BG67180B1 - Method and kit for detection of oncofusion protein - Google Patents
Method and kit for detection of oncofusion protein Download PDFInfo
- Publication number
- BG67180B1 BG67180B1 BG111862A BG11186214A BG67180B1 BG 67180 B1 BG67180 B1 BG 67180B1 BG 111862 A BG111862 A BG 111862A BG 11186214 A BG11186214 A BG 11186214A BG 67180 B1 BG67180 B1 BG 67180B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- tmprss2
- erg
- protein
- fusion
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 137
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 31
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 73
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 101001010792 Homo sapiens Transcriptional regulator ERG Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 101001077417 Gallus gallus Potassium voltage-gated channel subfamily H member 6 Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 58
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 15
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 9
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 101150029838 ERG gene Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 8
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 claims description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 7
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 44
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 abstract description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 6
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 78
- 102100029983 Transcriptional regulator ERG Human genes 0.000 description 25
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 108010024682 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Proteins 0.000 description 9
- 102000015775 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Human genes 0.000 description 9
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 101000876829 Homo sapiens Protein C-ets-1 Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 102100035251 Protein C-ets-1 Human genes 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 4-pentoxyphenol Chemical compound CCCCCOC1=CC=C(O)C=C1 JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 5
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 4
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710081844 Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 description 2
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108091031479 miR-204 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091032382 miR-204-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091085803 miR-204-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091089766 miR-204-3 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091073500 miR-204-4 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091053626 miR-204-5 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 101710199744 Anionic trypsin-2 Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000040848 ETS family Human genes 0.000 description 1
- 108091071901 ETS family Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 101710151381 Serine protease 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034392 Trypsin-2 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000009167 androgen deprivation therapy Methods 0.000 description 1
- 102000001307 androgen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000370 laser capture micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 201000005825 prostate adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000007655 standard test method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(54) МЕТОД И КИТ ЗА ОТКРИВАНЕ НА ОНКОФУЗИОНЕН ПРОТЕИН(54) METHOD AND KIT FOR DETECTION OF ONCOFUSION PROTEIN
Област на техникатаField of technology
Изобретението се отнася до метод и кит за откриване на онкофузионен протеин, по-специално на функционално активен онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин при карцином на простатата, приложими в изследователската, диагностична и терапевтична практика.The invention relates to a method and kit for detecting an oncofusion protein, in particular a functionally active oncofusion TMPRSS2-ERG protein in prostate cancer, useful in research, diagnostic and therapeutic practice.
Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION
Известни са редица изследвания и анализи на генетичен материал на онкоген за идентифициране на променени гени, резултат от променливо генно сливане, които водят до променена активност на онкогени като част от по-нататъшното развитие на молекулярно-биологични решения и повишаване на информираността относно генетичния фон на дегенерация на клетките.A number of studies and analyzes of oncogene genetic material are known to identify altered genes resulting from variable gene fusion that lead to altered oncogene activity as part of the further development of molecular biological solutions and awareness of the genetic background of cell degeneration.
Откриването на наличие или отсъствие на онкофузионен протеин корелира и с най-често развиващият се неопластичен процес при мъжете в световен мащаб - карциномът на простатата, който е и втората по честота причина за смъртност сред туморните заболявания след белодробния, го превръща в сериозен социален и здравно-икономически проблем - едно от най- големите предизвикателства в момента пред медицината.The detection of the presence or absence of oncofusion protein correlates with the most commonly developing neoplastic process in men worldwide - prostate cancer, which is the second most common cause of death among tumors after lung, makes it a serious social and health -economic problem - one of the biggest challenges currently facing medicine.
Известни са редица методи за своевременно откриване на онкофузионен протеин, като:A number of methods are known for the timely detection of oncofusion protein, such as:
- Биопсично изследване за получаване на хистологичен материал за морфологична и имунохистохимична оценка на хистологичния и клиничния стадий на простатния карцином, които имат специфични характеристики за простатен карцином след палпаторно изследване за нодули в простатната жлеза.- Biopsy to obtain histological material for morphological and immunohistochemical evaluation of the histological and clinical stage of prostate cancer, which have specific characteristics for prostate cancer after palpation for nodules in the prostate.
- Скрининг на класическия маркер простатно-специфичен антиген (PSA), чрез ензимно-свързан имуно-сорбентен анализ (ELISA) и други методи в биологични течности.- Screening of the classical marker prostate-specific antigen (PSA), by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and other methods in biological fluids.
Установено е, че за развитието на простатния карцином особено важни са транскрипционните фактори от семейството на Е26 трансформационно-специфични фактори (Е26 transformation-specific, ETS), тъй като секвенирането на пълния геном и транскриптом на пациенти показват наличието на новообразувани онкопротеини вследствие на драматично реаранжиране на генома [1]. TMPRSS2-ERG (TMPRSS2, Transmembrane protease, serine 2 - трансмембранна протеаза, серин 2; ERG, ETS- related gene - E26 трансформационно-специфичен фактор свързан ген) е уникална фузия за простатния аденокарцином между част от промотора на гена, кодиращ андроген-чувствителната простатспецифична серинова протеаза 2 (TMPRSS2) и транскрипционния фактор ERG от семейството на ETS [2], като съчетанието с генна амплификация води до влошена прогноза [3]. TMPRSS2-ERG фузията е с доказана специфичност и уникалност. Нейната разпространеност (над 40-50%) при пациентите с простатен карцином, има директен ефект при епигенетичната дисрегулация, съпътстваща простатната канцерогенеза, свързана с дълбокото разстройство на молекулния сигналинг на андрогенния рецептор, промотира епитело-мезенхимната трансформация на карциномните клетки, водещо до метастазиране [4].Transcription factors from the E26 transformation-specific family (ETS) family have been found to be particularly important for the development of prostate cancer, as sequencing of the complete genome and transcript of patients indicates the presence of newly formed oncoproteins due to dramatic rearrangement. of the genome [1]. TMPRSS2-ERG (TMPRSS2, Transmembrane protease, serine 2 - transmembrane protease, serine 2; ERG, ETS-related gene - E26 transformation-specific factor-related gene) is a unique fusion for prostate adenocarcinoma between part of the promoter of the gene encoding the androgen-sensitive prostate-specific serine protease 2 (TMPRSS2) and the transcription factor ERG from the ETS family [2], with the combination of gene amplification leading to a worse prognosis [3]. TMPRSS2-ERG fusion has proven specificity and uniqueness. Its prevalence (over 40-50%) in patients with prostate cancer has a direct effect on epigenetic dysregulation accompanying prostate carcinogenesis, associated with profound disorder of androgen receptor molecular signaling, promotes epithelial-mesenchymal transformation of cancer cells, water cells 4].
Ранното откриване на посочената генна фузия с висок метастатичен потенциал би позволила ранен старт на химиотерапия с по-висока степен на токсичност [5].Early detection of this gene fusion with high metastatic potential would allow early initiation of chemotherapy with a higher degree of toxicity [5].
Известен е метод за цитогенетично определяне на нови фузионни явления - флуоресцентна ин ситу хибридизация (FISH, Fluorescent in situ hibridisation) [6], при който специфични флуоресцентноA method for cytogenetic determination of new fusion phenomena is known - fluorescent in situ hybridization (FISH) [6], in which specific fluorescent
BG 67180 Bl маркирани сонди, съставени от комплементарни части от двата първични гена съставящи фузионния ген, се смесват със специално обработен хистологичен срез [8].BG 67180 B1 labeled probes composed of complementary parts of the two primary genes constituting the fusion gene are mixed with a specially treated histological section [8].
Основните недостатъци са: необходимост от биопсичен материал (болезнен метод, водещ до дискомфорт на пациента, изпълняван само от високо-квалифициран уролог) и получаване на парафинов срез с простатна тъкан (от квалифициран патолого-анатомичен персонал), последван от изпълняване на сравнително усложнена хистологична техника; нуждата от участие на специализирани лаборатории за цитогенетика е ограничено и няма възможност за скрининг приложение, поради което не може да се използва за бърз рутинен скрининг; изследването на биологични течности не е възможно; сондите би трябвало да детектират кратък участък от дивия тип на двата съставни за фузията гени, в резултат на което не биха могли да дискриминират in frame мутации (мутации без изместване рамката за четене), от frame shift мутации (мутации с изместване рамката за четене), като последните биха били позитивни чрез FISH метод, но не биха довели до функционална ERG или друга подобна молекула; цените на китовете за цитогенетика, валидирани за клинична употреба имат сравнително високи стойности.The main disadvantages are: the need for biopsy material (painful method, leading to patient discomfort, performed only by a highly qualified urologist) and obtaining a paraffin section with prostate tissue (by qualified pathological and anatomical staff), followed by a relatively complicated histological technique; the need for participation of specialized cytogenetics laboratories is limited and there is no possibility for screening application, therefore it cannot be used for fast routine screening; the study of biological fluids is not possible; the probes should detect a short wild-type section of the two fusion genes, as a result of which they could not discriminate in frame mutations (mutations without frame reading), from frame shift mutations (mutations with frame reading). , the latter being positive by the FISH method but not leading to a functional ERG or other similar molecule; the prices of cytogenetics kits validated for clinical use have relatively high values.
Известни са подходи, основаващи се на метода на полимеразно-верижната реакция (PCR) [7], използва се модификация на обратно-транскриптазна количествена полимеразно верижна реакция (RTqPCR), при която иРНК резултат от транскрибирането на геномно реаранжирана онкофузия се амплифицира чрез специфични праймери, които подобно на FISH детектират комплиментарни участъци от иРНК [9,10,11 ]. При този подход остават нерешени няколко основни проблема: в научната литература постоянно се описва възникването на нови комбинации от различни по дължина фрагменти на TMPRSS2 и ERG, при което стандартните праймери ще произведат различен по дължина ампликон (продукт на амплификация); методологично, ампликона който би се получил не би могъл да се интерпретира дали е in-frame без секвениране; не е възможно клиничното приложение дори на таргетно секвениране на тази мутация, поради високата цена за масово приложение. Дори при секвениране, пак би се наложило и последващо молекулно моделиране за определяне на функционалното състояние на фузионния продукт.Approaches based on the polymerase chain reaction (PCR) method are known [7], using a modification of the reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RTqPCR) in which the mRNA resulting from the transcription of genomically rearranged oncofusion is amplified by specific primers , which, like FISH, detect complementary regions of mRNA [9,10,11]. With this approach, several main problems remain unresolved: the scientific literature constantly describes the emergence of new combinations of different length fragments of TMPRSS2 and ERG, where the standard primers will produce different length amplicon (amplification product); methodologically, the amplicon that would be obtained could not be interpreted as being in-frame without sequencing; clinical application of even targeted sequencing of this mutation is not possible due to the high cost of mass administration. Even in sequencing, subsequent molecular modeling would still be required to determine the functional state of the fusion product.
