BR0300978B1 - Método para a produção de um ácido L-glutâmico - Google Patents

Description

“MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ÁCIDO L-GLUTÂMICCT

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a métodos para a produção de L-aminoácidos e bactérias usados para os mesmos. Mais precisamente, a presente invenção refere-se a bactérias tendo uma capacidade aperfeiçoada para a produção de L-aminoácido e a métodos para a produção de L- aminoácidos usando as mesmas.

Descrição da Arte Relacionada Convencional mente, L-aminoácidos, tais como o ácido L- glutâmico, são principalmente produzidos pela fermentação utilizando as assim denominadas bactérias corinoformes pertencentes ao gênero Erevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium (“Amino Acid Fermentation'’, Gakkai Shuppan Center, págs. 195-215, 1986). Além disso, microorganismos do gênero Bacillus, Streptomyces, Penicillium (Patente U.S. 3.220.929), Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Aerobacter, Candida (Patente U.S. 3.563.857), Escherichia (Publicação exposta a exame da Patente Japonesa (Kokai) N° 5-244970) ou os similares podem ser também utilizados na produção de L-aminoácidos. Além disso, microorganismos pertencentes ao gênero Enterobacter (EP 1078989 A 2), Klebsiella, Erwinici ou Pantoea (Publicação exposta a exame da Patente Japonesa N° 2000-106869) podem ser também utilizados na produção de L-aminoácidos, tais como o ácido L- glutâmico.

Além disso, foram expostas várias técnicas para aumentar a capacidade de produção de L-aminoácido pelo aumento das enzimas envolvidas na biossíntese de L-aminoácidos através de técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, foi exposto um método para produção de ácido L-glutâmico pela utilização de uma bactéria pertencente a o gênero Enterobacter ou Klebsiella, no interior da qual é introduzido um gene de citrato sintase (EP0999282A2), e um método para a produção de ácido L- glutâmico pela utilização de uma bactéria pertencente ao gênero Enterobacter, no interior da qual são introduzidos genes, que codificam a citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase e glutamato desidrogenase (EP 1 078 989 A2).

Além disso, há também técnicas conhecidas para melhorar a capacidade de produção de L-aminoácido introduzindo-se genes que codificam enzimas glicolíticas tais como glucose-6-fosfato isomerase (WO

01/02542 Al), frutose fosfotransferase (WO 01/48146 Al) e enolase (WO 01/02543 Al).

Entretanto, muitas bactérias Gram-negativas, que incluem enterobactérias, possuem o curso Entner-Doudoroff como um dos cursos metabólicos de glicose. Este curso envolve 6-fosfogluconato desidratase (abreviado como “EDD” a seguir), que catalisa uma reação para produzir 2- ceto-3-deóxi-6- fosfogluconato a partir de ácido 6-fosfoglucônico, e 2-ceto-3- deóxi-6- fosfogluconato aldolase (abreviado como “EDA” a seguir), que cliva 2-ceto-3-deóxi-6-fosfogluconato para produzir gliceraldeído-3-fosfato e ácido pirúvico. Os genes que codificam EDD e EDA foram clonados a partir de Escheríchia coli, Zymomonas mobilis, e assim por diante, e suas sequência de nucleotídeo foram relatadas. As seqüências de nucleotídeo do gene que codifica EDD (edd) e o gene que codifica EDA (eda) de Escheríchia coli são registrados como número de acesso ao GenBank L 20897. Além disso, a seqüência de nucleotídeo do gene eda de Zymomonas mobilis é registrado como número de acesso ao GenBank M 60615 M37982 na base de dados.

Entretanto, a relação entre a via Entner-Doudoroff e a produtividade de L-aminoácidos é desconhecida.

Sumário da Invenção É um objeto da presente invenção prover uma técnica para aperfeiçoar a produtividade de L-aminoácidos em bactérias a partir de um ponto de vista diferente das técnicas conhecidas.

Os inventores da presente invenção dirigiram a sua atenção para a via Entner-Doudoroff possuída pelas bactérias Gram-negativas. Dentre as vias metabólicas de sacarídeos para L-aminoácidos, tais como o ácido L- glutâmico, dióxido de carbono é produzido por uma reação para a produção de ribulose-5-fosfato a partir de ácidos 6-fosfoglucônicos através de 6- fosfogluconato desidrogenase. Em cepas de bactérias tendo um grande influxo de carbono ao interior da via de pentose fosfato, em particular, uma grande quantidade de dióxido de carbono deve ser também liberada pela reação acima mencionada. Portanto, eles consideraram que uma capacidade para produzir um L-aminoácido, tal como ácido L-glutâmico, podería ser aumentada, evitando-se o influxo ao interior da via de pentose fosfato.

Dois dos métodos de redução do influxo de carbono ao interior da via de pentose fosfato são concebidos: (1) eliminar ou reduzir uma atividade de glieose-6-fosfato desidrogenase ou 6-fosfogluconato desidrogenase; e (2) aumentar a via Entner-Doudoroff. Pode ser esperado que ambos os métodos tenham um efeito de desviar a via de pentose fosfato.

Entretanto, no caso de (2) é considerado que, como a distribuição de carbono com relação à via de pentose fosfato pode ser alterada pela regulação das atividades de EDD e EDA, podendo ser também suprido um derivado de uma substância intermediária na via de pentose fosfato, tal como um ácido nucléico. Além disso, como um resultado de várias investigações, eles verificaram que a capacidade das bactérias para a produção de L-aminoácidos pode ser aperfeiçoada pelo aumento da via Entner-Doudoroff, e, deste modo, realizada a presente invenção.

