[go: up one dir, main page]

BG110506A - Нови щамове млечно-кисели бактерии и техни комбинации за получаване на пробиотични препарати - Google Patents

Нови щамове млечно-кисели бактерии и техни комбинации за получаване на пробиотични препарати Download PDF

Info

Publication number
BG110506A
BG110506A BG10110506A BG11050609A BG110506A BG 110506 A BG110506 A BG 110506A BG 10110506 A BG10110506 A BG 10110506A BG 11050609 A BG11050609 A BG 11050609A BG 110506 A BG110506 A BG 110506A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
selur
cfu
strain
strains
milk
Prior art date
Application number
BG10110506A
Other languages
English (en)
Inventor
Prof. Dr. Irena ROGELJ
.
Dr. Bojana Matijasic
Original Assignee
"Селур Вк Холдинг" Еоод
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by "Селур Вк Холдинг" Еоод filed Critical "Селур Вк Холдинг" Еоод
Priority to BG10110506A priority Critical patent/BG110506A/bg
Priority to PCT/BG2010/000021 priority patent/WO2011050426A2/en
Priority to EP10795908A priority patent/EP2494027A2/en
Priority to CN2010800585087A priority patent/CN102686112A/zh
Priority to EP13000103.5A priority patent/EP2634269A1/en
Publication of BG110506A publication Critical patent/BG110506A/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
    • A23C11/103—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins containing only proteins from pulses, oilseeds or nuts, e.g. nut milk
    • A23C11/106—Addition of, or treatment with, microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/045—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with a leaven or a composition containing acidifying bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1238—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt using specific L. bulgaricus or S. thermophilus microorganisms; using entrapped or encapsulated yoghurt bacteria; Physical or chemical treatment of L. bulgaricus or S. thermophilus cultures; Fermentation only with L. bulgaricus or only with S. thermophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/60—Drinks from legumes, e.g. lupine drinks
    • A23L11/65—Soy drinks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A23L13/45—Addition of, or treatment with, microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/38—Other non-alcoholic beverages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/145—Gasseri
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/249—Thermophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до нови щамове на Lасtоbасillus delbrueckii ssр. bulgаricus (Selur 6 и Sеlur 19) и Streрtососсus thermophilus Selur 12, изолирани от традиционно кисело мляко, произведено в планините в България - Стара планина и Родопи, и до използването на тези нови щамове в комбинация с пробиотичен щам Lactobacillus gasseri К7, изолиран от фекалиите на кърмаче за получаването на пробиотични хранителни добавки, предназначени за хора или животни. Също така това изобретение се отнася до профилактични и терапевтични препарати, съдържащи като активен компонент различни комбинации на горепосочените щамове и биогенни вещества, произхождащи от ферментацията на мляко или суроватка за запазване общото здравословно състояние на гостоприемника и за превенция и/или лечение от заболявания на стомашно-чревния тракт. Освен това са разкрити процедури за получаване на пробиотична стартерна култура, пробиотично българско кисело мляко и на пробиотични хранителни добавки на основата на ферментация на мляко или суроватка от гореспоменатите щамове.@