Известна е модификация на метода RT-qPCR и т. нар. Scorpion праймери за по-високо ниво на детекция на 5' края на информационната РНК, кодираща TMPRSS2 [11]. Недостатъци на описания подход са: изследването не търси изобщо ERG или друг фузионен партньор; невъзможност да се разграничи нормален от фузионен TMPRSS2 фрагмент.A modification of the RT-qPCR method and the so-called Scorpion primers for a higher level of detection of the 5 'end of the messenger RNA encoding TMPRSS2 is known [11]. Disadvantages of the described approach are: the study does not look at all for ERG or another fusion partner; inability to distinguish normal from fusion TMPRSS2 fragment.
Известен е метод за откриване на панел от гени на ниво иРНК, който детектира предефинирани иРНК на туморни маркери, който се очаква да не съдържат високи степени на мутации сами по себе си [12]. Основен недостатък е възможността за възникване на точкови мутации в посочените гени, което не би било отчетено от метода, но би могло да доведе до функционални промени в протеиновите им продукти и до промяна в клиничното им значение.A method for detecting a panel of genes at the mRNA level is known, which detects predefined mRNAs of tumor markers that are not expected to contain high levels of mutations per se [12]. The main disadvantage is the possibility of point mutations in these genes, which would not be taken into account by the method, but could lead to functional changes in their protein products and to a change in their clinical significance.
Известно е решение, което търси фузионни феномени като TMPRSS2 и ERG, но само на ниво информационна РНК, използвайки PCR или други методи за детекция след амплификация на кДНК (т .нар. копи ДНК - получено при комплиментарна хибридизация копие на ген/ДНК последователност) или РНК, позволяващи по-висока степен на точност [9]. Тези подходи наследяват същия недостатък настъпването на нови мутации не би могло да се детектира с фиксирано множество праймери.There is a known solution that seeks fusion phenomena such as TMPRSS2 and ERG, but only at the level of messenger RNA, using PCR or other methods for detection after amplification of cDNA (so-called DNA copies - obtained by complementary hybridization copy of gene / DNA sequence) or RNA allowing a higher degree of accuracy [9]. These approaches inherit the same drawback: the occurrence of new mutations could not be detected with a fixed number of primers.
BG 67180 BlBG 67180 Bl
Друго решение отчита нивата на иРНК, кодираща фузионен феномен TMPRSS2/ERG в комбинация с ДНК метилационния статус на фузионния ген, както и на панел от други немутиращи гени. Този подход би могъл да се използва като индиректен маркер за протеиновата експресия на фузионния продукт, но в този подход има два недостатъка: метилационния статус е един от механизмите за регулация на транскрипцията на даден ген и протеиновите нива на получения продукт не са линейно зависими; подхода не отчита дали протеиновия продукт е функционален протеин, който би имал биологичен ефект и следователно клинично значение [10].Another solution takes into account the levels of mRNA encoding the TMPRSS2 / ERG fusion phenomenon in combination with the DNA methylation status of the fusion gene as well as a panel of other non-mutating genes. This approach could be used as an indirect marker for the protein expression of the fusion product, but this approach has two drawbacks: methylation status is one of the mechanisms for regulating the transcription of a gene and the protein levels of the resulting product are not linearly dependent; the approach does not take into account whether the protein product is a functional protein that would have a biological effect and therefore clinical significance [10].
Откриването на посочената фузионна мутация не е решена на ниво протеинов продукт. Известно е решение, което предлага моноклонални антитела, които разпознават епитоп 42-66 на ERG, като по този начин са приложими при имунологични методи за откриване наличието му (имунохистохимични, ELISA) [13]. В момента все още няма фузия-специфично антитяло детектиращо TMPRSS2-ERG или само ERG в мутантно състояние. Получаването на такова антитяло може да доведе до откриване на определени, вече характеризирани фузионни феномени, но възникването на нови такива би могло да доведе до получаването на нови фузионни генни секвенции, което да доведе до загуба на специфичния епитоп разпознаван от моноклоналното антитяло.Detection of said fusion mutation is not resolved at the protein product level. A solution is known which offers monoclonal antibodies that recognize epitope 42-66 of ERG, thus being useful in immunological methods for detecting its presence (immunohistochemical, ELISA) [13]. There is currently no fusion-specific antibody detecting TMPRSS2-ERG or only mutant ERG. The production of such an antibody may lead to the detection of certain already characterized fusion phenomena, but the emergence of new ones could lead to the production of new fusion gene sequences, leading to the loss of the specific epitope recognized by the monoclonal antibody.
Използваните до сега методи или демонстрират фузия чрез ДНК сонди (Е18Н)/количествен PCR (RT-qPCR), показващи началото на единия ген и края на другия, или още по-неточно използват имунохистохимия с антитела насочени към втория фузионен ген (ERG), който има генно-регулаторни функции. Използваните до момента в клиничната практика маркери и подходи за откриване на онкофузионнен протеин не позволяват разграничаването на клинично-важните злокачествени форми от неизявените карциноми, и не позволяват точна оценка на метастатичния потенциал на туморните образувания, въз основа на който да се направи прогноза за състоянието на пациента.The methods used so far either demonstrate fusion by DNA probes (E18H) / quantitative PCR (RT-qPCR), showing the beginning of one gene and the end of the other, or even more inaccurately use immunohistochemistry with antibodies directed to the second fusion gene (ERG), which has gene-regulatory functions. The markers and approaches for detection of oncofusion protein used so far in clinical practice do not allow to distinguish clinically important malignant forms from undetected carcinomas, and do not allow accurate assessment of the metastatic potential of tumors, on the basis of which to predict the condition of patient.
Задача на изобретението е да предложи метод за откриване на функционално активен онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин при карцином на простатата, както и кит за неговото приложение, с които да е възможно високо специфично, бързо и лесно диагностициране на заболяването, позволявайки точна прогноза и фокусирана терапия.It is an object of the invention to provide a method for detecting a functionally active oncofusion TMPRSS2-ERG protein in prostate cancer, as well as a kit for its application, with which a highly specific, rapid and easy diagnosis of the disease is possible, allowing accurate prognosis and focused therapy. .
Техническа същност на изобретениетоTechnical essence of the invention
Методът за откриване на функционално активен онкофузионнен TMPRSS2-ERG протеин при карцином на простатата, съгласно настоящото изобретение, се основава на откриване наличието на фузия на гените TMPRSS2 и ERG, имащи геномна локация в хромозома 21 съответно в: 41464551-41508065 и 38380028-38498504 (фигура 1), независимо от начина на тяхното реаранжиране. За целта, предварително разтворени в реакционен буфер антитяло-олигонуклеиден конюгат, специфично детектиращ гена TMPRSS2 и разтвор на антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ гена ERG, последователно се накапват към изследваната тестова проба в ямките на плака, съвместима с апаратите за количествена полимеразно верижна реакция (qPCR).The method for detecting a functionally active oncofusion TMPRSS2-ERG protein in prostate cancer according to the present invention is based on detecting the presence of fusion of the TMPRSS2 and ERG genes having a genomic location on chromosome 21 in: 41464551-41508065 and 3838004-38, respectively. Figure 1), regardless of how they are rearranged. For this purpose, antibody-oligonucleotide conjugate specifically detecting the TMPRSS2 gene and a solution of the antibody-oligonucleotide conjugate specifically detecting the ERG gene, pre-dissolved in the reaction buffer, are sequentially added to the test sample in the wells of the plate. (qPCR).
След инкубиране в продължение на 2 h при стайна температура следва двуетапно омрежване на конюгатите с използване на qPCR и последваща амплификация на продукта на омрежването чрез полимеразно верижна реакция в реално време. Получените данни се подлагат на регресионен анализ за определяне стойностите за протеинова експресия, съответстващи на стойностите за наличие на функционално активен онкофузионнен TMPRSS2-ERG протеин в изследваните проби (SEQ ID No.l).Incubation for 2 hours at room temperature is followed by two-step crosslinking of the conjugates using qPCR and subsequent amplification of the crosslinking product by real-time polymerase chain reaction. The obtained data were subjected to regression analysis to determine the values for protein expression corresponding to the values for the presence of functionally active oncofusion TMPRSS2-ERG protein in the test samples (SEQ ID No. 1).
BG 67180 BlBG 67180 Bl
От своя страна, антитяло-олигонуклеотидният конюгат, специфично детектиращ гена TMPRSS2, представлява конюгат на пречистен поливалентен TMPRSS2-cπeциφичeн имуноглобулин G (IgG) и разпознаващ епитопи с размер на 15-20 аминокиселинни остатъци, съответстващи на аминокиселинните остатъци при позиция 365 от молекулата на нативния TMPRSS2 ген (рефериран като антитяло 1) с лиофилизиран 40-60-мерен олигонуклеотид с молекулна маса от 12296 g/mol до 12690 g/mol, а антитялоолигонуклеотидният конюгат, специфично детектиращ гена ERG, представлява конюгат на пречистен поливалентен ERG-специфичен IgG, локализиран в карбокси края на протеина от молекулата на нативния ERG ген (рефериран като антитяло 2) с лиофилизиран 40-60-мерен олигонуклеотид с молекулна маса от 12296 g/mol до 12690 g/mol.In turn, the antibody-oligonucleotide conjugate, specifically detecting the TMPRSS2 gene, is a conjugate of purified polyvalent TMPRSS2-specific immunoglobulin G (IgG) and recognizing epitopes with a size of 15-20 amino acid residues at 36 residues. TMPRSS2 gene (referred to as antibody 1) with a lyophilized 40-60-dimensional oligonucleotide with a molecular weight of 12296 g / mol to 12690 g / mol, and the antibody-oligonucleotide conjugate specifically detecting the ERG gene is a conjugate of purified polyvalent ERG-specific IgG at the carboxy terminus of the protein from the native ERG gene molecule (referred to as antibody 2) with a lyophilized 40-60-dimensional oligonucleotide with a molecular weight of 12296 g / mol to 12690 g / mol.
В качеството на тестова проба в метода, съгласно изобретението, се използват клетъчни линии, носещи генната фузия TMPRSS2-ERG или материал, получен от биологични течности като кръв, серум, урина, лимфна течност, цереброспинална течност, течност от кистозни формации или тъкани като цялостен лизат, получен от простатна биопсия, клетъчен лизат, получен от биопсичен материал от първичен тумор или метастатично огнище, циркулиращи метастатични клетки, изолирани от периферна кръв, единична клетка или малка група клетки, изолирани от тумори и други. Тестовата проба се калибрира с лизат от клетъчна линия ATCC VCaP.Cell lines carrying the TMPRSS2-ERG gene fusion or material derived from biological fluids such as blood, serum, urine, lymph fluid, cerebrospinal fluid, fluid from cystic formations or tissues as a whole are used as a test sample in the method according to the invention. lysate obtained from prostate biopsy, cell lysate obtained from biopsy material from a primary tumor or metastatic focus, circulating metastatic cells isolated from peripheral blood, a single cell or a small group of cells isolated from tumors, and the like. The test sample is calibrated with lysate from the ATCC VCaP cell line.
