BR112019000435B1 - Método para separar lipídios de uma biomassa contendo lipídios lisados - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um método para separar lipídios contendo ácidos graxos poli-insaturados provenientes de biomassa contendo lipídios.

Description

[0001] A presente invenção se refere a um método para separar lipídios contendo ácidos graxos poli-insaturados provenientes de biomassa contendo lipídios.

[0002] Os lipídios contendo PUFAs (ácidos graxos poli- insaturados) são de grande interesse na indústria de ração, alimentos e na indústria farmacêutica. Devido à sobrepesca, há uma grande necessidade de fontes alternativas de lipídios contendo PUFAs além de óleo de peixe. Constatou-se que, além de certas cepas de levedura e alga, em particular, células de microalga como aquelas da ordem Thraustochytriales, são uma fonte muito boa de lipídios contendo PUFAs.

[0003] Porém, em relação a organismos microbianos e, em particular, células da ordem Thraustochytriales, as quais produzem os lipídios contendo PUFAs, o isolamento do óleo das células se mostrou um problema particular. A maneira mais eficaz de isolar o óleo consistia no uso de solventes orgânicos como hexano. Porém, o uso de solventes orgânicos resulta em condições operacionais perigosas, exige o uso de equipamento à prova de explosão dispendioso e exige a implementação de um processo de recuperação de solvente dispendioso para evitar a poluição do ambiente.

[0004] Em uma tentativa de evitar o uso de solventes orgânicos, como uma alternativa eficaz de isolar o óleo, encontrou-se a relargagem do óleo com grandes quantidades de cloreto de sódio. Porém, o uso de grandes quantidades de cloreto de sódio resulta em um subproduto de biomassa delipidada que, devido ao alto teor de sal, não pode ser utilizado como um ingrediente de ração, para que o processo não seja muito sustentável. Além disso, a alta concentração de sal resulta em corrosão rápida do equipamento de aço usado.

[0005] Então, era um objetivo da presente invenção fornecer um método eficaz para isolar um lipídio, em particular, um lipídio contendo PUFAs, de células contendo lipídios, em particular, da ordem Thraustochytriales, e evitar simultaneamente não apenas a necessidade de solventes orgânicos, porém também evitar a necessidade de grandes quantidades de sais para realizar o isolamento eficaz do óleo das células.

[0006] Também era um objetivo da presente invenção fornecer um método para isolar um lipídio, em particular, um lipídio contendo PUFAs, de células contendo lipídios, em particular, da ordem Thraustochytriales, e fornecer simultaneamente uma biomassa delipidada que pode ser utilizada de uma maneira comercial, preferencialmente no campo agrícola.

[0007] Constatou-se que uma separação eficaz do lipídio da fase aquosa contendo debris celulares pode ser realizada, se a mistura de células lisadas for incubada a um baixo pH alcalino e a uma temperatura de não mais que 100 °C por um período de tempo de pelo menos 10 horas. Mantendo-se a temperatura abaixo de 100 °C, foi possível proibir pelo menos essencialmente a saponificação dos ésteres de ácido graxo.

[0008] Então, uma primeira matéria da presente invenção é um método para separar um lipídio contendo ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) dos debris de uma biomassa que compreende as seguintes etapas:a) Fornecer uma suspensão de uma biomassa que compreende células que contêm um lipídio contendo PUFAs;b) Lisar as células da biomassa;c) Aquecer a suspensão como obtida na etapa (b) a uma temperatura de 80 °C a 100 °C, preferencialmente 85 °C a 95 °C, mais preferencialmente cerca de 90 °C, enquanto ajusta o pH a um valor de 9,5 a 11,5, preferencialmente 10,0 a 11,0, maispreferencialmente 10,3 a 10,7;d) Manter a temperatura e o valor de pH nas faixas como mostrado em (c) por pelo menos 10 horas, preferencialmente 15 a 40 horas, mais preferencialmente 20 a 36 horas.

[0009] As etapas (c) e (d) levam à separação da fase leve contendo óleo e da fase pesada contendo água, debris celulares, sais e óleo residual, como obtido lisando-se as células da biomassa. Essa separação da fase leve e da fase pesada também é denominada "desemulsificação" ou "demulsificação" no contexto deste pedido.

[0010] A ordem das medidas na etapa (d) não tem importância. O ajuste da temperatura pode ser realizado antes ou após o ajuste do valor de pH.

[0011] Preferencialmente, nas etapas (b), (c) e (d) do método, a suspensão é continuamente misturada com o uso de um misturador e/ou um agitador. Nas etapas do método (c) e/ou (d), agitação de cisalhamento e/ou agitação de fluxo axial preferencialmente baixas são aplicadas, em particular, como revelado no documento WO 2015/095694. Impulsores adequados para agitação antes e durante as etapas (c) e/ou (d) incluem em particular impulsores de pá reta, impulsores de pá Rushton, impulsores de fluxo axial, impulsores de fluxo radial, impulsores de disco de pá côncava, impulsores de alto desempenho, propulsores, palhetas, turbinas e combinações dos mesmos.

[0012] A lise das células da biomassa pode ser realizada por métodos como os conhecidos por aqueles versados na técnica, em particular enzimática, mecânica, física ou quimicamente, ou aplicando-se combinações dos mesmos.

[0013] Dependendo do tempo de exposição e/ou do grau de força aplicada, uma composição compreendendo apenas células lisadas ou uma composição compreendendo uma mistura de debris celulares e células intactas pode ser obtida. O termo "biomassa contendo lipídios lisados" se refere, desse modo, a uma suspensão que contém água, debris celulares e óleo como liberados pelas células da biomassa, porém, além disso, também pode compreender outros componentes, em particular, sais, células intactas, outros conteúdos das células lisadas, bem como componentes de um meio de fermentação, em particular, nutrientes. Em uma modalidade preferencial da invenção, apenas pequenas quantidades de células intactas, em particular, menos de 20 %, preferencialmente menos de 10 %, mais preferencialmente menos de 5 % (em relação ao número total de células intactas como presentes antes de lisar as células da biomassa) estão presentes na biomassa lisada após a etapa de lisar as células.

[0014] A lise das células pode ser realizada, por exemplo, com o uso de uma prensa celular francesa, sonicador, homogeneizador, microfluidificador, moinho de bolas, moinho de barras, moinho de seixos, moinho de esferas, rolo de moagem de alta pressão, impactador de eixo vertical, misturador industrial, misturador de alto cisalhamento, misturador de pás e/ou homogeneizador polytron.

[0015] Em uma modalidade preferencial da invenção, a lise das células é realizada sem aplicar alto estresse mecânico nas células. De acordo com a invenção, a entrada de energia nas células na etapa de lise soma preferencialmente não mais que 50 kWh por tonelada de suspensão, em particular, não mais que 40, 30 ou 20 kWh por tonelada de suspensão, especialmente preferencialmente não mais que 15, 10 ou 5 kWh por tonelada de suspensão.

[0016] Em uma modalidade preferencial da invenção, a lise das células compreende um tratamento enzimático das células aplicando-se uma enzima degradadora de parede celular.

[0017] De acordo com a invenção, a enzima degradadora de parede celular é preferencialmente selecionada a partir de proteases, celulases (por exemplo, Cellustar CL (Dyadic), Fibrezyme G2000 (Dyadic), Celluclast (Novozymes), Fungamyl (Novozymes), Viscozyme L (Novozymes)), hemicelulases, quitinases, pectinases (por exemplo, Pectinex (Novozymes)), sacarases, maltases, lactases, alfa-glucosidases, beta-glucosidases, amilases (por exemplo, Alphastar Plus (Dyadic); Termamyl (Novozymes)), lisozimas, neuraminidases, galactosidases, alfa-manosidases, glucuronidases, hialuronidases, pululanases, glucocerebrosidases, galactosilceramidases, acetilgalactosaminidases, fucosidases, hexosaminidases, iduronidases, maltases- glucoamilases, xilanases (por exemplo, Xylanase Plus (Dyadic), Pentopan (Novozymes)), beta-glucanases (por exemplo, Vinoflow Max (Novozymes), Brewzyme LP (Dyadic)), mananases, e combinações dos mesmos. A protease pode ser selecionada a partir de serina proteases, treonina proteases, cisteína proteases, aspartato proteases, metaloproteases, ácido glutâmico proteases, alcalases (subtilisinas), e combinações dos mesmos. A quitinase pode ser uma quitotriosidase. A pectinase pode ser selecionada a partir de pectoliases, pectozimas, poligalacturonases e combinações dos mesmos.

