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La présente invention concerne de l'héparine modi- fiée et cet relative à un procédé pour sa production.
Apres un repas gras, le sang humain devient laiteux à cause de la présence de particules de graisse émulsifises.
Cet état est appelé lipémie. Cet excès de graisse est normale- ment utilisé par combustion, par emmagasinage sous forme de dépits de graisse ou par incorporation générale dans les tis- sus du corps mais chez les artériosclérotiques, les diabéti- ques et dans une certaine mesure chez les personnes âgées, la lipémie tend à persister. Une telle lipémie persistante,ou hyperlipémie, est généralement associée à la présence d'une forte proportion de ss-lipoprotéines à haut ppide moléculaire.
On a proposé d'utiliser l'héparine et certains dé- rivés simples de l'héparine pour le traitement de l'hyperlipé- mie, étant donné que ces composés possèdent la propriété ca- ractéristique d'activer un enzyme du corps qui scinde le* ss-lipoprotéines ce qui provoque une clarification du sang* Un tel enzyme est normalement appelé, pour des raisons de simpli- cité, "un facteur de clarification**Malheureusement, l'hépa- rine et les substances antilipémiques citées possèdent égale- ment une forte activité anticoagulante et le danger existe, que, au cours d'une thérapie à long terme, des hémorragies épisodiques puissent se produire.
De plus, lorsque ces subs- tances sont administrées par voie aouscutannée ou intramus- culaire, le sang est capable de produire des "écohymoses" et
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même de e'extravaaar au point d'infection. U
L'héparine peut être dérivée d'un certain nombre de sources naturelles, par exemple lea poumons ou muqueuses, et des différences de composition peuvent être observées bien que les propriétés physiologiques de la matière provenant de
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diverses sources sont étroitement 81.lairea.
De plus,!'M- j tivité anticoagulante et antilipémique de l'héparine est aussi
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l'appenage d'un certain nombre de dérivés simples de i'hépari- ne formés #or momification des extrémités des chaînes réduc- triées, par exemple la cyanhydrine et les composés earboxy fore! més par hydrolyse de la cyanhydrine et aussi les composée hydroxy formes par la réduction des groupes réducteurs aldéhydi -
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quee, par exemple avec du borohydrure, ±tant donné que l'action physiologique de ces dérivés et que les d1versee formas d'h'!'" : parine sont toutes étroitement similaires, l'expression .
"héparine" sera utilisée dorénavant dans le prisent mémoire, ! et les revendications qui le terminent pour désigner aussi bien les dérivés simples décrits ci-dessus que les substances naturelles.
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La demanderesse a trouvé,"ue lori)que l'héparine est soumise à une scission glyoolique, des. substances sont formées qui possèdent une bonne activité antillpémique mais une aoti- vité anticoagulante réduite. Ces propriétés du produit ne sont pas changées de manière notable lorsque les groupe* aldéhyde formes au coure de la scission glycolique sont réduite. Le produit réduit est préféré pour l'objet de l'invention étant donné sa plus grande stabilité chimique .
Selon la présente invention, la demanderesse a trouvé un procédé de modification de l'héparine, afin d'abais- ser non activité anticoagulante sans diminution substantielle
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de son activité antilipémique, procédé dans lequel l'héparine est soumise à une scission glycolique suivie, si on le désire, d'une réduction des groupes aldéhydiques ainsi formée, l'hépa- ; rine modifiée étant finalement isolée du mélange réactionnel;
La matière de départ de choix est l'héparine natu- relle dans laquelle les extrémités des chaîna:) réductrices demeu- rent inchangées.
L'héparine est un aminopolysaccharide sulfaté qui possède une unité tétrasaccharide récurrente constituée par des unités acide D-glucuronique et D-glucosamine alternées, les unités glycosamines étant sulfatées sur le groupe amino.
