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et leur application en thérapeutique.
La présente invention concerne des sels et esters de l'acide libre correspondant à la lactone appelée Monacoline K, les procédés pour leur préparation et leur
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La demande de brevet britannique n[deg.] 8 005 748, au nom de la présente Demanderesse, décrit la Monacoline K et sa préparation au moyen de microorganismes du genre Monascus, en particulier la souche 1005 (FERM 4822) de Monascus ruber. Cette demande britannique divulgue l'activité précieuse et inattendue de la Monacoline K comme
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britannique ultérieure n[deg.] 8 007 240 décrit la préparation de la Monacoline K par culture de divers autres microorganismes du genre Monascus. Il a maintenant été trouvé que les sels et les esters de l'acide libre,dont la Monacoline K est la lactone présentent une activité anti-hypercholes-
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comparable ou supérieur. Par souci de commodité, ces composés sont dénommés, dans le présent mémoire, "sels ou esters de Monacoline K". Il est bien entendu que cette expression se réfère aux sels et esters de l'acide dont la Monacoline K est la lactone.
Les sels et esters de la Monacoline K objet de la présente invention répondent à la formule :
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dans laquelle :
- R représente un groupe alkyle substitué ou non substitué ou un atome de métal ; et - n est 1 ' Inverse de la valence du groupe ou atome représenté par R.
L'invention concerne aussi un procédé de préparation des sels et esters de la Monacoline K. par salification ou estérification de la Monacoline A ou d'un dérivé réactif de celle-ci.
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la Monacoline K, et séparation dudit sel de Monacoline A à partir du milieu de culture.
Les sels de Monacoline K auxquels la présente invention s'applique sont les sels métalliques et, de préférence, les sels des métaux alcalins, comme les sels de sodium ou de potassium, les sels de métaux alcalinoterreux comme les sels de calcium ou de magnésium, les sels des métaux du Groupe lira de la Classification périodique des éléments, comme le sel d'aluminium, et les sels des métaux de transition des Groupes Ib, IIb et VIII de la Classification périodique des éléments, comme les sels de fer, de nickel, de cobalt, de cuivre et de zinc. Parmi ces sels métalliques, les sels de métaux alcalins, les sels de métaux alcalino-terreux et le sel d'aluminium sont ceux que l'on préfère, les sels de sodium, de calcium et d'aluminium étant tout particulièrement appréciés.
Les sels de Monacoline K peuvent être facilement convertis en la Monacoline K elle-même, ou en l'acide
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Monacoline K:résultante ou l'acide correspondant peut être à nouveau transformé en un sel en présence d'une substance alcaline, par exemple un hydroxyde ou un carbonate de métal alcalin. Ces transformations peuvent être effectuées quantitativement, de manière répétée. Il a été trouvé que la transformation de la Monacoline K, ou de l'acide correspondant, en sel métallique ou réciproquement, est
<EMI ID=9.1> substances. La valeur de pH déterminante est d'environ 5,0.
Pourvu que des ions métal soient disponibles, la Monacoline
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inférieur à 5,0, la Monacoline K elle-même, l'acide correspondant à la Monacoline K ou un mélange de ces deux subs-
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Les esters de Monacoline K selon la présente invention sont ceux des composés de la formule précitée pour lesquels R représente un groupe alkyle substitué ou non substitué.. Lorsque R représente un groupe alkyle non substitué, celui-ci peut être un groupe à chaîne
droite ou à chaîne ramifiée, ayant de préférence jusqu'à
8 atomes de carbone. Comme exemples de tels groupes alkyle représentés.par R, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle et hexyle.
Lorsque R représente un groupe alKyie substitué, le substituant peut être choisi, comme il est bien connu dans cette technique, dans une gamme étendue de groupes et atomes, comprenant notamment les groupes aryle, les groupes acyle (en particulier les groupes arylcarbonyle), les groupes alcoxy, les atomes d'halogènes et les groupes hydroxy. Les substituants particulièrement préférés sont les groupes aryle et les groupes arylcarbonyle, c'est-à-dire ceux où R représente un groupe aralkyle ou un groupe arylcarbonylalkyle.
Lorsque R représente un groupe aralkyle, celui-ci est de préférence un groupe benzyle substitué ou non substitué. Les groupes benzyle substitués comportent de préférence un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes alkyle, les groupes alcoxy et les atomes d'halogènes. Comme exemples de tels groupes benzyle, on peut
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benzyle, 2-bromobenzyle, 3-bromobenzyle ou 4-bromobenzyle.
Lorsque R représente un groupe arylcarbonylal-
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Les groupes phénacyle substitués comportent de préférence un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes alkyle, les groupes alcoxy et les atomes d'halogène.