Description

НОВИ ЩАМОВЕ МЛЕЧНО - КИСЕЛИ БАКТЕРИИ И ТЕХНИ КОМБИНАЦИИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОБИОТИЧНИ ПРЕПАРАТИ
ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Настоящото изобретение се отнася до нови щамове на Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (Selur 6 и Selur 19) и Streptococcus thermophilus (Selur 12), и до използването на тези нови щамове в комбинация с пробиотичен щам Lactobacillus gasseri К7, за получаването на пробиотични хранителни добавки, предназначени за хора или животни. Също така, това изобретение се отнася до профилактични и терапевтични препарати, съдържащи като активен компонент различни комбинации на горепосочените щамове за запазване и подобряване на общото здравословно състояние на гостоприемника, както и за превенция и/или лечение на заболявания на стомашно - чревния тракт. Освен това, допълнително са изобретени и представени нови процедури и технологии за получаване на биомаса, пробиотични стартерни култури, хранителни добавки и фармацевтични препарати на основата на ферментация на мляко или суроватка от гореспоменатите щамове.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Млечно киселите бактерии (LAB) са разнообразна група от Грамположителни, неспорулиращи бактерии, анаероби или факултативни анаероби, изискващи специфична хранителна среда, и чийто краен метаболитен продукт е млечната киселина. В днешно време LAB са микроорганизми с индустриално значение поради тяхната ферментационна активност, както и заради техните здравни и хранителни предимства. LAB, особено млечните бактерии, които заемат важни ниши в стомашно чревния тракт (GIT) се разглежрат като предлагащи множество пробиотични предимства за общото здравословно състояние и за доброто физическо състояние. Тези предимства включват
-1 • · · положително влияние върху естествената микрофлора, конкурентно изключване на патогени и стимулиране/модулация на мукозния имунитет. В тази връзка си заслужава да се обърне особено внимание на това, че предимствата за здравето, дължащи се на пробиотичните бактерии, са щам специфични - зависят от особеностите на отделните щамове (Shah, 2007).
Вероятно, най-важните и достатъчно добре изследвани биогенни вещества в млечните продукти са протеините от суроватката и биоактивните пептиди. Протеините от суроватка са замесени в множество хранителни и физиологични резултати, включващи, физиологична промени, възстановяване след физически упражнения и превенция от мускулна атрофия, контрол на насищането и теглото, контрол на инфекциите и здравето с напредване на възрастта (Smithers, 2008). Млечните протеини са богат източник на биоактивни пептиди. Биоактивните пептиди, произхождащи от млечния протеин, не са активни в последователността на родителския протеин и могат да бъдат отделени чрез ензимна протеолиза по време на храносмилането или по време на ферментацията на мляко/суроватка от LAB. Веднъж освободени, биоактивните пептиди могат да действат в тялото като регулаторни съединения с различна активност като: средства за понижаване или контрол на високо кръвно налягане, антиоксиданти, средства за възпрепятстване на образуването на тромб, противомикробни средства и средства за регулиране на имунната система (Meisel, 1998, Korhonen и Pihlanto, 2006)
Киселото мляко е най-известното от всички видове млека получени в резултат на ферментация. Вярата в неговото полезно въздействие върху човешкото здраве съществува в много цивилизации през дълъг период от време. В Аюрведа, една от най-древните науки за здравето, която е възникнала преди около 2500г. пр. н. е., консумацията на кисело мляко е била препоръчвана за запазване на добро общо състояние (Chopra & Doiphode, 2002). Въпреки факта, че киселото мляко и следователно бактериите от киселото мляко Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus са били исторически свързани с човешкото здраве, те не са споменавани често като пробиотични бактерии. Причината за тази ситуация е
най-вероятно неспособността за наблюдение на тези бактерии в естествената микрофлора на стомашно чревния тракт на човека (GIT) и за това мнението на ловенето учени в миналото, е че тези видове не оцеляват в условията на GIT и на прохода (Guarner et al., 2005). Развитието на генетични методи способства учените да проследяват специфични щамове, при преминаване през GIT. Напоследък, млечно-кисели бактерии са набюдавани в екскременти на човешки субекти, консумиращи кисело мляко (Mater et al., 2005, Elli et al., 2006). Обратно Garcia-Albiach et all. (2008) предполага, че измененията в човешките фекални микроорганизми обикновено се дължат на свойствата на самото кисело мляко, което не изисква бактериална жизнеспособност. В тази връзка заявки за патент WO 96/20607, WO 2005/056028 и WO 2008/002484 разкриват специфични
щамове на стартерна култура за кисело мляко (Str. Thermophilus и Lb. bulgaricus) с пробиотични свойства, техни комбинации и препарати за лечение на различни разстройства на GIT.
До 1980 г., повечето от щамовете Lactobacillus, изолирани от червата са класифицирани като Lb. acidophilus, въз основа на техните морфологични и фенотипни характеристики. С развитието на модерната таксономия въз основа на молекулярните техники, шест различни вида в групата на преди това определените Lb. acidophilus са били идентифицирани и след това разделени в A (Lb. acidophilus, Lb. amylovorus, Lb. crispatus, Lb. gallinarum) и B (Lb. gasseri, Lb. johnsonii) ДНК хомоложни групи. Установено е, че свръхпроменливите16823S интергенни спейсърни региони както и 16S гРНК гениите последователности са достатъчно специфични за отличаване между сходните щамове Lactobacillus, както и чрез използването на видо-специфичните PCR праймери или чрез ДНК-последователността (Tannock et al., 1999, Kullen et al., 2000).
Щамът Lb. gasseri K7 е бил изолиран от здраво бебе на възраст 7-дена, хранено с кърма при Chair of Dairy Science, Biotechnical faculty, University of Ljubljana, през 1996. Той е депозиран в ZIM Culture Collection of Industrial Microorganisms, регистриран като WDCM810 (WFCC-MIRCEN World Data Centre for Microorganisms (WDCM)). През септември 2009 е депозиран въз основа на споразумението от Будапеща в Czech Collection of Microorganisms (CCM) под
-3• . · ·· ·» · · : · · : : · · ···« : · : : · · ·
..... ..· ..· регистрационен номер ССМ 7710. Въз основа на физиологичните и на биохимичните свойства, включващи определяне на схемите на ферментация с API 50 CHL (BioMerieux, Francee) е бил определен, като член на Lb. acidophilus групата. Липсата на S-layer протеин, PCR с щам- специфични праймери и определяне на първичната последователност на V2-V3 региона от 16S гДНК е показала, че щам К7 принадлежи към вида Lb. gasseri (Bogovic Matijasic и Rogelj, 2000, Canzek Majhenic et al., 2003).
Показано е, че Lb. gasseri K7 отговаря на основните критерии за пробиотични щамове, тъй като той е устойчив на ниско pH и на жлъчната течност, произвежда антимикробни вещества, включващи бактериоцини с широк противомикробен спектър и прикрепващи се към клетките Сасо-2 [Bogovic Matijasic и Rogelj, 2000, Bogovic Matijasic et al., 2003]. Специфичното за Lb. gasseri K7 е биосинтеза и продукцията на поне два бактериоцина, наречени гасерицин К7 А и гасерицин К7 В, чиито нуклеотидни последователности бяха депозирани в GenBank под регистрови номера EF392861 и AY307382. И двата бактериоцина принадлежат към групата на дву-пептидните бактериоцини (Zoric Peternel, 2007).
В допълнение, щамът е способен да оцелее, преминавайки през стомашно чревния тракт и да образува колонии в чревната лигавица на стандартни и родени с цезерово сечение прасенца, поне временно. При родените с цезерово сечение прасенца изкуствено инфектирани с ентеротоксигенните Escherichia coli, Lb. gasseri K7 понижи до определен обхват оцеляването на инфекцията и освен антимикробната активност, дължаща се на производството на органични киселини и стимулирането на имунния отговор, конкурентното отделяне на Е. coli от чревната лигавица послужи като възможен механизъм за такава активност. Способността на Lb. gasseri К7 да защити колонизирането на ентероцитите от не-ентерототоксигенния мутант Е. coli щам О8:К88+ беше потвърдено от клетъчни модели Сасо-2 (Bogovic Matijasic et al., 2004, Bogovic Matijasic et al., 2006, Rogelj и Bogovic Matijasic, 2006). Няколко по-ранни заявки за панетн описват изолирането на множество различни бактериални щамове, включващи пробиотични Lb. Gasseri щамове от
-4• *·· ..
фекалии на бебета (JP 04320642, JP 05227946, US патент 6596530) и човешко мляко (WO 2004/003235, WO 2008/016214)
Освен това Заявка за патент на САЩ US2008233104 разкрива състави и методи за приложение на пробиотични организми в терапевтични състави. По точно е разкрито използването на един или повече щама на млечно кисели бактерии за контрол на патогени. Бактериалните щамове притежават резистентност или силно понижена чувствителност на антимикробни средства такива като антибиотици и противовирусни средства. Разкритите състави се използват за лечение или превенция на медиирани от бактерии инфекции на стомашно чревния тракт.
Международна заявка за патент WO8905849 разкрива изолирани от стомашно чревния тракт на прасета млечно кисели бактерии заради тяхната способност да оцеляват в средата на стомашно чревния тракт т.е. заради тяхната жлъчна и киселинна поносимост Тези бактерии се включват във ферментирал млечен продукт предназначен за консумация от човек или животно за лечение или превенция на заболявания на стомашно чревния тракт.
NZ523010 разкрива изолиран щам на млечно кисели бактерии, притежаващ пробиотична активност. Щамовете са избрани от Lactobacillus, Bifidobacterium или Enterococcus, и по точно Lactobacillus reuteri NCC2581 (CNCMI-2448), Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM1-2449), Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCMI2451), Lactobacillus reuteri NCC2613 (CNCMI-2452), Lactobacillus acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453).
-5ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ
Настоящото изобретението се отнася до щамове на Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (Lb. bulgaricus), и Streptococcus thermophilus (St. Thermophilus), изолирани от традиционно кисело мляко, произведено в планините на България - Стара планина и Родопи, които проявявят няколко уникални характеристики. Тези щамове са:
• Lb. bulgaricus Selur 6, който е депозиран през Септември 2009 съгласно Будапещенския договор в Чехската колекция на микроорганизми (ССМ) под регистрационен № 7712, • Lb. bulgaricus Selur 19, който е депозиран през Септември 2009 съгласно Будапещенския договор в Чехската колекция на микроорганизми (ССМ) под регистрационен № 7713, • St. Thermophilus Selur 12, който е депозиран през Септември 2009 съгласно Будапещенския договор в Чехската колекция на микроорганизми (ССМ) под регистрационен № 7711.
Друг аспект на изобретението се отнася до състави и продукти, съдържащи поне един щам, от споменатите по-горе, с по-горе описания пробиотичен Lb. gassen К7 щам, изолиран от фекалии на деца, с регистрационен номер ССМ 7710.
Следващ аспект на изобретението разкрива процедури за получаване на биомаса и получаване на пробиотични стартерни култури, хранителни добавки за хора и животни и фармацевтични препарати на основата на ферментацията на мляко или суроватка от по-горе споменатите щамове.
Накрая, последният аспект на изобретението се отнася до използването на щамовете споменати по-горе или на всякаква култура, състав или продукт, който ги съдържа, при производството на функционални хранителни продукти и профилактични препарати като хранителни добавки за хора и животни и терапевтични препарати за запазване на общото здравословно състояние на
-6·· · · ; · · · ; ; · · • · · β ···· ..... ·..· е>· гостоприемника, както и за превенция и/или лечение на разстройства на стомашно чревния тракт, уро-генитални инфекции и вагинални инфекции .
Определения
Съгласно изобретението термина „пробиотик” трябва да се разбира така, както е определено по FAO/WHO (2002), и по-специално това са живи микроорганизми, които когато се погълнат в подходящи количества, предизвикват определена физиологична полза, и са обикновено щам специфични.
Съгласно изобретението термина „биогенни вещества” означава хранителни компоненти, произлизащи от микробната активност, които осигуряват полезност за здравословното състояние без да включват чревната микрофлора (Mitsuoka, 2000). Съгласно с това определение такива вещества от ферментирало мляко са такива като млечна киселина, бутирова киселина, биоактивни пептиди, β-галактозидаза и екзополизахариди произведени от LAB по време на ферментацията.
Съгласно с изобретението и, както е използвано тук, понятието хранително или/и фармацевтично приемливи вещества/носител означава едно или повече твърди или течни вещества или пълнители, разредители или капсулиращи вещества, които са подходящи за прием от хора или животни и които е/са съвместими с активния пробиотичен щам.
Съгласно с изобретението понятието съместим се отнася до компоненти, които не са инхибиращи за пробиотичните бактерии и позволяват доро оцеляване и активност на щама съгласно настоящото изобретение и на Lb. gasseri щам К7 в човешкото тяло или тялото на животно.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО • 9
Нови Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus щамове Selur 6 и Selur 19 и Streptococcus thermophilus щам Selur 12
Образци от новите Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus щамове Selur 6, и Selur 19 и Streptococcus thermophilus щам Selur 12 са депозирани в CCM (Чехска банка за микроорганизми) под регистрови номера ССМ 7712, ССМ 7713, и ССМ 7711 с дата на депозиране септември 2009. Депозирането беше направено при условията на Будапещенския договор за международно признаване на депозит на микроорганизми за целите на патентната процедура.
Lactobacillus щам Selur 6 и Streptococcus щам Selur 12 бяха изолирани от традиционно киело мляко получено от сурово мляко от Стара планина (България) и Lactobacillus щам Selur 19 беше изобиран от традиционно киело мляко получено от сурово мляко от Родопите (България).
По същия начин образец от Lactobacillus gasseri щам К7 беше депозиран в ССМ (чехската банка за микроорганизми) под регистров номер ССМ 7710 и дата на депозиране септември 2009. Също така, това депозиране беше ивършено при условията на Будапещенския договор за международно признаване на депозит на микроорганизми за целите на процедурата по патентоване. Lb. gasseri К7 е добре описан, пробиотичен щам (Bogovic Matijasic и Rogelj, 2000; Bogovic Matijasic et al., 2003, 2004, 2006; Rogelj и Bogovic Matijasic, 2006, Zoric Peternel, 2007) c регистров номер IM105 в ZIM Culture Collection of Industrial Microorganisms (Словения), регистриран като WDCM810 (WFCC-MIRCEN Световен център за данни за микроорганизми (WDCM). Изолиран е през август 1996 в Любляна, Словения от фекалии на бебета кърмачета на възраст 7 дена. К7 е продуцент на два бактериоцина: гасерицин К7 А и гасерицин К7 В. Въз основата на нуклеотидните последователности на опероните на бактериоцините в хромозомата, и двата бактериоцина бяха класифицирани в групата на дву-пептдни не-лантибиотици (ПЬ). Нуклеотидните последователности на гасерицин К7 А (1143 Ьр) и гасерицин К7 В (3276 Ьр) са депозирани в GenBank, регистрови номера EF392861 (гасерицин К7А) и AY307382 (гасерицин К7В). Той съдържа 1 плазмид, образува по-къси пръчици
-8намиращи се в дългите вериги. Оптималната температура за растеж е 37°С в микроаерофилни условия.