Методът за откриване на наличието на функционално активен онкофузионнен протеин, съгласно настоящото изобретение, се осъществява с помощта на кит, включващ:The method for detecting the presence of a functionally active oncofusion protein according to the present invention is performed using a kit comprising:
- Ямкова плака, съвместима с апарат за провеждане на количествена полимеразно верижна реакция (qPCR);- Pit plate compatible with a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) apparatus;
- Антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ TMPRSS2 гена, предварително разтворен в реакционен PBS буфер;- Antibody-oligonucleotide conjugate, specifically detecting the TMPRSS2 gene, pre-dissolved in reaction PBS buffer;
- Антитяло-олигонуклеотиден конюгат, специфично детектиращ ERG гена, предварително разтворен в реакционен PBS буфер и- Antibody-oligonucleotide conjugate, specifically detecting the ERG gene, pre-dissolved in reaction PBS buffer and
- Тестова проба, подлежаща на изследване;- Test sample to be tested;
- Калибрационна проба, представляваща лизат от клетъчна линия ATCC VCaP.- Calibration sample representing a lysate from the ATCC VCaP cell line.
Онкофузионният протеин при карцином на простатата е резултат от фузия на гените TMPRSS2 и ERG, имащи съответни геномни локации в хромозома 21: 41464551-41508065 и 38380028-38498504 (фигура 1). Като илюстрация, един от описаните фузионни продукти е следната изоформа: GenBank: EU432099.1, Homo sapiens TMPRSS2-ERG prostate cancer specific isoform 1 (ERG) mRNA, complete cds, alternatively spliced (фигура 2). Генът и аминокиселинната секценция са представени в SEQUENCE LISTING, SEQ ID No. 1The oncofusion protein in prostate cancer is the result of a fusion of the TMPRSS2 and ERG genes having corresponding genomic locations on chromosome 21: 41464551-41508065 and 38380028-38498504 (Figure 1). As an illustration, one of the described fusion products is the following isoform: GenBank: EU432099.1, Homo sapiens TMPRSS2-ERG prostate cancer specific isoform 1 (ERG) mRNA, complete cds, alternatively spliced (Figure 2). The gene and amino acid section are presented in SEQUENCE LISTING, SEQ ID No. 1
Методът позволява откриване на наличие на двете отделни протеинови компоненти, съставящи фузия между гените TMPRSS2 и ERG, независимо от начина на ре-аранжиране (описан или все още неизвестен) (фигура 3). Ако те не са на разстояние от порядъка на една молекула, както и ако са frame shift мутирали, тези две отделни части (домени) няма да бъдат разпознати и тестът ще бъде отрицателен. Обратно, ако има близко разположени домени на TMPRSS2 и ERG в близост от порядъка на една молекула, след първична детекция на двата домена се генерира междинен продукт (фигура 4), който се усилва във втора стъпка с помощта на амплифицираща технология (фигура 5), което позволява откриване на наличие на изключително слаб сигнал, получен от много малък брой детектирани фузионни молекули.The method allows the detection of the presence of the two separate protein components that make up the fusion between the TMPRSS2 and ERG genes, regardless of the method of rearrangement (described or still unknown) (Figure 3). If they are not at a distance of the order of one molecule, as well as if they are frame shift mutated, these two separate parts (domains) will not be recognized and the test will be negative. Conversely, if there are closely spaced TMPRSS2 and ERG domains close to the order of one molecule, after primary detection of both domains, an intermediate is generated (Figure 4), which is amplified in a second step using amplification technology (Figure 5), which allows the detection of the presence of an extremely weak signal obtained from a very small number of detected fusion molecules.
BG 67180 BlBG 67180 Bl
Методът позволява определяне на протеиновия продукт-патологично формирана генна фузия в клетки, получени от карцином на простатата генна фузия, резултат от пренареждане на гени от хромозома 21 (фигура 1), водещи до образуването на продукт с променлива дължина и вариабилна функция - TMPRSS2-ERG.The method allows the determination of the protein product-pathologically formed gene fusion in cells derived from prostate cancer gene fusion, resulting from rearrangement of genes from chromosome 21 (Figure 1), leading to the formation of a product with variable length and variable function - TMPRSS2-ERG .
Методът, съгласно изобретението, съчетава комбинация от имунологичен с молекулярнобиологичен метод, като позволява разпознаването на най-често срещания и с най-високо клинично значение функционално годен онко-фузионен протеин при карцином на простатата - TMPRSS2-ERG (SEQID No:l).The method according to the invention combines a combination of immunological with molecular biological method, allowing the recognition of the most common and most clinically relevant functional onco-fusion protein in prostate cancer - TMPRSS2-ERG (SEQID No: l).
Тестът се калибрира със стандарт и изисква много малко количество (1 микролитър) клиничен материал (серум, кръв, лизат от пункционна биопсия), провежда се в два етапа, посредством накапване на тестовия материал и няколко стандарта в 96 ямков формат, накапване на реакционна смес и инкубация, и последващ анализ/детекция посредством апарат за количествена полимеразно верижна реакция (qPCR). Протичащият процес в qPCR апаратът не е типична полимеразно верижна реакция и не изисква получаване на крива на топене. Общото време е около 4-6 часа, което позволява бърз клиничен отговор с цел оптимизация на терапията.The test is calibrated with a standard and requires a very small amount (1 microliter) of clinical material (serum, blood, puncture biopsy lysate), is performed in two stages, by instillation of the test material and several standards in 96-well format, instillation of reaction mixture and incubation, and subsequent analysis / detection by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) apparatus. The ongoing process in the qPCR apparatus is not a typical polymerase chain reaction and does not require a melting curve. The total time is about 4-6 hours, which allows a rapid clinical response in order to optimize therapy.
Разработеният метод детектира протеинови продукти, получени в резултат както на известни, така и на още неизвестни (непредвидени) фузионни феномени, свързани с реанжирането на два конкретни гена при карцином на простатата.The developed method detects protein products resulting from both known and as yet unknown (unforeseen) fusion phenomena associated with the resonance of two specific genes in prostate cancer.
Генно ре-аранжиране се нарича сливане на части от два гена, намиращи се на различни места (хромозоми) в генома и води до образуване на нови онко-фузионни протеини. При наличие на фузия, получените реаранжирани гени съдържат част от екзоните, кодиращи TMPRSS2 и част от екзоните, кодиращи ERG, като пренареждането може да се осъществи за сметка на деления на интроните между екзони на двата гена, но може да засяга част от екзони на TMPRSS2 или на ERG. Последните могат да са в правилна посока за четене (sense) или в обратна посока (anti-sense). Обикновено са известни началният край на единия ген и краят на вторият реаранжиран ген, но точните нуклеотидни последователности винаги варират. По тази причина кодираните от този фузионен ген аминокиселинни последователности се различават при различните индивиди и дори в рамките на един индивид ще се наблюдават няколко варианта на такова реаранжиране, и съответно различни аминокиселинни последователности на получените фузионни протеини.Gene rearrangement is the fusion of parts of two genes located at different sites (chromosomes) in the genome and leads to the formation of new onco-fusion proteins. In the presence of fusion, the resulting rearranged genes contain part of the exons encoding TMPRSS2 and part of the exons encoding ERG, and the rearrangement may occur at the expense of intron divisions between exons of the two genes, but may affect part of the exons of TMPRSS2. or the ERG. The latter can be in the right reading direction (sense) or in the opposite direction (anti-sense). The initial end of one gene and the end of the second rearranged gene are usually known, but the exact nucleotide sequences always vary. Therefore, the amino acid sequences encoded by this fusion gene differ in different individuals, and even within a single individual, several variants of such rearrangement will be observed, and accordingly different amino acid sequences of the resulting fusion proteins.
Всеки белтък е изграден от различен набор от функционално независими структурно обусловени части, наречени домени. При образуването на онко-фузионните протеини, домени от два различни белтъка се кодират от нов ре-аранжиран ген, като полученият продукт може да бъде функционално активен частично, или напълно, или да представлява неправилно навит протеин (protein missfolding), който съдържа част от оригиналната последователност от амино-киселини, но не е функционално навит и не притежава оригиналните домени, и съответно не е способен да изпълнява функции на молекулярно ниво, или може да съдържа абсолютно нова аминокиселинна последователност, кодирана от изместена рамка за четене (“frame shift’) в резултат от генната реаранжировка. В последния случай полученият протеин няма функционално значение и не може да изпълнява генно-регулаторни функции.Each protein is made up of a different set of functionally independent structural parts called domains. In the formation of onco-fusion proteins, domains of two different proteins are encoded by a newly rearranged gene, and the resulting product may be functionally active partially or completely, or be a misfolded protein that contains part of the original amino acid sequence, but is not functionally coiled and does not have the original domains, and therefore is not able to perform functions at the molecular level, or may contain a completely new amino acid sequence encoded by a shifted reading frame ('frame shift' ) as a result of gene rearrangement. In the latter case, the resulting protein has no functional significance and cannot perform gene-regulatory functions.
BG 67180 BlBG 67180 Bl
Едно антитяло може да разпознава специфично само много малък участък от дадена молекула (епитоп, състоящ се от 10-20 амино киселинни остатъка), но при разпознаване на цялата нативна молекула, то не може да разпознае нейна мутантна форма (фигура 3).An antibody can specifically recognize only a very small portion of a molecule (an epitope consisting of 10-20 amino acid residues), but upon recognition of the entire native molecule, it cannot recognize its mutant form (Figure 3).
По тази причина за откриване на наличие на разнообразните непредсказуеми варианти, получени в резултат на различно генно реаранжиране, получените фузионни протеинови продукти могат да се детектират с помощта на специфични поливалентни (поликлонални) антитела, насочени към участъци от пълния функционален протеинов продукт на дивите варианти на гените TMPRSS2 и ERG. По този начин се покрива етерично цялата таргетна молекула на всеки от елементите на фузията, т. к. загубата на специфичност към определени етерични участъци се компенсира със запазена специфичност към други. По този начин протеините TMPRSS2 и ERG могат да се открият поотделно, ако имат запазена поне частично нативна конформация.Therefore, to detect the presence of a variety of unpredictable variants resulting from different gene rearrangements, the resulting fusion protein products can be detected using specific polyvalent (polyclonal) antibodies targeting regions of the fully functional protein product of wild-type the TMPRSS2 and ERG genes. In this way the whole target molecule of each of the elements of fusion is ethereally covered, i.e. the loss of specificity to certain etheric sites is compensated by preserved specificity to others. Thus, TMPRSS2 and ERG proteins can be detected separately if they have at least partially native conformation preserved.
Разработеният, съгласно изобретението, метод позволява да се разпознаят по отделно части от домените, съставляващи двата оригинални протеина, само когато са в много голяма близост (наличие на фузия) и ако са правилно функционално навити и евентуално биха имали физиологичен ефект, т. е. биха предизвикали действително повишена малигнизация на клетките, носители на този феномен. На следващ етап в провеждането на теста, при наличие на детекция на фузионно събитие, следва усилване на сигнала, което позволява много нисък праг на откриване на наличие на особено малък брой фузионни молекули. Това е възможно, тъй като се използват антитяло-олигонуклеотидни конюгати, които при етерична близост (свързване по повърхността на фузионен протеин, но не и нативните протеини поотделно), създават междумолекулен мост между олигонуклеотидните конюгати (омрежване) (фигура 4). В следващ етап последният се усилва и този сигнал се отчита с помощта на конвенционален qPCR метод (фигура 5).The method developed according to the invention makes it possible to recognize separately the parts of the domains constituting the two original proteins only when they are very close (presence of fusion) and if they are properly functionally coiled and would eventually have a physiological effect, i. would actually cause increased malignancy of the cells carrying this phenomenon. At the next stage in the test, in the presence of detection of a fusion event, the signal is amplified, which allows a very low threshold for detecting the presence of a particularly small number of fusion molecules. This is possible because antibody-oligonucleotide conjugates are used, which, in ethereal proximity (binding to the surface of a fusion protein but not native proteins separately), create an intermolecular bridge between the oligonucleotide conjugates (crosslinking) (Figure 4). In the next step, the latter is amplified and this signal is read using a conventional qPCR method (Figure 5).