L'une des unités acide uronique dans l'unité de récurrence est sulfatée en position 2, tandis que l'autre unité acide unonique ne port, pas de groupe sulfaté, Les deux groupes sulfate res- tante, sont localisés sur les unités glucosamine . Il semble, pour cette raison, qu'étant donné qu'une unité acide glucuro- .nique liée en positions 1,4 possède normalement des groupes hy- droxyle sur les positions 2 et 3 seulement, une unité acide glucuronique du tétrasschraride possède des groupes hydroxy- les adjacente, tandis que les autres n'en possèdent pas.
Ceci est soutenu par la découverte que dans le traitement par du periodate de sodium coupe agent de scission glycolique, selon la présente invention, le produit résultant peut être dégradé pour donner un acide tétronique et environ 50 % de la quanti- ! té originelle d'acide glucuronique, indiquant en cela que seule) une unité uronique par unité tétrasaccharide a été attaquée.
Le produit résultant de la siscion glycolique de l'héparine, suivit' si on le désire, de la réduction des groupes aldéhydes ainsi formas, peut dont être caractérisé comme pos-
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aidant un rapport unités acide D-gluouronique/unitéa gluoofft-
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mine inférieur à 1,0, ceci étant dû à l'attaque sur les uni- tés acide uronique, et une teneur en D-gluoosamine, une te-
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nour en sulfate et un spectre infra-rouge similaire* à ceux de la matière au départ. Lorsqu'une scission glycolique nouai.
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blement complète a été effectuée, le rapport cité ci-aeaaua ' eat d'environ 0,5 La teneur de l'acide manique de la #Aiere est, en général, comprise entre 50 e et 100 % en poids de .t6.. parine.
La teneur en acide uronique de ra aaxitrre non rédui- te ne peut pas être déterminée par la méthode généralement ' ¯A utilisée mais il eut improbable qu'elle aolt change pp-t 3'f ; réduction. Des mesures de la teneur en acide urone4ue d<t l'e- parine oxydée sont pour cette raison normalement eifeotuéea en
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réduisant d'abord la matière par exemple avec du boronydrure. Le poids moléculaire des produits est similaire à celui de l'héparine bien qu'il n' est pas aisément déterminé, à. cause de 1* inhomogénéité* "3J "activité métachromatîque de la matière
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est aussi étroitement similaire à celle de l'héparine.
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Selon une autre caractéristique de la présolats.inven-1 tion, la demanderesse propose un aminopolyaaocharide, ayant
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un rapport des unités acide uronique inchangé aux unités D- glucosamine d'au moins 0,5 et inférieur à 1,0, le pourcentage
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des unités acide uronique inchangé dans la molécula étant d'mn moins 50 % .et inférieur a celui de l'héparine naturelle, cet aminopolyeaccharide ayant un poids moléculaire, une teneur en sulfate, une $gtivité métachromatique et un spectre infra-rou- ge sensiblement identiques à ceux de l'héparine naturelle et
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ayant une action antilipémique comparable à celle de l'héparine*
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mais une action anticoagulante plue faible que celle de 1114pa. rine.
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Lorsque le rapport de* unité a acide uronique à glucosamine approche 0,5, l'activité anticoagulante se trouve diminuée jusqu'à 4-8 unitéo/mg, par exemple approximativement 6 unités mg, lorsqu'on la compare aux 100-150 unités mg normales pour l'héparine inchangée et une telle matière est préférée.
Bien que la demanderesse ne désire pas limiter le cadre de la présente invention à des considérations théoriques. les pro- duits dérivés de l'héparine par réduction, selon la présente .invention, semblant contenir des unités tétrassccharides récur- rentes de structure générale suivante:
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L'activité antilipémique des produite selon la présente inven- tion peut être estimée par l'injection dans des lapins, suivi. par l'incubation de plasma citrate préparé à partir de sang tiré du lapin après un intervalle donné, avec uns dilution appropriée d'une émulsion à 50 % d'huile de noix de coco. L'o- pacité de l'émulsion peut être déterminée à l'aide d'un spectro- photomètre à une longueur d'onde de 650-700 mu. L'activité anti- caillotante ou anticoagulante du produit peut être mesurée par les méthodes et dans les unités conventionnelles pour l'hépa- rine. De manière similaire,l'activité anticaillotiante peur être mesurée par l'observation du caillottement dans le plasma de mouton (Pritchard; J.