Както е описано в пример 1, по-долу, новите Lactobacillus и Streptococcus щамове бяха първо характеризирани чрез генотипизиране. PCR с Lb. delbrueckii щам специфични праймери Del I (5'-ACG GAT GGA TGG AGA GCA G-3') и Del II (5'-GCA AGT TTG TTC TTT CGA ACT C-3') и Str. thermophilus щам специфични праймери Th I (5’-ACG GAA TGT ACT TGA GTT TC-3’) и Th II (5’-TTT GGC CTT TCG ACC TAA C-3’) (Tilsala-Timisjarvi и Alatossava, 1997) беше проведена върху ДНК, изолирана от чести култури с Wizard® набор за пречистване за геномна ДНК (Promega) или с Maxwell™ 16 система (Promega). Подвидовото идентифициране на Lb. delbrueckii беше проведено с праймери LB1 (5'-ААА ААТ GAA GTT GTT TAA AGT AGG ТА-3’) и LLB1 (5’-AAG ТСТ GTC СТС TGG CTG G-3') (Torriani et al., 1999). Щамове Selur 6 и Selur 19 бяха идентифицирани като Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus и щам Selur 12 като Streptococcus thermophilus.
За допълнително потвърждаване на видовото идентифициране, беше проведено секвентиране на PCR амплифицирани променливи региони V1 и V3 на 16S гРНК. Lactobacillus щамовете Selur 6 и Selur 19 бяха идентични (99%) с референтната последователност на Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ATCC BAA-365 или ATCC 11842 (Фиг. 4 и 5), Selur 12 щамът беше идентичен (100%) с референтната последователност на Streptococcus thermophilus LMG 18311 (Fig. 6). Щамът K7 е идентичен (100%) с референтната последователност на Lactobacillus gassen ATCC 33323 (Фиг 7).
Освен това, както е разкрито в пример 1, са определени RAPD моделите на новите щамове. Важно е да се разграничи специалния щам от останалите и в тази връзка RAPD-PCR може да бъде полезен метод. За разделяне на новите щамове от различните щамове, които са използвани за промишленото производство на кисело мляко бяха използвани няколко олигонуклеотидни праймера. Най-подходящо за щамовото разграничаване се оказа, че са RAPD праймерите 1254 (Фиг. 8) или KGT-70GC (Fig. 9). Както с
-9.· .· : . . ·'·.·*.
: : : : ·:
··· ·· ..· ..:
двата праймера, така и с описания протокол е възможно да се направи също така разграничение и между новите Lb. bulgaricus щамове (Selur6 и Selur 19).
В следващ аспект, настоящото изобретение описва характеристиките, които показват новите щамове самостоятелно или в комбинация с Lb. gasseri щам К7, полезен за човешкото здраве, и в частност при профилактиката или лечението на храносмилателни, инфекциозни и други имуно свързани заболявания, такива като алергии или възпалителни заболявания, диария при пътуващи или дължаща се на антибиотиколечение.
Както е показано в Пример 2 различни тестове бяха проведени съгласно с Крайния технически доклад за FSA проект G01022” (FSA, 2005) за оценка на способността на новите щамове да оцеляват в симулирани условия на стомашно чревния тракт. Съгласно с резултатите, при pH 1 единствено щамовете Selur 6 и Selur 12 оцеляха при 20 минутна обработка в SCJ в степен сравнима с щама Lb. gasseri К7. При pH 2 оцеляха приблизително половината от живите клетки на всички изпитани щамове, и 100 % от Lb. gasseri К7 клетките (Таблица 1). Щамовете бяха доста по-чувствителни на симулиран горен чревен сок съставен от жлъчни соли (1 g/l) в PBS буфер (pH 8) и панкреатичен ензим (1 g/L). Понижение в брой на клетките в порядъка на три или четири логаритмични едининци непосредствено след излагането на UIJ (при Т 0) беше наблюдавано за всички тествани щамове в чистите култури. Str. thermophilus Selur 12 не беше засегнат веднага, но инкубирането в продължение на 2 часа беше пагубно за този щам (Таблица 2). Оцеляването на щамовете беше подобро в препарат, култивирани на млечна среда (таблица 3). Съгласно in vitro изпитванията беше малко вероятно това Str. thermophilus Selur 12 да оцелее при GIT условията. Важната характеристика на този щам е неговия стимулиращ ефект върху растежа и ферментационната способност на Lb. bulgaricus щамовете Selur 6 и Selur19 (показано в пример 9)
В пример 3 са представени профилите на антибиотична чувствителност на новите щаморе. Lactobacillus щамовете Selur 6 и Selur 19 са чувствителни на четири (т.е. гентамицин, тетрациклин, еритромицин и ванкомицин) от клинично най-приложимите антибиотици. Когато са приложени
-10·· ·· точките на преход на Danielsen и Wind (2003), Lb. gasseri е също така податлив на тези четири антибиотика. В съгласие с FEEDAP панелния доклад (Европейска комисия, 2005) Str. thermophilus Selur 12 е резистентен на гентамицин и еритромицин. Всички щамове притежават стрептомицинова резистентност съгласно с FEEDAP (Европейска Комисия, 2005) граничните точки. Когато са приложени граничните точки на Danielsen и Wind (2003), Lactobacillus щамовете е намерено че са чувствителни на стрептомицин. Тъй като не съществува стойност на гранична точка за метронидазол, цефотаксим, цефаклор и амоксицилин, щамовете не могат да бъдат определени като чувствителни или резистентни. За метронидазол бяха постигнати високи MIC стойности за всички щамове. Този резултат е в съгласие с Delgado et al. (2007) който е забелязал съществена резистентност към този антибиотик при повечето Lactobacillus видове, когато са тествани изолати от човешкия стомашно чревен тракт. Str. thermophilus Selur 12 е резистентен на азитромицин, когато е взета под внимание микробиологичната гранична точка в съгласие с CLSI/NCCLS за клинични изследвания. Никаква стойност за граничната точка не е предположена за този антибиотик от FEEDAP панелния доклад (Европйска комисия, 2005).
Доказването на някои пробиотични характеристики на новите щамове е особено предпочетено изпълнение на изобретението. В тази връзка, новите щамове, които са предмет на това изобретение бяха изследвани за антимикробна активност, хидрофобност, β-галактозидаза активност, способност на прилепване към Сасо-2 клетки, конкурентни и изключващи свойства и имунна реакция на ТНР-1 макрофагите при стимулиране с Lb. bulgaricus щам Selur 6.
Антибактериалната активност беше тествана с агар точков тест към 31 индикаторни щама включващи различни млечни бактерии, Clostridium perfringens 1b 1106, Cl. tyrobutyricum DSM 2637, Bacilus cereus CCM 2010T, три щама на Staphylococcus aureus, Enterococcus durans CCM 5612, два щама на Enterococcus faecalis, E. faecium LMG 11423, Listeria monocytogenes IM 372, L. innocua ATCC 33090 и E. coli O8:K88. Както е представено в Пример 4 широк диапазон от антимикробна активност беше доказана специално за Lb. bulgaricus
-11 ♦ ♦ · * . · ·· * ..
• · :·· : : ♦ • ··· 2 · · · · ··· ·· ·φ>· щамовете Selur 6 и Selur 19 (таблица 8). Обширна антимикробна активност на Lb. bulgaricus Selur 6 и Selur 19 щамовете беше наблюдавана не само срещу Lactobacillus индикаторните щамове, но също така срещу S. aureus (Фиг. 10), Li. monocytogenes и Li. innocua. Str. thermophilus Selur 12, в допълнение към млечните бактерии, само умерено инхибираха ентерококи и Listeria щамовете. Нито един от новите щамове не инхибира Clostridium perfringens 1b 1106, Cl. tyrobutyricum DSM 2637, Enterococcus durans COM 5612, и E. coli O8:K88. Антимикробната активност на Lb. gasseri K7 срещу различни щамове на Clostridium tyrobutyricum и Cl. difficile беше доказано по-рано (Bogovic Matijasic и Rogelj, 2000, Bogovic Matijasic et al., 2007).
Хидрофобността беше определена съгласно с Vinderola и Reinheimer (2003) чрез измерване на разделяне на бактериалните клетки между органичните (n-хексадекан) и водните фази. Както е описано в Пример 5 висока клетъчно-повърхностна хидрофобност беше определена както за Lb. gasseri К7, така и за Lb. bulgaricus Selur 19.
Най-висока β-галактозидаза активност, определена чрез протокола на Vinderola и Reinheimer (2003), използвайки синтетичното съединение онитрофенил-В-О-галактозид (OPNG), беше демонстрирана от Lb. bulgaricus щама Selur 6. В сравнение с другите щамове и двата Lb. bulgaricus щама Selur 6 и Selur 19 проявиха отлична β-галактозидаза активност (Пример 6), което е много добър признак за всички от тези с понижена лактаза активност.
Важно функционално свойство за пробиотичните бактерии е способността на щама да се залепва към чревните епителни клетки. В нашите експерименти бяха използвани Сасо-2 клетки като in vitro модел. Подробната процедура е описана в Пример 7 заедно с теста за конкуретни и изключващи свойства на Lb. bulgaricus щам Selur 19 срещу два щама, S. aureus АТСС 29213 и Е. coli АТСС 25922. Прилепването на Lb. bulgaricus Selur 6 и Selur 19 и Str. thermophilus Selur 12 щамовете беше като цяло поне сравнимо или в даден случай, когато е изчислен % на прилепване (прилепнали cfu/ямка разделено на добавени cfu/ямка представено в %) дори по-добро от това определено за Lb. gasseri К7 и някои други пробиотични щамове (Lb. rhamnosus GG, Lb. johnsonii
-12Lj1, Lb. reuteri ING 1, Lb. Shirota SHI) (Fig. 11). В анализа за конкурентност Lb.
bulgaricus Selur 19 беше способен да инхибира прилепването на Е. co//АТСС 25922, но не и на S. aureus. В анализа на изключване Selur 19 не беше ефективен.
Модулацията на имунната реакция е едно от полезните за здравето ефекти на пробиотичните бактерии. Тъй като някои от предварителните експерименти показаха възможен имуно стимулиращ ефект за Lb. gasseri К7 и Lb. bulgaricus щам Selur 6 и двата щама бяха тествани за тяхната способност да въздействат на отделянето на цитокини от клетъчна линия на ТНР-1 микрофаги. Поради техните добре известни пробиотични ефекти, включващи модулация на имунна реакция, Lb. rhamnosus GG и Lb. casei DN-114001 бяха използвани като позитивна контрола. Експериментът е описан в Пример 8. Selur 6 и К7 щамовете не предизвикаха отделяне на възпалителни цитокини (IL8, IL-6 и TNF) от макрогаги клетъчната линия ТНР-1, докато и двата щама понижиха концентрацията на основните възпалителни цитокини предизвикано от добавянето на LPS (липополизахариди Е. coli О111:В4). Пониженото отделяне на възпалителни цитокини показва, че Selur 6 и К7 щамовете биха могли да притежават противовъзпалителен ефект. Доловеното нарастване в IL-Ιβ би могло да доведе до лимфоцит В пролиферация и последващо производство на IgA, което трябва да бъде потвърдено in vivo.
Пробиотични препарати, състоящи се от поне един от новите щамове самостоятелно или в комбинация с Lb. gasseri щам К7
Млечно киселите бактерии като цяло се използват като стартерна култура за производството на ежедневни и друг вид храни. Стартерни култури, които съдържат поне един от щамовете, съгласно изобретението, е друго изпълнение на изобретението. Като цяло, такава композиция на стартерна култура съдържа бактерии в концентрирана форма, включваща замразени, изсушени или лиофилизирани концентрати, като цяло притежаващи концентрация на живи клетки, която е в диапазона от 106 до 1011 cfu (колоно образуващи единици) на грам от състава, включващо поне 106 cfu на грам от
Я л · · състава, такова като 10 cfu/g, т.е. поне 10 cfu/g, такова като поне 10 cfu/g, т.е. поне Ю10 cfu/g, такова като поне 1011 cfu/g.
Също така аспект на изобретението е състав, съдържащ всеки от бактериалните щамове, съгласно изобретението, заедно с Lb. gasseri К7 или друг бактериален щам. В тази връзка, това изобретение се отнася до биологично чисти култури на всеки от щамовете или смеси от тях или с Lb. gasseri К7 или с други бактеиални щамове. По този начин, споменатият аспект на това изобретение е получаването на различни състави, включващи пробиотични такива, съдържащи поне един щам или смес от щамове съгласно изобретението.
Когато млечно киселите бактерии са използвани като стартерна култура за получаване на ферментирала храна, например ферментирало мляко, знанията за ферментационната активност на щамовете и комбинациите, което осигурява големия брой на живи щамове, е изключително необходимо. Изследването на различните комбинации от щамове и ферментационни температури е описано в Пример 9. Str. thermophilus щамът Selur 12 се прояви като добър стимулатор на млечните бактерии. Мляко, инокулирано с различни комбинации от щамове ферментира (беше достигнато средно pH 4,6) за 5 до
7,5 часа. Много добро развитие и преживяемост на пробиотичния щам Lb. gasseri К7 по време на ферментацията на млякото с Str. thermophilus щам Selur 12 и Lb. bulgaricus strain Selur 19 беше установено при две температури на ферментация 42 °C и 37 °C, съответно. Броят на живите клетки на Lb. gasseri К7 във ферментиралото мляко достигна ниво от 8,70*108 до 1,6*109 cfu/ml, когато ферментацията беше проведена при 42 °C и 37 °C, съответно. Беше потвърдено, че Lb. gasseri К7 може да бъде комбиниран с новите щамове за пробиотични хранителни продукти и препарати.
Следващо важно изпълнение на настоящото изобретение е технология за получаване на биомаса и получаване на пробиотични стартерни култури, хранителни добавки за хора и животни и фармацевтични препарати. Процедурата е подробно изложена в Пример 10. Цитираните състави могат да
бъдат на основата на ферментацията на мляко, суроватка или растителни субстрати такива като соево, оризово или друго зърнено мляко.
Като цяло, препарат на основата на млечна ферментация, който може да бъде използван като стартерна култура съдържа лиофилизирани бактерии в комбинация с живи клетки, които са в дипазона от 107 до Ю10 cfu на грам от препарата, включващо поне 107 cfu/g, например поне 108 cfu/g, например поне 109 cfu/g, такова като поне Ю10 cfu/g, по малко от 400 mg лактоза на грам и лактулоза, която е в диапазона от 25 до 50 mg/g.
Следващ аспект на изобретението се състои в хранителен продукт, съдържащ носещ материал и поне един щам , съгласно с изобретението, култура, състав или продукт, съгласно изобретението. За предпочитане носещият материал е храна избрана от мляко, кисело мляко, сирене, ферментирало мляко, мляко на основата на ферментирали продукти, месо на основата на ферментирали продукти, ферментирали на основата на пшеница продукти, прахове на основата на мляко или пшеница, бебешка храна, добавки за храна на хора и животни , сладоледи, сокове, бонбони, хляб, кексове и дъвки. В предпочетено изпълнение, микробният щам от настоящото изобретение се съдържа при ниво от около 106 до около 1011 cfu/g от носещия материал, за предпочитане от около 106 до около 109 cfu/g, по предпочетено от около 107 до около 109 cfu/g от носещия материал
В друг аспект, настоящото изобретение осигурява пробиотична хранителна добавка за хранене на хора и животни и фармацевтични състави, съдържащи поне един щам, съгласно изобретението, комбиниран с Lb. gasseri К7 самостоятелно или с Lb. gasseri К7 и други хранителни вещества, пребиотици, минерали, витамини или други хранителни или/и фармацевтично приемливи вещества. За получаване на цитираните препарати, съгласно с настоящото изобретение, поне един от щамовете на настоящото изобретение трябва да бъде наличен е количество от 107 cfu/g до около 1012 cfu/g от носещия материал и Lb. gasseri щама К7 трябва да присъства в количество от 108 cfu/g до около 1012 cfu/g от носещия материал, за предпочитане от 109 cfu/g до около 1012 cfu/дпо-предпочетено от 1О10 cfu/g до около 1012 cfu/g от носещия материал.
-15Пробиотичните хранителни добавки за хора и животни фармацевтичните препарати могат да бъдат получени под формата на таблети, капсули, гранули, течни бактериални суспензии, паста и прах. В допълнение пробиотичният състав съгласно с настоящото изобретение може да бъде всеки смилаем материал избран от групата, състояща се от мляко, извара, продукти на основата на ферментирало мляко, подкиселено мляко, кисело мляко, замразено кисело мляко, мляко на прах, прахове на основата на мляко, млечен концентрат, сирене, сирена за намазване, напитки, сладоледи, продукти на основата на ферментирала пшеница, бебешки храни, таблети, течни бактериални суспензии, изсушена орална добавка, влажна орална добавка, суха храна за хранене на животни през тръба или влажна храна за животни за подаване през тръба, която е получена чрез използването на поне един щам съгласно изобретението в комбинация с Lb. gasseri щам К7.