Методът, съгласно настоящото изобретение се осъществява посредством специално създаден за целта кит, позволяващ неговото лесно, бързо и ефективно прилагане в изследователската, диагностична и терапевтична практика.The method according to the present invention is carried out by means of a specially designed kit, allowing its easy, fast and effective application in research, diagnostic and therapeutic practice.
Китът, съгласно изобретението, открива протеиновите продукти получавани при свързаната с карцинома на простатата фузия на гените TMPRSS2 и ERG, имащи съответни интактни геномни локации в хромозома 21:41464551 -41508065 и 383 80028-38498504, с минимален праг на детекция 2,6.10-5 amol/pL тотален протеин, еквивалентни на 6,44.10-5 fg фузионен протеин, еквивалентен на 15 молекули TMPRSS2-ERG в единична VCaP клетка, динамичен обхват до 105.The kit according to the invention detects the protein products obtained by prostate cancer-associated fusion of the TMPRSS2 and ERG genes having corresponding intact genomic locations on chromosome 21: 41464551 -41508065 and 383 80028-38498504, with a minimum detection threshold of 2,6.10 -5 amol / pL total protein equivalent to 6,44.10 -5 fg fusion protein equivalent to 15 TMPRSS2-ERG molecules in a single VCaP cell, dynamic range up to 10 5 .
Китът за оценка на протеиновата експресия на TMPRSS2-ERG може да се използва за оценка на нивата на функционален протеин на генната фузия TMPRSS2-ERG, при експериментална работа с клетъчни линии носещи фузията (VCaP, NCI Н660), както и в материал получен от биологични течности (кръв, серум, урина, лимфна течност, церебро-спинална течност, течност от кистозни формации) и/или тъкани (цялостен лизат получен от простатна биопсия, клетъчен лизат получен от биопсичен материал от първичен тумор или метастатично огнище, циркулиращи метастатични клетки изолирани от периферна кръв, единична клетка или малка група клетки изолирани от фиксирани с формалин и включени в парафин тумори с помощта на техники като ласер захващаща микродисекция и други).The TMPRSS2-ERG protein expression assessment kit can be used to assess TMPRSS2-ERG functional fusion protein levels in experimental work with fusion-carrying cell lines (VCaP, NCI H660), as well as in material derived from biological fluids (blood, serum, urine, lymph fluid, cerebrospinal fluid, fluid from cystic formations) and / or tissues (complete lysate obtained from prostate biopsy, cell lysate obtained from biopsy material from a primary tumor or metastatic focus, circulating metastatic cells isolated from peripheral blood, a single cell or a small group of cells isolated from formalin-fixed and paraffin-embedded tumors using techniques such as laser capture microdissection and others).
Едно от приложенията на изобретения метод и кит е по същество и разработка на нов подход за оценка на състоянието (т. нар. стратификация) на пациенти с простатен карцином и позволяваOne of the applications of the invention method and kit is essentially the development of a new approach to assess the condition (so-called stratification) of patients with prostate cancer and allows
BG 67180 Bl положителните за TMPRSS2-ERG функционален протеин пациенти да бъдат лекувани с терапия, насочена към най-агресивни форми на простатен карцином (химиотерапия), докато пациенти позитивни за тази фузия на RT-qPCR, но негативни по предлагания кит, да бъдат лекувани с конвенционални схеми за лечение (андроген депривационна терапия и пр.).TM 67180 Bl positive TMPRSS2-ERG functional protein patients should be treated with therapy targeting the most aggressive forms of prostate cancer (chemotherapy), while patients positive for this RT-qPCR fusion but negative for the proposed kit should be treated. with conventional treatment regimens (androgen deprivation therapy, etc.).
Изобретението има редица предимства в сравнение с известните методи съгласно цитираната литература.The invention has a number of advantages over the known methods according to the cited literature.
- Методът позволява решение на широк кръг проблеми по откриване на протеиновите продукти, в резултат от фузионни явления. В настоящият момент няма друго реализирано технологично решение предоставящо тази възможност.- The method allows solving a wide range of problems in the detection of protein products as a result of fusion phenomena. At present, there is no other implemented technological solution providing this opportunity.
- Предложен е кит, позволяващ бърза (4-6 часа), високо-специфична детекция от минимално количество кръв (например 1 μΐ) на уникално за простатния карцином генно сливане, свързано с повишена злокачественост и най-неблагоприятна прогноза. Тестът е единствен по рода си тъй като разграничава наличието на функционално активни и клинично значими ново-образувани генно реаранжирани онкопротеини, от техните нормални немутантни предшественици, и от нефункционалните мутанти, позволявайки точна прогноза на заболяването и фокусирана терапия.- A kit has been proposed that allows rapid (4-6 hours), high-specific detection of a minimal amount of blood (eg 1 μΐ) of a unique gene fusion for prostate cancer, associated with increased malignancy and the most unfavorable prognosis. The test is unique in that it distinguishes the presence of functionally active and clinically significant newly formed genetically rearranged oncoproteins from their normal non-mutant precursors and from non-functional mutants, allowing accurate disease prognosis and focused therapy.
- Разработеният метод открива само протеинов продукт на рекурентни фузионни феномени като TMPRSS2 и ERG, независимо от типа на настъпилите реаранжировки и мутации, които биха могли да възникнат.- The developed method detects only a protein product of recurrent fusion phenomena such as TMPRSS2 and ERG, regardless of the type of rearrangements and mutations that may occur.
- Дава възможност за откриване на „функционални варианти на карциномната фузия.- Enables the detection of “functional variants of carcinoma fusion.
- Налице е откриване на ERG или друг фузионен партньор при детекцията, както и възможността да се разграничи нормален от фузионен TMPRSS2 фрагмент.- There is detection of an ERG or other fusion partner in the detection, as well as the ability to distinguish a normal from a fusion TMPRSS2 fragment.
- Основното предимство на разработения метод се състои в откриване на епитопи, които са поотдалечени от местата на фузия (на практика в области, които не подлежат на фузия, или които при фузия биха довели до функционално негоден протеинов продукт, а следователно и до биологично неактивен продукт, т. е. такъв без клинично значение).- The main advantage of the developed method is the detection of epitopes that are further away from the fusion sites (in practice in areas that are not subject to fusion, or which in fusion would lead to a functionally unfit protein product and therefore to a biologically inactive product, ie one without clinical significance).
- Възможност за бързо и евтино откриване на фузионен протеин в биологични течности получени от пациенти, като за разлика от горепосочените патенти, при които също се ползва биологична течност, тук е нужно количество от само 1 микролитьр, което е от порядъци по-малко от нужното за изолиране на ДНК или РНК в конвенционалните методи, основаващи се на PCR или на други хибридизационни подходи. Възможността за пре-амплификация би могла да доведе до намаляване на изходното количество проба, но различната амплификационна ефективност в зависимост от съдържанието на гуанинови и цитозинови бази и вторичната структура на иРНК би могла да доведе до грешки при определяне на количеството на новообразувани фузионни явления.- Ability to quickly and cheaply detect fusion protein in biological fluids obtained from patients, and unlike the above patents, which also use biological fluid, here you need an amount of only 1 microliter, which is orders of magnitude less than necessary. for isolating DNA or RNA in conventional methods based on PCR or other hybridization approaches. The possibility of pre-amplification could lead to a reduction in the initial sample amount, but the different amplification efficiency depending on the content of guanine and cytosine bases and the secondary structure of mRNA could lead to errors in determining the amount of newly formed fusion phenomena.
- Възможност да се използват антитела срещу интактните немутантни форми на двата протеинови продукти на гените, които търпят фузия при простатен карцином.- Possibility to use antibodies against intact non-mutant forms of the two protein products of genes that undergo fusion in prostate cancer.
- Освен това, откривайки епитопи, които са по-отдалечени от местата на фузия (на практика в области, които не подлежат на фузия, или които при фузия биха довели до функционално негоден протеинов продукт, а следователно и до биологично неактивен продукт, т. е. такъв без клинично значение) дава възможност да се откриват и нови фузионни феномени.Furthermore, by detecting epitopes which are further away from the fusion sites (in practice in areas which are not subject to fusion, or which in fusion would lead to a functionally unfit protein product and therefore to a biologically inactive product, e.g. f. one without clinical significance) makes it possible to discover new fusion phenomena.
BG 67180 BlBG 67180 Bl
Предимствата на настоящето изобретение са и по отношение на:The advantages of the present invention are also in terms of:
Времетраене - досега използваните методи изискват предварителна обработка на клетки или тъкани, което увеличава технологичното време над 24 часа, докато продължителността на метода, съгласно изобретението, се свежда до 4-5 часа.Duration - the methods used so far require pre-treatment of cells or tissues, which increases the technological time over 24 hours, while the duration of the method according to the invention is reduced to 4-5 hours.
Специфичност - откриването на отделните части (домени) на онко-фузионния протеин има специфичност от порядъка на високо специфични и високо авидни антитела, но позволява разграничаване на фузионния феномен от отделните нативни не-мутантни форми. Тестът може да разпознава всякакви реаранжирания на нормалните гени предшественици, стига те да водят до функционално навит протеин и следователно до функционална фузия.Specificity - the detection of the individual parts (domains) of the onco-fusion protein has a specificity of the order of highly specific and highly avid antibodies, but allows to distinguish the fusion phenomenon from the individual native non-mutant forms. The test can recognize any rearrangements of normal precursor genes, as long as they lead to a functionally coiled protein and therefore to functional fusion.
Удобство - използва се 1 микролитър кръв/плазма, количество многократно по-ниско от използването при ELISA и други методи, позволяващо съхраняването на ценния клиничен материал за други изследвания. При използване на клетъчен лизат от биопсия, количеството може да бъде и по-малко, т. к. в клетъчни линии и клетъчни лизати от биопсия наличието на онко-фузионния протеин е достатъчно за получаване на много висок сигнал.Convenience - 1 microliter of blood / plasma is used, an amount many times lower than the use in ELISA and other methods, allowing the storage of valuable clinical material for other studies. When using a cell lysate from a biopsy, the amount may be less, because in cell lines and cell lysates from biopsy, the presence of the onco-fusion protein is sufficient to obtain a very high signal.
Достъпност - Тестът изисква използване на конвенционален real-time PCR и не изисква промени в оптиката, нито в софтуера; В момента такива апарати са налични във всяка една от големите болници в страната; Последователността на действията изисквани от медицинския персонал, който би прилагал метода са много близки до тези на real-time PCR, като включват няколко предварителни стъпки, които не се нуждаят от допълнително оборудване.Availability - The test requires the use of conventional real-time PCR and does not require changes in optics or software; Currently, such devices are available in each of the major hospitals in the country; The sequence of actions required by the medical staff who would apply the method is very close to that of real-time PCR, including several preliminary steps that do not require additional equipment.
