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MEMOIRE DESCRIPTIF déposé à l'appui d'une demande de
BREVET D'INVENTION formée par Société dite :
NABISCO BRANDS, INC. pour : "Procédé pour l'isomérisation du glucose" Priorité d'une demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique déposée le 30 juin 1982, sous le NO 393.845
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La présente invention concerne des procédés enzymatiques pour transformer le glucose (dextrose) en fructose (lévulose).
La majeure partie du glucose de qualité alimentaire est fournie sous forme d'hydrolysat enzymatique de l'amidon de mais, c'est-à-dire du sirop (liqueur de trempage) de mais du commerce. Le glucose est généralement noté comme ayant un caractère sucré de 60 à 80% de celui du saccharose et se vend donc à un prix plus faible correspondant. On sait depuis longtemps isomériser le glucose en fructose (qui est même plus sucré que le saccharose) en utilisant une enzyme douée d'activité de glucoseisomérase, de préférence une enzyme qui a été immobilisée sur un support inerte tel que diéthylaminoéthylcellulose, verre poreux ou chitine. On pourra trouver des descriptions détaillées de la conversion enzymatique du glucose en fructose utilisant la glucoseisomérase dans Hamilton et coll.
"Glucose Isomerase a Case Study of Enzyme-Catalysed Process Technology", 'Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et coll., Plenum Press, New York (1974), pages 94-106, 112,115-137 ; Antrim et coll.,"Glucose Isomerase Production of High-Fructose Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering, vol. 2. Academic
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Press (1979) ; Chen et coll.,"Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem. (1980), pages 30-35 ; Chen et coll."Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem., (1980), pages 36-41 ; Nordahl et coll., "Fructose Manufacture from Glucose by Immobile Glucose Isomerase", Chem. Abstracts, vol. 82. (1975), Abs. No 110316h ; et Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem. Abstracts, Vol. 82, (1975), Abs. No. 110316h ; et Takasaki,"Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem.
Abstracts, Vol. 81, (1974), Abs. No. 76474a.
Il existe en outre de nombreux brevets concernant l'isomérisation du glucose ; on citera à titre d'exemples les brevets des Etats-Unis d'Amérique nO 3 616 221 ; Reissue 28 885 (initialement 3 623 953) ; 3 694 314 ; 3 708 397 ; 3 715 276 ; 3 788 945 ; 3 826 714 ; 3 843 442 ; 3 909 354 ; 3 960 663 ; 4 144 127 et 4 308 349.
Les teneurs en fructose que l'on peut obtenir par l'isomérisation du glucose avec la glucoseisomérase sont limitées par l'équilibre de la réaction d'isomérisation. A 65 C, l'équilibre de réaction s'établit à environ 51% en poids de fructose à partir
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d'un substrat de départ de dextrose pur.
Lorsqu'on utilise une liqueur de glucose raffinée comme substrat (contenant jusqu'à environ 6% en poids de sucres qui ne sont pas des monosaccharides) et en tenant compte d'une durée de séjour raisonnable dans le réacteur enzymatique, la teneur en fructose la plus élevée que l'on peut obtenir (exprimée en poids de matière sèche) avec les techniques antérieures mentionnées est celle d'un sirop à 48-52%. Pour obtenir des sirops à teneur plus élevée en fructose, on doit utiliser des systèmes de fractionnement qui augmentent fortement le prix de revient du produit final. A des températures supérieures, cependant, l'équilibre devient plus favorable.
Par exemple, un procédé enzymatique à la glucoseisomérase pouvant fonctionner à des températures d'environ 90-140 C a pu être utilisé pour donner directement des sirops de mais à teneur élevée en fructose (HFCS) contenant 53-60% en poids de fructose, en matière sèche, ce qui élimine la nécessité d'un fractionnement et d'un recyclage. La tendance des systèmes connus à la glucoseisomérase à subir une dénaturation thermique s'accompagnant d'une forte réduction d'activité a donc jusqu'à présent fait échouer les tentatives d'utiliser des régimes à température plus élevée pour déplacer davantage l'équilibre de l'isomérisation en faveur du fructose.
De plus, le glucose et spécialement le fructose sont des sucres réducteurs sensibles qui ont une tendance nette à former des sous-produits indésirables, tels que le psicose, des produits colorés, des précurseurs de produits colorés, des dianhydride de fructose, du mannose, du tagatose, et des acides, lorsqu'on les chauffe aux températures nécessaires pour l'isomérisation selon l'invention.
La demanderesse a maintenant découvert de façon surprenante qu'en mettant en oeuvre une technique d'isomérisation du glucose dans certaines limites essentielles de pH et de temps de séjour dans un réacteur enzymatique, telles que définies ci-après, on peut utiliser effectivement des températures d'isomération d'environ 90 à environ 140 C pour donner directement des sirops HFCS de qualité élevée (c'est-à-dire avec une formation de sous-produits acceptable) contenant d'environ 52 à environ 60% en poids de fructose, éliminant ainsi la nécessité d'opérations coûteuses et complexes de fractionnement et de recyclage qui sont nécessaires avec les procédés
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connus d'isomérisation du glucose pour obtenir la gamme ci-dessus de teneurs en fructose.
Selon l'invention, le glucose est isomérisé en fructose par le procédé qui consiste à mettre en contact une liqueur contenant du glucose avec la glucoseisomérase chimiquement stabilisée à une température d'environ 900C à environ 140 C et à un pH d'environ 3 à environ 8 pendant une durée de contact suffisante pour obtenir une teneur finale dans ladite liqueur d'au moins environ 53 à environ 60% en poids de fructose, par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone, sans formation notable de psicose et/ou de sucres n'appartenant pas aux séries du fructose et du glucose.
Le glucose qui est isomérisé en fructose selon l'invention peut dériver de n'importe quelles sources connues de ce sucre. Pour des raisons d'économie, le glucose dérive ordinairement de l'hydrolyse de la cellulose ou de l'amidon utilisant un acide et/ou une enzyme, de préférence cette dernière, selon des techniques connues. Les liqueurs contenant du glucose obtenues de cette manière contiennent de manière caractéristique de faibles quantités de polysaccharides, de sucres oligomères, etc., selon la source d'hydrate de carbone utilisée et la méthode d'hydrolyse employée.
Des graines de céréales, telles que mais, milo, blé, seigle, et analogues et des racines et tubercules amylacées telles que pommes de terre, igname, carottes, cassave (manioc) et analogues sont d'excellentes sources d'amidon pour la conversion en glucose de départ de l'invention.
Aux Etats-Unis d'Amérique, l'amidon de maïs est spécialement préféré en raison de son prix relativement faible et de sa facilité d'obtention. Comme la production de glucose de qualité alimentaire favorise l'utilisation de techniques d'hydrolyse enzymatique de l'amidon, ces techniques sont préférées dans l'invention. Des méthodes d'hydrolyse enzymatiques sont décrites dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique nO 4 017 363,3 912 590,3 922 196, 3 922 197-201 et 4 284 722, dont les descriptions sont incorporées à titre de référence dans la présente description.
La glucoseisomérase utilisée dans l'invention comme source d'enzyme pour la stabilisation chimique peut être isolée à partir de n'importe lequel des micro-organismes connus producteurs de glucoseisomérase, tels que Streptomyces flavovirens, Streptomyces
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achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces
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bobiliae, Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Bacillus coaulans Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Brevitacterium pentaamino- acidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides et Paracolobactrum aerogenoides.
En outre, on peut utiliser les glucoseisomérases fabriqués par les genres Nocardia, Micromonospora, Microbispora, Microellobospora et Arthrobacter. Une excellente source de glucoseisomérase à utiliser dans le procédé de l'invention est Streptomyces sp. ATCC 21 175.
Comme indiqué précédemment, il peut être avantageux d'utiliser une glucoseisomérase stable aux températures d'isomérisation relativement élevées utilisées dans l'invention, par exemple la glucoseisomérase produite par Bacillus stearothermophilus, en particulier les souches choisies parmi Bacillus stearothermophilus ATCC 21 365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 et NRRL B-3682 comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 826 714 ; la glucoseisomérase produite par un micro-organisme du genre Ampullariella, tel qu'Ampullariella digitata.
Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata et Ampullariella regularis (brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 308 349) ; la glucoseisomérase produite par Bacillus licheniformis (demande de brevet européen 41213) ; et la glucoseisomérase produite par les thermophiles des genres décrits dans la publication de brevet japonais 74/30588.
Outre les micro-organismes ci-dessus mentionnés, l'invention concerne l'utilisation de leurs mutants et variants ainsi que les micro-organismes transformés génétiquement qui en dérivent par introduction dans les micro-organismes de gènes à muta-
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tion glucoseisomérase, y compris les micro-organismes 8ésophiles et CD thermophiles. Les gènes à mutation glucoseisomérase choisis pour CD cette utilisation sont ceux qui donnent une glucoseisomérase qui est stable à températures élevées, spécialement à environ 90 C et de préférence jusqu'à environ 140 C. Ces gènes peuvent être préparés par les techniques habituelles utilisées pour la mutation de microorganismes comme les techniques d'irradiation ou aux mutagènes chimiques.