В следващо изпълнение, споменатият пробиотичен състав освен това съдържа хранителни или/и фармацевтично приемливи вещества и фармацевтично приемлив носител.
В полезни изпълнения, пробиотичният състав съгласно с изобретението е подходящ за превенция или лечение на заболяване, синдром или състояние от групата, състояща се от антибиотик-свързани разстройства, гастроентерит, диария, включващо диария при пътуващи и остра детска диария, непоносимост към лактоза, стомашно чревни инфекции и развитие в стомашно чревния тракт на патогенни бактерии, възпалително заболяване на червата (IBD) и други имуномодулиращи синдроми.
Кратко пояснение на фигурите
Фигура 1 показва PCR с Lb. delbrueckii вид специфични Del I и II праймери;
Фигура 2 показва PCR с Str. thermophilus вид специфични Th1 и Th2 праймери;
Фигура 3 показва PCR с Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus подвид специфични LB1 и LLB1 праймери;
-16• ·* • Σ · · • ! * · . ; ··· »С ···· « • · • · • · • ·»
Фигура 4. представя последователност на PCR разширени променливи региони V1 и V3 на 16S гРНК на Lb. bulgaricus щам Selur 6;
Фигура 5 представя последователност на PCR разширени променливи региони V1 и V3 на 16S гРНК на Lb. bulgaricus шам Selur 19;
Фигура 6 представя последователност на PCR разширени променливи региони V1 и V3 на 16S гРНК на Str. thermophilus щам Selur 12;
Фигура 7 представя последоварелност на PCR разширени променливи региони V1 и V3 на 16S гРНК на Lb. gasseri щам К7;
Фигура 8 показва ДНК фрагменти получени след RAPD-PCR с праймер 1254;
Фигура 9. ДНК фрагменти получени след RAPD-PCR с праймер KGT70GC;
Фигура 10 представя антимикробната активност на Lb. bularicus Selur 6 и Selur 19 щамовете срещу Staphylococcus aureus ATCC 29213;
Фигура 11 представя адхезивната способност на различни щамове към СаСо-2 клетки;
Фигура 12 представя изменение на pH стойностите по време на ферментацията на мляко заразено с Str. thermophilus Selur 12 и различни lactobacilli щамове.
ПРИМЕРИ
Пример 1: Характеризиране на новите щамове Lb. bulgaricus и Str. thermophilus
Изолираните щамове бяха пречистени З-пъти, съгласно класически метод върху М17 (Str. thermophilus Selur 12) и MRS (Lb. bulgaricus Selur 6, и Selur 19) arap и характеризирани чрез генотипизиране.
-17В допълнение към новите щамове Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (Selur 6, и Selur 19) и Streptococcus thermophilus Selur 12 референтни щамове получени от колекции за микробни култури (LMG 6901т Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, LMG 6412T Lb. delbrueckii ssp. delbrueckii), щамове изолирани от традиционни кисели млека (млечни бактерии: L7, L8, и L12; стрептокоови бактерии: ST4 и ST7) и щамове изолирани от множество различни кисели млека, получени от пазара бяха използвани за сравнение.
Lactobacillus щамовете бяха отгледани в MRS бульон/MRS arap, a Streptococcus щамовете в M17 бульон/М17 arap (Merck, Darmstadt, Германия) при 42 °C. Геномна ДНК беше изолирана от чистите култури на новите изолати и от референтните щамове чрез Wizard® набор за пречистване на геномна ДНК (Promega) или чрез Maxwell™ 16 ситема (Promega).
Видов и подвидов специфичен PCR
PCR с Lb. delbrueckii видово специфични праймери Del I (5'-ACG GAT GGA TGG AGA GCA G-3') и Del II (5'-GCA AGT TTG TTC TTT CGA ACT C-3’) и Str. thermophilus видово специфични праймери Th I (5’-ACG GAA TGT ACT TGA GTT TC-3’) и Th II (5-TTT GGC CTT TCG ACC TAA C-3’) (Tilsala-Timisjarvi и Alatossava, 1997) беше извършено върху ДНК екстрахирана от чисти култури на селектирани щамове за идентифициране на вида. ДНК фрагменти на очаквано сса. 200 Ьр бяха получени след PCR с Lb. delbrueckii видо специфичен Del I и Del II праймери (Фиг 1.) и DNA фрагменти на очаквано сса. 260 Ьр бяха получени след PCR с Str. thermophilus вид специфични Th I и Th II праймери (Фиг. 2). Фрагмент с по-голям размер е вероятно димер и липсва друг подвидов референтен щам от колекцията Lb. delbrueckii ssp. delbrueckii (Фиг. 1).
Подвидовото идентифициране на Lb. delbrueckii беше проведено с праймери LB1 (5'-ААА ААТ GAA GTT GTT TAA AGT AGG ТА-3') и LLB1 (5'-AAG ТСТ GTC СТС TGG CTG G-3') (Torriani et al., 1999). ДНК фрагментите на
-18• · · · · • · • · • ·· •· • · · ·· очакван сса. 1065 Ьр бяха получени след PCR с Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus подвид специфичните LB1 и LLB1 праймери. Никакви продукти на разширение не бяха наблюдавани в друга подвидова колекция щамове Lb. delbrueckii ssp delbrueckii (Фиг 3).
Идентифициране на щамовете чрез секвентиране на PCR разширени променливи региони V1 и V3 Ha16S гРНК
За допълнително потвърждаване на видовото идентифициране беше проведено секвентиране на PCR разширени променливи региони V1 и V3 на 16S гРНК. Изолираната геномна ДНК на Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus щамовете (Selur 6, и Selur 19, и L7, L8, L12), Str. thermophilus Selur 12 щама и Lb. gasseri K7 щама беше PCR разширена от праймери P1(5'-GCG GCG TGC CTA ATA CAT GC-3') и P4 (5'-ATC TAC GCA TTT CAC CGC TAC-3') за получаване на 660 bp размер променливи региони V1 и V3 на 16S гРНК на млечно кисела бактерия за идентифициране и класиране на вида както е описано по-рано от Klijn et al. (1991). PCR протоколът беше изменен с етапите на накаляване (при 52 °C за 30 s) и удължаване (при 72°С за 30 s). PCR продуктите бяха пречистени с гел елетрофореза и екстрахирани от гела като се използва Wizard® SV Гел и PCR изчистваща система (Promega). Секвентиране на PCR продуктите беше проведено от Microsynth lab в Balgach - Швейцария. Получените последователности след това бяха анализирани директно в NCBI база данните чрез BLAST търсене за определяне на хомологията с нуклеотидни последователности от GenBank база данните и след това беше определен вида/подвида.
Lactobacillus щамовете Selur 6 и Selur 19 бяха идентични (99%) с референтната последователност на Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus АТСС ВАА-365 или АТСС 11842 (Фиг. 4 и 5), Selur 12 щмът беше идентичен (100%) с референтната последователност на Streptococcus thermophilus LMG 18311 (Фиг. 6). Беше потвърдено отново, че щам К7 е идентичен (100%) с референтната последователност на Lactobacillus gasseri АТСС 33323 (Фиг 7).
-19• ·· • · ·· •· • · ··
В съгласие с предходните резултати получени от PCRs с видовите и подвидовите специфични PCR праймери (Фиг. 1, 2 и 3) новите щамове Selur 6 и Selur 19 бяха потвърдени като Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, а щамът Selur 12 като Streptococcus thermophilus.
RAPD-PCR амплификация
Няколко олигонуклеотидни праймера бяха използвани поотделно в една серия от PCR амплифкации с цел да се намери най-добрата възможност за разделяне на RAPD характеристиките между новите Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus щамове и да се разграничат новите щамове от различни Lb. bulgaricus щамове използвани за промишлено получаване на кисело мляко:
• М13 (Torriani et al.,1999) (5'-GAG GGT GGC GGT TCT-3') (2 варианта на протокола бяха приложени: протокол описан от Torriani et al.(1999) - 4 mM МдСЬ и накаляваща температура 45 °C за 20 s - и протокол създаден от Rossetti и Giraffa (2005) - 3 mM МдСЕ и температура на накаляване 42 °C за 20 s), • OPL-01 (Van Reenen и Dicks, 1996) (5'-GGC ATG ACC T-3'), • VALIO (Tynkkynen et al., 1999) (5’-AGT CAG CCA C-3'), • 1254 (Torriani et al.,1999) (5'-CCG CAG CCA A -3'), • KGT-70GC* (5-AGC GGG CGT A-3') и • KGT-80GC* (5'-CGC GTG CCC A-3') c нов протокол от 4mM MgCI2 и циклична програма от 95°С за 2 min, 35 цикъла: 95°С за 1 min, 37°С за 2 min, 72°С за 2 min и крайно удължаване 72°С за 5 min).
*Олигонуклеотидните праймери KGT-70GC и KGT-80GC бяха конструирани от Ръководителя на Dairy Science изследователската група (University of Ljubljana, Биотехнологичен факултет)
Продуктите на амплификацияата бяха анализирани с електрофореза в
1,5 % телове с ТАЕ буфер и оцветени с SYBR Safe ДНК гел оцветител (Molecular Probes, Invitrogen) и фотографирани.
-20• · · ·
Най-съответстващи по брой, разпределение, интензитет на показани ивици за диференциране на щама се оказаха , че са RAPD праймерите 1254 (Фиг. 8) или KGT-70GC (Фиг. 9).
ПРИМЕР 2:
Преживяемост на новите щамове в симулирани условия на стомашно чревния тракт (GIT)
Различни тестове бяха проведени съгласно FSA (2005). В допълнение към щамовете Selur 6, Selur 19 и Selur 12, щам Lb. gassen К7 изолиран от детски фекалии и щамове Lb. bulgaricus L7, L8 и L12, изолирани от традиционни кисели млека бяха включени в изпитванията за сравнение.
Преживяемост в симулиран стомашен сок (SGJ)
Среда, симулираща стомашен сок (SGJ) беше получена от пептонова вода (7.5 g/l) при pH 1, 2, 3 и 6.5 като се използва 1 М солна киселина. Преди експеримента, свеж разтвор на пепсин (300 mg/L) беше добавен в количество за достигане на крайна концентрация от 15 mg/L. 10 ml от култури, култивирани една нощ на щамовете бяха концентрирани чрез центрофугиране и повторно суспендиране в 1 ml SGJ. При време Т 0 и след 20 min, 1 ml от образеца беше разреден в пептонова вода и посят върху MRS или М17 агар. Петритата бяха инкубирани за 48 h при 37 °C. Резултатите са представени като съотношение (г) между логаритмична стойност на живите след 20 минутна обработка и логаритмична стойност на живите клетки преди обработката. Съгласно резултатите, при pH 1 само щамовете Selur 6 и Selur 12 оцеляват при 20 минутна обработка в SCJ при степен сравнима с щама Lb. gasseri К7. При pH 2 приблизително половината от живите клетки на вички тествани щамове оцеляват, както и 100 % от Lb. gasseri К7 клетките. pH 3 и 6,5 са частично пагубни само за Str. thermophilus Selur 12 (Таблица 1).
Таблица 1. Преживяемост на Lb. bulgaricus щамове L7, L8, L12, Selur 19, Selur
6, Lb. gasseri K7 и Str. thermophilus Selur 12 щамове в симулиран стомашно чревен сок при pH 1, 2, 3 и 6,5 за 20 min (г са средните стойности на два теста)
Щам ΓρΗ 1 SDphi ΓρΗ 2 SDph2 ΓρΗ 3 SDPH3 ΓρΗ 6,5 SDpH 6,5
L7 0,13 0,00 0,49 0,02 0,96 0,01 1,00 0,00
L8 0,20 0,01 0,55 0,01 1,01 0,01 1,00 0,01
L12 0,12 0,00 0,58 0,05 1,00 0,00 0,99 0,02
Selur 19 0,46 0,09 0,57 0,06 1,00 0,00 1,00 0,00
Selur 6 0,46 0,07 0,53 0,04 0,99 0,01 1,00 0,01
К7 0,54 0,00 1,00 0,01 0,99 0,01 0,99 0,01
Selur 12 0,00 0,00 0,55 0,01 0,86 0,03 0,96 0,06
Легенда:
г - Среден за клетки при Т20/средно за клетки при ТО
SD - стандартно отклонение г=1 - клетките оцеляват при 20-минутно излагане на SGJ, г>1 - растеж на щама, г=0,5 - загуба на половината от живите клетки налични в културата
Преживяемост в симулиран горно чревен сок (UIJ)
Симулираният горно чревен сок (UIJ) съставен но жлъчни соли (1 g/l) суспендирани в 1х PBS буфер (pH 8). Преди експеримента се добавя свежо получен разтвор на панкреатитен ензим (1 g/L) б. 1 ml от култура, развита в
-22продължение на една нощ или от 1 g от препарата с щамове, беше инокулирана в 10 ml UIJ и инкубирана при 37 °C за 2 часа. При Т 0 и 2 h, 1 ml от суспензията беше разредена и посята върху MRS или М17 агар. Петритата бяха инкубирани за 48 h при 37 °C. Понижението в броя на клетките в три или четири логаритмични едининци веднага след излагането на UIJ (при Т 0) беше наблюдавано за всички изпитани щамове в чистите култури. След 2 h на обработка, допълнително понижение в два порядъка беше наблюдавано само за контролен щам L12. Str. thermophilus Selur 12 не беше засегнат веднага докато инкубирането за 2 часа беше пагубно за този щам (Таблица 2). Когато биомасата на щамовете е получена чрез ферментация на мляко в биореактор (описано в Пример 10) и лиофилизиран препарат с щамове е изложен на UIJ, преживяемостта на щамовете беше по-добра (Таблица 3).
Таблица 2. Преживяемост на щамове Lactobacillus L7, L8, L12, Selur 19, Selur 6, К7 и щам Str. thermophilus Selur 12 в симулиран UIJ след инкубиране при 37 °C за 2 часа (log™ стойностите са осредени от два теста)
Щам Съдър. (cfu/ml) SD TO SD T2 SD
L7 7,40 0,27 3,77 0,53 3,29 0,26
L8 8,23 0,21 4,01 0,73 2,78 1,17
L12 8,70 0,08 5,41 0,46 3,76 0,20
Selur 19 8,43 0,54 5,54 0,90 5,17 0,84
Selur 6 7,85 0,42 3,92 0,71 4,03 0,12
К7 8,68 0,11 4,80 0,45 4,20 0,80
Selur 12 7,80 0,25 7,64 0,35 0,35 0,60
-23Легенда:
съдър. cfu/ml - първоначален брой на клетките (колония образуващи единици/ml) в юдю стойности
ТО - юдю клетки при началото - време 0
Т2 - юдю клетки след 2-часа инкубиране
SD - стандартно отлонение
Таблица 3. Преживяемост на Lb. bulgaricus Selur 6 при получаване на основата на мляко в симулиран UIJ след инкубиране при 37 °C за 2 часа
Получаване Selur 6 (cfu/g) TO (cfu/g) T2h (cfu/g)
1 8,27 7,51 6,05
2 9,17 8,33 6,69
3 9,10 8,24 6,89
легенда:
Selur 6 cfu/g - първоначален брой на клетките (колония образуващи единици/g) в юдю стойности
ТО - юд10 клетки при началото - време 0
Т2 - юдю клетки след 2-часа инкубиране
-24ПРИМЕР 3: ПРОФИЛИ НА АНТИБИОТИЧНА ПОДАТЛИВОСТ НА НОВИТЕ ЩАМОВЕ
Податливостта на щамовете към различни антибиотици беше анализирана с метод на Е-тест (AB Biodisk, Soina, Швещия) като се използваха ивици, за определяне на стрептомицин (SM), гентамицин (GM), тетрациклин (ТС), ампицилин (АМ), метронидазол (MZ), клиндамицин (СМ), хлорамфеникол (CL), еритромицин (ЕМ) рифампицин (RI), ванкомицин (VA), цефотаксим (CTL), цефаклор (CF), амоксицилин (АС), азитромицин (AZ), кларитромицин (СН), или амоксицилин/клавуланат (XL) резистентността съгласно с инструкциите на производителя. Mueller Hinton Agar (MH arap) плочи с бактериални суспензии бяха приготвени както следва: суспензии във физиологичен разтвор с клетъчна плътност от приблизително 107 cfu/ml бяха получени от MRS бульон култури на една нощ и 100 pL от суспензиите бяха посяти върху сух МН агар допълнен с 10% от MRS (Klare et al., 2005). Плочите бяха инкубирани в анаеробни (за млечно кисели бактерии) или аеробни (за Str. themophilus) условия за 24 h при 37 °C преди да бъде определена минималната инхибиторна концентрация (MIC). MIC стойностите докладвани от FEEDAP Panel Report (Европейска комисия, 2005) и Danielsen е Wind (2003) бяха използвани за класиране на щама като чувствителен (s) или резистентен (г) (Таблици 4-7).
Таблица 4. Резултати за MIC чрез Etest® (AB Biodisk, Швеция) за Lb. gasseri К7 (представени са резултати от два теста ; 1.парал., 2.парал.).
Lactobacillus gasseri К7 MICbp a MICbp b MIC (pg/ml) s/r
1.парал. 2.парал.
СТРЕПТОМИЦИН (SM) (0,064-1024) 16 >256 96 96 r/s
ГЕНТАМИЦИН (GM) (0,064- 1024) 8 256 64 48 r/s
ТЕТРАЦИКЛИН (ТС) (0,016- 256) 8 4 3 4 s
АМПИЦИЛИН (АМ) (0,016-256) 4 4 2 2 s
МЕТРОНИДАЗОЛ (MZ) (0,016-256) - - >256 >256 ?
КЛИНДАМИЦИН (СМ) (0,016- 256) 4 64 8 8 r/s
ХЛРОАМФЕНИКОЛ (CL) (0,016-256) 4 16 6 4 г/s
ЕРИТРОМИЦИН (ЕМ) (0,016- 256) 4 1 0,19 0,19 s
РИФАМПИЦИН (RI) (0,016-256) - 2 0,094 0,094 s
ВАНКОМИЦИН (VA) (0,016- 256) 4 4 1,5 2 s
ЦЕФТАКСИМ (CTL) (0,02-32) - - 1,5 2 ?
ЦЕФАКЛОР (CF) (0,016-256) - - 16 16 ?
АМОКСИЦИЛИН (АС) (0,016- 256) - - 1,5 1,0 ?
АЗИТРОМИЦИН (AZ) (0,016- 256) - 8 1,5 1,5 s
КЛАРИТРОМИЦИН (СН) (0,016-256) - 8 0,125 0,125 s
АМОКСИЦИЛИН/КЛАВУЛАНАТ (XL) (0,016-256) - 16/8 0,75 0,75 s
М1Сьра: микробиологична точка на прекъсване за задължителните хомоферментатични видове на Lactobacillus, в съгласие с FEEDAP Panel Report (Европйска комисия, 2005).
М 1СЬрЬ: микробиологична точка на прекъсване в съгласие с Danielsen и Wind (2003).
sir. чувствителен/устойчив
-: няма данни ?: не е посочено, тъй като не е посочена граничната точка за този антибиотик
-26• · ·
Таблица 5. Резултати за MIC чрез Etest® (AB Biodisk, Швеция) за Lb. bulgaricus
Selur 6 (посочени са резултати от два теста; 1 .парал., 2.парал.).
Lactobacillus bulgaricus Selur 6 MICbpa MICbP b MIC (pg/ml) sir
1. парал. 2.парал.
СТРЕПТОМИЦИН (SM) (0,064-1024) 16 >256 32 48 r/s
ГЕНТАМИЦИН (GM) (0,064- 1024) 8 256 6 6 s
ТЕТРАЦИКЛИН (ТС) (0,016- 256) 8 4 1,5 1,5 s
АМПИЦИЛИН (АМ) (0,016-256) 4 4 0,125 0,125 s