Ou seja, a presente invenção provê o seguinte: (1) um método para produzir um L-aminoácido, que compreende cultivar um microorganismo tendo uma capacidade para produzir um L-aminoácido em um meio, de modo a produzir e acumular o L- aminoácido no meio e coletar o L-aminoácido a partir do meio, em que o microorganismo é uma bactéria Gram-negativa tendo a via Entner-Doudoroff e que foi modificada, de tal modo que a atividade de 6-fosfogluconato desidratase ou a atividade de 2-ceto-3- deoxi-6- fosfogluconato aldolase, ou atividades de ambos sejam melhoradas, e que o aminoácido seja selecionado a partir de L-aminoácidos produzidos por uma via biossintético utilizando ácido pirúvico como um intermediário. (2) O método de acordo com (1), em que a bactéria é uma enterobactéria. (3) O método de acordo com (2), em que a bactéria pertence ao gênero Enterobacter. (4) O método de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que a atividade de 6-fosfogluconato desidratase ou a atividade de 2-ceto-3-deóxi- 6-fosfogluconato aldolase é aumentada pelo aumento do número de cópias de um gene que codifica 6-fosfogluconato desidratase ou 2-ceto-3-deoxi-6- fosfogluconato aldolase ou modifica uma seqüência regulatória de expressão do gene, de tal modo que a expressão do gene seja aumentada em uma célula da bactéria. (5) O método de acordo com (1), em que o L-aminoácido é um ácido L-glutâmico ou um L-aminoácido produzido por uma via biossintética, utilizando o ácido L-glutâmico como um intermediário ou como um doador de grupo amino. (6) O método de acordo com um de (1) a (5), em que o L- aminoácido é selecionado a partir de ácido L-glutâmico, L-arginina, L- glutamina, L-prolina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina e L-alanina. (7) O método de acordo com (6), em que o L-aminoácido é o ácido L-glutâmico.

De acordo com a presente invenção, aumentando-se a atividade da via de Entnar-Doudoroff, a capacidade de um microorganismo que possua a via para produzir o L-aminoácido pode ser aperfeiçoada.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra o crescimento de uma cepa, na qual são aumentados o gene edd e o gene eda (A) e a quantidade de ácido L-glutâmico produzida (B).

Figura 2 mostra as quantidades de acetoína e de 2,3- butanodiol produzidas por uma cepa, na qual o gene edd e o gene eda são aumentados: (A) a quantidade de acetoína em um meio, (B) a quantidade de 2,3-butanodiol em um meio, e (C) a quantidade total de acetoína produzida e de 2,3-butanodiol por unidade de célula bacteriana (peso por unidade de peso de célula seca).

Explanação Detalhada da Invenção A seguir, a presente invenção será explicada em detalhe: < 1> Bactéria da presente invenção: A bactéria Gram-negativa usada para a presente invenção é uma bactéria Gram-negativa tendo uma capacidade para produzir um L- aminoácido e a via Entner-Doudoroff. O termo “uma capacidade para produzir um L-aminoácido” usada na presente invenção significa uma capacidade para acumular o L- aminoácido em um meio, em que a bactéria da presente invenção é cultivada no meio. Esta capacidade para produzir um L-aminoácido pode ser uma propriedades de uma cepa selvagem da bactéria gram-negativa ou um propriedade conferida ou aumentada através de procriação. Os L- aminoácidos, aos quais a presente invenção pode ser aplicada, são L- aminoácidos produzidos por uma via biossintética, que utiliza ácido pirúvico como um intermediário. Exemplos específicos dos mesmos incluem ácido L- glutâmico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-leucina, L-isoleucina, L- valina, L-alanina e assim por diante.

Como mostrados nos exemplos posteriormente descritos, uma bactéria tendo a via Entner-Doudoroff aumentada por atividades crescentes de EDD e EDA demonstrou produção aumentada de acetoína e 2,3-butanodiol.

Como 2,3- butanodiol é produzido a partir de acetoína e acetoína é produzida a partir de ácido pirúvico, o aumento na produção de acetoína e 2,3- butanodiol indica um aumento na quantidade de ácido pirúvico suprida.

Portanto, é esperado que a bactéria, que possui a via Entner- Doudoroff aumentada, possua uma capacidade aumentada para produzir um L- aminoácido produzido por uma via biossintética, que utilize ácido pirúvico como um intermediário.

Exemplos específicos das bactérias Gram-negativas tendo a via Entner-Doudoroff, incluem bactérias que pertencem aos gêneros Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia ou Panioea, Escherichia, Pseudomonas, Arthrobacter, e Aerobacter e assim por diante. Se uma bactéria possuir a via Entner-Doudoroff ou não puder ser determinada por, por exemplo, misturação de uma suspensão de com célula rompida com gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, ácido 6-fosfoglucônico e dinucleotídeo de acetilpiridina adenina e detecção de glcieraldeido-3-fosfato produzido a partir de ácido 6-fosfoglucônico como um substrato pela medição do aumento de absrobância a 365 nm. Se for confirmado que uma bactéria produz gliceraldeído 3- fosfato, ela possui a via Entner-Doudoroff.

As bactérias usadas para a presente invenção podem ser adequadamente selecionadas dependendo do tipo de L-aminoácido alvo. As bactérias adequadas para a produção de ácido L-glutâmico são exemplificadas abaixo. Entretanto, o escopo da presente invenção não está limitado a estes exemplos.

Exemplos específicos de bactérias Enterobacter incluem as seguintes bactérias.