[0018] O pH adequado para utilizar a enzima depende do pH ideal da enzima. O pH ideal da enzima é conhecido por aqueles que são versados na técnica ou, de outro modo, pode ser determinado facilmente.

[0019] Em uma modalidade preferencial da invenção, uma enzima com um pH ideal entre 6,5 e 8,5, preferencialmente entre 7,0 e 8,0, em particular, de cerca de 7,5, é usado, para que o pH aplicado nessa etapa seja de 6,5 a 8,5, em particular, de 7,0 a 8,0, preferencialmente de 7,3 a 7,7. Uma enzima preferencial que pode ser usada nessa faixa de pH é uma alcalase.

[0020] A enzima é preferencialmente adicionada como uma solução de enzima concentrada, preferencialmente em uma quantidade de 0,01 a 1,5 % em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de 0,03 a 1,0 % em peso, principalmente em uma quantidade de 0,05 a 0,5 % em peso, em relação à quantidade de solução de enzima concentrada como adicionada em relação à quantidade total da suspensão após adição da solução de enzima concentrada.

[0021] Em uma modalidade muito preferencial da invenção, a lise das células é realizada como a seguir:a) Aquecer a suspensão de (a) a uma temperatura entre 50 °C e 70 °C, preferencialmente a uma temperatura entre 55 °C e 65 °C, e adicionar uma enzima degradadora de parede celular ao caldo de fermentação, e ajustar um valor de pH adequado, se necessário, no qual a enzima está funcionando adequadamente;b) Manter a temperatura e o pH nas faixas como mostrado em (b) por pelo menos uma hora,preferencialmente por pelo menos duas horas, mais preferencialmente por duas a quatro horas.

[0022] Na etapa (a), a enzima pode ser adicionada antes ou após o aquecimento da suspensão e/ou antes ou após o ajuste do pH. Do mesmo modo, o aquecimento da suspensão pode ser realizado antes ou após o ajuste do pH. - Porém, em uma modalidade preferencial, a enzima é adicionada após o aquecimento da suspensão e após o ajuste do pH, se o ajuste do pH for necessário, de todo. - Em uma modalidade muito preferencial, todas as medidas são realizadas mais ou menos simultaneamente.

[0023] Preferencialmente, nas etapas (a) e (b), a suspensão é continuamente misturada com o uso de um misturador e/ou um agitador.

[0024] Em uma modalidade preferencial adicional da invenção, após a lise das células da biomassa e antes da etapa de demulsificação, a suspensão é concentrada a um teor de matéria seca total de 30 a 60 % em peso, mais preferencialmente 35 a 55 % em peso, em particular 40 a 50 % em peso.

[0025] A concentração da suspensão é preferencialmente realizada por evaporação de água a uma temperatura não superior a 100 °C, preferencialmente 70 °C a 100 °C, mais preferencialmente 80 °C a 90 °C, até que um teor de matéria seca total de 30 a 60 % em peso, mais preferencialmente 35 a 55 % em peso, em particular, 40 a 50 % em peso, seja alcançado.

[0026] A concentração da suspensão é preferencialmente realizada em um evaporador de circulação forçada (por exemplo, disponível junto à GEA, Alemanha) para permitir uma remoção rápida da água.

[0027] Em geral, o ajuste do valor de pH pode ser realizado de acordo com a invenção com o uso de bases ou ácidos, como conhecido por aqueles que são versados na técnica. A diminuição do pH pode ser realizada em particular com o uso de ácidos orgânicos ou inorgânicos, como ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido perclórico, ácido hipocloroso, ácido cloroso, ácido fluorossulfúrico, ácido hexafluorofosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido fórmico, ou combinações dos mesmos. Já que se deseja evitar um alto teor de cloreto, em uma modalidade preferencial da invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de ácido clorídrico são usadas no processo da presente invenção. De acordo com a invenção, o ácido sulfúrico é a substância preferencial para diminuir o valor de pH. - O aumento do pH pode ser realizado em particular com o uso de bases orgânicas ou inorgânicas, como hidróxidos, em particular, hidróxido de sódio, hidróxido de lítio, hidróxido de potássio e/ou hidróxido de cálcio, carbonatos, em particular, carbonato de sódio, carbonato de potássio ou carbonato de magnésio, e/ou bicarbonatos, em particular, bicarbonato de lítio, bicarbonato de sódio e/ou bicarbonato de potássio. - Devido à facilidade de manuseio, os ácidos e bases são preferencialmente usados em forma líquida, em particular, como soluções concentradas. Então, a soda cáustica é a substância preferencial para aumentar o valor de pH.

[0028] O método de acordo com a invenção compreende preferencialmente, como uma etapa adicional, a coleta do lipídio contendo PUFAs da composição demulsificada como obtida na etapa (d).

[0029] A coleta do lipídio contendo PUFAs compreende preferencialmente a neutralização da suspensão demulsificada e separação subsequente da então obtida fase leve contendo óleo da fase pesada contendo água, sais, debris celulares e fase pesada contendo óleo residual.

[0030] A neutralização da composição demulsificada é preferencialmente realizada adicionando-se um ácido, preferencialmente ácido sulfúrico, para ajustar um valor de pH de 5,5 a 8,5, em particular, 6,5 a 8,5, preferencialmente 7,0 a 8,0. Antes de iniciar a separação da fase leve da fase pesada, a então obtida composição neutralizada pode ser agitada no dito valor de pH de vários minutos a diversas horas.

[0031] A separação da fase leve contendo óleo da fase pesada contendo água, sais e debris celulares é preferencialmente realizada por meios mecânicos e preferencialmente a uma temperatura de 60-90 °C, mais preferencialmente 70-80 °C, e a um valor de pH de preferencialmente 6-9, mais preferencialmente 7-8,5. "Meios mecânicos" se refere em particular a métodos de filtração e centrifugação como conhecido por aqueles que são versados na técnica.

[0032] Após a separação da fase leve contendo óleo, o óleo contendo PUFAs então obtido pode ser adicionalmente finalizado aplicando-se os métodos como conhecido por aqueles que são versados na técnica, em particular, refino, branqueamento, desodorização e/ou winterização.

[0033] Uma vantagem particular do método da presente invenção consiste no fato de que pode ser realizada sem o uso de qualquer solvente orgânico, em particular, sem o uso de qualquer solvente orgânico polar ou apolar. Então, em uma modalidade preferencial da invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de solventes orgânicos, em particular, de solventes orgânicos polares ou apolares, são usadas para isolar o óleo contendo PUFAs da biomassa. Os solventes orgânicos típicos são hexano e etanol.

[0034] Em uma modalidade preferencial da invenção, menos de 2 % em peso de solventes orgânicos apolares são usados, mais preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,1 % em peso. Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, nenhum solvente orgânico apolar é usado, de todo. Em uma modalidade muito preferencial da invenção, menos de 2 % em peso de solventes orgânicos são usados, em geral, de modo particularmente preferencial menos de 1, 0,5 ou 0,1 % em peso. Em uma modalidade particularmente muito preferencial da invenção, nenhum solvente orgânico é usado, de todo, para isolar o óleo contendo PUFAs da biomassa. - Isso significa, em particular, para essa modalidade, que a suspensão como empregada no método de acordo com a invenção, bem como todas as composições como obtidas pelas ditas etapas de método único, contém preferencialmente solventes orgânicos apolares, preferencialmente solventes orgânicos em geral, em uma quantidade de menos de 2 % em peso, mais preferencialmente menos de 1 % em peso, em particular, menos de 0,5 ou 0,3 % em peso, principalmente em uma quantidade de menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0035] Uma vantagem adicional do método da presente invenção é que uma separação muito eficaz do óleo da biomassa remanescente pode ser realizada sem a adição de cloreto de sódio, o qual é normalmente usado para relargagem do óleo a partir da biomassa. Preferencialmente, o método pode ser realizado sem a adição de sais de cloreto, de todo, principalmente sem a adição de quaisquer sais para relargagem do óleo. Porém, pequenas quantidades de sais de cloreto, em particular, cloreto de sódio, podem estar presentes na suspensão devido ao meio de fermentação, como usado para cultivar a biomassa.