Pharm. and Pharmacol. 1956, 8, 523-529)*
Les produite suivant la présente invention qui sont préparée à partir de l'héparine ne sont pas, tout comme l'hé- parine elle-même, absorbés par le duodénum ou l'estomac et sont de préférence administrés par voie paronthérale en combinaison
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avec un support ou véhicule inerte pharmaceutiquement accepta- . ble pour l'infection ou l'implantation. Des supporte ou véhiou- les appropriée comprennent l'eau apyrogène stérile, l'huile ou ! des émulsions huileuses 'contenant, si on le déaire,des agents d'émulsification ou de dispersion et des 'sels physiologiques.
Les produite sont bien tolérés et peuvent être administrés en . des 0.0-ses de l'ordre de 0,25-5 mg. par exemple 0,4 mg kg du poids du corps. Ils peuvent par exemple aussi être administrés en doses uniques comprises entre 10 et 500 mg.
Les produits suivant la présente invention peuvent être préparée comme indiqué ci-dessus, par traitement d'hépari- ne avec un agent de scission glycolique, suivi par la réduction des groupes aldéhyde ainsi formés. logent de scission glycoli- gue est aventegeunement un Rériednie, pas enemple un pdriednte de,,métal alcalin tel que le périodate de sodium ou de potassium* Le métapériodate de sodium est préféré, étant donné sa plue forte solubilité dans l'eau. La réaction de scission avec le périodate est de préférence effectuée à un pH légèrement acide, par exemple 'un pH de 4 ou de 5,
et cette réaction cet avanta- geusement effectuée à la température ambiante ou à une tempé- rature inférieure. Le solvant* est de préférence l'eau étant donné l'excellente solubilité des polysaccharides dans ce mi- lieu.
La demanderesse a trouvé qu'en plus de la réaction de scission glycolique, une suroxydation ge produit qui cet plus lente que la réaction de Mission susdite mais qui se dé- roule simultanément à la réaction de scissionet conduit à la production de matière à chaîne plus courte. Il est, pour cette raison, préférable de limiter l'absorption d'agents de scission glycolique à la quantité minimum nécessaire, par exemple, 3-4
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moles par unité tétrasaccharide, afin d'obtenir un produit ayant une activité anticoagulante faible, pr exemple 4 à 8 unités tg.
Tout excès de périodate peut être; éliminé si on le désire, par traitement, par exemple, avec un glycol, par exem- ple de l'éthylène glycol, et la matière à chaîne courte et d'autres matières indésirables peuvent être facilement élimi- nées par dialyse.
La réduction des groupes aldéhyde peut être effec- tuée par exemple par hydrogénation cataly tique, en utilisant par exemple un catalyseur de platine, mais elle est de préfé- rence effectué)en utilisant un hydrure métallique comme agent réducteur, tel qu'un botohydrure de métal alcalin. La tempéra- ture réactionnelle préférée est de nouvel la température ambiante ou une température inférieure et la réaction est de préférence effectuée dans de l'eau comme milieu de réaction, les borohydrurea étant des agents réducteurs préférés, étant donné leur bonne solubilité dans les milieux aqueux.
La matière réduite peut contenir d'autres matières. dégradées et celles-ci sont avantageusement éliminées, par ex- emple, par dialyse, avant l'isolement du produit, par exemple, par congélation.
Les exemples illustratifs suivants feront mieux com- prendre l'invention sans toutefois la limiter à ceux-ci.
EXEMPLE 1.
(1) Héparine de poumons de bovidés utilisée comme matière de départ.
L'héparine utilisée s'est révélée absorber très ra- pidement l'humidité de l'air. Par conséquent, avant toute ana- lyse, on a laisse l'héparine s'équilibrer avec l'atmosphère.
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,un* partis de l'échantillon a alors été analysée et une partit a été Biche* afin de trouver la teneur en humidité.
Analyse du sulfate.