Enterobacter agglomerans Enterobacter aerogenes Enterobacter aminogenus Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae Enterobacter dissolvens Enterobacter gergoviae Enterobacter hormaechei Enterobacter intermedius Enterobacter nimipressuralis Enterobacter sakazakii Enterobacter taylorae São mais preferidas as seguintes cepas bacterianas: Enterobacter agglomerans ATCC 12287 Enterobacter agglomerans AJ 13355 Enterobacter agglomerans AS 13356 Enterobacter agglomerans AJ 113601 Enterobacter agglomerans AJ 13355 e AJ 13556 foram depositadas no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (presentemente, a corporação administrativa independente, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Endereço: Chuo Daí-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Iabaraki-ken, Japão, código postal: 305-5466) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu os números de acesso FERM P-16644 e FERM P-16645, respectivamente. Então, os depósitos forma convertidos em depósitos internacionais sob as condições do Budapest Treaty em 11 de Janeiro de 1999 e recebeu os números de acesso FERM BP- 6614 e FERM BP - 6615. Enterobacter agglomerans AJ 13601 foi depositado no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of bioscience and Human Technology em 18 de agosto de 1999 e recebeu o número de acesso FERM P — 17516. Então, o depósito foi convertido no depósito internacional sob as condições do Budapest Treaty em 6 de julho de 2000 e recebeu o número de acesso FERM BP - 7207.

Enterobacter agglomerans ATCC 12287 pode ser distribuído a partir de ATCC (American Type Culture Collection, 10801, University Boulevard, Manassas, VA 21110 -2209, U.S. A.).

Exemplos de bactérias pertencentes ao gênero Klebsiella incluem as seguintes bactérias: Klebsiella planticola Klebsiella terrigena É mais preferida a Klebsiella planticola AJ 13399. Klebsiella planticola AJ 13399 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology (presentemente, a corporação administrativa independente, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu o número de acesso FERM P — 16646. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as condições do Budapest Treaty em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso FERM BP- 6616. A cepa Klebsiella Planticola AJ 13399 é uma cepa isolada a partir do solo em Sapporo-shi, Hokkaido.

Exemplos de microorganismos, pertencentes ao gênero Serratia usados para a presente invenção, incluem os seguintes: Serratia liquefacience Serratia entomophila Serratia ficaria Serratia fonticola Serratia grimesii Serratia proteamaculans Serratia odorifera Serratia plymuthica Serratia rubidaea São mais preferidas as seguintes cepas bacterianas: Serratia liquefacience ATCC 14460 Serratia liquefacience ATCC 14460 pode ser distribuída a partir de ATCC.

Exemplos de microorganismos pertencentes ao gênero Erwinia, usados para a presente invenção, incluem os seguintes: Erwinia herbicola (presentemente classificada como Pantoea agglomerans) Erwinia ananas Erwinia cacticida Erwinia chrysanthemi Erwinia mallotivora Erwinia persicinus Erwinia Psidii Erwinia quercina Erwinia rhapontici Erwinia rubrifaciens Erwinia salicis Erwinia uredovora É mais preferida Erwinia herbicola IAM 1595 {Pantoea agglomerans AJ 2666). A Erwinia Herbicola IAM 1595 pode ser distribuída a partir do Institute of Molecular and Cellular Biosciences, the University of Tokyo.

Erwinia herbicola não é mencionada no Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9a Ed., e o microorganismo, que foi classificado como Erwinia herbicola, é classificado como Pantoea agglomerans. Deste modo, microorganismos pertencentes ao gênero Erwinia e microorganismos pertencentes ao gênero Pantoea estão proximamente relacionados entre si.

Deste modo, microorganismos pertencentes ao gênero Pantoea pode ser similarmente usados como microorganismos pertencentes ao gênero Erwinia.

Como tais microorganismos pertencentes ao gênero Pantoea, podem ser mencionados Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa e Pantoea ananas.

Erwinia herbicola IAM 1595 foi designada como Pantoea agglomerans AJ 2666, depositada no National institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Bioscience and Human Technology (presentemente, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) como um depósito internacional sob as condições do Budapest Treaty em 25 de fevereiro de 1999 e recebeu o número de acesso FERM BP- 6660.

Exemplos dos microorganismos pertencentes ao gênero Escherichia usados para a presente invenção incluem Escherichia coli. É mais preferido Escherichia coli tendo resistência valina, e exemplos são as seguintes cepas.

Escherichia coli K-12 (ATCC 10798) Escherichia coli W (ATCC 9637) Escherichia coli K-12 (ATCC 10798) e Escherichia coli W (ATCC 9637) pode ser distribuída a partir ATCC. A bactéria Gram-negativa da presente invenção é uma bactéria Gram-negativa, que possui capacidade para produzir um L-aminoácido e a via Entner-Doudoroff precedentemente mencionada e que foi modificada, de tal modo que a atividade de EDD ou EDA, ou ambas as atividades, sejam aumentadas. A bactéria da presente invenção é preferivelmente uma bactéria Gram-negativa, que foi modificada de tal modo que as atividades de EDD e EDA são aumentadas.

A expressão “modificada de tal modo que a atividade de EDD ou EDA seja aumentada” significa que a atividade de EDD ou EDA por célula se tome mais alta do que aquela de uma bactéria do tipo selvagem. Por exemplo, aquelas, nas quais o número de moléculas EDD ou EDA é aumentada, aquelas, nas quais a atividade específica de EDD ou EDA por molécula de EDD ou EDA é aumentada e assim por diante, podem ser mencionadas. Além disso, a bactéria do tipo selvagem a ser comparada é uma bactéria, que não foi submetida à manipulação para o aumento da atividade de EDD ou EDA. O aumento da atividade de EDD e/ ou EDA em uma bactéria é alcançado pelo aumento do número de cópias de um gene, que codifica EDD e/ ou EDA. Por exemplo, o DNA recombinante pode ser preparado pela ligação de um fragmento de gene, que codifica EDD e/ ou EDA com um vetor, que funciona m uma bactéria alvo, preferivelmente um vetor do tipo de várias cópias, e pode ser introduzido na bactéria para transformá-la. Quando ambas as atividades de EDD e EDA são aumentadas, o fragmento do gene que codifica EDD e o fragmento do gene que codifica EDA podem ser separadamente incorporados em diferentes vetores, mas eles são preferivelmente incorporados no mesmo vetor. O DNA recombinante pode ser introduzido em uma bactéria tendo uma capacidade de produção de L- aminoácido, altemativamente o DNA recombinante pode ser introduzido em uma bactéria do tipo selvagem para a obtenção de uma cepa transformante, e então pode ser conferida à cepa transformante a capacidade de produção de L- aminoácido.