On peut également produire la mutation in vitro de gènes de
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glucoseisomérase isolés qui produisent une glucoseisomérase de 0 stabilité thermique moyenne, comme celle produite, par exemple, par certaines souches de Streptomyces. Le choix des gènes mutés appropriés s'effectue par réintroduction du gène muté soit dans l'organisme père, soit dans un autre organisme, suivie de croissance et reproduction de l'organisme et détermination de la stabilité thermique de la glucoseisomérase résultante.
On considère également que l'on peut utiliser des techniques à l'ADN recombinant pour donner une glucoseisomérase de stabilité thermique améliorée convenant pour la stabilisation chimique et l'utilisation dans l'invention. Argos et coll. (Biochemistry 18 (25), 5698-5703 (1979)) indiquent que l'on trouve dans les enzymes correspondantes d'organismes thermophiles certaines remplacements de restes alanyles par des restes glycyles, séryles, valyles et lysyles. Perutz (Science 201,1187-91 (1978)) indique que les enzymes de bactéries thermophiles doivent leur stabilité supérieure pour la plupart à des ponts salins supplémentaires à la surface de la protéine.
Zuber (dans"Biochemistry of Thermophily", Friedman, S. rI., ed. pages 267-285, Academic Press, New York, 1978) donne des renseignements supplémentaires sur la structure d'enzymes thermostables. Ainsi donc, si l'on connaît l'enchaînement d'aminoacides et la structure tridimensionnelle (tertiaire) d'une glucoseisomérase, il est possible d'obtenir une stabilité améliorée au moyen de mutations spécifiques du site dans le gène d'isomérase pour donner des enzymes conçues et fabriquées de manière à contenir des quantités accrues des aminoacides qui donnent des structures plus stables.
Après avoir déterminé l'enchaînement d'ADN de la glucoseisomérase, on peut utiliser un agent de synthèse des gènes pour produire de nouveaux enchaînements, augmentant ainsi la thermostabilité de la glucoseisomérase produite par ces gènes fabriqués par l'homme. On considère que ces enzymes fabriquées seraient spécialement intéressantes pour la mise en oeuvre de l'invention.
Comme la glucoseisomérase est produite par voie intracellulaire par ces micro-organismes et par d'autres, on peut fournir une source de glucoseisomérase en récoltant simplement les cellules et l'enzyme peut être séparée des cellules par des techniques connues
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de l'homme de l'art, par exemple autolyse des cellules, broyage par ultrasons et l'utiliser dans un réacteur enzymatique de conception connue et classique. De préférence, la glucoseisomérase chimiquement stabilisée peut être immobilisée sur un support inerte selon des techniques connues et classiques si elle n'est pas insolubilisée par suite de la stabilisation chimique.
Des matériaux et modes opératoires utilisés pour l'immobilisation d'enzymessont bien connus et décrits dans un certain nombre de publications, par exemple : Wang et coll., Fermentation & Enzyme Technology, John Wiley Sons, Inc., New York (1979), pages 318-338, et Kirk-Othmer, Encyclopedia of
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Chemical Technology, 3e édition, John Wiley York (1980) volume 9, pages 148-172, dont les descriptions sont incorporées ici à titre de référence.
La présence de faibles quantités de cations cobalt, manganèse et magnésium et/ou d'un sel hydrosoluble de l'acide sulfureux, tel que sulfite de sodium, bisulfite de sodium, sulfite de magnésium, et/ou bisulfite de magnésium, telle qu'elle est préco-
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nisée dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique Reissue n 885, pour réduire ou inhiber la dénaturation de la glucoseisomérase pen- dant la mise en oeuvre du procédé, est également considérée dans l'invention.
Il est nécessaire que la concentration d'hydrates de carbone dans la liqueur d'alimentation contenant du glucose soit comprise dans l'intervalle d'environ 20 à 85% en poids, et de préférence d'environ 30 à 50% en poids, pour obtenir les résultats désirés.
Il est également nécessaire que l'isomérisation soit effectuée à un pH d'environ 3 à 8, de préférence d'environ 4 à 7. et plus spécialement de 5 à 6,5. La mise en oeuvre de l'isomérisation à un pH notablement inférieur ou supérieur à la gamme indiquée ci-dessus conduit à la formation de trop fortes quantités de sous-produits indésirables, tels que psicose, acides organiques, produits colorés, précurseurs de produits colorés, dianhydrides de fructose et analogues.
La demanderesse a découvert que le pH pour l'activité optimale de la glucoseisomérase diminue nettement aux températures élevées. Donc, pour la glucoseisomérase de Streptomyces rubigenosus, on obtient l'activité optimale à pH 8, 6-9, 2 à 25 C, à pH 6,9-7, 5 à
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lorsque l'on auemente la à 75 C et à pH 5, 6-6, 2 à 1250C. Donc, température d'isomérisation, le pH d'isomérisation peut être diminué pour maintenir l'activité enzymatique maximale et en outre pour éviter une formation excessive de sous-produits.
Une autre condition nécessaire de l'invention réside encore dans la durée de contact de la liqueur d'alimentation contenant du glucose et de la glucoseisomérase chimiquement stabilisée.
Ce contact doit être maintenu dans l'intervalle d'environ 1 s à environ 5 h, de préférence d'environ 30 s à environ 1 h et mieux encore d'environ 2 min à 30 min pour donner un sirop de glucose de qualité acceptable.
La durée de contact préférée entre la glucoseisomérase chimiquement stabilisée et la liqueur contenant le glucose dépend dans une grande mesure du pH auquel est effectuée la réaction d'isomérisation. A l'extrémité inférieure de la gamme de pH, une durée de contact plus longue peut être tolérée sans provoquer une dégradation excessive du glucose par formation de psicose et d'autres produits de dégradation indésirables. A l'extrémité supérieure de la gamme de pH, une durée de contact plus courte est nécessaire pour éviter la formation de psicose et de produits colorés.
Dans la pratique, la durée totale au bout de laquelle le sirop contenant le glucose est à la température finale de réaction ou à une température voisine est calculée comme durée de contact efficace puisque les réactions de dégradation du sucre qui ont lieu ne sont pas enzymatiques et
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se produisent que la liqueur soit ou non en contact avec la glucoseCP isomérase.
Par conséquent, dans la mise en oeuvre d'isomérisations au-dessus de 90 C, il est important de réduire la durée nécessaire pour amener la liqueur de glucose à la température d'isomérisation désirée (par exemple en mélangeant la liqueur avec de la vapeur juste avant ou pendant le contact avec l'isomérase) et, une fois que la teneur en fructose désirée a été atteinte, de séparer ensuite rapidement la liqueur de l'isomérase active et de refroidir ensuite la liqueur aussi rapidement que possible au-dessous de 90 C et, de préférence à moins de 70 C. Si l'on utilise une forme soluble de glucoseisomérase chimiquement stabilisée, il sera nécessaire d'inactiver celle-ci (par exemple par réduction du pH dans une
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gamme de valeurs inactivant l'isomérase)
avant l'étape de refroidissement pour éviter une éventuelle reconversion en glucose du fructose formé pendant l'étape d'isomérisation à température élevée, puisque la réaction d'isomérisation est, bien entendu, réversible.
Le degré de conversion maximal du glucose en fructose que l'on peut obtenir est commandé par l'équilibre thermodynamique entre le glucose et le fructose, qui dépend à son tour de la température à laquelle est effectuée l'isomérisation. Une analyse très soigneuse des mélanges à l'équilibre de glucose et de fructose a établi la relation suivante :
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où F est le pourcentage de fructose à l'équilibre, par rapport au poids total de glucose et de fructose, T est la température ( C) à laquelle est effectuée l'isomérisation et K est la constante d'équilibre glucose/fructose.
La durée de contact réelle entre le sirop contenant le glucose et l'isomérase dans un réacteur peut généralement être calculée au moyen de la formule suivante lorsque l'on utilise un réacteur contenant une forme immobilisée d'isomérase.
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où : t est la durée de contact réelle C est la concentration de glucose et fructose V est le volume libre de liquide dans le lit de garnissage (volume du lit diminué du volume occupé par les particules d'enzyme mobilisée) F est la fraction de fructose dans le mélange glucose/fructose à e l'équilibre quand il se trouve à la température d'isomérisation F est la fraction de fructose (par rapport à G + F) à l'entrée o
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dans le lit de garnissage CI
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F est la fraction de fructose (par rapport à G + F)
dans la solu- tion sortant du lit de garnissage k est la constante de vitesse de réaction pour l'isomérisation dans les conditions d'isomérisation et A est l'activité de l'isomérase dans le lit de garnissage.
Les valeurs de k pour l'isomérase immobilisée préparée selon les
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exemples suivants varient d'environ 0, 07 à environ 5 g à des températures de 90 à 140 C, respectivement. Cette relation montre la nécessité de réduire la durée de contact à température élevée par l'utilisation de lit de garnissage d'activité élevée par unité de volume.
Les lits de garnissage formés selon les modes opératoires indiqués dans les exemples suivants peuvent contenir jusqu'à 2 000 IGIU/ml, ce qui permet d'atteindre une teneur en fructose de 99, 5% de la teneur à l'équilibre en moins de 1 min dans un réacteur à température élevée lorsque l'on utilise des réacteurs étagés à des températures différentes et que la charge entrant dans un premier réacteur est isomérisée à basse température avant l'isomérisation à température élevée dans un second réacteur.
