BG67684B1 - METHOD FOR DETERMINING SERUM ALBUMIN AND HYPOALBUMINEMIA IN PATIENTS WITH COVID-19 THROUGH ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE - Google Patents
METHOD FOR DETERMINING SERUM ALBUMIN AND HYPOALBUMINEMIA IN PATIENTS WITH COVID-19 THROUGH ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE Download PDFInfo
- Publication number
- BG67684B1 BG67684B1 BG113543A BG11354322A BG67684B1 BG 67684 B1 BG67684 B1 BG 67684B1 BG 113543 A BG113543 A BG 113543A BG 11354322 A BG11354322 A BG 11354322A BG 67684 B1 BG67684 B1 BG 67684B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- serum
- hypoalbuminemia
- covid
- maleimido
- patients
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 208000003623 Hypoalbuminemia Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004435 EPR spectroscopy Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- HGNHBHXFYUYUIA-UHFFFAOYSA-N 3-maleimido-PROXYL Chemical group CC1(C)N([O])C(C)(C)CC1N1C(=O)C=CC1=O HGNHBHXFYUYUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 25
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 claims 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 abstract description 33
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical class ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 4
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- FRPHFZCDPYBUAU-UHFFFAOYSA-N Bromocresolgreen Chemical compound CC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C(=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 FRPHFZCDPYBUAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001362 electron spin resonance spectrum Methods 0.000 description 6
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 5
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 5
- XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-amino-4-(trifluoromethyl)-1,3-thiazole-5-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C=1SC(N)=NC=1C(F)(F)F XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000009504 familial dysalbuminemic hyperthyroxinemia Diseases 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- -1 nitroxides Chemical class 0.000 description 3
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 3
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 102000002572 Alpha-Globulins Human genes 0.000 description 2
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000000804 electron spin resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- RPAZYIOIDZRJOO-UHFFFAOYSA-N 16-DOXYL-stearic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC1(CC)OCC(C)(C)N1[O] RPAZYIOIDZRJOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RAOLMQDPNYDCEF-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-n-(1-$l^{1}-oxidanyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)acetamide Chemical compound CC1(C)CC(NC(=O)CBr)CC(C)(C)N1[O] RAOLMQDPNYDCEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYDZKXQLRMNQFK-UHFFFAOYSA-N 5-DOXYL-stearic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC1(CCCC(O)=O)OCC(C)(C)N1[O] PYDZKXQLRMNQFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 206010053172 Fatal outcomes Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010021137 Hypovolaemia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 1
- 206010041277 Sodium retention Diseases 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008698 baroreceptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002016 colloidosmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108010004903 glycosylated serum albumin Proteins 0.000 description 1
- FHBSGPWHCCIQPG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-methyl-oxo-sulfanylidene-$l^{6}-sulfane Chemical compound CS(S)(=O)=O FHBSGPWHCCIQPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- STZCRXQWRGQSJD-GEEYTBSJSA-M methyl orange Chemical compound [Na+].C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 STZCRXQWRGQSJD-GEEYTBSJSA-M 0.000 description 1
- 229940012189 methyl orange Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 210000001774 pressoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 208000037921 secondary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5002—Partitioning blood components
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Методът намира приложение при изследване на промени в нивата на серумен албумин и състояния на хипоалбуминемия, които се смятат за отличителен маркер на тежко протичаща и фатална коронавирусна инфекция или са белег на усложнения при различни заболявания. Предложеният протокол, може да бъде прилаган и въведен в медицинската диагностика, като метод за определяне на нивата на серумен албумин в биохимичните лаборатории, при заболявания, които се характеризират с промени в нивата на серумен албумин и хиполабуминемия, вкл. при пациенти с COVID-19. ЕПР спектроскопията в комбинирация с 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (3-Maleimido-PROXYL, 5-MSL) представлява високоспецифичен и високочувствителен метод, приложим при изследване на протеиновата структура на албумин, нейната динамика, измерване на концентрацията на албумин в серумни проби на пациенти с COVID-19 за поставяне на диагноза - хипоалбуминемия и включва пет етапа: Етап 1) Извършване на венипункция по стандартен протокол - вземане на венозна кръв в епруветка от затворената система (вакуумна епруветка за серум/с червена капачка); Етап 2) Центрофугиране на кръвните проби за отделяне на серум; Етап 3) Отделяне на серум и преместването му в система епендрорф; Етап 4) Инкубиране на серумните проби с разтвор на нитроксидният радикал 3-Maleimido-PROXYL; Етап 5) Поставяне на тестовата проба в ЕПР-микрокапилярка и стартиране на ЕПР измерването, обработка и анализ на данните.The method is used in the study of changes in serum albumin levels and states of hypoalbuminemia, which are considered a distinctive marker of severe and fatal coronavirus infection or are a sign of complications in various diseases. The proposed protocol can be applied and introduced into medical diagnostics as a method for determining serum albumin levels in biochemical laboratories in diseases characterized by changes in serum albumin levels and hypoalbuminemia, including in patients with COVID-19. EPR spectroscopy in combination with 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (3-Maleimido-PROXYL, 5-MSL) is a highly specific and highly sensitive method applicable to the study of the protein structure of albumin, its dynamics, measurement of albumin concentration in serum samples of patients with COVID-19 for diagnosis - hypoalbuminemia and includes five stages: Stage 1) Performing venipuncture according to a standard protocol - taking venous blood into a tube from the closed system (vacuum tube for serum/with a red cap); Stage 2) Centrifugation of blood samples to separate serum; Stage 3) Separation of serum and its transfer to an Eppendorf system; Stage 4) Incubation of serum samples with a solution of the nitroxide radical 3-Maleimido-PROXYL; Step 5) Place the test sample in the EPR microcapillary and start the EPR measurement, data processing and analysis.
Description
Област на техникатаField of technology
Настоящото изобретение се отнася до метод за определяне на серумен албумин чрез електронен парамагнитен резонанс (EPR), използвайки спиново маркиране на протеинови структури с парамагнитни нитроксиди, с приложение при диагностика на хипоалбуминемия, включително COVID 19-индуцирана и други патологични състояния.The present invention relates to a method for determining serum albumin by electron paramagnetic resonance (EPR) using spin labeling of protein structures with paramagnetic nitroxides, with application in the diagnosis of hypoalbuminemia, including COVID 19-induced and other pathological conditions.