Como o gene que codifica EDD e o gene que codifica EDA, podem ser usados quaisquer dos genes derivados de bactérias Gram-negativas tendo a via Entner-Doudoroff. Especificamente, genes derivados da bactéria Escherichia podem ser mencionados. Foi relatado que o gene que codifica EDD (edd) e o gene que codifica EDA (eda) derivados de Escherichia coli formam um operon (J. Bacteriol., 174 (14): 1638-46, julho de 1992). A seguir, o gene que codifica EDD é referido como edd, e o gene que codifica EDA é referido como eda. Além disso, genes de bactérias do gênero Zymomonas foram também relatados e os genes edd e eda podem ser obtidos por PCR (Polymerase Chain Reaction, referência a White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989) usando iniciadores baseados nas seqüências daqueles genes ou hibridização usando uma amostra baseada nas seqüências de genes precedentemente mencionadas. Por exemplo, um fragmento operon contendo o gene edd e o gene eda de Escherichia coli pode ser obtido através de PCR usando os iniciadores edd-F (SEQ ID NO: 1) e eda-R (SEQ ID NO: 2) descritos posteriormente. O gene edd e o gene eda de outros microorganismos podem ser similarmente obtidos. A condição de hibridização é exemplificada por uma condição, sob a qual a lavagem é executada em uma concentração salina correspondente a 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, a 60°C.

Além disso, o gene edd e o gene eda, usados para a presente invenção, não estão limitados a genes do tipo selvagem e podem ser mutantes ou genes artificialmente modificados que codificam produtos genéticos que incluem substituição, deleção, inserção, adição ou os similares de um ou vários aminoácidos em um ou mais sítios, desde que as funções dos EDD e EDA codificados não sejam degradadas. Embora o número de “vários” aminoácidos aqui referido difira dependendo da posição ou do tipo de resíduos aminoácidos em uma estrutura tridimensional de uma proteína, mas ele pode ser especificamente de 2 a 60, preferivelmente de 2 a 40, mais preferivelmente de 2 a 20. Além disso, como o DNA que codifica uma proteína é substancialmente idêntico aos EDD e/ ou EDA precedentemente mencionados, pode haver o DNA hibridizável mencionado com seqüências de nucleotídeo de genes edd ou eda conhecidos (por exemplo, acessos ao GenBank L20897, X58364, M60615, M37982) ou uma amostra, que pode ser produzida a partir destas seqüências sob uma condição rigorosa e que codifica uma proteína tendo uma atividade similar àquela de EDD ou EDA. A “condição rigorosa” aqui referida é uma condição, sob a qual um assim denominado híbrido específico é formado e um híbrido não-específico não é formado. É difícil expressar claramente esta condição pelo uso de valores numéricos. Entretanto, por exemplo, a condição rigorosa inclui uma condição, sob a qual DNAs tendo alta homologia, por exemplo, DNAs tendo homologia de 50% ou mais, são hibridizados entre si, mas DNAs tendo homologia inferior àquela acima não são hidridizados entre si.

De modo alternativo, a condição rigorosa é exemplificada por uma condição, sob a qual os DNAs são hibridizados entre si em uma concentração salina, que corresponde a uma condição de lavagem ordinário de hibridização Southern, isto é, 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0, 1 % SDS, a 60°C. O DNA cromossômico pode ser preparado a partir de uma bactéria como um doador de DNA, por exemplo, o método de Saito e Miura (referência a Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, págs. 97- 98, Baifukan, 1992) ou os similares.

Se um DNA recombinante for preparado pela ligação do gene edd e/ ou eda amplificado por PCR com vetor DNA autonomamente replicável em uma célula Escherichia coli, ou os similares, e introduzido em Escherichia coli, operações subseqüentes se tomam mais fáceis. Exemplos de vetor autonomamente replicável na célula Escherichia coli incluem pMW219, pSTV28, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, p HSG398, RSF1010, pBR322, p ACYC184 e assim por diante.

Para introduzir o DNA recombinante preparado como acima descrito em uma bactéria Gram-negativa, os métodos de transformação, que foram até agora citados podem ser empregados. Por exemplo, pode ser mencionado o método de D. A Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), um método de tratamento de células receptoras com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade para DNA (Mandei, M. e Higa, A., J.

