BR9916325B1 - método para aumentar a expressão de proteìna de fusão de receptor-ig biologicamente ativa, método para a expressão de altos rendimentos de proteìnas de fusão fc de ig-membro da famìlia de receptor tnf, bem como método para obtenção de proteìnas de fusão fc da ig - ltbr ativas e minimizar a expressão de proteìnas de fusão fc da ig - ltbr inativas. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "métodopara aumentar a expressão de proteína de fusão de re-ceptor-ig biologicamente ativa, método para a expressãode altos rendimentos de proteínas de fusão fc de ig -membro da família de receptor tnf, bem como método pa-ra obtenção de proteínas de fusão fc da ig - ltbr ativas eminimizar a expressão de proteínas de fusão fc da ig -ltbr inativas".

antecedentes

A família de TNF consiste em pares de Iigantes e seus recepto-res específicos referidos como Iigantes da família TNF e receptores da famí-lia (Bazzoni e Beutler, 1996; Aggarwal e Natarajan, 1996). Os Iigantes taiscomo TNF são tipicamente encontrados como formas de ligação da mem-brana em superfícies celulares, ou em alguns casos eles são seletivamenteseparados da superfície celular e secretados. Os Iigantes aglutinam a recep-tores específicos e o evento de aglutinação serve para agregar dois ou maisreceptores. Os domínios intracelulares destes receptores podem de algummodo sentir esta mudança e comunicam esta informação na célula via ummecanismo de transdução de sinal. A família está envolvida na regulação dosistema imunológico e possivelmente outros sistemas não-imunológicos. Aregulação está freqüentemente em um nível de "desvio mestre" tal que asinalização da família de TNF pode resultar em um grande número de even-tos subseqüentes melhores tipificados por TNF. TNF pode iniciar a respostainflamatória protetora geral de um organismo para invasão externa a qualenvolve a exibição alterada de moléculas de adesão envolvidas em tráfegocelular, produção de quimiocina para direcionar células específicas em com-partimentos específicos e a preparação de várias células efetuadoras. Comotal, a regulação desses caminhos tem potencial clínico.

A família receptora de TNF é uma coleção de proteínas relacio-nadas que geralmente consistem em um domínio extracelular, um domíniode transmembranas e um domínio de sinalização intracelular. O domínio ex-tracelular é formado de 2-6 cópias de um domínio firmemente ligado a dis-Segue-se folha 1asulfito e é reconhecido na base da única disposição de resíduos de cisteína(Banner e outros, 1993). Cada receptor aglutina a um(s) ligante(s) corres-pondente embora um Iigante possa dividir vários receptores. Em alguns ca-sos, é claro que formas solúveis dos receptores em necessidade de região

Segue-se folha 2de transmembrana e/ou domínio intracelular existam naturalmente. Na natu-reza, versões truncadas destes receptores podem ter papéis reguladoresbiológicos diretos. Um exemplo desse processo é fornecido pelo sistema deosteoprotegerina. Osteoprotegerina é um receptor da família de TNF secre-tado que bloqueia sinalização via o RANK-L (também chamado TRANCE)e/ou TRAIL para receptores que disparam ativação de osteoclasto. Bloque-ando estes receptores, mais provável receptor RANK, reabsorção óssea éimpedida e massa óssea aumenta (Bucay e outros, 1998). Claramente, viro-ses tem usado esta tática para inibir atividade de TNF em seus organismoshospedeiros (Smith e outros, 1994). Estes receptores podem sinalizar várioseventos incluindo sinais de diferenciação celular, morte celular ou sobrevi-vência celular. Sinalização de morte celular freqüentemente é disparada vialigações relativamente diretas à cascata de proteases de caspase no casodos receptores FAS e TNF.

Os receptores de TNF são ferramentas poderosas para elucidarcaminhos biológicos já que eles são facilmente convertidos a proteínas defusão de imunoglobulina as quais têm meias-vidas largas em soro. Formasde receptores solúveis diméricos podem ser inibidoras de eventos mediadospor Iigantes ou secretados naturais ou de ligação de superfície. Aglutinandoa estes Iigantes estas proteínas de fusão previnem o Iigante de interagir comreceptores associados da célula e inibem o sinal associado. As proteínas defusão do receptor-lg são úteis em um sentido experimental, e têm tambémsido com sucesso usadas clinicamente, por exemplo TNF-R-Ig tem sidousado para tratar doença intestinal inflamatória, artrite reumatóide e a sín-drome clínica aguda acompanhando administração de OKT3 (Eason e ou-tros, 1996; Feldmann e outros, 1997; van Dullemen e outros, 1995). A mani-pulação destes muitos eventos mediados por sinalização através da famíliade TNF de receptores pode ter aplicação no tratamento de doenças basea-das em imune bem como o amplo limite de doenças humanas que têm se-qüelas patológicas devido a envolvimento do sistema imunológico. Porexemplo, uma forma solúvel de um receptor recentemente descrito, osteo-protegerina, tem sido apresentada a bloquear a perda de massa óssea(Simmonet e outros, 1997). Assim, os eventos controlados por sinalizaçãode família de TNF não são necessariamente limitados à regulação do siste-ma imunológico. Anticorpos para receptores podem bloquear aglutinação deIigante e assim também têm aplicação clínica. Tais anticorpos são freqüen-temente de vida muito longa e têm vantagens sobre a proteínas de fusão doreceptor-lg solúveis as quais têm meias-vidas mais curtas no sangue.

Enquanto inibição do caminho mediado por receptor representaa aplicação terapêutica mais explorada destes receptores, originalmente foia ativação dos receptores de TNF que mostrou promessa clínica (Aggarwale Natarajan, 1996). Ativação dos receptores de TNF pode iniciar morte ce-lular na célula alvo e disso a aplicação a tumores foi e ainda é atrativa(Eggermont e outros, 1996). O receptor pode ser ativado ou por administra-ção do ligante, isto é, o caminho natural ou por administração de anticorposque podem ligar-se transversalmente ao receptor. Anticorpos podem servantajosos para o tratamento de, por exemplo, cânceres, já que anticorpospodem persistir no sangue por períodos longos de forma contrária a ligantes,os quais geralmente têm breve espaço de vida curta no sangue. Anticorposagonistas são armas úteis no tratamento de câncer já que receptores podemser expressos mais seletivamente em tumores ou eles podem somente sina-Iizar a morte celular ou diferenciação em tumores. Igualmente, muitos even-tos imunológicos positivos são mediados via os receptores da família deTNF, por exemplo reações inflamatórias de hospedeiros, produção de anti-corpo etc. e portanto anticorpos agonistas poderiam ter efeitos benéficos emoutras, aplicações não oncológicas.

Paradoxalmente, a inibição de um caminho pode também terbenefício clínico no tratamento de tumores. Por exemplo o ligante Fas é ex-presso por alguns tumores e esta expressão pode levar à morte de linfócitospositivos Fas1 assim facilitando a capacidade do tumor de evadir o sistemaimunológico. Neste caso, inibição do sistema de Fas poderia então permitir osistema imunológico reagir ao tumor em outros modos agora que o acesso épossível (Green e Ware, 1997).

Um membro desta família de receptor, o receptor de Iinfotoxina-beta (LTpR) aglutina a Iinfotoxina (LT) de superfície a qual é composta deum complexo trimérico de cadeias de alfa e beta Iinfotoxina (Crowe e outros,1994). Este par receptor-ligante é envolvido no desenvolvimento do sistemaimunológico periférico e a regulação de eventos nos nódos de Iinfa e baço do sistema imunológico maduro (Ware e outros, 1995; Mackay e outros1997; Rennert e outros, 1996; Rennert e outros, 1997; Chaplin e Fu1 1998).Uma proteína de fusão de imunoglobulina de receptor de linfotoxina-β podeser feita entre LTpR e IgG (LTpR-Ig) que bloqueia sinalização entre o Iigantede superfície LT e o receptor com conseqüências no estado funcional de células dendríticas foliculares (Mackay e Browning 1998). Este bloqueiopode além do mais levar a doença auto-imune diminuída em modelos roedo-res (Mackay e outros, 1998. U.S.S.N. 08/505.606 depositada em 21 de julhode 1995 e U.S.S.N. 60/029.060 depositada em 26 de outubro de 1996). Umsegundo membro desta família de receptor chamado HVEM para mediador de entrada do vírus da herpes aglutina a um Iigante chamado Leve (Mauri, eoutros 1998) bem como ao Iigante LT herteromérico. A função deste receptoré correntemente desconhecida, mas uma proteína de fusão de HVEM-Igpode ser útil para o tratamento de doença imunológica e esta construçãotem sido apresentada a afetar ensaios de função imunológica in vitro (Har- roo. J. A.. e outros 1998).