Предшестващо състояние на техникатаPrior art
Човешкият серумен албумин е най-разпространеният транспортен протеин в кръвната плазма, който отговаря за обратимо свързване на множество ендогенни и екзогенни съединения. Той притежава висок общ капацитет на свързване и се характеризира, като основен транспортер на неутрални липофилни и киселинни лекарствени форми, и поддържа колоидно-осмотичното налягане (Raoufinia, R et al., 2016). При ниски нива на албумин се нарушава осмозата и се наблюдава изместване на течности от интраваскуларното към интерстициалното пространство, което от своя страна активира барорецепторите и благоприятства задържането на натрий и вода (Arques, S. and Ambrosi, Р., 2011).Human serum albumin is the most abundant transport protein in blood plasma, responsible for the reversible binding of a wide range of endogenous and exogenous compounds. It has a high total binding capacity and is characterized as the main transporter of neutral lipophilic and acidic drug forms, and maintains colloid-osmotic pressure (Raoufinia, R et al., 2016). At low albumin levels, osmosis is impaired and fluid shifts from the intravascular to the interstitial space are observed, which in turn activates baroreceptors and favors sodium and water retention (Arques, S. and Ambrosi, P., 2011).
Нива на серумен албумин под 35g/L, обикновено са в резултат на различни вродени (бизалбуминемия) (Chhabra, S et al., 2013) или придобити патологични състояния (хипоалбуминемия), дължащи се включително и на качествени промени в микрохетерогенността на албумина, като окислен албумин и гликоалбумин (Watanabe A et al., 2004).Serum albumin levels below 35g/L are usually the result of various congenital (bisalbuminemia) (Chhabra, S et al., 2013) or acquired pathological conditions (hypoalbuminemia), including qualitative changes in albumin microheterogeneity, such as oxidized albumin and glycoalbumin (Watanabe A et al., 2004).
Към момента съществуват различни методи за определяне нивата на серумен албумин, които представляват част от рутинните клинични и биохимични лабораторни анализи (Soeters, Р.В et al., 2019). По своята същност представляват спектрофотометрични методи и включват използването на специфични багрила. Понастоящем, методите за измерване на серумен албумин се основават на измерване на абсорбцията на комплекса протеин-багрило, при определена дължина на вълната и преминават през предварителна пробоподготовка. Стандартните спектрофотометрични анализи, включват използване на индикаторни багрила бромокрезолово лилаво, бромофенолово синьо и бромокрезолово зелено. Известните методи (виж. Патент ЕР 0414935 А1) изискват поддържане на относително тесен pH диапазон, което налага използването на допълнителни реактиви за поддържането му. Друг недостатък на спектрофотометричните методи за анализ на албумин (патент: G01N33/6839) е, че използваните индикаторни багрила не са изключително специфични по отношение на свързването с протеина, тъй като могат да се свържат с редица други интерфериращи протеини, например глобулините. Това може да доведе до неточен анализ, поради недостатъчната специфичност на багрилото към албумина. За да се подобри определянето на концентрацията на протеини (общ анализ на протеини) в тестовата проба, някой методи включват реагентна система с две индикаторни багрила (например бромофенол синьо и метилово оранжево), без да изключва използването на подходящ буфер (патент: ЕР 0361244 А2), което оскъпява анализа.Currently, there are various methods for determining serum albumin levels, which are part of routine clinical and biochemical laboratory analyses (Soeters, P.B. et al., 2019). They are essentially spectrophotometric methods and involve the use of specific dyes. Currently, methods for measuring serum albumin are based on measuring the absorption of the protein-dye complex at a specific wavelength and undergo preliminary sample preparation. Standard spectrophotometric analyses involve the use of indicator dyes bromocresol purple, bromophenol blue and bromocresol green. Known methods (see. Patent EP 0414935 A1) require maintaining a relatively narrow pH range, which necessitates the use of additional reagents to maintain it. Another disadvantage of spectrophotometric methods for albumin analysis (patent: G01N33/6839) is that the indicator dyes used are not highly specific in terms of protein binding, as they can bind to a number of other interfering proteins, e.g. globulins. This can lead to inaccurate analysis due to insufficient specificity of the dye for albumin. In order to improve the determination of the protein concentration (total protein analysis) in the test sample, some methods include a reagent system with two indicator dyes (e.g. bromophenol blue and methyl orange), without excluding the use of a suitable buffer (patent: EP 0361244 A2), which increases the cost of the analysis.
Често използваните багрила, като бромкрезолово зелено (BCG) и бромкрезолово лилаво (ВСР), се характеризират и с различен диапазон на аналитично отчитане 38-53 g/L за BCG и 36-51 g/L за ВСР.Commonly used dyes, such as bromocresol green (BCG) and bromocresol purple (BCP), are also characterized by a different analytical reading range of 38-53 g/L for BCG and 36-51 g/L for BCP.
Недостатък на тези методи е, че се наблюдава голям коефициент на вариация, което се дължи на липсата на единен стандарт за реактиви и апаратура в различните лаборатории. Също така, при някои заболявания като хипертония, диабетна нефропатия, чернодробна цироза и др., тези вариации създават предпоставка за неточно измерване на малки отклонения в серумния албумин, които са особено определящи при патофизиологична оценка на болестното състояние и могат да отложат стартиране на лечение, да влошат общото състояние на организма и да доведат до летален изход. Друг недостатък е, че се наблюдават и концентрационни ограничения. В зависимост от конвенционалният метод, при предварителната обработка на пробата, може да настъпи загуба на част от количество албумин.A disadvantage of these methods is that a large coefficient of variation is observed, which is due to the lack of a single standard for reagents and equipment in different laboratories. Also, in some diseases such as hypertension, diabetic nephropathy, liver cirrhosis, etc., these variations create a prerequisite for inaccurate measurement of small deviations in serum albumin, which are particularly decisive in the pathophysiological assessment of the disease state and can delay the start of treatment, worsen the general condition of the body and lead to a lethal outcome. Another disadvantage is that concentration limitations are also observed. Depending on the conventional method, during the pre-treatment of the sample, a loss of part of the amount of albumin may occur.