Comme exemples de tels groupes phénacyle, on peut citer les groupes phénacyle, 2-méthylphénacyle, 3-méthylphénacyle,
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4-chlorophênacyle, 2-bromophénacyle, 3-bromophénacyle ou 4-bromophën.acyle.
Parmi les esters, les esters de méthyle, éthyle, butyle et benzyle sont particulièrement préférés.
Les sels et.les esters de la Monacoline K selon la présente invention peuvent être facilement préparés
par salification ou estérification de la Monacoline K ellemême ou d'un dérivé réactif de la Monacoline K. Des exemples de dérivés réactifs convenables comprennent l'acide correspondant à la Monacoline K et, dans le cas de la préparation des esters, les sels de Monacoline K (par exemple les classes de sels décrites plus haut, en particulier le sel de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium, d'aluminium, de fer, de zinc, de cuivre, de nickel ou de cobalt).
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par simple réaction de la Monacoline K ou de l'acide correspondant avec un oxyde, hydroxyde, carbonate ou bicarbonate, de préférence un hydroxyde ou carbonate du métal choisi. On doit prendre les mesures nécessaires pour que la réaction soit effectuée à.une valeur de pH supérieure à 5,0 et de préférence à 7,0 pour assurer une conversion complète de la Monacoline K ou de l'acide correspondant en le sel désiré. La Monacoline K utilisée dans cette réaction est de préférence préparée comme décrit dans les demandes de brevet précitées, par culture d'un champignon du genre Monascus et isolement de la Monacoline K à partir du milieu de culture.
La Monacoline K peut être isolée du milieu de culture et purifiée avant salification ou, plus avantageusement, la réaction de salification est effectuée au cours de l'isolement et la purification de la Monacoline K à partir du milieu de culture, de sorte que la Monacoline K est isolée sous la forme de son sel de métal désiré. Quelque soit la méthode adoptée, le sel métallique peut être isolé du milieu de réaction ou
du milieu de culture par des méthodes bien connues dans la technique y compris celles décrites ci-après en relation avec l'isolement des sels métalliques de la Monacoline K
à partir de cultures de champignons producteurs de sels de Monacoline K.
Les esters de la Monacoline K peuvent être préparés par simple estérification de la Monacoline K ou d'un dérivé réactif de celle-ci.La réaction peut être effectuée en faisant réagir un alcool de formule ROH (ou un dérivé
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ou l'acide correspondant, de préférence en présence d'un agent de déshydratation, par exemple un halogénure d'acide, comme le chlorure d'acétyle. Selon un autre mode de réalisation, les esters de la Monacoline K peuvent être préparés en faisant réagir un sel de la Monacoline K avec un halogénure de formule RX (dans laquelle R représenta un groupe alkyle substitué ou non substitué et X représente un atome d'halogène, de préférence un atome d'iode).
il est aussi possible de préparer directement les sels de la Monacoline K par culture d'un microorganisme producteur de sel de Monacoline K, du genre Monascus. Des microorganismes convenables qui peuvent être utilisés
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(IFO 8201) ; Monascus ruber SANK 11272 (.IFO 9203) ; Monascus ruber SANK 13778 (Ferm 4959) ; Monascus ruber SANK 15177 <EMI ID=21.1>
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(Ferm 4957). Tous ces microorganismes sont disponibles ,dans des collections reconnues de cultures, telles que désignées par les abréviations suivantes :
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Les souches préférées du genre Menasses qui peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention, pour produire les sels de la Monacoline K, sont Monascus 'tuber SANK 10671,
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Monascus ruber SANK 15177 et Monascus ruber SANK 18174 sont tous des champignons récemment isolés du sol par la présente demanderesse, leurs propriétés microbiologiques
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Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956)
Cette souche a été isolée du sol à Tukimino, Yamato-city, préfecture de Kanagawa, Japon, et a été déposée le 27 avril 1979, sous le n[deg.] 4956,auprès du Fermentation Research Institute.
Cette souche croît bien sur un milieu pomme de terre-
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colorante soluble ayant une coloration brun-jaunâtre à brun-rougeâtre. Il se forme beaucoup de cléistothécies sur la couche basale des hyphes.
Sur un milieu farine d'avoine-agar, cette souche produit une substance colorante brun pâle et elle croît bien. La formation des cléistothécies est bonne : cellesci sont sphériques, d'un diamètre de 30 à 60 micromètres, et se forment sur de courts pédoncules. Ces pédoncules sont presque incolores et ramifiés, leurs dimensions étant de 25-60 x 3,5 � 5,0 micromètres. Les asques sont évanescents et par conséquent difficiles à observer. Les ascospores sont incolores et ellipsoïdales et leurs dimensions sont de 4,5-6,5 x 4,0 - 5,0 micromètres ; leurs surfaces sont lisses. Les conidies sont liées depuis leur sommet
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Leurs tissus sont rompus.