Lorsque l'on utilise un système à réacteurs étagés, on préfère utiliser un procédé qui consiste à mettre en contact une liqueur d'alimentation ccntenant du glucose à environ 20-85% en poids de glucose avec la glucoseisomérase à une température d'environ 20 à 80 C, à un pH d'environ 6,0 à 9, 0 et pendant une durée de contact d'environ 0,5 à 2 h, pour transformer de 40 à environ 45% en poids du glucose présent dans ladite liqueur en fructose, à augmenter la température du milieu d'isomérisation à environ 90-140 C, à régler le pH du milieu d'isomérisation si nécessaire dans la gamme d'environ 3 à 8,
à mettre en contact la liqueur contenant le fructose avec la glucoseisomérase pendant une durée supplémentaire d'environ 1 s à environ 5 h pour augmenter le degré de conversion jusqu'à environ 53% à 60% en poids du glucose présent dans la liqueur d'alimentation intiale contenant le glucose, sans qu'il n'y ait de formation notable de psicose ou d'autres sucres n'appartenant pas au séries du fructose et du glucose. Donc, l'utilisation de lits de garnissage à pouvoir élevé peut conduire à des durées de contact efficaces très faibles, ce qui réduit à son tour la dégradation du
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fructose qui a lieu aux températures élevées nécessaires pour l'invention.
Dans le choix des techniques d'immobilisation de la lucoseisomérase, il est préférable d'utiliser des procédés
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pouvant donner de petites particules de catalyseur poreu^, sensiblement incompressibles, de manière a réduire au minimum la limitation de la vitesse d'isomérisation par les effets de diffusion.
L'isomérase peut également être immobilisée dans les pores d'une membrane à travers laquelle on fait passer la solution de glucose en circulation forcée pendant l'isomérisation à température élevée, comme dispositif pour favoriser un bon contact entre l'enzyme et le substrat, minimisant les limitations par diffusion. Le support utilisé pour l'immobilisation est de préférence totalement insoluble et inerte, pour éviter une contamination ou une dégradation excessives des composants glucose et fructose des solutions de substrat.
Dans la pratique industrielle, cependant, les sirops contenant du fructose ne sont pas fabriqués à partir de glucose pur.
On utilise plutôt des hydrolysas d'amidon (préparés dans les références mentionnées ci-dessus) comme sourcesde glucose et ceux-ci contiennent invariablement des saccharides n'appartenant pas aux. séries du glucose et du fructose (ci-après dénommés polysaccharides) dérivés de l'hydrolyse incomplète de l'amidon et de l'inversion du glucose. Ceux-ci constituent de manière caractéristique de à 8% du poids total à sec en saccharides dérivés de l'hydrolyse de l'amidon.
Il est donc nécessaire, lorsque l'on calcule la température à laquelle l'isomérisation doit être effectuée, de tenir compte des polysaccharides éventuellement contenus dans la liqueur de glucose, ainsi que d'autres facteurs, tels que la teneur totale en fructose, en poids sec, à atteindre et la formation de psicose et d'autres produits n'appartenant pas aux séries du glucose et du fructose pendant la durée de contact efficace de la liqueur de glucose et de l'isomérase. Les relations pour le calcul de la température d'isomérisation sont indiquées ci-dessous.
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T = température d'isomérisation ( C).
F = teneur en fructose à l'équilibre (% par rapport au total glucose + fructose) à la température T.
M = fructose, % en poids sec, nécessaire dans le produit isomérisé.
C = psicose + autre produit de dégradation, %, formés pendant la durée de contact d'isomérisation efficace.
Q = % de l'équilibre atteint pendant la réaction d'isomérisation.
P = teneur en polysaccharides, %, dans la liqueur de glucose.
De manière caractéristique, il se forme moins de 1%, et de préférence moins de 0, 5%, de psicose et d'autres produits de dégradation et on peut atteindre 99, 5% de l'équilibre. Donc, pour préparer des sirops à 55,5% de fructose (en matières sèches), les températures d'isomérisation suivantes sont nécessaires pour des liqueurs de glucose ayant les teneurs en polysaccharides indiquées.
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<tb>
<tb> Polysaccharides <SEP> dans <SEP> la <SEP> Température <SEP> d'isoliqueur <SEP> de <SEP> glucose <SEP> mérisation <SEP> (OC) <SEP>
<tb> (% <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche)
<tb> 0 <SEP> 95,7
<tb> 1 <SEP> 99,1
<tb> 2 <SEP> 104, <SEP> 3
<tb> 3 <SEP> 108,9
<tb> 4 <SEP> 113, <SEP> 8
<tb> 6 <SEP> 124,3
<tb> 8 <SEP> 136,1
<tb>
Le produit du commerce accepté contient en moyenne 55,5% de fructose, en matière sèche.
Cela tient à ce que, à cette teneur en fructose, un sirop de mais à teneur élevée en fructose (HFCS) atteint un goût sucré égal à celui du saccharose, à poids égaux de matière sèche. Cependant, le HFCS à 55,5% de fructose est solidement établi comme produit commercial que l'on utilise pour le remplacement de tout ou partie du saccharose dans de nombreux produits alimentaires et spécialement dans les boissons sucrées au gaz carbonique. On s'attend à ce que la consommation de ce type de HFCS aux
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Etats-Unis d'Amérique soit de 1,3 billion de kg en 1982 avec une croissance à 1,8 billon de kg en 1983.
En raison de la complexité propre aux opérations de fourniture, stockage, mesure et formulation du HFCS dans les produits alimentaires, il y a une demande universelle d'uniformité du produit d'un fabricant de HFCS à un autre, afin que l'on puisse utiliser de manière interchangeable et simultanément des produits de différentes origines. Une teneur en fructose de 55-56%, en matière sèche, a acquis une importance spéciale comme teneur visée dans la technologie associée à la fabrication du HFCS.
Le procédé de l'invention fournit des teneurs en fructose d'au moins 53%, de préférence au moins 54%, et mieux encore d'au moins 55%. Si on le désire, au lieu d'utiliser une solution ccntenant seulement du glucose comme substrat pour le procédé de l'invention, il est également faisable d'utiliser une solution de glucose dans laquelle une partie du glucose est déjà isomérisée en fructose. Par exemple, on peut traiter par le procédé de l'invention une solution de glucose isomérisée contenant jusqu'à 50% de fructose pour augmenter la concentration en fructose aux teneurs plus souhaitables de plus de 50%, et aux teneurs préférées de 55-56% et plus.
Les solutions de glucose contenant du fructose en quantités de moins de 50% en poids des hydrates de carbone peuvent être préparées par des techniques connues.
En gardant présentes à l'esprit les conditions précédentes de concentration de glucose, pH et durée de contact on peut adapter convenablement des procédés connus d'isomérisation du glucose pour opérer entre environ 90 et 140 C, de préférence entre environ 100 et 110oC, pour fournir les sirops à teneur élevée en glucose-fructose de l'invention.
La thermostabilité de la glucoseisomérase peut être notablement accrue par un ou plusieurs traitements chimiques, l'enzyme conservant encore une activité appréciable, comme discuté ci-dessous. L'enzyme ainsi traitée est dénommée"isomérase chimiquement stabilisée"pour les but de la présente description.
La stabilisation chimique de l'isomérase est effectuée par un certain nombre de techniques différentes qui peuvent
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aboutir à une stabilité thermique accrue. L'approche fondamentale est d'introduire dans la molécule d'enzyme des éléments de structure, de telle sorte que l'enzyme résiste au dépliage (déplissement) lorsqu'elle est chauffée au-delà de son point normal de dénaturation thermique. Un procédé préféré pour y parvenir est de modifier l'enzyme par substitution chimique au moyen de portions de molécules contenant des groupes vinyles polymérisables, de sorte que ces derniers soient solidement fixés sur la surface de la molécule d'enzyme en plusieurs points.
Ensuite, l'enzyme modifiée est mélangée avec un ou plusieurs composés vinyliquespolymérisablesen solu- tion aqueuse et on copolymérise le mélange pour former l'enzyme chimiquement stabilisée, dans laquelle l'enzyme est solidement fixée en de nombreux points à une matrice polymère tridimensionnelle qui a formé une structure dont la forme est complémentaires de celle de l'enzyme.
Des exemples de ce type de stabilisation sont décrits par Martinek et coll. dans Biochem. Biophys. Acta 485, pages 1-12 (1977) et par Kulys et coll. dans Biokhimiya, 42, n 3, pages 453-459 (1978).
Il est essentiel, lorsque l'on met en oeuvre les réactions ci-dessus, d'éviter des conditions qui puissent conduire à la dénaturation de l'isomérase avec la perte d'activité qui s'ensuivrait. Par exemple, on doit éviter des valeurs extrêmes de pH et de température pendant n'importe laquelle et la totalité des manipulations nécessaires pour mettre en oeuvre la réaction cidessus.