[0036] Então, em uma modalidade preferencial da presente invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de cloreto de sódio são usadas para melhorar o isolamento de óleo. Em uma modalidade preferencial da invenção, menos de 1 % em peso de cloreto de sódio é usado, mais preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso de cloreto de sódio são usados para isolar o óleo da biomassa, principalmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, em que a % em peso se refere ao peso total da composição após a adição do cloreto de sódio. - Isso significa, em particular, para essa modalidade, que a suspensão como empregada no método de acordo com a invenção, bem como todas as composições como obtidas pelas ditas etapas de método único, contém preferencialmente cloreto de sódio em uma quantidade de menos de 2 % em peso, mais preferencialmente menos de 1 % em peso, em particular, menos de 0,5 ou 0,3 % em peso, principalmente em uma quantidade de menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0037] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de sais de cloreto são usadas para melhorar o isolamento de óleo, de todo. Nessa modalidade, preferencialmente menos de 1 % em peso de sais de cloreto, mais preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso de sais de cloreto são usados para isolar o óleo da biomassa, principalmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, em que a % em peso se refere ao peso total da composição após a adição dos sais de cloreto. - Isso significa, em particular, para essa modalidade, que a suspensão como empregada no método de acordo com a invenção, bem como todas as composições como obtidas pelas ditas etapas de método único, contém preferencialmente cloreto, em particular, sais de cloreto, em uma quantidade de menos de 2 % em peso, mais preferencialmente menos de 1 % em peso, em particular, menos de 0,5 ou 0,3 % em peso, principalmente em uma quantidade de menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0038] Em uma modalidade muito preferencial da invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de sais são usadas para melhorar o isolamento de óleo, em geral. Nessa modalidade, preferencialmente menos de 1 % em peso de sais, mais preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso de sais são usados para isolar o óleo da biomassa, principalmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, em que a % em peso se refere ao peso total da composição após a adição dos sais. - Isso significa, em particular, para essa modalidade, que a suspensão como empregada no método de acordo com a invenção, bem como todas as composições como obtidas pelas ditas etapas de método único, contém preferencialmente sais, em geral em uma quantidade de menos de 2 % em peso, mais preferencialmente menos de 1 % em peso, em particular, menos de 0,5 ou 0,3 % em peso, principalmente em uma quantidade de menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0039] Os métodos da presente invenção permitem uma separação muito eficaz do óleo contido na biomassa a partir de debris celulares e outras substâncias como contidas no caldo de fermentação. Com o uso dos métodos da presente invenção, preferencialmente mais de 80 % em peso, em particular, mais de 90 % em peso do óleo contido na biomassa podem ser separados da biomassa e isolados.

[0040] Constatou-se que o óleo como obtido aplicando-se o método da presente invenção tem algumas características vantajosas sobre os óleos contendo PUFAs como revelado no estado da técnica até o momento. Em particular, exibe valores de oxidação muito baixos, um baixo teor de ácidos graxos livres e impurezas, uma viscosidade muito baixa e um ponto fulgor muito alto.

[0041] Então, uma matéria adicional da presente invenção é um óleo como obtido ou como obtenível por um método de acordo com a presente invenção.

[0042] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um óleo contendo PUFAs que exibe as seguintes características: a) um valor de peróxido de menos de 0,5, preferencialmente menos de 0,3, em particular, menos de 0,15; b) um valor de anisidina de menos de 15, preferencialmente menos de 10; c) preferencialmente um teor de ácidos graxos livres de menos de 1 % em peso; d) preferencialmente um teor de umidade e impurezas de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 % em peso; e) preferencialmente uma viscosidade de menos de 0,25 Pa^s (250 cps), mais preferencialmente de menos de 0,2 Pa^s (200 cps), em particular, de menos de 0,16 Pa^s (160 cps); e) preferencialmente um ponto fulgor de pelo menos 350°C, mais preferencialmente de pelo menos 400°C, em particular, de pelo menos 450 °C; f) preferencialmente um teor de ácidos graxos ômega-3, em particular, de DHA e EPA, de pelo menos 35 % em peso, preferencialmente pelo menos 40 ou 45 % em peso, principalmente pelo menos 50 % em peso; g) preferencialmente DHA e EPA, cada um em uma quantidade de pelo menos 8 % em peso, preferencialmente pelo menos 10 % em peso, principalmente pelo menos 15 % em peso; h) preferencialmente uma quantidade de solventes orgânicos de menos de 0,5 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 % em peso, em particular, menos de 0,05 % em peso, principalmente menos de 0,01 % em peso; i) preferencialmente uma quantidade de cloretos de menos de 0,1 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,05 % em peso, em particular, menos de 0,01 % em peso; j) preferencialmente um teor de gordura bruta de mais de 90 % em peso.

[0043] O valor de anisidina (AV) é determinado de acordo com o Método Oficial da AOCS n° Cd 18-90. O AV é uma medida para produtos de reação secundários dos ácidos graxos, como aldeídos e cetonas, que ocorrem durante a oxidação do óleo.

[0044] O valor de peróxido (PV) é determinado de acordo com o Método Oficial da AOCS n° CD 8-53. O PV é uma medida para produtos de reação primários, como peróxido e hidroperóxidos, que ocorrem durante a oxidação do óleo. - De acordo com a invenção, o PV é medido em meq/kg.

[0045] O teor de ácidos graxos livres é determinado de acordo com o Método Oficial da AOCS n° AOCS Ca 5a-40. O teor de umidade é determinado de acordo com os Métodos Oficiais da AOCS n° AOAC 930.15, 935.29. O teor de impurezas insolúveis é determinado de acordo com o Método Oficial da AOCS n° AOCS 3a-46. A quantidade de DHA e EPA é determinada de acordo com o Método Oficial da AOCS n° AOCS Ce 1b-89. A quantidade de gordura total é determinada de acordo com o Método Oficial da AOCS n° AOCS 996.06. A quantidade de gordura bruta é determinada de acordo com os Métodos Oficiais da AOCS n° AOAC 920.39, 954.02.

[0046] Já que o isolamento do óleo é realizado com o uso de nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de solventes e também com o uso de nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de cloreto de sódio, a fase aquosa obtida como um subproduto também é, de modo preferencialmente substancial, livre de solventes orgânicos e cloreto de sódio. Então, a fase aquosa pode ser utilizada de diferentes maneiras, diretamente após a separação da fase oleosa ou após finalização adicional, como concentração e/ou secagem.

[0047] Uma matéria adicional da presente invenção é, portanto, uma suspensão aquosa contendo PUFAs, contendo uma biomassa, preferencialmente uma biomassa delipidada, como obtida ou como obtenível por um método de acordo com a presente invenção. Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um concentrado ou um produto seco como obtido ou obtenível concentrando-se e/ou secando- se essa suspensão aquosa. Ao concentrar a suspensão aquosa, a mesma é preferencialmente seca até que um teor de matéria seca total (TDM) de 20 a 60 % em peso seja alcançado. - A seguir, a expressão "suspensão aquosa de acordo com a invenção" se refere à fase aquosa como obtida após a separação da fase oleosa, bem como a quaisquer suspensões concentradas dessa fase aquosa como obtida concentrando-se essa fase aquosa. A secagem é preferencialmente realizada por evaporação de solvente, como descrito mais adiante.