A despeito dos avanços clínicos de membros da família TNFcomo discutido acima, ainda permanece uma necessidade por um métodode obter os rendimentos desejados de fusões de receptor Ig adequadas parauso em um ajuste clínico. Por exemplo, a proteína LTpR-Ig pode entrar emduas formas quando expressa em células de macaco cos ou em células deovário de hamster Chinês. Uma forma aglutina com alta afinidade ao passoque a outra não. Portanto, existe uma necessidade por um método para pro-duzir rendimentos maiores da forma a qual aglutina com alta afinidade, en-quanto minimizando a presença da forma de afinidade menor.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos para a expressão derendimentos altos da forma de fusões de proteína-lg tendo alta afinidadeaglutinando a seu ligante, referido aqui, como a forma 'ativa", a forma, culti-vando hospedeiros transformados com DNA codificando as fusões deseja-das em um sistema de cultura em uma temperatura baixa desse modo mini-mizando a quantidade de formas de proteínas de mal dobrado ou mal ponte-ado. A invenção em várias modalidades refere-se a métodos de expressaraltos rendimentos em sistemas de expressão de mamíferos, cultivando hos-pedeiros transformados em uma temperatura de aproximadamente 27°C acerca de 35°C. Preferivelmente, hospedeiros de mamíferos serão cultivadosem temperatura de aproximadamente 27°C a aproximadamente 32°C.

Em ainda outras modalidades a invenção refere-se a métodospara a expressão de altos rendimentos de proteínas de fusão ativas culti-vando hospedeiros transformados em um sistema de expressão de leveduraem temperaturas baixas. Quando as proteínas desejadas são expressas emleveduras, as temperaturas preferidas são de aproximadamente 10°C a cer- ca de 25°C, mas preferivelmente de aproximadamente 15°C a cerca de20°C.

Em certos métodos da invenção reivindicada, a fusão de proteí-na-lg compreende um membro da família receptora de TNF tal como recep-tor de linfotoxina-β ou um fragmento disso. Alternativamente, os métodos reivindicados podem abranger a expressão de uma proteína de fusão dese-jada em qualquer sistema de expressão em temperaturas baixas, tais comoum sistema de inseto ou bacterial.

Em outras modalidades, a invenção reivindicada, abrange asfusões de proteína-lg ativa que são obtidas pelos métodos reivindicados, e composições farmacêuticas compreendendo-as. Em ainda outras modalida-des, a invenção refere-se a métodos de produzir preparações farmacêuticascompreendendo cultivar um hospedeiro transformado com DNA codificandouma fusão de proteína-lg desejada em um sistema de cultura tendo umatemperatura baixa de aproximadamente 27°C a cerca de 35°C, preferivel- mente 27°C a cerca de 32°C, para expressar um alto rendimento de proteí-nas de fusão ativas, recuperando as fusões de proteína ativa do sistema decultura, e combinando as proteínas de fusão ativas recuperadas com umveículo aceitável farmaceuticamente. Em modalidades preferidas, a fusão deproteína-lg compreende uma linfotoxina-β ou um fragmento disso, ou HVEM,ou um fragmento disso.

Em ainda outras modalidades, a invenção reivindicada refere-sea composições farmacêuticas obtidas usando os métodos descritos.

A invenção reivindicada em modalidades diferentes refere-se asistemas de expressão de mamífero, bem como outros sistemas de expres-são, tais como levedura, sistemas bacteriais, ou sistemas de inseto.

Em certas modalidades, a invenção refere-se a métodos paraníveis altos de expressão de proteínas de fusão ativas em leveduras, culti-vando em temperaturas baixas de aproximadamente 10°C a cerca de 25°C,mais preferivelmente, aproximadamente 15°C a cerca de 20 °C. Fusões ati-vas obtidas por este método de expressão em levedura, e composições far-macêuticas compreendendo estas funções ativas são também abrangidas.Métodos de produzir preparações farmacêuticas são abrangidos dentro dainvenção compreendendo fusões de proteína-lg ativa compreendendo culti-var uma célula de levedura transformada com DNA codificando uma fusãodesejada em uma temperatura baixa, preferivelmente aproximadamente10°C a cerca de 25 °C, mais preferivelmente aproximadamente 15°C a cercade 20°C. Nas modalidades mais preferidas de todas as composições e mé-todos da invenção, a fusão de proteína-lg compreende um receptor de Iin-gotoxina-β, HVEM. ou um fragmento disso.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Esquemática da proteína quimérica receptora deimunoglobulina. O painel esquerdo apresenta um desenho de uma moléculade IgG típica, os domínios de Fc são preenchidos em preto, os domínios va-riáveis de cadeia pesada são coloridos em cinza e as cadeias leves são dei-xadas em brancos. O painel médio contém um desenho esquemático damolécula de LTpR incluindo os domínios intracelulares (cinza escuro) e ex-tracelulares (cinza claro). O painel direito representa um desenho esquemá-tico da proteína de fusão LTpR-Ig.

Figuras 2: Esquemática conceituai mostrando o provável defeitona forma de LTpR morta, embora os aminoácidos mal dobrados ou malponteados atuais não tenham sido identificados.

Figura 3: Análise de SDS-PAGE de LTpR humano antes e apóstratamento com PNGase F. Linhas 1 e 2 contém LTpR-Ig humano purificado de sobrenadante de cultura de célula CHO cultivado a 37°C usando croma-tografia de afinidade de Proteína A. Linha 3 apresenta a mesma preparaçãoapós tratamento com PNGAse F para remover todos oligossacarídeos liga-dos a N. Linha 1 é passada sob condições não-redutoras, linhas 2 e 3 sãopassadas sob condições redutoras. As faixas de proteínas são visualizadas manchando o gel com Azul Brilhante de Coomassie.

Figura 4: Uma análise de gel de poliacrilamida SDS não reduzi-do da proteína fluindo através de umas linhas de coluna de atividade deAGH1 e a proteína eluída com tampão de fosfato de pH 3,5. A proteína an-tes de purificação por afinidade é apresentada na linha no lado direito do gel.As faixas de proteínas são visualizadas manchando o gel com Azul Brilhantede Coomassie.

Figura 5: Capacidade das frações de fluxo direto (inferior) e eluí-das (superior) da coluna de afinidade AGH1 para aglutinar a Iinfotoxina desuperfície. Valores de intensidade de fluorescência médios foram derivados de uma análise de FACS como descrito. Exemplos dos perfis de FACS sãomostrados na direita onde o LTpR-Ig é comparado a aglutinação de umaproteína de LFA-3-lg de controle.

Figura 6: Cromatografia HIC analítica de LTpR-Ig humano usan-do uma coluna de éter POROS e um gradiente decrescente de sulfato de amônia. Pico 1 representa a inferior, forma inativa inferior, pico 2 a maior,forma ativa de LTpR humano. Frações correspondendo a picos 1 e 2 res-pectivamente foram reunidas e analisadas em um gel de SDS-PAGE de 4-20% (painel inserido). A linha rotulada "1" contém o material "inativo" de pico1, linha 2 o material "ativo" de pico 2 do cromatograma de HIC. O material inicial é mostrado em Linha "L". A linha rotulada "M" contém marcadores depeso molecular.

Figura 7: Cromatografia de HIC preparatória (cromatografia deinteração hidrófoba) de LTpR-Ig humano usando uma coiuna de Honte deFarmácia 15 ΗΡΕ. Proteína A eluiu contendo LTpR-Ig humano é ajustadacom NaCI 5 M para uma concentração final de NaCI 1,5 M, fosfato de sódiode 20 mM, pH 7,0 e carregada na coluna. A coluna foi lavada com 5 volumesde NaCI 1,5 M, fosfato de sódio de 20 mM, pH 7,0 e eluída com fosfato desódio 20 mM, pH 7,0. O eixo X representa o tempo em minutos, o eixo Ymostra a absorbância em 280 nm. Mostrado na inserção da figura é a ima-gem de um gel SDS-PAGE 4-20% não-redutor manchado com Azul Brilhantede Coomassie do fluxo direto (FT) e eluição (E). As posições de migraçãodas formas "vivas" e "mortas" são indicadas com setas.

Figura 8: Análise de SDS-PAGE/Western blot de LTpR-Ig huma-no secretado de células CHO cultivadas em temperaturas diferentes. Os so-brenadantes de célula CHO cultivados nas temperaturas de cultura indica-das contendo LTpR-Ig humano foram analisadas em duplicata por eletrofo-rese de SDS-PAGE não-redutora usando géis de gradiente 4-20% seguidopor Western blotting.