При клинични състояния, характеризиращи се с високи концентрации на серумни глобулини (> 39 g/L), недостатък на BCG методите е появяване на фалшиво положителни резултати, поради образуване на комплекс, не само между багрилото и албумина, но и с високо-реактивния α-2-макроглобулин. В случай на нефротичен синдром, BCG методите не се препоръчват. Наличието на а и β глобулините в пробите, пречат на измерването на албумина, поради лесното им свързване с багрилото и това води до положителни грешки и допринася за слабата специфичност на метода.In clinical conditions characterized by high serum globulin concentrations (> 39 g/L), a disadvantage of BCG methods is the occurrence of false positive results due to complex formation not only between the dye and albumin, but also with the highly reactive α-2-macroglobulin. In the case of nephrotic syndrome, BCG methods are not recommended. The presence of α and β globulins in the samples interfere with the measurement of albumin, due to their easy binding to the dye, and this leads to positive errors and contributes to the poor specificity of the method.
Известни до сега патенти, предложени във връзка с изследване на физиологично важни макромолекули (патент: ЕР 0714407 В1), които включват използването на стабилни нитроксидни радикали (вкл. 3Maleimido-PROXYL) като спин маркери, са насочени главно към белязане на хемоглобин с нитроксид (патент: WO 1996029974 А2). In vivo активната форма на радикала позволява приложение на този клас съединения при разработване на кръвни заместители с кислород детоксикираща функция, имитираща тази на червените кръвни клетки. Патентите представят ковалентно свързване на 4-(2-Bromoacetamido)-TEMPO и З-Maleimido-PROXYL към омрежен човешки хемоглобин и описват синтеза на нитроксид - белязани физиологично съвместими форми на хемоглобина. Също така разглеждат влиянието на нитроксидите върху хода на редокс-реакции с инициатор супероксид анион радикал. Недостатък на тези методи е, че включват допълнителна обработка по изолиране на хемоглобин и не се използват, като диагностичен анализ при изследване на ниски нива на протеини при вирусни инфекции и/или COVID-19.Known patents proposed in connection with the study of physiologically important macromolecules (patent: EP 0714407 B1), which include the use of stable nitroxide radicals (incl. 3Maleimido-PROXYL) as spin labels, are mainly aimed at labeling hemoglobin with nitroxide (patent: WO 1996029974 A2). The in vivo active form of the radical allows the application of this class of compounds in the development of blood substitutes with oxygen detoxification function, mimicking that of red blood cells. The patents present covalent binding of 4-(2-Bromoacetamido)-TEMPO and 3-Maleimido-PROXYL to cross-linked human hemoglobin and describe the synthesis of nitroxide - labeled physiologically compatible forms of hemoglobin. They also consider the influence of nitroxides on the course of redox reactions with the initiator superoxide anion radical. A disadvantage of these methods is that they involve additional processing to isolate hemoglobin and are not used as a diagnostic assay for testing low protein levels in viral infections and/or COVID-19.
При пациенти с COVID-19, нивата на хемоглобин обикновено са в норма или се наблюдава лека анемия (Hariyanto, Т. L; Kumiawan, А, 2020: Bergamaschi, G et al., 2021). Редица проучвания докладват висок процент на хипоалбуминемия, като физиологично ниските нива на албумин са един от основните маркери на тежко протичане на заболяването и са основание за разработването на диагностичен метод, с участието на нитроксидни радикали като спин детектори на COVID-индуцирана хипоалбуминемия (Huang, J et al., 2020).In patients with COVID-19, hemoglobin levels are usually normal or mild anemia is observed (Hariyanto, T. L; Kumiawan, A, 2020: Bergamaschi, G et al., 2021). A number of studies report a high rate of hypoalbuminemia, with physiologically low albumin levels being one of the main markers of severe disease and are the basis for the development of a diagnostic method involving nitroxide radicals as spin detectors of COVID-induced hypoalbuminemia (Huang, J et al., 2020).
Ниски нива на албумин, съчетани с огромни загуби на течности поради треска, предизвикват тежка хиповолемия и шок, които са често наблюдавани при пациенти с COVID-19, особено в критично състояние (Ramadori G, 2020). Едновременно с това, хипоалбуминемията при COVID-19 представлява вторично болестно състояние и създава предпоставка за намаляване ефективността на лечението и увеличаване вероятността от летален изход. При SARS-CoV-2 инфекция, навременното приложение на албумин, е от изключителна важност за провеждане на адекватно лечение, особено при пациенти в критично състояние, които са диагностицирани с ниски нива на албумин. В острата фаза на заболяването, албуминът играе ролята на антиоксидант. В условие на цитокинова буря и оксидативен стрес, генерирането на абнормални нива на свободни радикали могат да доведат до необратимо окисление на протеина, намаляване на неговата серумна концентрация и последващо увреждане на клетки, тъкани и органи. Клинични изследвания, показват, че високите нива на оксидативен стрес, в комбинация с хипоалбуминемия, повишават риска от смъртност при пациенти с COVID-19 (Belinskaia, D. A et al., 2021). До този момент, в литературата няма докладван случай на приложение на З-Melaimido-PROXYL и ЕПР спектроскопия, при изследване на албумин и хипоалбуминемия на пациенти с COVID-19.Low albumin levels, combined with massive fluid losses due to fever, cause severe hypovolemia and shock, which are often observed in patients with COVID-19, especially in critical condition (Ramadori G, 2020). At the same time, hypoalbuminemia in COVID-19 is a secondary disease state and creates a prerequisite for reducing the effectiveness of treatment and increasing the likelihood of a fatal outcome. In SARS-CoV-2 infection, timely administration of albumin is of utmost importance for adequate treatment, especially in critically ill patients who are diagnosed with low albumin levels. In the acute phase of the disease, albumin plays the role of an antioxidant. Under conditions of cytokine storm and oxidative stress, the generation of abnormal levels of free radicals can lead to irreversible oxidation of the protein, a decrease in its serum concentration and subsequent damage to cells, tissues and organs. Clinical studies have shown that high levels of oxidative stress, in combination with hypoalbuminemia, increase the risk of mortality in patients with COVID-19 (Belinskaia, D. A et al., 2021). To date, there is no reported case in the literature of the use of 3-Melaimido-PROXYL and EPR spectroscopy in the study of albumin and hypoalbuminemia in patients with COVID-19.