- Изобретението може широко да се прилага в клиничната онкология и урология при установяване на степента на малигненост (злокачественост) на простатния карцином, с цел оптимизация на терапията на пациентите с лоша прогноза.- The invention can be widely applied in clinical oncology and urology in determining the degree of malignancy (malignancy) of prostate cancer, in order to optimize the therapy of patients with poor prognosis.
- Дава лесна възможност за развитие на кита е мултиплексен (едновременен) анализ на допълнителни клинично значими фузионни мутации и други онкологични маркери в един клиничен тест, както при простатен карцином, така и при други онкологични заболявания (напр. левкози).- Multiplex (simultaneous) analysis of additional clinically significant fusion mutations and other oncological markers in one clinical test, both in prostate cancer and in other oncological diseases (eg leukemia), provides an easy opportunity for whale development.
Разработеният тест използва за контроли клетъчни линии с различна андрогенна рецептивност, носители на фузионната мутация и такива с див тип на съставящите я гени (без фузия). Тестът запазва своята чувствителност при разреждания на клетъчните лизати до 1:10'7 и до 1:10'10. Като зона за сигурност се препоръчва 1:1 O'4 -1:10'5.The developed test uses for control cell lines with different androgen receptivity, carriers of the fusion mutation and those with wild type of its constituent genes (without fusion). The test retains its sensitivity when diluting cell lysates to 1:10 ' 7 and to 1:10' 10 . As a safety zone, 1: 1 O ' 4 -1: 10' 5 is recommended.
За по-голяма яснота, изобретението се илюстрира със следните фигури:For clarity, the invention is illustrated by the following figures:
Фигура 1. Геномна локализация на гените кодиращи TMPRSS2 и ERG;Figure 1. Genomic localization of genes encoding TMPRSS2 and ERG;
Фигура 2. Геномна локализация на фузионен ген, кодиращи TMPRSS2-ERG изоформа;Figure 2. Genomic localization of a fusion gene encoding a TMPRSS2-ERG isoform;
Фигура 3. Рекомбинацията на различни по дължина фрагменти от двата гена имат за резултат различно комбинирани по размер фузионни протеини;Figure 3. The recombination of fragments of different lengths from the two genes results in differently combined fusion proteins;
Фигура 4. При физическа близост на разпознаваните от антителата молекулни фрагменти от продукта на реаранжиране, между конюгираните към антителата секвенции изгражда мост;Figure 4. Upon physical proximity of the molecular fragments of the rearrangement product recognized by the antibodies, a bridge is constructed between the antibody-conjugated sequences;
Фигура 5. В следващ етап сигналът от моста се усилва като секвенцията се намножава многократно с помощта на qPCR;Figure 5. In the next step, the signal from the bridge is amplified by multiplying the sequence many times using qPCR;
BG 67180 BlBG 67180 Bl
Фигура 6. VCaP клетъчната линия има 2 от изследваните 4 основни типа реаранжиране на TMPRSS2 и ERG;Figure 6. The VCaP cell line has 2 of the 4 main types of TMPRSS2 and ERG rearrangements studied;
Фигура 7. Амплификационни криви, получени с помощта на qPCR от реакционна смес след инкубация на антителата с проби за изследване и преминаване през стъпката за изграждане на мост между тях. Лизати от LNCaP клетки спрямо лизати от VCaP клетки;Figure 7. Amplification curves obtained using qPCR from the reaction mixture after incubation of the antibodies with assay samples and going through the step to build a bridge between them. LNCaP cell lysates versus VCaP cell lysates;
Фигура 8. Амплификационни криви, получени с помощта на qPCR от реакционна смес след инкубация на антителата с проби за изследване Серийно разредени лизати на VCaP клетки;Figure 8. Amplification curves obtained by qPCR from the reaction mixture after incubation of the antibodies with test samples Serially diluted lysates of VCaP cells;
Фигура 9. Стандартна калибровъчна крива получена чрез регресия между стойностите на Ct и концентрациите на калибровъчните лизати;Figure 9. Standard calibration curve obtained by regression between Ct values and calibration lysate concentrations;
Фигура 10. Амплификационна крива, получена при стъпка 2 от кита за детекция на TMPRSS2ERG протеин;Figure 10. Amplification curve obtained in step 2 of the TMPRSS2ERG protein detection kit;
Фигура 11. Пример за линейност на резултатите от серийните разреждания;Figure 11. Example of linearity of the results of serial dilutions;
Фигура 12. Резултати, получени с помощта на новия метод (кит) за детекция на протеиновия продукт;Figure 12. Results obtained using the new method (kit) for detection of the protein product;
Фигура 13. Анализ на експресията на микро-РНК 204 в различни линии от простатен карцином, с помощта на RT-qPCR;Figure 13. Analysis of the expression of micro-RNA 204 in various prostate cancer lines, using RT-qPCR;
Фигура 14. Анализ на експресията на транскриптите на TMPRSS2-ERG в линия VCaP от простатен карцином, с помощта на RT-qPCR;Figure 14. Analysis of the expression of TMPRSS2-ERG transcripts in the VCaP line of prostate cancer, using RT-qPCR;
Фигура 15. Амплификационни криви, получени с помощта на qPCR от реакционна смес след инкубация на антителата с проби за изследване;Figure 15. Amplification curves obtained by qPCR from the reaction mixture after incubation of the antibodies with assay samples;
Фигура 16. Амплификационни криви, получени при стъпка 2 от кита за детекция на TMPRSS2ERG протеин;Figure 16. Amplification curves obtained in step 2 of the TMPRSS2ERG protein detection kit;
Фигура 17. Стандартна калибровъчна крива, получена чрез регресия между стойностите на Ct и концентрациите на калибровъчните лизати;Figure 17. Standard calibration curve obtained by regression between Ct values and calibration lysate concentrations;
Фигура 18. Резултати, получени с помощта на новия метод (кит) за детекция на протеиновия продукт на реаранжирания фузионен продукт TMPRSS2-ERG в клетки и серуми от пациенти;Figure 18. Results obtained using the new method (kit) for detection of the protein product of the rearranged TMPRSS2-ERG fusion product in cells and sera from patients;
Фигура 19. Селекция на пациентите от фигура 18, имащи ниски нива на експресия, с цел елиминиране на пациентите, имащи порядъци по-високи нива и сравняването им;Figure 19. Selection of patients of Figure 18 having low levels of expression to eliminate patients having orders of magnitude higher and comparing them;
Фигура 20. Селекция на пациентите от фигура 18 имащи най-високи на експресия;Figure 20. Selection of patients from Figure 18 having the highest expression;
Фигура 21. Амплификационни крива на стандартен RT-qPCR за определяне нивата на транскриптите на TMPRSS2-ERG;Figure 21. Amplification curve of standard RT-qPCR for determining TMPRSS2-ERG transcript levels;
Фигура 22. Дисоциационни криви (крива на топене) от стандартен RT-qPCR за определяне разновидностите на транскриптите на TMPRSS2-ERG;Figure 22. Dissociation curves (melting curve) of standard RT-qPCR for determining TMPRSS2-ERG transcript variants;
Фигура 23. Амплификационни крива на стандартен RT-qPCR за определяне нивата на транскриптите на TMPRSS2-ERG, детектирани с праймерна двойка специфична за вариант 3 на фузията в серуми от пациенти с простатен карцином;Figure 23. Amplification curve of standard RT-qPCR to determine the levels of TMPRSS2-ERG transcripts detected with a primer pair specific for variant 3 of fusion in sera from prostate cancer patients;
Фигура 24. Дисоциационни криви (крива на топене) от стандартен RT-qPCR за определяне разновидностите на транскриптите на TMPRSS2-ERG;Figure 24. Dissociation curves (melting curve) of standard RT-qPCR for determining TMPRSS2-ERG transcript variants;
Фигура 25. Разновидности на дисоциационните криви на TMPRSS2-ERG иРНК при други серумни проби от същия пациент с №31Figure 25. Varieties of TMPRSS2-ERG mRNA dissociation curves in other serum samples from the same patient with №31
BG 67180 BlBG 67180 Bl
Изобретението се илюстрира със следните Примери без да ограничават неговия обхват.The invention is illustrated by the following Examples without limiting its scope.
Пример 1. Метод за откриване наличие на онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин в клетки от линията VCaP и генериране на калибрационна крива и функция.Example 1. Method for detecting the presence of oncofusion TMPRSS2-ERG protein in VCaP cells and generating a calibration curve and function.
В клетъчната линия VCaP, както и в серуми от пациенти с простатен карцином е възможна появата на повече от един пик в кривите на топене, получени с RT-qPCR, при амплификация на целия участък, обхващащ началото на гена за TMPRSS2 и края на гена за ERG (фигура 6). Този феномен се дължи на наличието на два вида реаранжиране в клетките от клетъчната линия VCaP. При това, тези реаранжировки са такива, че едната съдържа цели екзони от TMPRSS2 и ERG в правилна посока за четене, докато другата реаранжировка съдържа една правилна и една обратна по посоки част от гените. Това позволява получаването на два пика с помощта на RT-qPCR, съответстващи на двата модела на реаранжиране, без да може с този конвенционален метод да се определи дали продуктът е функционален или не. Това позволява линията VCaP да бъде използвана като модел за проверка на работоспособността и калибриране на кита за приложение на метода, съгласно изобретението.In the VCaP cell line, as well as in the sera of prostate cancer patients, more than one peak in the melting curves obtained with RT-qPCR is possible upon amplification of the entire region spanning the beginning of the TMPRSS2 gene and the end of the TMPRSS2 gene. ERG (Figure 6). This phenomenon is due to the presence of two types of rearrangement in the cells of the VCaP cell line. However, these rearrangements are such that one contains whole exons of TMPRSS2 and ERG in the correct reading direction, while the other rearrangement contains one correct and one reverse part of the genes. This allows two peaks to be obtained using RT-qPCR corresponding to the two rearrangement models, without this conventional method being able to determine whether the product is functional or not. This allows the VCaP line to be used as a model for checking the operability and calibration of the kit for applying the method according to the invention.