Mol. Biol., 53, 159 (1970)), e o método de eletroporação (Miller J. Η., “A

Short Course in Bacterial Genetics; Handbook”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U. S.A., pág. 279, 1992) e assim por diante. O número de cópias dos genes edd e/ ou eda pode ser também aumentado, permitindo com que existam copias múltiplas destes genes no DNA cromossômico de uma bactéria. Para a introdução de cópias múltiplas do gene edd e/ ou do gene eda no DNA cromossômico de uma bactéria, a recombinação homóloga é executada pelo uso de uma seqüência, cujas cópias múltiplas existem no DNA cromossômico como um alvo. Como seqüências, cujas cópias múltiplas existem no DNA cromossômico, o DNA repetitivo ou repetição invertida, que existe em uma extremidade do elemento transponível pode ser usado. Além disso, como exposto na Publicação exposta a exame da Patente Japonesa N° 2-109985, é também possível incorporar o gene edd d ou o gene eda em um transposon, e deixar com que ele seja transferido para introduzir múltiplas cópias dos genes no DNA cromossômico. O aumento das atividades de EDD e/ ou EDA pode ser também alcançado, além de ser baseado na amplificação de gene precedentemente mencionada, pela substituição da seqüência reguladora de expressão, tal como um promotor do gene edd d ou do gene eda no DNA cromossômico ou plasmídeo com um mais forte. Por exemplo, um promotor lac, um promotor trp, um promotor trc e assim por diante, como promotores fortes. Além disso, como exposto na Publicação de Patente Internacional W00/ 18935, através da introdução de uma substituição de vários nucleotídeos na região do promotor do gene edd d ou do gene eda, o promotor pode ser modificado, de modo a se tomar um promotor mais forte. A substituição ou modificação destes promotores aumenta a expressão do gene edd d ou do gene eda, e deste modo as atividades de EDD d ou EDA são aumentadas. A modificação das seqüências reguladores de expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópias do gene edd d ou do gene eda. O aumento das atividades de EDD e EDA pode ser confirmado pela misturação de uma suspensão de célula rompida com gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase e ácido 6-fosfoglucônico e medição do gliceraldeído-3- fosfato produzido a partir do ácido 6-fosfoglucônico como u substrato. Nesta reação, a atividade EDD pode ser medida pela quantificação do ácido 6- fosfoglucônico remanescentes após a reação pelo uso de 6-fosfogluconato desidrogenase, ou quantificação do ácido pirúvico produzido na presença de 2-ceto-3-deóxi-6-fosfogluconato aldolase usando lactato desidrogenase. O ácido 6-fosfoglucônico e o ácido pirúvico podem ser quantificados como aumento de NADH na reação de desidrogenase. Além disso, a atividade de EDA pode ser também medida pela detecção do ácido pirúvico produzido a partir de 2-ceto-3-deóxi-6-fosfogluconato como um substrato através do uso de lactato desidrogenase.

Na bactéria Gram-negativa da presente invenção, a atividade da enzima, que catalisa uma biossíntese de L-aminoácido, que não EDD ou EDA pode ser aumentada, desde que o efeito das atividades de aumento de EDD e EDA não seja degradado.

Por exemplo, quando um L-aminoácido alvo é ácido L- glutâmico, exemplos de uma tal enzima incluem glutamato desidrogenase (também referido como “GDH” a seguir), glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase (também referido como “CS” a seguir), fosfoenolpiruvato carboxilase (também referido como a “PEPC” a seguir), fosfoenolpiruvato sintase, piruvato desidrogenase, piruvato quinase, piruvato carboxilase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato quinase, gliuceraldeído-3-fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, ffutose bisfosfato aldolase, fosfofrutoquinase, glicose fosfato isomerase e assim por diante. Quando uma bactéria usada para a produção de ácido L-glutâmico é uma bactéria Enterobacter, qualquer um dos três tipos de CS, PEPC e GDH são preferidos dentre as enzimas antes mencioandas. Além disso, é preferido que as atividades dos três tipos de enzimas CS, PEPC, e GDH, sejam todos aumentados. Em particular a CS de Brevibacíerium lactofermentum é preferida porque ela não é submetida à inibição pelo ácido alfa-cetoglutárico, ácido L-glutâmico e NADH.

Como organismos que podem suprir fontes do gene que codifica CS (gltA), o gene que codifica PEPC (ppc) e o gene que codifica GDH (gdhA), podem ser usados quaisquer organismos, destes que eles possuam atividades de CS, PEPC e GDH. Em particular, bactérias, que são procarióticas, por exemplo, bactérias que pertencem ao gênero Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacíerium ou Bacillus são preferidas. Exemplos específicos das mesmas incluem Escherichia coli, Brevibacíerium lacíofermeníum e assim por diante.

O gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA podem ser obtidos a partir do DNA cromossômico dos microorganismos antes mencionados. O gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA podem ser obtidos pelo uso de um mutante deficiente em atividade de CS, PEPC ou GDH e isolamento de um fragmento de DNA, que complementa a sua auxotropia a partir do DNA cromossômico dos microorganismos precedentemente mencionados. Além disso, como as seqüências de nucleotídeos destes genes de bactérias Escherichia e destes genes de bactéria Corynebacíerium já foram elucidadas (Biochemistry, 22: 5243 - 5249, 1983); J. Biochem., 95: 909-916, 1984; Gene, 27: 193-199, 1984; Microbiology, 140; 1817-1828, 1994; Mol.

Gen. Genet., 218, 330-339, 1989; Molecular Microbiology, 6: 317-326, 1992), eles podem ser obtidos pela sintetização de iniciadores, com base nas respectivas seqüências de nucleotídeo e execução de PCR usando DNA cromossômico como um gabarito. A introdução destes genes em uma bactéria Gram-negativa, tal como a bactéria Enterobacíer, é descrita na EP 0 670 370 A 2, patente U.S. 6.1 97. 559, EP 0 999 282 A2 e EP 1 078 989 em detalhe.

As atividades de CS, PEPC e GDH, assim como outras atividades enzimáticas, podem ser aumentadas, do mesmo modo que pode ser realizado o aumento das atividades de EDD e de EDA acima mencionadas.

Além disso, na bactéria da presente invenção, uma atividade enzimática para catalisar uma reação para produzir outro composto através de ramificação a partir de uma via biossintética de um L-aminoácido alvo pode ser reduzida ou eliminada, desde que o efeito de aumento das atividades de EDD e/ ou EDA não seja degradado. Por exemplo, quando o L-aminoácido alvo é o ácido L-glutâmico, exemplos de uma tal enzima incluem alfa- cetoglutarato desidrogenase (também referido como “aKGDH” a seguir), isocitrato liase, fosfato acetiltransferase, acetato quinase, ácido acetoidróxi sintase, acetolactato sintase, formato acetiltransferase, lactato desidrogenase, L-glutamato descarboxilase, 1- pirrolina desidrogenase e assim por diante.