Figura 9: Efeitos de temperatura de cultura na porcentagem dematerial morto na quantidade total de LTpR-Ig humano secretado de célulasde mamíferos. Frascos duplicados contendo células de CHO secretandoLTpR-Ig humano recombinante foram cultivados nas temperaturas indicadase o LTpR-Ig humano secretado foi purificado por cromatografia por afinidadede proteína A. A porcentagem da forma "inativa" de LTpR-Ig humano foi ta-xada em duplicata usando cromatografia de HIC analítica. O eixo X repre-senta a temperatura de cultura, o eixo Y mostra a quantidade de material"inativo" expresso como uma porcentagem da quantidade total de LTpR-Ighumano secretado pelas células.

Figura 10: Análise de SDS-PAGE não-redutora HVEM-Ig prepa-rado em 28, 32 e 37°C: preparações purificadas de proteína A de HVEM-Igderivado de células cultivadas em 28, 32, e 37°C foram misturados comtampão de amostra de SDS-PAGE não-redutor. As faixas de proteínas foramvisualizados com azul de Coomassie. A faixa marcada com uma seta repre-senta HVEM-Ig não-agregado. As faixas de pesos moleculares maiores visí-veis no gel correspondem a formas agregadas.

Figuram 11: Análise FACS da aglutinação de HVEM-Ig gerado a37° contra 32°C para superfície Leve e/ou Ι_Ταβ. A). Aglutinação de HVEM-Ig como uma concentração de função para 293 células transfectadas comLEVE humano mostrando que material gerado a 32 C aglutina melhor doque material 37. B) Um exemplo dos perfis de FACS observados de HVEM-Ig aglutinando em uma concentração de 2 ug/ml para 293 células transfecta-das LEVES. C). Um exemplo adicional da aglutinação aperfeiçoada de 32 Cgerou HVEM-Ig para a superfície da linha de hibridoma de célula II-23T aqual exibe ambos complexo LEVE e de linfotoxina-αβ (ίΤαβ) de superfície.

Figura 12: Uma análise de BlAnúcleo da aglutinação de ou Ii-gantes LEVE ou de linfotoxina-α (LT-a) para lascas de BIA núcleo imobilizouHVEM-Ig gerado em três temperaturas diferentes. Cada curva mostra umevento de aglutinação em uma concentração de Iigante e as concentraçõesseguintes foram empregadas: 30,15, 7,5, 3,75, 1,87, 0,93, 0,47, 0,23, 0,11 e0,0 ug/ml. Cada lasca foi carregada ao mesmo nível RU indicando quequantidades iguais de receptor-lg foram ligadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Referência será agora feita em detalhe à invenção reivindicada.Esta invenção refere-se à capacidade para produzir altos níveis de formasfuncionais ou ativas de proteínas de fusão de imunoglobulinas de receptoresna família TNF. O sucesso de intervenções clínicas com proteínas de fusãode receptor-lg exige uma presença de longa duração e a capacidade paratratar cronicamente ou um mínimo durante fulgores da doença. Idealmente,preparações de tais proteínas de fusão para uso humano não terão quais-quer formas agregadas, inativas ou mal dobradas conforme sua presençareduzirá a potência da droga e as estruturas alteradas poderão extrair res-postas de anticorpos que podem facilitar claridade da droga desse modoreduzindo sua potência. Além do mais, anticorpos de anti-receptores podemdiretamente reticular receptor natural nas superfícies celulares desse modoativando-as, isto é, anticorpos agonistas tais como aqueles descritos emBrowning e outros 1996, JEM. Anticorpos agonistas ativam o sistema e as-sim tratamentos de receptores-lg adicionais podem ser menos eficazes ouainda prejudiciais. Por "proteínas de fusão de imunoglobulina" refere-se aqualquer fusão de quaisquer porções funcionais do domínio extracelular deum polipeptídeo com qualquer porção das regiões constantes de imunoglo-bulinas, por exemplo os domínios CH1, CH2 ou CH3 ou combinações disso.Preferivelmente o polipeptídeo é um membro da família de TNF de recepto-res. As porções da molécula de Ig podem derivar de qualquer um dos váriosisótopos de imunoglobulina, incluindo, por exemplo, IgGI, lgG2, IgM, IgA,etc. Por "família de TNF de receptores" refere-se a qualquer receptor, quer ligação de membrana naturalmente quer secretado (como no caso de osteo-protegerina), a qual tem os padrões de formação de ponte de cisteína defamília TNF canônica ou qualquer receptor o qual aglutina a um membro de-finido da família de TNF de Iigantes (por exemplo, Banner e outros, 1993). Ainvenção reivindicada em outras modalidades refere-se a fusões de recep-tor-lg de família de TNF obtidas pelos métodos discutidos aqui contidos, bemcomo para preparações farmacêuticas compreendendo-as.

Proteína de LTpR-Ig é expressa em duas formas em células demacaco cos ou células de ovário de hamster Chinês. Uma forma aglutinaIigante com alta afinidade, a forma "ativa" ao passo que a outra, a forma "in- ativa" não. Esta mistura de formas vivas e mortas não tem sido descrita pre-viamente para qualquer uma das proteínas de fusão de receptor-lg de TNF,entretanto, a natureza da forma inativa não é clara. As duas formas foramdescobertas pela presença de duas faixas em uma análise SDS-PAGE. Omaterial expresso contém heterogeneidade de glicosilação considerável; entretanto, esta heterogeneidade mais provável não resulta nos problemasfuncionais descritos aqui. Por exemplo, quando o receptor é expresso comouma forma monomérica solúvel necessitando de domínio de transmembranae a região de imunoglobulina Fc, formas glicosiladas não-, mono- e di-N-Iigadas são observadas. Ambas formas glicosiladas simples e duplas podem ser imunoprecipitadas por BDA8, um anticorpo que reconheça somente for-mas funcionais. Além do mais, as formas purificadas por afinidade têm hete-rogeneidade de glicosilação similar. Mais provavelmente, especula-se que aexpressão de uma formas ancoradas de não-membrana levam a algumaligação de dissulfito aberrante resultando em reticulação inapropriada entreos dois braços do dímero de receptor-lg.

A família de TNF de receptores geralmente 3-4 domínios repeti- dos na porção de aglutinação de Iigante extracelular com aproximadamente3 pontes de dissulfito por domínio. É concebível que a formação de dobrainapropriada levaria a ou um modelo incorreto de ligações de dissulfito ou afalta de alguma formação de ligações de dissulfito (ilustradas esquematica-mente na Figuras 2). No caso de uma proteína de fusão de receptor-lg, pa- rece que a formação de dobra precoce do domínio de Fc permite sua dimeri-zação subseqüente a qual leva as duas cadeias de LTBR, isto é os dois bra-ços receptores, em grande proximidade. Se os domínios receptores aindanão completaram sua formação de dobra, então existe o potencial para sulfi-drilas livres unirem-se entre os braços, isto é formação de pontes interbra-ços. Tal formação de dobra incorreta pode ocorrer, ou mistura de dissulfitopode resultar em sulfidrilas livres justapostas próximo a ligações de dissulfitojá formadas em ambos casos levando a erros de formação de dobra. É pos-sível que formação de dobra incorreta ocorra dentro de um braço isto é errosde formação de dobra interbraço, embora tais erros não possam resultar emum formato radicalmente diferente da molécula final. Neste caso, formas ati-vas e inativas podem não ser resolvíveis usando métodos de dimensiona-mento convencionais.

Finalmente, no receptor de TNFR55, o quarto domínio, isto é, odomínio mais próximo à região da transmembrana tem sido demonstrado ser crítico para aglutinação de Iigante quando o receptor foi expresso como umaproteína de fusão Ig (Marsters e outros, 1992). Este domínio pode ser críticopara muitos dos receptores de TNF. Outro estudo em TNFR55 mostrou quefoi crítico somente no contexto da proteína de fusão Ig, e que a forma demembrana necessitando do quarto domínio era completamente ativa em aglutinar Iigante de TNF (Corcoran e outros, 1994). Entretanto, mais recen-temente, análises de cristalografia apontou para funções críticas possíveisassociadas com o quarto domínio (Naismith e outros, 1996), O quarto domí-nio é relativamente conservado entre espécie que ainda necessita contatosdiretos com o Iigante (Banner e outros, 1993). É possível que formação deponte interbraço nesta região entre os dois quartos domínios os quais situ-am-se próximo à articulação e domínios Fc CH2+CH3 não apreciavelmentealteram o formato global da molécula e portanto podem estar invisíveis emmétodos de separação baseados em tamanho. Contudo, esta molécula exi-biria aglutinação de Iigante conferida. Receptores tendo somente 3 domíniospoderiam comportar-se em um modelo similar.