Така методът, съгласно настоящият вариант на изпълнение на изобретението, включва следната последователност от операции:Thus, the method according to the present embodiment of the invention comprises the following sequence of operations:
Предварително подготвени антитела (1:200 разреждане в стандартен буфер) срещу TMPRSS2 и ERG в стандартизирана концентрация, се добавят към изследвана реакционна смес - 1 pL (съдържаща лизат от клетки от клетъчна линия VCaP или клиничен тестов материал - серум) и се инкубира за 2 часа. С помощта на PCR машина се осъществява реакция, създаваща мост - на 37°С, като по този начин се извършва удължаване на конюгирани към антителата секвенции за 20 min, последвано от дезактивиране на специфичния ензим. Следва реакция на амплификация с помощта на qPCR, при която получения мост се намножава и количеството му се детектира с помощта на флуоресцентна боя. Следва се протокол, включващ:Pre-prepared antibodies (1: 200 dilution in standard buffer) against TMPRSS2 and ERG at a standardized concentration were added to the test reaction mixture - 1 pL (containing cell lysate from VCaP cell line or clinical test material - serum) and incubated for 2 o'clock. Using a PCR machine, a bridge-forming reaction was performed at 37 ° C, thus prolonging the antibody-conjugated sequences for 20 minutes, followed by inactivation of the specific enzyme. A qPCR amplification reaction followed, in which the resulting bridge was multiplied and its amount detected by fluorescent dye. The following protocol, including:
1. Детектиране на протеинов продукт1. Detection of a protein product
а) Конюгираните антитела се смесват с проба за изследване - 1 uL;a) The conjugated antibodies are mixed with a test sample - 1 uL;
б) Получаване и анализ на калибрационна стандартна крива - лизат от VCaP клетки се разрежда серийно, започвайки от стартово разреждане 1:1, 1:10, 1:100 и така до разреждане 1.10 11, прави се анализ на получените стойности на Ct от qPCR и се анализира регресионна зависимост между стойностите на Ct и разрежданията на концентрациите на лизата от VCaP клетки; обикновено се вземат в предвид първите 6 степени на разреждане; на основа на протеиновата концентрация в лизата и на известните абсолютни концентрации на най-често намиращата се във фузиите секвенция, част от фузионния протеин се изчислява количество молекули TMPRSS2-ERG на единица обем (единица количество белтък в пробата);b) Preparation and analysis of calibration standard curve - lysate from VCaP cells is diluted serially, starting from starting dilution 1: 1, 1:10, 1: 100 and so on to dilution 1.10 11 , analysis of the obtained Ct values from qPCR is performed and a regression relationship between Ct values and dilutions of lysis concentrations by VCaP cells was analyzed; the first 6 degrees of dilution are usually taken into account; based on the protein concentration in the lysis and the known absolute concentrations of the sequence most commonly found in fusions, the amount of TMPRSS2-ERG molecules per unit volume (unit amount of protein in the sample) is calculated;
2. Амплификация на междинните продукти от изследването на конкретни проби с неизвестно съдържание на търсената TMPRSS2-ERG фузия във функционална форма;2. Amplification of the intermediates from the examination of specific samples with unknown content of the desired TMPRSS2-ERG fusion in functional form;
а) Определяне на концентрацията на TMPRSS2-ERG протеин в относителни единици (или amol/pL, attomoles/pL или fg, femtograms) с помощта на получената калибрационна крива, определяне на броя молекули TMPRSS2-ERG;a) Determination of the concentration of TMPRSS2-ERG protein in relative units (either amol / pL, attomoles / pL or fg, femtograms) using the obtained calibration curve, determination of the number of TMPRSS2-ERG molecules;
BG 67180 BlBG 67180 Bl
б) Нормализиране на данните към нивата на експресия в клетъчна линия LNCaP, не съдържаща изследваната транслокация TMPRSS2-ERG с помощта на определените относителни единици за целите на сравнителни експериментални анализи или конвертиране на данните към абсолютен брой молекули,b) Normalization of the data to the expression levels in the LNCaP cell line, which does not contain the studied TMPRSS2-ERG translocation with the help of the determined relative units for the purposes of comparative experimental analyzes or conversion of the data to an absolute number of molecules,
в) Контрол на качеството и резултатите с помощта на негативни контроли - определяне нивата на експресия на TMPRSS2-ERG в серуми от клинично здрави мъже и от здрави жени (1 pL серум без разреждане или разреден 1:100);c) Quality and results control using negative controls - determination of TMPRSS2-ERG expression levels in sera from clinically healthy men and healthy women (1 pL serum without dilution or diluted 1: 100);
Описаният метод има добра чувствителност и разграничава TMPRSS2-ERG протеин в лизати на LNCaP клетки, които не съдържат или слабо съдържат мутацията, от лизати на VCaP клетки, съдържащи високи нива на търсения мутантен протеин (фигура 7). Получената разлика между двете групи е от порядъка на 3 и повече единици в праговият цикъл Ct, което означава разлика в броя на молекулите от порядъка на 3-та степен.The described method has good sensitivity and distinguishes TMPRSS2-ERG protein in lysates of LNCaP cells that do not contain or weakly contain the mutation from lysates of VCaP cells containing high levels of the desired mutant protein (Figure 7). The resulting difference between the two groups is of the order of 3 or more units in the threshold cycle Ct, which means a difference in the number of molecules of the order of the 3rd degree.
Получаването на стандартна крива има за цел определяне на регресионна зависимост между стойностите на праговия цикъл Ст (фигура 8) от амплификационните цикли на qPCR реакцията и познатите стойности за концентрация на общ протеин в лизатите на VCaP клетки (фигура 9).The purpose of obtaining a standard curve is to determine the regression relationship between the values of the threshold cycle C m (Figure 8) from the amplification cycles of the qPCR reaction and the known values for the concentration of total protein in the lysates of VCaP cells (Figure 9).
Получено е регресионно уравнение:A regression equation is obtained:
у = -0.052 * log(x) + 23.74y = -0.052 * log (x) + 23.74
Протеиновата концентрация, съответстваща на лизата от VCaP клетки е измерена с Bradford метод и отговаря на очакваната 0.210 mg/ml общ белтък, за клетки култивирани в 24 ямкова плака при пълна 100% конфлуентност. Така в 1 pL лизат има 210 pg тотален протеин.The protein concentration corresponding to the lysis of VCaP cells was measured by the Bradford method and corresponds to the expected 0.210 mg / ml total protein for cells cultured in 24-well plates at complete 100% confluence. Thus in 1 pL of lysate there is 210 pg of total protein.
Използвайки концентрацията на пептиди от двата нативни протеини, които не се засягат от реаранжирането и винаги присъстват във фузиите на при VCaP клетките (секвенции HMPPPNMTTNER и VIVPADPTLWSTDHVR), теоретично може да се определи концентрацията на TMPRSS2-ERG в клетъчна линия VCaP - 1240 amol/pL тотален протеин. По този начин се определя и броя молекули TMPRSS2-ERG (п) и количеството съответстващ им белтък (fg) което е налично в 1 pL VCaP или в съответна неизвестна проба: 1240 amol/pL * 210 pg тотален протеин в 1 pL VCaP лизат съответства на 260.4 amol или 6.1023.10'18 * 240 = 156240000 молекули; аналогично това съответства на 643.968 fg.Using the concentration of peptides from the two native proteins, which are not affected by rearrangement and are always present in the fusions of VCaP cells (HMPPPNMTTNER and VIVPADPTLWSTDHVR sequences), it is theoretically possible to determine the concentration of TMPRSS2-ERLa p cell / cell total protein. Thus, the number of TMPRSS2-ERG molecules (n) and the amount of corresponding protein (fg) present in 1 pL VCaP or in a corresponding unknown sample were determined: 1240 amol / pL * 210 pg total protein in 1 pL VCaP lysate corresponded to at 260.4 amol or 6.10 23 .10 '18 * 240 = 156240000 molecules; similarly this corresponds to 643,968 fg.
Серийното разреждане на лизати от различни експериментални условия показва линейност на промяната на Ст получена при използването на стъпка-2 от метода и промяната на фактора на разреждане (фигури 10, 11).Serial dilution of lysates from different experimental conditions showed the linearity of the change in C m obtained using step-2 of the method and the change in the dilution factor (Figures 10, 11).
Параметрите на метода за определяне на протеинова концентрация на TMPRSS2-ERG в биологични течности и клетъчни лизати са: праг на минимално откриваема концентрация-максимално разреждане на VCaP клетки, при което все още има сигнал - 1.10‘°7, еквивалентно на 2.604.105 amol/pL тотален протеин или на 6.43968.10’05 fg, или респективно 15 молекули TMPRSS2-ERG, Максимално измерени нива на TMPRSS2-ERG в 1 pL протеинов лизат от VCaP (210 pg) е 156240000 молекули за pL, или 744000 молекули за 1 pg лизат (74,4.106). Това количество протеин се получава от около 0,2.106 клетки, следователно около 781 протеинови молекули TMPRSS2-ERG се падат средно на клетка от линията VCaP. За LNCaP клетките това количество е 0.The parameters of the method for determination of protein concentration of TMPRSS2-ERG in biological fluids and cell lysates are: threshold of minimum detectable concentration-maximum dilution of VCaP cells, at which there is still a signal - 1.10 '° 7 , equivalent to 2.604.10 5 amol / pL total protein or 6.43968.10 '05 fg, or 15 molecules TMPRSS2-ERG, respectively, Maximum measured levels of TMPRSS2-ERG in 1 pL protein lysate of VCaP (210 pg) is 156.24 million molecules per pL, or 744000 molecules per 1 pg lysate (74,4.10 6 ). This amount of protein is obtained from about 0.2.10 6 cells, therefore about 781 TMPRSS2-ERG protein molecules fall on average per cell of the VCaP line. For LNCaP cells, this amount is 0.
Пример 2. Използване на кит за откриване на TMPRSS2-ERG протеин за оценка на количеството протеин в клетки от линията VCaP след третирането им с микро-РНК 204 мимик (miR-204 mimic), илиExample 2 Use of a TMPRSS2-ERG protein detection kit to assess the amount of protein in VCaP cells after treatment with 204 mimic microRNA (miR-204 mimic), or
BG 67180 Bl индивидуалното или в комбинация с подтискане на гените RUNX2, cMYB или ETS1, с помощта на siRNA (siRNA RUNX2, siRNA cMYB, siRNA ETS1).BG 67180 Bl individually or in combination with suppression of the RUNX2, cMYB or ETS1 genes, using siRNA (siRNA RUNX2, siRNA cMYB, siRNA ETS1).
Клетъчни лизати от клетки VCaP и LNCaP, култивирани по изискванията на Американската банка за клетъчни линии (АТСС), са получени с помощта на последователни цикли на дълбоко замразяване (70°С) и размразяване (24°С) и добавянето на коктейл протеазни инхибитори.Cell lysates from VCaP and LNCaP cells cultured according to the requirements of the American Bank for Cell Lines (ATCC) were obtained by successive cycles of deep freezing (70 ° C) and thawing (24 ° C) and the addition of cocktail protease inhibitors.