L'analyse du sulfate sur des quantités 4,9 3 mg ayant
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une teneur en humidité d'environ 19 % par la téthodo epeotro- photométrique de Jones et Lethaae et &pr0j' digeetion avec de l'acide nitrique et du peroxyde, a donne pour résultat! 41, 5 % de sulfate, '
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!, Cea3 suppose que le N-aulfaie est converti en sulfata au coure de l'analyse/ ce résultat s'aecoeue avec les 4.r''' tenue par la méthode de la cendre sulfatée,
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le pourcentage de soufre est donc 3.3 8.' Détermination de 1 ' aeiide uronique.
En utilisant la méthode décrite par Barder, Poster# Siddiqui et Stauuyl on a trouvé que 98,5 de l'atide uronique attendus étalent présente, La quantité théorique a été calcu- lés en se basant sur l'hypothèse qu'il y a deux résidus acide
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glueuronique par unité tétrasacoharide et qui il y a cinq grou- pes sulfate dans la môme unité.
(2) Oxydation de 1. ' héparine .
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De l'héparine (2,87 gm - poids sec 2,34 su - humidité 18,3 xi) a été dissoute dans de l'eau, 50 cl de périodate de sodium 0,25M ont été ajoutes et le mélange a été dilué jusqu'à
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un voluatc de 500 ml dans un flacon gradué. La solution a été entréporde dans lfebeouriié à 25*04 es parties aliquotes 4e 5 XI ont été prises de temps en temps afin de déterminer la conson- mation de périodate. Au cours de$ premiers stade de 1 oxydation
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*1 nry a pas eu élaboration 4'anhydrite carbonique.
De mômes des parties aliquotes plue importante$ ont été prises et l'oxydation y a été arrêtée par l'addition d'un
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excès d'éthylène glyool. Le mélange a été dialyse pendant tout! la nuit à contre-courant avec de l'eau Puis il a été séché par oongellation.
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EXEMPLE
La matière oxydée de l'exemple 1 a été réduite à l'at de de borohydrure de sodium à la température ambiante pendant
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toute la nuit,
l'excès de bofohydrure a été détruit à l'aide d'acide acétique et le mélange a à nouveau éti diayed et Ué I*r < - gellation. Cette matière réduite a été soumise à l'analyse. le tableau suivant donne les résultats analytiques obtenue à partir de deux parties aliquotes séparées.
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<tb>
Echantillon <SEP> Heures <SEP> après <SEP> Périodate <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> acide
<tb> amorce <SEP> de <SEP> uronique <SEP> sous
<tb> l'oxydation <SEP> forme <SEP> de <SEP> pourcentage
<tb> de <SEP> }. <SEP> 'original <SEP>
<tb> dégage- <SEP> test <SEP> par <SEP> le
<tb> ment, <SEP> par <SEP> carbazol
<tb> le <SEP> CO2
<tb>
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<XMt-MMMtt-M M*-<MM<#t --T f 'I ]| I ' 'I 1 1 1 I I i . Il . I . I I #rr IIIM|. 1|1||IL|.¯
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<tb> 1 <SEP> 97 <SEP> 3,28 <SEP> 57,4 <SEP> 51,5 <SEP>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 179 <SEP> 4,3 <SEP> 57,4 <SEP> 54,7 <SEP> %
<tb>
La teneur en amino-sucre a été déterminée par une
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méthode Bison-Morgan modifiée et cette méthode a montré qu'il n'y a pas eu de perte apparente d'amino-sucre dans l'un quel- conque des échantillons.
Chaque échantillon a été hydrolyse et l'électrophorèse sur papier dans une solution tampon d'acétate a montré l'exixtanoe d'un composant acide qui avait la même mobilité que l'acide glucuronique et l'existence d'un autre composant acide qui avait la même mobilité que l'acide érythro- nique. De la glucosamine était également présente.
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Les deux échantillons ont été testés afin de déter- miner leur activité de clarification par la méthode suivante. -
Une solution aqueuse du produit en question dans de l'eau sté- rile a été préparée et environ 100 unités méthadromatiques (Mac Intosh; Biochem J. 1941, 35, 776) ont été injectées par voie intraveineuse dans un lapin. Le lapin a été saigné immé- diatement avant l'injection et ensuite a certains intervalles, et, après citratation, le sang a été centrifugé et le plasma a été stocké à 4 C.