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meilleure croissance est observée entre 23 et 30[deg.]C.
Monascus ruber SANK 10671 (FERM 4958)
Cette souche a été isolée du sol à Shinagawa-ku, Tokyo, Japon, et a été déposée le 27 avril 1979 sous le n[deg.] 4958 auprès du Fermentation Research Institute.
La croissance sur les milieux pomme de terre-glucoseagar et farine d'avoine-agar est similaire à celle de la souche SANK 15177, sauf que la substance colorante soluble produite est rouge sombre.' Le diamètre des cléistothécies est de 30-80 micromètres et les dimensions des pédoncules sont de 30-70 x 3,0 - 5,0 micromètres. On n'observe pas d'asques. Les ascospores sont incolores et ellipsoïdales et leurs dimensions sont de 4,5-6,5 x 4,0 - 5,0 micromètres. Les conidies sont incolores et piriformes ou ovoïdes et leurs dimensions sont de 6,0 - 10,0 x 6,0 - 8,5 micromètres.
Monascus ruber SANK 13778- (FERM 4959) Cette souche a été isolée du sol à Inawashirocho Nagata, Yama-gun, Préfecture de Fukushima, Japon, et a été
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Fermentation Research Institute.
La croissance sur les milieux pomme de terre-
<EMI ID=30.1>
de la souche SANK 15177, sauf que la substance colorante soluble produite est de couleur brun-rougeâtre pâle à brun-rougeâtre. Les cléistothécies ont un diamètre de
35-75 micromètres et les pédoncules sont de 30-70 x 3,5-5,0 micromètres. On n'observe pas d'asques. Les ascospores sont incolores et ellipsoïdales et.leurs dimensions sont de 4,5-6,0 x 4,0-5,0 micromètres. Leurs surfaces
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x 6,0-10,0 micromètres.
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Cette souche a été isolée du sol à Shakotancho, Shakotan-gun, Shiribeshi'Shicho, Préfecture de Hokkaido, Japon, et a été déposée le 27 avril 1979, sous le n[deg.]4957, auprès du Fermentation Research Institute.
La croissance sur les milieux pomme de terreglucose - agar et farine d'avoine-agar est similaire à celle de la souche SANK 15177, sauf que la substance colorante produite est rose pâle. Les cléistothécies ont un diamètre de 20-70 micromètres et les dimensions des pédoncules sont de 20-60 x 3,0-5,0 micromètres. On n'observe pas d'asques. Les ascospores sont incolores et ellipsoïdales et leurs dimensions sont de 5,0-7,0 x 4,0-5,5 micromètres ; leurs surfaces sont lisses. Les conidies sont reliées entre elles depuis leur sommet et sont incolores ; la plupart d'entre elles sont piriformes et ont des dimensions de 6,0-9,5 x 6,0-10,0 microns.
Sur la base de l'observation des caractéristiques mentionnées plus haut,. ces microorganismes ont tous été identifiés comme étant des souches de Monascus ruber
van Tieghem.
<EMI ID=33.1>
et van Tieghem, Bull. Soc. Botan. France, 31, 227 (1884).
La production d'ascospores par la souche a été mentionnée par Cole et al dans le Canadian Journal of Botany, 46,
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arthrospores".
En plus des souches de champignons mentionnées plus haut, tous champignons du genre Monascus, y compri3 leurs variétés et les- souches obtenues par mutation, qui sont capables de produire des sels de Monacoline K, peuvent être utilisés dans le procédé de la présente invention.
Les sels de la Monacoline K peuvent être produits en cultivant le microorganisme choisi dans un milieu de culture, dans des conditions aérobies,en utilisant les techniques bien connues de culture de champignons et autres
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Monascus peut être tout d'abord cultivée sur un milieu convenable et les microorganismes produits peuvent être ensuite recueillis et inoculés dans un autre milieu de culture où ils sont cultivés pour produire le sel de Monacoline K désiré; le milieu de culture utilisé pour la multiplication du microorganisme et le milieu de culture utilisé pour la production du sel de Monacoline K peuvent être identiques
ou différents. Tout milieu de culture bien connu dans la technique pour la culture des champignons peut être utilisé, pourvu qu'il contienne, de manière en soi bien connue, les substances nutritives nécessaires, en particulier une
source de carbone assimilable et une source d'azote assimilable. Des exemples de sources convenables de carbone assimilable sont le glucose, le maltose, la dextrine, l'amidon, le lactose, le saccharose et la glycérine. Parmi ces sources, le glucose et la glycérine sont particulièrement appréciés pour la production des sels de la Monacoline K. Comme exemples de sources convenables
d'azote assimilable, on peut citer les peptones, l'extrait de viande, la levure, l'extrait de levure, la farine de soja, la farine de pois, la liqueur de mais macéré, le son de riz et les sources d'azote minéral. Parmi ces sources d'azote, les peptones sont tout particulièrement préférées. Lors de la production du sel de Monacoline K, on peut ajouter au milieu de culture, si nécessaire, un sel
minéral et/ou un sel métallique. De plus, si nécessaire -
une faible quantité d'un métal lourd peut aussi être ajoutée.