МЕТРОНИДАЗОЛ (MZ) (0,016-256) >256 >256 ?
КЛИНДАМИЦИН (СМ) (0,016- 256) 4 64 0,064 0,064 s
ХЛРОАМФЕНИКОЛ (CL) (0,016-256) 4 16 2 3 s
ЕРИТРОМИЦИН (ЕМ) (0,016- 256) 4 1 0,047 0,047 s
РИФАМПИЦИН (RI) (0,016-256) - 2 0,38 0,38 s
ВАНКОМИЦИН (VA) (0,016- 256) 4 4 1,0 1,0 s
ЦЕФТАКСИМ (CTL) (0,02-32) - - 0,094 0,094 ?
ЦЕФАКЛОР (CF) (0,016-256) - - 1 1 ?
АМОКСИЦИЛИН (АС) (0,016- 256) 0,064 0,064 ?
АЗИТРОМИЦИН (AZ) (0,016- 256) 8 0,25 0,19 s
КЛАРИТРОМИЦИН (СН) (0,016-256) 8 0,064 0,047 s
АМОКСИЦИЛИН/КЛАВУЛАНАТ - 16/8 0,064 0,064 s
(XL) (0,016-256)
MlCbpa: микробиологична точка на прекъсване за задължителните хомоферментатични видове на Lactobacillus, в съгласие с FEEDAP Panel Report (Европйска комисия, 2005).
MICbpb: микробиологична точка на прекъсване в съгласие с Danielsen и Wind (2003).
s/r: чувствителен/устойчив
-: няма данни ?: не еповочено тъй като не е посочена точка на прекъсване за този антибиотик
-28Таблица 6. Резултати за MIC чрез Etest® (АВ Biodisk, Швеция) за Lb. bulgaricus
Selur 19 (посочени са резултати от два теста; 1.парал., 2.парал.).
Lactobacillus bulgaricus Selur 19 MICbp a MICbp b MIC (pg/ml) s/r
1.парал. 2.парал.
СТРЕПТОМИЦИН (SM) (0,064-1024) 16 >256 24 32 r/s
ГЕНТАМИЦИН (GM) (0,064- 1024) 8 256 4 4 s
ТЕТРАЦИКЛИН (ТС) (0,016- 256) 8 4 2 2 s
АМПИЦИЛИН (АМ) (0,016-256) 4 4 0,047 0,064 s
МЕТРОНИДАЗОЛ (MZ) (0,016-256) >256 >256 ?
КЛИНДАМИЦИН (СМ) (0,016- 256) 4 64 0,032 0,032 s
ХЛРОАМФЕНИКОЛ (CL) (0,016-256) 4 16 3 3 s
ЕРИТРОМИЦИН (ЕМ) (0,016- 256) 4 1 0,064 0,047 s
РИФАМПИЦИН (RI) (0,016-256) - 2 0,25 0,25 s
ВАНКОМИЦИН (VA) (0,016- 256) 4 4 2 1,5 s
ЦЕФТАКСИМ (CTL) (0,02-32) - - 0,5 0,38 ?
ЦЕФАКЛОР (CF) (0,016-256) - - 8 8 ?
АМОКСИЦИЛИН (АС) (0,016- 256) 0,25 0,38 ?
АЗИТРОМИЦИН (AZ) (0,016- 256) 8 0,5 0,5 s
КЛАРИТРОМИЦИН (СН) (0,016-256) 8 0,047 0,047 s
АМОКСИЦИЛИН/КЛАВУЛАНАТ - 16/8 0,5 0,38 s
(XL) (0,016-256)
Ml
Cbp a: микробиологична точка на прекъсване за задължителните хомоферментатични видове на Lactobacillus, в съгласие с FEEDAP Panel Report (Европйска комисия, 2005).
М1Сьр ь: микробиологична точка на прекъсване в съгласие с Danielsen и Wind (2003).
sir: чувствителен/устойчив
-: няма данни ?: не еповочено тъй като не е посочена точка на прекъсване за този антибиотик
-30Таблица 7. Резултати за MIC чрез Etest® (AB Biodisk, Швеция) за Lb. bulgaricus
Selur 12 (посочени са резултати от два теста; 1.парал., 2.парал.).
Streptococcus thermophilus Selur 12 MICbp a NCCLSb for streptococci MIC (pg/ml) s/r
1.парал. 2.парал.
СТРЕПТОМИЦИН (SM) (0,064-1024) 16 64 64 r
ГЕНТАМИЦИН (GM) (0,0641024) 8 16 24 r
ТЕТРАЦИКПИН (ТС) (0,016- 256) 4 0,75 0,75 s
АМПИЦИЛИН (АМ) (0,016-256) 4 - 0,125 0,19 s
МЕТРОНИДАЗОЛ(MZ) (0,016-256) >256 >256 ?
КЛИНДАМИЦИН (СМ) (0,016- 256) 4 0,064 0,047 s
ХЛРОАМФЕНИКОЛ (CL) (0,016-256) 8 2 2 s
ЕРИТРОМИЦИН (ЕМ) (0,016- 256) 4 6 6 r
РИФАМПИЦИН (RI) (0,016-256) - 4 0,125 0,125 s
ВАНКОМИЦИН (VA) (0,016- 256) 4 2 2 s
ЦЕФТАКСИМ (CTL) (0,02-32) - 64 0,19 0,19 s
ЦЕФАКЛОР (CF) (0,016-256) - 32 1,5 1,5 s
АМОКСИЦИЛИН (АС) (0,016- 256) 0,38 0,38 ?
АЗИТРОМИЦИН (AZ) (0,016- 256) 8 32 24 r
КЛАРИТРОМИЦИН (СН) (0,016-256) 8 6 6 s
АМОКСИЦИЛИН/КЛАВУЛАНАТ - 16/8 0,19 0,125 s
(XL) (0,016-256)
MICbP a: микробиологична точка на прекъсване за задължителните хомоферментатични видове на Lactobacillus, в съгласие с FEEDAP Panel Report (Европйска комисия, 2005).
MICbpb: микробиологична точка на прекъсване в съгласие с Danielsen и Wind (2003).
s/r: чувствителен/устойчив
-: няма данни ?: не е посочено тъй като не е посочена точка на прекъсване за този антибиотик
ПРИМЕР 4:
АНТИБАКТЕРИАЛНА АКТИВНОСТ НА НОВИТЕ ЩАМОВЕ
На всички щамове антибактериалната активност беше тествана срещу 31 индикаторни щама, включващи различни млечно кисели бактерии, Clostridium perfringens 1b 1106, Cl. tyrobutyricum DSM 2637, Bacilus cereus CCM 2010T, три щама на Staphyilococcus aureus, Enterococcus durans CCM 5612, два щама на Enterococcus faecalis, E. faecium LMG 11423, Listeria monocytogenes IM 372, L. innocua ATCC 33090 и E. coli O8:K88.
Agar-spot тест беше проведен, като се използва MRS arap с понижена концентрация на глюкоза (0,2 % wt/v) за щамовете Lactobacillus и М17 агар за щама Str. thermophilus Selur 12 и 24 часово инкубиране на тестваните бактериални култури преди покриване на плочите с индикаторни микроорганизми. Покривният агар беше получен от 5 ml от съответен мек агар за различни индикаторни щамове (MRS за млечно кисели бактерии, BHI за В. cereus, Е. coli, S. aureus и Listeria щамове, RCM за Clostridium щамове и М17 за ентероколи) и 50 μΙ от 18-h индикаторни култури. Следващо 24-h инкубиране на покритите плочи беше проведено при условия подходящи за отделните индикаторни щамове (30 °С/аеробиоза за В. cereus и Lb. sakei, 37 °С/аеробиоза за млечво киселите бактерии, ентерококите Е. coli, S. aureus и Listeria щамовете, 37 °С/анаеробиоза за колстридия).
-32• · • ·
Само резултатите за индикаторните щамове инкубирани от поне един тестван щам са представени в таблица 8. Фиг. 10 показва антимикробната активност на Lb. bularicus щамовете Selur 6 и Selur 19 и Lb. gasseri К7 щама срещу Staphylococcus aureus ATCC 29213.
Таблица 8. Антимикробна активност на новите щамове (Lb. bulgaricus Selur 6 и
Selur 19, Str. thermophilus Selur 12) и щама Lb. gasseri K7
Тествани щамове Индикатор щамов«Г\. K71 Selur61 Selur191 Selur122
I Lb. helveticus ATCC 15009 ++ + + + (s)
Lb. gasseri DSM 20243 + + + +
Lb. sakei NCDO 2714 +++ (s) + ++ + (s)
Lb. acidophilus ATCC4356 +++ ++ (s) +++ (s) ++ (S)
Lb. johnsonii VP111088 + + ++ + (s)
Lb. bulgaricus LMG 6901T +++ ++ ++ ++ (S)
Lb. delbrueckii LMG 6412T +++ (s) + ++ ++
Lb. lactis IM 350 +++ + ++ + (s)
Ec. faecalis LMG 7937 ++ (s) ++ ++ (s) +
Ec. faecalis CCM 4647 ++ - + n.d.
Ec. faecalis LMG 11423 + (s) - + (s) n.d.
Ec. faecium LMG 11423 +++ ++ ++ +
B. cereus CCM 2010T + (s) - + (s) n.d.
S. aureus ATCC 29213 +++ +++ +++ -
S. aureus IM 388 +++ +++ +++ -
S. aureus IM 390 +++ +++ (s) +++ -
E. coli ATCC 25922 - + ++ n.d.
-33• ft * · ft · • ft • ft ·
Е. co//АТСС 11229 I - - + n.d.
Li. monocytogenes IM 372 +++ +++ +++ +
Li. innocua АТСС 33090 I +++ +++ +++ +
Легенда:
1: точков тест беше проведен върху MRS arap плоча 2: точков тест беше проведен върху М17 агар плоча не беше наблюдавана зона на инхибиране +: зона на инхибиране варираща между 0 и 2 mm ++: зона на инхибиране варираща между 2,5 и 5mm +++: зона на инхибиране > 5,5 mm s: остро ъглена зона, която обикновено е предизвикана не само от киселина, но също така и от други антимикробни вещества
n.d.: не е определено
ПРИМЕР 5: ХИДРОФОБНИ СВОЙСТВА НА НОВИТЕ ЩАМОВЕ
Хидрофобността беше определена съгласно с Vinderola и Reinheimer (2003) чрез измерване на разделянето от бактериални клетки между органичната (n-хексадекан) и водната фази. Хидрофобността на клетъчната повърхност (%Н) беше след това изчислена като се използва следващата формула:
%Н = (Ао-А)/Ао*1ОО където Ао и А са оптичните плътности преди и след екстракцията с органичен разтворител, съответно. В допълнение към щамовете Lb. bulgaricus Selur 6 и Selur 19 щамовете Lb. bulgaricus L7, L8 и L12, изолирани от традиционни български кисели млека и Lb. gasseri К7 бяха включени в тестването за сравнение.
Висока клетъчно - повърхностна хидрофобност беше определена за Lb.
gasseri К7 и Lb. bulgaricus Selur 19. Хидрофобността на всички други щамове беше доста ниска и вариараше от 12.8 и 16.9 % (таблица 9).
Таблица 9. Хидрофобност на новите щамове Lb. bulgaricus и Str. thermophilus
Vzorec AO A H (%)
L7 1,002 0,857 14,47
L8 1,062 0,883 16,85
L12 1,069 0,932 12,82
Selur 19 1,023 0,221 78,40
Selur 6 0,948 0,812 14,35
К7 1,058 0,115 86,13
Selur 12 1,007 0,875 13,11
Пример 6: β-галактозидазна активност на щамовете β-галактозидазната (B-Gal) активност на новите щамове беше изследвана по протокола на Vinderola и Reinheimer (2003) като се изпозлва синтетичното съединение о-нитрофенил-В-О-галактопиранозид (ONPG). Функцията на B-Gal в клетката е да хидролизира лактоза до глюкозата и галактозата така, че те могат да бъдат използвани като въглероден източник. Синтетичното съединение OPNG е субстрат, който след като е хидролизиран води до получаване на галактоза и о-нитрофенил, който има жълт цвят. Когато OPNG е в излишък спрямо ензима в реакцията, получаването на о-нитрофенол за единица време е пропорционално на концентрацията на В-галактозидаза; по този начин получаването на жълт цвят може да бъде използвано за определяне на ензимната концентрация. Стойностите на абсорбцията и при 420 и 560 пт
-35• · бяха определени за всеки образец и β-Gal активност беше изчислена (в Miller единици = стандартизирано количесво от β-Gal активност) както следва:
Iqqqχ (Λ20 ~0-75х Л2560)) _ Мюлерови единици (ίχνχΑ1560) t = реакционно време в минути v = обем на културата анализиран в милилитри
А420 = абсорбция на жълт о-нитрофенол
А2560 = абсорбционна стойност на реакционната смес (разсейване от клетъчен остатъци, които когато са умножени с 1,75 се приближава до разсейването наблюдавано при 420 nm)
AI560 = се отнася до клетъчната плътност в промита клетъчна суспензия прези анализ
За сравнението три добре известни пробиотични щамове бяха включени в теста (Lb. rhamnosus ATCC 53103, Lb. casei DN-11401 и Lb. casei Shirota) (Таблица 10).
Таблица 10. β-галактозидаза активност на новте щамове
Щам Miller единици
Lb. bulgaricus Selur 6 3710,0 ±111,2
Str. thermophilus Selur 12 156,2 ±3,5
Lb. bulgaricus Selur 19 3158,6 ± 17,2
Lb. gasseri K7 9,4 ± 2,3
Lb. rhamnosus ATCC 53103 5,6 ± 0,8
Lb. case/DN-11401 8,1 ±2,1
Lb. casei Shirota 37,9 ±1,2
-36• · • · · • ···
Пример 7:
Способност за адхезия на новите щамове
Важно функционално качество за пробиотичната бактерия е способността на щама да се залепи към епителниет клетки. В нашите експерименти бяха използвани Сасо-2 клетки като in vitro модел. Изследванията за прилепване съдържат следващите етапи:
a) Сасо-2 човешка колон аденокарциномна клетъчна линия (IZSBS BS TCL 87) беше рутинно култивирана в модифицирана по Dulbecco среда на Eagle (DMEM) (Sigma, САЩ) с L-глутамин, и 10 % (обемна фракция) от зародишен телешки серум Fetalclone II (Нусюпе, Германия) и 50 gg/ml_ от гентамицин сулфат (Sigma, САЩ). Инкубирането беше проведено при 37 °C в 10 % СО2 атмосфера.
b) За анализ на адхезията, Сасо-2 клетките бяха посяти при клетъчна концентрация от 104 клетки/ямка в 24-ямкови стандарни плата за тъканна култура. Клетките бяха задържани за 2 седмици след сливането, когато те бяха разглеждани като напълно диференцирани. Поне 24 h преди тестовете, DMEM среда с гентамицин беше заменена със същата среда без антибиотик. Млечно киселите и стрептококовите клетки от 18-h MRS култури бяха получени чрез центрофугиране (3500 д/ 10 min) и промити еднократно с PBS буфер (рН=7.3) и един път с буфер изпозлван в анализа (DMEM без FBS и антибиотик, рН=7). Клетъчната плътност беше доведена до оптичната плътност от 0.5 чрез измерване на абсорбцията при 600 nm. Бактериалните клетки бяха утаени чрез центрофугиране и повторно суспендирани в половин обем от DMEM, рН=7. Точният брой на живите бактериални клетки изпозлвани в анализите беше определен за всеки експеримент чрез преброяване на колониите върху MRS (за лактобацили) или М17 (за стрептококи) агар.
c) Анализите на адхезията бяха проведени в 24-ямкови стандартни плата за тъканни култури. След промиване Сасо-2 монослой беше прибавен два пъти към всяка ямка с PBS (рН=7.3), 0.5 mL от суспензията на лактобацили или стрептококи в DMEM (съдържащ клетките от 1 ml от суспензията на лактобацилите с OD=0,5) и инкубиран за 30 min в атмосфера с 10 % СО2, при 37 °C. После, несвързаните
-37бактериални клетки бяха отстранени чрез 3-кратно промиване с PBS. За да се изброят свързаните бактерии, всяка ямка беше обработена с 1 mL 0.05 % Triton Х-100 за 10 min. Смеси от лизирани Сасо-2 клетки и бактериални клетки бяха поставени върху MRS arap (Merck, Германия). Изброяването беше проведено след 72 h инкубиране при 37 °C в микроаерофилна атмосфера. Всеки бактериалиен щам беше тестван в десет ямки . Резултатите са средните стойности от 10 данни и са предсатвени на фиг. 11.
Lb. bulgaricus Selur 19 беше тестван също така за конкурентни и изключващи свойства срещу двата щама, S. aureus АТСС 29213 и Е. coli АТСС 25922. Последните два щама бяха избрани на базата на резултатите от агар точкови анализи - те бяха инхибирани от Lb. bulgaricus Selur 19. S. aureus ATCC 29213 и E. coli ATCC 25922 бяха култивирани в BHI бульон и получени както е описано за лактобацилите, с единствената разлика , че 10-кратно по-разредени клетъчни суспензии от тези на лактобацилите бяха приложени в теста. (Суспензиите бяха регулирани до OD=0,5, следващо разреждане до 1:10, центрофугирани; след това клетките бяха повторно суспендирани в подходящо количество от DMEM).
В конкурентния анализ (Lb. + S. aureus·, Lb. + Е. coli), лактобацилите бяха добавени към Сасо-2 клетки в ямките едновремено с S. aureus и Е. coli. За тестване на възможното изключване на S. aureus и Е. coli от лактобацилите (Lb. / S. aureus; Lb. / Е. coli), инкубирането на Сасо-2 клетки с лактобацили беше последвано от промиване на несвързаните клетки, добавяне на S. aureus или Е. coli и следващи 30 min на инкубиране. Сасо-2 клетките бяха лизирани от 0.05 % Triton Х-100 (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО, САЩ) за 5 min, и прилепналите S. aureus и E. coli бяха изброени (cfu/ямка) чрез преброяване на платото при BHI и VRB агар среда (Merck), съответно. BHI и VRB платата бяха инкубирани за 24 h при 30°С.
Адхезията на Lb. bulgaricus Selur 6 и Selur 19 и Str. thermophilus Selur 12 щамовете беше като цяло сравнима или в случая когато % на прилепване беше
-38изчислен (прилепнали cfu/ямка разделено с добавените cfu/ямка представено в %) дори по-добре от това, определено за Lb. gasseri К7 и някои други пробиотични щамове (Lb. rhamnosus GG, Lb. johnsonii Lj1, Lb. reuteri ING 1, Lb. Shirota SHI) (Фиг. 11).
Когато конкуренцията между Е. coli АТСС 25922 и Lb. bulgaricus Selur 19 или между S. aureus ATCC 29213 и Lb. bulgaricus Selur 19 за прилепване към Сасо-2 клетки беше тествана 1.75 х 107 cfu/ямка от Selur 19 и 2.22 х 107 cfu/ямка от Е. coli (съотношението на добавените cfu Е. coli: Selur 19 = 1,3 :1) или 1.75 х 107 cfu/ямка от Selur 19 и 0.52 х 107 cfu/ямка от S. aureus (съотношението на добавените cfu S. aureus'. Selur 19 = 0,3 :1) беше добавено.
β
Lb. bulgaricus Selur 19 беше способен да инхибира прилепването на Е. coli АТСС 25922 когато и двата щама бяха добавени към Сасо-2 клетки едновремено при близки концентрации. В анализа на изключване (Selur 19 / Е. coli) прилепването на Е. coli не беше инхибирано. Обаче, Selur 19 не беше способен да инхибира прилепването на S. aureus АТСС 29213, въпреки, че концентрацията на лактобацили беше около З-пъти по -висока (таблица 11).
Таблица 11. Ефект на Lb. bulgaricus Selur 19 върху адхезивната способност на
Е. coli АТСС 25922 и S. aureus АТСС 29213
Анализ Слепнали Е. coli (log cfu/ямка) Инхибиране на адхезията (%)*
Е. coli 6,21 ±0.08
Конкуренция (Е. co// + Selur 19) 5,72±0.08 67
Изключване (Selur 19/Е. coli) >7,3 0**
Слепнали S. aureus (log cfu/ямка)
S. aureus 5,39±0.10
Конкуренция^, aureus + Selur 19) 5,39±0.11 0
Изключване (Selur 19/S. aureus) 5,63±0.13 0 **
* Инхибиране на адхезията (%) беше изчислено чрез сравняване на резултатите (слепнали cfu от Е.соПямка\) получени в анализите Е. coli + Selur 19 и Selur 19/Е coli с адхезията на Е. coli самостоятелно (100 %) ** Адхезия дори по-добра спрямо когато е самостоятелно
Пример 8:
Имунен отговор на клетъчна линия ТНР-1 микрофаги при in vitro стимулиране с Selur 6 и К7
Selur 6 и К7 бяха тествани за тяхната способност да въздействат на отделянето на цитокини от клетъчна линия на макрофаги ТНР-1. Поради техните добре известни пробиотични ефекти, включващи модулация на имунна реакция, Lb. rhamnosus GG и Lb. casei DN-114001 бяха изпозлвани като позитивен контрол.