Para reduzir ou eliminar as atividades da enzimas antes mencionadas, um método de tratamento de um microorganismo com irradiação de raio ultravioleta ou um agente de mutagênese usado em um tratamento de mutação usual, tal como N-metil-N’- nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso e seleção de uma cepa mutante, na qual uma atividade enzimática alvo é reduzida, um método de ruptura de gene utilizando substituição de gene baseado em recombinação análoga, ou o similar, pode ser empregado. A ruptura do gene do gene, que codifica aKGDH, é descrita na Patente U.S. 5. 977. 331.

Quando genes, outros que o gene edd e o gene eda são introduzidos quando da construção da bactéria da presente invenção, é preferido usar menos tipos de vetores. Ou seja, um vetor usualmente possui um gene marcador, e um agente que corresponde ao gene marcador ou similar precisa ser adicionado a um meio. Portanto, se muitos tipos de vetores forem usados, um grande número de a gentes precisa ser adicionado ao meio. Isto pode resultar em um crescimento deficiente de bactérias. Portanto, é usualmente preferível que sejam usados menos tipos de vetores. É preferível o uso de dois ou de menos tipos, mais preferivelmente de um tipo de vetores ou vetor.

Além disso, quando dois ou mais tipos de vetores, cada qual tendo um número de cópia diferente, é usado, é preferível determinar a distribuição dos genes entre um vetor de um alto número de cópia e um vetor de baixo número de cópia dependendo dos tipos de genes a serem introduzidos.

Para as operações de isolamento de um gene, a introdução de um gene no interior de uma bactéria hospedeira, a ruptura do gene e assim por diante, métodos usuais bem conhecidos daqueles versados na arte podem ser empregados como os métodos para a preparação de DNA cromossômico, construção de coleção de DNA cromossômico, hibridização, PCR, preparação de DNA de plasmídeo, digestão e ligação de DNA, transformação, configuração de oligonucleotídeos usados como iniciadores e assim por diante. Estes métodos são descritos em SambrooK J., Fristsch E. F., e Maniatis T., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) e assim por diante. < 2> Produção de L-aminoácido usando a bactéria da presente invenção.

Um L-aminoácido pode ser produzido pela cultura da bactéria da presente invenção obtida como acima descrito em um meio para produzir e acumular o L-aminoácido no meio e coletar o L-aminoácido a partir do meio.

Para produzir um L-aminoácido através do uso da bactéria da presente invenção, podem ser usados meios ordinários contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e nutrientes em quantidade traço orgânica, tais como aminoácidos e vitaminas, conforme requerido em um modo convencional. Pode ser usado ou um meio sintético ou um meio natural. Quaisquer tipos de fonte de carbono e fonte de nitrogênio podem ser usados no meio, desde que eles possam ser tuilziados pelas cepas bacterianas a serem cultivadas.

Como a fonte de carbono, sacarídeos, tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisado de amido e melaços podem ser usados. Ácidos orgânicos, tais como ácido acético e ácido cítrico, e álcoois, tais como etanol, podem ser também usados individualmente ou em combinação com outras fontes de carbono. Dentre estes, glicose e sacarose são preferidos.

Como a fonte de nitrogênio pode ser usada amônia, sais de amônio, tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, nitratos e assim por diante.

Como os nutrientes em quantidade traço orgânica, podem ser usados aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos e ácidos nucléicos, assim como peptona, ácido casamino, extrato de levedura e produto de decomposição de proteína de soja contendo os mesmos e assim por diante. Quando um mutante auxotrófico, que requeira um aminoácido ou o similar para o crescimento é usado, é preferível suplementá-lo com um tal nutriente requerido.

Como sais inorgânicos, podem ser usados fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e assim por diante.

No que se refere à cultura, embora ela dependa do tipo de bactéria a ser usada, a cultura de aeração é usualmente executada, enquanto a temperatura de fermentação é controlada em uma temperatura de 20 a 45°C e em um pH de 5 a 9. Quando o pH declina durante a cultura, é adicionado carbonato de cálcio, ou a cultura é neutralizada com álcali, tal como gás de amônia. Através de cultura em um tal modo por cerca de 10 a 120 horas, uma quantidade acentuada de L-glutamina é acumulada em um caldo de cultura.

Como um método para coletar L-aminoácidos a partir do caldo de cultura após o completamento da cultura, métodos de coleta conhecidos, por exemplo, métodos que utilizam resinas de troca iônica, precipitação e assim por diante podem ser usados.

Exemplos A seguir, a presente invenção será explicada mais especificamente com referência aos exemplos que se seguem. <1> Clonagem de genes de enzimas envolvidos na via Entner- Doudoroff O gene edd e o gene da, que codificam as enzimas EDD e EDA, respectivamente, envolvidas na via de Entner-Doudoriff, foram clonadas a partir de Escherichia coli, Zymomonas mobilis e assim por diante.

Eníerobacter agglomerans pertence taxonomicamnete ao grupo de enterobactérias e considera-se que está proximamente relacionado a Escherichia coli. Além disso, é conhecido que os genes Escherichia coli podem ser expressos em Eníerobacter agglomerans.

Portanto, foi decidido clonar o gene edd e o gene eda a partir de Escherichia coli.

Estes dois genes formam um operon em Escherichia coli (J.

Bacteriol., 174 (14): 4638-46, Julho 1992). Portanto, edd-F (SEQ ID NO: 1) e eda-R (SEQ ID NO:2) foram designados como iniciadores, que poderíam simultaneamente amplificar ambos os genes para amplificar um fragmento de DNA, que inclua ambos os genes por PCR. PCR foi executado através do uso de Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo) e consistiu de uma reação a 94°C durante 30 segundos, a 60°C durante 30 segundos e a 72°C durante 3 minutos, repetidas por 30 ciclos.