L'opacité d'un mélange de 1,5 ml de plasma et de 3,0 ml d'diol Schenley à une dilution de 1 1000 (une émulsion à 50 % d'huile de noix de coco) a été déterminée dans. un spectrophotomètre Unicam à une longueur 'onde de 650 mu avant ]L'incubation à 37 C et à certain intervalles par après* Il s'est révélé que chaque échantillon produisait du plasma ré- i duisant l'opacité de l'émulsion de plus de 50 % en une période de 6 heures.
La méthode mentionnée ci-dessus a été utilisée pour préparer de l'héparine de muqueuse modifiée, l'oxydation étant effectuée en utilisant du périodate à trois concentrations dif- férentes. L'essai anticoagulant, mesuré par le test du caillot- tement de plasma de mouton de Pritohard (J. Pharm and Pharma- col.; 1956, 8, 523-9), et l'activité méthacromatique sont montrés dans le tableau suivant:
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TABLEAU.
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<tb>
Périodate <SEP> Potentiel
<tb>
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Temrs absorption -##########!#####"##"*'"
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<tb> (heures) <SEP> méthode <SEP> Méthode
<tb>
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caillottement métachromatique
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<tb> de <SEP> plasma <SEP> au <SEP> bleu <SEP> de
<tb> de <SEP> mouton <SEP> toluidine.
<tb>
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Héparine ae poumon 0,0038 j 97 3r3 6,6 80#0 Périodaie 0.025& - ) 179 493 4, 82,0 Héparine de muqueuse O,0030² ) 91 3985 - Périodate 0,027 = 135 4,5 3,2 8010 Héparine de truqueuse 0,0115 ) 21 2,5 - Periodate 0,125= 3 43 4.8 5.2 98,9 Héparine de muqueuse 0,0265 20 ',2 ériodate 0,25w 30 4,4 5,2 95, 4; 5.; 4.9 102.2
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The present invention relates to modified heparin and to a process for its production.
After a fatty meal, human blood becomes milky due to the presence of emulsified fat particles.
This condition is called lipemia. This excess fat is normally used by combustion, by storage in the form of fat deposits or by general incorporation into the tissues of the body, but in arteriosclerotics, diabetics and to some extent in the elderly, lipemia tends to persist. Such persistent lipemia, or hyperlipemia, is generally associated with the presence of a high proportion of high molecular ss-lipoproteins.
It has been proposed to use heparin and certain simple derivatives of heparin for the treatment of hyperlipemia, since these compounds possess the characteristic property of activating an enzyme in the body which cleaves the blood. * ss-lipoproteins which causes blood clarification * Such an enzyme is normally called, for the sake of simplicity, "a clarifying factor ** Unfortunately, heparin and the anti-lipemic substances mentioned also have strong anticoagulant activity and there is a danger that during long-term therapy episodic hemorrhages may occur.
In addition, when these substances are administered subcutaneously or intramuscularly, the blood is capable of producing "ecohymoses" and
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even from e'extravaaar to the point of infection. U
Heparin can be derived from a number of natural sources, for example the lungs or mucous membranes, and differences in composition can be observed although the physiological properties of the material derived from it.
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various sources are closely 81.lairea.
In addition, the anticoagulant and antilipemic activity of heparin is also
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the appenage of a number of simple heparyine derivatives formed by mummification of the ends of the reduced chains, eg cyanohydrin and earboxy compounds. més by hydrolysis of cyanohydrin and also the hydroxy compounds formed by the reduction of reducing aldehyde groups -
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quee, for example with borohydride, ± as the physiological action of these derivatives and that the derivatives of h '!': parin are all closely similar, expression.
"heparin" will henceforth be used in the memory,! and the claims which end it to denote both the simple derivatives described above and the natural substances.