Pour la production des sels de la Monacoline K par fermentation avec un champignon du genre Monascus, il est important que soient présents, dans le milieu de culture ou dons
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du sel que l'on désire produire.
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cultute du microorganisme sur ur milieu pomme de terredextrose-agar (par exemple disponible auprès de Difco Company) et l'inoculer ensuite dans un autre milieu de culture où on le cultive pour produire le sel de Monacoline K désiré. Le microorganisme est de préférence cultivé dans des conditions aérobies, en utilisant des méthodes de culture Bien connues dans la technique, par exemple la culture sur solide, la culture sous agitation ou la culture sous aération et agitation. Le microorganisme croît sur un intervalle étendu de températures, par exemple de 7 à 35[deg.]C,
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de produire de la Monacoline K ou l'un de ses sels, la
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Pendant la culture du microorganisme, la production du sel de Monacoline K peut être régulée par prélèvement d'échantillons du milieu de culture et mesure de l'activité physiologique du sel de Monacoline K dans le milieu de culture selon les essais décrits plus loin. La culture peut être poursuivie jusqu'à obtention d'une accumulation importante du sel de Monacoline K dans le milieu de culture et ce sel peut être isolé à ce moment et extrait du milieu de culture et des tissus du microorganisme par toute combinaison convenable de techniques d'isolement choisie eu égard à ses propriétés physiques et chimiques.
Par exemple, on peut utiliser tout ou partie des techniques d'isolement suivantes : extraction de la liqueur à partir du milieu de culture au moyen d'un solvant hydrophile
(comme l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme) extraction du microorganisme avec un solvant hydrophile (,comme l'acétone ou un alcool) ; concentration, par exemple par évaporation de tout ou partie du solvant sous pression réduite ; dissolution dans un solvant davantage polaire (comme l'acétone ou un alcool);enlèvement des impuretés avec un solvant moins polaire (comme l'éther de pétrole ou l'hexane) ,; filtration sur gel à travers une colonne garnie d'une substance comme le Sephadex (dénomination commerciale d'une substance disponible auprès de la Pharmacea Co.
Limited, Etats-Unis d'Amérique) ; chromatographie d'absorption avec du charbon actif ou un gel de silice ; chromatographie liquide rapide ; conversion en la Monacoline K elle-même ou en l'acide correspondant ; purification directe sous la forme du sel métallique ; et autres méthodes similaires. En utilisant une combinaison conve,nable de ces techniques, le sel de Monacoline K désiré
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substance pure.
Comme décrit dans la demande de brevet précitée , la Monacoline K elle-même peut être aussi produite en utilisant les microorganismes et les techniques décrits ci-dessus.
L'activité physiologique des sels et des esters
de la Monacoline K peut être évaluée et déterminée quantitativement par les essais suivants qui peuvent être aussi utilisés sous forme modifiée .pour réguler ou diriger la production des sels
de Monacoline K au cours du procédé de fermentation selon la présente invention.
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Tout comme la Monacoline K elle-même, les sels et esters de la Monacoline K inhibent spéciquement l'activité de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA réductase, qui est l'enzyme de détermination de la vitesse dans la biosynthèse
J
du cholestérol. Le tableau I ci-après donne les concentrations (en ng/ml) des composés de l'invention qui inhibent
<EMI ID=42.1>
CoA réductase ^mesurée par la méthode décrite dans Analytical Biochemestry, 31, 383 (19692.7 et les concentra-
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de 50 % la biosynthèse du cholestérol �mesure effectuée selon la méthode du Journal of Biological Chemistry, 247,
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correspondants pour le composé connu ML-236B (qui est un composé connu comme ayant un type similaire d'activité et qui est obtenu en cultivant des microorganismes du genre Pénicillium, comme décrit dans le brevet britannique n[deg.]
1 453 425, au nom de la présente demanderesse). On donne aussi la concentration de Monacoline K qui inhibe de 50 % la biosynthèse du cholestérol. On peut constater que, tandis que la concentration de ML-236B requise pour inhiber
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centration correspondante pour les esters de la Monacoline K est de l'ordre de 1 ng/ml (c'est-à-dire que le pouvoir d'inhibition est d'environ 10 fois plus élevé) et la concentration correspondante pour le sel de sodium de la Monacoline K est d'environ 0,14 ng/ml (pouvoir d'inhibition environ 70 fois plus élevé). Les activités des sels et des esters de la Monacoline K sont comparables à ou plus élevées que celles de la Monacoline K elle-même.