[0048] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, uma suspensão aquosa contendo PUFAs, contendo uma biomassa, em particular, debris celulares de uma biomassa delipidada, caracterizada por um teor de solventes orgânicos apolares de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, principalmente menos de 0,01 % em peso, e adicionalmente caracterizada por um teor de íons de cloreto de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0049] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, em particular, uma suspensão aquosa contendo PUFAs, contendo uma biomassa, em particular, debris celulares de uma biomassa delipidada, caracterizada por um teor de solventes orgânicos de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, principalmente menos de 0,01 % em peso, e adicionalmente caracterizada por um teor de íons de cloreto de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0050] Uma matéria preferencial da presente invenção também é, portanto, uma suspensão aquosa contendo PUFAs, contendo uma biomassa de Thraustochytrid, em particular, debris celulares de uma biomassa de Thraustochytrid delipidada, caracterizada por um teor de solventes orgânicos apolares de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, principalmente menos de 0,01 % em peso, e adicionalmente caracterizada por um teor de íons de cloreto de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0051] Uma matéria particularmente preferencial da presente invenção também é, portanto, uma suspensão aquosa contendo PUFAs, contendo uma biomassa de Thraustochytrid, em particular, debris celulares de uma biomassa de Thraustochytrid delipidada, caracterizada por um teor de solventes orgânicos de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, principalmente menos de 0,01 % em peso, e adicionalmente caracterizada por um teor de íons de cloreto de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0052] As suspensões aquosas da invenção como descrito anteriormente exibem preferencialmente um teor de matéria seca total (TDM) de 20 a 60 % em peso, em particular, de 25 a 55 % em peso, mais preferencialmente de 30 a 50 % em peso, já que tais suspensões concentradas se provaram particularmente adequadas para as aplicações da invenção, como descrito abaixo.

[0053] "Cloreto" de acordo com a invenção se refere à quantidade de cloro detectável. A quantidade de cloro presente pode ser determinada, por exemplo, por análise elementar de acordo com DIN EN ISO 11885. O cloro está presente na forma de sais que são denominados "cloretos". O teor de cloreto como mencionado de acordo com a invenção - também denominado "íons de cloreto" - apenas se refere à quantidade de cloro detectável, não à quantidade do sal de cloreto completo, o qual compreende, além de íon de cloreto, também um contraíon catiônico.

[0054] Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, a fase aquosa contendo água, sais, óleo residual e debris celulares, a qual é obtida como subproduto na etapa de coleta de óleo, como descrito anteriormente, é convertida em uma biomassa seca secando-se a biomassa a um teor de matéria seca total de mais de 90 % em peso.

[0055] Então, uma matéria adicional da presente invenção também é uma biomassa contendo PUFAs, em particular, uma biomassa delipidada contendo PUFAs, caracterizada por um teor de solventes orgânicos apolares de menos de 2 % em peso, preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1, 0,05 ou 0,02 % em peso e adicionalmente caracterizada por um teor de íons de cloreto de menos de 2 % em peso, preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0056] Então, uma matéria adicional da presente invenção também é uma biomassa contendo PUFAs, em particular, uma biomassa delipidada contendo PUFAs, caracterizada por um teor de solventes orgânicos de menos de 2 % em peso, preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1, 0,05 ou 0,02 % em peso e adicionalmente caracterizada por um teor de íons de cloreto de menos de 2 % em peso, preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0057] Então, uma matéria preferencial da presente invenção também é uma biomassa de Thraustochytrid contendo PUFAs, em particular, uma biomassa delipidada de Thraustochytrid, caracterizada por um teor de solventes orgânicos apolares de menos de 2 % em peso, preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1, 0,05 ou 0,02 % em peso e adicionalmente caracterizada por um teor de íons de cloreto de menos de 2 % em peso, preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0058] Então, uma matéria particularmente preferencial da presente invenção também é uma biomassa de Thraustochytrid contendo PUFAs, em particular, uma biomassa delipidada de Thraustochytrid, caracterizada por um teor de solventes orgânicos de menos de 2 % em peso, preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1, 0,05 ou 0,02 % em peso e adicionalmente caracterizada por um teor de íons de cloreto de menos de 2 % em peso, preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0059] Já que a preparação é preferencialmente realizada sem o uso de solventes orgânicos apolares, preferencialmente sem o uso de quaisquer solventes orgânicos, de todo, e sem o uso de cloreto de sódio, preferencialmente sem o uso de sais de cloreto, de todo, a biomassa resultante é preferencialmente livre de quaisquer solventes orgânicos apolares, preferencialmente livre de quaisquer solventes orgânicos, em geral, ainda essencialmente livre de quaisquer íons de cloreto, de todo, em que "essencialmente livre" significa que contém íons de cloreto em uma quantidade de menos de 0,1 % em peso, em particular, em uma quantidade de menos de 0,05 % em peso.

[0060] A biomassa de acordo com a invenção exibe preferencialmente um teor de umidade de não mais que 10 % em peso, preferencialmente não mais que 5 % em peso.

[0061] A biomassa então obtida compreende preferencialmente lipídios (gordura bruta) em uma quantidade de cerca de 3 a 14 % em peso, em particular, cerca de 4 a cerca de 14 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de cerca de 4,5 a cerca de 12 % em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 5 a cerca de 10 % em peso. Além disso, o lipídio compreende preferencialmente pelo menos um PUFA selecionado a partir de DHA e EPA, mais preferencialmente uma mistura de DHA e EPA, em que a razão entre DHA e EPA está preferencialmente entre 3:2 a 4:1 e em que a quantidade de DHA é preferencialmente de 30 a 50 % em peso da quantidade total de lipídios contidos e a quantidade de EPA é preferencialmente de 10 a 20 % em peso da quantidade total de lipídios contidos. Consequentemente, também as suspensões aquosas, como descrito anteriormente, são preferencialmente caracterizadas por serem conversíveis por secagem em uma biomassa com tal teor de gordura bruta e/ou teor de EPA e/ou teor de DHA por secagem da suspensão aquosa a um teor de umidade de não mais que 10 % em peso, preferencialmente não ais que 5 % em peso.

[0062] A biomassa ainda compreende preferencialmente aminoácidos em uma quantidade de 15 a 25 % em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de 17 a 23 % em peso, e exibe preferencialmente um teor de proteína bruta de 25 a 35 % em peso. Consequentemente, também as suspensões aquosas, como descrito anteriormente, são preferencialmente caracterizadas por serem conversíveis por secagem em uma biomassa com tal aminoácido e/ou teor de proteína bruta por secagem da suspensão aquosa a um teor de umidade de não mais que 10 % em peso, preferencialmente não mais que 5 % em peso.

[0063] A biomassa ainda exibe preferencialmente um teor de fibra bruta de menos de 5 % em peso, preferencialmente menos de 2 % em peso, mais preferencialmente de cerca de 0 % em peso. Consequentemente, também as suspensões aquosas, como descrito anteriormente, são preferencialmente caracterizadas por serem conversíveis por secagem em uma biomassa com tal teor de fibra bruta por secagem da suspensão aquosa a um teor de umidade de não mais que 10 % em peso, preferencialmente não mais que 5 % em peso.

[0064] A biomassa seca é preferencialmente uma biomassa delipidada, o que significa uma biomassa cuja maior parte dos lipídios foi removida, preferencialmente por um processo como revelado neste pedido. Já que a separação de óleo da biomassa é muito eficaz, o óleo remanescente na biomassa é preferencialmente menos de 20 % em peso, preferencialmente menos de 15 % em peso, mais preferencialmente menos de 10 % em peso, do óleo como originalmente contido na biomassa. Porém, já que o óleo não pode ser removido completamente por tal processo, uma quantidade substancial de óleo ainda permanece contida também na biomassa delipidada de acordo com a invenção. Isso significa que o termo "biomassa delipidada" de acordo com a invenção se refere a uma biomassa lisada, cuja maior parte de óleo foi removida, preferencialmente por um processo ou método como revelado neste pedido, porém que ainda contém uma parte substancial de lipídios, em particular, de lipídios contendo PUFAs, em que a quantidade de lipídios na biomassa seca delipidada é preferencialmente de 3-14 % em peso, em particular, 4-14 % em peso, preferencialmente de 4,5-12 % em peso, mais preferencialmente de 5-10 % em peso. Desse modo, a "biomassa delipidada" de acordo com a invenção também pode ser denominada "biomassa parcialmente delipidada" ou uma "biomassa substancialmente delipidada".