Reduzindo a temperatura durante cultura de células resultou emperda significante da forma menor mal dobrada (isto é a forma inativa) sendosecretada. Esta melhoria é presumivelmente devida a uma taxa de formaçãode dobra reduzida do polipeptídeo a qual permitiria por mais tempo dobrar osdomínios individuais da porção de LTpR antes de reunir a proteína de fusãode receptor-lg na forma dímera esperada. A temperatura absoluta exigidapara retardar o processo de formação de dobra é dependente do hospedei-ro. Para células de mamíferos (isto é CHO), o método reivindicado preferi-velmente ocorre em temperaturas de aproximadamente 27°C a cerca de35°C, mais preferivelmente, a temperatura é aproximadamente 27°C a cercade 32°C. Métodos reivindicados também podem ser usados em sistemas decultura de leveduras. Cultura de levedura necessita ser cultivada em tempe-raturas de aproximadamente 10°C a cerca de 25°C, e preferivelmente deaproximadamente 15°C a cerca de 20°C para alcançar benefício significante.

Exploração da invenção reivindicada permite a formação de do-bra correta de fusões de proteínas Ig ativas. Pode ser desejável, em algu-mas circunstâncias, permitir o crescimento celular em temperaturas maiores,por exemplo, aproximadamente 37°C a cerca de 43°C, durante o qual so-mente o um nível muito baixo de expressão do gene clonado ocorrerá. Apóso período de crescimento desejado, as fusões podem ser expressas nastemperaturas baixas, para produzir um rendimento aumentado de fusõesativas. As temperaturas baixas em sistemas de mamíferos, como discutidoacima, são preferivelmente aproximadamente 27°C a cerca de 35°C, maspreferivelmente de aproximadamente 27°C a cerca de 32°C.Assim, os métodos reivindicados, diminuindo & temperatura naqual as fusões de proteína-lg são expressas, permitem um versado na técni-ca regular a formação de dobra de ambos proteína e porções de Ig da pro-teínas desejada.

Adicionalmente, usando o método reivindicado incluindo técnicasde cromatografia por afinidade e/ou convencionais, um pode purificar as fra-ções ativas suficientemente para usar as proteínas quiméricas para bloquearfunção imunológica em vários ajustes clínicos. Além disso, usando os méto-dos reivindicados tendo condições de cultura celular de temperatura baixa(isto é < 32°C para CHO e < 25°C para levedura), é agora possível prepararsobrenadante de cultura que é altamente enriquecido na maior, forma ativade LTpR-Ig humano. Além do mais, é possível que outros membros destafamília de receptores sofram de problemas similares. Por exemplo, vê-seduas faixas similares em SDS PAGE para o TNFR55-lg não-redutor (tam- bém chamado TNFR de p55 ou p60). Similarmente, as propriedades de ou-tro receptor de família de TNF chamado HVEM são aperfeiçoadas por se-creção em temperaturas menores. Este receptor pode formar um exemplode um erro de formação de dobra intrabraço conforme não existe nenhumadiferença de tamanho óbvio nos materiais feitos nas várias temperaturas.Contudo, independentes do mecanismo, os métodos reivindicados tendoresultados em uma porcentagem maior de temperaturas de secreção dimi-nuídas mais proteínas de fusão ativas em preparações do se e outro mem-bro da família de TNF.

Exemplos

Exemplo 1. mAb que especificamente reconhece a forma viva de LTpR-Ighumano

A proteína de LTpR-Ig (Figura 1) quando o secretada de ou cé-lulas COS ou CHO transfectadas com um plasmídeo pode ser purificadausando métodos cromatográficos de afinidade baseados em proteína A pa-drão. A proteína purificada consiste em duas faixas proximamente espaça-das em aproximadamente 100 kDa em gel de acrilamida SDS não-redutor(Figura 3). As duas faixas diferem-se por aproximadamente 5 kDa em tama-nho aparente. Quando a proteína é reduzida, essencialmente duas faixas emaproximadamente 50 kDa são resolvidas resultando glicosilação heterogê-nea (Figura 3). As duas faixas observadas sob condições não-redutoras,entretanto, não resultam diretamente das diferenças de glicosilação que pro- porcionam aumento ao par de faixas reduzidas. Usando um painel de anti-corpos monoclonais do LTpR humano, mostrou-se que anticorpos do grupoI, isto é AGH1 e BDA8 reconhecem somente a forma MW grande do recep-tor (Tabela l; todos os dados exceto a seletividade para as faixas superior einferior foram tomados de Browning e outros 1996). Anticorpos deste grupo aglutinam diretamente a região de aglutinação de Iigante como evidenciadopela observação que um fragmento de Fab de BDA8 pode ainda bloquear.Grupo Il mAbs pode também bloquear aglutinação de ligante, entretanto, emensaios biológicos, estes mAbs mostram comportamento agonista e antago-nista misturados. Quando um faz uma coluna de afinidade destes mAbs (AGH1 foi usado nesses experimentos) e aplica-se a mistura de formasgrande e pequena do LTpR-Ig, a forma menor do receptor flui direto e a for-ma maior afixa a matriz da coluna. Eluição de pH baixo rende uma prepara-ção pura da forma grande (Figura 4). As duas frações foram analisadas parasua capacidade de aglutinar células de hibridoma de células II-23T ativada de éster forbol de superfície, isto é células expressando complexo de Iinfoto-xina de superfície (como descrito em Browning e outros, 1995) e somente afração que liga ao mAb estava apta a aglutinar a Iinfotoxina da superfície. Afração de fluxo direto, isto é a faixa MW menor era completamente inativa(Figura 5). Especificamente, sobrenadantes de células CHO estavelmentetransfectadas com o constructo de LTpR-Ig foram passadas sobre uma colu-na de proteína A para isolar a proteína. A proteína pura foi eluída com tam-pão de fosfato de sódio 25 mM em pH 2,8 e as frações contendo proteínaforam neutralizados com volume 1/10 de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8,6.Imunoprecipitações foram realizadas em um volume de 0,25 ml com 3 ug de LTpR-Ig e 4 ug de anti-LTpR mAb seguido por captura do mAb com gotas desefarose KappaLock as quais reconhecem somente a cadeia kappa no ca-mundongo mAb e não o domínio Fc humano. As contas foram removidas porcentrifugação e o sobrenadante foi clareado de imunòglobu-iné·. resrant© opmsefarose de proteína A. Contas foram tratadas com tampão de amostra deSDS PAGE (agente não-redutor) e o tampão foi carregado em géis de SDS-PAGE. Géis foram passados e transferidos em ligação Hybond e Westernblotted com fragmento de IgG Fc anti-humano conjugado para peroxidase derábano silvestre (LTpR mAb seguido por IgG-HRP de anticamundongo edetecção de quimioluminescência de HRP (Amersham).

Para explorar a capacidade de AGH1 que exclusivamente reco-nhece a forma ativa de LTpR:lg, uma coluna de afinidade de AGH1 foi pre-parada usando sefarose ativada por CNBr (Farmácia, Piscataway, NJ) deacordo com protocolo dos fabricantes. A coluna foi extensivamente lavadacom PBS e a LTpR-Ig de proteína A purificada foi aplicada e o fluxo diretocoletado. A coluna foi lavada com PBS e então eluída com fosfato de sódiomM, pH 2. Frações contendo eluente foram imediatamente neutralizadascomo descrito acima. Concentrações de proteínas foram determinadas porabsorbância em 280 nm assumindo que uma solução de 10D igual 1 mg/ml.As reuniões de fluxo direto e de eluição contendo LTpR-Ig foram testadaspara aglutinar por análise de FACS como descrito (Browning e outros, 1995).A fração de fluxo direto não mostrou mancha de FACS para células expres- sando superfície LT ao passo que a reunião de eluição reteve a atividade deaglutinação completa.

Exemplo 2. Separação cromatográfica convencional de componentes vivos emortos de LTpR-Ig humano.