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Applicants have found that, as heparin is subjected to glycol cleavage, substances are formed which possess good antillpemic activity but reduced anticoagulant activity. These properties of the product are not significantly changed. when the aldehyde groups formed during the glycolic scission are reduced The reduced product is preferred for the purpose of the invention due to its greater chemical stability.
According to the present invention, the Applicant has found a process for modifying heparin, in order to lower its anticoagulant activity without substantial reduction.
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of its antilipemic activity, a process in which heparin is subjected to glycolic scission followed, if desired, by a reduction of the aldehyde groups thus formed, heparin; the modified rine being finally isolated from the reaction mixture;
The starting material of choice is natural heparin in which the ends of the reducing chains remain unchanged.
Heparin is a sulfated aminopolysaccharide which has a recurring tetrasaccharide unit consisting of alternating D-glucuronic and D-glucosamine units, the glycosamine units being sulfated on the amino group.
One of the uronic acid units in the repeating unit is sulfated at position 2, while the other unonic acid unit does not carry a sulfated group. The two sulfate groups remaining are located on the glucosamine units. It seems, for this reason, that since a glucuronic acid unit linked at the 1,4-positions normally has hydroxyl groups at the 2 and 3 positions only, a glucuronic acid unit of tetrasschraride has groups hydroxyls adjacent to them, while the others do not.
This is supported by the finding that in the treatment with sodium periodate cutting glycolic scission agent, according to the present invention, the resulting product can be degraded to give tetronic acid and about 50% of the amount. original tee of glucuronic acid, indicating that only) one uronic unit per tetrasaccharide unit has been attacked.
The product resulting from the glycolic siscion of heparin, followed if desired by the reduction of the aldehyde groups thus formed, can therefore be characterized as pos-
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helping a D-gluouronic acid / gluoofft- unit ratio
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mine less than 1.0, this being due to the attack on the uronic acid units, and a content of D-gluoosamine, a te-
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nour in sulfate and an infrared spectrum similar * to those of the material at the start. When a glycolic split started.
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The manic acid content of the air is, in general, between 50% and 100% by weight of .t6. parine.
The uronic acid content of unreduced aaxitrre cannot be determined by the method generally used, but it is unlikely that it will change pp-t 3'f; reduction. Measurements of the uronic acid content of oxidized eparin are therefore normally obtained in
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first reducing the material eg with boronhydride. The molecular weight of the products is similar to that of heparin although it is not easily determined at. cause of 1 * inhomogeneity * "3J" metachromatic activity of matter
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is also closely similar to that of heparin.
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According to another characteristic of the presolats.inven-1 tion, the applicant proposes an aminopolyaaocharide, having
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a ratio of unchanged uronic acid units to D-glucosamine units of at least 0.5 and less than 1.0, the percentage
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unchanged uronic acid units in the molecule being minus 50%. and lower than that of natural heparin, this aminopolyeaccharide having a molecular weight, a sulfate content, a metachromatic $ gtivity and an infra-red spectrum substantially identical to those of natural heparin and
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having an antilipemic action comparable to that of heparin *
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but a weaker anticoagulant action than that of 1114pa. rine.
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When the ratio of * uronic acid unit to glucosamine approaches 0.5, the anticoagulant activity is decreased to 4-8 unit / mg, for example approximately 6 mg units, when compared to 100-150 units. mg normal for unchanged heparin and such material is preferred.
Although the Applicant does not wish to limit the scope of the present invention to theoretical considerations. the products derived from heparin by reduction, according to the present invention, appearing to contain recurrent tetrassaccharide units of the following general structure:
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The antilipemic activity of produced according to the present invention can be estimated by injection into rabbits, followed. by incubating citrate plasma prepared from blood drawn from the rabbit after a given interval, with an appropriate dilution of a 50% coconut oil emulsion. The opacity of the emulsion can be determined using a spectrophotometer at a wavelength of 650-700 mu. The anticoagulant or anticoagulant activity of the product can be measured by methods and in units conventional for heparin. Similarly, anti-clot activity can be measured by observing clotting in sheep plasma (Pritchard; J.