Subseqüentemente, o fragmento amplificado obtido foi completamente digerido com as enzimas de restrição Sall e BamHI, ligadas com o plasmídeo p MW219 completamente digerido com as enzimas de restrição Sall e BamHI e usadas para transformar Escherichia coli JM109 (adquirida de Takara Shuzo). Cinco cepas de clones contendo um fragmento tendo um tamanho desejado foram selecionadas a partir dos transformantes obtidos, e os plasmídeos foram extraídos a partir destas cepas.

Cada plasmídeo foi introduzido na cepa Enterobacter agglomerans AJ13601 pelo método de eletroporação (Miller J. H., “ A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U. S. A, pág. 279, 1992), e as atividades de EDD e EDA foram medidas de modo a selecionar um clone, no qual o gene edd e o gene eda estivessem expressados.

A cepa AJ13601 é uma cepa bacteriana obtida como se segue. A cepa Enterobacter agglomerans AJ13355 foi isolada a partir do solo como uma cepa que apresenta resistência ao ácido L- glutâmico sob um ambiente ácido e taxa de crescimento superior. Subseqüentemente, uma cepa mutante que produz baixa flegma foi derivada a partir da cepa AJ13355, e o gene aKGDH foi rompido para a obtenção da cepa AJ13356. A cepa AJ13356 era deficiente em atividade de aKGDH com um resultado da ruptura do gene da subunidade aKGDH-El (sucA). Subseqüentemente, a cepa AJ 13356 foi introduzida no plasmídeo RSFCPG tendo o gene citrato sintase (gltA), o gene fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) e o gene glutamato desidrogenase (gdhA) de Escherichia coli e o plasmídeo p STVCB tendo o gene gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum para a obtenção da cepa SC17sucA/ RSFCPG + p STVCB. Para esta cepa, a cepa AJ13601 foi selecionada como uma cepa bacteriana, demonstrando atividade aperfeiçoada para o ácido L- glutâmico sob um ambiente de baixo pH e a melhor taxa de crescimento (EP 1 078 989 A2).

Cepas selecionadas aleatoriamente a partir dos transformantes introduzidos com um plasmídeo incluindo os fragmentos de gene edd e eda, como a cima descrito, foram cultivadas por 15 horas em meio líquido LBGM9 (um meio contendo lOg/L de triptona, 5g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl e 5g/L de glicose, foi-lhes adicionado 1/10 volume de 10 x Mm (128g/L de Na2HP04. 7H20, 3- g/L de KH2P04, 5g/L de NaCl, 10 g/L de NH4 Cl)) contendo tetraciclina, cloroanfenicol e canamicina, cada qual contendo uma quantidade de 12, 5 mg/L, 25 mg/L ou 25 mg/L. As células foram coletadas a partir destes caldos de cultura por centrifugação, lavadas duas vezes com tampão Tris-HCL 50 mM (pH 7,6) e MgCl2 mM e e ntão suspensos no mesmo tampão. As células foram rompidas por tratamento com ultra-som e centrifugadas a 15000 rpm durante 30 minutos, e o sobrenadante foi usado como uma solução de enzima bruta.

As atividades de EDD e EDA foram simultaneamente medidas pela medição dos produtos da reação obtidos por duas das enzimas usando uma técnica fotoespectométrica. Ou seja, Tris-HCL 50 mM (PH 8,0), MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, APAD 1 mM (acetilpiridina adenina dinucleotídeo), K2HP04, 20 unidades de gliceraldeídos-3- fosfato desidrogenase, ácido 6- fosfoglucônico e a solução de enzima bruta foram misturados e um aumento de absorbância a 365 nm foram medidos para medir o gliceraldeído-3- fosfato produzido a partir de ácido 6-fosfoglucônico como um substrato. A mesma medição foi executada para uma cepa introduzida apenas com um vetor. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 Foi confirmado que todas as cepas tiveram as suas atividades aumentadas. Na cepa com atividade mais altas, as atividades foram aumentadas cerca de 7,2 vezes. O plasmídeo desta cepa foi designado como pMW-EDDA. <2> Produção de ácido L-glutâmico usando a cepa com via Entner-Doudoroff aumentada Então, a influência do aumento da via Entner-Doudoroff sobre a produção de ácido L-glutâmico foi examinada. A cepa Enterobacter agglomerans AJ 13601 usada na seção acima continha dois tipos de plasmídeos e as cepas, nas quais haviam sido introduzidos o gene edd e o gene eda, continham três tipos de plasmídeos.

Portanto, três tipos de agentes precisam ser adicionados à cultura, e conseqüentemente o crescimento foi muito fraco, isto é, quase não foi observado crescimento no sistema de avaliação da cultura que produz ácido L-glutâmico. Portanto, apenas dois tipos de plasmídeo foram usados pela introdução de citrato sintase (também referido como “CS”, a seguir), gene de Brevibacterium lactofermentum, o gene edd e o gene eda em um plasmídeo.

Do vetor pSTV28 usado para a construção do plasmídeo pSTVCB contendo o gene CS de Brevibacterium lactofermentum e o vetor pMW219 usado para a clonagem do gene edd e do gene eda, o primeiro apresenta um número de cópia. Foi considerado que, embora o gene CS de Brevibacterium lactofermentum seja aumentado pelo vetor pSTV28 na cepa AJ13601, foi necessário aumentar a quantidade de expressão para a introdução deste gene pelo uso de pMW219. Portanto, um gene cuja região do promotor no gene CS foi substituída por aquela do gene CS de Escherichia coli foi construída.