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2. Réduction des taux de cholestérol sanguin
Les animaux utilisés dans cet essai sont du* rais de la souche Wistar Imamichi, pesant chacun environ 300 g. Les essais sont effectués sur plusieurs groupes de rats comportar.t chacun 5 animaux. Chaque animal reçoit une in-
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(dénomination commerciale d'une substance connue pour accroître le taux du cholestérol sanguin) tandis qu'on lui administre simultanément, par voie orale, l'un des composés mentionnés sur le tableau II suivant, en la quantité indiquée sur ce tableau. 20 heures après l'administration orale les rats sont sacrifiés- en les saignant ; on recueille le sang et le foie et on détermine, par des moyens usuels,
les taux de cholestérol. Les résultats sont rapportés dans
le tableau II qui donne la réduction des taux de cholestérol dans ;le. sang et le foie .par. comparaison avec un groupe témoin de ra auxquels on a seulement administré du Triton WR-1339.
Dans un but de comparaison, on donne les résultats correspondants pour la Monacoline K elle-même et pour le composé ML-236B,,. mais ces composés ont été administrés en des doses nettement supérieures à celles utilisées pour
les composés de l'invention afin d'obtenir une réduction comparable des taux de cholestérol.
TABLEAU II
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La réduction du taux de cholestérol du sang ou du foie est donnée par la formule :
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où : A est le taux dans le groupe traité seulement par le
Triton WR-1339
B est le taux dans le groupe témoin non traité
C est le taux dans le groupe soumis à l'essai.
3. Toxicité aiguë
Les composés soumis aux essais sont les esters de méthyle, d'éthyle, de butyle, et de benzyle et les sels de sodium et de calcium de la Monacoline K. On a trouvé que
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de ces composés ,est d'au moins 2000 mg/kg par administration
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péritonéale. Ainsi, ces composés présentent une très faible toxicité.
Ces résultats démontrent que les composes de l'invention inhibent la biosynthèse du cholestérol et, par conséquent, diminuent le taux de cholestérol dans le sang. Ils constituent par conséquent des médicaments précieux pour le traitement de l'hyperlipémie et de l'artériosclérose.
Les composés de l'invention peuvent être administrés oralement ou parentéralement sous la forme
de capsules, de comprimés, de préparations injectables ou .de toute autre formulation connue, quoique leur administration orale soit normalement préférée.La dose varie en fonction de l'âge et du poids du corps du patient, ainsi que de la, gravité de l'état, mais, en, général, la dose journalière pour un adulte est de préférence de 0,1
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<EMI ID=54.1>
encore de 0,5 à 10 mg dans le cas des esters de la Monocoline K.
La préparation des composés de l'invention est
<EMI ID=55.1> titre non limitatif.
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Sel de sodium de la Monacoline K
300 litres d'un milieu de culture présentant un pH de 5,5 avant stérilisation et contenant 5 % en poids/ volume de glucose, 0,5 % en poids/volume de liqueur de
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tion commerciale Kyokuto, disponible auprès de Kyokuto Seiyaku KK, Japon) et 0,5 % en poids/volume de chlorure d'ammonium sont introduits dans un fermenteur de 600 litres,
<EMI ID=58.1>
18174 (Ferm. 4957) dans ce milieu. La culture du micro-
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un débit d'aération de 300 litres par minute et une agitation à raison de 190 tours par minute. Au bout de cette durée, on règle le pH du milieu de culture contenant le microorganisme à une valeur de 3,4 par addition d'acide chlorhydrique 6N, puis on le soumet à une extraction avec
800 litres de méthanol.
On ajoute 6 kg d'Hyflo Super Cel et on filtre ensuite l'extrait, en utilisant un filtre-presse, pour obtenir 1100 litres d'extrait méthanolique. Cet extrait est lavé avec 200 litres d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium et ensuite avec 180 litres d'ëthylcyclohexane. La solution résultante est soumise à une extraction avec 600 litres de dichlorure d'éthylène. On <EMI ID=60.1> le dichlorure d'éthylène et on laisse réagir à 80[deg.] C .pendant
30 minutes. On lave ensuite, successivement le mélange réactionnel avec 200 litres d'une solution aqueuse à 2 %
en poids/volume de bicarbonate de sodium et avec 200
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de chlorure de sodium. Le mélange est ensuite concentré par évaporation sous pression réduite, ce qui donne 135 g d'une substance huileuse.