Предложеният от нас метод, служи за диагностика на състоянието „хипоалбуминемия“ в човешки серумни проби, с Електрон парамагнитен резонас спектроскопия и нитроксидният радикал 3-MelaimidoPROXYL, като това специфично медицинско състояние, към този момент се определя с не дотам точни клинично-лабораторно-диагностични спектрофотометрични методи.The method we propose serves to diagnose the condition "hypoalbuminemia" in human serum samples, with Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy and the nitroxide radical 3-MelaimidoPROXYL, as this specific medical condition is currently determined with not very accurate clinical-laboratory-diagnostic spectrophotometric methods.
В научна статия, озаглавена „Exploring the pH-Induced Functional Phase Space of Human Serum Albumin by EPR Spectroscopy“ (Йорг Райхенвалнер и др.), е изследван човешки серумен албумин (HSA) чрез спиново сондиране с помощта на парамагнитни лиганди (5-DSA и 16-DSA) и спиново маркиране с 3-MaleimidoPROXYL в диапазон на pH от 0,7 до 12,9. Основната цел на авторите е да разгледат рН-индуцираните промени във функционалното фазово пространство на HSA, като провеждат моделни експерименти, при които денатурацията на албумина е обратима чрез корекция на pH. Експериментът е подходящ само за in vitro модели и включва разгъване на албуминовата молекула, позволявайки спиново сондиране в условия извън физиологични стойности на pH. Цитираният документ не е насочен към клинична диагностика на пациенти с COVID-19, използвайки реални серумни проби, което поставя възможност на нитроксидният радикал З-Melaimido-PROXYL и потенциалът му на приложение в медицинската диагностика и биохимичният скрийнинг, по-време и след коронавирусна инфекция. Наличните до този момент научни статии и патенти, не са свързани с разработване на метод за анализ на хипоалбуминемия при пациенти с COVID-19.In a scientific article entitled “Exploring the pH-Induced Functional Phase Space of Human Serum Albumin by EPR Spectroscopy” (Jörg Reichenwallner et al.), human serum albumin (HSA) was investigated by spin probing using paramagnetic ligands (5-DSA and 16-DSA) and spin labeling with 3-MaleimidoPROXYL in a pH range from 0.7 to 12.9. The main goal of the authors was to examine pH-induced changes in the functional phase space of HSA by conducting model experiments in which albumin denaturation is reversible by pH adjustment. The experiment is only suitable for in vitro models and involves unfolding the albumin molecule, allowing spin probing in conditions outside physiological pH values. The cited document is not aimed at clinical diagnosis of COVID-19 patients using real serum samples, which raises the possibility of the nitroxide radical 3-Melaimido-PROXYL and its potential for application in medical diagnostics and biochemical screening, during and after coronavirus infection. The scientific articles and patents available to date are not related to the development of a method for analyzing hypoalbuminemia in COVID-19 patients.
Техническа същност на изобретениетоTechnical essence of the invention
Настоящото изобретение се отнася до метод за определяне на серумен албумин и хипоалбуминемия при пациенти с COVID-19 чрез електронен парамагнитен резонанс използвайки стабилният нитроксиден радикал 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-l-pyrrolidinyloxy (3-Maleimido-PROXYL, 5-MSL) и неговите аналози, при изследване на ротационната подвижност на радикала, в присъствие на албумин и цели определяне на хиполабуминемия при пациенти с SARS-Cov-2 инфекция (COVID-19) или други вродени и патологични изменения, характеризиращи се със стойности на серумен албумин извън референтния диапазон 35-52 g/L.The present invention relates to a method for determining serum albumin and hypoalbuminemia in patients with COVID-19 by electron paramagnetic resonance using the stable nitroxide radical 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-l-pyrrolidinyloxy (3-Maleimido-PROXYL, 5-MSL) and its analogues, when studying the rotational mobility of the radical, in the presence of albumin and aims to determine hypoalbuminemia in patients with SARS-Cov-2 infection (COVID-19) or other congenital and pathological changes, characterized by serum albumin values outside the reference range 35-52 g/L.
По-специално, настоящото изобретение се състои в спектроскопски метод, базиран на електрон парамагнитен резонанс спектроскопия (ЕПР/EPR) и нитроксиднният спин-детектор 3-Maleimido-PROXYL и се характеризира със следните етапи:In particular, the present invention consists of a spectroscopic method based on electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) and the nitroxide spin detector 3-Maleimido-PROXYL and is characterized by the following steps:
А) венипункция, чрез вземане на венозна кръв в епруветка от затворената система;A) venipuncture, by taking venous blood into a tube from the closed system;
Б) инверсиране и престой на пробата 60 min;B) inversion and sample residence time 60 min;
В) центрофугиране на пробата в продължение на 15 min при 3000 грш за отделяне на кръвен серум;C) centrifugation of the sample for 15 min at 3000 rpm to separate blood serum;
Е) прехвърляне на кръвния серум в система епендорф с обем 2 ml;E) transfer of blood serum into an Eppendorf system with a volume of 2 ml;
Д) приготвяне на реактиви и подготовка на проби за анализ, където:E) preparation of reagents and preparation of samples for analysis, where:
- Реактивът се приготвя чрез разтваряне на З-Maleimido-PROXYL в диметил сулфоксид (DMSO) до достигане на работна концентрация от 200 μΜ:- The reagent is prepared by dissolving 3-Maleimido-PROXYL in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a working concentration of 200 μΜ:
- Смесване на реактива с тестова проба;- Mixing the reagent with a test sample;
- Инкубиране на сместа от реактив с тестовата проба при температура от 20°С до 24°С за 30 min;- Incubate the reagent mixture with the test sample at a temperature of 20°C to 24°C for 30 min;
- Анализ на сместа от реактив с тестовата проба чрез електронен парамагнитен резонанс;- Analysis of the mixture of reagent with the test sample by electron paramagnetic resonance;
Важна характеристика на настоящото изобретение, е че тестовата проба е от пациент с установен COVID-19.An important feature of the present invention is that the test sample is from a patient with confirmed COVID-19.