Pharm. and Pharmacol. 1956, 8, 523-529) *
The products according to the present invention which are prepared from heparin are not, like heparin itself, absorbed from the duodenum or the stomach and are preferably administered parontherically in combination.
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with a pharmaceutically acceptable carrier or inert vehicle. ble for infection or implantation. Suitable carriers or vehicles include sterile pyrogen-free water, oil, or! oily emulsions containing, if available, emulsifying or dispersing agents and physiological salts.
The products are well tolerated and can be administered in. 0.0-ses of the order of 0.25-5 mg. for example 0.4 mg kg of body weight. They can for example also be administered in single doses of between 10 and 500 mg.
The products according to the present invention can be prepared as indicated above, by treatment of heparyin with a glycolic cleavage agent, followed by reduction of the aldehyde groups thus formed. The glycol cleavage lodge is aventegne a reedie, not an alkali metal compound such as sodium or potassium periodate. Sodium metaperiodate is preferred, due to its higher solubility in water. The cleavage reaction with the periodate is preferably carried out at a slightly acidic pH, for example a pH of 4 or 5,
and this reaction suitably carried out at room temperature or at a lower temperature. The solvent * is preferably water due to the excellent solubility of the polysaccharides in this medium.
The Applicant has found that in addition to the glycolic scission reaction, an overoxidation ge produces which this slower than the aforementioned Mission reaction but which takes place simultaneously with the scission reaction and leads to the production of more chain material. short. It is, for this reason, preferable to limit the absorption of glycolic scission agents to the minimum amount necessary, for example, 3-4
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moles per tetrasaccharide unit, in order to obtain a product having a weak anticoagulant activity, for example 4 to 8 tg units.
Any excess periodate can be; removed if desired, by treatment, for example, with a glycol, for example ethylene glycol, and the short chain material and other unwanted material can be easily removed by dialysis.
The reduction of the aldehyde groups can be carried out, for example, by catalytic hydrogenation, for example using a platinum catalyst, but it is preferably carried out using a metal hydride as a reducing agent, such as a sodium botohydride. alkali metal. The preferred reaction temperature is again room temperature or lower and the reaction is preferably carried out in water as the reaction medium, borohydrides being preferred reducing agents, due to their good solubility in aqueous media. .
The reduced material may contain other material. degraded and these are advantageously removed, eg, by dialysis, prior to isolation of the product, eg, by freezing.
The following illustrative examples will better understand the invention without, however, limiting it to them.
EXAMPLE 1.
(1) Bovine lung heparin used as starting material.
The heparin used has been shown to absorb moisture from the air very quickly. Therefore, prior to any analysis, heparin was allowed to equilibrate with the atmosphere.
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, one * part of the sample was then analyzed and one part was doe * in order to find the moisture content.
Sulphate analysis.
Sulphate analysis in quantities of 4.9 3 mg having
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a moisture content of about 19% by the tethodo epeotrophotometric of Jones and Lethaae, and presumably with nitric acid and peroxide, resulted in! 41.5% sulfate, '
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!, Cea3 assumes that N-aulfaie is converted into sulfata during the analysis / this result is coeue with the 4.r '' 'held by the sulfated ash method,
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the percentage of sulfur is therefore 3.3 8. ' Determination of uronic acid.
Using the method described by Barder, Poster # Siddiqui and Stauuyl it was found that 98.5 of the expected uronic aid was present. The theoretical amount was calculated based on the assumption that there are two acid residue
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glueuronic per tetrasacoharid unit and which there are five sulphate groups in the same unit.
(2) Oxidation of heparin.
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Heparin (2.87 gm - dry weight 2.34 su - moisture 18.3 xi) was dissolved in water, 50cl of 0.25M sodium periodate was added and the mixture was diluted. until
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a volume of 500 ml in a graduated bottle. The solution was spilled into the 25 * 04 lfebeouriié. 4th 5 XI aliquots were taken from time to time to determine periodate consumption. During $ early stage of 1 oxidation
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* There was no development of carbonic anhydrite.