Cette substance huileuse est dissoute dans
400 ml de méthanol. 20 ml de la solution méthanolique résultante (contenant 6,8, g de l'huile) sont ensuite soumis à une chromatographie liquide rapide de préparation en utilisant l'appareillage dénommé "System 500" de Waters Co. Limited, équipé d'une colonne de Prepac C18
(colonne en phase inversée). On utilise un mélange
85:15 en volume de méthanol et d'eau, en tant qu'agent de développement. Le développement est effectué à un débit
<EMI ID=62.1>
minutes) ; on observe les indications d'un réfractomètre différentiel relié à la masse et. on sépare la fraction donnant le pic principal sur le réfractomètre différentiel. On répète cette opération, on recueille les fractions résultantes correspondant au pic principal et on les concentre pour obtenir 10,2 g d'une substance huileuse. Cette substance huileuse est dissoute dans 30 ml de méthanol et on soumet à nouveau 6 ml de la solution méthanolique (contenant environ 2 g de l'huile) à la même chromatographie liquide rapide de préparation ; on
<EMI ID=63.1>
et d'eau, à un débit de 200 ml/minute. On sépare la fraction présentant le pic principal. On répète cette opéra-
<EMI ID=64.1>
pondants au pic principal. Le résidu est traité par du méthanol aqueux pour donner 1170 mg de cristaux bruts, lesquels sont recristallisés plusieurs fois dans l'éthanol, ce qui donne 864 mg de cristaux.
<EMI ID=65.1>
dant 3 heures. On sépare les insolubles par filtration et on lyophilise le filtrat pour obtenir 900 mg du sel de sodium de la Monacoline K, qui présente les propriétés suivantes :
2. Analyse élémentaire
<EMI ID=66.1>
3. Poids moléculaire ;
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5. Spectre d'absorption ultraviolette :
Comme le montre la figure 1 des dessins ci-joints,
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
6. Spectre d'absorption infrarouge (comprimé de KBr) :
Comme le montre la figure 2 des dessins ci.joints.
7. Spectre de résonance magnétique nucléaire (D20) .
Comme le montre la figure 3 des dessins ci-joints.
8. Chromatographie rapide en phase liquide :
Durée de séjour : 8,5 minutes ;
Garnissage de la colonne : Microbondapac C18 ; Méthanol aqueux à 60 % en volume/volume + 0,1 %
de PIC-A (produit de Waters Co. Limited) ;
Débit : 1,5 ml/minute.
Comme le montre la figure 4 des dessins ci-joints.
9. Solubilité :
Soluble dans l'eau ; insoluble dans les solvants organiques.
10. Pouvoir rotatoire spécifique :
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EXEMPLE 2
Sel de sodium de la Monacoline K
300 litres d'un milieu de culture présentant un pH de 7,4 avant stérilisation et contenant 1,5 % en poids/ volume d'amidon soluble, 1,5 % en poids/volume de glycérine, 2,0 % en poids/volume de farine de poisson et 0,2 % en poids/volume de carbonate de calcium sont introduits dans un ferménteur de 600 litres ; le microorganisme
<EMI ID=71.1>
ce milieu. La culture du microorganisme est effectuée pendant 120 heures à 26[deg.]C, avec un débit d'aération de
300 litres par minute, sous agitation à raison de 190 tours par minute. Le -milieu de culture est ensuite filtré en utilisant -un filtre-presse, pour donner 35 kg
(poids humide) de microorganisme.
On y ajoute 100 litres d'eau et on règle la valeur du pH du mélange à 12 par addition d'hydroxyde de sodium, sous agitation. Le mélange est ensuite laissé à la température ambiante pendant une heure, après quoi on y ajoute
<EMI ID=72.1>
un filtre-presse. Le pH du filtrat est réglé à la valeur de 10 par addition d'acide chlorhydrique et le mélange résultant est-.ensuite adsorbé sur une colonne contenant
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d'eau puis avec 15 litres d'une solution aqueuse à 10 en volume/volume de méthanol. La colonne est ensuite éluée avec du méthanol aqueux à 90 % en volume/volume. L'éluat est concentré jusqu'à un volume d'environ 10 litres et son pH est ensuite réglé à la valeur 2 par addition d'acide chlorhydrique; le mélange est alors soumis à une extraction par l'acétate d'éthyle. L'extrait est lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, séché
sur du sulfate de sodium anhydre et ensuite concentré
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substance huileuse contenant l'acide de la Monacoline K. On ajoute du méthanol à cette substance huileuse, en quantité suffisante pour obtenir un volume total de 100 ml. On soumet 20 ml de la solution résultante à une chromatographie liquide rapide de préparation en utilisant une colonne à. phase inversée (comme décrit dans l'exemple 1); on élue avec une solution aqueuse à 20 % en volume/volume de méthanol (contenant 2 % d'acide acétique),à. un débit .de 200 ml/minute. La fraction présentant le pic principa..
<EMI ID=75.1>
tes). Les 80 ml restants de la solution méthanolique sont ensuite traites par le même processus. Les fractions résultantes correspondant au pic principal sont recueillies, concentrées et extraites par l'acétate d'éthyle.