Преди лизирането клетките са трансфектирани с нетаргетиращ конкретен ген мимик - отрицателна контрола (non-sense miR mimic), синтетичен аналог (мимик) на микро-РНК 204 (miR-204 mimic), малки интерфериращи РНК-и (siRNA) срещу транскрипционните фактори RUNX2, cMYB и ETS1 (транскрипционни фактори, свързани с метастазирането - реаранжиран при острата миелоидна левкемия онкоген, миобластозен онкоген и хомолог на еритобластозния онкоген). Трансфекцията е осъществена с Atractene (Qiagen) разтворен в нормална култивационна среда, където са кулитвирани в продължение на 48 часа, след което са лизирани по гореописаният начин. Разработеният кит за откриване наличие на TMPRSS2-ERG протеин е приложен по гореописаният начин. Получените резултати са сравнени с резултати от същата постановка, но изследвана с помощта на количествена полимеразно верижна реакция (RT-qPCR), като за целта вместо протеолиза е изолирана тотална РНК, извършена е реакция на обратна транскриптаза и получаване на комплементарна кДНК и с полученият шаблон е направена амплификация с помощта на специфични праймери на участъци от кДНК, съответстващи на иРНК на гените RUNX2, cMYB и ETS1, както и на транскрипта на фузионния продукт TMPRSS2-ERG. За последния е използвана двойка праймери, която да фланкира първия екзон на TMPRSS2 и последния екзон на ERG, като по този начин биха били намножени всички възможни комбинации на TMPRSS2ERG.Prior to lysis, the cells were transfected with a non-targeting specific mimic gene - negative control (non-sense miR mimic), synthetic analog (mimic) of micro-RNA 204 (miR-204 mimic), small interfering RNAs (siRNA) against RUNX2 transcription factors. , cMYB and ETS1 (metastatic transcription factors - rearranged in acute myeloid leukemia oncogene, myoblastic oncogene and homologue of erythoblastosis oncogene). Transfection was performed with Atractene (Qiagen) dissolved in a normal culture medium, where they were cultured for 48 hours, after which they were lysed as described above. The developed kit for detecting the presence of TMPRSS2-ERG protein was administered as described above. The obtained results were compared with the results of the same formulation, but studied using quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), for which purpose instead of proteolysis total RNA was isolated, reverse transcriptase reaction was performed and complementary cDNA was obtained and with the obtained template amplification was performed using specific primers on cDNA regions corresponding to the mRNA of the RUNX2, cMYB and ETS1 genes, as well as the transcript of the TMPRSS2-ERG fusion product. For the latter, a pair of primers was used to flank the first exon of TMPRSS2 and the last exon of ERG, thus multiplying all possible combinations of TMPRSS2ERG.
Получените резултати показват следното (фигура 12):The results obtained show the following (Figure 12):
1. При представяне на данните като релативна експресия на TMPRSS2-ERG, спрямо експресията му в контролни VCaP (100%), се установи понижаване на експресията с около 20-25 % на1. When presenting the data as a relative expression of TMPRSS2-ERG, relative to its expression in control VCaP (100%), a decrease in expression of about 20-25% of
TMPRSS2-ERG след подтискане на транскрипционните фактори RUNX2 и ETS1, и с 40% след подтискане на транскрипционния фактор cMYB. По подобен начин, комбинацията от подтискането на повече от един от транскрипционните фактори води до кумулативно подтискане на протеиновите нива на TMPRSS2-ERG.TMPRSS2-ERG after suppression of the transcription factors RUNX2 and ETS1, and by 40% after inhibition of the transcription factor cMYB. Similarly, the combination of suppression of more than one of the transcription factors results in cumulative suppression of TMPRSS2-ERG protein levels.
2. Свръхекспресията на микро РНК 204 води до понижение на нива на TMPRSS2- ERG с 40%.2. Overexpression of microRNA 204 results in a 40% decrease in TMPRSS2-ERG levels.
3. В клетъчната линия LNCaP няма експресия на TMPRSS2-ERG протеинов продукт.3. There is no expression of the TMPRSS2-ERG protein product in the LNCaP cell line.
Данните са представени като относителна експресия на TMPRSS2-ERG в експерименталните условия, спрямо средната им експресия в нетретирани или трансфектирани с нетаргетиращ мимик (или с нонсенс siRNA) VCaP клетки, където тази експресия е 100%.Data are presented as relative expression of TMPRSS2-ERG under experimental conditions, relative to their mean expression in untreated or non-targeting mimicry (or nonsense siRNA) VCaP cells, where this expression is 100%.
С цел проверка на разултатите и сравнението им със стандартен метод на изследване, се използва RT-qPCR за да се проследят нивата на микро РНК 204 в и LNCaP линии (фигура 13) и се установява сигнификантно повишение (над 104) в линията VCaP спрямо ниво, детектирано в линията LNCaP.In order to verify the results and compare them with a standard test method, RT-qPCR was used to monitor the levels of microRNA 204 in and LNCaP lines (Figure 13) and a significant increase (above 10 4 ) in the VCaP line relative to level detected in the LNCaP line.
На тази основа, анализира се експресията на транскриптите на TMPRSS2-ERG в линията VCaP от простатен карцином, с помощта на RT-qPCR (фигура 14). Клетките са предварително трансфектирани за 48 часа с siRNA срещу RUNX2, ETS1, cMYB или комбинация от RUNX2 и cMYB, RUNX2 и ETS1. За контрола са използвани клетки, трансфектирани или с нетаргетиращ мимик, или с мимик, имитиращ miRBG 67180 BlOn this basis, the expression of TMPRSS2-ERG transcripts in the VCaP line of prostate cancer was analyzed using RT-qPCR (Figure 14). Cells were pre-transfected for 48 hours with siRNA against RUNX2, ETS1, cMYB or a combination of RUNX2 and cMYB, RUNX2 and ETS1. Cells transfected with either non-targeting mimicry or mimicry mimicking 67180 Bl were used for control.
204. Получените резултати показват, че поведението на транскриптите на TMPRSS2-ERG следва наблюдаваното с помощта на новия разработен кит и на протеиново ниво: повишаването на микроРНК204 води до сигнификантно подтискане на транскрипта на TMPRSS2-ERG (фигура 14), подобно на неговия протеинов продукт (фигура 12).204. The results show that the behavior of TMPRSS2-ERG transcripts follows that observed with the newly developed kit and at the protein level: an increase in miRNA204 leads to a significant suppression of the TMPRSS2-ERG transcript (Figure 14), similar to its protein product. (Figure 12).
Установена е и аналогична зависимост между нивата на TMPRSS2-ERG транскриптите (иРНК) и ефекта на siRNA срещу RUNX2, ETS1, cMYB или комбинации от тях.A similar relationship was found between the levels of TMPRSS2-ERG transcripts (mRNA) and the effect of siRNA against RUNX2, ETS1, cMYB or combinations thereof.
Различните нива на подтискане на TMPRSS2-ERG като иРНК продукт и като протеинов продукт се влияят от свързаните с простатния карцином активиране и дисрегулация на протеазомата и системите за убиквитиниране.The different levels of suppression of TMPRSS2-ERG as an mRNA product and as a protein product are influenced by prostate cancer-related activation and dysregulation of the proteasome and ubiquitination systems.
Пример 3. Използване на кит за откриване на наличие на онкофузионен TMPRSS2-ERG протеин в серум от пациенти с простатен карцином в напреднал стадий на възраст от 60-80 години.Example 3. Use of a kit to detect the presence of oncofusion TMPRSS2-ERG protein in the serum of patients with advanced prostate cancer aged 60-80 years.
Серуми от пациенти с простатен карцином в напреднал стадий на възраст от 60-80 години и клетъчни лизати от клетки VCaP и LNCaP, култивирани по изискванията на АТСС, се съхраняват в условия на дълбоко замразяване (-70°С). При използване на разработения кит за откриване на наличие на TMPRSS2-ERG пробите се размразяват и се изпълнява описания - по-горе протокол.Serums from advanced prostate cancer patients aged 60-80 years and cell lysates from VCaP and LNCaP cells cultured according to ATCC requirements were stored under deep freezing conditions (-70 ° C). When using the developed kit for detecting the presence of TMPRSS2-ERG, the samples are thawed and the protocol described above is performed.
С помощта на серийни разреждания на лизати от клетки VCaP и LNCaP се изготвят калибрационни регресионни криви (фигури 15, 16, 17) за калкулиране на концентрациите, получени при анализа на серумите.Using serial dilutions of VCaP and LNCaP cell lysates, calibration regression curves (Figures 15, 16, 17) were prepared to calculate the concentrations obtained from the analysis of sera.
Получени са следните резултати:The following results were obtained:
1. Регресионната крива има същия фактор за умножение на х в регресионното уравнение, както полученият в Примери 1 и 2, показващ константна зависимост между стойностите на Ст и тези на разреждането. Ако има промяна в афинитета на системата детектиран антиген - двойка антитела, qPCR, този фактор за умножение би бил променен.1. The regression curve has the same factor for multiplying x in the regression equation as obtained in Examples 1 and 2, showing a constant relationship between the values of C m and those of the dilution. If there is a change in the affinity of the detected antigen-antibody pair system, qPCR, this multiplication factor would be altered.
2. Протеиновият продукт на реаранжирания фузионен продукт TMPRSS2-ERG в клетки и серуми от пациенти (п = 35) на възраст 60-80 години с простатен карцином в напреднал стадий има висока вариация (фигури 18, 19, 20), като позитивни за функционален TMPRSS2-ERG протеин са под половината от пациентите. В литературата се съобщава за над или около 50% позитивна фузионна реаранжировка, но детектирана на ниво геном или транскриптом. До момента няма данни какъв е процента на истински физиологично навитите и функционални TMPRSS2-ERG протеини.2. The protein product of the rearranged TMPRSS2-ERG fusion product in cells and sera from patients (n = 35) aged 60-80 years with advanced prostate cancer has a high variation (Figures 18, 19, 20), as positive for functional TMPRSS2-ERG protein accounted for less than half of patients. More than or about 50% positive fusion rearrangement but detected at genome or transcript level has been reported in the literature. To date, there is no data on the percentage of true physiologically coiled and functional TMPRSS2-ERG proteins.
3. Отделно са разгледани пациентите с изключително високи нива на TMPRSS2-ERG протеин (фигура 20). При тези пациенти нивата надхвърлят тези във VCaP клетки с над 1000 до 1033 пъти.3. Patients with extremely high levels of TMPRSS2-ERG protein were considered separately (Figure 20). In these patients, the levels exceed those in VCaP cells by more than 1000 to 10 33 times.
4. Клетъчни лизати от VCaP линията са използвани като позитивна контрола, клетъчни лизати от линията LNCaP и серуми от здрави мъже и жени са използвани като отрицателни контроли. Данните са представени като брой протеинови молекули TMPRSS2-ERG.4. Cell lysates from the VCaP line were used as positive controls, cell lysates from the LNCaP line and sera from healthy men and women were used as negative controls. Data are presented as the number of TMPRSS2-ERG protein molecules.
5. При сравняване на данните за експресия на TMPRSS2-ERG протеин с тези за експресия на неговия транскрипт се установяват следните разлики. Напр. пациент № 33 е позитивен и при двата теста - ново разработеният кит за откриване на наличие на протеин TMPRSS2-ERG и конвенционалният метод RT- qPCR за откриване на наличие на TMPRSS2-ERG иРНК транскрипт (фигури 21,23).5. When comparing the expression data of TMPRSS2-ERG protein with those for expression of its transcript, the following differences are found. Eg. patient № 33 tested positive for both tests, the newly developed TMPRSS2-ERG protein detection kit and the conventional RT-qPCR method for detecting the TMPRSS2-ERG mRNA transcript (Figures 21,23).
6. Получените данни за позитивни за TMPRSS2-ERG иРНК, както при 1, така и при използването на праймерна двойка амплифицираща фузия тип 3 имат позитивни амплификационни криви (фигури 21, 23).6. The obtained TMPRSS2-ERG mRNA positive data in both 1 and the use of primer pair amplifying fusion type 3 have positive amplification curves (Figures 21, 23).