Друг аспект на настоящия метод е, че реактивът от 3-Maleimido-PROXYL в диметил сулфоксид (DMSO) се добавя към 450 μΐ тестова проба чрез вариабелна пипета в количество от 50 μΐ и се разбърква в продължение на 5 s.Another aspect of the present method is that the reagent of 3-Maleimido-PROXYL in dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to 450 μΐ test sample via a variable pipette in an amount of 50 μΐ and mixed for 5 s.
След прилагане на горните стъпки на метода се пристъпва към анализ на спектралните ЕПР параметри на нитроксида, и се предоставя информация за нивата на серумния албумин:After applying the above steps of the method, the spectral EPR parameters of nitroxide are analyzed, and information about serum albumin levels is provided:
• при COVID-19 пациенти, с ниски концентрации на протеина (хипоалбуминемия, албумин < 35 g/L), се отчита свободна ротация на нитроксида;• in COVID-19 patients with low protein concentrations (hypoalbuminemia, albumin < 35 g/L), free rotation of nitroxide is reported;
• при здрави хора, с нива на серумен албумин в референтни граници 35-52 g/L, се отчита затруднена ротация на спин-етикета спрямо приложеното магнитно поле.• in healthy people, with serum albumin levels within the reference range of 35-52 g/L, difficulty in rotating the spin label relative to the applied magnetic field is reported.
За да бъде изучена динамиката на албумина при COVID-индуцирана хипоалбуминемия, спин-етикета трябва да има стабилна парамагнитна част, да включва функционална група, способна селективно да реагира със специфична аминокиселина, без да нарушава структурата й, и да бъде чувствителна към преориентацията на албумина. В зависимост от структура на макромолекулите и свойствата на локалната среда, методът трябва включва използването на специфични спин-етикети, отговарящи на тези условия като 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-l-pyrrolidinyloxy (3-Maleimido-PROXYL, 5-MSL), 2,2,5,5-tetramethyl-1-oxyl3-methyl methanethiosulfonate (MTSL), бифункционални производни и др. ЕПР спектроскопският анализ с използване на спин-етикета З-Maleimido-PROXYL, позволява проследяване на конформационни промени в молекулата на албумина, по силата на които се определя концентрацията на протеина.To study the dynamics of albumin in COVID-induced hypoalbuminemia, the spin label must have a stable paramagnetic moiety, include a functional group capable of selectively reacting with a specific amino acid without disrupting its structure, and be sensitive to albumin reorientation. Depending on the structure of the macromolecules and the properties of the local environment, the method should include the use of specific spin labels that meet these conditions, such as 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-l-pyrrolidinyloxy (3-Maleimido-PROXYL, 5-MSL), 2,2,5,5-tetramethyl-1-oxyl3-methyl methanethiosulfonate (MTSL), bifunctional derivatives, etc. EPR spectroscopic analysis using the 3-Maleimido-PROXYL spin label allows for the monitoring of conformational changes in the albumin molecule, by virtue of which the protein concentration is determined.
В резултат на свободно въртене на З-Maleimido-PROXYL в разтворител (Dimethyl Sulfoxide, DMSO) се наблюдават три остри и тясно разположени спектрални линии, които са с почти идентична ширина и приблизително еднакъв интензитет (контрола радикал-разтворител, С1). При здрави хора (контрола, С2), следва да се наблюдават промени в спектралните параметри на спин-етикета, които са в резултат на локализиране на нитроксида в протеиновата молекула и водят до намаляване на подвижността му спрямо приложеното магнитно поле.As a result of free rotation of 3-Maleimido-PROXYL in a solvent (Dimethyl Sulfoxide, DMSO), three sharp and closely spaced spectral lines are observed, which are of almost identical width and approximately equal intensity (radical-solvent control, C1). In healthy people (control, C2), changes in the spectral parameters of the spin label should be observed, which are a result of localization of the nitroxide in the protein molecule and lead to a decrease in its mobility relative to the applied magnetic field.
При нива на серумен албумин над > 35 g/L, стойностите на Hmax and ΔΗ0 и промяната в EPR спектъра на нитроксида, спрямо тези на 3-Maleimido-PROXYL/pa3TBopHTen, ще се дължат на висока степен на специфичност и свързване на радикала към албумина. В резултат на свързване на нитроксида към протеина се възпрепятства неговата ротация, което се изразява в промяна на спектралните параметри в сравнение с тези на 3-Maleirniclo-PPOX YL/разтворител. където няма наличен албумин. Обратно, при концентрации на протеина, по-малки от < 35 g/L характерни за пациенти с COVID-19, ще се наблюдават слаби изменения в стойностите на Hmax and ΔΗ0, като данните са съизмерими с тези на контролата 3-MaleimidoPROXYL/разтворител. В резултат на хипоалбуминемия при пациенти с COVID-19 и свободна ротация на спин-етикетът, параметрите Hmax and ΔΗ0 ще бъдат еднакви по стойност с тези на 3-MaleimidoPROXYL/разтворител.At serum albumin levels above > 35 g/L, the H max and ΔH 0 values and the change in the EPR spectrum of nitroxide, compared to those of 3-Maleimido-PROXYL/pa3TBopHTen, will be due to a high degree of specificity and binding of the radical to albumin. As a result of binding of nitroxide to the protein, its rotation is hindered, which is expressed in a change in the spectral parameters compared to those of 3-Maleirniclo-PPOX YL/solvent. where no albumin is present. Conversely, at protein concentrations less than < 35 g/L typical of patients with COVID-19, slight changes in the H max and ΔH 0 values will be observed, and the data are comparable to those of the 3-MaleimidoPROXYL/solvent control. As a result of hypoalbuminemia in patients with COVID-19 and free rotation of the spin label, the parameters H ma x and ΔH 0 will be the same in value as those of 3-MaleimidoPROXYL/solvent.