Diferenças estruturais potenciais entre os componentes MWgrande e pequeno e identificados acima são exploradas no projeto de méto-dos de separação usando etapas de cromatografia convencionais. Como umexemplo, a proteína pode ser dimensionada por filtração de gel em PBS paraobter separação parcial das formas maiores e menores. Estas preparaçõespodem então novamente ser aplicadas à mesma coluna para obter prepara-ções das formas maiores e menores de LTpR-Ig humano que são maioresdo que 90% enriquecidos nos componentes respectivos. Alternativamente,cromatografia de interação hidrófoba (HIC) pode ser empregada para alcan-çar o mesmo resultado. A mistura de proteína é diluída com sulfato de amo-,nio, carregada na coluna de HIC e os componentes grande e pequeno sãodiferencialmente eluídos com um gradiente de sal decrescente. Sob estascondições, separação de linha de base dos dois LTpR-Ig humanos é obtida (Figura 6). Estes métodos bem como o método de imunoafinidade descritoacima são úteis para preparar quantidades em mg das preparações grandee pequena de LTpR-Ig humano mas deixa muito a desejar para a prepara-ção de quantidades de grandes destes componentes para uso farmacêutico.Requerentes têm inventado um novo método adaptando o HIC método para resinas que podem ser obtidas em volume e têm identificado condições decromatografia que permitem a forma pequena de LTpR-Ig humano fluir atra-vés da coluna enquanto o componente grande é retido e pode ser seletiva-mente eluído (Figura 6). O material eluído pode ser sujeito a uma etapa finaltal como cromatografia de exclusão de tamanho ou de troca de íon para re- mover material agregado e outras impurezas e, as quais, após formulaçãoem um tampão fisiológico adequado podem ser usadas para trabalho in vivo.O primeiro exemplo abaixo (A) descreve as condições específicas que foramusadas para analiticamente taxar a quantidade de material inativo em umapreparação de LTpR-Ig. O segundo exemplo (B) descreve o processo de purificação preparativo que resulta em uma preparação de LTpR-Ig alta-mente enriquecido no componente ativo.

A). Cromatografia de interação hidrófoba analítica (HIC) pode ser usadacomo um ensaio quantitativo para taxar as quantidades de LTpR-Ig inativo

Resolução de linha de base dos componentes menores, inativos e dos maiores, ativos LTpR-Ig humano recombinante foi alcançado em umacoluna de éter/m de Perseptive Biosystems Poros (4,6x1 OOmm, N9 de catá-logo P091M526) equilibrado em sulfato de amônio 1,5M e eluição subse-qüente em um gradiente decrescente de sulfato de amônio. As preparaçõesde LTpR-Ig foram diluídas a uma concentração de 0,1 mg/ml e conduzidas auma composição de tampão final de sulfato de amônio 1,5M, fosfato de só-dio 20 mM, ρ H9 (tampão A). Uma porção (1 ml contendo 100 μg de proteí-na) foi carregado na coluna de éter/m de Poros. A coluna foi lavada com 8,3ml de tampão. Os componentes ativos e inativos toram :diferencia!menteeluídos com um gradiente linear (volume de gradiente total de 16,6 ml) de100 % de tampão A a 100 % de tampão B (fosfato de sódio 20 mM, ρ H9)seguido por uma lavagem de 16,6 ml com tampão Β. O efluente da colunafoi monitorado para absorbância em 214 nm. O procedimento completo foirealizado em uma temperatura ambiente usando uma taxa de fluxo de colu-na 1 ml/min. O perfil de eluição de um cromatograma de HIC analítico repre-sentativo é mostrado na Figura 5. Pico 1 contém fração inativa e pico 2 afração ativa de LTpR-Ig. A fim de quantificar a contribuição relativa das duasformas, as áreas de pico foram integradas usando software de integração deVisão de instrumentos Perceptivos.

B). Purificação preparatória de LTpR-Ig humano recombinante

Clarificação e concentração de meio condicionado: o fragmentocelular foi removido de 10L de meio condicionado colhido de células CHOsecretando LTpR-Ig recombinante usando filtração final de morte através deuma cápsula de filtro Calux 5μ de polipropileno 5 sqft. (Microseparations Inc,Westborogh, MA) seguida por um cartucho de filtros de 10,1 cm (4 polega-das) Opticap 0,2μ (Millipore Corp., Bedford, MA). O meio clarificado foi con-centrado por ultrafiltração para aproximadamente 1L usando três cartuchosde Ultrafiltração Espirais S1Y30 (Amicon, Berverly, MA) conectados em sé-rie.

Cromatografia de afinidade de proteína A: O meio condicionadoconcentrado foi passado por gravidade através de uma coluna de fluxo rápi-do (Pharmacia) de sefarose de Proteína A 10 ml a 4°C. A coluna foi lavadacom 50 ml de PBS, 50 ml de PBS contendo NaCI de 0,5 M, e 50 ml de PBS.Para remover IgG bovino contaminante, a coluna foi lavada com 50 ml defosfato de sódio 25 mM, pH 5,5. O LTpR-Ig ligado foi eluído por gravidadecom fosfato de sódio de 25 mM, 100 mM de NaCI, pH 2,8 em 3 ml de fra-ções e imediatamente neutralizadas com 0,3 ml de fosfato de sódio 0,5 M,pH 8,6. Frações contendo proteína foram identificadas por espectroscopia deabsorção, reunidas e armazenadas a -70°C.

Cromatografia de Interação Hidrófoba: A concentração da cavi-dade de eluição de proteína A (40 ml em uma concentração dé 2,5 rrig/ml)foi diluída com 40 ml de cloreto de sódio 3 M, fosfato de sódio de 40 mM pH7 e 20 ml de cloreto de sódio de 1,5 M, fosfato de sódio de 20 mM pH7 (to-das as soluções estavam a temperatura ambiente), A cavidade diluída foicarregada em uma Fonte de pH15 10 χ 100 mm (7,8 ml) (Pharmacia, Pisca-taway, NJ) em uma taxa de fluxo de 2 ml/min. A coluna foi lavada com 79 mlde cloreto de sódio de 1,5 M, fosfato de sódio de 20 mM pH7 em uma taxade fluxo de 20 ml/min. A proteína de ligação foi eluída com fosfato de sódio20 mM pH7 em uma taxa de fluxo de 2 ml/min. A absorbância do efluente foimonitorado em 280 nm e frações de 9 ml foram coletadas. Frações de elui-ção contendo proteína foram identificadas por espectroscopia de absorçãoUV, reunidas e armazenado a -709C. Figura 7 representa um perfil de elui-ção de HIC típico. Sob estas condições, o material inativo flui através da co-luna e o material ativo é ligado a resina. A inserção de figura 7 contém umavarredura da análise de NR SDS-PAGE manchado de azul de coomassie doseguido direto e grupos eluídos, respectivamente.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho: Aproximadamente 100ml (1,3 mg/ml) do grupo de eluição de HIC contendo os componentes ativosde LTpR-Ig foram concentrados por ultrafiltração a 9 ml usando um concen-trador de centriprep30 (Amicon, Beverly, MA). O concentrado (10,3 mg/ml)foi carregado em uma coluna de grade de Superose-6prep 1,6x100 cm(Pharmacia, Uppsala, Suécia) equilibrada em PBS em uma taxa de fluxo de1 ml/min. O efluente foi coletado em frações de 3 ml. Frações contendo pro-teínas foram identificadas por espectroscopia de absorção de UV. Fraçõesselecionadas foram analisadas para agregar conteúdo em uma carga de 3μg/rota usando eletroforese de gel NR SDS-PAGE. Frações com agregadovisível mínimo foram reunidas e armazenadas congeladas a -70°C.

Neste modelo, LTpR-Ig pode ser preparado que contenha quan-tidades mínimas do componente de LTpR-Ig inativo que está presente no meio de cultura bruto.

Exemplo 3. Condições de fermentação de temperatura baixa enriquecem ocomponente grande, ativo de LTpR-Ig humano durante o estágio de culturacelular