Des exemples de réactifs qui sont utilisés pour modifier l'isomérase par substitution avec des groupes vinyliques polymérisables sont le chlorure d'acryloyle, le chlorure de métha-
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cryloyle, l'acroléine, le crotonaldéhyde, l'anhydride maléique, le 3. 4-époxybutène, l'acrylate de 2, 3-époxypropyle, l'acrylate de 2, thioglycidyle, le l-allyloxy-3- le
3-0-succinamide ester d'acide acrylique, l'anhydride chloromaléique, l'azide d'acide maléique, le 3-bromopropène, et l'isothiocyanate d'allyle. Ces composés sont capable de réagir avec les groupes amino libres de l'isomérase, par exemple, le groupe epsilon-amino des restes lysine.
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D'autres composés capables de réagir avec les groupes acides carboxyliques libres de l'isomérase peuvent être utilisés pour la substituer facilement avec des restes vinyle poly- métrisables, comme il est évident pour l'homme de l'art.
Des exemples de composés vinyliques qui peuvent être copolymérisés avec l'isomérase modifiée sont l'acrylate de sodium, le méthacrylate de sodium, l'acrylamide, le méthacrylate
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d'hydroxyéthyle, l'acryloylpipéridine-4-spiro-2'- 3'-dioxacrylopentane), la l-acryloyl-4-pipéridone et l'acryloyiméthoxyamine.
On préfère généralement des monomères ou mélanges de monomères solubles dans l'eau qui conduisent à des polymères solubles dans l'eau (si on polymérise en l'absence d'agents réticulants).
De manière caractéristique, des composés vinyliques difonctionnels sont incorporés dans le mélange de monomères (0,1-5% du total des monomères) pour donner des centres de réticulation qui conduisent à un réseau polymère tridimensionnel. Des composés appropriés sont le N, N'-méthylène-bis-acrylamide et le diméthacrylate d'éthylèneglycol. Lorsqu'on utilise ceux-ci, le mélange polymérisé forme un gel insoluble qui conduit à l'immobilisation de l'isomérase.
Les systèmes inducteurs couramment utilisés dans les polymérisations vinyliques, tels que persulfate d'ammonium + bisulfite de sodium, peroxyde d'hydrogène + sulfate ferreux, sulfate de potassium + N, N, N', N'-tétraméthyléthylènediamine et riboflavine (% lumière) sont appropriés.
Une fixation non covalente à la matrice polymère tridimensionnelle peut aussi être suffisante pour conférer à la molécule d'isomérase la rigidité désirée et provoquer donc une augmentation notable de stabilité thermique. Ceci peut se produire lorsque l'isomérase est mécaniquement enrobée dans un gel polymère réticulé.
Dans ce cas, il n'est pas nécessaire que l'isomérase soit modifiée par fixation d'un composé vinylique avant l'étape de polymérisation.
Cependant, la concentration du gel doit être supérieure à environ 30% en poids amant que ne se produise une stabilisation notable et on préfère des gels d'une concentration d'environ 50%. On a besoin de monomères capables de donner des gels polymères pouvant former des liaison électrostatiques et des liaisons hydrogènes avec l'isomérase, par exemple acrylate de sodium, méthacrylate de sodium,
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et méthacrylate d'hydroxyéthyle.
Des exemples de stabilisation par incorporation dans des gels sont donnés par Martinek et coll. dans Biochem.
Biophys. Acta 485, pages 13-28 (1977) et par Kulys et coll. dans J. Solid Phase Biochem., 3 pages 95-105 (1978).
Une troisième technique de rigidification de l'isomérase est la réticulation intramoléculaire qui est capable de lui conférer une stabilisé thermique supplémentaire.
Les exemples de cette stabilisation sont discutés par Torchilin et coll. dans Biochem. Biophys. Acta, 522, pages 277-283 (1978), Martinek et coll. dans J. Solid Phase Biochem, 2, pages 343-385 (1977) et Torchilin et coll. dans Biochem.
Biophys. Acta, 568, pages 1-10 (1979).
Les agents réticulants convenables pour l'utilisation dans la présente invention comprennent les composés difonctionnels qui sont capables de réagir avec les groupes fonctionnels latéraux de la molécule d'enzyme. Le plus couramment, ces groupes fonctionnels sont des groupes amino, généralement des groupes amino primaires qui peuvent réagir avec une grande variété de groupements fonctionnels, tels qu'acide carboxylique, halogénure de sulfonyl, aldéhydes, isocyanates, propiolates et les analogues.
Les agents réticulants comprennent donc les anhydrides d'acidesdicarboxyliques, tels qu'anhydride succinique et anhydride adipique ; les dialdéhydes correspondants, tels que glyoxal, succinaldéhyde et glutaraldéhyde ; les composés insaturés, tels qu'acroléine et crotonaldéhyde, les propiolates de diols, tels que bispro-
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piolate d'éthylèneglycol, bispropiolate de propylèneglycol et bispropiolate d'hexaméthylèneglycol ; et les halogénures de disulfonyle, tels que chlorure de benzène-1. 3-disulfonyle, chlorure de naphtalène-l, 5-disulfonyle et chlorure de toll-2, 4-disulfonyle.
En outre, comme l'enzyme contient des groupes acides réactifs avec les amines, ou bien peut être modifiée de mailière à contenir ces groupes, les amines difonctionnelles peuvent être utilisées comme agents réticulants pour la présente invention. Cellesci contiennent par exemple des diamines jusqu'en czar exemple phénylènediamine, butylènediamine, hexylènediamine, octylènediamine, pentylènediamine, éthylènediamine et dodécylènediamine.
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La quantité d'agent réticulant peut varier considérablement, le rapport de l'enzyme à l'agent réticulant variant d'environ 0,1 à 0,0001. La technique pour réaliser la fixation nécessaire est déterminée dans une certaine mesure par la nature de
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l'agent réticulant choisi et l'enzyme. En général, les réactifs CD CD sont dissous dans un solvant inerte convenable et la réaction doit s'effectuer à des températures raisonnablement basses pour éviter des effets nuisibles sur l'enzyme qui peut être sensible aux températures élevées. On préfère ordinairement des réactions à la température ambiante ou à une température voisine et on utilise comme milieu de réaction l'eau ou des solvants aqueux.
Outre la substitution de la molécule d'enzyme par des groupes vinyliques polymérisables suivie de polymérisation par les méthodes décrites précédemment, un autre mode de mise en oeuvre comprend la condensation d'un polymère préformé avec l'isomérase par formation de liaisons covalentes intermoléculaires pour former une molécule stabilisée. Par exemple, on peut faire réagir des polypeptides, tels que des protéines naturelles et leurs produits d'hydrolyse, en utilisant des techniques connues de formation de liaisons peptidiques, avec la glucoseisomérase pour former une enzyme stabilisée.
Les produits ainsi obtenus peuvent être solubles dans l'eau, mais peuvent être rendus insolubles dans l'eau par l'utilisation d'agents réticulants tels que le glutaraldéhyde et le système enzymatique réticulé résultant est ordinairement encore plus stable. Les réactions de formation de peptides sont effectuées par des techniques connues, par exemple par l'utilisation de carbodiimides.
Si on le désire, on peut former un dérivé de l'enzyme initiale pour introduire dans la molécule les fonctions désirées en vue de la condensation avec la molécule préformée. Ainsi donc, pour une fonctionnalité carboxy, on peut faire réagir l'enzyme contenant des groupes amino libres avec un acide dicarboxylique pour la transformer en enzyme contenant des groupes carboxy.
Les polymères préformés à utiliser dans le mode opératoire précédent peuvent être n'importe lesquels de ceux contenant le type et la quantité nécessaires de groupes fonctionnels, par exemple amino ou carboxy, pour les réactions envisagées. On préfère
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les polypeptides, tels que les protéines naturelles, par exemple chitosane, protéine de levure et les analogues, ainsi que leurs mélanges ; et les polymères contenant des groupes amino, tels que la polyéthylèneimine. Ordinairement, le polymère préformé préféré forme des produits solubles dans l'eau et on préfère rendre ceux-ci insolubles par réaction avec des agents réticulants, par exemple le glutaraldéhyde et d'autres agents comme décrits précédecxnent.
Dans toutes les techniques précédentes de modification de l'enzyme, il est essentiel d'assurer qu'un nombre suffisant de fonctions chimique par exemple des groupes amino ou carboxy, coient présents pour obtenir le résultat désiré à un degré notable.
Par exemple, lorsque l'on choisit le polymère préformé à faire réagir avec l'enzyme, il est nécessaire que le polymère contienne des groupes réactifs vis-à-vis des groupes disponibles sur la molécule d'enzyme. Ainsi, une protéine comportant des groupes carboxy en chaîne latérale doit être choisie pour la réaction avec les groupes amino en chaîne latérale de l'enzyme. De plus, il doit y avoir un nombre raisonnable de groupes réactifs sur les réactifs choisis pour assurer une fixation en plusieurs points des réactifs pour réaliser une stabilisation notable. La détermination de la nature et du nombre de ces groupes réactifs pour des réactifs donnés est bien entendu connue de l'homme de l'art.
Une autre technique encore permettant d'augmenter la stabilité thermique des enzymes est de modifier chimiquement la structure de surface sans provoquer de perte appréciable d'activité.