Процедурата е следната:
Клетъчна линия ТНР-1 беше стимулирана с ТРА (форболов естер) за 24 часа за да се предизвика делене в зрелите макрофаги. Разделените клетки бяха промити и инкубирани за 24 часа със свежа среда (RPMI-1640) без ТРА, допълнена с 10% волски серум и антибиотици. Експериментът беше проведен на третия ден когато лактобацилите, LPS (липополизахариди на Е. coli 0111 :В4) бяха добавени и инкубирани с макрофаги за 24 часа. Концентрацията на шест различни цитокини (IL-8, IL-Ιβ, IL-6, IL-10, TNF в IL-12p70) беше измерено от BD™ СВА (Cytometric Bead Array) набор за възпаление при човек, като се изпозлва течен цитометър (BD FACSCalibur).
Selur 6 и К7 щамове не предизивкаха отделяне на възпалителни цитокини (IL-8, IL-6 и TNF) от клетъчната линия от макрофаги ТНР-1, докато
-40тяхното отделяне беше предизвикано чрез добавяне на LPS. Когато LPS и Selur 6 или К7 щамовете бяха приложени едновремено, и двата щама понижиха концентрацията на основната част от възпалителните цитокини. Найзабележителните промени в цитокиновите концентрации бяха наблюдавани при нивата от IL-8 (Таблица 12). Когато Selur 6 или К7 бяха добавени самостоятелно ние забелязахме леко повишение в IL-1 β (посредник на локално възпаление) концентрациите, обаче ефектът не беше статистически значим. Всички имунни реакции бяха сравними към контролните щамове. Концентрациите на IL-10 и 11_-12р70 не бяха засегнати от нито един от тестваните щамове.
Таблица 12. Редукция на IL-8 производството предизвикано от LPS
Бактериален щам % на редукция
Lb. gasseri К7 93
Lb. crispatus 4/26* 86
Lb. bulgaricus Selur 6 99
Lb. rhamnosus GG 95
Lb. case/DN 114001 99
* щам изолиран от черво на прасе
Пример 9: Ферментативна способност на различни комбинации от щамове
Различни комбинации от щамове и ферментационни температури бяха тествани. Чисти култури на една нощ бяха комбинирани и инокулирани в количество от 2 % в стерилно обезмаслено мляко и инкубрани при 42 °C и 37 °C (само комбинациите S20 + L89 и S20 + L89 + К7). По време на ферментацията pH беше измерено и ферментацията беше спряна при достигане на pH от 4,6. След ферментацията образци от ферментирало мляко
-41 • · · · ·
бяха посяти върху MRS, М17 и MRS с клиндамицин (0,1 mg/l) arap за селективно изброяване на стрептококите, лактобацилите и Lb. gasseri К7.
Измененията на pH стойностите по време на фермантацията на млякото инкубирано с Str. thermophilus Selur 12 и различни лактобацили щамове (Selur 6, Selur 19 и Selur 19 + К7) при съотношение 1:1 или 1:1:1 (Selur 12 + Selur 19 + К7) и при 42 °C и 37 °C (само Selur 12 + Selur 19 и Selur 12 + Selur 19 + К7) са представени на фиг. 12. Средният брой (в cfu/mL) от единичните щамове след ферментацията е представен в таблица 13.
Таблица 13. Среден брой на Str. thermophilus selur 12, Lb. bulgaricus Selur 6 или
Selur 19 и Lb. gasseri K7 във ферментирали млечни проби (cfu/mL)
Комбинация Str. thermophilus Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus Lb. gasseri K7
Selur 12+Selur6 2,16*108 9,30*108
Selur 12+Selur 19 3,10*109 8,27*108
Selur 12+Selur 19+K7 3,90*109 1,24*109 8,70*108
Selur 12+Selur 19* 8,20*109 4,20*109
Selur 12 +Selur 19+ K7* 1,57*109 1,47*109 1,57*109
* ферментация при 37 °C
-42Пример 10:
Технология за получаване на биомаса и получаване на пробиотични стартерни култури, хранителни добавки и фармацевтични препарати
Щамовете са приготвени като чисти култури чрез култивиране в продължение на 18-часа (условията на култивиране са описани в таблица 14).
Бульонни култури на една нощ са центрофугирани (10 min, 6000 g), супернатантът е отстранен и клетките са повторно суспендирани в 10-пъти помалко количество в разтвор Ringer. Клетъчната концентрация в 1 ml от клетъчна суспензия е около 1х109 - 1х1О10 клетки. Клетъчните суспензии на Selur 12, Selur 6 и Selur 19 са инокулирани разделно или в комбинации в стерилизирано възстановено обезмаслено сухо мляко (1 % инокулум), и Lb. gasseri К7 (1 % инокулум) във възстановено обезмаслено сухо мляко допълнено с 0,4 % от дрождев екстракт (Biolife 412220; добавяне в млякото преди стерилизиране на млякото), съответно за получаването на матерни култури, които могат да бъдат използвани като инокулум за ферментацията в биореактор. Култивирането е в продължение на една нощ при 42 °C за Selur 12, Selur 6 и Selur 19 и при 37 °C за Lb. gasseri К7.
Биомасата е получена чрез ферментация на мляко, суроватка или растителни субстрати такива като соево, оризово или друго зърнено мляко. Етапите в процедурата, когато млякото е изпозлвано като субстрат са както следват:
a) За получаване на средата 100 g/L от обезмаслено сухо мляко и 4 g/L от дрождов екстракт са разтворени в питейна вода и сместа е стерилизирана при 115 0 за 30 min в биореактор. След стерилизирането средата е охладена до температура подходяща за различните щамове или комбинация от щамове .
b) Получаване на биомаса чрез ферментация - технологични параметри
Пример 1
Получената среда в биореактор се иноккулира с 1 % от свежа 18часова култура от Str. thermophilus Selur 12 и с 1 % от свежа 18-часова култура от Lb. bulgaricus Selur 6 и/или Lb. bulgaricus Selur 19. Култивирането се провежда в продължение на 1 h при 42 °C лед това температурата се повишава до 44 °C и по време на ферментацията през следващите 3-4 часа се провежда неутрализацията три пъти с NH4OH за задържане на pH между 4.7 и 5.7. Разбъркването на средата се провежда единствено по време на неутрализацията. В края на ферментацията се добвя 10 % (об/об) криопротектор (200 g/L разтвор на
-43* · · · · • * стерилно обезмаслено мляко на прах) и ферментационната среда се охлажда бързо до 22 °C и задържа при тази температура за 30 min. След което културата се подава за лиофилизация.
Пример 2
Получената среда в биореактора е инокулирана с 2 % свежа 18часова култура от Lb. gasseri К7 и е проведена 16-часова ферментация при 37 °C без pH регулиране. В края на ферментацията 10 % (об/об) от крио-протектор (200 g/L разтвор на стерилно обемаслено мляко на прах ) е добавен и ферментационната среда в биореактора е охладена до 22 °C за 30 min. Ферментационната среда след това се лиофилизира.
ф
Пример 3
Получената среда в биореактора е инокулирана с 2 % свежа 18часова култура от Lb. gasseri К7 и е проведена ферментация при 37 °C без регулиране на pH. След 16-часа на ферментиране /култивиране при 37 °C pH е повишено до 5,7 и ферментационният бульон е инокулиран с 2 % от свежа 18-часова култура от Lb. bulgaricus Selur 6 или Selur 19. След посева температурата е повишена до 44 °C и по време на ферментацията за следващите 3-4 часа неутрализация с NH4OH от pH 5,0 до pH 5,7 е проведено три пъти. Разбъркване на ферментационната серда се провежда само по време на неутрализацията. В края на ® ферментацията 10 % (об/об) от криопротектор (200 g/L разтвор на стерилно обезмаслено мляко на прах) е добавен и ферментационният бульон в биореактора е охладен до 22 °C за 30 min.
с) Лиофилизация - технологични параметри
Дебелина на течния слой - 10 mm; охлаждане при 4 °C за 3 часа; замразяване при -40 °C за 90 минути; загряване при 35 °C до края на изпарението (<6 % вода).
Препаратите съдържат изсушени, лиофилизирани бактерии с концентрация на живи клетки, която е обикновено в диапазона от 107 до Ю10 cfu
-44на грам, по-малко от 400 mg от лактоза на грам и лактулоза, която е в диапазона от 25 до 50 mg/g.
Таблица 14. Оптимални условия за растеж на щамовете
Щам Растежна среда Температура/условие
Str. thermophilus Selur 12 M17 (бульон,arap) или 10 % възстановено обезмаслено мляко 42 °C / аеробно
Lb. bulgaricus Selur 6 MRS (бульон, агар) или 10 % възстановено обезмаслено мляко 42 °C / анаеробно
Lb. bulgaricus Selur 19 MRS (бульон, агар) или 10 % възстановено обезмаслено мляко 42 °C / анаеробно
Lb. gasseri K7 MRS (бульон, агар) 37 °C / анаеробно
Пример на продукт (фармацевтичен състав):
Лиолакт, 400ти капсули
Съдържание За една капсула
mg %
Лиофилизат Lactobacillus gasseri (К7) Selur 20 160 39,41%
Лиофилизат Lactobacillus bulgaricus (BF) Selur 6 + Streptococcus thermophilus (Selur 12) 80 19,70%
Лиофилизат Lactobacillus bulgaricus Selur 6 (L89) 160,0 39,41%
-45·· ·· ·
SiO2 (Aerosil A200) 2,0 0,49%
Магнезиев стеарат 4,0 0,99%
Общо за една капсула 406,0 100%
1. Разтеглят се необходимите количества от всяка съставка, като процент от общото количество смес, необходима за получаване на партидата.
2. Всички компоненти се песяват през сито с размер на отвора 0.5 mm:
3. Смесват се
3.1. подава се към смесителя за смесване в продължение на 30 min, с изключение на магнезиевия стеарат
3.2. прибавя се към сместа от т 3.2. пресятото предварително количество магнезиев стеарат и се провежда смесване в продължение на допълнителни 10 min:
4. Готовата смес се опакова в контейнери
Цитирана литература:
1. Basic Local Alignment Search Tool: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
2. Bogovic Matijasic B, Rogelj I. Lactobacillus K7 - A New Potential Probiotic Strain. Food Technol. Biotechnol. 2000; 38:113-119.
3. Bogovic Matijasic B, Narat M, Zoric M. Adhesion of two Lactobacillus gasseri Probiotic Strains on Caco-2 Cells. Food Technol. Biotechnol. 2003; 41: 83-88.
4. Bogovic Matijasic B, Stojkovic S, Salobir J, Malovrh S, Rogelj I. Evaluation of the Lactobacillus gasseri K7 and LF221 strains in weaned piglets for their possible probiotic use and their detection in the faeces. Anim. Res. 2004; 53: 35-44.
5. Bogovic Matijasic B, Narat M, Zoric Peternel M, Rogelj I. Ability of Lactobacillus gasseri K7 to inhibit Escherichia coli adhesion in vitro on Caco-2 cells and ex vivo on pigs’ jejunal tissue. Int. J. Food Microbiol. 2006; 107: 92 96.
• · ft ft · · • · · · е ·*« • · · · · • · · · · ·
6. Bogovic Matijasic B, Koman Rajsp M, Perko B, Rogelj I. Inhibition of Clostridium tyrobutyricum in cheese by Lactobacillus gasseri. Int. Dairy J. 2007; 17(2): 157-166.
7. Chopra A, Doiphode W. Ayurvedic medicine - Core concept, therapeutic principles, and current relevance. Med. Clin.North Am. 2002 ; 86 (1): 75.
8. Canzek Majhenic A, Bogovic Matijasic B, Rogelj I. Chromosomal location of the genetic determinants for bacteriocins produced by Lactobacillus gasseri K7. J. Dairy Res. 2003; 70:199-203.
9. Danielsen M, Wind A. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. Int. J. Food Microbiol. 2003; 82:1-11.
10. Delgado S, O’Sullivan E, Fitzgerald G, Mayo B. Subtractive Screening for Probiotic Properties of Lactobacillus Species from the Human Gastrointestinal Tract in the Search for New Probiotics. J. Food Sci. 2007; 65 (8): M310-M315.
11. ЕШ M, Callegari ML, Ferrari S, Bessi E, Cattivelli D, Soldi S, Morelli L, Feuillerat NG, Antoine JM. Survival of Yogurt Bacteria in the Human Gut. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72 (7): 5113-5117.
12. European Commission, 2005. European Commission, Opinion of the FEEDAP Panel on the updating of the criteria used in the assessment of bacteria for resistance to antibiotics of human or veterinary importance, EFSA J. 2005; 223: 1-12.
13. FAO/WHO, 2002. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. London, Ontario: Food and Agriculture Organization of United Nations and World Health Organization Working Group Report.
14. Final Technical report for FSA project ref G01022. An evaluation of probiotic effects in the human gut: microbial aspect, FSA 2005, ref G01022, 2-22.
15. Garcia-Albiach R, Jos6 M, de Felipe P, Angulo S, Morosini M-l, Bravo D, Baquero F, del Campo R. Molecular analysis of yogurt containing Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus in human intestinal microbiota. Am. J. Clin. Nutr. 2008; 87; 91-96.
16. Guarner F, Perdigon G, CorthierG, Salminen S, Koletzko B, Morelli L. Should yoghurt cultures be considered probiotic? Br. J. Nutr. 2005; 93: 783-786.
17. Klare I, Konstabel C, Muller-Bertling S, Reissbrodt R, Huys G, Vancanneyt M, Swings J, Goossens H, Witte W. Evaluation of New Broth Media for Microdilution Antibiotic Susceptibility Testing of Lactobacilli, Pediococci,
-47• · ·
Lactococci, and Bifidobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71 (12): 89828986.
18. Klijn N, Weerkamp AH, De Vos WM. Identification of Mesophilic Lactic Acid Bacteria by Using Polymerase Chain Reaction-Amplified Variable Regions of 16S rRNA and Specific DNA Probes. Appl. Environ. Microbiol. 1991; 57 (11): 3390-3393.
19. Korhonen H, Pihlanto A. Bioactive peptides: Production and functionality. Int. Dairy J. 2006; 16: 945-960.
20. Kullen MJ, Sanozky-Dawes RB, Crowell DC, Klaenhammer TR. Use of the DNA sequence of variable regions of the 16S rRNA gene for rapid and accurate identification of bacteria in the Lactobacillus acidophilus complex. J. Appl. Microbiol. 2000; 89 (3): 511-516.
21. Mater DD, Bretigny L, Firmesse O, Flores MJ, Mogenet A, Bresson JL, Corthier G. Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus survive gastrointestinal transit of healthy volunteers consuming yogurt. FEMS Microbiol Lett. 2005; 15 (2): 185-7.
22. Meisel H. Overview on Milk Protein-derived Peptides. Int. Dairy J. 1998; 8 (5/6): 363-373.
23. Mitsuoka T. Significance of dietary modification of intestinal flora and intestinal environment. Biosci. Microflora, 2000; 19: 15-25.
24. Rogelj I, Bogovic Matijasic B. Lactobacillus gasseri LF221 and K7 - from isolation to application. Biologia, 2006; 61: 761—769.
25. Rossetti L, Giraffa G. Rapid Identification of Dairy Lactic Acid Bacteria by MISgenerated RAPD-PCR Fingerprint Databases. J.Microbiol. Meth. 2005; 63: 135-144.
26. Shah NP. Functional cultures and health benefits. Int. Dairy J. 2007; 17:12621277.
27. Smithers GW. Whey and whey proteins—From ‘gutter-to-gold’. Int. Dairy J. 2008; 18: 695- 704.
28. Tannock GW, Tilsala-Timisjarvi A, Rodtong S, Ng J, Munro K, Alatossava T. Identification of Lactobacillus Isolates from the Gastrointestinal Tract, Silage, and Yoghurt by 16S-23S rRNA Gene Intergenic Spacer Region Sequence Comparisons. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65 (9): 4264-4267.
29. Tilsala-Timisjarvi A, Alatossava T. Development of Oligonucleotide Primers from the 16S-23S rRNA Intergenic Sequences for Identifying Different Dairy and Probiotic Lactic Acid Bacteria by PCR. Int. J. Food Microbiol. 1997; 35: 49-56.
30. Torriani S, Zapparoli G, Dellaglio F. Use of PCR-Based Methods for Rapid Differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis. Appl. Environ. Microbiol. 1999 ; 65 (10): 4351-4356.
31. Tynkkynen S, Satokari R, Saarela M, Mattila-Sandholm T, Saxelin M. Comparison of ribotyping, randomly amplified polymorphic DNA analysis, and pulsed-field gel electrophoresis in typing of Lactobacillus rhamnosus and L. case/strains. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65: 3908-3914.
32. Van Reenen CA, Dicks LMT. Evaluation of Numerical Analysis of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-PCR as a Method to Differentiate Lactobacillus plantarum and Lactobacillus pentosus. Cur. Microbiol. 1996; 32: 183-187.
33. Vinderola CG, Reinheimer JA. Lactic acid starter and probiotic bacteria: a comparative in vitro study of probiotic characteristics and biological barrier resistance. Food Res. Int. 2003; 36: 895-904.
34. Zoric Peternel M. Aktivnost bakteriocinskih kompleksov sevov Lactobacillus gasseri K7 in Lactobacillus gasseri LF221 v razlicnih ekspresijskih sistemih ; doktorska disertacija = Activity of bacteriocin complex of Lactobacillus gasseri K7 and Lactobacillus gasseri LF221 strains in different expression systems : doctoral dissertation. Ljubljana, 2007:138 p.
• е ·* · « · • 9 • · · • 9 ···· ·
ft 4 • • • + • «
• · • • • е
• · • · «
> · е « •
• ·· ·· ··
ПРЕТЕНЦИИ