L'extrait est concentré jusqu'à, siccité, après addition d'heptane- pour donner 1,2 � d'une substance huileuse.
Cette substance huileuse est dissoute dans 20 ml de méthanol et est ensuite soumise à une chromatographie liquide rapide, comme décrit ci-dessus, pour donner 150 mg d'acide de la Monacoline K. On yajoute 2 ml de méthanol et
100 ml d'eau et on règle le pH de la solution résultante
<EMI ID=76.1>
qui donne une solution aqueuse claire. On fait passer cette solution à travers une colonne contenant 10 ml de résine
<EMI ID=77.1>
avec du méthanol aqueux à 80 % en volume/volume. L'éluat est lyophilisé pour donnet 130 mg du sel de sodium de la
<EMI ID=78.1>
priétés du produit sont identiques à celles données pour le produit de l'exemple 1.
EXEMPLE 3
<EMI ID=79.1>
On répète la culture, l'extraction, la concentration, le chromatographie liquide rapide de préparation,
et la recristallisation dans l'éthanol, comme décrit dans l'exemple 1. 500 mg des cristaux résultants sont ensuite dissous dans 50 ml de chlorure de méthylène et la solution résultante est filtrée à. travers un filtre à pores très fins. 20 ml d'une solution aqueuse saturée d'hydroxyde de calcium sont ajoutés au filtrat et le mélange est ensuite énergiquement agité à. la température ambiante. Toutes les fois que le pH de la solution décroît pour venir en dessous de 8, on ajoute 'une nouvelle portion de 10 ml d'une solu-tion aqueuse saturée d'hydroxyde de sodium et on poursuit l'agitation. Lorsque le pH ne diminue plus (après addition d'une quantité totale de 50 ml de la solution aqueuse d'hydroxyde de calcium), on ajoute de l'eau distillée et on place la totalité de la solution dans un entonnoir à décantation.
On recueille la phase organique et on sépare le solvant par distillation. Le résidu est traité par l'héptane et une poudre est ensuite obtenue en soumettant le mélange à des -ultrasons. La poudre est filtrée et
échée pour donner 450 mg du sel de calcium de la Monacoline K, sous la forme d'une poudre blanche,
Ce sel de calcium présente les propriétés suivantes:
1. Poids moléculaire :
882 (par spectrométrie de masse)
2. Formule brute :
<EMI ID=80.1>
3. Point de fusion :
<EMI ID=81.1>
4. Pouvoir- rotatoire spécifique
<EMI ID=82.1>
- -
5. Spectre d'absorption infrarouge (KBr) :
Comme le montre la figure 5 des dessins ci-joints.
<EMI ID=83.1>
Comme le montre la figure 6 des dessins ci-joints.
EXEMPLE 4
Ester méthylique de la Monacoline K
On répète les processus de culture, extraction, concentration, chromatographie liquide rapide de préparation et recristallisation dans l'éthanol, comme décrit dans l'exemple 1, pour obtenir 864 mg de Monacoline K. On dissout
200 mg de cette Monacoline K dans 20 ml de méthanol (qui a été préalablement déshydraté avec le tamis moléculaire 3A). Après addition de quelques gouttes de chlorure d'acétyle, la solution est agitée à la température ambiante pendant
3 heures. Le solvant est séparé par distillation et le résidu est soumis à une extraction avec 50 ml d'acétate
<EMI ID=84.1>
"'" tion aqueuse à 2 % en poids/volume de bicarbonate de sodium et une solution aqueuse saturée de chlorure de sddium, puis il est séché sur du sulfate de sodium anhydre, après quoi le solvant est séparé par distilla-" tion. Le résidu est adsorbé sur une colonne contenant
<EMI ID=85.1>
ment traité par du benzène. Les fractions éluées avec un mélange 6 : 94 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est séparé par distillation, ce qui donne 65 mg de l'ester méthylique de la Monacoline K, sous la forme d'une huile incolore.
, Ce produit présente les propriétés suivantes :
1. Poids moléculaire :
436,6 (par spectrométrie de masse)
2. Formule brute ;
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
4. Spectre d'absorption infrarouge
Comme le montre la figure 7 des dessins ci-joints.
5. Spectre de résonance magnétique nucléaire :
Comme le montre la figure 8 des dessins ci-joints,.