Ainsi, les groupes amino de surface peuvent être transformés en amidines (Ludwig, N. L. et Hunter, M.. J., Me th. Enzymol. 11, pages 595-604 (1967)) ou en guanidines (Kimmel, J. R., l'Ieth. Enzymol. S pages 585-589 (1967)) pour former des substituants ressemblant étroitement à l'arginine. La lacticodéshydrogénase et plusieurs autres protéines ont
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été stabilisées (voir Tuengler, F. et Pfleiderer, G., Biochem. Biophys.
Acta., 284, pages 1-8 (1977)) ; MinotanLN. et coll. Biochim. Biohys.
Acta, 581, pages 334-341 (1979) ; et Cupo, P., et col. J. Biol. Chem., 255, pages 10828-10833 (1980)).
L'activité de la préparation d'isomérase soluble
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a été déterminée comme décrit par Lloyd et coll. dans Cereal Chemistry, 49, ne 544-553 (1972). Une unité IGIU est la
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quantité d'isomérase qui convertit une micromole de glucose en fructose par minute dans une solution contenant 2 moles de glucose par litre, 0, 02 mole de Mgs04 par litre et 0,001 mole de Cocu 2 par litre à un pH de 6,85 (maléate de sodium 0, 2 M) et à une température de 60 C, la détermination étant faite par la méthode cidessus.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLE 1
Cet exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose, constituée principalement d'un hydrolysat d'amidon de mais raffiné, pour obtenir une composition à 55, 5% de fructose, en poids sec, en utilisant un procédé d'isomérisation en deux stades. On effectue d'abord une isomérisation à basse température à 70 C, le produit de cette réaction étant utilisé comme charge d'alimentation d'un second réacteur à température élevée (105, 2 C) contenant une isomérase chimiquement stabilisée. L'isomérase chimiquement stabilisée est du type dans lequel l'enzyme est fixée par covalence sur un polymère soluble et ensuite insolubilisée pour former un catalyseur immobilisé.
L'hydrolysat est préparé à partir d'amidon de mais par les procédés décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 644 126 (liquéfaction) et le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 280 006 (saccharification). La liqueur saccharifiée est raffinée
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selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 834 940 pour donner un produit contenant 95, de glucose, en poids sec. On ajoute suffisam- ment de glucose cristallisé pour amener la teneur totale en glucose à 97, 6%, en poids sec.
La solution résultante a la composition suivante :
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<tb>
<tb> Substance <SEP> sèche <SEP> totale <SEP> (%) <SEP> 50,2
<tb> Glucose <SEP> (% <SEP> en <SEP> poids <SEP> sec) <SEP> 97,6
<tb> Fructose <SEP> (% <SEP> en <SEP> poids <SEP> sec) <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Polysaccharides <SEP> (% <SEP> en <SEP> poids <SEP> sec) <SEP> 2,4
<tb> Psicose <SEP> (% <SEP> en <SEP> poids <SEP> sec) <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP>
<tb> NaHS03 <SEP> (min) <SEP> 50,0
<tb> MgS04 <SEP> (mM) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> CoC12 <SEP> (mM) <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> pH <SEP> 6,8
<tb>
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L'isomérisation à basse température est effectuée à 700C en pompant la solution de substrat ci-dessus à travers le réacteur à basse température, à un débit de 3,2 ml/min.
Le réacteur d'isomérase à basse température (70 C) est construit par garnissage d'une colonne en verre de 2,54 cm de diamètre munie d'un orifice d'entrée et d'un orifice de sortie et d'une enveloppe pour la circulation d'eau provenant d'un thermostat, avec l'isomérase immobilisée sur DEAE-cellulose (préparée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 788 945). L'espace en tête de colonne au-dessus du garnissage contient un thermomètre et il est autrement rempli de billes de verre pour réduire l'espace mort autant qu'il est pratique.
Le réacteur contient suffisamment d'isomérase immobilisée pour fournir 20 000 unités IGIU et le lit de garnissage a une hauteur d'environ 15 cm. On jette les 1 000 premiers ml sortant du réacteur.
L'effluent est ensuite recueilli pour l'utilisation dans la seconde isomérisation à température élevée.
Le catalyseur stabilisé chimiquement utilisé dans le réacteur à haute température est préparé de la manière suivante.
On fait pousser une espèce de Streptomyces rubigenosus dérivée de S. rubigenosus ATCC 21175 en fermentation aérobie submergée sur un milieu de composition suivante :
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<tb>
<tb> % <SEP> en <SEP> poids
<tb> Dextrose <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> de <SEP> mais <SEP> (solides) <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> diammonium <SEP> 0,08
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> manganèse <SEP> 0, <SEP> 06
<tb> Antimousse <SEP> ("Pluronic <SEP> PL-61") <SEP> 0,003
<tb>
On stérilise le milieu à 121 C pendant 45 min, on refroidit et on ajuste à pH 6,8-7, 0. On inocule avec 14% en volume d'un inoculum comprenant le contenu d'un fermenteur d'ensemencement préparé avec la variante S. rubigenous mentionnée ci-dessus.
La fermentation est effectuée en conditions aseptiques à 30 C pendant environ 60 h, avec aération à 0,65 wm(min). On peut aussi utiliser S. rubigenosus ATCC 21175 pour l'inoculation et la production d'isomérase ; dans ce cas, on utilise la composition suivante :
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<tb>
<tb> % <SEP> en <SEP> poids
<tb> Dextrose <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> de <SEP> mais <SEP> (solides) <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Sorbitol <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Chlorure <SEP> cobalteux <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> diammonium <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Xylose <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
On extrait la glucoseisomérase de S. rubigenosus en ajoutant 0, 35% de"Maquat MC 1412" (de la Société jason Chemical Co. ) et 0, 001% de lysozyme d'oeuf de poule et en agitant pendant 5 h à 400C à pH 6,3-6, 6. On filtre ensuite le mélange pour obtenir une solution de glucoseisomérase brute non purifiée.
On purifie l'isomérase brute par adsorption sur DEAE-cellulose (fabriquée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 823 133), filtration et lavage du produit adsorbé avec une solution de NaCl 0,1 H pour éliminer les impuretés et ensuite désorption de l'isomérase par mise en contact avec une solution de NaCl 0,45 M. Le pH de toutes les solutions est maintenu à 7,5 pendant les étapes de purification. On mélange la solution d'isomérase partiellement purifiée ainsi obtenue avec 3 volumes d'éthanol à 95% à 0 C pour précipiter l'isomérase. On ajoute de la perlite comme auxiliaire de filtration, on recueille les solides par filtration et on sèche à l'air pour obtenir une préparation d'isomérase soluble cm tenant 2 500 IGlU/g.
On dissout l'isomérase purifiée dans HnCl2 1 mM pour donner une solution contenant 10 mg d'isomérase par ml à la température ambiante et on filtre le mélange pour séparer l'auxiliaire de filtration. L'activité spécifique de cette préparation est de 37, 3 IGIU par mg de protéine.
On obtient une solution de polymère soluble de polyamine en dissolvant 39,0 g de chitosane (produit"Kytex"de la Société Hercules Inc., Wilmington, Delaware 19899) dans 13 1 de HC1 0,08 N. Après dissolution, on ajuste la solution de chitosane à NaCl 0,5 M par addition de 380 g de NaCl et on ajuste la solution résultante à pH 6,15 par NaOH 8 N. Enfin, on filtre la solution de chitosanne sur un papier-filtre'Jhatman n 3"pour séparer la matière insoluble.
Aux 13 1 de chitosanne à 0,3% dans NaCl 0,5 il
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à pH 6,15, on ajoute ce qui suit : 100 ml d'isomérase soluble ccntenant 100 000 IGIU d'activité, 197, 6 g de xylitol (de la
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Société Sigma Chemical Co.) et 0, 619 g de On agite cette solution pendant 2 h, après quoi on ajoute 6, 24 g de 1-éthyle- 3-diméthylaminopropylcarbodiimide (de la Société Sigma Chemical Co.) pour fixer par covalence en plusieurs points les groupes carboxyles de l'isomérase aux groupes amino du chitosanne. Après 2 h à la température ambiante, on ajoute au mélange de réaction 15,6 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 50% en poids (de la Société Eastman Kodak) ajustée à pH 6, 0 par NaOH 8N, pour insolubiliser le complexe isomérase-chitosanne lié par covalence.
Après 15 min, on ajoute 2 1 d'une solution de phosphate 1 M à pH 8,0 pour faciliter l'écrasement du gel après sa formation par l'addition de glutaraldéhyde. On lave l'isomérase-chitosane insolubilisé résultant par l'eau déminéralisée sur filtre Buchner sous vide. On laisse ensuite sécher à l'air cette préparation pendant une nuit à la température ambiante, on la broie et on la tamise dans l'intervalle de grosseursde particulesde 0,25-1, 68 mm. Le catalyseur sec a une activité exprimée de 384 IGlU/g.
On prépare de la manière suivante le réacteur fonctionnant à 105, 2 C. On met en suspension 13 g du catalyseur dans le substrat et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant 60 min. On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 1, 5 x 20 cm dans une colonne de verre à enveloppe.
Le lit de garnissage contient 4 992 IGIU.