Sob condições de cultura de célula de mamífero convencionais,LTpR-Ig humano é secretado como uma mistura de aproximadamente 50%de componentes pequenos e 50% de grandes. Usando células de insetosinfectadas com bacilovírus para expressar a mesma proteína resulta em ní-veis drasticamente reduzidos da forma pequena. Como células de insetossão cultivadas a 28°C, explora-se se LTpR-Ig humano secretado de célulasde mamíferos cultivadas em temperatura baixa teriam uma razão alterada deformas grandes e pequenas. Mostrado na Figura 8 são os sobrenadantes de células CHO secretando LTpR-Ig humano cultivados em frascos T a 28, 30,33, 35, e 37°C analisados por Western blot. As formas grandes e pequenas(indicadas por setas) estão presentes nas culturas cultivadas a 33, 35, e37°C. Muito pouca evidência da forma pequena pode ser vista nas rotascontendo sobrenadante de cultura de células cultivadas a 30 e 28°C. Assim, diminuindo a temperatura durante a cultura celular drasticamente reduz aquantidade da forma pequena, inativa de LTpR-Ig humano. Para quantificara relação entre temperatura de cultura de células e a extensão do enrique-cimento para forma grande, ativa de LTpR-Ig humano, frascos de culturasduplicados foram postos e cultivados em temperaturas variando de 28-37°C em intervalos de um grau. As amostras de LTpR-Ig humano purificados porafinidade de proteína A foram analisadas por cromatografia HIC analíticapara quantificar a razão dos componentes pequenos e grandes de LTpR-Ighumano presentes nas preparações derivadas de células cultivadas a tem-peraturas diferentes. Como mostrado graficamente na Figura 9, a quantida- de da faixa inferior rapidamente diminui aproximadamente 5 vezes quando atemperatura de cultura é diminuída de 37 a 32 °C. Diminuindo a temperaturade cultura para 28 0C reduz a quantidade da forma inferior mas em um modomuito menos dramático. Estes resultados mostram que reduzindo a tempe-ratura de cultura por somente uns poucos graus de 372C dramaticamentediminui a quantidade do componente mw menor, mas aumentando o rendi-mento do componente ativo maior do LTpR-Ig humano. Baseado nessesdados, temperaturas de cultura de 32 a 28°C foram selecionadas para testarse estas observações poderiam ser duplicadas err· um escala grande sobcondições que seriam adequadas para fabricar usando células CHO secre-tando LTpR-Ig humano recombinante que têm sido adaptadas para crescerem suspensão. Para estes experimentos, as células foram cultivadas a den-sidades aproximando 2x106 células/ml a 37°C a cultura foi diluída com apro-ximadamente 4 volumes de meio cultivado e incubado a 32 °C até a viabili-dade celular diminuir abaixo de 80%. Diminuindo a temperatura a 28°C du-rante a fase de produção também resulta em níveis significantemente meno-res do componente "Ideadí" na colheita final. Foi interessante perceber queenquanto o número celular não aumentou muito durante a fase de produçãoa 28 ou 32°C, um aumento de dobra severo em titulação de produto sobrecultura cultivada exclusivamente a 37°C foi obtido no meio condicionado decolheita. As condições específicas que foram usadas no processo a 32 e28°C são descritas abaixo.

Dados iniciais sugerem que diminuindo a temperatura de culturaresulta em benefícios similares em outro sistemas de hospedeiro de tais le-veduras. É interessante que em leveduras, os efeitos benéficos de produçãode temperatura baixa são observados em temperaturas muito menores doque em células de mamíferos. Levedura cultivada a 30°C produz predomi-nantemente a forma inativa, culturas cultivadas a 25°C contém aproximada-mente uma mistura igual das formas inativas e ativas e culturas fermentadasa 16°C produzem predominantemente a forma ativa do LTpR-Ig humano.Estas observações sugerem que fermentação de temperatura baixa resulta-rá em rendimentos significativamente maiores do componente ativo deLTpR-Ig humano em qualquer sistema hospedeiros secretor. Um versado natécnica pode facilmente determinar as temperaturas de produções ótimaspara cada sistema.

Aqui é fornecido um exemplo detalhado de como este processofoi aplicado a produção de LTpR-Ig. Dois métodos de cultura de célula foramdesenvolvidos que levam vantagem do fato que reduzindo a temperatura decultura celular significantemente reduz-se a quantidade dos componentesinativos presentes em LTpR-Ig secretado das células hospedeiras. Um be-nefício inesperado adicional de fermentação de temperatura baixa é umamelhoria de dobra severa em titulação quando comparado a passagens defermentação tradicionais realizadas em 36-37eC. Tabela Il resume os rendi-mentos comparativos e as quantidades relativas de componentes de LTpR-Ig inativos obtidos de duas linhas de células diferentes transfectadas comconstructos de LTpR-Ig diferentes os quais variaram na extensão de glicosi-lação (não-adequado à veracidade deste exemplo).

Processo de Cultura de Célula a 329C: Células CHO secretandoLTPR-Ig humano que tem sido adaptado a crescimento em suspensão foramcultivadas em DME/HAM's F-12 meio de crescimento (veja Tabela Ill abaixo)suplementado com FBS 10%, estreptomicina 140 mg/L, e gentamicina 50mg/L. Para cada proporção, dois frascos de 750 ml-fiandeiro foram inocula-dos em aproximadamente 2x105 células/ml em meio de crescimento. Asculturas foram cultivadas em 379C em uma atmosfera de 5% de CO2 a umadensidade de aproximadamente 3x106 células/ml. As suspensões de célulasde ambas culturas de fiandeiro foram combinadas para inocular o biorreatorde proporção de escala contendo aproximadamente 10L de meio de cresci-mento. A cultura foi oxigenada a 11% de O2 e cultivada por três dias a 379Ca uma densidade de aproximadamente 2x106 células/ml. Esta cultura foiusada para inocular o biorreator de produção contendo 33L de meio de cres-cimento em uma densidade de 6,4x105 células/ml. O biorreator de produçãofoi então cultivado por 8 dias na temperatura benéfica de 329C com umataxa de borrifo de oxigênio estabelecida a 11% de O2. A densidade celularno dia da colheita (dia 8) foi aproximadamente 2x106 células/ml com umaviabilidade de aproximadamente 60%. Sob estas condições, uma titulaçãode 12 mg/L de LTpR-Ig foi alcançada a qual foi duas vezes maior do quequando as mesmas células foram cultivadas na temperatura tradicional de379C. A quantidade relativa de componente inativo na preparação de LTpR-Ig foi 17% a qual representou um decréscimo maior do que 60% quandocomparado a produto obtido de uma cultura a 379C.

Processo de Cultura de Célula a 289C: Células CHO secretandoLTpR-Ig humano que foi adaptado a crescimento em suspensão foram culti-vadas em DME/HAM's F-12 meio de crescimento (veja Tabela í; I aba-xo)suplementado com FBS 10%, estreptomicina 140 mg/L, e gentamicina 50mg/L. Para cada proporção, dois frascos de 800 ml-fiandeiro foram inocula-dos em aproximadamente 2x105 células/ml em meio de crescimento. Asculturas foram cultivadas em 379C em 5% de CO2 a uma densidade de apro-ximadamente 3,5x106 células/ml. As suspensões de células de ambas cultu-ras de fiandeiro foram combinadas para inocular o biorreator de proporçãode escala contendo aproximadamente 10L de meio de crescimento. A cultu-ra foi oxigenada a 11 % de O2 e cultivada por dois dias a 372C a uma densi- dade de aproximadamente 1,7x106 células/ml. Esta cultura foi usada parainocular o dois biorreatores de produção de 40L e um de 10L em densidadesde células iniciais de 2,5-3x105 células/ml usando uma razão de divisão de1:9. Os biorreatores de produção foram então cultivados a 37eC e oxigena-dos a 11% de O2 até uma densidade celular de aproximadamente 2x106 cé- lulas/ml ser alcançada (dois dias). No final dos dois dias, a temperatura dobiorreator foi diminuída a 289C e os biorreatores foram cultivados por 5 diasadicionais. No dia 7, em densidades celulares de aproximadamente 3x106células/ml e viabilidade de >75%, os biorreatores foram colhidos e o meiocondicionado foi processado como descrito acima. Sob estas condições, uma titulação final de aproximadamente 20 mg/ml de LTpR-Ig foi alcançadaa qual representa um aumento de 3,3 vezes sobre a titulação que foi obtidaquando as mesmas células foram cultivadas a 37eC. A proporção relativa decomponente inativo foi 10% a qual representa um decréscimo de 80% sobreo material preparado a 379C.

Exemplo 4. Alterações no Domínio de Fc para Minimizar Formas Mortas Du-rante Produção

Baseado em sua explicação hipotética de porque moléculasmortas resultam nestas preparações, um prediria que diminuindo o tempoantes de domínios Fc dimerizaria aumentaria a fração de domínios de re-ceptor dobrado corretamente. Explorou-se diversos métodos para alcançareste resultado. É possível que domínios de Ig Fc diferentes dobrariam emtaxas diferentes, ainda troca do domínio de IgGI por um domínio de lgG4não mudou a razão vivo morto. Em segundo lugar, os resíduos de cisíeínaem região de articulação que liga transversalmente as duas cadeias depeptídeo foram removidos do domínio de IgGI Fc por mutagênese. Os do-mínios de Fc podem dimerizar bem na ausência de formação de dissulfito de articulação mas a taxa pode ser mais lenta em sua ausência. Substituiçãodos dois resíduos de cisteína por alanina resultou em uma quantidade dimi-nuída de forma morta conforme quantificado por SDS-PAGE e cromatografiade HIC tal que onde LTpR-Ig do tipo selvagem conteria 50 e 5% de formasmortas a 37 e 28QC, a anulação das cisteínas da articulação de IgGI levou a20 e 5% de forma morta quando produzido nestas temperaturas respectivas.Portanto, modificação da articulação por substituição de ambos resíduos cyspodem aperfeiçoar a qualidade de uma preparação e, além do mais, é pos-sível que substituição de apenas um resíduo cys poderia ter um efeito bené-fico. Tais modificações genéticas poderia reduzir a porcentagem de forma morta com recurso a métodos de produção de temperatura baixa.