[0065] Desse modo, uma matéria adicional da presente invenção é um método para obter uma biomassa que é substancialmente livre de solventes orgânicos apolares, preferencialmente livre de solventes orgânicos, em geral, e que é, ainda, substancialmente livre de cloreto de sódio, preferencialmente livre de sais de cloreto, em geral, que compreende as etapas de método como mencionado anteriormente.

[0066] A conversão da fase pesada contendo água, sais, óleo remanescente e debris celulares, a qual é obtida como subproduto na etapa de coleta de óleo, em uma biomassa seca secando-se a biomassa a um teor de matéria seca total de mais de 90 % em peso pode ser realizada de diferentes maneiras.

[0067] De um modo muito preferencial, a transformação é realizada pela concentração da fase pesada a um teor de matéria seca de 30-50 % em peso, preferencialmente 35-45 % em peso, e granulação por aspersão subsequente da biomassa por meio de granulação de leito fluidizado. Ao fazê-lo, de um modo muito eficaz, uma biomassa com recursos vantajosos pode ser obtida. A granulação por aspersão por meio de granulação de leito fluidizado é revelada em mais detalhes no documento EP13176661.0.

[0068] A biomassa como obtida desse modo tem algumas características vantajosas adicionais como a seguir: tem uma boa fluidez (preferencialmente pelo menos grau 4), um baixo valor de pó (preferencialmente livre de pó), uma alta densidade aparente de preferencialmente mais de 500 kg/m3, e/ou um alto valor de energia de pelo menos 3500 kcal/kg, preferencialmente de cerca de 3800 a 4200 kcal/kg.

[0069] A concentração da fase pesada a um teor de matéria seca de 30-50 % em peso é preferencialmente realizada por evaporação de solvente, em particular, evaporação a vácuo, e/ou com o uso de um evaporador rotativo, um evaporador de filme fino ou um evaporador de filme descendente. Uma alternativa útil à evaporação de solvente é a osmose reversa.

[0070] Para determinar a fluidez da biomassa granular, vasos de efluxo cônicos de vidro com aberturas de efluxo de tamanho diferente são usados (Klein: Seifen, Õle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)). Os vasos de vidro exibem uma altura de 70 mm, um diâmetro interno máximo de 36 mm, um diâmetro externo máximo de 40 mm e orifícios circulares na extremidade cônica dos vasos de vidro com diâmetros como a seguir: 2,5; 5; 8; 12; 18 mm. Os vasos de vidro são completamente preenchidos com a biomassa granular e subsequentemente fixados em um bastidor com orifício direcionado para baixo. Preferencialmente, o orifício dos vasos de vidro é aberto removendo-se uma cobertura localizada no orifício após a fixação dos vasos de vidro no bastidor.

[0071] A fluidez é determinada como a seguir: Se o material granular pode fluir para fora do vaso com o menor diâmetro (2,5 mm) sem estagnação, então a fluidez é determinada como 1; se pode fluir para fora do vaso com diâmetro de 5 mm sem estagnação, então a fluidez é determinada como 2; e assim por diante. Uma fluidez de 6 significa que o material granular não pode fluir para fora do vaso com o maior diâmetro (18 mm), de todo, ou pode fluir para fora desse vaso apenas com estagnação. - Desse modo, uma fluidez de 4 significa que o material granular pode fluir para fora do vaso com um diâmetro de 12 mm sem estagnação.

[0072] Entende-se que "sem pó" de acordo com a invenção signifique um pó que contém apenas pequenas frações (< 10 % em peso, preferencialmente < 5 % em peso, em particular, < 3 % em peso, especialmente < 1 % em peso) de tamanhos de partícula abaixo de 100 micrômetros.

[0073] Em uma modalidade preferencial da invenção, uma fração de pelo menos 80 % em peso, em particular, pelo menos 90 % em peso, de modo particularmente preferencial pelo menos 95 % em peso, especialmente pelo menos 98 % em peso das partículas da biomassa possui um tamanho de partícula de 100 a 2500 micrômetros, preferencialmente 300 a 2500 micrômetros, em particular, 500 a 2200 micrômetros, mais preferencialmente 1000 a 2000 micrômetros.

[0074] O diâmetro médio de partícula d50 das partículas da biomassa está preferencialmente na faixa de 500 a 2200 micrômetros, mais preferencialmente na faixa de 1000 a 2000 micrômetros, em particular, na faixa de 1300 a 1900 micrômetros.

[0075] O tamanho de partícula ou grão é preferencialmente determinado de acordo com a invenção por métodos espectrométricos de difração a laser. Os métodos possíveis são descritos no livro "Teilchengroβenmessung in der Laborpraxis" [Medição de tamanho de partícula no laboratório] de R. H. Müller e R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) e no livro "Introduction to Particle Technology" de M. Rhodes, Wiley & Sons (1998). Já que vários métodos podem ser usados, o método utilizável primeiramente citado no livro de R.H. Müller e R. Schuhmann para a medição de tamanho de partícula é preferencialmente usado.

[0076] A densidade aparente da biomassa de acordo com a invenção é preferencialmente 400 a 800 kg/m3, de modo particularmente preferencial 450 a 750 kg/m3, em particular, 500 a 750 kg/m3.

[0077] Como uma alternativa à granulação por aspersão, outros métodos de secagem, em particular, outros métodos de secagem convectiva, como secagem em túnel ou secagem por aspersão, em particular, secagem com bocal de aspersão, ou métodos de secagem por contato, como secagem em tambor, ou métodos de secagem por radiação, como secagem por infravermelho, da fase pesada concentrada seriam alternativas aplicáveis, em que, com o uso daqueles métodos, normalmente partículas com um diâmetro menor ou mais são obtidas.

[0078] De acordo com a invenção, durante o processo de secagem, um agente antiaglomerante, em particular, sílica, preferencialmente uma sílica hidrofóbica ou hidrofílica, pode ser opcionalmente adicionada à biomassa para impedir aglomeração. Com esse propósito, o caldo de fermentação que compreende biomassa bem como a sílica são preferencialmente aspergidos na zona de secagem particular. Alternativa ou adicionalmente, a biomassa pode ser misturada com o agente antiaglomerante após o processo de secagem. Em relação ao uso de sílica como agente antiaglomerante, é feita referência em particular ao pedido de patente EP13187631.0.

[0079] Em uma modalidade particular, a biomassa de acordo com a invenção tem uma concentração de um agente antiaglomerante, em particular, sílica, preferencialmente sílica hidrofílica ou hidrofóbica, de 0,2 a 10 % em peso, em particular, 0,5 a 7 % em peso, especialmente 0,5 a 5 % em peso.

[0080] A conversão de um pó de granuralidade fina em um produto sem pó com granuralidade grossa pode ser realizada por processos de granulação. Os auxiliares orgânicos ou inorgânicos convencionais ou suportes, como amido, gelatina, derivados de celulose ou substâncias similares, os quais são tipicamente usados em processamento de alimentos ou processamento de rações como agentes ligantes, agentes geleificantes ou espessantes, podem ser opcionalmente usados nesse processo subsequente de granulação. Auxiliares adicionais que são preferencialmente usados de acordo com a invenção são revelados no documento WO 2016/050560, sendo que carboximetilcelulose é um agente ligante particularmente preferencial.

[0081] Então, em uma modalidade particular da presente invenção, a biomassa contém um auxiliar de aglomeração, em particular, um polissacarídeo modificado, preferencialmente carboximetilcelulose, em uma quantidade de 0,05 a 10 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de 0,1 a 5 % em peso.

[0082] Um produto que tem o tamanho de partícula e/ou distribuição de tamanho de partícula desejada pode ser opcionalmente obtido a partir do granulado como obtido por secagem e/ou granulação por peneiramento ou separação de pó subsequente.

[0083] Após secagem e opcionalmente granulação e/ou peneiramento da biomassa, a biomassa seca é preferencialmente armazenada ou embalada.