On ajuste à pH 7,75 le substrat préparé à partir de la première étape d'isomérisation à 70 C et on le dilue à 42, 0% de substance sèche. On envoie ensuite ce substrat par pompage à travers le réacteur à colonne à haute température sous une pression manométrique de 0,7 bar et à un débit de 1,96 ml/min à 60 C pendant 30 min. On contrôle la température à l'intérieur de la colonne au moyen d'un thermomètre situé directement au-dessus du lit et entouré de billes de verre de 0,5 cm pour réduire autant que possible le volume mort au minimum. On augmente ensuite rapidement la température de la colonne en faisant circuler à travers l'enveloppe de l'huile provenant d'un bain thermostaté à 1060C.
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On contrôle l'effluent de la colonne au moyen d'un polarimètre enregistreur étalonné entre 50 et 58% de fructose.
Lorsque la température de la colonne a atteint 105, 2 C et lorsque la teneur en fructose de l'effluent a atteint la valeur recherchée, on recueille l'effluent et on le refroidit immédiatement dans un bain de glace. On ajuste le pH à 4,90 par addition d'acide citrique 1 M. On recueille l'effluent jusqu'à ce que la teneur apparente en fructose tombe au-dessous de 55%.
On analyse les solutions isomérisées obtenues à partir des réacteurs à 70 et 105, 2 C pour déterminer la composition en hydrates de carbone et la couleur et les résultats obtenus sont comparés dans le tableau I suivant avec les valeurs obtenues sur la solution de substrat non isomérisé.
Les résultats obtenus montrent que l'on atteint 55, 5% de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0, 4% en poids, en matière sèche, et la couleur < 20 (CIRFX100).
EXEMPLE 2
Le présent exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose (consistant en un hydrolysat d'amidon de mais raffiné plus du glucose cristallisé) à température élevée pour obtenir une composition contenant 55, 2% de fructose, en poids de matière sèche, dans laquelle on utilise une isomérisation en deux stades, le second stade utilisant une isomérase chimiquement stabilisée composée de glucoseisomérase complexée par la polyéthylèneimine, le complexe étant insolubilisé par traitement
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par le glutaraldéhyde.
CD y Préparation de l'isomérase stabilisée.
On prépare une glucoseisomérase soluble comme décrit à l'exemple 1. On dissout l'isomérase purifiée dans MnCl. 1 mM pour obtenir une solution contenant 6 mg d'isomérase par ml à la température ambiante et on filtre le mélange pour éliminer l'auxiliaire de filtration. On ajoute 60 ml de polyéthylèneimine de poids moléculaire 600, pH 8, à 10% en poids par volume (produit"PEI-6"de la Société Dow Chemical Co. ) et 3 g de xylitol à 300 ml de la solution d'enzyme et on agite la solution résultante pendant 15 min. On ajoute 10 ml de glutaraldéhyde 2,5 M et on agite le mélange à la température ambiante pendant 2 h.
On recueille par filtration
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l'enzyme insolubilisée, on lave à l'eau et on sèche pendant une nuit dans un four à convection à 37 C, On récupère après séchage 12, 8 g d'isomérase immobilisée contenant environ 775 IGIU/g. On met en suspension 12 g de l'enzyme immobilisée dans le substrat.
On désaère sous vide pendant 60 min à température ambiante et on utilise pour préparer un réacteur à haute température de 1, 5 cm de diamètre.
On prépare le substrat du réacteur dans la première étape de l'isomérisation en deux stades comme décrit à l'exemple 1.
Ce substrat a la composition suivante :
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<tb>
<tb> Substance <SEP> sèche <SEP> totale <SEP> (%) <SEP> 42, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Glucose <SEP> en <SEP> poids <SEP> de <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 46, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Fructose <SEP> (% <SEP> en <SEP> poids <SEP> de <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 51, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Polysaccharides <SEP> en <SEP> poids <SEP> de <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Psicose <SEP> (% <SEP> en <SEP> poids <SEP> de <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP>
<tb> NaHSO <SEP> 1) <SEP> 0 <SEP>
<tb> MgSO4 <SEP> (mM) <SEP> 50
<tb> CoCl2 <SEP> (mM) <SEP> 0,1
<tb> pH <SEP> 6,75
<tb>
On fait circuler le substrat par pompage à travers le réacteur à 60 C pendant 45 min à environ 5 ml/min.
On augmente ensuite la température de la colonne à 101, 6 C et on réduit le débit à 2 ml/min. On applique une contre-pression de 0, 84 bar sur la colonne pour éviter l'ébullition du substrat. On contrôle l'effluent au moyen d'un polarimètre enregistreur étalonné entre 50 et 58% de fructose. On recueille l'effluent qui dépasse 55% dans un bain de glace et on l'ajuste à pH 4,0 par l'acide citrique 1,0 M.
On détermine par analyse la composition en hydrates de carbone et la couleur de l'effluent du réacteur à haute température, du substrat du réacteur de premier étage et de la solution initiale contenant du glucose utilisée comme substrat pour le réacteur de premier étage. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II ci-après.
Les résultats montrent que l'on atteint 55, 2% de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0, 2% en poids, en matière sèche.
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EXEMPLE 3
Cet exemple illustre l'isomérisation directe du glucose en fructose à 57,2% par un procédé d'isomérisation en deux
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stades dans lequel le premier réacteur est de 70 C et le second réacteur (haute température) est à 110, 4 C. L'isomérase chimiquement stabilisée utilisée dans la réaction à haute température est une isomérase dans laquelle l'enzyme est fixée par covalence à un polymère soluble et insolubilisée ensuite pour former un catalyseur immobilisé.
Le substrat et sa conversion dans le réacteur de premier étage à 70 C ont été décrits à l'exemple 1.
Le catalyseur immobilisé utilisé dans le réacteur à haute température à 110, 4 C a également été décrit à l'exemple 1.
On prépare de la matière suivante le réacteur à 110, 4 C. On met en suspension 28,4 g du catalyseur dans le substrat et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant 60 min. On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 2,5 x 12,4 cm dans une colonne de verre munie d'une enveloppe chauffante. Le lit de garnissage contient 10 885 IGIU.
On règle à pH 6,47 le substrat préparé dans le premier stade d'isomérisation à 70 C et on le dilue à zode matière sèche. On fait ensuite circuler ce substrat par pompage à travers la colonne du réacteur à haute température, sous une pression de 0,84 bar et à un débit de 3,38 ml/min, à la température de 60 C pendant 30 min. On contrôle la température dans la colonne par un thermomètre situé directement au-dessus du lit et entouré de billes de verre de 0,3 cm pour réduire autant que possible le volume mort. On augmente ensuite rapidement la température de la colonne en faisant circuler dans l'enveloppe chauffante une huile provenant d'un bain thermostaté à 111 C.
On contrôle l'effluent de la colonne au moyen d'un polarimètre enregistreur étalonne entre 50 et 58% de fructose.
Lorsque la température de la colonne a atteint 110, 4 C et lorsque la teneur en fructose dans l'effluent a atteint la valeur recherchée, on recueille l'effluent et on le refroidit immédiatement au bain de glace. On règle le pH à 4, 0 par addition d'acide citrique 1 M.
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On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées obtenues dans les réacteurs à 700C et à 110, OC et on compare les résultats avec ceux obtenus sur une solution de substrat non isomérisée, comme indiqué dans le tableau III ci-après.
Les résultats obtenus montrent que l'on atteint 57, 2% de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0, 4% en poids, en matière sèche, et la couleur (CIRFX100) au-dessous de 20.
EXEMPLE 4
Cet exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose consistant principalement en hydrolysat d'amidon de mais raffiné pour atteindre une composition de 56, 3% de fructose, en matière sèche, en utilisant un procédé d'isomérisation en deux stades. On effectue d'abord l'isomérisation à basse température à 70 C, le produit de cette réaction étant utilisé comme charge d'alimentation d'un second réacteur à haute température (103, 3 C) contenant une isomérase chimiquement stabilisée. Dans l'isomérase chimiquement stabilisée, l'enzyme a été mise à réagir avec une protéine protectrice (comme celle dérivée de la levure).
L'étape d'isomérisation à basse température, y compris la description du substrat et les conditions expérimentales, est décrite dans l'exemple 1.
On prépare de la manière suivante la glucoseisomérase chimiquement stabilisée utilisée dans le réacteur à haute température. On prépare la glucoseisomérase soluble pour la stabilisation chimique et on la purifie comme décrit à l'exemple 1. L'activité spécifique de cette préparation est d'environ 40 IGIU/mg de protéine.
On obtient de la manière suivante une protéine protectrice à partir de levure de boulanger. A 1229 g de tourteau humide de levure de boulanger, on ajoute 1 000 g d'eau et 50 g de toluène. On agite le mélange à température ambiante pendant une nuit, puis on chauffe à 850C et on maintient à cette température pendant environ 30 min.
On filtre le mélange sur un Bücher. La presque totalité du toluène reste avec les débris cellulaires insolubles, tandis que le filtrat aqueux contient l'extrait de levure soluble. On réduit le volume du
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filtrat aqueux à 276 g (évaporateur rotatif à 40 C), puis on ajoute en agitant 41 g d'acide trichloroacétique. On recueille la protéine de levure précipitée, puis on la redissout dans le tampon au phosphate de sodium 0,1 M (pH 7, (. Après clarification par filtration, on traite la solution par 900 ml (environ 3 volumes) d'acétone.