Пояснение на приложените фигуриExplanation of the attached figures
На фигура 1 е показан методичен и експериментален протокол за изследване на серумни нива на албумин и хипоалбуминемия, съгласно изобретението;Figure 1 shows a methodological and experimental protocol for testing serum albumin levels and hypoalbuminemia, according to the invention;
На фигура 2А е показан EPR спектър с контролата радикал/разтворител;Figure 2A shows an EPR spectrum with the radical/solvent control;
На фигура 2В е показан EPR спектър на ограничена ротационна подвижност на 3-Maleimido-PROXYL;Figure 2B shows the EPR spectrum of the restricted rotational mobility of 3-Maleimido-PROXYL;
На фигура 2С е показан EPR спектър на серумен албумин по нисък от 35 g/L, където ротацията на спинетикета е свободи.Figure 2C shows the EPR spectrum of serum albumin below 35 g/L, where the spin label rotation is free.
Примери за изпълнения на изобретениетоExamples of embodiments of the invention
Методът включва използването на стандартен X-Band EPR спектрофотометър и е разделен на пет етапа (Фигура 1):The method involves the use of a standard X-Band EPR spectrophotometer and is divided into five steps (Figure 1):
Етап 1: Извършване на венипункция по стандартен протокол - вземане на венозна кръв в епруветка от затворената система (епруветка за серум).Stage 1: Performing venipuncture according to a standard protocol - taking venous blood into a tube from the closed system (serum tube).
Етап 2: Центрофугиране на кръвните проби за отделяне на серум.Step 2: Centrifugation of blood samples to separate serum.
Етап 3: Отделяне на серум и преместването му в система епендрорф.Step 3: Separation of serum and transfer to an Eppendorf system.
Етап 4: Инкубиране на серумните проби с разтвор на нитроксидният радикал 3-Maleimido-PROXYL.Step 4: Incubation of serum samples with a solution of the nitroxide radical 3-Maleimido-PROXYL.
Етап 5: Поставяне на тестовата проба в ЕПР-микрокапилярка и стартиране на ЕПР измерването, обработка и анализ на данните.Step 5: Placing the test sample in the EPR microcapillary and starting the EPR measurement, processing and analysis of the data.
Определяне нива на серумен албумин - общ EPR протокол за подготовка и анализ на пробите.Determination of serum albumin levels - general EPR protocol for sample preparation and analysis.
Етап 1:Stage 1:
Провежда се стандартна процедура за вземане на венозна кръв, която включва протокол за венипункция при използване на Clot Activator вкуумни епруветки за кръвен серум (РЕТ вакутейнер с червена капачка). От всеки пациент се вземат 4 ml венозна кръв. Веднага след венипункцията, епруветките внимателно се инверсират (10 х), за да се осигури правилното размесване клот активатора с пробата и ускоряване процеса на кръвосъсирване. Пробите се оставят да престоят 60 min преди да се центрофугират.A standard venous blood collection procedure is performed, which includes a venipuncture protocol using Clot Activator vacuum serum tubes (PET vacutainer with red cap). 4 ml of venous blood is collected from each patient. Immediately after venipuncture, the tubes are carefully inverted (10 x) to ensure proper mixing of the clot activator with the sample and to accelerate the blood clotting process. The samples are allowed to stand for 60 min before centrifugation.
Етап 2 и 3:Stage 2 and 3:
Кръвните проби се центрофугират за 15 min и 3000 rpm, след което се отделя кръвният серум и се прехвърля в система епендорф с обем 2 ml.Blood samples are centrifuged for 15 min and 3000 rpm, after which the blood serum is separated and transferred to an Eppendorf system with a volume of 2 ml.
Етап 4:Stage 4:
4.1. Приготвя се разтвор с работна концентрация 200 μΜ на 3-Maleimido-PROXYL в разтворител диметил сулфоксид (DMSO) (S1).4.1. Prepare a solution with a working concentration of 200 μΜ of 3-Maleimido-PROXYL in dimethyl sulfoxide (DMSO) solvent (S1).
4.2. Подготовка на пробите за анализ: чрез вариабълна пипета се вземат 50 μΐ от разтвор S1 и се добавят към 450 μΐ тестова проба Pl, (Р1, проба на пациент с COVID-19 или друго заболяване, характеризиращо се с ниски нива на албумин и хипоалбуминемия).4.2. Preparation of samples for analysis: using a variable pipette, take 50 μΐ of solution S1 and add to 450 μΐ of test sample Pl, (P1, sample from a patient with COVID-19 or another disease characterized by low albumin levels and hypoalbuminemia).
4.3. Серумните проби се инкубират при температура (20-24°С) с 3-Maleimido-PROXYL за 30 min, след което се стартира анализът. Етапът включва разбъркване на тестови проби с Vortex за 5 s, веднага след смесването на S1 и Р1 и непосредствено преди стартиране на измерването.4.3. Serum samples are incubated at room temperature (20-24°C) with 3-Maleimido-PROXYL for 30 min, after which the analysis is started. The step involves mixing test samples with a Vortex for 5 s, immediately after mixing S1 and P1 and immediately before starting the measurement.