Claims (22)

1. Бактериален щам, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Selur 6, изолиран от традиционно кисело мляко получено от сурово мляко от Стара планина (България) и депозиран в ССМ под регистров № ССМ 7712.
2. Бактериален щам, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Selur 19, изолиран от традиционно кисело мляко получено от сурово мляко от Родопите (България) и депозиран в ССМ под регистров № ССМ 7713.
3. Бактериален щам Streptococcus thermophilus Selur 12, изолиран от традиционно кисело мляко получено от сурово мляко от Стара планина (България) и депозиран в ССМ под регистров № ССМ 7711.
4. Стартерна култура, съдържаща поне един от бактериалните щамове, съгласно претенции 1 до 3, характеризараща се с това, че всеки от щамовете е наличен в концентрация на живи клетки, която е в диапазона от 106 до 1011 cfu (образуваща колония единици) на грам от състава, включващ поне 106 cfu на грам от състава, такова като поне 107 cfu/g, предпочетено поне 108 cfu/g, такова като поне 109 cfu/g, или поне Ю10 cfu/g, такова като поне 1011 cfu/g.
5. Стартерна култура, съгласно претенция 4, характеризираща се с това, че съдържа 2 до 3 щама, съгласно претенции 1 до 3.
6. Стартерна култура, съгласно претенция 4, характеризираща се с това , че съдържа поне един от бактериалните щамове, съгласно претенции 1 до 3, заедно с друга култура или смес от култури съдържа две култури и всяка от тях присъства в продукта в съотношение от 0,1 % до 99,9 %, за предпочитане от 1% до 99 %, по предпочетено от 10 % до 90 %.
7. Стартерна култура, съгласно претенция 6, характеризираща се с това , че съдържа поне един от бактериалните щамове, съгласно претенции 1 до 3, заедно с пробиотичен Lb. gasseri щам К7, депозиран в ССМ под регистров номер ССМ 7710, и където щамът Lb. gasseri К7 присъства в концентрация на живи клетки, която е в диапазона от 106 до 1011 cfu (колонообразуващи единици) на грам или ml от състава поне 106 cfu на грам gram или ml от състава, такова като поне 107 cfu/g или ml, т.е. поне 108 cfu/g или ml, такова като поне 109 cfu/g или ml, например поне Ю10 cfu/g, такова като поне 1011 cfu/g.
8. Стартерна култура, съгласно всяка от претенции 4 до 7, за използване за ферментация на всеки материал, който е обикновено подложен на етап на ферментация с млечно кисели бактерии такива като мляко, растителни материали, месни продукти, плодови сокове и теста.
9. Хранителен продукт, съдържащ носещ материал и поне един щам, съгласно претенции 1 до 3 или стартерна култура, съгласно всяка от претенции 4 до 7 .
10. Продукт, съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че носещият материал е хранителен състав избран от мляко, кисело мляко, сирене, ферментирали млека, ферментирали продукти на основа мляко, ферментирали продукти на основата на месо, продукти на основата на ферментирали зърнени материали, прахове на основата на мляко и пщеница, бебебшки храни, сладоледи, сокове, бонбони или дъвки.
11. Метод на получаване на биомаса на бактериалните щамове съгласно претенции 1 до 3, и щама Lb. gasseri К7, и за получаване на пробиотични • е стартерни култури , съгласно претенции 4 до 6,характеризиращ се с това, че протича при етапите на подготовка на среда, провеждане на ферментация и накрая лиофилизация.
12. Метод, съгласно претенция 11, харсктеризираща се с това, че протича на основата на ферментацията на мляко или на друг ферментиращ субстрат такъв като суроватка или растителни субстрати такива като соево, оризово или други зърнено мляко.
13. Метод на получаване на добавки за хранене на хора или животни и на фармацевтични препарати, съдържащи поне един от бактериалните щамове , съгласно претенции 1 до 3, заедно с щамът Lb. gasseri К7, или щамът Lb. gasseri К7 самостоятелно.
14. Метод, съгласно претенция 13, харсктеризираща се с това, че протича на основата на ферментацията на мляко или на друг ферментиращ субстрат такъв като суроватка или растителни субстрати такива като соево, оризово или други зърнено мляко.
15. Състав на добавка за хранене на хора или животни характеризираща се с това, че, съдържа поне един от бактериалните щамове, съгласно претенции 1 до 3, заедно с щамът Lb. gasseri К7, или друг щам или щамът Lb. gasseri К7 самостоятелно.
16. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че, съдържа поне един от бактериалните щамове , съгласно претенции 1 до 3, заедно с щамът Lb. gasseri К7, или друг щам или щамът Lb. gasseri К7 самостоятелно.
-529 ·
17. Състав, съгласно претенция 15 до 16, характеризиращ се с това, че, съдържа поне един от щамовете, съгласно претенция 1 до 3 в количество от 107 cfu/g до около 1012 cfu/g от носещия материал и Lb. gasseri щам К7 в количество от около 108 cfu/g до около 1012 cfu/g носещ материла, за предпочитане от 109 cfu/g до около 1012 cfu/g, по предпочитано от около Ю10 cfu/g до около 1012 cfu/g носещ материал.
18. Състав, съгласно претенция 15 до 17, характеризиращ се с това, че съдържа също така други хранителни вещества, пребиотици, минерали, витамини и други хранителни или/и фармацевтично приемливи вещества.
19. Бактериален щам, съгласно която и да е от претенции 1 до 3, култура, състав или продукт, съгласно претенции 4 до 7, и 15 до 18 за използване за терапевтично или профилактично лечение на заболявания при хора или животни.
20. Използване на щам, съгласно която и да е от претенции 1 до 3, култура, състав или продукт, съгласно претенции 4 до 6, и 15 до 18 за получаване на продукт за терапевтично или профилактично лечение на заболявания при хора или животни.
21. Използване, съгласно претенция 20, характеризиращо се с това, че заболяването е на стомащно чревния тракт.
22. Използване, съгласно претенция 20 до 21, характеризиращо се с това, че заболяването е избрано от групата, състояща се от антибиотик-свързани разстройства, гастроентерит, диария включващо диария при пътуващи и остра детска диария, непоносимост към лактоза, стомашно чревни инфекции и колонизазия в стомашно чревния тракт на патогенни бактерии включващи Clostridium difficile, синдром на раздразнените черва
-53• * (IBS), възпалително заболяване на червата (IBD) и имуномодулиращи синдроми.
BG10110506A 2009-10-27 2009-10-27 Нови щамове млечно-кисели бактерии и техни комбинации за получаване на пробиотични препарати BG110506A (bg)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG10110506A BG110506A (bg) 2009-10-27 2009-10-27 Нови щамове млечно-кисели бактерии и техни комбинации за получаване на пробиотични препарати
PCT/BG2010/000021 WO2011050426A2 (en) 2009-10-27 2010-10-27 New strains of lactic acid bacteria and their combinations producing probiotic preparations
EP10795908A EP2494027A2 (en) 2009-10-27 2010-10-27 New strains of lactic acid bacteria and their combinations producing probiotic preparations
CN2010800585087A CN102686112A (zh) 2009-10-27 2010-10-27 制造益生菌制剂的乳酸细菌的新颖菌株和其组合
EP13000103.5A EP2634269A1 (en) 2009-10-27 2010-10-27 New strain of lactic acid bacteria and its combinations producing probiotic preparations