On recueille le précipité, on le dissout dans le tampon au phosphate de sodium 0, Ol M (pH 7,0) et on dialyse la solution résultante contre le tampon au phosphate de sodium 0,01 M. Le produit résultant (150 ml) est la protéine protectrice marquée obtenue à partir de levure de boulanger. On prépare une solution à 0, 6% de chitosanne en dissolvant 24 g de chitosanne ("Kytex"de la Société Hercules Inc., Wilmington, Delaware) dans 4 litres de HC1 0, 08 N. On ajuste la solution à pH 6,2 par NaOH 8 N, on filtre sur papier filtre ifhatman n 3, puis on dialyse contre 16 1 d'eau déminéralisée.
Dans un bécher de 400 ml, on place environ 100 000 IGIU de glucoseisomérase soluble (en melange avec l'auxiliaire de filtration), 1 g de xylitol et 100 ml (2/3) de la protéine protectrice dérivée de levure de boulangerie. On ajoute à ce mélange 2, 4 mg de MgSO4, 7H2O et 24 ? 1 de solution de chlorure de cobalt molaire. On filtre le mélange pour séparer l'auxiliaire de filtration, puis on concentre la solution (en évaporateur rotatif à environ 40 C) presque jusqu'à siccité, dans un ballon à fond rond de 2 1. On ajoute ensuite au ballon 800 ml de chitosanne (pH 6,2). On concentre ensuite le mélange (en évaporateur rotatif à environ 40 ) presque jusqu'à siccité et on ajoute 640 fil de solution de glu taraldéhyde à 50Z (ajustée à pH 6,5). On conserve le mélange en chambre froite pendant une nuit.
On retire ensuite le gel du ballon et on le fait passer à force à travers un tamis de 0,59 mm (U. S. n 30) et on sèche en étuve à environ 37 C. On tamise la préparation d'enzyme séchée pour séparer les fines (tamis de 0, 177 mm), puis on l'utilise (8,9 g de produit final) pour l'isomérisation à température élevée.
On prépare de la manière suivante le réacteur à 103, 30C. On met en suspension dans le substrat la préparation de glucoseisomérase ci-dessus (8,9 g) et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant environ 30 min. On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de
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1, 5 x 29 cm dans une colonne de verre munie d'une enveloppe chauffante.
On règle à pH 6, 75 et on dilue à 42, 0% substance sèche le substrat préparé dans la première étape d'isomérisation à 70 C. On fait ensuite circuler ce substrat par pompage à travers la colonne du réacteur à haute température à un débit d'environ 1 1/2 ml/min, à la température de 600C pendant 30 min. On contrôle la température dans la colonne au moyen d'un thermomètre situé juste au-dessus du lit et entouré de billes de verre de 0. 5 cm de diamètre pour réduire au minimum le volume mort. On augmente ensuite rapidement la température de la colonne en faisant circuler dans l'enveloppe chauffante une huile provenant d'un bain thermostaté à 104 C.
On contrôle l'effluent de la colonne avec un polarimètre enregistreur étalonné entre 50 et 58% fructose. On recueille les fractions (environ 5 ml) jusqu'à la production de 55% fructose ou plus ; à ce moment l'expérience est terminée. Tandis que l'on recueille les échantillons, l'effluent est immédiatement refroidi au bain de glace et le pH est ajusté à environ 4, 0 par addition d'acide citrique molaire (0, 1 ml), puis de HCl dilué.
On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées obtenues dans les réacteurs à 700C et à 103, 3 C. Les résultats sont comparés dans le tableau IV ci-après avec ceux obtenus de manière analogue sur la solution de substrat non isomérisée.
Les résultats obtenus montrent que l'on atteint 56, de fructose en maintenant le psicose au-dessous de 0, 2% en poids de matière sèche.
EXEMPLE 5 Cet exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose consistant principalement en un hydrolysat d'amidon de mais raffiné à faible concentration saline pour atteindre une composition à 55, 4% de fructose, en matière sèche, en utilisant un procédé d'isomérisation en deux stades. On effectue d'abord une isomérisation à basse température à 70 C et le produit de cette réaction est utilisé comme charge d'alimentation d'un
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second réacteur à température élevée (112, 6 C) contenant une isomérase chimiquement stabilisée. Dans l'isomérase chimiquement stabilisée, l'enzyme est liée par covalence à un polymère soluble, par fixation en plusieurs points, puis insolubilisée pour former un catalyseur immobilisé.
L'hydrolysat est préparé à partir d'amidon de ma'is par les procédés décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique 3 644 126 (liquéfaction) et 3 280 006 (saccharification).
La liqueur saccharifiée est raffinée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3 834 940 pour donner un produit contenant 93, 8% de glucose en matière sèche. On ajoute suffisamment de glucose cristallisé pour amener la teneur totale en glucose à 96, 9%, en matière sèche.
La solution résultante a la composition suivante :
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<tb>
<tb> Substance <SEP> sèche <SEP> totale <SEP> (%) <SEP> 50, <SEP> 3
<tb> Glucose <SEP> (% <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 96, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Fructose <SEP> (% <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 0,1
<tb> Polysaccharides <SEP> (% <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 3,1
<tb> Psicose <SEP> (% <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche) <SEP> 0,0
<tb> NaHS03 <SEP> (mH) <SEP> 2, <SEP> 5
<tb> MgSO, <SEP> (mol) <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> CoC12 <SEP> (us <SEP> !) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 8
<tb>
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On effectue l'isomérisation à basse température à 70 C en faisant circuler par pompage la solution de substrat cidessus à travers le réacteur à basse température qui a été décrit à l'exemple 1, à un débit de 2,
5 ml/min. On jette les 1 000 premiers ml sortant du réacteur. On recueille ensuite l'effluent pour l'utilisation dans la seconde isomérisation à température élevée.
On prépare de la manière suivante le catalyseur chimiquement stabilisé utilisé dans le réacteur à haute température.
On prépare et on purifie la glucoseisomérase soluble par le procédé décrit à l'exemple 1. L'activité spécifique de cette préparation est
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d'environ 40 IGIU/mg de protéine. On obtient une solution de polymère CD soluble, du type polyamine, en dissolvant 48, 4 g de chitosanne C'yte'de la Société Hercules Inc., Wilmington, Delaware 19839, E. U. A.) dans 15 1 de HC1 0, 08 N. Après dissolution, on ajuste la solution à 0, 5 ri en NaCl par addition de 438 g de NaCl et on ajuste la
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solution résultante à pH 6, 1 par NaOH 8 N. On filtre ensuite la solution de chitosanne sur un papier-filtre athman nO 3 pour séparer la matière insoluble.
Aux 15 1 de solution de chitosanne à 0, 3riz dans NaCl 0,5 Ma pH 6,1, on ajoute : 520 ml d'isomérase soluble contenant environ 602 000 IGIU d'activité, 236 g de xylitol (de la Société Sigma Chemical Co. ) et 3,07 g de MnCI, 4H20. On agite cette solution pendant 2 h, après quoi on ajoute 7,44 g de 1-éthyl-3diméthylaminopropylcarbodiimide (de la Société Sigma Chemical Co) pour lier par covalence en plusieurs points les groupes carboxyles de l'isomérase aux groupes amino du chitosanne. Après 2 h à la température ambiante, on ajoute au mélange de réaction 15,5 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 50% en poids (de la Société Eastman Kodak Chem. Co. ) réglée à pH 6,0 par NaOH 8 N pour insolubiliser le complexe de covalence isomérase-chitosanne.
Après 15 min, on mélange avec le complexe insoluble isomérase-chitosanne 4 1 d'une solution de phosphate 1 M à pH 8,0. On lave l'isomérase-chitosanne immobilisée par l'eau déminéralisée en filtrant sous vide dans un Büchner contenant du papier filtre {hatman nO 3. On sèche la préparation à l'air, on broie et on tamise dans la gamme de 0,250-1, 60 mm. Le catalyseur sec a une activité exprimée de 803 IGIU/g.
On prépare de la manière suivante le réacteur à 112, 6 C. On met en suspension 7,0 g du catalyseur dans le substrat et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant 60 min. On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 1,0 x 40 cm dans une colonne de verre à enveloppe chauffante.
Le lit de garnissage contient 5621 IGIU.
On ajuste à pH 6,55 le substrat préparé dans la première étape d'isomérisation à 70 C et on le dilue par l'eau déminéralisée à 42,0% de matière sèche, ce qui abaisse également les concentrations en sels à 2, 1 mM pour NaHSO. et 2,1 mM pour MgSO,. On fait ensuite circuler par pompage ce substrat à travers la colonne du réacteur à haute température, sous une pression manométrique de 0,84 bar pendant 10 min à un débit de 8 ml/min, à la température de 60, 0 C. On contrôle la température de la colonne au moyen d'un thermomètre situé juste au-dessus du lit et entouré de sable jusqu'aux graduations de température pour réduire autant que possible à un minimum le volume mort.
On élève ensuite rapidement la température de
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la colonne par circulation d'une huile provenant d'un bain thermostaté à environ 114 C. La température de la colonne est augmentée jusqu'à 112, 6 C et le débit diminué à 1,89 ml/min.