Exemplo 5. Anulação de Pontes de Cisteína para Corrigir Problemas deFormação de Dobras

Tipicamente, é muito difícil definir os caminhos da formação dedobra utilizados por uma proteína para chegar a forma final correta. Contu- do, algumas pontes de dissulfito na família de receptor de TNF são inco-muns e podem não ser necessárias para o estado dobrado final. Estas pon-tes são boas candidatas para mutagênese. Uma tal ponte no terceiro domí-nio de LTpR-Ig foi removida por mutagênese dirigida por sítio convencionalde cisteínas 101 e 108 para alaninas (usando a numeração das seqüência definida em Ware e outros, 1995) levam a uma razão aperfeiçoada de mate-rial morto/vivo como evidenciado por SDS-PAGE. Com LTpR-Ig do tipo sel-vagem tipicamente mostra a presença de 50 e 5% de forma morta quandoproduzido em 37 e 28QC respectivamente. A forma mutante com uma pontede dissulfito de cisteína anulada teve 20 e 5% de forma morta quando pro- duzido nestas temperaturas.Exemplo 6. Uso de temperaturas menores para aperfeiçoar a qualidade, deuma preparação de HVEM-Ig

Mediador de entrada de vírus de herpes (HVEM) é um receptorda família de TNF relacionado ao LTpR e aglutina ligeiramente ao IiganteLEVE ligeiramente e fracamente ao Iigante de linfotoxina-β (Lta) (Mauri eoutros, 1998). HVEM humano foi preparado como uma proteína de fusão Igpor ampliação de PCR ao domínio extracelular e fundido à região IgGI CH2e CH3 humana como descrito para LTpR-Ig (Crowe e outros, 1994). O cons-tructo foi inserido em um vetor chamado CH269 (Chicheportiche e outros1997) para expressão transitória na linha de célula renal embriônica humana293 com alta expressão de vetor de cópia usando o sistema EBNA (293-Ecélulas). Sobrenadantes foram coletados e HVEM-Ig purificado usando Cro-matografia de Afinidade de Proteína A e baixa eluição de pH. LTa recombi-nante foi preparado de células de inseto como descrito (Browning e outros, 1996a). LEVE humano solúvel recombinante foi preparado por ampliação dePCR do cDNA inteiro usando RNA de células II23 ativadas rendendo a regi-ão de codificação da seqüência descrita por Mauri e outros, 1998. O domíniode aglutinação de receptor de LEVE foi ampliado por PCR e fundido na se-qüência líder de fator de união alfa e expresso essencialmente como des- crito por outras proteínas relacionadas (Browning e outros, 1996). Uma eti-queta de FLAG e seqüências de aminoácidos espaçadores (G4S)3 foram in-seridas entre o líder e o domínio de aglutinação de receptor tal que o LEVEsecretado possuísse uma seqüência FLAG terminal Ν. O constructo codifi-cou a molécula seguinte:

"Mrfpsiftavlfaassalaapvntttedetaqipaeavigysdlegdfdvavlpfsnstnngllfinttiasiaakeegvslekr. . eadykddddngggsgggsgggskelnpaahltganssltgsggpllwetqlglaflrglsyhdgalwtkagyyyiyskvqlggvgcplglastithglykrtprypeelellvsqqspcgratsssrvwwdssflggwhleageevwrvlderlvrlrdgtrs yfgafmv "

onde dois pontos indicam o término N esperado da proteína madura a qualpoderia além disso ser processada por remoção dos próximos dois aminoá-cidos (EA). A proteína foi purificada do sobrenadante por cromatografia deafinidade sobre uma coluna de mAb de anti-FLAG e eluição com ou pH bai-xo ou quelação de cálcio. LEVE de comprimento completo foi· também inse-rido em um vetor CH269 para expressão na superfície de 293-E-célulascomo descrito (Chicheportiche e outros, 1997). Métodos de aglutinação deFAGS para a detecção de receptor-lg para superfícies celulares e métodos de BIA núcleo para medir a aglutinação de Iigantes solúveis para receptor-lgimobilizado têm sido descrito (Mackay e outros, 1997). A tecnologia de BIA-núcleo rende medições em tempo real de ligação de proteína aos vasos (istoé o receptor).

Células de CHO expressando HVEM-Ig foram cultivadas a con- fluência a 37C em frascos cilíndricos usando meio de crescimento suple-mentado com 10% de FBS. Quando as células alcançaram confluência, omeio despendido foi trocado com meio de crescimento fresco e as culturasforam incubadas a 37, 32, e 28C. As culturas a 28 e 32 C foram colhidasuma vez na semana, a cultura a 37C a cada 4 dias. O HVEM-Ig secretado foipurificado usando cromatografia de afinidade de Proteína A como descrito.As preparações purificadas foram armazenadas em -70C até análises.Quando HVEM-Ig foi produzido a 28, 32 e 37-C e purificado, todas as prepa-rações similarmente conduzidas em análise de SDS-PAGE (Figura 10) suge-rindo que grandes alterações na proteína não ocorreu. Portanto, se forma-ção de dobra aberrante/formação de ponte de dissulfito ocorreu, foi ou in-trabraço ou ocorreu próximo à região da articulação do domínio de Fc, isto éformação de ponte interbraço e isso não apreciavelmente afetou o formatototal da molécula em SDS-PAGΕ. A capacidade do receptor-lg para aglutinara LEVE expressa em 293-E-células ou LEVE em células II23 ativadas foi taxada em ensaios de aglutinação de FACS (Figura 11). Em ambos tipos decélula, a capacidade de HVEM-Ig para aglutinar Iigante de superfície celularfoi aperfeiçoado rudemente 2-3 vezes em expressão a 32C. Usando tecno-logia de BlAnúcleo, foi observado que quando vasos de BlAnúcleo foramcarregados com HVEM-Ig para níveis similares (valores de RU refletem quantidade de proteína no vaso), HVEM-Ig produziu em temperaturas meno-res ligado mais Iigante do que proteínas produzidas nas temperaturas maio-res (Figura 12). Este resultado foi obtido se LEVE u LTa foi o ligante. As cur-vas de aglutinação de BlAnúcleo mostram o tempo real dérítro o fora deeventos de aglutinação e pode ser visto que os eventos de aglutinação fo-ram similares independente da temperatura de produção. Portanto, uma por-ção da preparação é eficazmente morta e sua porção é minimizada por tem-peraturas de produção menores. Especula-se que a temperatura menor temcorrigido um problema de formação de dobra aberrante e aperfeiçoou a por-centagem das moléculas vivas mesmo que não se possa diretamente obser-var a fração de moléculas mortas. Técnicas cromatográficas de afinidadecomo delineadas acima poderiam servir para resolver as formas vi-vas/mortas seguindo a otimização seguinte da preparação por temperaturasde crescimento diminuídas e ou mutagênese de várias cisteínas ou na arti-culação ou no próprio receptor para prevenir formação de dobra incorreta.Exemplo 7. Esquemas Genéricos para Minimizar Formas mortas de OutrasProteínas de Fusão de Receptor-Ig de família de TNF

A maioria dos receptores da família de TNF têm sido preparadoscomo constructos de proteínas de fusão com domínios de imunoglobulina-Fc:

Referência

p55 TNF-R (Loestcher e outros, 1991; Masters e outros, 1992; Ashkenazi eoutros, 1991)

p75TNF-R (Mohler e outros, 1993)

LTp-R (Crowe e outros, 1994)Fas (Suda e outros, 1993)CD27 (Goodwin e outros, 1993)CD30 (Smith e outros, 1993)CD40 (Fanslow e outros, 1992)0x40 (Baum e outros, 1994)4-1BB (Alderson e outros, 1994)HVEM (Mauri e outros, 1998)

Em vários casos, mais notavelmente, Fas-Ig e CD40-lg porexemplo Fanslow e outros, 1992, as quimeras são pobremente ativas relati-vo às formas Fc solúveis dos receptores de TNF. É possível que algumasdestas preparações são misturas de formas vivas e mortas: em razoes vari-antes. Uma forma morta refere-se simplesmente a uma molécula que agluti-na com uma afinidade substancialmente (10-1000 vezes) menor do que aforma viva, isto é pode não estar completamente em falta de atividade de aglutinação, mas ao contrário tem uma afinidade reduzida para Iigante relati-vo à forma de alta afinidade encontrada em células naturalmente. Ligaçõesde dissulfito inter-receptor de braço ou intra-receptor de braço aberrantespodem ocorrer levando a uma proteína menos ativa.