Етап 5:Stage 5:
Пробите се инкубират в продължение на 30 min при стайна температура, след което се стартира ЕПР измерването при параметри: Microwave Frequency: 9,846 GHz, Microwave Power: l,290e + 001 mW, Modulation Frequency: 100.000 kHz, Center Field: 3510.00 G; Sweep Width: 100.00 G; Sweep Time: 82.9 s; Time constant: 327.680 ms, Signal Phase: 180.0 deg, брой сканирания: 2. Анализът на пробите се провежда със Xband EMXmicro спектрометър (Брюкер, Германия), оборудван със стандартен резонатор. Изследваната проба се поставя в кварцови капиляри, които се запечатват и поставят в стандартна EPR кварцова тръба (i.d. 3 mm), която се фиксира в кухината на ЕПР спектрометъра. Стартира се измерването, като анализът на всяка проба се провежда при три повторения. Спектралната обработка се извършва с помощта на софтуерни програми Bruker WIN-EPR и SimFonia.The samples were incubated for 30 min at room temperature, after which the EPR measurement was started with the following parameters: Microwave Frequency: 9.846 GHz, Microwave Power: l.290e + 001 mW, Modulation Frequency: 100.000 kHz, Center Field: 3510.00 G; Sweep Width: 100.00 G; Sweep Time: 82.9 s; Time constant: 327.680 ms, Signal Phase: 180.0 deg, number of scans: 2. The analysis of the samples was carried out with an Xband EMXmicro spectrometer (Bruker, Germany), equipped with a standard resonator. The sample under study was placed in quartz capillaries, which were sealed and placed in a standard EPR quartz tube (i.d. 3 mm), which was fixed in the cavity of the EPR spectrometer. The measurement was started, and the analysis of each sample was carried out in three repetitions. Spectral processing was performed using Bruker WIN-EPR and SimFonia software programs.
Анализът на EPR спектрите, се извършва след маркиране на цистеиновите остатъци, като се анализират константите на свръх-финно разцепване Нтах измерено от външните пикове а и с и ΔΗ0 - централна резонансна линия (Ъ), в ЕПР спектъра на нитроксида, които показват степента на инверсия на радикала и са маркер за мобилността му. При физиологично съвместими нива на албумин, каквито се наблюдават при здрави хора, ротационната подвижност на 3 -Maleimido-PROXYL е ограничена (Фигура 2В), докато при серумен албумин по нисък от 35 g/L, ротацията на спин-етикета е свободна (Фигура 2С), а измерените параметри са еднакви по-стойност с контролата радикал/разтворител (Фигура 2А).The analysis of the EPR spectra is performed after labeling the cysteine residues by analyzing the hyperfine splitting constants H t a x measured from the outer peaks a and c and the ΔH 0 - central resonance line (B), in the EPR spectrum of nitroxide, which indicate the degree of inversion of the radical and are a marker for its mobility. At physiologically compatible albumin levels, as observed in healthy humans, the rotational mobility of 3 -Maleimido-PROXYL is limited (Figure 2B), while at serum albumin levels lower than 35 g/L, the rotation of the spin label is free (Figure 2C), and the measured parameters are the same in value as the radical/solvent control (Figure 2A).
Стойности на ΔΗ0 = 1,66 G и Нтах = 30 G са характерни за контролата 3-Maleimido-PROXYL в разтворител DMSO (контролна проба без албумин). При проби на пациенти, при които не се наблюдава хипоалбуминемия с нива на серумен албумин в норма (35-52 g/L), отчетените стойности на ΔΗ0 = 3,6 G и Нтах = 60 = 62G. При пациенти с COVID-19 обусловена хипоалбуминемия, стойностите на ΔΗ° = 1,66 = 1,75 G и Нтах = 30 -.32 G, са съизмерими с тези на контролата 3-Maleimido-PROXYL в разтворител DMSO, в която няма албумин.Values of ΔH 0 = 1.66 G and H max = 30 G are characteristic of the 3-Maleimido-PROXYL control in DMSO solvent (control sample without albumin). In samples from patients in whom hypoalbuminemia is not observed with normal serum albumin levels (35-52 g/L), the reported values of ΔH 0 = 3.6 G and H max = 60 = 62G. In patients with COVID-19-related hypoalbuminemia, the values of ΔH ° = 1.66 = 1.75 G and H max = 30 -.32 G are comparable to those of the 3-Maleimido-PROXYL control in DMSO solvent, in which there is no albumin.
Резултатите (Таблица 1) от ЕПР спектралният анализ за доказване на хипоалбуминемия при пациенти с COVID-19, са сравнени и валидизирани чрез съпоставяне на данни от стандартен конвенционален колориметричен метод. Конвенционалният анализ е извършен с автоматичен клиничен лабораторен анализатор Cobas Integra® 400 Plus (Roshe DIAGNOSTICS).The results (Table 1) of the EPR spectral analysis for the detection of hypoalbuminemia in patients with COVID-19 were compared and validated by matching data from a standard conventional colorimetric method. The conventional analysis was performed with an automated clinical laboratory analyzer Cobas Integra® 400 Plus (Roshe DIAGNOSTICS).
Таблица 1. ЕПР спектралният анализ за доказване на хипоалбуминемия при пациенти с COVID-19 и конвенционален колориметричен метод за определяне нива на серумен албумин при COVID-19 индуцирана хипоалбуминемия. Всички тествани проби се измерват при 20-24°С, като резултатите се определят от средноаритметична стойност на три измервания.Table 1. EPR spectral analysis for proving hypoalbuminemia in patients with COVID-19 and conventional colorimetric method for determining serum albumin levels in COVID-19 induced hypoalbuminemia. All tested samples were measured at 20-24°C, with the results determined from the arithmetic mean of three measurements.
Приложение и използване на изобретениетоApplication and use of the invention
При изследване нивата на серумен албумин и състояния на хипоалбуминемия, които се смятат за отличителен маркер на тежко протичаща и фатална коронавирусна инфекция. ЕПР спектроскопското изследване на нивата на серумен албумин е З-Maleimido-PROXYL, представлява адекватен аналитичен метод за мониторинг на албумин и се характеризира като бърз, специфичен и евтин анализ.When examining serum albumin levels and states of hypoalbuminemia, which are considered a distinctive marker of severe and fatal coronavirus infection. EPR spectroscopic examination of serum albumin levels is 3-Maleimido-PROXYL, represents an adequate analytical method for monitoring albumin and is characterized as a rapid, specific and inexpensive assay.
Методът е приложим при болестни състояния придружени с промени в нивата на серумен албумин, вкл. такива свързани с нарушаване на протеиновата му структура или генетично-обусловени състояния (алоалбуминемия или бизалбуминемия, фамилна дисалбуминемична хипертироксинемия и хипертрийодтиронинемия), водещи до промени в конформацията и концентрацията на албумина. Тези състояния са с особено клинично значение, тъй като засегнатите индивиди са изложени на риск от неподходящо лечение или могат да получат нежелани странични ефекти при лекарствени терапии (Caridi G et al., 2022).The method is applicable to disease states accompanied by changes in serum albumin levels, including those associated with disruption of its protein structure or genetically determined conditions (alloalbuminemia or bisalbuminemia, familial dysalbuminemic hyperthyroxinemia and hypertriiodothyroninemia), leading to changes in the conformation and concentration of albumin. These conditions are of particular clinical importance, as affected individuals are at risk of inappropriate treatment or may experience undesirable side effects from drug therapies (Caridi G et al., 2022).
