêuticas padrão na forma de proteínas.
2. 2. Preparação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é composta essencial mente de:

   a) um anticorpo monoclonal ou policlonal;

   b) sacarose;

   c) arginina;

   d) um ácido inorgânico agindo como uma substância tampão e

   e) um tensoativo.
3. 3. Preparação de acordo a com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou policlonal é um anticorpo para o vírus de hepatite B, para o vírus de AIDS, citomegalovírus, vírus de meningoencefalite (FSME), vírus de rubéola, vírus de sarampo, agentes patogênicos de raiva, bactéria de Pseudomonas aeruginosa, vírus de varicelaZoster, agentes patogênicos do tétano, fator de van Willebrandt, NGRF (receptor de fator de crescimento nerval), PDGFR (receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas: E-selectina, L-selectina ou P-selectina); integrinas ou agentes patogênicos de difteria.
4. 4. Preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é um polissorbato ou um polímero de polioxietileno-polioxipropileno.
5. 5. Preparação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que contém substâncias auxiliares fisiologicamente toleradas do grupo compreendendo ácidos, bases, tampões e/ou agentes isotonificantes.
6. 6. Preparação farmacêutica aquosa de anticorpos monoclonais ou policlonais, caracterizada pelo fato de que é obtenível por redissolução do liofilizado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. 7. Preparação farmacêutica aquosa de acordo com a reivindica5 ção 6, caracterizada pelo fato de que a solução apresenta um valor de pH de

   5 a 8, de preferência, de 6 a 7,4.
8. 8. Processo para a produção de uma preparação farmacêutica liofilizada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que uma preparação aquosa é produzida, que contém um
9. 10 anticorpo monoclonal ou policlonal, como a substância ativa, e sacarose como açúcar, arginina como um aminoácido e um tensoativo, como aditivos, bem como, opcionalmente, outras substâncias auxiliares, contendo 7,25-35 mg de açúcar, 1,25-5 mg de aminoácido 0,0125-0,05 mg de um tensoativo com base em 1 mg do referido anticorpo monoclonal ou policlonal, em que a
10. 15 preparação é essencial mente livre de poli etileno glicóis e/ou isenta de substâncias auxiliares farmacêuticas padrão na forma de proteínas e, subseqüentemente, a solução é liofilizada.