[0084] A biomassa particulada da invenção bem como as suspensões aquosas da invenção podem ser usadas de modos diferentes. Por exemplo, podem ser usadas a fim de produzir um gênero alimentício ou composição alimentícia, já que a biomassa e as suspensões aquosas de acordo com a invenção se mostraram surpreendentemente bem aceitas como ingrediente de ração por animais, em particular, por gado bovino. Alternativamente, podem ser usadas diretamente como gênero alimentício ou composição alimentícia.

[0085] Uma composição alimentícia ou gênero alimentício que compreende uma biomassa particulada ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção é, portanto, uma matéria adicional da presente invenção. A composição alimentícia pode ser, por exemplo, usada para alimentar aves, suínos, martas, ruminantes, em particular, gado bovino ou bezerros, ovelhas, cabras, animais domésticos ou animais mantidos em aquacultura. Em uma modalidade muito preferencial da invenção, a composição alimentícia é usada para alimentar gado bovino. A composição alimentícia ou gênero alimentício compreende preferencialmente a biomassa em uma quantidade de 2 a 60 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de 5 a 50 % em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de 10 a 30 % em peso.

[0086] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, o uso de uma biomassa particulada e/ou de uma suspensão aquosa de acordo com a invenção para produzir um gênero alimentício ou composição alimentícia.

[0087] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para produzir uma composição alimentícia ou gênero alimentício, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção é usada, e é preferencialmente misturada com ingredientes adicionais de composição alimentícia ou gênero alimentício.

[0088] Em uma modalidade preferencial da invenção, a biomassa particulada e/ou a suspensão aquosa é usada para produzir um gênero alimentício ou composição alimentícia, em que a biomassa e/ou a suspensão aquosa é preferencialmente misturada com outros ingredientes de gênero alimentício ou composição alimentícia e é, então, processada para produzir o gênero alimentício ou a composição alimentícia.

[0089] A mistura de biomassa e/ou suspensão aquosa e outros ingredientes de gênero alimentício ou composição alimentícia é processada em uma modalidade preferencial por um processo de extrusão, a fim de obter porções de gênero alimentício ou composição alimentícia prontas para venda. Alternativamente, um método de peletização também pode ser usado.

[0090] Uma extrusora de rosca ou rosca dupla é preferencialmente empregada no processo de extrusão. O processo de extrusão é preferencialmente realizado a uma temperatura de 80 - 220 °C, particularmente 100 - 190 °C, uma pressão de 1000 a 4000 kPa (10 - 40 Bar) , e uma velocidade rotacional de haste de 100 - 1000 rpm, particularmente 300 - 700 rpm. O tempo de permanência da mistura introduzida é preferencialmente de 5 - 30 segundos, em particular, 10 - 20 segundos.

[0091] Em um modo do processo de extrusão que é preferencial de acordo com a invenção, o processo compreende uma etapa de compactação e uma etapa de compressão.

[0092] É preferencial misturar intensamente os componentes entre si antes de realizar o processo de extrusão. Isso é realizado, de preferência, em um tambor equipado com aletas. Nessa etapa de mistura, uma modalidade preferencial inclui uma injeção de vapor, em particular, de modo a causar o intumescimento do amido que está, de preferência, presente.

[0093] Antes de ser misturado com a biomassa e/ou suspensão aquosa, os demais ingredientes de ração ou produto alimentício são, de preferência, triturados - se exigido - de modo a garantir que uma mistura homogênea seja obtida na etapa de mistura. A trituração dos demais ingredientes de ração ou produto alimentício pode ser realizada, por exemplo, com o uso de um moinho de martelos.

[0094] Uma matéria adicional da presente invenção é, portanto, um método para alimentar animais, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção são fornecidas para animais, preferencialmente após misturar a biomassa particulada e/ou a suspensão aquosa com outros ingredientes de composição alimentícia, em que os animais são preferencialmente selecionados a partir de aves, suínos, martas, ruminantes, em particular, de bezerros e gado bovino, ovelhas, cabras, animais domésticos ou animais mantidos em aquacultura.

[0095] Alternativamente, a biomassa e/ou suspensão aquosa de acordo com a invenção podem ser usadas em aplicações de solo, em particular, como fertilizante (orgânico), NPC (fonte de nitrogênio/fósforo/potássio), melhorador de solo, melhorador de planta e/ou auxiliar de compostagem, para produzir biogás, para tratamento de água servida ou como combustível alternativo, em particular, para fornos de cimento. Podem ser adicionalmente usadas como parte de um meio de fermentação para produzir microrganismos, em particular, para produzir biomassa contendo PUFAs adicional.

[0096] Uma matéria adicional da presente invenção é, portanto, um método para melhorar o solo, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção são espalhadas sobre e possivelmente misturadas com o solo, em particular, com solo de terreno agrícola ou solo de jardim.

[0097] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para fertilização e/ou compostagem do solo, em particular, terreno agrícola ou jardim, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção são espalhadas sobre e possivelmente misturadas com o solo, em particular, com solo de terreno agrícola ou solo de jardim.

[0098] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para produzir biogás, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção é submetida à degradação microbiana sob condições anaeróbicas, em particular, com o uso de bactérias metanogênicas.

[0099] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para tratamento de água servida, em que a água servida é misturada com uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção.

[0100] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para produzir microrganismos, em particular, para produzir a biomassa contendo PUFAs, em que uma biomassa particulada e/ou suspensão aquosa de acordo com a invenção é usada como parte do meio de fermentação.

[0101] O método de acordo com a invenção também pode compreender como uma etapa de pré-tratamento a pasteurização da suspensão da biomassa, antes de realizar a lise das células. A pasteurização é preferencialmente realizada por 5 a 80 minutos, em particular, 20 a 60 minutos, a uma temperatura de 50 a 121 °C, em particular, 50 a 70 °C.

[0102] As células contendo PUFAs da biomassa são preferencialmente células microbianas ou células vegetais. Preferencialmente, as células são capazes de produzir os PUFAs devido a um sistema de policetídeo sintase. O sistema de policetídeo sintase pode ser endógeno ou, devido à engenharia genética, exógeno.

[0103] Consequentemente, "biomassa delipidada" de acordo com a invenção em particular se refere aos debris de tais células contendo PUFAs que compreendem biomassa, em particular, como revelado mais adiante, após terem sido submetidos a um processo de isolamento de óleo, em particular, como adicionalmente revelado anteriormente.

[0104] As células vegetais podem ser selecionadas em particular a partir de células das famílias Brassicaceae, Elaeagnaceae e Fabaceae. As células da família Brassicaceae podem ser selecionadas a partir do gênero Brassica, em particular, de colza oleaginosa, colza silvestre e mostarda da Índia; as células da família Elaeagnaceae podem ser selecionadas a partir do gênero Elaeagnus, em particular, da espécie Oleae europaea; as células da família Fabaceae podem ser selecionadas a partir do gênero Glycine, em particular, da espécie Glycine max.

[0105] Os organismos microbianos que contêm um lipídio contendo PUFAs são descritos extensivamente na técnica anterior. As células usadas podem ser, nesse contexto, em particular, células que já produzem naturalmente PUFAs (ácidos graxos poli-insaturados); no entanto, também podem ser células que, como resultado de métodos de engenharia genética adequados ou devido a mutagênese aleatória, mostram uma produção melhorada de PUFAs ou foram tornadas capazes de produzir PUFAs, de todo. A produção dos PUFAs pode ser auxotrófica, mixotrófica ou heterotrófica.

[0106] A biomassa compreende preferencialmente células que produzem PUFAs heterotroficamente. As células de acordo com a invenção são preferencialmente selecionadas a partir de algas, fungos, particularmente leveduras, bactérias ou protistas. As células são mais preferencialmente algas microbianas ou fungos.

[0107] As células adequadas de leveduras produtoras de óleo são, em particular, cepas de Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.