Especificamente, a região do promotor no gene CS foi amplificada pelo uso dos iniciadores GLTES1 (SEQ ID NO: 3) e GLTEBO (SEQ ID NO: 4) e o cromossomo de Escherichia coli W3110 como um gabarito. Além disso, um fragmento contendo a região ORF do gene CS foi amplificado pelo uso dos iniciadores GLTBBO (SEQ ID NO: 5) e GLTBA1 (SEQ ID NO: 6) e o cromossomo da cepa Brevibacterium lactofermentum 2256 como um gabarito. O cruzamento por PCR foi executado pelo uso de ambos os fragmentos como gabaritos e iniciadores GLTES2 (SEQ ID NO: 7) e GLTBA2 (SEQ ID NO: 8) para a obtenção de um fragmento alvo. Este fragmento foi digerido com as enzimas de restrição Smal e Hindlll e introduzido no mesmo sítio de pSTV28 para a obtenção de pSTV-C B (*). Este palsmídeo foi digerido com Kptil e Hindlll, e um fragmento de gene de fusão contendo o promotor do gene CS de Escherichia coli e a região de codificação do gene CS de Brevibacterium lactofermentum foi coletada efetuada terminação obtusa com T4 DNA polimerase. Este fragmento do gene de fusão foi introduzido no sítio Smal de pMW219 para a obtenção de pMW-CB (*).

Além disso, p pMW-EDDA foi tratado com BamElI e ligado com o fragmento do gene de fusão acima e foi efetuada a terminação obtida do produto de ligação com T4 DNA polimerase para a obtenção de pMW-CB (*). ED.

Subseqüentemente, AJ13601 foi agitado durante a noite em meio líquido LBGM9 a 31, 5°C, apropriadamente diluído, de tal modo que 100 a 200 colônias pudessem ser obtidas por placa e aplicado sobre uma placa LBGM9 contendo 12, 5 mg/ L de tetraciclina. As colônias que emergiram foram replicadas sobre uma placa LBGM9 contendo 12, 5 mg/L de tetraciclina e 25 mg/L de cloroanfenicol, e uma cepa, que se tomou sensível a cloroanfenicol, foi coletada e designada como G106S. A cepa G106S continha apenas RSFCPG e era deficiente em pSTVCB. As cepas obtidas pela introdução de pMW-CB (*) ou pMW-CB (*). ED no interior desta cepa foram designadas como G106S pMW.CB (*). ED, respectivamente.

Para avaliar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico destas cepas, foi executada para estas a avaliação da cultura usando um fermentador de jarro. O meio usado foi 300 ml de um meio contendo 50g/ L de sacarose, 0, 4 g/L de MgS04, 0,1 ml/L de GD-113 (agente de supressão de espuma ), 4 g/L de (NH4)2 S04, 2 g/L de KH2P04, 4 g/L de extrato de levedura, 10 mg/L de FeS04. 7H20, 10 mg/L de MnS04. 4 - 5H20, 0,4 g/L de L-lisina, 0,4 g/L de DL-metionina, 0,4 g/L de ácido diaminopimélico, 12, 5 mg/L de tetraciclina e 25 mg/L de cloroanfenicol. A cultura foi executada com aeração de 1/1 WM, agitação a 1300 rpm e pH de 6,0 e controlada com amônia até que a sacarose fosse consumida. As alterações ao longo do tempo na absorbancia a 660 nm e a produção de quantidades de ácido L-glutâmico nos meios são apresentadas na figura 1. Além disso, a produção final de quantidades de ácido L-glutâmico são apresentadas na Tabela 2.

Tabela 2 _____________________ Foi revelado que a capacidade de produção do ácido L- glutâmico podería ser aperfeiçoada pelo aumento da via Entner-Doudoroff, embora a cultura fosse retardada. <3> Investigação da produção de acetoína e 2,3-butanodiol pela cepa com via Entner-Doudoroff aumentada As cepas G106S pMW.CB (*) e G106S pMW-CB (*). ED foram cultivadas do mesmo modo que na avaliação quanto à capacidade de produção de ácido L-glutâmico em <2>, e as quantidades de acetoína e 2,3- butanodiol no meio e nas células foram medidas em um período de tempo. A medição foi efetuada por cromatografia gasosa (Shimadzu Corporation, CG - 1700 A) sob as seguintes condições.

Coluna usada: VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25X32 (0, 32 mm x 25 M).

Temperatura: sala de evaporação: 250°C, coluna; 240°C.

FID: 250°C

Pressão de entrada da coluna: 180 kPa Taxa de fluxo de gás veículo: 1,6062 ml/ min.

Os resultados são apresentados na Fig. 2 A (quantidade de acetoína no meio), Fig. 2B (quantidade de 2,3-butanodiol no meio) e Fig. 2C (quantidade total de acetoína e 2,3-butanodiol produzidos por células unitárias). Foi revelado que a produção de acetoína e 2,3-butanodiol foi aumentada pelo aumento da via Entner-Doudoroff.

Claims (3)

1. Método para a produção de um ácido L-glutâmico, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microorganismo tendo uma capacidade para produzir um ácido L-glutâmico em um meio para produzir e acumular o ácido L-glutâmico no meio e coletar o ácido L- glutâmico do meio, em que o microorganismo é uma bactéria Gram-negativa tendo a via Entner-Doudoroff e que foi modificada, de tal modo que a atividade de 6-fosfogluconato desidratase ou 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato aldolase, ou atividades de ambas sejam aumentadas pelo aumento do número de cópia de um gene que codifica 6-fosfogluconato desidratase ou 2-ceto-3-deóxi-6- fosfogluconato aldolase ou pela modificação de uma sequência promotora do gene, de tal modo que a expressão do gene seja aumentada em uma célula da bactéria e em que a bactéria Gram-negativa é uma enterobactéria.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria pertence ao gênero Eníerobacter.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria pertence ao gênero Pantoea.