Com qualquer um destes receptores ou outros como ainda re-ceptores indefinidos, um painel de anti-receptor mAb seria preparado portecnologias convencionais. Estas modalidades aptas a bloquear a aglutina-ção do Iigante ao receptor preferivelmente como taxado usando um ensaiode aglutinação de Iigante ao receptor nativo em uma superfície celular (em-bora outros métodos usando formas de receptores recombinantes podem ser suficientes) seria usado para formar colunas de afinidade. A preparaçãoda mistura de formas vivas e mortas de receptor-Fc seria passada sobre acoluna e o fluxo direto coletado. O material que limita a coluna seria eluídocom um tampão de pH baixo (tipicamente pH 2,5 a 4,0) imediatamente neu-tralizado. As duas frações seriam limitadas a ou células em um ensaio de aglutinação de FACS (ou qualquer formato de aglutinação padrão) ou Iiganteem concentrações de proteína variantes. Alguns destes mAbs seletivamenteaglutinam a forma viva e uma diferença entre a concentração necessáriapara obter 50% de aglutinação do fluxo direto contra eluído serão vistos.Este resultado marca que mAb como uma mAb de demarcação. A razão da proteína no eluído ao fluxo direto indicará a porcentagem de forma viva napreparação.

Estes mAbs assim identificados podem ser usados para purificarpor afinidade a forma viva. Além do mais, seu uso em vários formatos deimunoensaios podem ser usados para otimizar para expressão da forma cor-reta da forma de receptor-Fc desejado. O ensaio pode além disso ser usadoem conjunção com outros métodos de purificação convencionais para en-contrar métodos que purificariam a forma ativa do receptor sem recurso paratécnicas de afinidade. Usando estes Abs para delinear tormas vivas e mor-tas, a temperatura da cultura poderia ser otimizada e métodos cromatográfi-cos desenvolvidos para enriquecer a forma viva. Alternativamente, métodosde coluna de HIC poderiam ser explorados para separar formas vivas emortas e usando este método, condições de cultura poderiam ser otimiza-das. Igualmente, estes ensaios formariam a base para mutagênese de cis-teína da porção receptora para definir problemas ligações de dissulfito osquais em remoção renderiam funcionalmente material ativo.

Como muitos dos receptores terão aplicação como agentes te-rapêuticos em doença humana e um necessitaria colocar somente formasdobradas propriamente em um paciente, estes métodos para ambos definir apreparação e remover formas de aglutinação pobres terão utilidade.

Serão aparentes àqueles versados na técnica que várias modifi-cações e variações podem ser feitas nos métodos da presente invenção sem desviar-se do espírito ou escopo da invenção. Assim, é pretendido que apresente invenção cubra as modificações e variações desta invenção con-tanto que eles surjam dentro do escopo das reivindicações anexas e seusequivalentes.

Tabela I: Resumo de Anti-LT-b-RmAbs

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a Ensaio taxado se anticorpo bloqueia aglutinação de receptor solúvel para11-23 ativada, nd= não-feito.

b placa revestida de Fc anti-camundongo de cabra, mAb de anti-receptor25 capturado, HT29s mais IFNg.c Blocos

d Potenciais

e Variável, alguma inibição parcial em alguns ensaios, nenhuma em outros.f Forma de receptor precipitada usando mAb mais sistema de KappaLock.9 Grupos foram definidos nas bases do dado na tabela mais mapeamento deepítopo feito usando tecnologia de BlAnúcleo.

Tabela Il Expressão de constructos de LTpR-Iq em CHO cultivadas em tem-peraturas de culturas diferentes

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a O nível de expressão foi taxado usando cromatografia de afinidade de proteína A.b A quantidade de componentes inativos presente na preparaçãode LTpR-Ig foi taxada após purificação por afinidade de proteína A usando ométodo de HIC analítico.

Tabela III. DME/HAM's F-12 Suplementos de Meio de Crescimento

<table>table see original document page 31</column></row><table>continuação

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a Componentes são misturados com o pó médio de base e o volume é entãolevado a 1L. O pH do meio é ajustado a 7,20 η 7,25 usando HCI 50%.Referências

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Claims (26)

1. Método para aumentar a expressão de proteína de fusão dereceptor-lg biologicamente ativa em relação à proteína de fusão de receptor-Ig biologicamente inativa, caracterizado pelo fato de que compreende culti-var uma célula hospedeira de mamífero transformada com DNA codificandouma proteína de fusão de receptor-lg em um sistema de cultura tendo umatemperatura baixa de aproximadamente 27°C a cerca de 35°C, desse modoaumentando a expressão de proteína de fusão de receptor-lg biologicamenteativa em relação à proteína de fusão de receptor-lg biologicamente inativa; ométodo compreendendo ainda recuperar a proteína de fusão de receptor-lgbiologicamente ativa do sistema de cultura.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a temperatura baixa é aproximadamente 27°C a cerca de 32°C.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a temperatura baixa é menor ou igual a 30°C.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a temperatura baixa é aproximadamente 27°C a cerca de 30°C.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita célula hospedeira transformada é primeiro cultivada emuma temperatura acima de aproximadamente 33°C por um período de temposuficiente para permitir crescimento da dita célula hospedeira.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita proteína de fusão de receptor-lg compreende um membroda família de receptor de TNF.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o dito membro da família de receptor de TNF é um receptor delinfotoxina-β, TNFR-55, TNFR-75, HVEM ou um fragmento do mesmo.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o dito membro da família de receptor de TNF é um receptor delinfotoxina-β ou uma porção de aglutinação de Iigante do mesmo.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende ainda recuperar a proteína de fusão de receptor-lgbiologicamente ativa do dito sistema de cultura por cromatografia de intera-ção hidrófoba.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a proteína de fusão de receptor-lg biologicamente ativai recu- perada com base na aglutinação de anticorpo específico funcional.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a região Ig é humana.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a região Ig é de um isotipo lgG1.

13. Método para a expressão de altos rendimentos de proteínasde fusão Fc de Ig - membro da família de receptor TNF ativas e minimizar aexpressão de proteínas de fusão Fc de Ig - membro da família de receptorTNF inativas, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célulahospedeira cultivada com uma molécula de DNA codificando uma proteína de fusão Fc da Ig - membro da família de receptor TNF desejada em umsistema de cultura de células de mamíferos tendo uma temperatura inferiorou igual a 32°C.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe-lo fato de que a temperatura é inferior ou igual a 30°C.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe-lo fato de que a temperatura baixa é aproximadamente 27°C a cerca de32°C.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe-lo fato de que a temperatura baixa é aproximadamente 27°C a cerca de 3O0C.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13a 16, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira transformada é pri-meiro cultivada a uma temperatura acima de cerca de 33°C, por um períodode tempo suficiente para permitir o crescimento da célula hospedeira.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13a 16, caracterizado pelo fato de que o membro da família de receptor deTNF é um receptor de linfotoxina-β, TNFR-55, TNFR-75, HVEM ou porçãode aglutinação de Iigante do mesmo.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que o membro da família de receptor de TNF é um receptor delinfotoxina-β ou uma porção de aglutinação de Iigante do mesmo.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de recuperarproteínas de fusão Fc da Ig - membro da família de receptor TNF ativo a par-tir do sistema de cultura.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pe-lo fato de que os membros família de receptor TNF ativos são recuperadospor cromatografia de interação hidrófoba.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pe-lo fato de que os membros família de receptor TNF ativos são recuperadoscom base em sua habilidade de se ligar a um anticorpo específico funcional.

23. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe-lo fato de que o sistema de cultura compreende células CHO.

24. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe-lo fato de que a região Fc da Ig é humana.

25. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- lo fato de que a região Fc da Ig é um isotipo IgGI.

26. Método para obtenção de proteínas de fusão Fc de Ig -LTpR ativas e minimizar a expressão de proteínas de fusão Fc de Ig - LTpRinativas, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hos-pedeira de mamífero transformada com uma molécula de DNA codificandouma proteína de fusão de Ig - receptor TNF desejada em um meio de cultu-ra celular, a uma temperatura inferior ou igual a 30°C e isolar as proteínas defusão Fc da Ig - LTpR ativas a partir do meio de cultura usando cromatogra-fia de interação hidrófoba.