[0108] As células adequadas de algas produtoras de óleo e microrganismos similares a algas são, em particular, microrganismos selecionados a partir do filo Stramenopiles (também denominado Heterokonta). Os microrganismos do filo Stramenopiles podem ser em particular selecionados a partir dos seguintes grupos de microrganismos: Hamatores, Proteromonads, Opalines, Developayella, Diplophrys, Labrinthulids, Thraustochytrids, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatoms, Xanthophytes, Phaeophytes (algas marrons), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (incluindo Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales, e Chromulinales. Outros grupos preferenciais de microalgas incluem os membros das algas verdes e dinoflagelados, incluindo os membros do gênero Crypthecodiurn.

[0109] A biomassa de acordo com a invenção compreende preferencialmente células, e preferencialmente consiste essencialmente em tais células, do táxon Labirintulomicetos (Labyrinthulea, fungos net slime, mofos-em-rede), em particular, aqueles da família Thraustochytriaceae. A família Thraustochytriaceae (Thraustochytrids) inclui os gêneros Althomia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elnia, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium, e Ulkenia. A biomassa particularmente compreende preferencialmente células dos gêneros Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Schizochytrium, ou Thraustochytrium, principalmente do gênero Schizochytrium.

[0110] De acordo com a invenção, o ácido graxo poli- insaturado (PUFA) é preferencialmente um ácido graxo altamente insaturado (HUFA).

[0111] As células presentes na biomassa são preferencialmente distinguidas pelo fato de que contêm pelo menos 20 % em peso, preferencialmente pelo menos 30 % em peso, em particular, pelo menos 35 % em peso, de PUFAs, em cada caso com base na matéria seca celular.

[0112] De acordo com a presente invenção, o termo "lipídio" inclui fosfolipídios; ácidos graxos livres; ésteres de ácidos graxos; triacilgliceróis; esteróis e esterol ésteres; carotenoides; xantofilas (por exemplo, oxicarotenoides); hidrocarbonetos; compostos derivados de isoprenoide e outros lipídios conhecidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica. - Os termos "lipídio" e "óleo" são usados alternadamente de acordo com a invenção.

[0113] Em uma modalidade preferencial, a maioria dos lipídios nesse caso está presente na forma de triglicerídeos, com, de preferência, pelo menos 50 % em peso, em particular, pelo menos 75 % em peso e, em uma modalidade especialmente preferencial, pelo menos 90 % em peso dos lipídios presentes na célula que está presente na forma de triglicerídeos.

[0114] De acordo com a invenção, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs) são compreendidos de modo a se referir a ácidos graxos que têm pelo menos duas, particularmente pelo menos três, ligações duplas C-C. De acordo com a invenção, os ácidos graxos altamente insaturados (HUFAs) são preferenciais entre os PUFAs. De acordo com a invenção, os HUFAs são compreendidos de modo a se referir a ácidos graxos que têm pelo menos quatro ligações duplas C-C.

[0115] Os PUFAs podem estar presentes na célula em forma livre ou em forma ligada. Exemplos da presença em forma ligada são fosfolipídios e ésteres dos PUFAs, em particular, monoacil-, diacil- e triacilglicerídeos. Em uma modalidade preferencial, a maioria dos PUFAs está presente na forma de triglicerídeos, com, de preferência, pelo menos 50 % em peso, em particular, pelo menos 75 % em peso e, em uma modalidade especialmente preferencial, pelo menos 90 % em peso dos PUFAs presentes na célula que está presente na forma de triglicerídeos.

[0116] Os PUFAs preferenciais são ácidos graxos ômega-3 e ácidos graxos ômega-6, sendo que os ácidos graxos ômega-3 são especialmente preferenciais. Os ácidos graxos ômega-3 preferenciais do presente documento são o ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5w-3), particularmente o ácido (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoico, e o ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6w-3), particularmente o ácido (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19- hexaenoico.

[0117] Em uma modalidade muito preferencial da presente invenção, células, em particular, uma cepa de Schizochytrium, é empregada, a qual produz uma quantidade significativa de EPA e DHA, simultaneamente, em que DHA é preferencialmente produzido em uma quantidade de pelo menos 20 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de pelo menos 30 % em peso, em particular, em uma quantidade de 30 a 50 % em peso, e EPA é produzido em uma quantidade de pelo menos 5 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de pelo menos 10 % em peso, em particular, em uma quantidade de 10 a 20 % em peso (em relação à quantidade total de lipídio como contido nas células, respectivamente). As cepas de Schizochytrium que produzem DHA e EPA podem ser obtidas pela mutagênese consecutiva seguida da seleção adequada de cepas mutantes que demostra produção de EPA e DHA superior e uma razão específica entre EPA:DHA. Qualquer agente químico ou não químico (por exemplo, radiação ultravioleta (UV)) com capacidade para incluir alteração genética para a célula de levedura pode ser usado como o mutagênico. Esses agentes podem ser usados sozinhos ou em combinação entre si, e os agentes químicos podem ser usados puros ou com um solvente.

[0118] As espécies preferenciais de microrganismos do gênero Schizochytrium, as quais produzem EPA e DHA simultaneamente em quantidades significativas, como mencionado anteriormente, estão depositadas sob Número de Acesso ATCC PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, ou PTA-10211, PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215.

[0119] A suspensão de biomassa de acordo com a presente invenção, a partir da qual o lipídio contendo PUFAs é obtenível, é preferencialmente um caldo de fermentação, em particular, um caldo de fermentação com uma densidade de biomassa de pelo menos 80 ou 100 g/l, preferencialmente pelo menos 120 ou 140 g/l, mais preferencialmente pelo menos 160 ou 180 g/l (calculada como teor de matéria seca). Então, a suspensão pode ser obtida cultivando-se e desenvolvendo-se células adequadas em um meio de fermentação sob condições em que os PUFAs são produzidos pelo microrganismo.

[0120] Os métodos para produzir a biomassa, em particular, uma biomassa que compreende células contendo lipídios, em particular, PUFAs, particularmente da ordem Thraustochytriales, são descritos em detalhes na técnica anterior (consultar, por exemplo, documentos WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, WO97/36996, WO01/54510). Como regra, a produção ocorre por células sendo cultivadas em um fermentador na presença de uma fonte de carbono e de uma fonte de nitrogênio, juntamente a diversas substâncias adicionais, como minerais que permitem o crescimento dos microrganismos e a produção dos PUFAs. Nesse contexto, as densidades de biomassa de mais que 100 gramas por litro e taxas de produção de mais que 0,5 gramas de lipídio por litro por hora podem ser alcançadas. O processo é realizado, de preferência, no que é conhecido como um processo de batelada alimentada, isto é, as fontes de carbono e nitrogênio são alimentadas gradualmente durante a fermentação. Quando a biomassa desejada é obtida, produção de lipídio pode ser induzida por várias medidas, por exemplo, limitando-se a fonte de nitrogênio, a fonte de carbono ou o teor de oxigênio ou combinações das mesmas.

[0121] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, as células são cultivadas até que alcancem uma densidade de biomassa de pelo menos 80 ou 100 g/l, mais preferencialmente pelo menos 120 ou 140 g/l, em particular, pelo menos 160 ou 180 g/l (calculada como teor de matéria seca). Tais processos são, por exemplo, revelados no documento US 7.732.170.

[0122] De preferência, as células são fermentadas em um meio com baixa salinidade, em particular, de modo a evitar corrosão. Isso pode ser alcançado usando-se sais de sódio livre de cloro como a fonte de sódio em vez de cloreto de sódio, como, por exemplo, sulfato de sódio, carbonato de sódio, carbonato de sódio e hidrogênio ou soda calcinada. De preferência, cloreto é usado na fermentação em quantidades de menos que 3 g/l, em particular, menos que 500 mg/l, especialmente de preferência, menos que 100 mg/l.

[0123] As fontes de carbono adequadas são ambas as fontes de carbono alcoólica e não alcoólica. Exemplos de fontes de carbono alcoólicas são metanol, etanol e isopropanol. Exemplos de fontes de carbono não alcoólicas são frutose, glicose, sacarose, melaços, amido e xarope de milho.

[0124] As fontes de nitrogênio adequadas são ambas as fontes de nitrogênio inorgânicas e orgânicas. Exemplos de fontes de nitrogênio inorgânicas são nitratos e sais de amônio, em particular, sulfato de amônio e hidróxido de amônio. Exemplos de fontes de nitrogênio orgânicas são aminoácidos, em particular, glutamato, e ureia.