Even larger aliquots were taken and the oxidation was arrested by the addition of a
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excess ethylene glyool. The mixture was dialyzed the entire time! the night against the current with water Then it was dried by oongellation.
EMI9.1
EXAMPLE
The oxidized material of Example 1 was reduced to sodium borohydride at room temperature for
EMI9.2
All night long,
the excess bofohydride was destroyed with acetic acid and the mixture was again eti-diayed and ué I * r <- gellation. This reduced material was submitted for analysis. the following table gives the analytical results obtained from two separate aliquots.
EMI9.3
<tb>
Sample <SEP> Hours <SEP> after <SEP> Periodate <SEP> Content <SEP> in <SEP> acid
<tb> primer <SEP> of <SEP> uronic <SEP> under
<tb> oxidation <SEP> form <SEP> of <SEP> percentage
<tb> of <SEP>}. <SEP> 'original <SEP>
<tb> clear- <SEP> test <SEP> by <SEP> on
<tb> ment, <SEP> by <SEP> carbazol
<tb> the <SEP> CO2
<tb>
EMI9.4
<XMt-MMMtt-M M * - <MM <#t --T f 'I] | I '' I 1 1 1 I I i. He . I. I I #rr IIIM |. 1 | 1 || IL | .¯
EMI9.5
<tb> 1 <SEP> 97 <SEP> 3.28 <SEP> 57.4 <SEP> 51.5 <SEP>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 179 <SEP> 4.3 <SEP> 57.4 <SEP> 54.7 <SEP>%
<tb>
The amino sugar content was determined by a
EMI9.6
modified Bison-Morgan method and this method showed that there was no apparent loss of amino sugar in any of the samples.
Each sample was hydrolyzed and paper electrophoresis in acetate buffer solution showed the exixtanoe of an acidic component which had the same mobility as glucuronic acid and the existence of another acidic component which had the same mobility as erythronic acid. Glucosamine was also present.
<Desc / Clms Page number 10>
The two samples were tested in order to determine their clarifying activity by the following method. -
An aqueous solution of the product in question in sterile water was prepared and about 100 methadromatic units (Mac Intosh; Biochem J. 1941, 35, 776) were injected intravenously into a rabbit. The rabbit was bled immediately before injection and thereafter at certain intervals, and, after citration, the blood was centrifuged and the plasma was stored at 4 C.
The opacity of a mixture of 1.5 ml of plasma and 3.0 ml of Schenley diol at a dilution of 11000 (a 50% coconut oil emulsion) was determined in. a Unicam spectrophotometer at a wavelength of 650 mu before] Incubation at 37 C and at certain intervals thereafter * Each sample was found to produce plasma reducing the opacity of the emulsion by more. 50% in a 6 hour period.
The above-mentioned method was used to prepare modified mucosal heparin, the oxidation being carried out using periodate at three different concentrations. The anticoagulant test, measured by the Pritohard Sheep Plasma Clot Test (J. Pharm and Pharmacol .; 1956, 8, 523-9), and the methacromatic activity are shown in the following table:
<Desc / Clms Page number 11>
BOARD.
EMI11.1
<tb>
Periodate <SEP> Potential
<tb>
EMI11.2
Temrs absorption - ##########! ##### "##" * '"
EMI11.3
<tb> (hours) <SEP> method <SEP> Method
<tb>
EMI11.4
metachromatic clotting
EMI11.5
<tb> from <SEP> plasma <SEP> to blue <SEP> <SEP> from
<tb> of <SEP> sheep <SEP> toluidine.
<tb>
EMI11.6
Heparin ae lung 0.0038 d 97 3r3 6.6 80 # 0 Periodaia 0.025 & -) 179 493 4.82.0 Mucosal heparin 0.0030²) 91 3985 - Periodate 0.027 = 135 4.5 3.2 8010 Heparin from faking 0.0115) 21 2.5 - Periodate 0.125 = 3 43 4.8 5.2 98.9 Mucosal heparin 0.0265 20 ', 2 eriodate 0.25w 30 4.4 5.2 95, 4; 5 .; 4.9 102.2