При остра фаза на заболявания, които се характеризират с високи нива на глобулини (над 39 g/L), при които конвенционалните спектрофотометрични клинични лабораторни методи, са неприложими поради образуване на комплекси между а- и β-глобулин с флурофора. ЕПР спектроскопията в комбиниращия с 3Maleimido-PROXYL представлява мощен, точен и специфичен метод за изследване на протеиновата структура на албумин, нейната динамика, осигурява необходимата чувствителност чрез добро съотношение сигнал/шум, включително и при концентрации на протеини по-малки от 1 nmol/L протеин, което позволява резолюция на ниво протеинова молекула, т. е. извън възможностите на конвенционалните спектрофотометрични методи използвани към момента в биохимичния мониторинг на албумин. Анализът се извършва при физиологично pH и при стайна температура.In the acute phase of diseases characterized by high levels of globulins (over 39 g/L), in which conventional spectrophotometric clinical laboratory methods are inapplicable due to the formation of complexes between α- and β-globulin with the fluorophore. EPR spectroscopy in combination with 3Maleimido-PROXYL is a powerful, accurate and specific method for studying the protein structure of albumin, its dynamics, provides the necessary sensitivity through a good signal-to-noise ratio, including at protein concentrations of less than 1 nmol/L protein, which allows resolution at the protein molecule level, i.e. beyond the capabilities of conventional spectrophotometric methods currently used in the biochemical monitoring of albumin. The analysis is performed at physiological pH and at room temperature.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG113543A BG67684B1 (en) | 2022-06-06 | 2022-06-06 | METHOD FOR DETERMINING SERUM ALBUMIN AND HYPOALBUMINEMIA IN PATIENTS WITH COVID-19 THROUGH ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG113543A BG67684B1 (en) | 2022-06-06 | 2022-06-06 | METHOD FOR DETERMINING SERUM ALBUMIN AND HYPOALBUMINEMIA IN PATIENTS WITH COVID-19 THROUGH ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG113543A BG113543A (en) | 2023-12-15 |
| BG67684B1 true BG67684B1 (en) | 2024-12-16 |
Family
ID=89901351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG113543A BG67684B1 (en) | 2022-06-06 | 2022-06-06 | METHOD FOR DETERMINING SERUM ALBUMIN AND HYPOALBUMINEMIA IN PATIENTS WITH COVID-19 THROUGH ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG67684B1 (en) |
-
2022
- 2022-06-06 BG BG113543A patent/BG67684B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG113543A (en) | 2023-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hastka et al. | Washing erythrocytes to remove interferents in measurements of zinc protoporphyrin by front-face hematofluorometry | |
| Abugo et al. | Fluorescence properties of rhodamine 800 in whole blood and plasma | |
| Snyder et al. | The impact of hemolysis on Ortho-Clinical Diagnostic's ECi and Roche's elecsys immunoassay systems | |
| Alyan et al. | Point-of-care testing and optimization of sample treatment for fluorometric determination of hydrogen sulphide in plasma of cardiovascular patients | |
| Berska et al. | Newborns bilirubin concentration determined by different methods in relation to hematocrit and albumin level | |
| JPH06507235A (en) | diagnostic test | |
| RU2595806C2 (en) | Method of determining oxidative modification of fibrinogen in blood plasma by content of carbonyl groups in fibrinous clot | |
| US20260016467A1 (en) | Devices and methods for minimizing hook effect inteference in immunoassays | |
| van der Ham et al. | Suitability of methylmalonic acid and total homocysteine analysis in dried bloodspots | |
| US7166474B2 (en) | Method for the ESR-spectroscopic detection of changes in the transport properties of albumin in an albumin-containing samples, ESR-spectrometer for carrying out said method, and use of the method for diagnostic purposes and for controlling albumin-containing preparations | |
| BG67684B1 (en) | METHOD FOR DETERMINING SERUM ALBUMIN AND HYPOALBUMINEMIA IN PATIENTS WITH COVID-19 THROUGH ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE | |
| WO2020068574A1 (en) | Methods for detecting hook effect(s) associated with anaylte(s) of interest during or resulting from the conductance of diagnostic assay(s) | |
| US10393684B2 (en) | Micro magnetic resonance relaxometry | |
| US11327081B2 (en) | Calibrators and controls for the determination of percent glycated hemoglobin in a patient's liquid test sample | |
| AU2005313116B2 (en) | Assay for generation of a lipid profile using fluorescence measurement | |
| WO2019075471A2 (en) | Biosensor detecting glucose levels of free glucose, hemoglobin a1c and glycated blood proteins in a single blood sample | |
| CN106153942A (en) | A kind of method quantitative determining albumin content in biological sample and application | |
| Schneider et al. | Sample Processing Considerations for Protein Stability Studies of Low Concentration Biofluid Samples using Differential Scanning Calorimetry | |
| RU2296326C2 (en) | Method for predicting acute intoxication | |
| RU2799875C1 (en) | Method of determination of glutathione in whole blood | |
| RU2728784C1 (en) | Method for evaluating the effectiveness of a drug therapy of ischemic heart disease by parameters of a carbonyl-dependent modification of erythrocyte superoxide dismutase | |
| US20240319210A1 (en) | Application of neonatal biliary atresia biomarker and detection method for same | |
| Ye et al. | Synthesis of fluorescent 9-(4-aminoaniline)-acridine for highly specific and rapid detection of human serum albumin by fluorescence-capillary gel electrophoresis | |
| CN118603958A (en) | A Raman analysis method for ALS, APOC3, C3, and FCN2 proteins and its biological application | |
| Manual | OxiSelect™ Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) Assay Kit (ABTS) |