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG10110506A BG110506A (bg) 2009-10-27 2009-10-27 Нови щамове млечно-кисели бактерии и техни комбинации за получаване на пробиотични препарати

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG110506A true BG110506A (bg) 2011-05-31

Family

ID=43922651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG10110506A BG110506A (bg) 2009-10-27 2009-10-27 Нови щамове млечно-кисели бактерии и техни комбинации за получаване на пробиотични препарати

Country Status (4)

Country Link
EP (2) EP2634269A1 (bg)
CN (1) CN102686112A (bg)
BG (1) BG110506A (bg)
WO (1) WO2011050426A2 (bg)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201112487D0 (en) 2011-07-21 2011-08-31 Univ Bristol Probiotic formulation
CN102370058A (zh) * 2011-09-29 2012-03-14 孙义 一种高产多不饱和脂肪酸和多糖的混合发酵菌种组合及其复合微生态制剂
EP2923704B1 (en) * 2012-11-16 2024-03-20 Asahi Group Holdings, Ltd. Stress-induced bowel disorder-relieving agent comprising specific lactobacillus gasseri strain or treatment product thereof
CN103070209B (zh) * 2013-02-17 2014-07-16 哈尔滨伟平科技开发有限公司 一种多菌种混合发面的方法
CN103396959B (zh) * 2013-07-23 2014-11-05 扬州大学 徳氏乳杆菌保加利亚亚种grx33及其在发酵乳制备中的应用
CN105779338B (zh) * 2016-03-23 2019-08-20 北京工商大学 一种利用嗜热链球菌发酵乳清制备的冰淇淋乳脂肪替代物及方法
CN109983115B (zh) * 2016-12-20 2022-11-01 深圳华大生命科学研究院 一种加氏乳杆菌及其培养方法和应用
CN108004167B (zh) * 2017-12-17 2020-11-03 石家庄君乐宝乳业有限公司 一株产胞外多糖的嗜热链球菌jmcc0019、其分离纯化方法及应用
CN110129220B (zh) * 2019-04-30 2021-06-22 石河子大学 一种保加利亚乳杆菌bsts6-4及其应用
JP7529394B2 (ja) * 2019-11-15 2024-08-06 株式会社明治 ウイルス増殖を抑制するための組成物
JP7063514B2 (ja) * 2019-12-02 2022-05-09 株式会社ライフ・クオリティ研究所 起立性低血圧の予防又は改善用剤及びそれを含む組成物
CN111117935A (zh) * 2020-02-10 2020-05-08 农业农村部食物与营养发展研究所 一种抑制肌肉合成的微生物菌剂及其应用
US20240268394A1 (en) * 2021-06-08 2024-08-15 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Bacterial strains that enhance crop legume plant growth
CN114540235B (zh) * 2022-03-04 2023-10-31 中国海洋大学 一种诱导乳酸菌休眠态的方法及其应用
CN116948863A (zh) * 2023-04-26 2023-10-27 国家粮食和物资储备局科学研究院 一株德式乳杆菌保加利亚亚种dl22-1、固态发酵饲用乳酸菌制剂及其制备与应用
CN116656562B (zh) * 2023-06-14 2025-02-25 陕西科技大学 一株多功能发酵粘液乳杆菌kd-1及其应用
CN117143782B (zh) * 2023-10-30 2024-03-22 杭州微致生物科技有限公司 一种唾液链球菌嗜热亚种vb331及其应用
CN117305189B (zh) * 2023-11-29 2024-03-22 杭州微致生物科技有限公司 一种德氏乳杆菌保加利亚亚种vb183及其培养装置和应用
CN118813452B (zh) * 2024-06-26 2025-05-27 湖北蓝谷中微生物技术有限公司 一种丁酸梭菌、食淀粉乳杆菌联动发酵方法
CN118652810B (zh) * 2024-07-09 2025-01-10 浙江大学 一株德氏乳杆菌及其在促进动物消化道发育方面的应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK686187D0 (da) 1987-12-23 1987-12-23 Hansens Chr Bio Syst Veterinaert praeparat
JP2922013B2 (ja) 1991-04-17 1999-07-19 雪印ローリー株式会社 耐酸性及び酸素耐性を有する新規ビフィズス菌
JP2627698B2 (ja) 1992-02-20 1997-07-09 雪印乳業株式会社 ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌体を含有する培養物及びその製造法
DE69506002T2 (de) 1995-01-02 1999-06-24 Compagnie Gervais Danone, Levallois-Perret Milchsäureferment, und ihre verwendung zur herstellung von antidiarrhöeprodrukten
US6461607B1 (en) 1998-08-24 2002-10-08 Ganeden Biotech, Inc. Probiotic, lactic acid-producing bacteria and uses thereof
JP3046303B1 (ja) 1999-06-24 2000-05-29 明治乳業株式会社 Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ除菌性飲食品
SI1565547T2 (sl) 2002-06-28 2013-02-28 Biosearch S.A. Probiotiäśni sevi, postopek za izbiranje le-teh, njihovi sestavki in njihova uporaba
BG108449A (bg) 2003-12-15 2005-06-30 АЛЕКСАНДРОВ Никола Синбиотичен продукт и приложението му като носител на природни биоактивни вещества във функционални хранителни добавки
CN1628528A (zh) * 2003-12-19 2005-06-22 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 德氏乳杆菌保加利亚亚种酸奶或发酵乳干粉发酵剂
JP4320642B2 (ja) 2005-03-30 2009-08-26 新東工業株式会社 加飾体貼着木目込み方法及びその装置
CN100360658C (zh) * 2006-02-17 2008-01-09 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 肠道微生态制剂及其制备方法
WO2008002484A2 (en) 2006-06-23 2008-01-03 Lacpro Industries, Llc Novel lactobacillus bulgaricus strain and compositions
KR101108428B1 (ko) 2006-08-04 2012-01-31 (주)바이오니아 인간의 모유에서 분리한 프로바이오틱 활성 및 체중 증가억제 효과를 갖는 유산균
CN100469869C (zh) * 2006-09-08 2009-03-18 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 一种肠道益生菌包埋保护方法
RU2010132283A (ru) * 2008-02-06 2012-03-20 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани (US) Композиции, способы и наборы для повышения иммунного ответа на респираторное заболевание

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011050426A2 (en) 2011-05-05
EP2494027A2 (en) 2012-09-05
EP2634269A1 (en) 2013-09-04
WO2011050426A4 (en) 2012-09-07
WO2011050426A3 (en) 2012-05-03
CN102686112A (zh) 2012-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG110506A (bg) Нови щамове млечно-кисели бактерии и техни комбинации за получаване на пробиотични препарати
AU2021333530B2 (en) Bifidobacterium breve 207-1 and use thereof
CN111484957B (zh) 动物双歧杆菌乳亚种i797、其分离纯化方法及应用
KR102807892B1 (ko) 락토바실러스 파라카제이 207-27 및 이의 용도
TWI401086B (zh) 胚芽乳酸桿菌及其用途
DK2162143T3 (en) MAMMALS MILK-MICRO-FORMATIONS incorp-border THEM AND THEIR USE FOR THE TREATMENT OF MASTITIS
JP4176715B2 (ja) プロバイオティクス菌株、その選択方法、その組成物、およびその使用
US12478651B2 (en) Composition for improving gut microbiota
US12433921B2 (en) Bacteria
US20250375490A1 (en) Food products and the like, supplements and pharmaceutical compositions including probiotic compositions
CN117866831A (zh) 一种鼠李糖乳酪杆菌及其应用
NZ553616A (en) Strain of lactobacillus acidophilus having analgesic properties in the gastrointestinal system
WO2013021239A1 (en) New strain of l. bulgaricus capable of inhibiting the adhesion of h. pylori strains to epithelial cells
Petsuriyawong et al. Screening of probiotic lactic acid bacteria from piglet feces
CN102337227B (zh) 胚芽乳酸杆菌及其用途
JP2022052715A (ja) 腸内細菌叢改善用組成物
WO2025005237A1 (ja) 腸内菌叢でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌の制御用組成物及びその利用
HK40067147A (en) Bifidobacterium breve 207-1 and use thereof
HK40067147B (en) Bifidobacterium breve 207-1 and use thereof