L'effluent de la colonne est contrôlé avec un polarimètre enregistreur étalonné entre 50 et 58% de fructose. Lorsque la température de la colonne a atteint 112, 6 C et lorsque la teneur en fructose de l'effluent atteint la valeur désirée, on recueille l'effluent. on ajuste immédiatement le pH à 4,0 par addition d'acide citrique 1 il. On recueille l'effluent jusqu'à ce que la teneur apparente en fructose tombe au-dessous de 55%.
On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées obtenues dans les réacteurs à 70 C et à 112, 6 C et on compare les résultats obtenus dans le tableau V ci-après avec ceux obtenus de manière analogue sur la solution de substrat non isomérisée.
Les résultats obtenus montrent que l'on atteint 55, 4% de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0, 2% en poids, en matière sèche, et la couleur < 9 (CIRFxlOO).
EXEMPLE 6
Cet exemple illustre l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose consistant principalement en un hydrolysat d'amidon de mais raffiné à faible teneur en sels pour atteindre une composition de 54, 8% de fructose, en matière sèche, avec une très faible teneur en psicose ( < .. 0, 1%) et une très faible couleur ( < 2 CIRFxlOO) en utilisant un procédé d'isomérisation en deux stades. Le premier réacteur (à basse température) est à 70 C et le second réacteur (à température élevée) est à 105, 8 C. Dans l'isomérase chimiquement stabilisée utilisée dans le réacteur à haute température, l'enzyme est liée par covalence en plusieurs points à un polymère soluble, puis insolubilisée pour former un catalyseur immobilisé.
Le substrat et sa conversion dans le réacteur de première étage à 70 C sont décrits à l'exemple 5.
Le catalyseur immobilisé utilisé dans le réacteur à haute température à 105, 8 C est comme décrit à l'exemple 5.
On prépare de la manière suivante le réacteur à 105, 8 C. On met en suspension 5,63 g du catalyseur dans le substrat
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et on désaère sous le vide du laboratoire à la température ambiante pendant 60 min. On utilise la suspension désaérée pour préparer un lit de 1,0 x 32 cm dans une colonne de verre à enveloppe chauffante.
Le lit de garnissage contient 4521 IGIU.
Le substrat préparé à partir de la première étape d'isomérisation à 70 C est réglé à pH 6,5 et dilué par l'eau démi-
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néralisée à 42, 0% de matière sèche, ce qui abaisse également la concentration en sels à 2, 1 mM pour et 2, 1 mM 1 0 4 3' On fait ensuite circuler ce substrat par pompage à travers la colonne du réacteur à haute température sous une pression manométrique de 0, 7 bar et à un débit de 8 ml/min pendant 10 min, à la température de 60, 0 C. La température dans la colonne est contrôlée au moyen d'un thermomètre situé juste au-dessus du lit et entouré de sable jusqu'au début des graduations de températures, pour réduire autant que possible au minimum le volume mort.
On augmente ensuite rapidement la température de la colonne en faisant circuler dans l'enveloppe chauffante une huile provenant d'un bain thermostaté à environ 1070C.
On contrôle l'effluent de la colonne au moyen d'un polarimètre enregistreur étalonné entre 50 et 58% de fructose.
Lorsque la température de la colonne a atteint 105, 8OC et que la teneur en fructose dans l'effluent a atteint la valeur désirée, on recueille l'effluent. On ajuste immédiatement le pH à 4, 90 par addition d'acide citrique 1 M.
On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées provenant des réacteurs à 70 C et à 105, 8 C et on compare les résultats obtenus avec ceux obtenus de manière analogue avec la solution de substrat non isomérisé.
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau VI.
Les résultats montrent que l'on atteint 54, 8% de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0, 1% en poids en matière sèche et la couleur (CIRFxlOO) au-dessous de 2.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention.
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TABLEAUI Composition de solutions de substrats isomérisées à 70 C et 105, 2 C
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<tb>
<tb> Composition <SEP> en <SEP> hydrates <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Couleur
<tb> (% <SEP> en <SEP> poids, <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche <SEP> sans <SEP> cendre) <SEP> (CIRF
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Psicose <SEP> Polysaccharides <SEP> XI00)
<tb> non <SEP> isomérisée <SEP> 0 <SEP> 97,6 <SEP> 0 <SEP> 2,4 <SEP> 0,5
<tb> isomérisee <SEP> à <SEP> 70 C <SEP> 51,3 <SEP> 46,4 <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 7
<tb> isomérisée <SEP> à <SEP> 105, <SEP> 2 c <SEP> 55,5 <SEP> 41, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 2,6 <SEP> 14,
1
<tb>
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TABLEAU II Compositions des solutions des 1er et 2e stades d'isomérisation
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<tb>
<tb> Composition <SEP> en <SEP> hydrates <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Couleur
<tb> (% <SEP> en <SEP> poids, <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche <SEP> sans <SEP> cendre) <SEP> (CIRF
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Psicose <SEP> Polysaccharides <SEP> X100)
<tb> non <SEP> isomérisée <SEP> 0 <SEP> 97,6 <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 0,5
<tb> isomérisée <SEP> à <SEP> 700C <SEP> 51, <SEP> 3 <SEP> 46,4 <SEP> 0 <SEP> 2,3 <SEP> 0,7
<tb> isomérisée <SEP> à <SEP> IC1, <SEP> 6 C <SEP> 55,2 <SEP> 42,1 <SEP> 0 <SEP> 2,7 <SEP> 51,7
<tb>
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TABLEAU III Compositionsde solutions de substrats isomérisées à 70 C et 110,
4 C
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<tb>
<tb> Composition <SEP> en <SEP> hydrates <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Couleur
<tb> (% <SEP> en <SEP> poids, <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche <SEP> sans <SEP> cendre) <SEP> (CIRF
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Psicose <SEP> Polysaccharides <SEP> X100)
<tb> non <SEP> isomérisée <SEP> 0 <SEP> 99, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0,8 <SEP> 0,6
<tb> isomérisée <SEP> à <SEP> 70 C <SEP> 52, <SEP> 3 <SEP> 46,9 <SEP> 0 <SEP> 0,8 <SEP> 0,7
<tb> isomérisée <SEP> à <SEP> 110, <SEP> 4 C <SEP> 57,2 <SEP> 41,5 <SEP> 0,3 <SEP> 1,0 <SEP> 19, <SEP> 8
<tb>
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TABLEAU IV Compositions de solutions de substrats isomérisées à 70 C et 103, 3 C
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<tb>
<tb> Composition <SEP> en <SEP> hydrates <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Couleur
<tb> (% <SEP> en <SEP> poids,
<SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche <SEP> sans <SEP> cendre) <SEP> (CIRF
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Psicose <SEP> Polysaccharides <SEP> X100)
<tb> non <SEP> isomérisée <SEP> 0 <SEP> 97,6 <SEP> 0 <SEP> 2,4 <SEP> 0,5
<tb> isomérisée <SEP> à <SEP> 70 C <SEP> 51,3 <SEP> 46,4 <SEP> 0 <SEP> 2,3 <SEP> 0,7
<tb> isomerisee <SEP> à <SEP> 103, <SEP> 3 C <SEP> 56,3 <SEP> 41,5 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 2,2 <SEP> 34, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
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TABLEAU V Compositions de solutions de substrats isomérisées à 70 C et 112, 6 C
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<tb>
<tb> Composition <SEP> en <SEP> hydrates <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Couleur
<tb> (% <SEP> en <SEP> poids, <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche <SEP> sans <SEP> cendre)
<SEP> (CIRF
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Psicose <SEP> Polysaccharides <SEP> X100)
<tb> non <SEP> isomcrisee <SEP> 0 <SEP> 96,9 <SEP> 0 <SEP> 3,1 <SEP> 0
<tb> isomërisée <SEP> à70 C <SEP> 51,4 <SEP> 45,9 <SEP> 0 <SEP> 2,7 <SEP> 0
<tb> isomerisee <SEP> à <SEP> 112, <SEP> 6 C <SEP> 55,4 <SEP> 42, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 2,5 <SEP> 8,5
<tb>
<Desc/Clms Page number 38>
TABLEAU VI Compositions de solutions de substrats isomérisées à 70 C et 105,8 C
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<tb>
<tb> Composition <SEP> en <SEP> hydrates <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Couleur
<tb> (% <SEP> en <SEP> poids, <SEP> en <SEP> matière <SEP> sèche <SEP> sans <SEP> cendre) <SEP> (CIRF
<tb> Traitement <SEP> de <SEP> la <SEP> solution <SEP> Fructose <SEP> Glucose <SEP> Psicose <SEP> Polysaccharides <SEP> XlOO)
<tb> non <SEP> isomérisee <SEP> < 0,
<SEP> 1 <SEP> 96,9 <SEP> 0 <SEP> 3,1 <SEP> 0
<tb> isomérisée <SEP> à <SEP> 70 C <SEP> 51,4 <SEP> 45,9 <SEP> 0 <SEP> 2,7 <SEP> 0
<tb> isomérisée <SEP> à <SEP> 105, <SEP> 8 C <SEP> 54,8 <SEP> 42,3 <SEP> < 0, <SEP> 1 <SEP> 2,8 <SEP> 1,8
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