7. За разлика от този пациент, пациенти с № 31 и № 32 имат позитивна амплификация за TMPRSS2-ERG иРНК транскрипт, но са негативни при използване на кита за откриване на наличие на функционален протеинов TMPRSS2-ERG продукт (фигура 18).7. In contrast to this patient, patients with № 31 and № 32 had a positive amplification for the TMPRSS2-ERG mRNA transcript, but were negative when using the kit to detect the presence of a functional protein TMPRSS2-ERG product (Figure 18).
8. Тези разлики могат да се обяснят с наблюдаваните варианти между пациентите при анализа на техните дисоциационни криви в резултат на амплификацията на TMPRSS2-ERG иРНК с помощта на детектиращи две различни фузионни форми 1 и 3 праймерни двойки (фигури 22,24, 25). Пациент 31, има различни дисоциационни криви от тези на 32 и 33 при амплифициране на фузия тип 1 (фигура 22). Същите праймери амплифицират продукт при серумите на здравите жени и мъже контроли, който има по-голяма дължина и еднакъв температурен пик, но различен от този на пациентите с карцином. Кривите на пациент 32 и 33 имат еднакъв температурен пик.8. These differences can be explained by the variations observed between patients in the analysis of their dissociation curves as a result of the amplification of TMPRSS2-ERG mRNA using detecting two different fusion forms 1 and 3 primer pairs (Figures 22,24, 25). Patient 31 has different dissociation curves than those of 32 and 33 in type 1 fusion amplification (Figure 22). The same primers amplify a product in the sera of healthy women and control men that has a longer length and the same temperature peak, but different from that of cancer patients. Patient curves 32 and 33 have the same temperature peak.
9. Пациент 32 и 33 имат еднакъв температурен пик по рекомбинация тип 1, но имат различни температурни пикове по рекомбинация тип 3 (фигура 24) - дисоциационна крива с три пика, показваща леки промени в пикове 1 и 3 между пациент 31 и тези на пациент 33 - втория пик на пациент 33 е 68°С, докато този на пациент 32 е 71 °C (таблица 1).9. Patient 32 and 33 have the same type 1 recombination temperature peak but have different type 3 recombination temperature peaks (Figure 24) - a three-peak dissociation curve showing slight changes in peaks 1 and 3 between patient 31 and those of patient 33 - the second peak of patient 33 is 68 ° C, while that of patient 32 is 71 ° C (Table 1).
Откриването на по-малък брой пациенти позитивни за TMPRSS2-ERG функционален протеин позволява по-добра стратификация на пациентите и оптимизиране на терапията.The detection of a smaller number of patients positive for TMPRSS2-ERG functional protein allows better stratification of patients and optimization of therapy.
Таблица 1- Данни за пациенти от изследваната група, изследвани и за транскрипт на TMPRSS2ERG с помощта на RT-qPCR. Посочени са Ct на амплификационната крива и Тт на пирковете образувани от получените PCR продукти:Table 1- Data for patients from the study group, also examined for TMPRSS2ERG transcript using RT-qPCR. The Ct of the amplification curve and Tt of the peaks formed by the obtained PCR products are indicated:
BG 67180 BlBG 67180 Bl
Методът се прилага по следната технологична схема:The method is applied according to the following technological scheme:
1. Откриване на протеинови продукти от генна фузия, при която предварително подготвени разтворени в реакционен буфер антитяло-олигонуклеотиден конюгат 1 - специфично детектиращ TMPRSS2 и антитяло-олигонуклеотиден конюгат 2 - специфично детектиращ ERG и изследваната тестова проба, се накапват в 24/96/384/х-ямкова плака, инкубират се (в специфична последователност) за 2 h при стайна температура, подлагат се на предварително омрежване при + 37°С за 5 min и пълно омрежване с използване на qPCR апарат и последваща амплификация с помощта на оптимизиран qPCRDetection of gene fusion protein products in which pre-prepared antibody-oligonucleotide conjugate 1 - specifically detecting TMPRSS2 and antibody-oligonucleotide conjugate 2 - specifically detecting ERG dissolved in the reaction buffer and the test sample are added dropwise in 24/ / x-well plate, incubated (in a specific sequence) for 2 hours at room temperature, subjected to pre-crosslinking at + 37 ° C for 5 min and complete crosslinking using a qPCR apparatus and subsequent amplification using optimized qPCR
BG 67180 Bl протокол, като резултатите за Ст от амплификационните криви се експортират като структурирани данни (електронен файл) и се обработват с помощта на софтуер за регресионен анализ за определяне стойностите за протеинова експресия. Серийни разреждания на лизат от клетъчната линия ATCC VCaP служат като калибрационна проба и се използват за построяване на калибрационна крива.BG 67180 Bl protocol, the results for C m of the amplification curves are exported as structured data (electronic file) and processed using regression analysis software to determine the values for protein expression. Serial dilutions of lysate from the ATCC VCaP cell line serve as a calibration sample and are used to construct a calibration curve.
2. Подготовката на антитяло-олигонуклеотиден конюгат 1, посочен в т. 1, наименуван по-нататък като конюгирано антитяло 1 или само конюгат 1, детектиращ специфично TMPRSS2 се осъществява, чрез:2. The preparation of antibody-oligonucleotide conjugate 1, referred to in item 1, hereinafter referred to as conjugated antibody 1 or only conjugate 1, specifically detecting TMPRSS2 is carried out by:
2.1 Използва се антитяло 1, представляващо пречистен поливалентен (поликлонален) TMPRSS2специфичен имуноглобулин G (IgG) и разпознаващо епитопи с размер от 15-20 амино киселинни остатъци, съответстващ на остатъци до позиция 365 от молекулата на нативен TMPRSS2 (рефериран като антитяло 1).2.1. Antibody 1 is used, which is purified polyvalent (polyclonal) TMPRSS2-specific immunoglobulin G (IgG) and recognizes epitopes with a size of 15-20 amino acid residues corresponding to residues up to position 365 of the native TMPRSS2 molecule (referenced as an antibody).
2.2 Използва се общо стартово количество 10 pg от антитяло 1, което се пречиства през молекулноситова концентрационна колона (напр. Millipore или illustra MicroSpin G-50 Columns spin column, GE Healthcare), c цел подмяна на буфера в който е разтворено с PBS (Phosphate Buffered Saline изотоничен солеви буфер съдържащ натриев фосфат, натриев хлорид, калиев хлорид и калиев фосфат) и стандартизиране на концентрацията до 1 mg/ml. Буферът не трябва да съдържа първични амини, pH 7-9, оптимум pH 7. Напр. 25-50 μΐ антитяло се добавят към пре-еквилибрирана с PBS, pH 7 колона и последната се центрофугира на 3000 об/min за 2 min, докато е поставена в колекторна микро-епруветка. Събраното еквилибрирано антитяло се проверява за протеинова концентрация спектрофотометрично - 1 mg/ml протеин би трябвало да има приблизителна оптична плътност 1.4, при дължина на вълната 280 nm.2.2 A total starting amount of 10 pg of antibody 1 is used, which is purified through a molecular sieve concentration column (eg Millipore or illustra MicroSpin G-50 Columns spin column, GE Healthcare) to replace the buffer in which it is dissolved with PBS (Phosphate Buffered Saline isotonic salt buffer containing sodium phosphate, sodium chloride, potassium chloride and potassium phosphate) and standardization of the concentration to 1 mg / ml. The buffer should not contain primary amines, pH 7-9, optimum pH 7. Eg. 25-50 μΐ of antibody was added to a pre-equilibrated PBS, pH 7 column and the latter was centrifuged at 3000 rpm for 2 min while placed in a collector microtube. The collected equilibrated antibody is checked for protein concentration spectrophotometrically - 1 mg / ml protein should have an approximate optical density of 1.4, at a wavelength of 280 nm.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG111862A BG67180B1 (en) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Method and kit for detection of oncofusion protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG111862A BG67180B1 (en) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Method and kit for detection of oncofusion protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG111862A BG111862A (en) | 2016-05-31 |
| BG67180B1 true BG67180B1 (en) | 2020-10-30 |
Family
ID=56802015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG111862A BG67180B1 (en) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Method and kit for detection of oncofusion protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG67180B1 (en) |
-
2014
- 2014-11-20 BG BG111862A patent/BG67180B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG111862A (en) | 2016-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Somatic SF3B1 hotspot mutation in prolactinomas | |
| Yamada et al. | MiR‐96 and miR‐183 detection in urine serve as potential tumor markers of urothelial carcinoma: correlation with stage and grade, and comparison with urinary cytology | |
| US11279979B2 (en) | Method of determining PIK3CA mutational status in a sample | |
| Lin et al. | Overexpression of nuclear protein kinase CK2 α catalytic subunit (CK2α) as a poor prognosticator in human colorectal cancer | |
| Al‐Qatati et al. | Plasma micro RNA signature is associated with risk stratification in prostate cancer patients | |
| US20150218652A1 (en) | Methods for diagnosis and treatment of cancer | |
| EA037995B1 (en) | Biomarker panel for the detection of cancer | |
| CN106662543B (en) | Non-invasive genetic mutation testing in lung cancer patients | |
| US20100311815A1 (en) | Mir-101 cancer markers | |
| Lee et al. | Extensive lymphatic spread of papillary thyroid microcarcinoma is associated with an increase in expression of genes involved in epithelial‐mesenchymal transition and cancer stem cell‐like properties | |
| Yusenko et al. | Identifying CD82 (KAI1) as a marker for human chromophobe renal cell carcinoma | |
| US20080305493A1 (en) | Determining Cancer-Linked Genes and Therapeutic Targets Using Molecular Cytogenetic Methods | |
| Ge et al. | TP53I13 promotes metastasis in glioma via macrophages, neutrophils, and fibroblasts and is a potential prognostic biomarker | |
| Samir et al. | Competing endogenous RNA network crosstalk reveals novel molecular markers in colorectal cancer | |
| ES2906203T3 (en) | Novel CIP2A variant and uses thereof | |
| Zhao et al. | TWIST2: A new candidate tumor suppressor in prostate cancer | |
| Bujko et al. | Aberrant DNA methylation of alternative promoter of DLC1 isoform 1 in meningiomas | |
| Smit et al. | High‐resolution ERG‐expression profiling on G eneChip exon 1.0 ST arrays in primary and castration‐resistant prostate cancer | |
| CN101341256B (en) | Recurrent gene fusions in prostate cancer | |
| WO2011117586A1 (en) | Prognosis of oesophageal and gastro-oesophageal junctional cancer | |
| JPWO2015137406A1 (en) | A method for differential evaluation of squamous cell lung cancer and lung adenocarcinoma | |
| KR102384992B1 (en) | Age-specific biomarker of a patient with colorectal cancer and use thereof | |
| BG67180B1 (en) | Method and kit for detection of oncofusion protein | |
| WO2021198303A1 (en) | New method of prostate cancer diagnosis | |
| EP3757227A1 (en) | Cell-free chromatin immunoprecipitation (cfchip) as a measure of tumour gene expression in a sample |