[0125] Além disso, compostos de fósforo orgânicos e inorgânicos e/ou substâncias estimuladoras de crescimento conhecidas, como, por exemplo, extrato de levedura ou milhocina, também podem ser adicionados de modo a ter um efeito positivo na fermentação.

[0126] As células são, de preferência, fermentadas a um pH de 3 a 11, em particular, 4 a 10 e, de preferência, a uma temperatura de pelo menos 20 °C, em particular, 20 a 40 °C, especialmente de preferência, pelo menos 30 °C. Um processo de fermentação típico leva aproximadamente 100 horas.

[0127] Após a fermentação ter sido finalizada, as células podem ser pasteurizadas a fim de exterminar as células e desativar as enzimas que podem promover degradação de lipídio. A pasteurização é preferencialmente realizada aquecendo-se a biomassa a uma temperatura de 50 a 121 °C, preferencialmente 50 a 70 °C, por um período de 5 a 80 minutos, em particular, 20 a 60 minutos.

[0128] Do mesmo modo, após a fermentação ter sido finalizada, antioxidantes podem ser adicionados a fim de proteger os PUFAs presentes na biomassa da degradação oxidativa. Os antioxidantes preferenciais nesse contexto são BHT, BHA, TBHA, etoxiquina, beta-caroteno, vitamina E, em particular, tocoferol, e vitamina C. O antioxidante, se usado, é preferencialmente adicionado em uma quantidade de 0,001 a 0,1 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de 0,002 a 0,05 % em peso, em relação à quantidade total do caldo de fermentação após adição do antioxidante.

Exemplos de trabalho Exemplo 1

[0129] Um caldo celular não lavado contendo células microbianas (Schizochytrium sp.) a uma densidade de biomassa de mais de 100 g/l foi aquecido a 60 °C em um vaso agitado. Após aquecer a suspensão, o pH foi ajustado a 7,5 com o uso de soda cáustica (50 % em peso de solução de NaOH), antes de uma alcalase (Alcalase® 2.4 FG (Novozymes)) ter sido adicionada em forma líquida em uma quantidade de 0,5 % em peso (em peso de caldo). A agitação foi continuada por 3 horas a 60 °C. Após isso, a mistura celular lisada foi transferida para um evaporador de circulação forçada (obtido junto à GEA, Alemanha) e aquecida a uma temperatura de 85 °C. A mistura foi concentrada no evaporador de circulação forçada, até que um teor de matéria seca total de cerca de 30 % em peso fosse alcançado. A mistura celular lisada concentrada foi transferida para um novo vaso, aquecida até 90 °C sob agitação de baixo cisalhamento, enquanto se ajustou o pH a 10,5 adicionando soda cáustica. Agitação de baixo cisalhamento foi continuada por cerca de 30 horas, enquanto se manteve a temperatura a 90 °C e o pH acima de 9,0 adicionando soda cáustica.

[0130] Após isso, a mistura desemulsificada resultante foi neutralizada adicionando-se ácido sulfúrico para ajustar um pH de 7,5. A separação de fase em uma fase leve, contendo o óleo, e uma fase pesada, contendo água, debris celulares, óleo residual e sais, foi realizada mecanicamente com o uso de um separador de pilha de discos (Alfa Laval Disc Stack Centrifuge, LAPX 404/Clara 20).

[0131] Após a separação do óleo bruto, os debris celulares remanescentes foram ressuspensos na fase aquosa, concentrados e secos por granulação por aspersão.

[0132] Devido à desemulsificação eficaz, mais de 90 % em peso do óleo poderiam ser separados da biomassa sem a adição de solventes orgânicos ou cloreto de sódio.

[0133] A fase pesada remanescente foi convertida em uma biomassa sólida concentrando-a por meio de evaporação em uma matéria seca total de 45 % em peso a uma temperatura de cerca de 90 °C e secagem subsequente por meio de granulação por aspersão em um granulador por aspersão de leito fluidizado. A biomassa resultante exibe uma alta densidade aparente de mais de 530 kg/m3, um alto valor de energia de cerca de 4000 kcal/kg e propriedades de manuseio muito boas, em particular, uma fluidez de 4. Biomassas comparáveis originadas de Schyzochitria como disponível no mercado exibem uma fluidez muito pior de 6 e uma densidade aparente muito menor dentre 325 a 500 kg/m3.

Claims (15)

1. Método para separar um lipídio contendo ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) dos debris de uma biomassa, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:a) fornecer uma suspensão de uma biomassa que compreende células que contêm um lipídio contendo PUFAs;b) lisar as células da biomassa;c) concentrar a suspensão conforme obtida na etapa (b) a um teor de matéria seca total de 30 a 60 % em peso;d) aquecer a suspensão como obtida na etapa (c) a uma temperatura de 80 °C a 100 °C, enquanto ajusta o pHa um valor de 9,0 a 11,5;e) manter a temperatura e o valor de pH nas faixas como mostrado em (d) por 10 horas a 40 horas, resultando em uma suspensão demulsificada; ef) coletar o lipídio contendo PUFAs, em que a coleta dolipídio contendo PUFAs compreende a neutralização da suspensão demulsificada e separação subsequente da então obtida fase leve contendo óleo da fase pesada contendo água, sais, óleo residual e debris celulares;em que menos de 0,5 % em peso de solventes orgânicos e menos de 0,5 % em peso de sais são usados no método para isolar olipídio da biomassa, eem que as células da biomassa são do gênero Schizochytrium, em que a lise das células da biomassa é realizada enzimática, mecânica, química e/ou fisicamente, eem que, se enzimaticamente, a lise das células da biomassa é realizada como a seguir:g) aquecer a suspensão da biomassa a uma temperatura entre 50 °C e 70 °C, adicionar uma enzima degradadorade parede celular ao caldo de fermentação a um valor de pH adequado no qual a enzima está funcionando adequadamente; eh) manter a temperatura e o pH nas faixas como mostrado na etapa anterior por uma a quatro horas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura da etapa d) é de 85 °C a 95 °C.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o valor de pH da etapa d) é de 9,0 a 11,0.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o período de tempo da etapa e) é de 15 a 40 horas.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o período de tempo da etapa e) é de 20 a 36 horas.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a lise enzimática da biomassa é performada por duas a quatro horas.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que menos de 0,1 % em pesode solventes orgânicos e/ou menos de 0,1 % em peso de saissão usados no método.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que, após a lise das células, a suspensão é concentrada a um teor de matéria seca total de 35 a 55 % em peso.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida concentração é performada por evaporação de água a uma temperatura de 70 °C a 100 °C.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a separação da fase leve contendo lipídeo da fase pesada contendo água, sal, lipídio residual e debris celulares é performada mecanicamente a uma temperatura de 60-90 °C e a um valor de pH de 6-9.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a referida separação é performada a uma temperatura de 70-80 °C.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a referida separação é performada a um valor de pH de 7-8,5.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende como uma etapa adicional a conversão da fase pesada contendo água, sal, lipídio residual e debris celulares em uma biomassa seca por secagem da biomassa a um teor de matéria seca total de 90 % em peso a 100 % em peso, em que a conversão em uma biomassa seca é realizada por concentração da fase pesada a um teor de matéria seca de 3050 % em peso e granulação por aspersão subsequente da biomassa com o uso de um granulador de leito fluidizado.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a suspensão é fornecida como um caldo de fermentação com uma densidade de biomassa de 80 a 140 g/l, 100 g/l, ou 120 g/l.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a enzima degradadora de parede celular é selecionada a partir de proteases, celulases, hemicelulases, quitinases, pectinases, sacarases, maltases, lactases, alfa- glucosidases, beta-glucosidases, amilases, lisozimas, neuraminidases, galactosidases, alfa-manosidases, glucuronidases, hialuronidases, pululanases, glucocerebrosidases, galactosilceramidases, acetilgalactosaminidases, fucosidases, hexosaminidases, iduronidases, maltases-glucoamilases, beta-glucanases, mananases, e combinações dos mesmos.