EXEMPLE 5
Ester méthylique de la Monacoline K
On prépare le sel de sodium de la Monacoline K en procédant comme décrit dans l'exemple 2. On dissout ensuite 100 mg de ce sel de sodium dans 2 ml de.sulfoxyde
<EMI ID=88.1>
de méthyle à la solution. La solution est ensuite soumise
<EMI ID=89.1>
dans un récipient de réaction équipé d'un condenseur à reflux. Le mélange réactionnel est ensuite dilué avec
5 ml d'eau et soumis à une extraction avec 10 ml de chlorure de méthylène. Le solvant est chassé de l'extrait par distillation et: le résidu est adsorbé sur une colonne conte-nant 10 g de gel de silice (Wakogel C-100) qui a été préalablement traité par du benzène. Les fractions éluées avec un mélange 4:96 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est chasse par distillation, ce qui donne 35 mg de l'ester méthylique de la Monacoline K, sous la forme d'une Huile.
-EXEMPLE 6
<EMI ID=90.1>
préalablement déshydraté à l'aide du tamis moléculaire 3A et on ajoute quelques gouttes de chlorure d'acétyle à la solution. Le mélange est ensuite agité à la température ambiante pendant 3 heures, puis le solvant est chassé par distillation et le résidu est soumis à une extraction
avec 50 ml d'acétate d'éthyle. L'extrait est lavé successivement avec une solution aqueuse à 2 % en poids/volume de bicarbonate de sodium et avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, puis il est séché sur du sulfate de sodium anhydre. Après séparation du solvant par distillation, le résidu est adsorbé sur une colonne
<EMI ID=91.1>
préalablement traité par du benzène. Les fractions éluées avec un mélange 6:94 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est chassé par distillation, ce qui donne 30 mg de l'ester éthylique de la Monacoline K, sous la forme d'une huile incolore.
Les propriétés de ce composé sont les suivantes :
1. poids moléculaire:
450,6 (par spectrométrie de masse)
2. Formule brute :
<EMI ID=92.1>
Comme le montre la figure 9 des dessins ci-joints.
4. Spectre de résonance magnétique nucléaire :
Comme le contre la figure 10 des dessins ci-joints.
EXEMPLE 7
Ester butylique de la Monacoline K
On dissout 200 mg de Monacoline K (préparée comme décrit dans l'exemple 1).dans 20 ml de méthanol qui a été préalablement déshydraté avec le tamis moléculaire 3A.
Après addition de quelques gouttes de chlorure d'acétyle à la solution, le mélange résultant est agité à la tempéra-
<EMI ID=93.1>
chassé par distillation et le résidu est soumis à une extraction avec 50 ml d'acétate d'éthyle. L'extrait est lavé successivement avec une solution aqueuse à 2 % en poids/volume de bicarbonate de sodium et une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. La solution est ensuite séchée sur du sulfate de sodium anhydre et le solvant est chassé par distillation. Le résidu est adsorbé sur une
<EMI ID=94.1>
a été préalablement traité par du benzène. Les fractions éluées avec un mélange 4 ; 96 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est chassé par distillation, ce qui donne 80 mg de l'ester butylique de la Monacoline K, sous la forme d'une huile incolore.
Ce composé présente les propriétés suivantes :
1. Poids moléculaire :
478,7 (par spectrométrie de masse).
2. Formule brute :
<EMI ID=95.1>
Comme le montre la figure 11 des dessins ci-joints.
<EMI ID=96.1>
Comme le montre la figure 12 des dessins ci-joints.
EXEMPLE 8
Ester benzylique de la Monacoline K
On dissout 200 mg de Monacoline K (préparée comme décrit dans l'exemple 1) dans 20 ml d'alcool benzylique qui a été préalablement déshydraté au moyen du tamis moléculaire 3A. Après addition de quelques gouttes de chlorure d'acétyle à. la solution, le mélange résultant est agité à la température ambiante pendant 3 heures. Le solvant est ensuite chassé par distillation et le résidu
<EMI ID=97.1>
L'extrait est lavé successivement avec une solution aqueuse à 2 % en poids/volume de bicarbonate de sodium
et avec une- solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. La solution est ensuite sêchée sur du sulfate de sodium anhydre et le solvant est chassé par distillation. Le résidu est adsorbé sur une colonne contenant 10 g de gel de silice (Wakogel C-100) qui a été préalablement traité par du benzène. lies fractions éluées avec un mélange 4 :96 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est chassé par distillation, ce qui donne
70 mg de l'ester benzylique de la Monacoline K, sous la forme d'une huile incolore.
Les propriétés de ce composé sont les suivantes :
1. Poids moléculaire :
<EMI ID=98.1>
2. Formule brute :
C31H44C6.
3. Spectre d'absorption infrarouge (CHC1-) :
<EMI ID=99.1>
joints.
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
joints.
REVENDICATIONS
1. Composés utiles comme agents anti-hypercholes�
<EMI ID=102.1>
par des dérivés de la Monacoline K répondant à la formule :
<EMI ID=103.1>
dans laquelle :
R représente un atome métallique ou un groupe alkyle substitué ou non substitué ; et
- n est l'inverse de la valence de l'atome ou du groupe représenté par R.